KR20160077214A - 헨드라 및 니파 바이러스 ｇ 당단백질 면역원성 조성물 - Google Patents

헨드라 및 니파 바이러스 ｇ 당단백질 면역원성 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 헨드라 및 니파 면역원성 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 헨드라 및/또는 니파 바이러스로 감염된 대상체로부터 본 발명의 면역원성 조성물로 예방접종된 대상체를 구별하는 방법에 관한 것이다.

Description

헨드라 및 니파 바이러스 Ｇ 당단백질 면역원성 조성물{HENDRA AND NIPAH VIRUS G GLYCOPROTEIN IMMUNOGENIC COMPOSITIONS}
본 발명은 헨드라 바이러스(Hendra virus: HeV)로부터의 G 당단백질을 포함하는 면역원성 및 백신 조성물, 및 말에서의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 예방접종 후 연장된 기간 동안 상승된 항체 역가(titer)의 유지를 촉진시키는 개선된 투여 요법(dosing regimen)에 관한 것이다.
유의적인 수의 사람 치사율을 생성하는 NiV의 재발되는 발생은 최근에 문제가 되어 왔다(참고: 예를 들면, Butler (2000) Nature 429, 7). HeV는 또한 사람 및 동물에서 치사율을 유발하는 것으로 알려져 있으며 NiV와 유전적으로 및 면역학적으로 밀접하게 관련되어 있다. 현재 니파 바이러스(Nipah virus) 또는 헨드라 바이러스에 의해 유발된 감염 또는 질환의 예방을 위해 존재하는 것으로 알려진 백신이 유일하게 1개 존재한다(WO 2009/117035). 니파 바이러스 및 헨드라 바이러스는 미국, 알레르기 및 감염성 질환의 국가 연구소내, 생물방어 사업의 분류 C 우선권 제제이다. 또한, 이들 바이러스는 동물원성 감염증의 생물학적 안전성 수준-4번 제제(BSL-4)이므로, 안전성을 지닌 백신 및/또는 진단제의 생산은 매우 비용이 많이 들고 매우 어렵다. 따라서, 백신 및/또는 진단제의 높은 처리율 생산을 허용하는 추가의 및 개선된 니파 바이러스 또는 헨드라 바이러스 백신 및 진단에 대한 요구가 존재한다.
HeV 및 NiV와 같은 파라믹소바이러스는 바이러스 입자의 엔벨로프(envelope)내에 2개의 주요 막-앵커된 당단백질(membrane-anchored glycoprotein)을 지닌다. 1개의 당단백질은 숙주 세포에서 수용체에 대한 비리온 부착에 필요하며 헤마글루티닌-뉴라미니다제 단백질(HN) 또는 헤마글루티닌 단백질(H)로 지정되어 있고, 다른 것은 헤마글루틴화 또는 뉴라미니다제 활성을 지니지 않은 당단백질(G)이다. 당단백질의 부착은 제II 유형 막 단백질이며, 여기서 분자의 아미노(N) 말단은 세포질을 향해 배향되어 있고 단백질의 카복시(C) 말단은 세포외이다. 다른 주요 당단백질은 융합(F) 당단백질이며, 이는 2개의 헵타드 반복체(heptad repeat: HR) 영역 및 소수성 융합 펩타이드를 함유하는 3량체의 제I 부류 융합생성 엔벨로프 당단백질이다. HeV 및 NiV는 이들의 부착 G 당단백질 및 F 당단백질의 협조된 작용을 통한 수용성 숙주 세포(receptive host cell)내로의 pH-독립성 막 융합 공정에 이은 수용체 결합이라고 해도 세포를 감염시킨다. HeV 및 NiV 부착 G 당단백질의 주요 기능은 숙주 세포의 표면에서 적절한 수용체가 관여하는 것이며, 이는 대부분의 잘-특성화된 파라믹소바이러스의 경우 시알산 잔사이다. HeV 및 NiV G 당단백질은 숙주 세포 단백질 수용체 에프린 B2 및/또는 에프린 B3을 이용하며 G 당단백질에 의한 바이러스 부착을 차단하는 항체가 개발되어 왔다(참고: WO 2006/137931, Bishop (2008) J. Virol. 82: 11398-11409). 또한, HeV 및 NiV 감염에 대한 면역보호성 반응을 생성하는 수단으로서 G 당단백질을 또한 사용하는 백신이 개발되어 왔다(참고: WO 2009/117035).
투여량-부위 반응성은 백신 제제에서 Quil A의 가축 및 사람 용도 둘 다를 위한 주요 관심사이다. Quil A의 이러한 독성을 피하는 한가지 방법은 면역자극 복합체의 사용이다(참고: Rajput (2007) J. Zhejiang Univ. Sci. B, 8: 153-161). 이는, 주로 복합체내 콜레스테롤과 이의 연합이 세포 막으로부터 콜레스테롤을 추출시키는 이의 능력을 감소시켜 이의 세포 분해 효과를 감소시키기 때문에, 면역자극 복합체내로 혼입되는 경우 Quil A가 반응성이 거의 없기 때문이다. 또한, 보다 적은 양의 Quil A가 유사한 수준의 항원보강제 효과를 생성하는데 필요하다. Quil A 사포닌의 면역조절 특성 및 이들이 면역자극 복합체내로 혼입되는 경우 이들 사포닌으로부터 유래될 추가의 이점이 WO 2000/041720에 설명되어 있다.
단일 백신 속에서 HeV 및/또는 NiV G 당단백질과 면역자극 복합체의 조합은, 이들 성분이 조합하여 투여되는 경우 항원보강제 부작용을 감소시키면서 향상된 면역반응성을 위한 잠재능을 제공하는 효과적인 HeV 및 NiV 백신을 개발하는데 있어서의 진전을 나타낸다.
본 발명은 대상체에게 투여한 후 헨드라 및/또는 니파 바이러스에 대해 중화 항체의 생산을 이끌어내는데 효과적인 양의 헨드라 및/또는 니파 바이러스 G 단백질, 면역자극성 복합체(ISC) 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 면역원성 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 사포닌, 인지질, 및 스테로이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질은 천연의 헨드라 G 당단백질(서열번호 2)의 73 내지 604번 아미노산으로 이루어져 있다. 일부 구현예에서, 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질은 서열번호 16의 64 내지 1662번 뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 가용성 헨드라 바이러스 G 단백질은, 2량체 형태로 존재하며, 여기서 각각의 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질 2량체 소단위는 1개 이상의 이황화물 결합에 의해 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 가용성 헨드라 바이러스 G 단백질은 4량체 형태로 존재한다. 일부 구현예에서, 4량체 형태는 비-공유결합적으로 연결되고/되거나 하나 이상의 이황화물 결합에 의해 연결된 2량체들의 2량체로서 존재한다. 가용성 헨드라 바이러스 G 단백질의 농도는 면역원성 조성물 속에서 약 5 내지 100㎍/mL일 수 있다.
일부 구현예에서, 사포닌은 퀄라자 사포나리아 몰리나Quillaja saponaria Molina)로부터 분리되며 QH-A, QH-B, QH-C 또는 QS21로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 인지질은 포스파티딜 콜린(PC), 디팔미토일 포스파티딜 콜린(DPPC), 포스파티드산(포스파티데이트)(PA), 포스파티딜에탄올아민(PE), 포스파티딜세린(PS), 포스파티딜이노시톨(PI) 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PIP), 포스파티딜이노시톨 비스포스페이트(PIP2), 포스파티딜이노시톨 트리포스페이트(PIP3), 포스포릴콜린(SPH), 세라미드 포스포릴에탄올아민(Cer-PE) 및 세라미드 포스포릴글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 사포닌은 Quil A이고, 인지질은 DPPC이며 스테로이드는 콜레스테롤이고 조성물 중 Quil A : DPPC : 콜레스테롤의 비는 중량 기준으로 5:1:1이다.
본 발명은 또한 대상체에게 중화 항체 반응을 생산하기에 효과적인 양 및 기간으로 본원에 설명된 면역원성 조성물을 투여함을 포함하여, 대상체에서 헨드라 및/또는 니파 바이러스에 대해 중화 항체 반응을 생산하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 중화 항체 반응은 대상체내에서 헨드라 및/또는 니파 바이러스 재생산을 감소시키며 또한 대상체내에서 헨드라 및/또는 니파 바이러스 쉐딩(shedding)을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 아직 헨드라 및/또는 니파 바이러스에 노출되어 있지 않지만, 다른 구현예에서, 대상체는 헨드라 및/또는 니파 바이러스 감염으로 고생 중이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에게 중화 항체 반응을 생산하는데 효과적인 양 및 기간으로 본원에 설명된 면역원성 조성물을 투여함을 포함하여, 대상체내에서 헨드라 바이러스에 대한 중화 항체 반응을 생산하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에게 중화 항체 반응을 생산하는데 효과적인 양 및 기간으로 본원에 설명된 면역원성 조성물을 투여함을 포함하여, 대상체내에서 니파 바이러스에 대한 중화 항체 반응을 생산하는 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 근육내 투여된다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 다중 투여량으로 투여되고, 제1 투여량은 첫번째 투여량 이후 적어도 약 21일 내지 약 42일째에 두번째 투여량을 수반한다. 일부 구현예에서, 첫번째 투여량에 이어서 첫번째 투여량 후 28일째에 두번째 투여량이 수반되며, 추가로 제2 투여량 후 28일째에 제3 투여량이 수반된다. 일부 구현예에서, 부스터 투여량(booster dose)은 최종 투여량 후 6개월째에 투여된다. 구현예에서, 제3 투여량이 투여되지 않는 경우, 제2 투여량이 최종 투여량이다. 제3 투여량이 투여되는 구현예에서, 제3 투여량이 최종의 투여량이다. 추가의 구현예에서, 추가의 투여량은 부스터 투여량 후 1년째에 투여된다. 일부 구현예에서, 각각의 투여량은 약 50 또는 약 100㎍의 가용성 헨드라 바이러스 G 단백질을 함유한다.
본 발명은 또한 융합 단백질(F), 매트릭스 단백질(M), 인단백질(P), 거대 단백질(L) 및 핵캡시드 단백질(N)로 이루어진 군으로부터 선택된 다음의 HeV 및/또는 NiV 바이러스 단백질 중의 어느 것의 적어도 하나에 대한 대상체로부터 분리한 생물학적 시료 속의 항체의 존재를 검출함을 포함하여, 헨드라 및/또는 니파 바이러스에 노출된 대상체로부터 본원에 설명된 면역원성 조성물로 예방접종한 대상체를 차별화시키는 방법을 포함한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 사람, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 닭, 개 또는 고양이와 같은 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 중화 항체 반응을 생산하는데 효과적인 양 및 기간으로 헨드라 바이러스 가용성 G 당단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 사람 대상체에게 투여함을 포함하여, 상기 대상체에서 헨드라 및/또는 니파 바이러스에 대한 중화 항체 반응을 생산하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역원성 조성물은 항원보강제를 추가로 포함한다.
도 1은 250㎍의 면역 자극 복합체가 보조된 50 또는 100㎍/투여량의 재조합체 헨드라 바이러스 가용성 당단백질(sG)을 투여한 후 0일째에 생 헨드라 바이러스에 노출시킨 말에 대한 시간에 따른 직장 온도를 나타낸다.
도 2는 250㎍의 면역 자극 복합체가 보조된 50 또는 100㎍/투여량의 재조합체 헨드라 바이러스 가용성 당단백질(sG)을 투여한 후 0일째에 생 헨드라 바이러스에 노출시킨 말에 대한 시간에 따른 심박동수를 나타낸다.
도 3은 면역자극 복합체의 제조를 위한 개략도를 나타낸다.
도 4는 sGHeV 예방접종 및 NiV 시험감염 스케쥴의 개략적인 다이아그램을 나타낸다. sGHeV 예방접종, NiV 시험감염 및 안락사의 날짜를 화살표로 나타낸다. 혈액 및 면봉 표본을 나타낸 바와 같이(*) 시험감염 후 -42, -7, 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21 및 28일째에 수집하였다. 회색 내용은 시험감염 시각표(상부열)를 나타내고; 검정색 내용은 예방접종 시각표(하부 열)를 나타낸다. 각각의 백신 투여량 군에서 대상체 및 하나의 대조군 대상체에 대한 아프리카 녹색 원숭이(AGM) 수를 나타낸다.
도 5는 NiV-감염된 대상체의 생존 곡선을 나타낸다. 대조군 대상체(n=2) 및 sGHeV 예방접종된 대상체(n=9)로부터의 데이터를 사용하여 카플란-마이어 생존 곡선(Kaplan-Meier survival curve)을 생성하였다. 대조군은 추가의 역사적 대조군 대상체로부터의 데이터를 포함하였다. 예방접종된 대상체에게는 2회 피하 투여된 10㎍, 50㎍ 또는 100㎍의 sGHeV를 제공하였다. 말기 단계 질환에 대한 평균 시간은 대조군 대상체에서 11일이었던 반면 모든 예방접종된 대상체는 연구 말기에 안락사까지 생존하였다.
도 6은 예방접종된 대상체에서 NiV- 및 HeV-특이적인 면역글로불린(Ig)을 나타낸다. 혈청 및 비강 면봉을 예방접종된 대상체로부터 수집하여 IgG, IgA 및 IgM 반응을 sGHeV, 및 sGNiV 다중화된 미세구 검정을 사용하여 평가하였다. 동일한 백신 투여 군(n=3)에서의 대상체로부터의 혈청 또는 면봉을 개별적으로 검정하여 미세구 중간 형광성 강도의 평균(M.F.I.)을 계산하였으며 이는 Y-축에 나타낸다. 오차 바아(error bar)는 평균의 표준 오차를 나타낸다. 혈청 sG-특이적인 Ig는 흑색(sGHeV(빈 삼각형), sGNiV(채워진 삼각형))으로 나타내고 점막 sG-특이적인 IgA는 회색 기호(sGHeV(빈 삼각형), sGNiV(채워진 삼각형))으로 나타낸다.
백신 및 면역원성 조성물
본 발명의 백신 및 면역원성 조성물은 당해 조성물을 투여받은 대상체에서 하나 이상의 수의 체액성 및 세포성 면역 반응을 유발시키거나 HeV 및/또는 NiV의 하나 이상의 균주에 대한 적어도 하나의 면역 반응을 향상시키는데 있어서 효과적이므로, 상기 투여는 예방접종 목적 및/또는 HeV 및/또는 NiV의 하나 이상의 균주에 의한 HeV 및/또는 NiV의 감염의 예방에 적합하다. 본 발명의 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 HeV 및/또는 NiV로부터의 가용성 G 당단백질을 포함하는 G 당단백질 및, 항원보강제로서 작용하는 면역조절성 복합체(ISC)를 전달한다. 일부 구현예에서, G 당단백질의 양은 1mL당 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200 또는 250㎍을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 이는 또한 mL당 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 또는 300㎍의 ISC를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 1mL당 G 당단백질의 양은 5, 50 또는 100㎍이고 ISC의 양은 250㎍이다.
A. HeV 및 NiV G 단백질
일부 구현예에서, 백신 및 면역원성 조성물은 본원에 설명된 바와 같은 하나 이상의 HeV 및/또는 NiV G 당단백질을 포함한다. 용어 단백질은 본원에서 폴리펩타이드 또는 이의 단편을 포함하도록 광범위하게 사용된다. 예로서, 및 제한없이, HeV G 당단백질은 가용성 형태일 수 있으며 HeV G 당단백질에 대한 아미노산 서열의 73 내지 604번 아미노산을 포함한다(참고: Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979)(또한 참고: Yu (1998) Virology 251, 227-233). 또한 예로서 및 제한없이, NiV G 당단백질은 가용성 형태일 수 있으며 NiV G 당단백질에 대한 아미노산 서열의 71 내지 602번 아미노산을 포함한다(참고: Harcourt (2000) Virology 271: 334-349, 2000)(또한 참고: Chua (2000) Science, 288, 1432-1).
일반적으로, HeV 및 NiV G 당단백질의 가용성 형태는 HeV 또는 NiV의 G 당단백질의 엑토도메인(ectodomain)(예를 들면, 세포외)의 모두 또는 일부를 포함하며 일반적으로 G 당단백질의 전이막 도메인의 전부 또는 일부 및 G 당단백질의 세포질성 테일(tail)의 전부 또는 일부를 결실시킴으로써 생산된다. 예로서, 가용성 G 당단백질은 HeV 또는 NiV G 당단백질의 완전한 엑토도메인을 포함할 수 있다. 또한 예로서 및 비제한적으로, 가용성 G 당단백질은 엑토도메인의 전부 또는 일부 및 HeV 또는 NiV G 당단백질의 전이막 도메인 중 일부를 포함할 수 있다.
본 발명의 가용성 HeV 또는 NiV G 당단백질은 일반적으로 올리고머 형태 또는 형태들로 생산될 수 있는, 바이러스 숙주 세포 수용체와 상호작용하거나 결합하는 능력, 또는 천연의 G 당단백질을 인식할 수 있는 항체(바이러스 중화 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않음)를 이끌어낼 수 있는 능력과 같은, 상응하는 천연의 바이러스 당단백질의 하나 이상의 특징을 보유한다. 추가의 특징의 예는 숙주 세포의 감염을 차단하거나 예방하는 능력을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 통상의 방법론을 이용하여 하나 이상의 특징에 대해 가용성 HeV 또는 NiV G 당단백질을 평가할 수 있다.
예로서 및 비제한적으로, 가용성 HeV G 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 HeV G 당단백질(서열번호 2)에 대한 아미노산의 약 73 내지 604번 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다(참고: Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979). 또한 예로서 및 비제한적으로, 가용성 HeV G 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 HeV G 당단백질에 대한 폴리뉴클레오타이드 서열의 9129 내지 10727번 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다(참고: Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979). 또한, HeV G 당단백질(서열번호 2)에 대한 아미노산 서열의 약 73 내지 604번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드를 또한 이용할 수 있다. 일부 구현예에서, 이들 코돈 최적화된 서열은 서열번호 16의 64 내지 1662번 뉴클레오타이드를 포함하거나 이로 이루어진다. 추가의 구현예에서, 코돈 최적화된 서열은 Igκ 리더 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드를 포함하는 서열번호 16을 포함하거나 이로 이루어진다.
