KR20160077194A

KR20160077194A - Hiv-1 env dna 백신과 단백질 부스터

Info

Publication number: KR20160077194A
Application number: KR1020167014407A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 비. 웨이너; 카루피아 무투마니; 메간 와이즈; 지안 얀; 케이트 브로데릭
Original assignee: 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아; 이노비오 파마수티컬즈, 인크.
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2016-07-01
Anticipated expiration: 2034-11-06
Also published as: EP3964231A1; EP3068427A1; KR102395493B1; CA3233605A1; KR20220061285A; WO2015073291A1; US20160256539A1; CA2930695C; CA2930695A1; EP3068427A4

Abstract

본 발명은 강력한 T-세포 반응, 광범위한 중화 항체 (bNAbs), 그리고 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 유도하는, 효과적인 HIV 백신에 관계한다. 앞서, 적응 전기천공 (EP)을 이용하여 운반된 합성 콘센수스 DNA 면역원을 이용하여 마스크와 인간에서 강력한 HIV/SIV 세포성 면역 반응의 유도를 설명하였다. 그러나, 관련된 항체 반응을 프라임시키기 위한 이러한 개선된 DNA 방법의 능력은 기존에 연구되지 않았다.
여기에서, 우리는 DNA 프라임 단백질 부스터 백신 요법에서 HIV-1 아형 A, B, C 및 D로부터 gp140 서열들이 인코딩된 콘센수스 DNA 구조체의 면역원성을 조사한다. 마우스 및 기니피그는 EP를 통하여 단일 및 다중-클레이드 DNA로 프라임되고, 재조합 gp120 단백질로 부스트되었다. gp120 결합 및 중화 항체 활성의 유도에 대하여 혈청 분석되었다. 재조합 Env 단백질 만으로 면역화는 제한된 중화 폭과 함께 낮은-역가 결합 항체를 유도하였다. 대조적으로, 합성 DNA 프라임 단백질 부스터 프로토콜은 상당히 더 높은 항체 결합 역가를 유도하였다. 더욱이, DNA 프라임-단백질 부스터 집단의 혈청은 티어(tier) 1 클레이드 B 바이러스의 패널의 더 광범위한 바이러스를 중화하고, 뿐만 아니라 다수의 티어 1 클레이드 A 및 클레이드 C 바이러스를 중화시킬 수 있었다. 합성 DNA 프라임 + 적응 EP와 단백질 부스터의 추가 연구가 보증된 것으로 보인다.

Description

HIV-1 ENV DNA 백신과 단백질 부스터{HIV-1 ENV DNA VACCINE PLUS PROTEIN BOOST}

관련 출원들에 대한 교차-참조

본 출원은 2013년 11월 14일자로 제출된 U.S. 가특허출원 61/904,416에 대한 우선권을 주장하며, 이는 모두 본 명세서에 참고자료에 편입된다.

발명의 분야

본 발명은 항원이 인코딩된 DNA가 포함된 프라이밍(priming) 백신, 그리고 제 1 백신과 동일한 또는 상이한 항원을 이용하는, 제 1 백신에 대한 반응을 부양하는 제 2 백신을 이용하여 HIV 연합된 감염의 증상을 치료 및 예방하는 것에 관계한다.

발명의 배경

개선된 체액 및 세포성 면역 반응을 유도하는 HIV에 대항하는 개선된 백신접종 방법이 절실히 요구된다. 항체 중화에서 강력한 T-세포 반응 및 입김(breath)은 보호 백신의 개발에 있어서 중요한 역할을 할 것이라는 것에 일반적으로 동의한다. 과거 DNA 플랫포옴은 혈청전환의 부실한 유도물질이었지만, 최근 개선된 설계 개념(construct design), 개선된 운반 및 개선된 제형으로 인하여 이러한 방법의 면역 효능이 강화되었다. 우리는 전기천공 (EP)을 통하여 운반된 콘센수스(consensus) DNA 면역원을 이용한, 마우스, 마스크(아프리카 아시아산 원숭이중 하나) 및 인간에서 강력한 HIV/SIV-특이적 세포성 면역 반응의 유도를 최근에 보고하였다. 이러한 연구들이 강력하고, 광범위한 세포-매개된 반응의 유도를 확인하였지만, 중화 항체 (NAbs)의 유도 또는 프라임시키기 위하여 이러한 개선된 DNA-EP 플랫포옴의 능력은 알려지지 않고 있다. DNA 프라임-단백질 부스터 백신접종 전략이 포함된, HIV에 대한 면역 반응을 개선시키기 위한 노력에 대한 관심이 집중되어, 여기에서 우리들은 생체내에서 결합 역가 및 중화 능력의 증가에 촛점을 둔 이러한 조합을 연구하였다.

DNA 프라임-단백질 부스터 요법에서 HIV-1 개별 아형 A, B, C 및 D로부터 유도된 gp140 구조체(constructs)가 인코딩된 합성 DNA 백신의 면역원성을 연구하는 것이 당분야에서 필요하다. 이들 콘센수스 DNA 구조체는 다음의 플라스미드-증강 기술: 코돈 최적화, RNA 최적화, 리더 서열 추가, 고농도에서 플라스미드 생산을 이용하여 최적화될 수 있고, 그리고 DNA는 기존에 설명된 바와 같이, 적응(adaptive) EP에 의해 운반되었다. DNA 프라임은 재조합 HIV gp120와 함께 단백질 부스터에 의해 이어질 것이다. 면역 반응은 ELISA, B-세포 ELISpot, T-세포 ELISpot, 및 TZM-bl 중화 분석에 의해 측정되었다. 상기 복합 방법은 독립적인 양식으로 관찰된 것들에서 T 세포 및 항체 기능성을 증가시켰다.

발명의 요약

본 발명은 (a) 제 1 백신과 (b) 제 2 백신을 포함하는 조성물에 관계한다. 상기 제 1 백신은 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개의 핵산을 포함할 수 있으며, 이때 각 핵산은 항원을 인코드하며, 이때 상기 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개의 핵산은 HIV-1 아형 A 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 집단으로부터 선택될 수 있다. 상기 제 2 백신은 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개 항원성 펩티드를 포함할 수 있는데, 이때 상기 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개 항원성 펩티드는 HIV-1 아형 A 콘센수스 펩티드, HIV-1 아형 B 콘센수스 펩티드, HIV-1 아형 C 콘센수스 펩티드, HIV-1 아형 D 콘센수스 펩티드, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 집단으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 HIV-1에 대항하여 면역이 필요한 개체를 면역화시키는 방법에 관계한다. 상기 방법은 (a) 제 1 백신과 (b) 제 2 백신을 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 상기 제 1 백신은 제 2 백신과 독립적으로 투여될 수 있다. 상기 제 1 백신은 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개의 핵산을 포함할 수 있으며, 이때 각 핵산은 항원을 인코드하며, 이때 상기 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개의 핵산은 HIV-1 아형 A 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 집단으로부터 선택될 수 있다. 상기 제 2 백신은 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개 항원성 펩티드를 포함할 수 있는데, 이때 상기 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개 항원성 펩티드는 HIV-1 아형 A 콘센수스 펩티드, HIV-1 아형 B 콘센수스 펩티드, HIV-1 아형 C 콘센수스 펩티드, HIV-1 아형 D 콘센수스 펩티드, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 집단으로부터 선택될 수 있다.

도 1. 최적화된 HIV-1 Env 단백질 발현. (a) Jurkat T-세포는 HIV-1 Env-발현시키는 플라스미드로 형질감염되었고, FACS에 의해 발현이 측정되었다. 세포는 항-HIV 코어 또는 대조 항체에 이어서, PE-접합된 염소 항-마우스 및 인간 CD4-FITC 처리에 의해 착색되었다. (b) 최적화된 외피 발현의 면역형광 분석. 인간 RD 세포는 백신 구조체에 의해 형질감염되었고, 그리고 MHC-I 및 HIV-1 Env에 대항하는 단일클론 항체로 착색시킨 후, 동일촛점 분석을 하였다. MHC-I은 세포 표면 발현을 위한 표지로 이용되었는데, 그 이유는 유핵(nucleated) 포유류 세포의 표면상에서 편재 발현되기 때문이다.
도 2. HIV-1 Env 백신은 세포-매개된 면역 반응의 강력한 유도제다. (a) BALB/c에서 DNA 프라임-단백질 부스터 면역화 연구를 위한 동물 집단의 기획 단일 플라스미드 (b) 또는 복합된 플라스미드 (c) 제제로부터 항원-특이적 T-세포 반응은 IFN-γ ELI스팟에 의해 평가되었다. 비장 T-세포는 BALB/c 면역우세 Env 펩티드로 자극되었고, IFN-γ 스팟(spot) 형성 세포는 하룻밤 항온처리 후 열거되었다. 결과는 배경 펩티드가 차감된 대조 SFC 카운트와 함께, 4마리 동물/집단에 대한 스팟 형성 세포 (SFC)의 평균 수± SD로 나타낸다.
도 3. HIV-1 Env 항원에 대한 반응하여 IFN-γ 및 IL-2 생산 Env 펩티드로 자극된, IFN-γ 및 IL-2 발현시키는, Env-특이적 CD8⁺/CD4⁺ 비장 T 세포의 유동 세포측정 분석과 세포내 사이토킨 착색. 마우스는 표시된 Env 구조체로 면역화되었고, 비장세포들이 수집되고, 배양되었다. (a) 복합된 DNA로 면역화되고, 상기 외피 펩티드로 5시간 동안 자극을 받은 마우스로부터 수거한 비장 세포의 대표적인 유동 세포측정(flow cytometry) 데이터. (b&c) 재료 및 방법에서 설명된 바와 같이 시험관 자극에 의해 생성된, Env-특이적 IFN-γ 및 IL-2 발현시키는 (b) CD4⁺ 및 (c) CD8⁺T-세포 반응의 수를 나타내는 막대그래프다. 결과는 집단당 4마리 (n=4) 마우스에 대한 평균 ± SD로 나타낸다. 이 도면에서 제시된 데이터는 실행된 두 가지중 하나의 실험에서 나온 것이다.
도 4. HIV-1 Env에 대한 항혈청의 특징 아형 A, B C 및 D 외피 DNA 및 아형 B 단백질과 함께, DNA 프라임-단백질 부스터로부터 마우스 혈청의 결합 ELISA 플레이트는 재조합 gp120 (아형 B) 외피 당단백질로 피복되었다. (a&b) 나타낸 바와 같이, 상이한 Env 면역원으로 면역화된 마우스 (n=4)로부터 획득한 종점 항 gp120 IgG 역가, 데이터는 제 2 단백질 부스터 후 일주일, 35일차에 역가를 나타낸다. c) 결합 항체 역가와 T-세포 ELISpot 분석에 의해 획득된 SFU 사이의 상관관계.
도 5. 항체 분비 세포 (ASCs)의 탐지 마우스 (n=4) 집단은 표시된 구조체로 면역화되었다. (a) 96-웰 플레이트는 PBS 안의 염소 항-마우스 IgG로 피복되었고, 하룻밤 동안 4℃에서 차단되었다. IgG 생산 B-세포의 대략적인 수는 ELISpot 분석에 의해 결정되었다. (b) 2개의 개별 실험의 대표 플랏을 나타낸다; 오차 막대는 최소한 3개의 복제 웰의 표준 편차를 나타낸다. (c) 결합 항체 역가와 B-세포 ELISpot 분석에 의해 획득된 SFU 사이의 상관관계.
도 6. 기니피그(Guinea pig) 면역화 및 항체 결합. (a) 기니피그의 DNA 프라임-단백질 부스터 면역화 연구를 위한 시간표 면역화된 기니피그와 대조 기니피그로부터 혈청 시료는 나타낸 바와 같이 획득되었다. (b&c) 항-gp120 항체-결합 역가는 첫 단백질 부스터 후 2주차에 ELISA에 의해 결정되었다 (n=5). 데이터는 평균 종점 역가 ±SD로 나타낸다. (d) 다중-클레이드(clade) 프라임 및 재조합 단백질 부스터 면역화된 기니피그의 혈청을 이용한 웨스턴 블랏 분석에 의해 분석된 항-gp120 IgG의 특이성. 293T 세포의 세포 용해물은 HIV-1 Env 플라스미드 (pHxB2)로 일시적으로 형질감염되었으며, 10% SDS-PAGE 상에 로딩되었고, 그리고 표시된 면역화된 기니피그와 같이, 1:500 희석에서 주요(primary) 항체로써 HIV-1 Env로부터 혈청을 이용하여 웨스턴 블랏에 의해 분석되었다. 혈청은 최종 단백질 면역화후 2주차에 수집되었다.
도 7. 면역화된 기니피그 혈청으로부터 HIV-1에 대한 중화 항체 역가. 테스트를 위하여 기니피그 혈청은 최종 단백질 면역화 후 2주차에 수집되었다. 상기 중화 실험은 재료 및 방법에서 설명된 바와 같이, 외피 티어(tier) 1 슈도(pseudo) 바이러스 패널을 이용하여 TZM-bl 세포에서 실행되었다. 중화 역가는 바이러스 분리체의 50% 저해를 얻는 (ID50) 혈청 희석으로 정의된다.

상세한 설명

발명자들은 DNA 프라임-단백질 부스터 요법에서 개별 HIV-1 아형 A, B, C 및 D로부터 유도된 HIV 항원성 구조체가 인코드된 합성 콘센수스 DNA 백신의 놀라운 발견을 하였다. 이들 콘센수스 DNA 구조체는 다음의 플라스미드-증강 기술: 코돈 최적화, RNA 최적화, 리더 서열 추가, 고농도에서 플라스미드 생산을 이용하여 최적화될 수 있고, 그리고 DNA는 기존에 설명된 바와 같이, 적응(adaptive) EP에 의해 운반되었다. DNA 프라임은 재조합 HIV gp120와 함께 단백질 부스터에 의해 이어질 것이다. 면역 반응은 ELISA, B-세포 ELISpot, T-세포 ELISpot, 및 TZM-bl 중화 분석에 의해 측정되었다. 상기 복합 방법은 독립적인 양식으로 관찰된 것들에서 T 세포 및 항체 기능성을 증가시켰다.

