KR20140144934A - Ｃｔｈｒｃ１의 발현 및 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 치료 및 전이억제용 조성물 - Google Patents

Ｃｔｈｒｃ１의 발현 및 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 치료 및 전이억제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 췌장암 진단 및 스크리닝용 단백질 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 췌장암 환자 시료에서 CTHRC1의 mRNA 및 단백질의 발현이 증가하고, 상기 CTHRC1이 과발현 또는 녹다운된 세포주를 주입한 마우스에서 각각 암의 발생 및 전이가 증가 또는 억제되는 것을 확인하였으며, 또한, CTHRC1이 과발현 또는 녹다운되도록 세포주를 수립하여, CTHRC1의 과발현 또는 녹다운이 세포의 이동성, 부착성, Src-FAK 신호 및 Rac 1의 발현의 발현이 각각 증가 또는 억제되는 것을 확인함으로써, 췌장암 진단용 조성물 및 킷트, 진단방법, 활성물질 스크리닝 방법 및 췌장암의 치료 및 전이 억제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

Description

ＣＴＨＲＣ１의 발현 및 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 치료 및 전이억제용 조성물{Composition for treatment and metastasis inhibition of panceratic cancer including CTHRC1 expression and activation inhibitor as an active ingredient}
본 발명은 CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing-1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 췌장암 치료 및 전이억제용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
췌장암은 공격적인 질환이나 이를 진단하기 매우 어렵다는 단점이 있다. 또한, 췌장암은 급성으로 발병하고, 진단이 늦으며, 낮은 생존율을 보이는 가장 심각한 악성종양 중 하나이다. 췌장암 환자는 국소 진행성이고, 절제술을 실시하기에 어려운 점이 많으며, 전이성의 질환을 일반적으로 보이고, 종종 집중치료에 의한 부작용에 민감하게 반응한다. 환자 중 오직 10 내지 15%만이 수술적 절제로 치료할 수 있는 형태이며, 수술로 근본적인 치료를 한 이후에도 재발의 비율이 매우 높은 상태로 남아있다. 비록 신규한 표적에 대한 새로운 진단방법이 췌장암 치료를 위해 개발되고 있지만, 전체적인 생존율은 지난 십 년간 변화가 없는 실정이다. 따라서, 췌장암의 치료를 위한 신규 치료 전략이 필요하다.
CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing-1)은 혈관 리모델링(vascular remodeling), 골 형성(bone formation), 및 형태형성(morphogenesis)에 작용하는 수용성 단백질이고, 손상된 동맥에서 발현하여, 세포 이동을 촉진하고, 섬유아세포(fibroblasts) 및 연성근육세포(smooth muscle cell)에 있어서 콜라겐 합성을 억제하여 손상된 대동맥 리모델링의 기능이 있음이 알려져 있다. 혈관세포에서 CTHRC1의 발현은 형질전환생장인자-β(transforming growth factor-β; TGF-β)를 조절하고, 따라서, 콜라겐을 포함하는 TGF-β 표적 유전자의 발현을 억제한다. 특히, 켈로이드 섬유아세포(keloid fibroblast)에 있어서, 재조합 CTHRC1은 역으로 TGF-β-자극된 콜라겐 1형 발현 및 콜라겐 합성을 나타냈다. CHTRC1 유전자 이식 쥐(transgenic mice)는 골모세포의 뼈 형성(osteoblastic bone formation), 골전구세포(osteoprogenitor cells)의 분화 및 무기화(mineralization)를 증가시킨다. CTHRC1은 또한 Wnt5a와 상호결합하여 평면 세포 극성(planar cell polarity) 경로를 활성화시켜, 발달과정 동안 형태형성의 조절에 CTHRC1의 역할을 확인할 수 있다.
최근의 연구에 의하면, 암세포에서 CTHRC1의 발현 및 공격적인 종양(agressive tumor)에서 CTHRC1의 역할이 보고되었다. 인간 종양 cDNA 어레이 분석에서 CTHRC1이 인간 고형암(solid tumor)에서 주로 발현하고, 전사체 분석(transcriptome analysis)에서 소엽성 유암(breast lobular carcinoma) 및 일반 췌관세포(ductal cell) 및 소엽세포(lobular cell) 사이에서 발현의 차이가 있음을 확인하였다. CTHRC1은 침습성 원발성 흑색종(primary melanomas) 및 전이성 흑색종(metastatic melanomas)에서 발현하나, 양성 모반(benign nevi) 또는 비-침습성 시료에서는 발현되지 않았다. 또한 CTHRC1 발현의 억제는 흑색종 세포주의 이동을 시험관 내에서 감소시켰다. CTHRC1은 융기성 피부섬유육종(dermatofibrosarcoma protuberans), 빈번히 전이되는 국부적으로 공격적인 신생종양(neoplasms)으로 확인되었으나, 피부육종(dermatosarcomas), 일반적인 양성의 섬유조직구 종양(benign fibrohistiocytic tumor)은 아님이 확인되었다. CTHRC1 발현은 일반 조직 또는 전구체 장애(precursor lesions)와 비교하여 유방암 조직에서 유의적으로 높고, 골 전이(bone metastasis)의 위험과 연관되어 있다.