예로서 및 비제한적으로, NiV G 당단백질은 가용성 형태이고 NiV G 당단백질에 대한 71 내지 602번 아미노산 서열을 포함한다(참고: Harcourt (2000) Virology 271, 334-349). 가용성 NiV G 당단백질을 구축하는데 사용될 수 있는 서열의 비제한적 예는 문헌(참고: Harcourt (2000) Virology 271, 334-349)에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 임의의 니파 바이러스 분리체 또는 균주로부터의 G 당단백질 서열을 이용하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 유도시킬 수 있다.
예로써, 및 비제한적으로, 가용성 NiV G 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 문헌(참고: Harcourt (2000) Virology 271, 334-349)에서 NiV G 당단백질에 대한 아미노산 서열의 약 71 내지 602번 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 또한 예로서 및 비제한적으로, 가용성 NiV G 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 문헌(참고: Harcourt (2000) Virology 271, 334-349)(서열번호 4)에서 NiV G 당단백질에 대한 폴리뉴클레오타이드 서열의 234 내지 2042번을 포함할 수 있다. 또한, NiV G 당단백질에 대한 아미노산 서열의 약 71 내지 602번 아미노산을 암호화하는 코돈 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열을 또한 이용할 수 있다.
이들 G 당단백질의 기능적 등가물은 본 발명의 면역원성 및 백신 조성물에서 사용될 수 있다. 예로서 및 비제한적으로, 기능적으로 등가인 폴리펩타이드는 하나 이상의 다음 특징들을 포함한다: 2량체 또는 4량체 형태 또는 형태들로 생산될 수 있는, 바이러스 숙주 세포 수용체와 상호작용하거나 결합하는 능력, 천연의 G 당단백질을 인식할 수 있는 항체(HeV 및/또는 NiV 바이러스 중화 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않음)를 이끌어내는 능력 및/또는 숙주 세포의 감염을 차단하거나 예방하는 능력.
일부 구현예에서, G 당단백질은 2량체 및/또는 4량체 형태일 수 있다. 이러한 2량체는 G 당단백질내 시스테인 잔기들 사이에서 형성된 이황화물 결합의 형성에 의존한다. 이러한 이황화물 결합은 HeV 또는 NiV의 표면에 발현되는 경우 천연의 G 당단백질(예를 들면, 시스테인의 위치는 변하지 않고 남아있음) 속에 형성된 것들에 상응할 수 있으며 G 당단백질의 존재 또는 위치(예를 들면, 아미노산 서열내 시스테인의 위치를 변경시킴으로써)내에서 변경되어 항원성을 향상시키는 G 당단백질의 상이한 2량체 및/또는 4량체 형태를 형성할 수 있다. 또한, G 당단백질이 다수의 구조-의존성 에피토프(즉, 3차의 3차원 구조로부터 발생함)를 나타내고 다수의 이러한 천연의 에피토프의 보존이 중화 항체 반응을 부여하기 위해 매우 바람직함을 다시 고려할 때, 비-2량체 및 4량체화된 형태가 본 발명내에 존재한다.
본 발명의 HeV 면역원성 및 백신 조성물은 다양한 길이의 단백질을 함유할 수 있으나 서열번호 2의 73 내지 604번 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명의 엔벨로프 단백질은 서열번호 2(73 내지 604번 아미노산 포함)의 HeV 당단백질과 적어도 약 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일하다. 따라서, 본 발명의 HeV G 당단백질은 구조적 에피토프를 생산하기에 충분한 수의 아미노산을 지닌 천연의 HeV G 당단백질의 면역원성 단편을 포함한다. 면역원성 단편의 비-제한적 예는, 길이가 적어도 530, 531, 532, 533, 534 또는 535개 이상일 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, HeV G 당단백질은 서열번호 2 또는 Igκ 리더 서열(서열번호 15)을 추가로 포함하는 합성 구축물을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명의 NiV 면역원성 및 백신 조성물은 다양한 길이의 단백질을 함유할 수 있으나 서열번호 4의 71 내지 602번 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명의 엔벨로프 단백질은 서열번호 4(71 내지 602번 아미노산 포함)의 NiV 당단백질에 대해 적어도 약 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 동일하다. 따라서, 본 발명의 NiV G 당단백질은 구조적 에피토프를 생산하기에 충분한 수의 아미노산을 지닌 천연의 NiV G 당단백질의 면역원성 단편을 포함한다. 면역원성 단편의 비-제한적 예는, 길이가 적어도 528, 529, 530, 531, 532 또는 533개 이상일 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, NiV G 당단백질은 서열번호 4 또는 리더 서열을 추가로 포함하는 합성 구축물을 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에 기술된 면역원성 단편은 항원의 적어도 하나의 에피토프를 함유하고 HeV 및/또는 NiV 항원성을 나타내며, 예를 들어 다른 HeV 및/또는 NiV 항원에 융합되거나 담체 상에 존재하는 경우와 같이 적합한 구축물내에 존재하는 경우 면역 반응을 유발할 수 있으며, 이러한 면역 반응은 천연의 항원에 대해 지시된다. 본 발명의 일 구현예에서, 면역원성 단편은 HeV 및/또는 NiV 항원으로부터 적어도 20개의 연속된 아미노산, 예를 들면, HeV 및/또는 NiV 항원으로부터 적어도 50, 75 또는 100개의 연속된 아미노산을 함유한다.
HeV 및 NiV G 당단백질 구현예는 천연의 HeV 또는 NiV G 당단백질에 대해 적어도 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드를 추가로 포함하며, 여기서 상기 폴리펩타이드 서열은 천연의 HeV 또는 NiV G 당단백질 아미노산 서열과 동일할 수 있거나 천연의 HeV 또는 NiV G 단백질 아미노산 서열과 비교하여 특정의 정수의 아미노산 변경을 포함할 수 있고, 여기서 상기 변경은 적어도 하나의 아미노산 결실, 보존적 및 비-보존적 치환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 상기 변경은 참고 폴리펩타이드 서열의 아미노- 또는 카복시-말단 위치 또는 이들 말단 위치들 사이의 어느 곳에도 존재하거나, 참고 서열내 아미노산 중에서 개별적으로 또는 천연의 HeV 또는 NiV G 당단백질 아미노산 서열내 하나 이상의 연속된 군 속에 산재되어 있다.
아미노산 서열 수준에서 서열 동질성 또는 상동성은 서열 유사성 조사를 위해 조정된 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 사용된 알고리즘을 사용한 BLAST(기본적인 위치 정렬 조사 도구) 분석에 의해 측정할 수 있다(참고: Altschul (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 and Karlin (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268). BLAST 프로그램에 의해 사용된 시도는 우선 질의 서열(query sequence)과 데이터베이스 서열 사이에 갭이 있는(비-연속성) 및 갭이 없는(연속성), 유사 분절을 고려한 후, 동일한 모든 일치(match)들의 통계적 유의성을 평가하고 최종적으로 유의성의 예비선택된 한계(threshold)를 만족시키는 이들 일치만을 요약한다. 서열 데이터베이스의 유사성 조사에 있어서 기본적인 쟁점의 논의를 위해서는 문헌(참고: Altschul (1994) Nature Genetics 6, 119-129)을 참고한다. 히스토그램(histogram), 설명, 정렬, 예측(즉, 데이터베이스 서열에 대한 일치를 보고하기 위한 통계적 유의성 한계), 컷오프(cutoff), 매트릭스 및 필터(낮은 복합성)에 대한 조사 매개변수는 디폴트 설정(default setting)에 있다. blastp, blastx, tblastn 및 tblastx에 사용된 디폴트 점수매김 매트릭스는, 길이가 85개 아미노산을 초과하는 질의 서열에 대해 추천된, BLOSUM62 매트릭스(참고: Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919)이다.
본 발명의 백신 및 면역원성 조성물은 본 발명의 면역화 방법을 추가로 강화시킬 수 있는 상이한 균주로부터의 추가의 HeV 및/또는 NiV G 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
B. 면역자극성 복합체
일반적으로, 본 발명은 면역 조절 복합체(ISC)와 함께 HeV 및/또는 NiV G 당단백질 엔벨로프 단백질의 가용성 형태를 포함하는 백신 조성물을 포함하는 면역원성 조성물 및 대상체에서 HeV 및/또는 NiV 감염을 예방하고 치료하기 위해 이들 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명에서, 백신 및/또는 면역원성 조성물은 항원보강제로서 작용하는 면역자극성 복합체를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서, "항원보강제"는 어떠한 구체적인 항원 효과 자체를 가지지 않지만, 면역계를 자극하여 항원에 대한 반응을 증가시킬 수 있는 제제를 말한다.
ISC는 이를 특정의 적용에 이상적인 항원보강제가 되도록 하는 다수의 특징을 갖는다:
항원 스페어링(antigen sparing) : 항원 이용성이 제한되거나 항원 비용이 높은, 예를 들면, 문헌(참고: Wee (2008) Mucosal Immunol. 1, 489-496)에 주목된 바와 같이, ISC는 10 내지 100배 정도로 많은 항원 스페어링을 허용하는 것으로 밝혀졌다. 아마도 이는 다른 항원보강제와 비교하여 증가된 효능 또는 보다 적절한 작용 메카니즘의 조합에 기인한다.
교차-제시: 예를 들면, 문헌(참고; Schnurr (2009) J. Immunol. 182, 1253-1259)에 주목된 바와 같이, 항원 제시 세포(APC)에 의한 항원의 제시는 일반적으로 2개의 경로들 중 하나를 따른다. 외부 항원은 일반적으로 APC에 의해 에워싸인 후 주요 조직적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex: MHC) 제II 부류 분자와 관련하여 APC의 표면에서 프로세싱되어 재-발현된다. 이들은 이후에 림프구에 의해 관찰될 수 있으며, 올바른 공-자극성 인자/신호가 존재하는 경우, 적절하게 반응한다. 자가 또는 암 항원 및 바이러스 항원은 APC의 세포질 속에 존재하므로 이들은 제I 부류 분자와 관련하여 일반적으로 프로세싱되어 발현된다. 암 및 바이러스 항원에 대해 효과적인 면역성은 제I 부류 경로에 대한 접근을 필요로 한다. 이는 바이러스 감염 또는 세포 항상성(내부 항원의 세포 턴오버(turnover)) 동안에 천연적으로 발생한다. 백신으로서 도입된 항원(바이러스 또는 자체)은 세포의 외부로부터 세포의 항원 프로세싱 기관으로 이들의 경로를 찾아서 제II 부류 경로를 제I 부류 경로로 도입할 필요가 있다. 이는 수지 세포(DC - 전문 APC)내에서 천연적으로 발생하거나 항원보강제로서 ISC와 혼합된 항원을 사용한 예방접종에 의해 달성될 수 있다. 항원 제시의 제I 부류내로 이의 경로를 발견하는 외부적으로 기원한 항원의 이러한 공정은 교차-제시로 불린다. ISC가 항원의 교차-제시를 달성하는 정밀한 메카니즘은 완전히 해명되지 않았지만 ISC 성분의 막 교란에 의존할 수 있다.
체액성 및 세포 매개된 반응: 예를 들면 문헌(참고: Maraskovsky (2009) Immunol. Cell Biol. 87, 371-376)에서 주목한 바와 같이, ISC의 작용 메카니즘으로 인해, 후천성 면역계의 체액성 및 세포 아암 둘 다가 관여된다. 일부 종에서 이는 이들 항원보강제를 사용한 예방접종에 의해 자극된 사이토킨의 프로파일과 평행하다. 제1형 면역 반응은 인터루킨-2 및 IFN-감마 발현 및 세포내 병원체(세균, 원생동물 및 바이러스)에 대한 보호에 의해 특징화되며 제2형 반응은 인터루킨-4의 발현 및 항-독소 및 항-병원체 관련 면역성에 대한 중화 항체의 생성에 의해 특징화된다. ISC는 보다 큰 폭의 면역 반응을 허용하는 이들 2개의 극단들 사이의 균형잡힌 사이토킨 프로파일을 제공한다. 또한, 다수의 연구는, 백신이 비강내로 전달되는 경우에 ISC가 효과적일 수 있음을 나타내었다. 이는 점막 표면의 감작화를 허용함으로써 이 경우에 특히 관련된 병원체 도입 부위에서 관련된 면역성(점막 면역성)을 제공한다(참고: Sjolander (2001) 백신 19, 4072-4080).
멸균 여과가능하고 일관된 제조 범주: ISC 입자의 크기는, 직경이 통상적으로 40nm이어서 이것이 제형의 말기 제제를 멸균하는데 사용된 여과기를 통과하도록 한다. 또한, Quil A에서 발견된 것으로서 트리테르페노이드 사포닌에 대한 콜레스테롤 및 인지질과 연합되는 천연의 경향성은 ISC에 대한 제조 방법을 개발하는데 이용되어 왔다. ISC 입자를 형성하지 않는 Quil A 종은 최종 생성물로부터 투석제거된다. 성분들의 비를 조절함으로써 일관된 생성물이 Quil A 사포닌의 이종 스펙트럼으로부터 생성된다. 이러한 비는, 편차가 특징적인 40nm 입자(나선체, 쉬이트 등)가 아닌 구조를 초래하므로 중요하다. ISC 콜로이드의 자유-유동 특성 및 투과전자 현미경, HPLC 및 다른 기술을 사용하여 측정될 이의 능력은, 이러한 항원보강제가 방출 검정 및 다른 품질 척도의 개발에 적용할 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 상기한 사항을 기준으로 하여, 면역자극 복합체와 임의의 양의 G 당단백질의 제형은 사포닌, 인지질 및 스테로이드 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 사포닌, 인지질, 스테로이드 분자의 몰 비는 5:1:1의 비이다. 면역자극성 복합체는 예를 들면, 5 내지 10중량%의 사포닌, 1 내지 5%의 스테로이드 분자 및 인지질 및 G 당단백질을 포함하는 나머지를 함유할 수 있다. G 당단백질은, 단백질의 면역자극 복합체내로의 혼입 후 직접적으로 또는 담체 단백질(예를 들면, 키메라 또는 융합 단백질)에 대한 화학적 커플링에 의해 면역자극 복합체내로 혼입될 수 있다. 면역자극 복합체에 대한 참고는 이의 유도체, 화학적 등가물 및 유사체에 대한 참고를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, ISC는 HeV 및/또는 NiV G 당단백질로부터 별도로 혼합된 후 G 당단백질이 ISC와 혼합된다. 일부 구현예에서, G 당단백질은 사포닌, 인지질 및 스테로이드 분자와 직접 혼합된다.
적합한 사포닌은 트리테르페노이드 사포닌을 포함한다. 이들 트리테르페노이드는 식물 기원의 표면-활성 글리코시드의 군이며 스테로이드 또는 트리페르페노이드 구조의 소수성 영역과 연합된 친수성 영역(일반적으로 수개의 당 쇄)으로 구성된 일반적인 화학적 코어를 공유한다. 이들 유사성으로 인하여, 이러한 화학적 코어를 공유하는 사포닌은 유사한 보조 특성을 갖는 경향이 있다. 항원보강제 조성물에서 사용하기에 적합한 트리테르페노이드는 퀼라자 사포나리아, 토마틴, 인삼 추출물, 버섯을 포함하나 이에 한정되지 않는, 식물 기원하거나 합성 등가물인 많은 공급원, 및 스테로이드성 사포닌과 구조적으로 유사한 알칼로이드 글리코시드로부터 기원할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 사포닌은 Quil A 및/또는 이의 유도체이다. Quil A는 남아메리카 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나로부터 분리된 사포닌 제제이며 문헌(참고: Dalsgaard (1974) Saponin adjuvants, Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, pp. 243-254)에 의해 항원보강제 활성을 갖는 것으로 처음으로 기술되었다. Quil A의 정제된 단편은 HPLC에 의해 분리되었으며, 이는 Quil A와 관련된 독성이 없는 항원보강제 활성을 보유하고(참고: EP 0362278), 예를 들면, QS7 및 QS21(또한 QA7 및 QA21로 공지됨)이 있다. QS21은 CD8+ 세포독성 T 세포(CTL), Th1 세포 및 우세한 IgG2a 항체 반응을 유도하는 퀼라자 사포나리아 몰리나의 나무껍질로부터 기원한 천연의 사포닌이며 본 발명의 내용에서 사용하기 위한 사포닌이다. ISC에서 사용하기 위한 다른 적합한 사포닌은 Quil A의 QH-A, QH-B 및 QH-C 아단편, 파낙스(Panax)(인삼), 아스트라갈루스(Astragalus), 아키란테스(Achyranthes), 대두 콩, 아카시아(Acacia) 및 코도놉시스(Codonopsis) 속으로부터의 것들과 같은 퀼라이아 사포나리아 이외의 종으로부터의 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 사포닌은 퀼라이아 사포나리아 이외의 종으로부터 분리된다.
본 발명의 면역원성 및 백신 조성물에서 사용하기 위한 인지질의 비-제한적 예는 디아실글리세리드 구조 및 포스포스핑고지질을 지닌 분자를 포함한다. 디아실글리세리드 구조를 지닌 인지질의 비-제한적 예는 포스파티드산(포스파티데이트)(PA), 포스파티딜에탄올아민(세팔린)(PE), 포스파티딜콜린(레시틴)(PC), 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC) 또는 포스파티딜세린(PS)을 포함한다. 디아실글리세리드 구조를 지닌 인지질의 다른 비-제한적 예는 포스포이노시티드를 포함한다. 예시적인 포스포이노시티드는 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PIP), 포스파티딜이노시톨 비스포스페이트(PIP2) 또는 포스파티딜이노시톨 트리포스페이트(PIP3)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 포스포스핑고지질의 비-제한적 예는 세라미드 포스포릴콜린(스핑고마이엘린)(SPH), 세라미드 포스포릴에탄올아민(스핑고마이엘린)(Cer-PE) 또는 세라미드 포스포릴글리세롤을 포함한다.