1. 정의

본 명세서에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 목적이며, 제한하기 위한 의도는 없다. 본 명세서와 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수("a", "an" 및 "the")형은 다른 명시적인 언급이 없는 한 복수 개념을 포함한다.

본 명세서에서 숫자 범위의 언급에서, 동일한 수준의 정밀도에 의해, 이들 사이에 각각 있는 수들도 명시적으로 고려된다. 예를 들면, 6-9 범위의 경우, 6과 9에 추가하여 숫자 7과 8이 고려되며, 그리고 6.0-7.0 범위의 경우, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 및 7.0 숫자들이 명시적으로 고려된다.

본 명세서에서 이용된 바와 같이, "콘센수스" 또는 "콘센수스 서열"은 특정 항원의 다수 아형의 배열 분석에 근거하여 구축된, 합성 핵산 서열, 또는 대응하는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 상기 서열은 특정 항원의 다수 아형 또는 세르타입(sertypes)에 대항하는 광범위한 면역성을 유도하는데 이용될 수 있다. 합성 항원, 이를 테면 융합 단백질은 콘센수스 서열 (또는 콘센수스 항원)으로 조작될 수 있다.

"펩티드" 또는 "폴리펩티드"는 아미노산들이 연계된 서열이며, 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 변형 또는 조합일 수도 있다.

질환으로부터 동물을 보호할 때 언급되는 "치료" 또는 "치료하는"이란 이 질환을 방지, 억제, 억압 또는 완전하게 제거하는 것을 의미한다. 질환의 방지(preventing)는 이 질환이 개시되기 전, 동물에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 질환의 억제(suppressing)은 이 질환이 유도된 후, 그러나 임상적 출현이 있기 전, 동물에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 질환의 억압(reppressing)는 이 질환의 임상적 출현이 있고 난 후, 동물에게 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

"실질적으로 동일한(substantially identical)"이란 첫번째 아미노산 서열과 두번째 아미노산 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100개의 아미노산 범위에서 최소한 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%이다.

"변이체(variant)"는 아미노산의 삽입, 결손, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열은 상이하지만, 최소한 한 가지 생물학적 활성은 유지되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. "생물학적 활성"의 대표적인 예로는 특이적 항체에 결합하는 능력 또는 면역 반응을 촉진시키는 능력을 포함한다. 변이체는 최소한 한 가지 생물학적 활성을 유지하는 아미노산 서열을 가진 언급된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가진 단백질을 또한 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 가령, 하나의 아미노산을 유사한 성질(이를 테면, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)을 가진 상이한 아미노산으로 대체시키는 것은 전형적으로 작은 변화가 포함되는 것으로, 당업계에서 인지된다. 이러한 작은 변화는 아미노산의 소수성 지수(hydropathic index)를 고려하여 부분적으로 확인될 수 있다. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982) 참고. 아미노산의 소수성 지수는 이 아미노산의 소수성 및 전하를 근거로 한다. 소수성 지수가 유사한 아미노산들이 치환될 수 있으면, 여전히 단백질 기능을 유지할 수 있는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 한 측면에서, 소수성 지수 ±2 를 갖는 아미노산으로 치환된다. 아미노산의 친수성은 생물학적 기능이 유지되는 단백질을 야기하는 치환을 드러내는데 또한 이용될 수 있다. 펩티드 내용에서 아미노산의 친수성으로 해당 펩티드의 최대 국소 평균 친수성을 산출할 수 있으며, 이는 U.S. 특허 번호 4,554,101(본 명세서에서 전문이 참고자료에 편입됨)에서 논의된 바와 같이, 항원성 및 면역원성과 잘 관련된 것으로 보고된 유용한 척도다. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환으로 생물학적 활성, 예를 들면 면역원성이 유지되는 펩티드가 만들어질 수 있으며, 이는 당분야에서 인지하는 것이다. 아미노산의 각 친수성 값이 ±2 인 아미노산으로 치환이 실행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수와 친수성 값 모두 아미노산의 특정 측쇄에 영향을 받는다. 이러한 관찰과 일관되게, 생물학적 기능과 양립가능한 아미노산 치환은 아미노산의 관련 유사성에 의존적이며, 특히 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 성질에 의해 드러나는 것과 같이, 이들 아미노산의 측쇄에 의존적인 것으로 이해된다.

2. HIV 면역학적 반응의 프라이림 및 부스팅을 위한 조성물

HIV에 대한 면역 반응을 프라이밍하고 부스팅하기 위한, 제 1 백신과 제 2 백신이 포함된 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 상기 제 1 백신은 항원이 포함된 최소한 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 최소한 10개의 핵산으로 구성된다. 상기 제 2 백신은 1개, 최소한 2개, 최소한 3개, 최소한 4개, 최소한 5개, 최소한 6개, 최소한 7개, 최소한 8개, 최소한 9개, 또는 최소한 10개의 항원성 펩티드를 포함한다. 상기 제 1 백신은 백신접종 요법의 첫날(day 1)에 투여된다. 상기 제 1 백신은 다수의 투여분량(doses)으로 제공될 수 있다. 상기 제 1 백신은 제 1 백신의 첫 투여 후 12 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간 이내에 두번째 투여될 수 있다. 상기 제 1 백신은 프라이밍 백신접종일 수 있다.

상기 제 2 백신은 제 1 백신을 부스팅하기 위하여 투여될 수 있다. 상기 제 2 백신은 제 1 백신 투여 후 48 시간, 60 시간, 72 시간, 84 시간, 90 시간, 1.5 주, 2 주, 2.5 주, 3.0 주, 3.5 주, 4.0 주, 4.5 주, 5.0 주, 5.5 주, 6.0 주, 6.5 주, 7.0 주, 7.5 주, 8.0 주, 8.5 주, 9.0 주, 9.5 주, 10.0 주, 10.5 주, 11.0 주, 11.5 주, 12.0 주, 12.5 주, 13.0 주, 13.5 주, 14.0 주, 14.5 주 또는 15.0 주에 처음 투여될 수 있다. 상기 제 2 백신은 다수의 투여분량으로 제공될 수 있다. 상기 제 2 백신은 제 2 백신의 첫번째 투여 후 60 시간, 72 시간, 84 시간, 90 시간, 1.5 주, 2 주, 2.5 주, 3.0 주, 3.5 주, 4.0 주, 4.5 주, 5.0 주, 5.5 주, 6.0 주, 6.5 주, 7.0 주, 7.5 주, 8.0 주, 8.5 주, 9.0 주, 9.5 주, 10.0 주, 10.5 주, 11.0 주, 11.5 주, 12.0 주, 12.5 주, 13.0 주, 13.5 주, 14.0 주, 14.5 주 또는 15.0 주, 또는 15.5 주에 두번째 투여될 수 있다.

상기 백신은 항원-특이적 T 세포 기능을 저해하는 항원-특이적 T 세포를 유도할 수 있다. 항원이 인코딩된 DNA가 포합된 제1 백신과, 제 1 백신에 대한 면역반응을 부스팅하기 위한 항원이 포함된 제 2 백신의 복합은 항원 또는 이에 대응하는 DNA 만으로 구성된 백신보다, 특이적 항원에 대항하여 더 효과적인 면역반응을 유도한다. 상기 백신은 iTreg 세포 유도를 위한 MHC Class II 제시 및 발현을 더 강화시킬 수 있다.

a. 항원

상기 조성물은 항원을 포함할 수 있다. 상기 항원은 핵산 서열에 의해 인코드된다. 상기 핵산 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 핵산은 항원 또는 이의 변이체를 인코드한다. 상기 항원은 제 1 백신과 제 2 백신 사이에 동일한 항원 또는 상이한 항원일 수 있다. 상기 항원은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)로부터 단리된 항원일 수 있다. 상기 HIV 항원들은 면역원에 대한 변형된 콘센수스 서열들을 포함할 수 있다. 구조체의 면역원성을 증가시키기 위하여, 코돈 최적화, RNA 최적화를 포함하는 유전적 변형, 및 고효율 면역글로블린 리더 서열의 추가가 변형된 콘센수스 서열들 안에 포함될 수 있다. 새로운 면역원은 대응하는 코돈 최적화된 면역원 보다 더 강력하고, 더 광범위한 세포성 면역 반응을 유도하도록 기획될 수 있다.

제 1 백신의 항원은 HIV의 상이한 아형들에 대해 동일한 항원일 수 있다. 상기 제 1 백신은 HIV 아형 A, B, C, D, 또는 다른 HIV 아형, 또는 이의 복합 또는 이의 변이체로부터 단리된 특정 단백질 서열이 인코드된, 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 또는 5개 또는 그 이상의 DNA 서열을 포함할 수 있다. 제 1 백신의 항원은 HIV의 상이한 아형들에 대해 동일한 항원일 수 있다. 상기 제 1 백신은 HIV 아형 A, B, C, D, 또는 다른 HIV 아형, 또는 이의 복합 또는 이의 변이체로부터 단리된 특정 단백질 서열이 인코드된, 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 또는 5개 또는 그 이상의 콘센수스 DNA 서열을 포함할 수 있다. 상기 제 1 백신은 HIV 아형 A로부터 단리된 특정 단백질 서열이 인코드된 DNA 서열, HIV 아형 B로부터 단리된 특정 단백질 서열이 인코드된 제 2 DNA 서열, HIV 아형 C로부터 단리된 특정 단백질 서열이 인코드된 제 3 DNA 서열, HIV 아형 D로부터 단리된 특정 단백질 서열이 인코드된 제 4 DNA 서열, 또는 이의 복합을 포함할 수 있다. 상기 제 1 백신은 HIV 아형 A로부터 단리된 특정 단백질 서열이 인코드된 콘센수스 DNA 서열, HIV 아형 B로부터 단리된 특정 단백질 서열이 인코드된 제 2 콘센수스 DNA 서열, HIV 아형 C로부터 단리된 특정 단백질 서열이 인코드된 제 3 콘센수스 DNA 서열, HIV 아형 D로부터 단리된 특정 단백질 서열이 인코드된 제 4 콘센수스 DNA 서열, 또는 이의 복합을 포함할 수 있다. 상기 제 1 백신은 특정 HIV 아형 A 단백질 서열 또는 이의 변이체가 인코드된 콘센수스 DNA 서열 또는 이의 변이체, 특정 HIV 아형 B 단백질 서열 또는 이의 변이체가 인코드된 제 2 콘센수스 DNA 서열 또는 이의 변이체, 특정 HIV 아형 C 단백질 서열 또는 이의 변이체가 인코드된 제 3 콘센수스 DNA 서열 또는 이의 변이체, 특정 HIV 아형 D 단백질 서열 또는 이의 변이체가 인코드된 제 4 콘센수스 DNA 서열 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다.

상기 제 2 백신은 HIV 아형 A, B, C, D, 또는 다른 HIV 아형으로부터 단리된 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상의 항원성 펩티드 서열들, 또는 이의 복합 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 제 2 백신은 HIV 아형 A, B, C, D, 또는 다른 HIV 아형으로부터 단리된 1개 또는 그 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상의 콘센수스 항원성 펩티드 서열들, 또는 이의 복합 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 상기 제 2 백신은 제 1 백신의 DNA 인코드된 펩티드와 동일한 또는 상이한 항원성 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 제 2 백신은 HIV 아형 A, 아형 B, 아형 C, 아형 D 또는 다른 HIV 아형으로부터 단리된 특정 단백질 서열을 포함할 수 있다. 상기 제 2 백신은 HIV 아형 A, 아형 B, 아형 C, 아형 D 또는 다른 HIV 아형으로부터 단리된 특정 콘센수스 단백질 서열을 포함할 수 있다.

일부 구체예들에 있어서, HIV 항원은 아형 A 콘센수스 외피 DNA 서열 구조체, 아형(Subtype) A 외피 단백질의 콘센수스 서열에 연계된 IgE 리더 서열, 또는 아형 A 콘센수스 외피(Envelope) 단백질 서열일 수 있다.

다른 구체예들에 있어서, HIV 항원은 아형 B 콘센수스 외피 DNA 서열 구조체, 아형(Subtype) B 외피 단백질의 콘센수스 서열에 연계된 IgE 리더 서열, 또는 아형 B 콘센수스 외피(Envelope) 단백질 서열일 수 있다.

여전히 다른 구체예들에 있어서, HIV 항원은 아형 C 콘센수스 외피 DNA 서열 구조체, 아형 C 외피 단백질의 콘센수스 서열에 연계된 IgE 리더 서열, 또는 아형 C 콘센수스 외피 단백질 서열일 수 있다.

추가 구체예들에 있어서, HIV 항원은 아형 D 콘센수스 외피 DNA 서열 구조체, 아형(Subtype) D 외피 단백질의 콘센수스 서열에 연계된 IgE 리더 서열, 또는 아형 D 콘센수스 외피 단백질 서열일 수 있다.

일부 구체예들에 있어서, HIV 항원은 아형 A Nef-Rev 콘센수스 외피 DNA 서열 구조체, 아형(Subtype) A Nef-Rev 단백질의 콘센수스 서열에 연계된 IgE 리더 서열, 또는 아형(Subtype) A Nef-Rev 콘센수스 단백질 서열일 수 있다.

일부 구체예들에 있어서, HIV 항원은 아형 B Nef-Rev 콘센수스 외피 DNA 서열 구조체, 아형(Subtype) B Nef-Rev 단백질의 콘센수스 서열에 연계된 IgE 리더 서열, 또는 아형(Subtype) B Nef-Rev 콘센수스 단백질 서열일 수 있다.

일부 구체예들에 있어서, HIV 항원은 아형 C Nef-Rev 콘센수스 외피 DNA 서열 구조체, 아형(Subtype) C Nef-Rev 단백질의 콘센수스 서열에 연계된 IgE 리더 서열, 또는 아형(Subtype) C Nef-Rev 콘센수스 단백질 서열일 수 있다.

