KR20140084236A - 개선된 hcv 백신 및 이것을 사용하는 방법 - Google Patents

Abstract

개선된 항-HCV 면역원 및 이를 인코딩하는 핵산 분자가 개시된다. 개시된 면역원은 예를 들면, NS4B, NS5A 및 NS5B를 포함하는 공통 HCV 유전자형 1a를 갖는 것을 포함한다. 약제학적 조성물, 재조합 백신 및 약독화 생백신을 개시하고, 또한 HCV 에 대응하여 개체의 면역반응을 유도하는 방법을 개시한다.

Description

개선된 HCV 백신 및 이것을 사용하는 방법{IMPROVED HCV VACCINES AND METHODS FOR USING THE SAME}

본 발명은 개선된 HCV 항원 및 이로부터 만들어진 백신, 및 면역반응을 유도하는 개선된 방법, 및 개체를 HCV에 대해서 예방적 및/또는 치료학적으로 면역화시키는 개선된 방법에 관한 것이다.

출원인은 공동계류중 미국 특허 출원 번호 13/127,008 (2011년 4월 29일 출원)을 개시하고 있고, 그의 개시내용 각각은 참조로 포함되어 있다.

C형 감염 (HCV)은 전세계적인 주요 건강 부담을 현재 감염된 1억 7000만 명 초과의 개인에게 제공하는 작은 외피보유한, 양성 가닥 RNA 바이러스이다 [Thomson, B.J. and R.G. Finch, Hepatitis C virus infection. Clin Microbiol Infect, 2005. 11(2): p. 86-94]. 모든 인간 바이러스, HCV 중 가장 성공적인 것 중의 하나는 우선적으로 간세포를 감염시키고 모든 감염된 개인의 최대 70%의 간을 고집할 수 있다 [Bowen, D.G. and C.M. Walker, Adaptive immune responses in acute and chronic hepatitis C virus infection. Nature, 2005. 436(7053): p. 946-52]. 만성적으로 감염된 개인의 최대 30%는 세상에서 HCV 감염을 간 이식의 주된 원인으로 만드는 그의 수명 동안에 간경변 및 간세포 암종 (HCC)을 포함하는 진행성 간 질환을 발달시킬 것으로 추정된다. 또한, HCV 및 HBV 감염은 전세계적인 암 사망의 제3 주된 원인인 모든 경우의 HCC의 70%와 연구된다 [Levrero, M., Viral hepatitis and liver cancer: the case of hepatitis C. Oncogene, 2006. 25(27): p. 3834-47].

바이러스의 지속적인 본성으로 인해, HCV 감염은 치료하기에 극도로 어렵고 비쌀 수 있다. 대부분의 감염된 개인은 치료를 받지 못한다. 그러나, 치료하는 사람은 표준 치료 프로토콜에 대해 평균 SU$ 17,700 내지 22,000을 지불한다 [Salomon, J.A., 등, Cost-effectiveness of treatment for chronic hepatitis C infection in an evolving patient population. Jama, 2003. 290(2): p. 228-37]. 유럽 및 북아메리카에서 가장 보편적인 유전자형 감염은, 표준 치료에 해당하는 개인의 42% 정도로 낮은 열등한 예측을 갖는다 [Manns, M.P., 등, Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomised trial. Lancet, 2001. 358(9286): p. 958-65].

따라서, 만성 HCV의 효과적인 치료 및 경제적 부담이 부족한 감염의 고유행은 이러한 질환과 싸우기 위해 신규 면역 치료 전략의 개발에 대한 긴급한 필요를 설명한다. 현재 HCV에 대한 예방 또는 치료 백신은 없다.

이러한 바이러스에 대한 적응적 면역력을 이해하는 것은 바이러스성 감염과 싸우기 위해 전략, 예컨대 DNA 백신을 수립하는데 중요하다. 바이러스-특이적 항체가 HCV 감염 7-8 주 후 내에 검출될 지라도 [Pawlotsky, J.M., Diagnostic tests for hepatitis C. J Hepatol, 1999. 31 Suppl 1: p. 71-9], 재감염에 대항하여 보호되지 않고 [Farci, P., 등, Lack of protective immunity against reinfection with hepatitis C virus. Science, 1992. 258(5079): p. 135-40; Lai, M.E., 등, Hepatitis C virus in multiple episodes of acute hepatitis in polytransfused thalassaemic children. Lancet, 1994. 343(8894): p. 388-90], 감염의 분해 다음에 완전히 부재할 수 있다 [Cooper, S., 등, Analysis of a successful immune response against hepatitis C virus. Immunity, 1999. 10(4): p. 439-49; Post, J.J., 등, Clearance of hepatitis C viremia associated with cellular immunity in the absence of seroconversion in the hepatitis C incidence and transmission in prisons study cohort. J Infect Dis, 2004. 189(10): p. 1846-55].

따라서, HCV에 대한 백신 발달에서 주요 도전들 중의 하나는, 다른 간염 바이러스, 예컨대 A형 감염 및 B형 감염과는 달리, 성공적인 항체-기잔 백신이 만들어진 경우, 보호 HCV 감염에 대한 보호는 매개된 항체인 것으로 보이지 않는다는 것이다. 면역 보호의 정확한 관련요인이 설명된 채로 있을지라도, 급성으로 감염된 환자 및 침팬지 둘 모두의 수많은 연구는, 바이러스의 더 많은 유전적으로 보존된 비-구조 영역에 대항하여 지향된 강한 T 헬퍼 1 (Th1) 반응은 HCV 감염의 소거와 연관된다는 증거를 강제하는 것을 제공했다. 참고 Missale, G., 등, Different clinical behaviors of acute hepatitis C virus infection are associated with different vigor of the anti-viral cell-mediated immune response. J Clin Invest, 1996. 98(3): p. 706-14; and Diepolder, H.M., 등, Possible mechanism involving T-lymphocyte response to non-structural protein 3 in viral clearance in acute hepatitis C virus infection. Lancet, 1995. 346(8981): p. 1006-7. 또한, 중요하게, 말초 혈액보다는 오히려 간에 대한 HCV-특이적 T 세포의 국재화는 급성 감염의 바이러스 부하 및 소거에서 둘 모두의 감소를 위해 중요한 것으로 보였다. 참고 Thimme, R., 등, Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis C virus infection. J Exp Med, 2001. 194(10): p. 1395-406; and Shoukry, N.H., 등, Memory CD8+ T cells are required for protection from persistent hepatitis C virus infection. J Exp Med, 2003. 197(12): p. 1645-55.

더욱이, 초기의, 다중특이적, 간내 CD4+ 헬퍼 및 CD8+ 세포독성 T-세포 반응을 시작하는 감염된 개인은 HCV 감염의 제거를 보여주는 경향이 있는 것으로 보인다 [Lechner, F., 등, Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J Exp Med, 2000. 191(9): p. 1499-512; Gerlach, J.T., 등, Recurrence of hepatitis C virus after loss of virus-specific CD4(+) T-cell response in acute hepatitis C. Gastroenterology, 1999. 117(4): p. 933-41; Thimme, R., 등, Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis C virus infection. J Exp Med, 2001. 194(10): p. 1395-406; Grakoui, A., 등, HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T cell help. Science, 2003. 302(5645): p. 659-62].

DNA 백신은 생약독화 바이러스 및 재조합 단백질-기본 백신과 같은 더 전통적인 백신접종 방법에 비해서 다수 개념적 이점을 갖는다. DNA 백신은 안전하고, 안정하며, 쉽게 생산되고, 인간에게서 잘 허용되는데, 전임상 실험은 플라스미드 통합의 증거를 거의 나타내지 않는다 [Martin, T., 등, Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999. 10(5): p. 759-68; Nichols, W.W., 등, Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995. 772: p. 30-9]. 또한, DNA 백신은 백신의 효능이 벡터에 대한 기존의 항체 역가에 의해서 영향을 받지 않는다는 사실로 인하여 반복 투여하는데 꽤 적합하다 [Chattergoon, M., J. Boyer, and D.B. Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines and immune therapeutics. FASEB J, 1997. 11(10): p. 753-63]. 그러나, DNA 백신의 임상적 적용에 관한 한가지 주된 장애는 더 큰 동물에게 이동시키는 경우에 플랫폼 면역원성 (platforms immunogenicity)에 있어서의 감소였다 [Liu, M.A. and J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet, 2005. 55: p. 25-40]. 코돈 최적화, RNA 최적화 및 면역글로불린 리더 (leader) 서열의 부가와 같은 DNA 백신 면역원의 조작에 있어서의 최근의 기술적 진보는 DNA 백신의 발현 및 면역원성을 개선시켰으며 [Andre, S., 등, Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72(2): p. 1497-503; Deml, L., 등, Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22): p. 10991-1001; Laddy, D.J., 등, Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza. Vaccine, 2007. 25(16): p. 2984-9; Frelin, L., 등, Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther, 2004. 11(6): p. 522-33], 뿐만 아니라 전기천공과 같은 플라스미드 전달 시스템에서 있어서의 기술이 최근에 개발되었다 [Hirao, L.A., 등, Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques. Vaccine, 2008. 26(3): p. 440-8; Luckay, A., 등, Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J Virol, 2007. 81(10): p. 5257-69; Ahlen, G., 등, In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T cells. J Immunol, 2007. 179(7): p. 4741-53]. 또한, 연구들은 공통 면역원의 사용이 천연 항원 단독에 비해서 세포성 면역반응의 폭을 증가시킬 수 있음을 시사하였다 [Yan., J., 등, Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther, 2007. 15(2): p. 411-21; Rolland, M., 등, Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol, 2007. 81(16): p. 8507-14].

HCV NS3 및 NS4를 인코딩하는 DNA 백신은 하기에서 개시되어 있다: Lang, K.A. 등 Vaccine vol 26, issue 49, pp 6225-6231 (2008년 11월).

따라서, HCV에 대항하는 효과적인 백신에 대한 필요성이 여전히 있다. 또한, HCV가 감염된 개인을 치료하는 효과적인 방법에 대한 필요성이 여전히 있다.

발명의 요약

본 발명의 측면은 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 1 이상의 단백질을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산 서열을 포함한다: a) 서열번호:2; 서열번호:2와 98% 상동인 단백질; 또는 서열번호:2의 면역원성 단편; b) 서열번호:4; 또는 서열번호:4와 98% 상동인 단백질; 또는 서열번호:4의 면역원성 단편; c) 서열번호:6; 서열번호:6과 98% 상동인 단백질; 또는 서열번호:6의 면역원성 단편. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호:9를 인코딩하는 IgE 리더의 인코딩 서열이 부재할 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 1 이상의 서열일 수 있다: a) 서열번호:1; 또는 서열번호:1과 98% 상동인 코딩 서열; b) 서열번호:3; 또는 서열번호:3과 98% 상동인 코딩 서열; 또는 c) 서열번호:5; 또는 서열번호:5와 98% 상동인 코딩 서열. 일부 구현예에서, 이들 핵산 분자는 서열번호:7 또는 서열번호:8의 서열을 갖는 IgE 리더의 인코딩 서열이 부재한다.

게다가, HCV로 진단된 대상체를 치료하는 방법을 포함하는 개시된 측면이 있고, 상기 방법은 본원에서 기재된 핵산 분자를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

또 하나의 측면에서, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질이 있다: a) 서열번호:2; 서열번호:2와 98% 상동인 단백질; 또는 서열번호:2의 면역원성 단편; b) 서열번호:4; 서열번호:4와 98% 상동인 단백질; 또는 서열번호:4의 면역원성 단편; 또는 c) 서열번호:6; 서열번호:6과 98% 상동인 단백질; 또는 서열번호:6의 면역원성 단편. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 단백질은 서열번호:9를 갖는 IgE 리더가 부재할 수 있다.

HCV로 진단된 대상체를 치료하는 방법을 본원에서 추가로 기재하고, 상기 방법은 본원의 단백질을 투여하는 것을 포함한다.

추가로, 본원에서 기재된 약제학적 조성물은 본원에서 제공된 핵산 분자 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 더욱이, 약제학적 조성물은 본원에서 제공된 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 제공한다.

