KR20160059944A - 대장암 표적용 펩타이드 및 이의 의학적 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 대장암 표적용 펩타이드 및 이를 이용한 방사선 반응성에 따른 대장암 예후 진단용 조성물 및 약물전달 용도에 관한 것으로서, 암 발병환자 개개인의 유전적 차이로 인해 치료 반응성이 달라 환자별 치료사례가 달라짐에 따라 치료 시 문제점을 염두에 두고, 환자 개인별 맞춤형 진단 및 치료를 구현하고자 이를 표적할 수 있는 기능성 펩타이드를 발굴하였다. 실제 환자의 암 미세환경과 유사한 동물모델을 구축하여 방사선 조사한 개체군과 그의 대조군으로 방사선을 조사하지 않은 개체군으로 구분하고, 각 개체군에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝하여 선별된 펩타이드에 대해 각각의 표적효율을 검증하였다. 이를 통해 최종적으로 방사선 치료 반응성을 예측하기 위한 영상진단 기술 개발 및 그에 따른 맞춤형 표적 치료제 개발에 활용될 수 있다.

Description

대장암 표적용 펩타이드 및 이의 의학적 용도{Targeting Peptides for Colorectal Cancer and Medical Use Thereof}
본 발명은 대장암 표적용 펩타이드 및 이를 이용한 방사선 반응성에 따른 대장암 예후 진단용 조성물 및 약물전달 용도에 관한 것이다.
인간의 몸을 구성하고 있는 가장 작은 단위인 세포는 정상적일 때 세포 내 조절기능에 의해 분열하며 성장하고 죽어 없어지기도 하면서 세포 수 균형을 유지한다. 어떤 원인으로 세포가 손상을 받는 경우, 치료를 받아 회복하여 정상적인 세포로 역할을 하게 되지만, 회복이 안 된 경우는 스스로 죽게 된다. 그러나 여러 가지 이유로 인해 이러한 증식과 억제가 조절되지 않는 비정상적인 세포들이 과다하게 증식할 뿐만 아니라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴 형성 및 정상 조직의 파괴를 초래하는 상태를 암(cancer)이라 정의한다. 암은 이렇듯 억제가 안 되는 세포의 증식으로, 정상적인 세포와 장기의 구조와 기능을 파괴하기에 그 진단과 치료의 중요성은 매우 크다.
한편, 암 발병환자 개개인의 유전적 차이로 인해 치료 반응성이 달라 환자별 치료 사례가 달라짐에 따라 치료 시 문제점이 있다. 이에 암 환자의 효과적인 치료를 위해 방사선 반응성에 따라 달라지는 암 미세환경 및 그에 따른 바이오마커를 표적할 수 있는 기능성 표적 치료제 개발이 요구되고 있으며, 이를 통하여 환자 개인별 맞춤형 진단 및 치료를 구현할 수 있다.
또한, 약물을 암 세포 및 조직에 선택적으로 전달하는 약물전달체계 또는 표적 치료는 많은 관심을 받아온 기술이다. 왜냐하면 동일 양의 항암제를 사용하더라도 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 크게 줄일 수 있기 때문이다. 또한 유전자 치료에 적용할 경우 바이러스를 암 세포에 선택적으로 전달시킴으로써 치료 효율을 올리고 심각한 부작용을 줄일 수 있다. 이를 위해 지금까지는 주로 종양세포에 특이한 항원 및 이를 표적하는 항체를 개발하여 왔다. 그러나 항체의 경우 면역반응의 우려 및 조직 내 침투의 낮은 효율성 등의 문제가 존재한다. 반면 펩타이드의 경우는 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고 조직 내 침투가 용이한 것이 장점이다. 따라서, 암 표적 펩타이드를 기존의 항암제와 연결하게 되면 종양에 선택적으로 약물을 전달하는 지능형 약물전달체로 활용될 수 있다.
한국공개특허공보 제10-2011-0107231호 (2011.09.30)
본 발명은 기존의 배양 세포 수준에서 연구되었던 스크리닝 방법과 달리 실제 사람 암 조직을 이식한 마우스 모델을 구축하여, 방사선 조사한 개체군과 그의 대조군으로 방사선을 조사하지 않은 개체군으로 구분하였다. 보다 구체적으로 각 개체군을 방사선 민감성 및 저항성으로 구분하여 각각의 개체군에 특이적으로 결합하는 펩타이드 스크리닝 방법을 통해, 신규한 대장암 표적용 펩타이드 및 이의 의학적 용도를 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 대장암 표적용 펩타이드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 12 내지 서열번호 15, 서열번호 17 및 서열번호 33 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지며, 방사선이 조사된 대장암 조직에 특이적인 대장암 표적용 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 대장암 진단용 조성물 및 방사선 반응성 대장암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 대장암 표적용 펩타이드를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명은 대장암 표적용 펩타이드 및 이를 이용한 방사선 반응성에 따른 대장암 예후 진단용 조성물 및 약물전달 용도에 관한 것으로서, 암 발병환자 개개인의 유전적 차이로 인해 치료 반응성이 달라 환자별 치료사례가 달라짐에 따라 치료 시 문제점을 염두에 두고, 환자 개인별 맞춤형 진단 및 치료를 구현하고자 이를 표적할 수 있는 기능성 펩타이드를 발굴하였다. 실제 환자의 암 미세환경과 유사한 동물모델을 구축하여 방사선 조사한 개체군과 그의 대조군으로 방사선을 조사하지 않은 개체군으로 구분하고, 각 개체군에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝하여 선별된 펩타이드에 대해 각각의 표적효율을 검증하였다. 이를 통해 최종적으로 방사선 치료 반응성을 예측하기 위한 영상진단 기술 개발 및 그에 따른 맞춤형 표적 치료제 개발에 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 마우스에 실제 환자 대장암조직을 이식 후, 방사선을 조사한 동물모델 구축 방법 및 확인 결과를 나타낸 사진이다. A: BRC에서 분양 받은 환자 대장암조직, B: NOD/SCID 마우스 옆구리에 이종이소 이식, C: B에서 암조직이 500 mm3의 크기로 자라면 계대 배양을 위해 암조직을 3x3 mm 크기로 절단함, D:누드마우스에 마취제를 복강주사하고, 오른쪽 넓적다리 피하에 조직 1개 이종이소 이식한 마우스 모델, E: 암조직이 250 mm3의 크기로 자라면 암조직을 형성한 넓적다리 부분에만 2Gy의 방사선량을 국소적으로 조사하였다. 