KR20140144785A

KR20140144785A - 유자(Citrus junos Tanaka) 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 학습 능력 증진용 조성물

Info

Publication number: KR20140144785A
Application number: KR1020130066451A
Authority: KR
Inventors: 양혜정; 권대영; 박선민; 김민정; 김종찬
Original assignee: 한국식품연구원; 호서대학교 산학협력단
Priority date: 2013-06-11
Filing date: 2013-06-11
Publication date: 2014-12-22

Abstract

본 발명은 유자 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 학습 능력 증진용 조성물 및 인지기능장애 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명은 Tau 단백질의 인산화를 억제시키고 뇌조직의 아밀로이드 축적을 억제시키며 인슐린 저항성을 감소시킴으로써 인지기능 장애를 예방하는 효과를 갖는다. 본 발명은 신경세포를 보호 및 손상의 예방 효과를 통하여 기억력 및 학습 능력을 증진시킬 수 있을 뿐 만 아니라 인지기능장애로 질환을 예방 및 치료 할 수 있는 효능을 발휘한다. 해마에서의 아밀로이드의 축적은 체내 인슐린 저항성 증가시키고 간에서의 인슐린 신호전달을 약화시키는데 유자추출물은 이러한 체내 인슐린 저항성의 악화를 방지하는 역할을 한다. 또한, 본 발명은 기억력 및 학습 능력의 증진 효능, 또는 인지기능장애를 예방 및 치료 효능을 가지는 유자 추출물의 의약 및 식품으로서의 기초적인 자료를 제공한다.

Description

유자(Citrus junos Tanaka) 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 학습 능력 증진용 조성물{Compositions for Improving Memory Power and Learning Ability Comprising Extract from Citrus junos Tanaka as Active Ingredient}

본 발명은 유자(Citrus junos Tanaka) 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 학습 능력 진용 조성물에 관한 것이다.

전세계적으로 알츠하이머(Alzheimer’s disease, AD)의 발병은 증가하고 있으며 2050년에는 알츠하이머로 인한 치사율이 1.2%에 이를 것이라고 추산되고 있다(1). 더욱이, 비만 및 뇌졸중이 발생이 높아지면서 젊은 사람들에게서도 치매의 발병률이 높아지고 있다(1-3)

해마(hippocampus)는 주로 인지 기능을 담당하며, 해마에서 신경세포 사멸 및/또는 시냅스의 기형이 발생하는 경우 인지 장애가 유발된다(4). AD의 발병 원인은 정확히 알려져 있지 않지만 주요 가설로 해마 및 대뇌피질에 β-아밀로이드가 축적되는 것이 AD의 발병 원인일 것이라고 알려져 있다(5, 6). 그러나, β-아밀로이드는 AD의 초기 및 진행과정에서 필수적인 것은 아니라고 알려져 있으며, 다른 AD 발병 원인으로 뇌(특히, 해마)에서의 인슐린 민감성 손상이 보고되고 있다(7, 8). 뇌에서 글루코오스/에너지 대사 이상은 두정후두(parietotemporal) 및 전두엽 부분에서 높은 글루코오스 수요를 유발하며 인슐린 신호전달을 손상시킨다(7, 8). 최근 연구에서 비만 및 고지방식이는 뇌 인슐린 저항성과 관련이 있으며 결과적으로 인지 장애를 유발한다는 것이 보고되었다(9-11). 당뇨병은 치매에 대한 주요한 위험요소로 뇌에서의 글루코오스 대사를 교란시키며 그로 인해 인지기능이 손상된다(10, 11). AD는 제3형 당뇨병이라고도 불리며, 치매는 말초 글루코오스 항상성이 악화되어 나타날 수 있다.

천연물들은 전통적으로 알츠하이머를 포함하는 다양한 질병을 예방 및 치료하는데 사용되어져 왔다. 녹차의 EGCG(epigallocatechin-3-gallate), 레스바라트롤과 같은 천연 화합물은 β-아밀로이드 레벨을 감소시킬 수 있으며 APP(amyloid precursor protein) 형질전환 마우스의 뇌 및 돌연변이 인간 APP0-과발현 세포에서 플라크를 감소시킬 수 있다(12, 13).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 기억력 및 학습능력을 효과적으로 증진시킬 수 있으며 인체에 안전한 물질, 특히 식물-유래 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 종래부터 한약재로 사용되고 있는 유자가 기억력 및 학습능력을 증진시키는데 매우 유효하다는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 유자 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 학습 능력 증진용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 유자 추출물을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 유자 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈당 항상성 손상의 예방용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 유자 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 학습 능력 증진용 식품 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 유자 추출물을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 유자 추출물을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 유자(Citrus junos Tanaka) 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 학습 능력 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 유자 추출물을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 기억력 및 학습능력을 효과적으로 증진시킬 수 있으며 인체에 안전한 물질, 특히 식물-유래 물질을 개발하고자 예의 연구 노력하였고, 그 결과 종래부터 한약재로 사용되고 있는 유자가 기억력 및 학습능력을 증진시키는데 매우 유효하다는 것을 규명하였다.

본 발명에서는 유자 추출물이 Tau 단백질의 인산화를 억제시키며, 뇌조직의 베타-아밀로이드 축적을 억제한다는 사실을 처음으로 밝혀내어 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있음을 확인하였으며, 실험동물을 이용한 수중미로(water maze) 시험, 수동적 회피(passive avoidance) 시험 등의 동물실험을 실시하여 유자 추출물이 아밀로이드 관련 질환인 알츠하이머 병, 기억력 감퇴, 인지장애 등에 효능이 있음을 확인하였다.

본 발명의 조성물에서 이용되는 유자 추출물은 유자에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다.

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 조합을 유자 파우더에 처리하여 수득한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 유자 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 유자 추출물에 포함되는 것이다.

본 발명에서 이용되는 유자 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물은 기억력 및 학습능력 증진 뿐 만 아니라 인지능력장애 예방 및 치료에 매우 효과적으로 작용한다.