본 발명의 면역원성 및 백신 조성물에서 사용하기 위한 스테로이드 분자는 이들의 구조의 일부로서 혼입되는 분자를 포함한다. 스테로이드 분자의 비-제한적 예는 콜레스테롤, 프레그네놀론, 17-알파-하이드록시 프레그네놀론, 데하이드로에피안드로스테론, 안드로스텐디올, 안드로스텐디올, 프로게스테론, 17-알파-하이드록시 프로게스테론, 안드로스텐디온, 테스토스테롤론, 디하이드록시테스토론, 데옥시코르티코스테론, 11-데옥시코르티코스테론, 코르티솔, 코르티코스테론, 알도스테론, 에스트론, 에스트라디올 또는 에스트리올을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역자극 복합체는 전형적으로, 직경이 30 내지 40nm인 구조물과 같은 작은 케이지이나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 면역자극 복합체의 제형은, Quil A, 콜레스테롤 및 포스파티딜콜린의 몰 비가 5:1:1의 비이다. 면역자극 복합체는 예를 들면, 5 내지 10중량%의 Quil A, 1 내지 5중량%의 콜레스테롤 및 인지질 및, G 당단백질을 포함하는 나머지를 함유할 수 있다. G 당단백질은 면역자극 복합체내로, 단백질의 혼입 후 직접적으로 또는 담체 단백질(예를 들면, 키메라 또는 융합 단백질)에 커플링함으로서 면역자극성 복합체내로 혼입될 수 있다. 면역자극 복합체에 대한 참고는 이의 유도체, 화학적 등가물 및 유사체에 대한 참고를 포함하는 것으로 이해하여야 한다. 예를 들면, 면역자극성 복합체의 유도체에 대한 참고는 예를 들어, 하나 이상의 Quil A, 콜레스테롤, 포스파티딜콜린 또는 단백질은 결실되거나, 치환되거나, Quil A, 콜레스테롤, 포스파티딜콜린 또는 단백질 이외의 성분이 복합체에 첨가되는 경우 면역자극 복합체에 대한 참고를 포함한다. 면역자극성 복합체의 기능적 등가물은 면역자극성 복합체일 수 있으며, 여기서 이의 4개의 성분 중의 하나 이상은 기능적 등가물로 대체된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 면역자극성 복합체의 G 당단백질 성분은 결실된다. 이러한 유형의 면역자극성 복합체는 본원에서 단백질-유리된 면역자극성 복합체로서 언급된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 시험관내에서 HeV 및/또는 NiV의 다수 균주에 대해 교차-반응성 중화 항-혈청의 생산을 유도할 수 있는 분리된 HeV 또는 NiV G 단백질 및 예를 들면, Quil A, DPPC 및 콜레스테롤을 포함하는 항원보강제를 포함하는 면역원성 조성물을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 여기서 상기 조성물은 5, 50 또는 100㎍의 가용성 HeV 또는 NiV G 단백질, 및 적절한 양의 Quil A, DPPC, 및 콜레스테롤을 함유한다. 면역자극성 복합체의 추가의 예시적인 구현예, 및 이의 제조는 EP 0242380B1 및 EP 0180564B1, 및 또한 WO 2000/041720(예를 들면, 이의 3면 및 9면 참고, 문헌: Cox & Coulter (1992) Advances in Adjuvant Technology and Application in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology, Chapter 4, Yong (ed.), CRC Press; Dalsgard (1974) Gesamte Virusforsch, 44, 243-254; 호주 특허 명세서 제558258호, 제589915호, 제590904호 및 제632067호 참고)에 기술되어 있다. 또한 미국 특허 제6,506,386호에 기술된 대표적인 프로토콜, 및 면역자극성 복합체가 사용될 수 있다는 잘-공지된 사실에 대한 이들 문헌내 참고문헌을 참고하며, 여기서 상기 단백질 항원은 형성(참고: EP 0109942B1)되거나, 달리는 예비형성된 면역자극성 복합체가 제공되는 경우 면역자극성 복합체 속에 포함되며, 이는 이후 항원의 별도로 첨가된 분취량과 혼합되어 백신을 형성한다(참고: EP 0436620B1). 일반적으로 인식될 바와 같이, 단백질 항원은 또한 면역자극성 복합체에 공유결합적으로 부착될 수 있다(참고: 또한 EP 0180564B1). 당해 분야에 잘 인식된 바와 같이, 면역자극성 복합체는 점막 예방접종을 통해 투여될 수 있으며(참고: Mowat (1991) Immunology 72, 317-322) 본 발명의 면역자극성 복합체는 또한 막 표적화 단백질의 혼입에 의해 점막 예방접종을 위해 추가로 개선될 수 있다(참고: WO 97/30728).
일부 구현예에서, 본 발명은 시험관내에서 HeV 및/또는 NiV의 다수의 균주에 대한 교차-반응성 중화 항-혈청의 생산을 유도할 수 있는 분리된 HeV 또는 NiV G 단백질 및 Quil A, DPPC 및 콜레스테롤을 포함하는 항원보강제를 포함하는 면역원성 조성물을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 상기 조성물은 5, 50 또는 100㎍의 가용성 HeV 또는 NiV G 단백질, 및 적절한 양의 Quil A, 디팔미토일 포스파티딜 콜린(DPPC), 및 콜레스테롤을 함유한다. 면역자극성 복합체의 추가의 예시적인 구현예는 WO 2000/041720에 기술되어 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 백신 및 면역원성 조성물은 약학 조성물의 일부일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 활성 화합물을 작용 부위에 전달하기 위해 약학적으로 사용될 수 있는 제제내로의 가공을 촉진시키는 부형제 및 항원보강제를 포함하는 적합한 약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다.
C. 부형제
본 발명의 면역원성 및 백신 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액 형태의, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 안정화제(참고: 예를 들면, Remington: The Science and practice of Pharmacy (2005) Lippincott Williams)를 추가로 포함할 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 상기 용량 및 농도에서 수용체에 대해 무독성이며, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예를 들면, 수은((o-카복시페닐)티오)에틸 나트륨 염(THIOMERSAL), 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메티오늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트란을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 슈크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 상대이온(counter-ion); 금속 복합체(예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 트윈(TWEEN) 또는 플루로닉스(PLURONICS)와 같은 비-이온성 표면활성제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 용량을 운반하기에 충분한 용적의 어떠한 적절한 약학적 비히클 또는 담체 속에 현탁된 용량으로 존재할 수 있다. 일반적으로, 담체, 항원보강제 등을 포함하는 최종 용적은 전형적으로 적어도 1.0mL일 것이다. 상한치는 일반적으로 약 0.5mL 내지 약 2.0mL 이하로 투여될 양의 실현가능성에 의해 관리된다.
사용 방법
본 발명은 어떠한 포유동물 대상체에게 본 발명의 면역원성 및 백신 조성물을 투여함을 포함하여, 헨드라 및/또는 니파 바이러스 감염을 예방하고/하거나 치료하는 방법을 포함한다. 본원에 기술된 항원보강제와 함께 HeV 및/또는 NiV G 당단백질을 사용한 예방접종으로 유발된 활성 면역성은 세포성 또는 체액성 면역 반응을 개시하거나 증강시킬 수 있다. 유효량의 HeV 및/또는 NiV G 당단백질 또는 이의 항원성 단편은 항원보강제와의 혼합물로 제조되어 백신을 제조할 수 있다.
본 발명은 가용성 HeV 및/또는 NiV G 당단백질 또는 이의 배합물을 자체로 또는 사람에서 사용하기에 적합한 적어도 하나의 항원보강제와 함께 포함하는 면역원성 및/또는 백신 조성물을 투여함을 포함하여, 사람 대상체에서 헨드라 및/또는 니파 바이러스 감염을 예방하고/하거나 치료하는 방법을 포함한다. 사람에서 사용하기에 적합한 항원보강제는 단독으로 또는 함께 사용될 수 있다. 사람에서 사용하기에 접합한 항원보강제의 예는 알부민 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 알루미늄 염의 예는 수산화알루미늄, 수산화알루미늄 겔(Alhydrogel™), 인산알루미늄, 명반(황산알루미늄 칼륨), 또는 혼합된 알루미늄 염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 사람에서 사용하기에 적합한 항원보강제의 추가의 예는 유중수 유액, 수중유 유액, 및 AS04(수산화알루미늄 및 모노포스포릴 지질 A의 조합물) 및 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드는 특히 서열 측면에서 메틸화되지 않는 CpG 디뉴클레오타이드(CpG 모티프)를 함유하는 합성 올리고뉴클레오타이드이다. 이들 CpG 모티프는 포유동물 DNA와 비교하여 세균 DNA 속에 20배 더 큰 빈도로 존재한다. CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드는 강력한 면역자극성 효과를 생성하는 톨-유사 수용체(Toll-like receptor) 9(TLR9)에 의해 인식된다.
본원에 기술된 HeV 및/또는 NiV G 당단백질과 하나 이상의 항원보강제를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 예방학적 또는 치료학적 목적으로 존재할 수 있다. 본 발명의 하나의 국면에서, 조성물은 예방학적 목적으로 유용하다. 예방학적으로 제공되는 경우, 백신 조성물은 HeV 및/또는 NiV 감염의 어떠한 검출 또는 증상에 앞서 제공된다. 유효량의 화합물(들)의 예방학적 투여는 어떠한 후속적인 HeV 및/또는 NiV 감염을 예방하거나 약화시키기 위해 제공된다.
치료학적으로 제공되는 경우, 백신은 실제 감염의 증상의 검출시 유효량으로 제공된다. 조성물은, 이의 투여가 수용체에 의해 견디어질 수 있는 경우 "약학적으로 허용되는"으로 일컬어진다. 이러한 조성물은, 투여된 양이 생리학적으로 유의한 경우 "치료학적 또는 예방학적 유효량"으로 투여되는 것으로 일컬어진다. 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은, 이의 존재가 HeV 및/또는 NiV의 하나 이상의 균주에 대한 광범위한 반응성의 체액성 또는 세포 면역 반응을 향상시킴으로써 수용체 환자의 생리학에서 검출가능한 변화를 생성하는 경우 생리학적으로 유의하다. 제공된 보호는 절대적일 필요는 없으며(즉, HeV 또는 NiV 감염은 전체적으로 예방되거나 근절될 필요가 없다), 단, 대조군 집단에 대하여 통계적으로 유의한 개선이 존재한다. 보호는 질병의 증상의 발병의 중증도 또는 신속성을 완화시키기 위해 제한될 수 있다.
본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은 HeV 및/또는 NiV의 다수의 균주에 대해 내성을 부여할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 백신은, 대상체에 대한 이의 투여가 감염의 증상 또는 상태의 전체적인 또는 부분적인 약화(즉, 억제), 또는 감염에 대한 개인의 전체적인 또는 부분적인 면역성을 생성하는 경우 감염을 예방하거나 약화시키는 것으로 일컬어진다.
본 발명의 적어도 하나의 백신 또는 면역원성 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 약학 조성물을 사용하여, 의도된 목적을 달성하는 어떠한 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 이러한 조성물의 투여는 피하, 정맥내, 피내, 근육내, 복강내, 비강내, 경피, 또는 볼내 경로와 같은 다양한 비경구 경로에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 피하로 투여된다. 비경구 투여는 시간에 따라 볼내 주사 또는 전진적인 주입에 의해 수행될 수 있다.
활성의 특이적인 세포 면역치료요법에 의한 세포 면역 반응에 의해 완화될 수 있는 질병 또는 상태를 예방하거나, 억제하거나, 치료하기 위한 대표적인 요법은 1주 내지 약 24개월까지 및 이를 포함하는 기간에 걸쳐, 단일 치료로서 투여되거나, 향상되거나 증강된 용량으로서 반복된, 상기 기술된 바와 같은 백신 조성물의 유효량의 투여를 포함한다. 비-제한적 예는 제1 투여량에 이어 제1 투여량(0일째) 이후 약 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24일의 제2 투여량을 포함한다. 다른 예에서, 제2 투여량은 제1 투여량 후 42일째에 투여된다. 여전히 다른 예에서, 제2 투여량은 제1 투여량 후 28일째에 투여된 후 제2 투여량 후 28일째에 투여된 제3 투여량을 수반한다. 여전히 다른 예에서, 증강 투여량은 마지막 예방접종 후 6개월째에 투여되고, 증강 투여량 후 1년째에 매년 재예방접종이 수반된다. 면역원성 또는 백신 조성물의 투여량의 양은 0일째에 투여된 제1 투여량보다 작거나, 이와 동일하거나, 이보다 클 수 있다.
본 발명에 따라서, 백신 또는 면역원성 조성물의 "유효량"은, HeV 및/또는 NiV의 하나 이상의 균주에 대한 적어도 하나의 세포 또는 체액성 면역 반응의 경우에, 바람직한 생물학적 효과를 달성하기에 충분한 양이다. 유효 용량은 대상체의 연령, 성별, 건강 및 체중, 공존하는 치료의 종류, 경우에 따라, 치료 빈도, 및 바람직한 효과의 특성에 의존할 것이다. 하기 제공된 유효 투여량의 범위는 본 발명을 제한하는 것을 의도하지 않으며 본 발명의 조성물을 투여하기에 적합할 수 있는 투여량 범위의 예를 나타낸다. 그러나, 상기 용량은 과도한 실험없이, 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되고 결정가능하므로, 개인 대상체에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 백신 및 면역원성 조성물의 수용체는 HeV 및/또는 NiV에 대한 세포 또는 체액성 면역 반응을 통해 특이적인 면역성을 획득할 수 있는 어떠한 대상체일 수 있으며, 여기서 세포 반응은 MHC 제I 부류 또는 제II 부류 단백질에 의해 중재된다. 포유동물 중에서, 수용체는 영장류목의 포유동물(사람, 침팬지, 유인원 및 원숭이 포함)일 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물로 사람을 치료하는 방법이 제공된다. 대상체는 HeV 및/또는 NiV로 감염될 수 있거나 실험 연구에서와 같이 HeV 또는 NiV 감염의 모델을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 말, 암소, 황소, 물소, 양, 돼지(참고: Mingyi (2010) Vet. Res. 41, 33), 염소, 개(참고; Biosecurity Alert - Hendra Virus Update, 27 July 2011, Press Release, Biosecurity Queensland) 또는 고양이를 포함하나, 이에 한정되지 않는 가정용 포유동물이다. 일부 구현예에서, 대상체는 닭을 포함하는 가금류이다.
본 발명의 백신은 또한 헨드라 바이러스 감염에 대해 보호하기 위해 사용된 투여량에서 니파 바이러스 감염에 대해 교차-보호를 제공하므로 또한 니파 바이러스에 대해 효과적인 예방접종을 제공한다.
효과적인 면역 반응에 대한 참고는 유리한 예방학적 또는 치료학적 효과를 직접 또는 간접적으로 생성하는 면역 반응에 대한 참고로서 이해되어야 한다. 면역원이 본원에 기술된 바와 같은 HeV 또는 NiV G 당단백질을 포함하는 경우에, 이러한 반응은 바이러스 재생 및/또는 바이러스 쉐딩의 감소 또는 차단 및/또는 동물에서 질병 증상에 있어서의 감소를 포함한다. 효능은 기능적 척도이며 순환하는 항체 단독의 존재가 바이러스 재생 및 쉐딩을 차단하는 상기 순환하는 항체의 능력을 필수적으로 나타내지 않으므로 항-HeV 및/또는 항-NiV 항체 역가에 대한 참조로 정의되지 않음을 이해하여야 한다.
또한 예로서 및 비제한적으로, 본 발명의 가용성 G 단백질 폴리펩타이드가 헨드라 또는 니파로 감염되거나, 감염된 것으로 의심된 대상체내에서 면역 반응을 증강시키기 위해 투여되는 경우 및/또는 본 발명의 항체가 수동적 면역치료요법의 형태로서 투여되는 경우, 조성물은 예를 들면, 다른 치료학적 제제(예를 들면, 항-바이러스제)를 추가로 포함할 수 있다.
하기 실시예 4는 말을 예방접종하기에 사용하기 위한 특정의 바람직한 조성물에 대한 정보를 제공한다. 헨드라 바이러스로 감염될 수 있으므로, 동물 및 따라서 사람 둘 다를 헨드라 및 니파 바이러스 감염 둘 다로부터 보호하기 위한 예방접종을 보증할 수 있는 다른 동물과 관련하여, 다음의 정보가 일반적으로 적용가능하며 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 채택될 수 있다. 일반적으로 말해서, 비교 동물(개 및 고양이)는 대략 25㎍의 헨드라 항원을 보장하며, 바람직한 ISC 조성물 중에서 사포닌, 인지질 및 스테롤의 비가 5:1:1이지만 본원에 기재된 바와 같은 어떠한 성분 종을 사용하는, 25 내지 150㎍ 범위의 ISC 항원보강제로부터 유리할 수 있다. 비교 동물의 경우, 최종 투여량이 약 1mL인 것이 바람직하다. 공중합체계 항원보강제인, PolygenTM(제조원: MVP Technologies)은 또한 바람직하게는 약 5 내지 15%(v/v)로 사용될 수 있다.
일반적으로 말해서, 보다 큰 농장 동물(양, 암소, 돼지 등)의 경우, 말에 대해 본원에서 달리 제공된 항원 및 항원보강제 투여량(및 최종 투여 용적), 즉, 50 내지 100㎍의 항원이 적용가능하며, 전형적으로 약 250㎍의 ISC(예를 들면, 1 내지 3mL의 최종 용적)가 사용될 수 있다. 돼지와 관련하여, 대안의 및 효과적인 항원보강제 제형은 (대략적으로 동일한 양의 항원의 경우) ISC 및 이온성 다당류의 배합물, 특히 100mg의 DEAE 덱스트란 및 800㎍의 ISC의 배합물을 1 내지 3mL의 최종 투여량 용적(다시 5:1:1의 Quil A:포스파티딜 콜린:콜레스테롤(참고: WO 2000/41720))으로 포함한다.
예방접종된 동물의 구별
본 발명은 또한 HeV 및/또는 NiV에 노출되거나, 감염된 동물로부터 건강한 예방접종된 동물을 구별하는 방법을 포함한다. 바이러스 감염 동안, HeV 및 NiV는 융합 단백질(F), 매트릭스 단백질(M), 인 단백질(P), 거대 단백질(L) 및 핵캡시드 단백질(N)을 포함하는 G 당단백질(G) 이외의 추가의 단백질을 발현한다. 이들 추가의 단백질은 이들 단백질에 결합하는 항체 형태로 동물 속에서의 면역 반응을 유도하거나 T 세포 면역성을 유도하기 위한 잠재능을 갖는다. 이들 다른 단백질에 대한 항체 반응의 수준은 효소-연결된 면역 검정(EIA)과 같은 검정에 의해 일반적으로 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 면역원성 및 백신 제형은 HeV 및/또는 NiV 항원으로서 G 당단백질 만을 함유하므로, HeV 및/또는 NiV의 G 당단백질에 대해서만 항체와의 면역 반응을 유도할 것이다. HeV 또는 NiV에 의해 후속적으로 감염된 본원에 기술된 면역원성 조성물로 예방접종된 동물은 G 당단백질에 대한 증강 면역 반응을 증가시킬 것이지만, 또한 G 당단백질 이외의 일부 다른 HeV 및 NiV 단백질에 대한 항체 제시의 변화를 나타낼 것이다. 따라서, 융합 단백질(F), 매트릭스 단백질(M), 인단백질(P), 거대 단백질(L) 및 핵캡시드 단백질(N) 중의 어느 것에 대한 항체의 존재를 EIA에서 측정하여 혈청 시료 속에서 이들 단백질에 대해 특이적인 항체의 존재 또는 부재를 측정할 수 있다. 이들 다른 단백질(즉, G 당단백질 이외의 단백질) 중 어느 것에 대한 항체가 검출될 경우, 동물은 이후에 HeV 및/또는 NiV에 대해 노출된다. 달리는, 이들 다른 단백질에 대한 항체가 발견되지 않고 G 단백질에 결합하는 항체만이 검출되는 경우, 동물은 이후에 단지 예방접종된다.
