KR20140097529A - 항암 융합 단백질 - Google Patents

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예지 스체판 피에치콜란
세바스티안 파블락
미칼 스지마니크
안나 마리아 피에치콜란
바르틀로미 마체 제렉
피오트르 로즈가
알베르트 로베르트 야보르스키
말고르자타 이자벨라 테스카-카민스카
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아다메드 에스피. 제트 오.오.
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Abstract

본 발명은 hTRAIL95보다 낮지 않은 위치에 있는 아미노산으로 개시하는 가용성 hTRAIL 단백질 서열의 기능적 단편이거나, 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 85%의 서열 동일성을 가지며 아미노산 hTRAIL281로 종결하는 상기 기능적 단편의 동족체인 도메인 (a) 및 단백질 합성을 억제하는 효과기 펩타이드의 서열인 도메인 (b)를 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로, 상기 도메인 (b)의 서열은 상기 도메인 (a)의 C-말단 또는 N-말단에 부착되어 있다. 상기 융합 단백질은 암 질환이 치료를 위해 사용될 수 있다.

Description

항암 융합 단백질{Anticancer fusion protein}
본 발명은 치료학적 융합 단백질, 특히 재조합 융합 단백질 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 가용성 인간 TRAIL 단백질의 서열 및 단백질 합성을 억제하는 펩타이드 독소의 서열의 단편을 함유하는 융합 단백질, 이를 함유하는 약학적 조성물, 치료, 특히 항암제로서의 이의 용도, 및 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.
Apo2L (Apo2-리간드)로도 공지되어 있는 사이토카인 계열(종양 괴사 인자-관련된 아폽토시스 유도 리간드)의 구성원인 TRAIL 단백질은, 바이러스에 의해 감염된 세포 및 종양 세포에서 아폽토시스의 강력한 활성제이다. TRAIL은 체내에서 자연적으로 발생하는 리간드이다. TRAIL 단백질, 이의 아미노산 서열, 암호성 DNA 서열 및 단백질 발현 시스템은 EP 0 835 305 A1호에 최초로 개시되어 있다.
TRAIL 단백질은 아폽토시스 유발성 표면 TRAIL 수용체 1 및 2 (TRAIL-R1/R2)에 결합하고 후속적으로 이들 수용체를 활성화시킴으로써 이의 항암 활성을 나타낸다. DR4 및 DR5로도 공지되어 있는 이들 수용체(사멸 수용체 4 및 사멸 수용체 5)는 TNF 수용체 계열의 구성원이며 상이한 유형의 암세포에 의해 과발현된다. 이들 수용체의 활성화는, 활성화된 카스파제-8에 의해 실행성 카스파제의 활성화 및 이로 인한 핵산의 분해를 초래하는 억제 유전자 p53-독립적인 아폽토시스의 외부 신호전달 경로를 유도할 수 있다. TRAIL 활성화시에 방출된 카스파제-8은 또한 절단된 Bid 단백질의 방출을 유도할 수 있고, 이러한 Bid 단백질은 미토콘드리아로 전위되고, 이것은 시토크롬 c의 방출을 자극하여, 사멸 수용체로부터 아폽토시스 신호를 간접적으로 증폭시킨다.
TRAIL은 이러한 단백질에 대해 내성을 나타내는 건강한 세포 내에서 아폽토시스를 필수적으로 유도하지 않고 종양 세포에 선택적으로 작용한다. 그러므로, TRAIL의 엄청난 잠재성은 혈액암 및 고형 종양을 포함한 광범위하고 상이한 유형의 종양 세포에 작용하며 동시에 정상 세포에는 영향을 주지 않으며 잠재적으로 비교적 작은 부작용을 나타내는 항암제로서 인식되었다.
TRAIL 단백질은 281개의 아미노산 길이를 갖는 유형 II 막 단백질이며, 프로테아제에 의한 절단시 아미노산 잔기 114-281을 포함하는 이의 세포외 영역은 생물학적으로도 또한 활성인 20 kDa 크기의 가용성 sTRAIL 분자를 형성한다. TRAIL 및 sTRAIL의 두 형태는 표적 세포 상에 존재하는 TRAIL 수용체와의 상호 작용을 통해 아폽토시스를 촉발할 수 있다. TRAIL 분자의 가용성 부분의 강한 항종양 활성 및 매우 낮은 전신 독성은 세포주 시험을 사용하여 입증되었다. 또한, INN 둘라너민(dulanermin)으로 알려진 hTRAIL의 아미노산 114-281에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 재조합 인간 가용성 TRAIL(rhTRAIL)에 관한 예비 인간 임상 연구는 이의 양호한 내성 및 독성 제한 용량의 부재를 보여주었다. 예를 들면, EP 1 688 498에서 122-281hTRAIL의 재조합 원형 과변이된 돌연변이체에 대해 최근 보고된 바와 같이, 114-284보다 짧은 TRAIL의 단편도 또한 막 사멸 수용체와 결합하고, 이들 수용체를 통해 아폽토시스를 유도할 수 있다.
현재까지 보고된 간 세포 상의 재조합 TRAIL 단백질의 독성 효과는 변형, 즉 폴리히스티딘 태그의 존재와 관련되는 것으로 나타나며, 태그되지 않은 TRAIL은 어떠한 전신 독성도 나타내지 않았다.
그러나, 환자에 대한 추가의 임상 시험에서, 단일요법으로서의 TRAIL의 실제 효능은 낮은 것으로 입증되었다. 또한, 다수의 암세포에 의해 나타난 TRAIL에 대한 원발성 또는 후천성 내성은 문제가 있었다(예를 들면, WO 2007/022214호 참조). 내성은 각종 메커니즘으로 인한 것일 수 있으며, 암 유형에 특이적이거나 환자-의존적일 수 있다[Thorburn A, Behbakht K, Ford H. TRAIL receptor-targeted therapeutics: resistance mechanisms and strategies to avoid them. Drug Resist Updat 2008; 11: 17-24]. 이러한 내성은 항암제로서의 TRAIL의 유용성을 제한한다. TRAIL에 대한 내성의 메커니즘이 완전하게 이해되진 않았지만, 세포 표면 수용체의 수준으로부터 신호 전달 경로 내의 실행성 카스파제까지의 범위의 TRAIL-유도 아폽토시스 경로의 상이한 수준에서, 그 자체는 명백할 수 있는 것으로 믿어진다.
TRAIL에 대한 종양의 이러한 낮은 효능 및 내성을 극복하기 위해, 방사선요법제 및 화학요법제를 사용하는 각종 조합 요법이 설계되었으며, 이는 상승적인 아폽토시스 효과를 유발하였다(WO 2009/002947호; [A. Almasan and A. Ashkenazi, Cytokine Growth Factor Reviews 14(2003) 337-348; RK Srivastava, Neoplasis, Vol 3, No 6, 2001, 535-546, Soria JC et al., J. Clin. Oncology, Vol 28, No 9(2010), p.1527-1533]). 선택된 통상의 화학요법제(파클리탁셀, 카보플라틴) 및 단일클론 항-VEGF 항체와의 조합에 의한 암치료를 위한 rhTRAIL의 용도는 WO 2009/140469호에 개시되어 있다. 그러나, 이러한 조합은 종래의 화학요법 또는 방사선요법의 잘 공지된 결함을 필수적으로 내포한다. 그러나, 종래 기술은 TRAIL 단백질을 다른 단백질 또는 이의 단편과 융합시켜 수득된 TRAIL에 대한 세포 내성의 폐기를 제안하는 임의의 데이터에 대하여 침묵하고 있다.
더욱이, TRAIL 요법과 관련된 문제는 이의 낮은 안정성 및 투여 후 신체로부터의 신속한 제거인 것으로 입증되었다.
또한, 항암 요법은 종양 세포 단백질 합성의 억제에 관한 것일 수 있다. 세포내 단백질 합성을 억제함으로써 종양 세포 증식을 억제하는 유익한 효과는 공지되어 있다. 암 치료와 보완적인 암 치료 둘 다로서, 단백질 합성의 과정을 억제 또는 조절하는 물질의 임상적 사용에 대한 시도가 이루어지고 있다.
세포 단백질의 합성을 억제하는 물질은 세균, 진균 또는 식물 기원의 촉매 펩타이드 또는 단백질 독소이다. 촉매 도메인만을 가지고 결합 도메인을 갖지 않은 단일쇄 독소(헤미톡신으로도 공지되어 있음)는 통상적으로 세포에 대하여 실제로 무독성인 유리 천연 형태이다. 2개 이상의 쇄로 이루어진 독소(할로톡신으로도 공지되어 있음)는 촉매 도메인에 추가하여 결합 도메인을 가지지만 세포 선택성을 가지지 않아서 전신 투여 후 건강한 조직에 대한 바람직하지 못한 독성 및 광범위한 부작용을 나타낸다.
보다 높은 특이성을 달성하기 위해, 독소 또는 단백질 독소의 촉매 도메인은 캐리어 - 종양 세포 상에 존재하는 마커에 선택적으로 결합하는 리간드에 대하여 결합된다. 도메인 또는 리간드 표적화 단백질의 사용은 단질질의 독성 도메인을 세포로 특이적으로 전달할 수 있게 한다. 면역독소는, 독소가 결합 리간드에 연결되어 있는 융합 단백질 또는 접합체이며, 상기 결합 리간드는 항체, 성장 인자, 인터류킨 및 종양 괴사 인자와 같은 면역계 단백질이다. 성장인자 VEGF, FGF 및 PDGF와 리보솜 불활성화 단백질(ribosome inactivating protein: RIP)로 이루어진 그룹으로부터의 독소의 접합체, TNF와 RIP 독소의 접합체, IL-2와 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소의 접합체, IL-13와 슈도모나스 외독소의 접합체는 공지되어 있을 뿐만 아니라, 접합체 IL2-디프테리아 독소를 함유하는 치료제 Ontake®에 사용된다. 다른 예로는 겔로닌 및 아브린과 같은 독소와 인테그린, 피브로넥틴, I-CAM 및 그랜자임 B의 접합체 뿐만 아니라, 에불린과 트랜스페린의 접합체가 있다[Hall, W. A., Targeted toxin therapy for malignant astrocytoma. Neurosurgery 2000, 46, 544-551]. WO 2002/069886 및 US2003176331에서, 겔로닌 RIP 독소와 상기 독소의 표적화 전달을 위한 2차 폴리펩타이드의 접합화의 가능성이 언급되어 있다. 이러한 2차 폴리펩타이드의 다수의 가능한 유형 중에서도 TRAIL 단백질이 언급되어 있지만, 이러한 유형의 키메라의 구조 및 특성에 관한 어떠한 상세한 내용도 개시되어 있지 않다.
WO 2008052322에서, RIP 독소의 캐리어로서 세포 표면 구조에 결합하는 비-면역글로불린 폴리펩타이드 의 가능성이 언급되어 있다. WO 2008080218에서, 다수 열거된 TRAIL 중의 하나로 포함하는 사이토카인이 변형된 독소에 대한 캐리어로서 작용할 수 있는 것으로 언급되어 있지만, 상세한 설명은 TRAIL 및 독소를 포함하는 치료 효과적인 분자 및 이의 특성을 규정하는 어떠한 정보도 포함하지 않는다.
U.S. 6,627,197은 단백질 합성 불활성화 독소, HIV 프로테아제에 의해 절단가능한 펩타이드, 세포 표면에 결합하는 요소로서의 렉틴, 항바이러스제로서 적용되는 표적화 단편 및 소수성화제를 포함하는 작제물을 개시하고 있다.
종래 기술에서, 종양 환경에서 독소의 방출 및 그 결과 종양 세포로의 내지화를 가능하게 하는 특이적인 프로테아제에 의해 인식되는 절단 부위의 키메라 단백질에서의 용도도 또한 공지되어 있다. 예를 들면, US 7,252,993은 HIV 프로테아제에 의해 인식되는 링커를 통해 연결되는, 리신 및 표적화 펩타이드 - DP178 케모카인의 독성 단편을 포함하는 키메라 단백질을 개시하고 있다. 그러나, 이의 상세한 설명은 TRAIL-독소 키메라의 구조, 특성 및 적용에 대한 상세한 정보를 제공하지 않는다.
본 발명은 효과기 펩타이드로서의 펩타이드 독소의 독성 특성과 아폽토시스 유발성 특성을 조합하고 TRAIL 단백질의 암 세포 상에 존재하는 구조에 대하여 특이적으로 표적화하는 신규한 융합 단백질을 제공한다. 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL로부터 유래된 결합 도메인 및 단백질 합성 억제 특성을 갖는 효과기 펩타이드로서의 펩타이드 독소 도메인을 포함한다.
hTRAIL로부터 유래된 도메인의 존재로 인해, 본 발명에 따른 단백질은 암 세포에 선택적으로 유도되며, 단백질의 요소는 효과를 나타낸다.
특히, 효과기 펩타이드로서의 펩타이드 독소는 암 세포에서 단백질 합성 과정을 억제한다. 종양 환경에 대한 본 발명의 단백질의 전달은 체내에서 건강한 세포에 대하여 독성 및 부작용 뿐만 아니라, 투여 빈도의 감소를 최소화할 수 있게 한다. 추가로, 본 발명에 따른 단백질을 사용하는 표적화 치료는 고독성 및 고용량 투여의 필요성에 의해 유발되는 단백질 합성 억제에 기초하여 이전에 공지된 비특이적인 치료의 저효율성의 문제를 극복할 수 있게 한다.
다수의 경우에서, 본 발명의 융합 단백질은 서열의 단편을 포함하는 가용성 hTRAIL 및 이의 변이체 보다 더욱 강력한 것으로 밝혀졌다. 지금까지, 본 발명의 융합 단백질에 사용된 효과기 펩타이드는 바람직하지 못한 동력학, 비특이적인 프로테아제에 의한 신속한 분해, 또는 표적 부위에서 효과기 펩타이드의 적절한 작용을 가능하게 하는데 필요한 적절한 경로 활성화 서열의 결핍에 의해 유발되는 체내 축적 때문에 의약에 사용되지 않았다. 융합 단백질에 대한 효과기 펩타이드의 혼입은 작용이 바람직한 부위에 선택적으로 전달할 수 있게 한다. 더욱이, 효과기 펩타이드의 부착은 단백질의 질량을 증가시켜 종양에서 반감기 연장 및 단백질의 보유 증가 및 이의 효율성 향상을 야기한다. 추가로, 다수의 경우에서, 신규한 융합 단백질은 또한 TRAIL에 대한 천연 또는 유발 내성을 극복한다.
본 발명은 지금부터 하기 도면을 참고로 하여 상세히 기술한다.
도 1은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18a, 실시예 25a, 실시예 37a 및 실시예 42a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 Colo 205를 갖는 HsdCpb:NMRI-Foxn1 nin 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 2는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18a, 실시예 25a, 실시예 37a 및 실시예 42a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 Colo 205를 갖는 HsdCpb:NMRI-Foxn1 nin 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 3은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18a 및 실시예 35a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 갖는 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 4는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18a 및 실시예 35a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 갖는 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 5는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18a 및 실시예 50a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 갖는 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 6은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18a 및 실시예 50a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 갖는 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 7은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 2a, 실시예 18a 및 실시예 44a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 8은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 2a, 실시예 18a 및 실시예 44a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 9는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 20a, 실시예 26a, 실시예 43a 및 실시예 47a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 10은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 20a, 실시예 26a, 실시예 43a 및 실시예 47a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 11은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 20a, 실시예 51a 및 실시예 52a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 췌장암 PANC-1을 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 12는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 20a, 실시예 51a 및 실시예 52a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 췌장암 PANC-1을 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 13은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18a 및 실시예 44a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 췌장암 PANC-1을 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 14는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18a 및 실시예 44a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 췌장암 PANC-1을 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 15는 실시예 18a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 전립선암 PC3을 갖는 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 16은 실시예 18a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 전립선암 PC3을 갖는 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 17은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 51a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 간암 PCL/PRF/5를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 18은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 51a의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 간암 PCL/PRF/5를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 19는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b 및 실시예 2b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116을 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 19a는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116을 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 20은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b 및 실시예 2b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116을 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 20a는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116을 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 21은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b, 실시예 2b 및 실시예 54b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 SW620을 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 21a는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 SW620을 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 22는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b, 실시예 2b 및 실시예 54b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116을 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 22a는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HCT116을 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 23은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b 및 실시예 51b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HT-29를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 24는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b 및 실시예 51b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 대장암 HT-29를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 25는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 간암 HepG2를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 26은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 간암 HepG2를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 27은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b 및 실시예 2b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 28은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b 및 실시예 2b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 폐암 A549를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 29는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 자궁 육종 MES-SA/Dx5를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 29a는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b, 실시예 2b 및 실시예 51b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 자궁 육종 MES-SA/Dx5를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 체적 변화(초기 단계의 %)를 도시한 것이다.
도 30은 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 자궁 육종 MES-SA/Dx5를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 30a는 rhTRAIL114-281과 비교한 실시예 18b, 실시예 2b 및 실시예 51b의 본 발명의 융합 단백질로 처리된 자궁 육종 MES-SA/Dx5를 갖는 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에서의 종양 성장 억제 값(%TGI)을 도시한 것이다.
본 발명은
- hTRAIL95보다 낮지 않은 위치에 있는 아미노산으로 개시하는 가용성 hTRAIL 단백질 서열의 기능적 단편이거나, 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 85%의 서열 동일성을 가지며 아미노산 hTRAIL281로 종결하는 상기 기능적 단편의 동족체인 도메인 (a), 및
- 단백질 합성을 억제하는 효과기 펩타이드의 서열인 하나 이상의 도메인 (b)
를 포함하는 융합 단백질에 관한 것으로,
상기 도메인 (b)의 서열은 상기 도메인 (a)의 C-말단 및/또는 N-말단에 부착되어 있고,
상기 융합 단백질은 세포 표면 상의 탄수화물 수용체에 결합하는 도메인을 함유하지 않는다.
용어 "가용성 hTRAIL 서열의 기능적 가용성 단편"이란, 즉 세포의 표면에 있는 이의 수용체에 결합시 포유동물 세포에서 아폽토시스 신호를 유발할 수 있는 임의의 이러한 가용성 hTRAIL의 단편을 나타내는 것으로 이해되어야 한다.
TRAIL 서열의 70% 이상 또는 85% 이상의 상동성의 존재는 당업계에 공지되어 있는 것으로 당업자에게 또한 이해될 것이다.
본 발명의 융합 단백질에서 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 hTRAIL 단백질도 아니고 hTRAIL 단백질의 일부나 단편도 아닌 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에 따른 용어 "펩타이드"란, 펩타이드 결합을 통해 함께 연결된 복수의 아미노산으로부터 축조된 분자로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명에 따른 용어 "펩타이드"는 올리고펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 포함한다.
본 발명에서, 펩타이드의 아미노산 서열은 펩타이드의 N-말단(N-종결)에서 이의 C-말단(C-종결) 쪽으로의 방향으로 당업계에서 채택되는 통상의 방식으로 제시될 것이다. 그러므로, 임의의 서열은 이의 선형 제시(presentation)의 좌측 상에 이의 N-말단 및 우측 상에 이의 C-말단을 가질 것이다.
숫자보다 선행하는 용어 TRAIL은 hTRAIL의 공지된 서열에서 이러한 숫자를 갖는 아미노산을 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다.
본 발명의 융합 단백질은 도메인 (a)의 C-말단 및/또는 N-말단에 부착된, 효과기 펩타이드의 하나 이상의 도메인 (b)를 혼입한다.
특정 실시형태에서, 도메인 (a)는 hTRAIL95 내지 hTRAIL121 범위의 아미노산으로 개시하여 아미노산 hTRAIL281로 종결하는 hTRAIL 서열의 단편이다.
특히, 도메인 (a)는 hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 및 hTRAIL121-281에 상응하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 및 hTRAIL121-281이 수탁 번호 P50591로 ZenBank에 공개되고 서열 번호 141로서 본 발명의 서열 목록에 제시된 hTRAIL의 공지된 서열에서 각각 번호 95, 114, 116, 119, 120 및 121로 표시된 아미노산으로 개시하고 마지막 아미노산 281로 종결하는 인간 TRAIL 단백질의 단편을 나타낸다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
다른 특정 실시형태에서, 도메인 (a)는 hTRAIL95보다 낮지 않은 아미노산 위치에서 개시하고 아미노산 hTRAIL281에서 종결하는 가용성 hTRAIL 단백질 서열의 기능적 단편의 동족체로서, 그 서열은 본래의 서열과 70% 이상, 바람직하게는 85% 이상 동일하다.
이러한 실시형태의 특정 변형에서, 도메인 (a)는 hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 및 hTRAIL121-281에 상응하는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 단편의 동족체이다.
hTRAIL 단편의 동족체가 이러한 단편의 아미노산 서열의 변경/변형이며, 여기서 1개의 아미노산, 2개의 아미노산, 3개의 아미노산, 4개의 아미노산, 5개의 아미노산, 6개의 아미노산 및 아미노산 중의 15% 이하를 포함한 하나 이상의 아미노산이 변화되고, 변형된 서열의 단편이 hTRAIL 서열의 기능성, 즉 세포 표면 사멸 수용체에 결합하고 포유동물 세포에서 아폽토시스를 유발하는 능력을 보존한다는 것은 이해되어야 한다. 아미노산 서열의 변형은, 예를 들면, 아미노산의 치환, 결손 및/또는 부가를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 변형된 서열을 갖는 hTRAIL 단편의 동족체는 hTRAIL의 본래의 단편과 비교하여 사멸 수용체 DR4 (TRAIL-R1) 또는 DR5 (TRAIL-R2)에 대한 변형된 친화성을 나타낸다.
용어 "변형된 친화성"이란 증가된 친화성 및/또는 변경된 수용체 선택성을 갖는 친화성을 의미한다.
바람직하게는, 변형된 서열을 갖는 hTRAIL 단편의 동족체는 hTRAIL의 본래의 단편과 비교하여 사멸 수용체 DR4 또는 DR5에 대한 증가된 친화성을 나타낸다.
특히 바람직하게는, 변형된 서열을 갖는 hTRAIL 단편의 동족체는 사멸 수용체 DR4와 비교하여 사멸 수용체 DR5에 대한 증가된 친화성, 즉 증가된 선택성 DR5/DR4를 나타낸다.
또한 바람직하게는, 변형된 서열을 갖는 hTRAIL 단편의 동족체는 수용체 DR1 (TRAIL-R3) 및/또는 DR2 (TRAIL-R4)에 대한 친화성과 관련하여 사멸 수용체 DR4 및/또는 DR5에 대한 증가된 선택성을 나타낸다.
사멸 수용체 DR4 및 DR5에 대한 증가된 친화성 및/또는 선택성을 초래하는 hTRAIL의 변형은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면, DR4에 대한 증가된 선택성을 갖는 D218H 돌연변이를 개시하고 있는 문헌[Tur V, van der Sloot AM, Reis CR, Szegezdi E, Cool RH, Samali A, Serrano L, Quax WJ. DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) variants obtained by structure-based design. J. Biol. Chem. 2008 Jul 18; 283(29): 20560-8] 또는 DR4에 대한 감소된 친화성을 갖는 D269H 돌연변이를 개시하고 있는 문헌[Gasparian ME, Chernyak BV, Dolgikh DA, Yagolovich AV, Popova EN, Sycheva AM, Moshkovskii SA, Kirpichnikov MP. Generation of new TRAIL mutants DR5-A 및 DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun; 14(6): 778-87]을 참조한다. DR1 및 DR2 수용체와 비교하여 DR4 및 DR5로부터 선택된 하나의 수용체에 대한 증가된 친화성 및 DR4와 비교하여 수용체 DR5에 대한 증가된 친화성을 초래하는 hTRAIL 돌연변이체는 또한 WO 2009077857 및 WO 2009066174에 개시되어 있다.
적절한 돌연변이는 131, 149, 159, 193, 199, 201, 204, 204, 212, 215, 218 및 251로 이루어진 군으로부터 선택된 천연 hTRAL의 위치에 있는 하나 이상의 돌연변이이며, 특히 라이신, 히스티딘 또는 아르기닌과 같은 염기성 아미노산, 또는 글루탐산 또는 아스파라긴산과 같은 아미노산으로의 아미노산의 치환을 포함하는 돌연변이이다. 특히, WO 2009066174에 개시된 바와 같은 G131R, G131K, R149I, R149M, R149N, R149K, S159R, Q193H, Q193K, N199H, N199R, K201H, K201R, K204E, K204D, K204L, K204Y, K212R, S215E, S215H, S215K, S215D, D218Y, D218H, K251D, K251E 및 K251Q로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 명시할 수 있다.
적절한 돌연변이는 또한 195, 269 및 214로 이루어진 군으로부터 선택된 천연 hTRAIL의 위치에 있는 하나 이상의 돌연변이이며, 특히 라이신, 히스티딘 또는 아르기닌과 같은 염기성 아미노산으로의 아미노산의 치환을 포함하는 돌연변이이다. 특히, WO 2009077857에 기재된 바와 같은 269H, E195R 및 T214R로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 명시할 수 있다.
특정 실시형태에서, hTRAIL 단편의 동족체인 도메인 (a)는, WO 2009066174에 기재된 바와 같은 천연 TRAIL 서열의 D218H 돌연변이체, 또는 문헌[Gasparian ME et al. Generation of new TRAIL mutants DR5-A and DR5-B with improved selectivity to death receptor 5, Apoptosis. 2009 Jun; 14(6): 778-87]에 기재된 바와 같은 천연 TRAIL 서열의 Y189N-R191K-Q193R-H264R-I266R-D269H 돌연변이체로부터 선택된다.
도메인 (a), 즉 TRAIL 단편은 세포의 표면 상의 사멸 수용체에 대한 융합 단백질의 작제물의 결합을 담당하는 도메인이다. 더욱이, 결합시의 도메인 (a)는 이의 공지된 작용제 활성, 즉 아폽토시스의 외인성 경로의 활성화를 나타낸다.
본 발명의 융합 단백질은 세포 표면 상의 탄수화물 수용체에 결합할 수 있는 도메인의 서열을 포함하지 않는다. 세포 표면 상의 탄수화물 수용체에 대한 결합은 비-특이적 결합이다.
특히, 본 발명의 융합 단백질은 세포 표면 상의 슈가(sugar) 수용체에 결합할 수 있는 렉틴 도메인(당단백질)의 서열을 포함하지 않는다. 세포 표면 상의 탄수화물 수용체에 결합할 수 있는 렉틴 도메인은 특히 단백질 독소의 서브유닛(쇄)과 이의 단편 둘 다 뿐만 아니라, 효소적 기능성을 포함한 상이한 기능성의 도메인을 동반하지 않고 홀로 생성되는 렉틴 단백질로 이해되어야 한다.
또 다른 실시형태에서, 도메인 (a)를 제외한 본 발명의 융합 단백질은 세포 표면 상의 수용체에 결합하는 어떠한 다른 도메인도 포함하지 않는다. 본 발명의 융합 단백질의 도메인 (b)는 효과기 펩타이드 - 세포 내의 단백질 합성 과정을 억제하는 펩타이드 독소의 도메인이다.
본 발명의 융합 단백질의 도메인 (b)의 효과기 펩타이드는 세포에서 단백질 합성 과정의 해독 단계를 억제하여 단백질 합성을 억제하는 독소일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질의 도메인 (b)의 효과기 펩타이드는 세포에서 단백질 합성 과정의 전사 및 RNA 생성을 억제하여 단백질 합성을 억제하는 독소일 수 있다.
하나의 실시형태에서, 펩타이드 독소는 리보솜 수준에서 단백질의 해독을 효소적으로 억제하는 펩타이드이다. 본 발명의 이러한 실시형태에서, 하나의 변이체에서의 펩타이드 독소는 N-글리코시다제, 리보뉴클레아제 및 ADP-리보실트랜스퍼라제의 활성으로부터 선택된 효소적 촉매 활성을 가진다.
효과기 펩타이드로서의 이의 주요 활성에 추가하여, 펩타이드 독소가, 예를 들면, 문헌[W. J. Pneumans et al., The FASEB Journal, 2001, Vol. 15, str. 1493-1506]에 개시된 바와 같이, 세포에서 단백질 합성을 억제할 수 있는 하나 이상의 다른 활성을 가질 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이므로 이해되어야 한다.
N-글리코시다제 활성을 갖는 효과기 펩타이드는 28S rRNA의 서브유닛 60에서 하나의 특이적인 아데닌 잔기의 절단에 의해 리보솜의 변형(탈퓨린화)을 수행한다. 이러한 변형은 비가역적이며, 리보솜과 해독 인자 EF의 결합을 방지하고, 따라서 해독을 차단한다.
N-글리코시다제의 촉매 활성을 갖는 효과기 펩타이드는 유형 1 리보솜 불활성화 단백질 (RIP) (헤미톡신) 및 유형 2 RIP 단백질의 촉매 서브유닛(쇄) A 및 본래의 서열과 85% 이상의 서열 동일성의 보존된 N-글리코시다제 활성을 가지는 이들의 변형물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
N-글리코시다제 활성을 갖는 유형 1 RIP 독소는 단일-쇄 단백질이며, 촉매 도메인만을 가진다.
다음의 식물 기원의 공지된 독소는 단일-쇄 유형 1 RIP 독소: 겔로닌 (겔 로니움 멀티플로룸: Gelonium multiflorum 유래), 모모르딘 (Momordica 속의 식물로부터 분리된 단백질), 사포린 (사포나리아 오피시날리스: Saponaria Officinalis 유래), 도데칸드린 (파이토라카 도데칸드라: Phytolacca dodecandra 유래), 부가닌 (부가인빌레아 스펙타빌리스: Bougainvillea spectabilis 유래), 미국자리공 (파이토라카 아메리카나: Phytolacca Americana) 유래의 PAP 단백질, 트리코산틴 (트리코산테스 키릴로위이: Trichosanthes kirilowii 유래), 트리코안구인 (트리코산테스 안구이나: Trichosanthes anguina 유래), 아그로스틴 (아그로스테마 기타고: Agrostemma githago 유래), 디안트린, 루핀 P1 (루파 실린드리카: Luffa cylindrica 유래), 모모르카린 (모모르디카 카란티아: Momordica charantia 유래) 및 트리틴의 군으로부터의 특이적인 효과기 단백질로서 언급될 수 있다.
이러한 실시형태에서의 효과기 단백질 서열의 예는 서열 번호 55 (부가닌), 서열 번호 58 (PAP 독소 동족체), 서열 번호 59 (사포린의 단편), 서열 번호 60 (트리코산틴), 서열 번호 61 (트리코안구인), 서열 번호 65 (루핀 P1), 서열 번호 67 (모모르카린) 및 서열 번호 78 (겔로닌의 촉매 도메인)로서 표시된다.
이러한 실시형태에서의 효과기 단백질 서열의 추가 예는 겔로닌 (서열 번호 198)의 유사체 및 본래의 서열이 변형된 트리코산틴의 유사체 (서열 번호 199 및 서열 번호 200)이다.
변형된 트리코산틴의 하나의 예는 서열 번호 199이며, 트리코산틴의 공지된 서열은 독소의 면역원성을 낮추도록 변형된다. 즉, 트리코산틴의 공지된 서열에서, "YFF" 81-83 모티프는 "ACS"로 치환되고, 유사하게 "KR" 173-174 아미노산은 "CG" 잔기로 치환된다(상기 아미노산 잔기 번호는 GenBank에 공개된 서열: AAB22585.1과 일치한다)[An Q, Wei S, Mu S, Zhang X, Lei Y, Zhang W, Jia N, Cheng X, Fan A, Li Z, Xu Z. J Biomed Sci. 2006 Sep; 13(5): 637-43].
변형된 트리코산틴의 추가 예는 서열 번호 200이며, 트리코산틴의 공지된 서열은 다음의 방식으로 변형된다. 즉, "YFF" 81-83 모티프는 독소의 면역원성을 낮추기 위해 "ACS"로 치환되고, "KR" 173-174 아미노산은 혈관 누출 증후군 (vascular leak syndrome: VLS) 문제를 감소시키기 위해 "CG" 잔기로 치환되고[An Q, Wei S, Mu S, Zhang X, Lei Y, Zhang W, Jia N, Cheng X, Fan A, Li Z, Xu Z. J Biomed Sci.2006 Sep; 13(5): 637-43], 발린 잔기 - 2 및 66은 알라닌으로 치환되고, 류신 132는 글라이신으로 치환된다(상기 아미노산 잔기 번호는 GenBank에 공개된 서열: AAB22585.1과 일치한다)[Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Proc Natl Acad Sci. U S A. 1999 Mar 30; 96(7): 3957-62].
서열 번호 198의 돌연변이 V70A를 갖는 겔로닌 유사체는 공지되어 있으며, 문헌[Baluna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999]에 개시되어 있다.
서열 번호 199로 지정된 트리코산틴 유사체는 공지되어 있으며, 문헌[An Q, et al. J Biomed Sci. 2006 Sep; 13(5): 637-43]에 개시되어 있다.
서열 번호 200으로 지정된 트리코산틴 유사체는 신규하며, 문헌에 개시되어 있지 않다.
N-글리코시다제 활성을 갖는 유형 2 RIP 독소는 2개의 쇄 단백질이며, 세포 표면 상에 존재하는 탄수화물(슈가) 수용체에 결합할 수 있는 렉틴 결합 도메인 (서브유닛 B) 및 촉매 도메인 (서브유닛 A)을 갖는다. 본 발명에 따르면, 렉틴 결합 도메인이 없는 유형 2 RIP 독소의 촉매 서브유닛 A는 효과기 펩타이드로서 사용될 수 있다.
이러한 유형의 효과기 펩타이드로서, 다음 식물 독소의 촉매 서브유닛 A가 언급될 수 있다: 리신 (리시누스 코뮤니스: Ricinnus communis 유래), 아브린 (아브루스 프레카트리우스: Abbrus precatrius 유래), 모데신 (아데니아 디지타타: Adenia digitata 유래), 비스쿠민 (겨우살이 비스쿰 알붐: Viscum album 유래의 독소), 볼켄신 (아데니아 볼켄시이: Adenia volkensii 유래), 에불린 1 (삼부쿠스 에불루스: Sambucus ebulus 유래), 니그린 b (삼부쿠스 니그 라: Sambucus nigra 유래) 및 세균성 독소 시가 (시겔라 다이센테리애: Shigella dysenteriae 유래), 또는 본래의 서열과 85% 이상의 서열 동일성의 보존된 N-글리코시다제 활성을 가지는 이들의 변형물.
이러한 실시형태에서의 효과기 펩타이드 서열의 예는 서열 번호 56 및 서열 번호 57 (리신의 서브유닛 A 및 리신의 변이체 서브유닛 A), 서열 번호 195 (리신의 변형된 서브유닛 A), 서열 번호 62 (겨우살이 독소의 서브유닛 A), 서열 번호 63 (에불린 1의 서브유닛 A), 서열 번호 64 (니그린 b의 서브유닛 A), 서열 번호 66 (볼켄신의 서브유닛 A), 서열 번호 70 (시가 독소 서브유닛 A의 변이체), 서열 번호 82 (아브린의 서브유닛 A), 서열 번호 194 (돌연변이 V71A, G115A 및 S232Q를 갖는 문헌[Baluna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999]에 개시된 바와 같은 아브린의 변형된 서브유닛 A, 상기 아미노산 잔기 번호는 GenBank CAA38655.1에 공개된 서열과 일치한다)로서 지정된다.
이러한 실시형태에서의 효과기 펩타이드 서열의 예는 서열 번호 56 및 서열 번호 57 (리신의 서브유닛 A 및 리신의 변이체 서브유닛 A), 서열 번호 195 (결손 78 LDV 80을 갖는 문헌[Baluna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999]에 개시된 바와 같은 리신의 변형된 서브유닛 A, 상기 아미노산 잔기 번호는 GenBank ABG65738.1에 공개된 서열과 일치한다), 서열 번호 62 (겨우살이 독소의 서브유닛 A), 서열 번호 63 (에불린 1의 서브유닛 A), 서열 번호 64 (니그린 b의 서브유닛 A), 서열 번호 66 (볼켄신의 서브유닛 A), 서열 번호 70 (시가 독소 서브유닛 A의 변이체), 서열 번호 82 (아브린의 서브유닛 A), 서열 번호 194 (돌연변이 V71A, G115A 및 S233Q를 갖는 문헌[Baluna et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96, pp. 3957-3962, March 1999]에 개시된 바와 같은 아브린의 변형된 서브유닛 A, 상기 아미노산 잔기 번호는 GenBank CAA38655.1에 공개된 서열과 일치한다)로서 지정된다.
리보뉴클레아제의 촉매 활성을 갖는 효과기 펩타이드(리보톡신으로도 언급됨)는 엔도뉴클레아제에 속하며, 28S rRNA에서 포스포디에스테르 결합을 절단하고, 이에 의해 리보솜을 억제하고 해독을 중단시킨다. 이러한 그룹의 효과기 펩타이드로서 진균 독소 알파-사크린, 미토-길린, 아스퍼질루스 레스트릭투스(Aspergillus restrictus) 유래의 레스트릭토신 및 히르수텔린 (히르수텔라 톰소니이: Hirsutella thompsonii 유래)이 언급될 수 있다.
이러한 실시형태에서의 효과기 펩타이드 서열의 예는 서열 번호 71 (레스트릭토신) 및 서열 번호 72 (히르수텔린)로서 지정된다.
ADP-리보실트랜스퍼라제의 촉매 활성을 갖는 효과기 펩타이드는 ADP-리보실화를 유발하고, 따라서 단백질 합성 기구의 성분의 불활성화, 주로 신장/해독 인자 EF-2, 및 해독의 억제를 유발한다. 효과기 펩타이드의 이러한 그룹에는 코리네박테리움 디프테리애 (Corynebacterium diphteriae) 유래의 디프테리아 독소, 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래의 외독소 A 및 본래의 서열과 85% 이상의 서열 동일성의 보존된 ADP-리보실트랜스퍼라제 활성을 가지는 이들의 변형물의 촉매 도메인이 속한다.
슈도모나스 아에루기노사 외독소 A 및 디프테리아 독소의 촉매 도메인의 변형물의 예는 펩타이드의 말단 단편의 절단 뿐만 아니라, 촉매 도메인 또는 이의 단편에서의 치환 또는 결손을 포함한다. 적절한 치환 및 결손의 일부는 문헌[Weldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16; 113(16): 3792-800; 및 Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5; 108(14): 5742-7]에 개시되어 있다.
이러한 실시형태에서의 효과기 펩타이드 서열의 예는 서열 번호 69 (촉매 도메인 A의 천연 서열)로서 지정된 공지된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 촉매 도메인 A, 및 서열 번호 68, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 201, 서열 번호 202, 서열 번호 203, 서열 번호 204, 서열 번호 205, 서열 번호 206 및 서열 번호 207로서 지정된 이의 돌연변이형 유사체이다.
이러한 실시형태에서의 효과기 펩타이드 서열의 예는 서열 번호 68로 지정된 공지된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A, 및 서열 번호 69, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 201, 서열 번호 202, 서열 번호 203, 서열 번호 204, 서열 번호 205, 서열 번호 206 및 서열 번호 207로서 지정된 이의 유사체이다.
서열 번호 69, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 203 및 서열 번호 206으로서 지정된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A의 유사체는 공지되어 있으며, 문헌에 개시되어 있다.
서열 번호 201, 서열 번호 202, 서열 번호 204, 서열 번호 205 및 서열 번호 207로서 지정된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A의 유사체는 신규하며, 문헌에 개시되어 있지 않다.
공지된 서열 번호 203은 면역원성을 감소시키는 8개의 돌연변이를 갖는 문헌[Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5; 108(14): 5742-7]에 개시된 바와 같은 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A의 HA22-LR-8M 변이체이다.
공지된 서열 번호 206은 문헌[Weldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16; 113(16): 3792-800]에 개시된 바와 같은 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A의 결손 변이체 HA22-LR이다.
신규한 서열 번호 201은 외독소 A의 슈도모나스 아에루기노사 촉매 도메인의 유사체이며, 여기서 3개의 점 돌연변이 R318K, N441Q 및 R601K는 공지된 서열에 도입되어 면역원성을 감소시킨다(상기 아미노산 잔기 번호는 GenBank AAB59097.1에 공개된 서열과 일치한다).
신규한 서열 번호 202는 문헌[Choe M, Webber KO, Pastan I. Cancer Res. 1994 Jul 1; 54(13): 3460-7]에 개시된 바와 같은 면역원성을 낮추는 추가의 돌연변이 및 WO 2007/016150에 개시된 바와 같은 다른 돌연변이를 도입한 문헌[Weldon JE et al., Blood. 2009 Apr 16; 113(16): 3792-800]에 개시된 바와 같은 외독소 A의 슈도모나스 아에루기노사 촉매 도메인의 결손 변이체 A2-LR이다.
신규한 서열 번호 204는 문헌[Weldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16; 113(16): 3792-800]에 개시된 바와 같은 변이체 HA22 M3 (결손 및 돌연변이 C312S)과 문헌[Onda M et al.k Proc Natl Acad Sci. U S A. 2011 Apr 5; 108(14): 5742-7]에 개시된 바와 같은 면역원성을 감소시키는 8개의 돌연변이를 갖는 변이체 HA22 8M의 조합인 외독소 A의 슈도모나스 아에루기노사 촉매 도메인의 변이체이다.
신규한 서열 번호 205는 문헌[Weldon JE et al.. Blood. 2009 Apr 16; 113(16): 3792-800]에 개시된 바와 같은 변이체 HA22 M3, 즉 결손 및 돌연변이 C312S와 천연 슈도모나스 아에루기노사 독소에 존재하는 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 영역의 추가 결손을 갖는 문헌[Onda M et al.. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 5; 108(14): 5742-7]에 개시된 바와 같은 면역원성을 감소시키는 8개의 돌연변이의 조합인 외독소 A의 슈도모나스 아에루기노사 촉매 도메인의 변이체이다.
신규한 서열 번호 207은 문헌[Weldon JE et al., Blood. 2009 Apr 16; 113(16): 3792-800]에 개시된 바와 같은 변이체 HA22 M3, 즉 결손 및 돌연변이 C312S, 문헌[Onda M et al., Proc Natl Acad Sci. USA. 2011 Apr 5; 108(14): 5742-7]에 개시된 바와 같은 변이체 HA22 8M, 즉 면역원성을 감소시키는 8개의 돌연변이 및 추가의 돌연변이 R601K의 조합인 외독소 A의 슈도모나스 아에루기노사 촉매 도메인의 변이체이다.
이러한 실시형태에서의 효과기 펩타이드 서열의 다른 예는 디프테리아 독소의 공지된 서브유닛 A (촉매 도메인), 및 서열 번호 79, 서열 번호 80, 서열 번호 81, 서열 번호 196 (2개의 돌연변이 V7A 및 V27A의 도입에 의해 변형된 디프테리아 독소의 서브유닛 A)으로 지정된 이의 공지된 활성 단편이다. 변형은 문헌[Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 30; 96(7): 3957-62] 및 서열 번호 197로 인한 VLS (혈관 누출 증후군)를 제거하기 위해 선택된다(디프테리아 독소는 문헌[Baluna R, Rizo J, Gordon BE, Ghetie V, Vitetta ES. Proc. Natl. Acad Sci USA. 1999 Mar 30; 96(7): 3957-62]로 인한 VLS (혈관 누출 증후군)를 제거하기 위해 3개의 아미노산 6VDS9의 결손 및 돌연변이 V29A를 도입하여 변형된다).
본 발명의 융합 단백질의 도메인 (b)의 효과기 펩타이드는, 예를 들면, 세균에서 공지된 독소-항독소 시스템에 속하는 단백질 합성을 억제하는 펩타이드 독소일 수 있다. 이러한 독소는 다음과 같은 상이한 기작을 통해 작용하는 단백질 합성을 차단할 수 있다: 세포막과의 결합 및 이에 따른 막 전위의 신속한 붕괴 및 수반성 호흡 정지의 유발; 토포아이소머라제에 대한 결합에 의한 폴리마라제(DNA 및 RNA)의 억제; 또는 엔도리보뉴클레아제(RNase)로서의 작용.
mRNase 활성을 갖는 독소-항독소 시스템의 구성성분인 독소의 예는 다음과 같다: 서열 번호 77로서 지정된 RNase 활성을 갖는 StaB 단백질[Szymanik M., Doctoral thesis. 2006. Warsaw University, Warsaw]; 살모넬라 타이피(Salmonella typhi) 유래의 Kid 독소[Bravo A, de Torrontegui G, Diaz R. Identification of components of a new stability system of plasmid R1, ParD, that is close to the origin of replication of this plasmid. Mol Gen Genet. 1987 Nov; 210(1):101-10]; 및 서열 번호 73 (Kid 단백질) 및 서열 번호 76 (RelE 단백질)으로서 지정된 대장균(Escherichia coli) 유래의 RelE 독소[Gotfredsen M, Gerdes K. The Escherichia coli relBE genes belong to a New toxin-antitoxin gene family. Mol Microbiol. 1998 Aug; 29(4): 1065-7].
토포아이소머라제에 대한 결합에 의해 폴리머라제를 억제하는 독소-항독소 시스템의 구성성분인 독소의 예는 CcdB 계열 대장균 단백질 유래의 독소와 DNA 분해 및 RNA 폴리머라제 억제의 보존된 활성을 갖는 이의 변이체, 예를 들면, CcdBET2 독소이다[E. Trovatti et al, Bioorg Med Chem Lett. 2008 Dec 1; 18(23): 6161-4].
이러한 실시형태에서의 효과기 펩타이드 서열의 예는 서열 번호 74 (CcdB 단백질) 및 서열 번호 75 (CcdB 단백질 변이체)로서 지정된다.
세포막과 결합하고 이에 따라 막 전위의 신속한 붕괴 및 수반성 호흡 정지를 유발하는 독소-항독소 시스템의 구성성분인 독소의 예는 세포질 막 TisB 및 Hok에 삽입되는 소수성 잔기의 긴 스트레치(stretch)를 함유하는 소형 염기성 단백질이다. Hok 또는 TisB의 막 삽입은 전기화학 전위의 손실을 유발하는데, 이는 세포내 ATP의 감소를 설명한다. 따라서, TisB와 Hok 둘 다는 세균 막을 손상시킴으로써 세포를 사멸한다[Unoson C, Wagner EG. A small SOS-induced toxin is targeted against the inner membrane in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2008 Oct; 70(1): 258-70. Epub 2008 Aug 29]. 이러한 실시형태에서의 효과기 펩타이드 서열의 예는 서열 번호 208로서 지정된다.
상기에서 언급한 바와 같이, 일부 효과기 펩타이드는 신규하며, 이전에 개시되어 있지 않았다.
따라서, 본 발명은 서열 번호 200의 트리코산틴의 돌연변이형 변이체, 서열 번호 201의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체, 서열 번호 202의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체, 서열 번호 204의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체, 서열 번호 205의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체 및 서열 번호 207의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 신규한 펩타이드에 관한 것이다.
이러한 신규 펩타이드는 특히 본 발명의 항암 융합 단백질의 도메인 (b)의 효과기 펩타이드로서의 용도를 발견하였다.
이러한 신규한 펩타이드는 모 펩타이드의 면역원성을 낮추도록 특별히 설계된다.
따라서, 이러한 신규한 펩타이드의 특별한 특징은 낮은 면역원성이다.
서열 번호 200의 트리코산틴의 돌연변이형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드는 유리하다.
서열 번호 201의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드도 또한 유리하다.
서열 번호 202의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드도 또한 유리하다.
서열 번호 204의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체, 서열 번호 205의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체 및 서열 번호 207의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드도 또한 유리하다.
암 세포의 표면 상에 존재하는 TRAIL 수용체에 대한 결합시, 융합 단백질은 이중 효과를 나타낸다. TRAIL의 기능적 단편 또는 보존된 기능성을 갖는 이의 유사체인 도메인 (a)는 이의 공지된 작용제 활성, 즉 세포 표면 상의 사멸 수용체에 대한 결합 및 아폽토시스의 외인성 경로의 활성화를 나타낸다. 융합 단백질의 도메인 (b)의 효과기 펩타이드는 종양 세포에서 단백질 합성의 억제에 의해 TRAIL 도메인의 활성과 병행하여 세포내에서 이의 작용을 잠재적으로 나타낼 수 있을 것이다.
세포에 대한 융합 단백질의 내재화 후 효과기 펩타이드 - 기능적 도메인 (b)의 활성화는 리소좀(lisosomal) 효소(비특이적 프로테아제)에 의한 본 발명의 융합 단백질의 도메인 (b)로부터 도메인 (a)의 절단에 의해 비특이적으로 발생할 수 있다.
하지만, 바람직하게는 융합 단백질은 세포 환경에서 존재하는 프로테아제에 의해 인식되는 절단 부위의 도메인을 포함한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 도메인 (a) 및 도메인 (b)는 세포 환경, 특히 종양 세포 환경에서 존재하는 프로테아제, 예를 들면, 메탈로프로테아제, 유로키나제 또는 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 서열을 포함하는 하나 이상의 도메인 (c)에 의해 연결되어 있다.
프로테아제에 의해 인식되는 서열은,
- 메탈로프로테아제 MMP Pro　Leu　Gly　Leu　Ala　Gly　Glu　Pro/ PLGLAGEP에 의해 인식되는 서열, 또는 부착되는 서열의 마지막 아미노산에 의해 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 서열을 형성하는 이의 단편,
- 유로키나제 uPA Arg　Val　Val　Arg/RVVR에 의해 인식되는 서열, 또는 부착되는 서열의 마지막 아미노산에 의해 유로키나제에 의해 인식되는 서열을 형성하는 이의 단편, 및
이들의 조합, 또는
- 푸린 Arg　Gln　Pro　Arg/RQPR, Arg　Gln　Pro　Arg　Gly/RQPRG, Arg　Lys　Lys　Arg/RKKR에 의해 인식되는 서열, 문헌[M. Gordon et al., In Inf. and Immun, 1995, 63, No. 1, p. 82-87]에 개시된 푸린에 의해 인식되는 다른 이례적인 서열 또는 푸린 Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu (RHRQPRGWEQL)에 의해 인식되는 천연 서열.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 프로테아제 절단 부위는 메탈로프로테아제 MMP에 의해 인식되는 서열 및/또는 유로키나제 uPA에 의해 인식되는 서열 및/또는 임의의 순서로 서로 옆에 위치하는 푸린에 의해 인식되는 서열의 조합이다.
바람직하게는, 하나의 실시형태에서의 도메인 (c)는 Arg　Gln　Pro　Arg/RQPR, Arg　Gln　Pro　Arg　Gly/RQPRG, Arg　Val　Lys　Arg/RVKR 및 Arg　Lys　Lys　Arg/RKKR로부터 선택된 푸린에 의해 인식되는 서열이다.
프로테아제인 메탈로프로테아제 MMP, 유로키나제 uPA 및 푸린은 종양 환경에서 과발현된다. 프로테아제에 의해 인식되는 서열의 존재는 도메인 (a) 및 도메인 (b)의 절단, 즉 기능적 도메인 (b)의 방출 및 이에 따른 이의 가속화된 활성화를 가능하게 한다.
프로테아제 절단 부위의 존재는 효과기 펩타이드의 신속한 방출을 가능하게 함으로써, 비특이적인 프로테아제에 의한 융합 단백질의 무작위 분해가 일어나기 전에 종양 환경에서 과발현된 프로테아제에 의한 hTRAIL 단편으로부터의 절단의 결과로서 펩타이드를 이의 작용 부위까지 운반하는 기회를 증가시킨다.
이와 관련하여, 바람직한 효과기 펩타이드는 디프테리아 독소 및 슈도모나스 외독소이며, 이들은 푸린 Arg　Val　Arg　Arg/RVRR (디프테리아 독소) 및 Arg　Gln　Pro　Arg　Gly/RQPRG (슈도모나스 외독소)에 의해 인식되는 절단 부위의 저연 발생 서열을 함유한다.
추가로, 운반 도메인 (d)는 본 발명의 융합 단백질의 효과기 펩타이드의 도메인 (b)에 부착될 수 있다.
도메인 (d)는,
- (d1) 슈도모나스 아에루기노사로부터 유래하는, 세포막을 통해 운반하는 도메인;
- (d2) 소포체로 표적화하는, 상기 세포막을 통해 운반하는 도메인;
- (d3) 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 (Arg/R) 잔기로 이루어진, 상기 세포막을 통해 운반하는 폴리아르기닌 서열, 또는 부착되는 서열의 마지막 아미노산에 의해 운반 도메인 (d1), (d2) 또는 (d3)의 서열을 형성하는 이들의 단편; 및
- 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
도메인 (d1), (d2) 및 (d3)의 조합은 특히 (d1)/(d2), (d1)/(d3) 또는 (d1)/(d2)/(d3)의 조합을 포함할 수 있다.
더욱이, 도메인 (d1), (d2) 및 (d3)의 조합은 서로 옆에 위치하고 도메인 (b)의 하나의 말단에 연결된 도메인 및/또는 도메인 (b)의 상이한 말단에 연결된 도메인을 포함할 수 있다.
융합 단백질이 도메인 (b)에 부착된 운반 도메인 (d)와 도메인 (a) 및 도메인 (b) 사이의 절단 부위의 도메인 (c) 둘 다를 가지는 경우, 작제물의 절단 후 운반 도메인 (d)가 여전히 도메인 (b)에 부착되어 있는 방식으로 도메인 (c)가 위치된다 것은 이해되어야 한다. 즉, 융합 단백질이 운반 도메인 (d)와 절단 부위 도메인 (c) 둘 다를 함유하는 경우, 도메인 (d)는 도메인 (b)와 도메인 (c) 사이에 위치되어 있거나, 도메인 (d)의 부착 부위에 대향하는 도메인 (b)의 말단에 위치되어 있다.
본 발명은 또한 도메인 (d), 바람직하게는 전위 슈도모나스 아에루기노사 도메인이 2개의 도메인 (c) 사이에 위치되어 있는 변이체, 즉 작제물의 절단 후 운반 도메인, 바람직하게는 전위 슈도모나스 아에루기노사 도메인이 TRAIL 도메인에도 효과기 펩타이드 도메인에도 부착되어 있지 않은 변이체를 포함한다.
본 발명은 도메인 (d)가 도메인 (c)와 도메인 (a) 사이에 위치되어 있는 변이체, 즉 작제물의 절단 후 운반 도메인이 여전히 TRAIL 도메인에 부착되어 있는 변이체를 포함하지 않는다.
슈도모나스 아에루기노사 독소의 전위 도메인인 운반 도메인 또는 슈도모나스 아에루기노사 독소로부터 유래하는 리소좀 막을 통해 운반하는 도메인의 다른 단편은 세포막을 가로질러 전위하는 능력을 가지며, 효과기 펩타이드를 종양 세포의 구획에 도입하는데 사용될 수 있다. 슈도모나스 아에루기노사 전위 도메인의 서열은 잘 공지되어 있으며, 서열 번호 139로 지정된다.
바람직하게는, 슈도모나스 아에루기노사 전위 도메인은 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 위치되어 있고 추가로 도메인 (c)에 의해 분리되어 있다.
또한, 바람직하게는 소포체에 운반하는 도메인 (d2)는 효과기 펩타이드의 C-말단에 부착되어 있고 본 발명의 융합 단백질의 C-말단에 위치되어 있다.
또한, 바람직하게는 세포막을 통해 운반하는 폴리아르기닌 서열은 효과기 펩타이드의 C-말단에 부착되어 있고 효과기 펩타이드와 도메인 (a) 사이에 위치되어 있고, 바람직하게는 추가로 도메인 (c)에 의해 도메인 (d)와 분리되어 있다.
소포체로 유도하는 서열 (d2)는 소포체에 유도하는 당업계에 공지된 임의의 신호 서열일 수 있으며, 예를 들면, Lys　Asp　Glu　Leu/KDEL, His　Asp　Glu　Leu/HDEL, Arg　Asp　Glu　Leu/RDEL, Asp　Asp　Glu　Leu/DDEL, Ala　Asp　Glu　Leu/ADEL, Ser　Asp　Glu　Leu/SDEL 및 Lys　Glu　Asp　Leu/KEDL이 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
도메인 (d2)는 바람직하게는 Lys　Asp　Glu　Leu/KDEL 및 Lys　Glu　Asp　Leu/KEDL로부터 선택된다.
바람직하게는, 운반 서열 (d2)는 본 발명의 융합 단백질의 C-말단에 위치되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 융합 단백질에 대한 PEG 분자의 부착에 적절한 서열을 포함하는 도메인 (e)(페길화 링커)가 추가로 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 위치되어 있다. 이러한 링커는 공지된 서열인 Ala　Ser　Gly　Cys　Gly　Pro　Glu/ASGCGPE일 수 있다. 페길화 링커는 또한 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
Ala　Ala　Cys　Ala　Ala/AACAA,
Ser　Gly　Gly　Cys　Gly　Gly　Ser/SGGCGGS 및
Ser　Gly　Cys　Gly　Ser/SGCGS.
바람직하게는, 페길화 링커의 서열은 Ala　Ser　Gly　Cys　Gly　Pro　Glu/ ASGCGPE이다.
융합 단백질의 주요 기능적 요소 및 절단 부위 도메인(들) 이외에도, 본 발명의 융합 단백질은 가요성 입체 링커의 중립(neutral) 서열/서열들을 함유할 수 있다. 이러한 입체 링커는 잘 공지되어 있으며, 문헌에 기재되어 있다. 융합 단백질에 대한 이들의 혼입은 숙주 세포에서 이의 과발현의 과정에 의해 생성된 단백질의 정확한 접기(folding)를 제공하는 것으로 의도된다. 특히, 입체 링커는 글라이신, 글라이신-세린 또는 글라이신-시스테인-알라닌 링커일 수 있다.
특히, 입체 링커는 글라이신과 세린 잔기의 조합, 예를 들면, Gly　Gly　Gly　Gly　Ser/GGGGS, 또는 입체 링커로서 작용하는 임의의 이의 단편, 예를 들면, 단편 Gly　Gly　Gly　Ser/GGGS, Gly　Gly　Gly/GGG 또는 Gly　Gly　Gly　Gly/GGGG일 수 있다. 다른 실시형태에서, 입체 링커는 글라이신, 세린 및 알라닌 잔기의 조합의 임의의 조합, 예를 들면, Ala　Ser　Gly　Gly/ASGG, 또는 입체 링커로서 작용하는 임의의 이의 단편, 예를 들면, AlaSerGly/ASG일 수 있다. 입체 링커, 예를 들면, 서열 Gly Gly Gly Ser Gly/ GGGGS, 또는 입체 링커로서 작용하는 임의의 이의 단편, 예를 들면, 단편 Gly　Gly　Gly/GGG와 입체 링커로서 작용하는 또 다른 단편의 조합을 사용하는 것도 또한 가능하다. 이러한 경우, 입체 링커는 글라이신, 세린 및 알라닌 잔기의 조합, 예를 들면, Gly　Gly　Gly　Ser　Ala　Ser　Gly　Gly/GGGSASGG일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 입체 링커는 세린과 히스티딘 잔기의 조합, 예를 들면, Ser　His　His　Ser/SHHS 또는 Ser　His　His　Ala　Ser/SHHAS일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 입체 링커는 알라닌과 시스테인 잔기이 조합, 예를 들면, CAAACAAC (Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys), CAACAAAC (Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys) 또는 이들의 단편일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 적절한 입체 링커는 위에서 언급된 바와 같은 임의의 유형의 입체 링커의 조합에 의해 형성된다. 이러한 조합의 예는 다름과 같이 표시된다: Gly　Gly　Gly　Gly　Gly　Ser　Gly　Gly　Gly　Gly　Ser (GGGGGSGGGGS), Gly　Gly　Gly　Cys　Ala　Ala　Ala　Cys　Ala　Ala　Cys (GGGCAAACAAC) 및 Gly　Gly　Gly　Gly　Ser　Gly　Gly　Gly　Gly　Cys　Ala　Ala　Ala　Ala　Ala　Cys (GGGGSGGGCAAACAAC).
하나의 양태에서, 입체 링커는 또한 단일 아미노산 잔기, 예를 들면, 단일 시스테인 잔기로부터 선택될 수 있다.
또한, 입체 링커는 또한 비특이적 방식으로 발생하는 기능적 도메인 (b)의 활성화에 유용할 수 있다. 비특이적 방식에서의 도메인 (b)의 활성화는 입체 링커의 pH-의존적 가수분해로 인해 본 발명에 따른 융합 단백질의 도메인 (b)로부터 도메인 (a)를 절단함으로써 수행될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 융합 단백질은 인테그린에 대한 모티브 결합을 함유하는 링커를 포함할 수 있다. 이러한 링커는 세포 표면에 대한 추가의 결합을 제공하고 전신성 독성을 감소시킬 수 있다.