상기 본원발명의 효과들은 뇌조직, 바람직하게는 해마 부분에 베타-아밀로이드가 축적되는 것을 억제시킴으로써 발휘된다.

베타-아밀로이드가 뇌에 축적되면 그로 인한 독성으로 신경세포가 지속적으로 파괴되며 아세틸콜린이라는 뇌신경전달물질이 부족하게 되어 기억력, 학습능력 및 인지능력이 저하된다.

또한, 본 발명의 조성물은 Tau 단백질의 인산화를 억제시킴으로써 기억력 감퇴 및 학습능력 저하를 억제할 뿐 만 아니라 기억력 및 학습능력을 향상시킬 수 있는 효과를 발휘한다.

Tau는 중추신경계 특히 신경세포의 축색돌기에 주로 발현되는 미세소관 결합 단백질(microtubule-associated protein, MAP)로서 미세소관(microtubules, MT)을 안정화 시키는 역할을 한다. Tau의 과인산화는 Tau 단백질의 기능상실(Loss of function, LOF)로 인해 MT로부터 떨어져 미세소관의 안전성을 약화시키게 되고 이는 신경세포의 축삭이동(axonal transport) 이상을 가져와 퇴행을 야기하게 된다. 또한 미세소관으로부터 떨어진 과인산화된 Tau는 독성적 기능의 획득(toxic gains of function)하고 비이상적 구조 변화를 일으켜 응집형상을 유발하고 결국 섬유화 형태의 엉킴으로 신경원섬유덩굴(Neurofibrillary tangles, NFT)을 형성한다. 신경원섬유덩굴의 주요 구성 성분은 인산화된 Tau 단백질이며, 정상인보다 알츠하이머의 환자에게서 인산화가 3-4배 증가되어 있다고 알려져 있다.

본 발명의 명세서에서 ‘인지기능장애’는 기억처리, 지각 및 문제해결과 같은 인지기능을 발휘하지 못하는 질환을 의미한다.

본 발명은 인지기능장애를 예방 또는 치료할 수 있는 조성물이며, 본 발명의 조성물이 예방 또는 치료할 수 있는 인지기능장애는 뇌조직의 베타-아밀로이드 축적에 의해 유발된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서의 인지기능장애는 치매(dementia), 파킨슨병(Parkinson's disease), 학습장애(learning disorder), 실인증(agnosia), 건망증(amnesia), 실어증(aphasia), 실행증(apraxia) 또는 섬망(delirium)을 의미한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서의 인지기능장애는 AIDS 유발 치매(AIDS dementia complex), 빈스완거 병(Binswanger's disease), 루이소체 치매(dementia with Lewy Bodies), 전두측두엽성 치매(frontotemporal dementia), 경도 인지 장애(mild cognitive impairment), 다발성 경색성 치매(multi-infarct dementia), 픽병(Pick's disease), 의미치매(semantic dementia), 알츠하이머성 치매(Alzheimer's dementia) 또는 혈관성 치매(vascular dementia)를 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 유자 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈당 항상성 손상의 예방용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “혈당 항상성(glucose hoeostasis)"는 혈액 내 포도당 농도가 일정한 범위로 유지되는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 혈당 항상성 손상은 특정 원인에 의해 혈당 항상성이 유지되지 못해 저혈당 또는 고혈당이 되는 것으로 본 발명의 조성물은 인슐린 저항성을 감소시킴으로써 혈당 항상성을 유지할 수 있게 한다.

해마에서의 아밀로이드의 축적은 체내 인슐린 저항성 증가시키고 간에서의 인슐린 신호전달을 약화시키는데 본 발명의 유자추출물은 이러한 체내 인슐린 저항성의 악화를 방지하는 역할을 한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 혈당 항상성 손상은 뇌조직의 베타-아밀로이드 축적에 의해 유발된다.

당뇨병은 알츠하이머 병의 위험인자로 특히 신경세포의 퇴행성 변화와 신경염증을 촉진시켜 심각한 기억력 저하를 초래하는데 본 발명의 조성물은 인슐린 저항성을 감소시킴으로써 궁극적으로 신경세포의 손상을 억제하여 기억력 및 학습능력 증진 뿐 만 아니라 인지기능장애를 예방 및 치료가 가능하다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 유자 추출물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 유자 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 일반적인 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 식품 조성물로 제공될 수 있다.

본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 유효성분으로서 유자 추출물뿐 만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 유자 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 유자 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 학습 능력 증진용 조성물 및 인지기능장애 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 Tau 단백질의 인산화를 억제시키고 뇌조직의 아밀로이드 축적을 억제시키며 체내 인슐린 저항성의 악화를 방지함으로써 인지기능 장애를 예방하는 효과를 갖는다.

(ⅲ) 본 발명은 신경세포를 보호 및 손상의 예방 효과를 통하여 기억력 및 학습 능력을 증진시킬 수 있을 뿐 만 아니라 인지기능장애로 질환을 예방 및 치료 할 수 있는 효능을 발휘한다.

(ⅳ) 또한, 본 발명은 기억력 및 학습 능력의 증진 효능, 또는 인지기능장애를 예방 및 치료 효능을 가지는 유자 추출물의 의약 및 식품으로서의 기초적인 자료를 제공한다.

