KR20160053034A - 방기 추출물을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 방기(Sinomenium acutum) 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게 본 발명의 조성물은 파골세포의 분화 및 활성을 억제시키는 효과가 있어, 골손실로 인한 골질환을 억제할 수 있으므로, 이들 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

방기 추출물을 포함하는 골질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물{A pharmaceutical composition for preventing or treating bone diseases comprising Sinomenium acutum extract}

본 발명은 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 방기(Sinomenium acutum) 추출물 및 이로부터 분리한 화합물들의 용도에 관한 것이다.

골조직은 연골 및 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체기관 및 골수를 보호하는 기능을 한다. 또한 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 골은 매일 조금씩 분해되고, 분해된 양에 비례하여 새로운 골이 형성됨으로써 항상성을 유지하는 매우 역동적인 조직이다. 구체적으로 골은 파골세포에 의한 골흡수, 골아세포에 의한 골형성 및 휴지기를 포함하여 약 120 내지 150일 주기의 순환을 반복하고 있다. 건강한 성인의 경우, 골흡수와 골형성은 엄밀하게 콘트롤되고, 종합 골량은 거의 변화하지 않고 일정 수준을 유지한다.

조골세포는 간엽줄기세포에서 기원하여 형성되는데 조골세포의 분화에 의한 칼슘형성과 같은 무기질화는 뼈의 강도를 유지시켜줄 뿐만 아니라, 신체 전체의 칼슘 및 호르몬 대사의 항상성에도 매우 중요한 기능을 한다. 조골세포의 분화에 의한 칼슘형성은 비타민 D 및 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone) 등에 의해 조절되며, 조골세포의 분화에 의한 골형성은 세포 내에서 뼈 형태형성 단백질(bone morphogenetic protein; BMP), Wnt, MAP 키나아제, 칼시뉴린-칼모듈린 키나아제(calcineurin-calmodulin kinase), NF-κB, AP-1 등의 다양한 신호전달 체계의 상호작용(cross-talk)에 의해 조골세포의 분화와 관련된 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase, ALP)가 초기 분화단계에서 합성된 후, 무기질화와 관련된 오스테오폰틴(osteopontin), 오스테오칼신(osteocalcin), 제1형 콜라겐(type 1 collagen) 등이 합성됨으로써 이루어진다고 알려져 있다(Pittenger, M. F. et al., Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells, Science, 1999, 284: 143-147). 즉, 알칼린 포스파타제의 활성을 촉진하는 화합물들은 골세포의 분화를 촉진하므로 골질환 치료제의 표적이 될 수 있다.

한편, 파골세포는 뼈가 성장하도록 하기 위하여 석회화한 연골 및 뼈조직을 녹이는 세포로서 다핵거대세포이다. 상기 파골세포는 조골세포에서 분비되는 RANKL(receptor activator of NF-κB ligand)와 M-CSF(macrophage colony stimulating receptor)가 파골세포 표면에 있는 수용체와 결합하게 되어 분화가 일어난다.

상기 조골세포와 파골세포의 상호작용의 균형이 깨지게 되면 전신적(systemic) 또는 국부적(local) 골질환을 일으키게 된다. 상기 질병들은 대부분 파골세포의 수와 활성의 증가로 인한 것으로 알려져 있다. 이러한 파골세포의 활성증가로 인해 야기되는 질환에는 골절, 류마티스 관절염, 원발성 골종양, 암의 골전이 등이 있다. 또한 나이든 사람에게 많이 나타나는 원활하지 못한 혈액순환으로 인하여 일시적 또는 만성적으로 산소장력(oxygen tension)이 정상 골보다 낮은 상태가 되는 현상인 저산소증(hypoxia)이 발생한 산소함량이 부족한 골에서 파골세포의 활성이 증가하여 골상태의 악화를 초래하기도 한다.