대조군으로는 동일한 암 이식 마우스에서 방사선 조사하지 않은 개체군을 사용하였다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따라 마우스 모델에서 방사선 조사에 따른 반응성을 분류하고자 환자 암조직 이식 마우스에 방사선 조사 여부에 따른 암 증식곡선이다. 해당 증식 곡선을 완성하여 확인한 결과, C65는 방사선 저항성 케이스, C87은 방사선 민감성 케이스로 분류하였다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 M13 파아지 디스플레이 방법을 이용하여 생체 내 환자 대장암 조직을 표적하는 펩타이드 서열을 각 개체군에서 동정하기 위한 바이오패닝 계획도이다.
도 4는 3회의 바이오패닝 과정 진행 중 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 종양을 적출 후 파아지를 용출하여 파아지 농도를 비교한 결과이다.
도 5는 Cy5.5 형광 프로브가 연결된 펩타이드 파아지를 각각 개체군별 마우스 모델에 주사한 후 방사선 저항성 케이스(C65; 도 5a)는 7 일째, 방사선 민감성 케이스(C87; 도 5b)는 11일째 영상으로 확인하여 생체 내 암조직에 특이적으로 결합함을 확인한 결과이다.
도 6은 B5 펩타이드 서열의 방사선 저항성 케이스에서 방사선 조사 개체군에만 특이적 결합을 증명하기 위해 다른 대조군들에서의 반응성과 비교하고자 교차 검증한 결과이다.
도 7은 B5에 대한 교차 검증 결과를 토대로 ROI 값을 계산하여 표준화함에 따라 얻은 결과이다.
도 8은 B5의 우수한 표적능력을 조직면역염색을 통해 검증한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예 7에 따른 기존의 방사선 민감군/저항군 환자 대장암 조직 이외의 다른 환자 대장암 조직으로, 방사선 민감군과 저항군 케이스 각각 방사선 조사 여부에 따른 B5 펩타이드의 선택적 표적능을 확인한 결과이다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 대장암 표적용 펩타이드를 제공한다. 상기 서열번호의 아미노산 서열은 표 1 및 표 2에 기재되어 있다.
본 발명의 펩타이드는 아미노산 7개로 이루어진 저분자 펩타이드이다. 저분자 펩타이드는 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 점막을 쉽게 통과하며 조직 깊은 곳에서도 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 국소 주사를 통해 안정성이 확보되고 면역 반응성을 최소화 할 수 있기 때문에, 암을 조기 진단할 수 있는 장점이 있다. 그리고 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 약하다.
또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 항체보다 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되지만(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989), 이들로 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 AppliedBiosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 서열번호 12 내지 서열번호 15, 서열번호 17 및 서열번호 33 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지며, 방사선이 조사된 대장암 조직에 특이적인 대장암 표적용 펩타이드를 제공한다.
상세하게는, 본 발명의 서열번호 12 내지 서열번호 15, 서열번호 17 및 서열번호 33 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 대장암 조직, 특히 방사선이 조사된 대장암 조직에 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 “표적” 또는 “특이적”이란 다른 정상 조직에 결합하지 않고 대장암 조직, 특히 방사선이 조사된 대장암 조직에 한하여 특이적으로 결합하는 능력을 의미한다. 상기 대장암 특이적 펩타이드는 대장암 조직 내부 또는 외부에 특이적으로 결합할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 12 내지 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지며, 방사선 저항성 대장암 조직에 특이적인 대장암 표적용 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 33 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지며, 방사선 민감성 대장암 조직에 특이적인 대장암 표적용 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 "방사선 저항성(radio-resistance)"은 방사선 조사에 의해 쉽게 영향을 받지 않으며, 방사선에 노출시 세포 복구 또는 증식에 거의 변화가 없는 상태를 말한다.
본 발명에서 "방사선 민감성(radio-sensitive)"은 방사선 조사에 의해 쉽게 영향을 받으며, 방사선에 노출시 세포 복구 또는 증식에 변화를 보이는 상태를 말한다.
본 발명에 있어서, 방사선 치료 대상 대장암의 방사선 저항성 또는 민감성 여부 및 그 수준을 판단하면, 이를 반영하여 방사선 치료의 방사선 조사량을 정할 수 있기 때문에, 방사선 치료의 효율 및 치료 결과를 증진시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 대장암 표적 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함한다.