도 1은 유자 70% 에탄올 추출물에 대한 크로마토그램이다.
(A) 루틴, (B), 나린진, (C) 헤스페리딘, (D) 케르세틴, (E) TNG(tangeretin). 각 물질의 양은 표준품과 비교하여 결정하였음.
도 2는 고지방식이를 제공하면서 β-아밀로이드를 주사한 랫트에 28일 동안 유자 추출물을 투여 또는 비투여한 다음, 해마를 적출하여 면역염색을 실시한 결과이다.
녹색점은 β-아밀로이드 염색을 나타냄, AD-C, β-아밀로이드(25-35) 주사; AD-Y, β-아밀로이드(25-35) + 유자 추출물 투여; C, β-아밀로이드(35-25, non-AD) 주사.
도 3은 고지방식이를 제공하면서 β-아밀로이드를 주사한 랫트에 28일 동안 유자 추출물을 투여 또는 비투여한 다음, 기억, 인지 기능 및 행동 변화를 측정한 결과이다.
(a) 수중 미로 시험 동안 플랫폼 지역을 찾는데 걸리는 시간(초), (b) 수중 미로 시험 동안 5일째에 플랫폼 지역에 머무르는 기간 및 수동회피시험(passive avoidance test)에서 어두운 곳으로 들어가는 시간(초). 에러바는 ± 표준편차를 나타냄, n=20. (a)에서는 특정시간에서 평균에 위첨자로 적혀 있는 알파벳이 같지 않으면 P<0.05에서 통계적으로 유의한 것임. (b)에서는 평균에 위첨자로 적혀 있는 알파벳이 같지 않으면 P<0.05에서 통계적으로 유의한 것임. 실험군 x 시간, P=0.08. AD-C, β-아밀로이드(25-35) 주사; AD-Y, β-아밀로이드(25-35) + 유자 추출물 처리; C, β-아밀로이드(35-25, non-AD) 주사.
도 4는 고지방식이를 제공하면서 β-아밀로이드를 주사한 랫트에 28일 동안 유자 추출물을 투여 또는 비투여한 다음, 해마를 적출하여 인슐린 신호전달을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
AD-C, β-아밀로이드(25-35) 주사; AD-Y, β-아밀로이드(25-35) + 유자 추출물 처리; C, β-아밀로이드(35-25, non-AD) 주사. CREB(cAMP responding element binding protein), pCREB(인산화 CREB), Akt, 단백질 키나아제 B, pAKT(인산화 Akt), GSK(glycongen synthase kinase), pGSK(인산화 GSK), Tau(Tau 단백질), pTau(인산화 Tau 단백질), (b) 각 막대는 ± 표준편차를 나타냄, n=5. 평균에 위첨자로 적혀 있는 알파벳이 같지 않으면 P<0.05에서 통계적으로 유의한 것임.
도 5는 고지방식이를 제공하면서 β-아밀로이드를 주사한 랫트에 28일 동안 유자 추출물을 투여 또는 비투여한 다음, 경구포도당 내성시험을 실시하여 혈청 글루코오스 및 인슐린의 곡선하면적을 측정한 결과이다.
글루코오스(a) 및 인슐린(b)의 곡선하면적은 첫 번째 단계(0-40분) 및 두 번째 단계(40-120분)에 측정하였음. 에러바는 ± 표준편차를 나타냄, n=20. 평균에 위첨자로 적혀 있는 알파벳이 같지 않으면 P<0.05에서 통계적으로 유의한 것임. AD-C, β-아밀로이드(25-35) 주사; AD-Y, β-아밀로이드(25-35) + 유자 추출물 처리; C, β-아밀로이드(35-25, non-AD) 주사.
도 6은 고지방식이를 제공하면서 β-아밀로이드를 주사한 랫트에 28일 동안 유자 추출물을 투여 또는 비투여한 다음, 인슐린 내성시험을 실시하여 혈청 글루코오스의 곡선하면적을 측정한 결과이다.
글루코오스의 곡선하면적은 첫 번째 단계(0-30분) 및 두 번째 단계(30-90분)에 측정하였음. 각 막대는 ± 표준편차를 나타냄, n=20. 평균에 위첨자로 적혀 있는 알파벳이 같지 않으면 P<0.05에서 통계적으로 유의한 것임. AD-C, β-아밀로이드(25-35) 주사; AD-Y, β-아밀로이드(25-35) + 유자 추출물 처리; C, β-아밀로이드(35-25, non-AD) 주사.
도 7은 고지방식이를 제공하면서 β-아밀로이드를 주사한 랫트에 28일 동안 유자 추출물을 투여 또는 비투여한 다음, 인슐린 내성시험을 실시하는 동안 혈청 글루코오스 레벨의 변화를 측정한 결과이다.
각 점들은 ± 표준편차를 나타냄, n=20. 평균에 위첨자로 적혀 있는 알파벳이 같지 않으면 P<0.05에서 통계적으로 유의한 것임. AD-C, β-아밀로이드(25-35) 주사; AD-Y, β-아밀로이드(25-35) + 유자 추출물 처리; C, β-아밀로이드(35-25, non-AD) 주사. 인슐린 내성시험 동안 혈청 글루코오스 레벨에 대한 시간 및 실험군의 효과는 이원 반복 측정 ANOVA를 이용하여 분석하였음. 평균에 위첨자로 적혀 있는 알파벳이 같지 않으면 P<0.05에서 통계적으로 유의한 것임. AD-C, β-아밀로이드(25-35) 주사; AD-Y, β-아밀로이드(25-35) + 유자 추출물 처리; C, β-아밀로이드(35-25, non-AD) 주사.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

추출 및 동결건조

고흥군에서 유자를 구입하였으며 유자의 과피만을 분리하여 동결건조기(Il Shin, 한국)를 이용하여 건조한 후 분쇄기를 이용하여 분말화하였다. 유자 과피 분말 100 g에 70% 주정 900 mL를 가하고 25℃에서 24시간 추출한 후 30분 동안 8,000×g에서 원심분리기(Beckman, 미국)를 이용하여 고형분을 제거하였다. 원심분리된 상등액만을 모아 감압농축한 후 동결건조을 하였다. 건조하여 얻어진 유자과피 주정추출물의 수율은 29.4%였다.