인테그린은 다수의 세포 유형의 표면 상에 존재하는 알파-베타 이질이합체이다. 인테그린에 대한 리간드는 피브로넥틴, 콜라겐 및 라미닌과 같은 세포외 매트릭스 유착 단백질이다. 피브로넥틴 및 일부 다른 리간드의 경우, RGD 모티브는 인테그린과의 상호작용을 담당한다. 이러한 모티브를 함유하는 펩타이드는 인테그린 알파 5 베타 1을 특이적으로 인식하고, 전이를 형성하는 이의 능력을 제한함으로써 종양 세포의 침입에 대하여 억제 효과를 가진다[Ghelsen et al., (1988) J. Cell Biol. 106, 925-930]. 파지 디스플레이 방식을 사용하여, 6-아미노산 펩타이드의 라이브러리로부터 NGR 모티브를 포함하는 서열을 분리하고, 이는 인테그린 알파 5 베타 1에 결합하고 이를 특이적으로 인식한다[Koivunen et al.., J Biol Chem. 1993 Sep 25; 268(27): 20205-10]. 2개의 모티브 (NGR 및 RGD)는 혈관신생에 관련된 다른 인자에 대하여 길항제로서 결합하는 것으로 또한 입증되었다. RGD는 또한 혈관신생의 과정에서 특이적으로 과제시된 인테그린과 상호작용하는 반면[Friedlander et al. Definition of two angiogenic pathways by distinct αv integrins. Science (Washington DC), 270: 1500-1502, 1995], NGR은 암의 침입에도 또한 관련된 단백질이고 특히 종양 및 강렬한 혈관신생을 겪는 다른 세포의 혈관에 강하게 노출된 아미노펩티다제 N과 상호작용한다[Pasqualini et al., Aminopeptidase N is a receptor for tumor-homing peptides 및 a target for inhibiting angiogenesis. Cancer Res. 2000 Feb 1; 60(3): 722-7].
인테그린과 결합할 수 있는 본 발명의 융합 단백질로부터의 링커는 모티브 Asn　Gly　Arg (NGR), Asp　Gly　Arg (DGR) 또는 Arg　Gly　Asp (RGD)를 포함한다.
본 발명의 융합 단백질의 바람직한 실시형태에서, 인테그린과 결합하는 모티브를 포함하는 링커는 서열 번호 140으로 지정된다.
서열 번호 140 (Cys　Phe　Cys　Asp　Gly　Arg　Cys　Asp　Cys　Ala/CFCDGRCDCA)은 시스테인 서열에 의해 안정화된 모티브 Asp　Gly　Arg (DGR)을 포함하며, 공지되어 있으며, 문헌[Wang H, Yan Z, Shi J, Han W, Zhang Y Protein Expr Purif. 2006 Jan; 45(1): 60-5]에 개시되어 있다.
본 발명의 융합 단백질의 특정 실시형태는 해독 과정의 억제에 의해 세포내에서 작용하는 펩타이드를 포함하는 융합 단백질이며, 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65, 서열 번호 66, 서열 번호 67, 서열 번호 68, 서열 번호 69, 서열 번호 70, 서열 번호 71, 서열 번호 72, 서열 번호 73, 서열 번호 74, 서열 번호 75, 서열 번호 76, 서열 번호 77, 서열 번호 78, 서열 번호 79, 서열 번호 80, 서열 번호 81, 서열 번호 82, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 144, 서열 번호 145, 서열 번호 146, 서열 번호 147, 서열 번호 148, 서열 번호 149, 서열 번호 150, 서열 번호 151, 서열 번호 152, 서열 번호 153, 서열 번호 154, 서열 번호 155, 서열 번호 156, 서열 번호 157, 서열 번호 158, 서열 번호 159, 서열 번호 160, 서열 번호 161, 서열 번호 162, 서열 번호 163, 서열 번호 164, 서열 번호 165, 서열 번호 166, 서열 번호 167 및 서열 번호 168의 지정된 펩타이드의 군으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 융합 단백질에서의 TRAIL의 항암 활성은, 단백질 합성을 억제하는 다른 성분의 활성화(예를 들면, 28S rRNA에서 아데닌의 탈퓨린화, 인자 EF2의 ADP-리보실화, 28SRNA에서 아데닌의 N-글리코실화, 28S RNA의 절단, mRNA의 절단 또는 DNA 분해)를 수행하고, 이에 따라 프로테옴의 수준에서 세포의 반응을 차단하고, 아폽토시스 경로를 차단하는 단백질의 과생성을 감소시키고, 마지막으로 아폽토시스 경로를 재확립함으로써 잠재적으로 증가할 수 있다. 추가로, 세포의 단백질 합성 과정의 차단은 DR 시리즈의 기능적 세포 수용체에 대한 TRAIL의 부착으로부터 야기되는 신호와 상승작용하는 내부 유도된 아폽토시스를 세포 주기의 제어점 (예를 들면, 사이클린-의존적 키나제)에 의해 활성화시킬 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 다수의 경우에서 가용성 TRAIL 및 서열의 단편을 포함하는 이의 변이체 보다 더 강력한 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
지금까지, 본 발명의 융합 단백질에서 사용된 공지된 효과기 펩타이드 중에서도, 인터류킨-2에 융합된 디프테리아(Ontake®)만이 의약에서 사용되었다. 본 발명의 융합 단백질에 사용된 다른 효과기 펩타이드는 부적합한 동력학, 비특이적 프로테아제에 의한 신속한 분해, 및 표적 부위에서 효과기 펩타이드의 작용을 가능하게 하는데 필요한 적절한 활성화 경로의 서열의 결핍에 의해 유발되는 체내 축적 때문에 의약에 적용되지 않았다. 융합 단백질의 혼입은 이의 작용이 원해지는 부위로 이의 선택적인 전달을 가능하게 한다.
더욱이, 효과기 펩타이드의 부착은 단백질의 중량을 증가시키며, 이는 반감기를 연장시키고, 종양에서 단백질의 보유를 증가시키고, 그 결과 이의 효능을 증가시킨다. 추가적으로, 다수의 경우에서, 신규한 융합 단백질은 아마 단백질 합성을 담당하는 세포 기구의 불안정을 통해 TRAIL에 대한 자연 또는 유도 내성을 극복한다. 암 세포는 그 중에서도 아폽토시스 경로를 차단하는 단백질 (Bcl-2, IAP, XIAP 또는 cFLIP)의 과생성에 의해 TRAIL의 세포독성 활성에 대한 내성을 획득할 수 있기 때문에, 단백질 합성의 세포 기작의 차단은 프로테옴 수준에서 세포 반응을 봉쇄하고, 이에 따라 아폽토시스 경로를 해제할 수 있다.
상기에서 언급된 대표적인 융합 단백질의 구조에 대한 상세한 설명은 하기에 제시된 실시예에 나타낸다.
본 발명에 따르면, 융합 단백질은 2개 이상의 단백질을 함유하는 단일 단백질 분자 또는 이의 단편을 의미하며, 이는 추가의 화학 링커를 사용하지 않고 이의 각각의 펩타이드 쇄 내의 펩타이드 결합을 통해 공유결합되어 있다.
융합 단백질은 또한 대안적으로 단백질 작제물 또는 키메라 단백질로서 개시될 수도 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "작제물" 또는 "키메라 단백질"은, 사용된다면, 상기에서 정의된 바와 같은 융합 단백질을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
이와 같이 정의된 융합 단백질이 펩타이드 및 단백질의 공지된 화학 합성 방법에 의해 합성될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
융합 단백질은 화학 펩타이드 합성 방법, 특히 캐리어로서 적절한 수지를 사용하는 고체상에서의 펩타이드 합성 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 통상적으로 공지되어 있는 것이며, 그 중에서도 특히 논문, 예를 들면, [Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York; 및 Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company]에 개시되어 있다.
융합 단백질은 연속 단백질로서 펩타이드의 화학 합성 방법에 의해 합성될 수 있다. 대안적으로, 단백질의 각 단편(도메인)을 별개로 합성하고, 이어서 제2 펩타이드의 카복실 말단으로부터 하나의 펩타이드 단편의 아미노 말단을 축합함으로써, 펩타이드 결합을 통해 하나의 연속 펩타이드에서 함께 조합할 수 있다. 이러한 기술은 통상적으로 잘 공지되어 있다.
그러나, 바람직하게는 본 발명의 융합 단백질은 숙주 세포 내의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 유전자 발현 방법에 의해 생성된 재조합 단백질이다.
생성된 펩타이드의 구조를 증명하기 위해, 고분해능 질량 분석법과 같은 펩타이드의 아미노산 조성의 공지된 분석 방법을 사용하여 펩타이드의 분자량을 결정할 수 있다. 펩타이드 서열을 확인하기 위해, 순차적으로 펩타이드를 분해하고 아미노산의 서열을 식별하는 단백질 서열 분석기도 또한 사용할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 상기에서 정의된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 특히 DNA 서열이다.
바람직하게는, 상기에서 정의된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열, 특히 DNA는 대장균(E. coli)에서의 발현에 최적화된 서열이다.
본 발명의 또 다른 측면은 또한 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열, 특히 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기에서 정의된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
본 발명의 융합 단백질의 발현을 위한 바람직한 숙주 세포는 대장균 세포이다.
융합 단백질을 포함하는 재조합 단백질의 생성 방법은 잘 공지되어 있다. 간단히 말하자면, 이러한 기술은 폴리뉴클레오타이드 분자, 예를 들면, 표적 단백질의 아미노산 서열을 암호화하고 숙주에서 표적 단백질의 발현을 지시하는 DNA 분자의 생성에 있다. 이어서, 폴리뉴클레오타이드 분자를 암호화하는 표적 단백질을 적절한 발현 벡터에 혼입하는데, 이 발현 벡터는 폴리펩타이드의 효율적 발현을 보장한다. 이어서, 형질 감염/형질 전환을 위해 재조합 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 그 결과로서 형질 전환된 숙주 세포가 생성된다. 이후, 형질 전환된 세포를 배양하여 표적 단백질을 과발현시키고, 수득된 단백질을 정제하고, 임의로 단백질을 발현하거나 정제하는데 사용된 태그 서열을 절단하여 자른다.
발현 및 정제의 적절한 기술은, 예를 들면, 논문[Goeddel, Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990); 및 A. Staron et al., Advances Mikrobiol., 2008, 47, 2, 1983-1995]에 개시되어 있다.
숙주 세포에서 DNA 서열의 도입 및 복제를 위한 발현 벡터로서, 코스미드, 플라스미드 또는 변형된 바이러스를 사용할 수 있다. 전형적으로 플라스미드를 발현 벡터로서 사용한다. 적절한 플라스미드는 잘 공지되어 있으며, 상업적으로 입수 가능하다.
본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자 및 적절한 숙주 세포에 혼입된 암호화 서열의 전사 및 해독을 위한 필수 조절 서열을 포함한다. 조절 서열의 선택은 숙주 세포의 유형에 의존하며 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 이러한 조절 서열의 예는 전사 프로모터 및 인핸서 또는 RNA 폴리머라제 결합 서열, 암호화 서열 전에 삽입된 전사 개시 신호를 함유하는 리보솜 결합 서열, 및 암호화 서열 후에 삽입된 전사 종결자 서열이다. 더욱이, 사용되는 숙주 세포 및 벡터에 따라, 복제 원점, 추가적인 DNA 제한 부위, 인핸서, 및 전사의 유도를 허용하는 서열과 같은 기타 서열을 발현 벡터에 도입할 수 있다.
발현 벡터는 또한 형질전환된 세포에 정의된 표현형을 부여하고 형질전환된 세포의 특이적인 선택을 할 수 있게 하는 마커 유전자 서열을 포함할 것이다. 더욱이, 벡터는 또한 삽입되지 않은 플라스미드를 취한 세포와 표적 단백질의 삽입된 암호화 서열을 함유하는 재조합 플라스미드로 형질전환된 세포를 구별하도록 허용하는 제2 마커 서열을 함유할 수 있다. 가장 종종, 전형적인 항생제 내성 마커를 사용하지만, 세포내(생체내)의 존재가 자가방사선 기술, 분광광도법, 생체발광 또는 화학발광을 사용하여 용이하게 결정될 수 있는 당업계에 공지된 임의의 다른 리포터 유전자를 사용할 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포에 따라, β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 루시페라제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 또는 녹색 형광 단백질과 같은 리포터 유전자를 사용할 수 있다.
더욱이, 발현 벡터는 접기를 용이하게 하는 적절한 세포 구획, 예를 들면, 주변세포질(periplasma)로 단백질을 운반하는 신호 서열을 함유할 수 있다. 추가로, N-말단에 부착된 HisTag 또는 C-말단에 부착된 GST와 같은 라벨/태그를 암호화하는 서열이 존재할 수 있으며, 이는 니켈 컬럼 상에서 친화성 크로마토그래피를 통해, 친화성의 원리를 사용하여 생성된 단백질의 후속 정제를 용이하게 한다. 숙주 세포 내에서 단백질 가수분해에 대항하여 단백질을 보호하는 추가의 서열 뿐만 아니라, 이의 용해도를 향상시키는 서열도 또한 존재할 수 있다.
표적 단백질의 서열에 부착된 보조 요소는 이의 활성을 차단하거나, 예를 들면, 독성으로 인한 것과 같은 또 다른 이유로 유해할 수 있다. 이러한 요소를 제거해야 하는데, 이는 효소 절단 또는 화학 절단에 의해 달성될 수 있다. 특히, 6-히스해딘 태그 HisTag 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 단백질 정제를 허용하도록 부착된 이러한 유형의 다른 마커를 제거해야 하는데, 그 이유는 가용성 TRAIL 단백질의 간 독성에 대한 이의 기술된 효과 때문이다. 원핵 세포(대장균 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 세균, 사카로마이세스 세르비지애(Saccharomyces cervisiae) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모) 및 진핵 세포주(곤충, 포유동물, 식물)를 포함한 공지된 각종 숙주 세포를 기반으로 하는 이종 발현 시스템을 사용할 수 있다.
바람직하게는, 배양 및 유전자 조작의 용이성 및 다량의 수득 생성물로 인해, 대장균 발현 시스템을 사용한다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 표적 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 대장균에서의 발현을 위해 최적화될 것이고, 즉 당업계에 공지된 가능한 서열 변이체로부터 선택된 대장균에서의 발현에 최적인 코돈을 암호화 서열에 함유할 것이다. 더욱이, 발현 벡터는 암호화 서열에 부착된 대장균에 적절한 상기에서 개시된 요소를 함유할 것이다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 대장균에서의 발현을 위해 최적화된 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 85, 서열 번호 86, 서열 번호 87, 서열 번호 88, 서열 번호 89, 서열 번호 90, 서열 번호 91, 서열 번호 92, 서열 번호 93, 서열 번호 94, 서열 번호 95, 서열 번호 96, 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101, 서열 번호 102, 서열 번호 103, 서열 번호 104, 서열 번호 105, 서열 번호 106, 서열 번호 107, 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 110, 서열 번호 111, 서열 번호 112, 서열 번호 113, 서열 번호 114, 서열 번호 115, 서열 번호 116, 서열 번호 117, 서열 번호 118, 서열 번호 119, 서열 번호 120, 서열 번호 121, 서열 번호 122, 서열 번호 123, 서열 번호 124, 서열 번호 125, 서열 번호 126, 서열 번호 127, 서열 번호 128, 서열 번호 129, 서열 번호 130, 서열 번호 131, 서열 번호 132, 서열 번호 133, 서열 번호 134, 서열 번호 135, 서열 번호 136, 서열 번호 137, 서열 번호 138, 서열 번호 169, 서열 번호 170, 서열 번호 171, 서열 번호 172, 서열 번호 173, 서열 번호 174, 서열 번호 175, 서열 번호 176, 서열 번호 177, 서열 번호 178, 서열 번호 179, 서열 번호 180, 서열 번호 181, 서열 번호 182, 서열 번호 183, 서열 번호 184, 서열 번호 185, 서열 번호 186, 서열 번호 187, 서열 번호 188, 서열 번호 189, 서열 번호 190, 서열 번호 191, 서열 번호 192 및 서열 번호 193으로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 서열의 군으로부터 선택되며; 이들은 각각 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53, 서열 번호 54, 서열 번호 144, 서열 번호 145, 서열 번호 146, 서열 번호 147, 서열 번호 148, 서열 번호 149, 서열 번호 150, 서열 번호 151, 서열 번호 152, 서열 번호 153, 서열 번호 154, 서열 번호 155, 서열 번호 156, 서열 번호 157, 서열 번호 158, 서열 번호 159, 서열 번호 160, 서열 번호 161, 서열 번호 162, 서열 번호 163, 서열 번호 164, 서열 번호 165, 서열 번호 166, 서열 번호 167 및 서열 번호 168의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질을 암호화한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명은 또한 상기에서 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열인 서열 번호 85 내지 서열 번호 138 및 서열 번호 169 내지 서열 번호 193의 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 대장균의 형질 전환에 적절한 발현 벡터 뿐만 아니라, 이러한 발현 벡터로 형질전환된 대장균 세포를 제공한다.
형질 전환, 즉 세균성 숙주 세포, 특히 대장균에 대한 DNA 서열의 도입은, 예를 들면, 저온(4℃)에서 칼슘 이온으로 처리하고, 이어서 열 충격(37℃ 내지 42℃에서)을 수행하거나 전기천공법에 의해 DNA를 취하도록 제조된 적격 세포 상에서 일반적으로 수행된다. 이러한 기술은 잘 공지되어 있으며, 일반적으로 발현 시스템의 제조업자에 의해 결정되거나, 문헌 및 실험 작업을 위한 매뉴얼[Maniatis et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, N.Y., 1982]에 개시되어 있다.
대장균 발현 시스템에서의 본 발명의 융합 단백질의 과발현의 절차는 하기에서 더 개시될 것이다.
본 발명은 또한 활성 성분으로서 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 융합 단백질 및 적절한 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 통상의 보조 성분을 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 담체 또는 희석제에 용해 또는 분산된 유효량의 본 발명의 융합 단백질 및 약제학적으로 허용 가능한 보조 성분을 함유할 것이며, 바람직하게는 단위 투여 형태로 제형화된 약학적 조성물 또는 복수의 용량을 함유하는 제형의 형태일 것이다. 약학적 형태 및 이의 제형화 방법 뿐만 아니라, 다른 성분, 담체 및 희석제는 당업자에게 공지되어 있으며, 문헌에 개시되어 있다. 예를 들면, 이들은 논문[Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. 20, 2000, Mack Publishing Company, Easton, USA]에 개시되어 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및 보조 성분"은 당업계에 공지된 임의의 용매, 분산매, 계면활성제, 항산화제, 안정화제, 보존제(예를 들면, 항세균제, 항진균제) 및 등장제를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 선택된 투여 경로 및 목적하는 투여 형태, 예를 들면, 경구, 비경구, 흡입, 국소용 액체, 고체 및 에어로졸 형태에 따라 각종 유형의 담체, 희석제 및 부형제를 함유할 수 있으며, 이러한 선택된 형태는 주사와 같은 투여 경로를 위해 멸균 상태이어야 한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여 경로는 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 종양내와 같은 주사 경로, 또는 단일 또는 지속 정맥내 주입을 포함한 비경구이다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 종양에 직접 주사하여 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 정맥내 투여될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 피하로 또는 복강내로 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 약학적 조성물은, 필요에 따라, 적절한 pH로 완충되고 체액과 등삼투성인 약제학적으로 허용 가능한 수성 또는 비수성 매질 중의 용액 또는 분산액일 수 있으며, 또한 수용자의 조직 또는 혈액과 상용가능한 조성물을 만드는 항산화제, 완충액, 정균제, 가용성 물질도 함유할 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 기타 성분은, 예를 들면, 물, 알콜, 예를 들면, 에탄올, 폴리올, 예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 예를 들면, 트리글리세라이드, 식물성 오일, 리포솜을 포함할 수 있다. 상기 물질의 적절한 유동성 및 입자 크기는 코팅 물질, 예를 들면, 레시틴, 및 계면활성제, 예를 들면, 하이드록시프로필셀룰로스 폴리소르베이트 등에 의해 제공될 수 있다.
액체 비경구 조성물을 위한 적절한 등장제는, 예를 들면, 글루코스와 같은 슈가, 염화 나트륨 및 이들의 조합이다.
대안적으로 주사 또는 주입 투여를 위한 약학적 조성물은, 예를 들면, 발열원 없는 멸균수와 같은 적절한 캐리어에서 사용되기 직전에 재구성하기 위한 분말 형태, 예를 들면, 동결 건조된 분말일 수 있다.
비경구 투여를 위한 본 발명의 약학적 조성물은 용액, 스프레이 또는 에어로졸을 포함하는 비강 투여의 형태도 또한 가질 수 있다. 바람직하게는 비내 투여를 위한 형태는 수용액일 것이며, 코 분비물과 유사한 특성을 유지하기 위해 약 5.5 내지 약 6.5의 pH를 유지하도록 완충되거나 등장성일 것이다. 더욱이, 이는 잘 공지된 비내 제제에서와 같이 보존제 또는 안정화제를 함유할 것이다.
조성물은 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키는 각종 항산화제를 함유할 수 있다. 더욱이, 미생물의 작용을 방지하기 위해, 조성물은, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 히메로살, 소르브산 및 이러한 유형의 공지된 유사 물질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 각종 항세균제 및 항진균제를 함유할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은, 예를 들면, 약 0.01 중량% 이상의 활성 성분을 포함할 수 있다. 보다 특히, 조성물은 조성물 단위에 대하여 활성 성분을 1 중량% 내지 75 중량%의 양으로 또는, 예를 들면, 25 중량% 내지 60 중량%의 양으로 함유할 수 있으나, 지정된 값으로 한정되는 것은 아니다. 인간을 포함한 환자에게 투여되는 본 발명에 따른 조성물의 실제 복용량은 체중, 병태의 심각성, 치료될 질환의 유형, 선행 또는 수반되는 치료적 개입, 투여 환자 및 투여 경로와 같은 육체적 및 생리적 요인에 의해 결정될 것이다. 적절한 단위 복용량, 전체 복용량 및 조성물 중 활성 성분의 농도는 치료하는 의사에 의해 결정된다.
조성물은, 예를 들면, 환자의 체중 1kg 당 약 1μg 내지 약 1000mg의 복용량으로, 예를 들면, 환자의 체중 1kg 당 5mg 내지 100mg의 범위 또는 5mg 내지 500mg의 범위로 투여될 수 있다. 융합 단백질 및 이를 함유하는 조성물은 항암 또는 항종양을 나타내며, 암 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 인간을 포함한 포유 동물에서 암 질환을 치료하기 위한 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 융합 단백질의 용도도 제공한다. 본 발명은 또한 신생물/암 질환의 치료가 필요한 대상에게 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 융합 단백질을 항신생물/항암 유효량으로, 임의로 적절한 약학적 조성물의 형태로 투여하는 것을 포함하는, 인간을 포함한 포유 동물에서 신생물/암 질환을 치료하는 방법도 제공한다.
본 발명의 융합 단백질은 백혈병, 육아종증, 골수종 및 기타 혈액암과 같은 혈액암의 치료를 위해 사용될 수 있다. 융합 단백질은 또한 유방암, 비소세포 폐암을 포함한 폐암, 대장암, 췌장암, 난소암, 방광암, 전립선암, 신장암, 뇌암 등과 같은 고형 종양의 치료를 위해 사용될 수 있다. 암의 치료에서 융합 단백질의 적절한 투여 경로는 특히 비경구 경로일 것이며, 이는 본 발명의 융합 단백질을 주사액 또는 주입액의 형태로, 이러한 투여 경로에 적절한 조성물 및 형태로 투여하는데에 있다. 본 발명은 하기의 특정 융합 단백질의 일반 절차 및 실시예에서 더 상세히 개시될 것이다.
융합 단백질의 과발현을 위한 일반 절차
플라스미드의 제조
대장균에서의 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 표적 융합 단백질의 아미노산 서열은 이를 암호화하는 DNA 서열을 생성하기 위해 주형으로서 사용하였다. 이러한 절차는 대장균에서의 표적 단백질 합성의 추가 단계의 효율을 향상시키는 것을 가능하게 한다. 이어서, 생성된 뉴클레오타이드 서열은 자동적으로 합성되었다. 추가로, 제한 효소 Ndel (선도 가닥의 5'-말단에서) 및 Xhol (선도 가닥의 3'-말단에서)의 절단 부위를 표적 단백질을 암호화하는 생성된 유전자에 첨가하였다. 이들을 사용하여 벡터 pET28a(Novagen)에 유전자를 클로닝하였다. 이들은 또한 다른 벡터에 단백질을 암호화하는 유전자를 클로닝하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 작제물로부터 발현된 표적 단백질은 트롬빈에 의해 인식된 부위에 후행하는 폴리히스티딘 태그(6개의 히스티딘)가 N-말단에 임의로 설치되며, 이는 후속하여 친화성 크로마토그래피를 통해 정제를 위해 제공되었다. 일부 표적은 어떠한 태그도 없이, 특히 히스티딘 태그 없이 발현되었고, 이들을 후속하여 SP 세파로스 상에서 정제하였다. 생성된 작제물의 정확성을 효소 Ndel 및 Xhol을 사용하여 분리된 플라스미드의 제한 분석에 의해 우선적으로 확인한 후, 표적 단백질의 전체 해독틀의 자동 서열분석에 의해 확인하였다. 서열분석을 위해 사용된 프라이머는 벡터에 존재하는 T7 프로모터 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') 및 T7 종결자 (5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3')의 서열에 상보적이다. 생성된 플라스미드는 제조업자의 추천에 따라 형질전환된 시판용 대장균 균주에서의 표적 융합 단백질의 과발현을 위해 사용되었다. 선택 배지(LB 한천, 카나마이신 50 μg/ml, 1% 글루코스) 상에서 수득된 콜로니는 카나마이신(50μg/ml) 및 1% 글루코스가 보충된 LB 액체 배지에서 밤새 배양하기 위해 사용되었다. 진탕 배양기에서 약 15시간의 성장 후, 배양물을 사용하여 적절한 배양물에 접종하였다.
융합 단백질의 과발현 및 정제 - 일반 절차 A
카나마이신(30μg/ml) 및 100μM 황산아연을 포함하는 LB 배지에 밤새 배양물을 접종하였다. 배양물은 600nm에서의 광학 밀도(OD)가 0.60-0.80에 도달될 때까지 37℃에서 배양하였다. 이어서, IPTG를 0.25mM 내지 1mM 범위의 최종 농도까지 첨가하였다. 25℃에서의 진탕 배양 (3.5시간 내지 20시간) 후, 배양물을 25분간 6,000g에서 원심분리하였다. 세균 펠릿은 50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 10mM 이미다졸을 함유하는 pH 7.4의 완충액에 재현탁시켰다. 현탁액을 8분 동안 얼음 상에서 초음파처리하였다(40% 진폭, 15초 펄스, 10초 간격). 생성된 추출물을 20,000g, 4℃에서 40분 동안 원심분리하여 맑게 하였다. Ni-세파로스(GE Healthcare) 수지를 세균 세포 추출물의 제조를 위해 사용된 완충액으로 평형화시켜 전처리하였다. 이어서, 수지를 추출물의 원심 분리 후 수득된 상청액과 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 이를 크로마토그래피 컬럼에 주입하고, 50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 20mM 이미다졸의 pH 7.4의 완충액 15용적 내지 50용적으로 세정하였다. 수득된 단백질을 0.5M NaCl 및 50mM KH2PO4의 pH 7.4의 완충액에서 이미다졸 구배를 사용하여 컬럼으로부터 용출시켰다. 수득된 분획은 SDS-PAGE로 분석하였다. 적절한 분획을 합하고, 50mM 트리스 완충액, pH 7.2, 150mM NaCl, 500mM L-아르기닌, 0.1mM ZnSO4, 0.01% Tween 20에 대하여 4℃에서 밤새 투석하고, 동시에, 존재하는 경우, Histag를 트롬빈(1:50)으로 절단하였다. 절단 후, 벤즈아미딘 세파로스 TM 수지를 사용하여 정제에 의해 Histag와 함께 발현된 표적 융합 단백질로부터 트롬빈을 분리하였다. Histag 없이 발현된 표적 융합 단백질의 정제는 SP 세파로스 상에서 수행하였다. 생성물의 순도를 SDS-PAGE 전기영동에 의해 분석하였다[Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982].
융합 단백질의 과발현 및 정제 - 일반 절차 B
카나마이신(30μg/ml) 및 100μM 황산아연을 포함하는 LB 배지에 밤새 배양물을 접종하였다. 배양물은 600nm에서의 광학 밀도(OD)가 0.60-0.80에 도달될 때까지 37℃에서 배양하였다. 이어서, IPTG를 0.5mM 내지 1mM 범위의 최종 농도까지 첨가하였다. 25℃에서의 진탕 배양 20시간 후, 배양물을 25분 동안 6000g에서 원심분리하였다. 과발현 후 세균 세포는 50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 10mM 이미다졸, 5mM 베타-머캅토에탄올, 0.5mM PMSF(페닐메틸설포닐 플루오라이드)를 함유하는 pH 7.8의 완충액에서 프렌치 프레스(French Press)로 파괴하였다. 생성된 추출물을 8,000g에서 50분 동안 원심분리하여 맑게 하였다. Ni-세파로스 수지를 수득된 상청액과 함께 밤새 배양하였다. 이어서, 결합 단백질을 포함하는 수지를 크로마토그래피 컬럼에 충전하였다. 비결합 단백질을 함유하는 분획을 세정 제거하기 위해, 컬럼을 50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 10mM 이미다졸, 5mM 베타-머캅토에탄올, 0.5mM PMSF(페닐메틸설포닐 플루오라이드)의 pH7.8의 완충액 15용적 내지 50용적으로 세정하였다. 이어서, 층(bed)과 특이적으로 결합하는 대부분의 단백질을 세정 제거하기 위해, 컬럼을 50mM KH2PO4, 0.5M NaCl, 500mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 0,5mM PMSF를 함유하는의 pH 7.5의 완충액으로 세정하였다. 수득된 분획을 SDS-PAGE로 분석하였다[Maniatis et al, Molecular Cloning. Cold Spring Harbor, NY, 1982]. 표적 단백질을 함유하는 분획을 합하고, 단백질이 히스티딘 태그와 함께 발현된 경우, 트롬빈으로 절단하여(1U/4mg의 단백질, 16℃에서 8시간) 폴리히스티딘 태그를 제거하였다. 이어서, 분획을 제형 완충액(500mM L-아르기닌, 50mM 트리스, 2.5mM ZnSO4, pH 7.4)에 대하여 투석하였다.
본 상세한 설명에서, 후속하여 제거된 히스티딘 태그와 함께 최초로 발현된 단백질의 실시예는 실시예 번호 옆에 위첨자 a)로 지정된다. 히스티딘 태그 없이 최초로 발현된 단백질은 실시예 번호 옆에 위첨자 b)로 지정된다.
2-D 전기영동에 의한 융합 단백질의 특성화
수득된 단백질을 더 특성화하고 크로마토그래피 조건을 정확하게 선택하기 위해, 단백질의 등전점을 결정하였다. 이러한 목적을 위해, 하기 계획에 따라 2단계로 2차원 전기영동(2-D) 방법을 사용하였다.
단계 1. pH 구배 및 변성 조건에서 단백질의 등전점전기영동(isoelectrofocusing)
1mg/ml 내지 2mg/ml 농도의 단백질 제제를 아세톤 중의 10% 트리클로로아세트산 및 0.07% 베타-머캅토에탄올을 함유하는 침전 용액과 1:1 비율로 혼합하여 침전시켰다. 혼합물을 -20℃에서 30분 동안 배양하고, 이어서 15,000g 및 4℃에서 25분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 펠릿을 0.07% 베타-머캅토에탄올을 함유하는 냉 아세톤으로 2회 세정하였다. 이어서, 탐지 가능한 냄새가 검출되지 않을 때까지 아세톤 잔기를 증발시켰다. 후속하여 사용된 띠(strip)에 따라, 단백질 펠릿을 pH 3 내지 pH 11 또는 pH 6 내지 pH 11의 프로파일을 갖는 8M 우레아, 1% CHAPS, 15mM DTT, 0.5% 양쪽성 물질(GE Healthcare)의 재수화 완충액 250ml에 현탁시켰다. 단백질 용액을 등전점전기영동을 위해 세라믹 챔버에 넣은 후, 적절한 pH 프로파일(3-11 또는 6-11)을 갖는 13cm DryStrip(GE Healthcare)에 넣었다. 전체를 미네랄 오일 층으로 덮었다. 챔버를 Ettan IPGphor III 장치에 넣고, 등전점전기영동을 띠의 치수 및 pH 프로파일에 할당된 하기 프로그램에 따라 수행하였다:
20℃에서의 16시간 탈수
고정된 pH 구배로 전기장에서의 등전점전기영동
Figure pct00001
이어서, 등전점전기영동된 단백질을 함유하는 띠를 탈이온수에서 1분간 세정하고, Coomassie Brilliant로 염색하고, 이어서 탈색하고, 단백질의 위치를 표시하기 위해 이미지 파일로 보관하였다. 변색된 띠를 다음 조성의 완충액으로 15분 동안 2회 평형화시켰다: 50mM 트리스-HCl pH 8.8, 6M 우레아, 1% DTT, 2% SDS, 30% 글리세롤.
단계 2. SDS-PAGE에 의한 제2 방향에서의 분리
띠를 표준 크기 당 단일 웰을 함유하는 12.5% 폴리아크릴아미드 겔 상에 놓고, 이어서 3시간 동안 200V의 전압에서 SDS-PAGE를 위한 장치로 분리를 수행하였다. 겔을 Coomassie Brilliant로 염색하고, 이어서 적용된 스케일로 보관하였다. 단백질은 크기의 표준을 기준으로 이의 중량을 측정하여 확인되었고, 이의 IPI는 제조업자(GE Healthcare)에 의해 제공된 곡선(애노드로 표시된 말단으로부터 띠 길이의 %에 대한 pH의 비율)을 기준으로 하여 6-11의 규모로 판독되거나 등전점전기영동 캘리브레이션 키트(GE Healthcare)에 의해 실험적으로 측정된 곡선을 기준으로 3-11의 규모로 판독되었다.
본 발명의 융합 단백질의 대표적인 실시예는 하기 실시예에 개시된다.
하기 아미노산 서열 성분의 명칭이 사용된다:
LINKER1: 입체 링커 서열 (Gly　Gly　Gly　Gly　Ser / GGGGS)
LINKER2: 입체 링커 서열 (Gly　Gly　Gly　Gly / GGGG)
LINKER3: 입체 링커 서열 (Ala　Ser　Gly　Gly / ASGG)
LINKER4: 입체 링커 서열 (Gly　Gly　Gly　Ser / GGGS)
LINKER5: 입체 링커 서열 (Ser　His　Ala　Ser / SHAS)
FURIN: 푸린에 의해 절단된 서열 (Arg　Lys　Lys　Arg / RKKR)
UROKIN: 유로키나제에 의해 절단된 서열 (Arg　Val　Val　Arg / RVVR)
PEG: 페길화 링커 서열 (Ala　Ser　Gly　Cys　Gly　Pro　Glu / ASGCGPE)
TRANS1: 운반 서열 (Lys　Asp　Glu　Leu / KDEL)
TRANS2: 운반 서열 (Arg Arg　Arg　Arg　Arg　Arg　Arg　Arg / RRRRRRRR)
TRANS3: (Lys Glu　Asp Leu /KEDL)
LINKER6: (Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys / CAAACAAC)
LINKER7: (Gly Gly Gly / GGG)
MMP: (Pro　Leu　Gly　Leu　Ala　Gly　/ PLGLAG)
FURIN.NAT: (Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu / RHRQPRGWEQL)
실시예 1. 서열 번호 1의 융합 단백질
서열 번호 1의 단백질은 430개의 아미노산의 길이 및 48.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281의 서열에 의해 형성되고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 248-아미노산 부가닌 도메인 A (서열 번호 55)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b)의 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 55)-LINKER1-FURIN-PEG-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 85이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 1을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 85를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 2. 서열 번호 2의 융합 단백질
서열 번호 2의 단백질은 267개의 아미노산의 길이 및 50.8 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 리신 A의 267-아미노산 도메인 (서열 번호 56)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)는 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 서열 (ASGCGPE) 및 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 서열 (RKKR)에 의해 도메인 (b)와 분리되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에서, 전체 작제물의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-FURIN-LINKER1-(서열 번호 56)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 2 및 서열 번호 86이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 2를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 86을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 2a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 2b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 3. 서열 번호 3의 융합 단백질
서열 번호 3의 단백질은 378개의 아미노산의 길이 및 42 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 리신 A 도메인의 267-아미노산 변이체 (서열 번호 57)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)는 순차적으로 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 서열 (ASGCGPE), 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 서열 (RKKR) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)에 의해 도메인 (b)와 분리되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 작제물의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-FURIN-LINKER1-(서열 번호 57)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 87이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 3을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 87을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 4. 서열 번호 4의 융합 단백질
서열 번호 4의 단백질은 473개의 아미노산의 길이 및 53.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 PAP 독소의 290-아미노산 동족체 (서열 번호 58)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)는 순차적으로 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)에 의해 도메인 (b)와 분리되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 작제물의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 (KDEL)이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-LINKER1-(서열 번호 58)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 4 및 서열 번호 88이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 4를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 88을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 5. 서열 번호 5의 융합 단백질
서열 번호 5의 단백질은 430개의 아미노산의 길이 및 48.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 사포린의 252-아미노산 단편 (서열 번호 59)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)는 순차적으로 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)에 의해 도메인 (b)와 분리되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-LINKER1-(서열 번호 59)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 5 및 서열 번호 89이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 5를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 89를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 6. 서열 번호 6의 융합 단백질
서열 번호 6의 단백질은 442개의 아미노산의 길이 및 49.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 사포린의 252-아미노산 단편 (서열 번호 59)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 페길화 링커 서열 (ASGCGPE), 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS) 및 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-PEG-LINKER1-LINKER1-FURIN-(서열 번호 59)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 6 및 서열 번호 90이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 6을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 90을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 7. 서열 번호 7의 융합 단백질
서열 번호 7의 단백질은 429개의 아미노산의 길이 및 47.5 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 247-아미노산 펩타이드 트리코산틴 (서열 번호 60)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 60)-LINKER1-FURIN-PEG-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 7 및 서열 번호 91이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 7을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 91을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 8. 서열 번호 8의 융합 단백질
서열 번호 8의 단백질은 427개의 아미노산의 길이 및 47.5 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 247-아미노산 펩타이드 트리코안구인 (서열 번호 61)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 61)-LINKER1-FURIN-PEG-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 8 및 서열 번호 92이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 8을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 92를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 9. 서열 번호 9의 융합 단백질
서열 번호 9의 단백질은 427개의 아미노산의 길이 및 47.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 겨우살이 렉틴 A의 249-아미노산 쇄 (서열 번호 62)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 62)-LINKER1-PEG-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 9 및 서열 번호 93이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 9를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 93을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 10. 서열 번호 10의 융합 단백질
서열 번호 10의 단백질은 462개의 아미노산의 길이 및 51.9 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 에불린의 273-아미노산 서브유닛 A (서열 번호 63)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR) 및 입체 링커 서열 (GGGG)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 63)-LINKER1-PEG-FURIN-LINK2-(TRAIL114-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 10 및 서열 번호 94이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 10을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 94를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 11. 서열 번호 11의 융합 단백질
서열 번호 11의 단백질은 454개의 아미노산의 길이 및 50.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 니그린의 272-아미노산 서브유닛 A (서열 번호 64)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 64)-LINKER1-FURIN-PEG-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 11 및 서열 번호 95이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 11을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 95를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 12. 서열 번호 12의 융합 단백질
서열 번호 12의 단백질은 221개의 아미노산의 길이 및 25.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 47-아미노산 루핀 P1 펩타이드 (서열 번호 65)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS) 및 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-FURIN-(서열 번호 65)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 12 및 서열 번호 96이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 12를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 96을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 13. 서열 번호 13의 융합 단백질
서열 번호 13의 단백질은 221개의 아미노산의 길이 및 26 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 47-아미노산 루핀 P1 펩타이드 (서열 번호 65)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (ASGG) 및 (GGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR) 및 입체 링커 서열 (ASGG)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER4-PEG-FURIN-LINKER3-(서열 번호 65)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 13 및 서열 번호 97이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 13을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 97을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 14. 서열 번호 14의 융합 단백질
서열 번호 14의 단백질은 254개의 아미노산의 길이 및 29.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL95-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 47-아미노산 루핀 P1 펩타이드 (서열 번호 65)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 작제물의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL95-281)-LINKER1-PEG-FURIN-(서열 번호 65)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 14 및 서열 번호 98이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 14를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 98을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 14a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 14b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 15. 서열 번호 15의 융합 단백질
서열 번호 15의 단백질은 438개의 아미노산의 길이 및 49 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 볼켄신의 244-아미노산 서브유닛 A (서열 번호 66)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 66)-LINKER1-FURIN-PEG-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 15 및 서열 번호 99이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 15를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 99를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 15a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 15b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 16. 서열 번호 16의 융합 단백질
서열 번호 16의 단백질은 431개의 아미노산의 길이 및 48.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 볼켄신의 244-아미노산 서브유닛 A (서열 번호 66)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 작제물의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-LINKER1-(서열 번호 66)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 16 및 서열 번호 100이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 15를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 99를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 17. 서열 번호 17의 융합 단백질
서열 번호 17의 단백질은 428개의 아미노산의 길이 및 47.8 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 볼켄신의 246-아미노산 서브유닛 A (서열 번호 67)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 67)-LINKER1-FURIN-PEG-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 17 및 서열 번호 101이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 17을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 101을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 18. 서열 번호 18의 융합 단백질
서열 번호 18의 단백질은 515개의 아미노산의 길이 및 55.9 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 슈도모나스 아에루기노사 외독소의 변형된 서열의 단편의 342-아미노산 동족체 (서열 번호 68)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGS) 및 입체 링커 서열 (ASGG)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 작제물의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 (KDEL)이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER4-LINKER3-(서열 번호 68)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 18 및 서열 번호 102이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 18을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 102를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 18a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 18b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 19. 서열 번호 19의 융합 단백질
서열 번호 19의 단백질은 526개의 아미노산의 길이 및 57.1 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL119-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 변형된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 단편의 342-아미노산 동족체 (서열 번호 68)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR) 및 입체 링커 서열 (ASGG)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 (KDEL)이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL119-281)-LINKER4-PEG-FURIN-LINKER3-(서열 번호 68)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 19 및 서열 번호 103이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 19를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 103을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 20. 서열 번호 20의 융합 단백질
서열 번호 20의 단백질은 526개의 아미노산의 길이 및 57.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 변형된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 단편의 354-아미노산 동족체 (서열 번호 84)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR) 및 입체 링커 서열 (ASGG)이 순차적으로 혼입되어 있다.
추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER4-PEG-FURIN-LINKER3-(서열 번호 84)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 20 및 서열 번호 104이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 20을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 104를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 20a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 20b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 21. 서열 번호 21의 융합 단백질
서열 번호 21의 단백질은 534개의 아미노산의 길이 및 58.5 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 변형된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 단편의 354-아미노산 동족체 (서열 번호 69)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR) 및 입체 링커 서열 (ASGG)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER4-PEG-FURIN-LINKER3-(서열 번호 69)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 21 및 서열 번호 105이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 21을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 105를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 22. 서열 번호 22의 융합 단백질
서열 번호 22의 단백질은 534개의 아미노산의 길이 및 56.1 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 변형된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 342-아미노산 단편 (서열 번호 83)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGS)이 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER4-(서열 번호 83)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 22 및 서열 번호 106이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 22를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 106를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 23. 서열 번호 23의 융합 단백질
서열 번호 23의 단백질은 526개의 아미노산의 길이 및 57.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL119-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 변형된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 342-아미노산 단편 (서열 번호 83)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR) 및 입체 링커 서열 (ASGG)이 순차적으로 혼입되어 있다.
추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL119-281)-LINKER4-PEG-FURIN-LINKER3-(서열 번호 83)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 23 및 서열 번호 107이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 23을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 107을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 24. 서열 번호 24의 융합 단백질
서열 번호 24의 단백질은 526개의 아미노산의 길이 및 57.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 변형된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 342-아미노산 단편 (서열 번호 83)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR) 및 입체 링커 서열 (ASGG)이 순차적으로 혼입되어 있다.
추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL119-281)-LINKER4-PEG-FURIN-LINKER3-(서열 번호 83)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 24 및 서열 번호 108이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 24를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 108을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 25. 서열 번호 25의 융합 단백질
서열 번호 25의 단백질은 423개의 아미노산의 길이 및 47.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL114-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 시가 독소 stx의 239-아미노산 변이체 (서열 번호 70)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (SHHAS), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 70)-LINKER5-FURIN-LINKER1-(TRAIL114-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 25 및 서열 번호 109이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 25를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 109를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 26. 서열 번호 26의 융합 단백질
서열 번호 26의 단백질은 432개의 아미노산의 길이 및 47.9 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL120-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 시가 독소 stx의 239-아미노산 변이체 (서열 번호 70)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGS), 페길화 서열 (ASGCGPE), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR) 및 입체 링커 서열 (GGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL120-281)-LINKER4-PEG-FURIN-LINKER4-(서열 번호 70)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 26 및 서열 번호 110이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 26을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 110을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 26a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 26b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 27. 서열 번호 27의 융합 단백질
서열 번호 27의 단백질은 526개의 아미노산의 길이 및 38 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL114-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 149-아미노산 레스트릭토신 펩타이드 (서열 번호 71)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR) 및 페길화 링커 서열 (ASGCGPE)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 71)-LINKER1-LINKER1-FURIN-PEG-(TRAIL114-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 27 및 서열 번호 111이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 27을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 111을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 27a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 27b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 28. 서열 번호 28의 융합 단백질
서열 번호 28의 단백질은 335개의 아미노산의 길이 및 37.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 149-아미노산 레스트릭토신 펩타이드 (서열 번호 71)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-FURIN-LINKER1-(서열 번호 71)-TR2
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 28 및 서열 번호 112이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 28을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 112를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 28a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 28b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 29. 서열 번호 29의 융합 단백질
