KR20160047521A - 세포 증식성 질환의 치료를 위한 alk 억제제 및 cdk 억제제의 조합물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (1) ALK 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제1 작용제 및 (2) CDK 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제2 작용제를 개별적으로 또는 함께 포함하는 제약 조합물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 증식성 질환의 치료 또는 예방에 있어서 이러한 조합물의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 ALK 억제제 및 CDK 억제제를 포함하는 제약 조합물; 암의 치료에서 이러한 조합물의 용도; 및 암의 치료를 필요로 하는 인간을 비롯한 온혈 동물에게 유효 용량의 ALK 억제제 및 CDK 억제제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 앓고 있는 상기 동물을 치료하는 방법에 관한 것이다.
ALK 억제제
역형성 림프종 키나제 (ALK)는 수용체 티로신 키나제의 인슐린 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. 이 단백질은 세포외 도메인, 단일 통과 막횡단 영역에 해당하는 소수성 스트레치, 및 세포내 키나제 도메인을 포함한다. 이는 뇌의 발달에 중요한 역할을 하고 신경계에서 특정 뉴런에 그의 영향을 미치며, 발달성 신경 조직에서 정상적으로 발현된다. ALK의 유전자 변경은 조혈 및 비-조혈 종양에서 종양발생에 관련되어 있다. 유전자는 역형성 대세포 림프종, 신경모세포종 및 비소세포 폐암을 비롯한 일련의 종양에서 재배열되거나, 돌연변이되거나, 또는 증폭되는 것으로 발견되었다. 전장 ALK 수용체 단백질의 이상 발현은 신경모세포종 및 교모세포종에서 보고된 바 있고; ALK 융합 단백질은 역형성 대세포 림프종에서 발생하였다. 염색체 재배열이 ALK 유전자에서 가장 흔한 유전자 변경이지만, ALK 증폭은 유방암 및 식도암에서 나타난 바 있다. 따라서, ALK-양성 종양의 치료에서 ALK를 선택적으로 표적화하는 화합물의 개발이 잠재적으로 대단히 바람직하다. ALK 키나제 활성의 소수의 소분자 억제제는 최근에, 예를 들어, WO 2008/073687 A1에 기재된 바 있고; 그의 일부는 현재 임상 평가를 받고 있다. cMET 및 ALK의 티로신 키나제 억제제인 크리조티닙은 ALK-양성 진행성 비소세포 폐암을 갖는 환자에 대해 승인된 바 있고; 더 강력한 ALK 억제제가 곧 뒤따를 것이다.
CDK 억제제
시클린-의존성 키나제 (CDK)는 단백질 키나제의 거대 패밀리이다. CDK는 포유동물 세포 주기의 개시, 진행 및 완료를 조절한다. CDK의 기능은, 예를 들어 망막모세포종 단백질, 라민, 히스톤 H1, 및 유사분열 방추의 성분을 비롯한 특정 단백질을 인산화시켜 그를 활성화 또는 탈활성화시키는 것이다. CDK에 의해 매개되는 촉매 단계는 ATP로부터 거대분자 효소 기질로의 인산-전달 반응을 수반한다.
종양 발생은 CDK 및 그의 조절제의 유전자 변경 및 탈조절과 밀접하게 연관되며, 이는 CDK의 억제제가 유용한 항암 치료제일 수 있음을 시사한다. 실제로, 초기의 결과는 형질전환된 세포 및 정상 세포가, 예를 들어 시클린 D/CDK4/6에 대한 그의 요건에 있어서 상이하며, 통상의 세포독성 및 세포증식억제 약물에서 관찰되는 일반적인 숙주 독성이 없는 신규 항신생물제를 개발하는 것이 가능할 수 있음을 시사한다. 여러 군의 화합물 (예를 들어, 문헌 [Fischer, P. M. Curr. Opin. Drug Discovery Dev. 2001, 4, 623-634]에서 검토됨)은 CDK-특이적 ATP 길항작용에 의해 항증식성 특징을 보유하는 것으로 발견되었다. 따라서, 일반적으로 CDK 또는 특이적 CDK를 표적화하는 치료제를 사용하는, 증식성 장애, 예컨대 암의 치료를 위한 단독요법의 개발이 잠재적으로 매우 바람직하다. CDK의 억제제는 공지되어 있고, 특허 출원이 이러한 억제제에 대해 출원되었다; 예를 들어, WO2007/140222, WO2010/020675 및 WO2011/101409.
ALK 또는 CDK4/6을 억제하는 화합물을 제조하려고 시도해 왔고, 다수의 이러한 화합물은 관련 기술분야에 개시되어 있다. 그러나, ALK 및 CDK4/6에 의해 매개되는 다수의 병리학적 반응의 관점에서, 효과적이고 안전한 치료제에 대한 계속적인 필요성 및 조합 요법에서 이들의 우선적인 사용에 대한 필요성이 남아있다. 놀랍게도, ALK 억제제가 CDK 4/6 억제제와 조합하여 강한 항증식 활성 및 생체내 항종양 반응을 유발하는 것으로 발견되었다. 본 발명은 증식성 질환의 치료를 위한 특정한 조합 요법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 (1) ALK 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제1 작용제 및 (2) CDK 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제2 작용제를 개별적으로 또는 함께 포함하는 제약 조합물에 관한 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 제약 조합물, 및 적어도 1종의 부형제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 증식성 질환의 치료를 필요로 하는 환자에게 ALK 억제제인 제1 작용제의 치료 유효량 및 CDK 억제제인 제2 작용제의 치료 유효량을 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는, 증식성 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 증식성 질환을 치료하기 위한 제1 측면의 제약 조합물에 관한 것이다.
제5 측면에서, 본 발명은 증식성 질환의 치료를 위한 의약의 제조를 위한 제1 측면의 제약 조합물 또는 제2 측면의 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
제6 측면에서, 본 발명은 제1 측면에 따른 제약 조합물 또는 제2 측면에 따른 제약 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
도 1은 화합물 조합물의 잠재적 상승작용적 상호작용이 로에베(Loewe) 상가작용 모델을 기반으로 하여 챌리스(CHALICE) 소프트웨어의 출력으로부터 어떻게 평가될 수 있는지 가설 데이터를 사용하여 예시한다. 좌측의 도면은 용량 행렬 플롯이며, 여기서 7x7 행렬의 각 개별 블록은 약물 치료에 의한 억제 (세포 사멸)의 퍼센트를 보고한다. 단일 화합물 단독 처리에 의한 억제는 작용제 A에 대해서는 가장 좌측 열에 보고되어 있고, 작용제 B에 대해서는 하단 행에 보고되어 있으며; 데이터는 0 (작용제 A 및 작용제 B 농도 둘 다가 0인 값)으로 설정된 비히클 대조군에 의한 억제에 대해 정규화된다. 우측의 도면은 로에베 초과 행렬 플롯이며, 여기서 각 개별 블록은 로에베 상가작용 모델에 의해 생성된 예상된 억제 값에 대해 용량 행렬에서의 실험 데이터를 비교하여 초과 억제를 보고한다. 이 관점에서, 상승작용은 값 >0으로 정의되고, 상가작용은 값 = 0으로 정의되고, 길항작용은 값 <0으로 정의된다. 강조된 블록은 실험 데이터에서 상승작용이 관찰된 조합물을 확인시켜준다.
도 2는 LAN-1 인간 신경모세포종 세포의 억제에 대하여, 화합물 A1 및 화합물 B에 의한 공-치료 (상단 행), 화합물 A1 자체-교차 (중간 행) 및 화합물 B 자체-교차 (하단 행)로부터의 용량 효과 (억제 %)를 입증하는 챌리스 행렬 플롯을 보여준다.
도 3은 15종의 질환 (ALK 돌연변이체) 및 정상 (야생형) 신경모세포종 세포주에서 약물 조합물의 상승작용 스코어 (표 2 및 3의 데이터 참조)의 시각적 요약을 제공하는 박스플롯을 보여준다. 이 플롯에는, ALK 억제제인 화합물 A1 및 A2로부터 생성된, 그러나 A3으로부터 생성되는 것은 아닌 상승작용 스코어가 포함되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, ALK 억제제는 화합물 A1 또는 화합물 A2를 지칭하고, CDK4/6 억제제는 화합물 B를 지칭한다. 각 박스는 특정한 치료 요법 (ALK x CDK, ALK 자체-교차, 또는 CDK 자체-교차)의 상승작용 스코어 범위를 나타내고; 박스 내의 수평 백선은 군 중앙값을 나타내고, 수직 실선은 군 표준 편차를 나타낸다. 검은 원은 이상치를 나타낸다.
도 4A, 4B 및 4C는 "히트(hit)" 상승작용적 조합물의 시각적 확인을 제공하는 산점도를 보여준다. 최대 조합 효능 값을 15종의 질환 (ALK 돌연변이체) 및 정상 (야생형) 신경모세포종 세포주에서 ALK 억제제 및 CDK4/6 억제제의 조합물, ALK 억제제 자체-교차, 및 CDK4/6 억제제 자체-교차의 상승작용 스코어 (표 2 및 3의 데이터 참조)에 대해 플롯팅하였다. 이들 플롯에는, 화합물 A1 및 A2를 사용하여 생성된 데이터만을 플롯팅하였으며; 즉, 본원에 사용된 바와 같이, ALK 억제제는 화합물 A1 또는 화합물 A2를 지칭하고, CDK4/6 억제제는 화합물 B를 지칭한다. 도 4A는 15종의 세포주에서 2종의 ALK 억제제인 화합물 A1 및 A2의 자체-교차 데이터로부터의 산점도이다. 상기 플롯은 ALK 질환에 대한 우선적 단일 작용제 효능을 보여준다. 도 4B는 CDK 억제제인 화합물 B의 자체-교차로부터의 데이터의 산점도이다. 상기 플롯은 최소 단일 작용제 효능 또는 상승작용을 보여준다. 도 4C는 ALK 억제제인 화합물 A1 및 A2 중 하나와 CDK 억제제인 화합물 B와의 조합물로부터의 데이터의 산점도이다. 플롯은 4종의 질환 (Lan-5, 켈리(Kelly), Lan-1, NB-1643) 및 2종의 정상 (NB-1, SK-N-BE) 세포주에서 상승작용 및 증가된 효능 둘 다를 유도하는 상호작용을 나타낸다.
도 5a, 5b, 5c 및 5d는 슈(Chou) 및 탈랄레이(Talalay) 조합 지수 원리를 기반으로 하는 약물 조합물 플롯 및 그의 해석의 전형적 예를 보여준다. 도 5a는 일정한 조합 비에 대한 Fa-CI 플롯이다. CI는 하기 식에 따라 슈에 의해 정의된 바와 같다: CI = (D)1 / (Dx)1 + (D)2 / (Dx)2 (여기서 (Dx)1 및 (Dx)2는 개별적으로 사용되는 경우에 주어진 수준의 항증식 효과를 생성하는데 필요한 화합물 D1 및 D2의 농도이고, 한편 (D)1 및 (D)2는 조합물로 사용되는 경우에 동일한 항증식 효과를 생성하는 이들의 농도임). 조합 지수는 상가작용적 효과 (CI =1), 길항작용 (CI >1) 또는 상승작용 (CI <1)으로 정의되는, 약물 상호작용의 정량적 척도이다. Fa는 단독으로 또는 조합으로 주어진 농도의 화합물에 의해 영향받은 세포의 분율로 정의되는 것인 영향받은 분율을 의미한다. Fa = 0은 용량에 따라 DMSO 대조군을 기준으로 하여 결정되고, Fa =1은 완전 반응 (생존 세포가 남아있지 않음)이다. 전형적으로, 본원에 사용된 바와 같이 Fa-CI 플롯은 상승작용을 평가하는데 사용된다. 도 5b는 ED50, ED75 및 ED90에서의 전형적 이소볼로그램이다. (D)1 및 (D)2는 각각 약물 1 및 약물 2의 농도를 의미한다. EDx는 X% 효과에서의 용량을 의미하고, 100% 효과는 생존 세포가 남아있지 않음을 의미한다. 도 5c는 상이한 비의 조합물에 대해 정규화된 이소볼로그램이다. 용어는 도 5b에 정의된 바와 같다. 도 5d는 Fa-DRI 플롯이고 (Chou and Chou, 1988; Chou and Martin, 2005), 여기서 DRI는 용량-감소 지수를 의미하고, 하기 식에 따라 CI와 관련이 있다: CI = (D)1/Dx)1 + (D)2/(Dx)2 = 1/(DRI)1 + 1/(DRI)2. DRI은 상승작용적 약물이 조합물로 주어지는 경우에 각 약물이 개별적으로 투여될 때와 동일한 효과 크기를 달성하면서 각 약물의 용량을 얼마나 감소시킬 수 있는지 추정한다.
도 6A, 6B, 6C, 6D, 6E 및 6F는 NB-1643 세포 (질환)에서 화합물 A1 및 B의 조합물, 화합물 A 및 화합물 B에 대한 약물 조합물 플롯을 보여준다: (6A) 중앙-효과 플롯; (6B) 용량-효과 곡선; ED50, ED75 및 ED90에서의 전형적 이소볼로그램; (6C) Fa-CI 플롯; (6D) Fa-logCI 플롯; (6E) 전형적 이소볼로그램; 및 (6F) 보존적 이소볼로그램. 플롯은 조합물이 시험된 농도 범위에 걸쳐 상승작용적이었음을 공동으로 입증하였다.
도 7A, 7B, 7C, 7D, 7E 및 7F는 SH-SY5Y (질환) 세포에서 화합물 A1 및 B의 조합물, 단독 화합물 A1 및 단독 화합물 B에 대한 약물 조합물 플롯을 보여준다: (7A) 중앙-효과 플롯; (7B) 용량-효과 곡선; (7C) Fa-CI 플롯; (7D) Fa-log(CI) 플롯; (7E) ED50, ED75 및 ED90에서의 전형적 이소볼로그램; 및 (7F) 보존적 이소볼로그램. 도 7C 내지 7F는 조합물이 저용량에서는 중간 정도로 상승작용적이고, 고용량에서는 상가작용적 또는 약간 길항작용적이었음을 보여준다.
도 8A, 8B, 8C, 8D, 8E 및 8F는 NB1691 (정상) 세포에서 화합물 A1 및 B의 조합물, 화합물 A 및 화합물 B에 대한 약물 조합물 플롯을 보여준다: (7A) 중앙-효과 플롯; (7B) 용량-효과 곡선; (7C) Fa-CI 플롯; (7D) Fa-log(CI) 플롯; (7E) ED50, ED75 및 ED90에서의 전형적 이소볼로그램; 및 (7F) 보존적 이소볼로그램. 도 8C 내지 8F는 조합물이 저용량에서는 강하게 상승작용적이고, 보다 고용량에서는 상가작용적이고, 높은 화합물 A1 용량에서는 길항작용적이었음을 입증한다.
도 9A, 9B, 9C, 9D, 9E 및 9F는 EDC1 (정상) 세포에서 화합물 A1 및 B의 조합물, 화합물 A 및 화합물 B에 대한 약물 조합물 플롯을 보여준다: (9A) 중앙-효과 플롯; (9B) 용량-효과 곡선; (9C) Fa-CI 플롯; (9D) Fa-log(CI) 플롯; (9E) ED50, ED75 및 ED90에서의 전형적 이소볼로그램; 및 (9F) 보존적 이소볼로그램. 도 9C 내지 9F는 조합물이 시험된 농도 범위에 걸쳐 상승작용적이었음을 입증한다.
도 10A, 10B, 10C 및 10D는 화합물 A1, B1, 또는 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리에 대한 반응에서 SH-SY5Y 세포의, 각 화합물의 IC 50에서의 및 처리 72시간 후의 형태를 보여준다: (a) 비히클; (b) 단독 화합물 A1에 의한 처리; (c) 단독 화합물 B에 의한 처리, 및 (d) 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리.
도 11A, 11B 및 11C는 (a) 단독 화합물 A1; (b) 단독 화합물 B, 및 (c) 동등효력 비 (각각의 화합물의 0, 1/4, 1/2, 1, 2 및 4배 IC50)로 조합된 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리 72시간 후, 아포톡스-글로(ApoTox-Glo)TM 트리플렉스 검정에 의해 분석된 NB1643 세포의 아폽토시스와 세포 생존율을 비교한다. 그 결과는 약물 치료가 세포 사멸을 증대시키지만, 단독 화합물 A1으로도 화합물 B와의 조합물과 동일한 수준의 아폽토시스가 관찰됨을 보여준다.
도 12A, 12B 및 12C는 (a) 단독 화합물 A1; (b) 단독 화합물 B, 및 (c) 동등효력 비로 조합된 화합물 A 및 B의 조합물에 의한 처리 72시간 후, CTG 검정에 의해 분석된 NB1643 세포의 생존율을 보여준다. 그 결과는 조합물 처리가 세포 사멸을 증대시킨다는 것을 확인시켜준다.
도 13A, 13B 및 13C는 (a) 단독 화합물 A1; (b) 단독 화합물 B, 및 (c) 동등효력 비 (각각의 화합물의 0, 1/4, 1/2, 1, 2 및 4배 IC50)로 조합된 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리 72시간 후, 아포톡스-글로TM 트리플렉스 검정에 의해 분석된, SH-SY5Y 세포의 아폽토시스와 세포 생존율을 비교한다. 그 결과는 공-치료가 세포 사멸을 증대시킴을 보여준다. 세포는 최고 농도에서 보다 초기에 사멸되어, 아폽토시스가 그 농도에서는 검출가능하지 않았다.
도 14A, 14B 및 14C는 (a) 단독 화합물 A1; (b) 단독 화합물 B, 및 (c) 동등효력 비 (각각의 화합물의 0, 1/4, 1/2, 1, 2, 및 4배 IC50)로 조합된 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리 72시간 후, 아포톡스-글로TM 트리플렉스 검정으로 분석된 EBC1 세포의 아폽토시스와 세포 생존율을 비교한다. 데이터는 공-치료에 의한 세포 사멸 또는 아폽토시스의 증대가 거의 없거나 또는 전혀 없음을 보여준다.
도 15는 비히클; 1/16, 1/8, 1/4 및 4배 IC50 용량의 화합물 A1; 1/16, 1/8, 1/4 및 4배 IC50 용량의 화합물 B; 및 각각의 화합물의 1/16, 1/8, 1/4 및 4배 IC50 용량의 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리 20시간 후 NB1643 세포에서 총 및 pALK 발현의 웨스턴 블롯(Western blot)을 보여준다. 그 결과는 공-치료가 1/16x의 IC50 용량에서 출발하여 NB1643 세포에서의 pALK 단백질 발현을 크게 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 16은 비히클; 1/16, 1/8, 1/4 및 4배 IC50 용량의 화합물 A1; 1/16, 1/8, 1/4 및 4배 IC50 용량의 화합물 B; 및 각각의 화합물의 1/16, 1/8, 1/4 및 4배 IC50 용량의 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리 20시간 후 NB1643 세포에서의 총 Rb, 포스포-Rb S780 및 포스포-Rb S795 발현의 웨스턴 블롯을 보여준다. 그 결과는 공-치료가 1/16x의 IC50 용량에서 출발하여 NB1643 세포에서의 pRb 발현을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 조합물은 pRb S795 발현보다 pRb S780 발현을 감소시키는데 더 효과적이다.
