KR20150146032A - 혐기성 균의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 처리 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혐기성 균의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 처리 방법에 관한 것으로, 대사체 샘플링을 위한 최적 조건을 확립하고, 선정된 대사체 바이오마커를 사용하여 혐기성 균의 산생성 단계와 용매생성 단계를 구별할 수 있다.
Description
본 발명은 공기가 거의 없는 상태에서 번식하는 혐기성 균의 대사체 분석을 위한 최적의 대사체 샘플링 조건을 확립하고, 대사체 분석 및 통계적 검증을 통해 혐기성 균의 산생성 단계(acidogenic phase)와 용매생성 단계(solventogenic phase)를 구별할 수 있는 혐기성 균의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 및 처리 방법에 관한 것이다.
대사체 샘플링(metabolome sampling)의 중요성으로 인해 그람 음성 균인 사카로퍼거스 데그라단스, 대장균, 효모 등의 다양한 미생물에서 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 방법의 최적화 연구가 진행되고 있으며 이를 이용하여 메커니즘에 관한 연구들이 진행되고 있다(Rabinowitz JD and Kimball E. (2007) Anal Chem vol. 79, pp. 6167-6173; Shin MH et al (2010) Anal Chem vol. 82, pp. 6660-6666; Kim S et al (2013) Anal Chem vol. 85, pp. 2169-2176). 혐기성 균의 대사체 분석을 통하여 혐기성 균의 메커니즘에 관한 연구 역시 보고되고 있다(Amador-Noguez D et al (2011) Appl Environ Microbiol vol. 77, pp. 7984-7997; Amador-Noguez D et al (2010) J Bacteriol vol. 192, pp. 4452-4461).
대사체 샘플링 방법은 크게 대사 (metabolism)나 효소 활성(enzyme activity)을 억제시켜주는 ?칭 과정(quenching step)과 대사체를 추출하는 추출과정(extraction step)으로 구분된다. 기존에 널리 사용되는 저온의 메탄올(cold methanol)을 이용한 ?칭 방법(de Koning W and van Dam K (1992) Anal BioChem vol. 204, pp. 118-123)에 의한 세포막의 손상(cell leakage)을 초래하여 대사체의 손실을 일으킨다. 이러한 손실을 줄이기 위한 대체 방법으로 초고속 여과 방법(fast filtration)이 다양한 균의 대사체 샘플링 수행에 사용되고 있다(Wtiimann C et al (2004) Anal BioChem vol. 327, pp. 135-139; Shin MH et al (2010) Anal Chem vol. 82, pp. 6660-6666; Kim S et al (2013) Anal Chem vol. 85, pp. 2169-2176). 그러나, 혐기성 균은 산소에 의한 스트레스로 세포막의 손상을 유발할 수 있으므로(Cabiscol E et al (2000) Int Microbiol vol. 3, pp. 3-8) 초고속 여과 방법을 혐기 챔버(anaerobic chamber)에서 수행하고 있다. 하지만 혐기 챔버 안에서 수행하는 것은 샘플을 혐기 챔버 안으로 넣는 시간이 많이 지체 되고, 과정이 복잡하며 많은 기구들이 필요하다. 이러한 소요되는 시간에 의한 대사체의 변화를 최소화 하고, 불편함을 줄일 수 있도록 대기 중에서 대사체 샘플링을 수행하는 초고속 여과 방법의 개발 및 최적화가 필요하다. 샘플링 방법의 추출 과정에 사용되는 추출 용매의 선택은 매우 중요하다. 추출 용매에 따라서 대사체의 추출 효율이 달라질 수 있으며, 대사체 프로파일링의 차이를 보일 수 있다(Duportet X et al (2012) Metabolomics vol. 8, pp. 410-421; Canelas AB et al (2009) Anal Chem vol. 81, pp. 7379-7389). 이로 인해 생물학적 해석이나 메커니즘의 해석이 달라질 수 있다. 혐기성 균의 대사체 추출을 위해 사용되는 추출 용매는 대장균의 최적 추출 용매를 사용하고 있다(Rabinowitz JD and Kimball E. (2007) Anal Chem vol. 79, pp. 6167-6173; Amador-Noguez D et al (2011) Appl Environ Microbiol vol. 77, pp. 7984-7997; Amador-Noguez D et al (2010) J Bacteriol vol. 192, pp. 4452-4461). 아직까지 혐기성 균의 추출 용매는 최적화되지 않았다. 따라서 혐기성 균의 대사체 추출 효율을 높일 수 있으며 생물학적 해석이나 메커니즘 해석의 오도를 줄일 수 있는 추출 용매의 최적화가 필요하다.