또한 상기 폴리뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 대장암 표적용 펩타이드를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 12 내지 서열번호 15, 서열번호 17 및 서열번호 33 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지며, 방사선이 조사된 대장암 조직에 특이적인 대장암 표적용 펩타이드를 포함하는 방사선 반응성 대장암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 12 내지 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지거나, 서열번호 33 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 대장암 표적용 펩타이드를 포함하는 방사선에 대한 대장암 예후 진단용 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 방사선에 대한 대장암 예후 진단은 방사선 저항성 또는 민감성 여부를 판단하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "진단"이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 대장암의 존재 또는 특징을 확인하는 것이다.
본 발명의 펩타이드를 이용한 대장암의 진단은 혈액, 소변이나 바이옵시(biopsy)에 의해 직접 얻은 해당 조직 또는 세포에 본 발명의 펩타이드를 반응시켜 이들의 결합을 검출함으로써 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드가 대장암 조직에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소(예: 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)), 방사성 동위원소(예: 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P, 35S), 크로모포어(chromophore), 발광물질 또는 형광물질(예: FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 시아닌(cyanine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots))등 일 수 있다.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 암을 진단할 수 있다. 예컨대, 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 순환시키고 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면, 암으로 진단된다.
또한, 본 발명은 상기 대장암 표적용 펩타이드를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 약물을 암조직에 선택적으로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 종래 공지의 약물과 연결하여 암 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 약물이 암 조직 및 암 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약물의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 약물의 부작용을 현저히 줄일 수 있다.
상기 약물은 항암제로서, 본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 항암제로는 종래 암의 치료에 사용되는 것이라면 제한없이 사용될 수 있다. 예컨대, 시스플라틴, 5-플로오우라실, 아드리아마이신, 메토트렉세이트, 빈블라스틴, 부설판, 클로람부실, 시클로포스파미드, 멜팔란, 니트로겐 무스타드, 니트로소우레아, 탁솔, 파클리탁셀, 도세탁셀, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 블레오마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 하이드록시우레아 등이 있다. 항암제와 본 발명의 펩타이드 간의 연결은 당업계에 공지된 방법, 예컨대, 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드는 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식(modification)될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 환자 대장암 조직 이식 마우스 모델 구축
환자의 암 미세환경을 최대한 유사하게 재현할 수 있도록 실제 대장암 환자로부터 적출된 암 조직을 마우스에 이식하여 암환자와 가장 유사한 동물모델을 구축하였으며, 이를 통해 기존의 배양 암세포를 이식한 동물모델의 한계를 극복한 이상적인 암질환 동물 모델을 확보하였다.
상기 환자 대장암 조직 이식 마우스 모델 구축을 위해 적출한 환자 암 조직을 NOD/SCID 마우스에서 배양하여 암조직이 확보되면, 다음 계대배양에서부터는 Balb/c 누드마우스를 사용하여 계대배양 하였다. 해당 마우스 모델 구축을 위한 관련된 모든 실험은 서울아산병원 임상연구윤리위원회와 아산생명과학연구소 동물실험 윤리위원회의 승인 후 철저한 규정 준수 아래 실시하였으며, 환자 암조직은 서울아산병원의 Bio Resource Center (BRC)로부터 규정에 의한 경로를 통해 암조직을 분양 받았다.