도 1: pConNS4B, pConNS5A 및 pConNS5B에 대한 용량 반응. 동물 (n=5)은 5μg, 12.5μg 또는 25μg의 pConNS4B, pConNS5A 및 pConNS5B로 면역화되었다. 동물은 총 2개의 근육내 면역화 그 다음 전기천공을 수용했고, 각 면역화는 2 주로 걸쳐 했다. 동물은 마지막 면역화 다음 1주에 희생되었고 그 후 비장세포는 개별적으로 단리되었고 분석되었다. 각 개별 동물의 반응은 각 구조물의 최적의 용량이 결정된 IFN-γ ELISpot 검정의 사용을 통해 측정되었다.
도 2: 단리된 비장세포로부터의 IFN-γ+ T 세포 반응 의 유세포측정 분석. 각 동물 (n=5)로부터의 비장세포는 단리되었고 NS4B-, NS5A- 또는 NS5B-특이적 T 세포 반응에 대해 개별적으로 분석되었다. 비장세포는 5 시간 동안 R10 (음성 대조군) 또는 NS4B, NS5A 또는 NS5B 펩타이드 풀(pool)로 생체외로 자극되었다. 인큐베이션 다음에, 세포는 IFN-γ에 대해 세포내로 염색되었고 유세포측정으로 분석되었다. 면역화-특이적 반응은 펩타이드 자극된 그룹 중 퍼센트 IFN-γ+ T 세포 마이너스 R10 자극된 그룹 중 퍼센트 IFN-γ+ T 세포로서 보고되었다. 본 도는 각 그룹으로부터의 대표적인 동물을 보여준다. 보여진 그 값은 미접촉 및 면역화된 그룹 둘 모두로부터 5 마리 개별 동물의 평균 반응이다. 유의성은 스튜던트 t 시험에 의해 측정되었다 (*p< 0.05, **p< 0.005 및 ***p< 0.0005).
도 3: 단리된 비장세포로부터의 퍼센트 면역화-특이적 IFN-γ+ T 세포 반응의 그래프로 된 묘사. 그 값은 하기로서 보고된다: 미접촉 및 면역화된 그룹 둘 모두로부터의 각 동물 (n=5)의, A) 평균 퍼센트 CD4+ IFN-γ+ T 세포 반응 및 B) 평균 퍼센트 CD8+ IFN-γ+ T 세포 반응. 유의성은 스튜던트 t 시험에 의해 측정되었다 (*p< 0.05, **p< 0.005 및 ***p< 0.0005).
도 4: 단리된 간 림프구로부터의 퍼센트 면역화-특이적 IFN-γ+ T 세포 반응의 그래프로 된 묘사. 그 값은 평균 (± SE)로서 보고된다: 미접촉 및 면역화된 그룹 둘 모두로부터의 각 동물 (n=5)의, A) 퍼센트 CD4+ IFN-γ+ T 세포 반응 및 B) 퍼센트 CD8+ IFN-γ+ T 세포 반응. 유의성은 스튜던트 t 시험에 의해 측정되었다 (*p< 0.05, **p< 0.005 및 ***p< 0.0005).
도 5: 비장, 휴식 중인 간 및 형질감염된 간으로부터의 단리된 림프구로부터의 IFN-γ+ T 세포 반응의 백분율의 유세포측정 분석. 각 동물 (n=5)로부터의 림프구는 단리되었고 NS4B-, NS5A- 또는 NS5B-특이적 T 세포 반응에 대해 개별적으로 분석되었다. 단리된 림프구는 IFN-γ에 대해 세포내로 염색되었고 유세포측정으로 분석되었다. 이 도는 각 그룹으로부터의 대표적인 동물을 보여준다. 보여진 그 값은 미접촉 및 면역화된 그룹 둘 모두로부터 5 마리 개별 동물의 평균 반응 (± SE)이다. 유의성은 스튜던트 t 시험에 의해 측정되었다 (*p< 0.05, **p< 0.005 및 ***p< 0.0005).
도 6: 비장, 휴식 중인 간 및 형질감염된 간으로부터의 단리된 림프구로부터의 IFN-γ+ T 세포 반응의 백분율의 그래프로 된 묘사. 그 값은 평균 퍼센트 (± SE)로서 보고된다: 미접촉 및 면역화된 그룹 둘 모두로부터의 각 동물 (n=5)의, A) pConNS4B에 대한 CD4+ IFN-γ+ T 세포 반응, B) pConNS5A에 대한 CD4+ IFN-γ+ T 세포 반응, C) pConNS5B에 대한 CD4+ IFN-γ+ T 세포 반응, D) pConNS4B에 대한 CD8+ IFN-γ+ T 세포 반응, E) pConNS5A에 대한 CD8+ IFN-γ+ T 세포 반응, F) pConNS5B에 대한 CD8+ IFN-γ+ T 세포 반응. 유의성은 스튜던트 t 시험에 의해 측정되었다 (*p< 0.05, **p< 0.005 및 ***p< 0.0005).
도 7: DAPI로 정규화된 바와 같은 NS4B, NS5A 또는 NS5B 의 발현의 MFI 비의 그래프. 각 그룹에 대해, 3 이미지는 각 동물 (n=5)에 대해 포착되었다. NS4B, NS5A 또는 NS5B (적색)에 대한 MFI 값이 계산되었고 각 이미지에 대한 DAPI (청색)의 MFI 값으로 정규화되었다. 보여진 그 값은 미접촉 및 면역화된 그룹 둘 모두로부터 5 마리 개별 동물의 평균 반응 (± SE)이다. 유의성은 스튜던트 t 시험에 의해 측정되었다 (*p< 0.05, **p< 0.005 및 ***p< 0.0005).
도 8 은 하기의 플라스미드 맵을 보여준다: 도 8a 공통 항원 NS4B를 포함하는 발현 구조물 pConNS4B_pVAX1; 도 8b 공통 항원 NS5A를 포함하는 발현 구조물 pConNS5A_pVAX1; 및 도 8c 공통 항원 NS5B를 포함하는 발현 구조물 pConNS5B_pVAX1.
바람직한 구현예의 상세한 설명
본 발명에서 사용된 것으로서, 문구 "스트린전트 (stringent) 하이브리드화 조건" 또는 "스트린전트 조건"은 핵산 분자가 또 다른 핵산 분자에 하이브리드화할 수 있지만, 다른 서열에는 하이브리드화하지 않는 조건을 나타낸다. 스트린전트 조건은 서열-의존적이며, 상이한 환경에서는 상이할 수 있다. 더 긴 서열은 더 고온에서 특이적으로 하이브리드화한다. 일반적으로, 스트린전트 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 특이적 서열에 대해 열융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm은 표적 서열에 대해서 상보적인 프로브의 50%가 평형상태에서 표적 서열에 하이브리드화하는 온도 (규정된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에서)이다. 표적 서열은 일반적으로 과량으로 존재하기 때문에, Tm에서 프로브의 50%가 평형상태에서 점유된다. 전형적으로, 스트린전트 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 미만의 나트륨 이온, 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0 M의 나트륨 이온 (또는 다른 염)이고, 온도는 짧은 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, 10 내지 50 뉴클레오타이드)의 경우에는 적어도 약 30℃, 및 더 긴 프로브, 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드 (예를 들어, 10 내지 50 뉴클레오타이드)의 경우에는 적어도 약 60℃인 것이다. 스트린전트 조건은 또한, 포름아미드와 같은 불안정화제를 첨가함으로써 달성될 수도 있다.
뉴클레오타이드 및 아미노산에 대한 서열 상동성은 FASTA, BLAST 및 갭드 (Gapped) BLAST [Altschul 등, Nuc. Acids Res., 1997, 25, 3389; 이것은 본 발명에 온전히 참고로 포함된다] 및 PAUP* 4.0b10 소프트웨어 (D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)를 사용하여 결정될 수 있다. "유사성의 백분율"은 PAUP* 4.0b10 소프트웨어 (D. L. Swofford, Sinauer Associates, Massachusetts)를 사용하여 계산된다. 공통 서열의 평균 유사성은 계통수 (phylogenic tree) 내의 모든 서열과 비교하여 계산된다.
간략하면, 기본적 국소 정렬 탐색도구 (Basic Local Alignment Search Tool)를 의미하는 BLAST 알고리즘이 서열 유사성을 결정하는데 적합하다 [Altschul 등, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; 이것은 본 발명에 온전히 참고로 포함된다]. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)으로부터 공공연히 이용할 수 있다. 이 알고리즘은 우선, 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 단어로 정렬하는 경우에 일부의 양의 값을 갖는 역치 스코어 T와 부합하거나, 그를 충족시키는 문제의 서열 내의 길이 W인 짧은 단어를 확인함으로써 높은 스코어의 서열 쌍 (HSPs)을 확인하는 것을 포함한다. T는 근접 단어 스코어 역치 (neighborhood word score threshold)로 불린다 [Altschul 등, supra]. 이들 초기 근접 단어 히트 (hits)는 이들을 함유하는 HSPs를 찾기 위한 탐색을 개시하기 위한 근원으로 작용한다. 단어 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한은 각각의 서열을 따라서 양 방향으로 연장된다. 각 방향에서 단어 히트에 대한 연장은 다음의 경우에 중단된다: 1) 누적 정렬 스코어가 그의 도달된 최대값으로부터 양 X만큼 떨어지는 경우; 2) 누적 스코어가 하나 또는 그 이상의 음의 스코어를 갖는 잔기 정렬의 축적으로 인하여 0 또는 그 이하가 되는 경우; 또는 3) 각 서열의 말단에 도달한 경우. Blast 알고리즘 파라메터 W, T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. Blast 프로그램은 디폴트 (defaults)로서 11의 단어 길이 (W), 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 [참조: Henikoff 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10915-10919; 이것은 본 발명에 온전히 참고로 포함된다] 얼라인먼트 (B), 10의 기대값 (E), M=5, N=4, 및 양 스트랜드의 비교를 사용한다. BLAST 알고리즘 [Karlin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5873-5787; 이것은 본 발명에 온전히 참고로 포함된다] 및 갭드 BLAST는 두개의 서열 사이의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다. BLAST 알고리즘에 의해서 제공된 유사성의 한가지 척도는 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 부합이 우연히 나타날 수 있는 확률의 지표를 제공하는 최소 합계 확률 (smallest sum probability; P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 시험 핵산과 다른 핵산의 비교 시에 최소 합계 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우에 또 다른 것과 유사한 것으로 생각된다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "유전자 구조물"은 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 나타낸다. 코드화 서열은 프로모터를 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종결 시그날, 및 핵산 분자가 투여된 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 폴리아데닐화 시그날을 포함한다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "발현가능한 형태"는 개체의 세포에 존재하는 경우에 코드화 서열이 발현될 수 있도록 단백질을 코드화한 코드화 서열에 작동가능하게 연결된 필요한 조절 요소를 함유하는 유전자 구조물을 나타낸다.
증대된 세포성 면역 반응을 유도할 수 있는 상이한 DNA 백신을 설계하기 위해 다단계 접근법으로부터 생기는 개선된 백신이 개시되고, 이 반응은 특히, 바이러스 내의 다중 보존된 영역에 대항하여 지향된 세포독성 및 IFN-γ 및 HCV-특이적 T 세포 반응을 포함한다. 변형된 공통 서열이 생성되었고, 이 서열은 예를 들면, 공통 항원 NS4B, NS5A 및 NS5B을 포함하는 DNA 백신이다. 코돈 최적화, RNA 최적화, 및 고효율적인 면역글로빈 선도 서열의 부가를 포함하는 유전 변형이 또한 개시된다.
개선된 HCV 백신은 그에 대한 항-HCV가 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이도록 만드는 에피토프를 갖는 단백질을 코드화한 유전자 구조물 및 단백질을 기초로 한다.
일부 구현예에서 핵산 분자는 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 1 이상의 단백질을 인코딩하는 코딩 서열을 포함한다: a) 서열번호:2; 서열번호:2와 98% 상동인 단백질; 또는 서열번호:2의 면역원성 단편; b) 서열번호:4; 또는 서열번호:4와 98% 상동인 단백질; 또는 서열번호:4의 면역원성 단편; c) 서열번호:6; 서열번호:6과 98% 상동인 단백질; 또는 서열번호:6의 면역원성 단편. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 서열번호:9를 인코딩하는 IgE 리더의 인코딩 서열이 부재할 수 있다. 바람직하게는, 핵산 분자는 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 1 이상의 서열일 수 있다: a) 서열번호:1; 또는 서열번호:1과 98% 상동인 코딩 서열; b) 서열번호:3; 또는 서열번호:3과 98% 상동인 코딩 서열; 또는 c) 서열번호:5; 또는 서열번호:5와 98% 상동인 코딩 서열. 일부 구현예에서, 이들 핵산 분자는 서열번호:7 또는 서열번호:8의 서열을 갖는 IgE 리더의 인코딩 서열이 부재한다.
따라서, 백신은 치료학적 또는 예방적 면역반응을 유도할 수 있다. 일부의 구체예에서, 면역원을 전달하는 수단은 DNA 백신, 재조합 백신, 단백질 서브유니트 백신, 면역원을 포함하는 조성물, 약독화 백신 또는 사멸 백신이다. 일부의 구체예에서, 백신은 하나 또는 그 이상의 DNA 백신, 하나 또는 그 이상의 재조합 백신, 하나 또는 그 이상의 단백질 서브유니트 백신, 면역원을 포함하는 하나 또는 그 이상의 조성물, 하나 또는 그 이상의 약독화 백신 및 하나 또는 그 이상의 사멸 백신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 조합물을 포함한다.
일부의 구체예에 따르면, 백신을 개체에게 전달하여 개체의 면역 시스템의 활성을 변조시키고, 이에 의해서 HPV에 대한 면역반응을 증진시킨다. 단백질을 코드화한 핵산 분자가 개체의 세포에 의해서 흡수되면, 뉴클레오타이드 서열이 세포 내에서 발현되며, 이에 의해서 단백질이 개체에게 전달된다. 재조합 백신의 일부분으로서, 및 약독화 백신의 일부분으로서, 벡터의 분리된 단백질 또는 단백질 부분으로서 플라스미드와 같은 핵산 분자 상에 단백질의 코드화 서열을 전달하는 방법이 제공된다.
또 하나의 측면에서, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질이 있다: a) 서열번호:2; 서열번호:2와 98% 상동인 단백질; 또는 서열번호:2의 면역원성 단편; b) 서열번호:4; 서열번호:4와 98% 상동인 단백질; 또는 서열번호:4의 면역원성 단편; 또는 c) 서열번호:6; 서열번호:6과 98% 상동인 단백질; 또는 서열번호:6의 면역원성 단편. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 단백질은 서열번호:9를 갖는 IgE 리더가 부재할 수 있다.
게다가, HCV로 진단된 대상체를 치료하는 방법을 포함하는 개시된 측면이 있고, 상기 방법은 본원에서 기재된 핵산 분자를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
HCV로 진단된 대상체를 치료하는 방법을 본원에서 추가로 기재하고, 상기 방법은 본원의 단백질을 투여하는 것을 포함한다.
추가, 본원에서 기재된 약제학적 조성물은 본원에서 제공된 핵산 분자 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 더욱이, 약제학적 조성물은 본원에서 제공된 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 제공한다.