이에, 본 발명자들은 췌장암의 진단 및 치료를 용이하게 하기 위한 바이오 마커를 연구하던 중, 췌장암 환자 시료에서 CTHRC1의 mRNA 및 단백질의 발현이 증가하고, 상기 CTHRC1이 과발현 또는 녹다운(knock-down)된 마우스에서 각각 암의 발생 및 전이가 증가 또는 억제되는 것을 확인하였으며, 또한, CTHRC1이 과발현 또는 녹다운 세포주를 확립하여, CTHRC1의 과발현 또는 발현억제가 세포의 이동성, 부착성, Src-FAK 신호 및 Rac 1의 발현이 각각 증가 또는 억제되므로, 상기 마커를 췌장암 진단, 치료 및 전이 억제용 조성물에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 췌장암 예방, 치료 및 전이 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 췌장암 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CTHRC1(collagen triple helix repeat containing-1) 단백질에 특이적인 인간 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 단일클론 항체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방, 치료 및 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 CTHRC1(collagen triple helix repeat containing-1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방, 치료 및 전이 억제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다:
1) 피검체로부터 수득한 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 CTHRC1의 발현 또는 활성수준을 측정하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 CTHRC1의 발현 또는 활성수준이 피검물질 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검물질을 선별하는 단계.
또한, 본 발명은 하기를 포함하는 CTHRC1 단백질에 특이적인 인간 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 제공한다:
서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정영역1(heavy chain complementarity determining regions1, HCDR1), 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄, 및
서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역1(light chain complementarity determining regions, LCDR1), 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄.
또한, 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방, 치료 및 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 췌장암 환자 시료에서 CTHRC1의 mRNA 및 단백질의 발현이 증가하고, 상기 CTHRC1이 과발현 또는 녹다운 세포주를 마우스에 이식하였을 때, 각각 암의 발생 및 전이가 증가 또는 억제되는 것을 확인하였다. 또한, CTHRC1이 과발현 또는 녹다운 세포주의 이동성, 부착성, Src-FAK 신호 및 Rac 1의 발현의 발현이 각각 증가 또는 억제됨을 확인하여, 상기 CTHRC1을 이용한 췌장암 진단용 조성물 및 키트, 진단방법, 활성물질 스크리닝 방법 및 췌장암의 치료 및 전이 억제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
도 1A는 췌장관세포암 시료에서 CTHRC1 전사체가 증가하는 것을 나타내는 도이다.
도 1B는 췌장관세포암에서 CTHRC1 mRNA가 증가하는 것을 나타내는 도이다.
도 1C는 암성 조직(cancerous tissue)에서 CTHRC1의 발현이 증가하는 것을 나타내는 도이다.
도 1D는 정상 췌장관 상피세포에서는 CTHRC1이 매우 약하게 발현되었지만, 선암 세포에서는 강하게 발현되는 것을 나타내는 도이다.
a: 췌장암 세포에서 CTHRC1이 과발현하고, 반면에 일반 췌장 상피세포(ductal epithelium)는 약하게 발현(화살표),
b: 췌장암에서 음성 CTHRC1 발현의 경우,
c: 췌장암에서 CTHRC1이 강하게 발현하는 경우,
d: 막 또는 세포질의 CTHRC1 발현을 고배율로 관찰,
e: 종양세포의 임파절 전이(nodal metastasis)에서 CTHRC1이 강하게 발현, 및
f: 음성대조군.
도 2A는 CTHRC1이 과발현되도록 수립된 MiaPaCa-2 세포주에서 CTHRC1가 과발현되는 것을 나타내는 도이다:
Mock: 대조군, 및
CHTRC1: 시험군.
도 2B는 CTHRC1 발현이 감소되도록 수립된 BxPC-3 세포주에서 CTHRC1이 발현되지 않는 것을 나타내는 도이다:
shCtrl: 대조군, 및
shCTHRC1: 시험군.
도 2C는 CTHRC1이 녹아웃되도록 수립된 Panc-1 세포주에서 CTHRC1이 발현되지 않는 것을 나타내는 도이다:
shCtrl: 대조군, 및
shCTHRC1: 시험군.
도 3A는 CTHRC1이 과발현되는 세포주를 주입한 마우스에서 종양이 전이되는 것을 나타내는 도이다.
도 3B는 CTHRC1 발현이 감소된 세포주를 주입한 마우스에서 종양의 전이가 억제되는 것을 나타내는 도이다.
도 4A 및 4B는 CTHRC1이 과발현되는 MiaPaCa-2-CTHRC1 세포주에서 세포의 이동성 및 부착성이 증가하는 것을 나타내는 도이다:
Lam: 라미닌(laminin),
Vit: 비트로넥틴(vitronectin),
Fib: 피브로넥틴(fibronectin), 및
Col: 콜라겐 유형 1(collagen type 1).
도 4C 및 4D는 CTHRC1이 녹다운된 BxPC-3 및 Panc-1 세포주에서는 세포의 이동성 및 부착성이 감소하는 것을 나타내는 도이다:
Lam: 라미닌(laminin),
Vit: 비트로넥틴(vitronectin),
Fib: 피브로넥틴(fibronectin), 및
Col: 콜라겐 유형 1(collagen type 1).
도 4E 및 4F는 rCTHRC1에 의한 세포주의 이동성 및 부착성의 증가가 항-CTHRC1을 첨가할 때 감소하는 것을 나타내는 도이다.
도 5A는 CTHRC1-Fc 및 트롬빈으로 잘린 재조합 CTHRC1(rCTHRC1)의 발현을 확인한 도이다.
도 5B 및 5C는 rCTHRC1에 의해서 MiaPaCa-2 세포주의 이동성 및 부착성이 농도의존적으로 증가하는 것을 나타내는 도이다:
Lam: 라미닌(laminin),
Vit: 비트로넥틴(vitronectin),
Fib: 피브로넥틴(fibronectin), 및
Col: 콜라겐 유형 1(collagen type 1).