플라보노이드 및 총 페놀성 화합물(phenolic compounds) 분석

유자 추출물 플라보노이드는 YMC ODS-AM(250 mm × 4.6 mm I.D.; 입자크기, 5 μm) 역상 컬럼(reverse-phase column)을 이용하여 HPLC(JASCO-ChromNAV)로 분석하였다. 이동상은 용액 A(0.1% 아세트산을 포함하는 물) 및 용액 B(0.1% 아세트산을 포함하는 아세토니트릴)로 구성하였고 다음의 농도 구배로 사용하였다: 초기 0분 A:B(88:12, v/v); 18분 A:B(78:22); 28분 A:B(72:28); 35분 A:B(62:38); 48분 A:B(52:48); 54분 A:B(32:68); 58분 A:B(0:100); 60분 A:B(0:100); 및 62분 A:B(88:12). 이동상(mobile phase)은 1.0 ml/분의 유속으로 흘려주었으며, 컬럼 온도는 35℃, 주입량은 20 μL, UV 측정은 285 nm에서 실시하였다. 주요 화합물은 8 플라보노이드, 7 플라보논, 7 플라본, 1 플라보놀, 7 카테킨 및 다른 화합물(2-10 mg/L)을 포함하는 40개의 표준 화합물을 이용하여 정량화하였다. 총 페놀성 화합물의 분석은 FCR(FolinCiocalteu reagent)을 이용하여 수행하였다(15).

실험동물 관리 및 수술 과정

웅성 랫트(Sprague Dawley)(232±16 g, Daehan Bio Inc.)를 각각 스테인리스강(stainless steel) 케이지에 넣고 23℃, 12시간 빛/어둠 조건에서 식이 및 급수 제한없이 사육하였다. 모든 실험과정은 NIH의 실험동물 사용관리 가이드를 준수하였으며, 호서대학교 동물실험윤리위원회에서 승인을 받아 실시하였다. 랫트는 7일간(입수 후 0-6일) 적응 시킨 다음, 각 20마리씩 3개 그룹(AD-C, AD-Y 및 C)으로 분류하였다.

인슐린 저항성을 증가시키기 위해 실험에 사용하는 모든 랫트들은 고지방식이(modified polyphenol-free AIN-93 semi-purified high fat diet)를 자율 섭취하도록 하였다(16). AD-Y 식이군에는 동결건조된 유자 추출물이 3% 포함된 식이를 공급하였다. 유자는 식이성 섬유를 포함하고 있기 때문에 AD-C 및 C 식이군에서는 유자 추출물을 덱스트린으로 대체하였다. 모든 식이군에서 에너지원은 탄수화물 35%(옥수수 녹말 및 수크로오스), 단백질 22%(카제인) 및 지방 43%(라드)로 구성되었다.

랫트는 10일째에 케타민 및 자일라진(xylazine) 혼합물(각각 100 mg/kg bw, 10 mg/kg bw)을 복강 주사하여 마취하고 뇌 고정장치에 위치시켰다. 두피를 수직절개하여 골막(periosteum)을 노출시킨 다음, 삼투압 펌프와 캐뉼라 내의 양방향 CA1 구역과 연결되도록 스테인리스강 캐뉼라를 다음 방법에 따라 이식하였다: 양방향, 봉합 접합접으로부터 -3.3 mm; 뒤쪽, 정중선으로부터 2.0 mm; 배쪽, 경뇌막으로부터 -2.5 mm(17, 18).

뇌에 삽입한 캐뉼라에 다음과 같은 용액을 넣은 22-게이지 튜빙을 연결하였다: AD-C군과 AD-Y군은 β-아밀로이드(25-35), C는 β-아밀로이드(35-25)를 주입. β-아밀로이드(35-25)는 β-아밀로이드(25-35)의 아미노산 배열과 반대로 뇌에 주입하였을 때 뇌에서 결합하여 축적되지 않아서 면역조직화학염색법으로 조사하였을 때 뇌 조직에 β-아밀로이드의 축적이 없다. C군은 치매가 없는 대조군으로 사용하였다.

β-아밀로이드(25-35 및 35-25)(Sigma, 미국)는 멸균한 식염수에 녹인 후 삼투압 펌프(Alzet Osmotic Pump Company)를 이용하여 14일 동안 3.6 nmol/일 용량으로 양방향 CA1 소구역(bilateral CA1 subresions)에 주입하였다.

대사 분석

혈청 글루코오스 레벨, 사료 및 물 섭취, 몸무게는 식이를 중단하고 하룻밤이 지난 시점에 매주 측정하였다. 경구포도당 내성 시험(oral glucose tolerance test)은 수술 후 5주째(42-46일) 하룻밤 단식하고 몸무게 1 kg 당 2 g의 글루코오스를 구강 내 주입한 다음, 혈청 내 인슐린 레벨을 0, 20, 40, 60, 90, 120분에 측정하였다(19). 경구포도당 내성 시험 후 3일째에 12시간 동안 금식시키고 1 U/kg 몸무게 1 kg 당 1 U의 인슐린을 복강 내로 주사하여 인슐린 저항성 테스트를 실시하였다. 인슐린 주사 후 0, 15, 30, 60, 90분 후 꼬리에서 혈액을 채취하여 혈청 글루코오스 레벨을 측정하였다. 혈청 내 글루코오스 및 인슐린 레벨은 각각 Glucometer(Accuchek, Roche) 및 RIA 키트(Linco)를 이용하여 측정하였다. HOMA-IR(insulin resistance index)에 대한 HOMA(Homeostasis model assessment)는 혈청 인슐린 x 혈청 글루코오스(mmol/L)/22.5로 계산하였다.

간접적인 열량 측정으로 에너지 소비 분석

시험물질 투여 6주 후, 에너지 소비는 금식 6시간 후 광(light)-암(dark) 주기에서 암주기가 시작될 때 측정하였다(19). RQ(respiratory quotient) 및 REE(resting energy expenditure)는 Niwa 등의 방법으로 계산하였다(20). 평균 산소 소비량(VO₂) 및 이산화탄소 생성량(VCO₂)은 종래에 알려진 방법에 따라 계산하였으며, 평균 산소 소비량(VO₂) 및 이산화탄소 생성량(VCO₂)은 탄수화물 및 지방 산화, 산화된 기질 1 g당 산소 소비량 계산에 사용되었다(21).