상기 골질환의 대표적인 예인 골다공증은 골형성과 골흡수의 평형이 깨져 골밀도가 약화되어 일어나는 질환으로, 현재 미국에서만 약 천 만명이 이미 골다공증 질환을 앓고 있으며, 1천 8백만명이 골다공증의 발생 위험에 놓여 있다. 또한, 일생 동안 여성 2명 중 1명, 남성의 경우 8명 중 1명이 골다공증과 관련된 골절을 경험하며, 이미 2백만명 이상의 미국 남성들이 골다공증 질환을 앓고 있다. 미국에서는 골다공증과 관련된 질병과 골절로 인한 직접적인 지출이 매년 140억 달러에 달하고 있으며, 국내에서의 경우에도 약 400백만 명이 골다공증에 걸려있거나 그 위험에 노출되어 있다. 이는 노령화 사회로 접어들면서 더욱 증가할 것으로 추정되어, 이로 인한 사회적 지출과 가족 구성원의 정신적, 경제적 지출이 증가할 것으로 예상된다.

상기와 같은 골질환을 치료하기 위해서는 파골세포와 조골세포의 균형을 조절하는 것이 필요하며, 따라서 이에 대한 치료제로는 크게 골흡수 억제제 및 골형성 자극제가 있다. 일반적으로 상기 골흡수 억제제 또는 골형성 자극제 등의 골질환 치료제는 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적어야 하며, 투여의 번거로움을 해결하기 위하여 경구투여가 가능한 것이 바람직하므로, 이에 대한 연구가 절실히 필요한 실정이다. 한편, 상기 골질환 치료제 중 조골세포를 활성화 시킴으로써 골형성을 촉진하는 골형성 자극제에 대한 연구가 보다 활발하게 진행되고 있으나, 골형성 자극제로 인한 골밀도 강화가 반드시 골절의 감소를 의미하지는 않는다. 한편 현제 사용되고 있는 파골세포의 활성을 억제하는 골질환 치료제로는 데노수맙(Denosumab; Prolia™, Amgen®) 등이 있으며 이외에도 다양한 약물들이 개발되고 있으나, 약물치료는 장기간 지속되어야 함을 고려할 때 아직 부작용 등이 충분히 검증되지 않았으며, 파골세포의 정확한 메커니즘은 아직까지 밝혀지지 않은 상태이다.

이에 본 발명자들은 파골세포 형성을 억제함으로써 골손실을 감소시켜 골손실에 의해 유도되는 또는 골손실을 유발하는 질환의 발병 또는 진행을 억제할 수 있는 천연물을 찾고자 예의 노력한 결과, 방기 추출물 및 이로부터 분리한 화합물이 파골세포의 형성 및 활성을 억제함으로써 골질환에 대한 예방 또는 치료효과를 갖는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 방기(Sinomenium acutum) 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 방기 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 방기(Sinomenium acutum) 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 방기 추출물이 파골세포의 생성 및 이동을 억제함으로써 골질환을 예방 또는 치료하는 효과를 나타내는 것을 최초로 확인한 것이 기초한다. 특히 이로부터 추출한 11종의 유효성분 중 4종의 화합물이 이러한 효과를 나타남을 확인하였다.

바람직하게, 상기 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물은 살루타리딘(salutaridine), 다우리쿠민(dauricumine), 헤일란티포린(cheilanthifoline) 또는 다우리포핀(dauriphophine)일 수 있다.

본 발명의 용어, "방기(Sinomenium acutum)"는 한국, 중국, 일본 등지에 분포하는 낙엽 덩굴식물로 길이가 7 m에 달하고 가지에 털이 없으며, 세로줄이 있다. 잎은 어긋나고 원형 또는 넓은 난형이며, 때로는 3개로 얕게 갈라진다. 잎 가장자리가 밋밋하거나 3 내지 7개의 얕은 결각이 있고 잎자루는 잎몸보다 짧다. 꽃은 2가화로 6월에 피고 연한 녹색이며 원추꽃차례에 달린다. 꽃받침조각과 꽃잎은 6개씩이고 수술은 9 내지 12개이지만 암꽃에서는 3개의 헛수술과 3개의 심피가 있다. 핵과는 10월에 검게 익는다. 맛은 쓰고 매우며 성질은 차다. 한방에서 줄기와 뿌리를 신경통 및 이뇨에 사용한다. 풍습을 제거함으로 사지관절의 동통을 가라앉힌다. 수족경련, 중풍, 구안와사에도 쓰인다. 수분의 배설작용이 현저하여 피부가 부었을 때, 복수가 찼을 때, 각기병 등의 증상에도 널리 활용된다. 진통제와 해열제로도 쓰인다. 임상적으로 혈압을 낮추는 효과도 보고되었으며, 항종양 효과를 나타내어 폐암 치료를 위한 정맥주사제로도 사용되었다. 물로 달여 먹거나 환을 짓거나 가루내어 먹는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이의 골질환에 대한 예방 또는 치료효과는 현재까지 개시된 바 없다.

