KR20150102152A

KR20150102152A - 고시폴 및 펜포르민을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR20150102152A
Application number: KR1020140023315A
Authority: KR
Inventors: 김수열; 김종헌; 배영기; 이호; 장현철; 홍경만; 홍동완; 최범규
Original assignee: 국립암센터
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2015-09-07
Anticipated expiration: 2034-02-27
Also published as: EP3111931B1; WO2015130109A1; CN106232109B; EP3111931A4; US20170071877A1; JP6328259B2; JP2017506655A; DK3111931T3; CN106232109A; KR101579371B1; US10085950B2; EP3111931A1; ES2675009T3

Abstract

본 발명은 고시폴(Gossypol) 및 펜포르민(phenformin)을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 고시폴 및 펜포르민을 병용 처리시에 고시폴 및 펜포르민을 각각 단독 처리했을 때에 비해 현저하게 높은 항암 활성을 가지는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 시너지적인 항암활성을 가지는 고시폴 및 펜포르민을 함유하는 약제학적 조성물은 암 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

고시폴 및 펜포르민을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약제학적 조성물{Anti-cancer composition comprising gossypol and phenformin}

본 발명은 시너지적인 항암 활성을 가지는 고시폴 및 펜포르민을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

공격적 암세포 표현형은 세포내 신호전달 경로의 조절해제 (deregulation)를 유도하는 다양한 유전적 및 후성적(epigenetic) 변화의 결과이다 (Ponder, Nature 411:336 (2001)). 그러나, 모든 암세포에 대한 공통점은 세포소멸성 프로그램을 실행하는데 실패한다는 점이며, 정상적인 세포소멸 기구에서의 결함으로 인한 적절한 세포소멸의 결여는 암의 특질 (hallmark)이다 (Lowe et al., Carcinogenesis 21:485 (2000)). 화학요법제, 방사선 및 면역요법을 포함한 현재의 암 치료법의 대부분은 간접적으로 암세포에서 세포소멸을 유도함으로써 작용한다. 따라서, 정상적인 세포소멸성 기구에서의 결함에 기인하여 암세포가 세포소멸성 프로그램을 실행할 수 없는 것은 종종 화학요법, 방사선, 또는 면역요법-유도된 세포소멸에 대한 저항성의 증가와 연관된다. 통용되고 있는 치료 프로토콜에 대한 다양한 기원의 인간 암의, 세포소멸 결함에 기인한 일차적 또는 획득 저항성은 통용되고 있는 암 치료법에서의 주된 문제점이다 (Lowe et al., Carcinogenesis 21:485 (2000); Nicholson, Nature 407:810 (2000)). 따라서, 암 환자의 생존 및 삶의 질을 개선시키기 위하여 새로운 분자표적-특이적 항암요법을 디자인하고 개발하는 현재 및 미래의 노력은 세포소멸에 대해 저항성인 암세포를 특이적으로 표적화하는 전력을 반드시 포함하여야 한다. 이와 관련하여, 암세포에서 세포소멸을 직접적으로 억제하는데 중심적 역할을 하는 결정적인 음성 조절자 (negative regulators)를 표적화하는 것은 새로운 항암약물 디자인을 위한 매우 유망한 치료학적 전략을 나타낸다.

암의 퇴치를 위하여 다양한 암 표적 물질들을 찾아 연구가 진행 중이나, 말기 암의 경우 대부분의 표적 치료가 암의 퇴치보다는 생명 연장이라는 수단으로 사용되고 있다. 그런 중에 다양한 암의 대사 조절물질이 항암치료에 도움이 되는 연구 결과들이 나오고 있다. 그 연구의 바탕은 암에 특이한 보편적인 대사 특성을 표적으로 하는 것이다. 예를 들어, 암세포는 Warburg effect와 같이 포도당을 호홉하여 이산화탄소와 물로 배출하지 않고 젖산 발효하는 대사를 선호하는 것을 말한다. 따라서 Warburg effect를 줄이기 위해 해당경로를 차단하면 암세포는 몹시 힘들어 잘 자라지 못하거나 죽게 된다.

