KR20140052081A - 순환 종양 세포 분석 - Google Patents

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루이사 마리아 로베르츠
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마델린 아이 레폴렛
데이비드 알렌 치아네스
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Abstract

본 발명은 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체(IGF-1R)를 발현하는 순환 종양 세포의 검출, 산출 및 분석 방법을 개시하고 있다. 이러한 방법은 암 선별 및, 치료 섭생의 각색 및 개발 그리고 치료 반응, 암 재발 등을 모니터하는데 유용하다. 이러한 순환 종양 세포의 검출, 산출 및 분석을 촉진시키는 시험 키트가 또한 제공된다.

Description

순환 종양 세포 분석{CIRCULATING TUMOR CELL ASSAY}
본 발명은 종양학 및 진단 시험 분야, 보다 특히 암 선별 방법, 및 화학 요법 치료 반응, 암 재발 등을 예측 및 모니터하는 방법에 관한 것이다.
*인슐린-유사 성장 인자(IGF-1)는 고농도로 혈장에서 순환되고 대부분의 조직에서 검출될 수 있는 7.5 kD의 폴리펩타이드이다. 인슐린과 구조적으로 유사한 IGF-1은 세포 분화 및 세포 증식을 자극하고, 증식의 유지를 위한 대부분의 포유동물 세포 유형에서 요구된다. 이들 세포 유형으로는 특히 인간 이배체 섬유모세포, 상피 세포, 평활근 세포, T 림프구, 신경 세포, 골수 세포, 연골 세포, 조골 세포, 및 골수 줄기 세포가 포함된다.
IGF-1-자극된 세포 증식 또는 분화를 유도하는 형질도입 경로 중 제 1 단계는 IGF-1 또는 IGF-2(또는 생리학적 농도 이상의 인슐린)의 IGF-1 수용체(IGF-1R)로의 결합이다. IGF-1R은 티로신 키나아제 성장 인자 수용체 과에 속하며(울리히(Ullrich) 등의 문헌[Cell 61: 203-212, 1990]), 구조적으로 인슐린 수용체와 유사하다(울리히 등의 문헌[EMBO J. 5: 2503-2512, 1986]).
역학 연구는 가장 높은 정상 수준의 IGF-1을 가장 낮은 정상 수준의 IGF-1을 갖는 개체와 비교할 경우 폐, 유방, 전립선 및 직장결장과 같은 암의 위험성을 증가시키는 것으로 제시하고 있다. 시험관내 및 생체내 종양 세포의 유지에 있어서 IGF-1 및/또는 IGF-1R의 역할에 대한 증거가 상당하다. IGF-1R 수준은 폐 종양(카이저(Kaiser) 등의 문헌[J. Cancer Res . Clin . Oncol. 119: 665-668, 1993]; 무디(Moody) 등의 문헌[Life Sciences 52: 1161-1173, 1993]; 매컬리(Macauley) 등의 문헌[Cancer Res ., 50: 2511-2517, 1990]), 유방 종양(폴락(Pollack) 등의 문헌[Cancer Lett . 38: 223-230, 1987]; 포에켄스(Foekens) 등의 문헌[Cancer Res . 49: 7002-7009, 1989]; 아르티어카(Arteaqa) 등의 문헌[J. Clin . Invest. 84: 1418-1423, 1989]), 전립선 및 결장 종양(레마올레-베넷(Remaole-Bennet) 등의 문헌[J. Clin . Endocrinol . Metab. 75: 609-616, 1992]; 구오(Guo) 등의 문헌[Gastroenterol. 102: 1101-1108, 1992])에서 상승된다. 전립선 상피 중의 조절되지 않은 IGF-1의 발현은 유전자도입 마우스에서 신생물을 야기시킨다(디조반니(DiGiovanni) 등의 문헌[Proc . Nat'l . Acad . Sci . USA 97: 3455-3460, 2000]). 또한, IGF-1은 인간 신경교종의 자가분비 자극자인 것으로 보이고(샌드버그-노르드큐비스트(Sandberg-Nordqvist) 등의 문헌[Cancer Res . 53(11): 2475-78, 1993]), 동시에 IGF-1은 IGF-1R을 과발현하는 섬유육종의 성장을 자극시키는 것으로 보여져왔다(버틀러(Butler) 등의 문헌[Cancer Res. 58: 3021-3027, 1998]). 다양한 인간 종양의 성장에 있어서 IGF-1/IGF-1R 상호작용의 역할을 검토하기 위해, 매컬리의 문헌[Br . J. Cancer, 65: 311-20, 1992]을 참조한다.
IGF-1R RNA에 대한 안티센스 발현 벡터 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용함으로써, IGF-1R과의 간섭이 IGF-1-매개된 세포 성장 억제를 야기시키는 것으로 밝혀졌다(예컨대, 라이트(Wraight) 등의 문헌[Nat . Biotech . 18: 521-526, 2000]을 참조). 또한, IGF-1의 펩타이드 유사체(피에트르즈코우스키(Pietrzkowski) 등의 문헌[Cell Growth & Diff . 3: 199-205, 1992]; 피에트르즈코우스키 등의 문헌[Mol . Cell . Biol . 12: 3883-3889, 1992]), 또는 IGF-1 RAN에 대한 안티센스 RNA를 발현하는 벡터(트로잔(Trojan) 등의 문헌[Science 259: 94-97, 1992])를 사용하여 성장을 억제시킬 수 있다. 또한, IGF-1R에 대한 항체(아르티어가 등의 문헌[Breast - Canc . Res . Treatm . 22: 101-106, 1992]; 및 칼리빅(Kalebic) 등의 문헌[Cancer Res. 54: 5531-34, 1994]) 및 IGF-1R의 우성 음성 돌연변이(프라거(Prager) 등의 문헌[Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 91: 2181-85, 1994]; 리(Li) 등의 문헌[J. Biol . Chem . 269, 32558-2564, 1994]; 및 지앙(Jiang) 등의 문헌[Oncogene 18: 6071-6077, 1999])는 형질전환된 표현형을 역전시키고, 종양형성을 억제하고, 전이성 표현형의 손실을 유도할 수 있다.
또한, IGF-1은 세포자멸사의 조절에 있어 중요하다. 세포사가 프로그램되어 있는 세포자멸사는 면역계 및 신경계 성숙을 포함한 다양한 발생 과정에 관계된다. 발생시의 그의 역할 외에도, 또한 세포자멸사는 종양형성에 대한 중요한 세포 보호수단으로서 관련되어 왔다(윌리엄스(Williams)의 문헌[Cell 65: 1097-1098, 1991]; 및 레인(Lane)의 문헌[Nature 362: 786-787, 1993]). 세포자멸 프로그램의 억제는 악성종양의 발생 및 진행에 기여할 수 있다.
IGF-1은 IL-3-의존형 조혈 세포에서의 시토카인 인출에 의한 세포자멸사(루드리구에즈-타르듀치(Rodriguez-Tarduchy, G.) 등의 문헌[J. Immunol. 149: 535-540, 1992]) 및 Rat-1/mycER 세포에서의 혈청 인출(해링톤(Harrington, E.) 등의 문헌[EMBO J. 13: 3286-3295, 1994])로부터 보호한다. c-myc 유도된 섬유모세포가 그의 생존에 있어서 IGF-1에 의존한다는 증거는, IGF-1 수용체가 특이적으로 세포자멸사를 억제함으로써 종양 세포의 유지에 있어서 중요한 역할, 즉 IGF-1 또는 IGF-1R의 증식 효과와 구별되는 역할이 있음을 암시한다.