분양받은 암조직은 환자로부터 분리되기 전의 상태를 유지하기 위해 특정 보존액에 보관하여 동물실로 곧바로 이동하고, NOD/SCID 마우스에 마취제를 복강 주사하여 마취한 후, 3x3 mm 크기로 암조직을 절단하여 마우스 양쪽 옆구리 피하에 각각 조직 1개씩 이식하고 봉합한 뒤, 약 2 시간 가량 보온패드에서 회복하였다.(보존액 조건: HBSS containing 100 IU/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin, 100μg/ml gentamicin, 2.5μg/ml amphotericin B and 5% fetal bovine serum) 이식 완료 후 종양이 형성될 때까지 사육하며 매주 1회 이상 종양 형성 및 성장을 확인하고, 이식 암 조직이 500 mm3 이상 크기로 증식하면 적출하여 계대 배양을 위해 암조직을 3x3 mm 크기로 절단하였다. 누드마우스에 마취제를 복강주사하고, 오른쪽 넓적다리 피하에 조직 1개씩 이식하였다. 이식 부위를 옆구리에서 넓적다리 피하로 변경함은 방사선 조사 시 다른 장기 부위에 영향을 주지 않고 국소적으로 방사선을 조사하기 위함이다. 최종적으로 발명에 사용된 대장암 환자 암조직 이식 마우스 모델은 계대배양 4번 진행된 암조직 재이식하여 암조직을 형성한 마우스 모델을 구축하였다. 암 조직의 크기가 250 mm3 정도 성장하면 암조직에만 국소적으로 2 Gy의 방사선을 조사하고, 24 시간 이내의 회복시간을 가진 후에 in vivo 펩타이드 스크리닝을 진행하였다. 대조군으로 방사선을 조사하지 않은 개체군도 스크리닝을 따로 실시하였다. 상기 마우스 모델 구축은 총 2가지 대장암 조직에 대해 동일한 과정을 실시하였으며, 해당 결과를 도 1에 나타내었다.
< 실시예 2> 마우스 모델에서 방사선 조사에 따른 반응성 검증 및 분류
환자 암조직 이식 마우스에서 종양 형성 확인 후, 고유의 암 성장곡선을 완성하기 위해 각기 다른 두 환자 대장암 조직 이식 모델에서 각각 암 성장곡선을 확보하여 차후 발명의 대조군의 표준으로 활용할 수 있도록 하였다. 종양 크기 측정은 2-3일 간격으로 caliper로 크기를 측정하여 tumor volume을 계산하는 공식에 대입하여 성장 곡선을 작성하였다. (종양 크기 공식 : Tumor volume = a2b/2 (a: tumor의 짧은 직경, b: tumor의 긴 직경))
한 환자케이스 당 계대배양(P3) 누드마우스를 6마리 준비하여 3마리씩 2그룹으로 나누고 방사선 조사한 개체군과 대조군으로 방사선을 조사하지 않은 개체군으로 나누어 진행하였다. 종양 크기가 100 mm3으로 증식했을 때 오른쪽 뒷다리 종양 형성 부분에 2 Gy의 방사선을 조사하고, 방사선 조사 후 1일부터 종양 크기를 측정하였으며, 종양 크기가 약 1000 mm3 까지 증식할 때까지 측정하여 tumor volume을 plotting하여 암 증식 곡선을 완성하였으며, 실시 결과를 토대로 방사선 치료에 대한 민감도에 따라 방사선 민감 환자군(C87 케이스)과 방사선 저항 환자군(C65 케이스)으로 환자케이스를 분류하였다. 방사선 조사는 6 MV photon beam linear accelerator (CL/1800, Varian, CA, USA) 사용하고 1 cm 볼루스를 사용하였다. 상기 내용의 해당 결과를 도 2에 나타내었다.
< 실시예 3> in vivo 펩타이드 스크리닝 M13 파아지 디스플레이 방법
상기 실시예 2에서 방사선 민감도에 따라 분류된 환자 대장암 조직 이식 마우스 모델에 랜덤 루프형 펩타이드 라이브러리를 이용한 in vivo 펩타이드 스크리닝 과정에서 높은 특이성을 가지는 펩타이드를 동정할 수 있도록 디자인하였다. 상기 라이브러리는 7개의 아미노산으로 구성된 무작위 배열을 통하여 약 27억 개의 다양한 아미노산 서열을 가지도록 제작된 루프형태의 펩타이드 라이브러리[M13 파아지 gp3 minor coat 단백질에 융합된 라이브러리]-Ph.DTM phage display peptide library kit, New England Biolabs(NEB)를 구입하여 사용하였다. 구축한 마우스 모델에서 방사선 조사 개체군 (2 그룹)과 대조군 (2 그룹) 각각에서 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝하기 위하여, 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 M13 파아지 펩타이드 라이브러리를 꼬리 정맥으로 주사하여 생체 내에서 순환시킨 후(생체 내 암조직과 M13 파아지 펩타이드 라이브러리의 결합 방법), 암 조직에만 특이적으로 결합하는 펩타이드 발현 파아지를 선별하였으며, 이와 관련한 스크리닝 계획을 도 3 에 나타내었다. 구체적으로, 도 3은 암 조직에 타겟팅하는 펩타이드 스크리닝을 위한 M13 파아지 스크리닝의 계획도로서, (1) 오른쪽 넓적다리에 암 조직이 형성된 마우스 모델을 구축하고, (2) M13 파아지 표면에 7개 아미노산으로 구성된 루프형 펩타이드 라이브러리가 발현된 파아지 라이브러리를 꼬리정맥을 통해 주사하여 생체 내에서 15분간 순환시킨 뒤에, (3) 불필요한 파아지를 세척하는 과정을 거쳐(이를 퍼퓨징이라 함), (4) 최종적으로 암조직을 적출, 균질화 과정을 통해 암조직에 결합한 파아지를 용출하였다. 상기와 같이 얻은 파아지를 대장균에 감염시켜 파아지 수를 증폭 및 파아지 수를 파악하는 과정 (이를 titering이라 함)을 거쳐, 이를 다시 마우스 꼬리정맥을 통해 주사하여 순환시킨 후, 상기 과정을 반복시킴으로써 반복횟수가 증가함에 따라 점차 암조직 특이적이고 강한 결합력을 갖는 파아지만을 선별하는 과정을 실시하였다(이를 바이오 패닝(biopanning)이라 함). 최종적으로 총 3회의 바이오 패닝을 실시하여 생체 내 환자 대장암 조직에 특이적으로 결합하는 펩타이드 서열이 발현된 파아지를 확보하였다. 또한 상기에서 선별된 펩타이드 발현 파아지가 암조직만을 표적하는지를 확인하기 위해 생체 내의 다른 장기와 비교하고자, 바이오패닝 매 회 마다 심장, 폐, 간, 비장, 신장, 그리고 암조직을 각각 적출하여 파아지를 용출하였고 파아지 농도를 측정하여 비교한 결과를 도 4에 나타내었다. 최종적으로 상기에 의하여 얻어진 파아지를 숙주세포인 대장균 ER2738 세포에 감염시켜 LB 배지 상에서 증폭시킨 후, 100 개의 파아지 플라그를 무작위로 선택하여 M13 파아지 게놈성 DNA(단일 스트랜드화 원형 DNA)를 분리 정제하고 유전자 염기서열을 확인하여, 파아지 표면 단백질(gp3 minor coat 단백질)에 발현되어 암 조직에 타겟팅하는 펩타이드 부분의 아미노산 염기서열을 규명하였다. 동일한 과정을 상기 실시예 2에서 설명한 방사선 조사 그룹 (2그룹)과 대조군 (2그룹) 각각 in vivo 펩타이드 스크리닝을 진행하였으며, Clustal W 서열 분석 프로그램을 통하여 펩타이드 서열을 정리한 결과를 표 1 및 표 2에 나타내었다.
환자케이스 방사선조사 여부 번호 펩타이드 서열