Amador-Noguez D et al (2011) Appl Environ Microbiol vol. 77, pp. 7984-7997
Rabinowitz JD and Kimball E. (2007) Anal Chem vol. 79, pp. 6167-6173
Shin MH et al (2010) Anal Chem vol. 82, pp. 6660-6666
Kim S et al (2013) Anal Chem vol. 85, pp. 2169-2176
본 발명의 목적은 혐기성 균의 대사체 분석을 위한 최적의 대사체 샘플링 조건을 확립하고, 대사체 분석 및 통계적 검증을 통해 혐기성 균의 산생성 단계와 용매생성 단계를 구별할 수 있는 키트와 대사체 차별성을 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하이드록실아민(hydroxylamine), 숙시네이트(succinate), 2-메틸글리세레이트 NIST(2-methylglycerate NIST), 인산(phosphoric acid), 미리스트산(myristic acid), 레보글루코산(levoglucosan), 글루코스-1-포스페이트(glucose-1-phosphate), 2-모노팔미틴(2-monopalmitin), 시트라말레이트(citramalate) 및 라이보스(ribose)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 혐기성 균의 산생성 단계(acidogenic phase)와 용매생성 단계(solventogenic phase)의 구별용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 두 생체시료군의 차별성을 검출하는 방법으로서,
혐기 또는 호기 조건에서 혐기성 균의 생체시료를 초고속 여과(fast filtration)하고, 여과물에 대하여 1 내지 10 mL(v/v)의 물로 세척한 다음, 메탄올을 사용하여 대사체를 추출하는 대사체 샘플링 단계를 포함하는 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법을 제공한다.
본 발명은 혐기성 균의 대사체 분석을 위한 최적화된 대사체 샘플링 조건, 즉, 혐기 또는 호기 조건에서 초고속 여과, 최적 용량의 용매를 이용한 세척, 추출 효율이 우수한 추출 용매를 확립하고, GC/TOF MS를 이용한 대사체 바이오마커 검출, 비교 분석, 공초점 주사 레이져 현미경 및 주성분 분석(PCA)에 의한 다양한 통계 분석을 통해, 혐기성 균의 산생성 단계와 용매생성 단계를 구별할 수 있는 대사체 바이오마커를 제공하는 효과가 있다.
본 발명은 혐기성 균의 대사체 분석을 통한 다양한 메커니즘 연구에 이용될 것으로 기대한다. 또한 각 미생물에 맞는 최적의 대사체 샘플링 방법이 필요함을 입증함으로써 이를 이용하여 다른 미생물의 대사체 샘플링 방법의 최적화에 응용할 수 있다.
도 1은 PCA를 이용한 혐기 처리(anaerobic processing)과 호기 처리(atmospheric processing) 방법의 각 단계(phase)에서의 대사체 프로파일의 차이를 나타낸 결과로, Acid_Ana는 혐기 처리 방법으로 산생성 단계(acidogenic phase)의 대사체 분석 결과, Acid_Atm는 호기 처리 방법으로 산생성 단계의 대사체 분석 결과, Solvent_Ana는 혐기 처리 방법으로 용매생성 단계(solventogenic phase)의 대사체 분석 결과, Solvent_Atm는 호기 처리 방법으로 용매생성 단계의 대사체 분석 결과이다.
도 2는 각 단계의 혐기 처리 방법과 호기 처리 방법에 따른 주요 대사체의 피크 강도를 나타낸 것으로, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계다.
도 3은 각 단계의 혐기 처리 방법과 호기 처리 방법에 따른 공초점 주사 레이져 현미경 분석 결과로, SYTO 9는 전체 세포를 염색하며, PI는 손상 입은 세포만을 염색한 결과이고, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계다.
도 4는 각 단계의 호기 처리 방법으로 초고속 여과 후 세척 용량(washing volume)에 따른 세포 외 대사체 및 배지성분 제거율을 비교한 그래프로, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계를 나타낸다.
도 5는 각 단계의 호기 처리 방법으로 초고속 여과 후 세척 용량(washing volume)에 따른 세포 내 주요 대사체 강도를 비교한 결과로, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계를 나타낸다.