세포자멸사에 대한 IGF-1의 보호 효과는 IGF-1R이 세포에 존재하여 IGF-1과 상호작용하는 것에 의존한다(레스니코프(Resnicoff) 등의 문헌[Cancer Res . 55: 3739-41, 1995]). 종양 세포의 유지에 있어서 IGF-1R의 항-세포자멸 기능에 대한 지지는 또한 IGF-1R 수준 간의 정량적인 관계, 래트 동계 종양의 세포자멸사 정도 및 종양형성 가능성이 확인된 IGF-1R에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 연구에 의해 제공된다(레스니코프 등의 문헌[Cancer Res . 55: 3739-3741, 1995]. 과다발현된 IGF-1R은 에토포사이드-유도된 세포자멸사로부터 시험관내 종양 세포를 보호하고(셀(Sell) 등의 문헌[Cancer Res . 55: 303-06, 1995]), 보다 더 극적으로, 야생형 수준 미만의 IGF-1R 수준의 감소가 생체내 종양 세포의 대량 세포자멸사를 유발시킨 것(레스니코프 등의 문헌[Cancer Res . 55: 2463-69, 1995])으로 밝혀졌다.
몇몇 연구는 IGF-1R의 발현 수준이 임상 결과와 관련됨을 제시하였다. 종양 모델에서, IGF-1R은 세포 증식, 생존 및 전이를 조절하고, 표적 치료에 대한 내성을 유도한다. IGF-1R의 억제는 세포독성제의 활성을 상당히 증가시킨다(코헨(Cohen, B) 등의 문헌[Clin . Cancer Res . 11(5): 2063-73]). 따라서, IGF-1R 신호의 억제는 신규한 암 치료 계발에 유망한 전략이 될 것으로 보인다.
상피 조직의 악성 종양은 암의 가장 흔한 형태이며, 대부분의 암 관련 사망의 원인이다. 이러한 종양의 외과적 치료시 경과로 인해, 사망률은 종종 1차 진단시에 잠복되어 있는 초기 전이 및 재발로 점점 더 이어진다(라실라(Racila) 등의 문헌[Nat'l Acad . Sci . USA 95: 4589-94, 1998] 및 판텔(Pantel) 등의 문헌[J. Nat'l Cancer Inst. 91(3): 1113-24, 1999]). 예를 들면, 일부 기관의 원격 해부학적 자세는, 이들 기관의 종양이 이웃하는 구조로 침범하고 1cm 초과로 성장하기 전에 이들을 검출할 것으로 보이지 않는다. 심지어 유방암과 관련해서도, 유방조영술에 의해 검출된 12 내지 37%의 작은 유방암 종양(< 1cm)은 진단시에 이미 전이되었다(카드하(Chadha M.) 등의 문헌[Cancer 73(2): 350-3, 1994]).
순환 종양 세포(CTC)는 상이한 고형의 악성종양을 갖는 환자의 순환에 존재하는 상피 기관의 세포이다. 이들은 1차 종양의 클론으로부터 유도되며 악성이다. (펨(Fehm) 등의 문헌[Clin . Cancer Res . 8: 2073-84, 2002]을 참조). CTC가 암종의 암 진행에 대한 독립적인 진단인 것으로 고려될 수 있음을 입증하는 증거가 문헌에 축적되어 있다(베이츠흐 & 클리포드(Beitsch & Clifford)의 문헌[Am . J. Surg. 180(6): 446-49, 2000 (유방)]; 피조르(Feezor) 등의 문헌[Ann . Oncol . Surg. 9(10): 944-53, 2002 (직장결장)]; 고세인(Ghossein) 등의 문헌[Diagn . Mol . Pathol. 8(4): 165-75, 1999 (흑색종, 전립선, 갑상선)]; 글레이브스(Glaves)의 문헌[Br . J. Cancer 48: 665-73, 1983 (폐)]; 마츠나미(Matsunami) 등의 문헌[Ann . Surg. Oncol . 10(2): 171-5, 2003 (위)]; 및 라실라 등, 1998; 판텔 등, 1999 를 참조).
순환 종양 세포의 검출 및 산출은 여러 가지 이유로 환자의 관리에 있어 중요하다. 이들은 1차 종양 전에 검출될 수 있고, 따라서 초기 단계 진단을 허용한다. 이들은 치료에 반응하여 감소하므로, CTC를 산출하는 능력은 주어진 치료 섭생의 효과를 모니터하게 한다. 이들은 보조제 환경에서 추측할 수 없는 질병을 갖는 환자의 재발을 모니터하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들면, CTC는 명백히 미소전이(단일 종양 세포의 침착물 또는 신생물 세포의 매우 작은 군집)로부터 유방절제술 후 8 내지 22살의 유방암 환자 36%에 존재하는 것으로 발견되었다(멩(Meng) 등의 문헌[Clin . Can . Res . 10(24): 8152-62, 2004]).
또한, CTC는 무 진행 생존 기간(progession-free survival, PFS) 및 전체 생존 기간(overall survival, OS)을 예측하는데 사용될 수 있는데, 이는 전이 암종을 갖는 환자의 순환 종양 세포의 존재/개수가 PFS 및 OS 둘 다와 관련되는 것으로 입증되었기 때문이다. 예컨대, 크리스토파닐리(Christofanilli) 등의 문헌[J. Clin . Oncol. 23(1): 1420-1430, 2005; 크리스토파닐리 등의 문헌[N. Engl . J. Med . 351(8): 781-791, 2004]을 참조한다.
그러나, 단순한 CTC 검출보다 더 민감한 신속하고 신뢰성 높은 분석에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
발명의 개요
본 발명은 (a) 환자로부터 생물학적 표본을 입수하는 단계; (b) 다른 샘플 성분을 상당히 제외시키고, 생물학적 표본이 종양 세포와 특이적으로 반응하는 리간드와 혼합되어 있는 샘플을 제조하는 단계; (c) 샘플을 상피 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 시약과 접촉시키는 단계; (d) 샘플을 세포 상의 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGF-1R)에 대해 결합 친화도를 갖는 제제와 접촉시키는 단계; 및 (e) 샘플을 분석하여 IGF-1R을 발현하는 종양 세포의 존재를 결정하는 단계를 포함하는, 환자의 IGF-1R 길항제 치료의 효능을 예측하는 방법에 관한 것으로, 이때 샘플 중 IGF-1R을 발현하는 종양 세포의 존재가 환자의 IGF-1R 길항제 치료의 효능을 예측한다.
또한, 본 발명은 (a) 환자로부터 제 1 생물학적 표본을 입수하는 단계; (b) 다른 샘플 성분을 상당히 제외시키고, 제 1 생물학적 표본이 종양 세포와 특이적으로 반응하는 리간드와 혼합되어 있는 제 1 샘플을 제조하는 단계; (c) 제 1 샘플을 상피 세포에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 시약과 접촉시키는 단계; (d) 제 1 샘플을 세포 상의 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGF-1R)에 대해 결합 친화도를 갖는 제제와 접촉시키는 단계; (e) 제 1 샘플을 분석하여 IGF-1R을 발현하는 종양 세포의 존재 및 개수를 결정하는 단계; (f) 환자에게 IGF-1R 길항제 치료를 행하는 단계; (g) IGF-1R 길항제 치료를 행한 후, 환자로부터 제 2 생물학적 표본을 입수하는 단계; (h) 종양 세포와 특이적으로 반응하는 리간드와 혼합된 제 2 생물학적 표본으로부터 제 2 샘플을 제조하고, 제 2 샘플에 대해 단계 (c) 내지 (e)를 수행하는 단계; 및 (i) 제 1 샘플 중의 IGF-1R을 발현하는 종양 세포의 개수를 제 2 샘플 중의 IGF-1R을 발현하는 종양 세포의 개수와 비교하는 단계를 포함하는, 환자의 IGF-1R 길항제 치료의 효능을 모니터하는 방법에 관한 것으로, 이때 제 2 샘플 중의 IGF-1R을 발현하는 종양 세포의 수가 보다 적은 것은 환자의 IGF-1R 길항제 치료의 효과를 표시한다.
