KR20140131925A

KR20140131925A - 자가 암 세포 백신

Info

Publication number: KR20140131925A
Application number: KR1020147023098A
Authority: KR
Inventors: 페르난도 토메 크뤠츠
Original assignee: 페르난도 토메 크뤠츠
Priority date: 2012-01-20
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2014-11-14
Anticipated expiration: 2033-01-18
Also published as: EP2804626B1; US20160228524A1; EP2804626A1; BR112014017819A8; AU2013210783A2; CN104136040B; AU2013210783B2; JP2015509002A; EP3536340A1; EP3536340B1; CN104136040A; EP3536340B8; BR112014017819B1; US20130189310A1; HK1203817A1; JP6385280B2; CA2861565A1; BR112014017819A2; EP2804626A4; KR102047323B1

Abstract

세포 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현하는 암 세포를 포함하는 자가 암 세포 백신에 관한 것이다. MHC I은 암 항원을 제시하며, MHC II는 비-자기 항원을 제시한다. 일 측면에서, 개체로부터 분리된 암 세포 상에서 MHC II의 발현을 유도하는 단계; 상기 암 세포를 비-자기 항원과 인큐베이션하여, 상기 비-자기 항원을 발현된 MHC II에 결합시키는 단계; 및 상기 암 세포를 사멸시키는 단계를 포함하는, 분리된 면역원성 암 세포의 제조 방법을 제공한다.

Description

자가 암 세포 백신 {AUTOLOGOUS CANCER CELL VACCINE}

본 발명은 암 치료에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은, 여러 측면들에서, 분리되고 변형된 면역원성 암 세포, 상기 면역원성 암 세포를 포함하는 면역원성 조성물 및 백신, 암의 치료 방법 뿐만 아니라 상기 면역원성 암 세포, 면역원성 조성물 및 백신의 제조 방법에 관한 것이다.

주 조직적합성 복합체 (MHC)는 모든 척추 동물들에서 대규모 유전자 패밀리에 의해 코딩되는 세포 표면 분자이다. MHC 유전자 패밀리는 3가지 클래스, 클래스 I, 클래스 II 및 클래스 III로 분류된다.

MHC 클래스 I 분자는 신체의 모든 유핵 세포들에서 발견된다. 그 기능은 세포질 단백질의 단편들을 세포 안으로부터 세포독성 T 세포에 제시하는 것이다. "자기" 펩타이드를 제시하는 세포는 무시되지만, 자신의 것이 아닌 펩타이드를 제시하는 세포는 세포독성 T 세포에 의해 인지되어 사멸되게 된다.

MHC 클래스 II 분자는 대식세포, 수지상 세포 및 B 세포를 비롯한 항원 제시 세포 (APC)들에서만 발견된다. MHC 클래스 II 분자는 세포외 단백질의 단편을 헬퍼 T 세포에게 제시한다. "자기" 펩타이드를 제시하는 세포는 무시되지만, 자신의 것이 아닌 펩타이드를 제시하는 세포는 헬퍼 T 세포에 의해 인지되게 되고, 이 헬퍼 T 세포는 주로 다양한 사이토카인을 생산함으로써, 식균세포의 동원으로 인한 국소 염증과 부어오름 또는 B 세포의 활성화로 인한 항체 매개 면역 반응 등의, 적절한 면역 반응의 촉발에 일조하게 될 것이다.

예를 들어, 국제 특허 출원 공개공보 WO 1995/13092, 국제 특허 출원 공개공보 WO 2001/77301 및 Berger et al. (J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 10(2):144-152, 2007)을 통해, 인터페론 (IFN)을 이용하여 종양 세포 상의 MHC 클래스 I의 발현을 증가시킴으로써, 세포를 암 백신으로 사용할 수 있다는 것이 공지되었다. 하지만, IFN을 처리한 후 종양 세포에서의 MHC II 발현은 매우 다양하여, 일부 세포는 IFN 처리에 반응을 나타내는 반면, 일부는 IFN 처리에 반응하지 않는다. 아울러, MHC II를 발현하는 모든 종양 세포들은 MHC I 및 MCH II에 자신의 것 또는 암 항원만 제시할 수 있다. 암 항원은 다수가 자기 항원으로 인지되기 때문에, 면역원성이 일정하지 않다. 이는 특히, 암이 발병하여 점점 공격적으로 됨에 따라 더욱 그러하다. MHC II에 고 면역원성의 항원이 제시되지 못한다는 것은, T 헬퍼 세포가 활성화되지 못하며, 종래의 암 백신에 의해서는 강력하고 활발한 면역 반응이 일관성있게 일어나지 못한다는 것을 의미한다.

이에, 종래의 문제점들을 적어도 일부 해소 또는 줄이기 위한 대안적인 치료법들이 요구되고 있다.

본 발명은 분리된 면역원성 암 세포, 면역원성 암 세포를 이용한 면역원성 조성물과 암 백신, 상기한 면역원성 암 세포, 면역원성 조성물 및 암 백신의 제조 방법, 및 암 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은, 세포 표면에 MHC II를 발현하도록 변형된 분리된 암 세포의 사용을 수반한다. 이러한 암 세포가 MHC II를 발현하도록 변형되면, MHC II-발현 세포를 비-자기 (non-self) 항원과 인큐베이션함으로써, 이들 세포는 면역원성을 갖게 된다. 이 세포가 분리되어 나온 개체에 주입하게 되면, 상기한 방식으로 변형된 암 세포는 암 항원을 MHC I을 통해 CD8⁺ 세포독성 T 세포에게 제시하게 되며, 비-자기 항원을 MHC II를 통해 CD4⁺ 헬퍼 T 세포에게 제시하게 될 것이다. 즉, 변형된 암 세포는 2가지 기능을 가지고 있어, 헬퍼 T 세포와 세포독성 T 세포 둘다를 활성화시킬 수 있으며, 이로써 사이토카인의 생산과 놀라운 정도로 강력한 암-특이적인 면역반응을 유발할 수 있다.

이러한 방식으로 제조된 면역원성 암 세포는 면역원성 조성물과 백신에 도입될 수 있다. 이들 조성물과 백신은 자가 개체에서 암을 치료하는 방법에 유용하다.

일 측면에서, 하기 단계를 포함하는 분리된 면역원성 암 세포의 제조 방법을 제공한다:

- 개체로부터 분리된 암 세포 상에서 MHC II의 발현을 유도하는 단계;

- 상기 암 세포를 비-자기 항원과 인큐베이션하여, 상기 비-자기 항원을 발현된 MHC II에 결합시키는 단계; 및

- 상기 암 세포를 사멸시키는 단계.

일 측면에서, 본 방법은 MHC II 유도 후 MHC II-양성 세포를 동정하는 단계를 더 포함한다. 다른 측면에서, 본 방법은 MHC II-양성 암 세포를 MHC II-음성 암 세포로부터 분리하여, MHC II-양성 세포를 함유한 정제된 조성물을 수득하는 단계를 더 포함한다.

다른 측면에서, 본 방법은 개체로부터 상기 암 세포를 분리하는 단계를 더 포함한다. 일 측면에서, 상기 세포는 생체검사 중에 또는 외과적 종양 제거 중에 분리된다.

다른 측면에서, 본 방법은 상기 암 세포를 냉동-보존하는 단계를 더 포함한다.

일 측면에서, 상기 세포는 치사 수준의 방사선 조사, 냉동 보존제 사용없이 동결과 해동, 또는 세포 독성 화합물의 처리에 의해, 예를 들어 치사 수준의 방사선 조사에 의해 사멸된다.

다른 측면에서, 상기 MHC II는 MHC II-유도제를 이용하여 상기 암 세포 상에서 유도된다. 일 측면에서, 상기 MHC II-유도제는 사이토카인, 예컨대 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-4, IL-13, IL-23, TNF-α, 또는 이들의 조합, 예를 들어, IFN-γ이다. 다른 측면에서, 상기 MHC II-유도제는 MHC II 발현 구조체 또는 상기 암 세포와 융합시킬 MHC II-발현 세포이다.

다른 측면에서, 상기 비-자기 항원은 비-인간 항원이다.

다른 측면에서, 비-자기 항원은 티로글로불린, β-갈락토시다제, 덱스트란, 폴리라이신, 투베르쿨린 유래 단백질, 오브알부민 (OVA), 소 혈청 알부민 (BSA), 양 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민 또는 어류 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 이들의 조합으로부터 선택되며, 예컨대 오브알부민 또는 KLH이거나, 예컨대 BSA이다.

다른 측면에서, 상기 비-자기 항원은 BSA와 같은 소 항원이 아니다.

다른 측면에서, 상기 유도 단계는 BSA 무첨가 배지에서 이루어진다.

다른 측면에서, 세포의 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현하는 분리된 면역원성 암 세포로서, 상기 MHC I에는 암 항원이 결합하고, 상기 MHC II에는 비-자기 항원이 결합하는, 면역원성 암 세포를 제공한다.

일 측면에서, 상기 비-자기 항원은 비-인간 항원이다.

다른 측면에서, 상기 비-자기 항원은 티로글로불린, β-갈락토시다제, 덱스트란, 폴리라이신, 투베르쿨린 유래 단백질, 오브알부민 (OVA), 소 혈청 알부민 (BSA), 양 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민 또는 어류 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 이들의 조합으로부터 선택되며, 예컨대 비-자기 항원은 오브알부민 또는 KLH이거나, 예로, BSA이다.

다른 측면에서, 세포의 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현하는 분리된 면역원성 암 세포를 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 MHC I에는 암 항원이 결합하고, 상기 MHC II에는 비-자기 항원이 결합하는, 면역원성 조성물을 제공한다.

일 측면에서, 상기 조성물은 하나 이상의 부형제, 담체, 완충제, 안정제, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.

다른 측면에서, 상기 비-자기 항원은 비-인간 항원이다.

다른 측면에서, 상기 비-자기 항원은 티로글로불린, β-갈락토시다제, 덱스트란, 폴리라이신, 투베르쿨린 유래 단백질, 오브알부민 (OVA), 소 혈청 알부민 (BSA), 양 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민 또는 어류 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 이들의 조합으로부터 선택되며, 예컨대 오브알부민 또는 KLH이거나, 예로, BSA이다.

다른 측면에서, 상기 조성물은, 상기 조성물에서 총 세포 수를 기준으로 MHC II-양성 암 세포를 약 5% - 약 100%로, 예컨대, MHC II-양성 암 세포를 약 50% 이상으로, MHC II-양성 암 세포를 약 90% 이상으로, 또는 MHC II-양성 암 세포를 약 99% 이상으로 포함한다.

다른 측면에서, 세포의 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현하는 분리된 면역원성 암 세포를 포함하는 자가 암 백신으로서, 상기 MHC I에는 암 항원이 결합하고, 상기 MHC II에는 비-자기 항원이 결합하는, 자가 암 백신을 제공한다.

일 측면에서, 상기 백신은 하나 이상의 보강제, 예를 들어 모노포스포릴 리피드 A/합성 트레할로스 다이코리노마이콜레이트 (MPL-TDM), AS021/AS02, 비이온성 블록 코폴리머 보강제, CRL 1005, 알루미늄 포스페이트 (AlPO₄), R-848, 이미퀴모드, PAM3CYS, 폴리 (I:C), 록소리빈, 바실 칼메테-구에린 (BCG), 코리네박테리움 파르붐, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), 콜레라 독소 유래 항원, CTA 1-DD, 리포폴리사카라이드 보강제, 프로인트 완전 보강제, 프로인트 불완전 보강제, 사포닌, 미네랄 겔, 알루미늄 하이드록사이드, 표면 활성 물질, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩타이드, 수중 오일 또는 탄화수소 에멀젼, MF59, Montanide ISA 720, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 다이니트로페놀 및 이들의 조합, 예컨대 BCG를 더 포함한다.

다른 측면에서, 상기 백신은 하나 이상의 부형제, 담체, 완충제, 안정제, 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.

일 측면에서, 상기 비-자기 항원은 비-인간 항원이다.

다른 측면에서, 상기 백신은 백신내 총 세포 수를 기준으로 MHC II-양성 암 세포를 약 5% - 약 100%로, 예컨대, MHC II-양성 암 세포를 약 50% 이상으로, MHC II-양성 암 세포를 약 90% 이상으로, 또는 MHC II-양성 암 세포를 약 99% 이상으로 포함한다.

다른 측면에서, 상기 백신은 다회 접종을 위해 분할 투여 (divided doses)로, 예를 들어 7회 분할 투여로 제공된다.

일 측면에서, 각 투여량은 암 세포 약 1 x 10⁴ - 약 1 x 10⁹개, 예를 들어 약 1 x 10⁷개의 암 세포를 포함한다.

다른 측면에서, 분리된 면역원성 암 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공하며, 상기 세포는 상기 개체의 것이며, 세포 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현하며, 상기 MHC I에는 암 항원이 결합하고, 상기 MHC II에는 비-자기 항원이 결합한다.

일 측면에서, 세포는 면역원성 조성물로서 제형화된다. 다른 측면에서, 세포는 암 백신으로서 제형화된다.

다른 측면에서, 상기 비-자기 항원은 비-인간 항원이다.

일 측면에서, 비-자기 항원은 BSA와 같은 소 항원이 아니다.

다른 측면에서, 투여되는 세포의 총 수를 기준으로 투여되는 상기 암 세포의 약 5% - 약 100%가 MHC II-양성 암 세포이며, 예를 들어, 투여되는 상기 암 세포의 약 50% 이상이 MHC II-양성 암 세포이거나, 투여되는 상기 암 세포의 약 90% 이상이 MHC II-양성 암 세포이거나, 또는 투여되는 상기 암 세포의 약 99% 이상이 MHC II-양성 암 세포이다.