서열 번호 29의 단백질은 319개의 아미노산의 길이 및 35.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL114-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 130-아미노산 히르수텔린 펩타이드 (서열 번호 72)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR) 및 페길화 링커 서열 (ASGCGPE)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 72)-LINKER1-LINKER1-FURIN-PEG-(TRAIL114-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 29 및 서열 번호 113이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 29를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 113을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 29a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 29b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 30. 서열 번호 30의 융합 단백질
서열 번호 30의 단백질은 290개의 아미노산의 길이 및 32.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 109-아미노산 Kid 단백질 (서열 번호 73)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR)이 순차적으로 혼입되어 있다.
추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-FURIN-(서열 번호 73)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 30 및 서열 번호 114이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 30을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 114를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 31. 서열 번호 31의 융합 단백질
서열 번호 31의 단백질은 277개의 아미노산의 길이 및 31.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 100-아미노산 CcdB 단백질 (서열 번호 74)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-FURIN-(서열 번호74)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 31 및 서열 번호 115이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 31을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 115를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 32. 서열 번호 32의 융합 단백질
서열 번호 32의 단백질은 228개의 아미노산의 길이 및 25.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 CcdB 단백질의 47-아미노산 변이체 (서열 번호 75)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR)이 순차적으로 혼입되어 있다.
추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-FURIN-(서열 번호 75)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 32 및 서열 번호 116이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 32를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 116을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 32a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 32b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 33. 서열 번호 33의 융합 단백질
서열 번호 33의 단백질은 275개의 아미노산의 길이 및 31.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 94-아미노산 RelE 단백질 (서열 번호 76)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR)이 순차적으로 혼입되어 있다.
추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-FURIN-(서열 번호 76)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 33 및 서열 번호 117이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 33을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 117을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 34. 서열 번호 34의 융합 단백질
서열 번호 34의 단백질은 271개의 아미노산의 길이 및 30.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 90-아미노산 StaB 단백질 (서열 번호 77)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR)이 순차적으로 혼입되어 있다.
추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-FURIN-(서열 번호 77)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 34 및 서열 번호 118이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 34를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 118을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 35. 서열 번호 35의 융합 단백질
서열 번호 35의 단백질은 429개의 아미노산의 길이 및 48.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL114-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 251-아미노산 겔로닌 펩타이드 (서열 번호 78)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 78)-LINKER1-LINKER1-(TRAIL114-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 35 및 서열 번호 119이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 35를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 119를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 36. 서열 번호 36의 융합 단백질
서열 번호 36의 단백질은 434개의 아미노산의 길이 및 48.6 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL120-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 251-아미노산 겔로닌 펩타이드 (서열 번호 78)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 78)-LINKER1-FURIN-PEG-LINKER1-(TRAIL120-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 36 및 서열 번호 120이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 36을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 120을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 37. 서열 번호 37의 융합 단백질
서열 번호 37의 단백질은 427개의 아미노산의 길이 및 48 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 251-아미노산 겔로닌 펩타이드 (서열 번호 78)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-PEG-LINKER1-(서열 번호 78)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 37 및 서열 번호 121이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 37을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 121을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 38. 서열 번호 38의 융합 단백질
서열 번호 38의 단백질은 433개의 아미노산의 길이 및 48.5 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 251-아미노산 겔로닌 펩타이드 (서열 번호 78)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 78)-LINKER1-FURIN-PEG-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 38 및 서열 번호 122이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 38을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 122를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 39. 서열 번호 39의 융합 단백질
서열 번호 39의 단백질은 558개의 아미노산의 길이 및 61.4 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 디프테리아 독소의 387-아미노산 서브유닛 A (서열 번호 79)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 79)-LINKER1-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 39 및 서열 번호 123이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 39를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 123을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 40. 서열 번호 40의 융합 단백질
서열 번호 40의 단백질은 481개의 아미노산의 길이 및 53.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 디프테리아 독소의 193-아미노산 촉매 도메인 (서열 번호 80)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR), 슈도모나스 독소로부터 유래된 운반 도메인 서열 (서열 번호 139) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-FURIN-(서열 번호 139)-LINKER1-(서열 번호 80)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 40 및 서열 번호 124이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 40을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 124를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 40a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 40b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 41. 서열 번호 41의 융합 단백질
서열 번호 41의 단백질은 481개의 아미노산의 길이 및 53.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 디프테리아 독소의 189-아미노산 촉매 도메인 (서열 번호 81)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR), 입체 링커 서열 (GGGGS), 슈도모나스 독소로부터 유래된 운반 도메인 서열 (서열 번호 139), 푸린에 의해 절단된 서열 (RKKR) 및 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 81)-FURIN-LINKER1-(서열 번호 139)-FURIN-LINKER1-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 41 및 서열 번호 125이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 41을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 125를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 42. 서열 번호 42의 융합 단백질
서열 번호 42의 단백질은 432개의 아미노산의 길이 및 48.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL114-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 아브린의 251-아미노산 도메인 A (서열 번호 82)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 82)-LINKER1-LINKER1-(TRAIL114-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 42 및 서열 번호 126이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 42를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 126을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 42a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 42b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 43. 서열 번호 43의 융합 단백질
서열 번호 43의 단백질은 443개의 아미노산의 길이 및 49.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL114-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 아브린의 251-아미노산 도메인 A (서열 번호 82)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 인테그린 리간드 서열 (서열 번호 140), 유로키나제에 의해 절단된 서열 (RVVR) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 82)-LINKER1-(서열 번호 140)-UROKIN-LINKER1-(TRAIL114-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 43 및 서열 번호 127이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 43을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 127을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 43a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 43b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 44. 서열 번호 44의 융합 단백질
서열 번호 44의 단백질은 433개의 아미노산의 길이 및 48.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL114-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 아브린의 251-아미노산 도메인 A (서열 번호 82)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS) 및 유로키나제에 의해 절단된 서열 (RVVR)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 82)-LINKER1-LINKER1-UROKIN-(TRAIL114-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 44 및 서열 번호 128이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 44를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 128을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 44a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 44b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 45. 서열 번호 45의 융합 단백질
서열 번호 45의 단백질은 441개의 아미노산의 길이 및 50 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL114-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 아브린의 251-아미노산 도메인 A (서열 번호 82)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 8개의 아르기닌 잔기로 이루어진 운반 서열 (RRRRRRRR), 유로키나제에 의해 절단된 서열 (RVVR) 및 순차적으로 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 82)-TRANS2-UROKIN-LINKER1-LINKER1-(TRAIL114-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 45 및 서열 번호 129이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 45를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 129를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 46. 서열 번호 46의 융합 단백질
서열 번호 46의 단백질은 550개의 아미노산의 길이 및 61.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL114-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 아브린의 251-아미노산 도메인 A (서열 번호 82)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 유로키나제에 의해 절단된 서열 (RVVR), 슈도모나스로부터 유래된 운반 도메인 서열 (서열 번호 139), 입체 링커 서열 (GGGGS) 및 유로키나제에 의해 절단된 서열 (RVVR)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL114-281)-LINKER1-UROKIN-(서열 번호 139)-LINKER1-UROKIN-(서열 번호 82)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 46 및 서열 번호 130이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 46을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 130을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 46a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 46b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 47. 서열 번호 47의 융합 단백질
서열 번호 47의 단백질은 459개의 아미노산의 길이 및 51.5 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL95-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 아브린의 251-아미노산 도메인 A (서열 번호 82)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS), 유로키나제에 의해 절단된 서열 (RVVR) 및 페길화 링커 서열 (ASGCGPE)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 82)-LINKER1-LINKER1-UROKIN-PEG-(TRAIL95-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 47 및 서열 번호 131이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 47을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 131을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 47a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 47b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 48. 서열 번호 48의 융합 단백질
서열 번호 48의 단백질은 443개의 아미노산의 길이 및 49.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281 서열이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 아브린의 251-아미노산 도메인 A (서열 번호 82)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE), 유로키나제에 의해 절단된 서열 (RVVR) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-UROKIN-LINKER1-(서열 번호 82)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 48 및 서열 번호 132이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 48을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 132를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 49. 서열 번호 49의 융합 단백질
서열 번호 49의 단백질은 447개의 아미노산의 길이 및 50.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 아브린의 251-아미노산 도메인 A (서열 번호 82)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE), 유로키나제에 의해 절단된 서열 (RVVR) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단 상에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-UROKIN-LINKER1-(서열 번호 82)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 49 및 서열 번호 133이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 49를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 133을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 49a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 49b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 50. 서열 번호 50의 융합 단백질
서열 번호 50의 단백질은 441개의 아미노산의 길이 및 49.4 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL114-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 아브린의 251-아미노산 도메인 A (서열 번호 82)이고 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS), 유로키나제에 의해 절단된 서열 (RVVR) 및 페길화 링커 서열 (ASGCGPE)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 82)-LINKER1- LINKER1-UROKIN-PEG-(TRAIL114-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 50 및 서열 번호 134이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 50을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 134를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 50a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 50b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 51. 서열 번호 51의 융합 단백질
서열 번호 51의 단백질은 515개의 아미노산의 길이 및 55.9 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 D218H 돌연변이 (서열 번호 142)를 함유하는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 변형된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 단편의 342-아미노산 동족체 (서열 번호 68)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGS) 및 (ASGG)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 142)-LINKER4-LINKER3-(서열 번호 68)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 51 및 서열 번호 135이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 51을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 135를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 51a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 51b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 52. 서열 번호 52의 융합 단백질
서열 번호 52의 단백질은 515개의 아미노산의 길이 및 55.9 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 돌연변이 Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266R/D269H를 함유하는 TRAIL121-281 (서열 번호 143)이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 변형된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 단편의 342-아미노산 동족체 (서열 번호 68)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGS) 및 (ASGG)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 143)-LINKER4-LINKER3-(서열 번호 68)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 52 및 서열 번호 136이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 52를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 136을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 53. 서열 번호 53의 융합 단백질
서열 번호 53의 단백질은 515개의 아미노산의 길이 및 55.9 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 돌연변이 D218H를 함유하는 TRAIL121-281 (서열 번호 142)이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 변형된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 단편의 342-아미노산 동족체 (서열 번호 83)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGS) 및 페길화 링커 서열 (ASGCGPE)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 142)-LINKER4-PEG-(서열 번호 83)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 53 및 서열 번호 137이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 53을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 137을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 A에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질이 발현되었다.
실시예 54. 서열 번호 54의 융합 단백질
서열 번호 54의 단백질은 515개의 아미노산의 길이 및 55.9 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 돌연변이 Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266R/D269H를 함유하는 TRAIL121-281 (서열 번호 143)이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 변형된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 단편의 342-아미노산 동족체 (서열 번호 83)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGS) 및 (ASGG)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 143)-LINKER4-LINKER3-(서열 번호 83)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 54 및 서열 번호 138이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 54를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 138을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 54a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 54b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 55. 서열 번호 144의 융합 단백질
서열 번호 144의 단백질은 433개의 아미노산의 길이 및 48.8 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL114-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있고 아브린 A 도메인의 251-아미노산 변이체 (서열 번호 194)이다. 추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS) 및 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 (RKKR)이 순차적으로 혼입되어 있다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 194)-LINKER1-LINKER1-FURIN-(TRAIL114-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 144 및 서열 번호 169이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 144를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 169를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 56. 서열 번호 145의 융합 단백질
서열 번호 145의 단백질은 450개의 아미노산의 길이 및 50.5 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있고 리신 A 도메인의 264-아미노산 결손 변이체 (서열 번호 195)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 페길화 링커 서열 (ASGCGPE), 푸린에 의해 인식되는 서열 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-FURIN-LINKER1-(서열 번호 195)-TRANS3
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 145 및 서열 번호 170이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 145를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 170을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 57. 서열 번호 146의 융합 단백질
서열 번호 146의 단백질은 481개의 아미노산의 길이 및 53 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있고 디프테리아 독소의 189-아미노산 돌연변이형 활성 도메인 (서열 번호 196)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 서열 (RKKR), 입체 링커 서열 (GGGGS), 슈도모나스 독소로부터 유래된 운반 도메인 서열 (서열 번호 139), 또 다른 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 서열 (RKKR), 이어서 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 196)-FURIN-LINKER1-서열 번호 139-FURIN-LINKER1-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 146 및 서열 번호 171이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 146을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 171을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 58. 서열 번호 147의 융합 단백질
서열 번호 147의 단백질은 478개의 아미노산의 길이 및 52.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있고 디프테리아 독소의 186-아미노산 돌연변이형 활성 도메인 (서열 번호 197)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 서열 (RKKR), 입체 링커 서열 (GGGGS), 슈도모나스 독소로부터 유래된 운반 도메인 서열 (서열 번호 139), 또 다른 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 서열 (RKKR), 이어서 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 197)-FURIN-LINKER1-서열 번호 139-FURIN-LINKER1-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 147 및 서열 번호 172이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 147을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 172를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 59. 서열 번호 148의 융합 단백질
서열 번호 148의 단백질은 433개의 아미노산의 길이 및 48.5 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있고 겔로닌의 251-아미노산 돌연변이형 변이체 (서열 번호 198)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 서열 (RKKR), 페길화 링커 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 198)-LINKER1-FURIN-PEG-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 148 및 서열 번호 173이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 148을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 173을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 59a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 59b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 60. 서열 번호 149의 융합 단백질
서열 번호 149의 단백질은 258개의 아미노산의 길이 및 29.5 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL95-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있고 47-아미노산 P1 루핀 펩타이드 (서열 번호 65)이다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), (GGG) 및 (CAAACAAC), 이어서 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 서열 (RKKR)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL95-281)-LINKER1-LINKER7-LINKER6-FURIN-(서열 번호 65)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 149 및 서열 번호 174이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 149를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 174를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 61. 서열 번호 150의 융합 단백질
서열 번호 150의 단백질은 253개의 아미노산의 길이 및 29.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL95-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있고 47-아미노산 P1 루핀 펩타이드 (서열 번호 65)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 서열 (RKKR) 및 입체 링커 서열 (GGG) 및 (CAAACAAC)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 65)-TRANS1-FURIN-LINKER7-LINKER6-(TRAIL95-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 150 및 서열 번호 175이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 150을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 175를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 62. 서열 번호 151의 융합 단백질
서열 번호 151의 단백질은 539개의 아미노산의 길이 및 59.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있고 트리코산틴의 247-아미노산 돌연변이형 변이체 (서열 번호 199)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 서열 (RKKR) 및 입체 링커 서열 (GGGGS), 이어서 슈도모나스 독소로부터 유래된 운반 도메인 서열 (서열 번호 139), 또 다른 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 (RKKR) 및 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 199)-FURIN-LINKER1-서열 번호 139-FURIN-LINKER1-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 151 및 서열 번호 176이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 151을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 176을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 63. 서열 번호 152의 융합 단백질
서열 번호 152의 단백질은 429개의 아미노산의 길이 및 47.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 도메인 (a)의 N-말단에서 부착되어 있고 트리코산틴의 247-아미노산 돌연변이형 변이체 (서열 번호 200)이다.
추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS) 및 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 서열 (RKKR), 이어서 페길화 서열 (ASGCGPE) 및 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 200)-LINKER1-FURIN-PEG-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 152 및 서열 번호 177이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 152를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 177을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 64. 서열 번호 153의 융합 단백질
서열 번호 153의 단백질은 515개의 아미노산의 길이 및 55.9 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 점 돌연변이 R318K, N441Q 및 R601K를 갖는 342-아미노산 변형된 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열 (서열 번호 201)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGS) 및 (ASGG)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER4-LINKER3-서열 번호 201-(TRANS1)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 153 및 서열 번호 178이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 153을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 178을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 65. 서열 번호 154의 융합 단백질
서열 번호 154의 단백질은 402개의 아미노산의 길이 및 43.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 225-아미노산 결손 변이체 (서열 번호 202)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGS) 및 (GGGG) 및 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 서열 (RKKR)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER4-LINKER2-FURIN-(서열 번호 202)-TRANS3
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 154 및 서열 번호 179이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 154를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 179를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 65a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 65b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 66. 서열 번호 155의 융합 단백질
서열 번호 155의 단백질은 403개의 아미노산의 길이 및 44.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 몇 개의 점 돌연변이를 갖는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 226-아미노산 결손 변이체 (서열 번호 203)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS) 및 (GGGG) 및 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 서열 (RKKR)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
TRAIL121-281-LINKER1-LINKER2-FURIN-서열 번호 203-TRANS3
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 155 및 서열 번호 180이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 155를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 180을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 66a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 66b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 67. 서열 번호 156의 융합 단백질
서열 번호 156의 단백질은 470개의 아미노산의 길이 및 51.5 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 몇 개의 점 돌연변이를 갖는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 279-아미노산 결손 변이체 (서열 번호 204)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS) 및 페길화 링커 (ASGCGPE), 이어서 푸린에 의해 인식되는 서열 (RKKR) 및 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 천연 서열 (RHRQPRGWEQL)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-PEG-FURIN-푸린.NAT-(서열 번호 204)-TRANS3
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 156 및 서열 번호 181이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 156을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 181을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 67a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 67b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 68. 서열 번호 157의 융합 단백질
서열 번호 157의 단백질은 478개의 아미노산의 길이 및 51.8 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 몇 개의 점 돌연변이를 갖는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 279-아미노산 결손 변이체 (서열 번호 205)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 반복되는 입체 링커 서열 (GGGGS), 이어서 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 (RKKR), 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 천연 서열 (RHRQPRGWEQL) 및 반복되는 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-LINKER1-FURIN-푸린.NAT-LINKER1-LINKER1-(서열 번호 205)-TRANS3
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 157 및 서열 번호 182이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 157을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 182를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 68a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 68b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 69. 서열 번호 158의 융합 단백질
서열 번호 158의 단백질은 402개의 아미노산의 길이 및 44.7 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 214-아미노산 돌연변이형 결손 변이체 (서열 번호 206)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 이어서 입체 링커 서열 (GGGG), 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 (RKKR) 및 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 천연 서열 (RHRQPRGWEQL)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-LINKER2-FURIN-푸린.NAT-(서열 번호 206)-TRANS3
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 158 및 서열 번호 183이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 158을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 183을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 70. 서열 번호 159의 융합 단백질
서열 번호 159의 단백질은 467개의 아미노산의 길이 및 50.4 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 몇 개의 점 돌연변이를 갖는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 279-아미노산 돌연변이형 결손 변이체 (서열 번호 205)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 반복되는 입체 링커 서열 (GGGGS), 이어서 푸린에 의해 인식되는 절단 부위 (RKKR) 및 또 다른 반복되는 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-LINKER1-FURIN-LINKER1-LINKER1-(서열 번호 205)-TRANS3
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 159 및 서열 번호 184이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 159를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 184를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 71. 서열 번호 160의 융합 단백질
서열 번호 160의 단백질은 474개의 아미노산의 길이 및 51.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 몇 개의 점 돌연변이를 갖는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 279-아미노산 돌연변이형 결손 변이체 (서열 번호 205)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 반복되는 입체 링커 서열 (GGGGS), 이어서 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 천연 서열 (RHRQPRGWEQL) 및 또 다른 반복되는 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
TRAIL121-281-LINKER1-LINKER1-푸린.NAT-LINKER1-LINKER1-서열 번호 205-TRANS3
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 160 및 서열 번호 185이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 160을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 185를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 71a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 71b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 72. 서열 번호 161의 융합 단백질
서열 번호 161의 단백질은 474개의 아미노산의 길이 및 51.3 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 몇 개의 점 돌연변이를 갖는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 279-아미노산 돌연변이형 결손 변이체 (서열 번호 205)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 반복되는 입체 링커 서열 (GGGGS), 이어서 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 천연 서열 (RHRQPRGWEQL) 및 또 다른 반복되는 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-LINKER1-푸린.NAT-LINKER1-LINKER1-(서열 번호 205)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 161 및 서열 번호 186이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 161을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 186을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 73. 서열 번호 162의 융합 단백질
서열 번호 162의 단백질은 474개의 아미노산의 길이 및 51.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 돌연변이를 갖는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 279-아미노산 결손 변이체 (서열 번호 207)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다.
추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 반복되는 입체 링커 서열 (GGGGS), 이어서 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 천연 서열 (RHRQPRGWEQL) 및 또 다른 반복되는 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-LINKER1-푸린.NAT-LINKER1-LINKER1-(서열 번호 207)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 162 및 서열 번호 187이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 162를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 187을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 74. 서열 번호 163의 융합 단백질
서열 번호 163의 단백질은 515개의 아미노산의 길이 및 55.9 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 돌연변이 D218H를 함유하는 TRAIL121-281 (서열 번호 142)이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 3개의 점 돌연변이 R318K, N441Q 및 R601K를 갖는 342-아미노산 변형된 슈도모나스 아에 루기노사 외독소 서열 (서열 번호 201)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 입체 링커 서열 (GGGS) 및 (ASGG)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 142)-LINKER4-LINKER3-(서열 번호 201)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 163 및 서열 번호 188이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 163을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 188을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 75. 서열 번호 164의 융합 단백질
서열 번호 164의 단백질은 475개의 아미노산의 길이 및 51.4 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 돌연변이 D218H를 함유하는 TRAIL121-281 (서열 번호 142)이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 몇 개의 점 돌연변이를 갖는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 279-아미노산 돌연변이형 결손 변이체 (서열 번호 205)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 반복되는 입체 링커 서열 (GGGGS), 이어서 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 천연 서열 (RHRQPRGWEQL) 및 또 다른 반복되는 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 142)-LINKER1-LINKER1-푸린.NAT-LINKER1-LINKER1-(서열 번호 205)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 164 및 서열 번호 189이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 164를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 189를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 76. 서열 번호 165의 융합 단백질
서열 번호 165의 단백질은 463개의 아미노산의 길이 및 50.6 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 돌연변이 D218H를 함유하는 TRAIL121-281 (서열 번호 142)이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 몇 개의 점 돌연변이를 갖는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 279-아미노산 결손 변이체 (서열 번호 204)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGS), 이어서 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 천연 서열 (RHRQPRGWEQL)이 순차적으로 혼입되어 있다. 추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 142)-LINKER4-LINKER4-푸린.NAT-(서열 번호 204)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 165 및 서열 번호 190이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 165를 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 190을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 77. 서열 번호 166의 융합 단백질
서열 번호 166의 단백질은 475개의 아미노산의 길이 및 51.4 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 돌연변이 Y189N/R191K/Q193R/H264R/I266R/D269H를 함유하는 TRAIL121-281 (서열 번호 143)이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 몇 개의 점 돌연변이를 갖는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 서열의 279-아미노산 돌연변이형 결손 변이체 (서열 번호 205)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS), 이어서 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 천연 서열 (RHRQPRGWEQL) 및 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 143)-LINKER1-LINKER1-푸린.NAT-LINKER1-LINKER1-(서열 번호 205)-TRANS1
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 166 및 서열 번호 191이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 166을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 191을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질이 발현되었다.
실시예 78. 서열 번호 167의 융합 단백질
서열 번호 167의 단백질은 474개의 아미노산의 길이 및 51.24 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 점 돌연변이를 갖는 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A 서열의 279-아미노산 결손 변이체 (서열 번호 207)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (a)와 도메인 (b) 사이에 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS), 이어서 푸린에 의해 인식되는 절단 부위의 천연 서열 (RHRQPRGWEQL) 및 2개의 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
추가로, 도메인 (b)의 C-말단에, 전체 융합 단백질의 C-말단 단편을 형성하는, 효과기 펩타이드를 소포체로 유도하는 운반 서열 KDEL이 부착되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(TRAIL121-281)-LINKER1-LINKER1-푸린.NAT-LINKER1-LINKER1-(서열 번호 207)-TRANS3
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 167 및 서열 번호 192이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 167을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 192를 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
히스티딘 태그를 갖는 단백질(실시예 78a)과 히스티딘 태그를 갖지 않는 단백질(실시예 78b) 둘 다가 발현되었다.
실시예 79. 서열 번호 168의 융합 단백질
서열 번호 168의 단백질은 232개의 아미노산의 길이 및 26.2 kDa의 질량을 갖는 융합 단백질로서, 여기서 도메인 (a)는 TRAIL121-281이고, 효과기 펩타이드의 도메인 (b)는 51 아미노산 Hok 단백질 서열 (서열 번호 208)이고 도메인 (a)의 C-말단에서 부착되어 있다. 추가로, 도메인 (b)와 도메인 (a) 사이에 입체 링커 서열 (GGGGS), 이어서 유로키나제에 의해 인식되는 절단 부위의 서열 (RVVR) 및 메탈로프로테아제 MMP (PLGLAG) 및 a 입체 링커 서열 (GGGGS)이 순차적으로 혼입되어 있다.
따라서, 본 발명의 융합 단백질의 구조는 하기와 같다:
(서열 번호 208)-LINKER1-UROKIN-MMP-LINKER1-(TRAIL121-281)
아미노산 서열 및 대장균에서 발현을 위해 최적화된 코돈을 포함하는 DNA 암호화 서열은 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같이 각각 서열 번호 168 및 서열 번호 193이다.
아미노산 서열인 상기에서 개시된 구조의 서열 번호 168을 이의 암호화 DNA 서열인 서열 번호 193을 생성하기 위한 주형으로서 사용하였다. DNA의 암호화 서열을 함유하는 플라스미드를 생성하고, 융합 단백질의 과발현을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 수행하였다. Novagen으로부터 입수한 대장균 BL21 (DE3) 또는 Tuner (DE3) 균주를 사용하여 과발현을 일반 절차 B에 따라 수행하였다. 단백질을 상기에서 개시된 일반 절차에 따라 전기영동으로 분리하였다.
실시예 80. 융합 단백질의 항종양 활성의 검사
종양 세포주에 대한 세포독성 분석법으로 시험관내 및 마우스 생체 내에서 융합 단백질의 항종양 활성의 검사를 수행하였다. 비교를 위해서, rhTRAIL114-281 단백질 및 위약(placebo)을 사용하였다.
1. 원편광 이색성(Circular Dichroism: CD)의 측정
실시예 2a, 실시예 11a, 실시예 12a, 실시예 13a, 실시예 14a, 실시예 15a, 실시예 18a, 실시예 20a, 실시예 26a, 실시예 29a, 실시예 42a, 실시예 43a, 실시예 44a, 실시예 50a, 실시예 51a 및 실시예 52a의 융합 단백질에 대하여 원편광 이색성(CD)에 의해 이들의 구조의 관점에서 융합 단백질 제제의 품질을 측정하였다. 단백질의 2차 구조 및 입체형태의 측정을 위해 원편광 이색성을 이용하였다. CD 방법은 타원 편광의 외관 및 빛의 편광면 회전으로 명백해지는 단백질 구조의 광학 활성을 이용한다. 원자외선(far UV)에서 단백질의 CD 스펙트럼은 주요 폴리펩타이드 쇄의 입체형태에 대한 정확한 데이터를 제공한다.
분석될 단백질의 샘플을 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0,1 mM ZnCl2, 80 mM 사카로스, 5mM DTT로 이루어진 완충액으로 제형화한 후 컷 오프 12 kDa의 투석 백(Sigma-Aldrich)에서 투석하였다. 4℃에서 몇 시간 동안 교반하면서, 단백질 제제를 100배 과량 (v/v)의 완충액에 대하여 투석을 수행하였다. 투석을 완료한 후, 각각의 제제를 원심분리하고(25,000 rpm, 10분, 4℃), 상청액을 수집하였다.
상기와 같이 수득된 샘플 중 단백질 농도를 브래드포드(Bradford) 법에 의해 측정하였다.
0.1 mg/ml 내지 2.7 mg/ml의 농도 범위의 단백질에 대한 원편광 이색성의 측정을, 0.2mm 또는 1mm의 광로를 갖는 석영 큐벳트에서 Jasco J-710 분광편광계로 수행하였다. 7 L/분의 질소의 흐름 하에서 측정을 수행하였으며, 이는 195nm 내지 250nm의 파장 범위에서 측정을 수행할 수 있게 한다. 측정 파라미터: 스펙트럼 해상도 - 1nm; 광선의 반치폭 1nm; 감도 20mdeg, 1파장에 대한 평균 시간 - 8초, 스캔 속도 10 nm/분. CDPro 소프트웨어를 사용하여, 수득된 스펙트럼을 193nm 내지 250nm의 범위에서 수치로 분석하였다. 이러한 파장 범위에서 너무 낮은 신호 대 노이즈 비율 때문에, 광전자증배관에서의 전압이 700 V를 초과하는 포인트는 생략하였다.
CDPro 소프트웨어를 사용하여 수득된 데이터는 분석된 단백질에서의 특정한 2차 구조 함량의 산출을 제공한다(표 1 참조).
[표 1] 분석된 단백질에서의 2차 구조 함량
Figure pct00002