일부 구체예들에 있어서, HIV 항원은 아형 D Nef-Rev 콘센수스 외피 DNA 서열 구조체, 아형(Subtype) D Nef-Rev 단백질의 콘센수스 서열에 연계된 IgE 리더 서열, 또는 아형(Subtype) D Nef-Rev 콘센수스 단백질 서열일 수 있다.

다른 구체예들에 있어서, HIV 항원은 아형 A, B, C 및 D DNA 서열 구조체의 Gag 콘센수스 DNA 서열, Gag 콘센수스 아형 A, B, C 및 D 단백질의 콘센수스 DNA 서열에 연계된 IgE 리더 서열, 또는 콘센수스 Gag 아형 A, B, C 및 D 단백질 서열일 수 있다.

여전히 다른 구체예들에 있어서, HIV 항원은 MPol DNA 서열 또는 MPol 단백질 서열일 수 있다. 상기 HIV 항원은 Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev , Gag의 핵산 또는 아미노산 서열들, 또는 이의 임의의 복합일 수 있다.

다른 구체예들에 있어서, HIV 항원은 gp140 또는 콘센수스 gp140 단백질을 인코드하는 아형 A, B, C, 또는 D의 DNA 서열 또는 콘센수스 서열일 수 있다. 다른 구체예들에 있어서, HIV 항원은 gp140 또는 콘센수스 gp120 단백질을 인코드하는 아형 A, B, C, 또는 D의 DNA 서열 또는 콘센수스 서열일 수 있다. 다른 구체예들에 있어서, HIV 항원은 아형 A, B, C, 또는 D의 gp140 펩티드 서열 또는 gp140 콘센수스 펩티드 서열이다. 다른 구체예들에 있어서, HIV 항원은 아형 A, B, C, 또는 D의 gp120 펩티드 서열 또는 gp140 콘센수스 펩티드 서열이다.

상기 항원은 포유류에게 영향을 줄 수 있는데, 이때 포유류는 인간, 침팬지, 개, 고양이, 말, 소, 마우스, 또는 렛이 될 수 있다. 상기 항원은 포유류의 단백질 안에 있을 수 있으며, 이때 포유류는 인간, 침팬지, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 마우스, 또는 렛이 될 수 있다.

b. DNA

상기 조성물은 DNA를 포함할 수 있다. 상기에서 설명된 바와 같이, 상기 항원이 인코드된 DNA가 또한 본 명세서에서 제공된다. 상기 DNA는 항원이 인코드된 서열을 포함할 수 있다. 상기 DNA는 펩티드 결합에 의해 항원에 연계된 링커(linker) 또는 테그(tag) 서열들이 인코드된 추가 서열들을 또한 포함할 수 있다.

c. 벡터

상기 조성물은 항원을 인코딩하는 DNA가 포함된 벡터를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 상기 항원을 발현시킬 수 있다. 상기 벡터는 발현 구조체일 수 있으며, 이 구조체는 일반적으로 플라스미드이며 표적 세포 안으로 특정 유전자를 도입시킬 때 이용된다. 상기 발현 벡터가 일단 세포 내부에 있으며, 유전자에 의해 인코드된 단백질은세포성-전사 및 해독 기전 리보좀 복합체에 의해 생성된다. 상기 플라스미드는 인헨서(enhancer) 및 프로모터(promoter) 영역으로 작용하는 조절 서열을 포함하여, 상기 발현 벡터 상에 운반되는 유전자의 효과적인 전사를 유도하는 조절 서열들이 포함되도록 흔히 조작된다. 본 발명의 벡터는 다량의 안정적인 메신져 RNA, 및 따라서 단백질을 발현시킨다.

상기 벡터는 발현 시그날, 이를 테면 강력한 프로모터, 강력한 종료 코돈, 상기 프로모터와 클론된 유전자 간의 거리 조정, 그리고 전사 종료 서열 및 PTIS (이동가능한 해독 개시 서열)의 삽입을 가질 수 있다.

i. 발현 벡터

상기 벡터는 원형 플라스미드 또는 선형 핵산 백신일 수 있다. 상기 원형 플라스미드와 선형 핵산은 적절한 대상 세포 안에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 상기 벡터는 항원-인코딩 뉴클레오티드 서열에 작동가능하도록 연계된 프로모터를 가질 수 있으며, 이는 종료 시그날에 작용가능하도록 연계될 수 있다. 상기 벡터는 뉴클레오티드 서열의 적절한 해독에 요구되는 서열들을 또한 포함할 수 있다. 관심 대상의 뉴클레오티드 서열이 포함된 백터는 키메라(chimeric)일 수 있으며, 이는 성분들중 최소한 하나는 이의 다른 성분들중 최소한 하나에 대하여 이종(heterologous)임을 의미한다. 발현 카세트 안에 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적(inducible) 프로모터의 조절하에, 또는 숙주 세포가 일부 특정한 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는 유도성(inducible) 프로모터의 조절 하에 있을 수 있다. 다중세포 유기체의 경우에, 상기 프로모터는 특정 조직 또는 장기 또는 발생 단계에 또한 특이적일 수 있다.

ii. 원형 및 선형 벡터

상기 벡터는 원형 플라스미드일 수 있는데, 이는 세포성 게놈 안으로 통합됨으로써 표적 세포를 변형시킬 수 있거나, 또는 염색체외적으로 (이를 테면, 복제 원점과 함께 자가 복제가능한 플라스미드) 존재할 수 있다.

상기 벡터는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 상기 DNA를 발현시키고, 세포에 의해 상기 서열을 면역계에 의해 인지되는 항원으로 해독할 수 있도록 하는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 5:1 내지 1:5의 질량 비, 또는 1:1 내지 2:1의 질량비로 항원과 복합될 수 있다.

선형 핵산 백신, 또는 선형 발현 카세트 ("LEC")가 또한 제공되는데, 이것은 전기천공을 통하여 개체에게 효과적으로 운반될 수 있고, 그리고 하나 또는 그 이상의 바람직한 항원들을 발현시킬 수 있다. 상기 LEC는 임의의 포스페이트 기본골격이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. 상기 DNA는 하나 또는 그 이상의 항원을 인코드할 수 있다. 상기 LEC는 프로모터, 인트론, 중지 코돈, 폴리아데닐화 시그날을 포함할 수 있다. 상기 항원의 발현은 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 상기 LEC는 임의의 항생제 저항성 유전자들 및/또는 포스페이트 기본골격을 포함하지 않을 수 있다. 상기 LEC는 바람직한 항원 유전자 발현과 무관한 다른 핵산 서열들을 포함하지 않을 수 있다.

상기 LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유도될 수 있다. 상기 플라스미드는 항원을 발현시킬 수 있다. 상기 플라스미드는 pNP (Puerto Rico/34) 또는 pM2 (New Caledonia/99)일 수 있다. 도 1 참고. 상기 플라스미드는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 provax, 또는 상기 DNA를 발현시키고, 세포에 의해 상기 서열은 면역계에 의해 인지되는 항원으로 해독될 수 있도록 하는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.

상기 LEC는 pcrM2일 수 있다. 상기 LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR는 차례로 pNP (Puerto Rico/34) 및 pM2 (New Caledonia/99)로부터 유도될 수 있다. 도 34 참고. 상기 LEC는 5:1 내지 1:5의 질량 비, 또는 1:1 에서 2:1의 질량비로 항원과 복합될 수 있다.

iii. 프로모터, 인트론 , 중지 코돈, 및 폴리아데닐화 시그날

상기 벡터는 프로모터를 보유할 수 있다. 프로모터는 유전자 발현을 이끌고, 그리고 단리된 핵산의 발현을 조절할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 DNA 의존적 RNA 폴리메라제를 통하여 전사에 요구되는 시스-작용(cis-acting) 서열 요소이며, 본 명세서에서 설명된 항원 서열을 전사시킨다. 이종성 핵산의 발현을 지시하는데 이용된 프로모터의 선택은 특정 용도에 의존적이다. 상기 프로모터는 벡터의 자연적 환경에서 이 벡터의 전사 시작 부위에 있는 거리와 대략 동일한 거리의 전사 시작으로부터 위치될 수 있다. 그러나, 프로모터 기능의 상실없이도 이 거리에 변화가 있을 수 있다.

상기 프로모터는 항원과 이 전사체(transcript)의 효과적인 폴리아데릴화, 리보솜 결합 부위, 및 해독 종료에 요구되는 시그날이 인코드된 핵산 서열에 작용가능하도록 연계될 수 있다. 상기 프로모터는 CMV 프로모터, SV40 조기(early) 프로모터, SV40 후기(later) 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, Rous 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포 안에서 발현에 효과를 보인 또다른 프로모터일 수 있다.

상기 벡터는 기능을 하는 접합(splice) 공여(donor) 부위 및 수용(acceptor) 부위와 함께, 인헨서와 인트론을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 효과적인 종료를 제공하는 구조 유전자의 하류에 전사 종료 영역을 포함할 수 있다. 상기 종료 영역은 상기 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 획득될 수 있거나, 또는 상이한 유전자들로부터 획득될 수 있다.

d. 백신- 어쥬번트 , 부형제의 다른 성분들

상기 조성물은 약학적으로 수용가능한 부형제를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 수용가능한 부형제는 비이클(vehicles), 어쥬번트, 운반체, 또는 희석제로써 기능을 하는 분자들일 수 있다. 상기 약학적으로 수용가능한 부형제는 표면 활성 물질, 이를 테면 면역-자극 복합체 (ISCOMS), Freunds 불완전 어쥬번트, 모노포스포릴 지질 A가 포함된 LPS 유사체, 뮤라밀 펩티드, 퀴논 유사체들, 소낭 이를 테면 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 폴리음이온, 폴리양이온, 또는 나노입자을 포함하는 형질감염 촉진(facilitating) 물질, 또는 다른 공지의 형질감염 촉진 물질일 수 있다.

상기 형질감염 촉진 물질은 폴리음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)를 포함하는 폴리양이온, 또는 지질이다. 상기 형질감염 촉진 물질은 폴리-L-글루타메이트이며, 폴리-L-글루타메이트는 백신 안에 6 mg/ml 미만의 농도로 존재할 수 있다. 상기 형질감염 촉진 물질은 표면 활성 물질, 이를 테면 면역-자극 복합체 (ISCOMS), Freunds 불완전 어쥬번트, 모노포스포릴 지질 A가 포함된 LPS 유사체, 뮤라밀 펩티드, 퀴논 유사체들 및 소낭 이를 테면 스쿠알렌 및 스쿠알렌을 또한 포함할 수 있으며, 그리고 히알루론산은 이 유전자 구조체와 병용하여 또한 투여될 수 있다. 상기 DNA 플라스미드 백신은 형질감염 촉진 물질, 이를 테면 지질, 레시틴 리포좀 또는 당분야에 공지된 다른 리포좀이 포함된 리포좀, 가령 DNA-리포좀 혼합물 (예를 들면 W09324640 참고), 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 폴리음이온, 폴리양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 공지의 형질감염 촉진 물질을 또한 포함할 수 있다. 상기 형질감염 촉진 물질은 폴리음이온, 폴리-L-글루타메이트 (LGS)를 포함하는 폴리양이온, 또는 지질이다. 백신 안에 상기 형질감염 물질의 농도는 4 mg/ml 미만, 2 mg/ml 미만, 1 mg/ml 미만, 0.750 mg/ml 미만, 0.500 mg/ml 미만, 0.250 mg/ml 미만, 0.100 mg/ml 미만, 0.050 mg/ml 미만, 또는 0.010 mg/ml 미만이다.

상기 약학적으로 수용가능한 부형제는 어쥬번트일 수 있다. 상기 어주번트은 대체 플라스미드에서 발현되는 다른 유전자이거나, 또는 상기 백신안에 플라스미드와 복합된 단백질로 운반되는 다른 유전자일 수 있다. 상기 어주번트는 α-인터페론(IFN- α), β-인터페론 (IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), 피부 T 세포-유인 케모킨 (CTACK), 표피 흉선-발현된 케모킨 (TECK), 점막-연합된 표피 케모킨 (MEC), IL-12, IL-15, MHC, CD80, 시그날 서열이 결손되고, 임의선택적으로 IgE의 시그날 펩티드가 포함된 IL-15를 포함하는 CD86으로 구성된 집단에서 선택될 수 있다. 상기 어주번트는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유도된 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 상피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 또는 이의 복합일 수 있다.

유용한 어쥬번트가 될 수 있는 다른 유전자들은 다음을 인코딩하는 것들을 포함한다: MCP-1, MIP-la, MIP-1p, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이형태, CD40, CD40L, 맥관 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 맥관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 비활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자들, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 및 이의 기능을 하는 단편들.

상기 백신은 1994년 4월 1일자로 제출된 U.S. 일련번호 021,579에서 설명된 유전적 백신 촉진자를 더 포함할 수 있으며, 상기 출원은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.

상기 백신은 이용되는 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 주사가능한 백신 약학 조성물은 멸균된, 발열원이 없고, 미립자도 없을 것이다. 등장성 제제 또는 용액이 이용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로즈, 만니톨, 솔비톨 및 락토오스를 포함할 수 있다. 상기 백신은 혈관수축제를 포함할 수 있다. 상기 등장성 용액은 포스페이트 완충된 염수를 포함할 수 있다. 백신은 젤라틴 및 알부민이 포함된 안정제를 더 포함할 수 있다. LGS 또는 폴리양이온 또는 폴리음이온가 포함된, 상기 안정제는 이 제제가 실온 또한 주변 온도에서 장시간 동안 안정하도록 할 수 있다.

