KR20160077215A - 중증 저혈당증의 치료를 위한 신규 화합물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 저혈당증의 치료에 유용한 신규 화합물을 제공한다.
Description
본 발명은 당뇨병 및/또는 비만을 치료하는데 사용하기 위한, 인간 글루카곤에 비해 개선된 용해도 및 물리적 및 화학적 안정성을 갖는 화합물에 관한 것이다.
하기 아미노산 서열: His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (서열 1)을 갖는 인간 글루카곤은 췌장에서 생산되는 29개 아미노산 펩티드 호르몬이다. 혈액 글루코스가 떨어지기 시작할 때, 글루카곤은 간으로 신호전달하여 저장된 글리코겐을 글루코스로 분해하여 혈류로 방출시킴으로써, 혈액 글루코스 수준을 상승시킨다.
당뇨병을 갖는 대상체에서, 저혈당증은 당뇨병 치료의 부작용으로서 발생할 수 있다. 추가로, 당뇨병 환자에서는 저혈당증에 대한 자연적인 글루카곤 반응이 손상되어, 글루코스 수준을 정상 범위로 되돌리는 것이 힘들 수 있다. 중증 또는 급성 저혈당증은 치료되지 않은 채로 남겨지면, 심각한 문제, 예컨대 발작, 무의식, 뇌 손상, 또는 심지어 사망을 유발할 수 있다.
글루카곤의 투여는 급성 저혈당증을 치료하기 위한 확립된 요법이다. 응급 글루카곤 투여는 투여 수 분 이내에 정상 글루코스 수준을 복원할 수 있다. 그러나 투여를 위해 제조된 글루카곤은 여러 문제를 갖는다. 생리학적 pH에서의 및 그 근처의 수성 완충제 중에서, 글루카곤은 불량한 용해도를 갖는다. 낮은 또는 높은 pH에서 제제화될 때, 글루카곤은 불량한 화학적 안정성 및 불량한 물리적 안정성, 예컨대 겔화 및 가용성 응집체 형성을 또한 나타낸다. 이들 문제를 최소화하기 위해, 현재 상업용 글루카곤 제품은, 투여 시간에 재구성하기 위한 지침서와 함께 동결건조 분말로서 제공된다. 응급 상황에서, 동결건조 분말을 재구성하는 것은 부담스럽고 불편하다. 따라서, 생리학적 조건 하에 인간 글루카곤의 생물학적 성능을 유지하면서, 또한 비-생리학적 조건 하에서도 충분한 수용해도, 화학적 안정성 및 물리적 안정성을 나타내는, 치료 용도를 위한 화합물을 제공하는 것이 바람직하다.
산성 및 생리학적 pH 완충제에서의 용해도 및 안정성을 개선시키기 위한 아미노산 치환을 갖는 글루카곤 유사체가 WO2008086086에 개시되어 있다. 생리학적 조건 하에 인간 글루카곤의 생물학적 성능을 유지하면서, 또한 비-생리학적 조건 하에서도 충분한 용해도 및 화학적 및 물리적 안정성을 나타내는 화합물에 대한 필요가 여전히 존재한다.
따라서, 본 발명은, 야생형 글루카곤 활성을 유지하나, 충분한 용해도뿐만 아니라 화학적 및 물리적 안정성을 또한 나타내는 화합물을 제공하고자 한다. 본 발명은 펌프 및/또는 응급 투여에 적합한 화합물을 또한 제공한다. 추가로, 본 발명은 폐쇄-루프 혈당 조절을 제공하기 위해 이중-챔버 펌프에서 빠른 작용 인슐린 유사체와 조합하여 투여될 수 있는 화합물을 제공한다.
본 발명은 아미노산 서열
Tyr-Ser-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-(Aib)-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Phe-Val-Ala-Trp-Leu-Leu-Glu-Glu (서열 2)를 포함하는 화합물을 제공한다. 본 발명은 또한 아미노산 서열
Tyr-Ser-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-(Aib)-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Phe-Val-Ala-Trp-Leu-Leu-Glu-Glu (서열 2)로 이루어진 화합물을 제공한다. 놀랍게도, 본 발명의 화합물은 수용액 중의 인간 글루카곤과 비교하여, 증가된 수용해도, 증가된 화학적 안정성, 및 감소된 피브릴화를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 본 발명의 화합물은 pH 8 근처에서 증진된 용해도를 나타낸다. 본 발명의 화합물은 인간 글루카곤과 비교시에 인간 글루카곤과 유사한 활성 - 예를 들면, 효력, 작용 시간, 및 글루카곤 수용체에서의 선택성을 또한 제공한다. 따라서, 본 발명의 화합물은 중증 또는 급성 저혈당증을 포함하는 저혈당증을 치료하는데 적합하다. 본 발명의 화합물의 개선된 특성은 펌프 투여 및 중증 저혈당증 치료를 위한, 수용액 중의 글루카곤의 제조를 또한 허용한다.