일반 운동 활성

일반 운동 활성은 투명 아크릴 케이지 주변에 적외선 카메라 및 AmLogger 소프트웨어(Linton Instruments, 영국)가 장착된 Linton AM1053 활성 모니터를 이용하여 측정하였다. 사육기간, 이동성 및 활성 측정값은 총 운동 활성을 평가하는데 사용되었다. 운동 활성은 랫트가 투명 아크릴 케이지에서 30분 정도 적응한 후에 대부분 활동적으로 움직이는 때에 광/암 주기에서 암주기 동안 1시간에 걸쳐 측정하였다.

수동회피시험(Passive avoidance test)

실험 44일째에 2개 칸막이 암/광 셔틀 박스로 구성된 명시적 기억능력 측정 기구(17, 18)를 이용하여 랫트의 단기기억 손상을 평가하였다. 수동회피시험은 전기 쇼크에 대한 경험을 기억하여 얼마나 회피하는가를 시간으로 측정하여 기억 능력을 평가한다. 랫트를 암(dark) 챔버 안에 들어가게 한 다음, 즉시 5초 동안 전기충격(75 V, 0.2 mA, 50 Hz)을 가하였고 5초 후 랫트는 암 챔버에서 도망쳐서 원래의 케이지로 돌아갔다.

24시간 후에 먼저 시도한 것과 같은 방법으로 랫트를 밝은 방에 넣은 후에 어두운 방에 들어가는 시간을 최고 600초 동안 측정하였다. 이때는 24시간 전에 시도한 경우와는 달리 전기 충격을 주지 않았다. 빨리 어두운 방으로 들어갈수록 기억력이 낮다는 것을 나타내는 것이다.

수중 미로 시험(Water maze test)

공간 기억 능력을 평가하기 위해 모리스 수중 미로 시험을 실시하였다(17, 18). 모리스 수중 미로 시험은 공간 기억, 장기 기억 및 장기 공간 기억을 포함하는 해마-의존적인 학습을 평가한다.

뇌 면역조직화학염색법

시험물질 투여 6주 후, 각 실험군의 5마리 랫트로부터 적출한 뇌를 식염수 및 4% 파라포름알데히드 용액(pH 7.2)으로 관류시킨 다음, 상온에서 하룻밤 동안 고정시키고(19), 하룻밤 동안 30% 수크로오스에 담가 동결방지(cryoprotetion) 시켰다. 동결시킨 조직은 cryostat(Leica, 독일)를 이용하여 30 μm 두께로 절단한 다음, PBS가 담긴 6웰 플레이트에 옮겼다.

면역블롯 분석

각 실험군의 네 마리 랫트로부터 해마를 적출하여 준비하였다(19). CREB(cAMP responding element binding protein), 인산화 CREB^ser133, 단백질 키나아제 B(protein kinase B 또는 Akt), 인산화 PKB^ser473, GSK-3β, 인산화 GSK-3β^ser9, 타우, 인산화 타우^ser396(Cell Signaling Technology) 및 β-액틴(Santa Cruz Biotech) 항체를 이용하여 면역블롯 분석을 실시하였다. 단백질 발현 강도는 Imagequant TL(Amersham Biosciences)을 이용하여 측정하였다.

통계학적 분석

모든 결과는 ± 표준편차로 나타냈다. 통계학적 분석은 SAS 버전 7(SAS Institute)을 이용하여 실시하였다. 모든 변수는 일변량 분석에서 정규분포를 나타냈다. 다른 시간 포인트에서 측정된 변수들은 독립변수로서 시간 및 실험군을 갖는 이원 반복 측정 ANOVA(two-way repeated measures ANOVA)를 이용하여 분석하였다. 일원분산분석(one-way ANOVA)은 각 시간별로 실험군의 효과를 결정하기 위해 사용하였으며, 실험결과는 실험이 끝난 시점에 1회 측정하였다. 일원분산분석에서 P<0.05 값을 갖는 실험군간의 차이는 튜키 테스트(Tukey's test)에 의해 통계학적으로 유의하다고 판단되었다.

실험결과

유자 추출물에서 플라보노이드 및 페놀성 화합물

유자 추출물에서 총 페놀성 화합물 함량은 47.8 ± 0.45 mg/100 g 이었으며 주요 화합물은 루틴, 루틴 수화물, 나리루틴, 나린진, 아피겐-7-글루코시드, 헤스페리딘, 케르세틴, TNG(tageretin)로 나타났다 (표 1, 도 1).

70% 에탄올 유자 추출물에서 주요 화합물의 함량¹, mg/100 g

루틴	루틴 수화물	나리루틴	나린진	아피겔-7-글리코시드	헤스페리딘	케르세틴	TNG
4.9±0.7	4.2±0.1	29.2±3.1	13.1±1.5	17.8±1.5	38.1±2.7	1.9±0.2	0.6±0.1

¹결과값은 ± 표준편차를 나타냄, n=3.

해마 β-아밀로이드 침적 및 인지 기능

β-아밀로이드 면역반응성은 모든 랫트의 해마에서 측정되었는데 AD-C군에서 2.9±0.5%, AD-Y군 및 C군에서는 각각 0.7±0.1 및 0.1±0.1%가 측정되었다(도 2). 수중 미로시험에서 정상 대조군 및 AD-Y군 랫트는 수조를 수영해서 건너 신속하게 플랫폼에 도달했으며 플랫폼의 위치를 빠르게 학습하였다. 그러나, AD-C군 랫트는 AD-Y 및 C군 랫트에 비해 플랫폼을 찾는데 현저하게 오랜 시간이 걸렸다. 5일 째, AD-C군 랫트는 C군 또는 AD-Y군 랫트에 비해 플랫폼을 찾는데 오랜 시간이 걸렸으며 각각은 유의한 차이를 나타내지는 않았다(도 3a). AD-Y 및 C군의 랫트들은 AD-C군 랫트에 비해 플랫폼이 위치한 지역 5(zone 5)에 오랜 시간 머물러 있었다(도 3b). 단기기억 능력을 나타내는 이러한 수동회피시험 결과는 수중미로시험 결과와 비슷하였다: AD-C군의 랫트는 C군 및 AD-Y군 랫트에 비해 빠르게 어두운 방에 들어갔다(도 3b). AD-C군 랫트는 공간 기억 및 단기 기억 능력의 감소를 나타냈다.