바람직한 실시양태에서, IGF-1R 길항제 치료는 항-IGF-1R 항체이다.
또한, 본 발명은 (a) 자기 코어 물질, 단백질 기재 코팅 물질, 및 종양 세포의 특징적인 결정소에 특이적으로 결합되는 항체(이때, 항체는 직접 또는 간접적으로 상기 기재 코팅 물질에 커플링되어 있다)를 포함하는 코팅된 자기 나노입자; (b) 분석으로부터 종양 세포와 다른 샘플 성분을 제외하기 위한 세포 특이적 염료; 및 (c) IGF-1R에 대한 결합 친화도를 갖는 하나 이상의 검출 가능하게 표지된 제제를 포함하는, IGF-1R을 발현하는 순환 종양 세포의 존재에 대해 환자의 샘플을 선별하는 키트에 관한 것이다.
이후 명백해지는 본 발명의 상술한 목적과 다른 목적, 장점 및 특징에 의해, 본 발명의 특징은 하기 발명의 상세한 설명, 도면 및 첨부된 청구범위를 참고로 하여 보다 명백하게 이해될 수 있다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적이고 기술적인 용어는 당해 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 또한, 달리 문맥상 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수 용어를 포함하고, 복수 용어는 단수 용어를 포함한다.
미국에서는 매년 백만개 보다 많은 새로운 암 사례가 진단되고 있으며, 이 나라에서 5명중 대략 1명의 사인은 암 또는 그의 치료와 관련된 합병증에 기인한다. 이 질병의 치료 및 진단을 개선하려는 상당한 노력이 계속되어 왔다. 대부분의 암 환자는 그의 1차 종양에 의해 사망하지 않으며, 오히려 이들은 전이(원시 종양으로부터 악성 세포 자체를 분리하고 몸을 통해 종종 먼 곳까지 이동하는 악성 세포에 의해 생긴 복합적으로 만연한 종양 집락)로 인해 쓰러진다. 불행히도, 전이 집락은 1차 종양보다 분리 및 제거하기가 빈번히 더 어렵고, 종종 이들 모두를 성공적으로 치료하는 것은 불가능하다. 악성 세포의 전이 능력은 암 치료에 대한 주요 장애 중 하나로 남아 있으며 IGF-1 수용체에 의해 가속화될 수 있다. 예컨대, 바하(Bahr) 등의 문헌[Growth Factors 23: 1-14, 2005]을 참고한다.
암 및 암 전이의 복잡성과 수년간 암 환자의 치료 실패를 바탕으로, 치료를 조언하고 전이 또는 재발에 대한 상기 치료의 효과를 모니터하는 진단 시험을 개발하려는 많은 시도가 있어왔다. 이러한 시험은 아마도 암 선별을 위해 또한 사용될 수 있으며, 비교적 거친 시험, 예컨대 유방 종양에 대한 유방조영술 또는 전립선암에 대한 직장 수지 검사를 대체할 수 있다.
IGF-1 및 IGF-1R의 특정 암과의 관계에 관한 지식에 비추어, 순환 종양 세포의 개수 및 그들의 IGF-1R 발현에 대한 항-IGF-1R 항체의 효과뿐만 아니라 상기 항체의 임상 효능를 평가하는 연구가 착수되었다. 현재, 암의 진단과 치료에 유용하고 CTC와 관계된 종래 기술의 방법보다 뛰어난 IGF-1R을 발현하는 순환 종양 세포(IGF-1R-양성 CTC)를 검출하고 산출하기 위한 분석이 개발되었다. 이 분석은 IGF-1 수용체의 생물학적 기능을 보다 더 이해하는데 도움이 될 수 있다. 예를 들면, 상승된 IGF-1R 수준이 종양 세포 침습성/전이성 표현형을 일으키는데 필요한 것으로 가정되어 왔지만, IGF-1R 발현 수준과 전이 잠재성 간의 관계는 아직까지 완전하게 밝혀지지 않았다. 현재, 급격한 질병의 진행에 의해 증명되는 바와 같이 높은 IGF-1R-양성 CTC 개수를 갖는 환자가 보다 더 공격적인 종양을 갖는 것으로 보임이 밝혀졌다. 따라서, 증가된 IGF-1R 발현과 전이 잠재성 간의 잠재적인 관계는 나쁜 결과 및/또는 치료 간섭의 예언자로서 IGF-1R-양성 CTC의 검출에 대한 기초가 될 수 있다.
먼저, 본 발명의 CTC-IGF-1R 분석 방법은 종양의 초기 검출 또는 진단을 확인하는데 유용하다. 또한, 이는 예후를 평가하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 치료 계획에 유용하다. 치료 전에 IGF-1R-양성 순환 종양 세포를 갖는 환자가 그렇지 않은 환자보다 IGF-1R 길항제 치료에 보다 더 반응하기 쉬운 것으로 밝혀졌다. 임의의 치료를 시작하기 전에 IGF-1R-양성 항체에 대해 환자를 선별함으로써, IGF-1R 길항제 치료에 가장 잘 반응할 것 같은 개체군을 미리 선택하고 그에 따라 치료 섭생을 계획할 수 있다. 항-IGF-1R 항체의 생체지표로서 CTC-IGF-1R 분석의 잠재적인 용도는 최적 생물학적 투여량, 투여량 및 치료 섭생 선택의 확인 및 치료 기간의 결정을 포함할 수 있다.
혈중 IGF-1R-양성 CTC의 수준의 변화와 화학요법 및 임상 상태 간에 양호한 상관성이 있음이 밝혀졌다. 이러한 상관성에 비추어, 본 발명의 분석 방법을 사용하여 치료 또는 질병 진행에 대한 환자의 반응을 또한 평가할 수 있다. 순환 종양 세포 상의 IGF-1 수용체의 측정치는 실제 약역학(PD) 종료점을 제공한다. 치료가 시작되면, 종양 세포 상의 IGF-1R의 측정치를 사용하여 최대 내성 용량(MTD)에 도달하지 않으면서 표적의 최대 억제에 도달했는지를 결정할 수 있다. 또한, 주어진 치료에 대한 내성의 발생을 모니터할 수 있다. 본 발명의 추가의 이점은 전통적인 수단에 의한 것보다 CTC를 측정함으로써 보다 자주 약물 효과를 결정할 수 있다는 것이다.
마지막으로, 본 발명의 방법은 또한 심지어 임상 징후의 부재하에서도 종양의 재발을 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 유방암, 전립선암, 난소암, 폐암 및 결장암, 특히 비-소세포폐암(NSCLC) 및 호르몬-불응 전립선암(HRPC)을 포함한 비-혈액학적 악성종양의 진단 및/또는 치료와 관련하여 사용될 수 있다.