본 발명의 EIA는 HeV 및/또는 NiV로 감염된 동물과 본원에 기술된 면역원성 조성물로 예방접종된 건강한 동물 사이를 검출하고 구별하는데 있어서 매우 특이적이고 매우 선택적이다. 본 발명은 균질한 및 이종 환경 둘 다에서 ELISA를 포함하는 다양한 검정 과정을 이용할 수 있다. 이들 검정 과정은 항체를 함유하는 혈액, 혈청, 젖, 또는 어떠한 다른 체액과 같은 시료에서 수행할 수 있다.
일부 구현예에서, EIA에 사용된 항체는 G 당단백질을 사용한 예방접종에 의해 유도된 항체와 유일하게 경쟁할 수 있지만 HeV 및/또는 NiV에 의한 감염에 의해 동물에서 유도된 항체와는 경쟁하지 않는다. 이는 HeV 및 NiV 감염의 혈청학적 진단 뿐 아니라, 단일 검정에서 감염으로부터 예방접종의 구별을 허용한다. EIA 과정은 표준 혈액 혈청 시료 또는, 항체를 함유하는 어떠한 체액 또는 분비물에서도 수행할 수 있다. EIA 과정은 G 당단백질 및 어떠한 다른 HeV 및/또는 NiV 바이러스 단백질(예를 들면, 이러한 단백질과 같은 융합 단백질(F), 매트릭스 단백질(M), 인단백질(P), 거대 단백질(L) 및 핵캡시드 단백질(N)은 HeV 및/또는 NiV에 노출되지 않은 예방접종된 건강한 동물에서는 존재하지 않는다)에 대한 모노클로날 및/또는 폴리클로날 항체를 사용할 수 있다. EIA는 컴퓨터 보조된 데이터 분석 적응 소프트웨어 및 하드웨어가 존재하거나 존재하지 않는, 어떠한 수의 상업적으로 이용가능한 고정되거나 이동가능한-수동, 반-자동화된 또는 로보트로 자동화된 ELISA 장치에서 수행할 수 있다. 일부 구현예에서, HeV 및/또는 NiV에 노출되거나, 이로 감염된 동물로부터 건강한 예방접종된 동물을 구별하는 방법은 말, 암소, 양, 돼지, 염소, 개 또는 고양이를 포함하나, 이에 한정되지 않는 가정용 포유동물로부터 분리된 생물학적 시료에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 닭을 포함하는 가금류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 사람이다.
실시예
다음의 실시에는 본 발명의 특정 구현예뿐만 아니라 모든 구현예를 예증하므로, 본 발명의 영역을 한정하는 것으로 고려되지 않아야 한다.
실시예 1: 벡터 구축물
벡터를 전이막/세포질성 테일이 결실된 HeV G 또는 NiV G를 발현하도록 구축하였다. 완전한 길이의 HeV 또는 NiV G 단백질의 클로닝된 cDNA를 PCR로 증폭시켜 전이막 도메인/세포질성 테일-결실된 HeV 또는 NiV G 단백질을 암호화하는 약 2600개의 뉴클레오타이드의 단편을 생성시켰다.
다음의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 HeV G의 증폭을 위해 합성하였다. sHGS: 5'-GTCGACCACCATGCAAAATTACACCAGAACGACTGATAAT-3' (서열번호 5). sHGAS: 5'-GTTTAAACGTCGACCAATCAACTCTCTGAACATTGGGCAGGTATC-3'. (서열번호 6).
다음의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 NiV G의 증폭을 위해 합성하였다. sNGS: 5'-CTCGAGCACCATGCAAAATTACACAAGATCAACAGACAA-3' (서열번호 7). sNGAS: 5'-CTCGAGTAGCAGCCGGATCAAGCTTATGTACATTGCTCTGGTATC-3'. (서열번호 8).
모든 PCR 반응을 다음의 설정과 함께 아쿠폴(Accupol) DNA 폴리머라제(제조원: PGS Scientifics Corp)를 사용하여 수행하였다: 초기에 94℃에서 5분에 이어서 94℃에서 1분, 56℃에서 2분, 72℃에서 4분; 25 주기. 이들 프라이머는 Sal 1 부위에 의해 플랭킹된 sHeV G ORF 및 Xho 1 부위에 의해 플랭킹된 sNiV G ORF에 대한 PCR 생성물을 생성하였다. PCR 생성물을 겔 정제(제조원: Qiagen)하였다. 겔을 정제한 후, sHeV G 및 sNiV G를 TOPO 벡터(제조원: Invitrogen)내로 아클로닝(subcloning)하였다.
PSectag2B(제조원: Invitrogen)를 구입하고 S-폴리펩타이드 태그(Tag) 또는 myc-에피토프 태그를 함유하도록 변형시켰다. S-폴리펩타이드 및 분해된 Kpn 1 및 EcoR1 오버행에 대한 서열을 암호화한 오버랩핑된 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.
SPEPS: 5'-CAAGGAGACCGCTGCTGCTAAGTTCGAACGCCAGCACATGGATT
CT-3' (서열번호 9). SPEPAS: 5'AATTAGAATCCATGTGCTGGCGTTCGAACTT
AGCAGCAGCGGTCTCCTTGGTAC-3'. (서열번호 10).
myc-에피토프 태그 및 분해된 Kpn 1 및 EcoR1 오버행에 대한 서열을 암호화한 오버랩핑된 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.
MTS: 5'-CGAACAAAAGCTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3' (서열번호 11). MTAS
5'-AATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGCTTTTGTTCGGTAC-3' (서열번호 12).
64 ρmol SPEPS 및 64 ρmol SPEPAS를 혼합하고 65℃에서 5분 동안 가열하고 50℃로 서서히 냉각시켰다. 64 ρmol MTS 및 64 ρmol MTAS를 혼합하고 65℃로 5분 동안 가열하고 50℃로 서서히 냉각시켰다. 2개의 혼합물을 희석시키고 Kpn1 - EcoR1 분해된 PSectag2B내로 클로닝하여 S-폴리펩타이드 변형된 PSectag2B 또는 myc-에피토프 변형된 PSectag2B를 생성하였다. 모든 구축물을 제한 분해에 의해 초기에 스크리닝하고 서열분석에 의해 추가로 입증하였다.
TOPO sG 구축물을 정제되고 S-폴리펩타이드 변형된 PSectag2B 또는 myc-에피토프 변형된 PSectag2B의 Xho 1 부위내로 프레임내(in frame)내로 아클로닝된 Sal 1 겔(제조원: Qiagen)로 분해하였다. 모든 구축물을 제한 분해에 의해 초기에 스크리닝하고 서열분석에 의해 추가로 입증하였다.
이후에, Igκ 리더-S-폴리펩타이드-S-HeVG(sGS -태그) 및 Igκ 리더-myc 태그-sHeVG(sGmyc-태그) 구축물을 백시니아 셔틀 벡터(vaccinia shuttle vector) pMCO2내로 아클로닝하였다. 올리고뉴클레오타이드 SEQS: 5'-TCGACCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTA-3' (서열번호 13)를 합성하고 올리고뉴클레오타이드 sHGAS와 함께 사용하여 PCR에 의해 sGS -태그 및 sGmyc -태그를 증폭시켰다. 모든 PCR 반응을 아큐폴 DNA 폴리머라제(제조원; PGS Scientifics Corp.)를 사용하여 다음의 설정으로 수행하였다: 초기에 94℃에서 5분에 이어서 94℃에서 1분, 56℃에서 2분, 72℃에서 4분; 25 주기. 이들 프라이머는 Sal 1 부위에 의해 플랭킹된 PCR 생성물을 생성하였다. PCR 생성물을 겔 정제하였다(제조원: Qiagen). 겔 정제 후, sGS-태그 및 sGmyc -태그를 TOPO 벡터(제조원: Invitrogen)내로 아클로닝하였다. sG S-태그 및 sG myc-태그를 Sal 1로 분해하고 pMCO2의 Sal 1 부위내로 아클로닝하였다. 모든 구축물을 초기에 제한 분해로 스크리닝하고 서열분석으로 추가로 입증하였다. 코돈 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 후속적으로 생성하여 서열번호 16에 묘사된 진핵 세포주내에서의 생산을 촉진하였다.
크로모스 인공 염색새 발현(Chromos artificial chromosome expression: ACE) 시스템을 사용한 CHO 세포내에서 헨드라 sG 단백질의 발현을 위해, 헨드라 sG 단백질을 암호화하는 DNA를 Pfx 폴리머라제(제조원: Invitrogen)를 사용하는 PCR에 의해 제조업자의 지시사항에 따라 증폭시켰다. 주형은 pCDNA 헨드라 sG(S-폴리펩타이드 태그 없음)이었다. DNA를 증폭시키는데 사용된 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 다음과 같다: 5'- GATATCGCCACCATGGAAACCGACACCCTG-3' (서열번호 18) 및 5'- GGTACCTCAGCTCTCGCTGCACTG-3' (서열번호 19). 단편의 겔 정제를 QiaQuick 겔 추출(제조원: Qiagen)을 사용하여 제조업자의 지시사항에 따라 수행하였다. 이후에, PCR 생성물을 Zero Blunt®TOPO®(제조원: Invitrogen)내로 연결하고 연결 혼합물을 1개의 숏 막스 효능 세포(Shot Max efficiency cell)(제조원: Invitrogen)내로 형질전환시켰다. 양성 형질전환체로부터의 DNA를 정제하고, sG 삽입물을 KpnI 및 EcoRV를 사용하여 절개하여, ACE 시스템 표적화 벡터(ATV)인 pCTV927 내로 연결시켰다. 이후에, 연결 반응물을 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) OmniMax 세포(제조원: Invitrogen)내로 형질전환시켰다. 양성 클론의 확인에 이어서, pCTV927/헨드라 sG T1 플라스미드를 분리한 후, 삽입체를 서열분석으로 확인하였다.
실시예 2: CHO 세포를 사용한 가용성 G 단백질의 단백질 생산
세인트 루이스(St. Louis)로부터의 차이니즈 햄스터 난소(CHO) ChK2 세포를 해동시키고 CD-CHO 배지(제조원: Invitrogen) 및 6mM 글루타막스(제조원; Gibco)를 함유하는 멸균 125mL 플라스크내로 이전시키고, 계대배양에 적용시켰다. 형질감염 1시간 전에, 배양 배지를 제거하고 신선한 ChK2 부착 배양 배지로 대체시켰다. pCTV927/헨드라 sG T1 플라스미드를 분리하고, 에탄올 침전시키고, 0.85㎍/μL의 농도로 재현탁시켰다. 부착 세포를 ACE 인테그라제(pSI0343) 및 pCTV927/헨드라 sG T1과 LipofectamineTM 2000(제조원: Invitrogen)으로 제조업자의 지시에 따라 OptiMEM I(제조원: Gibco)을 사용하여 동시-형질감염시켰다. ACE 인테그라제는 박테리오파지 람다 DNA로부터 증폭되지만, 포유동물 발현을 위해 최적화된 인테그라제 유전자로 이루어진다. 배양물을 37℃/5% CO2에서 신선한 ChK2 부착 배지와 함께 밤새 배양하였다. 다음 날, 배양 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 조심스럽게 세척한 후, 2mL의 트립신 용액을 첨가하여 세포를 탈착시키고, 추가의 4mL의 신선한 ChK2 부착 배지를 첨가하였다. 이후에, 세포를 96-웰 플레이트 속에서 제한된 일련의 희석에 적용시킨 후 96-웰 플레이트 속에 침착시킨지 24시간째에 2mg/mL 하이그로마이신을 사용하여 선택하였다.
조심스럽게 모니터링한지 17일 후, 80개의 개개 형질감염된 클론을 선택하여 1mL의 6mM 글루타막스(제조원: Gibco) 및 0.1mg/mL의 하이드로마이신(유지 선택 배지)을 함유하는 CD-CHO(제조원: Invitrogen)가 들어있는 24-웰 플레이트내로 분배하였다. 4일 후, 클론을 유지 선택 배지를 사용하여 하기 나타낸 바와 같이 새로운 24개 플레이트내로 분할하였다. 500μL의 현탁 배지를 각각의 발현 플라스크로부터 제거하고, 500 xg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 깨끗한 새로운 튜브에 이전시키고 -20℃에서 동결시켰다. 모든 상층액을 후에 해동시키고 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 NuPAGE® Novex® 비스-트리스 미니 겔(제조원: Invitrogen)을 사용하여 적용시켰다. 겔 염색을 위한 1개 및 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 위한 다른 것을 포함하는, 각각의 시료에 대한 2개의 세트를 수행하였다. 겔의 제2 세트를 iBlot® 겔 전달 장치(제조원: Invitrogen)를 사용하여 니트로셀룰로즈내로 이전시켰다. 항-G 단백질 폴리클로날 항체를 일차 항체로 사용한 후, 퍼옥시다제-접합된 친화성 정제된 항-토끼 IgG 항체(제조원: Rockland)를 사용하였다. 이후에, 블롯(blot)을 TMB 막 퍼옥시다제 기질(KPL)을 첨가하여 전개하였다. G 단백질의 발현을 확인하였다.
실시예 3: 백시니아를 사용한 가용성 G 단백질의 단백질 정제
단백질 생산을 위해, 코돈 최적화된 서열을 함유하는 유전 구축물을 사용하여 재조합체 폭스바이러스 벡터(백시니아 바이러스, 균주 WR)를 생성하였다. 이후에, 재조합체 폭스바이러스를 tk-선택 및 GUS 염색을 사용하는 표준 기술을 사용하여 수득하였다. 요약하면, CV-1 세포를 pMCO2 sHeV G 융합물 또는 pMCO2 sNiV G 융합물로 인산칼슘 형질감염 키트(제조원: Promega)를 사용하여 형질감염시켰다. 이후에, 이들 단층을 0.05 PFU/세포의 감염 다중도(MOI)에서 백시니아 바이러스의 웨스턴 리버스(Western Reserve: WR) 야생형 균주로 형질감염시켰다. 2일 후에 세포 펠렛(pellet)을 조 재조합체 바이러스 스톡으로서 수집하였다. TK- 세포를 25μg/mL의 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU)(제조원: Calbiochem)의 존재하에 재조합체 조 스톡으로 형질감염시켰다. 2시간 후 바이러스를 1% 저 융점(LMP) 아가로즈(제조원: Life Technologies) 및 25μg/mL BrdU를 함유하는 EMEM-10 오버레이(overlay)로 대체하였다. 2일의 항온처리 후 1% LMP 아가로즈, 25mg/mL BrdU, 및 0.2mg/mL의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠론산(X-GLUC)(제조원: Clontech)을 함유하는 추가의 EMEM-10 오버레이를 가하였다. 24 내지 48 시간내에 청색 플라크(plaque)가 명확해졌으며, 이를 집어올려 2회 이상의 라운드의 이중 선택 플라크 정제에 적용시켰다. 이후에, 재조합체 백시니아 바이러스 vKB16(sHeV G 융합물) 및 vKB22(sNiV G 융합물)를 증폭시키고 표준 방법으로 정제하였다. 요약하면, 재조합체 백시니아 바이러스를 플라크 정제, 세포-배양물 정제, 한외원심분리 속에서 슈크로즈 쿠션 펠렛팅 및 플라크 검정에 의한 적정으로 정제하였다. sHeV G의 발현을 세포 분해물 및 배양 상층액 속에서 입증하였다.
실시예 4: 293F 세포를 사용한 가용성 G 단백질의 단백질 생산
코돈 최적화된 서열을 함유하는 유전 구축물을 사용하여 293F 세포(제조원: Invitrogen)를 형질전환시켜 HeV 가용성 G 당단백질을 발현하는 안정한 세포주를 생산하였다. CHO-S 세포(제조원: Invitrogen)를 또한 HeV 가용성 G 당단백질의 형질전환 및 발현을 위해 사용할 수 있다. 형질전환된 세포를 35mL의 DMEM-10을 함유하는 162 cm2의 조직 배양 플라스크 위에서 플레이팅하였다. 세포를 부착되도록 하고 37℃에서 5 내지 8% CO2와 함께 수일 동안 성장시켰다. 세포가 합치성이 되면, 이들을 DMEM-10과 150㎍/mL의 하이그로마이신 B(플라스크당 30mL)가 들어있는 다중 플라스크내로 분할시켰다. 세포가 70 내지 80%의 합치성이 되면, 이들을 30mL의 PBS로 2회 세척한 후, 20mL의 293 SFM II(제조원: Invitrogen)를 가하고 세포를 37℃에서 5 내지 8%의 CO2와 함께 밤새 항온처리하였다. 다음 날, 세포를 200mL의 SFM II 배지가 들어있는 에를렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask)내로 이전시켰다. 세포를 37℃에서 5 내지 8%의 CO2와 함께 125rpm에서 5 내지 6일 동안 세포가 사멸하기 시작할 때까지 성장하도록 하였다. 이때, 상층액을 수집하였다.
각각의 에를렌마이어 플라스크로부터의 배지를 3,500rpm에서 30분 동안 원심분리하였다. 이후에, 상층액을 250mL의 원심분리 병내로 이전시키고 10,000rpm에서 1시간 동안 회전시켰다. 수득되는 상층액을 수집하고 프로테아제 억제제를 제조업자의 추천에 따라 트리톤 X-100과 함께 0.1%의 최종 농도로 가한다. 이후에, 상층액을 0.2μm의 저 단백질 결합 여과기 막을 통해 여과하였다.