본 발명은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 저혈당증을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열로 이루어진 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 저혈당증을 치료하는 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 요법에 사용하기 위한, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 화합물을 추가로 제공한다. 본 발명은 요법에 사용하기 위한, 서열 2의 아미노산 서열로 이루어진 화합물을 또한 제공한다. 본 발명은 저혈당증의 치료에 사용하기 위한, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 화합물을 또한 제공한다. 본 발명은 저혈당증의 치료에 사용하기 위한, 서열 2의 아미노산 서열로 이루어진 화합물을 또한 제공한다. 본 발명은 저혈당증의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 화합물을 제공한다. 본 발명은 저혈당증의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한, 서열 2의 아미노산 서열로 이루어진 화합물을 또한 제공한다.
본 발명은 서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 화합물 및 제약상 허용되는 완충제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열로 이루어진 화합물 및 제약상 허용되는 완충제를 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. 제약 조성물은 바람직하게는 수용액이다. 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 완충제"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 표준 제약 완충제를 포괄하는 것으로 이해된다. 비경구 투여를 위한 제약상 허용되는 완충제는, 예를 들어 생리 염수, 포스페이트-완충 염수, 시트레이트-완충 염수, 트리스-완충 염수 및 히스티딘-완충 염수를 포함한다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]에 기재된 바와 같은 표준 제약 제제화 기술이 사용될 수 있다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA]에 기재된 바와 같은 표준 제약 제제화 기술이 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 임의의 표준 투여 경로를 사용하여, 예컨대 비경구로, 정맥내로, 피하로, 근육내로, 또는 경피로 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 피하로 또는 근육내로 투여된다.
제약 조성물은 생리학상 허용되는 pH를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 약 4 내지 약 8 범위의 pH를 가질 수 있다. 보다 바람직하게는, 제약 조성물은 약 8의 pH를 가질 수 있다.
본 발명의 화합물에 대한 용량은 약 0.01 mg 내지 약 100 mg 범위일 수 있다. 용량은 약 0.01 mg 내지 약 10 mg 범위일 수 있다. 용량은 또한 약 0.1 mg 내지 약 3 mg 범위일 수 있다. 추가로, 용량은 약 0.01 mg 내지 약 0.03 mg 범위일 수 있다.
본 발명의 화합물은 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 키트는 화합물을 인간 대상체에 투여하기 위한 장치와 함께 제공된다. 보다 바람직하게는, 키트는 화합물을 투여하기 위한 시린지 및 바늘을 포함한다. 가장 바람직하게는, 화합물은 시린지 내의 수용액 중에 사전-제제화된다.
본 발명의 화합물은 펌프 시스템, 예컨대 인슐린 펌프 또는 2-호르몬 (예를 들면, 인슐린-글루카곤) 펌프 시스템에 또한 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은, 대상체에게 투여될 때 허용되지 않는 부작용을 유발하지 않고, 바람직한 치료 효과를 생산하는 양을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 본 발명의 개시된 화합물의 "유효량"은, 치료의 부재 하에서보다 혈액 글루코스 농도의 더 큰 제어를 발생시킬 수 있는 양이다. 대상체에게 투여되는, 본 발명의 화합물의 "유효량"은 질환의 유형 및 중증도, 및 전반적 건강, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 내성, 및 혈액 글루코스 조절 불능의 중증도를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 대상체의 특징에 따라 달라질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료하는"은 특정한 장애 또는 상태, 예컨대 저혈당증과 연관된 증상의 개선을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 아미노산 서열은 20개의 자연 발생 아미노산에 대한 표준 단일 문자 또는 3문자 코드를 함유한다. 추가적으로, "Aib"는 알파 아미노 이소부티르산이다.
본원에 사용된 "피브릴화"는, 글루카곤이 낮은 또는 높은 pH에서 제제화될 때 관찰되는, 겔화 및 가용성 응집체 형성을 지칭한다.