3. 백신접종 방법

상기 조성물을 이용하여 HIV 감염을 치료 또는 예방하기 위하여 환자에게 백신접종 방법이 본 명세서에서 제공된다. 환자에게 백신접종 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 상기 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 상기 제 1 백신은 프라이밍 백신접종을 통한 면역 자극을 위하여 이를 필요로 하는 개체에게 효과적으로 항원을 전달 할 수 있다. 항원이 인코드된 프라이밍 DNA의 투여에 이어서, 부스터 항원성 펩티드의 투여에 의해, 특이적 항원에 대항하여 개체의 면역계가 효과적으로 유도될 수 있다. 항원-인코딩 원형 플라스미드 또는 선형 핵산을 포함하는 DNA 백신은 플라스미드-기반 백신과 비교하였을 때, 개체에게 효과적으로 전달된 경우, 항원-특이적 항체 반응을 유도할 수 있고, 더 오랜 기간 동안 반응이 지속될 수 있다. 상기 제 2 백신은 제 1 백신에 대한 부스팅 백신일 수 있으며, 제 1 백신과 동일한 또는 상이한 항원성 펩티드를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 설명된 조성물은 상기 개체 집단에 의해 용인되는 더 오래 지속되는 항원-특이적 면역 반응을 제공하기 위하여 개체에게 투여될 수 있다. 본 발명은 DNA로부터 발현될 수 있는 다수의 항원에 또한 관계한다.

제 1 백신과 제 2 백신의 투여분량은 시간당 체중 kg 당 1 μg 내지 10 mg의 활성 성분일 수 있고, 이는 시간당 체중 kg 당 20 μg 내지 10 mg의 성분일 수 있다. 상기 제 1 백신은 백신접종 요법의 첫날(day 1)에 투여된다. 상기 제 1 백신은 다수의 투여분량(doses)으로 제공될 수 있다. 상기 제 1 백신은 제 1 백신의 첫 투여 후 12 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간 이내에 두번째 투여될 수 있다. 상기 제 1 백신은 프라이밍 백신접종일 수 있다.

효과적인 치료를 위한 백신 투여분량의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다.

a. 투여

상기 조성물은 약학 분야의 당업자에게 잘 공지된 표준 기술에 따라 제형화될 수 있다. 이러한 조성물은 투약형으로 투여되는데, 나이, 성별, 체중 및 특정 개체의 상태 그리고 투여 경로와 같은 인자들을 고려하여 의료 분야의 당업자에게 공지된 기술에 의해 투여될 수 있다. 대상은 포유류, 이를 테면 인간, 말, 소, 돼지, 염소, 고양이, 개, 렛, 또는 마우스일 수 있다.

상기 조성물은 예방적으로 또는 치료요법적으로 투여될 수 있다. 예방적 투여에 있어서, 상기 백신은 iTreg 반응을 유도하는데 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료요법적 용도에서, 상기 백신은 치료요법적 효과를 유도하는데 충분한 양으로 이를 필요로 하는 개체에게 투여된다. 이를 실행하는데 적합한 양은 치료학적으로 효과적인 투여분량이라고 정의된다. 이러한 용도에 효과적인 양은 이를 테면, 투여되는 백신 요법의 특정 조성물, 투여 방식, 질환의 단계 및 심각성, 환자의 전반적인 건강 상태, 그리고 처방의사의 판단에 따라 달라질 것이다.

상기 조성물은 Donnelly et al. (Ann. Rev. Immunol. 15:617-648 (1997)); Felgner et al. (U.S. 특허 5,580,859, 1996년 12월 3일자로 공고됨); Felgner (U.S. 특허 5,703,055, 1997년 12월 30일자로 공고됨); 및 Carson et al. (U.S. 특허 5,679,647, 1997년 10월 21자로 공고됨)에서 설명된 바와 같이 공지된 방법들에 의해 투여될 수 있고, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 상기 백신의 DNA는 입자 또는 비드로 복합되어, 예를 들면, 백신 총(vaccine gun)을 이용하여 개체에게 투여될 수 있다. 당업자는 생리학적으로 수용가능한 화합물이 포함된, 약학적으로 수용가능한 운반체의 선택은 예를 들면, 상기 발현 벡터의 투여 경로에 의존적이라는 것을 인지할 것이다.

상기 조성물은 다양한 경로를 통하여 운반될 수 있다. 전형적인 운반 경로는 비경구 투여, 이를 테면, 피내, 근육내, 또는 피부 아래 운반을 포함한다. 다른 경로는 경구, 비강내 및 질내 경로를 포함한다. 특히 백신의 DNA의 경우에서, 상기 백신은 개체의 조직의 간질 공간으로 운반될 수 있다(Felgner et al., U.S. 특허 5,580,859 및 5,703,055, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다). 상기 백신은 또한 근육으로 투여될 수 있거나, 또는 피부내 또는 피부아래 주사를 통하여 투여될 수 있거나, 또는 이를 테면 이온이동법(iontophoresis)에 의해 피부를 통하여 투여될 수 있다. 상기 백신의 표피 투여가 또한 이용될 수 있다. 표피 투여는 자극제에 대한 면역 반응을 촉진시키기 위하여 표피의 가장 바깥 층을 기계적으로 또는 화학적으로 자극하는 것을 포함할 수 있다(Carson et al., U.S. 특허 5,679,647, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다).

상기 조성물은 비강 경로를 통하여 투여될 수 있도록 또한 제형화될 수 있다. 비강 투여에 적합한 제형, 이때 운반체는 고체가 되는 제형은 예를 들면, 약 10 내지 약 500 미크론 범위의 입자 크기를 갖는 거친 분말을 포함할 수 있고, 이런 분말이 포함된 용기를 코에 가까이 대고, 이 용기로부터 비강 통로를 통하여 신속하게 흡입함으로써, 코를 통하여 빨아들이는 방식으로 투여된다. 상기 제제는 비강 스프레이, 비강 점적약제가 될 수 있거나, 또는 분무기를 통하여 에어로졸 투여될 수 있다. 상기 제제는 백신의 수성 또는 유성 용액을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 액체 조제물, 이를 테면, 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르(elixir)가 될 수 있다. 상기 백신은 비경구, 피하, 진피, 근육내 또는 정맥 투여 (이를 테면, 주사가능한 투여)용 조제물, 이를 테면 멸균 현탁액 또는 에멀젼(emulsion)일 수 있다.

상기 조성물은 리포좀, 미소구(microspheres) 또는 다른 폴리머 매트릭스 안에 통합될 수 있다 (Felgner et al., U.S. Pat. No. 5,703,055; Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. Ito III (2nd ed. 1993), 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다). 리포좀은 인지질 또는 다른 지질로 구성될 수 있으며, 상대적으로 제조 및 투여가 용이한, 비독성의, 생리학적으로 수용가능한 그리고 대사가능한 운반체가 될 수 있다.

상기 조성물은 전기천공, 이를 테면 U.S. 특허 번호　7,664,545에서 설명된 방법에 의해 투여될 수 있고, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 상기 전기천공은 U.S. 특허 　6,302,874; 5,676,646; 6,241,701; 6,233,482; 6,216,034; 6,208,893; 6,192,270; 6,181,964; 6,150,148; 6,120,493; 6,096,020; 6,068,650; 및 5,702,359에서 설명된 방법 및/또는 기구에 의한 것일 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 상기 전기천공은 최소한의 침습성 장치를 통하여 실행될 수 있다.

상기 최소한의 침습성 전기천공 장치("MID")는 상기에서 설명된 백신과 연합된 유체를 신체 조직으로 주사하기 위한 기구일 수 있다. 상기 장치는 속이 빈 바늘, DNA 카세트, 그리고 유체 운반 수단을 포함할 수 있고, 이때 상기 장치는 신체 조직 안으로 바늘을 찌르는 동안 DNA를 동시에 주사(예를 들면, 자동)하기 위하여 유체 운반 수단을 작동시키도록 조정된다. 바늘이 삽입되어 있는 동안 DNA 및 연합된 유체를 점진적으로 주사하는 능력은 신체 조직을 통하여 상기 유체의 더욱 고른 분포를 유도하는 장점을 가진다. 주사되는 DNA는 더 넓은 부위로 분포되기 때문에 주사 동안 겪게 되는 통증이 감소될 수 있다.

MID는 바늘의 사용 없이 조직 안으로 조성물을 주사할 수 있다. MID는 백신이 조직의 표면을 뚫고, 하부 조직 및/또는 근육으로 유입될 정도의 힘을 가진 작은 기류(stream) 또는 분출(jet)로써 백신을 주사할 수 있다. 작은 기류(stream) 또는 분출(jet)의 힘은 순식간에 마이크로 크기의 구멍을 통하여 압착 가스, 이를 테면 이산화탄소의 팽창에 의해 제공될 수 있다. 최소한의 침습성 전기천공 장치의 예, 그리고 이를 사용하는 방법은 공개된 U.S. 특허 출원 번호 20080234655; U.S. 특허 번호 6,520,950; U.S. 특허 번호 7,171,264; U.S. 특허 번호 6,208,893; U.S. 특허 번호 6,009,347; U.S. 특허 번호 6,120,493; U.S. 특허 번호 7,245,963; U.S. 특허 번호 7,328,064; 및 U.S. 특허 번호 6,763,264에서 설명되며, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.

상기 MID는 통증없이 조직을 뚫을 수 있는 고속 액체 분출을 만드는 주입기를 포함할 수 있다. 이러한 바늘 없는 주입기는 시판되고 있다. 본 명세서에서 이용될 수 있는 바늘없는 주입기의 예들은 U.S. 특허 번호 3,805,783; 4,447,223; 5,505,697; 및 4,342,310에서 설명된 것들이 포함되며, 상기 문헌의 내용은 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.

직접 또는 간접 전기적 전달에 적합한 형태의 바람직한 조성물은 백신이 조직 안으로 침투될 수 있도록 충분한 힘을 가지고, 이 물질의 분출 운반되도록 하기 위하여, 치료되는 조직 안으로 바늘없는 주입기를 이용하여, 통상적으로 조직 표면에 주입기를 접촉시켜 도입(이를 테면, 주사)될 수 있다. 예를 들면, 치료될 조직이 점막, 피부 또는 근육인 경우, 이 물질은 이 물질이 각질층을 통하여 진피 층 또는 아래 조직 및 근육으로 침투할 수 있도록 충분한 힘을 가지고 점막 또는 피부 표면을 향하여 분사된다.

바늘없는 주입기는 모든 유형의 조직, 특히 피부 및 점막으로 백신을 운반하는데 적합하다. 일부 구체예들에 있어서, 바늘없는 주입기를 이용하여 백신이 포함된 액체를 표면 및 개체의 피부 또는 점막으로 밀어넣는데 이용될 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료될 수 있는 다양한 유형의 조직의 대표적인 예들은 췌장, 후두, 비인두, 후두인두, 입인두, 입술, 목, 폐, 심장, 신장, 근육, 유방, 결장, 전립선, 흉선, 고환, 피부 점막 조직, 난소, 혈관, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

상기 MID는 조직을 전기천공할 수 있는 바늘 전극을 보유할 수 있다. 직사각 또는 사각 패턴으로 설정된 다수의 전극 배열 안에 다수의 전극 쌍들 간에 펄스에 의해, 전극 쌍 사이의 펄스에 개선될 결과를 제공한다. 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,702,359 "Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes"에서 바늘 배열이 공개되는데, 이때 다수의 바늘쌍은 치료 처리 동안 펄스된다. 문헌의 내용의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된, 이 출원에서 바늘은 원형 배열로 배치되었지만, 마주하는 전극 쌍 사이에 펄스를 제공하는 연결기와 스위치를 가지고 있다. 재조합 발현 벡터를 세포로 운반하는 한 쌍의 바늘 전극이 이용될 수 있다. 이러한 장치 및 시스템은 U.S. 특허 번호 6,763,264에서 설명되며, 문헌의 내용의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다. 대안으로, 정상적인 주사 바늘을 닮은 단일 바늘을 가지고 DNA 및 전기천공 주사가 허용되는 단일 바늘 장치가 이용될 수 있는데, 이때 본 장치에서 이용되는 것보다 낮은 전압의 펄스를 제공하고, 따라서, 환자가 겪게 되는 전기 자극이 감소될 수 있다.

MID는 하나 또는 그 이상의 전극 배열을 포함할 수 있다. 이 배열은 동일한 직경 또는 상이한 직경의 2개 또는 그 이상의 바늘을 포함할 수 있다. 이 바늘은 일정한 또는 일정하지 않은 공간 배열을 가질 수 있다. 이 바늘은 0.005 인치 내지 0.03 인치, 0.01 인치 내지 0.025 인치; 또는 0.015 인치 내지 0.020 인치 범위일 수 있다. 이 바늘은 직경이 0.0175 인치일 수 있다. 바늘들은 서로 0.5 mm, 1.0 mm, 1.5 mm, 2.0 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm, 4.0 mm, 또는 그 이상의 공간으로 떨어져 있을 수 있다.

MID는 백신과 전기 천공 펄스를 단일 단계에서 전달하는 펄스 발생기와 2개 또는 그 이상-바늘 백신 주사기로 구성될 수 있다. 상기 펄스 발생기는 개인 컴퓨터의 플래쉬 카드 뿐만 아니라, 전기천공 및 환자 데이터의 방대한 기록 및 저장을 위하여 펄스 및 주사 매개변수의 유연한 프로그래밍을 허용할 수 있다. 펄스 발생기는 단시간에 다양한 볼트 펄스를 운반할 수 있다. 예를 들면, 펄스 발생기는 지속기간 동안 100 ms의 15볼트 펄스 3개를 운반할 수 있다. 이러한 MID의 예가 Inovio Biomedical Corporation의 Elgen 1000 시스템이며, 이는 U.S. 특허 번호 7,328,064에서 설명되며, 문헌의 내용의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.