다수의 종양 유형을 갖는 환자의 선별은 CTC 및 IGF-1R-양성 CTC가 HRPC 환자에서 빈번하게 검출됨을 가리킨다. HRPC에서 이들 세포의 식별은 예후 또는 치료적 암시를 가질 수 있다. 사실상, 선행 연구에서 CTC의 존재는 HRPC 환자에서 생존을 예측하는 가장 중요한 파라미터인 것으로 밝혀졌다(모레노(Moreno) 등의 문헌[Urology 65: 713-718, 2005]). 다수의 연구가 전립선암의 발생에 있어 IGF-1R의 역할을 성립시켰고, 시험관내 데이터는 증가된 IGF-1R 발현 및/또는 활성이 호르몬 불응 표현형에 대한 진행과 관련됨을 암시하였다(헬라우웰(Hellawell) 등의 문헌[Cancer Res ., 62: 2942-2950, 2002]; 쵸트(Chott) 등의 문헌[Am . J. Pathol . 155: 1271-1279, 1999]). 본원에 기재된 하나의 연구에서, IGF-1R 양성인 것으로 생각되는 HRPC 환자(즉, 하나 이상의 IGF-1R-양성 CTC가 검출됨)는 검출할 수 있는 CTC가 없는 환자보다 더 높게 기재된 혈청 PSA의 평균 수준을 갖는다. 또한, PSA 수준 및 CTC와 IGF-1R-양성 CTC 개수는 치료 반응 또는 질병 진행 동안 동시에 변한다. 진행성 전이 HRPC를 갖는 환자는 초기 질병 그룹에서의 것보다 상당히 높은 CTC 개수를 가지며, 도세탁셀로 초기 치료 후 1주에 CTC 개수의 하락은 두 명의 환자에서 보고된 것으로 이미 밝혀졌다(모레노 등의 상기 2005년의 문헌). 그러나, 환자 모두는 도세탁셀의 추가 투여에도 불구하고 CTC 개수 및 PSA 수준의 상승을 보이면서 진행되었다. 본원에 기재된 연구는 오직 일관된 CTC 개수의 감소가 HRPC의 치료에 반응하는 것과 관련 있음을 암시한다. 따라서, CTC 개수는 PSA 수준의 것과 무관한 예후 정보를 제공할 수 있다. 중요하게는, 임상 전 데이터는 항-IGF-1R 치료에 반응하는 PSA의 변화가 전립선 종양 성장의 변화를 초래함을 보여준다(우(Wu) 등의 문헌[Clin . Cancer Res . 11 : 3065-3074, 2005]).
또한, 병용된 항-IGF-1R 항체 및 도세탁셀의 치료에 대한 반응자의 비율은 연구 참가시에 검출될 수 있는 IGF-1R-양성 CTC를 갖는 환자가 이들 세포가 검출되지 않는 환자보다 더 높은 것으로 밝혀졌다. 추가로, 임상 이점과 반드시 관련될 필요는 없는(예컨대, 페트리락(Petrylak) 등의 문헌[J. Nat'l Cancer Inst . 98: 516-521 , 2006]을 참고) 만기 반응은 IGF-1R-CTC 음성 환자에서 볼 수 있었다. 이들 데이터는 항-IGF-1R 치료로부터 이로울 수 있는 HRPC 환자의 확인을 위한 IGF-1R CTC 산출의 잠재적인 용도를 암시하고 있다.
본 발명의 방법은 IGF-1R 신호를 억제하는 다양한 화학 치료적 화합물에 의한 치료를 계획 및/또는 모니터하는데 사용할 수 있다. 미국 특허 제 7,037,498 호 및 미국 특허 출원 공개 제 2005/0069539호에 기재된 것과 같은 항-IGF-1R 항체가 특히 바람직하다. 다른 바람직한 항-IGF-1R 항체는 F-50035 및 MK-0646(피에르 페브레(Pierre Fabre)/머크(Merck)); 19D12(슈어링-플라우(Schering-Plough)); R1507(로슈(Roche)/젠맙(Genmab)); EM-164/AVE-1642(이뮤노겐(Immunogen)/사노피-아벤티스(Sanofi-Aventis)); IMC-A12(임클론 시스템스(ImClone Systems)); AMG479(암겐(Amgen)) 뿐만 아니라 국제 특허 출원 공개 제 WO2006/069202 호, 미국 특허 출원 공개 제 2005/0147612 호, 미국 특허 출원 공개 제 2005/0084906 호, 미국 특허 출원 공개 제 2005/0249730 호, 미국 특허 출원 공개 제 2004/0018191 호, 미국 특허 출원 공개 제 2005/0136063 호, 미국 특허 출원 공개 제 2003/0235582 호, 미국 특허 출원 공개 제 2004/0265307 호, 미국 특허 출원 공개 제 2004/0228859 호, 미국 특허 출원 공개 제 2005/0008642 호, 유럽 특허 출원 공개 제 1622942 호, 미국 특허 출원 공개 제 2003/0165502 호 및 미국 특허 출원 공개 제 2005/0048050호에 기재된 항체를 포함한다.
본 발명과 함께 사용하기에 적합한 다른 분자 종류는 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 펩타이드 압타머(aptamer), 안티센스 올리고뉴클레오타이드 IGF-1R 조절제 및 소분자 IGF-1R 억제제를 포함한다. 바람직한 소분자 IGF-1R 억제제는 OSI-906(OSI 파마슈티컬스(OSI Pharmaceuticals)); AEW-541(노바티스(Novartis)); BMS-536924 및 BMS-554417(브리스톨-미어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)); INSM-18(인스메드(Insmed)); AG-1024(화이자(Pfizer)); XL228(엑셀리식스(Exelixis)), 피크로포도필린, 및 국제 특허 출원 공개 제 WO2004/043962 호 및 제 WO2004/054996 호에 개시된 것들을 포함한다.
하기에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 환자 샘플로부터 특정 항원 반응성 부위를 갖는 세포의 선택적 제거를 포함한다. 이러한 선택적 제거를 위한 방법 및 장치는 당해 분야의 숙련자에게 널리 알려져 있다. 예컨대, 미국 특허 제 4,551,435 호, 제 4,795,698 호, 제 4,925,788 호, 제 5,108,933 호 및 제 5,200,084 호 및 미국 특허 출원 공개 제 2004/0157271 호를 참조한다. 바람직한 실시양태에서, 관심있는 세포는 액체자석(ferrofluid)을 사용하여 환자 샘플로부터 면역자기적으로 단리된다. 액체자석은 자석 또는 자기장에 의해 흐름이 조절될 수 있는 콜로이드성 현탁액 중에 작은 자기 입자를 함유한다.
본 발명을 보다 더 이해할 수 있도록, 하기 실시예를 기재하였다. 이들 실시예는 오직 예시를 목적으로 하며, 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주해서는 안된다.
본원발명의 방법을 사용하면 환자에서 IGF-1R 길항제 치료의 효능을 예측하거나, IGF-1R 길항제 치료의 효능을 모니터링 하거나, 또는 IGF-1R 발현 순환 종양 세포의 존재에 대해 환자의 샘플을 스크리닝할 수 있다.
도 1은 다양한 세포주의 IGF-1R-피코에리트린 염색의 중첩된 히스토그램이다.
도 2는 표지된 MCF-7 유방암 세포(패널 A) 및 T-24 방광 세포(패널 B)의 모아진 형광 현미경 영상이다.
도 3은 잠재성 순환 종양 세포의 모아진 형광 현미경 영상이다.
도 4는 순환 종양 세포, 및 항-IGF-1R 항체로 치료받은 4명의 환자의 IGF-1R-양성 순환 종양 세포의 총 개수를 나타내는 그래프이다.
도 5는 순환 종양 세포, 및 도세탁셀과 병용하여 항-IGF-1R 항체로 치료받은 4명의 환자의 IGF-1R-양성 순환 종양 세포의 총 개수를 나타내는 그래프이다.
도 6은 순환 종양 세포, 및 파클리탁셀 및 카보플라틴과 병용하여 항-IGF-1R 항체로 치료받은 4명의 환자의 IGF-1R-양성 순환 종양 세포의 총 개수를 나타내는 그래프이다.