HeVsG를 S-단백질 아가로즈 친화성 컬럼의 사용을 통해 정제한다. 20mL의 층 용적(bed volume)의 S-단백질 아가로즈(제조원: Novagen)를 XK 26 컬럼(제조원: GE Healthcare)내로 로딩(loading)하였다. 컬럼을 10x 층 용적의 결합/세척 완충액(0.15M NaCl, 20mM 트리스-HCl, pH 7.5 및 0.1% 트리톤 X-100)으로 세척하였다. HeV sG의 제조된 상층액을 컬럼에 적용시켜 3mL/분의 유동 속도를 유지시켰다. 컬럼을 10x 층 용적(200mL)의 결합/세척 완충액 I에 이어 6x 층 용적(120mL)의 세척 완충액 1x 세척 완충액(0.15M NaCl, 및 20mM 트리스-HCl, pH 7.5)으로 세척한다.
이후에, 펌프를 정지시키고 30mL의 용출 완충액(0.2M 시트르산, pH 2)이 첨가되는 경우 세척 완충액이 비드(bead)의 표면에 이를 때까지 배수시켰다. 제1의 10mL의 유동 통과물(이는 여전히 세척 완충액일 수 있다)을 수집한 후 용출 완충액을 비드와 함께 10분 동안 항온처리하였다. 다음에, 15mL의 용출물을 25mL의 중화 완충액(1M 트리스, pH 8)을 함유하는 50mL의 멸균 원뿔 원심분리 튜브내로 수집하였다. pH를 중성으로 조절하고 용출 및 항온처리를 3회 반복하였다. 모든 중화된 용출물을 합하고 약 4mL로 원심분리하였다. 수집된 HeV sG(4mL)를 0.2μm의 저 단백질 결합 여과기 막(0.2μm HT 투프린 막을 사용한 Acrodisc 13 mm 주사기 여과기)을 통해 정제하였다.
겔 여과를 이용하여 HeV sG를 추가로 정제할 수 있다. 품질 조절 분석 및 순도와 올리고머 상태의 확인 후, 4량체+2량체, 2량체 및 단량체의 분취량 HeV sG 혼주된 분획(pooled fraction)을 -80℃에서 저장하였다.
실시예 5: CHO HeV sG 단백질의 감마 조사(gamma irradiation)
CHO HeV 마스터 세포 씨드 스톡(master cell seed stock)을 해동시키고, 진탕 플라스크 속에서 4회 연속 계대배양으로 확장시켰다. 수거된 물질을 생물반응기 속에서 3회 연속 계대배양에 의해 8x106개의 세포/mL의 최종 세포 밀도로 확장시켰다. 세포를 원심분리(달리는 이는 심층 여과에 의해 수행할 수 있었다)로 제거하였다. 수득되는 명확해진 HeV sG 배양 물질을 이후에 아스코르브산과 0.2%(w/v)의 최종 농도로 혼합하고, 50 kGray의 누적 선량(dose)을 위해 Co-60 감마 조사원(irradiation source)에 적용시켰다.
실시예 6: 백신 제형의 제조
ISC의 제조를 도 3에 나타내고 하기에 추가로 기술한다.
단계 1: 90g/L의 데카노일-n-메틸글루카미드(메타-10 세제)의 용액을 주사용 수-(WFI) 속에서 제조한다. 용액을 가열하여 메가(Mega) 10의 전체 용해를 보증한 후 단계 2에서 즉시 사용하거나 여과기 멸균하였다.
단계 2: 25g/L의 콜레스테롤 및 25g/L의 디팔미토일 포스파티딜 콜린(DPPC)을 함유하는 용액을, 이들 성분을 메가 10 세제의 스톡 용액 속에 용해함으로써 제조한다. 당해 용액을 가열하여 모든 성분을 용해한 후 단계 3에서 즉시 사용하거나 여과기 멸균시킨다.
단계 3: 완충된 등장성 염수, 10mM 인산염 완충액, pH 6.2 ± 1(BIS)을 WFI로 제조하고 즉시 사용하지 않을 경우 멸균 여과한다.
단계 4: Quil A를 BIS 속에서 100g/L의 최종 농도로 제조하고 즉시 사용하지 않을 경우 멸균 여과한다.
단계 5: ISC를 메가-10 용액(160mL/L), 및 Quil A 용액(200mL/L) 속에서 예비-가열된 BIS, 콜레스테롤/DPPC의 연속 첨가에 의해 교반되고 온도 조절된 용기(22 내지 37℃) 속에서 제형화한다. 반응물을 BIS를 첨가하여 표적 용적이 되도록 한다.
단계 6: 전체 제형을 요구된 온도(허용되는 작동 범위 22-37℃를 사용한 표적 27℃)로 평형화시킨 후 15분 동안 교반하면서 항온처리하여 ISC 형성을 촉진한다. ISC 용액을 단계 7에서 추가로 가공하거나 중간 저장을 위해 멸균 여과한다.
단계 7: ISC 반응 혼합물을 온도 조절(허용되는 작동 범위 21 내지 37℃를 갖는 표적 27℃) 하에 BIS에 대한 최소 20 용적의 교환을 위해 투석(막: 하이드로사르트 30kDa(제조원: Sartorius AG Goettingen))에 의해 세척하여 복합체화되지 않은 성분을 제거한다.
단계 8: 투석된 ISC를 투석에 사용된 것과 동일한 막을 사용하는 한외-여과에 의해 약 2배 농축시킨다. 여과 시스템을 BIS로 세정하여 ISC를 원래의 용적으로 재저장한다.
단계 9: ISC를 멸균 저장 용기로 0.22μm의 셀룰로즈 아세테이트 여과기를 통한 멸균 여과를 통해 멸균 저장 용기로 이전시킨다.
단계 10: ISC 항원보강제를 백신 제형에서 사용하기 위해 방출할 때까지 2 내지 8℃에서 저장한다.
이후에, 면역자극성 조성물(250㎍/mL)을 적절한 양의 가용성 HeV G 당단백질(예를 들면, 5, 50, 100㎍/mL)과 합하고 BIS 속에서 용적으로 조절한다.
실시예 7: 말에서 제1 임상 실험
시험 백신 1: 250㎍의 면역 자극 복합체가 보조된 100㎍/투여량에서 재조합체 헨드라 바이러스 가용성 당단백질(sG); 용적은 염수 용액으로 1mL/투여량으로 조절한다.
시험 백신 2: 250㎍의 면역 자극 복합체가 보조된 50㎍/투여량에서 재조합체 헨드라 바이러스 가용성 당단백질(sG); 용적은 염수 용액으로 1mL/투여량으로 조절한다.
시험 백신 3: 250㎍의 면역 자극 복합체로 보조된 5㎍/투여량에서 재조합체 헨드라 바이러스 가용성 당단백질(sG); 용적은 염수 용액으로 1mL/투여량으로 조절한다.
말로부터의 혈청학적 및 시험감염 보호 데이터를 보다 높은 수준의 항원(50㎍/투여량 및 100㎍/투여량)을 함유하는 백신을 제공한 말의 2개의 로트(lot)로부터 수집하였다.
혈청학: 2마리의 말을 2개의 백신 투여량(100㎍ sG와 ISC)을 사용하여 21일 간격으로 각각 면역화시켰다. 프라이밍 후 및 시험감염 전 혈청학을 HeV에 대한 백신-유도된 혈청전환으로 확인하였다(표 1). 시험감염 전 바이러스 중화 항체 수준은 밀접하게 관련된 니파 바이러스의 다른 치사 투여량에 노출된 고양이에서 보호성인 것으로 밝혀진 것과 비교할 수 있었다. 항원보강제만을 제공한 말(음성 대조군)은 바이러스 시험감염 전에 HeV에 대한 항체를 생성하지 않았다.
[표 1]
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따라서, 각각의 말은 증강 면역화를 수용한 후 27일째에 BSL4 봉쇄 시설에서 살아있는 HeV에 노출시켰다. 바이러스를 비강내(1x10 6 TCID50) 및 경구(1x10 6 TCID50) 투여하였다. 시험감염 시점에서 및 이후 관찰 기간 동안, 대조군 말의 실체는 작업의 당해 부분에 관여하는 관리자가 알지 못하였다.
V1에 대한 임상 관찰: 당해 말은 시험감염 후 8일째에 주목된 내재하는 경정맥 카테터(catheter)의 도입 부위의 국재화된 감염으로부터 떨어져서 HeV에 노출시킨 후 관찰 기간 동안 임상적으로 잘 남아있었다. 이는 질병의 어떠한 구성적 신호와 관련되지 않았다. 말을 바이러스 시험감염 후 9일째에 선택적으로 안락사시켰다. 전체적인 사후 실험시 비정상은 10cm 장간막 지방종(우연한 발견) 및 바르비투레이트에 기여된 좌측 심장 폐엽의 복부 끝에서 림프관의 약간의 확장으로 국한되었다. 조직의 초기 스크리닝은, 당해 말에서 병변 또는 HeV 항원의 증거가 없음을 발견하였다.
V2에 대한 임상적 관찰: 당해 말은 3일째에 온화한 일시적인 비강 흐름으로 진행되었으나, 이후 온도가 이의 내재하는 경정맥 카테터의 부위에서 국재화된 염증성 반응과 관련하여 6일째에 온도가 상승할 때까지 달리 잘 남아있었다. 카테터를 제거하였으나, 병변은 지속적으로 확장되었고 말은 다음 날(7일째) 등에 매우 자극적으로 되어서 암말을 장기 작용하는 페니실린으로 치료하였다. 암말의 체온 및 암말의 치료 둘 다는 8일째에 정상으로 회복시켰고 암말을 선택적으로 안락사시켰다. 전체적인 사후 실험시 비정상은 바르비투레이트에 기인한 우측 심장 폐엽의 복부 끝에서 림프관의 약간의 확장으로 국한되었다. 조직의 초기 스크리닝은, 당해 말에서 병변 또는 HeV 항원의 증거가 없음을 발견하였으며; 상세한 실험이 현재 완료중에 있다.
V3에 대한 임상적 관찰: 당해 말은 4일째에 약간의 일시적인 비강 방출로 진행되었으나, 이후 체온이 국소 신호없이 6일째에 상승할 때까지 달리 잘 남아있었다. 말의 심박수가 또한 상승하였으며, 말은 약간의 탈수 및 파묻히는 외관(tucked-up appearance)과 일치하여 피부의 약간의 텐팅(tenting)을 가졌다. 이러한 신호의 무리는 본 발명자들의 실험실 조건하에서 대표적인 급성 HeV 감염이다. 암말의 온도 및 심박수는 뒤이은 12시간에 걸쳐 지속적으로 증가하였고(도 1 및 2), 암말은 약간 우울해졌으므로, 암말을 7일째에 인도적인 차원에서 안락사시켰다. 사후 실험시, 늑막 비후화 및 부종을 동반한 복부 8 내지 10cm가 관여된 폐의 심장엽에서 림프관의 중간 정도로 심각한 확장이 존재하였다.
조직학적 실험시, 혈관벽의 피브리노이드 괴사, 소엽간 격막의 부종 및 중심 괴사 폐포염을 갖는 폐 맥관염이 존재하였다. 폐내 혈관의 내피 및 중막; 수막; 뇌 유조직; 삼차 신경절; 턱밑, 기관지, 사타구니 및 신장 림프절; 비장; 간; 심장; 연구개; 부신; 신부전; 소장 및 대장; 난소; 인두 및 비개골 및 비장 및 또한 때때로 심장 근세포내 배중심에서 HeV 항원의 대규모 침착이 존재하였다. 척수, 후두낭, 방광, 및 뇌의 후각 목은 음성이었다. 조직학 및 면역조직학은 과급성 HeV 감염과 일치하였다.
임상 시료의 분자 분석. 임상 관찰 기간 전체에서 면역화된 말 V1 및 V2로부터 수집된 임의의 생물학적 시료의 HeV의 쉐딩에 대한 증거는 존재하지 않았다. 구체적으로, 노출 후 어떠한 날에도 심부 비강 면봉으로부터 또는 혈액으로부터 회수된 게놈은 없었다.
대조적으로, 면역화되지 않은 말 V3에서, 바이러스 게놈이 시험감염 3일째로부터 비강 면봉에서 검출되었다. 성공적인 시료채취 일에 감소하는 Ct 값은 상부 호흡관내 바이러스 복제를 제안하며 HeV Redlands 2008에 나이브(naive) 말의 노출 후 본 발명자의 실험실로부터의 앞서의 관찰과 일치한다. 열의 발생 직전 혈액, 및 우울증과 같은 다른 임상 신호의 최초의 인지와 일치하는, 이후 모든 분비물에서 바이러스 게놈의 발견은 또한 이전 관찰과 일치한다.
[표 2]
시험감염 상 동안의 시료 분석 결과
Figure pct00002
시료를 시험감염 날로부터, 동물을 마취시키고 헨드라 바이러스 N 유전자의 존재에 대해 검정한 태크만(TaqMan) PCR에 의해 분석한 날까지 취하였다. -는 음성(증폭 없음)을 의미하고, +/-는 규정할 수 없음(CT = 40 내지 45)을 의미하며, +는 양성(CT <40, 괄호안의 값)을 의미하고, N/A는 이용가능한 결과가 없음을 의미한다.
부검 후 시료. 태크만 PCR(HeV N-유전자)은 다수의 조직에 대한 감염의 전파와 함께 V3(대조군)에서 시험감염 바이러스의 복제를 확인하였다(표 3). 최대 수준의 복제는 앞서 보고한 바와 같은 상부 및 하부 호흡관과 관련된 폐, 비장, 신장, 심근, 및 림프 조직에 존재하는 것으로 여겨졌다. 면역화된 말(V1 및 V2)의 조직내 바이러스 복제의 증거는 없었다.
[표 3]
헨드라 바이러스 N-유전자 태크만 결과
Figure pct00003
사후 조직 시료를 각각의 동물로부터 취하여 헨드라 바이러스 N 유전자의 존재에 대해 검정한 태크만 PCR에 의해 분석하였다. -는 음성(증폭 없음)을 의미하고, +/-는 규정할 수 없음(CT = 40 내지 45)을 의미하며, +는 양성(CT <40, 괄호안의 값)을 의미하며, ND는 수행되지 않음을 의미하고, N/A는 시료의 결여로 인하여 이용가능하지 않은 결과를 의미한다.
시험감염 후 혈청학. 면역화된 말 V1 및 V2는 HeV 시험감염 후 역가에 있어서 증강을 갖지 않았다(표 4). 이는, 이들 동물에서 시험감염 바이러스의 유의적인 복제가 없는 것과 일치한다. 시험감염 후 7일째 마취 시기에 대조군 말 V3에서 항체는 검출되지 않았다. 검출가능한 항체의 생성을 위해 바이러스 노출과 당해 동물의 사멸 사이의 불충분한 시간이 존재하였다고 고려하였으며 이는 말에서 HeV 레드랜드(Redland)를 사용한 본 발명자들의 앞서의 관찰과 일치한다.
[표 4]
Figure pct00004
프라임-증강 요법에서 100㎍ sG + ISC 항원보강제로 예방접종한 2마리의 말(V1 및 V2)은 HeV 노출 이전에 HeV에 대해 혈청변환되었다. ISC만을 제공받은 1마리의 말(V3)이 시험감염 바이러스에 대해 혈청음성으로 남았다.
기타의 치사 투여량의 HeV를 사용한 시험감염 후, 면역화된 말은 관찰 기간 전체에서 임상적으로 잘 남아있었으며, 이는 말에서 HeV의 모든 실험적으로 유도된 경우의 발병의 시기를 능가하였다. 면역성의 혈청학적 증거가 없는 말(V3)을 급성 HeV와 일치하는 임상 신호를 발현한 후 마취시켰다. 항체 역가의 증강은 면역화된 말에서 시험감염 후 검출되지 않았으며, 이는 이들 동물에서 시험감염 바이러스의 복제가 없다는 것과 일치한다.
모든 매일의 임상 시료에 있어서 PCR 음성 시험 결과에 의해 반영된 바와 같이, 면역화된 말에 의한 바이러스 쉐딩의 증거는 존재하지 않았다. 면역화되지 않은 대조군에서, 바이러스 게놈이 바이러스에 노출된 지 3일 후에 비강 면봉, 열의 발생 직전 혈액, 및 열이 확립된 시간으로부터의 모든 임상 시료속에서 검출되었다. 쉐딩의 이러한 패턴은 당해 시설에서의 이전 연구에서 HeV에 노출된 나이브 말에서 발견된 것과 일치한다.
급성 감염의 기간인 것으로 예측될 수 있는 기간 동안 안락사 이후, 사후 실험에서 수집된 면역화된 말의 어떠한 조직에서도 HeV 바이러스 복제의 증거가 없었다. 대조적으로, HeV 게놈 및 항원은 급성 HeV 감염과 일치하는 패턴으로 대조군 말의 조직 전체에 분포하였으며, HeV 감염의 대표적인 맥관병이 또한 확인되었다.
실시예 8: 말에서 제2의 임상 시험
3마리의 말을 2개의 백신 투여량(50㎍ sG와 ISC)으로 21일 간격으로 각각 면역화시켰다. 프라이밍 후 및 시험감염 전 혈청학은 HeV에 대한 백신-유도된 혈청전환을 입증하였다(표 5). 시험감염 전 바이러스 중화 항체 수준을 밀접하게 관련된 니파 바이러스의 기타의 치사 투여량에 노출된 고양이에서 보호성인 것으로 밝혀진 것 및 본원에 기술된 제1 임상 시험에서 HeV에 노출된 말과 비교가능하였다. 항원보강제만을 제공받은 말은 면역화된 말의 바이러스 시험감염 전에 HeV에 대해 항체를 생성하지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
[표 5]
Figure pct00005
따라서, 각각의 면역화된 말을 증강 면역화를 제공한 후 27일째에 BSL4 봉쇄 시설내에서 살아있는 HeV에 노출시켰다. 바이러스를 비강(1x106 TCID50) 및 경구(1x106 TCID50)로 투여하였다. 4마리의 기니아 피그(guinea pig)를 이들 중 적어도 하나가 HeV 질병에 대해 굴복할 수 있다는 예측과 함께 병원성 대조군으로서 본 연구에 사용하였다. 기니아 피그를 복강내 경로에 의해 50,000 TCID50 HeV에 노출시켰다.