HCV에 대해서 개체를 예방적으로 및/또는 치료학적으로 면역시키는 조성물 및 방법이 제공된다. 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 전달하는 조성물은 조절 요소에 작동적으로 연결된다. 조성물은 면역원을 코드화한 플라스미드, 면역원을 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 백신, 본 발명의 단백질을 코드화하고/하거나 본 발명의 단백질을 포함하는 생약독화 병원체; 본 발명의 단백질을 포함하는 사멸 병원체; 또는 본 발명의 단백질을 포함하는 리포좀 또는 서브유니트 백신과 같은 조성물을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한, 조성물을 포함하는 주사용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
서열번호:1은 HCV 단백질 NS4B의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호: 1은 추가로, IgE 리더로부터의 추가 5' 상류 서열과 함께, HCV 단백질 NS4B의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열을 포함한다. 서열번호:2는 HCV 단백질 NS4B의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호: 2는 추가로, 공통 면역원 서열여 연결된 IgE 선도 서열을 포함한다. IgE 선도 서열은 공통 NS4B에 대한 N-말단이고 서열번호: 9이고 서열번호:8에 의해 인코딩된다.
본원에서 기재된 공통 항원 및 이로부터 만들어진 백신은 IgE 선도 서열을 포함하거나, 제거할 수 있다.
일부 구현예에서, 백신은 바람직하게는 서열번호:2 또는 이것을 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 백신은 바람직하게는 서열번호: 1을 포함한다. 백신은 바람직하게는 IgE 선도 서열번호:9 또는 이것을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
서열번호:1의 상동 서열은 90 개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:1의 단편은 하기를 포함할 수 있다: 180 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 270 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 360 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 450 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 540 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 630 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 720 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 810 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 및 일부 구현예에서, 870 개 이상의 뉴클레오타이드. 일부 구현예에서, 서열번호:1의 단편은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:1의 상동 서열은 IgE 선도 서열에 대한 코딩 서열을 포함하지 않는다. 바람직하게는, 상동 서열은 서열번호:1에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 더 바람직하게는 98%, 또는 99% 상동성을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열번호:1의 면역원성 단편, 및 바람직하게는 단편은 서열번호:1에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 더 바람직하게는, 98% 또는 99% 상동성을 갖는다.
서열번호: 2의 상동 서열은 30 개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호: 2의 단편은 하기를 포함할 수 있다: 60 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 90 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 120 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서; 150 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서 180 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 210 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 240 개 이상의 아미노산; 및 일부 구현예에서, 270 개 이상의 아미노산. 바람직하게는, 상동 서열은 서열번호:2에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 더 바람직하게는 98%, 또는 99% 상동성을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열번호:2의 면역원성 단편, 및 바람직하게는 단편은 서열번호:2에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 더 바람직하게는, 98% 또는 99% 상동성을 갖는다.
서열번호:3은 HCV 단백질 NS5A의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:4는 HCV 단백질 NS5A의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:3은 추가로, IgE 리더로부터의 추가 5' 상류 서열과 함께, HCV 단백질 NS5A의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열을 포함한다. 서열번호:4는 HCV 단백질 NS5A의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:4은 추가로, 공통 면역원 서열 NS5A 에 연결된 IgE 선도 서열을 포함한다. IgE 선도 서열은 공통 NS5A 에 대한 N-말단이고 서열번호:9이고 서열번호:7에 의해 인코딩될 수 있다.
서열번호:3의 상동 서열은 90 개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:3의 단편은 하기를 포함할 수 있다: 180 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 270 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 360 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 450 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 540 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 630 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 720 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 810 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 900 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 990 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 1080 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 1170 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 1260 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 1350 개 이상의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 1430 개 이상의 뉴클레오타이드. 바람직하게는, 상동 서열은 서열번호:3에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 더 바람직하게는 98%, 또는 99% 상동성을 갖는다. 일부 구현예에서, there are 서열번호:3의 면역원성 단편, 및 바람직하게는 단편은 서열번호:3에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 더 바람직하게는, 98% 또는 99% 상동성을 갖는다.
서열번호:4의 상동 서열은 30 개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:4의 단편은 하기를 포함할 수 있다: 60 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 90 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 120 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서; 150 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서 180 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 210 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 240 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 270 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 300 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 330 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 360 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 390 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 420 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 450 개 이상의 아미노산; 및, 일부 구현예에서, 470 개 이상의 아미노산. 바람직하게는, 상동 서열은 서열번호:4에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 더 바람직하게는 98%, 또는 99% 상동성을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열번호:4의 면역원성 단편, 및 바람직하게는 단편은 서열번호:4에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 더 바람직하게는, 98% 또는 99% 상동성을 갖는다.
서열번호:5은 HCV 단백질 NS5B의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 서열번호:6는 HCV 단백질 NS5B의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:5은 추가로, IgE 리더로부터의 추가 5' 상류 서열과 함께, HCV 단백질 NS5B의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 연결된 IgE 선도 서열을 포함한다. 서열번호:6는 HCV 단백질 NS5B의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호:6은 추가로, 공통 면역원 서열 NS5B에 연결된 IgE 선도 서열을 포함한다. IgE 선도 서열은 공통 NS5B 에 대한 N-말단이고 서열번호:9이고 서열번호:8에 의해 인코딩될 수 있다.
서열번호:5의 상동 서열은 90 개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:5의 단편은 하기를 포함할 수 있다: 180 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 270 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 360 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 450 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서 540 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 630 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 720 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 810 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 900 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 990 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 1080 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 1170 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 1260 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 1350 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 1440 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 1530 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 1620 개 이상의 뉴클레오타이드; 일부 구현예에서, 1710 개 이상의 뉴클레오타이드; 및 일부 구현예에서, 1800 개 이상의 뉴클레오타이드. 바람직하게는, 상동 서열은 서열번호:5에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 더 바람직하게는 98%, 또는 99% 상동성을 갖는다. 일부 구현예에서, 면역원성 서열번호:5의 단편은, 및 바람직하게는 단편은 서열번호:5에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 더 바람직하게는, 98% 또는 99% 상동성을 갖는다.
서열번호:6의 상동 서열은 30 개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호:6의 단편은 하기를 포함할 수 있다: 60 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 90 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 120 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서; 150 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서 180 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 210 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 240 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 270 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 300 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 330 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 360 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 390 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 420 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 450 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 480 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 510 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 540 개 이상의 아미노산; 일부 구현예에서, 570 개 이상의 아미노산; 및, 일부 구현예에서, 600 개 이상의 아미노산. 바람직하게는, 상동 서열은 서열번호:6에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 더 바람직하게는 98%, 또는 99% 상동성을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열번호:6의 면역원성 단편, 및 바람직하게는 단편은 서열번호:6에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 및 더 바람직하게는, 98% 또는 99% 상동성을 갖는다.