대조군 분자 (rhTRAIL114-281)은 주로 β-시트형 구조를 갖는 단백질에 대해 특징적인 CD 스펙트럼을 나타낸다(220nm 파장에서 급격한 윤곽의 타원률 최소치). 이는 2차 구조 성분의 산출을 확인해 주며, 미미한 수치의 α-헬릭스 요소를 제시한다. 수득된 결과는 또한 hTRAIL 단백질의 결정 구조로부터의 데이터와 일치하고, 본 발명의 융합 단백질(실시예 12a, 실시예 13a, 실시예 14a 및 실시예 29a)에 대해 특징적이며, 여기서 베타 성분은 그 구조의 32% 내지 44%를 구성한다. 모든 실시예의 경우, 이색성 스펙트럼은 파장 220nm에서 1개의 최소값을 특징으로 한다. TRAIL에 부착된 소형 펩타이드는 단백질의 작은 부분을 구성하고 정의된 2차 구조를 생성할 필요성이 없기 때문에, 분석된 단백질은 출발 단백질과 유의하게 상이해서는 안된다.
실시예 2a, 실시예 11a, 실시예 15a, 실시예 20a, 실시예 26a, 실시예 42a, 실시예 43a, 실시예 44a, 실시예 50a, 실시예 51a 및 실시예 52a의 작제물의 경우, 알파/베타 2차 구조의 혼합 함량을 관찰하였으며, 이는 공지된 효과기 펩타이드 도메인의 결정 구조에 근거한 예상치와 일치한다. 이들 벌키한(bulky) 도메인의 경우에서의 50% 수준의 알파 구조의 함량은 융합 단백질의 구조에 대하여 유의한 영향을 미친다.
실시예 18a의 단백질만은 알파-헬릭스 함량이 70%를 초과하고 베타 구조의 함량은 낮았다.
2. 시험관내에서의 세포주에 대한 시험
세포주
세포주를 ATCC 및 CLS로부터 입수하고, 이어서 Laboratory of Biology Adamed's Cell Line Bank에서 번식시키고 보관하였다. 실험 동안, Venor®GeM Mycoplasma PCR Detection Kit (Minerva Biolabs, Berlin, Germany) 키트를 사용하여, 마이코플라스마의 존재에 대하여 PCR 기술에 의해 관례대로 세포를 확인하였다. 배양물을 다음의 표준 조건으로 유지하였다: 37℃, 5% CO2 (DMEM의 경우 - 10% CO2) 및 85% 상대 습도. 특정 세포주를 ATTC에 의해 추천된 적절한 배지에서 배양하였다.
[표 2] 부착 세포주
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005