실시예 1: 펩티드 합성
서열 2의 화합물을 프로테인 테크놀로지스 인크. 심포니(Protein Technologies Inc. Symphony) 상의 고체-상 펩티드 합성에 의해 생성하였다. 합성 (0.125 mmols 규모)을 대략 0.9 mmol/g으로 치환된 Fmoc-Glu(OtBu)-왕(Wang) 폴리스티렌 수지 (어드밴스드 켐테크(Advanced ChemTech)) 상에서 수행하였다. 합성을 Fmoc 주쇄 보호기 전략을 사용하여 수행하였다. 사용되는 아미노산 측쇄 유도체는 다음과 같다: Asp(O-tert-부틸, OtBu), Gln(트리틸, Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(tert-부톡시-카르보닐, Boc), Ser(OtBu), Thr(OtBu), Trp(Boc), 및 Tyr(OtBu). 커플링을, 디메틸포름아미드 (DMF) 중에서 디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 및 히드록시벤조트리아졸 (HOBt)로 활성화된 아미노산 (1:1:1 몰비)의 대략 10 당량을 사용하여 수행하였다. 커플링을 90분 내지 4시간 동안 실온에서 수행하였다.
수지로부터의 공-절단 및 측쇄 보호기 제거를, 2시간 동안 실온에서, 트리플루오로아세트산 (TFA):트리이소프로필실란:1,2-에탄디티올:물:티오아니솔 90:4:2:2:2 (v/v)를 함유하는 용액 중에서 수행하였다. 용액을 여과하고, 펩티드를 차가운 디에틸 에테르로 침전시키고, 3분 동안 4000 rpm에서 원심분리하였다 (차가운 에테르 세척을 3회 반복함). 조 펩티드를 10% 아세트산을 함유하는 100-150 mL의 물 중에 재용해시키고, C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 칼럼 (전형적으로 워터스 시메트리(Waters Symmetry) 정제용 7 um, 19 x 300 mm) 상에서 18 mL/분의 유량으로 정제하였다. 샘플을 100분에 걸쳐 22-55% B의 선형 AB 구배로 용리하였으며, 여기서 A = 0.05% TFA/물 및 B = 0.04% TFA/아세토니트릴이다. 생성물을 약 32-35% 아세토니트릴에서 일반적으로 용리하였다. 펩티드 순도 및 분자량을, 단일 사중극자 MS 검출기를 갖는 애질런트 1100 시리즈(Agilent 1100 Series) 액체 크로마토그래피-질량 분광측정법 (LC-MS) 시스템 상에서 확인하였다. 분석용 HPLC 분리를, 워터스 시메트리쉴드(SymmetryShield) RP18, 3.5 마이크로미터, 4.6 mm x 100 mm 칼럼 상에서 15분에 걸쳐 10-100% B의 선형 AB 구배로 수행하였으며, 여기서 A = 0.05% TFA/H2O 및 B = 0.04% TFA/40% 물/60% 아세토니트릴이고, 유량은 0.7 mL/분 (220 ηm의 파장)이다. 펩티드 유사체가 > 95% 순도로 정제되고, 1 원자 질량 단위 (amu) 내의 계산된 값에 상응하는 분자량을 가지는 것으로 확인되었다.
TFA 염을, AG 1-X8 수지 (바이오-라드(Bio-RAD), 아세테이트 형태, 100-200 메쉬, 3.2 meq/건조 g, 수분 함량 39-48 중량%) (음이온 교환 수지)를 사용하여 아세테이트 염으로 전환시켰다. 예를 들어, 464 mg 펩티드를 120 mL의 30% 아세토니트릴/H2O 중에 용해시켰다. 30 g 수지 (펩티드의 양전하에 대해 약 100배 몰비)를 첨가하였다. 혼합물 용액을 1시간 동안 실온에서 회전식 교반에 의해 혼합하였다. 혼합물 용액을 여과하고, 수지를 30% ACN/H2O로 5회 세척하였다. 원래 용액 및 세척한 용액을 합하고, 동결건조시켰다.
용해도 및 화학적 안정성
서열 2의 화합물을 1 mg/mL 농도 (펩티드 함량)로 20 mM 트리스-HCl/H2O, pH 8 중에 용해시키고, 0.22 마이크로미터 필터 (밀렉스(Millex), SLGV004SL)를 통해 여과하였다. 용액을 3개의 바이알에 옮겼다: 1개는 4℃에, 1개는 30℃에, 및 1개는 40℃에. 모든 바이알을 오토클레이빙하였다. 샘플을 탁도 및 상 분리에 대해 상이한 시점에서 시각적으로 평가하였다. 화합물의 안정성을, 1.2 mL/분의 유량 (220 ηm의 파장)으로, 5분에 걸쳐 5% B 등용매, 20분에 걸쳐 5-30% B, 30분에 걸쳐 30-35% B, 및 10분에 걸쳐 35-45% B의 AB (A=0.05% TFA/H2O; B= 0.04% TFA/아세토니트릴) 구배를 사용하는, 60℃에서 가열된 페노메넥스 에리스 와이드포어(Phenomenex Aeris Widepore), 3.6 μm, XB-C18 4.6 x 250 mm 칼럼 (P/NO 00G-4482-E0) 상 분석용 HPLC에 의해 평가하였다.