일 측면에서, 세포는 통상적인 화학요법, 방사선치료, 호르몬치료 및 바이오테라피 중 한가지 이상과 동시에 또는 순차적으로 투여된다.

다른 측면에서, 상기 세포는 외과적 종양 절제 이전 또는 이후에 투여된다.

다른 측면에서, 상기 세포는 다회 투약 (multiple doses)으로 투여된다

일 측면에서, 상기 세포는 소정의 수 주간 동안 매주 투여된다. 다른 측면에서, 상기 세포는 진행 중인 유지 요법으로서 투여된다.

일 측면에서, 상기 세포는 매주, 매달, 3달 마다, 6달 마다, 매해 또는 이들의 조합으로 투여된다.

다른 측면에서, 상기 세포는 암 재발 신호가 관찰될 때 투여된다.

다른 측면에서, 암을 치료하기 위한 자가 유래의 분리된 면역원성 암 세포의 용도를 제공하며, 상기 세포는 세포 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현하며, 상기 MHC I에는 암 항원이 결합하고, 상기 MHC II에는 비-자기 항원이 결합한다.

일 측면에서, 상기 세포는 면역원성 조성물로서 또는 암 백신으로서 제형화된다.

다른 측면에서, 상기 비-자기 항원은 비-인간 항원이다.

다른 측면에서, 상기 용도는 총 세포 수를 기준으로 MHC II-양성 암 세포를 약 5% - 약 100%로, 예컨대, MHC II-양성 암 세포를 약 50% 이상으로, MHC II-양성 암 세포를 약 90% 이상으로, 또는 MHC II-양성 암 세포를 약 99% 이상으로 사용하는 것을 포함한다

일 측면에서, 상기 세포는 통상적인 화학요법, 방사선치료, 호르몬치료 및 바이오테라피 중 한가지 이상과 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 것이다.

다른 측면에서, 상기 세포는 외과적 종양 절제 이전 또는 이후에 사용하기 위한 것이다.

다른 측면에서, 상기 세포는 다회 투약 (multiple doses)으로 사용하기 위한 것이다.

일 측면에서, 상기 세포는 소정의 수 주간 매주 사용하기 위한 것이거나, 또는 진행 중인 유지 요법으로서 사용하기 위한 것이다.

다른 측면에서, 상기 세포는 매주, 매달, 3달 마다, 6달 마다, 매해 또는 이들의 조합으로 사용하기 위한 것이다.

다른 측면에서, 상기 세포는 암 재발 신호가 관찰될 때 사용하기 위한 것이다.

다른 측면에서, 환자가 분리된 면역원성 암 세포를 이용한 치료에 대해 환자의 적격성 여부를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은

- 개체로부터 유래된 분리된 암 세포에 MHC II-유도제를 처리하는 단계; 및

- 상기 암 세포를 스크리닝하여, 발현된 MHC II의 존재를 확인하는 단계를 포함하며,

상기 암 세포 상에 발현된 MHC II의 존재는 상기 환자가 상기한 치료에 적격임을 의미한다.

일 측면에서, 상기 방법은 개체로부터 상기 암 세포를 분리하는 단계를 더 포함한다.

다른 측면에서, 상기 세포는 생체검사 중에 또는 외과적 종양 제거 중에 분리된다.

다른 측면에서, 상기 MHC II-유도제는 사이토카인, 예를 들어 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-4, IL-13, IL-23, TNF-α, 또는 이들의 조합이며, 예컨대 IFN-γ이다.

다른 측면에서, MHC II-유도제는 MHC II 발현 구조체 또는 상기 암 세포와 융합시킬 MHC II-발현 세포이다.

다른 측면에서, 암에 걸린 개체를 면역화하기 위한 암 백신을 제공하며, 상기 암 백신은 상기 개체 자신으로부터 유래된 분리된 면역원성 암 세포를 포함하며, 상기 암 세포는 MHC II-유도제로 처리한 다음 비-자기 항원과 인큐베이션함으로써, 세포 표면 상에 MHC II에서 상기 비-자기 항원을 제시하도록 변형된 것이며, 상기 암 백신은 MHC II-발현 세포를 증가된 농도로 포함하도록 정제된 것이다.

다른 측면에서,

- 상기 암 세포로부터 비-자기 항원이 결합된 MHC II를 추출하는 단계를 포함하는 면역원성 추출물의 제조 방법을 제공한다.

일 측면에서, 상기 면역원성 추출물은 막 분획 (membrane fraction)이다. 다른 측면에서, 상기 면역원성 추출물은 정제된 MHC II를 포함한다.

다른 측면에서, 상기 방법은 MHC II를 유도한 후 MHC II-양성 세포를 동정하는 단계를 더 포함한다.

다른 측면에서, 상기 방법은 MHC II-양성 암 세포를 MHC II-음성 암 세포로부터 분리하여, MHC II-양성 세포를 함유한 정제된 조성물을 수득하는 단계를 더 포함한다.

다른 측면에서, 상기 방법은 개체로부터 상기 암 세포를 분리하는 단계를 더 포함한다. 일 측면에서, 상기 세포는 생체검사 중에 또는 외과적 종양 제거 중에 분리된다.

다른 측면에서, 상기 방법은 상기 암 세포를 냉동-보존하는 단계를 더 포함한다.

다른 측면에서, 상기 세포는 치사 수준의 방사선 조사, 냉동 보존제 사용없이 동결 및 해동, 또는 세포 독성 화합물의 처리에 의해, 예를 들어 치사 수준의 방사선 조사에 의해 사멸된다.

다른 측면에서, 상기 MHC II는 MHC II-유도제, 예를 들어 사이토카인, 예컨대, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-4, IL-13, IL-23, TNF-α 또는 이들의 조합, 예로, IFN-γ를 이용하여 상기 암 세포 상에서 유도된다.

다른 측면에서, 상기 비-자기 항원은 비-인간 항원이다.

일 측면에서, 상기 비-자기 항원은 티로글로불린, β-갈락토시다제, 덱스트란, 폴리라이신, 투베르쿨린 유래 단백질, 오브알부민 (OVA), 소 혈청 알부민 (BSA), 양 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민 또는 어류 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 이들의 조합으로부터 선택되며, 예컨대 오브알부민 또는 KLH이거나, 예로, BSA이다.

다른 측면에서, 본원에 기술된 세포의 면역원성 추출물로서, 상기 추출물이 상기 세포로부터 유래된 비-자기 항원이 결합된 MHC II를 포함하는 면역원성 추출물을 제공한다.

일 측면에서, 상기 추출물은 막 분획 (membrane fraction)이다. 다른 측면에서, 상기 추출물은 정제된 MHC II를 포함한다.

다른 측면에서, 본원에 기술된 추출물을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

다른 측면에서, 본원에 기술된 추출물을 포함하는 자가 암 백신을 제공한다.

일 측면에서, 상기 백신은 하나 이상의 보강제, 예를 들어 모노포스포릴 리피드 A/합성 트레할로스 다이코리노마이콜레이트 (MPL-TDM), AS021/AS02, 비이온성 블록 코폴리머 보강제, CRL 1005, 알루미늄 포스페이트 (AlPO₄), R-848, 이미퀴모드, PAM3CYS, 폴리 (I:C), 록소리빈, 바실 칼메테-구에린 (BCG), 코리네박테리움 파르붐, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), 콜레라 독소 유래 항원, CTA 1-DD, 리포폴리사카라이드 보강제, 프로인트 완전 보강제, 프로인트 불완전 보강제, 사포닌, 미네랄 겔, 알루미늄 하이드록사이드, 표면 활성 물질, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩타이드, 수중 오일 또는 탄화수소 에멀젼, MF59, Montanide ISA 720, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 다이니트로페놀 및 이들의 조합을 더 포함하며, 예컨대 BCG를 더 포함한다.

다른 측면에서, 암 치료 방법으로서, 본원에 기술된 추출물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 세포가 상기 개체의 세포인 것인, 암 치료 방법을 제공한다.

일 측면에서, 상기 추출물은 면역원성 조성물로서 제형화된다. 다른 측면에서, 상기 추출물은 암 백신으로서 제형화된다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 통상적인 화학요법, 방사선치료, 호르몬치료 및 바이오테라피 중 한가지 이상과 동시에 또는 순차적으로 투여된다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 외과적 종양 절제 이전 또는 이후에 투여된다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 다회 투약 (multiple doses)으로 투여된다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 소정의 수 주간 동안 매주 투여된다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 진행 중인 유지 요법으로서 투여된다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 매주, 매달, 3달 마다, 6달 마다, 매해 또는 이들의 조합으로 투여된다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 암 재발 신호가 관찰될 때 투여된다.

다른 측면에서, 개체에서 암을 치료하기 위한 본원에 기술된 추출물의 용도를 제공하며, 세포는 개체의 자가 세포이다.

일 측면에서, 상기 추출물은 면역원성 조성물로서 제형화된다. 다른 측면에서, 상기 추출물은 암 백신으로 제형화된다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 통상적인 화학요법, 방사선치료, 호르몬치료 및 바이오테라피 중 한가지 이상과 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 것이다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 외과적 종양 절제 이전 또는 이후에 사용하기 위한 것이다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 다회 투약 (multiple doses)으로 사용하기 위한 것이다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 소정의 수 주간 매주 사용하기 위한 것이다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 진행중인 유지 요법으로서 사용하기 위한 것이다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 매주, 매달, 3달 마다, 6달 마다, 매해 또는 이들의 조합으로 사용하기 위한 것이다.

다른 측면에서, 상기 추출물은 암 재발 신호가 관찰될 때 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 특징들과 이점들은 후술하는 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다. 상세한 설명과 구체적인 예들은, 본 발명의 구현예에 대해 기술하고 있지만, 상세한 설명으로부터 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 사상과 범위내에서 다양한 변형 및 수정이 자명해질 것이므로, 오직 예시로서 제공되는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명은, 도면을 참조하여 후술하는 설명을 통해 더욱 이해될 것이다.
도 1은 여러가지 함량의 IFN-γ와 함께 72시간의 인큐베이션 기간을 경과한 후, 다양한 세포주들로부터 MHC II 양성 암 세포의 퍼센트를 도시한 것이다.
도 2는 여러가지 함량의 IFN-γ와 함께 72시간의 인큐베이션 기간을 경과한 후, 다양한 세포주들로부터 MHC II 양성 암 세포에서의 MHC II 발현 수준을 도시한 것이다.
도 3은 대조군 마우스 또는 살아있는 암 세포를 시험 접종한 지 30일 후 자가 암 세포 백신으로 면역화한 마우스에서 2차원의 평균 종양 크기와 표준 편차를 도시한 것이다.
도 4는 대조군 마우스 또는 살아있는 암 세포를 시험 접종한 지 30일 후 자가 암 세포 백신으로 면역화한 마우스에서 종양 검출율을 도시한 것이다.
도 5는 종양 세포와 인큐베이션한 후 면역화한 마우스 또는 네이티브 마우스에서 수득한 T 세포에서의 T 세포 증식 반응을 도시한 것이다.
도 6은 IFN-γ를 처리한 세포에서 추출한 BSA-바이오틴 펩타이드의 MHC II 제시를 도시한 것이다.
도 7은 살아있는 암 세포로 시험 접종한 후 자가 암 세포 백신으로 면역화한 마우스 또는 대조군 마우스에서의 종양 검출율을 도시한 것이다.
도 8은 자가 암 세포 백신을 투여받은 인간 개체의 생존 그래프를 도시한 것이다.
도 9는 전립선 종양을 외과적으로 절제하고 동시에 호르몬 차단 요법을 수행한 후, 자가 암 세포 백신을 투여한 환자 1의 전립선 특이 항원 (PSA) 측정 결과를 도시한 것이다.
도 10은 전립선 종양을 외과적으로 절제하고 동시에 호르몬 차단 요법을 수행한 후, 자가 암 세포 백신을 투여한 환자 2의 PSA 측정 결과를 도시한 것이다.
도 11은 전립선 종양을 외과적으로 절제하고 동시에 호르몬 차단 요법을 수행한 후, 자가 암 세포 백신을 투여한 환자 3의 PSA 측정 결과를 도시한 것이다.
도 12는 전립선 종양을 외과적으로 절제하고 동시에 호르몬 차단 요법을 수행한 후, 자가 암 세포 백신을 투여한 환자 4의 PSA 측정 결과를 도시한 것이다.
도 13은 전립선 종양을 외과적으로 절제하고 동시에 호르몬 차단 요법을 수행한 후, 자가 암 세포 백신을 투여한 환자 5의 PSA 측정 결과를 도시한 것이다.
도 14는 자가 암 세포 백신 또는 대조군을 처리한 환자에서 I/II상 임상 실험의 임상 결과를 도시한 것이다. 도 14A는 전립선 암으로 인한 사망율을 도시한 것이고; 도 14B는 혈청내 평균 PSA 수준을 도시한 것이고; 도 14C는 7년간 추적한 후 PSA의 수준을 검출할 수 없음 (< 0.04 ng/ml)을 도시한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 분리된 면역원성 암 세포, 상기 면역원성 암 세포를 포함하는 면역원성 조성물과 백신, 상기한 면역원성 조성물 및 백신의 제조 방법, 그리고 암 치료 방법에 관한 것이다. 분리된 면역원성 암 세포는 변이 또는 변형되어, 그 표면에 MHC II를 통해 비-자기 항원을 제시하며, MHC II는 헬퍼 T 세포에 상기 비-자기 항원을 제시함으로써 사이토카인의 생산을 유도하게 될 것이다. 또한, 분리된 면역원성 암 세포는 그 세포 표면 상에 MHC I을 발현하여, 이를 통해 세포독성 T 세포에 암 항원을 제시한다. 예측하지 못하게도, 이로써 하나의 변형된 암 세포는 자가 개체에서 이들 2가지 타입의 T 세포를 활성화하여, 강력하고 특이적인 항암 면역 반응을 유발할 수 있다.