본 발명의 용어, "방기 추출물(extract)"은 방기의 다양한 부분, 예컨대, 방기의 줄기, 뿌리, 잎, 꽃봉오리 및 꽃가루 중 적어도 한 부분을 추출하여 얻은 생성물을 의미한다. 바람직하게는 줄기, 뿌리 또는 둘 모두를 함께 추출하여 얻을 수 있다.

본 발명의 용어, "추출물"은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 상기 방기 추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 본 발명의 방기 추출물은 일정 중량의 건조된 방기에 10 내지 20배의 용매를 가하여 추출하였다. 용매로는 유기 용매를 사용할 수 있으며, 상기 유기용매는 C_{1 -4} 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매일 수 있고, 바람직하게는 메탄올일 수 있다. 또한 상기 추출은 바람직하게 냉침 추출법에 의해 수행될 수 있다. 상기 냉침 추출은 3 내지 15일 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 10일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 추출은 수회 반복하여 수행될 수 있으며, 추출한 시료는 여과 후 진공회전증발기로 감압농축하였다.

본 발명의 용어, "분획물"은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의해 얻어진 결과물을 의미한다. 상기 특정 성분 또는 특정 그룹의 분리는 특정한 성질의 용매, 또는 2종 이상의 용매를 함유하는 혼합용매 또는 이의 혼합비를 변화시켜 농도구배를 준 혼합용매를 이용하여 이들 용매에 대한 용해도 차이에 의해 달성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 방기 추출물의 분획물은 에틸아세테이트, C_{1 -4} 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용성인 화합물을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게, 에틸아세테이트 또는 n-부탄올 가용성 화합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 방기의 메탄올 추출물을 에틸아세테이트와 n-부탄올로 차례로 추출하여 에틸아세테이트 가용 분획 및 n-부탄올 가용 분획을 수득하고 이들의 혼합물에 대해 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용매를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 수개의 분획을 획득하였다. 이때, 이동상인 디클로로메탄/메탄올 혼합용매의 혼합비를 100:1로부터 1:1까지 순차적으로 증가시키는 농도구배 용출방식을 적용하였다.

본 발명의 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물은 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물의 이로운 효능을 저하시키지 않는 상기 화합물의 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 또한, 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 결합하거나 집합으로 사용될 수 있다.

상기 본 발명의 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 제조된 염을 의미하며, 이러한 제조방법은 당업자에게 공지되어 있다. 구체적으로, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 하기 무기산과 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 요오드화수소산(hydroiodic acid) 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨, 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

상기 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브롬화물, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물의 염으로는 약학적으로 허용가능한 염으로서, 상기 화합물 유도체와 동등한 파골세포생성 또는 이동 억제효과를 나타내는 상기 화합물 유도체의 이성질체의 염이면 제한없이 모두 사용 가능하다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 골질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 필요 이상의 파골세포의 존재로 인해 발생하는 골질환에 제한없이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "골질환"은 파골세포의 과다한 생성 및/또는 이동으로 인해 나타나는 상태 또는 질병을 의미하는 것으로, 골량 저하 질환을 포함한다. 상기 골량 저하 질환이란 골밀도의 저하, 골조직의 열화 등의 증상을 수반하는 골량의 저하가 나타나는 상태 또는 질환을 의미하는 것으로, 이의 비제한적인 예로는 골다공증(osteoporosis), 파제트병(Paget's disease), 치주질환, 골성장장애 및 류마티스관절염 등이 있다. 또한 암세포에 의해 활성화되는 파골세포에 의한 골손실도 본 발명의 범주에 포함된다.

바람직하게 본 발명의 조성물은 골다공증 또는 골감소증의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 사용된 용어, "골다공증"은 골량이 감소하고 질적인 변화로 인해 골절이 일어날 가능성이 있는 상태를 의미하며, "골감소증"이란 골다공증의 초기 증세를 의미한다. 일반적으로 골밀도 수치(T 수치)를 기준으로 -1.0 내지 -2.5인 경우 골감소증, -2.5 이상인 경우 골다공증으로 분류한다.