도 6은 PCA를 이용한 각 단계에서의 추출 용매에 따른 대사체 프로파일링 차이를 나타낸 결과로, 50ACN은 아세토니트릴:물=1:1; AMW는 아세토니트릴:메탄올:물=2:2:1; PM은 순수 메탄올; WiPM는 물:2-프로판올:메탄올=2:2:5를 나타내고, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계를 나타낸다.
도 7은 계층적 군집 분석(Hierarchical cluster analysis, HCA)를 이용한 각 단계에서의 추출 용매에 따른 대사체 프로파일링 차이를 나타낸 결과로, 50ACN은 아세토니트릴:물=1:1; AMW는 아세토니트릴:메탄올:물=2:2:1; PM은 순수 메탄올; WiPM는 물:2-프로판올:메탄올=2:2:5를 나타내고, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계를 나타낸다.
도 8은 각 단계의 추출 용매에 따른 대사체 그룹의 추출 효율을 비교한 결과로, 50ACN은 아세토니트릴:물=1:1; AMW는 아세토니트릴:메탄올:물=2:2:1; PM은 순수 메탄올; WiPM는 물:2-프로판올:메탄올=2:2:5를 나타내고, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계를 나타낸다.
도 9는 각 단계의 추출 용매에 따른 재현성 비교를 위한 %CV 값을 비교한 결과로, 50ACN은 아세토니트릴:물=1:1; AMW는 아세토니트릴:메탄올:물=2:2:1; PM은 순수 메탄올; WiPM는 물:2-프로판올:메탄올=2:2:5를 나타내고, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계를 나타낸다.
도 2는 각 단계의 혐기 처리 방법과 호기 처리 방법에 따른 주요 대사체의 피크 강도를 나타낸 것으로, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계다.
도 3은 각 단계의 혐기 처리 방법과 호기 처리 방법에 따른 공초점 주사 레이져 현미경 분석 결과로, SYTO 9는 전체 세포를 염색하며, PI는 손상 입은 세포만을 염색한 결과이고, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계다.
도 4는 각 단계의 호기 처리 방법으로 초고속 여과 후 세척 용량(washing volume)에 따른 세포 외 대사체 및 배지성분 제거율을 비교한 그래프로, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계를 나타낸다.
도 5는 각 단계의 호기 처리 방법으로 초고속 여과 후 세척 용량(washing volume)에 따른 세포 내 주요 대사체 강도를 비교한 결과로, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계를 나타낸다.
도 6은 PCA를 이용한 각 단계에서의 추출 용매에 따른 대사체 프로파일링 차이를 나타낸 결과로, 50ACN은 아세토니트릴:물=1:1; AMW는 아세토니트릴:메탄올:물=2:2:1; PM은 순수 메탄올; WiPM는 물:2-프로판올:메탄올=2:2:5를 나타내고, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계를 나타낸다.
도 7은 계층적 군집 분석(Hierarchical cluster analysis, HCA)를 이용한 각 단계에서의 추출 용매에 따른 대사체 프로파일링 차이를 나타낸 결과로, 50ACN은 아세토니트릴:물=1:1; AMW는 아세토니트릴:메탄올:물=2:2:1; PM은 순수 메탄올; WiPM는 물:2-프로판올:메탄올=2:2:5를 나타내고, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계를 나타낸다.
도 8은 각 단계의 추출 용매에 따른 대사체 그룹의 추출 효율을 비교한 결과로, 50ACN은 아세토니트릴:물=1:1; AMW는 아세토니트릴:메탄올:물=2:2:1; PM은 순수 메탄올; WiPM는 물:2-프로판올:메탄올=2:2:5를 나타내고, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계를 나타낸다.