암은 통제되지 않은 증식, 세포자살 기전의 소실 및 암 세포가 숙주 조직에 침입하여 먼 부위로 전이하는 능력과 같은 몇가지 유해한 특징들을 야기하는 복수의 돌연변이들로 인해 생긴다. 부가적으로, 암 세포는 CD8⁺ 세포독성 T 세포에 의해 비-자기로 인지되는 종양-특이 항원을 그 세포 표면 상의 MHC I에서 빈번하게 발현하지만, 이 암 세포는 숙주 면역계를 피하는 능력도 자주 발휘한다. 암 세포가 면역계를 피할 수 있는 기전들은 여러가지가 있으며, 다음과 같다:

a) 암 세포에서 MHC I은 하향-조절되어, 암 세포는 세포 독성 T 세포에 의해 인지될 수 없다.

b) 암 세포는, 비-자기로 인지되어 면역 반응을 일으킬 수 있는 종양-특이 항원의 발현을, 상실하게 될 수 있다.

c) 암 세포는 공-자극인자 또는 MHC II 분자를 발현하지 않기 때문에, 세포독성 T 세포를 유도하지 못할 수 있다.

d) 암 세포는 항암 면역 반응을 억제하는 분자를 생산할 수 있다.

e) 일부 종양 항원들은 암 세포에 대해 특이적인 면역 관용 (immune tolerance)을 유도할 수 있다.

항암 면역 반응을 강화 또는 회복시키는 방법은 암 면역학 분야에서 많은 연구 대상이 되고 있다.

MHC II 분자는 세포독성 T 세포의 탈-분화를 자극하는 CD4⁺ 헬퍼 T 세포의 활성화에 필수적이다. 즉, 암-특이적인 T 세포 반응을 유도하는데에는, 공-자극인자와 MHC II 분자를 발현하는, 전문적인 APC (professional APC)에 의한 교차-프라이밍이 요구된다. 이들 APC가 종양-특이 항원을 충분히 흡수 및 제시하지 않는다면, 암 세포에 특이적인 세포독성 T 세포는 확대되지 않을 수 있다.

증거에 따르면, 항원-유발성 T 세포 증식은 이의 특이적인 세포 표면 수용체에 대한 인터루킨-2 (IL-2)의 작용에 의해 주로 조절되는 것이 시사되고 있다. 헬퍼 T 세포가 자극을 받아 IL-2 세포를 발현하게 되면, 가용성 IL-2는 자가분비 방식으로 이를 생산하는 세포와 상호작용할 수 있거나, 또는 측분비 (paracrine) 방식으로 IL-2 수용체를 발현하는 다른 세포와 상호작용할 수 있다. 즉, IL-2를 생산하는 항원-활성화된 헬퍼 T 세포는 자신의 클론의 증가를 촉진하고, 세포 독성 T 세포의 증가를 촉진하고, 기억 T 세포의 생산을 촉진하고, B 세포와 자연 살상 (NK) 세포의 생산을 촉진할 수 있다. 네이티브 세포독성 T 세포의 경우, IL-2 생산량은 전형적으로 헬퍼 T 세포에 의해 생산되는 양 보다 적어도 10배 적으며, 이 양은 일반적으로 면역 반응을 지속하는데 불충분하므로, 이것이 헬퍼 T 세포에 의한 공-자극이 중요한 이유이다.

이에, 암에 반응하여 면역계를 충분히 활성화하기 위해서는, 4종의 세포 상호작용 모델이 필요하다: 1) MHC I에 종양-특이 항원을 제시하는 암 세포, 이 항원은 비-자기로 인지됨; 2) MHC II에 종양-특이 항원을 제시하는 APC, 이 항원은 비-자기로 인지됨; 3) MHC I- 항원 복합체와 상호작용하기 위한 세포독성 T 세포; 및 4) MHC II-항원 복합체와 상호작용하기 위한 헬퍼 T 세포. 이 모델에서, 세포독성 T 세포가 MHC I-항원 복합체를 인지하면, 세포독성 T 세포는 관용 유도를 예방하고 증가시키는데 IL-2가 필요한 상태로 활성화한다. IL-2는 세포독성 T 세포에 근접한 활성화된 헬퍼 T 세포에 의해 효과적으로 제공된다. 종종 종양 세포는 이러한 4 세포 상호작용 모델의 결핍으로 인해 면역계를 피하며, 전형적으로 MHC II를 통해 비-자기 항원을 헬퍼 T 세포에 제시하는 종양 세포 근처에는 APC가 충분하지 않다. 따라서, 헬퍼 T 세포는 활성화되지 않고, IL-2가 생산되지 않는다.

본 발명의 측면들에서, 암 세포가 비-자기 펩타이드를 MHC II를 통해 헬퍼 T 세포에 제시하도록 자체 변형된 3 세포 모델로 4 세포 모델을 대체한다. 변형된 암 세포는, 또한, 종양- 특이 항원을 MHC I을 통해 세포독성 I 세포에 제시하기 때문에, 2중 기능성인 것으로 간주된다.

본 발명의 측면들에서, 암 세포는 암을 가진 개체에서 분리하여, 배양한다. 이 세포는, 예를 들어, IFN-γ와 같은 MHC II-유도제를 처리함으로써와 같이, 이의 세포 표면에 MHC II를 발현하도록 변형시킨다. MHC II-양성인 것으로 동정된 세포를 이후 예를 들어 소 펩타이드와 같은 면역원성 비-자기 항원와 함께 인큐베이션한다. 인큐베이션하는 동안, 비-자기 항원은 암 세포에 의해 세포흡수 (pinocytosis)되어, 가공된 다음 마지막으로 세포 표면에 MHC II를 통해 제시될 것이다. 이후, 변형된 암 세포를 자가 개체, 즉 암 세포를 원래 분리한 개체로 다시 주입하기 위해 준비한다.

이러한 변형된 세포는 면역원성이며, 비-자기 펩타이드에 대해 강력한 헬퍼 T 세포 반응을 형성하여, 헬퍼 T 세포에 의한 IL-2 생산을 유도할 것이다. 한편, 암 세포에 MHC I을 통해 제시된 종양 항원을 인지한 세포독성 T 세포는, 동일한 암 세포의 표면에 MHC I와 MHC II 둘다가 존재하여 상기 헬퍼 T 세포가 부근에 존재하기 때문에 IL-2에 의해 자극을 받게 될 것이다. 이는 암 세포에 의해 생성되는 종양 항원에 대해 특이적인 면역 반응을 야기하게 될 것이다. 수많은 여러가지 종양 항원들이 전형적으로 암 세포의 표면에 MHC I에 의해 제시되기 때문에, 변형된 암 세포에 의해 형성되는 면역 반응은 사실상 다클론성 (polyclonal)이다.

정의:

용어 "분리한다", "분리된" 및 "분리하는"은, 본원에서 암을 앓고 있는 환자의 신체에서 암 세포를 취하는 것을 의미한다. 세포는, 예를 들어, 암을 외과적으로 제거하는 동안 또는 표준적인 생체 검사 공정을 수행하는 동안에 분리할 수 있다. 달리 언급되지 않은 한, 이들 용어는 암 세포가 다른 세포 타입들로부터 정제되거나 다른 세포 타입들이 없다는 의미는 아니다.

본원에서, 당해 기술 분야에서 잘 이해되는 바와 같이, "치료"는 임상 결과를 비롯하여 유익하거나 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 방법이다. 유익하거나 또는 원하는 임상 결과로는, 비제한적인 예로, 검출가능하거나 검출불가능하든 간에, 한가지 이상의 증상 또는 병태의 완화 또는 개선, 질환 규모의 축소, 질환 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질환의 확대 방지, 질환 진행의 지연 또는 서행, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 (부분적인 또는 완전한) 관해를 포함할 수 있다. 또한, "치료"는 치료받지 않을 경우 예상되는 생존에 비해 연장된 생존을 의미할 수 있다.

용어 "치료학적인 유효량", "유효량" 또는 "충분량"은 포유류, 예를 들어, 인간을 비롯한 개체에게 투여하였을 때, 원하는 결과를 달성하는데 충분한 양, 예를 들어 암을 치료하는데 효과적인 양을 의미한다. 치료 제제의 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중 등의 인자들에 따라 달라질 수 있다. 투여량 또는 치료 용법은 당업자들이 이해하는 바와 같이 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정할 수 있다.

아울러, 치료학적 유효량을 이용한 개체의 치료 용법은 1회 투여로 구성되거나, 또는 다른 예로, 일련의 적용을 포함할 수 있다. 치료기의 기간은 질환의 중증도, 개체의 연령, 암 백신의 농도, 암 백신에 대한 환자의 반응성 또는 이들의 조합과 같은 다양한 인자에 따라 결정된다. 또한, 치료에 사용되는 암 백신의 유효 투여량은 개별 치료 용법의 코스 동안 높이거나 낮출 수 있는 것으로 이해될 것이다. 투여량에 변화가 생길 수 있으며, 당해 기술 분야에 공지된 표준 진단 분석을 통해 명확해질 수 있다. 본 발명의 암 백신은, 몇몇 측면들에서, 통상적인 항암제, 방사선치료, 호르몬 치료, 바이오테라피 및/또는 외과적 종양 절제를 이용한 치료 전에, 치료 중에 또는 치료 후에, 투여할 수 있다.

용어 "개체"는, 본원에서, 동물계, 바람직하게는, 포유류에 속하는 모든 구성원을 지칭한다. 일 구현예에서, 포유류는 개, 고양이, 햄스터, 마우스, 랫, 돼지, 말, 소 또는 인간이다. 다른 구현예에서, 포유류는 인간이다.

용어 "자가 (autologous)"는 개체로부터 수득하여, 동일 개체를 치료하는데 사용되는 세포를 의미한다.

용어 "자기 항원" 또는 "자기 펩타이드"는, 특정 개체로부터 유래되며, 통상적으로 면역계에 관용되는, 그 개체의 체내 항원을 지칭한다. 용어 "비-자기 항원" 또는 "비-자기 펩타이드"는, 그 개체로부터 유래되지 않으며 통상 면역계에 의해 인지되어 공격을 받게되는, 그 개체의 체내에 존재하는 항원을 지칭한다. "암 항원" 또는 "암 펩타이드"는 개체의 암으로부터 유래되는 그 개체의 체내에 존재하는 항원을 지칭한다. 당해 기술 분야에서 이해되는 바와 같이, 암 항원은 때때로 면역계에 용인되며, 때로는 면역계에 의해 식별됨으로써 공격받게 된다. 각각의 암 세포는 임의의 소정의 시기에 세포 표면 상에 MHC I를 통해 수많은 여러가지 암 항원들을 제시할 것이며, 이중 일부는 면역계에 용인될 수 있으며, 일부는 면역계에 인지되어 공격을 받을 수 있다.

본 발명의 암 세포는, 설명되는 바와 같이, MHC I과 MHC II 둘다를 발현하고 헬퍼 T 세포와 세포독성 T 세포 둘다를 활성화할 수 있기 때문에, "2중 기능성"으로 지칭될 수 있다. MHC I과 MHC II를 발현하는, 이러한 2중 기능성의 종양 세포는, 또한 종양 제시 세포 (TPC)로서 기술될 수 있다.

용어 "보강제"는, 백신에 존재하여, 백신에 존재하는 항원에 대한 면역 반응을 강화하는, 화합물 또는 혼합물을 지칭한다. 예를 들어, 보강제는, 본원에서 고려되는 바와 같이, 자가 암 세포 백신에 존재하는 폴리펩타이드, 또는 본원에 고려되는 이의 면역원성 단편 또는 변이체에 대한 면역 반응을 강화할 수 있다. 보강제는 항원을 서서히 방출하는 조직 저장체 (tissue depot)로서 제공하거나, 또한 면역 반응을 비-특이적으로 강화하는 림프계 활성제로서 제공할 수 있다. 채택할 수 있는 보강제의 예로는, MPL-TDM 보강제 (모노포스포릴 리피드 A/합성 트레할로스 다이코리노마이콜레이트, 예컨대, GSK Biologics에서 구입가능함)를 포함한다. 다른 적합한 보강제는 면역자극성 보강제 AS021/AS02 (GSK)이다. 이들 면역자극성 보강제들은 강력한 T 세포 반응을 제공하도록 제형화되며, 지질 또는 리포좀 담체 중에서의, QS-21, 퀼레이 사포나리아 (Quillay saponaria)의 사포닌, TL4 리간드, 모노포스포릴 리피드 A를 포함한다. 다른 보강제로는, 비제한적으로, 비이온성 블록 코폴리머 보강제 (예컨대, CRL 1005), 알루미늄 포스페이트 (예컨대, AlPO.sub.4), R-848 (Th1-유사 보강제), 이미퀴모드, PAM3CYS, 폴리 (I:C), 록소리빈, BCG (바실 칼메테-구에린) 및 코리네박테리움 파르붐, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), 콜레라 독소 유래 항원 (예컨대, CTA 1-DD), 리포폴리사카라이드 보강제, 프로인트 완전 보강제, 프로인트 불완전 보강제, 사포닌, 미네랄 겔, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드, 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩타이드, 수중의 오일 또는 탄화수소 에멀젼 (예, Novartis vaccines 사의 MF59 또는 Montanide ISA 720), 키홀 림펫 헤모시아닌 및 다이니트로페놀을 포함한다.