V4에 대한 임상적 관찰: 당해 말은 HeV에 대한 노출 후 관찰 기간 동안에 임상적으로 잘 남아있었으며 체온 및 심박수가 정상 한계치내로 남았다. 말을 바이러스 시험감염 후 8일째에 선택적으로 안락사시켰다. 전체적인 사후 실험에서 비정상은 나타나지 않았다. 조직의 초기 스크리닝은 당해 말에서 병변 또는 HeV 항원의 증거가 없음을 발견하였으며; 상세한 실험이 현재 완료되고 있다.
V5에 대한 임상적 관찰: 당해 말은 HeV에 대한 노출 후 관찰 기간 동안에 임상적으로 잘 남아있었으며 체온 및 심박수가 정상 한계치내로 남았다(도 2). 말을 바이러스 시험감염 후 7일째에 선택적으로 안락사시켰다. 전체적인 사후 실험에서 비정상은 주목되지 않았다. 조직의 초기 스크리닝은 당해 말에서 병변 또는 HeV 항원의 증거가 없음을 발견하였으며; 상세한 실험이 현재 완료중에 있다.
V6에 대한 임상적 관찰: 당해 말은 HeV에 대한 노출 후 관찰 기간 동안에 임상적으로 잘 남아있었으며 체온 및 심박수가 정상 한계치내로 남았다(도 2). 말은 바이러스 시험감염 후 9일째에 선택적으로 안락사시켰다. 전체적인 사후 실험에서 비정상은 나타나지 않았다. 조직의 초기 스크리닝은 당해 말에서 병변 또는 HeV 항원의 증거가 없음을 발견하였으며; 상세한 실험이 현재 완료되고 있다.
기니아 피그: 4마리의 기니아 피그 중 한마리(3번)는 HeV 시험감염 후 3일째에 체중 감소가 시작되었다. 체중 감소는, 동물이 신경학적 신호(머리 기울기, 떨림)을 나타낸 5일까지 진행되었고 안락사되었다. 사후 실험에서 비정상은 복막후 연결 조직의 부종에 대해 확인되었다.
조직학적 실험에서 폐 맥관염, 말초 신장 혈관의 혈관염, 난소염, 및 HeV 항원의 침착과 관련된 비-화농성 뇌염이 존재하였다. 조직학 및 면역 조직학은 급성 HeV 감염과 일치하였으며 시험감염 바이러스의 병원성을 입증하였다.
36.2의 Ct 값(HeV N 유전자)이 증폭을 잘 나타내지 않은 제2 웰(well)을 지닌 2개의 복제 웰 중 하나에서 태크만 PCR에 의해 관찰된 3일째에 V6으로부터의 직장 면봉으로부터 떨어져서 임상적 관찰 전체에서 V4, V5 또는 V6으로부터 수집된 임의의 생물학적 시료에서 HeV의 쉐딩에 대한 증거는 존재하지 않았다(표 6). 구체적으로, 노출 후 어느 날에의 심부 비강 면봉 또는 혈액으로부터 회수된 게놈은 없었다.
[표 6]
헨드라 바이러스 N-유전자 태크만 결과
Figure pct00006
시료는 시험감염 날로부터 동물을 안락사시키고 헨드라 바이러스 N 유전자의 존재에 대해 검정한 태크만 PCR에 의해 분석한 날까지 취하였다. -는 음성(증폭 없음)을 의미하고, +/-는 규정할 수 없음(CT = 40 내지 45)을 의미하며, +는 양성(CT <40, 괄호안의 값)을 의미하고, * 결과는, 전, 후의 시료 및 동일한 날의 다른 시료가 모두 음성이므로 규정할 수 없는 것으로 고려하였고, N/A는 시료의 결여로 인하여 이용가능한 결과가 없음을 의미한다.
부검 후 시료. 면역화된 말 V4, V5 또는 V6의 조직에서 바이러스 복제의 증거는 없었다. 1마리의 기니아 피그(3번)에서, 바이러스 게놈은 당해 동물에서 급성 HeV 감염의 임상적, 조직학적 및 면역조직학적 발견을 입증하는 시험감염 후 5일째의 혈액(Ct 34.2), 뇌, 폐 및 비장에서 검출되었다(표 7).
[표 7]
헨드라 바이러스 N-유전자 태크만 결과
Figure pct00007
사후 조직 시료를 각각의 동물로부터 취하여 헨드라 바이러스 N 유전자의 존재에 대해 검정한 태크만 PCR에 의해 분석하였다. -는 음성(증폭 없음)을 의미하고, +/-는 규정할 수 없음(CT = 40 내지 45)을 의미하며, +는 양성(CT <40, 괄호안의 값)을 의미하고, ND는 수행되지 않음을 의미하며, N/A는 시료의 결여로 인하여 이용가능한 결과가 없음을 의미한다.
시험감염 후 혈청학. 면역화된 말 V4, V5 및 V6은 HeV 시험감염 후 역가에 있어서 증강되지 않았다(표 8). 이는 이들 동물에서 시험감염 바이러스의 유의적인 복제가 없는 것과 일치한다.
[표 8]
Figure pct00008
부스트 요법 전 50㎍ sG + ISC 항원보강제로 예방접종된 3마리의 말(V4, V5 및 V6)을 HeV 노출 전에 HeV로 혈청전환시켰다. ISC 만을 제공받은 1마리의 말은 시험감염 바이러스에 대해 혈청음성으로 남았다.
기타의 치사 투여량의 HeV를 사용한 시험감염 후, 면역화된 말은 관찰 기간 전체에서 임상적으로 잘 남아있었으며, 이는 말에서 HeV의 모든 실험적으로 유도된 경우의 발병 시기를 능가하였다. 병원성 대조군으로 사용된 1마리의 기니아 피그는 급성 HeV와 일치하는 임상 신호가 발현된 후 안락사시켰다. 이들 동물에서 시험감염 바이러스의 복제가 없는 것과 일치하여, 면역화된 말에서 시험감염 후 항체 역가의 증강은 검출되지 않았다.
3일째에 V6으로부터의 직장 면봉으로부터의 1개의 복제물과 떨어진 모든 일일 임상 시료에 있어서 PCR 음성 시험 결과에 의해 반영된 바와 같이, 면역화된 말에 의한 바이러스 쉐딩의 증거는 없었다. 당해 시험은 반복되었으며; 관찰된 유사한 결과일 수 있으며, 한가지 설명은, 이것이 낮은 수준의 잔류 접종물을 나타낸다는 것이다. 하나의 면역화되지 않은 기니아 피그에서, 바이러스 게놈은 주요 기관 및 혈액 속에서 바이러스에 노출된 지 5일째에 검출되었다.
급성 감염의 기간으로 예측될 수 있는 기간 동안의 사후 실험 이후 안락사시 수집된 면역화된 말의 어떠한 조직에서도 HeV 바이러스 복제의 증거는 존재하지 않았다. 대조적으로, HeV 게놈 및 항원은 급성 HeV 감염과 일치하는 패턴으로 민감성 기나아 피그의 조직 전체에 분포하였으며 HeV 감염의 대표적인 맥관병이 당해 동물에서 또한 확인되었다.
실시예 9: 말에 대해 헨드라 바이러스 백신을 사용한 대체 예방접종 요법의 평가
3개월령의 건강한 말을 당해 시험에 포함시켰다. 연구 군은 표 9에 요약해서 나타내었다.
[표 9]
Figure pct00009
*연구의 나머지 동안에, 일반적인 건강 관찰을 적어도 매 격일마다 수행하였다.
혈액을 0일째에 예방접종 전에 모든 말로부터 수집하여 말 헨드라 바이러스에 대한 노출 전으로부터 바이러스가 없음을 입증하였다. 또한, 혈액 시료를 80 및 91일째에 수집하였다. 헨드라 바이러스에 대한 항체의 검출은 인증된 실험실 과정을 사용한 혈청 중화 검정으로 검정하였다.
말을 지정된 연구일에 IVP로 예방접종하였다. IVP는 250g/투여량의 면역자극성 복합체(ISC)가 보조된 116g의 조사된 헨드라 바이러스 가용성 G 단백질(sG)로 이루어졌다. 백신의 투여량은 각각의 경우에 말당 1mL이었다.
예방접종 부위를 우선 80% 에탄올로 문질러서 이 부위가 깨끗하도록 보증하였다. 백신 투여는 개개의 3mL 고무가 없는 주사기 및 18G 1.5 인치 침을 사용하여 경험이 있는 수의사에 의해 수행되었다. 백신을 표준 수의학 과정에 따라, 모든 경우에 목의 좌측 부위의 중심에서 근육내 투여하였다.
유효 시험에 대한 기준은 다음과 같이 정의되었다: 1) 모든 말은 0일째에 예방접종 전에 임상적으로 정상이고; 2) 모든 말은 0일째에 말 헨드라 바이러스에 대한 항체가 없으며; 3) 대조군 군 T01에서 말은 연구 과정 전체에서 말 헨드라 바이러스에 대한 항체가 없이 잔류한다.
결과. 연구 과정 전체에서 백신에 대한 부작용으로 고생하는 것으로 보고된 동물은 없었다. 치료군 T02의 경우에, 모든 동물은 백신에 반응하여 80일째에 256 이상의 혈청 중화 역가(SNT)를 달성하였고 91일째에 SNT가 64 이상이었다. 치료군 T03의 경우, 모든 동물은 또한 백신에 반응하여, 80일째에 256의 SNT를 달성하였고, 91일째에 SNT는 32 이상이었다. 최종적으로, 치료군 T04의 경우, 모든 동물들은 백신에 반응하여, 80일째에 512 이상의 SNT를 달성하였고, 91일째에 SNT는 128 이상이었다.
결론적으로, 치료군 T02, T03 및 T04에서 모든 동물은 백신에 대해 반응하여 80일째에 256 내지 >1024의 SNT 및 91일째에 32 내지 2048의 SNT를 달성하였다. 당해 결과는, 3주 간격으로 2회 투여량(T02)으로부터 6주 간격의 2회 투여량(T03), 또는 4주 간격으로 3회 투여량(T04)으로부터의 말 헨드라 바이러스 백신의 백신 간격을 변화시키면, 최종의 투여량이 전달된 후 약 3주(24일)째에 말 헨드라 바이러스에 대해 혈청 중화 항체 반응을 생성함을 나타낸다. 말을 시험감염하여 3주 간격으로 2회 예방접종한 후 보호된 이전 효능 연구를 기반으로 하여, 현재 연구에서 80 및 91일째에 모든 3개의 예방접종 군(T02, T03 및 T04)에서 측정된 SNT는 말 헨드라 바이러스에 대해 동등하게 보호성인 것으로 예측될 수 있다.
실시예 10: 헨드라 바이러스 백신의 말에서 면역성의 기간
나이가 5 내지 14세인 임상적으로 건강한 말만을 당해 연구에 등록시켰다. 또한, 다음의 기준을 사용하여 당해 시험감염 연구를 위한 말을 선택하였다: 물리적 적합성(일반적인 건강, 심-호흡 기능, 발 및 사지의 통합성); 체온; 및 시험감염 전 낮은 항체 역가. 연구의 설계는 표 10에 나타낸다.
[표 10]
Figure pct00010
*혈액 시료는 이후 219일째로부터 1마리의 말로부터 수집하지 않았다.
봉쇄 시설의 제한과 관련한 구속으로 인하여, 살아있는 바이러스 및 감염된(예방접종되지 않은) 말과 작업하는 사람을 갖는 것과 관련된 위험, 및 동물 복지를 고려하여, 당해 연구는 연구의 시험감염 상 동안 표적 동물(말) 대조군없이, 동물만의 매우 작은 군을 이용하였다. 헨드라 바이러스를 사용하여 예방접종된 말을 시험감염함을 포함한 이전 실험 작업은 시험감염 모델의 효능을 지속적으로 입증하였으며, 후속적으로 흰담비를 병원성 대조군으로서 성공적으로 이용하여 왔다. 동일한 실험 설계를 당해 연구에서 시험감염 상 동안 대조군으로서 사용된 2마리의 흰담비와 함께 사용하여 시험감염 바이러스의 병원성을 확인하였다. 각각의 흰담비를 구비막 경로에 의해 50,000 TCID50 HeV에 노출시켰다. 흰담비 대조군에게 투여된 시험감염 바이러스는 말에게 투여된 것과 동일하였다.
시험감염을 위해, 조직 배양 상층액 속의 말 헨드라 바이러스의 병독성 용액을 제조하였다. 바이러스 배양물을 베로 세포(Vero cell) 속에서 성장시켰다. 시험감염의 아침에, 시험감염 물질을 다음의 과정에 따라 제조하였다: 조직 배양 상층액 속의 스톡 헨드라 바이러스의 분취량을 -80℃로부터 제거하고, 해동시키고 적절히 희석시켜 시험감염 접종물을 제공하였다. 접종물의 분취량을 역 연마를 수행하기 위해 보류하고 투여된 접종물의 역가를 확인하였다. 접종물을 실험 말 및 병원성 대조군(흰담비)에게 투여할 때까지 습윤 얼음 상태로 유지시켰다. 시험감염 바이러스를 말에게 비강내(1x106TCID50에서 표적화시킴) 및 경구적으로(1x106TCID50에서 표적화시킴) 투여하였다.
혈액을 말 헨드라 바이러스에 대한 노출 전에 말로부터 수집하였다. 또한, 혈액 시료를 21, 42, 56, 84, 120, 136 및 178일째에 수집하여 예방접종 후 HeV에 대한 항체 수준을 측정하였다. 시험감염 당일(218일째)에 출발하여, 혈액 시료를 매일 또는 격일로, 226일째까지 수집하였다. 혈액 시료는 내재하는 카테터를 사용하는 문제점으로 인하여 218일 후에 한마리의 말로부터 수집하지 않았다. 헨드라 바이러스에 대한 항체의 검출은 인증된 실험실 과정을 사용하여, 혈청 중화 검정으로부터 평가하였다.
시험감염 전 2일 동안(216 및 217일째), 체온을 매일 2회 기록하였고; 이들을 또한 시험감염 당일(시험감염 전 1회, 및 다시 4 내지 5시간 후)에 기록한 후; 각각의 말의 안락사일까지 매일 2회 기록하였다.
말을 4 내지 5시간까지 매일 관찰하고, 매일 2회 심박동 및 임상 신호를 기록하였다(시험감염 전 1회, 시험감염 후 4 내지 5시간에 1회, 및 이후 매일 2회).
모든 말은 218일(시험감염 전)째에 및 이후에 각각의 말의 안락사까지 매일 바이러스 확인 및 분리를 위해 취한 비강, 경구 및 직장 면봉 시료를 가졌다. 뇨 및 변을 또한 각각의 시료채취일에 각각의 말의 우리로부터 수집하였다.
말을 시험감염 후 7, 8 및 9일째(225, 226, 227일째)에 선택적으로 안락사시키고, 이들의 우리내에서 사후 실험을 수행하였다. 면봉 시료를 상기 기술된 바와 같이 수집하고, 조직 시료를 바이러스학 및 조직병리학을 위해 수집하였다. 모든 주요 기관계를 뇌, 호흡관 및 림프계에 특히 주의하면서, 시료채취하였다.
결과. 시험감염 접종물의 역 적정은, 말이 3.06x106 TCID50 각각을 제공받았는지, 및 흰담비 각각이 헨드라 바이러스 5.87x105 TCID50을 제공받았는지를 입증하였다.
유효한 시험을 위한 기준은 연구의 각각의 시험감염 상 후에 하나 이상의 흰담비 병원성 대조군에서 임상 신호의 발달, 및 급성 HeV 감염과 일치하는 조직학적/면역조직학적 발견으로 정의하였다. 당해 기준은, 연구의 당해 상에서 흰담비 둘 다가 급성 HeV 감염에 대해 굴복하였으므로 충족하였다. 주요 결과 기준은 급성 헨드라 바이러스 감염과 일치하는 임상 질병의 발달 또는 기타의 경우, 시험감염된 말에서, 이의 발달이었다.
표 11 및 표 12는 당해 연구에 등록된 3마리의 말의 HeV 혈청 중화 항체 역가를 나열한다. 표에서 일수는 백신의 첫번째 투여량의 시간(0일째)으로부터 계수한다.
[표 11]
Figure pct00011
[표 12]
Figure pct00012
모든 동물은 사후 실험에서 전체적으로 정상이었고, 조직학적 병변은 비장, 간, 심장, 신장(피질, 수질, 골반), 뇨 방광, 림프절(두부의 것을 포함), 폐, 부신(피질 및 수질), 척수(2 수준), 대장, 소장, 난소, 뇌하수체, 삼차신경절, 뇌(후신경구를 포함하는 모든 주요 영역), 위장, 인두 및 코 선반의 실험에서 어떠한 말에서도 검출되었다.
연구 과정 전체에서 백신에 대한 부작용으로 고생하는 것으로 보고된 동물은 없었다.
결론적으로, 3마리의 말은 증강(제2) 예방접종 후 197일째 시험감염되었으며, 시험감염 후 각각 7, 8 및 9일째에 선택적으로 안락사되었다. 모든 말은 관찰 기간 동안에 임상적으로 잘 남아있었으며, 심박동 및 체온에 있어서 정상의 한계치를 넘는 상승은 관찰되지 않았다.
시험감염 후 3마리의 말 중 2마리로부터 수집된 혈액 시료에 있어서 혈청학은 역가에 있어서 증강을 나타내지 않았으며, 이는 이들 예방접종된 동물에서 유의적인 바이러스 복제의 결여와 일치하였다(표 12). 혈액은 내재하는 카테터와 직면한 문제들로 인하여, 세번재 말(#V12)로부터 수집하지 않았다.
헨드라 바이러스 게놈(N 유전자)은 HeV에 노출된 후 어떠한 시점에서도 #V12 및 #V14로부터 수집된 어떠한 임상 시료로부터도 회수되지 않았고; 낮은 수준의 게놈이 시험감염 후 2, 3, 4 및 7일째에 #V13으로부터의 비강 면봉 시료에서 발견되었으나 안락사 당일에는 발견되지 않았다. 바이러스는 HeV N 유전자에 대해 낮은 카피 수를 나타낸 비강 면봉을 포함하는, 어떠한 임상 시료로부터도 재-분리되지 않았다. 나이브 대조군 동물과 비교하여 예방접종된 말의 상기도에서 바이러스 복제가 휠씬 더 낮다.