일부 구현예에 따르면, 면역원에 대항하여 개인에서 면역 반응을 유도하는 방법은 개인에게, HCV 단백질 NS4B, NS5A, 또는 NS5B의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원에 대한 아미노산 서열, 기능적 그의 단편, 또는 그의 발현성 코딩 서열, 또는 상기 언급된 것의 조합을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예는 HCV 단백질 NS4B, NS5A, 또는 NS5B의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원에 대한 아미노산 서열, 또는 그의 단편 인코딩하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예는 HCV 단백질 NS4B, NS5A, 또는 NS5B의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원에 대한 아미노산 서열 또는 그의 단편을 인코딩하는 재조합 백신을 포함한다. 일부 구현예는 HCV 단백질 NS4B, NS5A, 또는 NS5B의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원에 대한 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 서브유닛 백신을 포함한다. 일부 구현예는 HCV 단백질 NS4B, NS5A, 또는 NS5B의 HCV 유전자형 1a 공통 면역원에 대한 아미노산 서열을 포함하는 생약독화 백신 및/또는 사멸 백신을 포함한다.
개선된 백신은 그에 대한 항-HCV 면역반응이 유도될 수 있는 면역원으로서 특히 효과적이도록 만들고 특히 HCV-특이적 T 세포 면역성을 유도하는 에피토프를 갖는 단백질을 코드화한 유전자 구조물 및 단백질을 포함한다. 따라서, 백신은 치료학적 또는 예방적 면역반응을 유도하도록 제공될 수 있다. 일부의 구체예에서, 면역원을 전달하는 수단은 DNA 백신, 재조합 백신, 단백질 서브유니트 백신, 면역원을 포함하는 조성물, 약독화 백신 또는 사멸 백신이다. 일부의 구체예에서, 백신은 하나 또는 그 이상의 DNA 백신, 하나 또는 그 이상의 재조합 백신, 하나 또는 그 이상의 단백질 서브유니트 백신, 면역원을 포함하는 하나 또는 그 이상의 조성물, 하나 또는 그 이상의 약독화 백신 및 하나 또는 그 이상의 사멸 백신으로 구성된 그룹으로부터 선택된 조합물을 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에 따르면, 백신은 개인 면역계의 활성을 조절하기 위해 개인에게 전달되고 그렇게 함으로써 면역 반응을 향상시킨다. 단백질을 인코딩하는 핵산 분자가 개인의 세포에 의해 취해질 때 뉴클레오타이드 서열은 세포에서 발현되고 그렇게 함으로써 단백질은 개인에게 전달된다. 본 발명의 측면은 재조합 백신의 일부분으로서, 및 약독화 백신의 일부분으로서, 벡터의 분리된 단백질 또는 단백질 부분으로서 플라스미드와 같은 핵산 분자 상에 단백질의 코드화 서열을 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일부의 측면에 따르면, 개체를 예방적으로 및/또는 치료학적으로 면역시키는 조성물 및 방법이 제공된다.
DNA 백신은 각각 본 발명에 참고로 포함된 미국 특허 제5,593,972, 5,739,118, 5,817,637, 5,830,876, 5,962,428, 5,981,505, 5,580,859, 5,703,055, 5,676,594호, 및 여기에 인용된 선행 출원에 기술되어 있다. 이들 출원에 기술된 전달 프로토콜 이외에도, DNA를 전달하는 대체 방법은 모두 본 발명에 참고로 포함된 미국 특허 제4,945,050 및 5,036,006호에 기술되어 있다.
본 발명은 개선된 약독화 생백신, 개선된 사멸 백신, 및 항원을 코드화한 외래 유전자를 전달하기 위해서 재조합 벡터를 사용하는 개선된 백신뿐만 아니라 서브유니트 및 당단백 백신에 관한 것이다. 약독화 생백신, 외래 유전자를 전달하기 위해서 재조합 벡터를 사용하는 것, 서브유니트 백신 및 당단백 백신의 예는 각각 본 발명에 참고로 포함된 미국 특허 제4,510,245; 4,797,368; 4,722,848; 4,790,987; 4,920,209; 5,017,487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,364; 5,462,734; 5,470,734; 5,474,935; 5,482,713; 5,591,439; 5,643,579; 5,650,309; 5,698,202; 5,955,088; 6,034,298; 6,042,836; 6,156,319 및 6,589,529호에 기술되어 있다.
세포에 의해서 흡수되면, 유전자 구조물(들)은 세포 내에 기능적 염색체외 분자로 존재할 수 있고/있거나 세포 내의 염색체 DNA 내에 통합될 수 있다. DNA는 세포 내에 도입될 수 있으며, 여기에서 이것은 플라스미드 또는 플라스미드들의 형태의 별개의 유전자 물질로서 존재한다. 대신으로, 염색체 내로 통합될 수 있는 선형 DNA가 세포 내로 도입될 수 있다. DNA를 세포 내로 도입시키는 경우에는, 염색체 내로의 DNA 통합을 촉진하는 시약이 첨가될 수 있다. 통합을 촉진하는데 유용한 DNA 서열이 또한 DNA 분자 내에 포함될 수 있다. 대신으로, RNA가 세포에 투여될 수 있다. 또한, 동원체 (centromere), 말단소체 (telomeres) 및 복제 기점을 포함하는 선형 미니염색체로서 유전자 구조물을 제공하는 것도 고려된다. 유전자 구조물은 세포 내에서 생존하는 약독화된 생미생물 또는 재조합 미생물 벡터 내에 유전자 물질의 일부분으로서 잔류할 수 있다. 유전자 구조물은 유전자 물질이 세포의 염색체에 통합하거나 염색체외에 잔류하는 재조합 바이러스 백신의 게놈의 일부분일 수 있다. 유전자 구조물은 핵산 분자의 유전자 발현에 필요한 조절 요소를 포함한다. 상기의 요소에는 다음이 포함된다: 프로모터, 개시 코돈, 정지 코돈, 및 폴리아데닐화 시그날. 또한, 인핸서 (enhancers)는 종종, 표적 단백질 또는 면역조절 단백질을 코드화한 서열의 유전자 발현을 위해서 필요하다. 이들 요소는 원하는 단백질을 코드화한 서열에 작동가능하게 연결되며, 조절 요소는 이들이 투여되는 개체에게서 작동가능한 것이 필요하다.
개시 코돈 및 정지 코돈은 일반적으로, 원하는 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열의 일부분인 것으로 간주된다. 그러나, 이들 요소는 유전자 구조물이 투여되는 개체에게서 기능성인 것이 필요하다. 개시 및 정지 코돈은 코드화 서열과 함께 골격 내에 존재하여야 한다.
사용된 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날은 개체의 세포 내에서 반드시 기능성이어야 한다.
본 발명을 실시하는데, 특히 인간을 위한 유전자 백신의 생산에 유용한 프로모터의 예로는 시미안 바이러스 (Simian Virus) 40 (SV40), 마우스 유선종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, BIV 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터와 같은 인간 면역결핍 바이러스 (MV), 몰로니 (Moloney) 바이러스, ALV, CMV 즉시 초기 프로모터 (immediate early promoter)와 같은 사이토메갈로바이러스 (CMV), 엡스타인 바르 바이러스 (Epstein Barr Virus; EBV), 로우스 육종 바이러스 (Rous Sarcoma Virus; RSV)로부터의 프로모터뿐만 아니라 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 및 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자로부터의 프로모터가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명을 실시하는데, 특히 인간을 위한 유전자 백신의 생산에 유용한 폴리아데닐화 시그날의 예로는 SV40 폴리아데닐화 시그날 및 LTR 폴리아데닐화 시그날이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 특히, SV40 폴리아데닐화 시그날로 불리는, pCEP4 플라스미드 (Invitrogen, San Diego CA) 내에 존재하는 SV40 폴리아데닐화 시그날이 사용된다.
DNA 발현에 필요한 조절 요소 이외에도, 다른 요소가 또한 DNA 분자 내에 포함될 수 있다. 이러한 추가의 요소는 인핸서를 포함한다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 및 CMV, RSV 및 EBV로부터 유래하는 것과 같은 바이러스 인핸서를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 그룹으로부터 선택될 수 있다.
유전자 구조물에는 구조물을 염색체외적으로 유지시키고, 세포 내에서 구조물의 다수의 카피를 생산시키기 위해서 복제의 포유동물 기점이 제공될 수 있다. Invitrogen (San Diego, CA)으로부터의 플라스미드 pVAX1, pCEP4 및 pREP4는 복제의 엡스타인 바르 바이러스 기점 및 통합이 없이 높은 카피의 에피좀성 복제를 제공하는 핵 항원 EBNA-1 코드화 부분을 함유한다.
면역화 적용과 관련된 일부의 바람직한 구체예에서는, 본 발명의 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열, 및 추가로, 이러한 표적 단백질에 대한 면역반응을 더 증진시키는 단백질에 대한 유전자를 포함하는 핵산 분자(들)이 유도된다. 이러한 유전자의 예는 알파-인터페론, 감마-인터페론, 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피성장인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, MHC, CD80, CD86, 및 결실된 시그날 서열을 갖는 IL-15를 포함하며, 임의로 IgE로부터의 시그날 펩타이드를 포함하는 IL-15와 같은 다른 사이토킨 및 림포킨을 코드화한 것이다. 유용할 수 있는 다른 유전자에는 다음을 코드화한 것이 포함된다: MCP-1, MIP-lα, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이체 형태, CD40, CD40L, 혈관성장인자, IL-7, 신경성장인자, 혈관내피성장인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이들의 기능적 단편.
어떤 이유로든 유전자 구조물을 수용하는 세포를 제거하는 것이 바람직하다면, 세포 파괴에 대한 표적으로 작용하는 추가의 요소가 첨가될 수 있다. 발현가능한 형태의 헤르페스 티미딘 키나제 (tk) 유전자가 유전자 구조물 내에 포함될 수 있다. 약물 간사이클로비르가 개체에 투여될 수 있으며, 이 약물은 tk를 생산하는 모든 세포의 선택적 사멸을 야기할 수 있으며, 따라서 유전자 구조물에 의한 세포의 선택적 파괴를 위한 수단을 제공할 수 있다.
단백질 생산을 최대화시키기 위해서, 구조물이 투여되는 세포 내에서의 유전자 발현에 매우 적합한 조절 서열이 선택될 수 있다. 더구나, 세포 내에서 가장 효율적으로 전사되는 코돈이 선택될 수 있다. 본 기술분야에서 통상적인 기술을 갖는 전문가는 세포 내에서 기능성인 DNA 구조물을 생산할 수 있다.
일부의 구체예에서는, 본 발명에 기술된 단백질에 대한 코드화 서열이 IgE 시그날 펩타이드에 연결된 유전자 구조물이 제공될 수 있다. 일부의 구체예에서, 본 발명에 기술된 단백질은 IgE 시그날 펩타이드에 연결된다.
단백질이 사용되는 일부의 구체예에서, 예를 들어, 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 잘 알려진 기술을 사용하여 본 발명의 단백질을 생산하고 분리시킬 수 있다. 단백질이 사용되는 일부의 구체예에서, 예를 들어, 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 잘 알려진 기술을 사용하여. 잘 알려진 발현 시스템에서 사용하기 위한 상업적으로 이용할 수 있는 발현 벡터 내로 본 발명의 단백질을 코드화한 DNA 분자를 삽입할 수 있다. 예를 들어, 상업적으로 이용할 수 있는 플라스미드 pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.)는 이. 콜라이 내에서 단백질의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 플라스미드 pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.)는 예를 들어, 효모의 사카로마이세스 세레비지아에 (S. cerevisiae) 스트레인 내에서의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 MAXBAC™ 완전 바큘로바이러스 발현 시스템 (Invitrogen, San Diego, Calif.)은 예를 들어, 곤충 세포에서의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 상업적으로 이용할 수 있는 플라스미드 pcDNA I 또는 pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.)은 예를 들어, 차이니즈 햄스터 (Chinese Hamster) 난소 세포와 같은 포유동물 세포에서의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 이들 상업적 발현 벡터 및 시스템 또는 그 밖의 것을 사용하여 일상적인 기술 및 쉽게 이용할 수 있는 출발물질에 의해서 단백질을 생산할 수 있다 [참조: 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989); 이것은 본 발명에 참고로 포함된다]. 따라서, 바람직한 단백질은 원핵 및 진핵 시스템 둘 다에서 제조될 수 있어서 광범한 스펙트럼의 단백질의 가공된 형태를 제공할 수 있다.
본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 그 밖의 다른 상업적으로 이용할 수 있는 발현 벡터 및 시스템을 사용할 수 있거나, 잘 알려진 방법 및 쉽게 이용할 수 있는 출발물질을 사용하여 벡터를 생산할 수 있다. 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날, 및 바람직하게는 인핸서와 같은 필요한 조절 서열을 함유하는 발현 시스템은 다양한 숙주에 관해서 본 기술분야에서 쉽게 이용할 수 있으며, 공지되어 있다 [참조: 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989)]. 유전자 구조물은 구조물이 형질감염되는 세포주 내에서 기능성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 단백질 코드화 서열을 포함한다. 구성적 프로모터의 예로는 사이토메갈로바이러스 또는 SV40로부터의 프로모터가 포함된다. 유도성 프로모터의 예로는 마우스 유방 백혈병 바이러스 또는 메탈로티오네인 프로모터가 포함된다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 쉽게 이용할 수 있는 출발물질로부터 본 발명의 단백질을 코드화한 DNA로 세포를 형질감염시키는데 유용한 유전자 구조물을 쉽게 생산할 수 있다. 단백질을 코드화한 DNA를 포함하는 발현 벡터를 사용하여 허용되는 숙주를 형질전환시킨 다음에, 이것을 외래 DNA의 발현이 일어나는 조건 하에서 배양 및 유지시킨다.