해마 인슐린 신호전달

CREB 인산화의 약화는 IRS2 발현 감소를 유도하며, 결과적으로 인지 장애 및 인슐린 신호전달 손상을 가져온다(20, 21). AD-C군은 C 및 AD-Y군과 비교하여 해마 CREB 인산화가 적게 나타났다. AD-C군의 랫트는 Akt 및 GSK 인산화에 있어서도 C 및 AD-Y군과 비교하여 현저히 감소된 결과를 나타냈다(도 4). Tau 인산화는 AD-Y 랫트보다 AD-C 랫트에서 높게 나타났으며, C군 랫트에서는 매우 낮게 나타났다. 상술한 결과들로 볼 때, 유자 추출물은 β-아밀로이드에 의한 해마 인슐린 신호전달 약화 및 Tau 인산화 증가를 예방한다.

에너지 대사

AD-C군 랫트는 C군 랫트와 비교하여 체중이 감소하였으나, AD-Y군 랫트는 AD-C군 또는 C군 랫트와 비교하여 체중에 있어 큰 차이가 없었다. 부고환 지방 및 복막후 지방은 체중과 비교하여 상대적으로 AD-C군 및 C군에서 차이가 없었으나, 유자 추출물 처리군(AD-C군)에서는 현저하게 감소하였다(표 2). 에너지 섭취는 C군과 비교하여 AD-C군에서 현저하게 감소하였으나 AD-Y군에서는 정상적인 수치를 나타냈다. 산소 소비 및 호흡률은 실험군 간에 차이가 없었다. 탄수화물 산화는 C군보다 AD-C군에서 증가하였고, AD-C군 및 AD-Y군은 비슷한 수준을 나타냈다. 그러나, 지방 산화는 C군 및 AD-Y군 보다 AD-C군에서 낮게 나타났다. 총 활동시간은 C군 및 AD-Y군에 비해 AD-C군에서 낮았다(표 2).

유자 추출물을 투여에 따른 대사 변화¹

-	AD-C	AD-Y	C
몸무게, g	339±25^b	355±22^ab	363±23^a
부고환 지방 패드, g/kg bw	16.2±1.9^a	13.4±1.6^b	17.0±2.1^a
복막후 지방, g/kg bw	24.6±2.9^a	20.7±2.6^b	26.2±3.2^a
3-4주 동안 에너지 섭취량, kcal/일	91.7±9^b	123±14^a	119±13^a
총 활동 시간, 분	24.0±2.0^b	26.6±1.4^a	26.2±1.1^a
에너지 소비, kcalkg^-0.75 일^-1	120±15	109±13	108±13
호흡률	0.89±0.09	0.84±0.10	0.85±0.09
VO₂, mLkg^-0.75분^-1	17.1±2.2	15.5±1.9	15.4±2.0
탄수화물 산화, mgkg^-0.75분^-1	7.9±1.0^a	5.2±0.6^b	5.6±0.7^b
지방 산화, mgkg^-0.75분^-1	4.8±0.6^b	6.3±0.8^a	5.9±0.7^a

¹결과값은 ± 표준편차를 의미함, n=20. 평균에 위첨자로 적혀 있는 알파벳이 같지 않으면 P<0.05에서 통계적으로 유의한 것임. AD-C: β-아밀로이드(25-35) 투여, AD-Y: β-아밀로이드(25-35) + 유자 추출물 투여, C: β-아밀로이드(35-25, non-AD) 투여.

글루코오스 내성 검사

OGTT 동안 혈청 글루코오스 수치는 30-40분까지 계속적으로 증가하였고 그 이후에는 모든 실험군에서 감소하였다(effect of time P value <0.05). AD-C군 랫트는 C군 랫트보다 글루코오스 투여 후 측정된 모든 시간에서 높은 혈청 글루코오스 수치를 나타냈으며, 이것은 AD-C군이 C군과 비교하여 글루코오스 비내성(intolerant)을 갖는다는 것을 의미하나 두 실험군간의 차이는 현저하지 않았다(P=0.06). 유자 추출물은 AD-C군과 비교하였을 때, 글루코오스 내성을 유지하였다(도 5a). OGTT 동안 첫 번째 단계(글루코오스 주입 후 0-40분)에서 혈청 글루코오스 레벨의 곡선하 면적(area under curve)은 C군과 비교하여 AD-C군에서 조금 높았으며(P=0.07), AD-C군과 비교하여 AD-Y군에서 현저히 낮았다(도 6b). OGTT 동안 두 번째 단계(글루코오스 주입 후 40-120분)에서 혈청 글루코오스 레벨의 곡선하 면적은 C군 및 AD-Y군과 비교하여 AD-C군에서 현저히 높았다(도 6b).

OGTT 동안 첫 번째 단계에서 AD-Y군의 혈청 인슐린 수치에 대한 곡선하 면적은 AD-C군과 비교하여 현저히 낮았으나, 두 번째 단계에서는 AD-C군보다 C군 및 AD-Y군에서 현저히 낮았다(도 6b). 이러한 결과는 C군 랫트와 비교하여 AD-C 랫트에서는 인슐린 활성이 손상되었고, 유자 추출물 처리군에서는 정상적으로 유지되었음을 나타낸다.