모든 동물은 사후 실험에서 전체적으로 정상이었고, 수집된 조직의 시험시 어떠한 말에서도 조직학적 병변은 검출되지 않았다. HeV 항원은 어떠한 말로부터 시료채취된 어떠한 조직에서도 검출되지 않았다. 3마리의 말 중 어느 것으로부터의 사후 실험시 수집된 어떠한 조직으로부터도 HeV 게놈이 회수되지 않았다는 점에서, 이들 조직면역학 발견은 또한 태크만 qPCR 결과에 의해 지지되지 않는다.
요약하면, 예방접종 후 약 6개월째에 말 헨드라 바이러스의 살아있는 악성 균주로 시험감염된 말은 헨드라 바이러스 감염의 임상 신호로부터 보호되었다. 이는, 21일 간격으로 HeV sG 백신의 2회 투여량에 의해 부여된 면역성의 기간은 적어도 197일(약 6개월)임을 입증한다.
실시예 11: 영장류에서 니파 바이러스에 대한 임상 시험
통계학. 동물 연구, 특히 비-사람 영장류 연구를 수행하는 경우, 생물안전성에서 수준 4(BSL-4)는 다수의 동물 대상체, 수득될 수 있는 생물학적 시료의 용적 및 독립적으로 검정을 반복하는 능력을 심각하게 제한하므로 통계적 분석을 제한한다. 결과적으로, 데이터는 반복된 검정이 아닌, 반복된 시료로부터 계산된 평균 또는 중간값으로서 제공되며, 오차는 반복물에 걸친 표준 편차를 나타낸다.
바이러스. NiV-말레이지아(GenBank 수탁 번호 AF212302)를 미국 조지아주 아틀란타에 소재하는 질병 방제 및 예방 센터의 특수 병원체 부서(the Special Pathogens Branch of the Centers for Disease Control and Prevention)로부터 입수하였다. NiV는 문헌(참고: Rockx et al. (2010) J. Virol. 84, 9831)에서 HeV에 대해 기술된 바와 같이 베로 세포에서 증식하여 적정하였다.
백신 제형. sGHeV의 3개의 백신 제형을 사용하였다(10㎍, 50㎍ 또는 100㎍). sGHeV의 생산 및 정제는 문헌(참고: Pallister (2011) Vaccine 29, 5623)에 앞서 기술된 바와 같이 수행하였다. 각각의 백신 제형은 또한 Allhydrogel™(제조원: Accurate Chemical & Scientific Corporation) 및 완전한 포스포로티오에이트 골격을 함유하는 CpG 올리고데옥시뉴클레오타이드(ODN) 2006(제조원: InvivoGen)을 함유하였다. 고정량의 ODN 2006, 다양한 양의 sGHeV 및 알루미늄 이온(1:25의 중량비)을 함유하는 백신 투여량을 다음과 같이 제형화하였다: 100㎍의 투여량: 100㎍의 sGHeV, 2.5mg의 알루미늄 이온 및 150㎍의 ODN 2006; 50㎍의 투여량: 50㎍의 sGHeV, 1.25mg의 알루미늄 이온 및 150㎍의 ODN 2006; 및 10㎍의 투여량: 5㎍의 sGHeV, 250㎍의 알루미늄 이온 및 150㎍의 ODN 2006. 모든 투여량에 대해, Alhydrogel™ 및 sGHeV를, ODN 2006을 첨가하기 전에 먼저 혼합하였다. 각각의 백신 투여량을 PBS를 사용하여 1mL로 조절하고 혼합물을 회전 휠 위에서 실온으로 주사 전 적어도 2 내지 3시간 동안 항온처리하였다. 각각의 대상체에게 프라임을 위해 동일한 1mL 투여량을 제공하고 모든 백신 투여량을 근육내 주사를 통해 제공하였다.
동물. 체중이 4 내지 6kg인 10마리의 젊은 성체 아프리카 녹색 원숭이(African Green Monkeys: AGM)(클로로케부스 아에티옵스(Chlorocebus aethiops))(공급원: Three Springs Scientific Inc.)를 개별로 우리에 넣었다. 대상체를 케타민(10 내지 15 mg/kg)의 근육내 주사에 의해 마취시키고 -42일(프라임) 및 -21일(증강)째에 sGHeV로 예방접종하였다. 3마리의 대상체에게는 2회의 10㎍ 투여량(AGM 16, AGM 17, AGM 18)을 제공하고, 3마리의 대상체에게는 2회의 50㎍ 투여량(AGM 13, AGM 14, AGM 15)을 제공하며, 3마리의 동물에게는 2회의 100㎍ 투여량(AGM 10, AGM 11, AGM 12)을 제공하고 1마리의 대상체(AGM 9)에게는 항원보강제만을 제공하였다. 0일째에, 대상체를 마취시키고 4mL의 둘베코 최소 필수 배지(Dulbecco's minimal essential medium: DMEM)(제조원: Sigma-Aldrich) 중 1x105 TCID50(중간 조직 배양 감염 투여량)의 NiV로 기도내로 접종하였다. 대상체를 체온, 호흡률, 흉부 방사선, 혈류 및, 비강, 구강 및 직장 점막의 면봉을 포함하는 임상 실험을 위해 감염(p.i.) 후 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21 및 28일째에 마취시켰다. 대조군 대상체(AGM 9)를 감염후 10일째에 승인된 사람 말기점(humane end point)에 따라 마취시켜야만 하였다. 모든 다른 대상체는 연구 말기까지 생존하였으며 감염 후 28일째에 안락사시켰다. 부검시, 다양한 조직을 바이러스학 및 조직병리학을 위해 수집하였다. 시료채취된 조직은 다음을 포함한다: 결막, 편도, 중인두/비인두, 비강 점막, 기관, 우측 기관지, 좌측 기관지, 우측 폐 상엽, 우측 폐 중엽, 우측 폐 하엽, 라이트 폐 상엽(light lung upper lobe), 라이트 폐 중엽, 라이트 폐 하엽, 기관지 림프절(LN), 심장, 간, 비장, 신장, 뇌하수체, 췌장, 공장, 횡행 결장, 뇌(전뇌), 뇌(소뇌), 뇌간, 경부 척수, 뇌하수체, 아래턱 LN, 타액 LN, 서혜 LN, 겨드랑이 LN, 장간막 LN, 방광, 정소 또는 난소, 대퇴 골수. 예방접종은 BSL-2 봉쇄하에 수행하였다. 예방접종 스케쥴의 시각표, 시험감염 및 생물학적 표본 수집일은 도 4에 나타낸다.
예방접종 및 NiV 시험감염. 앞서, 본 발명자들은, 105 TCID50(중간 조직 배양 감염 투여량)의 NiV를 사용한 AGM의 기관지내 접종이 균일한 치사 결과를 유발하였음을 입증하였다(참고: Rockx et al. (2010) J. Virol. 84, 9831). 신속하게 진행하는 임상 질병은 이들 연구에서 주목되었으며; 임상 신호는 심각한 우울증, 급성 호흡 곤란증을 초래하는 호흡기병, 심각한 신경학적 질병 및 심각하게 감소된 운동능; 및 7 내지 12일 범위의 안락사를 위한 승인된 사람 말기점 기준에 도달하는 시간을 포함하였다. 여기서 본 발명자들은, sGHeV를 사용한 예방접종이 AGM에서 NiV 감염 및 질병을 예방할 수 있는지를 측정하는 것을 연구하였다. 10, 50 또는 100㎍의 sGHeV의 투여량을 방법에 기술된 바와 같이 명반 및 CpG 잔사와 혼합하였다. 각각의 백신 제형을 0일째(프라임) 및 다시 21일째(증강)에 3마리의 대상체에게 피하 투여하고 1마리의 대조군 대상체(AGM 9)에게는 동일한 날에 항원보강제만의 프라임 및 증강을 제공하였다. 42일째에 모든 대상체를 105 TCID50 NiV로 기관내 접종하였다. 대조군 대상체(AGM 9)는 식욕, 심각하게 지속된 거동 변화(우울증, 감소된 활성, 구부린 자세), 혈소판 수에 있어서의 감소 및 말기 단계 질병에서 호흡률에 있어서의 점진적인 증가를 나타내었다. 후속적으로, AGM 9는 급성 호흡 곤란증으로 진행되었고 감염 후 10일째에 승인된 사람 말기점에 따라 안락사하여야 했다. 대조적으로, 예방접종된 대상체의 어느 것도 임상 질병을 가지지 않았으며 모두 연구의 말기까지 생존하였다. 카플란-마이어 생존 그래프(Kaplan-Meier survival graph)는 도 5에 나타낸다.
대조군 대상체에 있어서 NiV-매개된 질병. 대조군 대상체에서 전체적인 병리학적 변화는 NiV-감염된 AGM에서 앞서 발견된 것들과 일치하였다(참고: Geisbert et al. (2010) PLoS One 5, e10690). 비장비대증 및 뇌 표면의 혈관의 울혈이 존재하였고 모든 폐엽은 젖었고 무거웠다. NiV RNA 및 감염성 바이러스는 AGM 9 혈액 시료로부터 회수되지 않았으며 바이러스혈증의 증거도 없었다. AGM 9는 유의적인 수준의 NiV-특이적인 IgM 및 검출가능한 NiV-특이적인 IgG 및 IgA를 가졌다. 조직 시료의 추가의 분석은 AGM에서 이미 관찰된 광범위한 NiV 조직 감염과 유사한 집중적인 NiV 조직 굴성을 나타내었다(참고: Geisbert et al. (2010) PLoS One 5, e10690). AGM 9는 나타낸 바와 같이 대부분의 조직에서 NiV RNA를 가졌으며 감염성 바이러스가 다수의 조직으로부터 회수되었다. 유의적인 병변은 폐섬유화증, 아급성 뇌염 및 괴사 및 백색수의 출혈을 포함하였다. 폐포강은 부종 유액, 피브린, 핵붕괴성 및 세포성 부스러기, 및 폐포대식세포로 채워졌다. 다초점 뇌염은 중간 수의 림프구 및 적은 수의 호중구에 의한 버쵸-로빈슨 공간(Virchow-Robins space)의 확장으로 특징화되었다. 보다 적은 수의 이들 염증성 세포가 인접한 유조직내로 확장되었다. 다수의 뉴우런이 팽윤되고 공포가 있게(변성)되거나 핵융해(괴사)로 단편화되었다. 백색수에 있어서 모낭의 다초점 배 중심은 출혈 및 피브린, 소수의 호중구 및 세포성 및 핵붕괴성 부스러기에 의해 없어졌다. 이러한 발견은 비장내 괴사 및 배중심의 손실과 일치하였다. 집중된 양의 바이러스 항원이 뇌간 속에 존재하였으며 이는 NiV가 중추신경계내 강력한 손상의 원인임을 강조한다.
sGHeV-예방처리된 대상체의 보호. 시험감염 후 수집된 모든 혈액 시료 및 괴사시 수집된 모든 조직을 포함하는 모든 생물학적 표본은 NiV RNA에 대해 음성이었으며 어떠한 표본으로부터도 분리되지 않았다. 예방처리된 대상체로부터의 조직 단면의 보다 밀접한 시험시, 조직 구성은 정상으로 보였고 NiV 항원은 면역조직화학 기술을 사용한 어떠한 조직에서도 검출되지 않았다. 백신-유발된 보호 메카니즘을 해부하기 위하여, 혈청 및 점막 sGNiV- 및 sGHeV-특이적인 IgM, IgG 및 IgA, 및 또한 NiV 및 HeV 혈청 중화 역가를 예방접종된 동물에서 측정하였다. 도 6에 입증된 바와 같이, 시험감염 7일 전에, 최저량의 sGHeV를 제공받은 대상체는 검출가능한 항원-특이적인 혈청 IgM 및 최대 수준의 sGHeV-특이적인 혈청 IgG를 가졌다. 50㎍의 sGHeV를 제공받은 대상체는 또한 시험감염 전 7일째에 검출가능한 수준의 혈청 IgM 및 이들의 최대 수준의 혈청 IgG를 가졌다. 고 투여량의 대상체는 검출가능한 혈청 IgM을 가지지 않았으며 혈청 IgG 수준은 다른 2개의 군과 비교하여 -7일째에 거의 유의적이지 않았다. NiV 시험감염 당일까지, 고 투여량 대상체에서 혈청 IgG 수준은 증가하였으며, 모든 예방접종된 대상체는 유사한 IgG 수준을 가졌다. 혈청 IgM 수준은 NiV 시험감염 후 어떠한 대상체에서도 변화하지 않았다. 혈청 IgG 수준은 NiV 시험감염 당일에 중간 투여량 대상체에서 감소하였으며 IgG 수준은 NiV 시험감염 직후 저 투여량 대상체에서 감소하였다. 흥미롭게도, IgG 수준은 3일 및 5일 p.i까지 이들 군 둘 다에서 증가하였지만 시험감염 7일 전에 존재한 IgG 수준을 능가하지 않았고 군 둘 다에서 역가는 28 p.i까지 유의적으로 감소하였다.
역으로, 고 투여량 군에서 혈청 IgG 수준은 높게 유지되었고 28일 p.i에서 최대였다. 항원-특이적인 혈청 IgA는 예방접종 후 모든 대상체에서 검출가능하였지만; 수준은 매우 낮았고 시험감염 전 및 후 수준은 유의적으로 상이한 것으로 나타나지 않았다(도 6). 점막 항원-특이적인 IgA에서 최소의 증가는 14 p.i째에 저 투여량 대상체로부터의 비강 면봉에서 검출되었지만, 당해 수준이 너무 낮아서 이들 점막 항체는 시험감염 후 NiV의 확산을 방지하는데 있어서 역할을 하지 않는 경향이 있었다. 혈청 중화 시험(SNT)으로부터의 결과는 표 9에 나타낸다. 모든 예방접종된 대상체의 경우, HeV-특이적인 중화 역가는 28일 p.i까지 동일하게 남아있거나 감소하였으며, NiV-특이적인 중화 역가는 심지어 시험감염 전 최저 역가였던 대상체에서조차 7일 p.i까지 유의적으로 변하지 않았다. 1마리의 저 투여량 및 1마리의 고 투여량 대상체는 14일 p.i까지 NiV SNT 역가에 있어서 log 감소를 가졌고 1마리의 중간 투여량 대상체는 21일 p.i까지 NiV SNT 역가에 있어서 log 증가를 가졌다. 모든 다른 예방접종된 동물의 경우, SNT 역가에 있어서의 변화는 일치하지 않았거나(역가는 증가할 수 있으며 이후 감소할 수 있다) 유의적이지 않았다(역가는 3 내지 4배 증가하지만 log 이하였다). 최종적으로, NiV 융합(F) 엔벨로프 당단백질에 대한 혈청전환을 NiV 시험감염 후 예방접종된 대상체에서 측정하였다. 최소 수준의 혈청 항-NiV F IgM이 각각 10일 및 21일 p.i에서 저 및 중간 투여량 대상체에서 검출되었고, 이들 낮은 M.F.I. 값은 NiV 시험감염 후 약한 주요 항체 반응을 제안한다. 혈청 항-NiV-F IgM은 고 투여량 대상체에서 검출되지 않았으며, 이는, 이들 동물이 시험감염 후 순환하는 바이러스를 거의 가지지 않았거나 전혀 가지지 않았음을 시사한다.
Figure pct00013
실시예 12: 영장류에서 헨드라 바이러스에 대한 임상 시험
제2 임상 시험을 AGM에서 수행하여 헨드라 바이러스를 사용한 예방접종 및 시험감염을 평가하였다. 실시예 9에 나타낸 바와 동일한 제형을 백신으로 사용하였으나 또한 항원보강제로서 Alhydrogel™ 단독(ODN 2006은 존재하지 않았다)과 sGHeV를 제공받은 다른 군과 비교하였다. 동물을 -21일에 예방접종하고, 0일째에 증강시키며, 21일째에 시험감염하였다. 달리 나타내지 않는 한, 모든 조건은 실시예 7의 조건과 동일하였다. 실험 요약은 하기와 같다:
Figure pct00014
결과: 군(A 및 B) 둘 다에서 모든 동물(n=4)은 105 TCID50 헨드라 바이러스를 기관내 접종한 후 헨드라 바이러스 시험감염에서 생존하였다. 대조군 대상체는 8일째에 죽었다. 예방접종된 대상체 중 어느 것에서도 임상적 질병은 관찰되지 않았고 이들은 연구 말기점까지 건강하게 잘 잔류하였다.