도 17은 비히클; 1/4, 1/2, 1 및 4배 IC50 용량의 화합물 A1; 1/4, 1/2, 1 및 4배 IC50 용량의 화합물 B; 및 각각의 화합물의 1/4, 1/2, 1 및 4배 IC50 용량의 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리 20시간 후 NBEBC1 세포에서의 ALK, pALK, 총 Rb 및 포스포-Rb S795 발현의 웨스턴 블롯을 보여준다. 그 결과는 공-치료가 pALK 및 pRb 단백질 발현의 감소에서 보다 효과적임을 보여준다.
도 18은 치료군 (1) 비히클 대조군, (2) 화합물 A1 50 mg/kg, (3) 화합물 B 187.5 내지 250 mg/kg, 및 (4) 화합물 A1 50 mg/kg 및 화합물 B 187.5 내지 250 mg/kg의 조합물에 대한 시간에 따른 CB17 SCID 마우스에서의 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 이종이식편의 상대적 종양 부피를 보여준다. 화합물 B에 대한 용량은 250 mg/kg에서 출발하여 제5일에 187.5 mg/kg으로 감소되었다. 그 결과는 단독 화합물 A1에 의한 치료가 비히클 대조군과 비교하여 단지 약간의 종양 성장 지연을 유발하였음을 보여준다. 단독 화합물 B에 의한 치료는 보다 느린 종양 성장을 결과로 하였다. 공-치료는 기존의 종양을 효과적으로 수축시키고, 총 종양 완화를 달성하였다.
도 19A, 19B, 19C 및 19D는 상기 도 18에 기재된 각각의 치료군에서 개별 마우스에 대한 치료 지속기간 (주 단위)에 따른 종양 부피의 변동을 보여준다.
도 20은 상기 도 18에 기재된 각각의 치료군에서 치료 지속기간 (주 단위)에 대한 마우스의 생존 (백분율 단위)을 보여준다. 제7일에, 군 4로부터의 마우스 중 2마리가 사망하였고, 제14일에, 화합물 B 군으로부터의 1마리 마우스가 사망하였다. 대조군 및 화합물 A1 군의 마우스는 그의 종양의 크기 때문에 안락사시켰다.
도 21은 16종의 질환 (ALK 돌연변이체) 및 정상 (야생형) 신경모세포종 세포주에서 화합물 A1 및 화합물 B의 조합물, 및 그의 각각의 자체-교차로부터의 조합 약물 효과 (효능 대 상승작용 스코어) (표 10의 데이터 참고)의 산점도이다. 상승작용적 조합물 히트는 상승작용 스코어 >2 및 최대 효능 >100 (해석을 위해 도 4A, 4B 및 4C 참조) 둘 다를 갖는 것으로 확인되었다. 상단 플롯은 ALK 질환에 대한 우선적 단일 작용제 효능을 보여주는 화합물 A1 (ALK 억제제)의 자체-교차이다. 중간 플롯은 최소 단일 작용제 효능 또는 상승작용을 보여주는 화합물 B (CDK 억제제)의 자체-교차이다. 하단 플롯은 화합물 A1 및 B의 조합물이며, 이는 2종의 질환 (NB-1691, Lan-5) 및 1종의 정상 (NB-1691) 세포주에서 상승작용 및 증가된 효능 둘 다를 유도하는 상호작용을 보여준다.
도 22a, 22b는 켈리 인간 신경모세포종 세포의 증식에 대해 ALK 억제제 및 CDK4/6 억제제에 의한 공-치료의 용량 효과를 보여준다. 도 22a는 화합물 A1 (ALK 억제제) 및 화합물 B (CDK4/6 억제제)에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 이소볼로그램을 보여준다. 조합물은 상승작용 스코어 1.75의 중간 정도의 상승작용적이고, 이소볼로그램은 매우 강한 상호작용을 나타내었다. 도 22b는 화합물 A2 (ALK 억제제) 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 이소볼로그램을 보여준다. 조합물은 상승작용 스코어 1.48의 중간 정도의 상승작용적이고, 이소볼로그램은 매우 강한 상호작용을 나타내었다
도 23a, 23b, 23c 및 23d는 켈리 및 NB-1 신경모세포종 세포의 증식 대한 ALK 억제제 및 CDK4/6 억제제에 의한 공-치료의 용량 효과를 보여준다. 도 23a는 켈리 세포에서 화합물 A1 (ALK 억제제) 및 화합물 B (CDK4/6 억제제)에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여준다. 조합물은 계산된 상승작용 스코어 2.51로 상승작용적이었다. 도 23b는 켈리 세포에 대해 화합물 A2 (ALK 억제제) 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여준다. 조합물은 상승작용 스코어 2.29로 상승작용적이었다. 도 23c는 NB-1 인간 신경모세포종 세포의 증식에 대한 화합물 A1 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여준다. 조합물은 상승작용적이 아니었다. 도 23d는 인간 NB-1 신경모세포종 세포의 증식에 대한 화합물 A2 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여준다. 조합물은 상승작용적이 아니었다.
도 24a, 24b, 24c, 24d, 24e 및 24f는 켈리, NB-1 및 SH-SY5Y 신경모세포종 세포에서 ALK 억제제 및 CDK4/6 억제제에 의한 공-치료의 용량 효과를 보여준다. 도 24a는 켈리 세포의 증식에 대한 화합물 A1 (ALK 억제제) 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여주고; 상승작용 스코어는 0.820이었다. 도 24b는 켈리 인간 신경모세포종 세포에서 화합물 A2 (ALK 억제제) 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여주고; 상승작용 스코어 1.52이었다. 도 24c는 NB-1 인간 신경모세포종 세포에서 화합물 A1 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여주고; 조합물은 상승작용적이 아니었다. 도 24d는 NB-1 인간 신경모세포종 세포에서 화합물 A2 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여주고; 조합물은 상승작용적이 아니었다. 도 24e는 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에서 화합물 A1 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여준다. 도 24f는 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에서 화합물 A2 및 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여준다.
도 2는 LAN-1 인간 신경모세포종 세포의 억제에 대하여, 화합물 A1 및 화합물 B에 의한 공-치료 (상단 행), 화합물 A1 자체-교차 (중간 행) 및 화합물 B 자체-교차 (하단 행)로부터의 용량 효과 (억제 %)를 입증하는 챌리스 행렬 플롯을 보여준다.
도 3은 15종의 질환 (ALK 돌연변이체) 및 정상 (야생형) 신경모세포종 세포주에서 약물 조합물의 상승작용 스코어 (표 2 및 3의 데이터 참조)의 시각적 요약을 제공하는 박스플롯을 보여준다. 이 플롯에는, ALK 억제제인 화합물 A1 및 A2로부터 생성된, 그러나 A3으로부터 생성되는 것은 아닌 상승작용 스코어가 포함되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, ALK 억제제는 화합물 A1 또는 화합물 A2를 지칭하고, CDK4/6 억제제는 화합물 B를 지칭한다. 각 박스는 특정한 치료 요법 (ALK x CDK, ALK 자체-교차, 또는 CDK 자체-교차)의 상승작용 스코어 범위를 나타내고; 박스 내의 수평 백선은 군 중앙값을 나타내고, 수직 실선은 군 표준 편차를 나타낸다. 검은 원은 이상치를 나타낸다.
도 4A, 4B 및 4C는 "히트(hit)" 상승작용적 조합물의 시각적 확인을 제공하는 산점도를 보여준다. 최대 조합 효능 값을 15종의 질환 (ALK 돌연변이체) 및 정상 (야생형) 신경모세포종 세포주에서 ALK 억제제 및 CDK4/6 억제제의 조합물, ALK 억제제 자체-교차, 및 CDK4/6 억제제 자체-교차의 상승작용 스코어 (표 2 및 3의 데이터 참조)에 대해 플롯팅하였다. 이들 플롯에는, 화합물 A1 및 A2를 사용하여 생성된 데이터만을 플롯팅하였으며; 즉, 본원에 사용된 바와 같이, ALK 억제제는 화합물 A1 또는 화합물 A2를 지칭하고, CDK4/6 억제제는 화합물 B를 지칭한다. 도 4A는 15종의 세포주에서 2종의 ALK 억제제인 화합물 A1 및 A2의 자체-교차 데이터로부터의 산점도이다. 상기 플롯은 ALK 질환에 대한 우선적 단일 작용제 효능을 보여준다. 도 4B는 CDK 억제제인 화합물 B의 자체-교차로부터의 데이터의 산점도이다. 상기 플롯은 최소 단일 작용제 효능 또는 상승작용을 보여준다. 도 4C는 ALK 억제제인 화합물 A1 및 A2 중 하나와 CDK 억제제인 화합물 B와의 조합물로부터의 데이터의 산점도이다. 플롯은 4종의 질환 (Lan-5, 켈리(Kelly), Lan-1, NB-1643) 및 2종의 정상 (NB-1, SK-N-BE) 세포주에서 상승작용 및 증가된 효능 둘 다를 유도하는 상호작용을 나타낸다.
도 5a, 5b, 5c 및 5d는 슈(Chou) 및 탈랄레이(Talalay) 조합 지수 원리를 기반으로 하는 약물 조합물 플롯 및 그의 해석의 전형적 예를 보여준다. 도 5a는 일정한 조합 비에 대한 Fa-CI 플롯이다. CI는 하기 식에 따라 슈에 의해 정의된 바와 같다: CI = (D)1 / (Dx)1 + (D)2 / (Dx)2 (여기서 (Dx)1 및 (Dx)2는 개별적으로 사용되는 경우에 주어진 수준의 항증식 효과를 생성하는데 필요한 화합물 D1 및 D2의 농도이고, 한편 (D)1 및 (D)2는 조합물로 사용되는 경우에 동일한 항증식 효과를 생성하는 이들의 농도임). 조합 지수는 상가작용적 효과 (CI =1), 길항작용 (CI >1) 또는 상승작용 (CI <1)으로 정의되는, 약물 상호작용의 정량적 척도이다. Fa는 단독으로 또는 조합으로 주어진 농도의 화합물에 의해 영향받은 세포의 분율로 정의되는 것인 영향받은 분율을 의미한다. Fa = 0은 용량에 따라 DMSO 대조군을 기준으로 하여 결정되고, Fa =1은 완전 반응 (생존 세포가 남아있지 않음)이다. 전형적으로, 본원에 사용된 바와 같이 Fa-CI 플롯은 상승작용을 평가하는데 사용된다. 도 5b는 ED50, ED75 및 ED90에서의 전형적 이소볼로그램이다. (D)1 및 (D)2는 각각 약물 1 및 약물 2의 농도를 의미한다. EDx는 X% 효과에서의 용량을 의미하고, 100% 효과는 생존 세포가 남아있지 않음을 의미한다. 도 5c는 상이한 비의 조합물에 대해 정규화된 이소볼로그램이다. 용어는 도 5b에 정의된 바와 같다. 도 5d는 Fa-DRI 플롯이고 (Chou and Chou, 1988; Chou and Martin, 2005), 여기서 DRI는 용량-감소 지수를 의미하고, 하기 식에 따라 CI와 관련이 있다: CI = (D)1/Dx)1 + (D)2/(Dx)2 = 1/(DRI)1 + 1/(DRI)2. DRI은 상승작용적 약물이 조합물로 주어지는 경우에 각 약물이 개별적으로 투여될 때와 동일한 효과 크기를 달성하면서 각 약물의 용량을 얼마나 감소시킬 수 있는지 추정한다.
도 6A, 6B, 6C, 6D, 6E 및 6F는 NB-1643 세포 (질환)에서 화합물 A1 및 B의 조합물, 화합물 A 및 화합물 B에 대한 약물 조합물 플롯을 보여준다: (6A) 중앙-효과 플롯; (6B) 용량-효과 곡선; ED50, ED75 및 ED90에서의 전형적 이소볼로그램; (6C) Fa-CI 플롯; (6D) Fa-logCI 플롯; (6E) 전형적 이소볼로그램; 및 (6F) 보존적 이소볼로그램. 플롯은 조합물이 시험된 농도 범위에 걸쳐 상승작용적이었음을 공동으로 입증하였다.
도 7A, 7B, 7C, 7D, 7E 및 7F는 SH-SY5Y (질환) 세포에서 화합물 A1 및 B의 조합물, 단독 화합물 A1 및 단독 화합물 B에 대한 약물 조합물 플롯을 보여준다: (7A) 중앙-효과 플롯; (7B) 용량-효과 곡선; (7C) Fa-CI 플롯; (7D) Fa-log(CI) 플롯; (7E) ED50, ED75 및 ED90에서의 전형적 이소볼로그램; 및 (7F) 보존적 이소볼로그램. 도 7C 내지 7F는 조합물이 저용량에서는 중간 정도로 상승작용적이고, 고용량에서는 상가작용적 또는 약간 길항작용적이었음을 보여준다.
도 8A, 8B, 8C, 8D, 8E 및 8F는 NB1691 (정상) 세포에서 화합물 A1 및 B의 조합물, 화합물 A 및 화합물 B에 대한 약물 조합물 플롯을 보여준다: (7A) 중앙-효과 플롯; (7B) 용량-효과 곡선; (7C) Fa-CI 플롯; (7D) Fa-log(CI) 플롯; (7E) ED50, ED75 및 ED90에서의 전형적 이소볼로그램; 및 (7F) 보존적 이소볼로그램. 도 8C 내지 8F는 조합물이 저용량에서는 강하게 상승작용적이고, 보다 고용량에서는 상가작용적이고, 높은 화합물 A1 용량에서는 길항작용적이었음을 입증한다.
도 9A, 9B, 9C, 9D, 9E 및 9F는 EDC1 (정상) 세포에서 화합물 A1 및 B의 조합물, 화합물 A 및 화합물 B에 대한 약물 조합물 플롯을 보여준다: (9A) 중앙-효과 플롯; (9B) 용량-효과 곡선; (9C) Fa-CI 플롯; (9D) Fa-log(CI) 플롯; (9E) ED50, ED75 및 ED90에서의 전형적 이소볼로그램; 및 (9F) 보존적 이소볼로그램. 도 9C 내지 9F는 조합물이 시험된 농도 범위에 걸쳐 상승작용적이었음을 입증한다.
도 10A, 10B, 10C 및 10D는 화합물 A1, B1, 또는 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리에 대한 반응에서 SH-SY5Y 세포의, 각 화합물의 IC 50에서의 및 처리 72시간 후의 형태를 보여준다: (a) 비히클; (b) 단독 화합물 A1에 의한 처리; (c) 단독 화합물 B에 의한 처리, 및 (d) 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리.
도 11A, 11B 및 11C는 (a) 단독 화합물 A1; (b) 단독 화합물 B, 및 (c) 동등효력 비 (각각의 화합물의 0, 1/4, 1/2, 1, 2 및 4배 IC50)로 조합된 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리 72시간 후, 아포톡스-글로(ApoTox-Glo)TM 트리플렉스 검정에 의해 분석된 NB1643 세포의 아폽토시스와 세포 생존율을 비교한다. 그 결과는 약물 치료가 세포 사멸을 증대시키지만, 단독 화합물 A1으로도 화합물 B와의 조합물과 동일한 수준의 아폽토시스가 관찰됨을 보여준다.
도 12A, 12B 및 12C는 (a) 단독 화합물 A1; (b) 단독 화합물 B, 및 (c) 동등효력 비로 조합된 화합물 A 및 B의 조합물에 의한 처리 72시간 후, CTG 검정에 의해 분석된 NB1643 세포의 생존율을 보여준다. 그 결과는 조합물 처리가 세포 사멸을 증대시킨다는 것을 확인시켜준다.
도 13A, 13B 및 13C는 (a) 단독 화합물 A1; (b) 단독 화합물 B, 및 (c) 동등효력 비 (각각의 화합물의 0, 1/4, 1/2, 1, 2 및 4배 IC50)로 조합된 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리 72시간 후, 아포톡스-글로TM 트리플렉스 검정에 의해 분석된, SH-SY5Y 세포의 아폽토시스와 세포 생존율을 비교한다. 그 결과는 공-치료가 세포 사멸을 증대시킴을 보여준다. 세포는 최고 농도에서 보다 초기에 사멸되어, 아폽토시스가 그 농도에서는 검출가능하지 않았다.
도 14A, 14B 및 14C는 (a) 단독 화합물 A1; (b) 단독 화합물 B, 및 (c) 동등효력 비 (각각의 화합물의 0, 1/4, 1/2, 1, 2, 및 4배 IC50)로 조합된 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리 72시간 후, 아포톡스-글로TM 트리플렉스 검정으로 분석된 EBC1 세포의 아폽토시스와 세포 생존율을 비교한다. 데이터는 공-치료에 의한 세포 사멸 또는 아폽토시스의 증대가 거의 없거나 또는 전혀 없음을 보여준다.
도 15는 비히클; 1/16, 1/8, 1/4 및 4배 IC50 용량의 화합물 A1; 1/16, 1/8, 1/4 및 4배 IC50 용량의 화합물 B; 및 각각의 화합물의 1/16, 1/8, 1/4 및 4배 IC50 용량의 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리 20시간 후 NB1643 세포에서 총 및 pALK 발현의 웨스턴 블롯(Western blot)을 보여준다. 그 결과는 공-치료가 1/16x의 IC50 용량에서 출발하여 NB1643 세포에서의 pALK 단백질 발현을 크게 감소시킨다는 것을 보여준다.
도 16은 비히클; 1/16, 1/8, 1/4 및 4배 IC50 용량의 화합물 A1; 1/16, 1/8, 1/4 및 4배 IC50 용량의 화합물 B; 및 각각의 화합물의 1/16, 1/8, 1/4 및 4배 IC50 용량의 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리 20시간 후 NB1643 세포에서의 총 Rb, 포스포-Rb S780 및 포스포-Rb S795 발현의 웨스턴 블롯을 보여준다. 그 결과는 공-치료가 1/16x의 IC50 용량에서 출발하여 NB1643 세포에서의 pRb 발현을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 조합물은 pRb S795 발현보다 pRb S780 발현을 감소시키는데 더 효과적이다.
도 17은 비히클; 1/4, 1/2, 1 및 4배 IC50 용량의 화합물 A1; 1/4, 1/2, 1 및 4배 IC50 용량의 화합물 B; 및 각각의 화합물의 1/4, 1/2, 1 및 4배 IC50 용량의 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한 처리 20시간 후 NBEBC1 세포에서의 ALK, pALK, 총 Rb 및 포스포-Rb S795 발현의 웨스턴 블롯을 보여준다. 그 결과는 공-치료가 pALK 및 pRb 단백질 발현의 감소에서 보다 효과적임을 보여준다.
도 18은 치료군 (1) 비히클 대조군, (2) 화합물 A1 50 mg/kg, (3) 화합물 B 187.5 내지 250 mg/kg, 및 (4) 화합물 A1 50 mg/kg 및 화합물 B 187.5 내지 250 mg/kg의 조합물에 대한 시간에 따른 CB17 SCID 마우스에서의 인간 신경모세포종 SH-SY5Y 이종이식편의 상대적 종양 부피를 보여준다. 화합물 B에 대한 용량은 250 mg/kg에서 출발하여 제5일에 187.5 mg/kg으로 감소되었다. 그 결과는 단독 화합물 A1에 의한 치료가 비히클 대조군과 비교하여 단지 약간의 종양 성장 지연을 유발하였음을 보여준다. 단독 화합물 B에 의한 치료는 보다 느린 종양 성장을 결과로 하였다. 공-치료는 기존의 종양을 효과적으로 수축시키고, 총 종양 완화를 달성하였다.