세포소멸의 중심적 음성 조절자의 부류로 알려진 것이 Bcl-2 패밀리 단백질이다 (Adams et al., Science 281:1322 (1998); Reed, Adv. Pharmacol. 41:501 (1997); Reed et al., J. Cell. Biochem. 60:23 (1996)). Bcl-2는 상기 패밀리의 기본적 구성원이며, 종양원의 생성물로서 최초로 분리되었다. Bcl-2 패밀리는 현재 Bcl-2 및 Bcl-XL과 같은 항-세포소멸성 분자, 및 Bax, Bak, Bid 및 Bad와 같은 전-세포소멸성 (pro-apoptotic) 분자 둘 다를 포함한다. Bcl-2 및 Bcl-XL은 Bcl-2의 과발현을 유도하는 염색체성 전좌 (chromosomal trnaslocation) (t14, 18)에 의해서 야기되는, 비-호지킨 림프종을 포함한 인간 암의 다수의 형태 (예를 들어, 유방, 전립선, 결장직장, 폐 등)에서 과발현된다. 이것은, 다수의 암세포 형태가 Bcl-2 및/또는 Bcl-XL의 상승된 레벨에 의존하여, 이들을 암세포 또는 전-암세포로 정의하고, 동시에 이들이 세포소멸 경로를 실행하도록 시도하게 하는 다른 세포성 이상 (cellular derangement)을 존속시킨다는 것을 시사한다. 또한, Bcl-2 패밀리 단백질의 증가된 발현은 종양세포에서 다양한 경로로 세포사를 유도하는 방사선 및 암 치료학적 약물에 대한 저항성의 발현에 대한 기초로 인식되고 있다. Bcl-2 및 Bcl-XL은 종양세포 이동 및 침습, 및 따라서 전이에서 역할을 담당하는 것으로 생각된다 (Amberger et al., Cancer Res. 58:149 (1998); Wick et al., FEBS Lett, 440:419 (1998); Mohanam et al., Cancer Res. 53:143 (1993); Pedersen et al., Cancer Res., 53:5158 (1993)). Bcl-2 패밀리 단백질은 새롭고 복제를 허용하지 않는 환경 (예를 들어, 전이성 부위)에서 존속하기 위한 기전을 갖는 종양세포를 제공하고, 임상적 전이성 암확산의 유기특이적(organospecific) 패턴에 기여하는 것으로 보인다 (Rubio, La Invest. 81:725 (2001); Fernandez et al., Cell Death Differ. 7:350 (2000)). Bcl-2 및/또는 Bcl-XL과 같은 항-세포소멸성 단백질은 또한, 예를 들어, 세포표면 인테그린의 조절을 통하여 세포-세포 상호작용을 조절하는 것으로 생각된다 (Reed, Nature 387:773 (1997); Frisch et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:701 (1997); Del Bufalo et al., FASEB J. 11:947 (1997)). 이에, 암세포 민감성을 회복시키고 세포소멸에 대한 암세포의 저항성을 극복하도록 세포에서 Bcl-2 및 Bcl-XL을 표적화하는 치료학적 전략이 광범하게 검토되었다 (Adams et al., Science 281:1322 (1998); Reed, Adv. Pharmacol. 41:501 (1997); Reed et al., J. Cell. Biochem. 60:23 (1996)). 현재, Bcl-2 안티센스 치료법은 고형 및 비-고형 종양의 치료를 위한 몇 가지의 III상 임상실험 중에 있다.