생산된 단백질은 세포를 용해시키거나 본 기술분야의 전문가에게 공지되고 적절한 배양 배지로부터 분리시킴으로써 배양물로부터 회수된다. 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가는 잘 알려진 기술을 사용하여, 이러한 발현시스템을 사용하여 생산된 단백질을 분리시킬 수 있다. 상술한 바와 같은 특정의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 천연 공급원으로부터 단백질을 정제하는 방법이 재조합 DNA 방법에 의해서 생산된 단백질을 정제하는데 동등하게 적용될 수 있다.
재조합 기술에 의해서 단백질을 생산하는 이외에도, 자동화된 펩타이드 합성기를 또한 사용하여 분리되고 본질적으로 순수한 단백질을 생산할 수 있다. 이러한 기술은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있으며, 치환을 갖는 유도체가 DNA-코드화된 단백질 생산 시에 제공되지 않는 경우에 유용하다.
핵산 분자는 DNA 주사 (또한, DNA 백신접종으로도 불림), 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관된 바이러스 및 재조합 백시니아와 같은 재조합 벡터를 포함하는 몇 가지 잘 알려진 기술 중의 어떤 것을 사용하여서도 전달될 수 있다.
투여의 경로에는 근육내, 비내, 복강내, 피내, 피하, 정맥내, 동맥내, 안내 및 경구뿐만 아니라 국소적으로, 경피적으로, 흡입 또는 좌제에 의해서, 또는 질, 직장, 요도, 협측 및 설하 조직에 대한 세척에 의한 것과 같은 점막 조직이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 투여의 경로에는 근육내, 복강내, 피내 및 피하 주사가 포함된다. 유전자 구조물은 전기천공 방법 및 장치, 전통적인 시린지, 무침 주사장치, 또는 "마이크로프로젝틸 봄바드먼트 곤건즈 (microprojectile bombardment gone guns)"를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 수단에 의해서 투여될 수 있다.
DNA 백신의 전달을 용이하게 하는데 바람직한 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예는 미국 특허 제7,245,963호 (Draghia-Akli, 등), 미국 특허공개 제2005/0052630호 (Smith, 등) (이들의 내용은 이에 의해서 온전히 참고로 포함된다)에 기술된 것을 포함한다. 또한, 35 USC 119(e)에 따라 2006년 10월 17일자 미국 임시출원 제60/852,149호 및 2007년 10월 10일자 제60/978,982호를 우선권으로 주장하는, 2007년 10월 17일에 출원된 공동 계류 중이고 공동-소유된 미국 특허출원 제11/874072호 (이들은 모두 이에 의해서 온전히 참고로 포함된다)에 제시된 DNA 백신의 전달을 용이하게 하는 전기천공 장치 및 전기천공 방법이 바람직하다.
다음은 전기천공 기술을 사용한 구체예의 예이며, 상기 검토된 특허문헌에서 더 상세하게 거론된다: 전기천공 장치를 포유동물의 원하는 조직에 사용자에 의해서 미리 설정된 전류 입력과 유사한 정전류를 생성하는 에너지의 펄스를 포유동물의 원하는 조직에 전달하도록 배열될 수 있다. 전기천공 장치는 전기천공 성분 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함한다. 전기천공 성분은 다음을 포함하는 전기천공 장치의 다양한 요소 중의 하나 또는 그 이상을 포함하고 통합할 수 있다: 조절기, 전류 파형 생성기, 임피던스 (impedance) 시험기, 파형 로거 (logger), 입력 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 메모리 성분, 동력원 및 동력 스위치. 전기천공 성분은 전기천공 장치의 하나의 요소로서 작용할 수 있으며, 다른 요소들은 전기천공 성분과 연결되는 별개의 요소 (또는 성분)이다. 일부의 구체예에서, 전기천공 성분은 전기천공 성분과는 별개의 전기천공 장치의 또 다른 요소와 연결될 수 있는 전기천공 장치의 하나 이상의 요소로서 작용할 수 있다. 요소들은 하나의 장치로서 또는 또 다른 것과 연결되는 별개의 요소로서 작용할 수 있기 때문에, 개선된 HCV 백신을 전달하기 위한 전기천공 기술의 사용은 하나의 전기기계 또는 기계 장치의 일부분으로 존재하는 전기천공 장치의 요소에 의해서 제한되지 않는다. 전기천공 성분은 원하는 조직에서 정전류를 발생시키는 에너지의 펄스를 전달할 수 있으며, 피드백 기전을 포함한다. 전극 어셈블리는 공간적 배열로 다수의 전극을 갖는 전극 어레이를 포함하며, 여기에서 전극 어셈블리는 전기천공 성분으로부터 에너지의 펄스를 수용하고, 이것을 전극을 통해서 원하는 조직에 전달한다. 다수의 전극 중의 적어도 하나는 에너지의 펄스의 전달 중에 중성이며, 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고 임피던스를 전기천공 성분에 전달한다. 피드백 기전은 측정된 임피던스를 수용할 수 있으며, 전기천공 성분에 의해서 전달된 에너지의 펄스를 조정하여 정전류를 유지시킬 수 있다.
일부의 구체예에서, 다수의 전극은 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있다. 일부의 구체예에서, 다수의 전극은 프로그래밍된 순서로 전극의 제어 하에서 분산된 패턴으로 에너지의 펄스를 전달할 수 있으며, 프로그래밍된 순서는 전기천공 성분에 대한 사용자에 의한 입력이다. 일부의 구체예에서, 프로그래밍된 순서는 순서대로 전달된 다수의 펄스를 포함하며, 여기에서 다수의 펄스 중의 각각의 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극에 의해서 전달되며, 다수의 펄스 중의 후속 펄스는 임피던스를 측정하는 하나의 중성 전극을 갖는 적어도 2개의 활성 전극 중의 다른 하나에 의해서 전달된다.
일부의 구체예에서, 피드백 기전은 하드웨어 또는 소프트웨어에 의해서 수행된다. 바람직하게는, 피드백 기전은 아날로그 폐쇄-루프 회로에 의해서 수행된다. 바람직하게는, 이 피드백은 매 50 ㎲, 20 ㎲, 10 ㎲ 또는 1 ㎲마다 일어나지만, 바람직하게는 실시간 피드백이거나 순간적이다 (즉, 응답시간을 측정하기 위해서 이용할 수 있는 기술에 의해서 측정되는 것으로서 실질적으로 순간적이다). 일부의 구체예에서, 중성 전극은 원하는 조직에서 임피던스를 측정하고, 임피던스를 피드백 기전에 전달하며, 피드백 기전은 임피던스에 응답하여 정전류가 미리 설정된 전류와 유사한 값으로 유지되도록 에너지의 펄스를 조정한다. 일부의 구체예에서, 피드백 기전은 에너지의 펄스의 전달 중에 정전류를 연속적으로 및 순간적으로 유지시킨다.
일부의 구체예에서, 핵산 분자는 폴리뉴클레오타이드 기능 인핸서 또는 유전자 백신 촉진제의 투여와 함께 세포에 전달된다. 폴리뉴클레오타이드 기능 인핸서는 각각 본 발명에 참고로 포함된 미국 특허 제5,593,972 및 5,962,428호 및 1994년 1월 26일에 출원된 국제출원 제PCT/US94/00899호에 기술되어 있다. 유전자 백신 촉진제는 본 발명에 참고로 포함된 1994년 4월 1일자 미국 특허출원 제021,579호에 기술되어 있다. 핵산 분자와 함께 투여되는 공동-약제는 핵산 분자와의 혼합물로 투여될 수 있거나, 별도로 핵산 분자의 투여와 동시에, 또는 그 전 또는 후에 투여될 수 있다. 또한, 형질감염제 및/또는 복제성 약제 및/또는 염증성 성분으로 작용할 수 있으며, GVF와 공동-투여될 수 있는 다른 약제에는 성장인자, 사이토킨 및 림포킨, 예를 들어, α-인터페론, 감마-인터페론, GM-CSF, 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), TNF, 표피성장인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12 및 IL-15뿐만 아니라 섬유아세포 성장인자, 표면활성제, 예를 들어, 면역-자극성 컴플렉스 (ISCOMS), 프로인드 (Freunds) 불완전 보조제, 모노포스포릴 지질 A (WL)를 포함하는 LPS 유사체, 뮤라밀 펩타이드, 퀴논 유사체 및 스쿠알렌 및 스쿠알렌과 같은 소포체가 포함되며, 히알우론산이 또한 유전자 구조물과 함께 투여될 수 있다. 일부의 구체예에서는, 면역조절성 단백질이 GVF로 사용될 수 있다. 일부의 구체예에서, 핵산 분자는 전달/흡수를 증진시키기 위해서 PLG와 함께 제공된다.
본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 약 1 나노그램 내지 약 2000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램의 DNA를 포함한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 25 내지 약 250 마이크로그램의 DNA를 함유한다. 일부의 바람직한 구체예에서, 약제학적 조성물은 약 100 내지 약 200 마이크로그램의 DNA를 함유한다.
본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 사용될 투여의 모드에 따라 제제화된다. 약제학적 조성물이 주사용 약제학적 조성물인 경우에, 이들은 멸균되고, 발열성 물질을 함유하지 않으며, 미립자를 함유하지 않는다. 등장성 제제가 바람직하게 사용된다. 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제에는 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 소르비톨 및 락토즈가 포함될 수 있다. 일부의 경우에, 포스페이트 완충된 식염수와 같은 등장성 용액이 바람직하다. 안정화제에는 젤라틴 및 알부민이 포함된다. 일부의 구체예에서는, 혈관수축제가 제제에 첨가된다.
본 발명의 일부의 구체예에 따르면, 면역반응을 유도하는 방법이 제공된다. 백신은 단백질 기본, 생약독화 백신, 세포 백신, 재조합 백신 또는 핵산 또는 DNA 백신일 수 있다. 일부의 구체예에서, 점막 면역반응을 유도하는 방법을 포함하는, 개체에게서 면역원에 대한 면역반응을 유도하는 방법은 개체에게 CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 및 그의 기능적 단편 또는 그의 발현가능한 코드화 서열 중의 하나 또는 그 이상을 본 발명의 단백질을 코드화한 분리된 핵산 분자 및/또는 본 발명의 단백질을 코드화한 재조합 백신 및/또는 본 발명의 단백질의 서브유니트 백신 및/또는 생약독화 백신 및/또는 사멸 백신을 함께 투여하는 것을 포함한다. CTACK 단백질, TECK 단백질, MEC 단백질 및 그의 기능적 단편 중의 하나 또는 그 이상은 면역원을 코드화한 분리된 핵산 분자; 및/또는 면역원을 코드화한 재조합 백신 및/또는 면역원을 포함하는 서브유니트 백신 및/또는 생약독화 백신 및/또는 사멸 백신의 투여 전에, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 일부의 구체예에서는, CTACK, TECK, MEC 및 그의 기능적 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 단백질을 코드화한 분리된 핵산 분자가 개체에게 투여된다.
본 발명은 이하의 실시예에서 더 설명된다. 이 실시예는 본 발명의 구체예를 나타내지만 단지 설명을 목적으로 제시된 것으로 이해되어야 한다. 상기한 검토 및 이 실시예로부터, 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 본 발명의 필수적인 특징을 확인할 수 있으며, 그의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 본 발명이 다양한 용도 및 조건에 적합하도록 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 본 발명에 나타내고 기술된 것 이외에도 본 발명의 다양한 변형은 전술한 설명으로부터 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 명백할 것이다. 이러한 변형은 또한, 첨부된 특허청구의 범위의 범위 내에 포함시키고자 한다.
본 발명 전체에 걸쳐서 인용된 미국 특허, 미국 특허출원 및 참고문헌은 각각 이에 의해서 온전히 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1
pConNS4B , pConNS5A 및 pConNS5B 의 설계 및 발현
로스 알라모스 국립연구소 HCV 서열 데이터베이스로부터 수득한 170개의 상이한 서열들로부터 HCV 단백질 NS4B, NS5A 및 NS5B에 대한 HCV 유전자형 1a 공통 서열을 생성하였다. 그리고 나서, 그의 발현 및 검출을 향상시키기 위해, 각 컨스트럭트의 C-말단에 IgE 리더 서열을 부가하고 N-말단에 IgE 리더 서열의 부가하는 것을 포함하여, 상기 공통 컨스트럭트에 몇 가지 변형을 가하였다. 또한, 각 컨스트럭트를 GeneOptimizer™(GENEART, Germany)를 이용한 코돈 및 RNA 최적화를 통해 더 변형시켰고 CMV 프로모터의 제어 하에 임상 발현 벡터 pVAX 내로 서브클로닝하였다. 최종 컨스트럭트를 pConNS4B, pConNS5A 및 pConNS5B로 명명하였다(도 8A-8C에 플라스미드 지도가 나타나 있음).
각 컨스트럭트의 단백질 발현을 각각의 개별적인 컨스트럭트를 이용한 인간 RD 근육 세포의 일시적인 형질감염을 통해 확인하였다. RD 근육 세포를 제조업체의 지침에 따라 리포펙타민™(Invitrogen)을 이용하여 pConNS4B, pConNS5A 및 pConNS5B으로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후, 세포를 고정시키고 투과시켰다. 각 단백질의 발현을 항-HA 폴리클로날 토끼 항체(Invitrogen) 이후 Cy3 콘주게이트된 염소 항-토끼 2차 항체(Invitrogen)로 검출하였다.
세포를 공초점 현미경을 이용하여 그리고 250X 배율에서 시각화하였다(이미지는 나타나 있지 않음). 세 가지 모든 컨스트럭트들이 발현되는 것으로 나타났으며, pConNS4B가 가장 높은 수의 형질감염된 세포를 나타낸 반면, pConNS5B가 가장 적은 수의 형질감염된 세포를 나타내었다. 공 벡터 pVax를 이용한 형질감염을 대조군으로 사용하였다.
실시예 2
pConNS4B , pConNS5A 및 pConNS5B 를 이용한 C57BL /6 마우스의 면역화가 강한 세포 면역 반응을 유도한다
컨스트럭트의 발현이 확인되자마자, 컨스트럭트의 면역원성을 결정하기 위해, C57BL/6 마우스를 면역화시켰다. 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 잭슨 실험실로부터 구입하여 미국국립보건원 및 펜실베이아 동물실험윤리위원회(IACUC) 지침에 따라 유지시켰다. 동물을 그룹당 5마리씩 각각의 개별적인 컨스트럭트에 대해 세 개의 상이한 복용 그룹으로 나누었다. 5μg, 12.5μg 또는 25μg의 pConNS4B, pConNS5A 또는 pConNS5B을 이용하여 근육내로 동물을 면역화시킨 다음, 전기천공을 수행하였다. 전기천공은 CELLECTRA™ 적응형 정전류 전기천공 장치 및 전극 어레이(Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA)를 이용하여 수행하였다.
동물에게 2주 간격으로 총 2번의 면역화를 하고 두 번째 면역화 후 1주일째에 희생시켰다. 컨스트럭트의 면역원성은 IFN-γ ELISpot 분석을 사용하여 결정하였다.