상기 MID는 CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell PA) 장치 및 시스템일 수 있고, 이는 모듈식 전극 시스템으로, 신체 또는 식물의 선택된 조직 세포 안으로 거대 분자 이를 테면, DNA를 도입시킨다. 상기 모듈식 전극 시스템은 다수의 바늘 전극; 피하 바늘; 프로그램된 정전류 펄스 콘트럴러로부터 전도성 링크를 다수의 바늘에 제공하는 전기 연결기; 그리고 전력원을 포함할 수 있다. 작업자는 지지 구조 상에 탑재된 다수의 바늘 전극을 움켜쥐고, 신체 또는 식물의 선택된 조직 세포 안으로 이를 단단하게 삽입시킬 수 있다. 그 다음 거대분자는 피하 바늘을 통하여 선택된 조직 안으로 전달된다. 프로그램된 정전류 펄스 콘트럴러가 작동되며, 정전류 전기 펄스는 다수의 바늘 전극에 제공된다. 제공된 정전류 전기적 펄스는 다수의 전극 사이에 있는 세포 안으로 거대분자의 도입을 실행한다. 정전류 펄스에 의해 조직에서 전력 소산을 제한시킴으로써, 세포의 과열로 인한 세포 사멸을 최소화시킨다. Cellectra 장치 및 시스템은 U.S. 특허 번호 7,245,963에서 설명되며, 문헌의 내용의 전문이 본 명세서의 참고자료에 편입된다.

상기 MID는 Elgen 1000 시스템 (Inovio Pharmaceuticals)일 수 있다. Elgen 1000 시스템은 속이 빈 바늘; 그리고 유체 운반 수단을 제공하는 장치를 포함할 수 있고, 이때 상기 장치는 신체 조직 안으로 바늘을 찌르는 동안 유체, 본 명세서에서 설명된 백신을 동시에 주사(예를 들면, 자동)하기 위하여 유체 운반 수단을 작동시키도록 조정된다. 장점은 바늘이 삽입되어 있는 동안 유체를 점진적으로 주사하는 능력은 신체 조직을 통하여 상기 유체의 더욱 고른 분포를 유도하는 능력이다. 주사되는 유체 용적이 더 넓은 부위로 분포되기 때문에 주사 동안 겪게 되는 통증이 감소되는 것으로 또한 믿는다.

또한, 유체의 자동 주사는 주사되는 유체의 실제 투여분량의 자동 모니터링 및 기록을 실시한다. 이 데이터는 필요한 경우 기록 목적으로 통제장치에 의해 저장될 수 있다.

주사 속도는 선형 또는 비-선형일 수 있고, 주사는 치료되는 개체의 피부를 통하여 바늘이 삽입된 후 그리고 신체 조직에 삽입되어 있는 동안 실시될 수 있는 것으로 인지될 것이다.

본 발명의 기구에 의해 유체가 주사되는 적합한 조직은 종양 조직, 피부 또는 간 조직을 포함하지만, 근육 조직일 수도 있다.

상기 장치는 바늘 삽입을 신체 조직으로 안내하는 바늘 삽입 수단을 더 포함한다. 유체 주사 속도는 바늘 삽입 속도에 의해 조절된다. 이것은 삽입 속도가 필요한 경우 주사 속도와 일치될 수 있도록 바늘 삽입 및 유체 주사가 조절될 수 있는 장점을 가진다. 이는 사용자가 이 장치의 작동을 더 용이하게 만든다. 원하는 경우, 신체 조직 안으로 바늘을 자동 삽입시키는 수단이 제공될 수 있다.

사용자는 유체 주사를 언제 시작할 지 선택할 수 있다. 그러나, 이상적으로, 주사는 바늘 끝이 근육 조직에 닿을 때 시작되며, 상기 장치는 바늘이 유체 주입이 시작될 수 있는 충분한 깊이에 도달되었을 때를 감지하는 수단을 포함할 수 있다. 이는 상기 바늘이 바람직한 깊이에 도달(통상적으로 근육 조직이 시작되는 깊이가 될 것이다)될 때 유체 주사가 자동적으로 개시될 수 있다는 것을 의미한다. 근육 조직이 시작되는 깊이는 예를 들면, 사전 설정된 바늘 삽입 깊이, 이를 테면 피부 층을 통하여 바늘이 들어가는 충분한 것으로 간주되는 4 mm가 될 수 있다.

상기 감지 수단(sensing means)은 초음파 프로브(ultrasound probe)를 포함할 수 있다. 상기 감지 수단은 임피던스(impedance) 또는 저항성의 변화를 감지하는 수단을 포함할 수 있다. 이 경우에서, 상기 수단은 신체 조직에서 바늘 깊이를 기록하지는 못하더라도 바늘이 상이한 유형의 조직으로부터 근육으로 이동될 때, 임피던스 또는 저항성의 변화를 감지하도록 적용될 수 있다. 주사가 시작되어야 하는 것을 감지하는 수단을 작동시키기 위하여, 이들 변화는 상대적으로 정확하고 간단하다. 바늘의 삽입 깊이는 필요한 경우 추가 기록될 수 있고, 이것은 바늘 삽입 깊이가 기록될 때 주사되는 유체의 용적이 결정되도록, 유체 주사를 조절하는데 이용될 수 있다.

상기 장치는 다음을 추가 포함할 수 있다: 바늘을 지지하는 베이스; 그리고 베이스를 수용하는 용기(housing), 이때 상기 베이스는 하우징에 대하여 이동가능하여, 베이스가 하우징에 대해 제 1 후방 위치에 있을 때 바늘이 하우징 안으로 들어가고, 베이스가 하우징 안에서 제 2 전방 위치에 있을 때, 바늘이 하우징 밖으로 나오게 된다. 이것은 하우징을 환자의 피부 상에 정렬시키고, 그 다음 베이스에 대하여 하우징을 움직임으로써 환자의 피부 안으로 바늘이 삽입될 수 있도록 하는 장점이 있다.

상기에서 언급된 바와 같이, 바늘이 피부 안에 삽입될 때 바늘의 길이를 따라 유체가 고르게 분포되도록 유체 주사 속도를 조절하는 것이 바람직하다. 상기 유체 운반 수단은 조절된 속도로 유체를 주사하도록 적용된 피스톤 구동 수단을 포함할 수 있다. 상기 피스톤 구동 수단은 예를 들면 서보(servo) 모터에 의해 작동될 수 있다. 그러나, 상기 피스톤 구동 수단은 하우징에 대하여 축 방향으로 베이스를 이동시켜 작동될 수 있다. 유체 운반을 위한 대체 수단이 제공될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 예를 들면, 조절된 또는 비-조절된 속도로 유체 운반을 위하여 압축될 수 있는 닫힌 용기가 주사기 및 피스톤 시스템을 대신하여 제공될 수 있다.

상기에서 설명된 기구는 임의의 유형의 주사에 이용될 수 있다. 그러나, 전기천공 분야에서 특히 유용할 것으로 예상되며, 따라서 바늘에 전압을 제공하는 수단을 더 포함할 수 있다. 바늘이 주사 뿐만 아니라, 전기천공 동안 전극으로도 이용될 수 있도록 한다. 전기장이 유체가 주사되는 동일한 지역에 제공된다는 의미로써 특히 유익하다. 이미 주사된 유체를 가진 전극을 정확하게 배치하는 것이 매우 어렵고, 따라서 사용자는 주사된 물질과 전기장 사이에 겹침을 보증하기 위한 시도로써, 더 넓은 지역을 통하여 요구되는 것보다 더 많은 양의 유체를 주사하는 경향이 있어, 전기 천공에서 전통적으로 문제점들이 있었다. 본 발명을 이용하여, 전기장과 유체 간에 조화를 잘 이루면서, 주사된 유체의 용적과 적용되는 전기장의 크기가 감소될 수 있다.

본 발명은 다음의 비-제한적인 실시예에 의해 설명되는 다수의 측면들을 보유한다.

4. 실시예

실시예 1-재료 및 방법

National Institutes of Health (Bethesda, MD, USA) 및 University of Pennsylvania (Philadelphia, PA, USA) Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC #801577)의 지침에 따라 온도-조절된, 빛-순환 시설에서 마우스들은 수용 및 취급되었다.

350 내지 450 g의 체중을 가진, 그리고 병발(intercurrent) 감염이 없는 암컷 Dunkin-Hartley 기니피그는 Charles River (Wilmington, MA)에서 구하였으며, Inovio Pharmaceuticals Inc., PA와의 협업을 통하여 Bio-Quant, Inc., (San Diego, CA)에서 수용하였다. 프로토콜은 Bio-Quant, Inc에서 동물 실험 윤리(Ethics of Animal Experiments)에 관하여 위원회의 승인을 받았다. Inovio Pharmaceuticals Inc., (허용 번호: 08-021)의 동물 자원 부서와 협업. 모든 위치에서, National Institutes of Health의 실험실 동물 관리 및 사용(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 관한 지침에서 권고를 바탕으로 하여 모든 동물들을 취급하였다. Weatherall 보고서에 따라, 동물의 복지는 보장받았으며, 단계들은 제거되거나 또는 최소화되었다.

세포 및 시약들: HeLa, 293T 및 Jurkat (ATCC, Manassas, VA) 그리고 HeLa-CD4-TZM-bl (NIH-AIDS Reagent Program, MD) 세포는 10% 태아 송아지 혈청(FBS) 및 항생제가 보충된 Dulbecco 변형된 Eagle 배지(DMEM; Gibco-Invitrogens)에서 유지되었고; 합류시 계대되었다. 재조합 HIV-1 외피 gp120 단백질들은 Protein Sciences Corporation, Meriden, CT에서 구입하였고, 페록시다제-접합된 스트렙타빈은 Jackson Laboratory에서 구입하였다. HIV-1 외피 다중클론 항체 및 기타 바이러스 시약들은 AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH (Germantown, MD)를 통하여 구하였다.

구축, 발현 및 면역화: 상기 HIV-1 외피 콘센수스 서열들은 이미 설명되었다. 간략하게 설명하자면, 아형 클레이드 A, B, C 및 D의 HIV-1 외피의 콘센수스 서열들은 논의된 바와 같이 변형을 가지고, 구축되었다. 발현을 개선시키기 위하여 IgE 리더 서열이 모든 외피 항원 서열에 추가되었고, 세포질 꼬리는 외피 재순환을 방지하기 위하여 절두되었다. 생성된 최적화된 HIV-Env DNA 면역원은 코돈 및 RNA 최적화된 것이며, GCAT 함량에 대하여 균형을 맞추었고, 합성되었고, 그리고 변형된 pVax1 발현 벡터 안으로 클론되었다. DNA 구조체의 생산은 Aldevron (Fargo, ND)에 의해 실행되었으며, 그리고 정제된 플라스미드 DNA는 설명된 바와 같이 면역화를 위하여 물에서 제형화되었다.

발현을 테스트하기 위하여, 제조업자가 제시하는 바와 같이 비-리포좀성 FuGENE 형질감염 시약 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)을 이용하여 합성 외피의 발현 분석을 위하여 세포는 형질감염되었다. 간략하게 설명하자면, 세포는 하루 전 70% 합류(6-웰 플레이트에서 웰당 50,000개 세포)로 접종되었고, 5μg의 HIV-1 외피 플라스미드로 형질감염되었다. 세포는 형질감염 후 48 내지 72 hrs 동안 1× RIPA 완충액 (50 mM Tris/HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% 쇼듐 데옥시콜레이트, 그리고 0.1% SDS, 그리고 Roche Applied Science, Indianapolis, IN의 완전 프로테아제 억제제 칵테일 보충됨)에서 수거되었고, SDS 시료 완충액 (0.08M Tris (pH 6.8); 2.0% SDS, 10% 글리세롤, 0.1M 디티오트레톨, 0.2% 브로모페놀 블루)과 혼합한 후, 5분 동안 가열하였다.

면역블랏에 의한 외피 발현 연구를 위하여, 특이적 혈청 또는 Abs는 PBS에서 1:100으로 희석되고, 그리고 개별 스트립(strips)과 함께 1h 동안 반응되었다. 후속적으로, 스트립은 Tris-완충된 염수- 0.2% Tween로 4회 세척되었고, 마우스 IgG (Sigma, St Louis, MO)에 대항한 페옥시다제-결합된 항혈청과 반응되었고, 그리고 디아미노벤지딘 기질 (Sigma, St. Louis, MO)과 함께 항온처리되었다. 최적화된 외피 발현의 면역형광 분석을 위하여, RD 세포는 백신 구조체로 형질감염되었고, 그리고 HIV-1 외피 (4E10; NIH-AIDS Reagent Program, MD) 및 MHC-I에 대항하는 단일클론 항체로 착색시킨 후, 동일촛점 분석을 하였다. 모든 영상은 PBS 안에서 관찰된 Zeiss 710 LSM Meta 현미경 시스템으로 촬영한 것이다.

마우스 및 기니피그 Pip 면역화: 연구 1은 BALB/c 마우스에서 도 2a에 나타낸 것과 같이, DNA 또는 단백질 면역원만을 제공받거나, 또는 프라임-부스트 복합을 제공받았던 동물 4개 집단(한 집단에 4마리 동물/3회 반복)을 이용하여 실행되었다. 연구 2, 기니피그 연구 (한 집단에 5마리 동물/2회 반복)의 경우, 도 6a에서 나타낸 것과 같이, HIV-1 Env 플라스미드가 면역화되었다. 프라임-부스터 및 재조합 집단에서 동물들은 TiterMax 어쥬번트 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)와 함께 제형화된 HIV-1 클레이드 B 단백질 (50μg)을 8주차와 11주차에 제공받았다. 허위(sham) 면역화 집단은 pVax1 빈(empty) 벡터와 TiterMax와 함께 제형화된 허위 단백질 (PBS)을 제공받았다.

도 2a 및 6a에 나타낸 것과 같이 ELISA 분석을 이용하여 체액 면역 반응을 분석하기 위하여 마우스와 기니피그로부터 소량의 말초 혈액을 다양한 시점에서 수거하였다. 세포성 면역 반응의 분석을 위하여, 7주차에 마우스는 잔혹하지 않게 희생시키고, 이들의 비장은 ELISpot 및 유동 세포측정 면역을 위한 림프구의 원료로 사용되었다. 이미 설명된 바와 같이, 생체내 Cellectra® -적응 EP에 의해 면역접종은 사두근으로 운반되었다. National Institutes of Health (Bethesda, MD, USA) 및 University of Pennsylvania (Philadelphia, PA, USA) Institutional Animal Care and Use Committee 의 지침에 따라 모든 과정이 실행되었다.

