KR20160010498A - 잠재적으로 ｈｄａｃ 억제제 치료를 필요로 하는 환자에서의 진단 및 예후 응용을 위한 유전자 발현 바이오마커 및 그들의 용도 - Google Patents

잠재적으로 ｈｄａｃ 억제제 치료를 필요로 하는 환자에서의 진단 및 예후 응용을 위한 유전자 발현 바이오마커 및 그들의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20160010498A
KR20160010498A KR1020157034950A KR20157034950A KR20160010498A KR 20160010498 A KR20160010498 A KR 20160010498A KR 1020157034950 A KR1020157034950 A KR 1020157034950A KR 20157034950 A KR20157034950 A KR 20157034950A KR 20160010498 A KR20160010498 A KR 20160010498A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
hdac inhibitor
patient
sample
gene expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
KR1020157034950A
Other languages
English (en)
Inventor
토마스 헤르츠
헬라 콜호프
로베르트 도블호퍼
마르틴 엘름링거
한스-페터 호프만
아이케 슈타우프
아슈트리트 짐머만
토마스 마이어
폴커 게켈러
마리나 몰렌하우어-타인
티모 비텐베르거
마르쿠스 뵘
토마스 베커스
Original Assignee
4에스체 악티엔게젤샤프트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 4에스체 악티엔게젤샤프트 filed Critical 4에스체 악티엔게젤샤프트
Publication of KR20160010498A publication Critical patent/KR20160010498A/ko
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G01N33/57484—
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • G01N2333/98—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 HDAC 억제제 치료를 위한 바이오마커로서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 이용에 관한 것이다. 상기 언급된 유전자의 발현 및/또는 변화는 바람직하게는 각각의 상응하는 mRNA 또는 상기 언급된 유전자에 의해 발현되는 하나 이상의 단백질을 통해 결정된다.