본원에 기재된 실시예에서, 혈액 샘플을 다수의 지리학적 위치에서 인간 대상으로부터 취하여, 세포 형태 및 세포 표면 항원 발현을 보존하기 위해 세포 보존제를 함유하는 10ml 혈액 인출 튜브를 배기시킨, CELLSAVE 보존제 튜브(CELLSAVE Preservative Tube)(미국 펜실베니아주 헌팅돈 밸리 소재의 이뮤니콘(Immunicon))로 넣었다. 샘플을 실온에서 유지시키고 혈액 수집 72 시간 내에 상기 기재한 바와 같이 처리하였다.
방사성으로 고형 종양에서의 반응 평가 기준(RECIST)(테라세(Therasse) 등의 문헌[J. Nat'l Cancer Inst . 92: 205-216, 2000]을 참고)을 사용하거나 또는 HRPC 환자에서 전립선 특이적 항원 작용 그룹(PSAWG) 기준(버블리(Bubley) 등의 문헌[J. Clin. Oncol . 17: 3461-3467, 1999]을 참고)을 사용하여 치료에 반응하는 환자를 평가하였다.
실시예 1
IGF -1R 순환 종양 세포 분석의 전개
세포 배양 및 세포 스파이킹 ( spiking ): 유방암 세포주 MCF-7, 전립선 세포주 PC3-9, 방광 세포주 T-24 및 조혈 세포주 CEM을 10% FCS가 보충된 RPMI-1640 세포 배양 배지를 함유하는 플라스크에서 배양하고 이어서 트립신을 사용하여 수확하였다. 세포 현탁액은 트립판 블루 배제법에 의해 평가되는 그의 생존력이 90% 초과하는 경우에만 사용하였다. 실제 세포수를 결정하기 위해, 50㎕의 세포 분취량을 삼투화하였고 0.5㎍/ml의 최종 농도에서 피코에리트린(PE)에 접합된 0.05% 사포닌 및 10㎕ 항-사이토케라틴 단클론 항체를 함유하는 200㎕ PBS를 첨가함으로써 형광성으로 표지하였다. 실온에서 15분 배양 후에, 200㎕의 완충제 및 대략 20,000 총 비드를 함유하는 20㎕의 형광성 비드(미국 플로리다주 마이애미 소재의 베크만-코울터, 인코포레이티드(Beckman-Coulter, Inc.))를 첨가하였다. 오직 비드만을 함유하는 한 쌍의 튜브를 유식 세포 분석기(FACSCalibur, 미국 캘리포니아주 샌어제이 소재의 비디 바이오사이언스(BD Biosciences)) 상에서 실행시켰다. 이는 20㎕에 존재하는 비드의 개수를 정확히 추정한다. 그 후, 10,000 비드가 각각의 튜브에서 계수될 때까지 실험 튜브를 유식 세포 분석기 상에서 3회 시험하였다. 공지된 단위 부피 당 비드의 개수를 사용하여, 세포 농도를 결정하였다. IGF-1R 검출에 있어서 스파이킹된 세포 수가 혈액 7.5ml 중에 130 내지 220개인 것으로 추정되었다.
CTC 의 단리 및 산출: 혈액으로부터 세포를 단리하기 위한 샘플을 준비하고, CELLTRACKS AUTOPREP 시스템, 시약 키트 및 CELLSPOTTER 분석기로 이루어진 CELLTRACKS 시스템(미국 펜실베니아주 헌팅돈 밸리 소재의 이뮤니콘)을 사용하여 분석하였다. CELLTRACKS AUTOPREP 시스템은 희박한 세포 검출을 위한 자동화된 샘플 준비 시스템이다. 시약 키트는 면역자기적으로 풍부한 세포에 대한 항체로 코팅된 액체자석, 형광성으로 접합된 항체(각각 상피 세포 및 백혈구를 표지하기 위해 PE 및 알로피코사이아닌(APC)에 접합된 항체)의 칵테일, 핵 염료 및 세포를 세척, 삼투화 및 재현탁시키기 위한 완충제로 구성된다. 암종 세포의 검출을 위해, 7.5ml의 혈액을 종양-관련 항원-EpCAM(상피 세포 부착 분자 또는 상피 세포 표면 항원)에 대해 향하는 항체로 코팅된 액체자석과 혼합하였다. 면역자기적 풍부화후에, 사이토케라틴 4, 5, 6, 8, 10, 13, 18 및 19를 인식하는 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC)-표지된 항체, 백혈구 항원 CD45를 인식하는 APC-표지된 항체, IGF-1R을 인식하는 PE-표지된 항체 및 핵산 염료 4',6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 삼투화 완충제와 함께 첨가하여 면역자기적으로-표지된 세포를 형광성으로 표지하였다. 시스템 상에서 배양 후에, 자기 분리를 반복하였고 과량의 염색 시약을 흡인시켰다. 최종 처리 단계에서, 세포를 MAGNEST 세포 표시 장치(미국 펜실베니아주 헌팅돈 밸리 소재의 이뮤니콘)에서 재현탁시켰다. 이 장치는 챔버 및 형광 현미경을 사용한 분석을 위해 면역자기적으로-표지된 세포로 향하는 두 개의 자석으로 구성된다.
MAGNEST를 CELLSPOTTER 분석기, 즉 4가지 색의 반자동 형광 현미경에 놓았다. 4개의 형광 필터 큐브 각각의 카트리지의 전체 표면을 덮는 영상 프레임을 포착하였다. 소정의 기준을 만족하는 대상을 함유하는 포착된 영상이 웹-가능한 브라우저(세포의 최종 선택은 작동자에 의해 이루어짐)에서 자동적으로 나타났다. CTC로서 정의되는 대상에 대한 기준은 둥근 형태 내지 타원 형태, 육안으로 보이는 핵(DAPI 양성), 사이토케라틴에 대한 양성 염색 및 CD45의 발현 결여(음성 CD45-APC 염색에 의해 결정됨)를 포함한다. 세포 산출 결과는 혈액 7.5ml 당 세포의 개수로서 항상 표현하였다.
종양 세포주에 대한 IGF -1R 항체의 선택 및 IGF -1R의 검출: 항-IGF-1R 항체 1H7(PE 접합물, 미국 캘리포니아주 샌어제이 소재의 비디 바이오사이언스) 및 33255.111(미국 미네소타주 미니애폴리스 소재의 알엔디 시스템스(R&D Systems))을 유방암 세포주 MCF-7 세포로부터의 세포 상에 적정하였다. 교차 차단 실험은 이들 항체가 IGF-1R의 상이하고 비경쟁적인 항원결정인자에 결합함을 암시하는 억제가 없음을 증명하였다. CP-751,871 인간 항-IGF-1R 항체에 의한 교차 차단 실험(화이자 인코포레이티드, 미국 특허 출원 제 7,037,498 호를 참고)은 항체 33255.111이 CP-751,871의 필수적인 등몰량에 의해 완전하게 결합 세포로부터 차단되었음을 보여주었다. 반면에, 1H7 항체는 CP-751,871의 존재하에 결합 억제가 없음을 보여주었다. 이러한 데이터는 33255.111 및 CP-751,871이 동일하거나 관련된 항원결정인자 중 어느 하나에 결합함을 증명한다. IGF-1R에 대한 1H7 항체의 결합이 CP-751,871의 존재하에 차단되지 않기 때문에, 1H7을 추가 평가를 위해 선택하였다.
PE-표지된 항-IGF-1R 항체 1H7로 염색한 후 유식 세포 분석기로 분석하여 조혈 세포주 CEM, 전립선암 세포주 PC3-9, 방광 세포주 T-24 및 MCF-7 유방암 세포주 상의 항원 밀도를 평가하였다.