용어 "정제된"은, 본원에서, 출발 물질에 비해 활성 물질의 농도를 증가시키는 하나 이상의 정제 단계에 의해 출발 물질로부터 수득되는 조성물들을 망라하기 위해 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 측면들에서, 생검 또는 외과적 종양 샘플로부터 수득한 IFN-γ-처리 세포는, MHC II 양성 세포의 농도를 높이기 위해 세포-분류 기법들로 정제할 수 있다. 정제된 조성물은, 예를 들어, MHC II 양성 세포를 약 5% - 약 100%로 포함할 수 있으며, 이들 범위의 임의 양으로, 예컨대 MHC II 양성 세포를 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%로 포함할 수 있다. 또한, 용어 "정제된"은, 정제 공정으로 수득하거나 또는 그렇지 않던 간에, 불순물에 대해 활성 물질을 현저한 양으로 포함하는 조성물을 망라한다. 용어 "정제된"은 절대 순도를 내포하는 것으로 해석되진 않아야 한다.

본 발명의 범위를 이해함에 있어, 용어 "포함하는" 및 이의 유사 용어들은, 본원에서, 언급된 특징, 요소, 성분, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 특정하는 개방형 용어들인 것으로 의도되지만, 언급되지 않은 다른 특징, 요소, 성분, 그룹, 정수 및/또는 단계들의 존재를 배제하는 것은 아니다. 또한, 전술한 내용은 용어 "비롯하여", "가지는" 및 이와 비슷한 용어 등의 비슷한 의미를 가지는 용어에 적용된다. 마지막으로, "실질적으로", "약" 및 "대략"과 같은 정도에 대한 용어들은 본원에서 최종 결과가 현저하게 바뀌지 않도록, 수정된 용어의 합리적인 편차량을 의미한다. 이들 정도에 대한 용어들은, 이 편차가 수정된 용어의 의미를 무효화하지 않는다면 수정된 용어의 적어도 ± 5% 편차를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

예상하지 못하게도, 암 세포를 세포 표면에 MHC II를 발현하도록 변형시켜, MHC II가 비-자기 항원을 헬퍼 T 세포에 제시하고, MHC I이 암 항원을 면역계의 세포독성 T 세포에 제시할 수 있다는 것을 확인하게 되었다. 이렇게 변형된 암 세포는 면역원성이며, 이를 개체에서 암을 치료하는데 효과적인 자가 암 백신 조성물에 사용할 수 있다.

이에, 세포 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현하며, 상기 MHC I에는 암 항원이 결합하고, 상기 MHC II에는 비-자기 항원이 결합하는, 분리된 면역원성 암 세포를 제공한다.

암 세포는 자가 개체로부터 분리되는데, 이는 이것이 유래된 동일 개체를 치료하는데 사용될 것이라는 의미이다. 다른 예로, 암 세포는 HLA-매치되는 이종 개체에 사용될 수 있다. 전형적으로, 세포는 생검 공정 또는 외과적 종양 절제 시에 분리된다. 암 세포는 임의 유형의 악성 종양으로부터 유래될 수 있으며, 일 측면에서, 이는, 소 세포성 폐암 및 비-소 세포성 폐암 (예, 선암종)을 비롯한 폐암, 췌장암, 대장암 (예, 결장직장암, 예로, 대장 선암종 및 대장 선종), 식도암, 경구 편평 상피암, 형 암, 위암, 간암, 비인두암, 림프구계의 조혈암 (예, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, 버킷의 림프종), 비-호지킨 림프종 (예, 멘틀 세포 (mantle cell) 림프종), 호지킨 질환, 골수성 백혈병 (예, 급성 골수성 백혈병 (AML) 또는 만성 골수성 백혈병 (CML)), 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 갑상샘소포암, 골수이형성 증후군 (MDS), 간엽 기원의 종양, 연조직 육종, 지방육종, 위장 기질 육종, 악성 말초 신경집 종양 (MPNST), 유잉 육종, 평활근육종, 간엽연골육종, 림포육종, 섬유육종, 횡문근육종, 흑색종, 기형암종, 신경모세포종, 뇌 종양, 수모 세포종, 신경교종, 피부의 양성 종양 (예, 각화극세포종 (keratoacanthoma)), 유방암 (예, 진행된 유방암), 신장암, 콩팥모세포종, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 방광암, 전립선 암, 예컨대, 진행된 질환 및 호르몬 불응성 전립선 암, 고환암, 골육종, 두경부암, 표피암, 다발성 골수종 (예, 불응성 다발성 골수종), 또는 중피종으로부터 유래된다. 일 측면에서, 암 세포는 고형암으로부터 유래된다. 전형적으로, 암 세포는 유방암, 결장직장암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 위암 또는 전린선 암으로부터 유래된다. 보다 전형적으로, 암 세포는 전립선 암으로부터 유래된다.

대부분의 암 세포는, 세포 표면 상에 임의의 MHC II를 있다하더라도 천연적으로 많이 발현하지 않지만, 암 세포가 예를 들어 B 세포 암과 같이 항원 제시 세포로부터 유래된다면, 이들 세포는 이미 세포 표면에 MHC II를 이미 발현할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이미 MHC II를 발현하고 있는 비-변형된 암 세포는 본 발명에서 분명하게 이미 제외될 수 있는 것으로 고려된다. 다시 말해, 본 발명은, 본 발명에 따라 변형하기 전에, MHC II-음성, MHC II-양성 또는 둘다인 암 세포를 포괄할 수 있는 것으로 간주된다. 다른 예로, 이들 세포는 본 발명에 포함될 수 있으며, 이들 세포는 이미 MHC II를 발현하기 때문에, MHC II-유도제와의 배양은 단지 발현 수준을 높이기 위한 옵션인 것으로 이해될 것이다.

암 세포가 세포 표면에 MHC II를 발현하게 하기 위해, 이를 MHC II-유도제와 인큐베이션한다. MHC II-유도체는, 예를 들어, 사이토카인, 화학제제 및 유전자 구조체를 망라한다.

예를 들어, MHC II-유도제는 IFN-γ일 수 있거나, 또는 암 세포를 형질감염 또는 형질전이하는데 사용되는 MHC II 발현 벡터일 수 있다. 또한, MHC II-유도제는 MHC II를 발현하는 세포를 포함하며, 즉, MHC II를 발현하는 세포는 암 세포와 세포 융합으로 융합하여, 암 세포에 MHC II 양성을 부여할 수 있다. 이러한 세포의 예로는, B 세포, 수지상 세포, 마크로파지, 및 단핵세포를 포함한다. 다른 측면에서, MHC II 유도제는 MHC II 전사촉진 (CIITA) 서열을 활성화하는 물질일 수 있다. 그러나, 전형적으로, MHC II-유도제는, 예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-4, IL-13, IL-23 또는 TNF-α와 같은 사이토카인이다. 또한, 사이토카인의 조합도 사용할 수 있다. 구체적인 측면에서, MHC II-유도제는 IFN-γ이다. 또한, MHC-II 유도제는 암 세포 상에 MHC I의 발현을 증가시키는 효과를 가질 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, IFN-γ가 MHC II-유도제로 사용된다면, 또한 암 세포의 표면에 MHC I의 증가를 유발하는 경향이 있을 것이다.

MHC II-유도제와 인큐베이션한 후, 분리된 암 세포를 기존 방법으로 스크리닝하여, MHC II가 세포 표면 상에 발현되는 지를 검증할 수 있다. 또한, 세포는 MHC II-양성 세포의 농도를 높이기 위해 이 단계에서 정제할 수 있다.

암 세포가 MHC II를 발현하도록 변형되면, 이를 비-자기 항원과 인큐베이션하여, 이들이 MHC II에 비-자기 항원을 제시하게 한다. 비-자기 항원은, 비-자기로 간주되며 MHC II에 의해 제시되었을 때 개체에서 면역 반응을 유도할 수 있는, 임의의 항원일 수 있다. 적합한 항원은, 합텐 담체로서 유용한 것으로 공지된 항원, 예를 들어, 티로글로불린, β-갈락토시다제, 덱스트란, 폴리라이신, 투베르쿨린 유래 단백질, 오브알부민 (OVA), 소 혈청 알부민 (BSA), 양 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민 또는 어류 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 항원은 여러가지 종으로부터 유래되거나 또는 개체와 동일한 종으로부터 유래될 수 있다. 에를 들어, 개체가 인간이라면, 항원은 인간 항원 또는 비-인간 항원일 수 있다. 전형적으로, 항원은 예를 들어 소, 토끼, 무라인, 개 또는 고양이 항원과 같은 비-인간 항원이다. 보다 전형적으로, 항원은 소 항원, 예를 들어 소 혈청 항원 (BSA)이다. KLH와 알부민도 전형적으로 사용되는 다른 항원이다. 일 측면에서, 소 항원은, 일반적으로, 본 발명에서 특히 제외된다. 다른 측면에서, BSA는 본 발명에서 특히 제외된다.

측면들에서, 본 발명에 따라 준비한 분리된 면역원성 암 세포는 세포 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현할 것이다. MHC I 분자와 MHC II 분자는 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이 다수의 여러가지 항원을 제시할 것이나, 일정 부분 이상의 MHC I 분자는 종양-특이 항원을 제시하고, 일정 부분 이상의 MHC II 분자는 비-자기 항원을 제시하게 될 것이다. 그 후, 이들 세포는 개체에서 암을 치료하기 위한 자가 대상으로 사용할 수 있다.

이 세포는 살아있는, 약화된 (attenuated) 또는 사멸된 형태로 사용될 수 있다. 전형적으로, 세포는, 개체에게 사용하기 전에, 예를 들어, 치사 수준의 방사선 조사, DMSO와 같은 냉동-보존제 없는 조건에서의 냉동과 해동, 또는 화학요법제나 독소와 같은 세포독성 화합물의 처리에 의해 사멸시킬 수 있다. 만일 세포가 즉시-사용하기 위한 것이 아니라면, 이는 예를 들어 냉동-보존에 의해 자가 개체에 이후 투여하기 위해 보존시킬 수 있다.

또한, 세포의 추출물도 개체에서 암을 치료하기 위한 자가 대상으로 사용할 수 있다. 예를 들어, 세포를 침연 (macerate)하거나, 초음파 처리하거나 또는 파괴시켜, 이의 본래의 완전한 형태 (whole form)가 아니게 할 수 있다. 비-자기 항원-결합된 MHC II 분자를 함유한 막 분획을 세포로부터 추출하여, 이를 자가 개체에서 암을 치료하기 위한 면역원성 조성물에 제공할 수 있다. 아울러, 단지 비-자기 항원-결합된 MHC II 분자를 함유한 분획을 세포로부터 추출하여, 자가 개체에서 암을 치료하기 위한 면역원성 조성물로 제공할 수 있다. 이에, MHC II 분자를 함유하며, MHC II 분자가 비-자기 항원을 제시하는, 세포 추출물을 제공한다. 이 추출물은 막 분획을 추가로 포함할 수 있으며, 아울러 암 항원을 제시하는 MHC I 분자를 포함할 수 있다. 추출물은 면역원성 조성물로 또는 암 백신으로 제공될 수 있으며, 이를 사용하여 암에 걸린 자가 개체를 치료할 수 있다.

MHC II를 통해 비-자기 항원을 제시하도록 기술된 바와 같이, 변형된 암 세포는 또한 암을 치료하기 위해 면역원성 조성물로 사용될 수 있다. 이에, 세포 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현하며, MHC I이 암 항원을 제시하고, MHC II가 비-자기 항원을 제시하는, 암 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 면역원성 조성물은 자가 개체에서 암을 치료하기 위해 자가 암 세포 백신으로서의 용도를 가진다.

면역원성 조성물 및 백신은, 변형된 암 세포 외에도, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정제, 보강제 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다.

본원에 기술된 면역원성 조성물과 백신은, 활성 성분의 유효량이 약제학적으로 허용가능한 비히클과의 혼합물로 조합되도록, 개체에게 투여할 수 있는 약제학적으로 허용가능한 조성물을 제조하기 위한 자체 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 적정 비히클은, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 2000)에 기술되어 있다. 이를 토대로, 상기 조성물은, 비록 전적으로는 아니지만, 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 비히클 또는 희석제와 조합하여 암세포를 포함할 수 있으며, 이는 생리학적 체액과 등-삼투성인 적정 pH의 완충화된 용액에 함유될 수 있다.

약학 조성물은, 비제한적인 예로, 동결건조 산제 또는 수성 또는 비-수성의 무균 주사용 용액제 또는 현탁제를 포함하며, 이는 항산화제, 완충제, 세균증식저해제 및 상기 조성물에 개체의 조직 또는 혈액과의 실질적인 혼화성을 부여하는 용질을 더 포함할 수 있다. 이러한 조성물에 존재할 수 있는 다른 성분으로는 예를 들어 물, 계면활성제 (예, Tween), 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일을 포함한다. 즉석 주사액제 및 현탁제는 멸균 산제, 과립제, 정제 또는 농축 용액제 또는 현탁제로 조제할 수 있다. 약학 조성물은, 예를 들어, 비제한적으로, 환자에게 투여하기 전에 멸균수 또는 염수를 이용하여 재구성하는 동결건조 분말로서 제공될 수 있다.

적절한 약제학적으로 허용가능한 담체는 약학 조성물의 생물학적 활성의 효능을 간섭하지 않는 기본적으로 화학적으로 불활성이며 무독성인 조성물을 포함한다. 적절한 약제학적 담체의 예로는, 비제한적으로, 물, 염수액, 글리세롤 용액, 에탄올, N-(1(2,3-다이올레일옥시)프로필)N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), 다이올레실포스포티딜-에탄올아민 (DOPE) 및 리포좀을 포함한다. 이러한 조성물은, 환자에게 직접 투여하기 위한 형태를 제공하기 위해, 적량의 담체와 더불어, 변형된 암 세포를 치료학적 유효량으로 포함하여야 한다.