Description

잠재적으로 ＨＤＡＣ 억제제 치료를 필요로 하는 환자에서의 진단 및 예후 응용을 위한 유전자 발현 바이오마커 및 그들의 용도{GENE EXPRESSION BIOMARKERS AND THEIR USE FOR DIAGNOSTIC AND PROGNOSTIC APPLICATION IN PATIENTS POTENTIALLY IN NEED OF HDAC INHIBITOR TREATMENT}
본 발명은 HDAC 억제제 치료와 관련하여 사용될 수 있는 일부 특정 바이오마커, 상기 바이오마커가 적용되는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
근본적인 DNA 서열의 변화 이외의 메카니즘에 의해 야기되는 표현형(외양) 또는 유전자 발현의 유전가능한 변화의 연구는 후성유전학으로 지칭된다. 그러한 변화는 세포의 나머지 생 동안 세포 분열을 통해 유지될 수 있으며, 다수의 세대 동안 존재할 수 있다. 상기 비-유전 인자는 유기체의 유전자 자체가 상이하게 거동하거나 발현되게 한다(문헌[Special report: "What genes remember" by Philip Hunter, Prospect Magazine May 2008 issue 146]).
최근의 후성유전학 연구에 의해, 환경 인자가 유기체의 특징에 영향을 미치며, 때때로 자손으로 전달될 수 있는 것으로 나타났다. 현재까지, 분자 구조가 연루된 것이 과학적으로 입증되어 있다: 중요한 인자는 정렬된 공간-절약 방식으로 DNA를 저장하기 위한 염색체의 구조 성분, 히스톤, 일종의 포장 물질이다. 그들이 지니는 화학 기 및 상응하는 변형에 따라, 예를 들어, 그들이 아세틸화, 인산화 또는 메틸화되면, 그들은 유전자를 영구적으로 활성화시키거나 불활성화시킨다.
종합하여, 100개 넘는 세대 간 후성유전학적 유전 현상의 예가 원핵생물, 식물 및 동물을 포함하는 매우 다양한 유기체에서 보고되었다(문헌[Jablonka, Eva; Gal Raz, 2009, The Quarterly Review of Biology 84 (2): 131-176]).
후성유전학적 메카니즘의 분자 기반은 복잡하고, 이질적이며, 특정 유전자의 활성화 상태의 변형을 수반하지만, DNA의 기본 구조 및 서열의 변형을 수반하지 않는다. 더욱이, DNA와 회합된 염색질 단백질은 다양한 단백질 변형에 의해 유도되는 활성화 또는 침묵화 상태로 존재할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 또한, 예를 들어, 염색질에 대한 그러한 후성유전학적 변화는 세포가 분열하는 경우 보존된다. 이들 변형에 기초하여, DNA가 히스톤 주위에 감기는 방식이 변경되고, 이러한 구조적 변형으로 인하여, 유전자 발현도 또한 변경된다. 그러한 염색질 리모델링의 메카니즘은 몇몇 메카니즘을 통해 달성될 수 있다.
하나의 중요한 과정은 히스톤 단백질을 구성하는 아미노산의 번역후 변형을 포함하며, 이는 예를 들어, 아세틸화, 메틸화 및/또는 인산화로서 발생할 수 있다. 아미노산이 변형된다면, 히스톤 단백질의 전체 형상이 변경될 수 있다. 또한, DNA는 복제 동안 완전히 풀리지 않기 때문에, 그러한 변형된 히스톤이 각각의 DNA의 신규한 카피로 전달될 수 있는 것이 가능한 것으로 보인다. 이어서, 이들 변형된 히스톤은 주형 구조로 작용하여, 주변의 신규한 히스톤도 또한 변형된 방식으로 형상화될 수 있다.
히스톤의 비구조화 N-말단("히스톤 테일(tail)"로도 지칭)이 특별히 고도로 변형되나, 히스톤 변형은 전체 서열의 도처에 발생할 수 있다. 이들 변형은 아세틸화, 메틸화, 유비퀴틴화, 인산화 및 수모화(sumoylation)를 포함한다. 예를 들어, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 효소(HAT)에 의한 히스톤 H3의 테일의 K14 및 K9 라이신의 아세틸화는 일반적으로 전사 능력과 연관이 있다. 이에 따라, 탈아세틸화는 전사 침묵화와 연관이 있으며, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 활성을 갖는 효소에 의해 제공된다.
"활성" 전사와 관련이 있는 아세틸화의 경향은 생물물리학적 성질인 것으로 여겨진다. 라이신 잔기가 보통 그의 말단에서 양으로 대전된 질소를 갖기 때문에, 이에 따라, DNA 백본의 음으로 대전된 인산염에 회합될 수 있다. 대조적으로, 아세틸화 사건에 의해 라이신 측쇄 상의 이러한 양으로 대전된 아민기가 변경되면, 그것은 중성의 아미드 결합으로 전환되어, DNA가 히스톤으로부터 풀리게 한다. 이것이 발생하는 경우, 전사 인자 및 복합체는 DNA에 더욱 용이하게 결합하고, 전사 과정이 발생하게 할 수 있다. 이것은 후성유전학적 메카니즘의 "시스" 모델로 지칭될 수 있으며, 여기서, 히스톤 테일에 대한 변경은 DNA 그 자체에 직접적인 영향을 갖는다. 다른 후성유전학적 메카니즘의 모델, "트랜스" 모델에서, 히스톤 테일에 대한 변경은 DNA에 간접적으로 작용한다. 예를 들어, 라이신 아세틸화는 염색질 변형 효소(및 또한 기초 전사 기구)에 대한 결합 부위를 생성할 수 있으며, 이는 이어서 염색질의 상태에 변화를 야기한다. 실제로, 보존된 브로모도메인, 아세틸-라이신에 특이적으로 결합하는 단백질 세그먼트(도메인)는 (단백질 폴리브로모 상의)SWI/SNF 복합체를 포함하는 전사 활성화를 돕는 많은 효소에서 관찰된다. 약술하면, 아세틸화는 "시스" 및 "트랜스" 모델 둘 모두로 작용하여, 전사 활성화를 변경시키는 것으로 보인다.
상이한 히스톤 변형은 상이한 방식으로 기능하는 것으로 여겨지며; 한 위치에서의 아세틸화는 다른 위치에서의 아세틸화와 상이하게 기능할 것 같다. 또한, 다수의 변형이 발생할 수 있으며, 이들 변형은 함께 작용하여, 뉴클레오솜 구조(DNA + 히스톤)의 거동을 변경시킬 수 있다. 이들 히스톤의 근본적인 다수의 역학적 변형은 체계적이며 재현가능한 방식으로 유전자 전사를 조절하며, 히스톤 코드로 지칭된다.
후성유전학적 메카니즘의 조절은 다양한 잠재적인 의학적 응용에 유망하다. 선천성 유전병은 상당히 이해되어 있지만, 예를 들어, 안젤만 증후군 및 프레더-윌리 증후군의 경우에서와 같이, 후성유전학이 중요한 것도 또한 명백하다. 이들은 유전자 결실 또는 유전자의 불활성화에 의해 야기되는 보통의 유전병이지만, 이환 개체가 본질적으로 게놈 각인(genomic imprinting)으로 인해 반접합성이고, 이에 따라, 단일의 유전자 낙 아웃이 질병을 야기하기에 충분하기 때문에, 매우 흔하며, 대부분의 경우는 둘 모두의 카피가 낙 아웃되는 것을 필요로 할 것이다(온라인 'Mendelian Inheritance in Man', OMIM, www.ncbi.nlm.nih.gov/omim).
다세포 유기체에서의 후성유전학적 메카니즘이 일반적으로 분화에 연루되는 것으로 여겨짐에도 불구하고, 심지어, 다양한 종에서 세대간 후성유전학적 유전의 관찰이 몇몇 존재한다. 이들 다세대 후성유전학적 형질의 대부분은 몇 세대에 걸쳐 점차 소실될 수 있으나, 다세대 후성유전학이 진화 및 적응에 다른 양태를 부가할 수 있을 가능성이 남아 있다. 소정의 DNA의 영역과 관련된 후성유전학적 특징의 변형은 다세대 시간 척도에서 유기체가 특정 유전자를 발현하고 억제하는 표현형 간에 전환되게 한다(문헌[O.J. Rando and K.J. Verstrepen, 2007, Cell 128 (4): 655-668]). 상기 영역의 DNA 서열이 돌연변이되지 않는 경우, 이러한 변화는 가역적이며, 적응 과정에 유연성을 제공한다.
현재의 연구에 의해, 후성유전학적 약제가 현재 허용되는 치료 방법, 예를 들어, 방사선 및 화학요법에 대한 추정의 대체 또는 보조 치료법일 수 있거나, 또는 이들 현재의 치료의 효과를 증진시킬 수 있는 것이 나타났다(문헌[Wang, LG; Chiao, JW, 2010, Int. J. Oncolo. 3 (37): 533-9]). 히스톤의 입체형태 변화에 의한, 예를 들어, 원암 유전자 영역 및 종양 억제 서열의 후성유전학적 조절이 암의 형성 및 진행에 직접적인 영향을 미치는 것으로 나타났다(문헌[Iglesias-Linares et al., 2010, Oral Oncology 5 (46): 323-9]).
더욱이, 후성유전학적으로 작용하는 약물을 사용하는 그러한 신규한 치료 옵션은 다른 암 치료가 제공하지 않는 특징인 가역성의 기회를 제공할 수 있다(문헌[Li, LC; Carroll, PR; Dahiya, R, 2005. JNCI 2 (97): 103-15]). 현재까지, 후성유전학적 약물 개발은 신규한 HDAC 억제 약제 보리노스타트(Vorinostat) 및 로미뎁신(Romidepsin)을 시장에 도입한 것을 포함하여, 주로 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 및 히스톤 데아세틸라제(HDAC)에 집중된다(문헌[Spannhoff, A; Sippl, W; Jung, M (2009), International Journal of Biochemistry & Cell Biology 1 (41): 4-11]). HDAC 효소는 구체적으로 구강 편평세포 암의 진행에서 필수적인 역할을 수행하는 것으로 나타났다(문헌[Iglesias-Linares et al., (2010), Oral Oncology 5 (46): 323-9]). 선택된 HDAC 동질효소의 과발현은 현재 상이한 암 유형, 예를 들어, HDAC-1 및 HDAC-2는 간세포 암 등에서(문헌[Lee TK, Poh YP et al., 2011: The Journal of Clinical Investigation, published online February 2011, www.jci.org]), 또는 HDAC-2는 대장 종양에서(문헌[Zhu P, Martin E, Mengwasser J, Schlag P, Janssen KP, Gottlicher M., 2004, Cancer Cell. 2004 May; 5(5):455-63])의 예후 악화와 관련되어 있다. 상기 기재된 바와 같이, 비정상적인 HDAC 효소 발현 또는 활성은 다수의 인간 악성종양과 관련이 있어, 잘 알려져 있는 종양-억제 유전자의 억제를 야기하고, 악성종양 진행에 중요한 다른 인자의 활성을 변경시키는 것으로 관찰되었다. 따라서, 히스톤 데아세틸라제의 억제는 종양학 약물 개발에서 유망한 치료 개념을 나타낸다.
오늘날, 유전적 구성, 즉, 직접적인 DNA의 염기 서열 및/또는 개체의 유전자의 돌연변이가 다양한 질병, 특히 암의 발병에 기여할 뿐 아니라, 예를 들어, 염색질로의 후성유전학적 2차 패키징에 영향을 미치는 환경 신호의 영향이 발병 사건에 효과를 미치거나 이를 야기하여, 발암에 기여할 수 있는 것이 사실상 널리 받아들여지고 있다.
상기 언급된 후성유전학적 변화는 심지어 하나의 세포 세대에서 다른 세대로 앞으로 전달되거나, 심지어 일반적으로 자손으로 전달되어, 개체에게 유전적, 및 후성유전학적 구성 둘 모두를 제공할 수 있다.
따라서, 유전자 구성 또는 유전자의 돌연변이뿐 아니라 개체의 전체 후성유전학적 구성이 질병의 발생에 기여할 수 있으며, 그러한 후성유전학적 메카니즘에 영향을 미치는 약물에 대한 신체의 반응에 기여할 수 있음을 주목해야 한다. 이런 식으로, 후성유전학적 메카니즘에 대해 영향을 미치는 약물에 의해 유도되는 신체의 임의의 세포에서의 개체의 후성유전학적 구성의 변화의 관찰은 치료에 대한 개체의 반응을 예측하기 위한 유효한 방법을 나타낼 수 있다. 그러한 개체의 이환 조직은 그러한 약물 효과가 측정될 수 있는 비-이환 조직과 동일하거나 적어도 유사한 방식으로 후성유전학적 수준에 효과를 갖는 약물에 반응할 것 같다.
그러한 약물은 예를 들어, 히스톤 데아세틸라제 활성을 갖거나, 그들의 데아세틸화 활성이 흔히 클라이언트 단백질(client protein)로서 히스톤에 제한되지 않고, 보다 광범위하게 원암유전자 및 종양 억제 단백질 기능에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 미칠 수 있기 때문에, 현재는 오히려 일반적으로 단백질 데아세틸라제로 지칭되는 효소의 억제제로 표현된다.
다양한 HDAC 억제제는 조혈계 악성종양 및 고형 종양 둘 모두를 포함하는 넓은 범위의 종양 엔티티(entity)에서 현재 임상 연구하에 있으며, 후성유전학적으로 활성인 강력한 항-증식성 분화-유도 및 아폽토시스-유발 작용제의 부류를 나타낸다. 히스톤 데아세틸라제 억제제 과의 2개의 구성원(보리노스타트 및 로미뎁신)은 불응성 피부 T-세포 림프종의 치료용으로 이미 승인되어 있으며, 이들 환자에서 단일 치료제로서 상당한 임상 이익을 보여준다.
파노비노스타트(panobinostat), 엔티노스타트(entinostat), 벨리노스타트(belinostat), 지비노스타트(givinostat) 및 레스미노스타트(resminostat)를 포함하는 다수의 추가의 HDAC 억제제는 현재 다양한 단계에서 임상 개발 중이다(문헌[Marks, PA and Wu, W-s, 2009, J. Cell. Biochem.; 107(4): 600-608])(문헌[Ellis, L and Pili, R, 2010, Pharmaceuticals (Basel); 3(8); 2411-2469]).
그러나 치료의 계획 또는 과정에서 가능한 조기에 HDAC 억제제 치료의 효과를 결정하는 것이 해당 분야에 필요하다.
C2H2-형 아연 핑거(finger) 단백질(ZFP) 과의 전사 인자, ZFP64는 발생, 분화, 종양형성 및 면역 반응을 포함하는 많은 세포 기능에서 중요한 역할을 수행한다. 그것은 NF-κB 활성화와 함께 TLR 신호전달과, 이후의 침입하는 병원체에 대한 염증 반응에서의 양성 조절제이다(2013년 7월 15일에 온라인에 공개된 문헌[Wang et al., J Biol Chem 2013]). 그러나 그의 생물학적 기능은 대부분 알려져 있지 않다.
IHC 염색 실험(http://www.proteinatlas.org/ENSG00000020256/ tissue/staining+overview 참조)에 기초하여, ZFP64 단백질은 바람직하게는 특정 조직/기관에서 발현되며, 대개 핵에서 관찰된다. 정상 조직/기관 내의 ZFP64 단백질은 바람직하게는 간, 췌장 및 위장관, 및 정소 및 피부에서 발현된다. 암 조직 내의 ZFP64 단백질은 바람직하게는 하기의 암 유형에서 발현된다: 간, 림프종, 췌장, 갑상선 및 신장. ZFP64는 CRC 환자에서 원발성 종양에 비하여 간 전이에서 상향-조절된다(문헌[Li et al., Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2010;9:149-53]).
ZFP64는 Notch1의 동시-활성화에 의해 간엽 세포의 분화를 조절하는 것으로 확인되었다. ZFP64는 Notch1의 세포내 도메인(NICD)과 회합되는 것으로 보고되었으며, Notch 표적 유전자 Hes1 및 Hey1의 프로모터에 동원되며, 그들을 트랜스활성화(transactivate)시키며, Notch1의 동시-활성화에 의해 간엽 세포의 분화에 연루된다(문헌[Sakamoto et al., J Cell Sci. 2008 May 15;121(Pt 10):1613-23. doi: 10.1242/jcs.023119]). 발명의 간단한 요약
예비임상 및 임상 연구에서, HDAC 억제제의 이용이 특정 유전자 발현 패턴의 재현가능한 조절을 야기하는 것이 확인되었다. HDAC 억제제가 (i) 시험관내에서 HDAC 억제제로 처리된 다양한 상이한 암 세포 유형, 및 (ii) 임상 연구의 맥락에서 HDAC 억제제로 처리된 암 환자의 말초 혈액 세포 및 (iii) 생체외에서 HDAC 억제제로 처리된 건강한 공여자의 PBMC에서 동일한 방식으로 그들 유전자 발현을 조절하는 것으로 볼 수 있었다.
따라서, 주어진 환자의 암 세포 및 말초 혈액 세포의 전체 후성유전학적 구성은 그의 감수성에 관하여, 특정 약리학적 작용제, 예를 들어, HDAC 억제제의 영향과 유사하며, 이에 따라, 둘 모두의 세포 유형이 동일하거나 유사한 유전자 발현 조절을 경험할 것으로 추론될 수 있다. 따라서, 환자의 말초 혈액 세포에서 후성유전학적으로 유도된 일부 특정 유전자의 유전자 발현 변화는 잠재적으로 동일한 환자의 종양 세포에 대한 약물의 활성을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
또한, HDAC 억제제로의 환자를 치료하는 동안 이들 유전자 발현 프로파일의 후성유전학적으로 유도된 변화의 감소 또는 증가는 환자에 대하여 감소된 또는 증가된 치료 이익을 나타낼 수 있으며, 이에 따라 질병 예후와 연관시킬 수 있다.
발명의 간단한 설명
일 양태에서, 본 발명은 암 세포주 및 PBMC, 및 암 환자의 말초 혈액 세포에서, HDAC 억제제로의 노출시, 재현가능하게 변경되는 선택된 특정 유전자의 유전자 발현의 조절에 관한 것이다.
본 명세서에서 바이오마커로 지칭되는 이들 유전자 발현 조절은 다양한 유용성을 갖는 것으로 예상된다.
그들은 적용되는 HDAC 억제제의 약력학적 활성의 마커로서 사용될 수 있다.
그들은 HDAC 억제제로의 치료로의 참여 이전에 예측 바이오마커(또는 계층화(stratification)용)로 사용되어, 환자가 HDAC 억제제로 치료되어야 하는지의 여부 및 HDAC 억제제로 치료할 환자에서 임상 이익이 예상될 수 있는지의 여부가 예측되게 할 수 있다.
그들은 HDAC 억제제로의 치료로의 참여 이전에 예후 바이오마커로 사용되어, 주어진 환자에 있어서 치료와 독립적으로 질병이 진행할 방식이 예측되게 할 수 있다.
그들은 HDAC 억제제로의 치료 동안 바이오마커로 사용되어, 환자가 HDAC 억제제로의 치료로 얼마나 오래 이익을 얻을 수 있는지를 예측하고, 일반적으로, HDAC 억제제 치료의 진행을 모니터링할 수 있다.
추가로, 이들 바이오마커는 원인이 되어 질병 진행에 연루될 수도 있으며, 이에 따라, 그들 자체에 치료 표적 구조를 나타낼 수 있다. 따라서, 그들의 활성은 예를 들어, siRNA 간섭에 의해, 그들의 mRNA 발현 패턴에 영향을 미치는 것, 유전자 요법을 통해 그들의 존재를 증가시키는 것, 항체 기술을 통해 그들의 단백질 기능을 조절하는 것, 또는 소분자 결합제를 통해 그러한 바이오마커 엔티티의 기능적 효력을 변경시키는 것과 같은 다양한 수단을 사용하는 치료적 간섭으로 처리될 수 있다. 또한, 백신접종 과정이 가능할 수 있다.
따라서, 본 발명의 대상은 HDAC 억제제 치료와 관련된 진단 및 예후 방법에서의, 그리고 HDAC 억제제 치료를 모니터링하거나, 환자를 계층화하기 위한 적어도 하나의 유전자, 상기 적어도 하나의 유전자의 DNA 서열, 상기 적어도 하나의 유전자 또는 길이가 적어도 150, 바람직하게는 180개 뉴클레오티드인 그의 단편에 의해 인코딩된 RNA 서열 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩된 적어도 하나의 단백질 또는 상기 단백질의 도메인의 용도이며, 상기 적어도 하나의 유전자는 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군의 하나 이상의 구성원으로부터 선택된다. 본 발명의 추가의 구현예는 치료적 간섭을 위한 표적으로서의 각각 상기 언급된 적어도 하나의 유전자, DNA 서열, RNA 서열 또는 단백질의 용도이다.
본 발명은 HDAC 억제제 치료를 모니터링하고, 잠재적으로 상기 치료를 필요로 하는 환자를 반응자(responder) 또는 비-반응자로 계층화하기 위한 본 발명에 따른 바이오마커, 뉴클레오티드 서열, 단백질, 키트, 방법 및 용도의 응용을 포함한다.
본 발명을 위해 선택된 유전자의 확인은 표 1에 제공되어 있다.
[표 1]
Figure pct00001
구현예의 상세한 설명
본 발명의 하나의 대상은 HDAC 억제제로의 치료의 시작 이전에 또는 치료의 과정 동안 직접적으로 이환 조직의 시료에서 또는 말초 혈액 세포에서 본 발명에 따른 유전자 중 하나 이상의 유전자 발현을 측정하는 것이다. 추가로, 본 발명의 다른 대상은 본 발명에서 선택된 유전자 중 하나 이상의 이들 발현 프로파일의 변화를 측정하여, 치료의 시작 이전의 유전자 발현을 치료 동안 관찰되는 유전자 발현과 비교하는 것이다. 추가로, 본 발명의 다른 대상은 본 발명에서 선택된 유전자 중 하나 이상의 이들 발현 프로파일의 차이를 측정하여, 치료를 받고 있는 환자의 상이한 하위군 간의 유전자 발현을 비교하는 것이다.
본 발명의 특정 구현예는 하기에 열거되어 있다.
1. 하기의 단계를 포함하는 HDAC 억제제 치료의 효과의 결정 방법:
a) 상기 HDAC 억제제 치료를 받고 있는 환자의 시료를 제공하는 단계,
b) 상기 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 결정하는 단계,
c) 상기 적어도 하나의 유전자의 결정된 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 상기 환자에서의 상기 HDAC 억제제 치료의 효과와 연관시키는 단계.
본 발명의 특정 구현예에서, 환자에서의 HDAC 억제제 치료에 대한 상기 적어도 하나의 유전자의 결정된 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화의 연관성은 상기 결정된 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 다른 환자로부터 획득한 이전의 데이터와 비교함으로써 결정될 수 있으며, 여기서, 상기 적어도 하나의 유전자의 특정 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화는 상기 HDAC 억제제 치료의 효과로 이미 처리되어 있다. 그러한 데이터는 예를 들어, 표 또는 기계 판독가능한 데이터 은행의 형태로 제공될 수 있다.
2. 하기의 단계를 포함하는 HDAC 억제제 치료의 모니터링 방법:
a) 상기 HDAC 억제제 치료를 받고 있는 환자의 시료를 제공하는 단계,
b) 상기 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 결정하는 단계,
c) 상기 단계 a 및 b를 적어도 1회, 바람직하게는 1회를 초과하여 반복하는 단계, 및
d) 단계 a) 내지 c)에서 결정된 상기 유전자 발현을 사용하여, 상기 HDAC 억제제 치료에 대한 상기 환자의 반응의 시간 프로파일을 생성하는 단계.
본 발명에 따른 HDAC 억제제 치료의 모니터링 방법은 상기 적어도 하나의 유전자의 결정된 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 상기 환자에서의 상기 HDAC 억제제 치료의 효과와 연관시키는 단계를 포함할 수 있다.
3. 상기 항목 1 또는 2 중 어느 하나의 항목에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 추가로 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 또는 부정적인 결과의 확률과 연관시키는 방법.
4. 하기의 단계를 포함하는 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 계층화 방법:
a) 상기 환자의 시료를 제공하는 단계,
b) 상기 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현을 결정하는 단계,
c) 상기 적어도 하나의 유전자의 결정된 유전자 발현을 HDAC 억제제 치료가 상기 환자에 유리한 효과를 갖는 확률과 연관시키는 단계, 및
d) 상기 환자를 단계 c에서 결정된 확률에 기초하여, 상기 HDAC 억제제 치료에 대한 반응자 또는 비-반응자로 분류하는 단계.
5. 상기 항목 4에 있어서, 단계 a)에서 제공되는 상기 시료는 HDAC 억제제를 상기 환자에게 투여하기 이전에 제공되며,
단계 a) 이후에 HDAC 억제제를 생체외에서 상기 시료에 첨가하여, 상기 시료에서 HDAC를 억제하고,
단계 b)에서, 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현을 상기 HDAC 억제제를 포함하는 상기 시료에서 결정하는 방법.
특히, 상기 항목 5에서, "단계 a)에서 제공되는 시료는 HDAC 억제제를 상기 환자에게 투여하기 이전에 제공된다"라는 표현은 단계 a)에서 제공되는 상기 시료가 HDAC 억제제가 상기 환자에게 처음 투여되기 이전에 제공되는 것을 의미한다. 대안적으로, 상기 항목 5에서, "단계 a)에서 제공되는 시료는 HDAC 억제제를 상기 환자에게 투여하기 이전에 제공된다"라는 표현은 단계 a)에서 제공되는 상기 시료가 HDAC 억제제 치료를 위해 상기 환자에게 투여되는 것으로 의도되는 특정 HDAC 억제제(예를 들어, 레스미노스타트)를 상기 환자에게 처음 투여하기 이전에 제공되는 것을 의미한다.
일 구현예에서, 환자의 시료에서 CCDC43의 유전자 발현이 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더더욱 바람직하게는 100% 이상 상이하다면, 상기 환자는 반응자로 분류되어야 한다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 차이는 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 유전자 발현의 증가이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 차이는 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 유전자 발현의 감소이다.
일 구현예에서, 환자의 시료에서 DPP3의 유전자 발현이 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더더욱 바람직하게는 100% 이상 상이하다면, 상기 환자는 반응자로 분류되어야 한다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 차이는 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 유전자 발현의 증가이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 차이는 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 유전자 발현의 감소이다.
일 구현예에서, 환자의 시료에서 HIST2H4A/B의 유전자 발현이 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더더욱 바람직하게는 100% 이상 상이하다면, 상기 환자는 반응자로 분류되어야 한다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 차이는 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 유전자 발현의 증가이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 차이는 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 유전자 발현의 감소이다.
일 구현예에서, 환자의 시료에서 KDELC2의 유전자 발현이 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더더욱 바람직하게는 100% 이상 상이하다면, 상기 환자는 반응자로 분류되어야 한다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 차이는 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 유전자 발현의 증가이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 차이는 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 유전자 발현의 감소이다.
일 구현예에서, 환자의 시료에서 MICALL1의 유전자 발현이 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더더욱 바람직하게는 100% 이상 상이하다면, 상기 환자는 반응자로 분류되어야 한다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 차이는 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 유전자 발현의 증가이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 차이는 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 유전자 발현의 감소이다.
일 구현예에서, 환자의 시료에서 ZFP64의 유전자 발현이 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더더욱 바람직하게는 100% 이상 상이하다면, 상기 환자는 반응자로 분류되어야 한다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 차이는 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 유전자 발현의 증가이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 차이는 건강한 대상체에서의 상기 유전자의 유전자 발현 중간값과 비교하여, 유전자 발현의 감소이다.
6. 하기의 단계를 포함하는 HDAC 억제제 치료를 받고 있는 환자에 대한 상기 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률의 예측 방법:
a) 상기 환자의 시료를 제공하는 단계,
b) 상기 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현을 결정하는 단계,
c) 상기 유전자 발현을, 단계 a) 이전에 상기 환자로부터 제공된 시료에서의 상기 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현과 비교하는 단계, 및
d) 단계 a)에서 제공된 상기 시료와, 단계 a) 이전에 제공된 상기 시료에서의 상기 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현의 차이를 상기 환자에 대한 상기 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률과 연관시키는 단계.
7. 항목 6에 있어서, 단계 a) 이전에 제공되는 상기 시료는 HDAC 억제제를 상기 환자에게 투여하기 이전에 상기 환자로부터 제공되며,
단계 a)에서 제공되는 상기 시료는 HDAC 억제제를 상기 환자에게 투여한 이후에, 바람직하게는 HDAC 억제제를 상기 환자에게 처음 투여한 이후에 제공되며, 바람직하게는 "HDAC 억제제를 투여하기 이전"은 상기 HDAC 억제제를 투여하기 1초 내지 1일, 더욱 바람직하게는 1초 내지 1시간 전을 의미한다.
일 구현예에서, HDAC 억제제의 투여 이후 2시간에 결정된 CCDC43의 유전자 발현이 HDAC 억제제를 상기 환자에게 투여하기 이전에 상기 환자 유래의 시료에서 결정된 상기 유전자의 유전자 발현과 비교하여, 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더더욱 바람직하게는 100% 이상, 더더욱 바람직하게는 150% 이상 변한다면, 주어진 환자에 대한 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률은 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 변화는 유전자 발현의 증가이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 변화는 유전자 발현의 감소이다.
일 구현예에서, HDAC 억제제의 투여 이후 2시간에 결정된 DPP3의 유전자 발현이 HDAC 억제제를 상기 환자에게 투여하기 이전에 상기 환자 유래의 시료에서 결정된 상기 유전자의 유전자 발현과 비교하여, 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더더욱 바람직하게는 100% 이상, 더더욱 바람직하게는 150% 이상 변한다면, 주어진 환자에 대한 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률은 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 변화는 유전자 발현의 증가이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 변화는 유전자 발현의 감소이다.
일 구현예에서, HDAC 억제제의 투여 이후 2시간에 결정된 HIST2H4A/B의 유전자 발현이 HDAC 억제제를 상기 환자에게 투여하기 이전에 상기 환자 유래의 시료에서 결정된 상기 유전자의 유전자 발현과 비교하여, 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더더욱 바람직하게는 100% 이상, 더더욱 바람직하게는 150% 이상 변한다면, 주어진 환자에 대한 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률은 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 변화는 유전자 발현의 증가이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 변화는 유전자 발현의 감소이다.
일 구현예에서, HDAC 억제제의 투여 이후 2시간에 결정된 KDELC2의 유전자 발현이 HDAC 억제제를 상기 환자에게 투여하기 이전에 상기 환자 유래의 시료에서 결정된 상기 유전자의 유전자 발현과 비교하여, 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더더욱 바람직하게는 100% 이상, 더더욱 바람직하게는 150% 이상 변한다면, 주어진 환자에 대한 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률은 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 변화는 유전자 발현의 증가이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 변화는 유전자 발현의 감소이다.