도 6A는 CTHRC1이 과발현 및 발현감소에 의해 Src-FAK 신호에 관여하는 단백질의 인산화가 증가 및 감소하는 것을 각각 나타내는 도이다.
도 6B는 rCTHRC1을 처리하였을 때, rCTHRC1-유도된 빠르고, 일시적인 활성이 나타나는 것을 확인한 도이다.
도 6C 내지 6H는 rCTHRC1-유도된 Src-FAK 신호전달, 세포 이동성 및 세포 부착성이 Src 억제제인 PP2 및 MEK 억제제인 U0126에 의해서 억제되는 것을 나타내는 도이다:
도 7A는 CTHRC1의 발현이 증가 및 감소함에 따라서 GTP-Rac 1의 발현이 증가 및 감소함을 각각 나타내는 도이다.
도 7B는 rCTHRC1-유도된 Rac 1 활성이 빠르고 일시적임을 나타내는 도이다.
도 7C 및 7D는 Rac 1 억제제인 NSC23766을 처리하였을 때 세포의 이동성 및 부착성이 감소함을 나타내는 도이다.
도 7E 및 7F는 우성음성 Rac 1(dominant-negative Rac 1)을 처리하였을 때 세포의 이동성 및 부착성이 감소함을 나타내는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 CTHRC1(collagen triple helix repeat containing-1) 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하는 췌장암 진단용 조성물을 제공한다.
상기 CTHRC1은 서열번호 17로 기재되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 mRNA 수준을 측정하는 물질은 CTHRC1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머(primer) 또는 탐침(probe)인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않고, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 서열번호 1 및 2로 기재되는 프라이머 셋트인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있고, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지는 것은 모두 사용가능하다. 따라서 본 발명의 프라이머는 주형인 CTHRC1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 상기 유전자 서열과 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지지는 것은 모두 사용가능하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다.
아울러, 상기 탐침은 단일쇄일 수 있으며, 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dDMP 및 dTMP), 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체인 것이 바람직하고, 올리고디옥시리보뉴클레오티드인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 탐침은 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 골격 변형된 뉴클레오티드 예를 들어, 펩티드 핵산(PNA), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파 DNA 및 메틸 포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오티드 예를 들어, 2'-O-메틸, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오티드 예를 들어, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르민-, 에티딜-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딘- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
상기 단백질 수준을 측정하는 물질은 CTHRC1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것이 바람직하고, 상기 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시예에서, 본 발명자들은 췌장암 환자의 시료를 마이크로어레이를 이용하여 분석하여 CTHRC1 유전자가 과발현되는 것을 발견하였고(도 1A 참조), 상기 결과를 RT-PCR 및 면역조직화학법을 수행하여 확인하였다(도 1B 및 1C 참조).
또한, 본 발명자들은 CTHRC1이 과발현 또는 녹다운된 세포주를 수립하여(도 2 참조), 상기 세포주를 마우스에 주입하여 발생하는 종양이 CTHRC1의 과발현에 의해서 종양의 진행 및 전이가 증가하고, CTHRC1이 녹다운된 경우에는 종양의 진행 및 전이가 억제되는 것을 확인하였다(도 3A 및 3B 참고).
또한, 본 발명자들은 CTHRC1이 과발현된 종양 세포주의 이동성 및 부착성이 증가하고, CTHRC1이 녹다운된 종양 세포주의 이동성 및 부착성은 억제됨을 확인하였다(도 4A 내지 4D 참조).
아울러, 본 발명자들은 상기 CTHRC1이 종양 세포주의 이동성 및 부착성을 조절하는 방식이 자가활성 방식(autocrine manner)인지 확인하기 위하여, 재조합 CTHRC1(rCTHRC1)을 제작하여(도 5A 참조), CTHRC1이 다운된 세포주에 형질감염함으로써 상기 세포주의 운동성 및 부착성이 농도의존적으로 증가함을 확인하였다(도 5B 및 5C). 아울러 상기 결과가 항-CTHRC1을 첨가할 때는 감소함을 확인하여, 상기 결과가 CTHRC1 특이적인 영향임을 확인하였다(도 4E 및 4F).
또한, CTHRC1이 세포의 이동성 및 부착성을 조절함에 있어서, Sre-FAK 신호전달 기작을 활성화하는지 확인하였고, CTHRC1의 과발현 또는 녹다운에 의해서 Sre-FAK 신호전달에 있어서, 이에 관여하는 단백질의 인산화가 증가 또는 감소함을 확인하였다(도 6A 참고). 또한, rCTHRC1을 농도별로 처리하였을 때, rCHTRC1-유도된 빠르고 일시적인 활성을 확인하였고(도 6B 참조), 상기 결과와 같은 맥락으로 rCTHRC1-유도된 Src-FAK 신호전달, 세포 이동성 및 부착성이 Src 억제제 및 MEK 억제제에 의해서 억제됨을 확인하였다(도 6C 및 6H 참조).
마지막으로, CTHRC1이 Rac 1의 활성을 유도하는가를 확인하였는데, CTHRC1의 발현이 증가 또는 감소함에 따라서 GTP 결합한 Rac 1의 발현이 증가 또는 감소하였고(도 7A 참조), rCTHRC1-유도된 Rac 1의 활성은 빠르고 일시적으로 일어남을 확인하였다(도 7B 참조). 또한, 세포의 이동성 및 부착성이 Rac 1 억제제 및 우성음성 Rac 1에 의해서 감소함을 확인하였다(도 7C 및 7F 참조).