인슐린 내성 검사

AD-Y군 및 C군의 랫트는 AD-C군 랫트보다 낮은 공복 혈청 글루코오스 및 인슐린 수치를 갖는다. HOMA-IR 수치는 AD-Y군 및 C군 랫트보다 AD-C군 랫트에서 현저히 높았다(표 3). 인슐린 내성 검사 결과, 인슐린은 AD-Y군 및 C군에서 만큼 30분 이후 AD-C군의 혈당을 낮추는 데에는 효과적이지 않았으며, 이것은 인슐린이 동일한 민감도를 갖는다는 것을 나타낸다(effect of time P<0.05; 도 7). 인슐린 내성 검사의 0-30분 및 30-90분에서 AD-Y군 및 C군의 혈청 글루코오스 수치는 AD-C군의 절반에도 못 미쳤으며 이러한 결과는 AD-C군의 랫트가 C군 랫트와 비교하여 높은 인슐린 저항성을 가지며 유자 추출물이 인슐린 저항성을 예방하는 효과를 갖는다는 것을 의미한다.

유자 추출물을 투여에 따른 혈청 글루코오스 및 인슐린 수치 변화¹

-	AD-C	AD-Y	C
혈청 글루코오스, mol/L	7.7±0.9^a	5.9±0.8^b	6.1±0.8^b
혈청 인슐린, pmol/L	213±30^a	132±18^c	159±21^b
HOMA-IR	12.1±1.7^a	5.2±0.7^c	6.4±0.8^b

논의

본 발명에서 β-아밀로이드(25-35)의 해마 CA1 부위 주입은 Tau 인산화를 증가시켜 알츠하이머-유사 플라크를 형성시켰으며 예상했던 바와 같이 인지 기능 장애를 유발하였다. 그러나, OGTT, HOMA-IR 및 인슐린 내성 시험 결과, β-아밀로이드(25-35)의 주입은 의도치 않게 체중 감소, 신체 활성 감소 및 해마 인슐린 저항성과 같은 에너지 대사 장애를 유도하였다. 한편, 유자 추출물 투여하였을 경우에 인지 장애 및 글루코오스 조절 이상이 예방되었다.

알츠하이머에 대한 대부분의 약초 치료는 약초의 항염증 및/또는 항산화 효과에 의한 것이다(22-25). 유자 추출물은 항산화 및 항염증 효과를 갖는 것으로 알려져 있으나, 항치매 효과에 대해서는 아직 알려진 바가 없다(26, 27). 헤스페리딘 및 나린진과 같은 플라보논 및 그들의 인 비보 대사물질이 BBB(blood brain barrier)를 통과한다는 것이 인 비트로 및 인 시투 모델에서 확인되었다(28, 29).

본 발명은 유자 추출물이 랫트에서 β-아밀로이드(25-35) 주입에 의해 유도되는 인지 장애를 예방할 수 있다는 것을 최초로 개시한 것으로 본 발명의 실험결과는 유자 추출물이 노인의 인지 장애를 예방할 수 있다는 것을 나타낸다.

알츠하이머의 발병 원인을 잘 알려져 있지 않지만, 뇌의 해마 부위에 β-아밀로이드가 축적되는 것이 하나의 원인으로 알려져 있다. 알츠하이머 환자의 뇌에서 발견되는 대량의 플라크는 아밀로이드 펩타이드에 의해 만들어진다(30). 설치류의 뇌실(intracerebral ventricle) 또는 해마에 β-아밀로이드(1-40), β-아밀로이드(1-42) 또는 β-아밀로이드(25-35)를 주입하면 기억력 손상이 유도된다는 것을 수중 미로 시험, 수동회피시험, 방사형 미로 시험 및 인지능력시험을 통해 확인하였다(31-35). Klementiev(33) 및 Chavant(34)는 β-아밀로이드(25-35) 주입 후 각각 4주 및 2주에 해마 및 대뇌 피질에 β-아밀로이드가 축적된다고 보고하였다. 더욱이, Zussy 등(35)은 β-아밀로이드(25-35) 주입 후 모든 측정 시점에서 전두 기질(frontal cortex)에 β-아밀로이드의 응집이 증가되었으며, 3주 후에는 편도체(amygdala), 1-2주 후에는 주로 해마에서 β-아밀로이드의 응집이 증가하였다고 보고하였다. 이러한 결과들은 β-아밀로이드(25-35)를 주입하면 인간 알츠하이머와 증상 및 병리 생리학적으로 유사한 상태가 된다는 것을 나타내며 동물에 β-아밀로이드를 주입하여 신규한 알츠하이머 치료제를 평가하는 모델로 이용할 수 있다.

뇌(특히, 해마)에서의 인슐린 신호전달 손상은 알츠하이머의 원인이 될 수 있다. 인슐린 수용체 활성화 및 PI3K(phosphatidylinositol 3-kinases) 신호전달 과정을 통한 인슐린 신호전달은 시냅스 가소성(synaptic plasticity)에 관계하며, 용해성 β-아밀로이드 및 β-아밀로이드 올리고머는 신경세포에서 인슐린 수용체 기능을 비정상적으로 조절한다는 것이 알려져 있다(36). 인슐린-PI3K-Akt 신호전달의 감소는 Tau 인산화를 증가시키는 글리코겐 합성효소 카나아제-3β의 활성화를 유도한다(37). Tau 단백질은 신경세포골격의 주요 구성요소의 하나인 미세소관으로 튜불린이 모이는 것을 촉진하는데 이것은 정상적인 형태학적 특성이며 이 과정을 통해 신경세포가 구조를 유지할 수 있도록 한다(38). IRS2 녹아웃 마우스에서 발달과정 동안 신경세포 증식은 50%까지 감소되었으며, 신경섬유매듭(neurofibrillary tangle) 형성은 해마에서 증가된 인산화 Tau 양에 의해 증가되었다(39). 이와 같이, Tau 인산화는 뇌의 인슐린 신호전달 약화에 의해 비롯된다(40).