본 발명의 서열 2의 화합물은, 시각적 평가 및 RP-HPLC 둘 다에서, 4-wk 동안 pH 8에서의 트리스-HCl 완충제 중에서, 4℃, 30℃ 및 40℃에서 우수한 용해도를 유지하였다.
<표 1>
서열 2의 화합물은 시각적 평가 및 RP-HPLC 둘 다에서, 4-wk 동안 pH 8에서, 4℃, 30℃ 및 40℃에서 화학적 안정성을 유지하였다. RP-HPLC 주요 피크 변화: < 2.5% (4-wk 30℃ vs 4℃); <7% (4-wk 40℃ vs 4℃) (표 2 참조).
<표 2>
티오플라빈 T 결합 검정을 사용하는 물리적 안정성 시험
피브릴화는 글루카곤이 수용액 중에 제제화될 때의 흔한 문제이다. 본 발명의 화합물의 피브릴화의 수준을 평가하기 위해, 티오플라빈 T 결합 검정을 수행하였다.
서열 2의 화합물을, 매우 작은 교반 막대 (피셔 카탈로그(Fisher Catalog) # 1451364)를 함유하는, 편평 바닥을 갖는 2.5 mL 피셔 바이알 (피셔 FS60965D)에 1 mg/mL로, 다양한 시험 완충제 중에 용해시켰다. 시험 완충제를 H2O 중에 제조하고, 모두 pH 8.0으로 조정하였다:
완충제 1= 20 mM 트리스-HCl
완충제 2= 20 mM 트리스-HCl, 150 nM NaCl
완충제 3= 20 mM 트리스-HCl, 300 mM 수크로스
완충제 4= 20 mM 트리스-HCl, 300 mM 소르비톨
완충제 5= 20 mM 트리스-HCl, 0.02% 트윈(Tween) 80
추가로, 인간 글루카곤 (서열 1)을 pH 2.8의 12 mg/mL 글리세롤 용액 중에 1 mg/mL의 최종 농도로 용해시켰다. 모든 샘플을 300 rpm으로 설정된 자기 교반 플레이트에서, 25℃에서 기계적으로 스트레스를 주었다. 상이한 샘플의 분취물 (100 μL 각 분취물 및 3중으로 수행)을 시점 0, 40 및 120시간에서 취하고, 플레이트에 첨가한 다음, 10 μL의 1 mM 티오플라빈 T (H2O 중의 원액, pH 2.8) (T35516-25G, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich))를 첨가하였다. 샘플을 30분 동안 인큐베이션하였다. 형광을, 여기 파장으로서 440 ηm을 사용하고, 방출 파장을 480 ηm로 설정 (475 ηm 컷오프 및 자동 감도 조정)하여, 스펙트라맥스(Spectramax) M5 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))를 사용하여 측정하였다. 미가공 데이터는 소프트맥스 프로(Softmax Pro) 5.4.1 (몰레큘라 디바이시스)로 수집하고 엑셀에 입력하였다. 각 시점당 3개 웰의 평균은 하기 표 3에 나타난, 보고된 형광 단위이다:
<표 3>
표 3에 나타난 바와 같이, 서열 2의 화합물은, 시각적 평가 및 티오플라빈 T 결합 검정 둘 다에 의해 평가된 바와 같이 기계적 스트레스의 존재 하에 120시간 동안 25℃ 및 pH 8에서 물리적 안정성을 유지하였다. 서열 2의 화합물은 티오플라빈 T 결합 검정에 의해 측정된 바와 같이 유의한 피브릴화를 나타내지 않았다.
C57/Bl6 수컷 마우스에서 혈액 글루코스 수준에 대한 화합물의 효과
혈액 글루코스 수준에 대한 서열 2의 화합물의 효과를 결정하기 위해, 화합물을 C57/B16 마우스에 투여하였다. 3개월령 수컷 C57BL6 마우스 (하를란 래보러토리즈(Harlan Laboratories))를 사용하였다. 동물을 12시간 명/암 주기를 갖는 온도-제어 (24℃) 설비에 개별적으로 수용하고, 음식 및 물에 자유롭게 접근하게 하였다. 설비에 1주 순응시킨 후, 마우스를 치료군에 무작위화하였다 (n= 4/군). 시험 화합물을 완충제 2 중에 제제화하였다 (티오플라빈 T 결합 검정을 사용한 물리적 안정성 시험 참조). 시험일의 아침에, 음식을 오전 8시에 제거하였다. 음식을 제거한 지 2시간 후, 시험 화합물을 0, 1, 3 또는 10 μg/kg 용량으로 피하로 투여하였다. 혈액 글루코스를 시험 화합물 투여 후 0, 15, 30, 60 및 120분에 아큐-체크(ACCU-CHECK)® (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics)) 혈당측정기로 측정하였다. 표 4는 상이한 시점에서의 글루코스 값을 나타낸다. 결과는 군당 4마리 마우스의 평균 ± 표준 오차 평균 (SEM)으로 표현된다.