일 구현예에서, HDAC 억제제의 투여 이후 2시간에 결정된 MICALL1의 유전자 발현이 HDAC 억제제를 상기 환자에게 투여하기 이전에 상기 환자 유래의 시료에서 결정된 상기 유전자의 유전자 발현과 비교하여, 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더더욱 바람직하게는 100% 이상, 더더욱 바람직하게는 150% 이상 변한다면, 주어진 환자에 대한 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률은 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 변화는 유전자 발현의 증가이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 변화는 유전자 발현의 감소이다.
일 구현예에서, HDAC 억제제의 투여 이후 2시간에 결정된 ZFP64의 유전자 발현이 HDAC 억제제를 상기 환자에게 투여하기 이전에 상기 환자 유래의 시료에서 결정된 상기 유전자의 유전자 발현과 비교하여, 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더더욱 바람직하게는 100% 이상, 더더욱 바람직하게는 150% 이상 변한다면, 주어진 환자에 대한 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률은 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 변화는 유전자 발현의 증가이다. 하나의 특정 구현예에서, 상기 변화는 유전자 발현의 감소이다.
8. 하기의 단계를 포함하는, HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자에서의 약력학적 마커로서의 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현의 결정 방법:
a) 상기 환자의 시료를 제공하는 단계;
b) 상기 시료에서 유전자 발현 및/또는 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 결정하는 단계,
c) 상기 적어도 하나의 유전자의 결정된 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 HDAC 억제제에 의한 HDAC의 상대적인 억제와 연관시키는 단계.
9. 상기 항목 1 내지 항목 8 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현이 상기 시료에서 상기 적어도 하나의 유전자 또는 적어도 150개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 적어도 180개 뉴클레오티드 길이의 그의 단편에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 mRNA의 수준을 측정함으로써 결정되는 방법.
10. 상기 항목 1 내지 항목 8 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현이 상기 시료에서 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질 또는 상기 단백질의 도메인의 수준을 측정함으로써 결정되는 방법.
11. 상기 항목 10에 있어서, 상기 적어도 하나의 단백질 또는 그의 도메인의 수준 및/또는 그의 수준의 변화는 항체 또는 항체를 포함하는 프로브의 결합에 의해 결정되며, 상기 항체는 상기 적어도 하나의 단백질 또는 그의 도메인에 특이적으로 결합하는 방법.
12. 상기 항목 4 내지 항목 11 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 시료를 HDAC 억제제 치료의 시작 이전에 또는 HDAC 억제제 치료 동안 취하는 방법.
13. 상기 항목 1 내지 항목 12 중 어느 한 항목에 있어서, 상기 시료가 체액의 시료, 바람직하게는 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하는 군으로부터 선택되는 혈액 시료, 더욱 바람직하게는 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하는 군으로부터 선택되는 말초 혈액 시료인 방법.
14. 상기 항목 1 내지 항목 12 중 어느 한 항목에 있어서, 시료가 조직 시료, 바람직하게는 이환 조직의 시료, 더욱 바람직하게는 암 조직 유래의 생검인 방법.
15. 상기 항목 1 내지 항목 14 중 어느 한 항목에 있어서, 단계 a 내지 c 또는 a 내지 b가 적어도 1회, 바람직하게는 1회를 초과하여 반복되는 방법.
단계 a 내지 c 또는 a 내지 b가 반복되는 본 발명의 방법에서, 전형적으로 상기 단계는 HCAD 억제제의 각각의 투여 이후 또는 각각의 치료 사이클 이후에 반복된다. 대안적으로, 단계 a 내지 c 또는 a 내지 b는 덜 빈번한 간격으로, 예를 들어, 제2, 제3, 제4 등의 HCAD 억제제의 각각의 투여 이후 또는 각각의 제2, 제3, 제4 등의 치료 사이클 이후 반복될 수 있다. 이러한 방식으로, 치료 과정 및 환자의 건강 상태를 모니터링할 수 있다.
16. 전술한 상기 항목 1 내지 항목 15 중 어느 한 항목에 있어서, HDAC 억제제가 보리노스타트, 로미뎁신, 발프로산, 파노비노스타트, 엔티노스타트, 벨리노스타트, 모세티노스타트, 지비노스타트 및 레스미노스타트 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 유리 형태의 (E)-3-(1-(4-((디메틸아미노)메틸)페닐설포닐)-1H-피롤-3-일)-N-하이드록시아크릴아미드 또는 그의 하이드로클로라이드 또는 메실레이트 염을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
17. HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자에 대한 HDAC 억제제 치료에서의 약력학적 마커로서의 적어도 하나의 유전자의 용도 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 용도로서, 상기 적어도 하나의 유전자가 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.
18. HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자에 대한 HDAC 억제제 치료의 결과를 예측하기 위한 적어도 하나의 유전자의 용도 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 용도로서, 상기 적어도 하나의 유전자가 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.
19. HDAC 활성을 결정하기 위한 대리 마커로서의 적어도 하나의 유전자의 용도 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 용도로서, 상기 적어도 하나의 유전자가 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.
20. 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자를 반응자 또는 비-반응자로서 계층화하기 위한 적어도 하나의 유전자의 용도 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 용도로서, 상기 적어도 하나의 유전자가 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 용도.
21. 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현을 결정하기 위한 키트로서,
상기 키트가 상기 적어도 하나의 유전자 또는 적어도 150개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 적어도 180개 뉴클레오티드 길이의 그의 단편에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하고,
상기 키트가 선택적으로 매질, 매질 성분, 완충제, 완충제 성분, RNA 정제 컬럼, DNA 정제 컬럼, 염료, dNTP 믹스를 포함하는 핵산, 중합효소를 포함하는 효소 및 염을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 성분을 포함하는 키트.
22. 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하기 위한 키트로서,
상기 키트가 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질 또는 상기 단백질의 도메인에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하고,
상기 키트가 선택적으로 매질, 매질 성분, 완충제, 완충제 성분, 멤브레인(membrane), ELISA 플레이트 효소 기질, 염료, 중합효소를 포함하는 효소 및 염을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 성분을 포함하는 키트.
23. 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현을 결정하기 위한 상기 항목 21 또는 항목 22에 따른 키트의 용도.
24. 상기 항목 23에 있어서, 상기 결정된 유전자 발현이 상기 시료에서의 HDAC 활성과 연관되는 용도.
25. 상기 항목 23 또는 항목 24에 있어서, 상기 시료가 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자로부터 제공되는 용도.
26. 상기 항목 1 내지 항목 16 중 어느 한 항목에 따른 방법에서의 상기 항목 21 또는 항목 22에 따른 키트의 용도.
27. 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 치료에서 이용하기 위한 HDAC 억제제로서, 상기 치료 이전 및/또는 그 동안에, ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자, 상기 적어도 하나의 유전자에 상응하는 적어도 하나의 mRNA 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질이 상기 환자에 대한 HDAC 억제제 치료의 효과의 확률을 결정하기 위해 또는 상기 환자가 HDAC 억제제 치료에 대한 반응자인지 여부를 결정하기 위해 사용되는 HDAC 억제제.
28. HDAC 억제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법으로서, 상기 방법 이전 및/또는 그 동안에, ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자, 상기 적어도 하나의 유전자에 상응하는 적어도 하나의 mRNA 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질이 상기 환자에 대한 HDAC 억제제 치료의 효과의 확률을 결정하기 위해 또는 상기 환자가 HDAC 억제제 치료에 대한 반응자인지 여부를 결정하기 위해 사용되는 방법.
29. HDAC 억제제가 보리노스타트, 로미뎁신, 발프로산, 파노비노스타트, 엔티노스타트, 벨리노스타트, 모세티노스타트, 지비노스타트 및 레스미노스타트 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 유리 형태의 (E)-3-(1-(4-((디메틸아미노)메틸)페닐설포닐)-1H-피롤-3-일)-N-하이드록시아크릴아미드 또는 그의 하이드로클로라이드 염 또는 메실레이트 염을 포함하는 군으로부터 선택되는 상기 항목 27에 따른 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 치료에 이용하기 위한 HDAC 억제제 또는 상기 항목 28에 따른 방법.
본 발명의 특히 바람직한 구현예는 잠재적으로 상기 기재된 바와 같은 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 치료에 이용하기 위한 각각의 방법, 용도, 키트 및 HDAC 억제제에 관한 것이며, ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 유전자는 ZFP64이다.
HDAC 억제제 치료를 받고 있는 환자에 대한 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률의 예측, HDAC 억제제 치료의 특정 효과의 확률의 결정, HDAC 억제제 치료의 모니터링 및/또는 잠재적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 계층화 방법이 더욱 바람직하며, ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 유전자는 ZFP64 및 DPP3을 포함하는 군으로부터 선택된다.
하기의 단계를 포함하는 HDAC 억제제 치료를 받고 있는 환자에 대한 상기 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률의 예측 방법이 더더욱 바람직하다:
a) 상기 환자의 시료를 제공하는 단계,
b) 상기 시료에서 ZFP64의 유전자 발현을 결정하는 단계,
c) 상기 유전자 발현을 단계 a) 이전에 상기 환자로부터 제공되는 시료에서의 ZFP64의 유전자 발현과 비교하는 단계, 및
단계 a)에서 제공되는 상기 시료 및 단계 a) 이전에 제공되는 상기 시료에서의 ZFP64의 유전자 발현의 차이를 상기 환자에 대한 상기 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률과 연관시키는 단계. 본 발명의 더더욱 특히 바람직한 구현예는 상기 기재된 바와 같은 HDAC 억제제 치료를 받고 있는 환자에 대한 상기 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률의 바람직한 예측 방법에 관한 것이며, 상기 유전자는 ZFP64이다.
추가로, 하기의 단계를 포함하는 HDAC 억제제 치료를 받고 있는 환자에 대한 상기 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률의 예측 방법이 더더욱 바람직하다:
d) 상기 환자의 시료를 제공하는 단계,
e) 상기 시료에서 DPP3의 유전자 발현을 결정하는 단계,
f) 상기 유전자 발현을 단계 a) 이전에 상기 환자로부터 제공되는 시료에서의 DPP3의 유전자 발현과 비교하는 단계, 및
단계 a)에서 제공되는 상기 시료 및 단계 a) 이전에 제공되는 상기 시료에서의 DPP3의 유전자 발현의 차이를 상기 환자에 대한 상기 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률과 연관시키는 단계. 본 발명의 더더욱 특히 바람직한 구현예는 상기 기재된 바와 같은 HDAC 억제제 치료를 받고 있는 환자에 대한 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률의 바람직한 예측 방법에 관한 것이며, 상기 유전자는 DPP3이다.
본 발명의 구현예, 예를 들어, 본 발명에 따른 용도, 방법, 키트 및 HDAC 억제제에서, 적용가능한 경우, 환자는 바람직하게는 암, 특히 혈액암, 더욱 구체적으로는 호지킨 림프종을 앓고 있는 환자이며, 적용가능한 경우, 시료는 바람직하게는 암, 특히 혈액암, 더욱 구체적으로는 호지킨 림프종을 앓고 있는 환자로부터 수득된다.
본 발명의 다른 구현예, 예를 들어, 본 발명에 따른 용도, 방법, 키트 및 HDAC 억제제에서, 적용가능한 경우, 환자는 바람직하게는 CRC 또는 HCC, 더욱 바람직하게는 HCC를 앓고 있는 환자이며, 적용가능한 경우, 시료는 바람직하게는 CRC 또는 HCC, 더욱 바람직하게는 HCC를 앓고 있는 환자로부터 수득된다.
본 발명의 하나의 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 바이오마커 중 하나 이상의 유전자 발현은 환자로의 HDAC 억제제의 투여 이후 다수의 시점에 측정된다. 이러한 방식으로, 바이오마커의 유전자 발현의 변화의 시간 프로파일을 결정할 수 있으며, 이는 바이오마커의 유효성을 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 바이오마커 중 하나 이상은 환자로의 HDAC 억제제의 투여 이후 다수의 시점에 측정된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 바이오마커 중 하나 이상은 환자로의 HDAC 억제제의 투여 이후 적어도 3개 또는 적어도 4개 또는 적어도 5개 또는 적어도 6개의 시점에 측정된다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기 하나 이상의 유전자의 유전자 발현은 바람직하게는 HDAC 억제제에 의한 HDAC의 억제에 대한 지표이다.
본 발명에 따른 방법에서, 상기 하나 이상의 유전자의 유전자 발현이 바람직하게는 HDAC 억제제 치료의 결과와 연관된다.
본 발명에 따른 방법의 특정 구현예에서, 시료를 각 방법에서 적절한 대로 HDAC 억제제 치료의 시작 이전 또는 HDAC 억제제 치료 동안에 취한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 키트는 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 시료에서, 본 발명에 따른 적어도 하나의 유전자 또는 본 발명에 따른 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하기 위해 사용된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "HDAC" 또는 히스톤 데아세틸라제는 히스톤의 탈아세틸화를 용이하게 하고, 추가로 기타 단백질, 예를 들어, 전사 인자, 수용체 등의 탈아세틸화를 용이하게 할 수 있는 효소를 특정한다. HDAC 단백질의 과는 그들의 NCI 유전자 ID에 의해 정의된 하기의 인간 유전자 및 다른 포유류 종에서의 그들의 대응부로부터 전사되는 단백질을 포함한다: HDAC1, ID: 3065; HDAC2, ID: 3066; HDAC3, ID: 8841; HDAC4, ID: 9759; HDAC5, ID: 10014; HDAC6, ID: 10013; HDAC7, ID: 51564; HDAC8, ID: 55869; HDAC9, ID: 51564; HDAC10, ID: 83933; HDAC11, ID: 79885; SIRT1, ID: 23411; SIRT2, ID: 22933; SIRT3, ID: 23410; SIRT4, ID: 23409; SIRT5, ID: 23408; SIRT6, ID: 51548; SIRT7, ID: 51547.
본 명세서에 Entrez ID 및 공식 유전자 기호(NCBI)로 특정된 유전자 서열은 인간 유전자에 관한 것이다. 그러나 본 발명은 또한 환자가 비-인간 포유류인 응용을 위해 다른 포유류 종에서의 상응하는 유전자를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "하이드록사메이트 유형의 HDAC 억제제"는 HDAC의 활성 부위에 위치한 아연 이온을 킬레이트화시킬 수 있는 하이드록사메이트기를 포함하는 HDAC 억제제를 특정한다.
모든 방법, 용도, 이용을 위한 화합물, 키트 등을 포함하는 본 발명의 모든 구현예에서, HDAC 억제제는 특히 레스미노스타트이다(따라서, 예를 들어, "HDAC 억제제 치료"는 특히 "레스미노스타트 치료"이다).
모든 방법, 용도, 이용을 위한 화합물, 키트 등을 포함하는 본 발명의 모든 구현예에서, ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 유전자는 특히 ZFP64이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "억제"는 억제되어야 하는 엔티티의 활성이 감소되며, 예를 들어, 효소, 예컨대 HDAC의 경우에, 효소에 의한 기질 전환의 전환율이 감소되는 것을 특정한다.
HDAC 억제제에 의한 HDAC 억제의 맥락에서 본 명세서에 사용되는 용어 "상대적인 억제"는 투여전, 즉, HDAC 억제제의 투여 이전의 HDAC 활성 수준에 비한 HDAC 활성의 억제를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "HDAC의 억제 수준" 또는 "HDAC 억제의 수준"은 HDAC 활성이 억제제의 투여시에 감소되는 비에 관한 것이다. 각각의 경우에 억제제의 투여 이전의 HDAC 활성과 비교하여, HDAC의 높은 수준의 억제는 HDAC 활성이 강력하게 감소되는 것을 의미할 것이며, HDAC의 낮은 수준의 억제는 HDAC 활성이 오직 약간만 감소되는 것을 의미할 것이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "유전자 발현"은 세포 내의 유전자의 발현 산물의 양을 말한다. 발현 산물은 유전자의 전사물, 예를 들어, mRNA 및 상응하는 번역 산물, 즉 단백질을 포함한다. 유전자 발현은 종종 상대적인 발현 수준, 즉, 하나 이상의 하우스키핑(housekeeping) 유전자의 발현에 비한 및/또는 통상 약물을 투여하기 이전, 예를 들어, 약물을 처음 투여하기 이전 또는 주어진 치료 사이클에서 약물을 처음 투여하기 이전의 시점인 특정 상이한 시점에서의 상기 표적 유전자의 발현에 비한 주어진 시점에서의 표적 유전자의 발현으로 표기된다. 유전자 발현은 특정 시료 내의 표적 유전자의 상대 존재비를 특정한다. 이에 따라, "유전자 발현"은 또한, 주어진 유전자의 발현의 부재도 포함할 수 있다. 유전자 발현에 대한 절대값은 통상 "Ct" 값(본 명세서에서 하기 참조)으로 표현되며, 발현이 결정되는 특정 방법, 특히, 사용되는 중합효소에 따라, 각 유전자에 대하여 달라질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 표현 "(예를 들어, 항목 x, 항목 y 및 항목 z)를 포함하는 군으로부터 선택되는" 등은 바람직하게는 "(예를 들어, 항목 x, 항목 y 및 항목 z)로부터 선택되는"과 동등하다(여기서, 용어 "및"은 상기 언급된 항목, 예를 들어, 항목 x, 항목 y 및 항목 z의 전부가 선택되지 않고, 오히려, 상기 군의 항목 중 하나(또는 특정 문맥에 따라 그 이상)가 선택되는 것으로 이해된다). 특정 구현예에서, 이는 또한 "(예를 들어, 항목 x, 항목 y 및 항목 z)로 구성된 군으로부터 선택되는"을 포함한다.
표 2에서, 상기 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 유전자의 발현에 대한 별개의 발현 범위를 정의하는 데이터가 제시되어 있다. 본 명세서에서, HDAC 억제제 치료의 결과와의 연관은 특정 신뢰성으로 범위 2 및 3에서 이루어질 수 있으며, 바람직하게는, HDAC 억제제 치료의 결과와의 연관은 보다 높은 신뢰성으로 범위 1 및 4에서 이루어질 수 있다.
[표 2]
Figure pct00002
표 2a에서, 특히 상기 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 ZFP64 유전자의 발현에 대한 별개의 발현 범위를 정의하는 데이터가 제시되어 있다. 본 명세서에서, HDAC 억제제 치료의 결과와의 연관은 특정 신뢰성으로 범위 2에서 이루어질 수 있으며, 바람직하게는, HDAC 억제제 치료의 결과와의 연관은 보다 높은 신뢰성으로 범위 1 및 3에서 이루어질 수 있다.
[표 2a]
Figure pct00003
본 명세서에 사용되는 용어 "기준선 유전자 발현"은 개체의 집단에서 결정된 평균 또는 보통 수준에 상응하는 유전자, RNA 또는 단백질의 발현의 수준을 특정하며, 여기서, 상기 개체는 HDAC 억제제의 영향하에 있지 않다. 상기 집단은 전체 집단 또는 특정 하위-집단의 인구 조성을 반영할 수 있으며, 여기서, 하위-집단은 개체가 특정 질병, 예를 들어, 암 또는 특정 유형의 암을 앓고 있는지, 특정 중증도의 질병을 갖는지 또는 건강한지 여부를 포함하는 의학적 조건; 성별; 인종; 체질량지수; 의학적 질환의 이전의 병력; 연령; 개체의 생활방식에서의 특정 인자, 예를 들어, 알코올 또는 물질 이용, 흡연, 의약, 영양소 등을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자에 대해 선택되는 개체를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "유전자 발현의 변화"는 상이한 시점에서의 유전자의 유전자 발현에 비한, 바람직하게는 보다 조기의 시점에서의 상기 유전자의 유전자 발현에 비한, 주어진 시점에서의 상기 유전자의 유전자 발현의 변화에 관한 것이다. 이는 예를 들어, 기준선 유전자 발현(상기 비교), 투여전 유전자 발현(즉, HDAC 억제제의 투여 이전의 동일한 개체에 대한 유전자 발현), 또는 치료 이전, 그 이후 또는 그 동안의 시점에 측정된 유전자 발현에 대한 유전자 발현의 변화를 말할 수 있다. 특정 경우에, 유전자의 유전자 발현의 변화는 0(즉, 유전자 발현은 변하지 않음) 또는 검출가능하지 않을 수 있으나; 그러한 경우도 또한, 유전자 발현의 변화와 관련된 구현예에 포함되며, 여기서, 유전자 발현의 변화의 결정의 결과는 유전자 발현이 변하지 않고 유지되는 것이다.
예를 들어, 유전자 발현의 변화는 (i) HDAC 억제제로의 치료의 시작 이전의 주어진 유전자의 유전자 발현을 HDAC 억제제 치료 동안의 상기 유전자의 유전자 발현과 비교함으로써; (ii) HDAC 억제제 치료 동안의 한 시점에서의 주어진 유전자의 유전자 발현을 HDAC 억제제 치료 동안의 다른 시점에서의 상기 유전자의 유전자 발현과 비교함으로써; 및/또는 (iii) 주어진 유전자의 유전자 발현을 건강한, 이환된, 미치료된 및/또는 치료된 개체의 집단으로부터 결정된 상기 유전자의 기준선 유전자 발현과 비교함으로써 결정될 수 있다.
상기 유전자 발현의 변화는 유전자 발현의 증가 또는 감소, 즉, 유전자의 상향- 또는 하향조절에 관한 것일 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 유전자는 서로 독립적으로 상향- 또는 하향조절될 수 있으며, 예를 들어, 상기 유전자 중 하나 이상은 상향조절될 수 있는 한편, 다른 것들은 하향조절될 수 있고, 다른 유전자의 유전자 발현은 변하지 않고 유지될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "바이오마커"는 정상적인 생물학적 과정, 발병 과정 또는 치료적 개입에 대한 약리학적 반응의 지표로서 검출되고 평가될 수 있는 분자 종, 예를 들어, 폴리펩티드, 예를 들어, 단백질 또는 폴리핵산, 예를 들어, mRNA를 특정한다. 그와 같이, 바이오마커는 생리학적, 약리학적 또는 질병 과정 또는 병태를 반영하는 측정가능한 특징이다.
다르게 특정되지 않는 한, "바이오마커" 또는 "하나의 바이오마커"와 같은 용어는 1개 초과의 바이오마커의 조합을 포함한다. 이는 특정 경우에, 1개 초과의 바이오마커에 대하여 수집된 조합된 데이터가 HDAC 억제제 치료의 특정 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다. 더욱이, 본 발명에 따른 하나 이상의 바이오마커에 대하여 수집된 데이터의 예측 또는 예후 값은 추가의 바이오마커, 예를 들어, 기준선 HDAC 활성 또는 히스톤 또는 단백질 아세틸화의 기준선 수준 또는 의약에 통상적으로 사용되는 다른 바이오마커, 예를 들어, 체질량지수, 이전의 병력, 연령 등을 이용함으로써 향상될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 진단 바이오마커는 특정 병태의 존재, 중증도 또는 부재를 확인하기 위해 사용되는 상기 기재된 바와 같은 바이오마커이다.
본 명세서에 사용되는 예후 바이오마커는 환자의 생존 확률을 결정하기 위해 사용되는 상기 기재된 바와 같은 바이오마커이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "약력학적 바이오마커" 또는 "약력학적 마커"는 약물, 예를 들어, HDAC 억제제의 투여시의 그의 수준의 변화에 의해 환자에서 약물의 존재 및/또는 효과를 나타내는 상기 기재된 바와 같은 바이오마커를 특정한다. 약물은 환자의 전체 계에 또는 환자의 특정 약학적 구획에, 예를 들어, 환자의 혈액, 체액, 간, 지방 조직 또는 기타 조직에 존재할 수 있다. 약력학적 바이오마커는 상기 약물이 생체내에서 표적에 이르는지 여부, 즉, 생체내에서 임의의 HDAC 억제가 존재하는지 여부를 결정하기 위하여 신규한 약물을 시험하는데 사용될 수 있다.
추가로, 약력학적 바이오마커는 약동학적/약력학적 모델링(PK/PD 모델링)을 위해, 즉, 약동학적 거동을 약력학적 거동과 연관시키기 위해 사용될 수 있으며, 이는 생체내에서, 예를 들어, 예비임상 단계 I 임상 시험에서, 투여된 HDAC 억제제의 용량과 억제의 수준의 연관에 관한 것이다. 추가로, 약력학적 바이오마커는 또한 생체내에서, 예를 들어, 단계 I 임상 시험을 위한 예비임상 모델 연구에서 또는 단계 II 임상 시험에서 용량 결정을 위해 단계 I 임상 시험에서 수집된 데이터를 사용함으로써 용량 결정을 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 예측 바이오마커는 어느 환자가 특정 치료로 이익을 얻을지 또는 이익을 얻지 않을지를 확인하기 위해, 예를 들어, 반응자를 비-반응자로부터 구별하기 위해 사용되는 상기 기재된 바와 같은 바이오마커이다. 예측 바이오마커는 환자 계층화를 위해 약물의 투여 이전에 또는 치료 모니터링 동안 사용될 수 있으며, 여기서, 모니터링 데이터는 치료의 추가의 결과를 예측하기 위해 사용된다. 예측 바이오마커는 또한 대리 종점으로서, 다시 말하면 치료가 계속되어야 하는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 "계층화" 또는 "계층화시키는"은 그들의 투여전 바이오마커 수준, 즉, HDAC 억제제의 투여 이전의 본 발명에 따른 바이오마커 중 하나 이상의 수준에 따른 환자의 선택을 위한 본 발명에 따른 바이오마커의 용도에 관한 것이며, 이에 의해, 특정 환자가 HDAC 억제제 치료로 이익을 얻을 확률을 결정한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "하우스키핑 유전자"는 전형적으로 사용되는 기술에 의해 우수한 검출가능한 발현, 예를 들어, 본 발명에서 적어도 100 ng의 전체 RNA의 양을 사용하는 qPCR 기술에서 25 미만의 Ct 값을 보여주는 하나 이상의 구성 유전자를 특정한다. 발현이 단백질 수준에서 결정되는 경우에, 물론 유사한 고려사항이 적용된다. 추가로, 하우스키핑 유전자는 동일한 치료 요법을 받고 있는 특정 환자 군의 모든 시료에서 약물의 투여 시의 유전자 발현의 부재 내지 최소의 변화를 보여준다. 하우스키핑 유전자 또는 하우스키핑 유전자들의 발현을 사용하여 예를 들어, 각 시료에서의 개체의 차이, 예를 들어, 상이한 세포 개수에 의해, 및/또는 기술적 측면, 예를 들어, 피펫팅(pipetting) 오차에 의해 야기되는 결정된 결과의 편차를 정규화시킨다.
본 명세서에 사용되는 용어 "표적 유전자"는 특정 치료에 의한 그의 발현 및 조절에 대하여 이러한 시험 시스템에서 조사되는 대상 유전자를 특정한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "HDAC 억제제 치료"는 본 발명의 설명에서 추가로 상세화된 바와 같이 환자에서의 의학적 질환(예를 들어, 질병)을 치료하기 위해, 치료를 필요로 하는 환자가 HDAC 억제제의 하나 이상의 용량의 투여를 포함하는 치료 요법을 받는 것을 의미한다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 HDAC 억제제 치료는 의학적 질환의 진단에서 시작하고, 치료 요법을 포함하여, 마지막 추적 시험까지의 기간을 포함할 수 있으며, 다시 말하면, 여기서, 환자는 임의의 약제를 더 제공받지 않지만, 환자의 신체 조건 및 치료 상태가 조절된다. 특정 경우에, 추적은 주어진 환자에 HDAC 억제제를 마지막으로 투여하고 심지어 수개월 또는 수년 후에 존재할 수 있는 HDAC 억제제의 투여의 장기간 효과의 결정을 포함할 수 있다.
이러한 맥락에서, "치료 사이클"은 HDAC 억제제가 일부 특정 시간 간격으로 환자에게 투여되는 동안의 기간을 말하며, 이는 HDAC 억제제가 상기 환자로부터 완전히 배설되도록 HDAC 억제제가 환자에게 투여되지 않는 특정 기간을 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료 사이클은 14일을 포함할 수 있으며, 여기서, HDAC 억제제는 제1일 내지 제5일에 1일 2회 투여되며, HDAC 억제제는 제6일 내지 제14일에 투여되지 않는다. 치료 사이클은 통상 HDAC 억제제 치료 동안 적어도 1회, 바람직하게는 1회를 초과하여 반복되지만, 수많은 인자, 예를 들어, HDAC 억제제의 투여에 대한 환자의 반응, HDAC 억제제의 원치않는 부작용의 발생, 환자의 전체 건강 상태 등에 따라 달라질 수 있다.