본 발명의 다른 구현예 및 용도는 본원에 개시된 본 발명의 명세서 및 실시를 고려하여 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 모든 공보, 미국 및 외국 특허 및 특허원을 포함하는, 본원에 인용된 모든 참조문헌은 참고로서 구체적으로 및 전체적으로 포함된다. 본 명세서 및 실시예는 하기 청구범위에 나타낸 본 발명의 실제 범위 및 취지와 함께 단지 예시적인 것으로 고려되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> ZOETIS SERVICES LLC <120> HENDRA AND NIPAH VIRUS G GLYCOPROTEIN IMMUNOGENIC COMPOSITIONS <130> ZP000040 <140> PCT/US2014/070273 <141> 2014-12-15 <150> US 61/916,391 <151> 2013-12-16 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1815 <212> DNA <213> Hendra virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1815) <400> 1 atg atg gct gat tcc aaa ttg gta agc ctg aac aat aat cta tct ggt 48 Met Met Ala Asp Ser Lys Leu Val Ser Leu Asn Asn Asn Leu Ser Gly 1 5 10 15 aaa atc aag gat caa ggt aaa gtt atc aag aat tat tac ggc aca atg 96 Lys Ile Lys Asp Gln Gly Lys Val Ile Lys Asn Tyr Tyr Gly Thr Met 20 25 30 gac atc aag aaa att aac gat ggg tta tta gat agt aag ata ctt ggg 144 Asp Ile Lys Lys Ile Asn Asp Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Gly 35 40 45 gcg ttt aac aca gtg ata gct ttg ttg gga tca atc atc atc att gtg 192 Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Ile Ile Ile Val 50 55 60 atg aat atc atg ata att caa aat tac acc aga acg act gat aat cag 240 Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr 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Asp Ile Lys Lys Ile Asn Asp Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Gly 35 40 45 Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Ile Ile Ile Val 50 55 60 Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln 65 70 75 80 Ala Leu Ile Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala 85 90 95 Leu Thr Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile 100 105 110 Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly 115 120 125 Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp 130 135 140 Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile 145 150 155 160 Ser Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln 165 170 175 Gly Val Ser Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys 180 185 190 Thr Thr Ser Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro 195 200 205 Ile Asn Thr Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val 210 215 220 Asp Asn Gly Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys 225 230 235 240 Thr Arg Gly Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu 245 250 255 Asp Arg Gly Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr 260 265 270 Pro Pro Asn Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu 275 280 285 Asp Phe Tyr Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile 290 295 300 Leu Asn Ser Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala 305 310 315 320 Val Arg Pro Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala 325 330 335 Ile Thr Lys Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly 340 345 350 Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly 355 360 365 Phe Leu Pro Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile 370 375 380 Ile His Cys Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly 385 390 395 400 Val Asn Ser Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr 405 410 415 Asn Leu Ser Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala 420 425 430 Asp Asn Arg Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu 435 440 445 Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile 450 455 460 Lys Leu Gly Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg 465 470 475 480 Asn Asn Ser Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe 485 490 495 Asn Val Cys Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe 500 505 510 Leu Ile Asp Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser 515 520 525 Asn Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu 530 535 540 Ile Leu Tyr Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys 545 550 555 560 Thr Ile Thr Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser 565 570 575 Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu 580 585 590 Phe Ala Val Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser 595 600 <210> 3 <211> 1809 <212> DNA <213> Nipah virus <220> <221> CDS <222> (1)..(1809) <400> 3 atg ccg gca gaa aac aag aaa gtt aga ttc gaa aat act act tca gac 48 Met Pro Ala Glu Asn Lys Lys Val Arg Phe Glu Asn Thr Thr Ser Asp 1 5 10 15 aaa ggg aaa att cct agt aaa gtt att aag agc tac tac gga acc atg 96 Lys Gly Lys Ile Pro Ser Lys Val Ile Lys Ser Tyr Tyr Gly Thr Met 20 25 30 gac att aag aaa ata aat gaa gga tta ttg gac agc aaa ata tta agt 144 Asp Ile Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser 35 40 45 gct ttc aac aca gta ata gca ttg ctt gga tct atc gtg atc ata gtg 192 Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val 50 55 60 atg aat ata atg atc atc caa aat tac aca aga tca aca gac aat cag 240 Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln 65 70 75 80 gcc gtg atc aaa gat gcg ttg cag ggt atc caa cag cag atc aaa ggg 288 Ala Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly 85 90 95 ctt gct gac aaa atc ggc aca gag ata ggg ccc aaa gta tca ctg att 336 Leu Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile 100 105 110 gac aca tcc agt acc att act atc cca gct aac att ggg ctg tta ggt 384 Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly 115 120 125 tca aag atc agc cag tcg act gca agt ata aat gag aat gtg aat gaa 432 Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu 130 135 140 aaa tgc aaa ttc aca ctg cct ccc ttg aaa atc cac gaa tgt aac att 480 Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile 145 150 155 160 tct tgt cct aac cca ctc cct ttt aga gag tat agg cca cag aca gaa 528 Ser Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu 165 170 175 ggg gtg agc aat cta gta gga tta cct aat aat att tgc ctg caa aag 576 Gly Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys 180 185 190 aca tct aat cag ata ttg aag cca aag ctg att tca tac act tta ccc 624 Thr Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro 195 200 205 gta gtc ggt caa agt ggt acc tgt atc aca gac cca ttg ctg gct atg 672 Val Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met 210 215 220 gac gag ggc tat ttt gca tat agc cac ctg gaa aga atc gga tca tgt 720 Asp Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys 225 230 235 240 tca aga ggg gtc tcc aaa caa aga ata ata gga gtt gga gag gta cta 768 Ser Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu 245 250 255 gac aga ggt gat gaa gtt cct tct tta ttt atg acc aat gtc tgg acc 816 Asp Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr 260 265 270 cca cca aat cca aac acc gtt tac cac tgt agt gct gta tac aac aat 864 Pro Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn 275 280 285 gaa ttc tat tat gta ctt tgt gca gtg tca act gtt gga gac cct att 912 Glu Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile 290 295 300 ctg aat agc acc tac tgg tcc gga tct cta atg atg acc cgt cta gct 960 Leu Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala 305 310 315 320 gtg aaa ccc aag agt aat ggt ggg ggt tac aat caa cat caa ctt gcc 1008 Val Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala 325 330 335 cta cga agt atc gag aaa ggg agg tat gat aaa gtt atg ccg tat gga 1056 Leu Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly 340 345 350 cct tca ggc atc aaa cag ggt gac acc ctg tat ttt cct gct gta gga 1104 Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly 355 360 365 ttt ttg gtc agg aca gag ttt aaa tac aat gat tca aat tgt ccc atc 1152 Phe Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile 370 375 380 acg aag tgt caa tac agt aaa cct gaa aat tgc agg cta tct atg ggg 1200 Thr Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly 385 390 395 400 att aga cca aac agc cat tat atc ctt cga tct gga cta tta aaa tac 1248 Ile Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr 405 410 415 aat cta tca gat ggg gag aac ccc aaa gtt gta ttc att gaa ata tct 1296 Asn Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser 420 425 430 gat caa aga tta tct att gga tct cct agc aaa atc tat gat tct ttg 1344 Asp Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu 435 440 445 ggt caa cct gtt ttc tac caa gcg tca ttt tca tgg gat act atg att 1392 Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile 450 455 460 aaa ttt gga gat gtt cta aca gtc aac cct ctg gtt gtc aat tgg cgt 1440 Lys Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg 465 470 475 480 aat aac acg gta ata tca aga ccc ggg caa tca caa tgc cct aga ttc 1488 Asn Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe 485 490 495 aat aca tgt cca gag atc tgc tgg gaa gga gtt tat aat gat gca ttc 1536 Asn Thr Cys Pro Glu Ile Cys Trp Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe 500 505 510 cta att gac aga atc aat tgg ata agc gcg ggt gta ttc ctt gac agc 1584 Leu Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser 515 520 525 aat cag acc gca gaa aat cct gtt ttt act gta ttc aaa gat aat gaa 1632 Asn Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu 530 535 540 ata ctt tat agg gca caa ctg gct tct gag gac acc aat gca caa aaa 1680 Ile Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys 545 550 555 560 aca ata act aat tgt ttt ctc ttg aag aat aag att tgg tgc ata tca 1728 Thr Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser 565 570 575 ttg gtt gag ata tat gac aca gga gac aat gtc ata aga ccc aaa cta 1776 Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu 580 585 590 ttc gcg gtt aag ata cca gag caa tgt aca taa 1809 Phe Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr 595 600 <210> 4 <211> 602 <212> PRT <213> Nipah virus <400> 4 Met Pro Ala Glu Asn Lys Lys Val Arg Phe Glu Asn Thr Thr Ser Asp 1 5 10 15 Lys Gly Lys Ile Pro Ser Lys Val Ile Lys Ser Tyr Tyr Gly Thr Met 20 25 30 Asp Ile Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser 35 40 45 Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val 50 55 60 Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln 65 70 75 80 Ala Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly 85 90 95 Leu Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile 100 105 110 Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly 115 120 125 Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu 130 135 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cgttcgaact tagcagcagc ggtctccttg gtac 54 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 11 cgaacaaaag ctcatctcag aagaggatct g 31 <210> 12 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 12 aattcagatc ctcttctgag atgagctttt gttcggtac 39 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 13 tcgacccacc atggagacag acacactcct gcta 34 <210> 14 <211> 1662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HeV sG viral sequence <220> <221> CDS <222> (1)..(1662) <400> 14 atg gaa acc gac acc ctg ctg ctg tgg gtg ctg ctc ctg tgg gtc ccc 48 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 ggc agc aca ggc gac tac acc aga acg act gat aat cag gca cta atc 96 Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala Leu Ile 20 25 30 aaa gag tca ctc cag agt gta cag caa caa atc aaa gct tta aca gac 144 Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys 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Leu Ile Arg Leu Ala Val Arg Pro 260 265 270 aaa agt gat agt gga gac tac aat cag aaa tac atc gct ata act aaa 864 Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile Thr Lys 275 280 285 gtt gaa aga ggg aag tac gat aag gtg atg cct tac ggt cca tca ggt 912 Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly 290 295 300 atc aag caa ggg gat aca ttg tac ttt ccg gcc gtc ggt ttt ttg cca 960 Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Pro 305 310 315 320 agg acc gaa ttt caa tat aat gac tct aat tgt ccc ata att cat tgc 1008 Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile His Cys 325 330 335 aag tac agc aaa gca gaa aac tgt agg ctt tca atg ggt gtc aac tcc 1056 Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val Asn Ser 340 345 350 aaa agt cat tat att ttg aga tca gga cta ttg aag tat aat cta tct 1104 Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn Leu Ser 355 360 365 ctt gga gga gac atc ata ctc caa ttt atc gag att gct gac aat aga 1152 Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp Asn Arg 370 375 380 ttg acc atc ggt tct cct agt aag ata tac aat tcc cta ggt caa ccc 1200 Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Gln Pro 385 390 395 400 gtt ttc tac cag gca tca tat tct tgg gat acg atg att aaa tta ggc 1248 Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys Leu Gly 405 410 415 gat gtt gat acc gtt gac cct cta aga gta cag tgg aga aat aac agt 1296 Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn Asn Ser 420 425 430 gtg att tct aga cct gga cag tca cag tgt cct cga ttt aat gtc tgt 1344 Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn Val Cys 435 440 445 ccc gag gta tgc tgg gaa ggg aca tat aat gat gct ttt cta ata gac 1392 Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe Leu Ile Asp 450 455 460 cgg cta aac tgg gtt agt gct ggt gtt tat tta aac agt aac caa act 1440 Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn Gln Thr 465 470 475 480 gca gag aac cct gtg ttt gcc gta ttc aag gat aac gag atc ctt 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Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser Lys Ile 65 70 75 80 Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys Cys Lys 85 90 95 Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Pro 100 105 110 Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln Gly Val Ser 115 120 125 Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys Thr Thr Ser 130 135 140 Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Ile Asn Thr 145 150 155 160 Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val Asp Asn Gly 165 170 175 Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys Thr Arg Gly 180 185 190 Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Gly 195 200 205 Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro Pro Asn 210 215 220 Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp Phe Tyr 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu Asn Ser 245 250 255 Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val Arg Pro 260 265 270 Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile Thr Lys 275 280 285 Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly 290 295 300 Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Pro 305 310 315 320 Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile His Cys 325 330 335 Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val Asn Ser 340 345 350 Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn Leu Ser 355 360 365 Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp Asn Arg 370 375 380 Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Gln Pro 385 390 395 400 Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys Leu Gly 405 410 415 Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn Asn Ser 420 425 430 Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn Val Cys 435 440 445 Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe Leu Ile Asp 450 455 460 Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn Gln Thr 465 470 475 480 Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile Leu Tyr 485 490 495 Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr Ile Thr 500 505 510 Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser Leu Val Glu 515 520 525 Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe Ala Val 530 535 540 Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser 545 550 <210> 16 <211> 1662 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mammalian - Codon optimized Hendra virus sG <220> <221> CDS <222> (1)..(1662) <400> 16 atg gaa acc gac acc ctg ctg ctg tgg gtg ctg ctc ctg tgg gtc ccc 48 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 ggc agc aca ggc gac tac acc cgg acc acc gac aac cag gcc ctg atc 96 Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala Leu Ile 20 25 30 aaa gag tcc ctg cag agc gtc cag cag cag atc aag gcc ctg acc gac 144 Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala Leu Thr Asp 35 40 45 aag atc ggc acc gag atc ggc ccc aaa gtg tcc ctg atc gac acc agc 192 Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp Thr Ser 50 55 60 agc acc atc acc atc ccc gcc aac atc ggg ctg ctg ggc tcc aag atc 240 Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser Lys Ile 65 70 75 80 agc cag agc acc agc tcc atc aac gag aac gtg aac gac aag tgc aag 288 Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys Cys Lys 85 90 95 ttc acc ctg ccc ccc ctg aag atc cac gag tgc aac atc agc tgc ccc 336 Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Pro 100 105 110 aac ccc ctg ccc ttc cgg gag tac cgg ccc atc agc cag ggc gtg agc 384 Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln Gly Val Ser 115 120 125 gac ctg gtg ggc ctg ccc aac cag atc tgc ctg cag aaa acc acc tcc 432 Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys Thr Thr Ser 130 135 140 acc atc ctg aag ccc cgg ctg atc agc tac acc ctg ccc atc aac acc 480 Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Ile Asn Thr 145 150 155 160 cgg gag ggc gtg tgc atc acc gac cct ctg ctg gcc gtg gac aac ggc 528 Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val Asp Asn Gly 165 170 175 ttc ttc gcc tac agc cac ctg gaa aag atc ggc agc tgc acc cgg ggc 576 Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys Thr Arg Gly 180 185 190 att gcc aag cag cgg atc atc ggc gtg ggc gag gtg ctg gac cgg ggc 624 Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Gly 195 200 205 gac aag gtg ccc agc atg ttc atg acc aac gtg tgg acc ccc ccc aac 672 Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro Pro Asn 210 215 220 ccc agc aca atc cac cac tgc agc agc acc tac cac gag gac ttc tac 720 Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp Phe Tyr 225 230 235 240 tac acc ctg tgc gcc gtg agc cac gtg ggc gac ccc atc ctg aac agc 768 Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu Asn Ser 245 250 255 acc agc tgg acc gag agc ctg agc ctg atc cgg ctg gcc gtg cgg ccc 816 Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val Arg Pro 260 265 270 aag agc gac agc ggc gac tac aac cag aag tat atc gcc atc acc aag 864 Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile Thr Lys 275 280 285 gtg gag cgg ggc aag tac gac aaa gtg atg ccc tac ggc ccc agc ggc 912 Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly 290 295 300 atc aag cag ggc gac aca ctg tac ttc ccc gcc gtg ggc ttc ctg ccc 960 Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Pro 305 310 315 320 cgg acc gag ttc cag tac aac gac agc aac tgc ccc atc atc cac tgc 1008 Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile His Cys 325 330 335 aag tac agc aag gcc gag aac tgc aga ctg agc atg ggc gtg aac agc 1056 Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val Asn Ser 340 345 350 aag agc cac tac atc ctg cgg agc ggc ctg ctg aag tac aac ctg tcc 1104 Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn Leu Ser 355 360 365 ctg ggc ggc gac atc atc ctg cag ttc atc gag atc gcc gac aac cgg 1152 Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp Asn Arg 370 375 380 ctg acc atc ggc agc ccc agc aag atc tac aac agc ctg ggc cag ccc 1200 Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Gln Pro 385 390 395 400 gtg ttc tac cag gcc agc tac agc tgg gac acc atg atc aag ctg ggg 1248 Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys Leu Gly 405 410 415 gac gtg gac acc gtg gac ccc ctg cgg gtg cag tgg cgg aac aac agc 1296 Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn Asn Ser 420 425 430 gtg atc agc aga ccc ggc cag agc cag tgc ccc cgg ttc aac gtg tgc 1344 Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn Val Cys 435 440 445 ccc gaa gtg tgc tgg gag ggc acc tac aac gac gcc ttt ctg atc gac 1392 Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe Leu Ile Asp 450 455 460 cgg ctg aac tgg gtg tcc gcc gga gtg tac ctg aac tcc aac cag acc 1440 Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn Gln Thr 465 470 475 480 gcc gag aac ccc gtg ttc gcc gtg ttc aag gac aac gag atc ctg tac 1488 Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile Leu Tyr 485 490 495 cag gtg ccc ctg gcc gag gac gac acc aac gcc cag aaa acc atc acc 1536 Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr Ile Thr 500 505 510 gac tgc ttt ctg ctg gaa aac gtg atc tgg tgc atc agc ctg gtg gag 1584 Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser Leu Val Glu 515 520 525 atc tac gac acc ggc gac tcc gtg atc cgg ccc aag ctg ttt gcc gtg 1632 Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe Ala Val 530 535 540 aag atc ccc gcc cag tgc agc gag agc tga 1662 Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser 545 550 <210> 17 <211> 553 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 17 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala Leu Ile 20 25 30 Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala Leu Thr Asp 35 40 45 Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp Thr Ser 50 55 60 Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser Lys Ile 65 70 75 80 Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys Cys Lys 85 90 95 Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Pro 100 105 110 Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln Gly Val Ser 115 120 125 Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys Thr Thr Ser 130 135 140 Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Ile Asn Thr 145 150 155 160 Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val Asp Asn Gly 165 170 175 Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys Thr Arg Gly 180 185 190 Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Gly 195 200 205 Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro Pro Asn 210 215 220 Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp Phe Tyr 225 230 235 240 Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu Asn Ser 245 250 255 Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val Arg Pro 260 265 270 Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile Thr Lys 275 280 285 Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly 290 295 300 Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Pro 305 310 315 320 Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile His Cys 325 330 335 Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val Asn Ser 340 345 350 Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn Leu Ser 355 360 365 Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp Asn Arg 370 375 380 Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Gln Pro 385 390 395 400 Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys Leu Gly 405 410 415 Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn Asn Ser 420 425 430 Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn Val Cys 435 440 445 Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe Leu Ile Asp 450 455 460 Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn Gln Thr 465 470 475 480 Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile Leu Tyr 485 490 495 Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr Ile Thr 500 505 510 Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser Leu Val Glu 515 520 525 Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe Ala Val 530 535 540 Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser 545 550 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 18 gatatcgcca ccatggaaac cgacaccctg 30 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 19 ggtacctcag ctctcgctgc actg 24

Claims (8)

  1. 헨드라(Hendra) 및/또는 니파(Nipah) 바이러스 G 당단백질, 면역자극성 복합체(ISC) 및 하나 이상의 부형제를 포함하는 면역원성 조성물을 다중 투여량으로 투여하고, 추가로 제1 투여량에 이어서, 상기 제1 투여량 후 적어도 약 21일 내지 약 42일째에 제2 투여량이 수반되는, 상기 면역원성 조성물을 투여하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    제1 투여량이 제1 투여량 후 28일째에 제2 투여량을 수반하고, 추가로 상기 제2 투여량 후 28일째에 제3 투여량이 수반되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    증강 투여량(booster dose)이 최종 투여량 이후 6개월째에 투여되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    추가의 투여량이 증강 투여량 이후 1년째에 투여되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    각각의 투여량이 약 50 또는 약 100㎍의 가용성 헨드라 바이러스 G 당단백질을 함유하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    대상체가 사람, 말, 암소, 양, 돼지, 염소, 닭, 개 또는 고양이인, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    G 당단백질이 헨드라 바이러스로부터 기원하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    G 당단백질이 니파 바이러스로부터 기원하는, 방법.
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