도 9는 각 단계의 추출 용매에 따른 재현성 비교를 위한 %CV 값을 비교한 결과로, 50ACN은 아세토니트릴:물=1:1; AMW는 아세토니트릴:메탄올:물=2:2:1; PM은 순수 메탄올; WiPM는 물:2-프로판올:메탄올=2:2:5를 나타내고, A는 산생성 단계, B는 용매생성 단계를 나타낸다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 혐기성 균의 대사체 분석을 위한 대사체 샘플링 방법인 ?칭 방법과 추출 방법을 혐기성 균의 각 단계(산생성 단계와 용매생성 단계) 별로 최적화하였다. 또한 혐기 챔버 안에서 수행한 것과 대기 중에서 수행한 것의 차이를 비교 분석하였으며, 이에 따른 추출 용매 최적화 연구를 수행하였다. 또한, 혐기성 균의 산생성 단계와 용매생성 단계의 각 단계별로 혐기 챔버 안에서 초고속 여과 방법을 수행한 혐기 처리 방법과 대기 중에서 초고속 여과 방법을 수행한 호기 처리 방법을 비교 분석하였다. ?칭 후 추출 용매는 기존에 많이 사용하고 있는 아세토니트릴:메탄올:물=2:2:1(AMW)을 이용하였다. 각 단계별로 차이를 보였을 뿐, 혐기 처리 방법과 호기 처리 방법의 대사체 프로파일링 차이는 보이지 않았다. 공초점 주사 레이져 현미경을 통하여 세포막의 손상을 살펴보았지만, 두 처리 모두 세포막의 손상을 보이지 않았다. 이를 통하여 혐기성 균주의 대사체 분석을 위하여 ?칭 과정을 진행할 때 대기 중에서 수행하는 호기 처리 방법을 사용해도 혐기 챔버 안에서 수행하는 혐기 처리 방법과 큰 차이가 없다는 결론을 얻을 수 있었다.
또한, 호기 처리 이후, 어떤 추출 용매를 이용하는 것이 혐기성 균의 대사체 추출 효율을 높일 수 있는지, 기존에 추출 용매로 사용하고 있던 AMW를 포함하여 미생물에서 많이 이용되고 있는 순수 메탄올(PM), 아세토니트릴:물=1:1(50ACN), 물:2-프로판올:메탄올=2:2:5(WiPM)를 비교 분석하였다. 산생성 단계에서는 추출 효율 및 재현성 부분에서 WiPM과 PM이 최적의 추출 용매임을 밝혔으며, 용매생성 단계에서는 PM과 50ACN이 최적의 추출 용매임을 밝혔다. 이를 통하여 혐기성 균의 대사체 분석 시 추출 용매로써 PM을 사용하는 것이 가장 최적임을 밝혔다.
따라서, 본 발명은 두 생체시료군의 차별성을 검출하는 방법으로서, 혐기 또는 호기 조건에서 혐기성 균의 생체시료를 초고속 여과(fast filtration)하고, 여과물에 대하여 1 내지 10 mL(v/v)의 물로 세척한 다음, 메탄올을 사용하여 대사체를 추출하는 대사체 샘플링 단계를 포함하는 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법은 혐기성 균의 산생성 단계(acidogenic phase)와 용매생성 단계(solventogenic phase)의 대사체 차별성을 분석하는 방법으로서,
우선, ?칭 과정과 대사체 추출 과정을 포함하는 대사체 샘플링 단계를 거친다.
대사체 샘플링은 혐기 또는 호기 조건에서 혐기성 균의 생체시료를 초고속 여과(fast filtration)하고, 여과물에 대하여 1 내지 10 mL(v/v)의 물로 세척한 다음, 메탄올을 사용하여 대사체를 추출하는 과정이다.
기존의 혐기성 균은 대사체 샘플링 단계에서 세포막이 손상되어 대사체 손실 우려가 있었으나, 본 발명의 대사체 샘플링 방법은 혐기 또는 호기 조건에서 혐기성 균에 대해 초고속 여과를 통해 메탄올 추출을 거칠 경우 세포막의 손상 없이 효율적으로 대사체를 추출할 수 있는 것을 특징으로 한다. 또한, 초고속 여과를 거친 여과물에 대하여 적절한 부피의 용매, 예컨대, 물을 이용하여 세척함으로써 세포 외 대사체와 배지 성분을 제거하여 세포 내 대사체의 손실 없이 추출이 가능하다.
상기 혐기 조건은 통상의 혐기성 챔버 내에서 초고속 여과를 수행하는 것일 수 있다.
상기 호기 조건은 대기 중에서 초고속 여과를 수행하는 것일 수 있다.
상기 초고속 여과는 혐기 또는 호기 처리 조건에 제한 없이 수행될 수 있다.
상기 여과물의 세척에 사용하는 용매로는 물을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
세척 용매의 용량은 여과물에 대하여 1 내지 10 mL(v/v)의 물이 적합한데, 1 mL 미만인 경우 세포 외 대사체와 배지 성분의 충분한 제거가 이루어지지 않고, 10 mL을 초과하는 경우 세척 시간이 오래 지체되어 비효율적일 수 있다.