방사선 저항성 환자 대장암 조직
(C65 케이스)



방사선 조사하지
않은 개체군 		A1 SHMEYPR (서열번호 1)
A2 NTGSPYE (서열번호 2)
A3 SNVYDHN (서열번호 3)
A4 STEHTRS (서열번호 4)
A5 SWGDRIL (서열번호 5)
A6 LQPKASQ (서열번호 6)
A7 ASKSTHD (서열번호 7)
A8 DVSGNW (서열번호 8)
A9 DLLHRGA (서열번호 9)
A10 MARYMSA (서열번호 10)
A11 NTWMKSK (서열번호 11)


방사선 조사한
개체군 		B1 STMNGKV (서열번호 12)
B2 SHMEYPR (서열번호 1)
B3 TVRSSAE (서열번호 13)
B4 VPSQKSK (서열번호 14)
B5 TPSFSKI (서열번호 15)
B6 GYSSFNR (서열번호 16)
B7 LKLGEKW (서열번호 17)












방사선 민감성 환자 대장암 조직
(C87 케이스)







방사선 조사하지
않은 개체군		 E1 SHMEYPR (서열번호 1)
E2 GYSSFNR (서열번호 16)
E3 NTGSPYE (서열번호 2)
E4 VQMPAHS (서열번호 18)
E5 GGNSNQR (서열번호 19)
E6 TAFSLGK (서열번호 20)
E7 QQTKNYY (서열번호 21)
E8 AIKNTKS (서열번호 22)
E9 TVRTSAV (서열번호 23)
E10 LTGSVNK (서열번호 24)
E11 MNFIQKN (서열번호 25)
E12 DETSGQI (서열번호 26)
E13 KISLPHN (서열번호 27)
E14 AFKSPSG (서열번호 28)
E15 LKTSGTY (서열번호 29)
E16 RSTGSSC (서열번호 30)
E17 YVSKNNS (서열번호 31)
E18 HKTEHRS (서열번호 32)




방사선 조사한
개체군		 F1 KLTQMM (서열번호 33)
F2 LKLGEKW (서열번호 17)
F3 SFFPFST (서열번호 34)
F4 DNSKLVE (서열번호 35)
F5 QLWQKEQ (서열번호 36)
F6 NTGSPYE (서열번호 2)
F7 LGSVGRD (서열번호 37)
F8 GQSGARF (서열번호 38)
F9 NGNSNTL (서열번호 39)
F10 TNPYPLD (서열번호 40)
< 실시예 4> 발굴 펩타이드의 환자 대장암조직 표적능력 확인을 위한 in vivo 이미징
상기에서 얻은 루프형 펩타이드가 발현된 파아지가 생체 내 이식 암조직을 표적함과 표적효율을 검증하고자 in vivo 이미징을 실시하였다.
구체적으로, in vivo 이미징 검증을 위해 펩타이드 파아지를 증폭시킨 후 형광 프로브(Cy5.5)를 연결하는 공정을 실시하였다. 구체적으로, 1 mL의 bicarbonate 버퍼 (pH 8.3)에서 파아지 농도 1012 plaque forming units (pfu) 에 N-hydroxysuccinimide esters of Cy5.5 (Amersham) 1 μg/μl를 첨가하고, 어두운 환경을 유지하며 3 시간동안 상온에서 파아지 표면 단백질과 Cy5.5 형광 프로브를 연결하였다. 파아지 표면 단백질의 아민기와 Cy5.5 형광 프로브의 N-hydroxysuccinimide esters 부분이 공유결합을 통해 화학적 결합으로 연결되었다. Cy5.5 형광 프로브가 연결된 각각의 펩타이드 파아지는 170μl의 20%(w/v) PEG 8000/ 2.5 M NaCl 용액으로 침전하여 정제하는 방법으로 얻었다. 최종으로 얻은 각각의 파아지 샘플에 Cy5.5 형광 프로브가 연결된 비율을 확인하고자, IVIS 스펙트럼 이미징 시스템 (Xenogen)을 통해 측정하고 해당 기기의 소프트웨어 프로그램을 사용하여 ROI 값을 결정하여 각각의 파아지 샘플들에 거의 동일한 연결 비율로 Cy5.5 형광 프로브가 연결됨을 확인하였다.
준비된 각각의 파아지 샘플을 실시예 1에서 구축한 환자 암조직 이식 마우스 모델에 각각 꼬리정맥을 통해 주사한 후, 주사 직후를 시작으로 하루에 한번 영상을 측정하여 생체 순환 및 배출과정을 확인하였고, 개체군마다 차이가 있으나 최종 7일에서 11일까지 영상을 측정하여, 오직 암조직만을 표적함을 검증하는 펩타이드 파아지를 선별하였다. 또한 in vivo 이미징 최종일에 암조직을 각각 적출하여 ex vivo 이미징을 획득하였다. 상기 결과에 대해 도 5에 나타내었다.
도 5의 결과를 바탕으로 각 개체군에서 선별된 펩타이드 파아지의 표적 효율 비교를 위해 적출한 암 조직들을 각각 모으고 암조직에 결합한 파아지를 용출하여 농도를 측정하였으며, 수치 표준화를 위해 각 암 조직의 무게를 측정하여, 암 조직 무게 대비 파아지 농도를 계산하여 수량화하였다. 또한 in vivo, ex vivo 이미징 결과를 형광세기에 따라 수치화하기 위해 ROI (Region Of Interest) 값을 계산하여 total flux 값을 얻었다. 각각의 수량화하여 계산된 값은 파아지가 없는 Cy5.5 dye와 펩타이드가 발현되지 않은 빈 파아지에 Cy5.5 프로브를 공정하여 주사한 마우스를 대조군에 대비하여 표준화하였고, 이를 표 3 및 표 4에 나타내었다. 표 3 및 표 4의 결과를 토대로 개체군 마다 각각 4개의 서로 다른 서열을 가진 펩타이드 서열이 선택되었으며, 이 펩타이드는 다른 펩타이드 서열의 파아지와 비교하였을 때, 보다 우수한 표적 능력을 지닌다는 것을 검증하였다.
환자케이스 방사선조사여부 샘플 pfu / mg in vivo ROI ex vivo ROI