따라서, 본 발명의 CTHRC1 유전자의 mRNA 및 단백질 발현수준을 측정하여 췌장암을 진단할 수 있는 조성물은 췌장암 진단용 조성물뿐만 아니라, 상기 조성물을 이용한 키트 및 췌장암 치료 및 전이억제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
아울러 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 췌장암 진단용 키트(kit)를 제공한다.
상기 췌장암 진단용 키트에 포함되는 조성물은 CTHRC1 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 물질을 포함하고, 상기 유전자의 mRNA를 측정할 수 있는 물질로는 프라이머 또는 탐침을 포함하며, 상기 단백질을 특정할 수 있는 물질로는 항체를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한 본 발명의 췌장암 진단용 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 상기 키트는 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예를 들어, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합효소 조인자 및 dNTP를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 췌장암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 상기 키트는 선택적으로 이차항체 및 표지의 기질을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 나아가, 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 본 발명의 키트로 제작될 수 있는 키트의 종류로는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 췌장암 진단의 정보를 제공하기 위한 상기 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준 검출방법을 제공하나 이에 한정하지 않는다:
1) 피검체로부터 수득한 시료에서 CTHRC1 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 CTHRC1 유전자 발현 수준이 정상대조군의 CTHRC1 유전자 발현 수준에 비해 증가하는 개체를 선별하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 선별된 개체가 췌장암에 걸릴 위험을 가진 개체로 판단하는 단계.
상기 단계 1)에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈청, 혈장, 혈액, 타액 및 뇨로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 2)의 상기 발현수준 측정은 RT-PCR, 실시간 PCR(real time PCR), 웨스턴 블랏, 노던 블랏, ELISA, 방사선면역분석(radioimmunoassay), 면역조직화학법(immnunohistochemistry) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 RT-PCR 및 면역조직화학법으로 구성되는 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 췌장암 치료물질 스크리닝 방법을 제공하나 이에 한정하지 않는다:
1) 피검체로부터 수득한 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 CTHRC1의 발현 또는 활성수준을 측정하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 CTHRC1의 발현 또는 활성수준이 피검물질 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검물질을 선별하는 단계.
아울러 본 발명은 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방, 치료 및 전이 억제용 조성물을 제공한다.
상기 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 CTHRC1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않으며, 상기 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 CTHRC1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 CTHRC1 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현을 억제하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 CTHRC1 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현을 억제제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏일 수 있고, 구체적으로 0.001 ~ 1 g/kg일 수 있으며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 췌장암 치료 및 전이억제를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기를 포함하는 CTHRC1에 특이적인 인간 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 제공한다:
서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정영역1(heavy chain complementarity determining regions1, HCDR1), 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄, 및
서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역1(light chain complementarity determining regions, LCDR1), 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄.
상기 CTHRC1은 인간 유래인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 중쇄 상보성 결정영역은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 경쇄 상보성 결정영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 면역학적 활성을 가진 단편은 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv, Fv, 단일쇄 Fv 이량체 및 디아바디(diabody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항체는 전체(whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 항체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변영역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변역역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론 항체의 중쇄 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론 항체의 경쇄 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 단일클론 항체를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방, 치료 및 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 췌장암에 있어서 CTHRC1 의 과발현 확인
<1-1> CTHRC1 유전자 과발현 확인
췌장암에서 과발현되는 유전자를 찾기 위하여 췌장관세포암(pnacreatic ductal adenocarcimonas; PDAC) 및 일반 췌장 세포주(normal)에서 유전자 발현을 게놈-폭 발현 분석(genome-wide expression analysis)방법으로 비교하였다.
구체적으로, 췌장관세포암(n=28) 및 일반 췌장 세포주(n=13)의 마이크로어레이 발현 분석은 HG-U133 진칩(UG-U133 GeneChip, Affymetrix, 미국)을 사용하여 제조사의 사용설명서에 따라 수행되었다.
그 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이 일반 췌장 세포주와 비교하였을 때 췌장관세포암 시료에서 CTHRC1 전사체가 유의적으로 증가(< 8.0 배)함을 확인하였다(도 1A).
<1-2> CTHRC1 전사체의 발현증가 확인
췌장암 세포주에서 CTHRC1 전사체의 발현이 증가한다는 실시예 <1-1>의 결과를 재확인하기 위하여 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 전체 RNA는 알엔이지 키트(RNeasy kit, Qiagen, 미국)를 사용하여 임상조직샘플로부터 수득하였고, 췌장 조직과 일치하는 전체 RNA(Ambion, 미국)를 대조군으로 프리믹스 RT-PCR(PreMix RT-PCR, 바이오니아, 대한민국)을 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. PCR은 하기의 프라이머를 이용하여 수행되었으며, 대조군으로는 GAPDH 유전자를 사용하였다. PCR과정은, 중합효소의 활성화를 위해 97℃에서 5분 반응시키고 95℃에서 1분간 더 두어 DNA의 이중나선 구조가 끊어지도록 한다(denaturation step). 다음 단계로 프라이머가 단일가닥의 DNA 결합할 수 있도록 낮은 온도인 60℃에서 1분간 반응시킨 뒤(annealing step), 중합효소가 단일가닥의 DNA와 상보적인 DNA가닥을 합성할 수 있도록 72℃에서 1분간 반응시켰다(elongation step). 상기 과정을 35회 반복하여 DNA를 증폭시킨 후, 마지막으로 남아있을지 모르는 단일가닥의 DNA를 합성하기 위하여 72℃에 10분간 반응시켰다:
CTHRC1_F(서열번호 1): 5'-AGC GCC TCT GAG ATC CCC AA-3',
CTHRC1_R(서열번호 2): 5'-TGA ACA AGT GCC AAC CCA GA-3',
GAPDH_F(서열번호 3): 5'-TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA-3', 및
GAPDH_R(서열번호 4): 5'-TCC TTG GAG GCC ATG TGG GCC AT-3'.