"HDAC 억제제 치료의 효과" 또는 "상기 HDAC 억제제 치료의 효과"의 맥락에서 본 명세서에 사용되는 용어 "효과"는 본 명세서에서 하기 정의된 바와 같은 HDAC 억제제 치료의 약력학적 효과 및/또는 긍정적인 또는 부정적인 결과를 포함한다. 그러한 효과에 대한 예는 a) HDAC 활성의 감소, 히스톤 아세틸화 또는 기타 단백질, 예를 들어, 전사 인자 또는 수용체의 아세틸화의 유도, 유전자 전사의 조절, 단백질 발현의 조절 및 신호전달 경로의 조절된 활성을 포함하는 군으로부터 선택되는 효과를 포함하는 약력학적 효과, 즉, 분자 수준에서의 효과; b) 종양 크기, 대사 활성, 세포 생존력, 종양의 혈액 공급, 즉, 혈관신생, 종양의 조성, 예를 들어, 종양을 포함하는 세포, 예를 들어, 종양 세포, 면역 세포, 섬유아세포 및 내피 세포의 관계의 변화를 포함하는 이환 조직 또는 세포에서의 효과; 및 c) 임상 상태, 건강 상태, 질병의 진행 또는 안정화의 변화, 무진행 생존 시간의 감소 또는 증가, 질병의 치유, 전체 생존의 증진 또는 단축, 질병 진행의 지연 및 증상의 완화 또는 악화를 포함하는 환자의 의학적 상태에 대한 효과이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 효과는 약력학적 효과이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과"는 HDAC 억제제 치료가 환자에 대하여 유리한 효과를 야기하는 것을 의미한다. 이는 임상적 이익, 건강 개선, 질병의 안정화, 무진행 생존 시간의 증가, 질병의 치유, 전체 생존의 증진 및 질병 진행의 지연 및 증상의 완화를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "HDAC 억제제 치료의 부정적인 결과"는 HDAC 억제제 치료가 환자에 대하여 유리한 효과를 야기하지 않거나, 결과가 상기 언급된 긍정적인 결과와 반대인 것, 예를 들어, 건강 쇠약을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 "반응자"는 상기 정의된 바와 같은 HDAC 억제제 치료에 기인하여 긍정적인 결과를 보여주는 환자이다.
본 명세서에 사용되는 "비-반응자"는 상기 정의된 바와 같은 HDAC 억제제 치료에 기인하여 부정적인 결과를 보여주는 환자이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "체액("bodily fluid" 또는 "body fluid")"은 말초 혈액, 혈청, 혈장을 포함하는 혈액, 소변, 간질액, 양수(liquor), 안방수, 유리체액, 담즙, 모유, 뇌척수액, 내림프액, 외림프액, 정액, 위액, 점액, 복막액, 늑막액, 타액, 땀, 눈물 및 질 분비물을 포함하나 이들에 한정되지 않는 환자의 신체로부터 배출되거나 분비되는 유체를 포함하는 환자의 신체로부터 기원한 유체 또는 유체의 일부를 특정한다. 본 발명의 맥락에서 바람직한 체액은 말초 혈액, 혈청, 혈장 및 소변이다. 상기 체액 그 자체는 이환 및/또는 비-이환 세포를 포함하거나 그를 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "조직 시료"는 환자 신체로부터 유래되는 비-유체 물질 또는 고체를 특정한다. 조직 시료는 비제한적으로 골 물질, 골수, 피부, 모낭, 점막, 뇌, 연골, 근육, 폐, 신장, 위, 장, 방광 및 간의 시료를 포함한다. 상기 조직 시료 그 자체는 이환 세포를 포함할 수 있거나 그를 포함하지 않을 수 있고, 예를 들어 환자 신체의 이환 영역으로부터 취한 시료, 예컨대 종양의 생검일 수 있다. 바람직하게는, 조직 시료는 피부, 모낭 또는 구강 점막으로부터 선택된다.
본 발명의 구현예에서, 시료는 의학 분야에서의 당업자에게 일반적으로 공지된 임의의 방법 및/또는 수단에 의해 환자로부터 수득되며, 예를 들어, 바람직하게는 정맥천자에 의해 취한 혈액 시료이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "말초 혈액"은, 심장으로부터 먼 순환계로부터 수득된 혈액, 즉 전신 순환되는 혈액, 예를 들어 말단 영역으로부터의 혈액을 특정한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "전혈"은, 상기 혈액의 공여자, 예컨대 환자로부터 수득된, 세포 및 유체를 포함하는 변형되지 않은 혈액을 특정한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "환자"는 HDAC 억제제 치료를 받는 것으로 의도되는 대상체를 특정한다. 환자는 잠재적으로 이환되며, HDAC 억제제의 안전성, 독성 및 약력학적 거동을 결정하기 위하여 이환 대상체 및 건강한 대상체, 예를 들어, 단계 I 임상 시험에서의 건강한 자원자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 환자는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 환자는 암을 앓고 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자"는 HDAC 억제제 치료가 유리한 것으로 예상되고/거나 HDAC 억제제 치료에 반응성인 질병 또는 장애를 갖는 것으로 의심되는, 바람직하게는 질병 또는 장애를 갖는 대상체를 특정한다. 이러한 맥락에서, "잠재적으로 필요로 하는 환자"는 또한 "필요로 하는 환자"를 포함하고, 특정 구현예에서, 그것을 의미한다.
본 발명에 따른 유전자의 발현은 이들 유전자의 전사 과정으로부터 유래된 mRNA의 정량화를 위한 최신 기술에 따른 검출 방법, 예를 들어, 정량적 리얼-타임 PCR(qPCR) 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 추가로, 이들 유전자 발현은 질의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현을 분석함으로써 측정될 수 있다. 그들 측정의 전부는 생체외 또는 시험관내에서 수행될 수 있다.
RNA의 검출 또는 측정 방법은 특별히 제한되지 않으며, RNA의 검출 또는 측정은 당업자에게 알려져 있는 임의의 적합한 방법에 의해 행해질 수 있다. 그러한 방법의 예는 정량적 PCR(리얼 타임 PCR로도 알려져 있음), mRNA의 정량적 시퀀싱(딥 시퀀싱(deep sequencing)으로도 알려져 있음), 노던 블롯 기술 또는 돗트(dot) 블롯 기술이다. 상기 방법은 프라이머 쌍을 포함하고/거나 DNA 분자를 포함하는 일부 특정 프로브의 사용을 수반할 수 있다. 그러한 프라이머 쌍은 전형적으로 관심 대상의 동일한 폴리핵산 분자(전형적으로 특정 mRNA 분자의 cDNA 카피)의 상이한 영역에 특이적으로 결합하는 예를 들어, 약 20개 염기 길이의 짧은 비-상보적인 단일 가닥 DNA 분자의 쌍이며, 상기 폴리핵산의 증폭에 사용될 수 있다. DNA 분자를 포함하는 상기 언급된 분자 프로브는 대상 폴리핵산 분자에 특이적으로 결합하는 단일 가닥 DNA 분자 및 검출을 용이하게 하기 위한 하나 이상의 표지("태그"로도 알려져 있음)를 포함하는 분자 작제물이다. 선택적으로, 상기 프로브는 추가로 하나 이상의 링커 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 언급된 표지는 예를 들어, 단일 가닥 DNA 분자의 결합시에 색상 세기의 변화를 보여주는 색상 표지, 형광 표지, 예를 들어, 형광 단백질 또는 형광 염료, 효소 표지, 예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 방사성 표지 또는 분자 생물학에 통상적으로 적용되는 단일 가닥 DNA 분자의 결합의 검출을 가능하게 하는 기타 표지로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "항체를 포함하는 프로브"는 에피토프로의 결합을 위한 특이적인 항체 및 검출을 용이하게 하는 하나 이상의 표지("태그"로도 알려져 있음)를 포함하는 분자 작제물이다. 선택적으로, 상기 프로브는 추가로 하나 이상의 링커 모이어티를 포함할 수 있다. 상기 언급된 표지는 예를 들어, 색상 세기 및/또는 변화에 기초하여 항체의 결합을 나타내는 색상 표지, 형광 표지, 예를 들어, 형광 단백질 또는 형광 염료, 효소 표지, 예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 방사성 표지 또는 분자 생물학에 통상적으로 적용되는 항체 결합의 검출을 가능하게 하는 기타 표지로부터 선택될 수 있다. 그의 표적 에피토프로의 특이적인 항체의 결합을 검출하는 다른 가능성은 특정 항체의 검출을 위하여 제2 항체가 사용되는 간접적인 기술을 포함하며, 여기서, 제2 항체는 표지를 지니며, 당해 표지는 상기 정의된 바와 같고, 제2 항체는 상기 언급된 특정 항체에 특이적으로 결합한다. 그러한 간접적인 기술은 분자 생물학 분야에 통상적으로 알려져 있는 방법, 예를 들어, ELISA, 단백질의 검출을 위한 HPLC 방법, 웨스턴 블롯 기술, 역상 단백질 검출 기술 또는 돗트 블롯 기술을 포함한다. 또한, 상기 언급된 "간접적인 기술"은 직접적인 환경에서 수행될 수 있으며, 여기서, 상기 언급된 프로브는 표적 에피토프에 결합하며, 직접적으로 검출된다. 특정 구현예에서, 특정 항체는 예를 들어, 시트 물질, 비드, 스트립 등에 고정화될 수 있다. 일 구현예에서, 검출은 용액에서 또는 용액에 현탁된 비드를 사용하여 용이하게 되며, 상기 비드는 본 명세서에 언급된 바와 같은 고정화된 프로브를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "프로브들"은 또한, "하나의 프로브", 즉 단일의 프로브를 말한다.
추가의 구현예에서, 단백질의 검출 및/또는 정량화는 질량 분석 방법 또는 LC-결합 질량 분석 방법에 의해 용이하게 될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 예시적인 방법은 문헌["Short Protocols in Molecular Biology", 5th Edition, 2 Volume Set; Frederick M. Ausubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston (Editor), David D. Moore (Editor), J. G. Seidman (Editor), John A. Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor); Wiley; ISBN: 978-0-471-25092-0]에 상세히 기재되어 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같이, 특이적으로 결합하는 항체, 프라이머 쌍 또는 DNA 분자는 바람직하게는 그의 표적 구조에 대하여 다른 구조에 비하여 적어도 1000배의 결합 친화성을 갖는다. 본 명세서에서 "구조"는 단백질 에피토프 및 폴리핵산 서열을 포함하는 분자 엔티티에 관한 것이다. 본 명세서에서, "에피토프"는 항체에 의해 인식되는 단백질의 부분이다.
본 발명에 사용하기 위한 항체는 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 상기 항체의 유형은 특히 제한되지 않으며, 이론상으로, 모노클로널 항체 및 폴리클로널 항체를 포함하는 유전자의 발현 산물의 검출에 적합한 임의의 항체 유형이 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법, 용도 및 키트는 HDAC의 억제에 반응성인 질병 또는 장애의, HDAC 억제제의 제조 및 추적을 포함하는 HDAC 억제제 치료에 적용가능하다. 그러한 질병 및 장애는 비정상적인 세포 증식 및/또는 생존 및/또는 분화의 차단을 나타내는 세포에 의해 정의된 세포 신생물을 포함한다. 용어 신생물은 생체내에서 진행성 전이 종양을 형성할 수 없는 세포의 과다증식과 관련된 "양성 신생물" 및 전신 질병을 형성할 수 있는, 예를 들어, 원위 기관에서 종양 전이를 형성할 수 있는 다수의 세포 및 생화학적 이상이 있는 세포와 관련된 "악성 신생물"을 포함한다. 악성 신생물의 예는 고형 및 혈액 종양을 포함한다. 고형 종양은 유방, 방광, 뼈, 뇌, 중추 및 말초 신경계, 결장, 내분비선(예를 들어, 갑상선 및 부신 피질), 식도, 자궁 내막, 생식 세포, 두경부, 신장, 간, 폐, 후두 및 하인두, 중피종, 난소, 췌장, 전립선, 직장, 신장, 소장, 연조직, 정소, 위, 피부, 수뇨관, 질 및 외음부의 종양에 의해 예시된다. 악성 신생물은 망막아종 및 빌름스 종양에 의해 예시되는 유전된 암을 포함한다. 또한, 악성 신생물은 상기 기관에서의 원발성 종양 및 원위 기관에서의 상응하는 이차 종양("종양 전이")을 포함한다. 혈액 종양은 진행성 및 무통 형태의 백혈병 및 림프종, 즉, 비-호지킨병, 만성 및 급성 골수성 백혈병(CML/AML), 만성 및 급성 림프모구성 백혈병(CLL/ALL), 호지킨병, 다발성 골수종 및 T-세포 림프종에 의해 예시된다. 골수이형성 증후군, 형질 세포 신생물, 부신생물 증후군(paraneoplastic syndrome), 알려져 있지 않은 원발 부위의 암 및 AIDS 관련 악성종양도 또한 포함된다.
본 발명의 특히 바람직한 구현예는 HCC 및 간암 전이를 포함하는 간, 췌장, 결장 및 대장(CRC)을 포함하는 위장관. 갑상선, 신장(즉, 신장암), 피부, 정소 및 호지킨 림프종을 포함하는 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암에 관한 것이다. 그러한 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 환자는 바람직하게는 암 환자, 더욱 바람직하게는 HCC 및 간암 전이를 포함하는 간, 췌장, 결장 및 대장(CRC)을 포함하는 위장관, 갑상선, 신장(즉, 신장암) 및 호지킨 림프종을 포함하는 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암을 앓고 있는 환자이다.
추가로, HDAC의 억제에 반응성인 질병 또는 장애는 다음을 포함하는 군으로부터 선택되는 비-악성 질병을 포함한다:
(i) 관절병증 및 골병리학적 질환, 예를 들어, 류마티스 관절염, 골관절염, 통풍, 다발관절염 및 건선 관절염;
(ii) 전신홍반루푸스;
(iii) 혈관 증식 장애, 죽상경화증 및 재협착을 포함하는 평활근 세포 증식;
(iv) 염증 질환 및 피부 질환, 예를 들어, 궤양대장염, 크론병, 알러지성 비염, 알러지성 피부염, 낭성 섬유증, 만성 기관지염 및 천식;
(v) 자궁내막증, 자궁 유섬유종(uterine fibroids), 자궁내막 증식증 및 양성 전립선 비대증;
(vi) 심장 기능장애;
(vii) HIV 감염과 유사한 억제성 면역억제 질환;
(viii) 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 폴리글루타민 관련 장애와 같은 신경병증성 장애; 및
(ix) 내인성 유전자 발현의 강화 및 유전자 치료법에서 트랜스유전자 발현의 증진에 의해 치료할 수 있는 병리학적 질환.
유전자 발현이 결정되는 본 발명의 특정 구현예에서, 이것은 상기 유전자로부터 전사되는 mRNA의 cDNA 카피의 qPCR을 통해 수행되며, 상기 cDNA는 상기 유전자로부터 전사되는 mRNA의 완전한 또는 부분적인 카피일 수 있고, 상기 mRNA는 전형적으로 ZFP64의 전사물 변이체에 대하여 본 명세서에 상세화된 바와 같이 ZFP64의 경우에 상기 유전자의 1개 초과의 엑손을 포함한다. 상기 qPCR에서, 상기 cDNA의 완전한 또는 부분적인 카피가 생성될 수 있으며(qPCR 프라이머의 각각의 결합 부위에 따라), 전형적으로 그러한 카피는 50 내지 90, 구체적으로 60 내지 80, 더욱 구체적으로 65 내지 75, 더더욱 구체적으로 73개 염기쌍을 포함한다. 특정 경우에, 상기 유전자의 1개 초과의 전사 변이체(즉, 상이한 mRNA)가 상기 유전자의 엑손의 상이한 조합에 기초하여, 시료에 존재할 수 있으며; 이러한 경우에, 하나 이상의 상기 전사 변이체의 cDNA 카피가 생성될 수 있고, 이어서 그 중 하나 이상은 qPCR로 처리될 수 있고(하나 이상의 증폭 산물 생성); 유전자 발현을 결정하기 위한 판독은 또한 상기 증폭 산물 중 하나 이상에 기초할 수 있다.
ZFP64의 유전자 발현이 결정되는 본 발명의 다른 특정 구현예에서, 이것은 택맨(Taqman)® 검정 ID Hs00217022_m1에 의해, 또는 서열(Seq ID 1) 5' CACCTCGGAGACCCAGACAATCACAGTTTCAGCTCCAGAA TTTGTTTTTGAACATGGCTATCAAACTTACCTG 3'을 갖는 ZFP64로부터 전사된 mRNA(이로부터 ZFP64 mRNA 인트론은 배제됨)의 cDNA 카피 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드의 쌍에 의해 수행된다. 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 쌍은 하기의 것, 또는 쌍 1 정방향 프라이머와 쌍 2 역방향 프라이머 또는 쌍 2 정방향 프라이머와 쌍 1 역방향 프라이머의 조합을 포함하거나, 그러한 프라이머는 이들보다 더 짧거나 더 길 수 있으며, 특히 17 내지 최대 26개 염기 길이일 수 있다:
쌍 1: 정방향 프라이머(Seq ID 2) 5' CACCTCGGAGACCCAGACAA 3'(20개 염기), 역방향 프라이머(Seq ID 3) 5' CAGGTAAGTTTGATAGCCATGTTCA 3'(25개 염기)
쌍 2: 정방향 프라이머(Seq ID 4) 5' CACCTCGGAGACCCAGACA 3'(19개 염기), 역방향 프라이머(Seq ID 5) 5' CAGGTAAGTTTGATAGCCATGTTC 3'(24개 염기)
qPCR 방법에 의한 ZFP64의 유전자 발현의 결정을 위해 상기 기재된 프라이머에 더하여, ZFP64의 cDNA 서열을 특이적으로 증폭시키기 위한 프라이머가 사용될 수 있다. 일반적으로, 그들 프로브/프라이머는 ZFP64의 하나 이상의 전사물 변이체에 특이적으로 결합하는 짧은 DNA 서열이다. 그들 프라이머 쌍의 길이는 17 내지 25, 구체적으로 19 내지 23, 더욱 구체적으로 20 내지 22개 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있으며, RNA 시료에 존재할 수 있는 게놈 DNA의 증폭을 피하기 위하여 인트론에 걸쳐 있도록 설계되어야 한다(즉, 적어도 하나의 인트론에 의해 분리된 2개의 개별 엑손에 결합하는 프라이머 쌍의 정방향 및 역방향 프라이머). 이러한 방법에 의해 수득되는 PCR 산물은 50 내지 400, 구체적으로 70 내지 300, 더욱 구체적으로 80 내지 200, 더욱 구체적으로 123 또는 198개 염기쌍 길이일 수 있다. RNA 시료 중에 남아 있는 게놈 DNA로부터 야기되는 PCR 산물은 이론적으로 증폭된 cDNA와 함께 생성될 수 있다. 그러나, 그러한 게놈 DNA의 카피는 증폭된 cDNA보다 훨씬 더 길고, 더욱이, 중합효소 매개의 PCR 과정의 연장 단계를 위한 제한된 기간에 의해 긴 산물의 연장이 방지된다(고속 중합효소도 1000개 염기에 대하여 15초를 필요로 하는 것을 주의한다). 따라서, 당업자는 유전자 DNA의 과잉의 카피의 형성을 피하기 위하여 적절한 증폭 단계 기간을 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명에서 ZFP64로부터 전사되는 mRNA의 cDNA 카피를 증폭시키기 위해 사용하기 위한 특정 프라이머 쌍에 대한 예는 다음과 같다:
Figure pct00004
Figure pct00005
상기 프라이머 전부는 58℃의 어닐링(annealing) 온도를 갖는다.
NCBI 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/55734)에서 참조 번호에 의한 ZFP64의 전사물 변이체
NM_199427.2; 전사물 변이체 4, mRNA
NM_018197.2, 전사물 변이체 1, mRNA
NM_199426.1, 전사물 변이체 3, mRNA
NM_022088.4, 전사물 변이체 2, mRNA
추가로, ZFP64 mRNA 수준은 또한 RNA 시퀀싱에 의해 결정될 수 있다. 이는 적어도 2개의 상이한 방법, mRNA의 직접적인 시퀀싱 및 역전사된 mRNA, cDNA의 시퀀싱에 의해 수행될 수 있다. 이들 시퀀싱 기술을 위한 방법은 당업계에 널리 알려져 있다.
유전자 발현이 결정되는 본 발명의 특정 구현예에서, 이는 RNA 시퀀싱에 의해 수행된다. "전체 전사체 샷건 시퀀싱(Whole Transcriptome Shotgun Sequencing)"("WTSS")으로도 지칭되는 RNA 시퀀싱(문헌[RD. Morin, et al. (2008), BioTechniques 45 (1): 81-94])은 주어진 순간에 게놈 유래의 특정 RNA의 존재 및 양이 드러나게 한다(문헌[Chu Y, Corey DR (2012). Nucleic Acid Ther 22 (4): 271-4]). 시퀀싱-기반의 RNA 분석으로, 시료에서 주어진 서열의 수치적 빈도가 기록된다. 세포의 전체 전사체에 걸쳐 있는 프라이머의 풀을 사용하여 세포의 전체 cDNA를 시퀀싱함으로써 본 발명에 따른 유전자, 특히 ZFP64의 mRNA/cDNA의 수준이 검출된다(다른 유전자에 비해).
유전자 발현이 결정되는 본 발명의 특정 구현예에서, 이는 (단백질 수준에서) 웨스턴 블롯에 의해 수행된다. 웨스턴 블롯(때때로 단백질 면역블롯으로 지칭)은 시료에서 특정 단백질을 검출하기 위해 광범위하게 사용되는 분석 기술이다. 그것은 겔 전기영동을 사용하여, 고유 단백질을 3차원 구조에 의해 분리하거나 대안적으로 폴리펩티드의 길이에 의해 변성된 단백질을 분리한다. 이어서, 단백질을 멤브레인(전형적으로 니트로셀룰로스 또는 PVDF)으로 옮기고, 여기서, 그들을 표적 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 염색한다. 항체의 교차-반응성의 문제를 해결하기 위하여, 겔 전기영동 단계를 웨스턴 블롯 분석에 포함시킨다. 개선된 면역블롯 방법, 제스턴(Zestern) 분석(Zhang, Jiandi; Wang, Dan., 미국 특허 제8,293,487호)으로, 전기영동 단계 없이 이러한 문제를 다룰 수 있어, 단백질 분석의 효율을 상당히 향상시킨다. 웨스턴 블롯 분석에 비하여, 제스턴 분석에는 검출 단계 이전에 용리 단계가 부가된다. 멤브레인 상에 형성된 면역복합체가 과량의 경쟁 분자를 함유하는 용액에 접근하게 한다. 경쟁 분자는 합성 항원 또는 부분 항원, 또는 하나의 분자 내의 항원 또는 부분 항원의 다중의 반복일 수 있다. 경쟁은 항원-항체 상호작용의 가역성으로 인하여 발생한다. 항체는 경쟁 분자에 의해 멤브레인으로부터 용리 용액으로 유리된다. 리포터 검정을 통한 용리 용액 중 항체의 양의 정량화에 의해, 단백질 시료 중 항원의 양의 신뢰성있는 지표가 제공된다. 따라서, 에피토프로의 표지된 항체의 특이적인 결합은 경쟁 항원을 첨가함으로써 정량화될 수 있다. 다른 관련 기술은 돗트 블롯 분석, 면역염색에 의해 조직 및 세포에서 단백질을 검출하기 위해 항체를 사용하는 면역조직화학 및 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA)을 포함한다. ZFP64에 특이적인 특정 항체는 예를 들어 하기와 같다:
아브캄(Abcam) ab66658; ZFP64에 대한 토끼 폴리클로널; 면역원: 인간 ZFP64의 C 말단 아미노산 633 내지 682에 상응하는 합성 펩티드 내의 영역 DGGQNIAVATTAPPVFSSSSQQELPKQTYSIIQGAAHPALLCPADSIPD(Seq ID 10);
시그마(Sigma) HPA035112; 토끼 폴리클로널; 면역원 서열 SFDTKQPSNLSKHMKKFHGDMVKTEALERKDTGRQSSRQVAKLDAKKSFHCDICDASFMREDSLRSHKRQHSEYSESKNSDVTVLQFQIEPS(Seq ID 11);
써모사이언티픽(ThermoScientific) PA5-28546, 토끼 폴리클로널; 면역원: 인간 ZFP64의 아미노산 394 및 681 내의 영역에 상응하는 재조합 단편.
유전자 발현이 검출되는 본 발명의 특정 구현예에서, 이는 (단백질 수준에서) 루미넥스(luminex) 기술에 의해 수행된다. 루미넥스 기술은 항체 의존적 방식으로 상이한 매트릭스에서 주어진 단백질의 발현을 결정하기 위한 비드-기반의 기술이다. 따라서, 포획 항체 및 검출 항체의 세트는 둘 모두 대상 단백질에 특이적으로 결합하나 본질적으로 상이한 비-중첩 에피토프에 결합하지 않는다. 포획 항체는 비드에 코팅되고, 검출 항체는 직접적으로(피코에리트린(PE) 결합) 또는 간접적으로(비오티닐화 - 이후의 스트렙트아비딘-PE 결합에 의한 이러한 항체의 검출) 표지되거나(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지를 사용함), 표지된 종 특이적인 항체(예를 들어, Zfp64 에피토프 특이적인 토끼 항체에 대한 표지된 항-토끼 항체)에 의해 검출될 수 있다.
유전자 발현이 결정되는 본 발명의 특정 구현예에서, 이는 (단백질 수준에서) ELISA에 의해 수행된다. 효소-연결 면역흡착 검정(ELISA) 및 효소 면역검정은 항체 의존적 방식으로 상이한 시료 유형(예를 들어, 혈액 혈장, 혈청, 세포 용해물 등)에서 주어진 단백질의 발현을 결정하기 위한 기술이다. 따라서, 포획 항체 및 검출 항체를 포함하는 세트가 필요하며, 둘 모두는 대상 단백질에 특이적으로 결합하나, 본질적으로 상이한 비-중첩 에피토프에 결합하지 않는다. 포획 항체는 고체상, 예를 들어, 플라스틱 표면에 고정화되고, 검출 항체는 직접적으로(예를 들어, TMB, DAB, ABTS와 같은 발색 기질을 전환시키는 호스래디쉬 퍼옥시다제와 같은, 기질을 검출가능한 신호로 전환시키는 효소를 사용함) 또는 간접적으로(비오티닐화 - 이후의 스트렙트아비딘-효소 또는 스트렙트아비딘-형광 표지 결합에 의한 이러한 항체의 검출) 표지되거나(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지를 사용하여), 표지된 종 특이적인 항체(예를 들어, Zfp64 에피토프 특이적인 토끼 항체에 대한 표지된 항-토끼 항체)에 의해 검출될 수 있다.
유전자 발현이 결정되는 본 발명의 특정 구현예에서, 이는 하나 이상의 특정 시점에서, 예를 들어, 환자로의 HDAC 억제제의 투여 직전(0시간으로도 명명) 및 환자로의 HDAC 억제제의 투여 후 1 내지 10, 특히 1 내지 6, 더욱 특히 2 내지 5시간에 있는 하나 이상의 시점에서 수행된다. ZFP64 유전자 발현이 결정되는 본 발명의 특정 구현예에서, 이는 임상 시험 설명(SAPHIRE, SHELTER, SHORE)의 맥락에서 본 명세서에 기재된 하나 이상의 특정 시점에, 즉, 환자로의 HDAC 억제제의 투여 직전, 환자로의 HDAC 억제제의 투여 후 약 2 및/또는 5시간에 수행될 수 있다.
전형적으로, 유전자 발현이 HDAC 억제제 치료의 효과를 결정하기 위해, HDAC 억제제 치료를 모니터링하기 위해, 환자의 계층화를 위해 또는 긍정적인 결과의 확률을 예측하기 위해 측정되면, 이는 환자로의 HDAC 억제제의 투여 전에, 특정 구현예에서는 투여 직전에 수행된다. 환자의 계층화를 위해 또는 긍정적인 결과의 확률을 예측하기 위해, 이는 전형적으로 HDAC 억제제 치료의 시작 이전에(즉, 제1 HDAC 억제제 용량이 상기 환자에게 투여되기 이전에) 수행되며, 이는 이후의 시점에, 특히 임상 시험 설명의 맥락에서 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료 사이클의 시작 직전에 1회 이상의 추가의 측정을 동반할 수 있다. HDAC 억제제 치료의 효과를 결정하거나 HDAC 억제제 치료를 모니터링하기 위하여, 이는 HDAC 억제제 치료의 시작 이전에 수행될 수 있으며, 전형적으로 임상 시험 설명의 맥락에서 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료 사이클의 시작 직전에 1회 이상 수행된다.
ZFP64 유전자 발현이 결정되는 본 발명의 특정 구현예에서, 이는 시료를 항체, 특히 아브캄 ab66658; 시그마 HPA035112 및 써모사이언티픽 PA5-28546(본 명세서에 추가로 기재)으로부터 선택되는 항체와 접촉시키고, ZFP64에 의해 발현되는 단백질과 상기 항체 간의 결합을 측정함으로써 수행된다. 특히, 상기 결합은 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법, 예를 들어, ELISA, 루미넥스 등을 사용하여 측정된다.
본 발명의 특정 구현예는 하기의 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 환자를 HDAC 억제제로 치료하는 방법에 관한 것이다:
a) 상기 환자의 시료를 제공하는 단계로서, 상기 환자가 이미 HDAC 억제제 치료를 받은 단계,
b) 상기 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1, 특히 ZFP64를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 결정하는 단계,
c) 상기 적어도 하나의 유전자의 결정된 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 상기 환자에서의 단계 a)의 상기 HDAC 억제제 치료의 효과와 연관시키는 단계, 및
d) HDAC 억제제를 단계 c)의 연관성에 기초하여 결정되는 HDAC 억제제의 투여량 및/또는 투여 스케쥴을 사용하여 상기 환자에게 투여하는 단계.
본 발명의 추가의 특정 구현예는 하기의 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 환자를 HDAC 억제제로 치료하는 방법에 관한 것이다:
a) 상기 환자의 시료를 제공하는 단계,
b) 상기 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1, 특히 ZFP64를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현을 결정하는 단계,
c) 상기 적어도 하나의 유전자의 결정된 유전자 발현을 HDAC 억제제 치료가 상기 환자에서 유리한 효과를 갖는 확률과 연관시키는 단계,
d) 상기 환자를 단계 c)에서 결정된 확률에 기초하여, 상기 HDAC 억제제 치료에 대한 반응자로 분류하는 단계, 및
e) 상기 환자의 반응자로서의 분류에 기초하여, HDAC 억제제를 상기 환자에게 투여하는 단계.
본 발명의 추가의 특정 구현예는 하기의 단계를 포함하는 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 계층화 방법에 관한 것이다:
a) 상기 환자의 시료를 제공하는 단계로서, 상기 환자가 암, 특히 간세포 암종(HCC), 호지킨 림프종(HL) 또는 대장암(CRC), 더욱 특히 간세포 암종(HCC)이 있는 것으로 진단된 단계,
b) 하나 이상의 하우스키핑 유전자의 Ct 값의 평균을 ZFP64에 대하여 결정된 Ct 값으로부터 제함으로써 ZFP64의 유전자 발현 수준에 대한 dCt 값을 수득하는 단계, 및
c) 단계 b)에서 ZFP64에 대하여 수득되는 dCt 값이 11.15 미만, 특히 10.02 미만이면, 상기 환자를 반응자로 분류하는 단계.
본 발명의 추가의 특정 구현예는 하기의 단계를 포함하는 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 계층화 방법에 관한 것이다:
a) 상기 환자의 시료를 제공하는 단계로서, 상기 환자가 암, 특히 간세포 암종(HCC), 호지킨 림프종(HL) 또는 대장암(CRC), 더욱 특히 간세포 암종(HCC)이 있는 것으로 진단된 단계,
b) 하나 이상의 하우스키핑 유전자의 Ct 값의 평균을 ZFP64에 대하여 결정된 Ct 값으로부터 제함으로써 ZFP64의 유전자 발현 수준에 대한 dCt 값을 수득하는 단계, 및
c) 단계 b)에서 ZFP64에 대하여 수득되는 dCt 값이 11.15 미만, 특히 10.02 미만이면, 상기 환자를 HDAC 억제제 치료에 적격한 것으로 분류하는 단계.
본 발명의 방법의 특정 구현예에서, ZFP64의 유전자 발현에 대한 상기 dCT 값은 하우스키핑 유전자 18sRNA, TBP 및 GAPDH의 Ct 값의 평균을 ZFP64에 대하여 결정된 Ct 값으로부터 제함으로써 수득가능하다.
본 발명의 방법의 특정 구현예에서, Ct 값은 상기 유전자에 의해 발현되는, 특히 ZFP64에 의해 발현되는 mRNA의 cDNA 카피의 qPCR 증폭에 의해 결정가능하다.
본 발명의 특정 구현예는 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1, 특히 ZFP64를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현을 결정하기 위한 키트이며, 키트는 상기 유전자에 의해 발현되는 mRNA의 cDNA 카피에 결합하며, 2개의 엑손의 부분에 상보적인 뉴클레오티드 프로브(예를 들어, PCR 프라이머 쌍), 특히, 상기 유전자, 더욱 특히 ZFP64로부터 전사되는 mRNA의 cDNA 카피의 qPCR에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 프라이머 쌍으로부터 선택되는 프라이머 쌍을 포함하고,
키트는 선택적으로 매질, 매질 성분, 완충제, 완충제 성분, RNA 정제 컬럼, DNA 정제 컬럼, 염료, dNTP 믹스를 포함하는 핵산, 중합효소를 포함하는 효소 및 염을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 성분을 포함한다.
본 발명의 다른 특정 구현예는 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1, 특히 ZFP64를 포함하는 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하기 위한 키트이며,