임의의 적절한 보강제가 본 발명의 백신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 적절한 보강제로는 MPL-TDM 보강제, AS021/AS02, 비이온성 블록 코폴리머 보강제, 알루미늄 포스페이트, R-848, 이미퀴모드, PAM3CYS, 폴리 (I:C), 록소리빈, BCG, 코리네박테리움 파르붐, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 콜레라 독소 유래 항원, 리포폴리사카라이드 보강제, 프로인트 완전 보강제, 프로인트 불완전 보강제, 사포닌, 미네랄 겔, 예컨대 알루미늄 하이드록사이드, 표면 활성 물질, 예로, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩타이드, 수중 오일 또는 탄화수소 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 및 다이니트로페놀을 포함한다. 전형적으로, 사용되는 보강제는 BCG이다.

본 발명의 면역원성 조성물 및 백신은, 여러 측면들에서, 예를 들어, 비경구, 정맥내, 피하, 진피내, 근육내, 두개강내, 안와내, 안, 뇌실내, 관절낭내, 척수내, 낭내, 복막내, 코내, 직장내, 에어로졸 또는 경구 투여로 투여할 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 상기 조성물은 피하로, 근육내로 또는 진피내로 투여한다. 보다 전형적으로, 본 발명의 상기 조성물은 피부 (derma)에서 발생하는 특이적인 항원 프로세스로 인해 팔 (upper limbs)에서 진피내로 투여한다.

본 발명의 면역원성 조성물 및 백신은, 여러 측면에서, 예를 들어, 화학요법, 호르몬 치료, 바이오테라피 및 방사선 치료를 비롯한 기존의 암 치료법과 조합하여, 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물은 적절한 경우 이러한 기존 치료법과 함께 제형화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 임의의 적량으로 사용할 수 있지만, 전형적으로 암 세포 약 1 x 10⁴ - 약 1 x 10⁹개를 포함하는 용량으로 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은, 측면들에서, 암 세포 약 1 x 10⁴, 1 x 10⁵, 약 1 x 10⁶, 약 1 x 10⁷, 약 1 x 10⁸, 또는 약1 x 10⁹개를 포함할 수 있다. 전형적으로, 본 조성물은 암세포 약 1 x 10⁷개를 포함한다.

부가적으로, 암 세포를 이용한 백신화는 1회 수행하거나 또는 여러번 반복할 수 있다. 예를 들어, 백신화는 질환 상태에 따라 매일, 매주, 매달, 매년 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 개체에게 활성 암을 치료하기 위해 매주 기준으로 투여량을 수회로 투여할 수 있다. 암 증식이 서행되거나 또는 관해로 진행되면, 추적 유지 투여를, 예를 들어, 매달 기준으로, 3개월 마다, 6개월 마다 또는 매년 기준으로 제공할 수 있다. 일반적으로, 이용가능한 생물학적 물질이 존재하는 한, 개체에 대한 백신화를 계속하는 것이 적절하다. 부가적으로, 암 환자는 전형적으로 암 재발에 대한 임의의 신호를 신속하게 동정하기 위해 관해 후, 수년 간 추적한다. 임의의 이러한 신호가 동정되면, 암 세포 백신의 추적 투여 또는 투여들을 재발성 암을 치료할 필요가 있을 때 투여할 수 있다.

다회의 투여가 환자의 종양으로부터 수득한 암 세포의 수로 단순 제한되지 않는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 암 세포를 개체로부터 분리하였을 때, 이를 일정 기간 동안 배양하여 생존성과 세포 수 증가를 확보한다. 미리 정해진 횟수의 투여가 적합하다면, 미리 정해진 횟수의 투여량을 제공하기에 충분한 수의 세포가 존재할 때까지 세포를 배양할 수 있다. 오리지날 세포 물질이 다 사용되면, 추가적인 생검 또는 외과적 샘플을 수득할 때까지는 추가적인 투여량을 준비할 수 없을 수 있다.

따라서, 암 세포는, 배양 후, MHC II-유도체와 비-자기 항원을 처리하기 전 또는 처리한 이후에 냉동보존하여, 향후, 예를 들어 암이 재발한 경우 이를 재-배양하여 세포 수를 추가적인 투여량으로 증식시킬 수 있는 것으로 고려된다. 구체적인 암 재발 경우에, 추가적인 백신 투여를 위해 추가적인 생물학적 물질을 제공하기 위해서는, 재발된 암으로부터 수득한 2차 생검 또는 외과적 샘플을 수득할 수 있다. 가능하다면, 오리지날 암이 아닌 다른 암 항원을 MHC I을 통해 제시할 수 있기 때문에, 재발된 암으로부터 제2 생검 또는 외과적 샘플을 수득하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물, 백신, 세포 및 방법을 이용하여 암을 치료할 수 있는 것으로 상기에 언급되어 있지만, 이를 또한 이용하여 암을 예방할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이러한 측면에서, 개체로부터 수득한 종양 세포를 스크리닝하여, 그 표면에 인간 백혈구 항원 (HLA)을 발현하는지를 확인할 수 있다. 이들 세포는 HLA-매칭되는 개체에서 암을 예방하기 위해 백신으로 제형화할 수 있다.

상기 내용은 일반적으로 본 발명을 기술한다. 하기 구체적인 실시예들을 참조하여 보다 충분히 이해할 수 있다. 이들 실시예들은 단지 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 상황에 따라 방책이 필요하거나 제안될 수 있으므로, 형태의 변화 및 등가체로의 치환도 고려된다. 구체적인 용어들이 본원에 사용되고 있지만, 이들 용어는 설명하기 위한 의미일 뿐 한정하기 위한 것은 아니다.

실시예

실시예 1

인간 LST174T, LoVo, SW1116, Colo205 및 HT29 대장암 세포와 인간 SK-OV-3 난소암 세포를 72시간 동안 IFN-γ 농도를 달리하여 첨가하여 배양하였다. 그런 후, 이들 세포에서 IFN-γ에 의해 MHC II 발현이 유도되는지를 확인하기 위해, 세포를 특이적인 항-MHC II (DP, DQ 및 DR) 항체를 이용하여 유세포 측정으로 분석하였다. 그 결과는 표 1과 2, 그리고 상응하는 도 1과 2에 도시한다.

표 1. 본 표는 IFN-γ를 이용한 72시간 인큐베이션한 후, MHC II 양성 세포의 퍼센트를 열거한다.

IFN-γ (U/mL)	LST174T	LoVo	SW1116	Colo205	OV3	HT29
0	2.70	0.59	2.96	1.35	2.03	0.35
100	0.26	12.41	10.50	26.59	NA	41.87
1000	1.32	19.11	32.54	39.96	40.43	81.60

표 2. 본 표는 평균 채널 강도 (mean channel intensity)를 열거하며, MHC II 양성 세포에서 MHC II 발현 수준에 관한 것이다.

IFN-γ (U/mL)	LST174T	LoVo	SW1116	Colo205	OV3	HT29
0	16.7	34.29	25.71	59.89	27.14	35.87
100	41.42	79.86	27.88	53.28	NA	31.91
1000	15.68	108.43	34.91	138.24	45.32	53.76

본 실시예는, 다른 오리진의 수종의 여러가지 세포 타입을 IFN-γ와 인큐베이션하여 MHC II를 발현하도록 만들 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 2

마우스 413-BCR 유방 종양 세포를 48시간 동안 100 U/mL IFN-γ와 24시간 동안 50 ㎍/mL BSA와 인큐베이션하였다. 보다 구체적으로, 세포를 10 ml 배지가 든 T25 플라스크에 접종하였다. 이 세포를 IFN-γ가 첨가된 배지를 사용하여 48시간 인큐베이션한 다음, 무혈청성 RPMI 1640으로 3회 세척하였다. 그 후, 세포를 2시간 동안 BSA 용액 2 ml과 인큐베이션 한 다음, 100 U/ml IFN-γ 및 50 ㎍/ml BSA를 비롯한 완전 배지를 첨가하였다. 413-BCR 세포를 치사 수준으로 방사선 처리하고, 냉동보존하였다. BALB/c 마우스를, 각각 1 x 10⁵ 413-BCR 세포가 함유된 주사로 3회 i.p.로 보강제 첨가없이 시험 감염 전 21, 14 및 7일 전에, 사전-면역화하였다. 그런 다음, 마우스에 살아있는 413-BCR 세포 2.5 X 10⁶개를 s.c. 주사로 시험 감염시켰다. 사전-면역화한 마우스들 모두 종양이 발생하지 않은 (n=5) 반면, 무처리 대조군 마우스 모두 (n=5) 30일 후 종양이 발생하였다.

본 실시예는, 세포 표면에 MHC II를 통해 비-자기 펩타이드를 제시하도록 변형된 암 세포로 사전-면역화하는 것이 마우스에서 자가 비-변형된 암 세포의 시험 감염을 방지하도록 보호할 수 있다는 것을 보여준다.

실시예 3

20마리의 BALB/c 암컷 마우스를 그룹 당 각각 5마리씩 4개의 그룹, A, B, C 및 D로 표시한 그룹으로 나누었다. 이들 마우스에는 표 3에 기술된 바와 같이 2번의 사전-면역화를 투여하였다. 간략하게는, A 그룹은 세포 표면에 MHC II를 통해 비-자기 항원을 제시하는 암 세포로 면역화하였고; B 그룹은 세포 표면에 MHC II를 발현하나 비-자기 항원은 없는 암 세포로 면역화하였고; C 그룹은 비-자기 항원으로 면역화하였고; D 그룹은 PBS로 면역화하였다. 모든 주사는 s.c.로 수행하였으며, 시험 감염 전 14일째에 보강제로서 Quil-A를 포함시켰으며, 시험 감염 전 7일에는 보강제를 포함시키지 않았다. 0일에, 5 x 10⁵개의 살아있는 413-BCR 세포를 s.c.로 접종하였다.

표 3. 본 표는 실시예 3의 마우스 그룹들에 실시된 사전-면역화를 기술한다.

처리	공정
A	100 U/ml IFN-γ와 함께 48시간 인큐베이션한 다음 50 ㎍/ml BSA와 100 U/ml IFN-γ와 함께 24시간 배양한, 413-BCR 세포 10⁵개. 이 세포에 치사 수준으로 방사선을 처리하였다.
B	IFN-γ와 함께 72시간 인큐베이션한 10⁵개의 413-BCR 세포. 이 세포에 치사 수준으로 방사선을 처리하였다.
C	50㎍ BSA
D	PBS

표 3과, 도 3 및 4는 본 실험의 결과를 나타낸다. 표 4와 이에 상응하는 도 3은, 사전-면역화시 MHC II-발현하는 암 세포를 투여한 A 그룹과 B 그룹의 마우스의 경우, 사전-면역화시 세포를 투여받지 않은 마우스 보다 종양의 크기가 더 작았다는 것을 보여준다. 70일째에 마우스에 대한 육안 평가를 통해, A 그룹의 마우스에서는 종양이 검출되지 않은 반면, B, C 및 D의 그룹들에서는 각각 마우스 1, 4 및 5마리에서 검출가능한 종양이 확인된 것으로 나타났다 (도 4).

표 4. 본 표는 살아있는 종양 세포를 시험 검염하기 30일 전에 각 그룹의 마우스들에서, 2차원의 평균 종양 크기 및 표준 편차를 나타낸 것이다.

	30일째의 2차원 종양 크기
	평균 (mm²)	SD (mm²)
A	12.1	5.1
B	10.8	3.8
C	31.7	14.4
D	33.7	12.7

본 실시예는, 세포 표면에 MHC II를 통해 비-자기 펩타이드를 제시하도록 변형된 암 세포로 사전-면역화하는 경우, 구체적으로 종양 크기와 발생율 감소 측면에서 마우스에서 자가 비-변형된 암 세포를 이용한 시험 감염으로부터 보호된다는 것을 보여준다.

실시예 4

실시예 3의 A 그룹의 마우스들을 희생시키고, 마우스의 비장을 적출하여 T 세포 증식을 분석하였다. 네이티브 동물의 비장을 대조군으로 사용하였다. A 그룹의 마우스 유래의 T 세포를 대략 1.2 x 10⁵ T 세포/웰로 다음과 같은 물질 또는 세포의 존재 하에 배양하였다: 2 mg/mL 피토헴어글루티닌 (PHA) (양성 대조군); 표준 배지 (음성 대조군); 10⁴방사선 처리된 종양 세포, 10⁴방사선 처리된 IFN-γ-처리 종양 세포, 또는 50 ㎍/mL BSA. 이들 T 세포를 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 다음, 1 mCi 3H-티미딘과 함께 20시간 인큐베이션하였다. 병합된 활성을 솔리드 신틸레이션을 이용하여 측정하였다.

표 5 및 도 5는 본 실험의 결과를 도시하며, 면역화된 마우스 유래의 T 세포는 종양 세포와 BSA에 반응하여 증식된 반면, 네이티브 마우스로부터 유래된 T 세포는 그렇지 않았다. 이는, 이들 세포에 IFN-γ를 처리하거나 처리하지 않던 간에 상관없이, 암 백신으로 면역화한 동물에서 종양 세포 상에 존재하는 여러가지 종양 항원에 대해 독립적인 면역성이 발현된다는 것을 의미한다. 부가적으로, 암 백신으로 면역화된 동물은 BSA에 대해 면역성을 나타내었다.

표 5: 본 표는 면역화된 마우스 (A 그룹) 대 네이티브 마우스로부터 유래된 T 세포의 증식 반응을 나타낸다.