[표 3] 비부착 세포주
Figure pct00006

MTT 세포독성 시험
MTT 분석법은 세포의 증식, 생존성 및 세포독성을 측정하기 위해 사용되는 비색분석법이다. 이는 미토콘드리아 효소 석시네이트-테트라졸륨 리덕타제 1에 의해 황색 테트라졸륨 염 MTT (4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)를 수불용성 자색 염료인 포르마잔으로 분해하는 데에 있다. MTT 환원은 살아있는 세포에서만 일어난다. 데이터 분석은 단백질의 IC50 농도(ng/ml)의 측정에 있으며, 여기에서 세포수의 50% 환원은 대조군과 비교하여 처리된 집단에서 발생한다. 결과는 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 시험은 문헌[Celis, JE, (1998). Cell Biology, a Laboratory Handbook, second edition, Academic Press, San Diego; Yang, Y., Koh, LW, Tsai, JH., (2004); Involvement of viral and chemical factors with oral cancer in Taiwan, Jpn J Clin Oncol, 34 (4), 176-183]의 상세한 설명에 따라 수행하였다.
세포 배양 배지를 소정의 밀도(100μl 당 104 내지 105 세포)로 희석하였다. 이어서, 적절하게 희석된 세포 현탁액 100μl를 96웰 플레이트에 3번씩 적용하였다. 이와 같이 제조된 세포를 사용된 배지에 따라 5% CO2 또는 10% CO2에서 24시간 동안 37에서 배양하고, 이어서 상기 세포(100μl의 배지 중)에 다양한 농도의 시험된 단백질을 함유하는 배지 100μl를 추가로 첨가하였다. 3회 내지 4회의 세포 분열에 상당하는 다음 72시간에 걸쳐 시험된 단백질과 함께 세포를 배양한 후, 시험 단백질을 포함하는 배지에 MTT의 작업 용액[5 mg/ml] 20 ml를 가하고, 5% CO2에서 3시간 동안 37에서 계속 배양하였다. 이어서, MTT 용액을 포함하는 배지를 제거하고, DMSO 100μl를 가하여 포르마잔 결정을 용해하였다. 교반한 후, 570nm에서 흡광도를 측정하였다(기준 필터 690nm).
EZ4U 세포독성 시험
비부착 세포주에서 단백질의 세포독성 활성을 시험하기 위하여 EZ4U (Biomedica) 시험을 이용하였다. 본 시험은 MTT 방법의 변형이며, 여기서 테트라졸륨 염의 환원시에 형성된 포르마잔은 수용성이다. 단백질(7개 농도의 단백질, 각각 3번씩)과 함께 세포를 72 시간 연속 배양한 후 세포 생존성 연구를 수행하였다. 이에 기초하여, GraphPad Prism 5 소프트웨어를 사용하여 IC50 값을 (2개의 독립적인 실험의 평균으로서) 측정하였다. 대조군 세포는 용매만으로 배양하였다.
시험관내 세포독성 시험의 결과를 IC50 값 (ng/ml)으로서 요약하였으며, 이는 용매만으로 처리된 대조군 세포에 대하여 융합 단백질의 세포독성 효과가 50% 수준으로 관찰되는 단백질 농도에 상응한다. 각각의 실험은 3번씩 수행된 2개 이상의 독립적인 실험의 평균값을 나타낸다. 단백질 제제의 활성 결여의 기준으로는 2000 ng/ml의 IC50 한도를 채택하였다. 2000을 초과하는 IC50 값을 갖는 융합 단백질은 비활성인 것으로 간주하였다.
본 시험을 위한 세포는 종래의 항암제에 대해 내성인 암 세포주로서 독소루비신 라인 MES-SA/DX5에 대해 내성이고 TRAIL 단백질에 대해 민감한 종양 세포주 뿐만 아니라, TRAIL 단백질에 대해 자연 내성(TRAIL에 대한 자연 내성의 기준: TRAIL 단백질에 대한 IC50 > 2000)인 종양 세포주를 포함한다.
비-암세포에서 융합 단백질의 효능/독성의 평가를 위해 분화되지 않은 HUVEC 세포주를 건강한 대조군 세포주로서 사용하였다.
TRAIL에 대해 자연 내성인 세포에 본 발명의 특정 융합 단백질을 투여함으로써 TRAIL에 대한 세포주의 내성을 극복할 가능성을 수득된 결과로 확인하였다. TRAIL에 대해 민감한 세포에 본 발명의 융합 단백질을 투여할 때, 일부의 경우 효능의 분명하고 강력한 강화 작용이 관찰되었으며, TRAIL 단독에 대한 IC50과의 비교하여 융합 단백질의 IC50 값의 감소가 명백하였다. 더욱이, 고전적인 항암제 독소루비신에 대해 내성인 세포에서 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성이 수득되었고, 일부의 경우 TRAIL 단독의 활성보다 더 강력했다.
비-암세포주에 대해 수득된 2000 초과의 IC50 값은 건강한 세포에 대한 본 발명의 단백질의 사용과 관련된 독성 작용이 없음을 나타내며, 이는 단백질의 전신 독성 가능성이 낮음을 나타낸다.
확장된 패널의 종양 세포주에 대해 선택된 단백질 제제의 세포독성 활성의 측정
표 4는 광범위하고 가장 흔한 암에 상응하는, 상이한 장기로부터의 광범위한 패널의 종양 세포에 대해 선택된 본 발명의 융합 단백질의 시험관내 세포독성 활성에 대한 시험 결과를 나타낸다.
실험 결과는 평균값 ± 표준 편차(SD)로 제시된다. 모든 계산 및 그래프는 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 작성하였다.
수득된 IC50 값에 의해, 융합 단백질의 높은 세포독성 활성과 이에 따른 암 치료에서의 잠재적 유용성을 확인하였다.
[표 4] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00007