ED50을 30분 글루코스 측정값에서 계산하였다. 10 μg/kg의 서열 2의 화합물에서의 혈액 글루코스 수준을 최대값으로서 취하였다. 서열 2의 화합물에 대해, ED50은 3.34 μg/kg (95% 신뢰 구간)이었다. 결과는 서열 2의 화합물이 혈액 글루코스를 증가시킬 수 있음을 입증한다.
<표 4>
인간 글루카곤 수용체 결합 검정
서열 2의 화합물의 결합을 인간 글루카곤 수용체 (hGR)를 과다발현하는 293HEK 세포주를 사용하여 결정하였다 (Lok S et al. Gene 140 (2), 203-209 (1994); GenBank: L20316).
조 형질 막을 현탁 또는 부착 배양물로부터의 세포를 사용하여 제조하였다. 세포 펠릿을, 20 μg/ml에서의 DNAase (인비트로젠(Invitrogen), 18047-019)를 포함하는 저장성 균질화 완충제 (25 mM 트리스 HCl, pH 7.5, 1 mM MgCl2, 및 EDTA를 포함하지 않는 로슈 컴플리트(Roche Complete)TM 억제제 (로슈, 11873580001)) 중에 얼음 상에서 용해시켰다. 세포 현탁액을, 25 스트로크를 위한 테플론(Teflon) 막자를 이용하는 유리 다운스 균질화기로 균질화하였다. 균질물을 4℃에서 15분 동안 1800 X g에서 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 펠릿을 (DNAse를 포함하지 않는) 저장성 균질화 완충제 중에 재현탁시키고, 재균질화하였다. 혼합물을 15분 동안 1800 X g에서 원심분리하였다. 제2 상청액을 제1 상청액과 합하고, 15분 동안 1800 X g에서 원심분리하여 정화시켰다. 정화된 상청액을 4℃에서 30분 동안 25000 X g에서 추가로 원심분리하였다. 막 펠릿을 (DNAse를 포함하지 않는) 저장성 균질화 완충제 중에 재현탁시키고, 사용할 때까지 -80℃에 동결된 분취물로서 저장하였다.
인간 글루카곤을 125I-락토퍼옥시다제 절차에 의해 방사성아이오딘화하고, 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)/NEN (NEX207)에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 비활성은 약 2200 Ci/mmol이었다. KD 결정을, 125I-표지된 글루카곤 물질에서의 높은 프로판올 함량으로 인해 포화 결합 대신에 상동 경쟁에 의해 수행하였다. KD는 1.24 ηM인 것으로 추정되었고, 이를 사용하여 시험된 모든 화합물에 대한 Ki 값을 계산하였다.
수용체 결합 검정을, 1% 지방산 무함유 소 혈청 알부민 (BSA) (깁코(Gibco), 7.5% BSA)으로 이전에 차단된 밀 배아 응집소 (WGA) 비드 (퍼킨-엘머)를 사용하는 섬광 근접 검정 (SPA)을 사용하여 수행하였다 (Sun, S., Almaden, J., Carlson, T.J., Barker, J. and Gehring, M.R. Assay development and data analysis of receptor-ligand binding based on scintillation proximity assay. Metab Eng. 7:38-44 (2005)). 인간 글루카곤 (서열 1) 및 화합물 (서열 2)을 2 mM의 농도로 디메틸 술폭시드 (DMSO) 중에 용해시키고, -20℃에서 동결 저장하였다.
인간 글루카곤 및 서열 2의 화합물을 DMSO에 연속 희석하였다. 10 μL의 희석된 샘플을 40 μL 검정 결합 완충제 (25 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES), pH 7.4, 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0.1% 지방산 무함유 BSA, 0.003% 트윈 20, 및 EDTA를 포함하지 않는 로슈 컴플리트 억제제) 또는 차가운 글루카곤 (최종 1 μM에서의 비-특이적 결합 (NSB))을 함유하는 코닝(Corning) 3632 투명 바닥 검정 플레이트로 옮겼다. 90 μL 막 (3 μg/웰), 50 μL 125I-표지된 글루카곤 (반응에서 0.15 ηM 최종 농도), 및 50 μL의 WGA 비드 (150 μg/웰)를 첨가하였다. DMSO 농도는 4.2%를 초과하지 않았다. 플레이트를 밀봉하고, 회전시키면서 혼합하고, 실온에서의 12시간의 침강 시간 후 마이크로베타(MicroBeta)® 섬광 계수기로 판독하였다.