도 19A, 19B, 19C 및 19D는 상기 도 18에 기재된 각각의 치료군에서 개별 마우스에 대한 치료 지속기간 (주 단위)에 따른 종양 부피의 변동을 보여준다.
도 20은 상기 도 18에 기재된 각각의 치료군에서 치료 지속기간 (주 단위)에 대한 마우스의 생존 (백분율 단위)을 보여준다. 제7일에, 군 4로부터의 마우스 중 2마리가 사망하였고, 제14일에, 화합물 B 군으로부터의 1마리 마우스가 사망하였다. 대조군 및 화합물 A1 군의 마우스는 그의 종양의 크기 때문에 안락사시켰다.
도 21은 16종의 질환 (ALK 돌연변이체) 및 정상 (야생형) 신경모세포종 세포주에서 화합물 A1 및 화합물 B의 조합물, 및 그의 각각의 자체-교차로부터의 조합 약물 효과 (효능 대 상승작용 스코어) (표 10의 데이터 참고)의 산점도이다. 상승작용적 조합물 히트는 상승작용 스코어 >2 및 최대 효능 >100 (해석을 위해 도 4A, 4B 및 4C 참조) 둘 다를 갖는 것으로 확인되었다. 상단 플롯은 ALK 질환에 대한 우선적 단일 작용제 효능을 보여주는 화합물 A1 (ALK 억제제)의 자체-교차이다. 중간 플롯은 최소 단일 작용제 효능 또는 상승작용을 보여주는 화합물 B (CDK 억제제)의 자체-교차이다. 하단 플롯은 화합물 A1 및 B의 조합물이며, 이는 2종의 질환 (NB-1691, Lan-5) 및 1종의 정상 (NB-1691) 세포주에서 상승작용 및 증가된 효능 둘 다를 유도하는 상호작용을 보여준다.
도 22a, 22b는 켈리 인간 신경모세포종 세포의 증식에 대해 ALK 억제제 및 CDK4/6 억제제에 의한 공-치료의 용량 효과를 보여준다. 도 22a는 화합물 A1 (ALK 억제제) 및 화합물 B (CDK4/6 억제제)에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 이소볼로그램을 보여준다. 조합물은 상승작용 스코어 1.75의 중간 정도의 상승작용적이고, 이소볼로그램은 매우 강한 상호작용을 나타내었다. 도 22b는 화합물 A2 (ALK 억제제) 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 이소볼로그램을 보여준다. 조합물은 상승작용 스코어 1.48의 중간 정도의 상승작용적이고, 이소볼로그램은 매우 강한 상호작용을 나타내었다
도 23a, 23b, 23c 및 23d는 켈리 및 NB-1 신경모세포종 세포의 증식 대한 ALK 억제제 및 CDK4/6 억제제에 의한 공-치료의 용량 효과를 보여준다. 도 23a는 켈리 세포에서 화합물 A1 (ALK 억제제) 및 화합물 B (CDK4/6 억제제)에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여준다. 조합물은 계산된 상승작용 스코어 2.51로 상승작용적이었다. 도 23b는 켈리 세포에 대해 화합물 A2 (ALK 억제제) 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여준다. 조합물은 상승작용 스코어 2.29로 상승작용적이었다. 도 23c는 NB-1 인간 신경모세포종 세포의 증식에 대한 화합물 A1 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여준다. 조합물은 상승작용적이 아니었다. 도 23d는 인간 NB-1 신경모세포종 세포의 증식에 대한 화합물 A2 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여준다. 조합물은 상승작용적이 아니었다.
도 24a, 24b, 24c, 24d, 24e 및 24f는 켈리, NB-1 및 SH-SY5Y 신경모세포종 세포에서 ALK 억제제 및 CDK4/6 억제제에 의한 공-치료의 용량 효과를 보여준다. 도 24a는 켈리 세포의 증식에 대한 화합물 A1 (ALK 억제제) 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여주고; 상승작용 스코어는 0.820이었다. 도 24b는 켈리 인간 신경모세포종 세포에서 화합물 A2 (ALK 억제제) 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여주고; 상승작용 스코어 1.52이었다. 도 24c는 NB-1 인간 신경모세포종 세포에서 화합물 A1 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여주고; 조합물은 상승작용적이 아니었다. 도 24d는 NB-1 인간 신경모세포종 세포에서 화합물 A2 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여주고; 조합물은 상승작용적이 아니었다. 도 24e는 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에서 화합물 A1 및 화합물 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여준다. 도 24f는 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에서 화합물 A2 및 B에 의한 공-치료의 용량 효과를 입증하는 용량 행렬 및 로에베 초과 행렬을 보여준다.
정의
하기 일반적 정의는 본 발명을 보다 잘 이해하기 위해 제공된다:
"알킬"은 모이어티, 및 다른 군, 예를 들어 할로-치환된-알킬 및 알콕시의 구조적 요소로서의 모이어티를 지칭하며, 직쇄형이거나 분지형일 수 있다. 본원에 사용되는 임의로 치환된 알킬, 알케닐 또는 알키닐은 임의로 할로겐화될 수 있거나 (예를 들어, CF3), 또는 헤테로원자, 예컨대 NR, O 또는 S로 치환되거나 대체된 1개 이상의 탄소를 가질 수 있다 (예를 들어, -OCH2CH2O-, 알킬티올, 티오알콕시, 알킬아민 등).
"아릴"은 탄소 원자를 함유하는 모노시클릭 또는 융합된 비시클릭 방향족 고리를 지칭한다. "아릴렌"은 아릴 기로부터 유래된 2가 라디칼을 의미한다. 예를 들어, 아릴 기는 페닐, 인데닐, 인다닐, 나프틸 또는 1,2,3,4-테트라히드로나프탈레닐일 수 있으며, 이는 임의로 오르토, 메타 또는 파라 위치에서 치환될 수 있다.
본원에 사용되는 "헤테로아릴"은 상기 아릴에 대해 정의된 바와 같으며, 여기서 고리원 중 1개 이상은 헤테로원자이다. 헤테로아릴의 예는 피리딜, 피라지닐, 인돌릴, 인다졸릴, 퀴녹살리닐, 퀴놀리닐, 벤조푸라닐, 벤조피라닐, 벤조티오피라닐, 벤조[1,3]디옥솔, 이미다졸릴, 벤조-이미다졸릴, 피리미디닐, 푸라닐, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 트리아졸릴, 벤조트리아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 티에닐, 피롤릴, 이소퀴놀리닐, 퓨리닐, 티아졸릴, 테트라지닐, 벤조티아졸릴, 옥사디아졸릴, 벤족사디아졸릴 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용되는 "카르보시클릭 고리"는, 예를 들어 =O로 임의로 치환될 수 있는 탄소 원자를 함유하는 포화 또는 부분 불포화, 모노시클릭, 융합된 비시클릭 또는 가교된 폴리시클릭 고리를 지칭한다. 카르보시클릭 고리의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로프로필렌, 시클로헥사논 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용되는 "헤테로시클릭 고리"는 상기 카르보시클릭 고리에 대해 정의된 바와 같으며, 여기서 1개 이상의 고리 탄소는 헤테로원자이다. 예를 들어, 헤테로시클릭 고리는 N, O, S, -N=, -S-, -S(O), -S(O)2- 또는 -NR-을 함유할 수 있으며, 여기서 R은 수소, C1- 4알킬 또는 보호기일 수 있다. 헤테로시클릭 고리의 예는 모르폴리노, 피롤리디닐, 피롤리디닐-2-온, 피페라지닐, 피페리디닐, 피페리디닐온, 1,4-디옥사-8-아자-스피로[4.5]데스-8-일, 1,2,3,4-테트라히드로퀴놀리닐 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용되는 헤테로시클릭 고리는 비시클릭 아민 및 비시클릭 디아민을 포괄할 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 통상적으로 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 보다 바람직하게는 10% 이내, 가장 바람직하게는 또한 5% 이내를 의미한다. 대안적으로, 특히 생물계에서 용어 "약"은 주어진 값의 대략 로그값 (즉, 한 자릿수) 이내, 바람직하게는 2배 이내를 의미한다.
본원에 사용된 "역형성 림프종 키나제 (ALK) 억제제"는 효소의 키나제 활성을 억제하는 화합물에 관한 것이다. 이러한 화합물은 "ALK 억제제"로서 지칭될 것이다.
"ALK 저항성 종양 또는 암"은, 이전 ALK 억제제에 의한 치료에 유리하게 반응하는데 실패하거나, 또는 대안적으로 ALK 억제제에 유리하게 반응한 후에 재발 또는 악화되는 암 또는 종양을 지칭한다. 암 또는 종양은 치료 초기에 내성 또는 불응성일 수 있거나, 또는 치료 동안에 내성 또는 불응성이 될 수 있다.
"공-투여하다", "공-투여" 또는 "조합 투여" 등은 단일 환자에게 선택된 치료제를 투여하는 것을 포괄하는 것으로 의도되며, 작용제가 반드시 동일한 투여 경로에 의해 또는 동시에 투여되는 것은 아닌 치료 요법을 포함하고자 한다.
"조합물"은 하나의 투여 단위 형태의 고정 조합물, 또는 화합물과 조합 파트너 (예를 들어 "치료제", "작용제" 또는 "공동-작용제"로도 지칭되는, 하기에 설명되는 바와 같은 또 다른 약물)가 독립적으로 동시에, 또는 특히 시간 간격이 조합 파트너가 협동 효과, 예를 들어 상승작용적 효과를 나타내는 것을 가능하게 하는 경우에 시간 간격 이내에 개별적으로 투여될 수 있는 조합 투여를 위한 비-고정 조합물 (또는 부분들의 키트)을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "조합 투여" 등은 이를 필요로 하는 단일 대상체 (예를 들어 환자)에게 선택된 조합 파트너를 투여하는 것을 포괄하는 것으로 의도되며, 작용제들이 반드시 동일한 투여 경로에 의해 또는 동시에 투여되는 것은 아닌 치료 요법을 포함하고자 한다. 용어 "고정 조합물"은 활성 성분, 예를 들어 화학식 A1의 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 단일 실체 또는 투여형의 형태로 동시에 환자에게 투여된다는 것을 의미한다. 용어 "비-고정 조합물" 또는 "부분들의 키트"는 활성 성분, 예를 들어 화학식 A1의 화합물 및 조합 파트너가 둘 다 구체적인 시간 제한 없이 동시에, 공동으로 또는 순차적으로 개별 개체로서 환자에게 투여되며, 여기서 이러한 투여가 환자의 신체에서 치료상 유효한 수준의 2종의 화합물을 제공하는 것을 의미한다.
본원에 정의된 바와 같은 "시클린 의존성 키나제 (CDK) 억제제"는 시클린-CDK 복합체와 상호작용하여 키나제 활성을 차단하는 소분자를 지칭한다.
"용량 범위"는 명시된 치료제 양의 허용가능한 변화의 상한치 및 하한치를 지칭한다. 전형적으로, 명시된 범위 이내의 임의의 양의 작용제의 용량이 치료가 진행 중인 환자에게 투여될 수 있다.
조합 요법에 관한 "연합 치료 유효량"은 함께, 독립적으로 동시에, 또는 적절한 시간 간격 내에 개별적으로 투여될 수 있는 각각의 조합 파트너의 양을 의미하며, 여기서 조합 파트너는 그를 필요로 하는 환자에서의 질환 증상을 완화, 진행 지연 또는 억제하는데 있어서 공동으로 유익한/치료 효과를 발휘한다.
"제약상 허용되는"은, 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 및 다른 문제가 되는 합병증이 없이 포유동물, 특히 인간의 조직과의 접촉에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭한다.
"제약 제제" 또는 "제약 조성물"은 온혈 포유동물, 예를 들어 인간에게 투여되어 포유동물에게 영향을 주는 특정한 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 제어하는, 적어도 하나의 치료 화합물을 함유하는 혼합물 또는 용액을 지칭한다.
"염" ("또는 그의 염들" 또는 "또는 그의 염"이 의미하는 것)은 단독으로, 또는 유리 화합물, 예컨대 화학식 I의 화합물과의 혼합물로 존재할 수 있고, 바람직하게는 제약상 허용되는 염이다. 이러한 화학식 I의 화합물의 염은, 예를 들어, 염기성 질소 원자를 갖는 화학식 I의 화합물로부터, 바람직하게는 유기 또는 무기 산과의 산 부가염으로서 형성된다. 적합한 무기 산은, 예를 들어 할로겐산, 예컨대 염산, 황산 또는 인산이다. 적합한 유기 산은, 예를 들어 카르복실산 또는 술폰산, 예컨대 푸마르산 또는 메탄술폰산이다. 단리 또는 정제 목적을 위해, 제약상 허용되지 않는 염, 예를 들어 피크레이트 또는 퍼클로레이트를 사용하는 것이 또한 가능하다. 치료 용도를 위해, 제약상 허용되는 염 또는 유리 화합물 만이 사용되고 (제약 제제의 형태로 적용가능한 경우에), 따라서 이들이 바람직하다. 유리 형태의 신규 화합물과, 예를 들어, 신규 화합물의 정제 또는 확인에서 중간체로서 사용될 수 있는 염을 비롯한 그의 염 형태의 신규 화합물 사이의 밀접한 관계를 고려할 때, 상기 및 하기의 유리 화합물에 대한 임의의 언급은, 적절한 경우에 및 편의상 상응하는 염을 또한 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 화학식 I의 화합물의 염은 바람직하게는 제약상 허용되는 염이며; 제약상 허용되는 염을 형성하는 적합한 반대-이온은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
"단일 제약 조성물"은 유효량의 두 치료제를 환자에게 전달하도록 제제화된 단일 담체 또는 비히클을 지칭한다. 단일 비히클은 임의의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 유효량의 각각의 작용제를 전달하도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 비히클은 정제, 캡슐, 환제 또는 패치이다. 다른 실시양태에서, 비히클은 용액 또는 현탁액이다.
"대상체", "환자" 또는 "온혈 동물"은 동물을 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예는 포유동물, 예를 들어 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 래트 및 트랜스제닉 비-인간 동물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간, 예를 들어 뇌 종양 질환을 앓고 있는, 앓을 위험이 있는, 또는 잠재적으로 앓을 가능성이 있는 인간이다. 특히 바람직하게는, 대상체 또는 온혈 동물은 인간이다.
"치료상 유효한"은 바람직하게는 증식성 질환의 진행에 대하여 치료적으로, 또는 더 넓은 의미에서는 또한 예방적으로 유효한 치료제의 양에 관한 것이다.
"치료"는 암 질환 또는 장애의 예방적 및 치유적 치료 (경감, 치유, 증상-완화, 증상-감소를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 뿐만 아니라 그의 진행의 지연을 포함한다. 용어 "예방적"은 암의 발병 또는 재발의 예방을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "진행의 지연"은 치료할 암의 전구-단계 또는 초기 단계 (상응하는 암의 전구-형태가 진단됨)에 있는 환자에게 및/또는 상응하는 암이 발병할 것으로 예상되는 상태로 진단된 환자에서 조합물을 투여하는 것을 의미한다.
"억제"
바람직한 실시양태의 기재
본 발명은 (a) 역형성 림프종 키나제 (ALK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제1 작용제 및 (b) 시클린-의존성 키나제 (CDK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제2 작용제를 개별적으로 또는 함께 포함하는 제약 조합물에 관한 것이다. 이러한 조합물은 증식성 질환의 치료를 위해 동시, 개별 또는 순차적 사용을 위한 것일 수 있다.
본 발명의 조합물에 사용하기 위한 적합한 ALK 억제제는 하기 화학식 A의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다:
<화학식 A>
상기 식에서,
W는 
이고;
A1 및 A4는 독립적으로 C 또는 N이고;
각각의 A2 및 A3은 C이거나, 또는 R6 및 R7이 고리를 형성하는 경우에 A2 및 A3 중 하나는 N이고;
B 및 C는 독립적으로 임의로 치환된 5-7원 카르보시클릭 고리, 아릴, 또는 N, O 또는 S를 함유하는 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 고리이고;
Z1, Z2 및 Z3은 독립적으로 NR11, C=O, CR-OR, (CR2)1-2 또는 =C-R12이고;
R1 및 R2는 독립적으로 할로, OR12, NR(R12), SR12, 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐이거나; 또는 R1 및 R2 중 하나는 H이고;
R3은 (CR2)0- 2SO2R12, (CR2)0- 2SO2NRR12, (CR2)0- 2CO1 - 2R12, (CR2)0- 2CONRR12 또는 시아노이고;
R4, R6, R7 및 R10은 독립적으로 임의로 치환된 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐; OR12, NR(R12), 할로, 니트로, SO2R12, (CR2)pR13 또는 X이거나; 또는 R4, R7 및 R10은 독립적으로 H이고;
R, R5 및 R5'는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고;
R8 및 R9는 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 할로 또는 X이거나, 또는 R1 및 R2가 고리를 형성하는 경우에 R8 및 R9 중 하나는 H이며; 단 R8 및 R9 중 하나는 X이고;
다르게는, R1 및 R2, 또는 R6 및 R7, R7 및 R8, 또는 R9 및 R10은 탄소 원자에 부착된 경우에 임의로 치환된 5-7원 모노시클릭 또는 융합된 카르보시클릭 고리, 아릴, 또는 N, O 및/또는 S를 포함하는 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있거나; 또는 R7, R8, R9 및 R10은 N에 부착된 경우에 부재하고;
R11은 H, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, (CR2)pCO1 -2R, (CR2)pOR, (CR2)pR13, (CR2)pNRR12, (CR2)pCONRR12 또는 (CR2)pSO1 - 2R12이고;
R12 및 R13은 독립적으로 임의로 치환된 3-7원 포화 또는 부분 불포화 카르보시클릭 고리, 또는 N, O 및/또는 S를 포함하는 5-7원 헤테로시클릭 고리; 아릴 또는 헤테로아릴이거나; 또는 R12는 H, C1-6 알킬이고;
X는 (CR2)qY, 시아노, CO1- 2R12, CONR(R12), CONR(CR2)pNR(R12), CONR(CR2)pOR12, CONR(CR2)pSR12, CONR(CR2)pS(O)1 - 2R12 또는 (CR2)1- 6NR(CR2)pOR12이고;
Y는 임의로 치환된 3-12원 카르보시클릭 고리, 5-12원 아릴, 또는 N, O 및/또는 S를 포함하는 5-12원 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 고리이고, (CR2)qY에서 q가 0인 경우에 상기 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 고리의 탄소 원자를 통해 A2 또는 A3 또는 둘 다에 부착되고;
n, p 및 q는 독립적으로 0-4이다.
화학식 A의 한 변형에서, W는 
이고, 여기서 A1, A2, A3, A4, R6, R7, R8, R9 및 R10는 상기 정의된 바와 같다.