키트는 상기 유전자에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질 또는 상기 단백질의 도메인에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하고, 상기 프로브는 특히 본 명세서에 기재된 바와 같은 표지를 포함하고/거나, 상기 프로브는 ZFP64에 대하여 특히 특이적인 항체로서 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체이고/거나, 상기 프로브는 예를 들어, ELISA 또는 루미넥스의 맥락에서 본 명세서에 기재된 바와 같이 고정화되고, 키트는 선택적으로 매질, 매질 성분, 완충제, 완충제 성분, 멤브레인, ELISA 플레이트 효소 기질, 염료, 중합효소를 포함하는 효소 및 염을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 성분을 포함한다.
ZFP64에 의해 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 프로브가 적용되는 본 발명의 구현예에서, 상기 프로브 또는 항체는 특히 상기 본 명세서에 기재된 바와 같은 ZFP64에 대하여 특히 특이적인 항체로부터 선택된다.
도 1은 800 ㎎ 용량 그룹에 비한 600 ㎎ 용량 그룹의 SAPHIRE 임상 시험에서 관찰되는 레스미노스타트 의존적인 HDAC 효소 억제 중간값을 보여준다. Y 축은 HDAC 억제제 치료의 제1일, 0시간의 시점에서의 값과 비교한 백분율의 효소 활성에 관한 것이며, X 축은 각각의 치료 사이클의 시작 이후 수일 및 수시간으로 세분된 치료 사이클에 관한 것이다.
도 2는 HDAC 억제제의 투여 후 시점 0, 2 및 5(x 축에 나타낸 시점)에서 말초 혈액(생체외) 및 선택된 인간 암 세포주(시험관내)의 시료에서 결정시, 발현 수준(Y 축)으로 측정되는 HDAC 억제제 투여 시의 본 발명의 유전자에 대한 유전자 발현의 변화 간의 비교를 보여준다. 빗금친 컬럼은 혈액에 관한 것이며, 흑색 컬럼은 HepG2 세포에 관한 것이고, 백색 네모는 HT 29 세포에 관한 것이다. 값은 0시간에서의 값으로 표준화된다.
도 3은 HDAC 억제제의 투여 후 시점 0, 2 및 5(x 축에 나타낸 시점)에서 말초 혈액(생체외) 및 선택된 인간 암 세포주(시험관내)의 시료에서 결정시, 발현 수준(Y 축)으로 측정되는 하우스키핑 유전자에 대한 HDAC 억제제 투여시의 유전자 발현의 변화 간의 비교를 보여준다. 빗금친 컬럼은 혈액에 관한 것이며, 흑색 컬럼은 HepG2 세포에 관한 것이고, 백색 네모는 HT 29 세포에 관한 것이다. 값은 0시간에서의 값으로 표준화된다.
도 4는 도 1에 나타낸 HDAC 효소 억제에 따른 제1일, 제5일, 제8일 및 제33일에 대한 CCDC43 유전자 발현 패턴의 약력학적 거동을 보여준다. 값은 발현 수준(Y 축)으로 측정되며, X 축은 각각의 치료 사이클의 시작 이후 수일 및 수시간으로 세분된 치료 사이클에 관한 것이다.
도 4b는 HCC 및 HL 환자의 혈액 세포에서 레스미노스타트에 의한 ZFP64 하향-조절을 보여준다. 진한 선은 레스미노스타트 600 ㎎(n=14 HCC+16 HL)의 1일 용량에 관한 것이며, 단속적인 선은 레스미노스타트 600 ㎎ + 소라페닙 400 ㎎(n= 19 HCC)의 1일 용량에 관한 것이고, 점선은 레스미노스타트 800 ㎎(n=15 HL)의 1일 용량에 관한 것이다. 제1일(좌측 패널) 및 제5일(우측 패널) 투여에서 상대적인 ZFP64 발현에 대한 데이터가 나타나 있다.
도 4c는 레스미노스타트(10 μM)로의 처치 후, 처치 이후 0, 2, 5 및 24시간에서의 다양한 암 세포주에서의 ZFP64 유전자 발현 데이터를 보여준다.
도 4d는 약물 또는 약물 병용의 투여 이후 4시간 및 2시간에 ZFP64의 발현의 배수 변화에 관하여, 간암 세포주 HepG2 및 동일한 건강한 공여자 유래의 전혈 및 PBMC의 레스미노스타트(5μM)("R") 또는 레스미노스타트(5μM) 및 소라페닙(5μM)의 병용("R/S")으로의 처치를 보여준다. 비교의 이유로, HepG2 세포에서의 siRNA 실험(ZFP64 낙다운)이 나타나 있다. 레스미노스타트 시료와 비교되는 siRNA 시료를 제외하고, 시료를 DMSO 대조군과 비교하고, 배수 변화를 결정한다.
도 5는 중간값(Y 축) 11.08(진행성 질병 환자: PD) 및 10.67(안정한 질병 환자: SD), 및 각각의 p-값 0.03(만-휘트니-검정(Mann-Whitney-test)에 기초)을 갖는, ZFP64에 대한 사이클 1, 제1일, 0시간에 SAPHIRE 임상 연구로부터 호지킨 림프종에서의 혈액 세포에서의 dCt 값에 대한 박스 플롯을 보여준다.
도 6은 ZFP64에 대한 사이클 1, 제1일, 0시간에 SHELTER 임상 연구로부터 HCC에서의 혈액 세포에서의 ZFP64 기준선 발현을 보여준다. 환자는 임상 결과에 의해 분리된다(PD 대 SD).
도 7은 PD 대 SD를 경험하는 SHORE 임상 연구로부터의 CRC 환자에서의 바이오마커 ZFP64 발현을 보여준다. 시료는 사이클 1, 제1일, 0시간(투여전)에 취한다.
도 8은 4SC 임상 시험(SAPHIRE, SHORE, SHELTER) 및 건강한 자원자를 비교하는 기준선에서의 ZFP64 dCt에 대한 임상 이익의 박스플롯을 보여주며; 각 임상 시험에 대한 데이터는 따로 나타나 있고, 환자는 SD 및 PD 그룹으로 분류된다.
도 9는 4SC 임상 시험 데이터 및 건강한 자원자를 비교하는 기준선에서의 ZFP64 dCt에 대한 임상 이익의 박스플롯을 보여주며; 모든 임상 시험(SAPHIRE, SHORE, SHELTER)에 대한 데이터가 통합되며, 환자는 SD 및 PD 그룹으로 분류된다.
도 10은 ZFP64를 위한 예후 영역에 대한 백분위수 순위 및 분할을 보여준다. 상위 1/3은 0.78의 예측률로 '임상 이익 부재(PD)' 그룹을 나타내며, 하위 1/3은 '임상 이익 그룹(SD)'을 0.69의 예측률로 보여준다. Y 축은 백분위수에 관한 것이며, X 축은 dCt에 관한 것이다. 각 경우에, X는 PD 환자를 표시하고, 점은 SD 환자를 표시한다.
도 11은 SHELTER 임상 연구로부터의 HCC에서의 혈액 세포에서의 ZFP64 기준선 발현을 보여준다. 환자는 전체 생존 길이에 관하여 40 및 60 백분위수 그룹으로 분리된다.
도 11b는 SHELTER 임상 연구로부터의 HCC에서의 혈액 세포에서의 ZFP64 기준선 발현을 보여준다. 환자는 무진행 생존 길이에 관하여 40 및 60 백분위수 그룹으로 분리된다.
도 12(XXX는 13b이었음)는 HCC 환자로부터의 SHELTER 임상 시험 데이터, 기준선에서의 ZFP64 발현 대 전체 생존(OS); ZFP64 상대적 발현의 분할을 위한 전체 생존(OS)의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 추정치를 보여준다 - 기준선 ZFP64 발현은 60 백분위수에서 분할된다(60% 고발현/40% 저발현). 진한 선은 기준선에서의 낮은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것이며, 단속적인 선은 기준선에서의 높은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것이다. 백색 원은 데이터 수집점에서 생존하는 환자에 관한 것이다.
도 12b는 레스미노스타트(600 ㎎) 또는 레스미노스타트(600 ㎎) 및 소라페닙(400 ㎎)의 병용을 받고 있는 HCC 환자로부터의 SHELTER 임상 시험 데이터를 보여준다. 기준선에서의 ZFP64 발현 대 전체 생존(OS); 75 백분위수(75% 고발현/25% 저발현)에서의 ZFP64 상대 발현의 분할을 위한 전체 생존(OS)의 카플란-마이어 추정치. 진한 선은 기준선에서의 높은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것이며, 점선은 기준선에서의 낮은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것이다. 백색 원은 데이터 수집점에서 생존하는 환자에 관한 것이며, 흑색 원은 추적에 실패한 환자에 관한 것이다.
도 13은 SHELTER 임상 시험 데이터 - 레스미노스타트(600 ㎎)를 받고 있는 HCC 환자; 기준선에서의 ZFP64 발현 대 전체 생존(OS)을 보여준다. 분할은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 계산하고, 오직 레스미노스타트(600 ㎎)를 받고 있는 환자의 특정 하위군에 기초한다. 진한 선은 기준선에서의 높은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것이며, 점선은 기준선에서의 낮은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것고, 단속적인 선은 전체 카플란-마이어 플롯에 관한 것이다. 백색 원은 데이터 수집점에서 생존하는 환자에 관한 것이며, 흑색 원은 추적에 실패한 환자에 관한 것이다.
도 14는 SHELTER 임상 시험 데이터 - 레스미노스타트(600 ㎎) 및 소라페닙(400 ㎎)을 받고 있는 HCC 환자, 기준선에서의 ZFP64 발현 대 전체 생존(OS)을 보여준다. 분할은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 계산하고, 오직 레스미노스타트(600 ㎎)를 받고 있는 환자의 특정 하위군에 기초한다. 진한 선은 기준선에서의 높은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것이며, 점선은 기준선에서의 낮은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것이고, 단속적인 선은 전체 카플란-마이어 플롯에 관한 것이다. 백색 원은 데이터 수집점에서 생존하는 환자에 관한 것이다.
도 15는 HCC 환자로부터의 SHELTER 데이터; 기준선에서의 ZFP64 발현 대 전체 생존(OS)을 보여준다. 파선은 기준선에서의 높은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것이며, 진한 선은 기준선에서의 낮은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것이고, 1점쇄선은 전체 카플란-마이어 플롯에 관한 것이다. 백색 원은 데이터 수집점에서 생존하는 환자에 관한 것이다. 좌측 패널은 레스미노스타트 단일요법 아암(arm)을 보여주고, 우측 패널은 레스미노스타트/소라페닙 병용 아암을 보여준다. 분할 값은 전체 연구 코호트로부터 취한다(평가가능한 환자: 레스미노스타트에 대하여 6명의 고발현/8명의 저발현, 병용 아암에 대하여 12명의 고발현/6명의 저발현). 도 16은 SAPHIRE 임상 연구로부터의 호지킨 림프종에서의 혈액 세포에서의 ZFP64 기준선 발현을 보여준다. 환자를 전체 생존 길이에 관하여 35 및 65 백분위수 그룹으로 분리한다.
도 17은 호지킨 림프종 환자로부터의 SAPHIRE 데이터; 기준선에서의 ZFP64 발현 대 전체 생존(OS)을 보여준다 - 기준선 ZFP64 발현은 65 백분위수(65% 고발현/35% 저발현)에서 분할된다. 진한 선은 기준선에서의 낮은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것이며, 단속적인 선은 기준선에서의 높은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것이다. 백색 원은 데이터 수집점에서 생존하는 환자에 관한 것이다.
도 18은 OS(SHORE 임상 시험)와 연관된 CRC 환자에서의 ZFP64 기준선 발현을 보여준다. 진한 선은 높은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것이고, 단속적인 선은 낮은 상대적 ZFP64 발현에 관한 것이다.
도 19는 중간값 9.15(PD) 및 8.67(SD), 및 각각의 p-값 0.03(만-휘트니-검정에 기초)을 갖는, DPP3에 대한 사이클 1, 제1일, 0시간에서의 dCt에 대한 박스 플롯을 보여준다.
도 20에서, DPP3을 위한 예후 영역에 대한 백분위수 순위 및 분할이 나타나 있다. 상위 1/3은 0.69의 예측률로 '임상 이익 부재(PD)' 그룹을 나타내며, 하위 1/3은 '임상 이익 그룹(SD)'을 0.64의 예측률로 보여준다. Y 축은 백분위수에 관한 것이며, X 축은 dCt에 관한 것이다. 각 경우에, X는 PD 환자를 표시하고, 점은 SD 환자를 표시한다.
도 21은 24시간 동안 0.1% DMSO(비히클 대조군) 또는 5 μM 레스미노스타트로 처치된 HepG2 세포에서의 ZFP64 핵 단백질 수준을 나타낸 것이다. 핵 분획을 단리한 후에, ZFP64 단백질 수준을 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출하였다. 히스톤 H3은 핵 로딩 대조군으로 사용한다. ZFP64 단백질 수준은 레스미노스타트의 첨가시에 감소되는 한편, 히스톤 H3 수준은 본질적으로 변경되지 않고 유지된다.
실시예
(E)-3-(1-(4-((디메틸아미노)메틸)페닐설포닐)-1H-피롤-3-일)-N-하이드록시아크릴아미드(INN: 레스미노스타트)는 최근에 개발된 하이드록사메이트 분류의 HDAC 억제제이다. 본 발명에 따른 바이오마커의 세트를 사용하여 인간 대상체로의 레스미노스타트의 경구 투여를 조사하고, 그의 약리학적 거동 및 효능을 결정하였다.
실시예 1: HDAC 억제
본 명세서에서 하기 기재된 방법을 사용하여 시료를 수득하고, 유전자 발현을 결정하였다. 전혈을 37℃에서 2시간 동안 형광 HDAC 기질 Boc-K(Ac)-AMC와 인큐베이션시켰다. 적혈구의 용해 후에, 나머지 세포를 -80℃에 보관하였다. HDAC 활성을 FLUOstar OPTIMA 플레이트 판독기를 사용하여 형광 분석에 의해 결정하였으며, 여기서, 세포를 세포 용해 및 탈아세틸화 기질로부터의 형광단의 생성을 야기하는 정의된 현상 시약(트립신 및 용해 완충제 함유)과 인큐베이션시켰다. 마지막으로, 투여전 수준에 비한 HDAC 활성의 억제를 계산하였다. 결과는 도 1에 나타나 있다.
HDAC 효소 활성의 억제는 일시적이며 시간 의존적이었으며, 1.0시간 내지 1.5시간의 레스미노스타트의 피크 혈장 수준 중간값에 상응하는 투여 후 2시간의 최대 억제를 갖는다. HDAC 효소 활성은 둘 모두의 용량 그룹에서 투여 후 2시간에 93%의 중간값까지 억제될 수 있었다.
실시예 2: 말초 혈액 세포 및 암 세포에서의 유전자 발현 간의 연관성
본 명세서에서 하기에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여, 시료를 수득하고, 유전자 발현을 결정하였다. 결과는 하기 표 3 및 도 2 및 도 3에 나타나 있다.
도 2 및 도 3에 요약된 결과는 바이오마커가 레스미노스타트로 처리된 암 세포주 및 건강한 공여자의 혈액 세포에서 동일한 방식으로 조절됨을 보여준다. 상기 값은 각각에 대하여 3회의 기술적 반복검증을 준비한 2회의 생물학적 반복검증에 기초하여 결정되는 평균 값을 나타낸다. 결과는 재현가능한 것으로 나타났다. 이는 말초 혈액에서의 상기 유전자의 유전자 발현이 이환 조직에서의 유전자 발현에 상응하는 것을 나타낸다. 말초 혈액 시료에서 결정되는 유전자 발현의 수준을 예를 들어, 각각의 특정 질병 및/또는 환자 그룹에 대하여 결정될 수 있는 적절한 전환 인자 또는 전환 표를 적용함으로써 이환 세포에서의 HDAC의 특정 수준의 활성과 연관시킬 수 있다.
도 4b는 HDAC 억제제 레스미노스타트가 암 환자에서 ZFP64 발현을 하향조절하는 한편, 소라페닙의 추가의 투여는 ZFP64 발현에 영향을 미치지 않는 것을 보여준다.
ZFP64로의 동일한 하향-조절 효과가 몇몇의 암 세포주에 대하여 도 4c에서 관찰될 수 있으며, 여기서, 레스미노스타트의 투여 후 0, 2, 5 및 24시간에서의 ZFP64의 발현 수준이 나타나 있다. 또한, 도 4d에서, ZFP64의 조절은 배수 변화에 관하여 나타나 있으며, 여기서, 암 세포주, 동일한 건강한 공여자 유래의 전혈 및 PBMC를 서로 비교하고, 추가로 HepG2 세포주에서의 ZFP64의 siRNA 낙다운과 비교한다. 동일한 경향의 하향조절이 모든 시료에 대하여 관찰될 수 있다. siRNA 시료의 일시적인 상향조절은 siRNA의 발현이 레스미노스타트 투여를 사용하는 시료와 비교된다는 사실에 기인한다. 전형적으로, siRNA에 의한 표적 유전자의 하향 조절은 소분자 억제제에 비하여 지연된다.
실시예 3: 암 환자로부터 수득되는 시료에서의 유전자 발현 분석
HDAC 효소 활성, H4 히스톤 아세틸화 및 유전자의 그룹의 유전자 발현을 용량 그룹 100 ㎎, 200 ㎎, 400 ㎎, 600 ㎎ 및 800 ㎎에서 측정하였다. 각 그룹은 상이한 유형의 종양을 갖는 3명의 환자로 이루어져 있다. 가장 높은 용량 그룹은 이러한 그룹 내의 처음 3명의 환자에서 1명의 환자의 용량-제한 독성[DLT](피로 및 구역 등급 3)으로 인하여 6명의 환자로 이루어져 있다. 치료 사이클은 본 명세서에 하기 기재된 SAPHIRE, SHELTER 및 SHORE 임상 시험에 대하여 상세화된 바와 같다.
약물 혈장 수준(PK 데이터)을 약물 용량 증가 동안의 HDAC 효소 억제와 연관시켰다. 분석에 의해, 200 ㎎ 용량 그룹에서 시작하여, 연장된 약물 효과가 나타났다. 이들 결과 때문에, 800 ㎎ 용량 그룹에 대한 SAPHIRE 시험에서 제8일에 추가의 시점을 수정하였다. HDAC 효소 활성이 이러한 용량 그룹에서 최대 41%까지, 그러나 광범위한 개별 억제 값으로 억제되는 것으로 나타낼 수 있다.
ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1에 상응하는 mRNA를 54.675 프로브 세트로부터 인간 칩(Human Chip) U133 v2.0(미국 산타 클라라 소재의 아피메트릭스 인코포레이티드(Affymetrix Inc.))을 사용한 유전자 칩 마이크로어레이 분석 및 이후의 qPCR을 통해 추출하였다. 이들 실험의 목적은 임상 반응과 관련될 가능성이 있는 인간 PBMC의 전사에 대한 HDAC 억제제 효과를 모니터링하기 위해 mRNA 바이오마커를 확인하는 것이었다. 추가의 선택 기준은 HDAC 억제제에 대한 높은 진폭 및 안정한 발현 신호를 갖는 대상 유전자의 상향- 및 하향-조절이었다.
3개의 유전자, 즉, 18sRNA, TBP 및 GAPDH를 정규화를 위한 하우스키핑 유전자로서 선택하였다(Entrez 유전자 ID는 하기에 상세화되어 있음).
임상 연구 설명
본 명세서에서 (E)-3-(1-(4-((디메틸아미노) 메틸)페닐설포닐)-1H-피롤-3-일)-N-하이드록시아크릴아미드(INN: 레스미노스타트) 메실레이트 염을 사용하는 임상 시험, 즉, 독일 소재의 4SC AG에 의한 SAPHIRE 임상 시험(추가의 참조를 위하여, http://clinicaltrials.gov/show/NCT01037478 참조), 독일 소재의 4SC AG에 의한 SHELTER 임상 시험(추가의 참조를 위하여, http://clinicaltrials.gov/ show/NCT00943449 참조), 및 독일 소재의 4SC AG에 의한 SHORE 임상 시험(추가의 참조를 위하여, http://clinicaltrials.gov/show/NCT01277406 참조) 동안 임상 데이터를 획득하였다. 각각의 연구 프로토콜의 짧은 설명은 하기에 상세화되어 있다.
공개 표지 단일 아암 SAPHIRE 시험에는 이전의 치료법 이후 진행되거나 치료에 불응성이었던 호지킨 림프종 환자를 포함시켰다. 레스미노스타트를 600 ㎎ 또는 800 ㎎으로 1일 1회 투여하였다. 환자를 하나의 14일 사이클을 구성하는, 연속 5일에 이어서 9일 무치료 기간(5+9 스케쥴)의 사이클에서 처치하였다. 환자는 PET/CT에 의해 그들의 병태의 평가를 겪었다. 연구의 일차 종점은 전체 목표 반응률(ORR)이었고, 이차 종점은 효능, 안전성 및 용인성, 및 1차 및 3차 치료 사이클 동안 투여 후 최대 6시간 동안의 둘 모두의 용량의 약동학의 분석을 포함하였다. 동일한 시점에, 약력학적 마커에 대한 상이한 용량의 레스미노스타트의 효과, 예를 들어, HDAC 효소 억제 및 선택된 표적 유전자의 유전자 발현의 변화를 말초 혈액 세포에서 결정하였다.
SHELTER 시험을 설계하여, 소라페닙에 대하여 불응성이었던 간세포 암(HCC)이 있는 환자에서 레스미노스타트의 치료에 대한 안전성, PK 및 효능을 평가하였다. 레스미노스타트를 단일요법으로, 그리고 소라페닙과 병용하여 조사하였다. 진행된 HCC(BCLC 병기 B/C)가 있는 환자를 멀티-센터, 2-아암 시험에 포함시켰다. 소라페닙 1차 치료법 하의 방사선학적 진행을 연구 참가 이전에 중앙 검토(RECIST)에 의해 확인해야 한다. 소라페닙(400 또는 800 ㎎)과 병용되는 레스미노스타트(200 내지 600 ㎎ 범위)의 용량 증가를 수행하였다. 아암 A는 약물 병용을 조사하고(레스미노스타트+소라페닙), 아암 B는 레스미노스타트(600 ㎎)의 단일요법을 조사하였다. 일차 목적은 12주(w) 후의 무진행 생존률(PFSR)이었다. 이차 목적은 안전성, 용인성, 종양 반응, PFS, TTP, OS 및 PK 및 바이오마커(BM)의 분석, incl. HDAC 효소 억제, 히스톤 아세틸화 및 말초 혈액에서의 유전자 발현을 포함하였다.
SHORE 임상 연구(4SC-201-3-2010)를 k-ras 돌연변이된 진행 대장 암종(CRC)이 있는 환자를 위해 확립된 2차 화학요법 섭생(FOLFIRI)과 병용되는 레스미노스타트의 안전성, 용인성, 약동학 및 효능을 평가하기 위한 단계 I/II 연구로 설계하였다.
주요 포함 기준은 다음을 포함하였다: 18세 이상의 연령, 조직학적으로 또는 세포학적으로 확인된 진행 또는 전이 k-ras 돌연변이된 대장암. 환자는 이전에 5-FU로의 치료를 받았으며, FOLFIRI로의 2차 치료에 적격해야 한다. 단계 I 부분을 위하여, k-ras 야생형 상태 및 이후의 차수의 치료도 또한 포함되게 하였다.
단계 I 부분의 일차 목표는 FOLFIRI와의 병용의 안전성, 용인성 및 약동학을 조사함으로써 FOLFIRI와 병용되는 레스미노스타트의 MTD를 결정하는 것이었다. 이차 목표는 8주 후의(4 사이클) 그리고 매 8주 후의, PFSR, PFS, TTP, 목표 반응의 개수, OS 및 DOR을 평가하는 것이었다. 추가로, HDAC 효소 억제, 히스톤 아세틸화, 유전자 발현 분석, 단백질 바이오마커 및 종양 마커, 예를 들어, CA 19-9 및 CEA를 포함하는 바이오마커를 조사하였다. 본 출원의 출원일에, 단계 I 후에 환자가 동원되지 않았으며, 연구를 http://clinicaltrials.gov에 "진행 중이나 동원하지 않음"으로 표시하였다.
단계 I 부분 동안, 3 내지 6명의 환자의 코호트에는 병용의 MTD를 결정할 때까지 FOLFIRI 치료의 표준 섭생과 병용되는 1일 200 내지 800 ㎎의 증가 용량의 레스미노스타트를 제공하였다. 각 14일 치료 사이클에서, 환자에 레스미노스타트를 연속 5일(제1일 내지 제5일)에 투여한 다음, 9일 휴지 기간(제6일 내지 제14일)을 행하였다. 제3일 및 제4일에, FOLFIRI 섭생의 화합물을 투여하였다.
본 특허 출원의 출원일에, 17명의 환자가 단계 I 부분에 등록되었다: 각각의 용량 수준 200 ㎎, 400 ㎎ 및 600 ㎎ 레스미노스타트 + FOLFIRI에서 3명 및 용량 수준 400 ㎎ 레스미노스타트 BID + FOLFIRI에서 8명의 환자.
재료 및 방법
시료
환자로부터 2.5 ㎖의 전혈을 적혈구를 용해시키고, RNAase에 의한 분해로부터 RNA를 안정화시키고, 유전자 발현의 생체외 변화를 최소화시키기 위한 화학물질을 함유하는 PAXgene™ 튜브(비디 바이오사이언스즈(BD Biosciences))에서 수집하였다. 시료를 20℃ 내지 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 전체 RNA를 정제할 때까지 -20℃에서 동결시켰다.
시료 수집을 위한 바람직한 프로토콜은 하기에 기재되어 있다:
모든 절차를 얼음 위에서 행하였다. 하기의 단계를 수행하였다:
정맥혈 시료(2 ㎖)를 표지된 K-EDTA 진공채혈기(예를 들어, 모노베츠(monovettes)®)에 수집한다. 시점 "0시간"은 투여 직전의 시간을 나타낸다(투여전 시료).
사이클 1, 제1일: 0시간(투여전); 2시간; 5시간
사이클 1, 제5일: 0시간(투여전); 2시간; 5시간
사이클 1, 제8일: 0시간(투여전)
사이클 3, 제5일: 0시간(투여전); 2시간; 5시간
달리 언급하지 않는 한, 허용되는 시차는 +/- 10분이다.
PBMC 단리:
필요한 재료
● 표지된 류코셉(Leucosep)™ 튜브(그레이너 바이오-원(Greiner bio-one))(사용할 때까지 +4 내지 +8℃ 및 암 중에 보관하고, 사용 전에 실온으로 가온시켜야 함)
● 표지된 15 ㎖ 튜브(예를 들어, PP 튜브, 예를 들어, 팔콘(Falcon)® 튜브)
● 표지된 2 ㎖ 튜브(예를 들어, PP 튜브)
● 적혈구 용해 완충제(퀴아젠(Qiagen) 79217)(사용할 때까지 실온에 보관해야 함)
● PBS(사용할 때까지 실온에 보관해야 함)
● RIPA 완충제(써모 사이언티픽 89900)(사용할 때까지 4℃에 보관해야 함)
● 10 ㎕ 분취액으로 제공되는 프로테아제 억제제 칵테일 원액(써모 사이언티픽 87785)(사용할 때까지 -80℃에 보관해야 함)
시료 처리
1) 치료될 7 ㎖의 시트르산염 혈액(응집을 억제하기 위한 통상적으로 알려져 있는 절차에 의해 시트르산염으로 처리된 혈액 시료)을 즉시 사용형 류코셉™ 튜브로 옮긴다.
2) 실온에서 브레이크 없이 800 g에서 15분 동안 원심분리한다.
3) 대략 2 ㎖의 혈장 상청액(혈소판 함유)을 제거하여, PBMC 계면 위에 최대 5 ㎜를 남긴다.
4) 다공성 장벽 위의 완전히 안정된 상청액을 피펫팅에 의해 원심분리에 적합한 표지된 15 ㎖ PP(예를 들어, 팔콘®) 튜브로 전달한다.
5) 10 ㎖의 PBS(실온)를 첨가하고, 혼합한다.
6) 실온에서 브레이크를 사용하여 400 g에서 7분 동안 원심분리한다.
7) 대략 0.5 ㎖의 안정 부피의 PBS를 제외하고 상청액을 제거하고, 세포를 재현탁시킨다.
8) 1.5 ㎖의 Erylysis(적혈구 용해)-완충제(퀴아젠 79217)를 첨가하고, 용해를 위해 실온에서 4분 동안 인큐베이션시킨다.
9) 10 ㎖의 PBS를 첨가하여, Erylysis(적혈구 용해)를 중단시킨다.
10) 실온에서 400 g에서 7분 동안 원심분리한다.
11) 상청액을 제거하고, 14 ㎖의 PBS 중에 세포를 재현탁시킨다.
12) 실온에서 400 g에서 7분 동안 원심분리한다.
13) 상청액을 제거하고, 4.5 ㎖의 PBS 중에 세포를 재현탁시킨다.
14) 세포 현탁액으로부터 3개의 동일한 분취액(3×1.5 ㎖)을 표지된 2㎖ 튜브로 옮긴다.
15) 실온에서 400g에서 7분 동안 원심분리한다.
16) 하기의 절차에 따라 상청액을 완전히 제거한다: 튜브를 45도 각도로 기울여, 세포 펠렛이 위를 향하게 하고, 겔 로더 팁(gel loader tip)을 사용하여 세포 펠렛의 맞은편의 액체를 제거한다. 얼음에 둔다.
17) 1000 ㎕의 차가운 RIPA-완충제를 한 튜브의 프로테아제 억제제 칵테일 원액으로 옮기고, 혼합한다.
18) 50 ㎕의 이러한 프로테아제 억제제 칵테일 용액을 3개의 분취된 세포 펠렛 각각으로 옮기고, 간단히 혼합한다.
19) 펠렛을 즉시 -80℃에 보관한다.
세포 HDAC 효소 활성 검정 프로토콜
필요한 재료
● 표지된 15 ㎖ 튜브(예를 들어, PP 튜브, 예를 들어, 팔콘® 튜브)
● 표지된 2 ㎖ 튜브(예를 들어, PP 튜브)
● 적혈구 용해 완충제(퀴아젠 79217)(사용할 때까지 실온에 보관)
● DMSO 중 40mM Boc-K(Ac) AMC 원액(바켐(Bachem): I-1875)(사용할 때까지 -80℃에 보관)
시료 처리
1) 1 ㎖의 시트르산염 혈액을 15 ㎖의 표지된 튜브에 첨가한다.
2) 5 ㎕의 40 mM Boc-K(Ac) AMC를 1 ㎖ 시트르산염 혈액에 첨가한다(최종 농도: 200 μM Boc-K(Ac) AMC).
3) 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션시킨다(37℃).
4) 5배 부피(5 ㎖)의 4℃의 차가운 적혈구 용해 완충제(EL 완충제, 퀴아젠 79217)를 첨가한다.
5) 진탕기에서 간단히 혼합한다.
6) 적어도 15분 동안 얼음에서 인큐베이션시키고, 그 사이에 플레이트 진탕기에서 2회 혼합한다.
7) 7 ㎖의 4℃ EL 완충제를 첨가한다.
8) 4℃, 400 g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한다.
9) 2배 부피(2 ㎖)의 4℃ EL 완충제를 첨가하고, 간단히 혼합한다.
10) 4℃, 400 g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거한다.
11) 2배 부피(2 ㎖)의 4℃ EL 완충제를 첨가하고, 간단히 혼합한다.
12) 시료추출을 위해 정확한 시점으로 표지된 2 ㎖ 튜브를 가져온다.
13) 환자 번호를 튜브 표지에 기재한다.
14) 2개의 1 ㎖ 분취액(분취 전에 피펫을 사용하여 다시 혼합)을 제조한다.
15) +4℃, 400 g에서 10분 동안 원심분리하고, 하기의 절차에 따라 상청액을 완전히 제거한다. 튜브를 45도 각도로 기울여, 세포 펠렛이 위를 향하게 하고, 겔 로더 팁을 사용하여 세포 펠렛의 맞은편의 액체를 제거한다.
16) 시료를 -80℃에서 동결시킨다.
세포주 및 PBMC로부터의 RNA 단리
시료, 예를 들어, 세포를 예를 들어, 기계적으로(예를 들어, 초음파 분해) 또는 화학적으로(예를 들어, 세제, 예를 들어, 도데실황산나트륨, 구아니딘 이소티오시아네이트 사용) 파괴하여, RNA에 접근되게 한다. RNA, DNA, 단백질 및 다른 엔티티를 함유하는 세포 용해물로부터 RNA를 추출하기 위하여, 상이한 방법, 예를 들어, 유기물질(예를 들어, 페놀/클로로포름)을 사용하는 추출 방법, 필터-기반의 회전 배스킷 형식(예를 들어, 핵산이 결합하는 유리 섬유, 유도체화 실리카 또는 이온 교환 멤브레인), 자성 입자 방법(상자성 코어 입자 및 실리카와 같이 핵산에 결합하도록 변형된 주변의 쉘이 있는 입자) 및 직접 용해 방법(예를 들어, 시료를 파괴하고 핵산을 안정화시키는 용해 완충제 제형 사용)을 사용할 수 있다.
상이한 암 세포주 및 PBMC에서 ZFP64의 RNA 발현 수준을 결정하기 위하여, 세포 막을 세포를 용해시키고, 실리카 멤브레인으로의 RNA의 결합을 지지하는 구아니딘 이소티오시아네이트를 함유하는 완충제를 사용하여 화학적으로 파괴하고, RNA를 필터-기반의 회전 컬럼을 통해 추출하였다.
PaxGene 프로토콜
1) 2개의 표지된 PaxGene® 튜브(퀴아젠 79217)(사용할 때까지 실온에 보관해야 함)를 시점 및 환자마다 취한다.
2) 2 ㎖의 혈액의 첨가 후에, 튜브를 10회 역위시킴으로써 튜브를 혼합한다.
3) 실온에서 2시간 동안 혈액으로 채워진 튜브를 인큐베이션시킨다.
4) 튜브를 -20℃ 동결기로 옮긴다.
5) 혈액 함유 튜브를 배송 전 적어도 24시간 동안 -20℃에서 보관한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, RT는 실온을 의미하며, 이는 전형적으로 21 내지 25℃ 범위이다.
바람직한 바이오마커 측정 방법은 유럽 특허 출원 제12179187.5호에 기재되어 있다.
전혈 시료로부터의 RNA 단리
전체 RNA를 제조처의 지침에 따라 (퀴아젠사의 PAXgene™ 혈액 miRNA 키트 또는 PAXgene™ 혈액 RNA 키트와 같은) 전혈 시료에 적합한 회전 컬럼 기반의 기술을 사용하여 PAXgene™ 완충제에서 안정화된 전혈 시료로부터 단리하였다. 정제를 (PAXgene™ 혈액 RNA) 튜브에서 핵산을 펠렛화시키기 위한 원심분리 단계로 시작하였다. 재현탁된 펠렛을 단백질 분해를 야기하기 위한 프로테이나제 K와 함께 RNA 안정성의 유지를 위해 최적화된 완충제에서 인큐베이션시켰다. PAXgene™ 쉬레더(shredder) 회전 컬럼을 통한 추가의 원심분리를 수행하여, 세포 용해물을 균질화시키고, 잔류 세포 데브리스(debris)를 제거하고, 통과 유동 분획의 상청액을 새로운 마이크로원심분리 튜브로 옮겼다. 에탄올을 첨가하여, 결합 조건을 조정하고, 용해물을 PAXgene™ RNA 회전 컬럼에 적용하였다. 간단한 원심분리 동안, 오염물질이 통과함에 따라, RNA가 PAXgene™ 실리카 멤브레인에 선택적으로 결합하였다. 잔여 오염물질을 몇몇의 효율적인 세척 단계에서 제거하였다. 제1 및 제2 세척 단계 사이에, 멤브레인을 본 명세서에서 1.3에 하기 기재된 바와 같이, DNase I으로 처리하여, 미량의 결합된 DNA를 제거하였다. 세척 단계 후에, RNA를 뉴클레아제 미함유 물 중에 용리시키고, 열-변성시켰다.
추가의 DNase 분해 및 세정
RNA의 순도를 향상시키기 위하여, RNase-미함유 DNase 세트(퀴아젠)를 사용하여 추가의 용액 중 DNase 분해를 수행하였다. 약술하면, 용리된 RNA를 실온에서 10분 동안 6.81 쿠니츠(Kunitz) 유닛 RNase 미함유 DNase I과 인큐베이션시켰다. 쿠니츠 유닛은 DNase I을 측정하기 위해 통상적으로 사용되는 유닛이며, 이는 기질로서 고도로 중합된 DNA를 사용하여, 25℃, pH 5.0에서 밀리리터당 분당 0.001의 A260의 증가를 야기하는 DNase I의 양으로 정의된다(문헌[Kunitz, M. [1950] J. Gen. Physiol. 33, 349 and 363]). 이어서, 시료를 회전 컬럼 기반의 기술을 사용하여 정제하였다(퀴아젠사의 RNeasy® 미니 키트).
RNA 농도 및 순도의 측정