결과를 화합물의 존재 하의 특이적 125I-표지된 글루카곤 결합의 퍼센트로서 계산하였다. 화합물의 절대 IC50 농도를, 125I-표지된 글루카곤의 퍼센트 특이적 결합 vs. 첨가된 샘플의 농도 (8.5x10-12 내지 0.5x10- 7 mol/L)의 비-선형 회귀에 의해 도출하였다. IC50 용량을 쳉-프루소프(Cheng-Prusoff) 방정식을 사용하여 Ki로 전환시켰다 (Cheng Y., Prusoff W. H., Biochem. Pharmacol. 22: 3099-3108 (1973)). 서열 2의 화합물의 Ki는 hGR 결합에 대해 3.20 ± 0.76 ηM (n=3)이었다 (인간 글루카곤에 대한 Ki는 hGR 결합에 대해 1.66 ± 0.09 ηM (n=47)이었다). 이 데이터는 서열 2의 화합물이 인간 글루카곤과 비교하여 유사한 친화도로 hGR에 결합하고, 그 수용체를 활성화시켜, 결국 글루카곤-의존성 생리학적 반응이 촉발될 수 있음을 입증한다.
마우스 글루카곤 수용체 결합 검정
서열 2의 화합물이 마우스 글루카곤 수용체 (mGR)에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 인간 글루카곤 수용체 결합 검정에 본질적으로 기재된 바와 같은 결합 검정을 수행하였다. 조 형질 막을 클로닝된 mGR을 발현하는, 현탁 배양물 중의 293HEK 세포로부터 제조하였다. ((Burcelin R, Li J, Charron MJ. Gene 164 (2), 305-10 (1995) GenBank: L38613). 막 펠릿을 인간 글루카곤 수용체 결합 검정에 기재된 바와 같이 제조하고, 균질화 완충제 중에 재현탁시키고, 사용할 때까지 -80℃에 동결된 분취물로서 저장하였다.
인간 글루카곤을 125I-락토퍼옥시다제 절차에 의해 방사성아이오딘화하고, 퍼킨-엘머/NEN (NEX207)에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 비활성은 약 2200 Ci/mmol이었다. KD 결정을, 125I-표지된 글루카곤 물질에서의 높은 프로판올 함량으로 인해 포화 결합 대신에 상동 경쟁에 의해 수행하였다. KD는 2.05 ηM인 것으로 추정되었고, 이를 사용하여 시험된 모든 화합물에 대한 Ki 값을 계산하였다.
SPA 수용체 결합 검정 및 그 결과의 계산을 인간 글루카곤 수용체 결합 검정에 기재된 바와 같이 수행하였다. 서열 2의 화합물의 Ki는 mGR 결합에 대해 8.63 ± 0.71 ηM (n=3)이었다 (인간 글루카곤에 대한 Ki는 mGR 결합에 대해 1.37 ± 0.07 ηM (n=33)이었다). 이 데이터는 서열 2의 화합물이 mGR에 결합하고, 그 수용체를 활성화시켜, 결국 글루카곤-의존성 생리학적 반응이 촉발될 수 있음을 입증한다.
글루카곤-유사-펩티드 1 수용체 결합 검정
서열 2의 화합물이 인간 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체 (hGLP-1R)에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 인간 글루카곤 수용체 결합 검정에 본질적으로 기재된 바와 같은 결합 검정을 수행하였다. 조 형질 막을, 293HEK 막으로부터 단리된, 클로닝된 인간 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체 (hGLP-1R) (Graziano MP, Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 196 (1):141-6 (1993) GenBank: NM_002062)를 발현하는, 293HEK 현탁액 세포로부터 제조하였다. 막 펠릿을 인간 글루카곤 수용체 결합 검정에 기재된 바와 같이 제조하고, 균질화 완충제 중에 재현탁시키고, 사용할 때까지 -80℃에 동결된 분취물로서 저장하였다.
글루카곤-유사 펩티드 1 7-36 아미드 (GLP-1 아미드) (서열 3)를 125I-락토퍼옥시다제 절차에 의해 방사성아이오딘화하고, 퍼킨-엘머/NEN (NEX308)에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 비활성은 약 2200 Ci/mmol이었다. KD 결정을, 125I-표지된 GLP-1 아미드 물질에서의 높은 프로판올 함량으로 인해 포화 결합 대신에 상동 경쟁에 의해 수행하였다. KD는 0.329 ηM인 것으로 추정되었고, 이를 사용하여 시험된 모든 화합물에 대한 Ki 값을 계산하였다.