고시폴은 조면실유 (Gossypium sp.)로부터 유도되는 천연적으로 존재하는 이중 비페놀성 화합물이다. 남성 피임제로서의 고시폴의 인체 실험은 이들 화합물의 장기간 투여의 안전성을 나타내었다 (Wu, Drugs 38:333 (1989)). 더욱 최근에, 고시폴은 항-증식성 효과를 갖는 것으로 나타났다 (Flack et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 76:1019 (1993); Bushunow et al., J. Neuro-Oncol., 43:79 (1999); Van Poznak et al., Breast Cancer Res. Treat. 66:239 (2001)). (-)-고시폴 및 그의 유도체는 최근에, Bcl-2 및 Bcl-XL의 강력한 억제제이며, 강력한 항암활성을 갖는 것으로 나타났다 (미국특허출원 제2003/0008924 호).

펜포르민(Phenformin)은 메트포르민(Metformin)과 같은 바이구아나이드(biguanide) 계열의 약물로 당뇨병 치료제로 알려져 있다. 그러나, 펜포르민과 같은 바이구아나이드 계열 약물들이 탄수화물 대사와 지질 대사를 생리적으로 조절하는 핵심 효소인 AMPK(AMP-activated protein kinase)를 활성화시켜 p53 유전자가 결여된 암의 치료에 효과적인 것으로 알려지기 시작하면서, 펜포르민 약물의 항암 효과에 대한 연구가 진행되었고, 펜포르민의 항암 효과에 대한 가능성이 입증되었다 (Effect of phenformin on the proliferation of human tumor cell lines. Life sciences, 2003 Dec 19:vol74(issue 5):643-650.) (Potentiation of antitumor effect of cyclophosphamide and hydrazine sulfate by treatment with the antidiabetic agent, 1-phenylethylbiguanide(phenformin), Cancer let. 1979 Oct; 7(6):357-61.). 그러나, 펜포르민과 고시폴 각각의 항암효과에 대해서는 알려져 있으나, 이 둘의 작용에 의한 시너지적인 항암효과에 대해서는 아직까지 밝혀진 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 보다 강력한 암 치료 효과를 나타내기 위한 물질들을 개발하기 위해 연구한 결과, ALDH 억제제인 고시폴(Gossypol)과 바이구아나이드(biguanide) 계열의 펜포르민(phenformin)의 조합이 다른 물질들과는 달리 현저한 항암 시너지 효과를 보임을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 고시폴(Gossypol) 및 펜포르민(phenformin)을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고시폴(Gossypol) 및 펜포르민(phenformin)을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 각기 단독으로 처리하였을 때에는 암세포주 사멸 효과가 없거나 약한 ALDH(Aldehyde dehydrogenase)를 억제하는 고시폴(Gossypol)과 미토콘드리아의 산화적 인산화를 낮추는 펜포르민(phenformin)을 병용처리 하였을 때에는 현저하게 항암 효과가 나타나는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 고시폴 및 펜포르민을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 암의 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 고시폴 처리에 의한 암세포에서의 ATP 생성 저해를 확인한 도이다:
Primary small airway epithelial: 폐의 정상 상피세포 (대조군).
도 2는 폐암 세포주 6 종을 대상으로 SRB test를 한 결과를 확인한 도이다:
0: 고시폴을 처리하지 않은 대조군;
-7: 고시폴을 10^-7M(0.1μM) 처리;
-6: 고시폴을 10^-6M(1μM) 처리;
-5: 고시폴을 10^-5M(10μM) 처리; 및
-4: 고시폴을 10^-4M(100μM) 처리.
도 3은 A549 폐암 세포주에서 고시폴의 시간별 또는 농도별 AMPK의 인산화를 확인한 도이다:
p-AMPK (T172): 인산화된 AMPK;
AMPK: 총 AMPK의 양; 및
β-actin: 대조군.
도 4는 phenformin을 각각 10 μM, 50 μM 및 100 μM 처리하면서 고시폴을 각각 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM 및 50 μM 처리하면서 암 세포주의 성장을 확인한 도이다:
파란색 선: A549/ATCC 세포주에 phenformin 만을 단독 처리한 암세포의 성장 곡선;
붉은색 선: NCI-H460 세포주에 phenformin 만을 단독 처리한 암세포의 성장 곡선;
녹색 선: A549/ATCC 세포주에 phenformin 및 Gossypol을 병용 처리한 암세포의 성장 곡선;
보라색 선: NCI-H460 세포주에 phenformin 및 Gossypol을 병용 처리한 암세포의 성장 곡선; 및
CTL: 고시폴 및 펜포르민을 처리하지 않은 암세포.
도 5는 Metformin을 100 μM 처리하면서 고시폴을 각각 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM 및 50 μM 처리하면서 암 세포주의 성장을 확인한 도이다:
파란색 선: A549/ATCC 세포주에 Metformin 만을 단독 처리한 암세포의 성장 곡선;
붉은색 선: NCI-H460 세포주에 Metformin 만을 단독 처리한 암세포의 성장 곡선;
녹색 선: A549/ATCC 세포주에 Metformin 및 Gossypol을 병용 처리한 암세포의 성장 곡선;
보라색 선: NCI-H460 세포주에 Metformin 및 Gossypol을 병용 처리한 암세포의 성장 곡선; 및
CTL: 고시폴 및 펜포르민을 처리하지 않은 암세포.
도 6은 Cisplatin을 각각 1 μM, 10 μM 및 50 μM 처리하면서 고시폴을 각각 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM 및 50 μM 처리하면서 암 세포주의 성장을 확인한 도이다:
파란색 선: A549/ATCC 세포주에 Cisplatin 만을 단독 처리한 암세포의 성장 곡선;
붉은색 선: NCI-H460 세포주에 Cisplatin 만을 단독 처리한 암세포의 성장 곡선;
녹색 선: A549/ATCC 세포주에 Cisplatin 및 Gossypol을 병용 처리한 암세포의 성장 곡선;
보라색 선: NCI-H460 세포주에 Cisplatin 및 Gossypol을 병용 처리한 암세포의 성장 곡선; 및
CTL: 고시폴 및 펜포르민을 처리하지 않은 암세포.
도 7은 고시폴 및/또는 펜포르민을 투여한 종양 보유 마우스에서의 종양 감소 효과를 확인한 도이다:
A: 고시폴 및/또는 펜포르민을 투여한 종양 보유 마우스에서의 종양 크기; 및
B: 펜포르민 100 mg/kg 및 고시폴 10 mg/kg을 병용 투여한 마우스 군과 대조군의 종양 크기.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 고시폴(Gossypol) 및 펜포르민(phenformin)을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 고시폴은 하기의 화학식 1의 화합물 또는 이의 유도체인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:

상기 펜포르민은 하기의 화학식 2의 화합물 또는 이의 유도체인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다:

상기 약제학적 조성물은 고시폴 및 펜포르민, 또는 이들의 허용 가능한 염을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 고시폴의 농도는 0.1 nM 내지 100 μM인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 펜포르민의 농도는 1 내지 200 μM인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 암은 자궁암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 폐암, 피부암, 혈액암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하며, 폐암인 것이 더욱 바람직하고, 소세포 폐암인 것이 가장 바람직하나, 암세포의 특이적인 대사를 표적으로 하고 있으므로 어느 암에든 적용 가능하므로 이에 한정되지 않는다.

상기 암 치료용 약제학적 조성물은 펜포르민 및 고시폴을 동시에 방출 또는 처리하는 것이 바람직하며, 펜포르민 또는 고시폴을 고시폴 또는 펜포르민 보다 먼저 방출 또는 처리하여도 상관없다.

본 명세서 전체에서, “약제학적 조성물”이라 함은 명시적인 다른 기재가 없는 한, 한번에 복용 또는 투여되는 경구제 또는 주사제 등과 같은 단일 투여 형태뿐만 아니라, 2회 이상으로 나누어 투여되는 복수의 단위 투여 형태도 포괄하여 지칭할 수 있는 것으로 해석된다. 예를 들어, “고시폴 및 펜포르민을 함유하는 약제학적 조성물”이라 함은 이들 2가지 활성 성분을 함께 포함하는 단일 단위 투여 형태뿐만 아니라, 각각 하나씩의 활성 성분을 포함하는 두 개의 단위 투여 형태를 함께 포함하는 것으로 해석된다. 또한, 2가지 활성 성분을 함께 포함하는 단일 단위 투여 형태라도 시간차 방출되도록 제조되어 동시에 투여되거나, 또는 두 개의 단위 투여 형태가 동시 또는 일정 시간 이하의 간격을 두고 투여되어 이들 단위 투여 형태 각각에 포함된 2가지 활성 성분이 체내에서 함께 존재해 상승 작용을 일으키는 경우, 단일 또는 두 개의 단위 투여 형태를 포괄하여 상기 “고시폴 및 펜포르민을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약제학적 조성물”의 범주에 속하는 것으로 지칭될 수 있다. 상기 2가지 활성 성분은 동시에 또는 시간차로 방출 내지 처리(또는 투여)가 이루어질 수 있다. 따라서 상기 고시폴 및 펜포르민, 또는 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염을 활성 성분으로 함유하는 암 치료용 약제학적 조성물은, 동시 병용 처리(또는 방출) 가능한 단순 복합 약제학적 조성물은 물론이고 시간차 병용 처리(또는 방출) 가능한 약제학적 조성물이 될 수 있다.

본 명세서 전체에서, “시간차 방출 또는 시간차 투여”라 함은 각각의 약효 성분이 복용 내지 투여될 때, 동시에 흡수되지 않고, 순차적으로 흡수되도록 약물이 방출 또는 투여되는 것을 의미한다. 이러한 “시간차 방출 또는 시간차 투여”는 두 성분이 하나의 제형에 포함되어 있는 복합제제뿐만 아니라, 개개의 활성 성분이 각각의 단일제 형태로 제조되었을 경우에도 최소 한 성분 이상을 시간차 방출이 되도록 제형을 설계함으로써 동시에 복용 또는 투여하더라도 시간차가 발생하여 작용할 수 있는 제제 또는 투여단위로 구현할 수 있다. 또한 상기 “시간차 투여”는 두 가지 활성 성분을 일정한 시간 간격으로 투여하는 방법도 포함할 수 있다.

상기 약제학적 조성물에서 고시폴 및 펜포르민은 그 자체로 사용하는 것이 바람직하나, 용해도 및 안정성의 특성을 고려하여 이의 유도체를 제조하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 항암제를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

한편, 본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 활성 성분 외에 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함할 수 있다. 본 명세서 전체에서 “약제학적으로 허용 가능한 담체”는 투여용 약제학적 조성물을 제형화 할 경우에 유용하고 사용 조건하에 비독성 및 비민감성인 약제학적 첨가제를 의미하며, 이러한 부형제의 구체적인 함량비는 활성성분의 용해도와 화학적 특성, 선택된 투여경로뿐만 아니라, 표준 약제학적 관행에 의해 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 갈화 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성 용제, 현탁 용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 갈화 추출물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 암환자의 치료를 위하여 단독 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제와 병행하여 사용될 수 있다.

본 발명이 적용 가능한 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 및 비교예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 및 비교예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 및 비교예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 및 비교예는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 고시폴 ( gossypol )의 항암활성 확인

<1-1> 암세포의 에너지 생성 억제 확인

ALDH(aldehyde dehydrogenase)인 고시폴에 의한 암세포의 에너지 생산이 저해되는지 확인하기 위하여, NSCLC(non-small cell lung cancer) 세포주들인 A549 세포주, H460 세포주, Hop-92 세포주 및 H23 세포주에 고시폴을 1 μM로 1시간 동안 처리한 뒤 ATP Assay Kit (Biovision; #K354-100)를 사용하여 ATP의 양을 측정하였다. 대조군으로는 폐의 정상 상피세포를 사용하였다. 또한, 고시폴의 농도에 따른 ATP 양의 변화를 알아보기 위하여 A549 세포주에 고시폴을 0, 0.1 또는 1 μM로 1시간 동안 처리한 뒤 ATP의 양을 측정하였다.