방사선 저항성
환자 대장암조직 (C65 케이스)




방사선 조사하지
않은 개체군		 Cy5.5 - 1.00 1.00
Empty 0.23 1.43 1.16
A1 136.36 1.77 1.27
A2 181.48 2.04 1.61
A3 34.8 1.62 0.67
A4 264.86 3.20 1.83
A5 51.38 2.16 1.52
A6 15.4 2.75 1.47
A7 27.14 1.80 1.08
A8 8.56 2.99 1.57
A9 54.17 2.35 0.56
A10 183.16 2.26 1.58
A11 6.71 1.93 0.95



방사선 조사한
개체군		 Cy5.5 - 1.00 1.00
Empty - 1.40 0.72
B1 16.67 1.52 1.48
B2 230 2.27 1.89
B3 195.40 2.38 1.63
B4 20.62 2.12 1.36
B5 209.47 4.07 2.43
B6 211.76 3.03 2.06
B7 3.45 1.72 0.62
환자케이스 방사선조사여부 샘플 pfu / mg In vivo ROI Ex vivo ROI














방사선 민감성
환자 대장암조직
(C87 케이스)


















방사선 조사하지않은 개체군		 Cy5.5 - 1.00 1.00
Empty 1.40 1.21 0.82
E1 74.12 1.68 1.72
E2 3.96 1.12 0.62
E3 1.55 1.13 0.77
E4 5.00 0.84 0.94
E5 15.96 0.92 0.76
E6 4.24 0.78 0.77
E7 58.32 2.02 1.38
E8 15.00 0.90 0.49
E9 86.40 1.27 1.20
E10 2.25 1.19 1.00
E11 4.43 1.05 0.34
E12 5.56 1.24 1.07
E13 1.22 1.50 0.93
E14 2.89 0.70 0.55
E15 6.13 0.77 0.47
E16 2.14 0.50 0.24
E17 204.00 1.66 1.29
E18 4.15 0.69 0.21