세척을 거친 여과물에 대하여 메탄올 추출을 통해 대사체를 추출하는데, 메탄올은 혐기성 균에서 대사체의 추출 효율이 높고, 재현성이 우수한 장점이 본 발명을 통해 입증되었다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 아민류, 아미노산류, 당 및 당 알코올류, 지방산류, 인산류, 유기산류 등을 포함한 116개의 대사체가 동정되었다.
상기 대사체 샘플링 단계에서 추출된 대사체에 대해서는 다음의 분석 단계를 거친다:
추출된 대사체를 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기로 분석하는 단계;
GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계; 및
변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 상기 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 단계.
즉, 상기 GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계는 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정하고, 대사체의 강도를 총 동정된 대사체의 강도 합으로 나누어 각 대사체를 표준화한다.
다음으로, 대사체의 프로파일링 차이를 비교하기 위해 주성분 분석(Principle Component Analysis: PCA)을 수행하여 두 생체시료군 간의 유의적인 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 선정하고, 분석 및 검증한다.
주성분 분석이란 원래 변수들의 선형결합으로 표시되는 새로운 주성분을 찾고, 이를 통하여 자료의 요약과 용이한 해석을 목적으로 하는 통계적 기법이다. 즉 차후의 분석을 위한 수단을 제공하여 주는 분석방법이다.
주성분 분석(PCA)의 로딩 값이 양수인 것은 대사체 바이오마커의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체 바이오마커의 감소 경향을 나타내는 것으로 판정한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 혐기성 균의 산생성 단계(acidogenic phase)와 용매생성 단계(solventogenic phase)를 구별하기 위한 바이오마커로, 하이드록실아민(hydroxylamine), 숙시네이트(succinate), 2-메틸글리세레이트 NIST(2-methylglycerate NIST), 인산(phosphoric acid), 미리스트산(myristic acid), 레보글루코산(levoglucosan), 글루코스-1-포스페이트(glucose-1-phosphate), 2-모노팔미틴(2-monopalmitin), 시트라말레이트(citramalate) 및 라이보스(ribose)를 사용할 수 있다.
상기 바이오마커들은 산생성 단계의 혐기성 균에서, 하이드록실아민, 숙시네이트, 2-메틸글리세레이트 NIST, 인산 및 미리스트산은 증가 경향을, 레보글루코산, 글루코스-1-포스페이트, 2-모노팔미틴, 시트라말레이트 및 라이보스는 감소 경향을 나타내며, 용매생성 단계의 혐기성 균에서, 레보글루코산, 글루코스-1-포스페이트, 2-모노팔미틴, 시트라말레이트 및 라이보스는 증가 경향을, 하이드록실아민, 숙시네이트, 2-메틸글리세레이트 NIST, 인산 및 미리스트산은 감소 경향을 나타낼 수 있다.
상기 증가 또는 감소 경향이란 대사체 농도의 증가 또는 감소를 의미하는 것으로, 용어 "대사체 농도의 증가"는 산생성 단계 대비 용매생성 단계의 혐기성 균에서 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미하며, 본 명세서에서, 용어 "대사체 농도의 감소"는 용매생성 단계 대비 산생성 단계의 혐기성 균에서 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 감소된 것을 뜻한다.
따라서, 본 발명은 또한 하이드록실아민(hydroxylamine), 숙시네이트(succinate), 2-메틸글리세레이트 NIST(2-methylglycerate NIST), 인산(phosphoric acid), 미리스트산(myristic acid), 레보글루코산(levoglucosan), 글루코스-1-포스페이트(glucose-1-phosphate), 2-모노팔미틴(2-monopalmitin), 시트라말레이트(citramalate) 및 라이보스(ribose)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 혐기성 균의 산생성 단계(acidogenic phase)와 용매생성 단계(solventogenic phase)의 구별용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에 포함된 정량 장치는 크로마토그래피/질량분석기일 수 있다. 구체적으로, 가스 크로마토그래피(Gas Chromatography), 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 가장 구체적으로는, GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기일 수 있다.
본 발명의 대사체는 가스 크로마토그래피에서 각 성분들이 분리되며, TOF MS를 거쳐 얻어진 정보를 이용하여 정확한 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elemental composition)를 통해 구성 성분을 확인한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> PCA를 이용한 혐기 처리(anaerobic processing)와 호기 처리(atmospheric processing) 방법의 각 단계(phase)에서의 대사체 프로파일링
혐기성 균의 산생성 단계(acidogenic phase)와 용매생성 단계(solventogenic phase)에서 각각 샘플링하여 혐기성 챔버 내에서 초고속 여과 방법을 수행하고(anaerobic processing), 대기 중에서 초고속 여과 방법을 수행하였다(atmospheric processing).