[표 4a] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00008

[표 4b] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00009

[표 4c] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00010

[표 4d] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00011

[표 4e] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00012

[표 4f] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00013

[표 4g] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00014

[표 4h] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00015

[표 4i] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00016

[표 4j] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00017

[표 4k] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00018

[표 4l] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00019

[표 4m] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00020

[표 4n] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00021

[표 4o] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00022

[표 4p] 본 발명의 융합 단백질의 세포독성 활성
Figure pct00023

3. 이종이식에서 생체 내 융합 단백질의 항암 효능
인간 대장암 Colo 205 및 HCT-116, SW620, 인간 폐암 A549, 인간 전립선암 PC-3, 인간 췌장암 Panc-1, 인간 간암 PCL/PRF/5, HT-29, HepG2 및 인간 자궁 육종 MES-SA.Dx5의 마우스 모델에서 단백질 제제의 항종양 활성을 시험하였다.
세포
인간 대장암 Colo 205 세포를 10% 우태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충된 RPMI1640 배지 (HyClone, Logan, UT, USA) (임의로 Opto-MEM (Invitrogen, Cat.22600-134)과 1:1 비율로 혼합함)에서 유지하였다. 마우스 이식일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 지지체로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하였다.
인간 폐암 A549 세포를 10% 우태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충된 RPMI1640 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 유지하였다. 마우스 이식일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 지지체로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하였다.
인간 폐암 A549 세포를 10% 우태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충된 RPMI1640 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 유지하였다. 마우스 이식일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 지지체로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하였다.
인간 전립선암 PC3 세포를 10% 우태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충된 RPMI1640 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 유지하였다. 마우스 이식일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 지지체로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하였다.
인간 췌장암 PANC-1 세포를 10% 우태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충된 DMEM 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 유지하였다. 마우스 이식일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 지지체로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하였다.
인간 간암 PCL/PRF/5 (CLS) 및 인간 대장암 SW-620 세포를 10% 우태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충된 DMEM 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 유지하였다. 마우스 이식일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 지지체로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하였다.
인간 대장암 HCT-116 및 HT-29 세포를 10% 우태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충된 McCoy 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 유지하였다. 마우스 이식일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 지지체로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하였다.
인간 간암 HepG2 세포를 10% 우태아 혈청 및 2mM 글루타민으로 보충된 DMEM 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 유지하였다. 마우스 이식일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 지지체로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하였다.
다중약물 내성 인간 자궁 육종 MES-SA.Dx5 세포를 10% 우태아 혈청, 2mM 글루타민 및 1μM 독소루비신 하이드로클로라이드 (Sigma, Cat. No. D1515-10MG)로 보충된 McCoy 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)에서 유지하였다. 세포 이식 3일 전에, 세포를 독소루비신이 없는 배지에서 배양하였다. 마우스 이식일에, 트립신(Invitrogen)으로 세포를 세척하여 지지체로부터 세포를 분리하고, 이어서 세포를 1300 rpm, 4℃에서, 8분 동안 원심분리하고, HBSS 완충액 (Hanks 배지)에 현탁하였다.
마우스
본 발명의 단백질의 항종양 활성의 검사는 Centrum Medycyny Doswiadczalnej in Bialystok로부터 입수한 7주령 내지 9주령의 CD-누드 (Crl:CD1-Foxn1 nu 1) 마우스, Harlan UK로부터 입수한 7주령 내지 8주령의 Hsd:Athymic-Nude-Foxn1nu 마우스 (암컷), Harlan UK로부터 입수한 8주령 내지 10주령의 HsdCpb:NMRI-Foxn1nu 마우스, Centrum Medycyny Doswiadczalnej in Bialystok로부터 입수한 8주령 내지 10주령의 암컷 Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스 및 Charles River Germany로부터 입수한 4주령 내지 5주령의 암컷 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr 마우스에 대하여 수행하였다. 마우스를 음식물과 탈이온수에 대한 자유로운 접근(임의로)과 함께 특정 병원체가 없는 조건 하에 유지하였다. 동물에 대한 모든 실험은 다음의 지침서에 따라 수행하였다: New York Academy of Sciences' Ad Hoc Committee on Animal Research에 의해 발행되고, IV Local Ethics Committee on Animal Experimentation in Warsaw (No. 71/2009)에 의해 승인된 "Interdisciplinary Principles and Guidelines for the Use of Animals in Research, Marketing and Education".
실험 과정 및 평가
전자 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하고, 다음 식을 사용하여 종양 체적을 산출하였다: (a2 x b)/2, 여기서 a = 종양의 짧은 대각선 (mm) 및 b = 종양의 긴 대각선 (mm). 다음 식을 사용하여 종양 성장 억제값을 산출하였다:
TGI [%] (종양 성장 억제값) = (WT/WC) x 100 - 100%
여기서, WT는 처리군에서의 평균 종양 체적이고, WC는 대조군에서의 평균 종양 체적이다.
실험 결과는 평균값 ± 표준 편차(SD)로 제시된다. 모든 계산 및 그래프는 GraphPad Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 작성하였다.
인간 대장암 모델
A. Colo 205
0일째에, 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 0.15ml RPMI1640 배지에 현탁된 5x106의 Colo 205 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 10일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 100 mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 18a (3 mg/kg), 실시예 25a (3 mg/kg), 실시예 37a (5 mg/kg) 및 실시예 42a (10 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (10 mg/kg)을, 대조군으로서 주사용수를 투여하였다. 2일마다 제제를 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 27일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 1 및 도 2에 도시되며, 도 1은 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 2는 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
도 1 및 도 2에 제시된 실험 결과는 실시예 18a, 실시예 25a, 실시예 37a 및 실시예 42a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 27일째에 대조군에 비하여 종양 Colo 205 성장을 각각 TGI 30.5%, 37%, 29% 및 60.2%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 12% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
B. HCT -116
0일째에, 마우스 Crl:SHO-Prkdc scid Hr hr 에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 5x106의 HCT116 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 71mm3 내지 432mm3의 크기에 도달할 때(13일), 마우스를 무작위로 추출하여 약 180mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 18b (3 mg/kg) 및 실시예 2b (5 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (65 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (50mM Trizma Base, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로스, pH 8.0)을 투여하였다. 2일마다 rhTRAIL114-281 및 실시예 2b에 6회 정맥내(i.v.) 투여하고, 실험 13일째, 15일째, 21일째, 24일째에 실시예 18b에 정맥내(i.v.) 투여하였다. 대조군에 제형 완충액을 투여하였다. 실험 24일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 19 및 도 20에 도시되며, 도 19는 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 20은 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
도 19 및 도 20에 제시된 실험 결과는 실시예 18b 및 실시예 2b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 24일째에 대조군에 비하여 HCT116 종양 성장을 각각 TGI 81% 및 67%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 38% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
B1. HCT116
0일째에, 마우스 Crl:SHO-Prkdc scid Hr hr 에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 5x106의 HCT116 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 63mm3 내지 370mm3의 크기에 도달할 때(17일), 마우스를 무작위로 추출하여 약 190mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 18b (3 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (70 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (50mM Trizma Base, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로스, pH 8.0)을 투여하였다. 2일마다 rhTRAIL114-281에 6회 정맥내(i.v.) 투여하고, 4일마다 실시예 18b에 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 대조군에 제형 완충액을 투여하였다. 실험 47일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 19a 및 도 20a에 도시되며, 도 19a는 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 20a은 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
도 19a 및 도 20a에 제시된 실험 결과는 실시예 18b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 47일째에 대조군에 비하여 HCT116 종양 성장을 TGI 85%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 37% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
C. SW620 TAZD
0일째에, 마우스 Crl:SHO-Prkdc scid Hr hr 에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 5x106의 SW620 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 92mm3 내지 348mm3의 크기에 도달할 때(13일), 마우스를 무작위로 추출하여 약 207mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 2b (5 mg/kg), 실시예 18b (3 mg/kg) 및 실시예 51b (5 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (50 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (50mM Trizma Base, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로스, pH 8.0)을 투여하였다. 제제를 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 대조군에 제형 완충액 [f25]을 투여하였다.
실험 26일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 21 및 도 22에 도시되며, 도 21은 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 22는 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
도 21 및 도 22에 제시된 실험 결과는 실시예 18b, 실시예 51b 및 실시예 2b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 34일째에 대조군에 비하여 SW620 종양 성장을 각각 TGI 62.6%, 39% 및 54%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 23% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
C1 . SW620
0일째에, 마우스 Crl:SHO-Prkdc scid Hr hr 에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 5x106의 SW620 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 126mm3 내지 300mm3의 크기에 도달할 때(11일), 마우스를 무작위로 추출하여 약 210mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 18b (5 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (50 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (50mM Trizma Base, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로스, pH 8.0)을 투여하였다. 제제를 3일마다 5회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 대조군에 제형 완충액 [f25]을 투여하였다.
실험 31일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 21a 및 도 22a에 도시되며, 도 21a는 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 22a는 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
도 21a 및 도 22a에 제시된 실험 결과는 실시예 18b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 31일째에 대조군에 비하여 SW620 종양 성장을 TGI 73%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 27.6% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
D. HT -29
0일째에, 마우스 Crl:SHO-Prkdc scid Hr hr 에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 5x106의 HT-29 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 80mm3 내지 348mm3의 크기에 도달할 때(12일), 마우스를 무작위로 추출하여 약 188mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 18b (4회 용량 3 mg/kg, 나머지 2회 용량 6 mg/kg) 및 실시예 51b (5 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (50 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 [f25]을 투여하였다. 제제를 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 대조군에 제형 완충액 (50mM Trizma Base, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로스, pH 8.0)을 투여하였다. 실험 26일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 23 및 도 24에 도시되며, 도 23은 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 24는 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
도 23 및 도 24에 제시된 실험 결과는 실시예 18b 및 실시예 51b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 26일째에 대조군에 비하여 HT-29 종양 성장을 각각 TGI 53% 및 67%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 17.5% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
폐암 모델
A. 0일째에, Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 배지 0.15ml에 현탁된 5x106의 A549 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 20일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 45mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 18a (5 mg/kg) 및 실시예 35a (5 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (15 mg/kg)을, 대조군으로서 주사용수를 투여하였다. 제제를 다음과 같이 투여하였다: 투여 (1일째), 하루 휴식, 3일째, 4일째, 5일째 매일 투여, 하루 휴식, 투여 (7일째), 하루 휴식, 투여 (9일째). 실험 38일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 3 및 도 4에 도시되며, 도 3은 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 4는 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
도 3 및 도 4에 제시된 실험 결과는 실시예 18a 및 실시예 35a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 38일째에 대조군에 비하여 A549 종양 성장을 각각 TGI 73.3% 및 20.7%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 16% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
B. 0일째에, Cby.Cg-foxn1(nu)/J 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 배지와 Matrigel (4:1)의 혼합물 0.10ml에 현탁된 5x106의 A549 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 19일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 75mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 18a (5 mg/kg) 및 실시예 50a (20 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (15 mg/kg)을, 대조군으로서 주사용수를 투여하였다. 제제를 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 35일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 5 및 도 6에 도시되며, 도 5는 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 6은 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
실험 결과는 실시예 18a 및 실시예 50a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 35일째에 대조군에 비하여 A549 종양 성장을 각각 TGI 26% 및 45%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 억제 효과를 0% 수준의 TGI로 수득하지 못하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
C. 0일째에, 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 배지와 Matrigel (3:1)의 혼합물 0.10ml에 현탁된 5x106의 A549 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 17일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 100mm3 내지 120mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 2a (5 mg/kg), 실시예 18a (3 mg/kg) 및 실시예 44a (20 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (19mM NaH2PO4, 81mM Na2HPO4, 50mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, pH 7.4)을 투여하였다. 제제를 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 34일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 7 및 도 8에 도시되며, 도 7은 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 8은 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
실험 결과는 실시예 2a, 실시예 18a 및 실시예 44a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 34일째에 대조군에 비하여 A549 종양 성장을 각각 TGI 83.5%, 80% 및 47%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 21.8% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
D. 0일째에, 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 배지와 Matrigel (3:1)의 혼합물 0.10ml에 현탁된 7x106의 A549 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 21일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 160mm3 내지 180mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 20a (15 mg/kg), 실시예 26a (6 mg/kg), 실시예 43a (10 mg/kg) 및 실시예 47a (5 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (40 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (5mM NaH2PO4, 95mM Na2HPO4, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로스, pH 7.4)을 투여하였다. 제제를 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 35일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 9 및 도 10에 도시되며, 도 9는 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 10은 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
실험 결과는 실시예 20a, 실시예 26a, 실시예 43a 및 실시예 47a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 35일째에 대조군에 비하여 A549 종양 성장을 각각 TGI 49.5 %, 64%, 40.2% 및 49.5%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 15% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
E. A549 - 종양의 재성장
0일째에, 마우스 Crl:SHO-Prkdc scid Hr hr 에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 7x106의 A549 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 85mm3 내지 302mm3의 크기에 도달할 때(17일째), 마우스를 무작위로 추출하여 약 177mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 2b (5 mg/kg) 및 실시예 18b (3 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (90 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (50mM Trizma Base, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로스, pH 8.0)을 투여하였다. rhTRAIL114-281에 2일마다 12회 정맥내(i.v.) 투여하고, 실시예 2b에 2일마다 7회 정맥내(i.v.) 투여하고, 실시예 18b에 실험 17일째, 20일째, 25일째 및 29일째에 정맥내(i.v.) 투여하였다. 대조군은 제형 완충액을 투여하였다. 실험 45일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 27 및 도 28에 도시되며, 도 27은 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 28은 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
도 27 및 도 28에 제시된 실험 결과는 실시예 18b 및 실시예 2b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 45일째에 대조군에 비하여 A549 종양 성장을 각각 TGI 71% 및 44%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 10.6% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
췌장암 모델
A. 0일째에, 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 배지와 Matrigel (3:1)의 혼합물 0.10ml에 현탁된 7x106의 PANC-1 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 27일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 95mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 20a(5 mg/kg), 실시예 51a (10 mg/kg) 및 실시예 52a (10 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (5mM NaH2PO4, 95mM Na2HPO4, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로스, pH 7.4)을 투여하였다. 제제를 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 40일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 11 및 도 12에 도시되며, 도 11은 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 12는 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
실험 결과는 실시예 20a, 실시예 51a 및 실시예 52a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 40일째에 대조군에 비하여 PANC-1 종양 성장을 각각 TGI 19%, 38% 및 34%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 12% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
B. 0일째에, 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 배지와 Matrigel (3:1)의 혼합물 0.10ml에 현탁된 5x106의 PANC-1 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 31일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 110mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 18a (3 mg/kg) 및 실시예 44a (20 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (20 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (19mM NaH2PO4, 81mM Na2HPO4, 50mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, pH 7.4)을 투여하였다. 제제를 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 42일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 13 및 도 14에 도시되며, 도 13은 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 14는 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
실험 결과는 실시예 18a 및 실시예 44a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 42일째에 대조군에 비하여 PANC-1 종양 성장을 각각 TGI 56% 및 43%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 27.5% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
전립선암 모델
0일째에, 마우스에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 배지와 Matrigel (9:1)의 혼합물 0.20ml에 현탁된 5x106의 PC3 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 29일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 90mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 18a(5 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 대조군으로서 주사용수를 투여하였다. 제제를 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 60일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 15 및 도 16에 도시되며, 도 15는 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 16은 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
실험 결과는 실시예 18a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 60일째에 대조군에 비하여 PC3 종양 성장을 TGI 30.8%로 억제하였음을 나타낸다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
간암 모델
A. PCL/PRF/5
0일째에, 마우스 Crl:SHO-PrkdcscidHrhr에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 배지와 Matrigel (3:1)의 혼합물 0.10ml에 현탁된 7x106의 PCL/PRF/5 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 실험 31일째에, 마우스를 무작위로 추출하여 약 200mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 51a (10 mg/kg)a의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (30 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (5mM NaH2PO4, 95mM Na2HPO4, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로스, pH 7.4)을 투여하였다. 제제를 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실험 49일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 17 및 도 18에 도시되며, 도 17은 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 18은 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
실험 결과는 실시예 51a의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 49일째에 대조군에 비하여 PCL/PRF/5 종양 성장을 TGI 88.5%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 18% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
E. A549 - 종양의 재성장
0일째에, 마우스 Crl:SHO-Prkdc scid Hr hr 에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 7x106의 A549 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 85mm3 내지 302mm3의 크기에 도달할 때(17일째), 마우스를 무작위로 추출하여 약 177mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 2b (5 mg/kg) 및 실시예 18b (3 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (90 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (50mM Trizma Base, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로스, pH 8.0)을 투여하였다. rhTRAIL114-281에 2일마다 12회 정맥내(i.v.) 투여하고, 실시예 2b에 2일마다 7회 정맥내(i.v.) 투여하고, 실시예 18b에 실험 17일째, 20일째, 25일째 및 29일째에 정맥내(i.v.) 투여하였다. 대조군은 제형 완충액을 투여하였다. 실험 45일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 27 및 도 28에 도시되며, 도 27은 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 28은 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
도 27 및 도 28에 제시된 실험 결과는 실시예 18b 및 실시예 2b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 45일째에 대조군에 비하여 A549 종양 성장을 각각 TGI 71% 및 44%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 10.6% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
B. HepG2
0일째에, 마우스 Crl:SHO-Prkdc scid Hr hr 에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 7x106의 HepG2 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 64mm3 내지 530mm3의 크기에 도달할 때(25일째), 마우스를 무작위로 추출하여 약 228mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 18b (5 mg/kg) 및 실시예 18b (10 mg/kg HSA로 보충된 5 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (50 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (50mM Trizma Base, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로스, pH 8.0) 및 기준 화합물 5FU (20 mg/kg)를 투여하였다. rhTRAIL114-281에 2일마다 12회 정맥내(i.v.) 투여하고, 실시예 18b에 실험 25일째, 27일째, 29일째, 37일째 및 42일째에 정맥내(i.v.) 투여하였다. 5FU (20 mg/kg)를 2일마다 6회 복강내(i.p.) 투여하였다. 대조군은 제형 완충액을 투여하였다. 실험 49일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 25 및 도 26에 도시되며, 도 25는 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 26은 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
도 25 및 도 26에 제시된 실험 결과는 실시예 18b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 49일째에 대조군에 비하여 HepG2 종양 성장을 TGI 82.5%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281 및 5FU의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 각각 31% 및 -4.7% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독 및 표준 화학요법과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
시험된 융합 단백질은 마우스의 체중 감소 (즉, 기준선 체중의 10% 미만)에 의해 나타나는 유의한 부작용을 일으키지 않았다. 이는 단백질의 전신 독성이 낮음을 나타낸다.
다중약물 내성 자궁 육종 모델
MES-SA.Dx5
0일째에, 마우스 Crl:SHO-Prkdc scid Hr hr 에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 7x106의 MES-SA.Dx5 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 64mm3 내지 323mm3의 크기에 도달할 때(13일째), 마우스를 무작위로 추출하여 약 180mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 18b (5 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (50 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (50mM Trizma Base, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로스, pH 8.0) 및 기준 화합물 CPT-11 (camptothecin, Pfeizer) (30 mg/kg)을 투여하였다. rhTRAIL114-281 및 실시예 18b에 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. CPT-11을 2일마다 6회 복강내(i.p.) 투여하였다. 대조군은 제형 완충액을 투여하였다. 실험 34일째에, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 29 및 도 30에 도시되며, 도 25는 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이고, 도 26은 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(% TGI)을 도시한 것이다.
도 29 및 도 30에 제시된 실험 결과는 실시예 18b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 34일째에 대조군에 비하여 MES-SA/Dx5 종양 성장을 TGI 85%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281 및 CPT-11의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 각각 51% 및 57% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독 및 표준 화학요법과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
MES-SA.Dx5
0일째에, 마우스 Crl:SHO-Prkdc scid Hr hr 에 0.5mm x 25mm의 바늘(Bogmark)을 갖는 주사기로 HBSS 완충액:Matrigel의 3:1 혼합물 0.1ml에 현탁된 7x106의 MES-SA.Dx5 세포를 우측에 피하로(s.c.) 이식하였다. 종양이 26mm3 내지 611mm3의 크기에 도달할 때(19일째), 마우스를 무작위로 추출하여 약 180mm3의 그룹의 종양의 평균 크기를 수득하고, 처리군으로 할당하였다. 처리군에 실시예 2b (3 mg/kg), 실시예 18b (3 mg/kg) 및 실시예 51b (7,5 mg/kg)의 본 발명의 융합 단백질의 제제를, 비교 기준으로서 rhTRAIL114-281 (60 mg/kg)을, 대조군으로서 제형 완충액 (50mM Trizma Base, 200mM NaCl, 5mM 글루타티온, 0.1mM ZnCl2, 10% 글리세롤, 80mM 사카로스, pH 8.0)을 투여하였다. rhTRAIL114-281, 실시예 2b 및 실시예 51b에 2일마다 6회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 실시예 18b에 2일마다 4회 정맥내(i.v.) 투여하였다. 대조군은 제형 완충액을 투여하였다.
실험 33일째, 척수 파괴를 통해 마우스를 희생시켰다.
실험 결과는 도 29a 및 도 30a에 도시되며, 도 29a는 종양 체적 변화의 다이어그램을 도시한 것이며, 도 30a는 대조군의 백분율로서의 종양 성장 억제값(%TGI)을 도시한 것이다.
도 29a 및 도 30a에서 그래프로 제시된 실험 결과는 실시예 2b, 실시예 18b 및 실시예 51b의 본 발명의 융합 단백질의 투여가 실험 33일째에 대조군에 비하여 MES-SA/Dx5 종양 성장을 각각 TGI 84%, 67.5% 및 58.6%로 억제하였음을 나타낸다. 비교 기준으로서 사용된 rhTRAIL114-281의 경우, 대조군에 비하여 종양 세포 성장에 대한 약간의 억제 효과를 25.8% 수준의 TGI로 수득하였다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 TRAIL 단독과 비교하여 훨씬 더 강력한 효과를 발휘한다.
SEQUENCE LISTING <110> Adamed Sp. z o.o. <120> Anticancer fusion protein <130> PL <150> PL397167 <151> 2011-11-28 <160> 208 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 430 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> none <400> 1 Tyr Asn Thr Val Ser Phe Asn Leu Gly Glu Ala Tyr Glu Tyr Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ile Gln Asp Leu Arg Asn Glu Leu Ala Lys Gly Thr Pro Val Cys 20 25 30 Gln Leu Pro Val Thr Leu Gln Thr Ile Ala Asp Asp Lys Arg Phe Val 35 40 45 Leu Val Asp Ile Thr Thr Thr Ser Lys Lys Thr Val Lys Val Ala Ile 50 55 60 Asp Val Thr Asp Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Asp Lys Trp Asp Gly 65 70 75 80 Lys Asp Arg Ala Val Phe Leu Asp Lys Val Pro Thr Val Ala Thr Ser 85 90 95 Lys Leu Phe Pro Gly Val Thr Asn Arg Val Thr Leu Thr Phe Asp Gly 100 105 110 Ser Tyr Gln Lys Leu Val Asn Ala Ala Lys Val Asp Arg Lys Asp Leu 115 120 125 Glu Leu Gly Val Tyr Lys Leu Glu Phe Ser Ile Glu Ala Ile His Gly 130 135 140 Lys Thr Ile Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile 145 150 155 160 Gln Met Val Ser Glu 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130 135 140 Lys Thr Ile Asn Gly Gln Glu Ile Ala Lys Phe Phe Leu Ile Val Ile 145 150 155 160 Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Thr Glu Val 165 170 175 Val Asp Arg Gly Leu Tyr Gly Ser Phe Lys Pro Asn Phe Lys Val Leu 180 185 190 Asn Leu Glu Asn Asn Trp Gly Asp Ile Ser Asp Ala Ile His Lys Ser 195 200 205 Ser Pro Gln Cys Thr Thr Ile Asn Pro Ala Leu Gln Leu Ile Ser Pro 210 215 220 Ser Asn Asp Pro Trp Val Val Asn Lys Val Ser Gln Ile Ser Pro Asp 225 230 235 240 Met Gly Ile Leu Lys Phe Lys Ser 245 <210> 56 <211> 267 <212> PRT <213> Ricinus communis <300> <308> GenBank/ABG65738.1 <309> 2006-07-16 <313> (1)..(267) <400> 56 Glu Asp Asn Asn Ile Phe Pro Lys Gln Tyr Pro Ile Ile Asn Phe Thr 1 5 10 15 Thr Ala Gly Ala Thr Val Gln Ser Tyr Thr Asn Phe Ile Arg Ala Val 20 25 30 Arg Gly Arg Leu Thr Thr Gly Ala Asp Val Arg His Glu Ile Pro Val 35 40 45 Leu Pro Asn Arg Val Gly Leu Pro Ile Asn Gln Arg Phe Ile Leu Val 50 55 60 Glu Leu Ser Asn His Ala Glu Leu Ser Val Thr Leu Ala Leu Asp Val 65 70 75 80 Thr Asn Ala Tyr Val Val Gly Tyr Arg Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Phe 85 90 95 Phe His Pro Asp Asn Gln Glu Asp Ala Glu Ala Ile Thr His Leu Phe 100 105 110 Thr Asp Val Gln Asn Arg Tyr Thr Phe Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Asp 115 120 125 Arg Leu Glu Gln Leu Ala Gly Ser Leu Arg Glu Asn Ile Glu Leu Gly 130 135 140 Asn Gly Pro Leu Glu Glu Ala Ile Ser Ala Leu Tyr Tyr Tyr Ser Thr 145 150 155 160 Gly Gly Thr Gln Leu Pro Thr Leu Ala Arg Ser Phe Ile Val Cys Ile 165 170 175 Gln Met Ile Ser Glu Ala Ala Arg Phe Gln Tyr Ile Glu Gly Glu Met 180 185 190 Arg Thr Arg Ile Arg Tyr Asn Arg Arg Ser Ala Pro Asp Pro Ser Val 195 200 205 Ile Thr Leu Glu Asn Ser Trp Gly Arg Leu Ser Thr Ala Ile Gln Glu 210 215 220 Ser Asn Gln Gly Ala Phe Ala Ser Pro Ile Gln Leu Gln Arg Arg Asn 225 230 235 240 Gly Ser Lys Phe Ser Val Tyr Asp Val Ser Ile Leu Ile Pro Ile Ile 245 250 255 Ala Leu Met Val Tyr Arg Cys Ala Pro Pro Pro 260 265 <210> 57 <211> 192 <212> PRT <213> Ricinus communis <300> <308> GenBank/ACZ56254.1 <309> 2009-12-05 <313> (1)..(192) <400> 57 Gly Pro Gly Pro Lys Gln Tyr Pro Ile Ile Asn Phe Thr Thr Ala Gly 1 5 10 15 Ala Thr Val Gln Ser Tyr Thr Asn Phe Ile Arg Ala Val Arg Gly Arg 20 25 30 Leu Thr Thr Gly Ala Asp Val Arg His Glu Ile Pro Val Leu Pro Asn 35 40 45 Arg Val Gly Leu Pro Ile Asn Gln Arg Phe Ile Leu Val Glu Leu Ser 50 55 60 Asn His Ala Glu Leu Ser Val Thr Leu Ala Leu Asp Val Thr Asn Ala 65 70 75 80 Tyr Val Val Gly Tyr Arg Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Phe Phe His Pro 85 90 95 Asp Asn Gln Glu Asp Ala Glu Ala Ile Thr His Leu Phe Thr Asp Val 100 105 110 Gln Asn Arg Tyr Thr Phe Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Asp Arg Leu Glu 115 120 125 Gln Leu Ala Gly Asn Leu Arg Glu Asn Ile Glu Leu Gly Asn Gly Pro 130 135 140 Leu Glu Glu Ala Ile Ser Ala Leu Tyr Tyr Tyr Ser Thr Gly Gly Thr 145 150 155 160 Gln Leu Pro Thr Leu Ala Arg Ser Phe Ile Ile Cys Ile Gln Met Ile 165 170 175 Ser Glu Ala Ala Arg Phe Gln Tyr Ile Glu Gly Glu Met Arg Val Pro 180 185 190 <210> 58 <211> 290 <212> PRT <213> Phytolacca americana <300> <308> GenBank/CAA66702.1 <309> 2005-04-18 <313> (25)..(314) <400> 58 Ile Asn Thr Ile Thr Phe Asp Ala Gly Asn Ala Thr Ile Asn Lys Tyr 1 5 10 15 Ala Thr Phe Met Glu Ser Leu Arg Asn Gln Ala Lys Asp Pro Lys Leu 20 25 30 Lys Cys Tyr Gly Ile Pro Met Leu Pro Asp Thr Asn Ser Thr Pro Lys 35 40 45 Tyr Leu Leu Val Lys Leu Gln Gly Ala Asn Leu Lys Thr Ile Thr Leu 50 55 60 Met Leu Arg Arg Asn Asn Leu Tyr Val Met Gly Tyr Ser Asp Pro Phe 65 70 75 80 Asn Gly Asn Lys Cys Arg Tyr His Ile Phe Asn Asp Ile Thr Ser Thr 85 90 95 Glu Arg Thr Asp Val Glu Asn Thr Leu Cys Ser Ser Ser Ser Ser Arg 100 105 110 Val Ala Met Ser Ile Asn Tyr Asn Ser Leu Tyr Pro Thr Met Glu Lys 115 120 125 Lys Ala Glu Val Asn Ser Arg Asn Gln Val Gln Leu Gly Ile Gln Ile 130 135 140 Leu Ser Ser Asp Ile Gly Lys Ile Ser Gly Val Asp Ser Phe Pro Val 145 150 155 160 Lys Thr Glu Ala Phe Phe Leu Leu Val Ala Ile Gln Met Val Ser Glu 165 170 175 Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Asn Gln Val Lys Thr Asn Phe Asn 180 185 190 Arg Ala Phe Tyr Pro Asp Pro Lys Val 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85 90 95 Ala Glu Leu Thr Ala Leu Phe Pro Glu Ala Thr Thr Ala Asn Gln Lys 100 105 110 Ala Leu Glu Tyr Thr Glu Asp Tyr Gln Ser Ile Glu Lys Asn Ala Gln 115 120 125 Ile Thr Gln Gly Asp Lys Ser Arg Lys Glu Leu Gly Leu Gly Ile Asp 130 135 140 Leu Leu Leu Thr Phe Met Glu Ala Val Asn Lys Lys Ala Arg Val Val 145 150 155 160 Lys Asn Glu Ala Arg Phe Leu Leu Ile Ala Ile Gln Met Thr Ala Glu 165 170 175 Val Ala Arg Phe Arg Tyr Ile Gln Asn Leu Val Thr Lys Asn Phe Pro 180 185 190 Asn Lys Phe Asp Ser Asp Asn Lys Val Ile Gln Phe Glu Val Ser Trp 195 200 205 Arg Lys Ile Ser Thr Ala Ile Tyr Gly Asp Ala Lys Asn Gly Val Phe 210 215 220 Asn Lys Asp Tyr Asp Phe Gly Phe Gly Lys Val Arg Gln Val Lys Asp 225 230 235 240 Leu Gln Met Gly Leu Leu Met Tyr Leu Gly Lys Pro 245 250 <210> 60 <211> 247 <212> PRT <213> Trichosanthes kirilowii <300> <308> GenBank/AAB22585.1 <309> 1993-05-08 <313> (1)..(247) <400> 60 Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Val 1 5 10 15 Phe Ile Ser Asn Leu Arg Lys Ala Leu Pro Asn Glu Arg Lys Leu Tyr 20 25 30 Asp Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Leu Pro Gly Ser Gln Arg Tyr Ala 35 40 45 Leu Ile His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp Glu Thr Ile Ser Val Ala Ile 50 55 60 Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Arg Ala Gly Asp Thr Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Phe Asn Glu Ala Ser Ala Thr Glu Ala Ala Lys Tyr Val Phe 85 90 95 Lys Asp Ala Met Arg Lys Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu 100 105 110 Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly 115 120 125 Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala 130 135 140 Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val Leu Ile Gln Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160 Ala Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln Gln Ile Gly Lys Arg Val Asp 165 170 175 Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp 180 185 190 Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln 195 200 205 Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asn Ala Gln Asn Gln Arg Val Thr 210 215 220 Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu 225 230 235 240 Leu Asn Arg Asn Asn Met Ala 245 <210> 61 <211> 245 <212> PRT <213> Trichosanthes anguina <300> <308> GenBank/AAD02686.1 <309> 1999-03-03 <313> (20)..(264) <400> 61 Asp Val Ser Phe Asp Leu Ser Thr Ala Thr Lys Lys Ser Tyr Ser Ser 1 5 10 15 Phe Ile Thr Gln Leu Arg Asp Ala Leu Pro Thr Gln Gly Thr Val Cys 20 25 30 Gly Ile Pro Leu Leu Pro Ser Thr Ala Ser Gly Ser Gln Trp Phe Arg 35 40 45 Phe Phe Asn Leu Thr Asn Tyr Asn Asp Glu Thr Val Thr Val Ala Val 50 55 60 Asn Val Thr Asn Val Tyr Ile Val Ala Tyr Arg Ala Asp Ala Val Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Phe Glu Asp Thr Pro Ala Glu Ala Phe Lys Leu Ile Phe Ala 85 90 95 Gly Thr Lys Thr Val Lys Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Asp Lys Leu 100 105 110 Gln Ser Val Val Gly Lys Gln Arg Asp Met Ile Glu Leu Gly Ile Pro 115 120 125 Ala Leu Ser Ser Ala Ile Thr Asn Met Val Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ser 130 135 140 Thr Ala Ala Ala Leu Leu Val Leu Ile Gln Cys Thr Ala Glu Ala Ala 145 150 155 160 Arg Tyr Lys Tyr Ile Glu Gln Gln Val Ser Ser His Ile Ser Ser Asn 165 170 175 Phe Tyr Pro Asn Gln Ala Val Ile Ser Leu Glu Asn Lys Trp Gly Ala 180 185 190 Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile Ala Asn Arg Thr Gly His Gly Gln Phe 195 200 205 Glu Asn Pro Val Glu Leu Tyr Asn Pro Asp Gly Thr Arg Phe Ser Val 210 215 220 Thr Asn Thr Ser Ala Gly Val Val Lys Gly Asn Ile Lys Leu Leu Leu 225 230 235 240 Tyr Tyr Lys Ala Ser 245 <210> 62 <211> 249 <212> PRT <213> Viscum album <300> <308> GenBank/AAL87006.1 <309> 2002-03-17 <313> (1)..(249) <400> 62 Tyr Glu Arg Leu Arg Leu Arg Val Thr His Gln Thr Thr Gly Glu Glu 1 5 10 15 Tyr Phe Arg Phe Ile Thr Leu Leu Arg Asp Tyr Val Ser Ser Gly Ser 20 25 30 Phe Ser Asn Glu Ile Pro Leu Leu Arg Gln Ser Thr Ile Pro Val Ser 35 40 45 Asp Ala Gln Arg Phe Val Leu Val Glu Leu Thr Asn Glu Gly Gly Asp 50 55 60 Ser Ile Thr Ala Ala Ile Asp Val Thr Asn Leu Tyr Val Val Ala Tyr 65 70 75 80 Gln Ala Gly Asp Gln Ser Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Pro Arg Gly Ala 85 90 95 Glu Thr His Leu Phe Thr Gly Thr Thr Arg Ser Ser Leu Pro Phe Asn 100 105 110 Gly Ser Tyr Pro Asp Leu Glu Arg Tyr Ala Gly His Arg Asp Gln Ile 115 120 125 Pro Leu Gly Ile Asp Gln Leu Ile Gln Ser Val Thr Ala Leu Arg Phe 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Thr Arg Thr Gln Ala Arg Ser Ile Leu Ile Leu Ile 145 150 155 160 Gln Met Ile Ser Glu Ala Ala Arg Phe Asn Pro Ile Leu Trp Arg Ala 165 170 175 Arg Gln Tyr Ile Asn Ser Gly Ala Ser Phe Leu Pro Asp Val Tyr Met 180 185 190 Leu Glu Leu Glu Thr Ser Trp Gly Gln Gln Ser Thr Gln Val Gln Gln 195 200 205 Ser Thr Asp Gly Val Phe Asn Asn Pro Ile Arg Leu Ala Ile Pro Pro 210 215 220 Gly Asn Phe Val Thr Leu Thr Asn Val Arg Asp Val Ile Ala Ser Leu 225 230 235 240 Ala Ile Met Leu Phe Val Cys Gly Glu 245 <210> 63 <211> 273 <212> PRT <213> Sambucus ebulus L <300> <308> GenBank/CAC33178.1 <309> 2001-02-17 <313> (26)..(298) <400> 63 Ile Asp Tyr Pro Ser Val Ser Phe Asn Leu Ala Gly Ala Lys Ser Thr 1 5 10 15 Thr Tyr Arg Asp Phe Leu Lys Asn Leu Arg Asp Arg Val Ala Thr Gly 20 25 30 Thr Tyr Glu Val Asn Gly Leu Pro Val Leu Arg Arg Glu Ser Glu Val 35 40 45 Gln Val 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Met Pro His Val Leu Val Gly Glu Asp Asn Lys Phe 260 265 270 Asn <210> 64 <211> 272 <212> PRT <213> Sambucus nigra <300> <308> GenBank/AAB39475.1 <309> 1996-12-13 <313> (26)..(297) <400> 64 Ile Asp Tyr Pro Ser Val Ser Phe Asn Leu Asp Gly Ala Lys Ser Ala 1 5 10 15 Thr Tyr Arg Asp Phe Leu Ser Asn Leu Arg Lys Thr Val Ala Thr Gly 20 25 30 Thr Tyr Glu Val Asn Gly Leu Pro Val Leu Arg Arg Glu Ser Glu Val 35 40 45 Gln Val Lys Ser Arg Phe Val Leu Val Pro Leu Thr Asn Tyr Asn Gly 50 55 60 Asn Thr Val Thr Leu Ala Val Asp Val Thr Asn Leu Tyr Val Val Ala 65 70 75 80 Phe Ser Gly Asn Ala Asn Ser Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Thr Glu Val 85 90 95 Gln Lys Ser Asn Leu Phe Val Gly Thr Lys Gln Asn Thr Leu Ser Phe 100 105 110 Thr Gly Asn Tyr Asp Asn Leu Glu Thr Ala Ala Asn Thr Arg Arg Glu 115 120 125 Ser Ile Glu Leu Gly Pro Ser Pro Leu Asp Gly Ala Ile Thr Ser Leu 130 135 140 Tyr His Gly Asp Ser Val Ala Arg Ser Leu Leu Val Val Ile Gln Met 145 150 155 160 Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr Ile Glu Gln Glu Val Arg 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Pro Phe Tyr Trp Asp Asn Val Ala Gln Ala Ile Thr Arg Leu Ser Leu 225 230 235 240 Met Leu Phe Val Ser Arg Ser Thr Asp 245 <210> 67 <211> 246 <212> PRT <213> Momordica charantia <300> <308> GenBank/AAB22586.1 <309> 1993-05-08 <313> (1)..(246) <400> 67 Asp Val Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala Asp Pro Arg Ser Tyr Gly Met 1 5 10 15 Phe Ile Lys Asp Leu Arg Asn Ala Leu Pro Phe Arg Glu Lys Val Tyr 20 25 30 Asn Ile Pro Leu Leu Leu Pro Ser Val Ser Gly Ala Gly Arg Tyr Leu 35 40 45 Leu Met His Leu Phe Asn Tyr Asp Gly Lys Thr Ile Thr Val Ala Leu 50 55 60 Asp Val Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Leu Ala Asp Thr Thr Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Phe Asn Glu Pro Ala Ala Glu Leu Ala Ser Gln Tyr Val Phe 85 90 95 Arg Asp Ala Arg Arg Lys Ile Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu 100 105 110 Arg Leu Gln Ile Ala Ala Gly Lys Pro Arg Glu Lys Ile Pro Ile Gly 115 120 125 Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Ser Thr Leu Leu His Tyr Asp Ser 130 135 140 Thr Ala Ala Ala Gly Ala Leu Leu Val Leu Ile Gln Thr Thr Ala Glu 145 150 155 160 Ala Ala Arg Phe Lys Tyr Ile Glu Gln Gln Ile Gln Glu Arg Ala Tyr 165 170 175 Arg Asp Glu Val Pro Ser Leu Ala Thr Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp 180 185 190 Ser Gly Leu Ser Lys Gln Ile Gln Leu Ala Gln Gly Asn Asn Gly Ile 195 200 205 Phe Arg Thr Pro Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Gly Asn Arg Val Gln 210 215 220 Ile Thr Asn Val Thr Ser Lys Val Val Thr Ser Asn Ile Gln Leu Leu 225 230 235 240 Leu Asn Thr Arg Asn Ile 245 <210> 68 <211> 342 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 68 Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His 1 5 10 15 Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu 20 25 30 Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr 35 40 45 Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Ala Asn 50 55 60 Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg 65 70 75 80 Glu Ser Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu 85 90 95 Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala 100 105 110 Ala 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Pro Asp Ser Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser 325 330 335 Gln Pro Gly Lys Pro Pro 340 <210> 69 <211> 354 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 69 Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His 1 5 10 15 Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu 20 25 30 Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr 35 40 45 Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn 50 55 60 Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg 65 70 75 80 Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu 85 90 95 Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Val Val Ser Leu Thr 100 105 110 Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp 115 120 125 Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp 130 135 140 Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val 145 150 155 160 Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val 165 170 175 Phe Val 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thompsonii <300> <308> GenBank/AAB47280.1 <309> 2003-01-15 <313> (35)..