마우스 IFN-γ ELISpot 분석은 문헌[Yan, J., 등, Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype B consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther, 2007. 15(2): p. 411-21]에 종래 기술된 대로 수행하였다. 비장세포를 8개의 아미노산이 중첩되고 각 컨스트럭트의 길이에 걸쳐있는 15머 펩타이드의 집단(pool)으로 자극시켰다. 펩타이드를 Genscript(Piscataway, NJ)에 의해 합성하고, DMSO에 재현탁시키고, 2μg/ml/펩타이드의 농도로 모았다. 비장세포를 웰당 200,000 세포의 농도로 도말하였다. 결과를 조정하고 1x10⁶ 비장세포 당 점 형성 단위(spot forming unit; SFU)의 평균 수로서 도식화하였다. 결과를 도 1에서 확인할 수 있다.
컨스트럭트의 면역원성은 면역형광에 의해 결정되는 컨스트럭트의 발현 수준과 상관관계가 높다. 모든 컨스트럭트들이 상당히 면역원성임에도 불구하고, pConNS4B에 대한 반응이 가장 큰 반면 pConNS5B에 대한 반응은 가장 적었다. pConNS4B에 대한 최적 용량은 12.5μg(1687 ± 237 SFU/10⁶ 비장세포)이었고, pConNS5A에 대한 최적 용량은 5μg(1091 ± 111 SFU/10⁶ 비장세포)이었으며, pConNS5B에 대한 최적 용량은 12.5μg(736 ± 136 SFU/10⁶ 비장세포)이었다.
각 컨스트럭트에 대한 투여량이 결정되면, 각 컨스트럭트에 의해 유도된 세포 면역 반응을 더 상세히 분석하였다. 앞서 기재된 바와 같이, 동물을 면역화시키고, 그룹화하였다. 희생 후, 비장을 분리하고 스토마커 장치를 사용하여 개별적으로 분쇄하였다. 비장세포를 40μM 세포 여과기(cell strainer)로 여과하고 ACK 세포용해 버퍼(Biosource)로 5분간 처리하여 RBC를 소거하였다. 비장세포를 완전 배지(10% 열 불활성화된 FBS, 1X 항생제/항-진균제, 및 55μM/L β-머캅토에탄올이 보충된, 2mM/L L-글루타민을 갖는 RPMI 1640)에 재현탁시켰다. 혈구계를 이용하여 세포수를 결정하였다.
각 컨스트럭트에 대한 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응의 상대적 기여도를 결정하기 위해, 비장세포를 IFN-γ에 대해 세포내로 염색하고 유세포측정을 이용하여 시각화하였다(도 2). 세포내 사이토카인 염색의 결과들은 IFN-γ ELISpot 분석을 이용하여 앞서 관찰된 것과 상관관계가 높았다. pConNS4B에 대한 반응이 가장 높은 반면, pConNS5B는 가장 면역원성이 낮았다. 각 컨스트럭트에 대해 특이적인 CD4+ T 세포들이 또한 확인되었음에도 불구하고, pConNS4B 및 pConNS5A에 대한 대다수의 IFN-γ 반응들은 CD8+ T 세포에 의해 생산되었다. 흥미롭게도, pConNS5B에 대한 대다수의 IFN-γ 반응은 CD4+ T 세포에 의해 매개되었고, IFN-γ+ CD8+ T 세포들은 거의 확인되지 않았다. pConNS4B, pConNS5A 및 pConNS5B에 대한 IFN-γ+ CD4+ T 세포의 평균 백분율은 각각 0.50% ± 0.11%, 0.27% ± 0.06% 및 0.32% ± 0.11%였다(도 3A). pConNS4B 및 pConNS5A에 대한 IFN-γ+ CD8+ T 세포의 평균 백분율은 각각 3.29% ± 1.33% 및 0.68% ± 0.22%였다(도 3B).
실시예 3
면역화 유도된 NS4B -, NS5A - 및 NS5B -특이적 T 세포들이 근육내 면역화 후 간 내부에서 검출되었다.
전술한 실시예 1에서 앞서 기술된 바와 같이, 마우스를 면역화시켰다. 최종 면역화 후 1주일째에 동물을 희생시켰다. 희생 후, 간을 분리하고 스토마커 기계를 이용하여 개별적으로 분쇄하였다. 얻어진 혼합물을 여과하고 RBC를 10ml ACK 세포용해 버퍼(Bioscience)로 5분간 처리하여 RBC를 소거하였다. 상기 혼합물을 펠렛화하고 35% 퍼콜 구배를 이용하여 림프구로부터 간세포를 분리하였다. 상기 펠렛화된 림프구를 완전 배지에 재현탁시켰다. 실험을 간 관류를 이용 및 이용하지 않고 수행하였으며, 차이가 관찰되지 않았다.
T 세포를 각각의 간으로부터 분리하고, 각각의 개별적인 컨스트럭트에 상응하는 중첩 펩타이드를 이용하여 자극시켰다. 면역화 유도된 HCV-특이적 T 세포를 세포내 사이토카인 염색 및 유세포측정을 통해 검출된 IFN-γ 발현에 의해 확인하였다. 각 동물을 개별적으로 분석하였다. 흥미롭게도, HCV-특이적 T 세포들은 모든 면역화된 마우스의 간에서 확인되었다. 두 가지 CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응은 pConNS4B 및 pConNS5A로 면역화된 마우스의 간 내부에서 검출되었고, CD4+ T 세포 반응만이 pConNS5B로 면역화된 마우스에서 검출되었다. 간 내부에서 검출된 지배적인 T 세포 반응들은 비장 내부에서 확인된 것과 동일하였다. pConNS4B 및 pConNS5A로 면역화된 마우스들은 간 내부에서 강한 CD8+ T 세포 반응을 가진 반면, pConNS5B로 면역화된 마우스들은 주로 CD4+ T 세포 반응을 나타내었고 CD8+ T 세포 반응은 거의 나타내지 않았다. pConNS4B, pConNS5A 및 pConNS5B에 대한 CD4+ T 세포 반응은 각각 0.29% ± 0.07%, 0.41% ± 0.09% 및 0.41% ± 0.06%였다(도 4A). pConNS4B, pConNS5A 및 pConNS5B에 대한 CD8+ T 세포 반응은 각각 3.73% ± 0.73%, 2.28% ± 0.68% 및 0.06% ± 0.02%였다(도 4B).
실시예 4
3.4 간세포에 의한 HCV 항원의 간-특이적 발현이 형질감염된 간세포의 IFN -γ 생산 및 소거 증가를 야기하였다
다음으로, 본 발명자들은 NS4B, NS5A 또는 NS5B 단백질의 간-특이적 발현이 간 내부에서 검출된 HCV-특이적 T 세포를 활성화시킬 수 있는지 여부를 결정하고자 하였다. NS4B, NS5A 및 NS5B의 간-특이적 발현을 유도하기 위해, 문헌[Ahlen, G., 등, In vivo clearance of hepatitis C virus nonstructural 3/4A- expressing hepatocytes by DNA vaccine - primed cytotoxic T lymphocytes . J Infect Dis, 2005. 192(12): p. 2112-6]에서 종래에 기재된 바와 같이 pConNS4B, pConNS5A 또는 pConNS5의 꼬리 정맥 주사를 투여함으로써 면역화된 마우스의 간세포를 형질감염시켰다. 간을 48시간 동안 형질감염시킨 다음, 이들을 수확하여 전술한 실시예 3에 기재된 바와 같이 간 림프구를 분리하였다. 앞서 언급된 바와 같이, 면역화 유도된 HCV-특이적 T 세포를 세포내 사이토카인 염색 및 유세포측정을 통해 검출된 IFN-γ 분비에 의해 확인하였다.
세포내 사이토카인 염색
비장세포를 1x10⁶ 세포/100μl의 농도로 완전 배지에 재현탁시키고 둥근바닥 96-웰 플레이트에 도말하였다. 비장세포를, 모두 GolgiStop 및 GolgiPlug(BD Bioscience)가 보충된 완전 배지에 희석된, 100μl의 1) 2μg/ml pConNS4B, pConNS5A 또는 pConNS5B 중첩 펩타이드, 2) 1μg/ml 스타필로코쿠스 장독소 B(양성 대조군; 시그마-알드리치, St. Louis, MO) 또는 3) 0.1% 디메틸 설폭사이드(음성 대조군) 중 하나로 자극시켰다. 비장세포를 37℃에서 총 5시간 동안 자극시킨 다음, 세포를 PBS로 3회 세척하고 생존율을 위해 염색하였다. 비장세포를 표면 마커인 항-CD4, CD8에 대해 4℃에서 30분간 세포외로 염색시켰다. 이후, 비장세포를 투과시키고 BD Cytofix/Cytoperm 용액 키트(BD Bioscience)를 이용하여 세척한 다음, 항-IFN-γ 및 CD3으로 4℃에서 45분간 세포내로 염색시켰다. 염색 후, 비장세포를 1% 파라포름알데하이드로 고정시키고 분석 때까지 4℃에서 보관하였다. 각 동물에 대해, 특이적 기능은 펩타이드 자극된 그룹의 퍼센트 기능에서 0.1% 디메틸 설폭사이드 자극된 그룹(음성 대조군)의 퍼센트 기능을 뺀 것으로서 보고되었다.
유세포측정 시약
하기와 같은 직접 콘주게이트된 항체들을 사용하였다: 항-마우스 CD3-알로피코시아닌 시아닌 염료 7(APC-Cy7)[클론 145-C11], 항-마우스 CD4-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)[클론 H129.19], 항-마우스 CD8-페리디닌 클로로필 단백질 5.5(PerCP5.5)[클론 53-6.7], 항-마우스 IFN-γ-피코에리트린 시아닌 염료 7(PE-Cy7)[클론 XMG1.2](모두 BD Biosciences, San Jose, CA). 살아있는 세포를 확인하기 위해 Aqua Live/Dead fixable dead cell Stain Kit(Molecular Probes, Eugene, OR)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다.
샘플을 LSRII 유세포 측정기(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) 상에서 수집하였다. BD CompBeads(BD Biosciences) 및 단일 형광색소를 보상을 위해 사용하였다. 데이타를 FlowJo 소프트웨어, Mac용 버전 8.7.1(Tree Star, Ashland, OR)을 이용하여 분석하였다.
꼬리 정맥 주사 후, 비장 및 휴지중인 간에서 검출된 HCV-특이적 T 세포의 백분율에 비해, 세 가지 모든 면역화 그룹에서 CD4+ 및 CD8+ HCV-특이적 T 세포의 백분율에서의 엄청난 증가가 관찰되었다(도 5). CD4+ HCV-특이적 T 세포의 백분율은 pConNS4B, pConNS5A 및 pConNS5B로 각각 면역화된 마우스에 대해, 2.27% ± 0.70%, 2.55% ± 0.70% 및 1.22% ± 0.22%였다(도 6A). CD8+ HCV-특이적 T 세포의 백분율은 pConNS4B, pConNS5A 및 pConNS5B로 각각 면역화된 마우스에 대해 9.46% ± 1.53%, 6.98% ± 0.48% 및 0.477% ± 0.16%였다(도 6B). 꼬리 정맥 주사 전 및 후에 간에서의 HCV-특이적 IFN-γ+ T 세포의 백분율에 의해 결정되는 바와 같이, 가장 큰 배수 증가는, CD4+ T 세포 반응으로 관찰되었다. pConNS4B, pConNS5A 및 pConNS5B 면역화된 마우스에서의 간내 CD4+ T 세포 반응에서의 배수 증가는 각각 대략 8, 6 및 3배였다. CD8+ T 세포 반응은 꼬리 정맥 주사 전과 후 모두에 간에서 지배적인 반응으로 남아 있는 반면, CD4+ T 세포 반응과 비교하여, CD8+ T 세포 반응에서 약간 더 적은 배수 증가가 관찰되었다. pConNS4B, pConNS5A 및 pConNS5B 면역화된 마우스에서의 간내 CD8+ T 세포 반응에서의 배수 증가는 각각 대략 3, 3 및 8배였다.
각 컨스트럭트에 의해 생성된 간내 HCV-특이적 IFN-γ 반응을 평가한 후에, 면역화가 간내 세포독성 HCV-특이적 T 세포도 생성하였는지 여부를 결정하는 연구를 수행하였다. 각 그룹 내의 각 동물로부터 간엽을 수득하고 NS4B, NS5A 또는 NS5B의 간세포 발현을 위해 염색하였다. 형질감염된 면역화 미처리 대조군과 비교하여, 각 컨스트럭트를 이용한 면역화에 의해 생성된 간내 T 세포 반응의 세포독성을, 형질감염후 각각의 면역화된 동물들이 NS4B, NS5A 또는 NS5B 발현 간세포들을 소거하는 능력에 의해 평가하였다. 각 그룹에 대해 이 염색의 대표적인 공초점 이미지를 관찰하였다(이미지는 나타나 있지 않음).
공초점 현미경검사
간을 절개하고 생검을 2% 파라포름알데하이드에서 고정시킨 다음, 30% 수크로오스에서 동결보호시켰다. 생검을 Tissue-Tek OCT(Bayer Corporation, Pittsburgh, PA)에 담그고 드라이아이스 질소 위에서 2-메틸 부탄에 급속 동결시켰다. 수퍼프로스트 플러스 유리 슬라이드(Superfrost Plus glass slide)(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) 위에 얹혀진 조직 절편(6μm)에 염색을 수행하고, 사용할 때까지 80℃에 유지시켰다. 면역형광 염색 전, 슬라이드를 실온으로 옮기고 각각 10분간 포스페이트-완충 식염수(PBS)로 3회 세척하고, 2차 시약이 증가된 종의 10% 정상 혈청, 및 0.1% 트리톤을 함유하는 PBS 중에서 블로킹시켰다. 일차 시약을 절편에게 적용하고 실온에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 배양하였다. 절편을 각각 10분간 PBS에서 3회 세척하고, 필요한 경우, 2차 시약을 실온에서 30분간 적용하였다. 절편을 다시 각각 10분간 PBS에서 3회 세척하였다. 프로롱 골드(Prolong Gold) 마운팅 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 커버슬립을 얹고, 연구 및 촬영 때까지 슬라이드를 4℃ 암실에서 유지시켰다. 모든 염색은 가습 환경에서 수행하였다. 사용된 항체들은 인비트로젠사(Invitrogen) 또는 대안적으로 항체를 제조하는 경쟁 회사로부터 수득하였다. 모든 이미지는 Zeiss Axiovert 100 역상 공초점 현미경을 이용하여 수득하였고 형광 세기의 분석 및 정량화는 이미지 J 소프트웨어(NIH, Rockville, MD)를 이용하여 수행하였다.
핵 DAPI 염색의 MFI에 의해 측정된 바와 같이, 각 필드 내에 존재하는 간세포의 수에 의해 정규화된 NS4B, NS5A 또는 NS5B 발현의 평균 형광 세기(MFI)에 의해 각 그룹에 대한 형질감염된 간세포의 소거를 정량화하였다(도 9). 미처리 대조군과 비교하여, 형질감염된 간세포의 수의 급격한 감소가 세 가지 모든 컨스트럭트에 대해 면역화된 동물 그룹에서 관찰되었다. pConNS4B, pConNS5A 또는 pConNS5B로 면역화된 동물은 미처리 대조군과 비교하여 형질감염된 간세포 발현이 약 9, 3, 및 2배 감소하였다. 각 면역화 그룹에서 관찰된 소거량은 형질감염된 간 내부에서 검출된 HCV-특이적 CD8+ T 세포 반응과 상관관계가 높았다. pConNS4B로 면역화된 동물에서 가장 큰 소거량이 관찰되었고 pConNS5B 면역화된 동물에서 가장 적은 소거가 관찰되었다.
제공된 결과들은, 간내 HCV-특이적 T 세포들의 거대한 집단(pool)의 형성을 야기하는 동족 항원의 간-특이적 발현이 없을 때, 전신 면역화를 통해 유도된 HCV-특이적 T 세포가 간 안으로 동원된다는 것을 보여준다. 이들 T 세포는 간 내부에서 완전히 기능적인 상태로 유지되는데, 이는 이들의 휴지 중인 간으로의 동원이 면역 감시의 끊임없는 공정의 일부로서 대신 기능할 수 있고 이것이 간이 감염을 막는 중요한 기전임을 입증할 수 있다는 것을 제시한다. 이를 지지하여, HCV 항원의 간-특이적 발현에 대한 반응으로, 간에 국한된 HCV-특이적 T 세포들의 이 모집단은 IFN-γ 발현을 빠르게 유도할 수 있고 형질감염된 간세포를 소거시킬 수 있었다. T 세포 침윤이 간 형질감염 이후 72시간까지 관찰되지 않았다고 종래에 보고되었으므로(Ahlen 등, supra), HCV 형질감염된 간세포의 급격한 소거는 형질감염 이전에 간 내부에 존재하는 간에 국한된 HCV-특이적 T 세포 집단에 좌우될 가능성이 높은 것 같다. 또한, pConNS5B로 면역화된 동물에서 관찰된 바와 같이, IFN-γ 생산에 의해 측정된 비교적 작은 비율의 백신-특이적 반응만으로도 간 내부에서 형질감염된 간세포를 2배 감소시키는 것을 유도하는데 충분하였고, 이는 주변에서 검출된 작은 비율의 백신-특이적 반응이 간 내부에서 상당한 효과를 발휘하는 능력을 가진다는 것을 제시한다.
간-유도된 T 세포 내성은 전신 면역화를 통해 전복될 수 있고 그 효과적인 간-특이적 면역력은 휴지 상태 하에 항원-특이적 T 세포를 동원하고 격리시키는 간의 능력을 이용함으로써 달성될 수 있다. 간의 이러한 독특한 특성은 바이러스로 이미 감염된 환자에서 HCV-특이적 반응을 높이는데 이용될 수 있을 뿐만 아니라, 미처리 개인의 내부에서 감염의 첫 번째 징후시 빠르게 반응하고 동원되는 능력을 갖는 HCV-특이적 T 세포의 집단을 생성하는데 이용될 수 있다. 종합하면, 상기 발견은, 항원-특이적 T 세포의 간으로의 동원이, 간 내부에서의 이들의 효과기 기능의 보존과 함께, 면역 감시의 공정에서 중요하면서도 종래에 인정받지 못한 역할을 할 수 있어, 미래의 T 세포 기반 HCV 백신에 이용될 수 있음을 제시한다.