본 발명에서 사용된 용어, "골질환의 예방 또는 치료"는 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 달성되는 상기 골질환의 예방 및 완전한 또는 부분적인 치료를 포함한다. 이는 또한 골질환 증상의 감소, 개선, 그 증상의 고통 경감, 골질환 발생율 감소 또는 치료결과를 증가시키는 환자의 어떠한 다른 변화를 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어, "개체"는 골질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에게 투여하여 상기 골질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 기존의 골질환 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "투여"란, 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성별, 연령, 체중, 건강상태, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 활성물질을 약 0.01 mg/kg/일 내지 1000 mg/kg/일의 용량으로 투여할 수 있다. 경구 투여하는 경우, 50 내지 500 mg/kg의 범위가 적합할 수 있으며, 1일 1회 이상 투여할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 조성물은 파골세포의 생성 또는 이동을 억제하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 사용된 용어, "파골세포(osteoclast)"는 뼈가 자라도록 하기 위하여 석회화한 연골과 뼈조직을 녹이는 세포로 골 재흡수에 관여하는 다핵거대세포(large multinuclear cell)이다. 2 내지 100개의 조밀하게 들어찬 타원형의 핵을 가지고 있으며 지름은 20 내지 100 μm이고 전형적인 파골세포는 자기자신에 의해 형성된 뼈 표면의 얕고 작은 홈에 존재한다. 뼈 흡수면에 위치한 파골세포는 밝은 띠와 파도모양의 가장자리가 관찰되며 상기 파골세포에 의해 분비된 가수분해효소에 의한 유기기질의 소화흡수, 산에 의한 무기질 용해와 흡수에 의하여 뼈흡수가 일어나는 것으로 알려져 있다. 뼈를 형성하는 조골세포와 뼈를 재흡수하는 파골세포의 활성이 유기적으로 균형을 이루어 골조직의 양을 조절한다.

파골세포는 화학주성(chemotaxis)에 의해 뼈에서 미세골절부위로 이동한다. 단핵세포-대식세포주의 세포 융합에 의해 형성되며 TRAP(Tartrate Resistant Acid Phosphatase)과 카텝신 K(cathepsin K)를 높은 수준으로 발현하는 특징을 갖는다. 또한 고농도의 소포(vesicles)와 공포(vacuoles)로 인한 균일한 표말형 외관(homogeneous, foamy appearance)을 갖는 세포질을 특징으로 한다. 상기 공포는 산성 포스파타제(acid phosphatase)로 채워진 라이소좀이다. 파골세포의 내형질의 망상조직(endoplasmic reticulum)은 성글며(sparse), 골지 복합체는 광범위하다. 뼈와 같은 기질의 제거에 유용한 주름잡힌 경계부분은 활발하게 골을 재흡수하는 파골세포의 형태적 특징이다. 수산화인회석(hydroxyapatite)이라 불리는 기질의 무기질 부분(mineral portion)은 칼슘과 인산 이온을 포함하며 상기 이온들은 세포내 섭취(endocytosis)에 의해 작은 소포 내로 흡수되어 세포를 가로질러 이동하여 결과적으로 세포외액(extracellular fluid)으로 방출되어 혈액 중 이온의 농도를 증가시킨다.

상기 파골세포는 부갑상선으로부터 분비되는 부갑상선 호르몬(parathyroid hormone; PTH), 갑상선으로부터 분비되는 칼시토닌(calcitonin) 및 성장인자 인터루킨 6(interleukin 6; IL-6)에 의해 조절된다. 상기 IL-6는 골재흡수와 골형성 간의 불균형에 의한 골다공증과 같은 질환의 요인 중 하나이다. 또한 파골세포의 활성은 조골세포에 의해 생성되는 두 가지 분자, 오스테오프로테그린(osteoprotegerin) 및 RANK 리간드의 상호작용에 의해 매개되며, 따라서 파골세포의 분화는 상기 두 가지 분자에 의해 조절된다. 이러한 파골세포의 과다한 생성 및/또는 이동은 다양한 골질환의 원인이 되며 본 발명의 상기 방기 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 혀용가능한 염에 의해 파골세포의 생성 또는 이동을 억제하여 치료될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명에 따른 방기 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물 중 살루타리딘(salutaridine), 다우리쿠민(dauricumine), 헤일란티포린(cheilanthifoline) 또는 다우리포핀(dauriphophine)을 처리하여 배양하는 경우, M-CSF 및 RANKL을 배지에 첨가하여 배양하는 파골세포 분화를 유도하는 배양 조건 하에서도 파골세포로의 분화가 현저히 억제되는 것을 확인하였다. 아울러 이들 추출물 또는 화합물은 10 μg/ml 농도까지 처리하여도 세포 독성을 나타내지 않으므로, 골질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학적 조성물이나 건강기능식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

바람직하게, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 방기 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 0.001 내지 1 중량% 함유할 수 있다.