T-세포 Elispot 분석: IFN-γ ELISpot을 통하여 항원-특이적 T-세포 반응을 결정하였다. 간략하게 설명하자면, ELISpot 96-웰 플레이트 (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA)는 항-마우스 IFN-γ 포획 Abs로 피복시키고, 24h 동안 4℃에서 항온처리되었다 (R&D Systems, Minneapolis, MN). 다음 날, 플레이트는 세척되고, 2h 동안 1% BSA로 차단되었다. 면역화된 마우스의 비장세포를 각 웰에 넣고, 37 ℃, 5% CO2에서, RPMI 1640 (음성 대조), 콘카나발린 A (양성 대조), 또는 특이적 펩티드 푸울 (10μg/ml) 존재하에서, 하룻밤 동안 자극되었다. 펩티드 푸울은 11개의 아미노산이 중첩되는 15-mer 펩티드로 구성된다. 자극 24h 후, 이들 세포는 세척되고, 바이오티닐화된 항-마우스 IFN-γ Abs (R&D Systems, Minneapolis, MN)와 함께 24 h 동안 4℃에서 항온처리되었다. 상기 플레이트는 세척되었고, 스트렙타아비딘-알칼리 포스파타제 (R&D Systems, Minneapolis, MN)가 각 웰에 추가되고, 실온에서 2h 동안 항온처리되었다. 그 다음 상기 플레이트는 세척되었고, 5-브로모-4-클로로-3'-인돌일포스페이트 p-톨루이딘 염과 니트로 블루 테트라졸리움 클로라이드(색소원 발색 시약; R&D Systems, Minneapolis, MN)가 각 웰에 추가되었다. 그 다음 플레이트는 증류수로 세척되었고, 실온에서 건조되었다. 자동화된 ELISpot 판독기 (CTL Limited, Shaker Heights, OH)에 의해 스팟이 카운트되었다.

B-세포 Elispot 분석: 항체-분비 B 세포 (ASCs)를 테스트할 때, ELISpot 분석에 의한 탐지에 앞서, 비장 세포는 자극되지 않았고, 대신 비장으로부터 단리된 후 바로 테스트되었다. MultiScreen-IP 플레이트 (Millipore, Billerica, MA)는 PBS에서 친화력-정제된 염소 항-마우스 IgG (KPL, Gaithersburg, MD)로 피복되었다. 플레이트는 PBS로 6회 세척되었고, 실온에서 2시간 동안 10% FCS와 함께, RPMI로 차단되었다. 비장세포(10⁵)는 최소한 100μl의 배지의 ELISpot 플레이트의 각 웰 안에 추가되었고, 하룻밤 동안 37℃에서 항온처리되었다. 플레이트는 0.25% Tween 20 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (PBS-T)와 함께, PBS 안에서 6회 세척되었고, 100μl의 1:5,000 바이오틴-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)으로 1 h 동안 실온에서 항온처리되었다. 그 다음 플레이트는 세척되었고, 100μl의 1:60 스트렙타아비딘-AP (R&D Research Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 1h 동안 실온에서 항온처리되었다. 상기 플레이트는 PBS-T, PBS, 및 증류수로 세척되었고, 100μl의 BCIP/NBT (R&D Research Systems, Minneapolis, MN)로 실온에서 20 분 동안 발달되었고, 상기 반응은 증류수에 의해 중단되었다. 자동화된 ELISpot 판독기 (CTL Limited, Shaker Heights, OH)에 의해 스팟이 카운트되었다. 미가공(raw) 값이 결정되었고, 적절한 인자를 곱하여, 이 데이타는 백만 비장 세포당 ASCs로 나타낼 수 있다.

세포내 사이토킨 착색: 반응하는 T 세포의 표현형은 설명된 바와 같이, ICS 형광 활성화된 세포 소팅 (FACS) 분석에 의해 분석되었다. 비장세포 (5×10⁶)는 15-mer HIV-1 MN Env 펩티드 푸울 (2 μg/ml의 각 펩티드; NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, MD)로 자극되었다. 골지 플러그(Golgi plug) (BD Biosciences, San Jose, CA)가 최종 4h 항온처리 동안 추가되었다. 그 다음 세포는 항-마우스 CD16/32 (Fc 블록) 항체로 착색되었고, 이어서 표면 착색되었다. 세포는 CD3-FITC, CD4-Alexa 700, CD8-PerCP (BD Biosciences, San Jose, CA)으로 표면 착색되었다. 그 다음 세포는 고정되고, 사이토픽스 사이토펌(cytofix cytoperm) (BD Biosciences, San Jose, CA)으로 침투되었고, 항- IFN-γ -PE 및 항-IL2-FITC로 착색되었다. BD LSRII 유동 세포측정 (BD Biosciences, San Jose, CA)에서 시료당 백만개 세포가 획득되었고, CD4⁺ 및 CD8⁺ 이벤트 (CD3⁺ 세포에서 이미 게이트화되었으며(gated))는 IFN- γ 및 IL-2에 대하여 게이트화되었다. 시료 분석는 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR)를 이용하여 실행되었다.

항체 결합 분석: Elisa: 항체 탐지를 위하여, 마우스 혈청 시료는 최종 면역화 후 7일차에 수집되었다. 표준 ELISAs는 이미 설명된 바와 같이 준비된, 항원 원천으로써 재조합 GP120을 이용하여 실행되었다. 항체 결합 분석은 개별 동물 또는 HIV의 상이한 클레이드로부터 DNA 또는 DNA+gp120로 면역화된 각 집단의 마우스 또는 기니피그로부터 푸울된 혈청으로 실행되었다. 간략하게 설명하자면, 고-결합 폴리스티렌 Corning® 96 웰 플레이트 (Sigma, St Louis, MO)는 50 mM 탄산염 완충액 (pH 9.6)으로 희석되었고, 하룻밤 동안 4℃에서 보관된, 재조합 외피 단백질 (MN 클레이드 B) (2μg/ml) (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT)로 하룻밤 동안 4℃에서 피복되었다.

다음 날, 플레이트는 PBS-T (PBS, 0.05% Tween 20)로 세척되었고, PBS-T에서 3% BSA와 함께 1h 동안 차단되었다. 결합된 IgG는 1:5,000의 희석에서 염소 항-마우스 IgG-HRP (Sigma, St Louis, MO)를 이용하여 탐지되었다. 결합된 효소는 색소원 기질 용액 TMB (R&D Systems, Minneapolis, MN)의 추가에 의해 탐지되었다. 효소 반응은 1N H₂SO₄로 중단되었고, 플레이트는 Biotek EL312e Bio-Kinetics 판독기 (BioTek, Winooski, VT) 상에서 450-nm에서 판독되었다. 모든 시료는 3중 분석되었다. 최종 면역화 후 항체의 역가를 결정하기 위하여, 한 집단 안의 마우스 혈청을 모으고, 연속적으로 희석시키고, 상기에서 설명된 바와 같이, ELISA에 의해 분석되었다. 모든 시료는 3중 분석되었다. 종점 역가는 최대 희석으로 산출되었고, 음성 대조 혈청 값보다 높은 2개 OD를 판독하게 된다.

HIV-1 단일 라운드 슈도바이러스 생산: 상기 HIV-1 프로바이러스 감염성 DNA 구조체 pNL4-3/ΔEnv, 및 주요 클레이드 특이적 외피 분리체는 AIDS Research and Reference Reagent (RRR)-Program, National Institute of Health (NIH)를 통하여 획득하였다. 슈도바이러스는 HIV 기본골격을 인코드하는 pNL4-3/ΔEnv DNA 플라스미드와 다수의 주요 바이러스 및 실험실 바이러스를 인코드하는 플라스미드를 이용하여 생산되었는데, 클레이드 A (SF162 LS; NL4-3 및 92RW020) 클레이드 B (MN/H9; Bal.26; 6535.3 및 HXB2); 클레이드 C (MW965.26); 그리고 클레이드 A/G (DJ263) 외피 변이체를 포함한다. HIV-1 모의바이러스 입자들은 293T 세포에서 pNL4-3/ΔEnv 만으로 형질감염에 의해 생성되거나, 또는 FuGENE 6 형질감염에 의한 외피 플라스미드 패널과 함께 공동-형질감염되어, 생성되었다. 형질감염 후 2-3일 후, 비리온-함유 배양 상청액이 수거되었고, 1,200 rpm에서 7 분간 원심분리에 의해 사전제거되었고(precleared), 그리고 0.45-μm 포어-크기 막을 통하여 여과되었다. 맑아진 배양 상청액은 그 다음 DNase I (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), 최종 농도 20μg/ml로 37℃에서 1 h 동안 처리되었고, 필요할 때까지 300-μl 분획이 -80℃에 보관되었다. 바이러스 스톡(stocks)의 p24 농축물은 설명된 바와 같이, HIV-1 p24 항원 ELISA에 의해 정량화되었다. 슈도유형(pseudotyped)의 바이러스 역가는 TZM-BI 세포에서 50% 조직 배양 감염성 투여 분량 (TC-ID₅₀) 분석을 이용하여 결정되었다.

HIV-1 중화 분석: 중화 역가는 이미 설명된 바와 같이[40], TZM-Bl 세포에서 단일 라운드의 바이러스 감염 후, 루시퍼라제 리포터 유전자 발현에서 기능 감소로 측정되었다. TZM-Bl 세포는 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program를 통하여 구하였다. 이들 세포는 CD4 및 CCR5를 발현시키고, 그리고 HIV-1 LTR의 조절하에 초파리 루시퍼라제와 대장균 β-갈락토시다제의 통합된 리포터 유전자들을 포함하도록 작제되었다.

기니피그 혈청은 분석에 앞서 56 ℃에서 1h 동안 열에 의해 비활성화되었다. 4개 집단으로부터 25μl의 혈청은 125μl의 PBS에서 희석되었다. 희석된 혈청은 96-웰 플레이트에서 3배 추가 희석되었다. 50 μl의 세포-없는 바이러스 (200 TCID₅₀)가 각 웰에 추가되었다. 1h의 항온처리 후, 10,000 TZM-Bl 세포 현탁액이 각 웰에 추가되었다. 그 다음 플레이트는 48h 동안 항온처리되고, 그 다음 20μl의 용해 완충액 (Cell Culture Lysis Reagent, Promega. Madison, WI)이 실온에서 10분 동안 각 웰에 추가되고, 이어서 100μl의 Bright-Glo 기질 및 완충액 (Luciferase Assay system, Promega, Madison, WI)이 추가되었다. 상기 플레이트는 Glomax Luminometer (Promega, Madison, WI)를 이용하여 즉시 판독되었다. RLU 감소 백분율은 (1-(시료 혈청을 가진 중복의 평균 RLU-대조 웰)/(슈도 대조 혈청의 평균 RLU-대조 웰)) × 100%로 산출되었다. 중화 항체 역가는 RLU를 50% 감소시키기 위하요 요구되는 상호 혈청 희석으로 표현되었다.

통계학적 분석: 집단 분석은 일치된, 양측 독립 t-테스트(two-tailed, unpaired t-test)에 의해 완성되었고, 모든 값은 평균 ± SEM으로 나타내었다. 통계학적 분석은 GraphPad Prism Software (La Jolla, CA)에 의해 실행되었다. 집단간의 통계학적 유의적 차이는 *P < 0.1, **P < 0.01, ***P < 0.001, 및 ****P < 0.0001으로 정의된다.

실시예 2: HIV-1 외피 콘센수스 DNA 백신의 기획

HIV-1-외피가 구축되었다. 상기 플라스미드의 구축에 있어서 발현을 촉진시키기 위하여 매우 효과적인 IgE 리더 펩티드 서열의 추가를 포함한, 몇 가지 변형이 있었다. 생성된 Env 플라스미드는 Jurkat 세포에서 FACS 분석에 의해 나타난 바와 같이, 조직 배양에서 높은 수준으로 발현되었다 (도 1a). 콘센수스 HIV-1 Env 플라스미드의 발현을 증명하기 위하여, 항-HIV-1 Env 4E10 mAbs 항체를 이용하여 형질감염된 RD 세포의 동일 촛점 현미경과 함께, 간접 면역 형광 분석(IFA)이 실행되었고, MHC-1 발현과 함께, Env의 특이적 세포 막 발현의 공동편재화(colocalization)가 관찰되었다 (도 1b). 대조 벡터 (pVax1) 형질감염된 세포에서 발현은 탐지되지 않았다.

실시예 3: 최적화된 HIV-1 외피 플라스미드에 의한 개선된 CD8 T-세포 반응

백신 면역원성은 마우스에서 실행된 다음과 같은 생체내 다음의 면역화 에 의해 평가되었다. 마우스는 적응 EP를 이용하여, 0 주차 및 2 주차에 25ug 각 Env 플라스미드 DNA를 이용하여 면역화되었다 (도 2a). 그 다음 상기 단백질 부스터를 제공받은 마우스는 4주와 6주차에 50μg의 HIV-1 MN gp120 제형화된 Titermix X-Gold 어쥬번트로 근육으로 면역주사를 받았다. 최종 면역접종 후 1주 시점에, 마우스들이 희생되었고, 비장세포가 단리되어 ELISpot 분석을 이용하여, 자극을 위한 대응하는 외피 펩티드 푸울을 이용하여 T-세포 반응이 테스트되었다. 백신접종된 동물에서 Env-특이적 IFN-γ 생산 세포의 수치 증가가 관찰되었지만, 반면 대조 (pVax1) 집단 비장세포는 Env 펩티드에 대하여 반응을 보이지 않았다 (도 2b). DNA 백신접종 단독은 재조합 단백질 단독보다 우수하였지만, 모든 경우에서 복합이 최고 반응을 유도하였다. 흥미로운 것은, 클레이드 A, C 및 D 집단, DNA 프라임은 불정합(mismatched) 클레이드 B 항원에 의해 부스트되었다. 더욱이, 복합 다중-클레이드 DNA 백신으로 면역화된 마우스는 단일-클레이드 백신을 주사맞은 마우스보다 CD8 T 세포에 의한 IFN-γ 생산이 상당히 더 많이 발생되었다. 외피 간의 임의의 항원 경쟁은 나타나지 않았다 (도 2c).