	A 그룹 - 면역화된 동물		네이티브 동물
	Media CPM	DP CPM	Media CPM	DP CPM
PHA 2㎍/ml	145659	4718	143239	10850
배지	138	60	157	71
방사선 처리한 종양 세포	5268	372	506	184
INF 처리한 종양 세포	4989	638	430	262
알부민 50 ㎍/ml	7714	1555	735	159

실시예 5

10⁶개의 413-BCR 세포를 48시간 동안 100 U/ml IFN-γ와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 PBS로 5회 세척한 다음, 바이오틴을 높은 몰 비율 (BSA 1몰 대 바이오틴 20몰)로 사용하여, 2시간 동안 바이오틴-BSA 100 ㎍/ml 또는 10 ㎍/ml (2 ml)과 함께 인큐베이션하였다. 그런 후, 세포를 IFN-γ + 바이오틴-BSA가 포함된 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이 세포를 PBS로 5회 세척하고, 밤새 Triton-100^TM으로 가용화하였다. 항-마우스 MHC I 또는 MHC II (PBS 중의 10 ㎍/ml) 포착 항체를 96웰 ELISA 플레이트에 코팅하였다. 이 플레이트를 1시간 동안 PBS 중의 3% BSA로 블록킹하였다. 가용화된 세포가 포함된 샘플을 실온에서 4시간 인큐베이션하였다. 플레이트를 헹구고, 스트렙타비딘-퍼옥시다제 접합체를 37℃에서 45분간 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 5회 헹구고, TMB 기질을 첨가하였다. 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였다. 대조군 샘플 (무처리 세포)과 처리 세포 간의 비를 도 6에 나타낸다.

본 실시예는, BSA가 용량 의존적인 방식으로 IFN-γ로 사전-처리된 암 세포에 의해 발현되는 MHC II에 결합할 수 있다는 것을, 보여준다.

실시예 6

인간 PBL로 재구성한 SCID-beige 마우스 그룹을 본원에 기술된 자가 암 백신을 생체내 평가하기 위해 재구축하였다. 보다 구체적으로, 25마리의 SCID-beige 마우스 (암컷, 8-10주령)에 부분 매치되는 공여체 (HLA type A2, B44, DR13)의 10⁷ hPBL을 i.p. (0.5 mL/mouse with 20% v/v Matrigel)로 주사하였다. hIgG 수준을 검증하기 위해 재구축한지 7일 및 14일째에 마우스 혈액을 채혈하였다. hIgG가 10 ㎍/mL 보다 높은 마우스들만 이후 실험들에 사용하였다. 표 6은 재구축한 마우스들의 hIgG 측정치를 나타낸다.

표 6: 본 표는 재구축한 마우스의 hIgG 측정치를 나타내며, 이후의 실험에서 사용되는지 아닌지를 표시한다.

	h-IgG ㎍/ml
마우스	7일	14일
1-1	0	15.6	재구축
1-2	0	1919.7	재구축
1-3	ND	560	재구축
1-4	ND	211.2	재구축
1-5	ND	26.4	재구축
2-1	0	407.9	재구축
2-2	0	338.6	재구축
2-3	ND	99.2	재구축
2-4	ND	19.4	재구축
2-5	ND	3.4	제외 (Deleted)
3-1	0	37.8	재구축
3-2	0	120.5	재구축
3-3	ND	10.2	재구축
3-4	ND	229.6	재구축
3-5	ND	7.3	제외
4-1	0	12.2	재구축
4-2	0	1.7	제외
4-3	ND	0	제외
4-4	ND	2.3	제외
4-5	ND	384.7	재구축
5-1	0	0	제외
5-2	0	13.2	재구축
5-3	ND	1396.5	재구축
5-4	ND	5.4	제외
5-5	ND	3.6	제외

ND, 검출 안됨

SCID-Beige 마우스들 중 17 (68%)가 14일까지 재구축되었다. 이들 동물을 자가 암 백신을 생체내 평가하기 위해 사용하였다. 이들 마우스를 하기와 같이 면역화를 위해 4개의 그룹으로 랜덤 분할하였다:

A) N=5, 10⁶ 방사선 처리한 변형된 종양 세포, 여기서, 종양 세포는 48시간 동안 100 U/ml IFN-γ + 24시간 동안 50 ㎍/ml BSA를 전술한 바와 같이 처리하여 변형시킴;

B) N=4, 10⁶ 방사선 처리한 변형된 종양 세포, 여기서, 종양 세포는 72시간 동안 IFN-γ로 처리하여 변형시킴;

C) N=4, 100 ㎍/마우스 BSA; 및

D) N=4, PBS.

면역화와 시험 감염에 사용되는 종양 세포는 세포주 SW 1116 (HLA type A2, 23, B 44,60, DR 11,13,52, DQ 6,7)로부터 유래되었다. 면역화 프로토콜을 표 7에 나타낸다. 모든 그룹들을 Ribi 보강제로 i.p.로 면역화하였다. RiBi는 이의 독성으로 인해 1차 면역화에만 사용하였다.

표 7: 본 표는 이러한 생체내 모델에서 사용된 면역화와 시험 감염의 프로코톨을 기술한다.

일	공정
-14	면역화
-7	면역화
0	종양 시험 감염 - 2.5 X 10⁶ SW 1116 세포, s.c.
+3	면역화
+8	면역화
+15	면역화

본 실험의 결과들을 표 8과 도 7에 나타낸다. 이들 결과는, BSA 또는 PBS 만을 이용한 면역화를 제공받은 마우스들 모두 시험 감염 후 17일까지 검출가능한 종양을 가지고 있다는 것을 보여준다. 대조적으로, 변형된 암 세포를 제공받은 마우스는 시험 감염 후 17일까지 검출가능한 종양이 없었으며, 5마리 중 2마리만 시험 감염 후 21일까지 검출가능한 종양을 가지고 있었다.

표 8: 본 표는 대조군 제형화로 백신 접종한 마우스와 비교하여 자가 암 백신으로 백신 접종한 마우스에서의 종양 발생율을 보여준다.

처리군	9일 종양 (N)	17일 종양 (N)	21일 종양 (N)
A (N=5)	0	0	2
B (N=4)	0	0	2
C (N=4)	2	4	4
D (N=4)	1	4	4

실시예 7

자가 암 백신을 인간에서 검사하였다. 외과적 시술 또는 생검으로 세포를 수득하였다. 외과의는 육안으로 종양 세포가 함유된 것으로 보이는 종양의 소형 절편 (최대 - 약 0.5 cm³)을 수득하였다. 바늘 생체 검사를 이용하는 경우, 복수의 바늘 샘플을 채집하였다. 세포를 이동 배지 (RPMI 1640, +20% FBS, + 페니실린, + 스트렙토마이신 또는 젠타마이신, + 10 mM 옥살로아세트산, 4.5 mM 피루베이트, 및 2.0 U/ml 인슐린 (인간 또는 소))가 든 튜브에 즉시 넣었다. 수집한 샘플을 수집하고 30분에서 72시간 후 세포 배양 랩에서 가공할 때까지 얼음 위에 두었다 (약 2 - 8℃). 전형적으로, 종양을 수집하여 종양을 가공하기 까지의 시간은 약 24시간 보다 짧았다. 물질이 실험실에 도착하면, 세포를 차가운 RPMI 1640으로 3번 헹군 다음, 유리 글라이딩, 가위 또는 메스를 이용하여 기계적으로 해체하였다. 또한, 세포를 예를 들어 트립신을 이용하여 효소적으로 분해시켰으나, 표층 세포막 단백질에 지장을 주지 않기 때문에 기계적 해체를 사용하였다. 일부 종양은 그 자체로 복수액 또는 골수 샘플에 존재하였다. 이러한 경우, 기계적 해체는 필요하지 않았다.

해체시킨 세포를 일부 작은 종양 단편과 더불어 VAP 배지 (RPMI 1640, + 10% FBS, + 페니실린, + 스트렙토마이신 또는 젠타마이신, + 10 mM 옥살로아세트산, 4.5 mM 피루베이트, 및 2.0 U/ml 인슐린 (인간 또는 소))를 이용한 배양에 배치하였다. T25 또는 T75 배양 플라스크를 사용하였다. 세포가 적어도 7 x 10⁷개에 도달하는데 걸리는 평균 시간은 28일이었지만, 이들 샘플에서 범위는 10 - 91일이었다. 배지는 3일 마다 또는 필요에 따라 종양 세포 증식 특징들에 따라 교체하였다.

충분한 세포 (적어도 3 컨플루언트 T 25 플라스크)가 존재하면, 신선한 VAP 배지 (7 ml)에 ml 당 1000 IU의 IFN-γ를 T25 플라스크에 첨가하였다. IFN-γ를 첨가한 세포를 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 후, 세포를 5 ml RPML 1640으로 3번 헹구고, RPMO 1640에서 BSA 50 ㎍/ml을 첨가하여 37℃에서 인큐베이션하였다. BSA-함유 배지를 제거한 다음, VAP 배지 + 1000 U IFN-γ + 50 ㎍/ml BSA로 교체하여, 다시 24시간 인큐베이션하였다. 이러한 인큐베이션 시간이 경과한 후, 세포를 스크랩퍼로 기계적으로 회수하여, 염수로 5회 헹구었다. 헹군 세포를 ml 당 세포 적어도 1x10⁷개가 되도록 멸균 PBS에 재현탁하여, 1 ml 마이크로 튜브에 넣었다. 각 환자 샘플을 유세포 측정으로 평가하여, MHC I 및 MHC II의 존재 뿐만 아니라 이용가능한 경우 표면 종양 마커의 존재를 검증하였다.

그런 다음, 샘플에 200 Gy로 방사선을 조사하였다. 방사선 처리한 세포를, 각각 세포 150 ㎕ (대략 세포 10⁷개)이 든 마이크로 튜브 7개 이상으로 나눠 넣었다. 샘플 1 및 2개가 든 튜브들을 2-8℃에 냉장 보관한 다음, 나머지 샘플들은 -80℃에서 냉동하였다. BCG를 미생물 10⁷개로 첨가하여 (50 ul), 처음 2개의 샘플의 최종 부피를 200 ㎕ (세포 150 ㎕ + BCG 50 ㎕)로 만들었다. 그런 다음, 샘플을 튜베르쿨린 시린지로 이동시켜, 팔에 진피내로 주사하였다. 처음 2번의 면역화는 7일 간격으로 다른 팔에 행하였다. 1차 면역화하기 전에, 가능한 경우 체액성 면역 반응과 세포성 면역 반응을 분석하기 위해 혈액을 채혈하였다.

방사선 처리한 종양 세포만 함유된 백신의 3차 투여량을 PBS로 희석하고 (세포 10⁷개), 2차 투여 후 7일째에 접종하였다. 4차 투여는 다른 쪽 팔에 3차와 동일한 방식으로 수행하였다. 5차 및 6차 투여는 30일 간격으로 수행하였다. 마지막으로, 7차 투여는 6차 투여 후 3개월째에 투여하였다. 생물학적 물질을 입수가능하다면, 이후의 투여는 환자 발생에 따라 3달 또는 2달 마다 투여하였다. 임상 및 생화학적 평가는 각 투여시에 수행하였다. 표준 암 치료는 면역화 공정 전 기간 동안 유지하였다. 지연형 과민 (DTH) 반응이 각각의 면역화 후 24, 48 또는 72시간 째에 측정되었으나, BCG가 함유된 최초 2번의 투여시에는 제외되었다. 표 9에 기술된 바와 같이 다수의 환자들과 종양 부위들에서 성공적으로 백신이 준비되었다.

표 9: 본 표는 자가 암 세포 백신이 성공적으로 준비된 환자의 수와 종양 부위를 나타낸다.

종양 부위	환자의 수
전립선	159
유방	7
장	5
폐	5
뇌	3
위	3
흑색종	3
난소	3
췌장	3
갑상선	3
담낭	3
자궁경부암	2
간	2
중피종	2
미정 부위	2
직장	2
신장	2
육종	2
두경부	2
골수종	1
방광	1
식도	1
눈물샘	1

성공적으로 백신을 제조한 후, 백신을 이용하여 인간을 치료하였으며, 안전하고 효과적인 것으로 확인되었다. 본 실험의 결과를 표 10과 상응하는 도 8에 나타낸다.

표 10: 본 표는 자가 암 백신으로 치료한 다양한 타입의 암을 가진 환자 60명의 생존율을 나타낸 것이다.

N	60	26	5	3	3	4	3
개월	총	전립선	유방	췌장	흑색종	장과 직장	난소
0	100%	100%	100%	100%	100%	100%	100%
1	100%	100%	100%	100%	100%	100%	100%
1.25	100%	100%	100%	100%	100%	100%	100%
1.5	97%	100%	100%	100%	100%	100%	100%
1.75	90%	96%	100%	67%	100%	100%	100%
2	90%	96%	100%	67%	100%	100%	100%
3	80%	96%	100%	33%	100%	75%	67%
4	75%	88%	100%	33%	100%	75%	67%
7	67%	81%	80%	33%	100%	75%	0%
8	58%	73%	80%	0%	100%	50%	0%
9	57%	69%	80%	0%	100%	50%	0%
10	55%	69%	80%	0%	100%	50%	0%
11	53%	69%	80%	0%	100%	50%	0%
12	53%	69%	80%	0%	100%	50%	0%
13	53%	69%	80%	0%	100%	50%	0%
14	50%	69%	80%	0%	67%	50%	0%
15	50%	69%	80%	0%	67%	50%	0%

실시예 8

이제는 전립선 암에 걸린 환자 5명에 대한 I상 임상 실험의 사례 연구들을 기술하며, 백신 접종 전, 중 및 이후의 전립선 특이 항원 (PSA) 측정 결과를 제시한다. 백신 준비 및 치료는 실시예 7에서와 같이 수행하였다.