그 결과, 도 1B에 나타난 바와 같이 일반 췌장 세포주(normal)과 비교하여 췌장관세포암에서 CTHRC1 mRNA가 증가하는 것을 확인하였다(도 1B). 또한, 비-암성 조직(non-cancerous tissue)과 비교하였을 때 암성 조직(cancerous tissue)에서 CTHRC1의 발현이 증가함을 확인하였다(도 1C).
<1-3> 면역조직화학법 ( immunohistochemistry )을 이용한 CTHRC1 의 발현 수준확인
CTHRC1의 발현 수준을 확인하기 위하여 환자로부터 수득한 25개의 췌장암 조직 시료의 면역조직화학 분석을 수행하였다.
구체적으로, 25명의 환자로부터 외과적으로 수득된 췌장암 조직을 사용하였고, 상기 모든 암은 선암(adenocarcinomas)이었다. 또한, 상기 선암은 췌장관(pancreatic duct)로부터 발생한 1차 췌장 선암종으로 확인되었다. 수득된 시료를 포르말린으로 고정한 후, 파라핀에 끼워넣어 EnVision-HRP 탐지 시스템(EnVision-HRP detection system, Dako, 미국)을 이용하여 제조사의 사용설명서에 따라 항-CTHRC1 항체(Abcam 및 Abgent, 미국)를 사용하여 면역조직화학적인 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1D에 나타난 바와 같이 정상 췌장관 상피세포에서는 CTHRC1이 유의적인 발현을 보이지 않았지만, 선암 세포에서는 강하게 발현됨을 확인하였다. 아울러, 췌장암 시료의 24%(25개 시료 중 6개)는 CTHRC1이 약하거나 발현되지 않았으나, 76%(25개 시료 중 19개)는 세포질 및 세포막에서 CTHRC1의 발현이 중간 또는 강하게 나타났다. 또한, 일부 전이된 암 세포주에서도 CTHRC1이 강하게 발현되었다(도 1D). 상기 결과는 환자의 병력, 나이 또는 성별과 관련성이 없었다.
< 실시예 2> 종양의 진행 및 전이에 있어서 CTHRC1 의 효과 확인
<2-1> 세포배양
인간 췌장암세포주인 Panc-1, MiaPaCa-2 및 BxPC-3는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였고, 상기 세포주들은 37℃, 5% CO2의 조건에서 Panc-1의 경우 10% 소태아혈청이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium), MiaPaCa-2의 경우 10% 소태아혈청 및 2.5% 말혈청이 포함된 DMEM, 또는 BxPC-3의 경우 10% 소태아혈청이 포함된 RPMI에서 배양하였다.
<2-2> 세포주의 수립
상기 <실시예 1>의 결과에 대한 영향을 확인하기 위하여, CTHRC1을 안정적으로 상향 또는 하향 발현하는 인간 췌장암세포주를 수립하였다.
구체적으로, CTHRC1을 과발현하는 세포주의 수립을 위하여, CTHRC1의 암호화 영역(coding region)을 하기의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 상기 수득된 PCR 산물을 Kpn I 및 Xba I을 이용하여 pcDNA3.1(+)-MycHis(Invitrogen, 미국) 벡터에 클로닝하였으며, 제작된 CTHRC1 발현벡터를 pLFG238이라 명명하였다:
CTHRC1_2_F(서열번호 5): 5'-CCT TGG TAC CGG CCA TCA GGG CCA TGC GAC CCC AGG GCC CCGC-3', 및
CTHRC1_2_R(서열번호 6): 5'-CCT TTC TAG ATG GGC CAG CCA GGC CTT TTG GTA GTT CTT CAA TAA TG-3'.
상기 제작된 pLFG238 또는 pcDNA3.1(+)-MycHis를 리포펙타민(lipofectamine, Invitrogen)을 이용하여 형질주입(transfection)하였으며, 상기 형질주입된 세포주에서 CTHRC1을 안정적으로 발현하는 세포주를 선별하기 위하여 G418을 사용하였다.
또한, CTHRC1가 녹다운(knock down)된 세포주를 수립하기 위하여 CTHRC1 특이적인 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)[shRNA(서열번호 7): 5'-CAGCGTTGGTATTTCACAT-3']를 제작하고, 이를 렌티바이러스(lentivirus) 벡터인 shLenti2.4G(Macrogen, 대한민국)에 클로닝하여 shLenti2.4G-CTHRC1을 제작하였다. 음성대조군으로 사용된 렌티바이러스 벡터는 shLenti2.4G-Ctrl로 서열번호 8(5'-AATCGCATAGCGTATGCCGTT-3')로 기재된 서열을 포함한다. 상기 제작된 shLenti2.4G-CTHRC1 또는 shLenti2.4G-Ctrl을 세포에 도입한 후, 안정적으로 shRNA를 발현하는 세포주는 퓨로마이신(puromycin)을 사용하여 선별하였다.
그 결과, 각각의 수립된 세포주에서 적어도 세 개의 독립적인 클론(clone)을 선별하였다.