그 결과, 암세포주에서 증가했던 ATP 생성량(1 내지 6 nmol per 1 x 10⁶cells)이 고시폴에 의해 저해되었으며 (도 1A), 이는 고시폴의 농도 의존적임을 알 수 있었다 (도 1B).

<1-2> 암세포 성장 억제 확인

고시폴의 암세포주의 성장 억제 효과를 확인하기 위하여 SRB 분석을 수행하였다. 구체적으로, A549/ATCC, HOP-62, HOP-92, NCI-H23, NCI-H460 또는 NCI-H522 세포주들의 더블링 타임에 따라 5000 내지 40000 cell/well의 세포들을 96 웰 마이트로타이터 플레이트에서 배양하였다. 24시간 뒤에, 0, 0.1, 1, 10 또는 100 uM의 고시폴을 각각의 웰에 100 ml씩 처리한 뒤 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 부착형 세포주에는 50%의 차가운(4℃) Trichloroacetic acid (TCA)를 부유형 세포주에는 80%의 TCA를 각각 50 ml씩 첨가하여 이용하여 세포를 고정하였다. 플레이트를 4℃에서 1 내지 3 시간 동안 인큐베이션한 뒤, 플레이트 내의 TCA 용액을 버리고 증류수로 5회 헹궜다. 플레이트를 상온에서 약 12 내지 24시간 동안 건조시킨 뒤, 고정된 세포들을 100 ml의 sulforhodamine B (SRB)으로 상온에서 5분 동안 염색하였다. 염색 후, 플레이트를 1% glacial acetic acid로 3회 세척한 뒤 상온에서 약 12 내지 24시간 동안 건조하였다. SRB 염색약은 10 mM의 Trizma base로 녹였으며 흡광도는 515 nm에서 측정하였다. 고시폴의 암세포 억제 효과는 GI50 (50% growth inhibition)로 나타내었다.

그 결과, 고시폴이 폐암세포주의 성장을 억제하는 GI50 농도가 5 uM인 것으로 확인되었다 (도 2).

<1-3> 고시폴의 처리 시간 또는 농도에 따른 암세포 증식 억제 효과

고시폴의 처리 시간 또는 농도에 따른 항암 효과를 확인하기 위하여 A549 폐암 세포주에 Gossypol 1 uM을 0, 8, 16 및 24 시간 동안 처리한 뒤 암세포 분열에 중요한 단백질인 AMPK(AMP-activated protein kinase)의 인산화를 웨스턴 블롯 방법으로 확인하였다. 또한, 고시폴을 0, 0.1, 0.5 및 1 uM을 24시간 동안 처리한 뒤 상기에서와 같이 웨스턴 블롯 방법으로 AMPK의 인산화를 확인하였다.

그 결과, 시간 및 농도 의존적으로 AMPK의 인산화가 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3). 이를 통해, 고시폴이 암세포가 분열하는데 절대적으로 필요한 생합성을 억제하는 것을 알 수 있었으며, 이는 고시폴이 암세포의 증식을 억제하는 좋은 증거이다.

< 실시예 2> 고시폴 및 펜포르민(phenformin)의 병용처리에 의한 항암 효과 확인

암세포주 A549/ATCC 및 NCI-H460에 Gossypol을 0.1, 0.5, 1.0, 5, 10 및 50 uM의 농도로 단독 처리하였으며 (single), Phenformin을 10, 50 및 100 uM 농도로 병용처리 (combi)한 후 상기 실시예 <1-2>에서와 같은 방법으로 SRB 분석을 하였다.