환자 1:

환자 1은 수술 후 269일 째에 개시하여 매달 기준으로 호르몬 차단 요법으로 치료하였다. 자가 암 백신의 1차 투여는 441일에 제공하였으며, 이후 투여는 448, 454, 461, 491, 521 및 611일에 제공하였다. 도 9에서 보여지는 바와 같이, 373일째에 측정된 바와 같이 호르몬 차단이 먼저 PSA 수준 저하를 야기하였지만, 이는 다시 증가하기 시작하여 463일째에 최고에 도달하였다. 자가 암 백신을 처리하면 이 환자에서 PSA 수준이 추가로 지속적으로 감소되어 587일 및 651일에 최저 0.03로 감소되었다.

환자 2:

환자 2는 수술 후 14일째에 개시하여 매달 기준으로 호르몬 차단 요법으로 치료하였다. 자가 암 백신의 1차 투여는 168일에 제공하였으며, 이후 투여는 175, 182, 189, 219, 249 및 339일에 제공하였다. 도 10에서 보여지는 바와 같이, 138일째에 측정된 바와 같이 호르몬 차단이 먼저 PSA 수준 저하를 야기하였지만, 이는 다시 증가하기 시작하여 164일째에 최고에 도달하였다. 자가 암 백신을 처리하면 수준이 다시 증가하기 시작하는 402일째까지 이 환자에서 PSA 수준이 추가로 지속적으로 감소되었다.

환자 3:

환자 3는 외과적으로 샘플을 수집하기 전 6개월에 개시하여 매달 기준으로 호르몬 차단 요법으로 치료하였다. 자가 암 백신의 1차 투여는 68일에 제공하였으며, 이후 투여는 74, 79, 86, 107, 146, 236, 400, 520 및 684일에 제공하였다. 도 11은, 심지어 호르몬-내성 환자에서도, 호르몬 차단과 백신 치료의 조합이 이 환자에서 PSA 수준의 꾸준한 감소를 야기한다는 것을 보여준다.

환자 4:

환자 4는 외과적으로 샘플을 수집하기 전 0일에 개시하여 매달 기준으로 호르몬 차단 요법으로 치료하였다. 자가 암 백신의 1차 투여는 5일에 제공하였으며, 이후 투여는 11, 18, 26, 55, 83 및 173일에 제공하였다. 도 12는, 호르몬 차단과 백신 치료의 조합이 이 환자에서 44일째의 최고 354에서, 측정을 기록한 마지막 날인 136일째 최저 175로, PSA 수준의 감소를 야기한다는 것을 보여준다.

환자 5:

환자 5는 약 30일에 수술 즉시 개시하여 매달 기준으로 호르몬 차단 요법으로 치료하였다. 자가 암 백신의 1차 투여는 141일에 제공하였으며, 이후 투여는 148, 155, 162 및 192일에 제공하였다. 도 13은, 호르몬 차단과 백신 치료의 조합이 이 환자에서 43일째의 최고 50.3에서, 측정을 기록한 마지막 날인 180일째 최저 1.12로, PSA 수준의 감소를 야기한다는 것을 보여준다.

실시예 9

본원에 기술된 자가 암 백신은 국소 진행된 전립선 암 환자에 대한 초기 I 상에서 안전한 것으로 입증되었다. 이 실험을 IIb 상으로 확장시켰다. IIb 상 실험의 일차 엔드포인트는 국소 진행된 (T2 및 T3) 전립선 암 환자에서의 임상 반응 (PSA 수준 및 생존)이었으며, 2차 엔드포인트로서 안전성과 면역 반응이었다.

방법:

107명의 전립선 절제 수술 환자에서 종양 세포를 수집하였다 (HCPA - Porto Alegre - Brazil). 동반 상병 (co-morbidity) 요인을 가진 T4, T3 또는 T2의 전립선 암 환자 63명 (59%)이 참여하였다. 환자 23명에게는 상기 백신을 투여하였고, 40명은 대조군이었다. 백신 그룹은 더 진행된 종양을 앓고 있는 환자들로 구성되며, 백신 그룹에 속하는 환자들 중 83%가 T3 또는 T4 전립선 암을 가지고 있는 반면, 대조군은 35%에 불과하였다. 백신 그룹에서, 환자의 22%가 N+ (국소 림프절로 퍼짐)이었고, 대조군의 경우 환자의 2.5%가 N+였다. 수술 전 평균 PSA는 백신 그룹의 경우 16.15 ng/ml이었고, 대조군은 15.74 ng/ml이었다. 평균 글리슨 점수는 7.5 (백신 그룹) 및 6.9 (백신 비-접종군)이었으며, 연령은 64 (백신 비-접종군) 및 63 (백신 그룹)으로 비슷하였다.

자가 암 백신을 실시예 7에 따라 제조하여, 4주간 매주 1회로 진피내 주사로 제공한 다음, 2달 간 매달 1회로, 이후 3달간 1회로 제공하였다. 또한, 자가 암 백신의 1차 2회 투여시에는 보강제로서 BGC를 함유시켰다. DTH는 BCG를 포함시키지 않은 백신을 투여한 지 48시간 후에 측정하였다. 성분채집술로 베이스라인에서, 그리고 T 세포 증식 분석으로 D54일에 일부 환자들에서 PBMC를 수집하였다. 임상 추출을 수행하였으며, 모든 표준적인 관리를 모든 환자들에게 제공하였다.

결과:

총 평균 추적 기간은 7년이었다. 백신에 기인한 3 또는 4단계의 독성은 나타나지 않았다. 부작용도 주사 부위 반응으로 1 또는 2단계로 거의 한정되었다. DTH는 백신 주사한 환자의 73%에서 양성 (5 mm 이상)이었다. 암 관련 사망율은 백신 그룹의 경우 4% (1/23)였고, 백신 비-접종 군은 10% (4/40)였다 (도 14A). 7년 후 평균 PSA 수준은 백신 그룹의 경우 20.4 ng/ml, 백신 비-접종 군의 경우 42 ng/ml이었다 (도 14B). 5년간 추적한 후, 백신 환자의 70% (16/23)에서는 PSA가 검출 불가하였으며 (< 0.04 ng/ml), 백신 비-접종 환자는 42.5% (17/40)였다 (p=0.03853) (도 14C). 백신 접종한 환자들에서 시험관내 특이적인 T 세포 증식이 확인되었다.

결론:

본원에 기술된 자가 암 백신은 안전하며, 허용성이 우수한 백신이다. 선정된 환자에서 임상적인 활성과 면역 변화에 대한 증거가 확인된다.

상기 내용은 일반적으로 본 발명을 설명한다. 구체적인 용어들이 본원에 사용되지만, 이들 용어는 설명하기 위한 의미일 뿐 한정하고자 하는 의도는 아니다.

모든 간행물, 특허 및 특허 출원들은, 각각의 개개 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 그 전체 내용이 원용에 의해 포함되는 것으로 표시된 바와 같은 수준으로 이들의 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.

본 발명에 대한 바람직한 구현예들이 상세하게 본원에 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면, 본 발명의 사상 또는 첨부된 청구항의 범위내에서 이에 대한 변형을 가할 수 있다는 것을 알 것이다.