각각의 전체 RNA 시료의 분취액을 사용하여, 분광광도계(나노드롭(NanoDrop)® ND-1000 분광광도계(peqlab))에서 RNA 농도 및 순도를 측정하였다.
RNA 무결성 조절
RNA 무결성을 시험하였으나, 주어진 시료에 대하여, RNA 품질이 시료에서 측정된 모든 RNA에 대해 비슷하기 때문에, 임의의 가능한 변이를 균등하게 하는 것은 필수는 아니다. 전체 RNA 농도에 따라 RNA 6000 나노(Nano) 또는 RNA 6000 피코(Pico) 랩칩(LabChip) 키트(아질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies))를 사용하여 2100 바이오어널라이저(Bioanalyzer)(아질런트 테크놀로지즈)에서 모든 시료를 분석하였다.
2100 바이오어널라이저는 모세관 전기영동에 의해 전체 RNA 시료의 분석을 가능하게 한다. RNA를 단편 크기에 따라 분리하고, 결과를 전기영동도(electropherogram) 및 가상의 겔 이미지로 복귀시킨다.
RNA 품질에 대한 지표, 소위 RIN(RNA 무결성 수)은 전기영동 프로파일로부터 유래된다. RIN 스케일은 1 내지 10 범위이다. 10의 RIN은 뛰어난 RNA 품질을 나타내는 한편, 1의 RIN은 대량의 분해를 나타낸다. RIN 계산을 위하여, 알고리즘은 28S/18S-rRNA 비에만 의존하지 않고, 전체 전기영동 프로파일(예를 들어, 짧은 분해된 RNA 종, 예를 들어, 약 20개 뉴클레오티드 길이의 분획)을 고려한다(문헌[Schroeder et al., 2006, BMC Molecular Biology 7:3]).
역전사
고용량 cDNA 역전사 키트(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 제조처의 지침에 따라 랜덤 헥사머 프라이머의 도움으로, 단일 가닥 cDNA로의 전체 RNA의 역전사를 위해 사용하였다. 약술하면, 반응 믹스를 위하여, 전체 RNA를 과잉의 4 mM dNTP 믹스, 2.5 U/반응, 역전사효소 및 뉴클레아제 미함유 물에서 랜덤 프라이머와 혼합하였다. 역 전사를 하기의 조건하에 써멀 사이클러(thermal cycler)에서 행하였다: 25℃에서 10분, 37℃에서 120분, 85℃에서 5분에 이어서 4℃에서 반응물 냉각. 역전사는 또한 원칙적으로 다른 역전사효소, 프라이머 및 온도 프로토콜을 사용하여 행할 수 있다. 가능한 경우에는 언제나, 250 ng의 전체 RNA를 역 전사시켰으며, 이용가능하지 않다면, 더 적은 양을 사용하였다.
커스텀 (Custom) 택맨 ® 어레이에서의 정량적 리얼 -타임 PCR
형식 16에서 커스텀 택맨® 어레이(어플라이드 바이오시스템즈)를 표 4에 요약된 바와 같은 본 발명의 바이오마커 및 하우스키핑 유전자의 유전자 발현 분석을 위해 설계하였다. 이들 어레이는 카드마다 8개 시료의 qPCR 분석을 가능하게 한다. 물론, 모든 반응은 또한 특이적인 프라이머를 사용하는 통상적인 qPCR 분석에 의해 행해질 수 있다.
[표 4]
Figure pct00006
미세유체 카드에 포트마다 택맨® 유전자 발현 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템즈) 및 200 ng 또는 더 이상 이용가능하지 않다면 그 미만의 cDNA를 로딩하였다.
반응 믹스를 각각 330 g 및 4℃에서 1분 동안 2회 원심분리함으로써 반응 챔버로 옮겼다. 밀봉 후에, 미세유체 카드를 AB7900HT 기기(어플라이드 바이오시스템즈)에서 작동시켰다. 소프트웨어 SDS 2.4(어플라이드 바이오시스템즈)를 기기 조절, 데이터 획득 및 미가공 데이터 분석을 위해 사용하였다. 플레이트를 상대 정량화(ΔΔCt) 방식으로 작동시키고, 하기의 온도 프로파일을 사용하였다:
50℃/2:00분 - 94.5℃/10:00분 - 40 사이클 동안 [97℃/0:30분 - 59.7℃/1:00분].
핵 단백질 추출 및 웨스턴 블롯 분석
Figure pct00007
Figure pct00008
일차 항체:
Figure pct00009
이차 항체:
Figure pct00010
씨딩 4시간에, HepG2 세포를 0.1% DMSO 또는 5 μM 레스미노스타트로 처리하였다.
레스미노스타트 처리 24시간에, 세포를 PBS로 1회 세척한 후에, 스크레이핑(scraping)하고, 차가운 PBS에 수집하고, 세포를 사전-냉각된 15 ㎖ 팔콘 튜브로 옮겼다.
세포질 및 핵 추출물을 제조하기 위하여, 먼저 저장성 완충제에서의 재현탁에 의해 세포 팽윤을 야기한다. 그 후에 세제(예를 들어, Nonident P-40)를 첨가하는데, 이는 세포막을 파괴하고, 이에 의해 세포질 분획으로의 접근을 가능하게 한다. 세포 분별은 원심분리 및 세포질 추출물의 제거에 의해 수행된다. 그 후에, 핵을 핵 추출 완충제를 사용하여 용해시킨다.
세포질 추출 완충제: 10 mM HEPES, 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, pH 7.6으로 조정; 세제: 0.075% (v/v) NP-40; 핵 추출 완충제: 20 mM Tris Cl, 420 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 1 mM PSMF, 25% (v/v) 글리세롤, pH 8.0으로 조정.
아브노바 핵 추출 키트를 사용한 완충제의 제조:
PBS/인산염 억제제 용액(1×)
Figure pct00011
저장성 완충제(1×)
Figure pct00012
추출 완충제(1×)
Figure pct00013
핵 추출을 하기와 같이 제조처에 의해 기재된 바와 같이 제조하였다(아브노바, 카탈로그 번호 KA1346):
- 300 xg, 5분, 4℃에서 현탁된 세포의 원심분리
- 상청액을 폐기하고, 3 ㎖의 빙냉 PBS/포스파타제 억제제 용액 중 펠렛의 재현탁
- 300 xg, 5분, 4℃에서 원심분리
- 상청액을 폐기하고, 3 ㎖의 빙냉 PBS/포스파타제 억제제 용액 중 펠렛의 재현탁
- 300 xg, 5분, 4℃에서 원심분리
- 상청액을 폐기하고, 250 ㎕의 빙냉 저장성 완충제를 첨가하고, 혼합하고, 재현탁된 펠렛을 사전-냉각된 1.5 ㎖ 튜브로 전달
- 얼음에서 15분 동안 인큐베이션
- 50 ㎕의 10% Nonident P-40을 첨가하고, 피펫팅에 의해 온건하게 혼합
- 30초, 4℃에서의 원심분리
- 상청액(세포질 분획 함유)을 새로운 튜브로 전달
- 펠렛을 50 ㎕의 빙냉 핵 추출 완충제 중에 재현탁시키고, 15초 와류시키고, 얼음에서 15분 동안 로킹(rocking)하고, 30초 동안 와류시키고, 얼음에서 15분 동안 로킹
- 14000 xg, 10분, 4℃에서의 원심분리
- 상청액(핵 분획 함유)을 신규한 튜브로 전달
- 세포질 및 핵 시료를 -80℃에서 보관
각 핵 시료로부터, 4.4 ㎍의 단백질(BCA 단백질 검정을 통해 측정)을 동량의 트리신 완충제(β-머캅토에탄올 보충)에 첨가하고, 95℃에서 5분 동안 가열한 다음, 얼음에 두었다. 시료-트리신 완충제 믹스를 프리캐스트 12% 비스-트리스 겔의 웰에 적용하였다. 겔을 80 내지 110 V에서 전개하였다.
블롯팅 페이퍼 및 PVDF 멤브레인(메탄올에서 간단히 활성화)을 블롯팅 완충제에 침지시키고, 블롯팅 장치에 적층하였다. 겔을 일정 180 mA를 사용하여 45분 동안 멤브레인에 블롯팅하였다. 그 후에, 멤브레인을 슈퍼블록 T20(PBS) 블로킹 완충제를 함유하는 플라스틱 박스에 두고, 실온에서 2시간 동안 진탕시키면서 인큐베이션시켰다. 멤브레인을 적절한 크기로 절단한 후에, 이들 멤브레인 조각을 항체 표에 기재된 바와 같이 희석된, 각각의 일차 항체를 함유하는 10 ㎖의 1/10 희석된 슈퍼블록 T20 블로킹 완충제 중에 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다.
다음날, 세척 완충제를 사용하여 4회 세척한 후에, 멤브레인을 1/50,000 희석된 상응하는 호스래디쉬 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 항-토끼 IgG 이차 항체 및 1/1,000 희석(10 ㎖의 1/10 희석 슈퍼블록 T20 블로킹 완충제 중에 희석)된 항-비오틴과 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 완충제를 사용하여 4회 세척한 후에, 향상된 화학발광을 사용하여 HRP 신호를 검출하고 X-선 필름에 노출시켰다. 이후에, 필름을 Gel Doc 2000을 사용하여 스캐닝하고, "Quantity One" 소프트웨어(바이오라드)를 사용하여 상응하는 신호를 정량화하였다.
데이터 분석
분석 설정
다운스트림 분석을 위하여, 384-웰 미세유체 카드의 리얼-타임 PCR 시행을 소프트웨어 RQ 매니저(Manager) 1.2.1(어플라이드 바이오시스템즈)에 로딩하였다. 개별 연구(*.sdm 파일)를 각각의 시험된 환자에 대하여 생성하였다.
각각의 웰에 있어서, Ct 값(사이클 역치), 즉, 증폭 곡선이 명백하게 백그라운드를 초과하고, 지수 곡선이 선형 상태인 사이클 수를 소프트웨어 RQ 매니저 1.2.1에서 계산하였다. 가능한 경우는 언제나 기계의 설정 "Automatic Ct"를 사용하고, 모든 수동의 설정은 증폭 플롯의 검사에 기초하여 정하였다. 이어서, 생성된 Ct 값을 각 시료/검정 조합의 3벌의 측정에서 평균을 내어, Ct Avg 값을 생성하였다. 관련된 변이(Ct Avg의 평균의 표준 오차와 등가인 Ct SD)를 소프트웨어 RQ 매니저 1.2.1의 알고리즘을 사용하여 계산하였다.
품질 필터링 (기술적 균일성)
각 웰의 미가공 신호, 즉 6-FAM(6-카르복시플루오레세인) 신호 및 ROX(6-카르복실-X-로다민) 신호(마스터 믹스에 함유된 수동 참조 염료(passive reference dye))를 면밀히 조사하였다. 불규칙성(예를 들어, 곡선에서의 예상되지 않은 버클(buckle) 또는 이동)이 관찰되는 경우에 언제나, 가공된 신호 및 생성된 증폭 플롯에 대한 영향을 점검하였다. 불규칙한 미가공 신호를 갖는 웰을 필요에 따라 다운스트림 분석으로부터 생략하였다.
추가로, 각 시료/검정 조합의 3벌의 측정의 균일성을 Ct SD 값에 기초하여 평가하였다. 0.25 이하의 품질 필터 Ct SD를 적용하였으며, 이는 Ct SD 값이 0.25 초과인 것으로 관찰된 경우에는 언제나, 3벌의 웰의 증폭 플롯을 면밀히 검사한 것을 의미한다. 이상점(outlier) 웰, 즉, 다른 반복검증에 비하여 1 초과의 dCt가 관찰되는 경우에는 언제나, 그것을 추가의 분석으로부터 배제하였다. 그러한 이상점은 반응 챔버의 불충분한 충전, PCR 동안의 불규칙적인 과정, 예를 들어, 작은 기포의 버스팅(bursting) 또는 제조자에 의해 야기되는 생성 오차에 의해 야기될 수 있다.
표적 유전자 발현이 낮고(예를 들어, 32 초과의 Ct), 출발 분자 개수가 매우 제한되면(분자 및 qPCR 검정에 따라, 1,000 내지 10,000 카피), 확률적 영향은 PCR 증폭 과정에 우세한 영향을 가하여, 가변적인 Ct 값을 초래한다. 특히 32 초과의 Ct 값에 있어서, 기술적 반복검증 측정의 낮은 재현성이 관찰된다. 이러한 이유로, 높은 Ct 값 및 0.25 초과의 Ct SD를 갖는 3벌의 웰을 분석으로부터 배제하지 않았다. 그러나 그들의 결과는 주의하여 해석해야 한다.
Ct 값이 32 미만이나, Ct SD 값이 0.25 초과이고, 명백한 이상점을 확인할 수 없는 경우, 3개 모두의 데이터 점을 다운스트림 계산을 위해 사용하였다.
상대 발현 수준의 계산
ΔΔCt 방법을 적용하여, 표적(바이오마커) 전사물의 상대 발현 수준을 계산하였다. 이러한 방법은 표적 유전자의 유전자 발현을 하나 이상의 하우스키핑 유전자의 발현에 대해 표준화시킨 다음, 그것을 교정(참조) 시료 또는 그룹에서 표적 및 하우스키핑 유전자의 유전자 발현과 관련시킨다.
ΔΔCt 방법의 기본 개념:
제1 단계에서, 시료 A에서의 유전자의 3벌의 측정의 Ct 값의 평균을 내어, Avg Ct 값을 생성하였다. 표적 유전자의 Avg Ct 값과 하우스키핑 유전자의 Avg Ct 값 간의 차이를 계산한다(ΔCt 값). 이후에 시료 A의 ΔCt 값과 교정 시료의 ΔCt 값의 차이를 계산한다(ΔΔCt 값).
식 2- ΔΔCt에 기초하여, RQ 값(상대량)을 결정하고, 이는 교정 시료에 비한 시료 A에서의 표적 유전자의 상대 발현을 나타낸다. 교정 시료는 모든 표적 유전자에 대하여 1,000의 RQ 값을 얻는다. RQ 값은 X-배 변화 값과 등가이다.
기본 ΔΔCt 계산을 RQ 매니저 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 상이한 상대 정량화 연구의 결과를 하우스키핑 유전자로서 18S 및 교정 시료로서 각 환자의 제1 시료(사이클 1, 제1일, 0시간)를 사용하여 계산하였다.
몇몇의 하우스키핑 유전자를 구현하기 위한 ΔΔCt 방법의 변형:
R / 바이오컨덕터(Bioconductor) 패키지 ddCt(v1.5.0, http://www.bioconductor.org/ packages/bioc/ html/ddCt.html; Authors: Jitao David Zhang, Rudolf Biczok and Markus Ruschhaupt)를 상대 발현 수준의 진전된 계산을 위해 구현하였다. 이러한 툴은 몇몇의 하우스키핑 유전자를 조합하기 위한(그리고, 또한, 필요에 따라, 몇몇의 시료를 교정(참조) 그룹으로 통합하기 위한) 접근법을 제공한다.
하기의 계산 단계를 ddCt 스크립트에 의해 수행한다:
각 유전자-시료 조합에 대한 기술적 반복검증의 평균을 계산하고, MeanCt로 칭한다. (ddCt로부터의 원래 출력 표에서, 이러한 열은 간단히 'Ct'로 칭한다. 그를 개별 기술적 반복검증의 Ct 값으로부터 더 잘 식별하기 위하여, 그를 ddCt 분석 후에 "MeanCt"로 재명명하였다).
모든 하우스키핑 유전자의 MeanCt 값의 평균을 각 시료에 대하여 계산한다.
모든 하우스키핑 유전자의 MeanCt 값의 평균을 유전자 Gene1의 상응하는 MeanCt 값으로부터 제한다. 생성된 값을 dCt로 칭한다.
유전자 Gene1에 있어서, (적용가능하다면) 모든 참조 시료의 dCt 값의 평균을 계산한다.
모든 참조 시료의 생성된 평균 dCt 값을 시료 A에서의 Gene1의 상응하는 dCt 값으로부터 제한다. 생성된 값을 ddCt로 칭한다.
변환 x → 2-x를 각각의 ddCt 값에 적용한다. 생성된 값을 exprs로 칭한다. 이러한 값은 상대 발현 수준 또는 X-배 변화와 등가이다.
각각의 값에 대하여, 오차를 계산하며, 이는 평균의 표준 오차에 기초한다.
이러한 분석을 각 환자에 대하여 개별적으로 수행하였다. 제1 시료(사이클 1, 제1일, 0시간)을 참조 시료로 사용하였다. 'exprs' 값은 개별 시료에 대한 상대 발현 수준(배수 변화 값)을 나타낸다.
중간값/평균 유전자 발현 값
데이터 분포에 따라, 중간값 또는 평균 값을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 환자에 대한 발현 수준의 분포가 비-정규 분포인 경우에, 본 실시예에서와 같이, 중간값이 통상 평균 값에 비해 바람직하며, 이에 따라, 가능한 편중 데이터 분포를 설명한다. 유전자 발현의 반복적인 거동을 입증하기 위하여, 치료 기간에 걸쳐 발현 수준을 보여주기 위한 예가 제공된다[도 4].
600 ㎎ 또는 800 ㎎ 레스미노스타트 메실레이트 염의 1일 용량에서의 치료 제5일(사이클 1, 제5일, 0, 2 및 5시간)에 대한 발현 수준 중간값을 포함하는 표 5가 하기에 제공된다.
[표 5]
Figure pct00014
실시예 3a: SD/PD와 연관된 ZFP64 유전자 발현
예후 마커로서의 ZFP64
통계 소프트웨어 R(문헌[R_Core_Team, 2012. R: A language and environment for statistical computing]. [온라인] http://www.R-project.org에서 이용가능)을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다.
유전자 ZFP64의 기준선 발현(사이클 1, 제1일, 0시간)의 통계적 분석에 의해, ZFP64 기준선 유전자 발현에 기초하여, 환자가 2개의 그룹, 즉, a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과를 보여주는 것으로 예상되는 환자 및 b) 본 명세서에 기재된 바와 같은 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과를 보여주는 것으로 예상되지 않는 환자로 분리될 수 있음이 드러났다. ZFP64 유전자 발현에 대한 기준선에서의 차이는 발현 수준이 아닌 dCt 값을 사용함으로써 검출가능하다(2개 사이의 수학적 연결성에 대하여, 'ΔΔCt 방법의 기본 개념' 참조, 상기 참조). 도 5는 그들의 각각의 중간값, 사분범위(25 내지 75 백분위수) 및 데이터 범위를 갖는 SAPHIRE 임상 연구로부터의 2개의 환자 그룹의 박스 플롯을 보여준다. 웰치(Welch) 2개 시료 t-검정에 따르면, 2개의 그룹 간의 차이에 대한 p-값(양측)은 0.03이다.
따라서, 도 6 및 도 7에서, 각각의 플롯은 SHELTER(p-값 = 0.04) 및 SHORE(p-값 = 0.06) 임상 연구에 대하여 나타나 있으며, 이는 레스미노스타트 치료 하의 마커로서의 ZFP64의 적용가능성을 나타낸다. 추가로, 건강한 공여자로부터 혈액 시료를 취하고, 임상 연구를 위하여 mRNA 발현을 상기 기재된 바와 같이 측정하였다. 건강한 공여자로부터의 dCt 값은 안정한 질병(SD)을 갖는 환자의 각각의 중간값이 건강한 공여자의 중간값에 보다 근접한, 임상 시료의 발현 범위 내에 있었다. 이것은 개별 연구에 대하여 도 8에, 그리고 모든 연구의 조합으로서 도 9에 박스 플롯 다이어그램으로 나타나 있다.
바이오마커로서 ZFP64의 예후 값을 고려하여, dCt 값의 백분위수 순위에 기초하여 3개의 예후 능력의 그룹으로의 분리가 가능하다(도 10 참조). 71 백분위수 이상을 포함하는 범위의 dCt 값은 0.78의 정밀도(9개 중 7개)로, HDAC 억제제 치료가 긍정적인 결과를 야기하지 않는 것을 나타낸다. 51 백분위수 이하를 포함하는 범위의 dCt 값은 0.69(16개 중 11개) 정밀도로, HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과를 나타낸다. 51 백분위수 및 71 백분위수를 포함하지 않는 그 사이의 범위의 dCt 값은 결정적인 예후 표시를 제공하지 않는다. 상기 기재된 바와 같은 dCt 값의 백분위수 범위는 HDAC 억제제 치료를 받고 있는 모든 환자에 대한 유전자 발현의 전체 분포에 관한 것이다.
실시예 3b: OS/ PFS와 연관된 ZFP64 유전자 발현
분할 방법
실시예 3a의 분석에 나타낸 결과 및 표시에 기초하여, 기준선에서의 ZFP64의 dCt 값을 유전자 발현 그룹 간의 분할을 결정하기 위해 본 명세서에 기재된 방법으로 처리하였다. 데이터를 다음과 같이 처리하였다: 대상 유전자의 유전자 발현 데이터를 특정 시점, 예를 들어, 치료 시작 이전의 기준선에서의 하우스키핑 유전자의 발현에 비한 리얼 타임 PCR dCt 값으로 수집하였다. 환자 코호트를 대상 유전자에 대한 dCt 값의 정의된 백분위수(5 백분위수의 단계로, 총 25 백분위수 내지 85 백분위수)에서 2개의 그룹으로 단계적으로 분할하였다: 서로에 대해 낮은 및 높은 값. 그 다음, 상기 2개의 그룹을 OS, PFS에 대한 카플란-마이어 분석에서 비교하여, OS, PFS에 대한 환자의 확률을 분리하는 통계적으로 유의미한 차이를 확인하였다.
도 10의 데이터 및 백분위수 순위 및 상기 기재된 바와 같은 분할 방법에 기초하여, 저발현 및 고발현 그룹은 도 11 및 도 11b에 나타내고, 그에 대해 상세화된 바와 같이 정의된다.
상기 분할을 SHELTER 연구로부터의 데이터에 대하여 예시된 도 11에서 전체 생존(OS) 및 도 11b에서 무진행 생존(PFS)을 나타내는 박스플롯 다이어그램에 적용한다. 이러한 분석은 OS와의 연관성에 대하여 0.06의 p-값 및 PFS와의 연관성에 대하여 0.03의 p-값을 갖는 고발현 그룹 및 저발현 그룹 간의 통계적 차이를 보여준다.
도 12 및 도 12b에 나타낸 바와 같은 상기 데이터의 카플란-마이어 분석은 도 11 및 도 11b로부터의 결과를 반영한다. 도 12에서 SHELTER 시험으로부터 모든 이용가능한 환자를 OS에 대한 분석에 포함시킨다. 분할은 도 11의 것과 유사하며, 로그-순위 검정(log-rank test)을 사용하여 환자의 60%는 고 발현 그룹이고, 40%는 저 발현 그룹이며, 통계적으로 결정된 p-값은 0.04이다. OS 중간값(고 ZFP64 발현)은 8개월인 한편(95% C.I.: 5.6 - NA), OS 중간값(저 ZFP64 발현)은 3.9개월이다(95% C.I.: 2.6 - 9.9).
도 12b에서, 레스미노스타트(600 ㎎) 또는 레스미노스타트(600 ㎎) 및 소라페닙(400 ㎎)의 병용으로 처리된 SHELTER 연구 유래의 환자만을 분석에 포함시킨다. 분할을 위한 백분위수는 각각의 그룹에 대한 중간값과 같이, 도 12에서와 상이하다. OS 중간값(고 ZFP64 발현)은 9.4개월이고(95% C.I.: 7.0 - 20.6), OS 중간값(저 ZFP64 발현)은 5.1개월이며(95% C.I.: 3.3 - NA), 로그-순위 검정에 의해 결정되는 p-값은 0.02이다.
도 10과 함께, 도 12 및 도 12b는 동일한 경향을 나타낸다. 51% 내지 71% 사이의 도 10의 중심 부분은 도 12 및 도 12b에서 분할을 위해 사용되는 2개의 백분위수와 동일한 범위 내에 있다(각각 60 백분위수 및 75 백분위수). 보다 높은 dCt ZFP64 기준선 값이 보다 낮은 ZFP64 mRNA 발현을 의미하며, 레스미노스타트로의 치료시의 HCC 환자에서의 진행성 질병(PD)의 발생을 나타내는 한편, 보다 낮은 dCt ZFP64 기준선 값(즉, 보다 높은 ZFP64 mRNA 발현)은 안정한 질병(SD)의 발생을 나타내는 것을 유념한다.
도 13에서, 레스미노스타트(600 ㎎)를 받고 있는 SHELTER 연구로부터의 평가가능한 환자(임상 시험에 참여하는 몇몇 환자는 데이터 소실 또는 저 품질 시료로 인하여 이러한 분석에 포함될 수 없음)의 기준선 발현을 분석한다. 나타낸 분할은 75 백분위수에서 이루어져, 0.9개월의 낮은 ZFP64 발현에 대한 OS 중간값(95% C.I.: 1.9 - NA) 및 7.0개월의 높은 ZFP64 발현에 대한 OS 중간값(95% C.I.: 3.3 - NA)을 초래하며, 로그-순위로, 0.05의 p-값이 결정된다. 2개의 그룹에 대한 전체 OS 중간값은 3.7개월이며, 이는 단속적인 선으로 표현된다.
도 14에서, 레스미노스타트(600 ㎎) 및 소라페닙(400 ㎎)의 병용을 받고 있는 SHELTER 연구로부터의 평가가능한 환자(상기 참조)의 기준선 발현을 분석한다. 나타낸 분할은 75 백분위수에서 이루어져, 6.1개월의 낮은 ZFP64 발현에 대한 OS 중간값(95% C.I.: 0.6 - NA) 및 11.1개월의 높은 ZFP64 발현에 대한 OS 중간값(95% C.I.: 8.0 - NA)을 초래하며, 로그-순위로, 0.07의 p-값이 결정된다. 2개의 그룹에 대한 전체 OS 중간값은 8.3개월이며, 이는 단속적인 선으로 표현된다.
도 15는 각각 레스미노스타트 또는 레스미노스타트 및 소라페닙의 병용을 함께 받고 있는 SHELTER 연구로부터의 평가가능한 환자(상기 참조)를 보여준다. 분할은 본 명세서에 기재된 방법에 의해 그리고 전체 연구 집단에 기초하여 계산한다(도 11에 나타낸 바와 같음). 2개의 그래프는 본질적으로 각각 도 13 및 도 14에 나타낸 경향을 반영하여, 2개의 그룹으로의 분할에 사용되는 값이 상이하다는 사실로 인한 차이만을 나타낸다. 백분위수(도 13 및 도 14에 대하여 75 백분위수 및 도 15에 대하여 60 백분위수)가 결정적인 결과 예측가능성의 영역 및 확실한 예측가능성이 제공되지 않는 영역이 정의되는 도 10에서 관찰되는 것과 비슷하기 때문에, 마커로서의 ZFP64의 적용가능성이 확인된다.
도 16 및 도 17은 SHELTER 데이터 분석에 대하여 본 섹션에 기재된 바와 동일한 방법에 기초한, SAPHIRE 데이터에 대한 분석을 나타낸다. 도 16의 박스플롯 다이어그램은 65 백분위수에서의 고 및 저 ZFP64 발현으로의 분할에 관한 전체 생존(OS) 데이터를 나타내어, 2개의 그룹 간의 통계적 차이와 함께 로그-순위 검정에 의한 0.04의 p-값을 보여준다. 도 17은 65 백분위수에서의 ZFP64 발현의 분할을 사용하는 OS의 카플란-마이어 분석을 보여준다. 로그-순위 검정에 의한 p-값은 0.04이다.
도 18은 SHORE 연구 데이터에 대한 각각의 카플란-마이어 분석이다. 데이터를 최종 연구 기록 이전에 수집하였으며, 일부 검열된(censored) 환자(원)는 생존선의 0.5 비 초과이며, 이에 따라, 각 그룹에서의 OS에 대한 중간값은 모든 환자 데이터의 최종의 평가시에 어느 정도 상이할 수 있다. 그럼에도 불구하고, HCC 및 HL에서와 유사한 경향이 CRC에서 관찰되며, 상대적으로 낮은 ZFP64 발현 그룹은 보다 짧은 OS를 보이고, 상대적으로 높은 ZFP64 발현 그룹은 보다 긴 OS를 보여준다.
예후 마커로서의 DPP3
유전자 DPP3의 기준선 발현(사이클 1, 제1일, 0시간)의 통계적 분석에 의해, DPP3 기준선 유전자 발현에 기초하여, 환자가 2개의 그룹, 즉, a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과를 보여주는 것으로 예상되는 환자 및 b) 본 명세서에 기재된 바와 같은 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과를 보여주는 것으로 예상되지 않는 환자로 분리될 수 있음이 드러났다. DPP3 기준선 유전자 발현에서의 차이는 발현 수준이 아닌 dCt 값을 사용하여 검출가능하다. 도 19는 그들의 각각의 중간 값, 사분범위(25 백분위수 내지 75 백분위수) 및 데이터 범위와 함께 2개의 환자 그룹의 박스 플롯을 보여준다. 차이에 대한 양쪽 p-값은 웰치 2개 시료 t-검정에 따라 0.03이다. 바이오마커로서 DPP3의 예후 값을 고려하여, 3개의 예후 능력 그룹으로의 분리를 dCt 값의 백분위수 순위에 기초하여 행한다(도 20 참조).
59 백분위수 이상을 포함하는 범위의 dCt 값은 0.69(13개 중 9개)의 정밀도로 HDAC 억제제 치료가 긍정적인 결과를 야기하지 않음을 나타낸다. 52 백분위수 이하를 포함하는 범위의 dCt 값은 0.64(17개 중 11개)의 정밀도로 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과를 나타낸다. 52 백분위수 및 59 백분위수를 포함하지 않는 그 사이의 범위의 dCt 값은 결정적인 예후 표시를 제공하지 않는다. 상기 기재된 바와 같은 dCt 값의 백분위수 범위는 HDAC 억제제 치료를 받고 있는 모든 환자에 대한 유전자 발현의 전체 분포에 관한 것이다.
레스미노스타트 투여가 암 세포주, 건강한 공여자 PBMC 및 전혈 세포에서, 그리고 임상 시험 SHELTER, SAPHIRE 및 SHORE에서의 환자로부터 취한 전혈 세포에서 ZFP64 유전자 발현의 하향-조절을 야기하는 것이 나타났다. 기준선(사이클 1, 제1일, 0시간)에서의 임상 시험의 상대 유전자 발현은 레스미노스타트 치료 하의 환자에 대한 임상 결과, 즉, 진행성 질병(PD) 또는 적어도 안정한 질병 또는 심지어 반응성 질병(SD)의 평가를 나타낸다. 암 환자에서 기준선(치료 시작 이전)에서 측정된 보다 높은 ZFP64 발현 수준은 레스미노스타트로의 치료시의 보다 큰 임상 이익을 나타낸다(PD 대 SD, PFS 및 OS 시간의 증가). 추가로, 그리고 더욱 적절하게, 기준선에서의 상기 상대 유전자 발현은 또한 레스미노스타트 치료 하의 환자의 무진행 생존(PFS) 및/또는 전체 생존(OS) 시간을 나타내며, 이는 정의된 상대적으로 높은 및 상대적으로 낮은 발현 그룹 간의 통계적으로 적절한 차이를 보여준다.
세포 및 전혈 실험에 의해, 레스미노스타트의 유전자 조절 효과가 소라페닙에 의해 영향을 받지 않음이 입증된다. 레스미노스타트 및 소라페닙의 병용은 단독의 레스미노스타트에 대한 하향-조절과 비교하여, 비슷한 값의 ZFP64 유전자 발현의 하향-조절을 보여준다.
ZFP64는 레스미노스타트 활성에 대한 약력학적 마커이다.
ZFP64는 레스미노스타트 반응에 대한 예후 및 예측 바이오마커로 나타났다. 추가로, ZFP64는 환자 계층화를 위한 동반 진단의 개발의 기회를 제공한다.
도면에 대한 미가공 데이터(표 번호는 각각의 도면 번호와 동등하다 ):
[표 F2/F3]
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
[표 F7]
Figure pct00019
[표 F8]
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
SEQUENCE LISTING <110> 4SC, AG <120> Gene expression Biomarkers and their use for diagnostic and prognostic application in patients potentially in need of HDAC inhibitor treatment <130> PWO00208VIE <150> US 61/827,201 <151> 2013-05-24 <150> US 61/865,712 <151> 2013-08-14 <150> US 61/935,914 <151> 2013-02-05 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 73 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> ZFP64 target sequence <400> 1 cacctcggag acccagacaa tcacagtttc agctccagaa tttgtttttg aacatggcta 60 tcaaacttac ctg 73 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> artificial primer <220> <223> forward <400> 2 cacctcggag acccagacaa 20 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 caggtaagtt tgatagccat gttca 25 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> forward primer <400> 4 cacctcggag acccagaca 19 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> reverse primer <400> 5 caggtaagtt tgatagccat gttc 24 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 6) Reversed transcription forward primer 1 <400> 6 acctgcccac ggaaagtaat 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 7) Reversed transcription reverse primer 1 <400> 7 tatggggttt gtctcccgtg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 9) Reversed transcription reverse primer 2 <400> 8 acccagacaa tcacaggttg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> 9) Reversed transcription reverse primer 2 <400> 9 gctaaagcac ttgccacaga c 21 <210> 10 <211> 49 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 10) Abcam ab66658 - Rabbit polyclonal ZFP64 antibody immunogen peptide <400> 10 Asp Gly Gly Gln Asn Ile Ala Val Ala Thr Thr Ala Pro Pro Val Phe 1 5 10 15 Ser Ser Ser Ser Gln Gln Glu Leu Pro Lys Gln Thr Tyr Ser Ile Ile 20 25 30 Gln Gly Ala Ala His Pro Ala Leu Leu Cys Pro Ala Asp Ser Ile Pro 35 40 45 Asp <210> 11 <211> 92 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> immunogen peptide <400> 11 Ser Phe Asp Thr Lys Gln Pro Ser Asn Leu Ser Lys His Met Lys Lys 1 5 10 15 Phe His Gly Asp Met Val Lys Thr Glu Ala Leu Glu Arg Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Arg Gln Ser Ser Arg Gln Val Ala Lys Leu Asp Ala Lys Lys Ser 35 40 45 Phe His Cys Asp Ile Cys Asp Ala Ser Phe Met Arg Glu Asp Ser Leu 50 55 60 Arg Ser His Lys Arg Gln His Ser Glu Tyr Ser Glu Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Asp Val Thr Val Leu Gln Phe Gln Ile Glu Pro Ser 85 90