또 다른 변형에서, ALK 억제제는 하기 화학식 A1의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
<화학식 A1>
상기 식에서,
R1은 할로 또는 C1-6 알킬이고;
R2는 H이고;
R3은 (CR2)0- 2SO2R12이고;
R4는 C1-6 알킬, C2-6 알케닐 또는 C2-6 알키닐; OR12, NR(R12), 할로, 니트로, SO2R12, (CR2)pR13 또는 X이거나; 또는 R4는 H이고;
R6은 이소프로폭시 또는 메톡시이고;
R8 및 R9 중 하나는 (CR2)qY이고, 다른 것은 C1-6 알킬, 시아노, C(O)O0- 1R12, CONR(R12) 또는 CONR(CR2)pNR(R12)이고;
X는 (CR2)qY, 시아노, C(O)O0- 1R12, CONR(R12), CONR(CR2)pNR(R12), CONR(CR2)pOR12, CONR(CR2)pSR12, CONR(CR2)pS(O)1 - 2R12 또는 (CR2)1- 6NR(CR2)pOR12이고;
Y는 피롤리디닐, 피페리디닐 또는 아제티디닐이고, 이들 각각은 탄소 원자를 통해 페닐 고리에 부착되고;
R12 및 R13는 독립적으로 3-7원 포화 또는 부분 불포화 카르보시클릭 고리, 또는 N, O 및/또는 S를 포함하는 5-7원 헤테로시클릭 고리; 아릴 또는 헤테로아릴이거나; 또는 R12는 H 또는 C1-6 알킬이고;
R은 H 또는 C1-6 알킬이고;
n은 0-1이다.
또 다른 변형에서, ALK 억제제는 하기 화학식 A2의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
<화학식 A2>
상기 식에서,
R1 및 R2는 함께 임의로 치환된 5 내지 6원 아릴, 또는 1-3개의 질소 원자를 포함하는 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
R3은 (CR2)0- 2SO2R12, (CR2)0- 2SO2NRR12, (CR2)0- 2C(O)O0 - 1R12, (CR2)0- 2CONRR12, CO2NH2 또는 시아노이고;
R, R5 및 R5'는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이고;
R6은 할로 또는 O(C1-6 알킬)이고;
R8 및 R9는 독립적으로 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, 할로 또는 X이거나, 또는 R8 및 R9 중 하나는 H이며; 단 R8 및 R9 중 하나는 X이고;
X는 (CR2)qY, 시아노, C(O)O0- 1R12, CONR(R12), CONR(CR2)pNR(R12), CONR(CR2)pOR12, CONR(CR2)pSR12, CONR(CR2)pS(O)1 - 2R12 또는 (CR2)1- 6NR(CR2)pOR12이고;
Y는 임의로 치환된 3-12원 카르보시클릭 고리, 5-12원 아릴, 또는 N, O 및/또는 S를 포함하는 5-12원 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 고리이고, (CR2)qY에서 q가 0인 경우에 상기 헤테로아릴 또는 헤테로시클릭 고리의 탄소 원자를 통해 A2 또는 A3 또는 둘 다에 부착되고;
R12는 임의로 치환된 3-7원 포화 또는 부분 불포화 카르보시클릭 고리, 또는 N, O 및/또는 S를 포함하는 5-7원 헤테로시클릭 고리; 아릴 또는 헤테로아릴이거나; 또는 R12는 H, C1-6 알킬이고;
p 및 q는 독립적으로 0-4이다.
본 발명의 조합물의 일부 실시양태에서, ALK 억제제는 하기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염으로부터 선택된다:
본 발명의 조합물의 또 다른 실시양태에서, ALK 억제제는 하기 화합물로부터 선택된다:
본 발명의 조합물의 한 바람직한 실시양태에서, ALK 억제제는 하기의 5-클로로-N2-(2-이소프로폭시-5-메틸-4-(피페리딘-4-일)페닐)-N4-[2-(프로판-2-술포닐)-페닐]-피리미딘-2,4-디아민인 화합물 A1 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
<화합물 A1>
또 다른 바람직한 실시양태에서, ALK 억제제는 하기의 N6-(2-이소프로폭시-5-메틸-4-(1-메틸피페리딘-4-일)페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4,6-디아민인 화합물 A2 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
<화합물 A2>
여전히 또 다른 바람직한 실시양태에서, ALK 억제제는 하기 (R)-3-(1-(2,6-디클로로-3-플루오로페닐)에톡시)-5-(1-(피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)피리딘-2-아민인 화합물 A3 (크리조티닙(Crizotinib) 및 상표명 잘코리(XALKORI)®로 일반적으로 공지되어 있음) 또는 그의 제약상 허용되는 염이다:
<화합물 A3>
조합물의 한 실시양태에서, CDK 억제제는 CDK4 또는 CDK6 억제제이다. 한 변형에서, CDK 억제제는 CDK4 억제제이다. 또 다른 변형에서, CDK 억제제는 CDK6 억제제이다. 또 다른 변형에서, CDK 억제제는 CDK4 및 CDK6 이중 억제제이다.
적합한 CDK 억제제는 하기 화학식 B의 화합물 또는 제약상 허용되는 염을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다:
<화학식 B>
상기 식에서,
X는 CR9 또는 N이고;
R1은 C1- 8알킬, CN, C(O)OR4 또는 CONR5R6, 5-14원 헤테로아릴 기 또는 3-14원 시클로헤테로알킬 기이고;
R2는 C1- 8알킬, C3-14시클로알킬 또는 5-14원 헤테로아릴 기이고, 여기서 R2는 하나 이상의 C1- 8알킬 또는 OH로 치환될 수 있고;
L은 결합, C1- 8알킬렌, C(O) 또는 C(O)NR10이고, 여기서 L은 치환되거나 비치환될 수 있고;
Y는 H, R11, NR12R13, OH이거나, 또는 Y는 하기 기의 일부이고,
여기서 Y는 CR9 또는 N이고; 여기서 0-3개의 R8이 존재할 수 있고, R8은 C1- 8알킬, 옥소, 할로겐이거나, 또는 2개 이상의 R8은 가교된 알킬 기를 형성할 수 있고;
W는 CR9 또는 N이고;
R3은 H, C1- 8알킬, C1- 8알킬R14, C3- 14시클로알킬, C(O)C1-8 알킬, C1- 8할로알킬, C1-8알킬OH, C(O)NR14R15, C1- 8시아노알킬, C(O)R14, C0-8알킬C(O)C0 - 8알킬NR14R15, C0- 8알킬C(O)OR14, NR14R15, SO2C1 - 8알킬, C1- 8알킬C3 - 14시클로알킬, C(O)C1- 8알킬C3 - 14시클로알킬, C1- 8알콕시 또는 OH이고, 여기서 R3이 H가 아닌 경우에 이는 치환되거나 비치환될 수 있고;
R9는 H 또는 할로겐이고;
R4, R5, R6, R7, R10, R11, R12, R13, R14 및 R15는 각각 독립적으로 H, C1- 8알킬, C3-14시클로알킬, 3-14원 시클로헤테로알킬 기, C6- 14아릴 기, 5-14원 헤테로아릴 기, 알콕시, C(O)H, C(N)OH, C(N)OCH3, C(O)C1- 3알킬, C1- 8알킬NH2, C1-6 알킬OH로부터 선택되고, 여기서 R4, R5, R6, R7, R10, R11, R12, 및 R13, R14 및 R15가 H가 아닌 경우에 이는 치환되거나 비치환될 수 있고;
m 및 n은 독립적으로 0-2이고;
여기서 L, R3, R4, R5, R6, R7, R10, R11, R12, 및 R13, R14 및 R15는 C1- 8알킬, C2- 8알케닐, C2- 8알키닐, C3- 14시클로알킬, 5-14원 헤테로아릴 기, C6- 14아릴 기, 3-14원 시클로헤테로알킬 기, OH, (O), CN, 알콕시, 할로겐 또는 NH2 중 하나 이상으로 치환될 수 있다.
한 실시양태에서, CDK 억제제는 하기 화학식에 의해 기재된 7-시클로펜틸-N,N-디메틸-2-((5-(피페라진-1-일)피리딘-2-일)아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드인 화합물 B1이다:
<화합물 B1>
본 발명의 제약 조합물의 구체적 실시양태는 다음을 포함한다:
(1) 화합물 A1 및 화합물 B1을 포함하는 조합물;
(2) 화합물 A2 및 화합물 B1을 포함하는 조합물; 및
(3) 화합물 A3 및 화합물 B1을 포함하는 조합물.
또한, 상기 제시된 2종 초과의 개별 활성 성분의 조합물이 본 발명의 범위 내에 있고, 즉 본 발명의 범위 내의 제약 조합물은 3종의 활성 성분 또는 그 초과를 포함할 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 화합물의 구조 및 그의 화학 명칭 사이에 불일치가 존재한다면, 화합물의 구조가 우세하다.
상기 화학식 (A, A1, A2 및 B), 특히 화합물 A1-A3 및 B의 화합물은 그의 유리 염기 또는 그의 임의의 염의 형태로 본 발명의 조합물에 혼입될 수 있다. 염은 단독으로 또는 유리 화합물과의 혼합물로 존재할 수 있고, 바람직하게는 제약상 허용되는 염이다. 화합물의 이러한 염은 염기성 질소 원자를 갖는, 바람직하게는 유기 또는 무기 산을 사용하여, 예를 들면, 산 부가염으로서 형성된다. 적합한 무기 산은, 예를 들어 할로겐 산, 예컨대 염산, 황산 또는 인산이다. 적합한 유기 산은, 예를 들어 숙신산, 카르복실산 또는 술폰산, 예컨대 푸마르산 또는 메탄술폰산이다. 단리 또는 정제 목적을 위해, 제약상 허용되지 않는 염, 예를 들어 피크레이트 또는 퍼클로레이트를 사용하는 것이 또한 가능하다. 치료 용도를 위해, 제약상 허용되는 염 또는 유리 화합물 만이 사용되고 (제약 제제의 형태로 적용가능한 경우에), 따라서 이들이 바람직하다.
마찬가지로, 그의 제약상 허용되는 염, 상응하는 라세미체, 부분입체이성질체, 거울상이성질체, 호변이성질체, 뿐만 아니라 존재하는 경우에 상기 개시된 화합물의 상응하는 결정 변형체, 예를 들어 용매화물, 수화물 및 다형체가 포함되며, 이들은 그 내에 개시되어 있다. 본 발명의 조합물에서 활성 성분으로 사용되는 화합물은 각각 인용 문헌에 기재된 바와 같이 제조 및 투여될 수 있다.
약리학 및 유용성
본 발명의 조합물의 개별 파트너가 억제 활성을 갖는 것으로 공지되어 있는 화합물인 것에 유의한다. 놀랍게도, 본 발명에 이르러 본 발명의 조합물(들) 및 그의 제약상 허용되는 염이 시험관내 세포-무함유 키나제 검정에서 및 세포 검정에서 및 생체내 암 마우스 모델에서 시험되는 경우에 유익한 협동 (예를 들어, 상승작용적) 치료적 특성을 나타내고, 따라서 이를 증식성 질환, 특히 암의 치료에 유용하게 함으로써 유용해지는 것으로 발견되었다. 용어 "증식성 질환"은 암, 종양, 증식증, 재협착, 심장 비대, 면역 장애 및 염증을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 증식성 질환, 특히 암의 치료에 사용하기 위한, (a) 역형성 림프종 키나제 (ALK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제1 작용제 및 (b) 시클린-의존성 키나제 (CDK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제2 작용제를 개별적으로 또는 함께 포함하는 제약 조합물에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 증식성 질환, 특히 암의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, (a) 역형성 림프종 키나제 (ALK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제1 작용제 및 (b) 시클린-의존성 키나제 (CDK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제2 작용제를 개별적으로 또는 함께 포함하는 제약 조합물의 용도를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 추가로, 증식성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 (a) 역형성 림프종 키나제 (ALK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제1 작용제 및 (b) 시클린-의존성 키나제 (CDK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제2 작용제를 포함하는 연합 치료 유효량의 제약 조합물 또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 증식성 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 제1 작용제 및 제2 작용제는 단일 제약 조성물로 함께, 개별 제약 조성물로 독립적으로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 증식성 질환, 예컨대 암을 앓는 포유동물, 특히 인간을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 조합물로 치료될 수 있는 증식성 질환에 대한 예는 예를 들어 암, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 육종, 신경모세포종, 림프종, 폐암, 기관지암, 전립선암, 유방암 (산발성 유방암, 및 코우덴병 환자 포함), 췌장암, 위장암, 결장암, 직장암, 결장암, 결장직장암 선종, 갑상선암, 간암, 간내 담관암, 간세포암, 부신암, 위암, 위의 암, 신경교종, 교모세포종, 자궁내막암, 흑색종, 신장암, 신우암, 방광암, 자궁체부암, 자궁경부암, 질암, 난소암, 다발성 골수종, 식도암, 백혈병, 급성 골수 백혈병, 만성 골수 백혈병, 림프구성 백혈병, 골수성 백혈병, 뇌암, 뇌 암종, 구강 및 인두암, 후두암, 소장암, 비-호지킨 림프종, 흑색종, 융모성 결장 선종, 신생물, 상피 특징의 신생물, 유방 암종, 기저 세포 암종, 역형성 대세포 림프종, 비-소세포 폐 암종, 편평 세포 암종, 광선 각화증, 종양 질환 (고형 종양 포함), 두경부 종양, 진성 다혈구혈증, 본태성 혈소판혈증, 골수 화생을 동반한 골수섬유증, 염증성 유방암, 및 발덴스트룀병이다.
추가의 예는 진성 다혈구혈증, 본태성 혈소판혈증, 골수 화생을 동반한 골수섬유증, 천식, COPD, ARDS, 뢰플러 증후군, 호산구성 폐렴, 기생충 (특히 후생동물) 감염 (열대성 호산구증가증 포함), 기관지폐 아스페르길루스증, 결절성 다발동맥염 (처그-스트라우스 증후군 포함), 호산구성 육아종, 약물-반응에 의해 유발되어 기도에 영향을 미치는 호산구-관련 장애, 건선, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 원형 탈모증, 다형성 홍반, 포진성 피부염, 경피증, 백반증, 과민성 혈관염, 두드러기, 수포성 유천포창, 홍반성 루푸스, 천포창, 후천성 수포성 표피박리증, 자가면역 혈액 장애 (예를 들어 용혈성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 순수 적혈구 빈혈 및 특발성 혈소판감소증), 전신 홍반성 루푸스, 다발연골염, 경비증, 베게너 육아종증, 피부근염, 만성 활성 간염, 중증 근무력증, 스티븐-존슨 증후군, 특발성 스프루, 자가면역 염증성 장 질환 (예를 들어 궤양성 결장염 및 크론병), 내분비 안병증, 그레이브스병, 사르코이드증, 폐포염, 만성 과민성 폐렴, 다발성 경화증, 원발성 담즙성 간경변증, 포도막염 (전방 및 후방), 간질성 폐 섬유증, 건선성 관절염, 사구체신염, 심혈관 질환, 아테롬성동맥경화증, 고혈압, 심부 정맥 혈전증, 졸중, 심근경색, 불안정형 협심증, 혈전색전증, 폐 색전증, 혈전용해 질환, 급성 동맥 허혈, 말초 혈전성 폐쇄, 및 관상 동맥 질환, 재관류 손상, 망막병증, 예컨대 당뇨병성 망막병증 또는 고압 산소-유도 망막병증, 및 안내압 또는 안구 방수의 분비를 특징으로 하는 상태, 예컨대 녹내장을 포함한다.
암, 종양, 종양 질환, 육종 또는 암이 언급되는 경우에, 또한 최초의 기관 또는 조직 및/또는 임의의 다른 위치에서의 전이가 종양 및/또는 전이의 위치에 관계없이 대안적으로 또는 추가적으로 암시된다.
본 발명의 ALK 및 CDK4/6 억제제의 조합물은 ALK 양성 암, 즉 역형성 림프종 키나제 (ALK)에 의해 매개되는/에 의존적인 암의 치료에 특히 유용하다. 본원에 나타낸 데이터는 본 발명의 조합물이 ALK 유전자 및/또는 단백질의 과다발현 또는 증폭 및/또는 체세포 돌연변이를 나타내는 암, 특히 신경모세포종을 치료하는데 효과적임을 나타낸다.
본 발명의 ALK 및 CDK4/6 억제제의 조합물은 또한 ALK 내성 종양 또는 암을 치료하는데 유용할 수 있다. ALK 억제제로 치료되는 경우에 종양 내성에 대한 하나의 메카니즘은 ALK 유전자에서 나타나는 돌연변이에 대한 것이다. 이 메카니즘은 ALK 양성 종양 (대부분 비소세포 폐 암종)을 갖는 크리조티닙 치료된 환자에서의 임상 시험에서 입증되었다. 이러한 내성 돌연변이의 일부는 신경모세포종에서 발견된 돌연변이와 유사하다. 이론에 얽매이기를 원하지는 않지만, 이러한 내성 돌연변이가 종양의 증식을 추가로 추진하도록 ALK의 활성화를 유도하는 것으로 가정된다. 예를 들어, ALK의 T1151/L1152/C1156 영역 및 I1171/F1174 영역에서의 돌연변이는 신경모세포종 돌연변이와 유사하다. 본 발명의 ALK 억제제 및 CDK 억제제의 조합물이 증폭 돌연변이를 갖는 신경모세포종 종양에 효과적이기 때문에, 조합물은 이러한 ALK 내성 종양에서 효과적일 것이다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 조합물은 ALK 유전자의 증폭에 의존적인 증식성 질환을 치료하는데 있어서 유용하다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조합물은 ALK 유전자의 돌연변이에 의존적인 증식성 질환을 치료하는데 있어서 유용하다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조합물은 ALK 유전자의 돌연변이 및 증폭에 의존적인 증식성 질환을 치료하는데 있어서 유용하다.
한 실시양태에서, 세포 증식성 질환은 림프종, 골육종, 흑색종, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 결장직장 종양, 갑상선 종양, 난소 종양, 췌장 종양, 뉴런 종양, 폐 종양, 자궁 종양 또는 위장 종양, ALK 내성 종양, 염증성 유방암, 역형성 대세포 림프종, 비소세포 폐 암종 및 신경모세포종으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 세포 증식성 질환은 역형성 대세포 림프종이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 세포 증식성 질환은 비소세포 폐 암종이다. 아직 또 다른 바람직한 실시양태에서, 세포 증식성 질환은 역형성 대세포 림프종이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 세포 증식성 질환은 신경모세포종이다. 여전히 또 다른 바람직한 실시양태에서, 세포 증식성 질환은 ALK 내성 종양이다.
시험관내 및 생체내 연구는 본 발명의 제약 조합물의 투여가 본 발명의 조합물에 사용되는 단 하나의 작용제 (a) 또는 작용제 (b)를 적용하는 단독요법과 비교하여 증상을 완화하거나, 증상 진행을 지연시키거나 또는 증상을 억제하는 것과 관련하여 유익한 효과, 예를 들어, 상승작용적 치료 효과를 생성하였다는 것을 입증하였다. 소량의 활성 성분이 사용될 수 있는, 예를 들어 투여량이 보다 적고/거나 덜 빈번하게 투여될 수 있는 경우의 이익은 부작용의 발생율 또는 심각성을 감소시킬 수 있으며, 이는 삶의 질을 개선하거나 이환율을 감소시킬 수 있다. 이는 치료할 환자의 목적 및 요건에 따른다. 시험관내 및 생체내 연구의 결과는 하기 실시예 섹션에 보고되어 있다.