도 1은 세포주의 IGF-1R-PE 염색의 중첩된 히스토그램을 도시하고 있다. CEM 세포의 염색은 대조군의 것과 유사하고, 따라서 IGF-1R 밀도는 검출 한계 미만이다. PC3-9 세포의 IGF-1R-PE 염색은 배경으로부터 분리될 수 있고, T24 및 MCF-7 세포는 명백하게 보다 더 밝은 염색을 가졌다. 항원 밀도의 평가는 공지된 수의 PE 분자를 갖는 비드에 의해 유식 세포 분석기를 보정하여 얻었다. PC3-9 세포 상의 IGF-1R 밀도는 대략 10,000 IGF-1R 항원이었고, T24 세포 상의 밀도는 대략 50,000 IGF-1R 항원이었고, MCF-7 세포 상의 밀도는 대략 1,000,000 IGF-1R 항원이었다.
IGF -1R 분석 특성화: CELLTRACKS 시스템을 사용하는 표준 CTC 분석은 상피 기원의 세포 상에 존재하는 사이토케라틴의 검출을 위해 PE를 사용하고, 조혈 기원의 세포 상에 존재하는 CD45의 검출을 위해 APC를 사용하고, 사이토케라틴-양성, CD45-음성 핵화된 세포로서 정의된 CTC 상의 분석물 특이적 시약의 검출을 위해 FITC를 사용하였다. FITC-표지된 항체를 갖는 항원의 검출을 위한 CELLSPOTTER 분석기의 현행 검출 한계는 대략 세포 당 100,000 항원이다. 이러한 민감도를 증가시키기 위해, IGF-1R 검출을 위한 검출 한계를 낮추도록 CTC 분석을 재구성하였다. 상피 세포 상에서 높은 밀도로 발현되는 사이토케라틴을 FITC로 표지시켰으며, 이는 PE-표지된 항-IGF-1R 항체의 사용을 허용하였다. 별도의 실험에서, 130 내지 200 PC3-9, T-24 또는 MCF-7 세포를 7.5ml의 혈액 중에 스파이킹하고, 새롭게 구성된 염색 시약으로 제조하였다. 제조 후에, 샘플을 CELLSPOTTER 분석기 상에서 스캐닝하였다. 분석기는 사이토케라틴 FITC-양성, 핵화된 DAPI-양성 사건이 CTC 후보자로서 사용자에게 보여지도록 재구성되었다.
도 2의 패널 A에는, 7.5ml의 혈액으로부터 회수된 전형적인 MCF-7 세포의 예가 도시되어 있다. 가장 윗줄은 IGF-1R 수용체를 명백하게 발현한 3개의 MCF-7 세포의 군집을 보여주며, 복합 영상 옆의 체크 표시는 작동자가 세포를 CTC로서 분류하였음을 나타내고, IGF-1R 염색을 보여주는 영상 옆의 체크 표시는 작동자가 이러한 CTC를 IGF-1R을 발현한 것으로서 분류하였음을 나타낸다. 패널 A에서 보여진 모든 세포는 IGF-1R 수용체를 명백하게 발현하였다. MCF-7 세포로 스파이킹된 16명의 건강한 개체로부터의 혈액에서, 회수된 MCF-7 세포의 80.6%(SD7.7)는 IGF-1R을 발현한 CTC로서 분류되었다. 도 2의 패널 B에는, 7.5ml의 혈액으로부터 회수된 전형적인 T-24 세포의 예가 도시되어 있다. 4개의 T-24 세포의 IGF-1R의 발현은 MCF-7 세포의 IGF-1R 염색과 비교할 경우 명백하게 더 흐렸으며, 작동자는 오직 아래의 두 개의 세포 만을 IGF-1R 수용체를 발현한 CTC로서 분류하였다. T-24 세포로 스파이킹된 6명의 건강한 개체로부터의 혈액에서, 회수된 MCF-7 세포의 13.6%(SD3.9)는 IGF-1R을 발현한 CTC로서 분류되었다. PC3-9 세포로 스파이킹된 6명의 건강한 개체로부터의 혈액에서, 회수된 MCF-7 세포의 3.8%(SD6.0)는 IGF-1R을 발현한 CTC로서 분류되었다.
이러한 데이터는 이 분석에 의해 검출될 필요가 있는 전이성 암종을 갖는 환자의 CTC 상의 IGF-1R 항원 밀도에 대한 지침서를 제공한다.
전이성 암종에서 CTC 상의 IGF -1R 발현: 139명의 건강한 개체로부터의 혈액 7.5ml에서, CTC는 실질적으로 없었다(135 중 0 CTC 및 4 중 1 CTC). IGF-1R이 실제로 전이성 암종을 갖는 환자의 CTC에서 검출되는지 여부를 시험하기 위해, 50명의 환자로부터의 혈액 샘플을 시험하였다. 7.5ml의 혈액에서, CTC는 50명의 환자 중 11명에서(22%) 검출되었다. 이들 50명의 환자 중 18명은 유방암을 가졌고 28%의 CTC에서 검출되었으며, 13명은 직장결장암을 가졌고 31%의 CTC에서 검출되었으며, 3명은 전립선암을 가졌고 33%의 CTC에서 검출되었고, 12명은 폐암을 가졌고 8%의 CTC에서 검출되었고, 난소암을 갖는 4명의 환자에서 CTC는 검출되지 않았다. 검출된 CTC의 예가 도 3에 도시되어 있다. 8개의 CTC 후보자가 도면에 도시되어 있다. 사건 1, 4, 5, 7 및 8은 CTC로서 분류되었으며, 오직 첫 번째 및 4번째 줄의 CTC만이 IGF-1R을 발현한 CTC로서 분류되었다. 잠재성 IGF-1R 염색이 5번째 줄 및 7번째 줄의 CTC에서 관찰되었지만 이는 IGF-1R 양성 CTC로서 분류되기에 충분한 것으로 고려되지 않았음을 주목한다. 하기 표 1은 CTC를 갖는 11명의 환자에서 검출된 CTC의 개수, IGF-1R을 발현한 CTC의 개수 및 IGF-1R을 발현하는 CTC의 비율을 보여준다. 11명의 환자 중 8명에서(91%), CTC는 IGF-1R을 발현한 것으로 검출되었다. 그러나, IGF-R을 발현한 CTC의 비율은 매우 달랐다.
CTC IGF-1R(+) CTC IGF-1R(+) CTC(%)
유방 180 47 26
25 11 44
5 1 20
4 1 25
직장결장 6 1 17
5 0 0
4 0 0
2 0 0
1 1 100
전립선 16 1 6
폐 2 1 50
실시예 2
항- IGF -1R 항체의 임상 제 1 상 투여량-발견 연구에서 CTC 상의 IGF -R 발현
연구 1은 진행성 고형 종양을 갖는 환자에서 미국 특허 제 7,037,498 호에 기재된 바와 같이 완전 인간 항-IGF-1R 항체의 안정성 및 내성을 한정하도록 고안된 투여량-발견 임상 제 1 상 연구였다. 이 연구에서, 항-IGF-1R 항체 치료는 3 내지 20mg/kg의 투여량에서 매 21일마다(21일 주기) 주어졌다. 이 환자에서 CTC 및 IGF-1R을 발현하는 CTC의 개수에 대한 항-IGF-1R 항체에 의한 치료 효과를 평가하기 위해, 혈액 샘플을 매 21일 치료 주기의 투여-전 1일의 선별시 및 8일째의 연구시에 인출하였다. 질병의 진행으로 인해 환자가 연구에서 빠질 때마다 하나의 추가의 샘플을 취하였다. 26명의 환자에게서 이 연구 과정 중 CTC의 산출을 위한 혈액 샘플을 제공받았다.