방사선 조사한
개체군




 Cy5.5 - 1.00 1.00
Empty 8.18 0.96 0.83
F1 6.73 1.63 2.39
F2 1.90 1.00 2.92
F3 22.31 1.07 2.64
F4 69.18 1.59 3.11
F5 144.55 1.63 3.72
F6 4.75 1.15 2.64
F7 141.04 1.61 3.97
F8 6.10 1.18 1.92
F9 95.24 1.77 4.45
F10 7.86 1.91 1.74
< 실시예 5> 방사선 반응성 표적 펩타이드 선별을 위한 in vivo 이미징
상기에서 선별한 여러 펩타이드 파아지 중, 방사선 저항성 환자케이스(C65)에서 방사선 조사 개체군에서만 스크리닝된 펩타이드 서열인 B5 펩타이드에 대해 in vivo 이미징을 재시도 함과 동시에, 해당 개체군 이외의 다른 대조군들에서의 반응성도 확인하고자 교차실험을 실시하였다. 구체적으로 상기 실시예 1에서 구축한 방사선 민감 환자군과 방사선 저항 환자군 케이스 각각에서 방사선 조사의 차이를 두고, 총 4개 개체군에서 B5 펩타이드 서열의 표적 여부를 확인하고자 in vivo 이미징을 실시하였다. C65 케이스의 방사선 조사 개체군을 실험군으로 하고, C65 케이스에서 방사선 조사하지 않은 개체군 및 C87 케이스 개체군 모두를 대조군으로 확립하여 실시예 4에서와 동일한 방법으로 펩타이드 파아지 증폭 및 Cy5.5 형광 프로브 연결 공정과정을 실행한 다음, 각각의 개체군에 꼬리정맥으로 주사하여 최종 7일 째까지 영상을 관찰하였다. 그 결과 B5 펩타이드 서열은 파아지가 없는 Cy5.5 dye와 펩타이드가 발현되지 않은 빈 파아지에 Cy5.5 프로브를 공정하여 주사한 개체군과 비교하여 방사선 저항성 케이스 (C65)에서 방사선 조사 개체군에서만 뛰어난 표적능력을 증명하였다. 해당 실시예의 결과에 대해 도 6에 나타내고, 도 7에 이에 대한 ROI 값에 대한 표준화 결과를 나타내었다. 결론적으로 B5 펩타이드 서열의 경우, 대장암 환자 중 방사선 치료 시 방사선에 대해 저항성을 유도하는 인자 (바이오마커)를 표적, 다시 말해 방사선 조사 시 영향을 받는 암 미세환경에 따라 반응하는 서열일 가능성을 검증하였다.
< 실시예 6> 방사선 저항성 인자 추적용 펩타이드에 대한 조직학적 검증
상기 실시예 5에서 검증한 B5 펩타이드 서열의 조직학적 표적능력 검증을 위해 이미징 획득 후 각 개체군의 암조직을 적출하여 각각 파라핀 블록 및 절편 제작을 실시하였다. 구체적으로, (1) 적출한 암조직을 파라 포름알데하이드 용액에 담궈 24시간 동안 상온에서 조직을 고정시킨 후 탈수화 과정을 거친 다음 파라핀을 침투시켜 암조직 파라핀 블록 형성 후, 마이크로톰을 이용해 3 μm 두께로 절편하여 절편 슬라이드를 제작하였다. 본격적인 면역조직염색을 실시하기 위해, (2) 절편 슬라이드 상에서 탈파라핀 과정을 수행한 다음, (3) 조직 절편 내 고정되어 있던 다양한 단백질들의 구조를 회복하여 정상적으로 항체가 결합하는 부위를 복원할 수 있도록 Unmasking 과정을 실시하였다. 순차적으로, (4) 5 % BSA 용액으로 blocking, (5) 1차 항체를 결합하고 (사용한 항체는 M13 파아지 캡시드 단백질을 인식하는 anti-mouse M13 IgG), (6) 2차 항체 결합 및 HRP 결합 완료 후, (7) DAB 발색을 통해 파아지가 존재하는 부분을 염색한 다음, (7) Hematoxylin으로 핵을 염색하고 (8) 탈수화 과정 완료 후 마지막으로 mounting 하여 면역조직염색 완료된 조직 슬라이드를 영구 보존시킨다. 상기 내용대로 실시한 면역조직염색 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8의 결과는 실시예 5에서 B5 펩타이드 서열의 방사선 저항성 대장암 환자 케이스 (C65)에서 방사선 조사 개체군에서만 특이적으로 결합함을 확실하게 증명한 결과이다.
< 실시예 7> 다른 환자 대장암 조직에서 방사선 저항성 인자 추적용 펩타이드의 선택적 표적능 검증
상기 실시예에서 선별한 방사선 저항성 인자 추적능을 지닌 B5 펩타이드가 스크리닝에 이용된 방사선 저항성 환자 대장암 조직 이외 다른 방사선 저항성 환자 대장암 조직에서도 동일한 표적능을 갖는 지 확인하고자 다른 환자 대장암 조직 이식 마우스에 적용하였다. 구체적으로 실시예 5에서 검증한 교차실험을 확장하여, 상기 실시예 1에서 구축한 방사선 민감 환자군과 방사선 저항 환자군 케이스 이외 다른 환자 대장암 조직이면서, 암의 특성은 선암(adenocarcinoma)인 방사선 민감성 1 케이스, 방사선 저항성 1케이스를 추가적으로 도입하였다. B5 펩타이드 파아지 증폭 및 Cy5.5 형광 프로브 연결 공정과정은 상기 실시예 4에서와 동일한 방법으로 수행되었고, 표적능을 확인은 실시예 5와 동일하게 in vivo 이미징 방법으로 관찰하였다. 그 결과, 방사선 민감성 대장암 조직에서는 방사선 조사 여부와 관계없이 표적능을 보이지 않았으며, 방사선 저항성 대장암 조직에서는 방사선 조사 시에만 표적능을 확인하였고 해당 실시예의 결과를 도 9에 나타내었다. 구체적으로 실시 예6에서 대장암의 방사선 치료 시 방사선 저항성을 유도하는 인자를 표적하는 B5 펩타이드 서열의 표적능을 다른 방사선 저항성 환자 대장암 조직에서도 검증함으로써, 대장암의 방사선 치료 시 저항성을 유도하는 암 미세환경에 반응하는 서열로써 가능성을 확인하였다. 한편으로 방사선 민감성 대장암 환자에서는 방사선 조사 여부와 관계없이 표적능을 보이지 않는 펩타이드 서열로써 방사선 저항성 인자만을 선택적으로 추적하는 서열임을 보다 명확하게 검증하였다. 궁극적으로 방사선 저항성 케이스인 특정 대장암 환자에 국한되는 표적능이 아니며, 다른 방사선 저항성 환자 대장암 조직에서도 적용될 수 있음을 검증함으로써 임상 적용 시 적용 범위의 한정성을 극복하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Targeting Peptides for Colorectal Cancer and Medical Use Thereof <130> ADP-2015-0341 <160> 40 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 1 Ser His Met Glu Tyr Pro Arg 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 2 Asn Thr Gly Ser Pro Tyr Glu 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 3 Ser Asn Val Tyr Asp His Asn 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 4 Ser Thr Glu His Thr Arg Ser 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 5 Ser Trp Gly Asp Arg Ile Leu 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 6 Leu Gln Pro Lys Ala Ser Gln 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 7 Ala Ser Lys Ser Thr His Asp 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 8 Asp Val Ser Gly Asn Trp 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 9 Asp Leu Leu His Arg Gly Ala 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 10 Met Ala Arg Tyr Met Ser Ala 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 11 Asn Thr Trp Met Lys Ser Lys 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 12 Ser Thr Met Asn Gly Lys Val 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 13 Thr Val Arg Ser Ser Ala Glu 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 14 Val Pro Ser Gln Lys Ser Lys 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 15 Thr Pro Ser Phe Ser Lys Ile 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 16 Gly Tyr Ser Ser Phe Asn Arg 1 5 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 17 Leu Lys Leu Gly Glu Lys Trp 1 5 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 18 Val Gln Met Pro Ala His Ser 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 19 Gly Gly Asn Ser Asn Gln Arg 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 20 Thr Ala Phe Ser Leu Gly Lys 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 21 Gln Gln Thr Lys Asn Tyr Tyr 1 5 <210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 22 Ala Ile Lys Asn Thr Lys Ser 1 5 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 23 Thr Val Arg Thr Ser Ala Val 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 24 Leu Thr Gly Ser Val Asn Lys 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 25 Met Asn Phe Ile Gln Lys Asn 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 26 Asp Glu Thr Ser Gly Gln Ile 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 27 Lys Ile Ser Leu Pro His Asn 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 28 Ala Phe Lys Ser Pro Ser Gly 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 29 Leu Lys Thr Ser Gly Thr Tyr 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 30 Arg Ser Thr Gly Ser Ser Cys 1 5 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 31 Tyr Val Ser Lys Asn Asn Ser 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 32 His Lys Thr Glu His Arg Ser 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 33 Lys Leu Thr Gln Met Met 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 34 Ser Phe Phe Pro Phe Ser Thr 1 5 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 35 Asp Asn Ser Lys Leu Val Glu 1 5 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 36 Gln Leu Trp Gln Lys Glu Gln 1 5 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 37 Leu Gly Ser Val Gly Arg Asp 1 5 <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 38 Gly Gln Ser Gly Ala Arg Phe 1 5 <210> 39 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 39 Asn Gly Asn Ser Asn Thr Leu 1 5 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <400> 40 Thr Asn Pro Tyr Pro Leu Asp 1 5