본 발명자들은 β-아밀로이드를 실험동물에 주사하면 해마에서 인슐린 신호전달(pAkt → pGSK)이 약화되며, 대조군과 비교하여 Tau 인산화가 감소된다는 것을 확인하였다. 유자 추출물 투여는 인슐린 신호전달을 강화시키며 Tau 인산화를 감소시킨다. 이와 같이, 개선된 인슐린 신호전달은 β-아밀로이드 축적 감소와 연관되어 있으며 나아가 인지 기능을 보호할 수 있다.

알츠하이머는 흔히 영양 장애(nutritional disorders) 및 체중 관소와 관련이 있다(41). 그러나, 치매의 임상증상과 비교하여 체중감소의 시작을 확인하는 것은 어려우며, 체중감소와 알츠하이머의 관계에 대해서는 많이 알려져 있지 않아 추가 연구가 필요하다(42, 43). Zussy 등(35)은 β-아밀로이드(25-35)의 ICV(intracerebroventricular) 주사는 아밀로이드 축적을 유도하며, 3주 후에는 해마의 형태가 변화되고 체중이 감소하며 장단기 기억이 손상된다고 보고하였다.

또한, 본 발명의 실험결과에서 6주 시험 물질 투여 동안 음식 섭취 및 운동활성 감소에 의해 AD-C군 랫트의 체중이 감소하였음을 확인하였다. AD-Y군 랫트는 AD-C군 또는 C군과 비교하여 체중에 있어 현저한 차이를 보이지 않았으나, 내장지방은 다른 실험군에 비해 현저히 낮았다. 이러한 결과는 AD-Y군 랫트가 AD-C군 랫트보다 무지방 신체 질량을 더 많이 유지하고 있다는 것을 의미한다. 치매 진행과정에 있어 환자들은 먹는 것을 잊거나 일부 음식을 꺼려하게 되어 결과적으로 비자발적인 체중 감소로 이어지게 된다(43).

알츠하이머는 제2형 당뇨병과 밀접하게 연관되어 있으며, “뇌 당뇨병” 또는 “제3형 당뇨병”으로도 불려진다(44). 최근 연구에 따르면 과혈당은 기억력 손상을 유도한다. 제2형 당뇨병에서 과혈당은 osmotic insult, 산화 스트레스, 염증 및 최종 당화산물(advanced glycated end-products)를 포함하는 단백질 변형을 통해 뇌세포에 심각한 손상을 줄 수 있다(45). 또한, 제2형 당뇨병에서 과혈당은 해마에서 β-아밀로이드 응집을 증가시킴으로써 알츠하이머 증상을 가속화시킨다. 한편, 알츠하이머 환자들은 흔히 글루코오스 조절 기능이 손상되었으며(46, 47), APP23 형질전화 마우스(알츠하이머 동물 모델)는 대조군 마우스와 비교하여 심화된 당뇨 증상을 보였다(6). Zhang 등은 혈장 β-아밀로이드 레벨이 인간 알츠하이머 환자 및 알츠하이머 동물모델에서 과혈당과 관련되어 있음을 밝혔다(48).

인슐린 수용체의 인슐린-자극 인산화, Akt 및 GSK3β를 통한 간 인슐린 민감성은 농도 및 시간에 의존적으로 감소하였다(48). 동물 모델을 이용한 이러한 역학 및 실험적 데이터는 알츠하이머 타입 치매가 글루코오스 대사를 손상시키고 제2형 당뇨병을 악화시킨다는 것을 나타낸다.

본 발명자들의 고인슐린혈증 정상혈당 클램프 선행 연구에서 비당뇨(non-diabetic) 랫트 해마에 β-아밀로이드(25-35)를 주사하여 유도한 치매는 간을 포함하는 전신의 인슐린 저항성을 유도하였다. 본 발명에서 AD-C군 랫트는 HOMA-IR 및 인슐린 내성 시험 결과 인슐린 저항성을 갖는 것으로 확인되었으나 인슐린 분비 증가로 인해 글루코오스 내성은 부분적으로 유지되었고 결과적으로 당뇨병 경계 상태(borderline diabetes)를 나타냈다. 유자 추출물은 과도한 인슐린 분비 및 인슐린 저항성이 유도되는 것을 예방하였다. 유자 및 헤스페리딘 및 나란진과 같은 유자 유래 플라보노이드의 항당뇨 효과는 잘 알려져 있다(49, 50). 유자 추출물이 치매가 유발된 랫트에서 인슐린 저항성 악화를 방지하고 간에서 인슐린 신호전달을 향상시킨 것이 직접적으로 간에 작용하여 인슐린 저항성을 감소시킨 것인지 치매의 유발을 억제함으로 인슐린 저항성을 억제한 것인지를 구별하기는 어렵다.

해마의 β-아밀로이드 축적은 랫트의 인지 기능, 인슐린 민감성과 에너지 및 글루코오스 항상성을 손상시키며 비자발적인 체중감소를 유발한다. 플라보노이드를 다량 포함하는 유자 추출물의 구강 섭취는 인지 장애를 예방하며 해마에서의 인슐린 신호전달을 정상화시키고, 에너지 및 글루코오스 대사를 개선시킨다.

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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

유자(Citrus junos Tanaka) 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 학습 능력 증진용 조성물.
유자(Citrus junos Tanaka) 추출물을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애(cognitive disorder) 예방 또는 치료용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 유자 추출물은 물, 알코올 또는 이들의 혼합 용매의 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 뇌조직의 베타-아밀로이드 축적(accumulation)을 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 Tau 단백질의 인산화를 억제시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항에 있어서, 상기 인지기능 장애는 치매, 파킨슨병, 빈스완거 병, 학습장애, 경도 인지 장애, 픽병, 실인증, 건망증, 실어증, 실행증 또는 섬망인 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 상기 제 2 항의 조성물의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 인지기능장애 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
유자(Citrus junos Tanaka) 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈당 항상성(homeostasis) 손상의 예방용 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 조성물은 인슐린 저항성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
유자(Citrus junos Tanaka) 추출물을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 학습 능력 증진용 식품 조성물.
유자(Citrus junos Tanaka) 추출물을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 예방 또는 개선용 식품 조성물.