<2-3> 선별된 세포주에서 CTHRC1 의 상향 또는 하향 발현 확인
상기 실시예 <2-2>에서 선별된 CTHRC1을 상향 또는 하향 발현하는 세포주를 확인하기 위하여 항-CTHRC1(Abcam 및 Abgent, 미국) 및 항-β-액틴(Santa Cruz, 미국) 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
구체적으로, 웨스턴 블랏은 세포주를 PBS로 씻어내고, 1 x RIPA 완충액에 넣어 세포를 용균(lysis)하여 추출된 상기 단백질을 준비하였고, 배양 상층액(culture supernatants)는 마이크로콘 원심분리기(Microcon centrifugal filters, Millipore, 미국)을 이용하여 농축하여 준비하였다. 상기 단백질을 BCA 방법을 이용하여 농도를 정량하였다. 그리고 그 후, 같은 양의 단백질을 PAGE 전기영동법으로 SDS 러닝 완충액(running buffer)을 이용하여 분리하고, 이를 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)으로 이동시켰다. 단백질의 불특정 결합을 막기 위하여, 0.1% 트윈 20(Tween 20)이 포함된 PBS에 5% 무지방 우유(fat-free milk)를 사용하였고, 1차 항체를 처리하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 막은 ECL(Pierce, Rockford, IL, USA) 방법을 사용하여 현상하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, CTHRC1을 과발현하는 MiaPaCa-2-CTHRC1 및, CTHRC1이 녹다운된 BxPC-3-shCTHRC1 및 Panc-1-shCTHRC1을 각각 수립하였다(도 2). 또한, 음성대조군 세포주로는 MiaPaCa-2-Mock, BxPC3-shCtrl 및 Panc-1-shCtrl 세포주를 각각 수립하였다.
<2-4> 수립된 세포주의 생체 내에서 효과 확인
상기 실시예 <2-3>에서 수립된 세포주가 마우스 생체 내에서 암의 진행 및 전이를 향상시키는가 여부를 확인하기 위하여, 생체 내 생체 발광 이미지분석(in vivo bioluminescence imaging analysis)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <2-3>에서 수립된 세포주에 파이어플라이 루시퍼라제(firefly luciferase) 유전자(LentiM1.4-Luci, 마크로젠, 대한민국)를 렌티바이러스 유전자 이동(lentiviral gene transfer)을 사용하여 도입하였다. 상기 유전자 삽입에 사용된 렌티바이러스는 RNA 바이러스로 핵공을 통하여 핵으로 자유롭게 들어갈 수 있는 시스템을 갖고 있어 세포 내 핵으로 이동하여 게놈 DAN(genomic DNA)에 삽입되어 있다가 특정 환경이 되면 유전자를 발현시키는 특징을 갖고 있다. 상기 기능을 하는 렌티바이러스를 생산하기 위하여, pLVX 벡터에 파이어 루시퍼라제(fire leuciferase) 유전자가 주입된 재조합 DNA를 만들어 바이러스 패키징(packaging)을 위한 WPRE, CPPT, RRE 벡터와 같이 리포펙타민(lipofectamine)을 이용하여 바이러스 생산 세포주인 293T 세포주에 형질도입하고, 48시간 후, 배양액을 회수하여 렌티바이러스만 채취하였다. 상기 생산된 렌티바이러스를 인간 췌장암 세포주에 감염시킨 후, 바이러스벡터가 주입된 세포주를 퓨로마이신을 이용하여 선별하였다. 그리고나서, 상기 파이어플라이 루시퍼라제가 도입된 세포주 1 x 106 cell을 마우스의 복부를 절개하고 췌장을 노출시켜 췌장의 몸통(body)에 주사하고, CTHRC1가 이식된 종양의 진행에 어떤 영향을 주는지 생체 내 생체 발광 이미지분석(in vivo bioluminescence imaging analysis)은 IVIS 루미나 생체 내 이미지 시스템(IVIS Lumina in vivo imaging system, Xenogen, 미국)을 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이 음성 대조군과 비교하였을 때, CTHRC1이 과발현되는 마우스의 경우 형광 신호(luminescence signal)의 강도가 유의적으로 높고, 전이와 관련해서는 비장, 간, 결장 및 위를 포함하는 여러 기관(organ)으로 전이된 것을 확인하였다(도 3A). 반면에, CTHRC1의 발현이 감소된 세포의 경우, 음성 대조군과 비교하였을 때, 종양의 진행 및 전이가 감소함을 확인하였다(도 3B). 따라서, 상기 결과는 CTHRC1이 췌장암의 진행 및 전이를 향상시킴을 확인하였다.
< 실시예 3> CTHRC1 의 시험관 내 종양 세포의 이동 및 부착 효과 확인
CTHRC1이 시험관 내에서 췌장암 세포주의 이동성 및 부착성에 미치는 효과를 확인하였다.
구체적으로, 세포 이동 검정을 위하여, CTHRC1이 과발현되는 MiaPaCa-2-CTHRC1, 및 CTHRC1이 녹다운된 BxPC-3 및 Panc-1 세포주 1 x 105 cells을 포함하는 무혈청 배지를 1 ug/ml의 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin), 파이브로넥틴(fibronectin), 또는 콜라겐 타입 1(collagen type 1)으로 코팅된 트랜스웰 삽입(Transwell inserts, Corning, 미국)의 윗부분에 두고, 아랫부분은 10% 소태아혈청이 포함된 배지로 채운다. 상기 트랜스웰을 5% CO2, 37℃ 조건하에 20시간 배양한 후, 필요한 화학물, 항체 또는 재조합 단백질을 윗부분에 넣어준다. 이동한 세포의 수는 당업계의 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 측정되었다.