SPA 수용체 결합 검정 및 그 결과의 계산을, 방사성아이오딘화 GLP-1 아미드를 인간 글루카곤 수용체 결합 검정의 방사성아이오딘화 글루카곤 대신에 사용하는 것을 제외하고, 인간 글루카곤 수용체 결합 검정에 기재된 바와 같이 수행하였다.
서열 2의 화합물의 Ki는 hGLP-1R 결합에 대해 >3380 ηM (n=3)인 반면에, 글루카곤 (서열 1)의 Ki는 2098 ± 91 (n=17)이었다 (인간 GLP-1 7-36 아미드에 대한 Ki는 hGLP-1R 결합에 대해 0.427 ± 0.169 ηM (n=64)이었다). 이 데이터는 서열 2의 화합물이 hGLP-1R에 특이적으로 결합하지 않고, 따라서 GLP-1R-매개 생리학적 반응이 개시되지 않음을 입증한다.
글루코스-의존성 인슐린분비자극 펩티드 수용체 결합 검정
서열 2의 화합물이 글루코스-의존성 인슐린분비자극 펩티드 수용체 (GIP-R)에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 인간 글루카곤 수용체 결합 검정에 본질적으로 기재된 바와 같은 결합 검정을 수행하였다. 조 형질 막을, 현탁 배양물로부터의 세포를 사용하여, 인간 GIP-R (R (Usdin,T.B., Gruber,C., Modi,W. and Bonner,T.I., GenBank: AAA84418.1)을 발현하는, 현탁액 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO-S)로부터 제조하였다. 막 펠릿을 인간 글루카곤 수용체 결합 검정에 기재된 바와 같이 제조하고, 균질화 완충제 중에 재현탁시키고, 사용할 때까지 -80℃에 동결된 분취물로서 저장하였다.
GIP (서열 4)를 I-125-락토퍼옥시다제 절차에 의해 방사성아이오딘화하고 (Markalonis, J.J., Biochem. J. 113:299 (1969)), 퍼킨-엘머/NEN (NEX-402)에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 비활성은 2200 Ci/mmol이었다. KD 결정을 포화 결합 대신에 차가운 인간 GIP를 사용하여 상동 경쟁에 의해 수행하였다. KD는 0.174 ηM인 것으로 추정되었고, 이를 사용하여 시험된 모든 화합물에 대한 Ki 값을 계산하였다.
SPA 수용체 결합 검정 및 그 결과의 계산을 인간 글루카곤 수용체 결합 검정에 기재된 바와 같이 수행하였다. 서열 2의 화합물의 Ki는 인간 GIP-R 결합에 대해 >2240 ηM (n=1)인 반면에, 글루카곤 (서열 1)의 Ki는 >3010 (n=1)이었다 (인간 GIP에 대한 Ki는 0.127 ± 0.048 ηM이었다). 이 데이터는 서열 2의 화합물이 hGIP-R에 특이적으로 결합하지 않고, 따라서 hGIP-R-매개 생리학적 반응이 개시되지 않음을 입증한다.
인간 글루카곤 수용체 자극된 cAMP 기능적 검정
hGR 자극된 cAMP 기능적 검정은, 인간 글루카곤 수용체 결합 검정에 상기 기재된 hGR 결합 검정에 사용된 것과 동일한 클로닝된 hGR 발현 세포주를 사용하였다. 세포를 글루카곤, 완충제 대조군, 또는 시험 샘플로 자극하고, 세포 내에서 생성된 cAMP를 시스바이오(CisBio) cAMP 다이나믹(Dynamic) 2 HTRF 검정 키트 (62AM4PEC)를 사용하여 정량화하였다. 간략하게, 세포 내의 cAMP 수준을 세포 용해 완충제의 존재 하의 cAMP-d2 포획 항체에의 결합에 의해 검출하였다. 키트에 제공되는 제2 검출 항체, 항-cAMP 크립테이트를 첨가하여 경쟁적 샌드위치 검정을 만들었다. 검출 항체 복합체가 형성되었을 때 퍼킨-엘머 엔비전(Envision)® 기기에서 측정되는 신호의 증가가 존재하였다.