Claims (29)

  1. 하기의 단계를 포함하는 HDAC 억제제 치료의 효과의 결정 방법:
    a) 상기 HDAC 억제제 치료를 받고 있는 환자의 시료를 제공하는 단계,
    b) 상기 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 결정하는 단계,
    c) 상기 적어도 하나의 유전자의 결정된 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 상기 환자에서의 상기 HDAC 억제제 치료의 효과와 연관시키는 단계.
  2. 하기의 단계를 포함하는 HDAC 억제제 치료의 모니터링 방법:
    a) 상기 HDAC 억제제 치료를 받고 있는 환자의 시료를 제공하는 단계,
    b) 상기 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 결정하는 단계,
    c) 상기 단계 a 및 b를 적어도 1회, 바람직하게는 1회를 초과하여 반복하는 단계, 및
    d) 단계 a) 내지 c)에서 결정된 상기 유전자 발현을 사용하여, 상기 HDAC 억제제 치료에 대한 상기 환자의 반응의 시간 프로파일을 생성하는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 추가로 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률 또는 부정적인 결과의 확률과 연관시키는 방법.
  4. 하기의 단계를 포함하는, 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 계층화(stratification) 방법:
    a) 상기 환자의 시료를 제공하는 단계,
    b) 상기 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현을 결정하는 단계,
    c) 상기 적어도 하나의 유전자의 결정된 유전자 발현을 HDAC 억제제 치료가 상기 환자에 유리한 영향을 갖는 확률과 연관시키는 단계, 및
    d) 상기 환자를 단계 c에서 결정된 확률에 기초하여, 상기 HDAC 억제제 치료에 대한 반응자(responder) 또는 비-반응자로 분류하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 단계 a)에서 제공되는 상기 시료는 HDAC 억제제를 상기 환자에게 투여하기 이전에 제공되며,
    단계 a) 이후에 HDAC 억제제를 생체외에서 상기 시료에 첨가하여, 상기 시료에서 HDAC를 억제하고,
    단계 b)에서, 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현이 상기 HDAC 억제제를 포함하는 상기 시료에서 결정되는 방법.
  6. 하기의 단계를 포함하는, HDAC 억제제 치료를 받고 있는 환자에 대한 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률의 예측 방법:
    a) 상기 환자의 시료를 제공하는 단계,
    b) 상기 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현을 결정하는 단계,
    c) 상기 유전자 발현을, 단계 a) 이전에 상기 환자로부터 제공되는 시료에서의 상기 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현과 비교하는 단계, 및
    d) 단계 a)에서 제공되는 상기 시료와, 단계 a) 이전에 제공되는 상기 시료에서의 상기 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현의 차이를 상기 환자에 대한 상기 HDAC 억제제 치료의 긍정적인 결과의 확률과 연관시키는 단계.
  7. 제6항에 있어서, 단계 a) 이전에 제공되는 상기 시료는 HDAC 억제제가 상기 환자에게 투여되기 이전에 상기 환자로부터 제공되며,
    단계 a)에서 제공되는 상기 시료는 HDAC 억제제가 상기 환자에게 투여된 이후, 바람직하게는 HDAC 억제제가 상기 환자에게 처음 투여된 이후에 제공되는 방법.
  8. 하기의 단계를 포함하는, HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자에서의 약력학적 마커로서의 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현의 결정 방법:
    a) 상기 환자의 시료를 제공하는 단계,
    b) 상기 시료에서 유전자 발현 및/또는 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 결정하는 단계,
    c) 상기 적어도 하나의 유전자의 결정된 유전자 발현 및/또는 유전자 발현의 변화를 HDAC 억제제에 의한 HDAC의 상대적 억제와 연관시키는 단계.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현이 상기 시료에서 상기 적어도 하나의 유전자 또는 적어도 150개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 적어도 180개 뉴클레오티드 길이의 그의 단편에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 mRNA의 수준을 측정함으로써 결정되는 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현이 상기 시료에서 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질 또는 상기 단백질의 도메인의 수준을 측정함으로써 결정되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 적어도 하나의 단백질 또는 그의 도메인의 수준 및/또는 그의 수준의 변화가 항체 또는 항체를 포함하는 프로브의 결합에 의해 결정되며, 상기 항체가 상기 적어도 하나의 단백질 또는 그의 도메인에 특이적으로 결합하는 방법.
  12. 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료를 HDAC 억제제 치료의 시작 이전에 또는 HDAC 억제제 치료 동안 취하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료가 체액의 시료, 바람직하게는 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하는 군으로부터 선택되는 혈액 시료, 더욱 바람직하게는 전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하는 군으로부터 선택되는 말초 혈액 시료인 방법.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료가 조직 시료, 바람직하게는 이환 조직의 시료, 더욱 바람직하게는 암 조직 유래의 생검인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a 내지 c 또는 a 내지 b가 적어도 1회, 바람직하게는 1회를 초과하여 반복되는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, HDAC 억제제가 보리노스타트(vorinostat), 로미뎁신(romidepsin), 발프로산(valproic acid), 파노비노스타트(panobinostat), 엔티노스타트(entinostat), 벨리노스타트(belinostat), 모세티노스타트(mocetinostat), 지비노스타트(givinostat) 및 레스미노스타트(resminostat) 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 유리 형태의 (E)-3-(1-(4-((디메틸아미노)메틸)페닐설포닐)-1H-피롤-3-일)-N-하이드록시아크릴아미드 또는 그의 하이드로클로라이드 또는 메실레이트 염을 포함하는 군으로부터 선택되는 방법.
  17. HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자에 대한 상기 HDAC 억제제 치료에서의 약력학적 마커로서의 적어도 하나의 유전자의 용도 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 용도로서, 상기 적어도 하나의 유전자가 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 용도 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 용도.
  18. HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자에 대한 상기 HDAC 억제제 치료의 결과를 예측하기 위한 적어도 하나의 유전자의 용도 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 용도로서, 상기 적어도 하나의 유전자가 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 용도 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 용도.
  19. HDAC 활성을 결정하기 위한 대리 마커로서의 적어도 하나의 유전자의 용도 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 용도로서, 상기 적어도 하나의 유전자가 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 용도 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 용도.
  20. 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자를 반응자 또는 비-반응자로 계층화(stratifying)하기 위한 적어도 하나의 유전자의 용도 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 용도로서, 상기 적어도 하나의 유전자가 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 용도 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 용도.
  21. 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현을 결정하기 위한 키트로서,
    상기 키트가 상기 적어도 하나의 유전자 또는 적어도 150개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 적어도 180개 뉴클레오티드 길이의 그의 단편에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하고,
    상기 키트가 선택적으로 매질, 매질 성분, 완충제, 완충제 성분, RNA 정제 컬럼, DNA 정제 컬럼, 염료, dNTP 믹스를 포함하는 핵산, 중합효소를 포함하는 효소 및 염을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 성분을 포함하는 키트.
  22. 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 유전자에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질의 수준을 결정하기 위한 키트로서,
    상기 키트가 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질 또는 상기 단백질의 도메인에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하고,
    상기 키트가 선택적으로 매질, 매질 성분, 완충제, 완충제 성분, 멤브레인(membrane), ELISA 플레이트 효소 기질, 염료, 중합효소를 포함하는 효소 및 염을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 추가의 성분을 포함하는 키트.
  23. 시료에서 ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자의 유전자 발현을 결정하기 위한 제21항 또는 제22항에 따른 키트의 용도.
  24. 제23항에 있어서, 상기 결정된 유전자 발현이 상기 시료에서의 HDAC 활성과 연관되는 용도.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 시료가 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자로부터 제공되는 용도.
  26. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법에서의 제21항 또는 제22항에 따른 키트의 용도.
  27. 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 치료에서 이용하기 위한 HDAC 억제제로서, 상기 치료 이전 및/또는 그 동안에, ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자, 상기 적어도 하나의 유전자에 상응하는 적어도 하나의 mRNA 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질이 상기 환자에 대한 상기 HDAC 억제제 치료의 효과의 확률을 결정하기 위해 또는 상기 환자가 상기 HDAC 억제제 치료에 대한 반응자인지 여부를 결정하기 위해 사용되는 HDAC 억제제.
  28. HDAC 억제제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법으로서, 상기 방법 이전 및/또는 그 동안에, ZFP64, DPP3, CCDC43, HIST2H4A/B, KDELC2 및 MICALL1을 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 유전자, 상기 적어도 하나의 유전자에 상응하는 적어도 하나의 mRNA 또는 상기 적어도 하나의 유전자에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 단백질이 상기 환자에 대한 상기 HDAC 억제제 치료의 효과의 확률을 결정하기 위해 또는 상기 환자가 상기 HDAC 억제제 치료에 대한 반응자인지 여부를 결정하기 위해 사용되는 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 HDAC 억제제가 보리노스타트, 로미뎁신, 발프로산, 파노비노스타트, 엔티노스타트, 벨리노스타트, 모세티노스타트, 지비노스타트 및 레스미노스타트 또는 그들의 약제학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 유리 형태의 (E)-3-(1-(4-((디메틸아미노)메틸)페닐설포닐)-1H-피롤-3-일)-N-하이드록시아크릴아미드 또는 그의 하이드로클로라이드 또는 메실레이트 염을 포함하는 군으로부터 선택되는, 잠재적으로 HDAC 억제제 치료를 필요로 하는 환자의 치료에 사용하기 위한 HDAC 억제제 또는 방법.
KR1020157034950A 2013-05-24 2014-05-22 잠재적으로 ｈｄａｃ 억제제 치료를 필요로 하는 환자에서의 진단 및 예후 응용을 위한 유전자 발현 바이오마커 및 그들의 용도 Withdrawn KR20160010498A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361827201P 2013-05-24 2013-05-24
US61/827,201 2013-05-24
US201361865712P 2013-08-14 2013-08-14
US61/865,712 2013-08-14
US201461935914P 2014-02-05 2014-02-05
US61/935,914 2014-02-05
PCT/EP2014/060532 WO2014187894A1 (en) 2013-05-24 2014-05-22 Gene expression biomarkers and their use for diagnostic and prognostic application in patients potentially in need of hdac inhibitor treatment