또한, 상기 본 발명에 따른 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어, "약학적으로 허용가능한"은 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간 등의 개체에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물을 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.

경구 투여를 위하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 고형 제제로 제조할 수 있다. 이러한 고형제제는 상기 조성물 이외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스, 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 활성 성분이 산에 의해 분해되기 쉬운 경우, 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 활성 성분의 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스, 덱스트란 등의 카보하이드레이트, 아스코르빅산, 글루타치온 등의 항산화제, 킬레이팅 물질, 저분자 단백질 또는 다른 안정화제들을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 방기 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골질환의 치료방법을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 방기 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 골 질환의 예방 또는 개선을 위하여 골 질환의 발병 단계 이전 또는 발병 후, 질환의 치료를 위한 약제와 동시에 또는 별개로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

또한 본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 방기 추출물, 이의 분획물 또는 이들로부터 분리된 화합물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료적 처치 등의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "건강기능식품"은 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 상기 건강식품용 조성물은 질병의 예방 및 질병의 회복 등과 관련된 기능을 수행할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 화합물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 이외에도 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.

본 발명의 방기 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 천연 한약재를 원료로 하므로 약학적 조성물 또는 식품 첨가물로 사용할 경우에도 일반적인 합성 화합물에 비하여 부작용이 덜할 수 있으므로, 안전하게 약학적 조성물 및 건강기능식품에 포함되어 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 방기(Sinomenium acutum) 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 특히, 살루타리딘(salutaridine), 다우리쿠민(dauricumine), 헤일란티포린(cheilanthifoline) 및/또는 다우리포핀(dauriphophine) 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 파골세포의 분화 및 활성을 억제시킴으로써, 골손실로 인한 골질환을 억제할 수 있으므로, 다양한 골질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 방기 추출물 나타낸 도이다. 상기 추출물을 농도별로 처리하여 배양한 세포에 대한, (a)는 TRAP 염색에 대한 현미경 이미지를, (b)는 TRAP 활성을, (c)는 상기 세포들에 대한 생존율을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 방기 추출물로부터 분리한 유효성분(화합물 1 내지 11)의 구조식 및 명칭을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 방기 추출물로부터 분리한 화합물 1 내지 4, 8, 10 및 11의 처리에 따른 RANKL-유도 파골세포 형성에 대한 효과를 나타낸 도이다. 상기 화합물을 농도별로 처리하여 배양한 세포에 대한, (a)는 TRAP 염색에 대한 현미경 이미지를, (b)는 TRAP 활성을 나타낸다.
도 4는 본 발명에 따른 방기 추출물로부터 분리한 화합물 5, 8, 10 및 11의 처리에 따른 RANKL-유도 파골세포 형성 억제효과를 나타낸 도이다. 상기 화합물을 농도별로 처리하여 배양한 세포에 대한, (a)는 TRAP 염색에 대한 현미경 이미지를, (b)는 TRAP-양성 다핵성 파골 세포(MNC)의 수를, (c)는 상기 세포들에 대한 생존율을 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 방기 추출물 및 이의 분획물의 제조

건조된 방기(Sinomenium acutum) 6 kg을 칭량하여 추출용기에 넣고 메탄올 90 L를 가하여 7일 동안 냉침시켜 추출하고 여과하였다. 상기 수득한 추출액을 진공회전증발기를 이용하여 감압농축하였다. 상기 추출 및 농축 과정을 2회 반복하여 737 g의 방기 추출물을 수득하였다.

상기 수득한 방기 메탄올 추출물을 4 L의 증류수에 현탁시킨 후, 1N NaOH를 첨가하여 pH 12.0으로 조절한 후 동량의 에틸아세테이트로 추출하였다. 상기 추출 과정을 3회 반복하여 얻어진 추출액을 합쳐서 다시 감압농축하여 84 g의 에틸아세테이트 분획물을 수득하였다. 상기 추출 과정으로부터 수득한 여액을 동량의 n-부탄올로 3회 반복하여 추출하고 추출액을 감압농축하여 72 g의 부탄올 분획물을 수득하였다.