Claims (12)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 대장암 표적용 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 12 내지 서열번호 15, 서열번호 17 및 서열번호 33 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 방사선이 조사된 대장암 조직에 특이적인 대장암 표적용 펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 12 내지 서열번호 15로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 방사선 저항성 대장암 조직에 특이적인 대장암 표적용 펩타이드.
  4. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 33 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 방사선 민감성 대장암 조직에 특이적인 대장암 표적용 펩타이드.
  5. 제1항의 대장암 표적용 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항의 대장암 표적용 펩타이드를 포함하는 대장암 진단용 조성물.
  7. 제2항의 대장암 표적용 펩타이드를 포함하는 방사선 반응성 대장암 진단용 조성물.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지되는 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 조성물.
  9. 제3항 또는 제4항의 대장암 표적용 펩타이드를 포함하는 방사선에 대한 대장암 예후 진단용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 방사선에 대한 대장암 예후 진단은 방사선 저항성 또는 민감성 여부를 판단하는 것을 특징으로 하는 대장암 예후 진단용 조성물.
  11. 제1항의 대장암 표적용 펩타이드를 포함하는 약물 전달용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 약물은 항암제인 것을 특징으로 하는 약물 전달용 조성물.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180060184A (ko) * 2016-11-28 2018-06-07 재단법인 아산사회복지재단 Ccsp-2와 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
WO2022035244A1 (ko) * 2020-08-14 2022-02-17 한국과학기술연구원 약물 반응성 예측을 위한 대장암 진단 또는 검출용 조성물, 대장암 예방 또는 치료용 조성물

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110041400B (zh) * 2018-01-15 2022-07-29 中国医学科学院药物研究所 一种多肽、及其在结直肠癌的早期诊断中的应用
CN116284255B (zh) * 2021-12-21 2024-08-02 中国医学科学院药物研究所 一种用于早期结直肠肿瘤的靶向多肽化合物与应用
CN116063384A (zh) * 2023-01-31 2023-05-05 贵州医科大学 一种荧光探针及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003016482A2 (en) * 2001-08-17 2003-02-27 Monsanto Technology Llc Methyltransferase genes and uses thereof
CN101971033A (zh) 2007-06-04 2011-02-09 戴诺普雷克斯公司 用于结直肠癌的生物标志物组合
KR101029881B1 (ko) 2007-12-14 2011-04-18 한국생명공학연구원 대장암 과발현 유전자를 이용한 대장암 진단 마커
CN103328496A (zh) 2010-10-25 2013-09-25 中央研究院 癌靶向肽及其于癌症治疗与诊断的应用
US8691189B2 (en) 2011-02-14 2014-04-08 Institute Of Nuclear Energy Research, Atomic Energy Council Method of colorectal cancer detection by using radiolabeled anti-GRP78 peptide
KR20130040493A (ko) * 2011-10-14 2013-04-24 전흥철 음식물 쓰레기통의 미생물 발효액 분사장치
KR101478826B1 (ko) 2011-10-28 2015-01-08 전남대학교산학협력단 신규한 대장암 진단용 마커 및 이를 이용한 대장암 진단 키트
US20140256586A1 (en) * 2013-03-09 2014-09-11 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for diagnosis of colorectal cancer

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180060184A (ko) * 2016-11-28 2018-06-07 재단법인 아산사회복지재단 Ccsp-2와 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
WO2022035244A1 (ko) * 2020-08-14 2022-02-17 한국과학기술연구원 약물 반응성 예측을 위한 대장암 진단 또는 검출용 조성물, 대장암 예방 또는 치료용 조성물

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