26명의 환자 중 16명(61%)은 연구 중에 몇몇 지점(투여-전 또는 치료 중)에서 하나 이상의 CTC를 가졌다. 연구 중 몇몇 지점에서 검출된 CTC를 갖는 16명의 환자 중 3명에서 어떠한 IGF-1R-양성 CTC도 검출되지 않았다. 두 가지 경우에서, 오직 하나의 CTC만이 7.5ml의 혈액 중에서 검출되었다. CTC 및 IGF-1R-양성 CTC의 수준을 시간에 대해 플롯팅하였고, 항-IGF-1R 항체 치료에 반응하는 몇몇 패턴이 관찰되었다. 4개의 실험을 도 4에 도시하였다. 패널 A에는, 항-IGF-1R 항체 6mg/kg의 단일 투여에 의해 치료받은 환자로부터의 CTC 개수가 도시되어 있다. 이 환자에서, CTC와 IGF-1R-양성 CTC의 개수는 항-IGF-1R 항체에 의한 치료 8일에 감소되었고 주기 2의 시작 전 재출현할 때까지 15일째에 더 이상 검출되지 않았다. 패널 B에는, 항-IGF-1R 항체 10mg/kg의 단일 투여에 의해 치료받은 환자로부터의 CTC 개수가 도시되어 있다. 치료 8일 및 15일 후에 CTC의 약간의 감소 후, CTC 및 IGF-1R-양성 CTC의 개수가 환자가 연구에서 벗어날 때까지 증가하였다. 이 환자는 CT 스캔에 의해 질병 진행을 보여주었다. 패널 C에는, 항-IGF-1R 항체 20mg/kg의 단일 투여에 의해 치료받은 환자로부터의 CTC 개수가 도시되어 있다. CTC 및 IGF-1R-양성 개수는 투여량의 투여 후 15일에 CTC 스파이크를 제외하고는 영향을 받지 않았다. 패널 D는 항-IGF-1R 항체 3mg/kg의 단일 투여에 의해 치료받은 환자로부터의 CTC 개수가 도시되어 있으며, 거의 모든 검출된 CTC는 IGF-1R을 발현하였다. CTC의 증가는 환자가 연구에서 벗어날 시기에 주목되었다. 이러한 데이터의 한 가지 가능한 해석은 이들 환자에서 가장 많은 순환 종양 세포가 IGF-1R을 발현하고 항-IGF-1R 항체에 의한 치료가 CTC의 보존에 필요한 생존 신호를 차단하는 것으로 보인다는 것이다. 다르게는, 항-IGF-1R 항체의 효과가 종양 덩어리에서 직접적으로 발생할 수 있으며, CTC의 이동을 억제한다.
변이성에도 불구하고, 치료 주기의 말기까지 순환 세포의 개수의 반동뿐만 아니라 CTC 및 IGF-1R-양성 CTC 개수의 투여-후 감소가 관찰되었다. 또한, CTC 및 IGF-1R-양성 CTC 개수의 증가는 연구-후 추적 조사 시찰시에 주목되었다. 이러한 데이터는 항-IGF-1R 항체에 대한 생물학적 및 임상학적 반응을 모니터하는데 있어 CTC 및 CTC-IGF-1R 분석의 역할을 입증한다.
실시예 3
도세탁셀과 병용한 항- IGF -1R 항체의 연구에서 CTC 상의 IGF -1R 발현
연구 2는 진행성 고형 종양을 갖는 환자에서 도세탁셀(TAXOTERE)과 병용하여 미국 특허 제 7,037,498 호에 기재된 바와 같은 완전 인간 항-IGF-1R 항체의 임상 제 1b 상 투여량-발견 연구였다. 도세탁셀 및 항-IGF-1R 항체를 각각 75mg/m2 및 0.1 내지 10mg/kg의 투여량으로 1일 및 22일에 투여하였다. 19명의 호르몬-불응 전립선암(HRPC) 환자를 포함한 27명의 환자에게서 CTC의 산출을 위한 혈액 샘플을 제공받았다. CTC 샘플을 각각의 주기마다 투여-전 1일 및 8일에 모았다.
27명의 환자 중 19명(70%)은 연구 중 몇몇 지점에서 하나 이상의 CTC를 가졌다. 연구의 몇몇 지점에서 CTC가 검출된 19명의 환자 중 오직 1명에서만, IGF-1R-양성 CTC가 검출되지 않았다. 흥미롭게도, 이 환자의 모든 5개의 CTC 평가에서 CTC는 검출되었고, IGF-1R-양성 CTC는 검출되지 않았으며, 이는 이 환자의 종양 부위 자체가 IGF-1R을 발현할 수 없음을 시사한다.
치료에 반응하는 CTC 개수의 감소는 대부분의 환자에서 관찰되었다. CTC 및 IGF-1R-양성 CTC의 수준을 시간에 대해 플롯팅하였고, 항-IGF-1R 항체 치료에 반응하는 몇몇 패턴이 관찰되었다. 4개의 실험을 도 5에 도시하였다. 패널 A는 항-IGF-1R 항체 10mg/kg 및 도세탁셀 75mg/m2에 의해 치료받은(21일 주기) 호르몬 불응 전립선암 환자에서 CTC 및 IGF-1R-양성 CTC의 개수가 도시되어 있다. 치료 후, CTC의 총 개수는 병용 치료에 대한 반응을 반영하면서 감소되었다. 이 환자로부터 얻은 PSA 값은 치료에 대한 임상 반응을 확인하였다. 또한, 이 환자에서 대략 50%의 CTC는 처음에는 항-IGF-1R 항체/도세탁셀 치료 전 IGF-1R-양성이었고, IGF-1R-양성 CTC의 개수가 치료에 따라 빠르게 감소되었다. 항-IGF-1R 항체의 생물학적 효과가 IGF-1R 하향 조절을 유도하기 때문에, 이들 데이터는 항-IGF-1R 항체의 임상학적 및 생물학적(생체지표) 활성 둘 다를 모니터하는데 있어 CTC 및 CTC-IGF-1R 분석의 잠재적인 역할을 입증한다. 패널 B는 CTC 및 IGF-1R 양성 CTC의 개수가 유사하게 감소된 환자를 보여주고 있다. 패널 C 및 D는 CTC 및 IGF-1R-양성 CTC의 개수가 각각의 투여 후 감소되지만 매번 다시 반동되는 두 명의 환자를 보여주고 있다. 모든 환자는 낮은 투여량(각각 0.8 및 3mg/kg)의 항-IGF-1R 항체로 치료받았다.
연구 2에서 등록된 등록시 하나 이상의 검출될 수 있는 IGF-1R-양성 CTC를 갖는 HRPC 환자는 IGF-1R-CTC 음성인 환자(n=8, 평균 PSA 92ng/ml)보다 더 높은 PSA 수준(n=10, 평균 PSA 475ng/ml)을 가졌다. 분실된 샘플로 인해 두 명의 환자에서 어떠한 평가도 할 수 없었다. 명백히 보다 높은 종양 존재량에도 불구하고, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 등록시 IGF-1R-CTC 양성인 환자는 보다 높은 비율(10분의 6)로 그리고 전체적으로 IGF-1R-CTC 음성(8분의 2)인 환자보다 도세탁셀 및 항-IGF-1R 항체의 병용에 더 빠르게 PSA 기준만큼 반응하였다.