실시예 2: 방기 추출물로부터 유효성분의 분리 및 동정

상기 실시예 1로부터 제조한 방기 추출물로부터 유효성분으로서 11종의 화합물을 분리하였으며, 이들 화합물의 구조식과 명칭을 도 2에 나타내었다.

구체적으로, 상기 실시예 1로부터 수득한 방기 메탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물(84 g)과 n-부탄올 추출물(72 g)을 알카로이드 분획(156 g)이라 명명하였다. 또한, 에틸아세테이트 분획물 중에서 시노메닌(도 2의 화학식 1) 5.5 g을 결정 상태로 분리하였다. 상기 시노메닌을 제외한 알카로이드 분획물 150.5 g을 대상으로, 디클로로메탄/메탄올 혼합 용액을 이동상으로 흘려주되 디클로로메탄/메탄올의 혼합비를 100:1로부터 1:1까지 순차적으로 증가시키는 농도구배 용출방식으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 총 5개 분획(제1분획 내지 제5분획)을 획득하였다.

수득한 제1분획을 대상으로 아민겔 컬럼 크로마토그래피(이동상: n-헥산/에틸아세테이트=10:1)를 실시하여 3.1 mg의 다우리포핀(도 2의 화학식 11)을 분리하였다. 제2분획을 대상으로는 역상 컬럼 크로마토그래피(매직: 리버스페이스 카본-18, 이동상: 30~90% 메탄올)를 실시하여 8-데메톡시루나닌(도 2의 화학식 4) 37.1 mg과 헤일란티폴린(도 2의 화학식 10) 6.0 mg을 각각 분리하였다. 또한 제3분획을 대상으로 제2분획에서와 동일한 조건의 역상 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 14-에피시노메닌(도 2의 화학식 2) 23.8 mg, 살루타리딘(도 2의 화학식 5) 37.2 mg, 아쿠투민(도 2의 화학식 6) 58.7 mg, 아쿠투미딘(도 2의 화학식 7) 7.4 mg 및 다우리쿠민(도 2의 화학식 8) 9.3 mg을 각각 분리하였다. 아울러 제4분획을 대상으로 아민겔 컬럼 크로마토그래피(이동상: n-헥산/에틸아세테이트=5:1)를 실시하여 시노메닌 N-옥사이드(도 2의 화학식 3) 92.4 mg을 분리하고, 남은 분획으로부터 마그노플로린(도 2의 화학식 9) 2.1 g을 분리하였다.

분리된 각각의 화합물들은 ¹H-NMR 및 ¹³C-NMR을 사용하여 구조를 확인하였다.

실시예 3: 방기 추출물 및 이로부터 분리된 화합물의 파골세포 형성 억제 효과 평가

5주령의 수컷 ICR 마우스를 구입하여 대퇴골(fermur) 및 경골(tibia)을 취하고 항생제(100 units/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신)를 포함하는 α-MEM으로 세척하여 골수세포(bone marrow cell)를 획득하였다. 상기 골수세포를 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 M-CSF(macrophage colony-stimulating factor; 10 ng/ml)를 포함하는 α-MEM에 1일간 배양하였다. 비부착(non-adherent) 골수세포를 페트리접시에 분주하고 M-CSF(30 ng/ml) 존재 하에 3일간 배양하였다. 비부착세포를 세척한 후 부착세포(adherent cell)를 골수-유래 마크로파지(bone marrow-derived macrophage; BMM)로 사용하였다. BMM 세포를 RANKL(10 ng/ml) 및 M-CSF(30 ng/ml) 존재 하에 DMSO 또는 실시예 1로부터 제조한 방기 추출물을 농도별(1, 3 및 10 μg/ml)로 처리하여 4일간 배양하였다. 음성대조군으로는 RANKL 없이 M-CSF만을 처리한 세포를 사용하였다. 다핵성 파골세포(multinucleated osteoclast)를 3.7% 포르말린으로 10분간 고정하고 0.1% 트리톤 X-100으로 10분간 처리하여 투과성을 갖도록 하였다. 세포를 TRAP 용액(Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 다핵성 파골세포를 TRAP(tartrate resistant acid phosphatase) 염색으로 가시화하였다(도 1a). 방기 추출물 농도에 따른 TRAP 활성을 확인하고 이를 도 1b에 나타내었으며, 이로부터 특히 10 μg/ml 농도의 방기 추출물을 처리하였을 때 30~40% 수준으로 TRAP 활성이 효과적으로 감소한 것을 확인하였다. 또한, 상기 방기 추출물이 세포 독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 동일한 농도로 방기 추출물을 처리한 세포에서 세포생존율을 계산하여 도 1c에 나타내었다. 도 1c에 나타난 바와 같이, 방기 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 방기 추출물을 1 내지 10 μg/ml 농도로 처리한 세포군에서 오히려 세포생존율이 증가하였음을 확인하였다. 이는 해당 농도 범위 내에서 방기 추출물은 세포 독성을 나타내지 않음을 나타낸다.