<110> THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA INOVIO PHARMACEUTICALS, INC. WEINER, David LANG, Krystle YAN, Jian DRAGHIA-AKLI, Ruxandra KHAN, Amir <120> IMPROVED HCV VACCINES AND METHODS FOR USING THE SAME <130> UPVG0024 WO2 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Sequence of ConNS4B <400> 1 gccaccatgg attggacctg gatcctgttc ctcgtggccg ctgccacaag agtgcacagc 60 agccagcatc tgccctacat cgaacagggc atgatgctgg ccgagcagtt caaacagaaa 120 gccctgggcc tgctgcagac agccagcaga cagggaagag gcattgcccc tgccgtgcag 180 accaactggc agaagctgga agccttctgg gccaagcaca tgtggaactt catcagcggc 240 atccagtacc tggccggcct gagcaccctg cctggcaacc ctgccattgc cagcctgatg 300 gccttcacag ccgccgtgac cagccctctg accacctccc agaccctgct gttcaacatc 360 ctgggcggat gggtggcagc ccagctggca gctcctggcg ccgctacagc ctttgtggga 420 gccggactgg ctggcgctgc catcggaagc gtgggcctgg gcaaggtgct ggtcgacatc 480 ctggccggct atggcgctgg cgtggctggg gccctggtgg cattcaagat catgagcggc 540 gaggtgccca gcaccgagga cctggtgaat ctgctgcccg ccattctgtc acctggcgct 600 ctggtggtgg 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gagatcctgc ggaagtcccg gaagttcccc cctgccatgc ccatctgggc cagacctgac 1020 tacaaccccc ccctgctgga aagctggaag gaccccgact acgtgcctcc tgtggtgcac 1080 ggctgccctc tgcctccaac caaggcccct cccatccccc ctcccagacg gaagagaacc 1140 gtggtgctga cagagtccac cgtgtctagc gccctggccg agctggccac caagaccttc 1200 ggcagcagcg agagcagcgc cgtggattct ggcacagcca ccgcccctcc cgatcagcct 1260 agcgacgacg gcgacaccgg ctccgatgtg gagagctaca gcagcatgcc ccccctggaa 1320 ggcgaacccg gcgaccctga cctgagcgac ggcagctggt ctaccgtgtc cgaggaagcc 1380 agcgaggacg tcgtgtgctg ctacccctac gacgtgcccg actacgcctg ataa 1434 <210> 4 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence of ConNS5A <400> 4 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp Ile Cys Thr 20 25 30 Val Leu Thr Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gln Ser Lys Leu Leu Pro Arg 35 40 45 Leu Pro Gly Val Pro Phe Phe Ser Cys Gln Arg Gly Tyr Lys Gly Val 50 55 60 Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met Gln Thr Thr Cys Pro Gly Gly Ala Gln 65 70 75 80 Ile Thr Gly His Val Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Val Gly Pro Lys 85 90 95 Thr Cys Ser Asn Thr Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn Ala Tyr Thr 100 105 110 Thr Gly Pro Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser Arg Ala Leu 115 120 125 Trp Arg Val Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg Val Gly Asp 130 135 140 Phe His Tyr Val Thr Gly Met Thr Thr Asp Asn Val Lys Cys Pro Cys 145 150 155 160 Gln Val Pro Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly Val Arg Leu 165 170 175 His Arg Tyr Ala Pro Ala Cys Lys Pro Leu Leu Arg Glu Glu Val Thr 180 185 190 Phe Gln Val Gly Leu Asn Gln Tyr Leu Val Gly Ser Gln Leu Pro Cys 195 200 205 Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu Thr Asp Pro 210 215 220 Ser His Ile Thr Ala Glu Ala Ala Gly Arg Arg Leu Ala Arg Gly Ser 225 230 235 240 Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Pro Ser 245 250 255 Leu Lys Ala Thr Cys Thr Thr His His Asp Ser Pro Asp Ala Asp Leu 260 265 270 Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr 275 280 285 Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val Ile Leu Asp Ser Phe Asp Pro 290 295 300 Leu Arg Ala Glu Glu Asp Glu Arg Glu Val Ser Val Pro Ala Glu Ile 305 310 315 320 Leu Arg Lys Ser Arg Lys Phe Pro Pro Ala Met Pro Ile Trp Ala Arg 325 330 335 Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu Glu Ser Trp Lys Asp Pro Asp Tyr 340 345 350 Val Pro Pro Val Val His Gly Cys Pro Leu Pro Pro Thr Lys Ala Pro 355 360 365 Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg Lys Arg Thr Val Val Leu Thr Glu Ser 370 375 380 Thr Val Ser Ser Ala Leu Ala Glu Leu Ala Thr Lys Thr Phe Gly Ser 385 390 395 400 Ser Glu Ser Ser Ala Val Asp Ser Gly Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp 405 410 415 Gln Pro Ser Asp Asp Gly Asp Thr Gly Ser Asp Val Glu Ser Tyr Ser 420 425 430 Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp 435 440 445 Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Glu Glu Ala Ser Glu Asp Val Val Cys 450 455 460 Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 465 470 <210> 5 <211> 1866 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA Sequence of ConNS5B <400> 5 gccaccatgg attggacctg gatcctgttc ctggtggccg ctgccacaag agtgcacagc 60 agcatgagct actcttggac aggcgccctg gtgacacctt gtgccgccga ggaacagaag 120 ctccccatca acgccctgag caacagcctg ctgcggcacc acaacctggt gtacagcacc 180 acctccagaa gcgcctgtca gcggcagaaa aaagtgacct tcgaccggct gcaggtgctg 240 gacagccact accaggacgt gctgaaagaa gtgaaggctg ccgccagcaa agtgaaggcc 300 aatctgctgt ccgtggagga agcctgcagc ctgacacccc ctcacagcgc caagagcaag 360 ttcggctacg gcgccaagga tgtgcggtgc cacgccagaa aggccgtgaa ccacatcaac 420 agcgtgtgga aggatctgct ggaagatagc gtgaccccca tcgacaccac catcatggcc 480 aagaacgagg tgttctgcgt gcagcccgag aagggcggca gaaagcccgc cagactgatc 540 gtgttccccg acctgggcgt gagagtgtgc gagaagatgg ccctgtacga cgtggtgtcc 600 aagctgcctc tggccgtgat gggcagcagc tacggcttcc agtacagccc tggccagcgg 660 gtggaattcc tggtgcaggc ctggaagtcc aagaaaaccc ccatgggctt cagctacgac 720 accagatgct tcgacagcac tgtgaccgag agcgacatcc ggaccgagga agccatctac 780 cagtgctgcg acctggaccc tcaggccaga gtggccatca agagcctgac cgagagactg 840 tacgtgggcg gacctctgac caacagcaga ggcgagaact gcggcgccag aagatgtaga 900 gccagcggcg tgctgaccac ctcctgcggc aacaccctga cctgttacat caaggccaga 960 gccgcctgta gagccgccgg actgcaggac tgcaccatgc tggtgtgcgg cgacgacctg 1020 gtggtgatct gcgagtctgc cggcgtgcag gaagatgccg ccagcctgag agccttcacc 1080 gaggccatga ccagatacag cgcccctccc ggcgatcctc cccagcccga gtacgacctg 1140 gaactgatca ccagctgcag cagcaacgtg tccgtggccc acgatggcgc cggaaagcgg 1200 gtgtactacc tgaccaggga ccctaccaca cctctggcaa gggccgcttg ggagacagcc 1260 agacacaccc ccgtgaacag ctggctgggc aacatcatca tgttcgcccc caccctgtgg 1320 gcccggatga tcctgatgac ccacttcttc agcgtgctca tcgcccggga tcagctggaa 1380 caggccctgg actgcgagat ctacggcgcc tgctacagca tcgagcccct ggatctgccc 1440 cccatcatcc agagactgca cggcctgagc gccttctccc tgcacagcta cagcccaggc 1500 gagatcaaca gagtggccgc ctgcctgcgg aaactgggcg tgcctcctct gagagcctgg 1560 cggcacagag ccagatccgt gcgggccaga ctgctgtcaa gaggcggcag agcagccatc 1620 tgcggcaagt acctgttcaa ctgggccgtg cggaccaagc tgaagctgac ccctatcgcc 1680 gctgccggcc agctggatct gagcggctgg ttcacagccg gctacagcgg cggagacatc 1740 taccacagcg tgtcaagagc cagaccccgg tggttctggt tttgcctgct gctgctggcc 1800 gctggcgtgg gcatctatct gctgcccaac agatacccct acgacgtgcc cgactacgcc 1860 tgataa 1866 <210> 6 <211> 618 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Sequence of ConNS5B <400> 6 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser Ser Met Ser Tyr Ser Trp Thr Gly Ala Leu Val Thr Pro Cys 20 25 30 Ala Ala Glu Glu Gln Lys Leu Pro Ile Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu 35 40 45 Leu Arg His His Asn Leu Val Tyr Ser Thr Thr Ser Arg Ser Ala Cys 50 55 60 Gln Arg Gln Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gln Val Leu Asp Ser 65 70 75 80 His Tyr Gln Asp Val Leu Lys Glu Val Lys Ala Ala Ala Ser Lys Val 85 90 95 Lys Ala Asn Leu Leu Ser Val Glu Glu Ala Cys Ser Leu Thr Pro Pro 100 105 110 His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Cys 115 120 125 His Ala Arg Lys Ala Val Asn His Ile Asn Ser Val Trp Lys Asp Leu 130 135 140 Leu Glu Asp Ser Val Thr Pro Ile Asp Thr Thr Ile Met Ala Lys Asn 145 150 155 160 Glu Val Phe Cys Val Gln Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg 165 170 175 Leu Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala 180 185 190 Leu Tyr Asp Val Val Ser Lys Leu Pro Leu Ala Val Met Gly Ser Ser 195 200 205 Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg Val Glu Phe Leu Val Gln 210 215 220 Ala Trp Lys Ser Lys Lys Thr Pro Met Gly Phe Ser Tyr Asp Thr Arg 225 230 235 240 Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu Ser Asp Ile Arg Thr Glu Glu Ala 245 250 255 Ile Tyr Gln Cys Cys Asp Leu Asp Pro Gln Ala Arg Val Ala Ile Lys 260 265 270 Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Val Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Arg 275 280 285 Gly Glu Asn Cys Gly Ala Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr 290 295 300 Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Ile Lys Ala Arg Ala Ala 305 310 315 320 Cys Arg Ala Ala Gly Leu Gln Asp Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp 325 330 335 Asp Leu Val Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly Val Gln Glu Asp Ala Ala 340 345 350 Ser Leu Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro 355 360 365 Gly Asp Pro Pro Gln Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu Ile Thr Ser Cys 370 375 380 Ser Ser Asn Val Ser Val Ala His Asp Gly Ala Gly Lys Arg Val Tyr 385 390 395 400 Tyr Leu Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu 405 410 415 Thr Ala Arg His Thr Pro Val Asn Ser Trp Leu Gly Asn Ile Ile Met 420 425 430 Phe Ala Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile Leu Met Thr His Phe Phe 435 440 445 Ser Val Leu Ile Ala Arg Asp Gln Leu Glu Gln Ala Leu Asp Cys Glu 450 455 460 Ile Tyr Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro Leu Asp Leu Pro Pro Ile 465 470 475 480 Ile Gln Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser 485 490 495 Pro Gly Glu Ile Asn Arg Val Ala Ala Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val 500 505 510 Pro Pro Leu Arg Ala Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Val Arg Ala Arg 515 520 525 Leu Leu Ser Arg Gly Gly Arg Ala Ala Ile Cys Gly Lys Tyr Leu Phe 530 535 540 Asn Trp Ala Val Arg Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro Ile Ala Ala Ala 545 550 555 560 Gly Gln Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Thr Ala Gly Tyr Ser Gly Gly 565 570 575 Asp Ile Tyr His Ser Val Ser Arg Ala Arg Pro Arg Trp Phe Trp Phe 580 585 590 Cys Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyr Leu Leu Pro Asn 595 600 605 Arg Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 610 615 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE Leader DNA sequence for NS5A <400> 7 atggattgga cctggatcct gttcctggtg gccgctgcta ccagagtgca cagc 54 <210> 8 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE Leader DNA sequence for NS5B and NS4B <400> 8 atggattgga cctggatcct gttcctggtg gccgctgcca caagagtgca cagc 54 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgE leader protein <400> 9 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser

Claims (15)

1. 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 1 이상의 단백질을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자:
   a) 서열번호:2;
   서열번호:2와 98% 상동인 단백질; 또는
   서열번호:2의 면역원성 단편;
   b) 서열번호:4;
   서열번호:4와 98% 상동인 단백질; 또는
   서열번호:4의 면역원성 단편; 또는
   c) 서열번호:6;
   서열번호:6과 98% 상동인 단백질; 또는
   서열번호:6의 면역원성 단편.
2. 청구항 1에 있어서, 서열번호: 2; 서열번호:4; 또는 서열번호:6을 포함하는 그룹으로부터 선택된 1 이상의 단백질을 인코딩하는 핵산 분자.
3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열번호:9의 서열을 갖는 IgE 리더의 인코딩 서열이 부재한 핵산 분자.
4. 청구항 1에 있어서, 하기를 포함하는 그룹으로부터 선택된 1 이상의 서열을 포함하는 핵산 분자:
   a) 서열번호:1; 또는
   서열번호:1과 98% 상동인 코딩 서열;
   b) 서열번호:3; 또는
   서열번호:3과 98% 상동인 코딩 서열;
   또는
   c) 서열번호:5; 또는
   서열번호:5와 98% 상동인 코딩 서열;
5. 청구항 4에 있어서, 서열번호:1; 서열번호:3; 또는 서열번호:5를 포함하는 그룹으로부터 선택된 1 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
6. 청구항 4 또는 5에 있어서, 상기 핵산 분자는 IgE 리더의 인코딩 서열이 부재하고, 상기 부재한 인코딩은 서열번호:7 또는 서열번호:8인 핵산 분자.
7. 청구항 1 내지 6 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 플라스미드인 핵산 분자.
8. 청구항 1 내지 7중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 발현 벡터이고 상기 하나 초과의 단백질을 인코딩하는 서열은 조절 인자에 작동가능하게 연결된 핵산 분자.
9. 청구항 1 내지 8 중 어느 하나의 항의 핵산 분자를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, HCV로 진단된 대상체를 치료하는 방법.
10. 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단백질:
    a) 서열번호:2;
    서열번호:2와 98% 상동인 단백질; 또는
    서열번호:2의 면역원성 단편;
    b) 서열번호:4;
    서열번호:4와 98% 상동인 단백질; 또는
    서열번호:4의 면역원성 단편; 또는
    c) 서열번호:6;
    서열번호:6과 98% 상동인 단백질; 또는
    서열번호:6의 면역원성 단편.
11. 청구항 10에 있어서, 서열번호:2; 서열번호:4; 또는 서열번호:6을 포함하는 그룹으로부터 선택된 단백질을 인코딩하는 단백질.
12. 청구항 10 또는 11에 있어서, 상기 단백질은 서열번호:9를 갖는 IgE 리더가 부재한 단백질.
13. 청구항 10 내지 12 중 어느 하나의 항의 단백질을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, HCV로 진단된 대상체를 치료하는 방법.
14. 청구항 1 내지 8 중 어느 하나의 항의 핵산 분자 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
15. 청구항 10 내지 12 중 어느 하나의 항의 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
    

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