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160010498A true KR20160010498A (ko) 2016-01-27

Family

ID=50771295

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157034950A Withdrawn KR20160010498A (ko) 2013-05-24 2014-05-22 잠재적으로 ｈｄａｃ 억제제 치료를 필요로 하는 환자에서의 진단 및 예후 응용을 위한 유전자 발현 바이오마커 및 그들의 용도

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20160215348A1 (ko)
EP (1) EP3004377A1 (ko)
JP (1) JP2016521543A (ko)
KR (1) KR20160010498A (ko)
CN (1) CN105408498A (ko)
AU (1) AU2014270380A1 (ko)
BR (1) BR112015028997A2 (ko)
CA (1) CA2912973A1 (ko)
EA (1) EA201501137A1 (ko)
HK (1) HK1223129A1 (ko)
MX (1) MX2015016114A (ko)
WO (1) WO2014187894A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017034234A1 (ko) * 2015-08-21 2017-03-02 서울대학교 산학협력단 Hdac 억제제 내성을 갖는 암 치료용 복합제제
CN110412268A (zh) * 2018-04-27 2019-11-05 刘晓健 诊断经典霍奇金淋巴瘤的结外累犯的标志物及其应用
CN112691199A (zh) * 2021-01-26 2021-04-23 冠科生物技术(苏州)有限公司 一种预测病患对抑制剂反应的标志物及其使用方法
CN115267165A (zh) * 2022-08-15 2022-11-01 海仕兰(上海)生物科技有限公司 一种悬浮芯片系统及其应用以及基于悬浮芯片系统对肿瘤伴随诊断因子检测方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8859502B2 (en) * 2010-09-13 2014-10-14 Celgene Corporation Therapy for MLL-rearranged leukemia
CN104056270B (zh) * 2013-02-21 2018-11-09 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 用于制备多器官损伤救治药物的组蛋白去乙酰化酶抑制剂

Also Published As

Publication number Publication date
CA2912973A1 (en) 2014-11-27
EP3004377A1 (en) 2016-04-13
AU2014270380A1 (en) 2015-11-19
MX2015016114A (es) 2016-07-21
HK1223129A1 (zh) 2017-07-21
EA201501137A1 (ru) 2016-06-30
US20160215348A1 (en) 2016-07-28
WO2014187894A1 (en) 2014-11-27
JP2016521543A (ja) 2016-07-25
BR112015028997A2 (pt) 2017-10-24
CN105408498A (zh) 2016-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. CircLIFR synergizes with MSH2 to attenuate chemoresistance via MutSα/ATM-p73 axis in bladder cancer
Zhang et al. Analysis of the androgen receptor–regulated lncRNA landscape identifies a role for ARLNC1 in prostate cancer progression
Ma et al. USP1 inhibition destabilizes KPNA2 and suppresses breast cancer metastasis
Du et al. 5-Fluorouracil targets histone acetyltransferases p300/CBP in the treatment of colorectal cancer
Fang et al. MYEOV functions as an amplified competing endogenous RNA in promoting metastasis by activating TGF-β pathway in NSCLC
US20210388040A1 (en) Non-canonical swi/snf complex and uses thereof
US10012652B2 (en) Screening method
US20170058360A1 (en) Methods for Prediction of Clinical Response to Radiation Therapy in Cancer Patients
Wilmott et al. Expression of the class 1 histone deacetylases HDAC8 and 3 are associated with improved survival of patients with metastatic melanoma
CN104995313A (zh) 使用c-maf的前列腺癌转移的诊断、预后和治疗的方法
Liu et al. LncRNA MNX1-AS1 sustains inactivation of Hippo pathway through a positive feedback loop with USP16/IGF2BP3 axis in gallbladder cancer
Hu et al. A reciprocal feedback of Myc and lncRNA MTSS1-AS contributes to extracellular acidity-promoted metastasis of pancreatic cancer
JP2023504786A (ja) 抗がん効果増進のためのＥＲＲγ抑制剤を有効成分として含む組成物の用途
Koike et al. High prevalence of epigenetic inactivation of the human four and a half LIM domains 1 gene in human oral cancer
Zang et al. Hsa_circ_0001479 accelerates tumorigenesis of gastric cancer and mediates immune escape
Tang et al. PARP6 suppresses the proliferation and metastasis of hepatocellular carcinoma by degrading XRCC6 to regulate the Wnt/β-catenin pathway
KR20160010498A (ko) 잠재적으로 ｈｄａｃ 억제제 치료를 필요로 하는 환자에서의 진단 및 예후 응용을 위한 유전자 발현 바이오마커 및 그들의 용도
Adamson et al. The catalytic subunit of DNA-PK regulates transcription and splicing of AR in advanced prostate cancer
Kallenbach et al. The oncogenic lncRNA MIR503HG suppresses cellular senescence counteracting supraphysiological androgen treatment in prostate cancer
CA2966772A1 (en) Mir-214 as a diagnostic and prognostic biomarker specific for ulcerative colitis and a mir-214 inhibitor for treatment of same
CN114214418A (zh) 一种评估肺癌患者对质子放疗敏感性的生物标志物及其用途
TW202122584A (zh) 預測癌症預後之方法及其應用
Motiwala et al. AP-1 elements and TCL1 protein regulate expression of the gene encoding protein tyrosine phosphatase PTPROt in leukemia
Takayama et al. Inhibition of PSF activity overcomes resistance to treatment in cancers harboring mutant p53
US20220081719A1 (en) Method and application thereof for predicting prognosis of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A15-nap-PA0105

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-3-3-R10-R18-oth-X000

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-2-2-P10-P22-nap-X000

PC1203 Withdrawal of no request for examination

St.27 status event code: N-1-6-B10-B12-nap-PC1203

WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid
P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-2-2-P10-P22-nap-X000

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-2-2-P10-P22-nap-X000