본 발명의 ALK 억제제 및 CDK 억제제의 조합물이 우수한 치료역 및 다른 이점을 갖는 증식성 질환의 유효 치료에 특히 적합하다는 것을 입증하기 위해, 임상 시험은 통상의 기술자에게 공지된 방식으로 수행될 수 있다.
적합한 임상 연구는, 예를 들어, 증식성 질환에 걸린 환자에서의 개방 표지 용량 증량 연구이다. 이러한 연구는 특히 본 발명의 조합물의 활성 성분의 상승작용을 입증한다. 유익한 효과는 통상의 기술자에게 그와 같이 공지된 이러한 연구의 결과를 통해 직접 측정될 수 있다. 이러한 연구는 특히 활성 성분을 사용한 단독요법과 본 발명의 조합물의 효과를 비교하기에 적합하다. 바람직하게는, 작용제 (a)의 용량은 최대 허용 투여량에 도달할 때까지 증가되며, 작용제 (b)는 고정 용량으로 투여된다. 다르게는, 작용제 (a)는 고정 용량으로 투여되며, 작용제 (b)의 용량은 증가된다. 각 환자는 작용제 (a)의 용량을 매일 또는 간헐적으로 제공받는다. 치료 효능은 이러한 연구에서, 예를 들어 12, 18 또는 24주 후 매 6주마다 증상 스코어의 평가에 의해 결정될 수 있다.
제약 조성물, 투여 및 투여량
본 발명의 한 목적은 증식성 질환의 표적화 또는 예방에 연합 치료상 유효한 양의 본 발명의 각 조합 파트너 작용제 (a) 및 (b)를 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 역형성 림프종 키나제 (ALK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제1 작용제 및 (b) 시클린-의존성 키나제 (CDK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제2 작용제를 개별적으로 또는 함께 포함하는 제약 조합물, 및 적어도 1종의 부형제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. ALK 억제제 및 CDK 억제제는 본 발명의 조합물의 용도에 적합하고, 한 실시양태에서 본 발명의 이러한 제약 조성물은 증식성 질환의 치료에 사용하기 위한 것이다. 본 발명에 따르면, 작용제 (a) 및 작용제 (b)는 단일 제약 조성물로써 함께, 하나의 조합된 단위 투여 형태로 또는 2개의 개별 단위 투여 형태로 개별적으로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 단위 투여 형태는 또한 고정 조합물일 수 있다.
본 발명에 따른, 작용제의 개별 투여를 위한 또는 고정 조합물로의 투여를 위한 제약 조성물 (즉, 적어도 2종의 조합 파트너 (a) 및 (b)를 포함하는 단일 생약 조성물)은 그 자체로 공지된 방식으로 제조될 수 있고, 포유동물 (온혈 동물), 예컨대 인간을 비롯한 대상체에게 경장, 예컨대 경구 또는 직장, 국소 및 비경구 투여에 적합한 것이며, 예를 들어 상기 나타낸 바와 같이, 치료 유효량의 적어도 1종의 약리학상 활성 조합 파트너만을 단독으로, 또는 경장 또는 비경구 적용에 특히 적합한 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 조합하여 포함한다. 적합한 제약 조성물은, 예를 들어 약 0.1% 내지 약 99.9%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 60%의 활성 성분(들)을 함유한다.
경장 또는 비경구 투여를 위한 조합 요법을 위한 제약 조성물은, 예를 들어 단위 투여 형태의 것, 예컨대 당-코팅 정제, 정제, 캡슐 또는 좌제, 앰플, 주사액 또는 주사가능한 현탁액이다. 국소 투여는, 예를 들어 피부 또는 눈에, 예를 들어 로션, 겔, 연고 또는 크림 형태로, 또는 비강 또는 좌제 형태로 이루어진다. 달리 나타내지 않는 한, 이들은 그 자체로 공지된 방식으로, 예를 들어 통상의 혼합, 과립화, 당-코팅, 용해 또는 동결건조 공정에 의해 제조된다. 각 투여 형태의 개별 용량에 함유된 각 작용제의 단위 함량은 필요 유효량이 다수의 투여 단위의 투여에 의해 도달될 수 있기 때문에 그 자체로 유효량을 구성할 필요가 없는 것으로 이해될 것이다.
제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있으며, 하나 또는 두 조합 파트너를 제약상 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합함으로써 통상의 방식으로 제조될 수 있다. 제약상 허용되는 희석제의 예는 락토스, 덱스트로스, 만니톨, 및/또는 글리세롤, 및/또는 윤활제 및/또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 제약상 허용되는 결합제의 예는 규산알루미늄마그네슘, 전분, 예컨대 옥수수, 밀 또는 쌀 전분, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈을 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 원하는 경우에, 제약상 허용되는 붕해제는 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 염, 예컨대 알긴산나트륨, 및/또는 발포성 혼합물, 또는 흡착제, 염료, 향미제 및 감미제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비경구로 투여가능한 조성물의 형태 또는 주입 용액의 형태로 본 발명의 화합물을 사용하는 것이 또한 가능하다. 제약 조성물은 멸균될 수 있고/거나 부형제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤 화합물 및/또는 유화제, 가용화제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 포함할 수 있다.
특히, 치료 유효량의 본 발명의 조합물의 각각의 조합 파트너는 동시에 또는 순차적으로 및 임의의 순서로 투여될 수 있고, 상기 성분은 개별적으로 또는 고정 조합물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 암을 예방 또는 치료하는 방법은 (i) 유리 또는 제약상 허용되는 염 형태의 제1 작용제의 투여; 및 (ii) 유리 또는 제약상 허용되는 염 형태의 제2 작용제의 투여를 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로, 연합 치료 유효량으로, 바람직하게는 상승작용적 유효량으로, 예를 들어 본원에 기재된 양에 상응하는 매일 또는 간헐적 투여량으로 포함할 수 있다. 본 발명의 조합물의 개별 조합 파트너는 요법의 기간 동안 상이한 시간에 개별적으로, 또는 분할 또는 단일 조합 형태로 공동으로 투여될 수 있다. 또한, 용어 투여는 또한 조합 파트너 그 자체로 생체내 전환되는 조합 파트너의 전구약물의 사용을 포괄한다. 따라서, 본 발명은 동시 또는 교대 치료의 이러한 요법 모두를 포괄하는 것으로 이해되어야 하며, 용어 "투여하는"은 이에 따라 해석되어야 한다.
본 발명의 조합물에서 사용되는 조합 파트너 작용제 각각의 유효 투여량은 사용되는 특정한 화합물 또는 제약 조성물, 투여 방식, 치료되는 상태, 치료되는 상태의 중증도에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 발명의 조합물의 투여 요법은 환자의 유형, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료할 상태의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 사용되는 특정한 화합물을 비롯한 다양한 인자에 따라 선택된다. 관련 기술분야의 의사, 임상의 또는 수의사는 상태를 예방하거나 호전시키거나 또는 그의 진행을 정지시키는데 필요한 약물의 유효량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 효능을 나타내는 범위 이내의 약물 농도를 달성하는 최적의 정확성을 위해서는, 표적 부위의 약물 이용률에 대한 역학을 기초로 하는 요법이 요구된다. 이것은 약물의 분포, 평형 및 제거에 대한 고려를 수반한다.
본 발명의 목적을 위해, 치료 유효 용량은 일반적으로 숙주에게 단일 또는 분할 용량으로 투여되는 총 1일 용량일 것이다. 화학식 I의 화합물은 숙주에게, 예를 들어 약 0.05 내지 약 50 mg/kg 수용자 체중, 바람직하게는 약 0.1-25 mg/kg 수용자 체중, 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 10 mg/kg 수용자 체중의 1일 투여량 범위로 투여될 수 있다. 작용제 (b)는 예를 들어 약 0.001 내지 1000 mg/kg 수용자 체중, 바람직하게는 1.0 내지 100 mg/kg 수용자 체중, 보다 바람직하게는 1.0 내지 50 mg/kg 수용자 체중의 1일 투여량 범위로 숙주에게 투여될 수 있다. 투여 단위 조성물은 1일 용량을 구성하도록 하는 그의 약수의 양을 함유할 수 있다.
본 발명의 ALKi 및 CDKi 조합물은 이들 병리상태에 사용하기 위해 단독으로, 또는 적어도 1종의 다른 제약 활성 화합물과 함께 조합하여 사용될 수 있다. 이들 활성 화합물은 동일한 제약 제제로, 또는 조합 파트너가 독립적으로, 또는 구별되는 양의 조합 파트너와의 다양한 고정 조합물의 사용에 의해, 즉 동시에 또는 상이한 시점에 투여될 수 있다는 관점에서 조합된 제제인 "부분들의 키트" 형태로 조합될 수 있다. 이어서, 부분들의 키트의 부분들은, 예를 들어 동시에 또는 시차를 두고, 즉 상이한 시점에 및 부분들의 키트의 임의의 부분들에 대해 동일하거나 또는 상이한 시간 간격으로 투여될 수 있다. 본 발명의 ALKi 및 CDKi 조합물과 조합하여 사용하기 위해 언급될 수 있는 화합물의 비-제한적인 예는 세포독성 화학요법 약물, 예컨대 아나스트로졸, 독소루비신 히드로클로라이드, 플루타미드, 덱사메탁손, 도세탁셀, 시스플라틴, 파클리탁셀 등을 포함한다.
키트
본 발명은 추가로 화합물 A1 내지 A3 또는 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 화합물, 및 화합물 B 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 증식성 질환을 치료하기 위한 지침을 비롯한 패키지 삽입물 또는 다른 라벨을 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명은 또한 화합물 A1-A3 또는 그의 제약상 허용되는 염으로부터 선택된 제1 화합물, 및 화합물 B 또는 그의 제약상 허용되는 염과의 공-투여에 의해 증식성 질환을 치료하기 위한 지침을 비롯한 패키지 삽입물 또는 다른 라벨을 포함하는 키트에 관한 것이다.
실시예
하기 실시예는 상기 기재된 본 발명을 예시하지만; 이들은 어떠한 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명의 제약 조합물의 유익한 효과는 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 그 자체로 공지된 다른 시험 모델에 의해 결정될 수 있다.
실시예 A: 고처리량 스크리닝을 사용한, 로에베 상가작용 모델을 기반으로 하는 상승작용적 조합물의 확인
약물 조합물의 상승작용적 상호작용을 챌리스 소프트웨어 [콤비네이토알엑스(CombinatoRx), 매사추세츠주 캠브리지])를 사용하는 로에베 상가작용 모델을 기반으로 하여 평가하였다. 문헌 [Lehaer J, Krueger AS, Avery W, et al., 2009, in Synergistic drug combinations tend to improve therapeutically relevant selectivity, Nat Biotechnol. 27:659-66]을 참조한다. 상기 소프트웨어는 약물-자체 용량-상가작용 참조 모델 (로에베 상가작용 모델)에 대하여, 2종의 작용제의 조합물으로부터의 약물 치료 반응 (세포 생존율의 억제 % 또는 감소 %)을 단독으로 작용하는 작용제의 반응과 비교하였다. 용량 상가작용으로부터의 편차는 조합 효과의 전체적인 강도를 정량화하는 "상승작용 스코어"로 숫자상으로 평가할 수 있다. 상승작용 스코어 >0은 상승작용적 조합물을 나타낸다. 단지 강한 상승작용적 조합물만이 선택되었다는 것을 확실하게 하기 위해, 수용 기준을 보다 높은 수준으로 설정하였다. 강한 상승작용적 조합물은 성장 억제 계산으로부터 결정된 바와 같이 상승작용 스코어 >2 (배경 (비-상승작용) 모델이 예상한 것보다 2배 더 큰 상승작용 스코어), 및 최대 효능 >100 (정체에 해당하는 값) 둘 다를 갖는 것으로 정의되었다.
하기 20종의 광범위한 특징화된 인간 신경모세포종 세포주 (표 1)를 화합물 A1, A2, A3, 및 B에 의해 개별적으로, 및 하기 조합물에 의해 처리하였다:
(1) 화합물 A1 및 B;
(2) 화합물 A2 및 B, 및
(3) 화합물 A3 및 B.
처리 후에, 각 시험 혼합물에 대한 세포 생존율 (생존 세포의 양)을 하기 검정 섹션에 기재된 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® (CTG) 발광 세포 생존율 검정 (프로메가(Promega))에 의해 결정하였다. 20종의 세포주 중 15종은 고품질 1차 스크리닝 데이터를 생성하였고; 다른 5종의 세포주는 성장에 실패하거나, 또는 너무 노이즈가 많아서 분석에 포함되지 않는 데이터를 산출하였다. 처리에 대한 반응 (세포 생존율의 감소 %)을 챌리스 소프트웨어 [콤비네이토알엑스, 매사추세츠주 캠브리지])를 사용하여 분석하였다. 데이터 평가 및 그래프 생성을 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel) 소프트웨어 및 챌리스 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
3종의 시험된 조합물에 대한 상승작용 스코어는 표 2 및 표 3에 표로 만들었다. 상승작용은 LAN1 (F1174L), LAN5 (R1275Q), NB-1643 (R1275Q), NB-SD (F1174L) 및 NB-1691 (WT) 세포에서 A1 및 B의 조합물에 대해 관찰되었다. 이 공-치료가 LAN-5 세포에서 특히 상승작용적인 것에 유의한다. 상승작용은 켈리 (F1174L), LAN-5 (R1275Q), SK-N-BE (2) (WT) 및 NB-1691 (WT)에서 A2 및 B의 조합물에 대해 관찰되었다. NB-1 (ALK-증폭) 세포주에서의 화합물 A2의 자체-조합물은 또한 이 세포주에서 이 화합물의 강력한 단일 작용제 활성 때문에 상승작용적일 가능성이 있는 것으로 확인되었다. 상승작용은 임의의 시험된 세포주에서 A3 및 B의 조합물에 대해서는 관찰되지 않았다.
<표 2> 인간 신경모세포종 세포에서 A1 x B 조합물의 상승작용 스코어
볼드체의 값은 상승작용 스코어 >2 및 최대 조합 효과 > 100의 조합물을 기준으로 하는 상승작용적 상호작용으로서 확인되었다.
<표 3> 인간 신경모세포종 세포에서 A2 x B 및 A3 x B 조합물의 상승작용 스코어
볼드체의 값은 상승작용 스코어 >2 및 최대 조합 효과 > 100의 조합물을 기준으로 하는 상승작용적 상호작용으로서 확인되었다.
약물 치료의 효과는 챌리스 행렬에 의해 입증되었다. 도 2는 화합물 A1 및 B의 조합물 (상단 행), 화합물 A 자체-교차 (중간 행) 및 화합물 B 자체-교차 (하단 행)로 처리된 LAN-1 세포에 대한 챌리스 용량 행렬 및 로에베 (ADD) 초과 억제를 보여준다. 약물 치료에 의한 억제 % (세포 생존율의 감소)는 용량 행렬 (좌측)의 블록에 보고하였고; 단일 작용제 처리는 맨 좌측 열 및 하단 행에, 및 조합물은 나머지 6x6 조합물 블록에 보고하였다. 용량 행렬의 데이터 및 로에베 모델에 의해 생성된 예상된 억제 값 사이의 차이를 로에베 초과 행렬에 보고하였다. 이 초과 억제 행렬에서, 상승작용은 값 >0으로 정의되고; 이는 단순한 상가작용적 상호작용으로부터 예상될 것보다 더 큰 억제이다. 길항작용은 값 <0으로 정의되고; 이는 단순한 상가작용적 상호작용으로부터 예상될 것보다 더 큰 억제이다. 약물 치료에 대한 상승작용 스코어는 행렬 내에 있는 전체 6x6 조합물 블록을 고려하여 컴퓨터처리하였다. Lan-1 세포에서 Cpd. A1 x B, Cpd A1xA1 및 Cpd. BxB에 대한 생성된 상승작용 스코어는 각각 2.26, 1.01 및 1.32였다. A1xB 조합물은 Lan-1 세포에서 상승작용적이었다.
표 2 및 3에 표로 만든 상승작용 스코어의 표준 편차를 박스 플롯(Box Plot)에 의해 그래프로 예시하였다 (도 3). 3종의 ALK 억제제 중 2종으로부터의 데이터만을 포함하고; 이 플롯에 사용된 바와 같이, ALK 억제제는 화합물 A1 또는 화합물 A2를 지칭하고, CDK4/6 억제제는 화합물 B를 지칭한다. ALK 질환 세포에서, ALK x CDK4/6 조합물은 상승작용 스코어 2.26 및 표준 편차 0.9로 강하게 상승작용적이었다. ALK x ALK 및 CDK4/6 X CDK4/6 조합물은 각각 상승작용 스코어 1.011 (sd=0.4) 및 1.16 (sd=0.43)로 중간 정도로 상승작용적이었다. ALK 정상 세포에서, 조합물 및 자체-교차 처리는 상승작용 스코어 약 0.5, 그러나 유사하게 큰 표준 편차로 상승작용적이 아니었다.
강한 상승작용적 조성물에 대한 시각적 확인을 위해, 표 2 및 3의 데이터를 산점도로 나타내었고 (도 4 A-C), 여기서 최대 조합 효능을 상승작용 스코어에 대해 플롯팅하였다. 3종의 ALK 억제제 중 2종인 화합물 A1 및 A2로부터의 데이터만을 포함하였다. 산점도에서, 수직 이동은 상가작용적 효과를 암시하고; 우측 이동은 상승작용적 상호작용을 암시하고, 비스듬한 이동은 효능에서 부스트를 갖는 상승작용을 암시한다. 상승작용적 조합물 히트는 상단 우측 사분면에 있는 것이고, 여기서 상승작용 스코어는 >2이고, 최대 효능은 >100이다. 2종의 ALK 억제제 (화합물 A1 및 A2)가 ALK 정상 세포주에 비해 ALK 질환 세포주에 대해 우선적 단일-작용제 효능을 나타내었다 (도 4A). CDK 억제제 (화합물 B)는 2종의 질환 세포주 및 1종의 정상 세포주에서 단일-작용제 효능 (>100)을 나타내었다 (도 4B). ALK 및 CDK4/6 억제제의 조합물은 시험된 15종의 세포주 중 7종에서 상승작용 및 증가된 효능 둘 다를 유도하는 상호작용을 생성하였고, ALK 질환 세포주에 우선적이었다.
이 결과는 ALK 양성 암, 특히 신경모세포종의 치료를 위한 ALK 억제제 및 CDK 억제제의 조합물의 용도를 지지한다.
실시예 B: 슈-탈랄레이 모델을 기반으로 하는 조합 약물 효과의 결정
ALK 및 CDK4/6 억제제 조합물의 조합 약물 효과를 칼쿠신(CalcuSyn) v2 소프트웨어 (바이오소프트(Biosoft), 영국 캠브리지)를 사용하는 슈-탈랄레이 조합 지수 방법 (Trends Pharmacol Sci 4, 450-454)을 사용하여 정량화하였다.