치료에 반응하는 HRPC 환자 기준치 PSA(ng/ml) 기준치 CTC 기준치 IGF-1R(+) CTC 초기 PSA 반응의 치료 주기
1006 238 2 1 3회
1008 471 4 1 12회
1014 9944 12 5 2회
1019 617 44 19 3회
1022 1639 6 2 1회
1025 807 160 37 1회
1003 13 0 0 6회
1011 131 0 0 12회
연구 참가시 검출될 수 있는 CTC를 갖지 않는 8명의 HRPC 환자 중에서, 6명은 치료에 반응하지 않았으며, 이들 중 3명은 질병의 진행시에 실제로 CTC 및 IGF-1R-양성 CTC 개수의 증가를 경험하였다. 마지막으로, 검출될 수 있는 CTC를 갖지만 검출될 수 있는 IGF-1R-양성 CTC를 갖지 않는 도세탁셀 및 항-IGF-1R 항체로 치료받은 1명의 HRPC 환자는 병용 치료에 반응하지 않았다. 그 환자의 CTC 개수의 감소는 또한 오래가지 못하였다(1 주기).
하기 표 3에는, 연구 2에서 HRPC 환자에 대한 환자 최적 반응의 개요를 나타내고 있다. 치료 억제 전 7.5ml 중에 검출될 수 있는 IGF-1R-양성 CTC를 갖지 않는 8명의 환자 중 2명(25%)은 치료에 대한 부분적인 반응을 보인 반면, 7.5ml 중에 1이상의 IGF-1R-양성 CTC를 갖는 11명의 환자 중 6명(25%)은 부분적인 반응을 보였다. 이러한 데이터는 CTC-IGF-1R 분석을 사용하여 최적 투여량을 식별하고 치료 기간을 결정할 뿐만 아니라 항-IGF-1R 항체 치료에 의해 이점을 가질 수 있는 환자를 식별할 수 있다는 생각을 강하게 입증한다.
연구 2에서 IGF-1R-양성 순환 종양 세포 및 환자 최적 반응
환자 기준치에서 IGF-1R(+) CTC (n) 최적 반응
1001 2 PD
1005 2 SD
1006 1 PR
1008 1 PR
1012 31 PD
1013 4 PD
1014 5 PR
1019 19 PR
1021 4 PD
1022 2 PR
1025 37 PR
총 = 6 PR/11명의 환자
PD: 진행성 질병; SD: 안정성 질병; PR: 부분적인 반응
환자 기준치에서 IGF-1R(+) CTC (n) 최적 반응
1002 0 SD
1003 0 PR
1010 0 PD
1011 0 PR
1015 0 SD
1016 0 PD
1018 0 SD
1020 0 SD
총 = 2 PR/8명의 환자
PD: 진행성 질병; SD: 안정성 질병; PR: 부분적인 반응
실시예 4
파클리탁셀 및 카보플라틴과 병용한 항- IGF -1R 항체의 연구에서 CTC 상의 IGF-1R 발현
연구 3은 진행성 고형 종양을 갖는 환자에서 파클리탁셀(TAXOL) 및 카보플라틴(PARAPLATIN)과 병용하여 미국 특허 제 7,037,498 호에 기재된 바와 같은 완전 인간 항-IGF-1R 항체의 임상 제 1b 상 연구였다. 파클리탁셀, 카보플라틴 및 항-IGF-1R 항체의 투여량은 각각 200mg/m2, 6 AUC 및 0.05 내지 10mg/kg이었다. 41명의 환자에게서 CTC의 산출을 위한 혈액 샘플을 제공받았다. 혈액 샘플을 각각의 주기마다 투여-전 1일 및 8일에 모았다.
41명의 환자 중 21명(51%)은 연구 중 몇몇 지점에서 하나 이상의 CTC를 가진 반면, 41명의 환자 중 10명(24%)은 제 1 투여량을 투여하기 전에 하나 이상의 CTC를 가졌다. 41명의 환자 중 16명(39%)은 연구 중 몇몇 지점에서 하나 이상의 IGF-1R-양성 CTC를 가진 반면, 41명의 환자 중 8명(20%)은 제 1 투여량을 투여하기 전에 하나 이상의 IGF-R-양성 CTC를 가졌다. 연구에 등록된 1명의 HRPC 환자는 연구 참가시 많은 수의 CTC를 가졌고(71개의 CTC 및 15개의 IGF-1R-양성 CTC), 이는 치료에 반응하여 감소되었다(치료 21일째 21개의 CTC 및 2개의 IGF-1R CTC).
CTC 및 IGF-1R-양성 CTC의 수준을 시간에 대해 플롯팅하였고, 치료에 반응하는 몇몇 패턴이 관찰되었다. 4개의 실험을 도 6에 도시하였다. 패널 A는 매우 적은 수의 CTC를 갖는 연구에 참가한 환자로부터의 데이터를 나타낸다. 파클리탁셀/카보플라틴 및 항-IGF-1R 항체 0.05mg/kg에 의한 치료 6 주기에 이어서 추가로 항-IGF-1R 항체 3mg/kg의 2 주기 후, 환자는 더 이상 치료에 반응하지 않았다. 이러한 임상 반응의 결핍은 CTC 및 IGF-1R-양성 CTC 개수의 극적인 증가와 관련된다. 이 환자의 질병 진행을 CT 스캔에 의해 확인하였다. 패널 B에는, 연구 과정 중에 상승된 CTC 및 IGF-1R-양성 CTC의 유사한 패턴을 갖는 환자로부터의 데이터가 나타나있다. 패널 C 및 D에는, 치료의 개시 전에 CTC를 갖는 두 명의 환자가 예시되어 있다. 환자에게 각각 1.5 및 6mg/kg의 항-IGF-1R 항체를 접수시켰다. IGF-1R-양성 세포의 개수는 감소(패널 C)되거나 낮게 유지(패널 D)되는 것으로 보이면서, 환자는 항-IGF-1R 치료 중이었다. 추가로, 이들 데이터는 항-IGF-1R 항체 치료에 대한 효과 및 상기 치료에 대한 내성 발생을 모니터하는데 있어 CTC 및 CTC-IGF-1R 분석의 잠재적인 역할을 입증한다.
본 발명의 특정한 바람직한 실시양태가 본원에 기재되어 있지만, 본 발명의 범주 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 기재된 실시양태의 변형 및 개조가 이루어질 수 있음이 본 발명에 관련된 당해 분야의 숙련자에 의해 즉시 명백해질 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 응용할 수 있는 법에 의해 요구되는 정도로만 제한되는 것으로 의도된다.

Claims (1)

  1. (a) 환자의 샘플을 종양 세포와 특이적으로 반응하는 리간드와 혼합시켜 다른 샘플 성분이 실질적으로 배제된 샘플을 제조함으로써 종양 세포가 풍부한 세포 집단을 수득하는 단계;
    (b) 상기 종양 세포가 풍부한 세포 집단을 항-사이토케라틴 항체와 접촉시키는 단계;
    (c) 상기 종양 세포가 풍부한 세포 집단을 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGF-1R)에 대한 항체(항-IGF-1R 항체)와 접촉시키는 단계; 및
    (d) 항-사이토케라틴 항체 및 항-IGF-1R 항체 둘다에 의해 결합된 세포의 존재를 측정하는 단계를 포함하되,
    여기서, 상기 항체들 둘다에 의해 결합된 세포의 존재는 환자에서 IGF-1R 길항제 치료의 효능을 예측하는 것인,
    환자에서 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGF-1R) 길항제 치료의 효능을 예측하기 위해 환자의 샘플을 분석하는, 종양 세포에 특이적으로 반응하는 리간드, 항-사이토케라틴 항체 및 IGF-IR에 대한 항체의 용도.
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