아울러 상기 실시예 2로부터 분리한 11종의 화합물(도 2)을 각각 농도별로 처리하여 배양하였다. 상기 방기 추출물을 처리하여 배양한 세포와 동일한 방법으로 배양하여 TRAP 염색하였다. 상기 11종의 화합물 중 TRAP 활성 억제효과가 미미한 화합물들(화합물 1 내지 4, 6, 7 및 9)에 대한 결과를 도 3에, 우수한 TRAP 활성 억제효과를 나타내는 화합물들(화합물 5, 8, 10 및 11)에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 상기 화합물 1 내지 4, 6, 7 및 9는 분리하여 정제된 화합물임에도 불구하고 3 μg/ml 처리 농도까지도 비처리군인 양성대조군과 유사한 수준의 TRAP 활성을 나타내어 이에 대한 억제 효과를 나타내지 못함을 확인하였다.

반면, 화합물 5, 8, 10 및 11은 3 μg/ml 농도부터 육안상으로도 확인할 수 있을 만큼 눈에 띄는 TRAP 활성 억제효과를 나타내었다(도 4a). 이들 세포 중, TRAP-양성 다핵성 파골세포(TRAP-positive multinucleated osteoclast cells; MNC)라고 표현하는 TRAP 염색되고 핵을 3개 이상 갖고 있는 다핵세포를 별도로 계수하여 도 4b에 나타내었으며, 본 발명의 화합물의 파골세포 형성 억제 효과를 평가하였다. 육안상으로도 확인된 바와 같이, 3 μg/ml 농도로 처리한 실험군부터 MNC의 수는 급격히 감소하기 시작하여 10 g/ml 농도로 처리한 실험군에서는 4가지 화합물 모두에 대해 거의 MNC가 나타나지 않았다. 나아가 이들 TRAP 활성 억제 효과를 나타내는 화합물들에 대해서도 세포생존율을 측정하여 세포 독성을 나타내는지를 확인하고, 그 결과를 도 4c에 나타내었다. 도 4c에 나타난 바와 같이, 4가지 화합물 모두에 대해 5 μg/ml까지는 100% 이상의 생존율을 나타내었으며, 화합물 10 및 11을 10 μg/ml 농도로 처리한 세포군에서 다소 세포생존율이 감소하였으나, 여전히 70% 이상의 수준을 유지하였으며, 화합물 5 및 8은 10 μg/ml 농도에서도 100% 이상의 생존율을 나타내었다.

Claims (8)

1. 방기(Sinomenium acutum) 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 C_{1 -4} 저급 알콜 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것인 약학적 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 메탄올을 용매로 사용하여 65 내지 85℃에서 추출한 것인 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 방기 추출물 또는 이의 분획물로부터 분리한 화합물은

   

   (살루타리딘; salutaridine),

   

   (다우리쿠민; dauricumine),

   

   (헤일란티포린; cheilanthifoline),

   

   (다우리포핀; dauriphophine) 또는 이들의 혼합물인 것인 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   파골세포의 생성 또는 이동을 억제하는 것인 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 골질환은 골다공증(osteoporosis), 파제트병(Paget's disease), 치주질환, 골성장장애 및 류마티스관절염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염을 0.001 내지 1 중량% 함유하는 약학적 조성물.
   
8. 방기 추출물, 이의 분획물, 이들로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 골질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.

Images