4종의 광범위한 특징화된 인간 신경모세포종 세포주 NB1643 (R1275Q), SHSY5Y (F1174L), NB1691 (WT) 및 EDC1 (WT)을 연구를 위해 선택하였다. 세포주에 일정한 동등효력 비를 사용하는 조합물을 3중으로 투약하고, 여기서 조합 파트너인 화합물 A1 및 화합물 B는 이들의 개별적 IC50 용량의 4x, 2x, 1x, 1/2 및 1/4로, 및 각 화합물과 개별적으로 조합하였다. 조합 파트너 둘 다에 대한 항-증식 효과의 농도 의존성을 처음에는 단독으로 및 이어서 조합물로 x셀리젠스(xCELLigence) 시스템을 사용하여 측정하였다. 각각의 처리에 대한 CI를 칼쿠신 v2 소프트웨어 (바이오소프트, 미주리주)에 의해 컴퓨터처리하였다.
ALK 돌연변이 세포주 NB1643 (R1275Q)에 대한 CI를 표 5에 보고하였다. 0.9-1.1의 CI가 상가작용적 상호작용을 나타내고, 0.9 미만의 값이 상승작용을 나타내고, 1.1 초과의 값이 길항작용을 나타내는 것으로 이해된다. 이러한 데이터는 2가지를 제외하고는 시험된 모든 조합물에 대한 CI가 0.9 미만이었음을 나타내고; 따라서 화합물 A 및 화합물 B의 시험 조합물은 상승작용적이었다.
<표 5> 실험 값으로부터의 NB1643 세포에 대한 CI
NB-1643 세포에서의 A1xB 조합물의 조합 약물 효과를 도 6A-D에 플롯팅하였다. 이들 플롯의 해석은 도 5a-5d 및 하기 검정 섹션에서 발견될 수 있다. 각각의 플롯은 화합물 A1 및 B의 조합물이 NB-1643 세포에서 상승작용적 효과를 나타내었다는 것을 시각적으로 입증한다. 특히, Fa-CI 플롯 (도 6C 및 D)은 CI가 시험된 모든 조합물에 대해 훨씬 1 미만 (상가작용적)이었음을 보여준다. 추가로, 이소볼로그램 플롯 (도 6E)은 공-치료에 대한 ED90 및 ED75 용량이 그의 각각의 이소볼로그램 아래에 잘 속해있음을 보여준다.
상승작용적 조합물의 다수의 이점 중 하나는 부작용을 감소시키면서 동일한 효능을 달성하는데 있어서 보다 적은 양의 약물이 사용될 수 있거나 또는 덜 빈번한 투약이 사용될 수 있다는 것이다. 용량-감소 지수 (DRI, Chou and Chou, 1988)는 실험 값으로부터 또는 계산으로부터 추정될 수 있다. NB1643 세포의 경우에, 실험 값으로부터의 용량-감소 지수 (DRI)는 표 6에 보고되어 있고, 계산치로부터의 것은 표 7에 보고되어 있다.
<표 6> NB1643 세포에 대한 화합물 A1 및 B 공-치료의 실험 값으로부터의 DRI
<표 7> NB1643 세포에 대한 화합물 A1 및 B 공-치료의 계산치로부터의 DRI
SHSY5Y (F1174L) 세포에서의 화합물 A1 및 B의 조합물의 효과를 표 8에 보고하였다. 이러한 데이터는 조합물이 저농도 내지 중간 농도에서는 중간 정도로 상승작용적이고, 고농도에서는 길항작용적이었음을 나타낸다.
<표 8> 실험 값으로부터의 SHSY5Y 세포에 대한 CI
SHSY5Y (F1174L) 세포에서의 화합물 A1 및 B의 조합물의 효과를 도 7 A-F에 플롯팅하였다. 플롯은 조합물이 약간 내지 중간 정도로 상승작용적이었음을 시각적으로 입증하였고; Fa-CI 플롯 (도 7C)에서의 CI 값은 1 약간 미만이었고, ED90 농도는 ED90 이소볼로그램 바로 위에 있었다.
NB1691 (WT) 세포에서의 화합물 A1 및 B의 조합물의 효과를 도 8 A-F에 플롯팅하였다. Fa-CI 플롯 (도 8C)은 화합물 농도가 낮은 경우에는 CI가 1 미만이고 화합물 농도가 높은 경우에는 1 초과인 것으로 나타내었으며, 이는 약물 조합물이 저농도 범위에서는 상승작용적이고, 보다 고농도 범위에서는 상가작용적 또는 약간 길항작용적이었음을 시사한다. 이러한 해석은 조합물의 ED50 및 ED75가 상승작용적이지만 조합물의 ED90이 길항작용적임을 나타내는 이소볼로그램 플롯 (도 8E)에 의해 지지되었다.
NBEDC1 (WT) 세포에서의 화합물 A1 및 B의 조합물의 효과를 표 9에 보고하였있다. 이러한 데이터는 조합물이 저농도 내지 중간 농도에서는 중간 정도로 상승작용적이고, 고농도에서는 매우 강하게 상승작용적이었음을 보여준다.
<표 9> 실험 값으로부터의 NB-EBC1 세포에 대한 CI
NB EDC1 (WT) 세포에서의 화합물 A1 및 B의 조합물의 효과를 도 9 A-F에 플롯팅하였다. Fa-CI 플롯 (도 9C)은 CI가 모두 1 미만이었음을 나타내고, 이는 약물 조합물이 시험된 농도 범위 전체에서 상승작용적이었음을 시사한다. 이러한 해석은 조합물의 ED50, ED75 및 ED90가 모두 상승작용적이었음을 나타내는 이소볼로그램 플롯 (도 9E)에 의해 지지되었다.
상기 제시된 데이터는 ALK 억제제 (화합물 A1) 및 CDK 억제제 (화합물 B)의 조합물이 슈-탈랄레이 조합 지수 모델을 기반으로 하여 신경모세포종 세포에서 상승작용적이었음을 입증하였다. 상승작용은 ALK 양성 세포주 및 야생형 세포주 둘 다에 존재한다.
실시예 C: 세포 형태 및 세포 사멸에 대한 공-치료의 효과
본 발명의 조합물의 상승작용적 항증식 효과는 광학 현미경검사에 의해 가시화되었다. 인간 신경모세포종 SH-SY5Y (F1174L) 세포를 화합물 A1 및 화합물 B (각각 IC50 농도), 및 화합물 A1 및 B의 조합물 (그의 IC50 농도의 각 화합물)로 처리하였다. 처리 72시간 후, 시험된 샘플을 광학 현미경검사에 의해 미처리 샘플 (비히클)과 비교하고, 현미경사진으로 기록하였다 (도 10 A 내지 D). 미처리 샘플 (도 10A)과 비교하여, 단독 화합물 A1로 처리된 샘플 (도 10B)은 무손상 세포의 수에서 유의한 감소를 나타내었다. 단독 화합물 B로 처리된 샘플 (도 10C)은 세포 수 및 세포 형태에서 최소 효과를 나타내었다. 화합물 A1 및 화합물 B의 조합물에 의해 처리된 샘플 (도 10D)은 무손상 세포를 거의 나타내지 않았다. 이들 현미경사진은 단일의 단독 화합물에 의한 처리와 비교하여 세포 사멸을 증대시키는데 있어서 본 발명의 조합물의 상승작용을 명확하게 입증하였다.
실시예 D: 세포 사멸에 대한 공-치료의 효과
본 발명의 조합물은, 세포 사멸은 증대시키지만 아폽토시스는 증대시키지 않는 상승작용적 효과를 나타낸다. 세포 생존율 및 아폽토시스에 대한 본 발명의 조합물에 의한 치료 효과는 3종의 인간 신경모세포종 세포주: NB1643 (R1275Q), SH-SY5Y (F1174L) 및 EBC1 (WT)에서 아포톡스-글로 트리플렉스 검정을 사용하여 평가하였다. 확인을 위해, 세포 생존율에 대한 치료 효과는 또한 NB1643 (R1275Q)에서 셀타이터-글로 (CTG) 발광 세포 생존율 검정을 사용하여 평가하였다. 검정은 하기에 기재하였다.
세포주를 DMSO 비히클, 화합물 A1 및 화합물 B (개별적으로, 조합 요법에 사용된 것과 동일한 용량으로), 및 화합물 A1 및 B의 조합물 (각각의 작용제에 대해 1/4, 1/2, 1, 2 및 4배 IC50 값의 일정한 동등효력 비 조합물로)로 3중으로 투약하였다. 화합물 A1 및 화합물 B에 대한 IC50은 각각 222 nM 및 749.5 nM으로 사전에 결정되었다. 시험 혼합물을 투약 후 72시간까지 평가하였고, 그 결과를 도 11A-C, 12A-C, 13A-C 및 14A-C에 플롯팅하였다.
도 11A, 11B 및 11C는 NB1643 세포의 생존율 및 아폽토시스에 대한 치료 효과를 보여준다. 세포 생존율 및 아폽토시스를 화합물(들)의 농도에 대한 배수의 분율 변화로서 나타내었다. 데이터는 단독 화합물 A1 (도 11A) 또는 조합물 (도 11C)이 세포 사멸 및 아폽토시스를 유발하는데 효과적이고, 단독 화합물 B가 단지 약간만 효과적임 (도 11B)을 보여준다. 구체적인 투여량의 단독 화합물 A1 및 조합물 (도 11C)에서의 반응을 비교하는 경우에, 데이터는 공-치료에 의한 세포 사멸의 유의한 증대를 나타내지만, 동일한 수준의 아폽토시스가 관찰되었다.
세포 사멸을 증대시키는 공-치료에 대한 이러한 발견은 처리된 NB1643 세포의 CTG 검정에 의해 개별적으로 확인되었다. 구체적인 투여량 포인트에서, 조합물 처리 (도 12C)는 단일 작용제 처리 (도 12A 및 B)와 비교하는 경우에 세포 사멸을 유의하게 증대시켰다.
도 13 A 내지 C는 SH-SY5Y (F1174L) 세포에 대한 치료 효과를 보여준다. 다시, 단일 작용제 처리 (도 13 A 및 B)와 비교하여, 조합물 처리 (도 13 C)는 세포 생존율에 대해 상승작용적 효과를 나타내지만, 낮은 화합물 농도에서는 동일한 수준의 아폽토시스를 나타낸다. 세포가 보다 높은 농도에서는 보다 초기에 사멸되어, 이에 따라 아폽토시스가 검출가능하지 않고 평가되지 않는 것에 유의한다.
도 14 A 내지 C는 EBC1 (WT) 세포에 대한 약물 치료의 효과를 나타낸다. 동일한 수준의 세포 사멸은 세포가 단독 화합물 A1 (도 14 A) 또는 공-치료 (도 14 C)로 처리되는 경우에 관찰되었다. 조합물은 EBC1 세포에 대해 상승작용적 효과를 갖지 않았다.
이 연구는 본 발명의 조합물, 특히 화합물 A1 및 화합물 B의 조합물이 ALK 양성 신경모세포종 세포에서 상승작용적 항증식 효과를 보유함을 입증하였다. 본 발명의 조합물은 ALK 양성 증식성 질환, 특히 ALK 양성 신경모세포종을 치료하는데 유용할 것이다.
실시예 E: 공-치료는 pALK 및 pRb 단백질 발현을 크게 감소시킴
pALK 및 pRb는 각각 ALK 및 CDK 활성화에 대한 바이오마커이다. 망막모세포종 단백질 (Rb)은 세포 주기 진행을 억제함으로써 과도한 세포 성장을 방지하는 종양 억제 단백질이다. 다양한 메카니즘을 통한 cdk4 또는 cdk6 활성화에 의존적인 세포 증식은 인산화 Rb 단백질 (pRB)의 증가를 나타내며; CDK의 억제는 pRb의 감소 및 세포 주기 정지를 유도한다. ALK의 억제는 ALK의 인산화 (pALK)의 발현을 감소시키고; pALK의 감소는 아폽토시스의 궁극적인 종점인 증식 감소를 유도한다.
웨스턴 블롯팅을 사용하여 ALK+ 및 야생형 신경모세포종 세포에서 총 및 인산화 Rb 단백질 및 총 및 인산화 ALK의 양에 대한 약물 치료의 효과를 검정하고, IC50의 분율에서 이들 데이터와 화합물 용량의 상관관계를 나타내었다. ALK+ 세포주 NB1643 (R1275Q) 및 야생형 세포주 EBC1은 연구를 위해 선택되었다.
NB1643 (R1275Q) 세포를 화합물 A1 및 화합물 B로 개별적으로, 및 각각의 화합물의 1/16, 1/8, 1/4 및 4배 IC50 농도의 일정한 동등효력 비의 조합물로 처리하였다. 비히클로 처리되고 화합물로 처리되지 않은 샘플을 준비하여, 대조군으로 사용하였다. 세포 혼합물을 처리 20시간 후에 분석하였다.
EBC1 (WT) 세포를 화합물 A1 및 화합물 B로 개별적으로, 및 각각의 화합물의 1/4, 1/2, 1 및 4배 IC50 농도의 일정한 동등효력 비의 조합물로 처리하였다. 비히클로 처리되고 화합물로 처리되지 않은 샘플을 준비하여, 대조군으로 사용하였다. 세포 혼합물을 처리 72시간 후에 분석하였다.
도 15는 처리된 NB1643 세포의 총 ALK (tALK) 및 pALK 상태를 나타낸다. 데이터는 단독 작용제에 의한 또는 조합물로의 처리가 투약 범위에 걸쳐 총 ALK에 대해 거의 효과가 없음을 나타낸다. 단독 작용제에 의한 또는 조합물로의 처리는 1/16배 IC50 용량에서 출발하여 pALK 단백질의 양을 감소시키지만; 조합물에 의한 처리는 보다 명백한 감소 효과를 생성하였다. 추가로, 감소 정도가 인산화 위치에 의존적인 것에 유의한다. 티로신 1604 코돈에서의 pALK 인산화는 티로신 1278 코돈에서의 pALK 인산화보다 더 큰 감소를 보였다.
도 16은 처리된 NB1643 세포의 총 Rb 및 pRb 상태를 나타낸다. 단독 작용제 또는 2종의 작용제의 조합물에 의한 처리는 총 Rb 및 pRb 단백질의 발현을 감소시켰다. 조합물 처리로부터의 감소가 더 컸다. 치료 효과는 또한 인산화 위치에 의존적이고; 치료 효과는 pRb S780보다 pRB S795에 대해 실질적으로 더 컸다.
도 17은 처리된 EBC1 (WT) 세포의 총 및 pALK 상태 및 총 및 pRb 상태를 나타낸다. 블롯은 공-치료가 pALK 및 pRb 단백질 발현을 감소시키는데 효과적이었음을 나타낸다.
상기 연구는 결론적으로 공-치료가 pALK 및 pRb 단백질의 발현을 감소시켰음을 보여주었다. 그 효과는 단일 작용제 단독으로의 치료와 비교하는 경우에 공-치료로 증대되었다. 따라서, 본 발명의 조합물은 ALK+ 및 야생형 세포에서 상승작용을 나타내었다.
실시예 F: CB17 SCID 마우스에서 인간 신경모세포종 종양에 대한 치료 효과를 증대시키는 공-치료
효능 연구의 증대를 인간 신경모세포종 SH-SY5Y (F1174L ALK 돌연변이를 보유함) 이종이식편에 대하여 CB17 SCID 마우스 상에서 생체내 수행하였다. 마우스를 4개의 연구군으로 분할하였다:
1) 용매 비히클만으로 처리된 대조군;
2) 화합물 A1 단지 50 mg/kg 용량만으로 p.o. 위관영양, OD를 통해 치료된 군 (사전에 이 마우스 모델에서 비효과적인 것으로 나타난 용량);
3) 화합물 B 단지 250 mg/kg만으로 치료되고 제5일에 출발하여 (독성을 감소시키기 위해) 187.5 mg/kg로 감소되는 군 (치료 스케줄은 p.o. 위관영양, OD였음), 및
4) 약물 조합물로 치료된 군 (화합물 A1 50 mg/kg 및 화합물 B 250 mg/kg, 제5일에 187.5 mg/kg로 감소됨).
이 연구의 결과는 도 18, 19A-D 및 20에 나타내었다.
화합물 A1 및 화합물 B의 조합물로 치료된 군 4의 마우스에서, 종양 부피는 다른 군에 비해 상당한 감소를 나타내었다 (도 18). 시험 군에서의 각 시험 마우스의 종양 부피를 시간에 대해 플롯팅하면 (도 19A 내지 19D), 종양 부피가 군 4 (공-치료) 마우스에서는 시간에 따라 감소한 반면; 모든 다른 군에 대한 종양 부피는 시간에 따라 증가한 것으로 나타났다. 도 20은 시간에 따른 시험 마우스의 생존 %를 나타낸다. 군 4에서, 마우스 중 2마리가 제7일에 사망하였고, 나머지는 치료 기간 내내 생존하였다. 군 3 (단독 화합물 B로 치료됨)에서, 마우스 중 1마리가 제14일에 사망하였고, 나머지는 치료 기간 내내 생존하였다. 군 1 및 2의 마우스에서, 종양은 너무 크게 성장하였고, 마우스를 각각 제1주 1/2 및 제3주에 안락사시켰다.
이러한 결과는 인간 SY5Y NB 이종이식편에 대한 조합 요법이 각 단독 약물로의 치료보다 더 큰 효능을 달성하였음을 입증하였다. 인상적으로, 50 mg/kg 약리학적 관련 용량의 화합물 A1 및 B의 조합물에 의한, NB SY5Y 종양을 보유한 SCID 마우스 (이는 사전에 단독 ALK 억제제 치료에 대해서는 반응하지 않는 것으로 나타남)의 치료는 확립된 종양 수축을 유도하고, 총 종양 완화를 달성한 반면, 50 mg/kg의 단독 화합물 A1에 의한 치료는 SY5Y 이종이식편 모델에서의 비히클 대조군과 비교하여 약간의 종양 성장 지연만을 생성하였다.
실시예 G: 신경모세포종 세포에서 화합물 A1 및 B에 대한 강한 상승작용적 상호작용의 스크리닝.
신경모세포종 세포주에서 강한 상승작용적 조성물을 확인하기 위해, 화합물 A1 및 B의 조합물을 16종의 신경모세포종 세포주의 패널에 대해 시험하였고, 이 중 10종은 활성화 ALK 돌연변이 또는 증폭을 보유하였다 (표 10). 조합물을 하기 검정 섹션에 기재된 세포 증식 판독으로 1536웰 포맷에서 7 x 7 용량 행렬 블록을 사용하여 2중으로 시험하였다. 화합물 A1 및 B를 그 자체와 조합하여 예상된 용량-상가작용적 상호작용의 상승작용 평가 파라미터에 대한 검정 노이즈의 효과를 결정하였다. 마찬가지로, 화합물 첨가 시간에 따른 세포의 수/생존율을 평가하고, 계산을 위한 NCI 방법을 사용하여 검정 내에서 관찰된 최대 성장 억제를 결정하는데 사용하였다.