Claims

분리된 면역원성 암 세포를 제조하는 방법으로서,
상기 방법은,
- 개체로부터 분리된 암 세포 상에서 MHC II의 발현을 유도하는 단계;
- 상기 암 세포를 비-자기 (non-self) 항원과 인큐베이션하여, 상기 비-자기 항원을 발현된 MHC II에 결합시키는 단계; 및
- 상기 암 세포를 사멸시키는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, MHC II 유도 후 MHC II-양성 세포를 동정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, MHC II-양성 암 세포를 MHC II-음성 암 세포로부터 분리하여, MHC II-양성 세포를 함유한 정제된 조성물을 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 개체로부터 상기 암 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 세포는 생체검사 중에 또는 외과적 종양 제거 중에 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 상기 암 세포를 냉동-보존하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포를 치사 수준의 방사선 조사, 냉동 보존제 사용없이 동결 및 해동, 또는 세포 독성 화합물의 처리에 의해 사멸시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 세포를 치사 수준의 방사선 조사에 의해 사멸시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MHC II는 MHC II-유도제를 이용하여 상기 암 세포 상에서 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 MHC II-유도제가 사이토카인인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 사이토카인이 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-4, IL-13, IL-23, TNF-α, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 사이토카인이 IFN-γ인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 MHC II-유도제가 MHC II 발현 구조체인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 MHC II-유도제가 상기 암 세포와 융합시킬 MHC II-발현 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 비-인간 (non-human) 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 티로글로불린, β-갈락토시다제, 덱스트란, 폴리라이신, 투베르쿨린 유래 단백질, 오브알부민 (OVA), 소 혈청 알부민 (BSA), 양 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민 또는 어류 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 오브알부민 또는 KLH인 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 소 (bovine) 항원이 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한항에 있어서, 상기 유도 단계는 BSA 무첨가 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
세포의 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현하는 분리된 면역원성 암 세포로서,
상기 MHC I에는 암 항원이 결합하고, 상기 MHC II에는 비-자기 항원이 결합하는 것인, 세포.
제22항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 비-인간 항원인 것을 특징으로 하는 세포.
제23항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 티로글로불린, β-갈락토시다제, 덱스트란, 폴리라이신, 투베르쿨린 유래 단백질, 오브알부민 (OVA), 소 혈청 알부민 (BSA), 양 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민 또는 어류 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
제24항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 오브알부민 또는 KLH인 것을 특징으로 하는 세포.
제24항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA인 것을 특징으로 하는 세포.
제22항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 소 항원이 아닌 것을 특징으로 하는 세포.
제27항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA가 아닌 것을 특징으로 하는 세포.
세포의 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현하는 분리된 면역원성 암 세포를 포함하는 면역원성 조성물로서,
상기 MHC I에는 암 항원이 결합하고, 상기 MHC II에는 비-자기 항원이 결합하는 것인, 면역원성 조성물.
제29항에 있어서, 하나 이상의 부형제, 담체, 완충제, 안정제, 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 비-인간 항원인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제31항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 티로글로불린, β-갈락토시다제, 덱스트란, 폴리라이신, 투베르쿨린 유래 단백질, 오브알부민 (OVA), 소 혈청 알부민 (BSA), 양 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민 또는 어류 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제32항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 오브알부민 또는 KLH인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제32항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 소 항원이 아닌 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제35항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA가 아닌 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제29항 내지 제36항 중 어느 한항에 있어서, 상기 조성물에서 총 세포 수를 기준으로 MHC II-양성 암 세포를 약 5% - 약 100%로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제37항에 있어서, MHC II-양성 암 세포를 약 50% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제38항에 있어서, MHC II-양성 암 세포를 약 90% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
제39항에 있어서, MHC II-양성 암 세포를 약 99% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
세포의 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현하는 분리된 면역원성 암 세포를 포함하는 자가 암 백신으로서,
상기 MHC I에는 암 항원이 결합하고, 상기 MHC II에는 비-자기 항원이 결합하는 것인, 백신.
제41항에 있어서, 하나 이상의 보강제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제42항에 있어서, 상기 보강제가 모노포스포릴 리피드 A/합성 트레할로스 다이코리노마이콜레이트 (MPL-TDM), AS021/AS02, 비이온성 블록 코폴리머 보강제, CRL 1005, 알루미늄 포스페이트 (AlPO₄), R-848, 이미퀴모드, PAM3CYS, 폴리 (I:C), 록소리빈, 바실 칼메테-구에린 (BCG), 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum), CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), 콜레라 독소 유래 항원, CTA 1-DD, 리포폴리사카라이드 보강제, 프로인트 완전 보강제, 프로인트 불완전 보강제, 사포닌, 미네랄 겔, 알루미늄 하이드록사이드, 표면 활성 물질, 리소레시틴 (lysolecithin), 플루로닉 폴리올 (pluronic polyol), 폴리음이온 (polyanion), 펩타이드, 수중 오일 또는 탄화수소 에멀젼, MF59, Montanide ISA 720, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 다이니트로페놀, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
제43항에 있어서, 상기 보강제가 BCG인 것을 특징으로 하는 백신.
제41항 내지 제44항 중 어느 한항에 있어서, 하나 이상의 부형제, 담체, 완충제, 안정제, 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제41항 내지 제45항 중 어느 한항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 비-인간 항원인 것을 특징으로 하는 백신.
제46항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 티로글로불린, β-갈락토시다제, 덱스트란, 폴리라이신, 투베르쿨린 유래 단백질, 오브알부민 (OVA), 소 혈청 알부민 (BSA), 양 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민 또는 어류 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
제47항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 오브알부민 또는 KLH인 것을 특징으로 하는 백신.
제47항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA인 것을 특징으로 하는 백신.
제41항 내지 제45항 중 어느 한항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 소 항원이 아닌 것을 특징으로 하는 백신.
제50항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA가 아닌 것을 특징으로 하는 백신.
제41항 내지 제51항 중 어느 한항에 있어서, 상기 백신에서 총 세포 수를 기준으로 MHC II-양성 암 세포를 약 5% - 약 100%로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제52항에 있어서, MHC II-양성 암 세포를 약 50% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제53항에 있어서, MHC II-양성 암 세포를 약 90% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
[청구항 53]
제54항에 있어서, MHC II-양성 암 세포를 약 99% 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
[청구항 54]
제41항 내지 제53항 중 어느 한항에 있어서, 다회 접종을 위해 분할 투여 (divided doses)로 제공되는 것을 특징으로 하는 백신.
제54항에 있어서, 7회 분할 투여로 제공되는 것을 특징으로 하는 백신.
제41항 내지 제55항 중 어느 한항에 있어서, 각 투여시 암 세포 약 1 x 10⁴ - 약 1 x 10⁹개를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제56항에 있어서, 각 투여시 암 세포 약 1 x 10⁷개를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
분리된 면역원성 암 세포를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암 치료 방법으로서,
상기 세포는 상기 개체의 것이며, 세포 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현하며,
상기 MHC I에는 암 항원이 결합하고, 상기 MHC II에는 비-자기 항원이 결합하는 것인, 치료 방법.
제58항에 있어서, 상기 세포는 면역원성 조성물로서 제형화되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제58항에 있어서, 상기 세포는 암 백신으로서 제형화되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제58항 내지 제60항 중 어느 한항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 비-인간 항원인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제61항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 티로글로불린, β-갈락토시다제, 덱스트란, 폴리라이신, 투베르쿨린 유래 단백질, 오브알부민 (OVA), 소 혈청 알부민 (BSA), 양 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민 또는 어류 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제62항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 오브알부민 또는 KLH인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제62항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제58항 내지 제60항 중 어느 한항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 소 항원이 아닌 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제65항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA가 아닌 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제58항 내지 제66항 중 어느 한항에 있어서, 투여되는 세포의 총 수를 기준으로 투여되는 상기 암 세포의 약 5% - 약 100%가 MHC II-양성 암 세포인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제67항에 있어서, 투여되는 상기 암 세포의 약 50% 이상이 MHC II-양성 암 세포인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제68항에 있어서, 투여되는 상기 암 세포의 약 90% 이상이 MHC II-양성 암 세포인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제69항에 있어서, 투여되는 상기 암 세포의 약 99% 이상이 MHC II-양성 암 세포인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제58항 내지 제70항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포는 통상적인 화학요법, 방사선치료, 호르몬치료 및 바이오테라피 중 한가지 이상과 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제58항 내지 제71항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포는 외과적 종양 절제 이전 또는 이후에 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제58항 내지 제72항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포는 다회 투약 (multiple doses)으로 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제73항에 있어서, 상기 세포는 소정의 수 주간 동안 매주 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제73항에 있어서, 상기 세포는 진행중인 유지 요법으로서 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제75항에 있어서, 상기 세포는 매주, 매달, 3달 마다, 6달 마다, 매해 또는 이들의 조합으로 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제58항 내지 제76항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포는 암 재발 신호가 관찰될 때 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
암을 치료하기 위한, 자가 유래의 분리된 면역원성 암 세포의 용도로서,
상기 세포는 세포 표면에 MHC I과 MHC II 둘다를 발현하며, 상기 MHC I에는 암 항원이 결합하고, 상기 MHC II에는 비-자기 항원이 결합하는 것인, 용도.
제78항에 있어서, 상기 세포는 면역원성 조성물로서 제형화되는 것을 특징으로 하는 용도.
제78항에 있어서, 상기 세포는 암 백신으로서 제형화되는 것을 특징으로 하는 용도.
제78항 내지 제80항 중 어느 한항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 비-인간 항원인 것을 특징으로 하는 용도.
제81항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 티로글로불린, β-갈락토시다제, 덱스트란, 폴리라이신, 투베르쿨린 유래 단백질, 오브알부민 (OVA), 소 혈청 알부민 (BSA), 양 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민 또는 어류 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제82항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 오브알부민 또는 KLH인 것을 특징으로 하는 용도.
제82항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA인 것을 특징으로 하는 용도.
제78항 내지 제80항 중 어느 한항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 소 항원이 아닌 것을 특징으로 하는 용도.
제85항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA가 아닌 것을 특징으로 하는 용도.
제78항 내지 제86항 중 어느 한항에 있어서, 세포의 총 수를 기준으로 약 5% - 약 100%의 MHC II-양성 암 세포의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제87항에 있어서, 약 50% 이상의 MHC II-양성 암 세포의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제88항에 있어서, 약 90% 이상의 MHC II-양성 암 세포의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제89항에 있어서, 약 99% 이상의 MHC II-양성 암 세포의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
제78항 내지 제90항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포는 통상적인 화학요법, 방사선치료, 호르몬치료 및 바이오테라피 중 한가지 이상과 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
제78항 내지 제91항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포는 외과적 종양 절제 이전 또는 이후에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
제78항 내지 제92항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포는 다회 투약 (multiple doses)으로 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
제93항에 있어서, 상기 세포는 소정의 수 주간 매주 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
제93항에 있어서, 상기 세포는 진행중인 유지 요법으로서 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
제95항에 있어서, 상기 세포는 매주, 매달, 3달 마다, 6달 마다, 매해 또는 이들의 조합으로 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
제78항 내지 제96항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포는 암 재발 신호가 관찰될 때 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
환자가 분리된 면역원성 암 세포를 이용한 치료에 대해 환자의 적격성 여부를 확인하는 방법으로서,
- 개체로부터 유래된 분리된 암 세포에 MHC II-유도제를 처리하는 단계; 및
- 상기 암 세포를 스크리닝하여, 발현된 MHC II의 존재를 확인하는 단계를 포함하며,
상기 암 세포 상에 발현된 MHC II의 존재는 상기 환자가 상기한 치료에 적격함을 의미하는 것인, 방법.
제99항에 있어서, 개체로부터 상기 암 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제99항에 있어서, 상기 세포는 생체검사 중에 또는 외과적 종양 제거 중에 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제98항 또는 제100항에 있어서, 상기 MHC II-유도제가 사이토카인인 것을 특징으로 하는 방법.
제101항에 있어서, 상기 사이토카인이 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-4, IL-13, IL-23, TNF-α, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제102항에 있어서, 상기 사이토카인이 IFN-γ인 것을 특징으로 하는 방법.
제98항 내지 제100항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MHC II-유도제가 MHC II 발현 구조체인 것을 특징으로 하는 방법.
제98항 내지 제100항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MHC II-유도제가 상기 암 세포와 융합시킬 MHC II-발현 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
암에 걸린 개체를 면역화하기 위한 암 백신으로서,
상기 암 백신은 상기 개체 자신으로부터 유래된 분리된 면역원성 암 세포를 포함하며,
상기 암 세포는 MHC II-유도제로 처리한 다음 비-자기 항원과 인큐베이션함으로써, 세포 표면 상에 MHC II에서 상기 비-자기 항원을 제시하도록 변형된 것이며;
상기 암 백신은 MHC II-발현 세포를 증가된 농도로 포함하도록 정제된 것임을 특징으로 하는, 백신.
면역원성 추출물의 제조 방법으로서,
- 개체로부터 분리된 암 세포 상에서 MHC II의 발현을 유도하는 단계;
- 상기 암 세포를 비-자기 항원과 인큐베이션하여, 상기 비-자기 항원을 발현된 MHC II에 결합시키는 단계; 및
- 상기 암 세포로부터 비-자기 항원이 결합된 MHC II를 추출하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제107항에 있어서, 상기 면역원성 추출물이 막 분획 (membrane fraction)인 것을 특징으로 하는 방법.
제107항에 있어서, 상기 면역원성 추출물이 정제된 MHC II를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제107항 내지 제109항 중 어느 한항에 있어서, MHC II를 유도한 후 MHC II-양성 세포를 동정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제110항에 있어서, MHC II-양성 암 세포를 MHC II-음성 암 세포로부터 분리하여, MHC II-양성 세포를 함유한 정제된 조성물을 수득하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제107항 내지 제111항 중 어느 한항에 있어서, 개체로부터 상기 암 세포를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1112항에 있어서, 상기 세포는 생체검사 중에 또는 외과적 종양 제거 중에 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제107항 내지 제113항 중 어느 한항에 있어서, 상기 암 세포를 냉동-보존하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제107항 내지 제114항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포는 치사 수준의 방사선 조사, 냉동 보존제 사용없이 동결 및 해동, 또는 세포 독성 화합물의 처리에 의해 사멸시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제115항에 있어서, 상기 세포를 치사 수준의 방사선 조사에 의해 사멸시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제107항 내지 제116항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MHC II는 MHC II-유도제를 이용하여 상기 암 세포 상에서 유도되는 것을 특징으로 하는 방법.
제117항에 있어서, 상기 MHC II-유도제가 사이토카인인 것을 특징으로 하는 방법.
제118항에 있어서, 상기 사이토카인이 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, IL-4, IL-13, IL-23, TNF-α, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제119항에 있어서, 상기 사이토카인이 IFN-γ인 것을 특징으로 하는 방법.
제117항에 있어서, 상기 MHC II-유도제가 MHC II 발현 구조체인 것을 특징으로 하는 방법.
제117항에 있어서, 상기 MHC II-유도제가 상기 암 세포와 융합시킬 MHC II-발현 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제107항 내지 제122항 중 어느 한항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 비-인간 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
제123항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 티로글로불린, β-갈락토시다제, 덱스트란, 폴리라이신, 투베르쿨린 유래 단백질, 오브알부민 (OVA), 소 혈청 알부민 (BSA), 양 혈청 알부민, 염소 혈청 알부민 또는 어류 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제117항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 오브알부민 또는 KLH인 것을 특징으로 하는 방법.
제117항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA인 것을 특징으로 하는 방법.
제107항 내지 제122항 중 어느 한항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 소 (bovine) 항원이 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
제127항에 있어서, 상기 비-자기 항원이 BSA가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
제107항 내지 제128항 중 어느 한항에 있어서, 상기 유도 단계는 BSA 무첨가 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제22항 내지 제28항 중 어느 한항에 따른 세포의 면역원성 추출물로서,
상기 추출물은 상기 세포로부터 유래된 비-자기 항원이 결합된 MHC II를 포함하는 것을 특징으로 하는, 추출물.
제130항에 있어서, 상기 추출물이 막 분획 (membrane fraction)인 것을 특징으로 하는 추출물.
제130항에 있어서, 상기 추출물이 정제된 MHC II를 포함하는 것을 특징으로 하는 추출물.
제130항 내지 제132항 중 어느 한항에 따른 추출물을 포함하는 면역원성 조성물.
제133항에 있어서, 하나 이상의 부형제, 담체, 완충제, 안정제, 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제130항 내지 제132항 중 어느 한항에 따른 추출물을 포함하는 자가 암 백신.
제135항에 있어서, 하나 이상의 보강제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
제136항에 있어서, 상기 보강제가 모노포스포릴 리피드 A/합성 트레할로스 다이코리노마이콜레이트 (MPL-TDM), AS021/AS02, 비이온성 블록 코폴리머 보강제, CRL 1005, 알루미늄 포스페이트 (AlPO₄), R-848, 이미퀴모드, PAM3CYS, 폴리 (I:C), 록소리빈, 바실 칼메테-구에린 (BCG), 코리네박테리움 파르붐, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN), 콜레라 독소 유래 항원, CTA 1-DD, 리포폴리사카라이드 보강제, 프로인트 완전 보강제, 프로인트 불완전 보강제, 사포닌, 미네랄 겔, 알루미늄 하이드록사이드, 표면 활성 물질, 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩타이드, 수중 오일 또는 탄화수소 에멀젼, MF59, Montanide ISA 720, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 다이니트로페놀, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
제137항에 있어서, 상기 보강제가 BCG인 것을 특징으로 하는 백신.
제135항 내지 제138항 중 어느 한항에 있어서, 하나 이상의 부형제, 담체, 완충제, 안정제, 또는 이들의 조합을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신.
암 치료 방법으로서,
제130항 내지 제132항 중 어느 한항에 따른 추출물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며,
상기 세포가 상기 개체의 세포인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제140항에 있어서, 상기 추출물은 면역원성 조성물로서 제형화되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제140항에 있어서, 상기 추출물은 암 백신으로서 제형화되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제140항 내지 제142항 중 어느 한항에 있어서, 상기 추출물은 통상적인 화학요법, 방사선치료, 호르몬치료 및 바이오테라피 중 한가지 이상과 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제140항 내지 제143항 중 어느 한항에 있어서, 상기 추출물은 외과적 종양 절제 이전 또는 이후에 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제140항 내지 제144항 중 어느 한항에 있어서, 상기 추출물은 다회 투약 (multiple doses)으로 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제145항에 있어서, 상기 추출물은 소정의 수 주간 동안 매주 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제145항에 있어서, 상기 추출물은 진행중인 유지 요법으로서 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제147항에 있어서, 상기 추출물은 매주, 매달, 3달 마다, 6달 마다, 매해 또는 이들의 조합으로 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제140항 내지 제148항 중 어느 한항에 있어서, 상기 추출물은 암 재발 신호가 관찰될 때 투여되는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
개체에서 암을 치료하기 위한 제130항 내지 제132항 중 어느 한항에 따른 추출물의 용도로서,
세포가 상기 개체의 세포인 것을 특징으로 하는 용도.
제150항에 있어서, 상기 추출물이 면역원성 조성물로서 제형화되는 것을 특징으로 하는 용도.
제150항에 있어서, 상기 추출물이 암 백신으로 제형화되는 것을 특징으로 하는 용도.
제150항 내지 제152항 중 어느 한항에 있어서, 상기 추출물은 통상적인 화학요법, 방사선치료, 호르몬치료 및 바이오테라피 중 한가지 이상과 동시에 또는 순차적으로 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
제150항 내지 제153항 중 어느 한항에 있어서, 상기 추출물은 외과적 종양 절제 이전 또는 이후에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
제150항 내지 제154항 중 어느 한항에 있어서, 상기 추출물은 다회 투약 (multiple doses)으로 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
제155항에 있어서, 상기 추출물은 소정의 수 주간 매주 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
제155항에 있어서, 상기 추출물은 진행중인 유지 요법으로서 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
제157항에 있어서, 상기 추출물은 매주, 매달, 3달 마다, 6달 마다, 매해 또는 이들의 조합으로 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
제150항 내지 제158항 중 어느 한항에 있어서, 상기 추출물은 암 재발 신호가 관찰될 때 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.