수행 후 기존에 가장 많이 사용되고 있는 AMW(아세토니트릴:메탄올:물=2:2:1)를 추출 용매로 이용하여 대사체를 추출 한 후 GC/TOF MS로 분석하였다.
아민류, 아미노산류, 당 및 당 알코올류, 지방산류, 인산류, 유기산류 등을 포함한 131개의 대사체를 동정하였다.
대사체 프로파일링 차이를 비교하기 위하여 PCA(주성분 분석)을 실시하였다. 각 단계(phase)에서는 명확하게 차이가 남을 확인하였지만, 각 처리에 따라서 대사체 프로파일링의 차이가 크지 않음을 확인하였다(도 1). 특히 혐기 처리에 의해서 각 단계의 PC1 값과 PC2 값의 표준편차가 큼을 확인하였다(표 1). 이를 통하여 혐기 처리를 이용할 때 시간의 소요에 따른 더 큰 오차 값을 얻을 수 있음을 확인하였다.
| 처리 방법 | PC1 | PC2 | ||
| 산 생성 | 용매 생성 | 산 생성 | 용매 생성 | |
| 호기 | 5.70 ± 0.89 | ?6.46 ± 2.64 | ?1.16 ± 2.60 | 0.84 ± 2.68 |
| 혐기 | 4.64 ± 2.80 | ?3.89 ± 3.28 | ?2.41 ± 8.32 | 3.73 ± 3.12 |
<실시예 2> PCA를 이용한 산생성 단계와 용매생성 단계에서 차이를 보이는 주요 대사체 선정
실시예 1로부터 나온 PCA 분석을 실시하여, 각 단계에서 큰 차이를 보이는 주요 대사체 10개를 선정하였다(표 2).
| 대사체 | 로딩값 (Loading) |
| 3,6-anhydrogalactose | -0.940 |
| xylose | -0.929 |
| hypoxanthine | -0.928 |
| citramalate | -0.925 |
| glycerate | -0.913 |
| hydroxylamine | 0.848 |
| butyrolactam NIST | 0.686 |
| valine | 0.649 |
| fumarate | 0.624 |
| isoleucine | 0.588 |
상기 표 2는 혐기성 조건과 호기성 조건에서 산생성 단계와 용매생성 단계를 프로파일링하여 선별한 바이오마커이며, 로딩 값이 양수인 경우 산생성 단계에서 증가 경향을 나타냄을 의미하고, 음수인 경우 용매생성 단계에서 증가하는 경향을 나타냄을 의미한다.
<실시예 3> 각 단계의 혐기 처리 방법과 호기 처리 방법에 따른 주요 대사체의 피크 강도
각 단계별로 챔버 안에서 수행한 혐기 처리 방법과 대기 중에서 수행한 호기 처리 방법에 따른 실시예 2로부터 선정된 주요 대사체 10개의 피크 강도를 비교 분석하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 대부분의 대사체는 처리 방법에 따라 큰 차이를 보이고 있지 않았다. 이를 통하여 대사체 분석을 위한 ?칭 과정을 혐기 처리 방법을 이용하는 것과 호기 처리 방법을 이용하는 것의 큰 차이가 없음을 확인하였다.
<실시예 4> 각 단계의 혐기 처리 방법과 호기 처리 방법에 따른 공초점 주사 레이저 현미경 분석
혐기성 균의 산생성 단계와 용매생성 단계에서 각각 샘플링하여 혐기성 챔버 내에서 초고속 여과 방법을 수행하고(혐기 처리), 대기 중에서 초고속 여과 방법을 수행하였다(호기 처리). 샘플링 후 SYTO 9과 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide: PI)로 각각 염색하여 세포막 손상을 살펴보았다.
도 3에 나타난 바와 같이, 두 처리 방법 모두 SYTO 9에 의해서는 염색 되었지만, PI에 의해서는 염색되지 않았다. 이를 통하여 혐기 처리와 호기 처리 방법에 의해 세포막 손상이 초래되지 않음을 알 수 있다.