그 결과, Gossypol 단독 처리시에는 거의 성장을 억제하지 않았으나, Phenformin 및 Gossypol 병용처리시, 고시폴 단독 처리시의 암세포 성장 억제 농도 (GI50)인 5 uM보다 현저히 낮은 농도에서 암세포의 성장이 억제된 것을 확인할 수 있었다 (도 4). 이를 통해, Phenformin 및 Gossypol 병용처리에 의한 암세포의 성장 억제 시너지 효과(synergy effect)를 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> 동물 모델에서의 고시폴 및 펜포르민(phenformin)의 병용 투여에 의한 항암 효과 확인

A549-luciferase 세포에 T/E(0.12% trypsin 및 0.008% EDTA)를 처리해서 plate에서 떼어낸 뒤, cold PBS로 washing한 후, 2 x 10⁶ cells/head/100㎕ PBS로 Balb/c-nude 6주령 암컷 마우스에 주사하였다. 한 달 뒤, 종양(tumor)의 사이즈를 측정하여 100 mm³가 된 경우 각각 그룹을 나눈 뒤 (그룹 당 5마리) 펜포르민 100 mg/kg/100㎕ PBS 및/또는 고시폴 0, 5, 10 mg/kg/100㎕ PBS(40% EtOH)를 제조하여 일주일에 5번 경구 투여 실시하였다. 종양 크기의 측정은 일주일에 2번 실시하였다.

그 결과, 고시폴 또는 펜포르민을 각각 투여한 경우의 마우스에 비해 고시폴 및 펜포르민을 병용 투여한 마우스에서 종양의 크기가 현저하게 감소하는 것을 확인하였다 (도 7).

< 비교예 1> 고시폴과 다른 biguanide 계통 화합물과의 병용처리에 의한 항암 효과 확인

항암 시너지 효과가 Gossypol 및 phenformin 만의 병용처리에 의한 것인지 확인하기 위하여, 암세포주 A549/ATCC 및 NCI-H460에 Gossypol을 0.1, 0.5, 1.0, 5, 10 및 50 uM의 농도로 단독 처리하였으며 (single), 미토콘드리아 산화적 인산화 억제제 중 phenformin이 속한 biguanide 계통이며 항암 효과가 있다고 알려진 metformin을 100 uM 농도로 병용처리한 경우의 암세포 성장 억제 효과를 동일한 방법으로 확인하였다.

그 결과, Metformin 100 uM을 Gossypol과 병용처리한 경우 Gossypol 단독 처리와 큰 차이가 없어, Gossypol 및 phenformin의 병용처리와 달리 시너지 효과가 없음을 확인할 수 있었다 (도 5). 따라서 Gossypol과의 병용처리로 항암 시너지 효과를 보이는 물질은 phenformin 계열이 될 것으로 생각된다.

< 비교예 2> 고시폴과 기존 항암제와의 병용처리에 의한 항암 효과 확인

실제 항암치료용 약물로 상용되고 있는 Cisplatin 단독 또는 이와 고시폴을 병용처리한 뒤 이의 항암 효과에 있어서의 시너지 효과를 확인하였다.

그 결과, cisplatin 1, 10 및 50 uM을 Gossypol과 병용처리하여도 Gossypol 단독 처리와 항암 활성에서 큰 차이가 없어 시너지 효과가 나타나지 않는 것을 알 수 있었다 (도 6).

Claims

고시폴(Gossypol) 및 펜포르민(phenformin), 또는 이들의 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 고시폴은 하기의 화학식 1의 화합물인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물:
[화학식 1]

.
제 1항에 있어서, 상기 펜포르민은 하기의 화학식 2의 화합물인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물:
[화학식 2]

.
제 1항에 있어서, 상기 고시폴의 농도는 0.1 nM 내지 100 μM이고 상기 펜포르민의 농도는 1 내지 200 μM인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 암은 자궁암, 유방암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 폐암, 피부암, 혈액암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 암 치료용 약제학적 조성물은 펜포르민 및 고시폴을 동시에 방출하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물.
제 1항의 약제학적 조성물에 항암제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물.
제 7항에 있어서, 상기 항암제는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 카보플라틴, 소라페닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴 및 카르무스틴으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물.