모든 상승작용 계산은 잘리쿠스(Zalicus)로부터의 챌리스 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행하였고, 화합물 조합물 사이의 잠재적 상승작용적 상호작용은 로에베 상가작용 모델에 따른 초과 억제 2D 행렬을 사용하여 평가하여, 상승작용 스코어로서 보고하였다 (표 10) (Lehaer et al). 강한 상승작용적 조합물은 (1) 상승작용 스코어 2 초과 (배경 (비-상승작용) 모델이 예상할 것보다 2배 더 큰 상승작용 스코어), 및 (2) 최대 효능 >100 (성장 억제 계산으로부터 결정된 바와 같은 정체에 대략 해당하는 값) 둘 다를 갖는 것으로 확인되었다. 모든 평가된 조합에 대한 약물 효과를 산점도로 나타내었다 (도 21). 화합물 A1 자체-교차에 의한 치료 (상단)가 ALK WT 세포주에 비해 세포주의 ALK 질환 하위세트에 대해 우선적 단일 작용제 효능을 생성하는 것으로 관찰되었다. 화합물 B 자체-교차에 의한 치료 (중간)는 시험된 임의의 세포주에서 단일 작용제 효능을 나타내지 않았다. 화합물 A1 및 B에 의한 공-치료 (하단)는 시험된 16종의 세포주 중 3종에서 상승작용 및 증가된 효능 둘 다를 유도하는 상호작용을 생성하고, ALK 질환 세포주에 우선적이었다.
<표 10> 16종의 신경모세포종 세포주에서 화합물 A1 및 B 조합물에 대한 상승작용 스코어 및 최대 조합 효능
실시예 H: 켈리 신경모세포종 세포에서 ALK 억제제 및 CDK4/6 억제제에 의한 공-치료의 용량 효과.
켈리 신경모세포종 세포에서 ALK 억제제 (화합물 A1 또는 A2) 및 CDK4/6 억제제 (화합물 B)에 의한 공-치료의 용량 효과가 연구되었다. 검정을 보다 큰 스크린의 일부로서 실행하였다. 켈리 세포를 노파르티스(Novartis) 세포 라이브러리로부터 입수하고, 화합물 A1 및 B 및 화합물 A2 및 B의 조합물로 처리하였다. 검정은 9 x 9 용량 행렬을 대신 사용하는 것을 제외하고는 하기 검정 섹션에 기재된 바와 같았다. 조합물을 9 x 9 용량 행렬 블록을 사용하여 2중으로 시험하였다. 단일 작용제를 가장 좌측 열 및 하단 행에서 투여하고, 나머지 8x8 조합물 블록에 3-배 연속 희석물 시리즈의 화합물을 투여하고, 여기서 원액의 최고 농도는 화합물 A1, A2 및 B에 대해 각각 1.67 mM, 5mM 및 5mM이었다. 세포 억제 판독은 하기 검정 섹션에 기재된 바와 같았다. 데이터 분석을 챌리스 소프트웨어에 의해 수행하고, 화합물 조합물 사이의 잠재적 상승작용적 상호작용을 로에베 상가작용 모델에 따라 평가하고, 상승작용 스코어로서 보고하였다. 마찬가지로, 화합물 첨가 시간에 따른 세포의 수/생존율을 평가하고, 계산을 위한 NCI 방법을 사용하여 검정 내에서 관찰된 최대 성장 억제를 결정하는데 사용하였다. 그 결과는 표 11에 표로 만들고, 도 22a 및 22b에서 그래프로 입증하였다.
<표 11> 켈리 (ALK+ F1174L) 세포에서 화합물 A1 및 B 및 화합물 A2 및 B 조합물에 대한 상승작용 스코어 및 최대 조합 효능
ALK 억제제 중 하나와 CDK 억제제와의 조합물은, 특히 보다 높은 화합물 농도에서 켈리 세포의 증식을 억제하는데 효과적이었다. 상승작용 스코어는 중간 정도였지만, 이소볼로그램은 매우 강한 상호작용을 나타내었다.
실시예 I: 켈리 및 NB-1 신경모세포종 세포에서 ALK 억제제 및 CDK4/6 억제제에 의한 공-치료의 용량 효과.
켈리 (ALK+, Amp 및 F1174L) 및 NB-1 (ALK+, Amp) 신경모세포종 세포에서 ALK 억제제 (화합물 A1 또는 B) 및 CDK4/6 억제제 (화합물 B)에 의한 공-치료의 용량 효과를 연구하였다. 검정을 실행하여 상기 실시예 H의 결과를 확인하였다. 켈리 세포 및 NB-1 세포를 노파르티스 세포 라이브러리로부터 구입하고, 화합물 A1 및 B 및 화합물 A2 및 B의 조합물에 의해 치료하였다. 이 실험에서, 조합물을 9 x 9 용량 행렬 블록을 사용하여 2중으로 시험하고, 여기서 조합물 블록에 3-배 연속 희석물 시리즈를 투여하였다. 켈리 세포에 사용된 원액의 최고 농도는 각각의 화합물 A1, A2 및 B에 대해 5mM였다. NB-1 세포에 사용된 원액의 최고 농도는 각각의 화합물 A1, A2 및 B에 대해 0.56mM, 0.56mM 및 5mM였다. 세포 억제 판독은 하기 검정 섹션에 기재된 바와 같다. 데이터 분석을 챌리스 소프트웨어에 의해 수행하고, 화합물 조합물 사이의 잠재적 상승작용적 상호작용을 로에베 상가작용 모델에 따라 평가하고, 상승작용 스코어로서 보고하였다. 마찬가지로, 화합물 첨가 시간에 따른 세포의 수/생존율을 평가하고, 계산을 위한 NCI 방법을 사용하여 검정 내에서 관찰된 최대 성장 억제를 결정하는데 사용하였다. 화합물 전달 동안 건너 뛴 웰 때문에, 투여되지 않은 블록에서의 결과는 상승작용 스코어 및 최대 조합 효능에 대해 컴퓨터에 입력하지 않았다. 그 결과는 표 12에 표로 만들고, 치료에 대한 반응을 도 23a, 23b, 23c, 23d에서 그래프로 나타내었다.
<표 12> 켈리 (ALK+ F1174L) 및 NB-1 세포에서 화합물 A1 및 B 조합물 및 화합물 A2 및 B 조합물에 의한 상승작용 스코어 및 최대 조합 효능
ALK 억제제 중 하나와 CDK 억제제와의 조합물은 켈리 세포의 증식을 억제하는데 효과적이고, 약물 상호작용은 강하게 상승작용적이었다.
ALK 억제제 중 하나와 CDK 억제제와의 조합물은 NB-1 세포의 증식을 억제하는데 효과적이고, 조합물은 상승작용적이 아니었다.
실시예 J: 켈리, NB-1 및 SH-SY5Y 신경모세포종 세포에서 ALK 억제제 및 CDK4/6 억제제에 의한 공-치료의 용량 효과.
켈리 (ALK+, Amp 및 F1174L), NB-1 (ALK+, Amp)에서 ALK 억제제 (화합물 A1 또는 A2) 및 CDK4/6 억제제 (화합물 B)에 의한 공-치료의 용량 효과를 결정하는 실험을 상이한 농도의 약물 화합물을 사용하여 반복하였고; SH-SY5Y 신경모세포종 세포를 또한 실험에 포함시켰다. 모든 3종의 세포주를 노파르티스 세포 라이브러리 또는 ATCC로부터 입수하였다.
세포를 화합물 A1 및 B의 조합물, 및 화합물 A2 및 화합물 B로 처리하였다. 이 실험에서, 조합물을 9 x 9 용량 행렬 블록을 사용하여 2중으로 시험하고, 여기서 조합물 블록에 3-배 연속 희석물 시리즈를 투여하였다. 켈리 세포에 사용된 원액의 최고 농도는 각각의 화합물 A1, A2 및 B에 대해 2.5mM였다. NB-1 세포에 사용된 원액의 최고 농도는 각각의 화합물 A1, A2 및 B에 대해 0.28 mM, 0.28 mM 및 2.5 mM였다. SH-SY5Y 세포에 사용된 원액의 최고 농도는 각각의 화합물 A1, A2 및 B에 대해 2.5mM였고, 세포 억제 판독은 하기 검정 섹션에 기재된 바와 같았다. 데이터 분석을 챌리스 소프트웨어에 의해 수행하고, 화합물 조합물 사이의 잠재적 상승작용적 상호작용을 로에베 상가작용 모델에 따라 평가하고, 상승작용 스코어로서 보고하였다. 마찬가지로, 화합물 첨가 시간에 따른 세포의 수/생존율을 평가하고, 계산을 위한 NCI 방법을 사용하여 검정 내에서 관찰된 최대 성장 억제를 결정하는데 사용하였다.
데이터 품질 이슈가 관찰되었다. 켈리 세포에서 A1 및 A2 둘 다에 대한 단일 작용제 용량 반응은 실시예 I의 것과 비교하는 경우에 예측치 미만이었다. 보다 낮은 투약 농도는 낮은 상승작용 스코어에 기여할 수 있지만; 다른 인자, 예컨대 화합물로부터의 염석 또는 세포주 불안정성이 역할을 할 수 있다. 조합물에 대한 최대 조합 효능은 이 실험에 대해 결정되지 않았다. 켈리 및 NB-1 세포주에 대한 상승작용 스코어는 표 13에 표로 만들고, 치료의 용량 효과는 도 24 a 내지 d에서 그래프로 입증하였다. SH-SY5Y 세포주를 사용한 데이터 품질 이슈는 보다 심각하고, 데이터의 해석이 어려웠다 (도 24e 및 24f). 상승작용 스코어는 이 세포주에 대해서는 결정되지 않았다.
<표 13> 켈리 (ALK+ F1174L) 및 NB-1 세포에서 화합물 A1 및 B 조합물 및 화합물 A2 및 B 조합물에 대한 상승작용 스코어 및 최대 조합 효능
A1 x B 및 A2 x B 조합물에 대한 상승작용 스코어는 낮은 내지 중간 정도였고, 강한 상승작용적 조합물에 대한 기준 미만이었다 (상승작용 스코어 >2). ALK 억제제 중 하나와 CDK 억제제와의 조합물은 NB-1 세포에서 상승작용적이 아니었다. 데이터가 관찰된 데이터 이슈로 인해 신뢰할 수 없을 것으로 이해되어야 한다.
열거된 실시양태
본 발명의 다양한 열거된 실시양태가 본원에 기재되어 있다. 각 실시양태에 명시된 특징은 다른 명시된 특징과 조합되어 본 발명의 추가 실시양태를 제공할 수 있음이 인식될 것이다.
실시양태 1. 이 제1 실시양태에서, 본 발명은 (a) 역형성 림프종 키나제 (ALK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제1 작용제 및 (b) 시클린-의존성 키나제 (CDK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제2 작용제를 개별적으로 또는 함께 포함하는 제약 조합물을 제공한다.
실시양태 2. 실시양태 1에 있어서, ALK 억제제가 하기 화학식 A1에 의해 기재된 화합물 A1인 제약 조합물.
<화학식 A1>
실시양태 3. 실시양태 1에 있어서, 상기 ALK 억제제가 하기 화학식 A2에 의해 기재된 화합물 A2인 제약 조합물.
<화학식 A2>
실시양태 4. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, CDK 억제제가 CDK4 또는 CDK6 억제제인 제약 조합물.
실시양태 5. 실시양태 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, CDK 억제제가 CDK4 및 CDK6 이중 억제제인 제약 조합물.
실시양태 6. 실시양태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, CDK 억제제가 하기 화학식 B1에 의해 기재된 화합물 B인 제약 조합물.
<화학식 B>
실시양태 7. 실시양태 1에 있어서, 2종의 작용제가
화합물 A1 및 화합물 B; 및
화합물 A2 및 화합물 B
로부터 선택된 것인 제약 조합물.
실시양태 8. 본 발명은 또한 실시양태 1 내지 7중 어느 하나에 따른 제약 조합물, 및 적어도 1종의 부형제를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
실시양태 9. 본 발명은 또한 세포 증식성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 연합 치료 유효량의 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 제약 조합물 또는 실시양태 8에 따른 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 세포 증식성 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
실시양태 10. 실시양태 9에 있어서, 제1 작용제 및 제2 작용제를 함께, 독립적으로 또는 순차적으로 투여하는 것인 방법.
실시양태 11. 실시양태 9 및 실시양태 10에 있어서, 세포 증식성 질환이 ALK 양성 암인 방법.
실시양태 12. 실시양태 11에 있어서, 암이 ALK 유전자의 돌연변이에 의존적인 것인 방법.
실시양태 13. 실시양태 11에 있어서, 암이 ALK 유전자의 증폭에 의존적인 것인 방법.
실시양태 14. 실시양태 11 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 암이 림프종, 골육종, 흑색종, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 결장직장 종양, 갑상선 종양, 난소 종양, 췌장 종양, 뉴런 종양, 폐 종양, 자궁 종양 또는 위장 종양, 염증성 유방암, 역형성 대세포 림프종, 비소세포 폐 암종 및 신경모세포종으로부터 선택된 것인 방법.
실시양태 15. 실시양태 14에 있어서, 암이 신경모세포종인 방법.
실시양태 16. 실시양태 14에 있어서, 암이 역형성 대세포 림프종인 방법.
실시양태 17. 실시양태 14에 있어서, 암이 비소세포 폐 암종인 방법.
실시양태 18. 실시양태 14에 있어서, 암이 염증성 유방암인 방법.
실시양태 19. 본 발명은 또한 증식성 질환을 치료하기 위한 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 제약 조합물에 관한 것이다.
실시양태 20. 본 발명은 또한 증식성 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 제약 조합물 또는 실시양태 9의 제약 조성물의 용도에 관한 것이다.
실시양태 21. 본 발명은 또한 실시양태 1 내지 7 중 어느 하나에 따른 제약 조합물 또는 실시양태 8에 따른 제약 조성물, 및 증식성 질환을 치료하기 위한 지침을 제공하는 패키지 삽입물 또는 라벨을 포함하는 키트에 관한 것이다.
검정
ALK 및 CDK 억제제의 제조
본원에 개시된 화합물은 통상의 기술자에 의해 통상의 화학을 통해 합성될 수 있다.
화합물 A1, 5-클로로-N2-(2-이소프로폭시-5-메틸-4-(피페리딘-4-일)페닐)-N4-[2-(프로판-2-술포닐)-페닐]-피리미딘-2,4-디아민은 WO2010/020675의 실시예 66으로서 구체적으로 개시되어 있고, 그 안에 기재된 합성 절차에 의해 제조되었다.
화합물 A2, N6-(2-이소프로폭시-5-메틸-4-(1-메틸피페리딘-4-일)페닐)-N4-(2-(이소프로필술포닐)페닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4,6-디아민은 WO2010/020675의 실시예 231로서 구체적으로 개시되어 있고, 그 안에 기재된 합성 절차에 의해 제조되었다.
크리조티닙, 상표명 잘코리®로 일반적으로 공지된 화합물 A3은 화이자 코포레이션(Pfizer Corp.)에 의해 판매되고, 상업적으로 입수가능하다.
화합물 B, 7-시클로펜틸-N,N-디메틸-2-((5-(피페라진-1-일)피리딘-2-일)아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-카르복스아미드는 WO2010/020675의 실시예 74로서 개시되어 있고, 그 안에 기재된 합성 절차에 의해 제조되었다.
세포주 및 세포 배양
이 작업에 사용된 세포주는 인간 신경모세포종-유래된 것이고, 노파르티스 내부 세포 라이브러리, ATCC로부터 및/또는 필라델피아 소아 병원 (The Children's Hospital of Philadelphia; CHoP)의 소아 종양학과 표준 실험실로부터 입수가능하였다. CHoP 세포주를 미코플라스마 감염 뿐만 아니라 유전자형에 대해서 상용적으로 시험하여 (AmpFLSTR 식별자 키트, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 완전성을 확실하게 하고 교차-오염에 대해 보호하였다. 추가로, 세포주는 일루미나(Illumina) HH550 SNP 칩 상에서 결정된 게놈-전반 DNA 카피수 상태, 및 일루미나 발현 칩 상에서 결정된 게놈-전반 엑손-수준 유전자 발현을 가졌다. 세포주를 관련 업계에 공지된 권장 배지 조건에 따라 유지할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Thiele, C. J. Neuroblastoma: in (Ed.) Masters, J. Human Cell Culture. Lancaster, UK: Kluwer Academic Publishers. 1998, Vol 1, p. 21-53]). 특히, 세포를 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민을 함유한 10% 태아 소 혈청을 갖는 RPMI-1640 배지 중에 37℃ 및 5% CO2에서 유지할 수 있다. 대안적으로, 세포는 동결 저장되고 사용 전에 재구성될 수 있다.
세포주를 1차 조직에서 동등하게 ALK 표적 상태의 대표가 되도록 선택하였다: ALK 돌연변이 양성, ALK 돌연변이 음성 그러나 게놈 증폭 및 야생형 ALK의 과다발현, 및 ALK 돌연변이 음성 및 정상 카피수. ALK 돌연변이 양성인 세포주는 역형성 림프종 키나제 (ALK) 티로신 키나제 도메인에서 3개의 독특한 돌연변이를 나타낸다. 생어(Sanger) 서열분석에 의한 엑솜 서열분석은 돌연변이가 ALK 티로신 키나제 도메인에 있음을 확인하였다. 추가로, 세포주는 그의 MycN, TP53, ALK, TrkA 및 TrkB 상태를 특징으로 하고, 그 결과는 하기 표 1에 요약하였다.
<표 1> 인간 신경모세포종 세포주 및 특성화
본 발명의 조합물로 시험하기에 적합한 다른 신경모세포종 세포주가 존재하는 것으로 이해된다. 이러한 세포주에 대한 정보는 문헌 [Thiele CJ.; Neuroblastoma: In (Ed.) Masters, J. Human Cell Culture. Lancaster, UK: Kluwer Academic Publishers. 1998, Vol 1, p 21-53]으로부터 입수할 수 있다.
세포 생존율 검정
세포 생존율은 셀타이터-글로® (CTG) 발광 세포 생존율 검정 (프로메가)을 사용하여 세포 ATP 함량을 측정함으로써 결정하였다. CTG 시약을 시험 화합물로 처리된 세포에 첨가하고, 생성된 발광을 플레이트 판독기 (예를 들어, 뷰럭스(Viewlux), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer))에 의해 판독하였다. 감소 및 증대된 발광 신호 값 (반응)을 미처리 (대조군) 세포와 비교하여 계산하였고, 계산된 신호 값은 세포 생존율에 비례하였다.
로에베 상가작용 모델을 기반으로 하는 고용량 스크린에서 상승작용적 치료 조합물의 확인
상승작용적 조합물을 로에베 상가작용 모델을 기반으로 하여 확인하였다. 세포 생존율에 대한 약물 조합물의 효과를 측정하기 위해, 상기 표 1에 열거된 20종의 세포주로부터의 세포를 7μL 최종 부피에서 웰 당 300개 세포의 밀도로 1536-웰 검정 플레이트에 시딩하고, 95% RH 및 5% CO2를 갖는 GNF 시스템 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
시험 화합물을 위한 6-포인트 용량 반응 곡선을 3배 연속 희석물 시리즈로 384웰 에코(ECHO) 호환성 공급 플레이트 (랩사이트(Labcyte) P-05525)에서 제조하였다. 예를 들어, 6-포인트 용량 반응 곡선 및 최고 화합물 농도 5 mM의 경우, 공급 웰에서의 화합물의 농도는 5mM, 1.67mM, 0.56mM, 0.19mM, 0.06mM 및 0.02mM이었다.