(164) <400> 72 Ala Pro Ile Val Thr Cys Arg Pro Lys Leu Asp Gly Arg Glu Lys Pro 1 5 10 15 Phe Lys Val Asp Val Ala Thr Ala Gln Ala Gln Ala Arg Lys Ala Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Gly Lys Ser Gly Asp Pro His Arg Tyr Phe Ala Gly Asp 35 40 45 His Ile Arg Trp Gly Val Asn Asn Cys Asp Lys Ala Asp Ala Ile Leu 50 55 60 Trp Glu Tyr Pro Ile Tyr Trp Val Gly Lys Asn Ala Glu Trp Ala Lys 65 70 75 80 Asp Val Lys Thr Ser Gln Gln Lys Gly Gly Pro Thr Pro Ile Arg Val 85 90 95 Val Tyr Ala Asn Ser Arg Gly Ala Val Gln Tyr Cys Gly Val Met Thr 100 105 110 His Ser Lys Val Asp Lys Asn Asn Gln Gly Lys Glu Phe Phe Glu Lys 115 120 125 Cys Asp 130 <210> 73 <211> 109 <212> PRT <213> Salmonella typhi <300> <308> GenBank/ACJ63596.1 <309> 2010-04-22 <313> (28)..(136) <400> 73 Glu Arg Gly Glu Ile Trp Leu Val Ser Leu Asp Pro Thr Ala Gly His 1 5 10 15 Glu Gln Gln Gly Thr Arg Pro Val Leu Ile Val Thr Pro Ala Ala Phe 20 25 30 Asn Arg Val Thr Arg Leu Pro Val 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Garrido SS, Barros RS, Marchetto R. <302> Peptides based on CcdB protein as novel inhibitors of bacterial topoisomerases <303> Bioorg Med Chem Lett. <304> 18 <305> 23 <306> 6161-6164 <307> 2008-10-07 <400> 75 Gln Phe Lys Val Tyr Thr Tyr Lys Gly Gly Ser Gly Gly Arg Leu Leu 1 5 10 15 Ser Asp Lys Val Ser Arg Glu Leu Gly Gly Ser Gly Gly Ser His Arg 20 25 30 Glu Asn Asp Ile Lys Asn Ala Ile Asn Leu Met Phe Trp Gly Ile 35 40 45 <210> 76 <211> 94 <212> PRT <213> Escherichia coli <300> <308> NCBI Reference Sequence/NP_416081.1 <309> 2011-02-13 <313> (2)..(95) <400> 76 Ala Tyr Phe Leu Asp Phe Asp Glu Arg Ala Leu Lys Glu Trp Arg Lys 1 5 10 15 Leu Gly Ser Thr Val Arg Glu Gln Leu Lys Lys Lys Leu Val Glu Val 20 25 30 Leu Glu Ser Pro Arg Ile Glu Ala Asn Lys Leu Arg Gly Met Pro Asp 35 40 45 Cys Tyr Lys Ile Lys Leu Arg Ser Ser Gly Tyr Arg Leu Val Tyr Gln 50 55 60 Val Ile Asp Glu Lys Val Val Val Phe Val Ile Ser Val Gly Lys Arg 65 70 75 80 Glu Arg Ser Glu Val Tyr Ser Glu Ala Val Lys Arg Ile Leu 85 90 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ctgattgtga ttattcagat ggttgcagaa gcagcacgct ttcgttatat ttcaaatcgt 1080 gttcgtgtga gcattcagac cggcaccgca tttcagccgg atgcagcaat gattagcctg 1140 gaaaataatt gggataatct gagccgtggt gttcaggaaa gcgttcagga tacctttccg 1200 aatcaggtta ccctgaccaa tattcgtaat gaaccggtta ttgttgatag cctgagccat 1260 ccgaccgttg cagttctggc actgatgctg tttgtttgta atcctccgaa tgttcgtgaa 1320 cgtggtccga aagaagatct g 1341 <210> 134 <211> 1323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> none <400> 134 gaagatcgtc cgattaaatt tagcaccgaa ggtgcaacca gccagagcta taaacagttt 60 attgaagcac tgcgtgaacg tctgcgtggt ggtctgattc atgatattcc ggttctgccg 120 gatccgacca ccctgcagga acgtaatcgt tatattaccg ttgaactgag caatagcgat 180 accgaaagca ttgaagttgg tattgatgtg accaatgcct atgttgttgc atatcgtgca 240 ggcacccaga gctattttct gcgtgatgca ccgagcagcg caagcgatta cctgtttacc 300 ggcaccgatc agcatagcct gccgttttat ggcacctatg gtgatctgga acgttgggca 360 catcagagcc gtcagcagat tccgctgggt ctgcaggcac tgacccatgg tattagcttt 420 tttcgtagcg gtggcaatga taatgaagaa aaagcacgta ccctgattgt gattattcag 480 atggttgcag aagcagcacg ctttcgttat atttcaaatc gtgttcgtgt gagcattcag 540 accggcaccg catttcagcc ggatgcagca atgattagcc tggaaaataa ttgggataat 600 ctgagccgtg gtgttcagga aagcgttcag gatacctttc cgaatcaggt taccctgacc 660 aatattcgta atgaaccggt tattgttgat agcctgagcc atccgaccgt tgcagttctg 720 gcactgatgc tgtttgtttg taatccgccg aatggtggtg gtggtagcgg tggtggtggc 780 agccgtaaaa aacgtgcaag cggttgtggt ccggaatgtg ttcgtgaacg tggtccgcag 840 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 900 agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaatagct gggaaagcag ccgtagcggt 960 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 1020 ttttattata tttatagcca gacctatttt cgctttcagg aagaaattaa agaaaatacc 1080 aaaaatgata aacaaatggt gcagtatatc tataaataca ccagctatcc ggatccgatt 1140 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggtctgtat 1200 agcatttatc agggtggcat ttttgaactg aaagaaaatg atcgcatttt tgtgagcgtg 1260 accaatgaac atctgattga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtt 1320 ggt 1323 <210> 135 <211> 1545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> none <400> 135 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60 agcaaaaatg aaaaagccct gggtcgcaaa attaatagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttttattata tttatagcca gacctatttt cgctttcagg aagaaattaa agaaaacacc 240 aaaaatgata aacaaatggt gcagtatatc tataaatata ccagctatcc gcatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggtggcat ttttgaactg aaagaaaatg atcgcatttt tgtgagcgtg 420 accaatgaac atctgattga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtt 480 ggtggtggtg gtagcgcaag cggtggtccg gaaggtggta gcctggcagc actgaccgca 540 catcaggcat gtcatctgcc gctggaaacc tttacccgtc atcgtcagcc tcgtggttgg 600 gaacagctgg aacagtgtgg ttatccggtt cagcgtctgg ttgcactgta tctggcagca 660 cgtctgagct ggaatcaggt tgatcaggtt attgcaaatg cactggcatc tccgggtagc 720 ggtggtgatc tgggtgaagc aattcgtgaa tctccggaac aggcacgtct ggcactgacc 780 ctggcagcag cagaaagcga acgttttgtt cgtcagggca ccggtaatga tgaagccggt 840 gcagcaaatg gtccggcaga tagcggtgat gcactgctgg aacgtaatta tccgaccggt 900 gcagaatttc tgggtgatgg cggtgatgtt agctttagca cccgtggcac ccagaattgg 960 accgttgaac gtctgctgca ggcacatcgt cagctggaag aagccggtta cgtttttgtg 1020 ggttatcatg gcacctttct ggaagcagca cagagcattg tttttggtgg tgttcgtgca 1080 cgtagccagg atctggatgc aatttgggca ggcttttata ttgccggtga tccggcactg 1140 gcatatggtt atgcacagga tcaggaaccg gacgcagccg gtcgtattcg taatggtgca 1200 ctgctgcgtg tttatgttcc gcgtagcagc ctgcctggtt tttatgcaac cagcctgacc 1260 ctggctgcac cggaagcagc gggtgaagtg gaacgtctga ttggtcatcc gctgccgctg 1320 cgtctggatg ccattaccgg tccggaagaa tctggtggtc gtctggaaac cattctgggt 1380 tggcctctgg cagaacgcac cgttgttatt ccgagcgcaa ttccgaccga tccgcgtaat 1440 gttggtggcg atctggatcc gagcagcatt ccggatagcg aacaggcaat tagcgcactg 1500 ccggattatg ccagccagcc tggtaaacct ccgaaagatg aactg 1545 <210> 136 <211> 1545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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gcagcaaatg gtccggcaga tagcggtgat gcactgctgg aacgtaatta tccgaccggt 900 gcagaatttc tgggtgatgg cggtgatgtt agctttagca cccgtggcac ccagaattgg 960 accgttgaac gtctgctgca ggcacatcgt cagctggaag aagccggtta cgtttttgtg 1020 ggttatcatg gcacctttct ggaagcagca cagagcattg tttttggtgg tgttcgtgca 1080 cgtagccagg atctggatgc aatttgggca ggcttttata ttgccggtga tccggcactg 1140 gcatatggtt atgcacagga tcaggaaccg gacgcagccg gtcgtattcg taatggtgca 1200 ctgctgcgtg tttatgttcc gcgtagcagc ctgcctggtt tttatgcaac cagcctgacc 1260 ctggctgcac cggaagcagc gggtgaagtg gaacgtctga ttggtcatcc gctgccgctg 1320 cgtctggatg ccattaccgg tccggaagaa tctggtggtc gtctggaaac cattctgggt 1380 tggcctctgg cagaacgcac cgttgttatt ccgagcgcaa ttccgaccga tccgcgtaat 1440 gttggtggcg atctggatcc gagcagcatt ccggatagcg aacaggcaat tagcgcactg 1500 ccggattatg ccagccagcc tggtaaacct ccgaaagatg aactg 1545 <210> 137 <211> 1557 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> none <400> 137 cgtgtggcgg cgcatattac cggcacccgt ggccgtagca acaccctgag cagcccgaac 60 agcaaaaacg aaaaagcgct gggccgtaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggc 120 catagctttc tgagcaacct gcatctgcgt aacggcgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttttattata tttatagcca gacctatttt cgttttcagg aagaaattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacagatggt gcagtatatt tataaatata ccagctatcc gcatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcgcg taacagctgc tggagcaaag atgcggaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggcggcat ttttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt tgtgagcgtg 420 accaacgaac atctgattga tatggatcat gaagcgagct tttttggcgc gtttctggtg 480 ggcggcggcg gcagcggcgc gagcggctgc ggcccggaac cggaaggcgg cagcctggcg 540 gcgctgaccg cgcatcaggc gtgccatctg ccgctggaaa cctttacccg tcatcgtcag 600 ccgcgtggct gggaacagct ggaacagtgc ggctatccgg tgcagcgtct ggtggcgctg 660 tatctggcgg cgcgtctgag ctggaaccag gtggatcagg tgattgcgaa cgcgctggcg 720 agcccgggca gcggcggcga tctgggcgaa gcgattcgtg aaagcccgga acaggcgcgt 780 ctggcgctga ccctggcggc ggcggaaagc gaacgttttg tgcgtcaggg caccggcaac 840 gatgaagcgg gcgcggcgaa cggcccggcg gatagcggcg atgcgctgct ggaacgtaac 900 tatccgaccg gcgcggaatt tctgggcgat ggcggcgatg tgagctttag cacccgtggc 960 acccagaact ggaccgtgga acgtctgctg caggcgcatc gtcagctgga agaacgtggc 1020 tatgtgtttg tgggctatca tggcaccttt ctggaagcgg cgcagagcat tgtgtttggc 1080 ggcgtgcgtg cgcgtagcca ggatctggat gcgatttggg cgggctttta tattgcgggc 1140 gatccggcgc tggcgtatgg ctatgcgcag gatcaggaac cggatgcggc gggccgtatt 1200 cgtaacggcg cgctgctgcg tgtgtatgtg ccgcgtagca gcctgccggg cttttatgcg 1260 accagcctga ccctggcggc gccggaagcg gcgggcgaag tggaacgtct gattggccat 1320 ccgctgccgc tgcgtctgga tgcgattacc ggcccggaag aaagcggcgg ccgtctggaa 1380 accattctgg gctggccgct ggcggaacgt accgtggtga ttccgagcgc gattccgacc 1440 gatccgcgta acgtgggcgg cgatctggat ccgagcagca ttccggatag cgaacaggcg 1500 attagcgcgc tgccggatta tgcgagccag ccgggcaaac cgccgaaaga tgaactg 1557 <210> 138 <211> 1545 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> none <400> 138 cgtgtggcgg cgcatattac cggcacccgt ggccgtagca acaccctgag cagcccgaac 60 agcaaaaacg aaaaagcgct gggccgtaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggc 120 catagctttc tgagcaacct gcatctgcgt aacggcgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttttattata tttatagcca gaccaacttt aaatttcgtg aagaaattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacagatggt gcagtatatt tataaatata ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcgcg taacagctgc tggagcaaag atgcggaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggcggcat ttttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt tgtgagcgtg 420 accaacgaac gtctgcgtga tatgcatcat gaagcgagct tttttggcgc gtttctggtg 480 ggcggcggcg gcagcgcgag cggcggcccg gaaggcggca gcctggcggc gctgaccgcg 540 catcaggcgt gccatctgcc gctggaaacc tttacccgtc atcgtcagcc gcgtggctgg 600 gaacagctgg aacagtgcgg ctatccggtg cagcgtctgg tggcgctgta tctggcggcg 660 cgtctgagct ggaaccaggt ggatcaggtg attgcgaacg cgctggcgag cccgggcagc 720 ggcggcgatc tgggcgaagc gattcgtgaa agcccggaac aggcgcgtct ggcgctgacc 780 ctggcggcgg cggaaagcga acgttttgtg cgtcagggca ccggcaacga tgaagcgggc 840 gcggcgaacg gcccggcgga tagcggcgat gcgctgctgg aacgtaacta tccgaccggc 900 gcggaatttc tgggcgatgg cggcgatgtg agctttagca cccgtggcac ccagaactgg 960 accgtggaac gtctgctgca ggcgcatcgt cagctggaag aacgtggcta tgtgtttgtg 1020 ggctatcatg gcacctttct ggaagcggcg cagagcattg tgtttggcgg cgtgcgtgcg 1080 cgtagccagg atctggatgc gatttgggcg ggcttttata ttgcgggcga tccggcgctg 1140 gcgtatggct atgcgcagga tcaggaaccg gatgcggcgg gccgtattcg taacggcgcg 1200 ctgctgcgtg tgtatgtgcc gcgtagcagc ctgccgggct tttatgcgac cagcctgacc 1260 ctggcggcgc cggaagcggc gggcgaagtg gaacgtctga ttggccatcc gctgccgctg 1320 cgtctggatg cgattaccgg cccggaagaa agcggcggcc gtctggaaac cattctgggc 1380 tggccgctgg cggaacgtac cgtggtgatt ccgagcgcga ttccgaccga tccgcgtaac 1440 gtgggcggcg atctggatcc gagcagcatt ccggatagcg aacaggcgat tagcgcgctg 1500 ccggattatg cgagccagcc gggcaaaccg ccgaaagatg aactg 1545 <210> 139 <211> 108 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 139 Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His 1 5 10 15 Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu 20 25 30 Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr 35 40 45 Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln 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161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> none <300> <302> IMPROVED CYTOKINE DESIGN <310> WO2009066174 <311> 2008-11-21 <312> 2009-05-28 <400> 142 Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu 1 5 10 15 Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn 20 25 30 Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His 35 40 45 Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile 50 55 60 Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr 65 70 75 80 Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr 85 90 95 Pro His Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser 100 105 110 Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe 115 120 125 Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His 130 135 140 Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val 145 150 155 160 Gly <210> 143 <211> 161 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> brak <300> <301> Gasparian ME, <302> DR4-selective tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) variants obtained by structure-based design <303> J Biol Chem <304> 283 <305> 29 <306> 20560-8 <307> 2008-07-18 <400> 143 Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu 1 5 10 15 Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn 20 25 30 Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His 35 40 45 Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile 50 55 60 Tyr Ser Gln Thr Asn Phe Lys Phe Arg Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr 65 70 75 80 Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr 85 90 95 Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser 100 105 110 Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe 115 120 125 Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu Arg 130 135 140 Leu Arg Asp Met His His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val 145 150 155 160 Gly <210> 144 <211> 433 <212> 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540 catcaggcat gtcatctgcc gctggaaacc tttacccgtc atcgtcagcc tcgtggttgg 600 gaacagctgg aacagtgtgg ttatccggtt cagaaactgg ttgcactgta tctggcagcc 660 cgtctgagct ggaatcaggt tgatcaggtt attgcaaatg cactggcaag tccgggtagc 720 ggtggtgatc tgggtgaagc aattcgtgaa agtccggaac aggcacgtct ggcactgacc 780 ctggcagccg cagaaagcga acgttttgtt cgtcagggca ccggtaatga tgaagccggt 840 gcagcaaatg gtccggcaga tagcggtgat gcactgctgg aacgtaatta tccgaccggt 900 gcagaatttc tgggtgatgg cggtgatgtt agctttagta cccgtggcac ccagcagtgg 960 accgttgaac gtctgctgca ggcacaccgt cagctggaag aggcaggtta tgtttttgtt 1020 ggttatcatg gcacctttct ggaagcagca cagagcattg tgtttggtgg tgttcgtgca 1080 cgtagccagg atctggatgc aatttgggca ggtttctata ttgccggtga tccggcactg 1140 gcctatggtt atgcacagga tcaagaaccg gatgcagcag gtcgtattcg caatggtgcc 1200 ctgctgcgtg tttatgttcc gcgtagcagc ctgcctggtt tttatgcaac cagcctgaca 1260 ctggctgcac ctgaagcagc cggtgaagtg gaacgtctga ttggtcatcc gctgccgctg 1320 cgtctggatg cgattaccgg tcctgaagaa agtggtggtc gtctggaaac cattctgggt 1380 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ggcagcacgt ctgagctgga atcaggttga tcaggttatt 660 cgtaatgcac tggcaagtcc gggtagcggt ggtgatctgg gtgaagcaat tcgtgaacag 720 ccggaacagg cacgtctggc actgaccctg gcagcagcag aaagcgaata tccgaccggt 780 gcagaatttc tgggtgatgg tggtgcagtt agctttagta cccgtggcac ccagaattgg 840 accgttgaac gtctgctgca ggcacaccgt cagctggaag agggtggtta tgtttttgtt 900 ggttatcatg gcacctttct ggaagcagca cagagcattg tgtttggtgg tgttcgtgca 960 cgtagccagg atctggatgc aatttgggca ggtttctata ttgccggtga tccggcactg 1020 gcctatggtt atgcacagga tcaagaaccg gatgcagcag gtcgtattcg caatggtgca 1080 ctgctgcgtg tttatgttcc gcgtagcagc ctgcctggtt tttatgcaac cagcctgaca 1140 ctggctgcac cggaagcagc cggtgaagtg gaacgtctga ttggtcatcc gctgccgctg 1200 cgtctggatg ccattaccgg tccggaagaa gcaggcggtc gtctggaaac cattctgggt 1260 tggcctctgg cagaacgtac cgttgttatt ccgagcgcaa ttccgaccga tccgcgtaat 1320 gttggtggcg atctggatcc gagcagcatt ccggatgccg aagcagcaat tagcgcactg 1380 ccggattatg ccagccagcc tggtaaaccg cctaaagatg aactg 1425 <210> 190 <211> 1389 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 190 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60 agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttctactata tctacagcca gacctatttt cgcttccaag aagagattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacaaatggt gcagtacatc tataaataca ccagctatcc gcatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggtggcat ctttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt cgtgagcgtg 420 accaatgaac atctgatcga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtg 480 ggtggtggtg gtagcggtgg tggttcacgt catcgtcagc ctcgtggttg ggaacagctg 540 gaacagagcg gttatccggt tcagcgtctg gttgcactgt atctggcagc acgtctgagc 600 tggaatcagg ttgatcaggt tattcgtaat gcactggcaa gtccgggtag tggtggtgat 660 ctgggtgaag caattcgtga acagcctgaa caggcacgtc tggcactgac cctggcagca 720 gcagaaagcg aatatccgac cggtgcagaa tttctgggtg atggtggcgc agttagcttt 780 agtacccgtg gcacccagaa ttggaccgtt gaacgtctgc tgcaggcaca ccgtcagctg 840 gaagagggtg gttatgtttt tgttggttat catggcacct ttctggaagc agcacagagc 900 attgtgtttg gtggtgttcg tgcacgtagc caggatctgg atgcaatttg ggcaggtttc 960 tatattgccg gtgatccggc actggcctat ggttatgcac aggatcaaga accggatgca 1020 gcaggtcgta ttcgcaatgg tgcactgctg cgtgtttatg ttccgcgtag cagcctgcct 1080 ggtttttatg caaccagcct gacactggct gcaccggaag cagccggtga agtggaacgt 1140 ctgattggtc atccgctgcc gctgcgtctg gatgccatta ccggtccgga agaagcaggc 1200 ggtcgtctgg aaaccattct gggttggcct ctggcagaac gtaccgttgt tattccgagc 1260 gcaattccga ccgatccgcg taatgttggc ggagatctgg atccgagcag cattccggat 1320 gccgaagcag caattagcgc actgccggat tatgccagcc agcctggtaa accgcctaaa 1380 gatgaactg 1389 <210> 191 <211> 1425 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 191 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60 agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttctattaca tctacagcca gaccaacttc aaatttcgcg aagagattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacaaatggt gcagtatatc tataaataca ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggtggcat ctttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt cgtgagcgtt 420 accaatgaac gtctgcgtga tatgcatcat gaagcaagct tttttggtgc atttctggtg 480 ggtggtggtg gcggtagtgg cggtggtggt agccgtcatc gtcagcctcg tggttgggag 540 cagctgggag gtggtggttc aggcggtggc ggttcagaac agagcggtta tccggttcag 600 cgtctggttg cactgtatct ggcagcacgt ctgagctgga atcaggttga tcaggttatt 660 cgtaatgcac tggcaagtcc gggtagcggt ggtgatctgg gtgaagcaat tcgtgaacag 720 ccggaacagg cacgtctggc actgaccctg gcagcagcag aaagcgaata tccgaccggt 780 gcagaatttc tgggtgatgg tggtgcagtt agctttagta cccgtggcac ccagaattgg 840 accgttgaac gcctgctgca ggcacaccgt cagctggaag agggtggtta tgtttttgtt 900 ggttatcatg gcacctttct ggaagcagca cagagcattg tgtttggtgg tgttcgtgca 960 cgtagccagg atctggatgc aatttgggca ggtttctata ttgccggtga tccggcactg 1020 gcctatggtt atgcacagga tcaagaaccg gatgcagcag gtcgtattcg caatggtgca 1080 ctgctgcgtg tttatgttcc gcgtagcagc ctgcctggtt tttatgcaac cagcctgaca 1140 ctggctgcac cggaagcagc cggtgaagtg gaacgtctga ttggtcatcc gctgccgctg 1200 cgtctggatg ccattaccgg tccggaagaa gcaggcggtc gtctggaaac cattctgggt 1260 tggcctctgg cagaacgtac cgttgttatt ccgagcgcaa ttccgaccga tccgcgtaat 1320 gttggtggcg atctggatcc gagcagcatt ccggatgccg aagcagcaat tagcgcactg 1380 ccggattatg ccagccagcc tggtaaaccg cctaaagatg aactg 1425 <210> 192 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 192 cgtgttgcag cacatattac cggcacccgt ggtcgtagca ataccctgag cagcccgaat 60 agcaaaaatg aaaaagcact gggtcgcaaa attaacagct gggaaagcag ccgtagcggt 120 catagctttc tgagcaatct gcatctgcgt aatggtgaac tggtgattca tgaaaaaggc 180 ttctactata tctacagcca gacctatttt cgcttccaag aagagattaa agaaaacacc 240 aaaaacgata aacaaatggt gcagtacatc tataaataca ccagctatcc ggatccgatt 300 ctgctgatga aaagcgcacg taatagctgt tggagcaaag atgcagaata tggcctgtat 360 agcatttatc agggtggcat ctttgaactg aaagaaaacg atcgtatttt cgtgagcgtg 420 accaatgaac atctgatcga tatggatcat gaagccagct tttttggtgc atttctggtg 480 ggtggtggtg gtagcggtgg tggcggttca cgtcatcgtc agcctcgtgg ttgggagcag 540 ctgggtggcg gtggctcagg tgggggtggt tcagaacaga gcggttatcc ggttcagaaa 600 ctggttgcac tgtatctggc agcacgtctg agctggaatc aggttgatca ggttattcgt 660 aatgcactgg caagtccggg tagtggtggt gatctgggtg aagcaattcg tgaacagccg 720 gaacaggcac gtctggcact gaccctggca gcagcagaaa gcgaatatcc gaccggtgca 780 gaatttctgg gtgatggtgg cgcagttagc tttagtaccc gtggcaccca gaattggacc 840 gttgaacgtc tgctgcaggc acaccgtcag ctggaagagg gtggttatgt ttttgttggt 900 tatcatggca cctttctgga agcagcacag agcattgtgt ttggtggtgt tcgtgcacgt 960 agccaggatc tggatgcaat ttgggcaggt ttctatattg ccggtgatcc ggcactggcc 1020 tatggttatg cacaggatca agaaccggat gcagcaggtc gtattcgcaa tggtgcactg 1080 ctgcgtgttt atgttccgcg tagcagcctg cctggttttt atgcaaccag cctgacactg 1140 gctgcaccgg aagcagccgg tgaagtggaa cgtctgattg gtcatccgct gccgctgcgt 1200 ctggatgcca ttaccggtcc ggaagaagca ggcggtcgtc tggaaaccat tctgggttgg 1260 cctctggcag aacgtaccgt tgttattccg agcgcaattc cgaccgatcc gaaaaatgtt 1320 ggcggagatc tggatccgag cagcattccg gatgccgaag cagcaattag cgcactgccg 1380 gattatgcca gccagcctgg taaaccgcct aaagaagatc tg 1422 <210> 193 <211> 696 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> - <400> 193 aaactgcctc gtagcagcct ggtttggtgt gttctgattg tttgtctgac cctgctgatt 60 tttacctatc tgacccgtaa aagcctgtgc gaaattcgtt atcgtgatgg tcatcgtgaa 120 gttgcagcat ttatggccta tgaaagcggt aaaggtggtg gtggtagccg tgttgttcgt 180 ccgctgggtc tggcaggcgg tggtggcggt tcacgtgttg cagcacatat taccggcacc 240 cgtggtcgta gcaataccct gagcagcccg aatagcaaaa atgaaaaagc actgggtcgc 300 aaaattaaca gctgggaaag cagccgtagc ggtcatagct ttctgagcaa tctgcatctg 360 cgtaatggtg aactggtgat tcatgaaaaa ggcttctact atatctacag ccagacctat 420 tttcgcttcc aagaagagat taaagaaaac accaaaaacg ataaacaaat ggtgcagtac 480 atctataaat acaccagcta tccggatccg attctgctga tgaaaagcgc acgtaatagc 540 tgttggagca aagatgcaga atatggcctg tatagcattt atcagggtgg catctttgaa 600 ctgaaagaaa acgatcgtat tttcgtgagc gtgaccaatg aacatctgat cgatatggat 660 catgaagcca gcttttttgg tgcatttctg gtgggt 696 <210> 194 <211> 251 <212> PRT <213> Abrus precatorius <300> <308> genbank/CAA38655.1 <309> 2005-04-18 <313> (2)..(251) <400> 194 Glu Asp Arg Pro Ile Lys Phe Ser Thr Glu Gly Ala Thr Ser Gln Ser 1 5 10 15 Tyr Lys Gln Phe Ile Glu Ala Leu Arg Glu Arg Leu Arg Gly Gly Leu 20 25 30 Ile His Asp Ile Pro Val Leu Pro Asp Pro Thr Thr Leu Gln Glu Arg 35 40 45 Asn Arg Tyr Ile Thr Val Glu Leu Ser Asn Ser Asp Thr Glu Ser Ile 50 55 60 Glu Val Gly Ile Asp Ala Thr Asn Ala Tyr Val Val Ala Tyr Arg Ala 65 70 75 80 Gly Thr Gln Ser Tyr Phe Leu Arg Asp Ala Pro Ser Ser Ala Ser Asp 85 90 95 Tyr Leu Phe Thr Gly Thr Asp Gln His Ser Leu Pro Phe Tyr Gly Thr 100 105 110 Tyr Ala Asp Leu Glu Arg Trp Ala His Gln Ser Arg Gln Gln Ile Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Gln Ala Leu Thr His Gly Ile Ser Phe Phe Arg Ser Gly 130 135 140 Gly Asn Asp Asn Glu Glu Lys Ala Arg Thr Leu Ile Val Ile Ile Gln 145 150 155 160 Met Val Ala Glu Ala Ala Arg Phe Arg Tyr 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Natl. Acad. Sci. USA <304> 96 <306> 3957?962 <307> 1999-03-01 <400> 195 Glu Asp Asn Asn Ile Phe Pro Lys Gln Tyr Pro Ile Ile Asn Phe Thr 1 5 10 15 Thr Ala Gly Ala Thr Val Gln Ser Tyr Thr Asn Phe Ile Arg Ala Val 20 25 30 Arg Gly Arg Leu Thr Thr Gly Ala Asp Val Arg His Glu Ile Pro Val 35 40 45 Leu Pro Asn Arg Val Gly Leu Pro Ile Asn Gln Arg Phe Ile Leu Val 50 55 60 Glu Leu Ser Asn His Ala Glu Leu Ser Val Thr Leu Ala Thr Asn Ala 65 70 75 80 Tyr Val Val Gly Tyr Arg Ala Gly Asn Ser Ala Tyr Phe Phe His Pro 85 90 95 Asp Asn Gln Glu Asp Ala Glu Ala Ile Thr His Leu Phe Thr Asp Val 100 105 110 Gln Asn Arg Tyr Thr Phe Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Asp Arg Leu Glu 115 120 125 Gln Leu Ala Gly Ser Leu Arg Glu Asn Ile Glu Leu Gly Asn Gly Pro 130 135 140 Leu Glu Glu Ala Ile Ser Ala Leu Tyr Tyr Tyr Ser Thr Gly Gly Thr 145 150 155 160 Gln Leu Pro Thr Leu Ala Arg Ser Phe Ile Val Cys Ile Gln Met Ile 165 170 175 Ser Glu Ala Ala Arg Phe Gln Tyr Ile Glu Gly Glu Met Arg Thr Arg 180 185 190 Ile Arg Tyr Asn Arg Arg Ser Ala Pro Asp Pro Ser Val Ile Thr Leu 195 200 205 Glu Asn Ser Trp Gly Arg Leu Ser Thr Ala Ile Gln Glu Ser Asn Gln 210 215 220 Gly Ala Phe Ala Ser Pro Ile Gln Leu Gln Arg Arg Asn Gly Ser Lys 225 230 235 240 Phe Ser Val Tyr Asp Val Ser Ile Leu Ile Pro Ile Ile Ala Leu Met 245 250 255 Val Tyr Arg Cys Ala Pro Pro Pro 260 <210> 196 <211> 189 <212> PRT <213> Corynebacterium diphtheriae <400> 196 Gly Ala Asp Asp Val Ala Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn 1 5 10 15 Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Ala Asp Ser Ile Gln 20 25 30 Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp 35 40 45 Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly 50 55 60 Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val 65 70 75 80 Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val 85 90 95 Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu 100 105 110 Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly 115 120 125 Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser 130 135 140 Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser 145 150 155 160 Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp 165 170 175 Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn 180 185 <210> 197 <211> 186 <212> PRT <213> Corynebacterium diphtheriae <300> <301> Baluna et al. <302> - <303> Proc. Natl. Acad. Sci. USA <304> 96 <306> 3957?962 <307> 1999-03-01 <400> 197 Gly Ala Asp Asp Val Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser 1 5 10 15 Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Ala Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile 20 25 30 Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys 35 40 45 Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val 50 55 60 Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val 65 70 75 80 Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala 85 90 95 Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met 100 105 110 Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala 115 120 125 Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val 130 135 140 Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu 145 150 155 160 Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr 165 170 175 Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn 180 185 <210> 198 <211> 251 <212> PRT <213> Gelonium multiflorum <300> <301> Baluna et al. <303> Proc. Natl. Acad. Sci. USA <304> 96 <306> 3957?962 <307> 1999-03-01 <400> 198 Gly Leu Asp Thr Val Ser Phe Ser Thr Lys Gly Ala Thr Tyr Ile Thr 1 5 10 15 Tyr Val Asn Phe Leu Asn Glu Leu Arg Val Lys Leu Lys Pro Glu Gly 20 25 30 Asn Ser His Gly Ile Pro Leu Leu Arg Lys Lys Ala Asp Asp Pro Gly 35 40 45 Lys Ala Phe Val Leu Val Ala Leu Ser Asn Asp Asn Gly Gln Leu Ala 50 55 60 Glu Ile Ala Ile Asp Ala Thr Ser Val Tyr Val Val Gly Tyr Gln Val 65 70 75 80 Arg Asn Arg Ser Tyr Phe Phe Lys Asp Ala Pro Asp Ala Ala Tyr Glu 85 90 95 Gly Leu Phe Lys Asn Thr Ile Lys Thr Arg Leu His Phe Gly Gly Ser 100 105 110 Tyr Pro Ser Leu Glu Gly Glu Lys Ala Tyr Arg Glu Thr Thr Asp Leu 115 120 125 Gly Ile Glu Pro Leu Arg Ile Gly Ile Lys Lys Leu Asp Glu Asn Ala 130 135 140 Ile Asp Asn Tyr Lys Pro Thr Glu Ile Ala Ser Ser Leu Leu Val Val 145 150 155 160 Ile Gln Met Val Ser Glu Ala Ala Arg Phe Thr Phe Ile Glu Asn Gln 165 170 175 Ile Arg Asn Asn Phe Gln Gln Arg Ile Arg Pro Ala Asn Asn Thr Ile 180 185 190 Ser Leu Glu Asn Lys Trp Gly Lys Leu Ser Phe 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125 Leu Pro Ala Leu Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala 130 135 140 Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val Leu Ile Gln Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160 Ala Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln Gln Ile Gly Cys Gly Val Asp 165 170 175 Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp 180 185 190 Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln 195 200 205 Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asn Ala Gln Asn Gln Arg Val Thr 210 215 220 Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu 225 230 235 240 Leu Asn Arg Asn Asn Met Ala 245 <210> 200 <211> 247 <212> PRT <213> Trichosanthes kirilowii <400> 200 Asp Ala Ser Phe Arg Leu Ser Gly Ala Thr Ser Ser Ser Tyr Gly Val 1 5 10 15 Phe Ile Ser Asn Leu Arg Lys Ala Leu Pro Asn Glu Arg Lys Leu Tyr 20 25 30 Asp Ile Pro Leu Leu Arg Ser Ser Leu Pro Gly Ser Gln Arg Tyr Ala 35 40 45 Leu Ile His Leu Thr Asn Tyr Ala Asp Glu Thr Ile Ser Val Ala Ile 50 55 60 Asp Ala Thr Asn Val Tyr Ile Met Gly Tyr Arg Ala Gly Asp Thr Ser 65 70 75 80 Ala Cys Ser Asn Glu Ala Ser Ala Thr Glu Ala Ala Lys Tyr Val Phe 85 90 95 Lys Asp Ala Met Arg Lys Val Thr Leu Pro Tyr Ser Gly Asn Tyr Glu 100 105 110 Arg Leu Gln Thr Ala Ala Gly Lys Ile Arg Glu Asn Ile Pro Leu Gly 115 120 125 Leu Pro Ala Gly Asp Ser Ala Ile Thr Thr Leu Phe Tyr Tyr Asn Ala 130 135 140 Asn Ser Ala Ala Ser Ala Leu Met Val Leu Ile Gln Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160 Ala Ala Arg Tyr Lys Phe Ile Glu Gln Gln Ile Gly Cys Gly Val Asp 165 170 175 Lys Thr Phe Leu Pro Ser Leu Ala Ile Ile Ser Leu Glu Asn Ser Trp 180 185 190 Ser Ala Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ile Ala Ser Thr Asn Asn Gly Gln 195 200 205 Phe Glu Ser Pro Val Val Leu Ile Asn Ala Gln Asn Gln Arg Val Thr 210 215 220 Ile Thr Asn Val Asp Ala Gly Val Val Thr Ser Asn Ile Ala Leu Leu 225 230 235 240 Leu Asn Arg Asn Asn Met Ala 245 <210> 201 <211> 342 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 201 Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His 1 5 10 15 Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu 20 25 30 Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Lys Leu Val Ala Leu Tyr 35 40 45 Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Ala Asn 50 55 60 Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg 65 70 75 80 Glu Ser Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu 85 90 95 Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala 100 105 110 Ala Asn Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr 115 120 125 Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser 130 135 140 Thr Arg Gly Thr Gln Gln Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His 145 150 155 160 Arg Gln Leu Glu Glu Ala Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr 165 170 175 Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg 180 185 190 Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp 195 200 205 Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala 210 215 220 Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser 225 230 235 240 Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu 245 250 255 Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg 260 265 270 Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr 275 280 285 Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala 290 295 300 Ile Pro Thr Asp Pro Lys Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser 305 310 315 320 Ile Pro Asp Ser Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser 325 330 335 Gln Pro Gly Lys Pro Pro 340 <210> 202 <211> 225 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 202 Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Pro Thr Gly Ala Glu 1 5 10 15 Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln 20 25 30 Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu 35 40 45 Ala Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala 50 55 60 Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp 65 70 75 80 Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr 85 90 95 Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile Arg Asn 100 105 110 Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val 130 135 140 Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr 145 150 155 160 Gly Pro Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro 165 170 175 Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro 180 185 190 Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Ser Glu 195 200 205 Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro 210 215 220 Pro 225 <210> 203 <211> 226 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <300> <301> Onda M et al. <302> - <303> Proc Natl Acad Sci U S A. <304> 108 <305> 14 <306> 5742-7 <307> 2011-04-05 <400> 203 Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Tyr Pro Thr Gly Ala 1 5 10 15 Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Ala Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr 20 25 30 Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu 35 40 45 Glu Gly Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala 50 55 60 Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu 65 70 75 80 Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala 85 90 95 Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala Gly Arg Ile Arg 100 105 110 Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly 115 120 125 Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu 130 135 140 Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile 145 150 155 160 Thr Gly Pro Glu Glu Ala Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp 165 170 175 Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp 180 185 190 Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Ala 195 200 205 Glu Ala Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys 210 215 220 Pro Pro 225 <210> 204 <211> 279 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 204 Glu Gln Ser Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu 20 25 30 Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln 35 40 45 Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu 50 55 60 Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Ala Val Ser Phe 65 70 75 80 Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala 85 90 95 His Arg Gln Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly 100 105 110 Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala 115 120 125 Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly 130 135 140 Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala 145 150 155 160 Ala Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg 165 170 175 Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro 180 185 190 Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu 195 200 205 Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ala Gly Gly Arg Leu Glu 210 215 220 Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser 225 230 235 240 Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser 245 250 255 Ser Ile Pro Asp Ala Glu Ala Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala 260 265 270 Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro 275 <210> 205 <211> 279 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 205 Glu Gln Ser Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu 20 25 30 Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln 35 40 45 Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu 50 55 60 Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Ala Val Ser Phe 65 70 75 80 Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala 85 90 95 His Arg Gln Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly 100 105 110 Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala 115 120 125 Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly 130 135 140 Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala 145 150 155 160 Ala Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg 165 170 175 Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro 180 185 190 Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu 195 200 205 Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ala Gly Gly Arg Leu Glu 210 215 220 Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser 225 230 235 240 Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser 245 250 255 Ser Ile Pro Asp Ala Glu Ala Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala 260 265 270 Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro 275 <210> 206 <211> 214 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <300> <301> Weldon JE et al. <303> Blood <304> 113 <305> 16 <306> 3792-3800 <307> 2009-04-16 <400> 206 Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser 1 5 10 15 Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His 20 25 30 Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr 35 40 45 Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg 50 55 60 Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp 65 70 75 80 Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg 85 90 95 Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser 100 105 110 Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu 115 120 125 Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg 130 135 140 Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr 145 150 155 160 Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala 165 170 175 Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser 180 185 190 Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser 195 200 205 Gln Pro Gly Lys Pro Pro 210 <210> 207 <211> 279 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 207 Glu Gln Ser Gly Tyr Pro Val Gln Lys Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu 20 25 30 Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln 35 40 45 Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu 50 55 60 Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Ala Val Ser Phe 65 70 75 80 Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala 85 90 95 His Arg Gln Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly 100 105 110 Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala 115 120 125 Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly 130 135 140 Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala 145 150 155 160 Ala Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg 165 170 175 Ser Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro 180 185 190 Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu 195 200 205 Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ala Gly Gly Arg Leu Glu 210 215 220 Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser 225 230 235 240 Ala Ile Pro Thr Asp Pro Lys Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser 245 250 255 Ser Ile Pro Asp Ala Glu Ala Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala 260 265 270 Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro 275 <210> 208 <211> 51 <212> PRT <213> Salmonella typhi <300> <308> GenBank/1209200A <309> 1996-10-01 <313> (2)..(52) <400> 208 Lys Leu Pro Arg Ser Ser Leu Val Trp Cys Val Leu Ile Val Cys Leu 1 5 10 15 Thr Leu Leu Ile Phe Thr Tyr Leu Thr Arg Lys Ser Leu Cys Glu Ile 20 25 30 Arg Tyr Arg Asp Gly His Arg Glu Val Ala Ala Phe Met Ala Tyr Glu 35 40 45 Ser Gly Lys 50

Claims (41)

  1. - hTRAIL95보다 낮지 않은 위치에 있는 아미노산으로 개시하는, 가용성 hTRAIL 단백질 서열의 기능적 단편이거나, 70% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 85%의 서열 동일성을 가지며 아미노산 hTRAIL281로 종결하는 상기 기능적 단편의 동족체인 도메인 (a), 및
    - 단백질 합성을 억제하는 효과기 펩타이드의 서열인 하나 이상의 도메인 (b)
    를 포함하는 융합 단백질로서,
    상기 도메인 (b)의 서열은 상기 도메인 (a)의 C-말단 및/또는 N-말단에 부착되어 있고,
    상기 융합 단백질은 세포 표면 상의 탄수화물 수용체에 결합하는 도메인을 함유하지 않는 것인, 융합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 도메인 (a)는 hTRAIL95 내지 hTRAIL121 범위의 아미노산으로 개시하고, 아미노산 281로 종결하는 가용성 hTRAIL 단백질 서열의 단편을 포함하는 것인, 융합 단백질.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 도메인 (a)는 hTRAIL95-281, hTRAIL114-281, hTRAIL116-281, hTRAIL119-281, hTRAIL120-281 및 hTRAIL121-281로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 (a)는 DR4 및/또는 DR5 수용체에 대하여 변형된 친화성을 갖는 hTRAIL의 상기 기능적 단편의 동족체인, 융합 단백질.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 동족체는 서열 번호 142 및 서열 번호 143으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 (b)의 상기 효과기 펩타이드는 리보솜의 수준에서 단백질 해독을 효소적으로 억제하는 펩타이드인, 융합 단백질.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 효과기 펩타이드는 N-글리코시다제의 효소 활성을 갖는 펩타이드인, 융합 단백질.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 효과기 펩타이드는 리보솜을 불활성화하는 단백질 독소 RIP 유형 1 및 리보솜을 불활성화하는 단백질 독소의 촉매 서브유닛 A RIP 유형 2, 또는 본래의 서열과 85% 이상의 서열 동일성의 보존된 N-글리코시다제 활성을 가지는 이들의 변형물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 효과기 펩타이드는 겔로닌 (겔로니움 멀티플로 룸: Gelonium multiflorum 유래), 돌연변이형 겔로닌, 모모르딘, 사포린, 브리오딘 I, 도데칸드린, 부가닌 (부가인빌레아 스펙타빌리스: Bougainvillea spectabilis 유래) 및 미국자리공 (파이토라카 아메리카나: Phytolacca Americana) 유래의 PAP 단백질을 포함하는 RIP 유형 1 독소의 군으로부터 선택되거나, 리신의 서브유닛 A, 돌연변이형 리신 변이체, 아브린 (아브루스 프레카 트리우스: Abbrus precatrius 유래), 돌연변이형 아브린 변이체, 모데신 (아데 니아 디지타타: Adenia digitata 유래), 비스쿠민 (비스쿰 알붐: Viscum album 유래의 독소 MLI), 볼켄신 (아데니아 볼켄시이: Adenia volkensii 유래), 시가 독소 (시겔라 다이센테리애: Shigella dysenteriae 유래), 트리코산틴 및 돌연변이형 트리코산틴 변이체를 포함하는 RIP 유형 2 독소의 촉매 서브유닛의 군으로부터 선택되거나, 본래의 서열과 85% 이상의 서열 동일성의 보존된 N-글리코시다제 활성을 가지는 이들의 변형물의 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  10. 청구항 7 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효과기 펩타이드는 서열 번호 55, 서열 번호 56, 서열 번호 57, 서열 번호 58, 서열 번호 59, 서열 번호 60, 서열 번호 61, 서열 번호 62, 서열 번호 63, 서열 번호 64, 서열 번호 65, 서열 번호 66, 서열 번호 67, 서열 번호 70, 서열 번호 78, 서열 번호 82, 서열 번호 194, 서열 번호 195, 서열 번호 198, 서열 번호 199 및 서열 번호 200으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  11. 청구항 6에 있어서, 상기 효과기 펩타이드는 리보뉴클레아제 효소 활성을 가지는 펩타이드인, 융합 단백질.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 효과기 펩타이드는 단백질 독소인 알파-사크린, 미토질린, 히르수텔린 (히르수텔라 톰소니이: Hirsutella thompsonii 유래), 레스트릭토신 (아스퍼질루스 레스트릭투스: Aspergillus restrictus 유래) 및 본래의 서열과 85% 이상의 서열 동일성의 보존된 리보뉴클레아제 활성을 가지는 이들의 변형물로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 효과기 펩타이드는 서열 번호 71 및 서열 번호 72로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  14. 청구항 6에 있어서, 상기 효과기 펩타이드는 ADP-리보실트랜스퍼라제의 효소 활성을 가지는 것인, 융합 단백질.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 효과기 펩타이드는 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)의 촉매 서브유닛 A 또는 슈도모나스 아에루기노사 독소의 돌연변이형 촉매 서브유닛 A 및 코리네박테리움 디프테리애 (Corynebacterium diphteriae)의 디프테리아 독소 또는 코리네박테리움 디프테리애의 돌연변이형 디프테리아 독소 및 본래의 서열과 85% 이상의 서열 동일성의 보존된 ADP-리보실트랜스퍼라제 활성을 가지는 이들의 변형물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 효과기 펩타이드는 서열 번호 79, 서열 번호 80, 서열 번호 81, 서열 번호 83, 서열 번호 84, 서열 번호 196, 서열 번호 197, 서열 번호 201, 서열 번호 202, 서열 번호 203, 서열 번호 204, 서열 번호 205, 서열 번호 206 및 서열 번호 207로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  17. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 (b)의 효과기 펩타이드는 독소-항독소 시스템에 속하는 단백질 합성을 억제하는 독소인, 융합 단백질.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 효과기 펩타이드는 토포아이소머라제 활성, mRNAse 활성 또는 세포막과의 결합을 가지는 펩타이드인, 융합 단백질.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 효과기 펩타이드는 서열 번호 74의 CcdB 단백질, 서열 번호 75의 CcdB 단백질, 서열 번호 73의 Kid 단백질, 서열 번호 76의 RelE 단백질, 서열 번호 77의 StaB 단백질, 서열 번호 208의 Hok 단백질 및 본래의 서열과 85% 이상의 서열 동일성의 보존된 토포아이소머라제 활성, mRNAse 활성 또는 세포막과의 결합 활성을 가지는 이들의 변형물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  20. 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 (a)와 상기 도메인 (b) 사이에 또는 상기 도메인 (b) 사이에 프로테아제 절단 부위를 함유하는 도메인 (c)를 함유하는, 융합 단백질.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 도메인 (c)는 종양 환경에 존재하는 프로테아제에 의해 인식되는 프로테아제 절단 부위를 함유하는 것인, 융합 단백질.
  22. 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도메인 (b)의 효과기 펩타이드는
    - 서열 번호 139의 슈도모나스 유래하는, 세포막을 통해 운반하는 도메인 (d1);
    - Lys　Asp　Glu　Leu/KDEL, His　Asp　Glu　Leu/HDEL, Arg　Asp　Glu　Leu/RDEL, Asp　Asp　Glu　Leu/DDEL, Ala　Asp　Glu　Leu/ADEL, Ser　Asp　Glu　Leu/SDEL 및 Glu　Asp　Leu/KEDL로부터 선택된 소포체로 유도하는, 상기 세포막을 통해 운반하는 도메인 (d2);
    - 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 Arg 잔기로 이루어진, 상기 세포막을 통해 운반하는 폴리아르기닌 서열 (d3); 및
    이들의 조합
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 운반 도메인 (d)와 더 연결되어 있고,
    상기 운반 도메인 (d)는 상기 도메인 (b)의 효과기 펩타이드의 C-말단 및/또는 N-말단에 위치되어 있는 것인, 융합 단백질.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 운반 도메인 (d)는 상기 도메인 (b)와 도메인 (c) 사이에, 상기 도메인 (a)와 도메인 (c) 사이에, 또는 2개의 도메인 (c) 사이에 위치되어 있는 것인, 융합 단백질.
  24. 청구항 22에 있어서, 상기 서열 (d)는 상기 융합 단백질의 C-말단에 위치되어 있는 것인, 융합 단백질.
  25. 청구항 20 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 도메인 (a), 상기 도메인 (b), 상기 도메인 (c) 및/또는 상기 도메인 (d) 사이에 가요성 입체 링커를 더 포함하는 것인, 융합 단백질.
  26. 청구항 25에 있어서, 상기 입체 링커는 Gly　Gly　Gly　Gly　Ser/GGGGS, Gly　Gly　Gly　Ser/GGGS, Gly　Gly　Gly/GGG, Gly　Gly　Gly　Gly/GGGG, Ala　Ser　Gly　Gly/ASGG, Ala　Ser　Gly/ASG, Gly　Gly　Gly　Ser　Gly/GGGSG, Gly　Gly　Gly/GGG, Gly　Gly　Gly　Ser　Ala　Ser　Gly　Gly/GGGSASGG, Ser　His　His Ser/SHHS, CAAACAAC (Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Cys), CAACAAAC (Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Cys) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  27. 청구항 20 내지 청구항 26 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 도메인 (a), 상기 도메인 (b) 및/또는 상기 도메인 (c) 사이에 Ala　Ser　Gly　Cys　Gly　Pro　Glu/ASGCGPE, Ala　Ala　Cys　Ala　Ala/AACAA, Ser　Gly　Gly　Cys　Gly　Gly　Ser/SGGCGGS 또는 Ser　Gly　Cys　Gly　Ser/SGCGS로부터 선택된, PEG 분자의 부착을 위한 링커인 도메인 (e)를 함유하는 것인, 융합 단백질.
  28. 청구항 20 내지 청구항 27 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 상기 도메인 (b)와 상기 도메인 (c) 사이에 Asn　Gly　Arg/NGR, Asp　Gly　Arg/DGR 또는 Arg　Gly　Asp/RGD로 이루어진 군으로부터 선택된 인테그린과 결합하는 모티브를 더 함유하는 것인, 융합 단백질.
  29. 청구항 1에 있어서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 서열 번호 22, 서열 번호 23, 서열 번호 24, 서열 번호 25, 서열 번호 26, 서열 번호 27, 서열 번호 28, 서열 번호 29, 서열 번호 30, 서열 번호 31, 서열 번호 32, 서열 번호 33, 서열 번호 34, 서열 번호 35, 서열 번호 36, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47, 서열 번호 48, 서열 번호 49, 서열 번호 50, 서열 번호 51, 서열 번호 52, 서열 번호 53. 서열 번호 54, 서열 번호 144, 서열 번호 145, 서열 번호 146, 서열 번호 147, 서열 번호 148, 서열 번호 149, 서열 번호 150, 서열 번호 151, 서열 번호 152, 서열 번호 153, 서열 번호 154, 서열 번호 155, 서열 번호 156, 서열 번호 157, 서열 번호 158, 서열 번호 159, 서열 번호 160, 서열 번호 161, 서열 번호 162, 서열 번호 163, 서열 번호 164, 서열 번호 165, 서열 번호 166, 서열 번호 167 및 서열 번호 168로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 것인, 융합 단백질.
  30. 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 재조합 단백질인, 융합 단백질.
  31. 청구항 1 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 대장균(E. coli)에서의 유전자 발현에 최적화되어 있는 것인, 폴리뉴클레오타이드 서열.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열 번호 85, 서열 번호 86, 서열 번호 87, 서열 번호 88, 서열 번호 89, 서열 번호 90, 서열 번호 91, 서열 번호 92, 서열 번호 93, 서열 번호 94, 서열 번호 95, 서열 번호 96, 서열 번호 97, 서열 번호 98, 서열 번호 99, 서열 번호 100, 서열 번호 101, 서열 번호 102, 서열 번호 103, 서열 번호 104, 서열 번호 105, 서열 번호 106, 서열 번호 107, 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 110, 서열 번호 111, 서열 번호 111, 서열 번호 113, 서열 번호 114, 서열 번호 115, 서열 번호 116, 서열 번호 117, 서열 번호 118, 서열 번호 119, 서열 번호 120, 서열 번호 121, 서열 번호 122, 서열 번호 123, 서열 번호 124, 서열 번호 125, 서열 번호 126, 서열 번호 127, 서열 번호 128, 서열 번호 129, 서열 번호 130, 서열 번호 131, 서열 번호 132, 서열 번호 133, 서열 번호 134, 서열 번호 135, 서열 번호 136, 서열 번호 137, 서열 번호 138, 서열 번호169, 서열 번호 170, 서열 번호 171, 서열 번호 172, 서열 번호 173, 서열 번호 174, 서열 번호 175, 서열 번호 176, 서열 번호 177, 서열 번호 178, 서열 번호 179, 서열 번호 180, 서열 번호 181, 서열 번호 182, 서열 번호 183, 서열 번호 184, 서열 번호 185, 서열 번호 186, 서열 번호 187, 서열 번호 188, 서열 번호 189, 서열 번호 190, 서열 번호 191, 서열 번호 192 및 서열 번호 193으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 폴리뉴클레오타이드 서열.
  34. 청구항 31 내지 청구항 33 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  35. 청구항 34에 기재된 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 숙주 세포는 대장균 세포인, 숙주 세포.
  37. 활성 성분으로서의 청구항 1 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  38. 청구항 37에 있어서, 상기 약학적 조성물은 비경구 투여를 위한 형태인, 약학적 조성물.
  39. 청구항 1 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 인간을 포함한 포유동물에서 신생물성 질환의 치료에 사용하기 위한 것인, 융합 단백질.
  40. 인간을 포함한 포유동물에서 암 질환의 치료 방법으로서,
    상기 치료 방법은 청구항 1 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질이나 청구항 37 또는 청구항 38에 기재된 약학적 조성물을 항신생물성 유효량으로 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 암 질환의 치료 방법.
  41. 서열 번호 200의 트리코산틴의 돌연변이형 변이체, 서열 번호 201의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체, 서열 번호 202의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체, 서열 번호 204의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체, 서열 번호 205의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체 및 서열 번호 207의 슈도모나스 아에루기노사 독소의 촉매 서브유닛 A의 돌연변이형 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드.
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