<실시예 5> 초고속 여과 방법 후 최적의 세척 용량(washing volume) 선정
실시예 2, 3, 4를 통해 대기 중에서 초고속 여과 방법 수행하는 호기 처리로 혐기성 균의 대사체 분석이 가능함을 확인하였다. 그 이후 세포 외 대사체와 배지 성분을 제거하기 위하여 1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL의 물을 각각 분주한 후 세포 내 대사체를 손실하지 않고, 세포 외 대사체와 배지 성분을 효과적으로 제거할 수 있는 최적의 용량(volume)을 선정하였다.
도 4와 5에 나타난 바와 같이, 세척 용량이 증가할수록 세포 외 대사체와 배지 성분을 효과적으로 제거할 수 있으며, 세포 내 주요 대사체 강도의 큰 차이를 보이지 않았다. 10 mL의 세척 용량을 이용할 경우 세척 시간이 오래 걸려 10 mL과 큰 차이를 보이지 않는 5 mL을 최적의 세척 용량으로 결정하였다.
<실시예 6> 혐기성 균의 대사체 분석을 위한 최적의 추출 용매 선정
실시예 2, 3, 4, 5으로부터 선정된 호기 처리로 초고속 여과 방법을 사용한 후 5 mL의 물로 세척하여 혐기성 균의 각 단계에서 대사체를 얻은 후 PM, 50ACN, AMW, WiPM의 용매를 이용하여 추출한 후 추출 효율을 비교 분석하였다.
도 6 내지 9에 나타난 바와 같이, 각 단계에서 모두 추출 용매에 따라서 대사체 프로파일링의 차이가 나는 것을 확인할 수 있었으며, 추출 효율 또한 다름을 확인할 수 있었다. 추출 용매에 따라 각 단계를 구분할 수 있는 주요 대사체 분포도도 달라짐을 확인하였다(표 4). 산생성 단계에서는 WiPM과 PM의 추출 효율이 제일 높았으며, 용매생성 단계에서는 PM과 50ACN의 추출 효율이 제일 높았다. 각 단계에서 추출 용매에 따른 재현성을 살펴보면, 산생성 단계에서는 50ACN과 PM의 재현성이 제일 높았으며, 용매생성 단계에서는 PM과 WiPM의 재현성이 제일 높았다(표 3). 이를 통하여 혐기성 균의 대사체 분석을 위한 대사체 추출 시 최적 용매로써 PM을 선정하였다.
| 추출 용매 |
평균 PC1 스코어 | %CV | 평균 PC2 스코어 | %CV | ||
| 산 생성 | 용매 생성 | 산 생성 | 용매 생성 | |||
| 50ACN | ?1.19 | 6.99 | 24 | 5.00 | ?5.26 | 48 |
| AMW | ?8.36 | ?8.50 | 45 | ?1.22 | ?2.00 | 38 |
| PM | 3.15 | 4.09 | 30 | ?5.22 | 5.46 | 30 |
| WiPM | 6.40 | ?2.59 | 31 | 1.44 | 1.80 | 31 |
| 50ACN | AMW | PM | WiPM |
| hypoxanthine | tyrosine | hydroxylamine | 1-monopalmitin |
| ribose | homoserine | succinate | 2-monopalmitin |
| myo-inositol | aspartate | 2-methylglycerate NIST | aspartate |
| 2-monopalmitin | serine | phosphoric acid | orotate |
| oxoproline | threonine | myristic acid | arabitol |
| phosphoric acid | adipate | levoglucosan | glutamate |
| ethanolamine | 2-hydroxyglutarate | glucose-1-phosphate | ribose |
| maltose 1 | salicylaldehyde | 2-monopalmitin | myristic acid |
| adenosine-5-monophosphate | lignoceric acid | citramalate | succinate |
| fumarate | pelargonic acid | ribose | adenosine-5-monophosphate |
| 대사체 | 로딩값 (Loading) |
| hydroxylamine | -0.982 |
| succinate | -0.977 |
| 2-methylglycerate NIST | -0.976 |
| phosphoric acid | -0.974 |
| myristic acid | -0.961 |
| levoglucosan | 0.979 |
| glucose-1-phosphate | 0.980 |
| 2-monopalmitin | 0.988 |
| citramalate | 0.990 |
| ribose | 0.991 |
상기 표 5는 호기성 조건에서 추출 용매로 메탄올을 사용하여 동정된 아민류, 아미노산류, 당 및 당 알코올류, 지방산류, 인산류, 유기산류 등을 포함한 116개의 대사체 중에서 산생성 단계와 용매생성 단계에서 큰 차이를 보이는 주요 대사체 10개를 선정하고, 상기 대사체의 로딩값을 나타낸 것이다. 로딩값이 음수인 경우 산생성 단계에서 증가 경향을 나타냄을 의미하고, 양수인 경우 용매생성 단계에서 증가하는 경향을 나타냄을 의미한다.