아울러, 세포 부착성은 1 ug/ml의 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin), 파이브로넥틴(fibronectin), 또는 콜라겐 타입 1(collagen type 1)으로 코팅된 96-웰을 사용하였다. 2% 혈청이 포함된 배지 100 ul에 1 x 104 cells/웰로 세포를 접종하고, 37℃에서 배양하였다. 부착되지 않은 세포주는 PBS로 두 번 세척하여 제거하고, 부착된 세포의 수는 당업계의 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 측정되었다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 CTHRC1이 과발현되는 MiaPaCa-2-CTHRC1 세포주에서 세포의 이동성 및 부착성이 유의적으로 증가하였고(도 4A 및 4B), 반면에 CTHRC1이 녹아웃된 BxPC-3 및 Panc-1 세포주에서는 세포의 이동성 및 부착성이 감소함을 확인하였다(도 4C 및 4D).
< 실시예 4> 자가활성 방식( autocrine manner )을 이용하여 CTHRC1 이 세포의 이동 및 부착을 조절
상기 <실시예 3>의 결과에서 CTHRC1의 과발현 및 녹다운 모두는 세포의 증식속도에는 아무런 영향을 주지 못하였다. 이는 CTHRC1이 분비 단백질이기 때문이라 사료되고, 본 발명자들은 CTHRC1이 세포의 이동 및 부착에 있어서 자가활성 방식(autocrein manner)으로 조절할 수 있는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, CTHRC1의 암호영역, 트롬빈 절단서열(thrombin cleavage sequence), 면역글로불린의 불변부(constant region)(Fc) 재조합 및 디히드로엽산환원효소(dihydrofolate reductase; dhfr) 유전자를 pcDNA3.1(+)에 삽입한 재조합 CTHRC1을 우선 제작하여, pGR235라고 명명하였다. 상기 제작된 플라스미드는 CHO/dhfr-세포주에 안정적으로 형질주입되었고, rCTHRC1을 발현하는 클론은 메토트렉사트(methotrexate, Sigma, 미국)의 농도가 단계적으로 증가하는 배지에 배양되면서 적응되었다. rCTHRC1은 CTHRC1-Fc에서 트롬빈으로 절단되어 방출되었고, 이는 항-Fc(Sigma, 미국) 및 항-CTHRC1(Abcam 및 Abgent, 미국) 항체를 이용하여 상기 서술된 웨스턴 블랏을 수행하여 확인하였으며, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 정제되었다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 CTHRC1-Fc 및 트롬빈으로 잘린 rCTHRC1의 발현을 확인하였고(도 5A), rCTHRC1에 의해서 MiaPaCa-2 세포주의 운동성 및 부착성이 농도의존적으로 증가하는 것을 확인하였다(도 5B 및 5C 참고). 게다가, CTHRC1에 의한 세포주의 운동성 및 부착성의 증가가 항-CTHRC1을 첨가할 때 감소함을 확인함으로써 상기 결과가 CTHRC1 특이적인 영향임을 확인하였다(도 4E 및 4F).
< 실시예 5> CTHRC1 의 Sre - FAK 신호전달 활성 효과 확인
CTHRC1에 의한 세포의 부착 및 이동 기작을 확인하기 위하여, Src 리쿠르팅(recruiting) 및 Sre-FAK 복합체의 형성 후에 활성화되는 FAK의 활성을 확인하였다.
구체적으로, 실시예 <2-3>에 서술된 방법으로 Src(Cell Signaling, 미국), rSrc(Cell Signaling, 미국), FAK(Cell Signaling, 미국), pFAK(Cell Signaling, 미국), 팍실린(paxillin, Cell Signaling, 미국), p-팍실린(Cell Signaling, 미국), MEK-1/2(Cell Signaling, 미국), p-MEK-1/2(Cell Signaling, 미국), ERK(Cell Signaling, 미국), pERK 항체(Cell Signaling, 미국), 및 β-액틴(Santa Cruz, 미국) 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 6A에 나타난 바와 같이 CTHRC1이 과발현되면, Src-FAK 신호에 관여하는 단백질의 인산화가 증가하고, 반면에 CTHRC1이 녹다운되었을 경우 Src-FAK 신호에 관여하는 단백질의 인산화가 감소함을 확인하였다(도 6A). 또한, MiaPaCa-2 세포주를 혈청-결핍(serun-starved) 조건에서 16시간 동안 배양하고 rCTHRC1을 0, 5, 10, 30, 120 또는 720분 동안 처리하였을 때, rCTHRC1-유도된 빠르고, 일시적인 활성이 확인되었고(도 6B), rCTHRC1-유도된 Src-FAK 신호전달, 세포 이동성 및 세포 부착성이 Src 억제제인 PP2 및 MEK 억제제인 U0126에 의해서 억제됨을 확인하였다(도 6C 내지 도 6H).