hGR-HEK293 세포를 효소-무함유 세포 해리 용액 (특수 배지 5-004-B)을 갖는 전면생장 미만 조직 배양 접시로부터 수거하였다. 세포를 실온에서 5분 동안 100 X g에서 펠릿화시킨 다음, 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 2회 세척하였다. 세척된 세포 펠릿을 리커버리(Recovery)TM 동결 배지 (깁코 2044) 중에 1x 107개 세포/ml로 재현탁시키고, 액체 질소 중에서 동결시켰다. 치료 당일에, 세포의 동결된 분취물을 사전-가온된 재현탁 세포 배지 (0.5% 규정된 FBS (하이클론(Hyclone) SH30070); 20 mM HEPES, pH 7.4; 및 2 mM 글루타민을 함유하는 DMEM, 깁코 (31053P))로 옮겼다. 세포를 이어서 실온에서 5분 동안 100 X g에서 펠릿화시켰다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 1.25x105개 세포/ml로 세포 배지 (0.1% 지방산-무함유 소 혈청 알부민, BSA, 7.5%, (깁코 15620); 20 mM HEPES, pH 7.4, 및 2 mM 글루타민을 포함하는 DMEM, 깁코 (31053P)) 중에 재현탁시켰다. 시험 샘플을 DMSO 중의 2 mM 원액으로서 제조하고, 필요할 때까지 -20℃에서 동결시켰다. 글루카곤, 완충제 대조군 및 서열 2의 화합물을 DMSO에 연속 희석한 후에 화합물 희석 배지 (500 μM IBMX를 함유하는 검정 배지 (0.1% 지방산-무함유 소 혈청 알부민, BSA, 7.5%, (깁코 15620); 20 mM HEPES, pH 7.4, 및 2 mM 글루타민을 포함하는 DMEM, 깁코 31053P))에 스텝-다운 희석하였다. 반응을, 20 μL의 세포 (2500개 세포/웰) 또는 cAMP 표준 곡선 샘플을 96 웰 플레이트 절반 면적 흑색 플레이트 (코스타 3694)에 첨가한 후 20 μL의 화합물 희석 배지 중의 2X 농축 글루카곤, 완충제 대조군 또는 서열 2의 화합물을 첨가함으로써, 40 μL 중에서 수행하였다. 최종 DMSO 농도는 1.1%를 초과하지 않고, 최종 IBMX 농도는 250 μM이었다. 반응을, 시스바이오 용해 완충제에 희석된 cAMP-d2-포획 항체 (시스바이오) 20 μL의 첨가에 의해 정지시킨 후, 타이터텍(TITERTEK) 진탕기에서 서서히 혼합하였다. 5분 용해 후, 20 μL의 검출 항체, 항-cAMP 크립테이트 (시스바이오)를 첨가하고 1분 동안 600 rpm에서 혼합하였다. 용해된 세포 및 항체 혼합물을 퍼킨-엘머 엔비전®을 사용하여 실온에서 1시간 후에 판독하였다. 엔비전® 단위를 cAMP 표준 곡선을 사용하여 ρmol/L cAMP/웰로 전환시켰다. 각 웰에서 생성된 피코몰의 cAMP를 글루카곤 대조군에서 관찰되는 최대 반응의 퍼센트로 전환시켰다. 상대 EC50 값은 퍼센트 최대 반응 vs. 첨가된 펩티드의 농도 (0.17x10-12 내지 1x10-8 M)를 사용하는 비-선형 회귀 분석에 의해 도출하였다.
서열 2의 화합물은 0.0658 ±0.0167 ηM (n=8)의 EC50으로 hGR에 결합하였다 (인간 글루카곤에 대한 EC50은 0.0142±0.0018 ηM (n=6)이었다). 이 데이터는 서열 2의 화합물이 hGR에 결합하여, 이를 활성화시키고, 그에 의해 글루카곤 수용체-매개 생리학적 반응이 개시될 수 있음을 입증한다.
서열 목록
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<120> NOVEL COMPOUND FOR TREATMENT OF SEVERE HYPOGLYCEMIA
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<170> PatentIn version 3.5
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<213> Homo sapiens
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<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa at position 16 is 2-aminoisobutyric acid
<400> 2
Tyr Ser His Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Asp Xaa
1 5 10 15
Lys Lys Ala Ala Glu Phe Val Ala Trp Leu Leu Glu Glu
20 25
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<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<221> MOD_RES
<222> (30)..(30)
<223> AMIDATION
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His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
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20 25 30
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys
1 5 10 15
Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys
20 25 30
Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln
35 40
Claims (7)
- Tyr-Ser-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-(Aib)-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Phe-Val-Ala-Trp-Leu-Leu-Glu-Glu (서열 2)의 아미노산 서열을 포함하는 화합물.
- 제1항에 있어서, Tyr-Ser-His-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-(Aib)-Lys-Lys-Ala-Ala-Glu-Phe-Val-Ala-Trp-Leu-Leu-Glu-Glu (서열 2)의 아미노산 서열로 이루어진 화합물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
- 유효량의 제1항 또는 제2항에 따른 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 저혈당증을 치료하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 요법에 사용하기 위한 화합물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 저혈당증의 치료에 사용하기 위한 화합물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 저혈당증의 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 화합물.
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