실시예 4: DNA 프라임 -단백질 부스트 면역화 후 항원 특이적 T-세포는 IFN -δ 및 IL-2를 생산한다.

HIV-1 감염의 관리에서 다중기능성 T 세포 반응이 중요하기 때문에, 외피 펩티드 풀 자극에 반응하여 IFN-γ 및 IL-2를 분비하기 위한, 면역화된 마우스로부터 다중클레이드-특이적 T 세포 집단의 능력을 측정하였다. 기능적으로 확산성(divergent) Ag-특이적 T-세포 집단은 흔히 CD4 T 세포 집단의 IL-2 분비와 CD8 T 세포 집단의 IFN-γ 분비의 의해 흔히 정의된다. 따라서, 재료 및 방법에서 설명된 바와 같이, 펩티드 자극후 IFN-γ 및 IL-2 모두의 분비를 동시 측정함으로써, Ag-특이적 CD8⁺ 및 CD4⁺ T-세포 반응을 특징화하였다. FACS- 기반의 ICS를 이용하여 다중유색성 유동 세포측정에 의해 DNA+단백질 면역화 집단에서 유도된 적응 면역 반응의 표현형을 추가 분석하였고, 전체 Env 서열을 포함하는 HIV-1 Env 펩티드 푸울에 의한 시험관내 자극 후, IFN-γ 및 IL-2 를 분석하였다. 세포내 사이토킨 유동 세포측정 분석을 위한 우리의 방법 전략은 도 3a에 설명되어 있다; 이 전력에 의해 하나 또는 그 이상의 사이토킨을 생산하는 능력에 근거하여 CD8⁺ 또는 CD4⁺ T 세포를 하위집단으로 분리시킬 수 있었다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 다중-클레이드 DNA 프라임 및 단백질 부스터는 CD8⁺/CD4⁺ T-세포에서 IFN-γ/IL-2의 분비를 더 높은 수준으로 유도하였다(도 3b & c). Env-특이적 IFN-γ⁺ -분비 CD8⁺ T세포의 백분율은 IL-2⁺ 분비 CD4⁺ T-세포의 것보다 더 높은 것으로 관찰되었는데, 이는 다중 클레이드 백신에서 관찰된 더 우세한 CD8⁺ T-세포 반응을 유도한다는 것을 암시한다. DNA 프라임-단백질 부스터 전략의 또다른 효과는 CD8⁺ /IL-2⁺및 CD4⁺/IFN-γ⁺ 집단과 비교하였을 때, CD8⁺ /IFN-γ⁺ 및 CD4⁺/IL-2⁺ T-세포 집단의 증가에 있었다. IFN-γ ELISpot에서 관찰된 결과와 일관되게, 복합 DNA 프라임-단백질 부스터는 더 강력한 Env 특이적 T-세포 반응을 만들었다. 이 결과는 EP 운반과 복합된 최적화된 DNA, 그리고 단백질 부스터의 백신 접종으로 기능을 하는 Env-특이적 CD8⁺ 및 CD4⁺ T-세포의 확장을 유도할 수 있다는 결론을 뒷받침한다.

실시예 5: ABS 유발 및 B-세포 활성화에서 다중 클레이드 제형 및 단백질 부스트 섭생의 효과

다음, 다수 Env 변이체를 이용한 면역화가 임의의 단일 구조체만을 이용한 면역화보다 더 높은 역가를 유도하였는지를 테스트하고 싶었다. HIV-1 Env에 ELISA를 결합시킴으로써 마우스 집단에서 푸울된 혈청을 이용하여 Env-특이적 IgG 생산 수준을 측정하였다. 놀랍게도, DNA 단독은 단일 재조합 단독보다 더 높은 항체 결합 역가를 유도하였다. 그러나, DNA 프라임-단백질 부스터는 DNA 또는 단백질 단독보다 더 강력한 결합 역가를 유도하였다 (도 4). 더욱 중요한 것은, 다수-클레이드 면역화는 임의의 단일 Env 변이체 만을 이용한 면역화보다 더 높은 역가를 유도하였다 (도 4b). 다수-클레이드 면역화의 역가는 단백질 부스터의 추가에 의해 더 강화되었다. 다중-클레이드 DNA 프라임과 이어서 재조합 단백질 부스터에 의해 개선된 체액 반응이 생성된다는 것이 이들 연구에서 설명된다.

항체 생산의 근원적인 기전을 더 이해하기 위하여, 백신-유도된 항체 분비 세포 (ASCs)의 빈도를 측정하기 위하여 B-세포 ELISpots이 실행되었다. 도 5a 및 도 5b에 나타낸 것과 같이, 단백질 부스터보다는 DNA 프라임이후 HIV-1-특이적 IgG 생산하는 B-세포의 수준이 더 높다는 것이 관찰되었다. EP와 복합된 DNA 백신은 B-세포 ELI스팟에 의해 Env-특이적 IgG 생산으로 측정될 때 강력한 체액 반응을 활성화시킬 수 있다는 것을 또한 이들 결과는 설명한다. B-세포 반응은 재조합 단백질 부스터의 포함으로 대략 50% 강화되었다. 이와 함께, 이들 데이터는 최적화된 DNA 만으로 강력한 체액 반응을 유도할 수 있고, 그 효과는 단백질 부스터의 추가에 의해 더 강화된다는 결론을 뒷받침한다. 더욱이, 다중-클레이드 DNA 프라임에 이어 재조합 단백질 부스터 면역화 전략에서 B-세포 ELIspot에 대한 항체 역가 사이에 영성 상관관계를 또한 관찰하였다(도 5c).

실시예 6-DNA 프라임 단백질 부스트 면역화 후 기니피그에서 항체 수준

EP와 함께 25μg DNA의 3회 면역화, 이어서 2회의 50 μg 단백질 부스터를 이용하여 기니피그에서 DNA 프라임-단백질 부스터 요법에 의해 유도된 체액 반응을 특징화하였다 (도 6a). 기니피그는 항체 반응의 추가 연구를 허용하는데, 그 이유는 TZM-Bl 세포를 이용한 중화 분석은 마우스 혈청의 경우에 필수적이었던 IgG의 단리 없이 용이하게 실행될 수 있기 때문이다. 마우스에서 볼 수 있는 것과 같이, DNA 프라임-단백질 부스터 면역화된 기니피그는 ELISA 결합에 의해 판단될 때 최고 수준의 항체 반응을 유도하였다. 우리의 마우스 연구와 유사하게 일관된 것은 다중-클레이드 DNA 만으로 재조합 단백질 단독과 비교하였을 때 결합 항체 수준이 더 우위에 있었다는 사실이다 (도 6b&c).

면역화된 기니피그에서 유도된 Env-특이적 반응을 더욱 특징화하기 위하여, DNA 프라임 및 단백질 부스터 동물로부터 혈청은 특이성을 확인하기 위한 웨스턴 블랏을 이용한 혈청전환에 대하여 테스트되었다. 단백질 용해물은 HIV-1 클레이드 Env 형질감염된 293T 세포로부터 단리되었고, 그리고 SDS-PAGE를 이용하여 해리되었다. 도 6d에서 다중 클레이드 Env-면역화된 기니피그의 혈청은 Env 단백질에 결합된 것을 보여준다. ELISA에 의한 항체 분석과 일관되게, 다중-클레이드 DNA 백신으로 면역접종된 기니피그는 상이한 클레이드의 외피 단백질과 높은 교차 활성을 나타내었고, 다중-클레이드 DNA 프라임 및 단백질 부스터 백신접종 과정은 다가(polyvalent) Env 제제를 이용하여 더욱 효과적인 HIV 백신을 개발하기 위한 기술적인 플랫포옴을 제공하였다.

실시예 7- 기니피그에서 중화 항체 반응

면역화된 기니피그의 혈청은 다중-클레이드 DNA 프라임-단백질 부스터에 의해 유도된 항체 기능성을 정의하기 위한 NAbs 활성 수준 및 특이성에 대하여 분석되었다. 중화 연구에서 마우스의 경우 혈청 IgG 단리가 요구되는데, 기니피그 혈청은 이런 단리가 필요없기 때문에 이용되었다. TZM-bl 세포 분석 시스템을 이용하여 혈청이 바이러스 감염의 50%를 중화시키는지를 평가함으로써 혈청 중화 역가가 결정되었다. 혈청은 특이성을 테스트하기 위하여 3중(1:50 희석)으로 테스트되었다.

Env 클레이드 A, B, C 및 D 복합 프라임으로 면역화 및 단백질 부스터는 Nab 평가를 위하여 기준 Env 슈도바이러스의 표준화된 티어(tier) 1a 및 1b를 이용하여 NAbs를 생성할 수 있다는 것을 관찰하였다 (도 7). 테스트된 상이한 클레이드로부터 9개 바이러스중, 6개 바이러스는 다중-클레이드 DNA 백신접종 및 단백질 부스터 집단의 푸울된 혈청으로 중화되었다. 대조적으로, 재조합 단백질 만으로 백신접종하면, 매우 제한된 중화 폭을 나타내었고: 이 집단의 혈청은 테스트된 9개 바이러스중 오직 소수의 바이러스에 대한 탐지가능한 중화 역가를 나타내었다. 재조합 단백질 백신접종은 또한 제한된 교차-클레이드 폭(breadth)을 나타내었다.

결합 약가 분석의 결과와 유사하게, DNA 프라임-단백질 부스터 백신접종 프로토콜에 의해 Nabs 생산 크기가 강화되었다. 재조합 단백질 부스터의 추가는 많은 바이러스의 경우 DNA 단독에 의해 생성된 역가를 절반 강화시켰다. 다중-클레이드 DNA 프라임은 더 낮은 역가로 개선된 중화 폭을 생성시킬 수 있고, 이 반응의 크기는 폭의 감소없이 재조합 단백질 부스터의 추가에 의해 강화된다는 것을 이들 데이터는 제안한다. 전반적으로, DNA 프라임-단백질 부스터 요법은 모든 항체 분석에서 우수한 결과를 낳았다.

실시예 8: 논의

과거 DNA 백신접종의 주요 제약은 생체내에서 이들의 상대적으로 약한 면역원성이었다. 생체내 EP를 이용한 최근 DNA 연구에서, 차세대 DNA 백신은 더욱 강력한 면역성이 있고, 인간의 세포 반응에서 이러한 결과가 관찰되었다고 제시하였다. HIV 제1 세대 DNA 백신을 이용하여 연구한 우리 실험실 및 다른 실험실의 기준 연구에서 최근의 DNA 기술을 통하여 작은 동물에서 Env에 약한 결합 항체가 유도될 수 있다는 것을 보여주었다. 항체 반응은 단량체 gp120 단백질을 이용한 부스팅에 의해 강화되었지만, NAbs는 저역가였으며, 교차 반응성도 거의 없었다. 면역 시스템을 더 강력한 체액 반응으로 지향될 수 있도록 우리의 백신 플렛포옴에 변화를 도입시킴으로써, 이들 결과에 개선책을 추구하였다. 이들 변화에는 세포 표면 상에 항원 발현을 유도할 수 있는 가능성이 있는 강화된 콘센수스 DNA 백신, 적응 전기천공을 통한 형질감염 효과 및 항원 제시에서 개선, 그리고 B-세포 확장을 더 자극하기 위하여 재조합 단백질 부스터의 추가가 포함되었다.

1990년대 초반에 만들어진 제 1 DNA 백신은 인간이 아닌 영장류와 인간에서 상당 수준의 세포 중개된 면역성(CMI)을 유도하지 못하였다. DNA 구조체 기획 및 운반 방법에서 최근 발전을 통하여, 이 방법은 현재 이들 종에서 강력한 CD8+ T-세포 반응을 만들 수 있고, 가장 중요한 것으로 HPV 및 HIV 에 대한 두 가지 인간의 임상 시험에는 적응 EP에 의해 운반된 합성 콘센수스 최적화된 DNA에 의한 강력한 T 세포 반응이 포함되었다. 여기에서 제공되는 프라임 부스터 연구에 이들 고무적인 데이터를 지속한다. 합성 콘센수스 외피 면역원이 인코딩된 DNA 플라스미드를 이용한 백신 접종이 단백질 단독보다 우수한 T-세포 반응을 유도한다는 것을 반복한다. 복합된 DNA 프라임-단백질 부스터 전략으로 대부분 강력한 반응이 획득되었고, 특히 CD4 반응이 강화되었음을 또한 설명한다. 다중-클레이드 DNA 프라임의 효과를 연구할 때, 클레이드 A, B, C 및 D의 복합은 ELISpot 및 유동 세포측정 분석에 의해 측정되었을 때, T-세포 반응을 개선시켰다는 것을 알았다. 이러한 현상은 단일-클레이드 집단의 경우 25μg와 비교하여, 다중-클레이드에 투여된 DNA의 총량은 100μg (각 클레이드 25μg 씩 )이었기 때문에, 투여분량 효과의 결과이었다는 가능성을 생각하였다. 이 변수를 조절하기 위하여 하나의 단일-클레이드 백신에 대한 투여 분량이 마우스에게 제공된 투여분량 연구가 실행되었다. 투여분량이 >25μg DNA인 경우 면역반응은 상당히 개선되지 않았고, 따라서, 투여분량 만으로 관찰된 개선을 설명할 수 없었다(결과 나타내지 않음). 이러한 현상을 더 잘 설명하는 것은 백신에 의해 제시되는 독특한 에피토프의 수가 더 많기 때문에 다중-클레이드 백신으로부터 더 많은 수의 T-세포가 활성화된다는 것이다. 흥미로운 것은, 다중-클레이드 DNA 프라임-단백질 부스터는 더 많은 기능을 하는 확산 T-세포 반응을 구동하는 것으로 보였다. 단백질 및 DNA 만의 백신접종은 대체로 유사한 수의 IFN-γ+/CD8+, 및 IFN-γ+/CD4+ T-세포, 뿐만 아니라 유사한 수의 IL-2+/CD4+ 및 IL-2+/CD8+ T- 세포를 생산하였다. 대조적으로, 다중-클레이드 DNA 프라임-단백질 부스터는 IFN-γ+-분비 CD4+ T-세포보다 4배 더 많은 IFN-γ+-분비 CD8+ T-세포를 초래하였고, 더 높은 IL-2+ -분비 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 초래하였다. 강화된 DNA 프라임-단백질 부스터 플랫포옴으로부터 생성된 표현형 T-세포 차이와 정확한 기전을 밝히기 위한 추가 연구가 요구될 것이다.