< 실시예 6> CTHRC1 의 Rac 1 활성 유도효과 확인
다음으로, 대부분의 세포에 있어서 세포 이동에 주요 요소이고, 췌장암 세포에서 팍실린 신호전달에 의해 자극되는 Rac 1의 활성이 CTHRC1에 의해서 유도되는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 내생적으로 활발한(active) GTP-결합된 Rac 1을 EZ-탐지 Rac 1 활성화 키트(EZ-Detect Rac1 activation kit, Pierce)를 사용하여 제조사의 사용설명서에 따라 풀다운(pull down)하였다. 세포 용해물을 원심분리하여 찌꺼기를 제거하고, 총 Rac 1 단백질을 준비하였다. 남아있는 용해물을 PBD(p21-결합 영역)-아가로스 비드[PBD(p21-binding domain)-agarose bead] 1 mg과 함께 4℃에서 한 시간 동안 배양하였고, 침전된 비드 복합체는 샘플 완충액으로 세척되고 현탁하였다. 총 Rac 1 및 활성 Rac 1의 수준은 상기 실시예 <2-3>의 방법으로 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 CTHRC1의 발현이 증가 및 감소함에 따라서 GTP-Rac 1의 발현이 증가 및 감소하였고(도 7A), rCTHRC1-유도된 Rac 1 활성은 자극 5분 후에 최고점에 도달하였다(도 7B). 또한, 세포의 이동성 및 부착성에 있어서는 Rac 1 억제제인 NSC23766을 처리하였을 때 감소하였고(도 7C 및 7E), 우성음성 Rac 1(dominant-negative Rac 1)을 처리하였을 때도 역시 감소함을 확인하였다(도 7D 및 도 7F).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Protein marker for diagnosis and screening of pancreatic cancer and using thereof <130> 13P-01-01 <160> 17 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTHRC1_F <400> 1 agcgcctctg agatccccaa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTHRC1_R <400> 2 tgaacaagtg ccaacccaga 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 3 tgatgacatc aagaaggtgg tgaa 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 4 tccttggagg ccatgtgggc cat 23 <210> 5 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTHRC1_2_F <400> 5 ccttggtacc ggccatcagg gccatgcgac cccagggccc cgc 43 <210> 6 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTHRC1_2_R <400> 6 cctttctaga tgggccagcc aggccttttg gtagttcttc aataatg 47 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA <400> 7 cagcgttggt atttcacat 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shRNA_Ctrl <400> 8 aatcgcatag cgtatgccgt t 21 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 9 Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Ile 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 10 Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr 1 5 <210> 11 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 11 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Asp Glu Ser Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain <400> 12 Glu Ile Gln Leu Gln Gln Thr Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ile Met Leu Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Asn Pro Tyr Tyr Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Leu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Gly Tyr Asp Glu Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 13 Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 14 Leu Val Ser 1 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 15 Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 16 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain <400> 16 Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Thr Lys Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser 85 90 95 Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 17 <211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp 1 5 10 15 Val His Ser Ala Gln Pro Ala Ser Glu Ile Pro Lys Gly Lys Gln Lys 20 25 30 Ala Gln Leu Arg Gln Arg Glu Val Val Asp Leu Tyr Asn Gly Met Cys 35 40 45 Leu Gln Gly Pro Ala Gly Val Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala 50 55 60 Asn Gly Ile Pro Gly Thr Pro Gly Ile Pro Gly Arg Asp Gly Phe Lys 65 70 75 80 Gly Glu Lys Gly Glu Cys Leu Arg Glu Ser Phe Glu Glu Ser Trp Thr 85 90 95 Pro Asn Tyr Lys Gln Cys Ser Trp Ser Ser Leu Asn Tyr Gly Ile Asp 100 105 110 Leu Gly Lys Ile Ala Glu Cys Thr Phe Thr Lys Met Arg Ser Asn Ser 115 120 125 Ala Leu Arg Val Leu Phe Ser Gly Ser Leu Arg Leu Lys Cys Arg Asn 130 135 140 Ala Cys Cys Gln Arg Trp Tyr Phe Thr Phe Asn Gly Ala Glu Cys Ser 145 150 155 160 Gly Pro Leu Pro Ile Glu Ala Ile Ile Tyr Leu Asp Gln Gly Ser Pro 165 170 175 Glu Met Asn Ser Thr Ile Asn Ile His Arg Thr Ser Ser Val Glu Gly 180 185 190 Leu Cys Glu Gly Ile Gly Ala Gly Leu Val Asp Val Ala Ile Trp Val 195 200 205 Gly Thr Cys Ser Asp Tyr Pro Lys Gly Asp Ala Ser Thr Gly Trp Asn 210 215 220 Ser Val Ser Arg Ile Ile Ile Glu Glu Leu Pro Lys 225 230 235

Claims (13)

  1. CTHRC1(Collagen triple helix repeat containing-1) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방, 치료 및 전이 억제용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 CTHRC1은 서열번호 17로 기재되는 것을 특징으로 하는 췌장암 예방, 치료 및 전이 억제용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 CTHRC1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 췌장암 예방, 치료 및 전이 억제용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 CTHRC1 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 CTHRC1 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 췌장암 예방, 치료 및 전이 억제용 조성물.
  5. 1) 피검체로부터 수득한 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 세포에서 CTHRC1의 발현 또는 활성수준을 측정하는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 CTHRC1의 발현 또는 활성수준이 피검물질 무처리 대조군에 비해 감소하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 췌장암 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 단계 2)의 CHTRC1의 발현 또는 활성수준 측정은 RT-PCR, 실시간 PCR(real time PCR), 웨스턴 블랏, 노던 블랏, ELISA, 방사선면역분석(radioimmunoassay), 면역조직화학법(immunohistochemistry) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 췌장암 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.
  7. 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정영역1(heavy chain complementarity determining regions1, HCDR1), 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역1(light chain complementarity determining regions, LCDR1), 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄를 포함하는
    CTHRC1 단백질에 특이적인 인간 단일클론 항체, 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 CTHRC1 단백질에 특이적인 인간 단일클론 항체, 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 CTHRC1 단백질에 특이적인 인간 단일클론 항체, 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 면역학적 활성을 가진 단편은 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv, Fv, 단일쇄 Fv 이량체 및 다아바디(diabody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 CTHRC1 단백질에 특이적인 인간 단일클론 항체, 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편.
  11. 제 7항의 단일클론 항체의 중쇄 또는 이의 단편의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제 7항의 단일클론 항체의 경쇄 또는 이의 단편의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제 7항의 단일클론 항체 또는 상기 항체의 면역학적 활성을 가진 단편을 유효성분으로 함유하는 췌장암 예방, 치료 및 전이 억제용 약학적 조성물.



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