Claims (11)
- 하이드록실아민(hydroxylamine), 숙시네이트(succinate), 2-메틸글리세레이트 NIST(2-methylglycerate NIST), 인산(phosphoric acid), 미리스트산(myristic acid), 레보글루코산(levoglucosan), 글루코스-1-포스페이트(glucose-1-phosphate), 2-모노팔미틴(2-monopalmitin), 시트라말레이트(citramalate) 및 라이보스(ribose)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 대사체에 대한 정량 장치를 포함하는 혐기성 균의 산생성 단계(acidogenic phase)와 용매생성 단계(solventogenic phase)의 구별용 키트.
- 제1항에 있어서,
정량 장치는 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기인 키트.
- 제1항에 있어서,
산생성 단계의 혐기성 균은 대사체 중에서 하이드록실아민, 숙시네이트, 2-메틸글리세레이트 NIST, 인산 및 미리스트산은 증가 경향을, 레보글루코산, 글루코스-1-포스페이트, 2-모노팔미틴, 시트라말레이트 및 라이보스는 감소 경향을 나타내는 키트.
- 제1항에 있어서,
용매생성 단계의 혐기성 균은 대사체 중에서 레보글루코산, 글루코스-1-포스페이트, 2-모노팔미틴, 시트라말레이트 및 라이보스는 증가 경향을, 하이드록실아민, 숙시네이트, 2-메틸글리세레이트 NIST, 인산 및 미리스트산은 감소 경향을 나타내는 키트.
- 두 생체시료군의 차별성을 검출하는 방법으로서,
혐기 또는 호기 조건에서 혐기성 균의 생체시료를 초고속 여과(fast filtration)하고, 여과물에 대하여 1 내지 10 mL(v/v)의 물로 세척한 다음, 메탄올을 사용하여 대사체를 추출하는 대사체 샘플링 단계를 포함하는 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 분석 방법은
추출된 대사체를 GC/TOF MS(gas chromatography/time-of-flight mass spectrometry) 분석기기로 분석하는 단계;
GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계; 및
변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 상기 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 단계를 더 포함하는 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법.
- 제6항에 있어서,
GC/TOF MS 분석 결과를 통계처리 가능한 수치로 변환하는 단계는 총 분석시간을 단위시간 간격으로 나누어 단위시간 동안 나타난 크로마토그램 피크의 면적 또는 높이 중 가장 큰 수치를 단위시간 동안의 대표값으로 정하는 것인 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법.
- 제6항에 있어서,
변환된 수치를 이용하여 통계학적으로 상기 두 생체시료군의 차별성을 검증하는 단계는 주성분 분석(Principle Component Analysis: PCA)을 수행하여 두 생체시료군 간의 유의적인 차이를 나타내는 대사체 바이오마커를 분석 및 검증하는 것인 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법.
- 제8항에 있어서,
주성분 분석(PCA)의 로딩 값이 양수인 것은 대사체 바이오마커의 증가 경향을, 로딩 값이 음수인 것은 대사체 바이오마커의 감소 경향을 나타내는 것인 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법.
- 제8항에 있어서,
대사체 바이오마커는 혐기성 균의 산생성 단계(acidogenic phase)와 용매생성 단계(solventogenic phase)를 구별하는 것인 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법.
- 제8항에 있어서,
대사체 바이오마커는 하이드록실아민(hydroxylamine), 숙시네이트(succinate), 2-메틸글리세레이트 NIST(2-methylglycerate NIST), 인산(phosphoric acid), 미리스트산(myristic acid), 레보글루코산(levoglucosan), 글루코스-1-포스페이트(glucose-1-phosphate), 2-모노팔미틴(2-monopalmitin), 시트라말레이트(citramalate) 및 라이보스(ribose)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 두 생체시료군 간의 대사체 차별성 분석 방법.
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| CN111579666A (zh) * | 2020-05-21 | 2020-08-25 | 西北大学 | 利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪检测水样中左旋葡聚糖的方法 |
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-
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