T-세포 반응의 유도에 추가로, 콘센수스 외피 백신접종은 또한 강력한 체액 반응을 유도하였다. 다중-클레이드 DNA 백신은 재조합 단백질 백신 단독의 경우보다 더 높은 항체 역가를 유도한 것으로 관찰되었다. 이러한 결과는 재조합 단백질이 항체-기반 백신의 경우 전통적으로 최적의 표준이라는 사실을 고려하면 놀라운 것이다. 이들 결과는 이 연구에 이용된 재조합 단백질을 이용한 면역화로 인한 것일 수 있다. 상이한 단백질과 어쥬번트 시스템은 우리 DNA 백신에서 관찰된 연구와 더 일관된 높은 역가를 초래할 수도 있다. rgp120 단독의 단일 면역화에 의해 획득된 낮은 항체 활성에도 불구하고, 이는 단일 또는 다중-클레이드 DNA 프라임 이후 결합 역가를 강화시키는 효과적인 부스팅 물질로 작용하였다. 단일-클레이트와 다중-클레이드 DNA 프라임 사이에서, 다중-클레이드 제제에 의해 더 큰 항체 수준이 획득되었다. T-세포 반응과 유사하게, 이는 더 많은 독특한 에피토프의 수에 의해 더 큰 자극의 결과일 것이다.

미래 HIV 백신접종의 또다른 중요한 특징은 체액 반응의 폭이다. 클레이드 A 또는 클레이드 C- DNA 면역원을 이용한 백신접종은 클레이드 B DNA 백신에 의해 생성된 것과 대등한 클레이드 B gp120의 결합 역가를 만들었다. 우리는 우리의 다른 합성 콘센수스 백신중 일부를 이용한 광범위한 교차-반응성 반응을 유사하게 관찰하였다. 이들 광범위한 반응은 가장 공통적인 아미노산 서열들만 발현되고, 보존된 에피토프가 제시되도록 기획된 콘센수스 기획 때문일 것이다. 상기 DNA 플랫포옴 자체 또한 관찰된 폭에 기여할 수 있는데, 최종 gp140 단백질 생성물은 자연적인 글리코실화 패턴과 기능적으로 관련된 삼량체 형태로 발현될 가능성이 더 있기 때문이다. 숙주 세포에서 생산된 콘센수스 gp140의 생물학적 성질을 현재 조사중이며, 최종 단백질 생성물의 올리고머 상태와 국소화에 특히 집중하여 조사중이다.

마우스에서 항체 생산의 경우에 관찰된 데이터와 유사하게, 기니피그에 투여되었을 때, 콘센수스 DNA 백신는 더 광역의 중화 역가를 유도하였다. 콘센수스 클레이드 A, B, C 및 D 백신은 몇 가지 주요 클레이드 바이러스에 대항한 역가를 유도하였다. 대조적으로, 클레이드 B 재조합 단백질은 오직 클레이드 B 중화 항체만을 유도하였다 단독으로 투여되었을 때 오직 클레이드 B NAbs만을 유도함에도 불구하고, DNA 프라임후 전달된 재조합 단백질은 클레이드 A, B, C 및 D NAbs 역가의 유도를 상당히 개선시킬 수 있었다.

우리 데이터는 EP에 의해 전달된 강화된 DNA 백신은 광범위한 바이러스 균주에 대항하여 강력한 결합 항체 반응을 유도하는데 유용하다는 것을 뒷받침한다. DNA와 단백질 부스터의 복합은 바이러스 분리체 패널에 대한 NAbs 강화된 활성을 유도하였다. 따라서, 이들 데이터는 강화된 적응 EP 운반된 DNA 프라임-단백질 부스터는 폭을 개선시키는 것을 목표로 하는 다가 Env-기반 HIV 백신을 운반하는 중요한 전력이 된다는 중요한 의견을 제공한다. 다수 단백질 부스터와 복합된 다양한 HIV DNA 카세트에 의해 유도된 면역 반응의 추가 면역화 연구는 HIV 백신 개발과 관련된 중요한 정보를 제공할 것이다.

5. 조항

조항 1. 다음을 포함하는 조성물: (a) 제 1 백신, 이때 상기 제 1 백신은 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개의 핵산을 포함하며, 이때 각 핵산은 항원을 인코드하고, 그리고 이때 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개의 핵산은 HIV-1 아형 A 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 집단으로부터 선택되며, (b) 제 2 백신, 이때 제 2 백신은 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개의 항원성 펩티드를 포함하며, 이때 상기 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개의 항원성 펩티드는 HIV-1 아형 A 콘센수스 펩티드, HIV-1 아형 B 콘센수스 펩티드, HIV-1 아형 C 콘센수스 펩티드, HIV-1 아형 D 콘센수스 펩티드, 그리고 이의 임의의 조합으로부터 선택된다.

조항 2. 조항 1에 있어서, 이때 제 1 백신의 최소한 두개의 핵산은 (a) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제1 핵산, 그리고 (b) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제 2 핵산을 포함하는, 조성물.

조항 3. 조항 1에 있어서, 이때 제 1 백신의 최소한 3개의 핵산은 (a) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제1 핵산, (b) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제 2 핵산; 그리고 (c) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제3 핵산을 포함하는, 조성물.

조항 4. 조항 1에 있어서, 이때 제 1 백신의 최소한 3개의 핵산은 (a) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제1 핵산; (b) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제2핵산; (c) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제3핵산; 그리고 (d) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제4핵산을 포함하는, 조성물.

조항 5. 조항 1에 있어서, 이때 제 1 백신의 항원은 Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag, gp120 및 gp140로 구성된 집단에서 선택되는, 조성물.

조항 6. 조항 1에 있어서, 이때 제 2 백신의 항원은 Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag, gp120 및 gp140로 구성된 집단에서 선택되는, 조성물.

조항 7. 조항 1에 있어서, 이때 제 1 백신의 항원성 펩티드는 gp140인, 조성물.

조항 8. 조항 1에 있어서, 이때 제 2 백신의 항원성 펩티드는 gp120인, 조성물.

조항 9. 조항 1에 있어서, 이때 제 1 백신은 프라이밍 백신인, 조성물.

조항 10. 조항 1에 있어서, 이때 제 2 백신은 부스팅 백신인, 조성물.

조항 11. HIV-1에 대항하여 개체를 면역화시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 조항 1의 조성물을 상기 개체에 투여하는 것을 포함하며, 이때 제 1 백신은 제 2 백신과 독립적으로 투여되는, 방법.

조항 12. 조항 11에 있어서, 이때 제 1 백신이 제1 시점에 투여되고, 이때 제 1 시점은 백신접종 요법 첫날인, 방법.

조항 13. 조항 12에 있어서, 제 1 백신은 제2 시점에 투여되며, 이때 제 2 시점은 제 1 백신 투여 제1시점에서 12 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간이내인, 방법.

조항 14. 조항 13에 있어서, 이때 제 1 백신은 프라이밍 백신인, 방법.

조항 15. 조항 11에 있어서, 이때 제 2 백신은 제 1 백신 투여후 약 48 시간 내지 약 15 주, 약 48 시간 내지 약 10 주, 약 48 시간 내지 약 5 주, 또는 약 48 시간 내지 약 1 주일에 투여되는, 방법.

조항 16. 조항 11에 있어서, 이때 제 2 백신은 제 1 백신 투여 후 최소한 약 48 시간, 최소한 약 90 시간, 최소한 약 2 주, 최소한 약 5 주, 또는 최소한 약 10 주후에 투여되는 방법.

조항 17. 조항 11에 있어서, 이때 제 2 백신는 제 2 시점에 투여되며, 이때 제 2 시점은 제2 백신의 제 1 투여 후 약 48 시간 내지 약 15 주, 약 48 시간 내지 약 10 주, 약 48 시간 내지 약 5 주, 또는 약 48 시간 내지 약 1 주가 되는, 방법.

조항 18. 조항 11에 있어서, 이때 제 2 백신은 제 2 시점에 투여되며, 이때 제 2 시점은 제2 백신의 제 1 투여 후 최소한 약 48 시간, 최소한 약 90 시간, 최소한 약 2 주, 최소한 약 5 주, 또는 최소한 약 10 주가 되는, 방법.

조항 19. 조항 11에 있어서, 이때 제 1 백신은 1회, 2회, 3회, 4회, 또는 5회 투여되며, 제 1백신의 각 투여는 제1 백신의 또다른 투여와 시간을 두고 투여되는, 방법.

조항 20. 조항 9에 있어서, 이때 제 2 백신은 1회, 2회, 3회, 4회, 또는 5회 투여되며, 제 2백신의 각 투여는 제2 백신의 또다른 투여와 시간을 두고 투여되는, 방법.

Claims

다음을 포함하는 조성물:
(a) 제 1 백신, 이때 상기 제 1 백신은 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개 핵산을 포함하며, 이때 각 핵산은 항원을 인코드하고, 이때 상기 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개의 핵산은HIV-1 아형 A 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 핵산, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 집단으로부터 선택되며; 그리고
(b) 제 2 백신, 이때 제 2 백신은 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개 항원성 펩티드를 포함하고, 이때 상기 최소한 하나, 최소한 둘, 최소한 셋, 또는 최소한 네개 항원성 펩티드는 HIV-1 아형 A 콘센수스 펩티드, HIV-1 아형 B 콘센수스 펩티드, HIV-1 아형 C 콘센수스 펩티드, HIV-1 아형 D 콘센수스 펩티드, 그리고 이의 임의의 조합으로 구성된 집단에서 선택된다.
청구항 1에 있어서, 이때 제 1 백신의 최소한 두개의 핵산은
(a) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제1핵산, 그리고
(b) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제2핵산을 포함하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 이때 제 1 백신의 최소한 세개의 핵산은
(a) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제1핵산,
(b) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제2핵산; 그리고
(c) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제3핵산을 포함하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 이때 제 1 백신의 최소한 네개의 핵산은
(a) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제1핵산;
(b) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제2핵산;
(c) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제3핵산; 그리고
(d) HIV-1 아형 A 콘센수스 항원, HIV-1 아형 B 콘센수스 항원, HIV-1 아형 C 콘센수스 항원, 또는 HIV-1 아형 D 콘센수스 항원을 인코드하는 제4핵산을 포함하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 이때 제 1 백신의 항원은 Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag, gp120 및 gp140로 구성된 집단에서 선택되는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 이때 제 2 백신의 항원은 Env A, Env B, Env C, Env D, B Nef-Rev, Gag, gp120 및 gp140로 구성된 집단에서 선택되는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 이때 제 1 백신의 항원성 펩티드는 gp140인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 이때 제 2 백신의 항원성 펩티드는 gp120인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 이때 제 1 백신은 프라이밍 백신인, 조성물.
청구항 1에 있어서, 이때 제 2 백신은 부스팅 백신인, 조성물.
HIV-1에 대항하여 개체를 면역화시키는 방법에 있어서, 상기 방법은 청구항 1의 조성물을 상기 개체에 투여하는 것을 포함하며, 이때 제 1 백신은 제 2 백신과 독립적으로 투여되는, 방법.
청구항 11에 있어서, 이때 제 1 백신이 제1 시점에 투여되고, 이때 제 1 시점은 백신접종 요법 첫날인, 방법.
청구항 12에 있어서, 제 1 백신은 제2 시점에 투여되며, 이때 제 2 시점은 제 1 백신 투여 제1시점에서 12 시간, 24 시간, 36 시간, 또는 48 시간이내인, 방법.
청구항 13에 있어서, 이때 제 1 백신은 프라이밍 백신인, 방법.
청구항 11에 있어서, 이때 제 2 백신은 제 1 백신 투여후 약 48 시간 내지 약 15 주, 약 48 시간 내지 약 10 주, 약 48 시간 내지 약 5 주, 또는 약 48 시간 내지 약 1 주일에 투여되는, 방법.
청구항 11에 있어서, 이때 제 2 백신은 제 1 백신 투여 후 최소한 약 48 시간, 최소한 약 90 시간, 최소한 약 2 주, 최소한 약 5 주, 또는 최소한 약 10 주후에 투여되는 방법.
청구항 11에 있어서, 이때 제 2 백신는 제 2 시점에 투여되며, 이때 제 2 시점은 제2 백신의 제 1 투여 후 약 48 시간 내지 약 15 주, 약 48 시간 내지 약 10 주, 약 48 시간 내지 약 5 주, 또는 약 48 시간 내지 약 1 주가 되는, 방법.
청구항 11에 있어서, 이때 제 2 백신은 제 2 시점에 투여되며, 이때 제 2 시점은 제2 백신의 제 1 투여 후 최소한 약 48 시간, 최소한 약 90 시간, 최소한 약 2 주, 최소한 약 5 주, 또는 최소한 약 10 주가 되는, 방법.
청구항 11에 있어서, 이때 제 1 백신은 1회, 2회, 3회, 4회, 또는 5회 투여되며, 제 1백신의 각 투여는 제1 백신의 또다른 투여와 시간을 두고 투여되는, 방법.
청구항 9에 있어서,이때 제 2 백신은 1회, 2회, 3회, 4회, 또는 5회 투여되며, 제 2백신의 각 투여는 제2 백신의 또다른 투여와 시간을 두고 투여되는, 방법.