플레이팅 대략 18시간 후에, 화합물 조합물을 세포주마다 반복 플레이트와 함께 ACP-1 시스템 상에 통합된 랩사이트 ECHO555를 사용하여 사전-희석된 공급 플레이트로부터의 화합물 7.5nL를 전달함으로써 때맞춰 생성하였고; 웰 당 최종 DMSO 농도는 0.2%였다. 웰에서의 총 부피는 7μL인 것에 유의한다.
모든 조합물의 항증식 활성을 비-편재 방식으로 평가하기 위해, 뿐만 아니라 모든 가능한 농도에서의 상승작용적 효과를 확인하기 위해, 6 (또는 8) 포인트 연속-희석된 시험 작용제의 모든 가능한 순열을 사용하는 7x7 행렬 (초기 실험에서는 9x9) 웰 (블록)에 투약하였다. 조합물 블록의 제1 열 (좌측) 및 제1 행 (하단)의 처음 6개 웰에 2종의 작용제를 개별적으로 투약함으로써 단일 작용제 곡선을 생성하였고; 각 웰은 7.5 nL의 시험 화합물 및 7.5 nL의 DMSO를 수용하였고, 보다 아래쪽 좌측 코너를 향하여 화합물 농도를 계속 낮아지게 하였다. 화합물을 수용하지 않은 제1행 및 제1열의 교차점의 웰에는 2x 7.5nL의 DMSO를 투여하고, 대조군으로 사용하였다. 각각 2종의 화합물 7.5nL를 전체 투여량 범위에 걸쳐 각 웰에 투약함으로써 조합물 곡선을 생성하고, 보다 아래쪽의 좌측 코너를 향하여 화합물 농도를 계속 낮아지게 하였다.
화합물 첨가 후에, 플레이트를 120시간 동안 인큐베이터에 복귀시켰다. 세포 생존율에 대한 조합물의 효과를 ACP-1 시스템 상의 GNF 보틀 밸브(Bottle Valve) 분배기 중 하나를 사용하여 셀 타이터 글로 (프로메가 G7573)의 첨가로 평가하고; 이어서, 플레이트를 10분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 통합된 퍼킨 엘머 뷰럭스 (2초 노출, 2x bin, 고감도)에서 판독하였다. 미가공 데이터를 각 플레이트 내 DMSO-처리 세포 대조군 웰을 사용하여 정규화하였다. 화합물 첨가시 세포의 수/생존율을 마찬가지로 평가하고, 이를 사용하여 검정 내에 관찰된 최대 성장 억제를 계산을 위한 NCI 방법을 사용하여 결정하였다. 문헌 [Boyd, M. R.; Paull, K. D.; Rubinstein, L. R. In Cytotoxic Anticancer Drugs: Models and Concepts for Drug Discovery and Development; Vleriote, F. A.; Corbett, T. H.; Baker, L. H., Eds.; Kluwer Academic: Hingham, MA, 1992; pp 11-34, and Monks, A.; Scudiero, D. A.; Skehan, P.; Shoemaker, R. H.; Paull, K. D.; Vistica, D. T.; Hose, C.; Langley, J.; Cronice, P.; Vaigro-Wolf, M.; Gray-Goodrich, M.; Campbell, H.; Mayo, M. R. JNCI, J. Natl. Cancer Inst. 1991, 83, 757-766]을 참조한다.
모든 상승작용 계산은 잘리쿠스로부터의 챌리스 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 문헌 [Lehaer J, Krueger AS, Avery W, et al., 2009, in Synergistic drug combinations tend to improve therapeutically relevant selectivity, Nat Biotechnol. 27:659-66]을 참조한다. 화합물 조합물 사이의 잠재적 상승작용적 상호작용은 로에베 상가작용 모델에 따른 초과 억제 2D 행렬을 사용하여 평가하였고, 상승작용 스코어로 보고하였다.
화합물을 그 자체와 조합하여, 예상된 용량-상가작용적 상호작용의 상승작용 평가 파라미터의 검정 노이즈의 효과를 결정하기 위해 였다. 상승작용적 조합물 히트 (강한 상승작용적)는, 성장 억제 계산으로부터 결정된 바와 같이, 상승작용 스코어 >2 (배경 모델 (비-상승작용)이 예상할 것보다 2배 더 큰 상승작용 스코어) 및 최대 효능 >100 (정체에 해당하는 값) 둘 다를 갖는 것으로 확인되었다.
상승작용적 상호작용은 챌리스 소프트웨어의 2D 행렬 출력으로부터 시각적으로 평가될 수 있다. 도 1은 가설 성장 억제 실험의 2D 행렬 플롯을 보여준다. 용량 행렬 플롯 (좌측)은 실험 데이터의 챌리스 대표값이며, 여기서 단일 작용제 용량 반응 곡선은 가장 좌측 열 및 하단 행에 나타내면서, 각 작용제의 최고 농도는 조합물 블록의 최상부 우측 코너에 도시하였다. 로에베 초과 억제 플롯 (우측)은 단일 작용제 곡선으로부터 발생된 로에베 모델에 대한, 상기 실험 데이터의 비교를 나타낸다. 용량 상가작용 모델은 조합물 행렬에서의 각 블록의 예상된 억제 값을 계산한다. 상승작용은 초과 억제 플롯에서 값 >0으로 정의되고; 이는 단순한 상가작용적 상호작용으로부터 예상될 것보다 더 큰 억제이다. 길항작용은 값 <0으로 정의되고; 이는 단순한 상가작용적 상호작용으로부터 예상될 것보다 더 적은 억제이다.
약물 조합물 연구로부터의 데이터의 시각적 표현에 대한 다른 일반적 대안은 블록 플롯 (도 3) 및 산점도 (도 4A, 4B 및 4C)를 포함한다. 박스 플롯은 치료 요법의 상승작용 스코어를 비교하는데 사용되었다. 산점도는 화합물 사이의 상호작용의 경향을 시각화하고 강한 상승작용적 상호작용을 확인하기 위해 사용되었다.
슈-탈랄레이 조합 지수 원리를 기반으로 하는 조합 약물 효과의 결정
세포 배양
이 실험에 사용된 신경모세포종 세포주는 상기 세포 배양 섹션 및 표 1에 기재되어 있다. 특히, 세포는 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민을 함유한 10% 소 태아 혈청을 갖는 RPMI-1640 배지 중에 37℃ 및 5% CO2에서 유지된 세포로 유지되었다.
화합물 A1 및 화합물 B 단독요법에 의한 시험관내 성장 IC50
"세포 지수"를 측정하는 96-웰 실시간 세포 전자 감지 x셀리젠스 시스템 (ACEA, 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 시험관내 억제 활성을 다섯 (5)종의 신경모세포종 세포주에서 결정하였다. 세포 지수는, 세포가 각 웰의 생체적합성 마이크로전극 표면과 상호작용하는 것으로 인한 전기 임피던스의 변경으로부터 도출하여, 기판 점착성 증식을 측정한다. 성장 속도에 따라, 하기 세포 밀 도로 웰 당 플레이팅하였다: NB1643: 20,000; SHSY5Y: 6,000; SKBE2C:10,000; NBEBC1: 11,000; NB1691: 30,000. 24시간 후에, 플레이팅된 세포를 나타낸 바와 같은 각 용량의 시험 화합물에 의해 3중으로 또는 DMSO 비히클 대조군에 의해 처리하였다. 화합물 A1을 웰 당 1 nM 내지 10,000 nM로 투약하였고, 화합물 B는 웰 당 0.6 nM 내지 6,000 nM, 또는 1nM 내지 10,000 nM로 투약하였다. 약물 노출 72시간 후에, 세포 지수를 보고하였다.
그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 5.0 4-파라미터 가변 기울기 조정을 사용하여 IC50을 계산하였다. 선택된 세포주에서 화합물 A1 및 화합물 B의 IC50을 하기 표 4에 요약하였다. 이러한 값을 하기 조합 연구의 투약에 사용하였다.
시험관내 약물 조합물 연구
약물 조합물 효과 및 상승작용의 정량화는 슈-탈랄레이 조합 지수 방법 (Trends Pharmacol Sci 4, 450-454) 및 칼쿠신 v2 소프트웨어 (바이오소프트, 미주리주)를 사용하여 4종의 신경모세포종 세포주에서 결정하였다. 세포를 플레이팅하고, 시험관내 증식을 상기 기재된 바와 같이 x셀리젠스 시스템을 사용하여 측정하였다. 세포를 일정한 동등효력 약물 조합물 (여기서 2종의 작용제, 예를 들어, 화합물 A1 및 화합물 B에서, 4x, 2x, 1x, 1/2 및 1/4의 그의 개별 IC50 용량으로 조합됨)로 및 각 작용제로 개별적으로 3중으로 투여하였다.
각 개별 작용제의 항증식 효력은 중앙-효과 용량, Dm에 의해 추정되었다. Dm은 "중앙-효과 플롯" 상의 x-절편으로 정의된, 중앙 효과를 생성하는 화합물 농도이며, 여기서 하기 정의에 따라 x = log (D) 및 y = log (fa/fu)이다:
D: 약물의 용량;
Fa: 영향받은 분율은 단독으로 또는 조합으로 주어진 농도의 화합물에 의해 영향받은 세포의 분율로서 정의된다. Fa = 0은 용량에 따라 DMSO 대조군을 기준으로 하여 결정되고, Fa =1은 완전 반응 (생존 세포가 남아있지 않음)이다.
Fu: 용량에 따라 영향 받지 않는 분율 (여기서 fu = 1 - fa).
선택된 세포주에서 화합물 A1 및 화합물 B의 Dm은 하기 표 4에 요약된다.
<표 4> 선택된 신경모세포종 세포에서 화합물 A1 및 B에 대한 IC50 및 Dm의 요약
조합 약물 효과의 효과는 하기 방정식에 따라 슈에 의해 정의된 바와 같은 조합 지수 (CI)를 사용하여 결정되었다:
CI = (D)1 / (Dx)1 + (D)2 / (Dx)2
여기서 (Dx)1 및 (Dx)2는 개별적으로 사용되는 경우에 주어진 수준의 항증식 효과를 제공하는데 필요한 화합물 D1 및 D2의 농도이고, 한편 (D)1 및 (D)2는 조합물로 사용되는 경우에 동일한 항증식 효과를 생성하는 이들의 농도이다. 조합 지수는 상가작용적 효과 (CI =1), 길항작용 (CI >1) 또는 상승작용 (CI <1)로 정의되는, 약물 상호작용의 정량적 척도이다. 전형적으로, 본원에 사용된 바와 같은 CI 범위를 사용하여 상승작용을 평가한다. 0.9-1.1의 조합 지수는 상가작용적 상호작용을 나타내고, 0.9 미만의 값은 상승작용을 나타내고, 1.1 초과의 값은 길항작용을 나타낸다. 하기는 CI 범위에 대한 설명이다:
<0.1 +++++ 매우 강한 상승작용
0.1-0.3 ++++ 강한 상승작용
0.3-0.7 +++ 상승작용
0.7-0.85 ++ 중간 정도의 상승작용
0.85-0.90 + 약간의 상승작용
0.90-1.10 ± 거의 상가작용
1.10-1.20 - 약간의 길항작용
1.20-1.45 - - 중간 정도의 길항작용
조합 지수를 사용하여 용량-감소 지수 (DRI)를 평가하였다 (Chou and Chou, 1988):
CI = (D)1 / (Dx)1 + (D)2 / Dx)2 = 1 /(DRI)1 + 1 / (DRI)2
DRI는 상승작용적 약물이 조합물로 주어지는 경우에 각 약물이 개별적으로 투여될 때와 동일한 효과 크기를 달성하면서 각 약물의 용량을 얼마나 감소시킬 수 있는지 추정한다.
약물 조합물 효과는 그래프로 입증될 수 있다. 슈 및 탈랄레이 조합 지수 원리를 기반으로 하는 약물 조합물 플롯의 전형적인 예는 (a) "Fa - CI 플롯", (b) 전형적 이소볼로그램; (c) 상이한 조합 비의 조합물에 대한 정규화된 이소볼로그램, 및 (d) Fa-PRI 플롯을 포함한다 (Chou and Martin, 2005). 다양한 플롯의 해석은 도 5a-d에 요약된다. 상승작용적 효과를 평가하기 위해, Fa-CI 플롯 및 이소볼로그램 플롯이 보다 적절하다.
시험관내 생존율 및 카스파제-글로 3/7 검정에 의한 아폽토시스
시험관내 세포 생존율 및 카스파제-글로 3/7을 아포톡스-글로 트리플렉스 검정 (프로메가, 캘리포니아주)를 사용하여 3종의 신경모세포종 세포주에서 동시에 검정하였다. 24시간에, 세포를 DMSO 비히클로, 조합 요법에 사용된 동일한 용량의 화합물 A1 또는 화합물 B로 개별적으로, 또는 나타낸 용량의 일정한 동등효력 비 조합물로 3중으로 처리하였다. 약물 노출 72시간 후에, 형광 기질 GF-AFC를 첨가하였다. 시험 혼합물을 10분 동안 인큐베이션하고, AFC 형광을 380-400nm 여기 및 505 nm 방출에서 측정하였다. GF-AFC는, 세포내에서는 활성이고 세포막 완전성 손실시에는 불활성인 프로테아제에 의한 절단 후에 형광을 내므로, GF-AFC 형광은 세포 생존율과 상관관계가 있다.
살아있는 세포 형광의 측정 후에, 발광원성 카스파제-글로 3/7 기질 및 루시페라제를 동일한 웰에 첨가하였다. 발광은 30분 인큐베이션 기간 후에 측정하였다. 루시페린이 카스파제-3/7에 의한 기질 절단 후에 방출되고, 이에 따라 발광 신호는 카스파제 활성에 비례한다.
웨스턴 블롯
각 세포주를 70 내지 80% 전면생장률로 성장시키고, 나타낸 바와 같이 화합물 A1, 화합물 B, 또는 동등효력 비의 조합물로 20시간 또는 72시간 동안 처리하였다. 빙냉 포스페이트 완충 염수로 2회 세척하고, 전세포 단백질 용해물을 기재된 바와 같이 (Mosse, et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gent, 2008, Nature Vol 455), ALK, 1:1000; pALK Tyr1604, 1:1000; pALK Tyr1278, 1:2000; RB, 1:2000; pRBS780, 1:2000; pRBS795, 1:2000; 시클린 D1, 1:1000; 시클린 D3, 1:1000 (셀 시그날링(Cell Signaling)); CDK4, 1:2000; 및 CDK6, 1:3000; (산타 크루즈(Santa Cruz))에 대한 항체를 사용하는 이뮤노블롯팅에 의해 분석하였다.
생체내 종양 성장 억제
CB17 scid 암컷 마우스 (타코닉 팜스(Taconic Farms))를 사용하여 피하로 이식된 신경모세포종 종양을 증식시켰다. 종양 직경을 전자 캘리퍼를 사용하여 1주에 2회 측정하고, 종양 부피를 회전타원체 식, (p/6)xd3 (여기서 d는 평균 직경을 나타냄)을 사용하여 계산하였다. 종양 부피가 200 mm3을 초과하면, 마우스를 무작위화하여 (부문 당 n = 10마리), 비히클, 화합물 A1 (용량 당 50 mg/kg), 화합물 B (용량 당 150 mg/kg), 또는 조합된 화합물 A1 (용량 당 50 mg/kg) 및 화합물 B (용량 당 150 mg/kg)를 경구 위관영양에 의해 7주 동안 매일 투여받았다. 종양 부피가 3000 mm3을 초과하는 경우 또는 7주 연구 결론에서 마우스를 안락사시켰다. 혼합-효과 선형 모델을 사용하여, 등록시의 종양 크기에 대조하면서 치료군 및 비히클 군 사이에서 시간에 걸친 종양 부피를 평가하였다. 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 사용하여 무사건 생존 확률을 추정하고, 생존 곡선을 로그-랭크(log-rank) 시험 (SAS 9.3 및 스타타(Stata) 12.1)를 사용하여 비교하였다. 사건은 종양 부피 ≥ 3000 mm3까지의 시간으로 정의되고, 제7주 후 종양 부피를 검열하였다. 마우스를 본 발명자들의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인받은 프로토콜 및 조건 하에 유지하였다.
Claims (21)
- (a) 역형성 림프종 키나제 (ALK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제1 작용제 및 (b) 시클린-의존성 키나제 (CDK) 억제제 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제2 작용제를 개별적으로 또는 함께 포함하는 제약 조합물.
- 제1항에 있어서, ALK 억제제가 하기 화학식 A1에 의해 기재된 화합물 A1인 제약 조합물.
<화학식 A1>
- 제1항에 있어서, 상기 ALK 억제제가 하기 화학식 A2에 의해 기재된 화합물 A2인 제약 조합물.
<화학식 A2>
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CDK 억제제가 CDK4 또는 CDK6 억제제인 제약 조합물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CDK 억제제가 CDK4 및 CDK6 이중 억제제인 제약 조합물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CDK 억제제가 하기 화학식 B에 의해 기재된 화합물 B인 제약 조합물.
<화학식 B>
- 제1항에 있어서, 2종의 작용제가
(a) 화합물 A1 및 화합물 B; 및
(b) 화합물 A2 및 화합물 B
로부터 선택된 것인 제약 조합물. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 제약 조합물, 및 적어도 1종의 부형제를 포함하는 제약 조성물.
- 세포 증식성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 연합 치료 유효량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 제약 조합물 또는 제8항에 따른 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 세포 증식성 질환의 치료 방법.
- 제9항에 있어서, 제1 작용제 및 제2 작용제를 함께, 독립적으로 또는 순차적으로 투여하는 것인 방법.
- 제9항 및 제10항에 있어서, 세포 증식성 질환이 ALK 양성 암인 방법.
- 제11항에 있어서, 암이 ALK 유전자의 돌연변이에 의존적인 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 암이 ALK 유전자의 증폭에 의존적인 것인 방법.
- 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 림프종, 골육종, 흑색종, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 결장직장 종양, 갑상선 종양, 난소 종양, 췌장 종양, 뉴런 종양, 폐 종양, 자궁 종양 또는 위장 종양, 염증성 유방암, 역형성 대세포 림프종, 비소세포 폐 암종 및 신경모세포종으로부터 선택된 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 암이 신경모세포종인 방법.
- 제14항에 있어서, 암이 역형성 대세포 림프종인 방법.
- 제14항에 있어서, 암이 비소세포 폐 암종인 방법.
- 제14항에 있어서, 암이 염증성 유방암인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 증식성 질환을 치료하기 위한 제약 조합물.
- 증식성 질환을 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 제약 조합물 또는 제9항의 제약 조성물의 용도.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 제약 조합물 또는 제8항에 따른 제약 조성물, 및 증식성 질환을 치료하기 위한 지침을 제공하는 패키지 삽입물 또는 라벨을 포함하는 키트.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0105 | International application |
Patent event date: 20160323 Patent event code: PA01051R01D Comment text: International Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| PC1203 | Withdrawal of no request for examination | ||
| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |