KR20160077750A

KR20160077750A - 재조합 트랜스 글루타미나아제의 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR20160077750A
Application number: KR1020140188039A
Authority: KR
Inventors: 안정오; 윤남경; 이홍원; 정준기; 이은교
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2014-12-24
Filing date: 2014-12-24
Publication date: 2016-07-04

Abstract

본 발명은 수용성 발현 유도용 단백질을 암호화하는 유전자, 재조합 트랜스 글루타미나아제의 세포 내 활성 억제 서열, 단백질 분해 효소 인식부위를 암호화하는 유전자 및 트랜스 글루타미아나제를 암호화하는 유전자를 포함하는 제1 재조합 발현 벡터; 및 수용성 발현 유도용 단백질을 암호화하는 유전자 및 단백질 분해 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 제2 재조합 발현 벡터; 로 미생물을 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 미생물을 배양하여 활성형의 재조합 트랜스 글루타미나아제를 생산하는 단계; 를 포함하는 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산하기 위한 벡터에 관한 것이다.

Description

재조합 트랜스 글루타미나아제의 대량 생산 방법 {MASS PRODUCTION METHOD OF RECOMBINANT TRANS GLUTAMINASE}

본 발명은 재조합 트랜스 글루타미나아제의 대량 생산을 위한 벡터 및 이를 이용한 재조합 트랜스글루타미나아제의 대량 생산 방법에 관한 것이다.

트랜스 글루타미나아제(Transglutaminase, TGase; protein-glutamine γ-glutamyltransferase, EC2.3.2.13)는 펩티드 사슬의 글루타민 잔기(glutamine residue)의 γ-carboxyamide group과 lysine residue의 ε-amino group 사이의 아실 그룹 이동 반응(acyl group transfer reaction)을 촉매하는 효소로서 ε-(γ-glutamyl)lysine cross-linkage를 형성하는 효소이다.

트랜스 글루타미나아제는 식품 및 어류가공 산업에서 다양하게 활용되고 있고, 비식품산업에서 그 용도가 다양하게 개발되어 의료 공학, 재료과학, 섬유, 피혁가공 등 많은 분야에서 응용되고 있다.

현재 트랜스 글루타미나아제는 대부분 스트렙토마이시스 모바렌시스(Streptomyces mobaraensis)로 부터 전통적 발효공정에 의해 생산하고 있다. 최근에는 유전공학기술을 이용하여, 대장균이나 코리네박테리움에서도 트랜스 글루타미나아제의 생산을 시도하고 있다. 그러나 현재의 트랜스 글루타미나아제 생산 기술은 생산 수율이 낮아 대량생산이 어려운바(대장균: 5 mg/l, S. lividans: 0.1 mg/l, Corynebacterium: 132 mg/l (native type); Shino Takehana, Hiroshi Takagi, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1994 Jan;58(1):88~92; Kinya Washizu, Kazuyuki Takeuchi, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1994 Jan;58(1):82~87; Masayo Date, Yoshimi Kikuchi, Appl Environ Microbiol. May 2003;69(5):3011~3014), 생산 수율을 획기적으로 향상 시킬 필요가 있는 실정이다.

또한, 활성형의 트랜스 글루타미나아제는 세포 내에서 단백질의 가교(crosslinking)를 유도하기 때문에 toxic하여, 세포 내에서는 비활성형의 유지를 위해 성숙형(mature form)의 N-말단(N-terminal)에 활성 억제 서열인 pro-sequence가 붙여져 있다. pro가 붙여져 있는 형태의 트랜스 글루타미나아제 (pro-TGase)는 활성형을 띄지 않지만, 특정 단백질 분해효소에 의해서 pro 서열이 제거되면 활성형을 가지게 된다. 그러나 상기 활성 억제 서열의 제거를 위해 특정 서열을 인식하는 단백질 분해 효소는 고가인바 트랜스 글루타미나아제의 대량생산에 적합하지 않다. 또한 트랜스 글루타미나아제가 불용해성으로 발현되는 것은 복잡한 재접힘(refolding) 과정이 요구되기 때문에 대량생산에 부적합하다.

이에 본 발명자들은, 상기한 문제점을 해결하고 전량 수입에 의존하는 트랜스 글루타미나아제의 국내 자체 대량 생산을 위해, 분자유전학 기술을 이용해 트랜스 글루타미나아제의 대량 발현 방법 및 정제, 분리 공정을 확립함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

1. 대한민국 공개특허공보 제2010-0029566호 2. 국제공개공보 WO1996-006931호

본 발명의 목적은 재조합 트랜스 글루타미나아제의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 트랜스 글루타미나아제를 대량 생산하기 위한 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수용성 발현 유도용 단백질을 암호화하는 유전자, 재조합 트랜스 글루타미나아제의 세포 내 활성 억제 서열, 단백질 분해 효소 인식부위를 암호화하는 유전자 및 트랜스 글루타미아나제를 암호화하는 유전자를 포함하는 제1 재조합 발현 벡터; 및 수용성 발현 유도용 단백질을 암호화하는 유전자 및 단백질 분해 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 제2 재조합 발현 벡터;로 미생물을 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 미생물을 배양하여 활성형의 재조합 트랜스 글루타미나아제를 생산하는 단계; 를 포함하는 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 용어, "벡터"는 적합한 숙주내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 외부 DNA 서열을 포함하는 DNA 작제물을 말한다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 재조합 펩타이드 또는 단백질을 발현시키기 위한 벡터이다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 예컨대, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터 등일 수 있다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 그러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된　숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 본 발명에 이용되는 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 용어, "작동가능하게 연결"되어 있다는 것은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열(예컨대, 트랜스 글루타미나아제-코딩 서열)사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역 과정을 조절하게 된다.

본 발명의 상기 제1 재조합 발현 벡터는 수용성 발현 유도용 단백질을 암호화하는 유전자, 재조합 트랜스 글루타미나아제의 세포 내 활성 억제 서열, 단백질 분해 효소 인식부위를 암호화하는 유전자 및 트랜스 글루타미아나제를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있으며, 상기 유전자를 차례로 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, “수용성 발현 유도용 단백질”은 비용해성 단백질 형태의 발현이 대량생산에 부적합하다는 단점을 개선하기 위해 재조합 단백질을 수용성의 융합 단백질로 생산할 수 있는 단백질을 말한다. 재조합 단백질을 불용성 형태에서 수용성형태로 생산하기 위해, 보통의 경우 수용성 증진성 단백질의 결합형태인 융합단백질형태로 생산하는 방법을 사용하는데, 모든 단백질이 수용성 증진성 단백질을 부착한다고 하더라도 수용성형태로 생산되지 않을 수 있으며, 또한 융합단백질형태로 수용성 형태로 발현이 될 경우에는 목적단백질의 고유의 활성을 잃어버릴 수가 있으며, 더욱이, 목적단백질에서 수용성 증진성 태그를 제거해야하는 번거로운 일이 발생할 수 있다. 본 발명에서는 복잡한 재접힘(refolding) 과정이 불필요한 수용성 단백질로의 발현을 극대화하기 위하여, 베타-갈락토시다제(β-galactosidase), CAT(chloramphenicol acetyltransferase), GST(glutathione S transferase) 및 MBP(maltose binding protein) 등의 단백질을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 가장 바람직하게는 MBP(maltose binding protein)를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 수용성 발현 유도용 단백질로 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 말토오스 결합 단백질을 결합하여, 융합단백질(Fusion protein) 형태로 발현시켜 수용성 단백질로의 발현을 유도하는 공정을 개발하였다. 본 발명의 구체예에서, 상기 수용성 단백질로의 발현은 플라스크 배양 및 5L 발효조를 통한 배양에서도 동일한 양상을 나타내었다.

본 발명의 “재조합 트랜스 글루타미나아제의 세포 내 활성 억제 서열”은 재조합 트랜스 글루타미나아제 발현 시, 활성형 트랜스 글루타미나아제 효소는 세포 내 기작에 영향을 미쳐 발현이 어려운 문제를 해결하고자 결합한 것이다. 구체적으로, 재조합 트랜스 글루타미나아제의 세포 내 활성 억제 서열(pro sequence)을 통해 트랜스 글루타미나아제를 발현시킨 후, 효소 정제 과정에서 추가적인 활성 억제 서열 제거 과정을 통해 상기한 세포 내 기작에 영향을 미치는 문제점을 해결할 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 트랜스 글루타미나아제의 세포 내 활성 억제 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분해 저항성(proteolytic-resistant sequence, pro sequence) 서열일 수 있다.

본 발명의 “단백질 분해 효소 인식부위”는 본 발명의 재조합 트랜스 글루타미나아제의 발현 후, 트랜스 글루타미나아제 활성형으로의 변환을 위하여, 활성 억제 서열 제거를 위해 단백질 분해 효소가 인식하는 아미노산 서열 부위를 말한다.

본 발명의 상기 제2 재조합 발현 벡터는 수용성 발현 유도용 단백질을 암호화하는 유전자 및 단백질 분해 효소를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있으며, 상기 유전자를 차례로 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 수용성 발현 유도용 단백질은 본 발명의 상기 제1 재조합 발현 벡터의 수용성 발현 유도용 단백질과 동일할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 베타-갈락토시다제(β-galactosidase), CAT(chloramphenicol acetyltransferase), GST(glutathione S transferase) 및 MBP(maltose binding protein) 등의 공지된 단백질을 사용할 수 있으며, 특히 MBP(maltose binding protein)를 사용할 수 있다.

상기 제2 재조합 발현 벡터의 “단백질 분해 효소”는 종래 활성 억제 서열 제거를 위해 고가의 단백질 분해 효소 사용함으로써 대량 생산이 어려웠던 문제를 극복하고자, 특정 서열을 인식하는 단백질 분해효소를 자가 생산하기 위한 것이다. 상기 단백질 분해 효소는 바람직하게 트롬빈, TEV(tobacco etch virus)프로테아제, 프리시션(PreScission) 프로테아제, Factor Xa 및 엔테로키나아제(Enterokinase)를 사용할 수 있으며, 바람직하게 TEV(tobacco etch virus)프로테아제를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 구체예에서는 재조합 트랜스 글루타미나아제의 발현 후, 트랜스 글루타미나아제를 활성형으로 변환시키기 위하여, 활성 억제 서열 제거를 위한 특정 아미노산 서열을 인식하는 단백질 분해 효소(Protease)로 Tabacco etch virus 유래의 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 TEV 단백질 분해 효소를 선정하였다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드들은 각각의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 제1 재조합 발현 벡터는 도 1a로 표시되는 것일 수 있으며, 상기 제2 재조합 발현 벡터는 도 1c로 표시되는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 상기 제1 재조합 발현 벡터 및 제2 재조합 발현 벡터는 수용성 융합 단백질로 동시 발현되는 것일 수 있으며, 본 발명의 구체예에서, 말토오스 결합 단백질과 융합단백질 형태의 수용성 단백질로 발현되는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 제2 재조합 발현 벡터는 미생물에 형질전환되어 융합단백질 형태로 발현된 후, 발현 구조 내에 있는 단백질 분해 효소 절단 부위를 인식하여 수용성 발현 유도용 단백질과 단백질 분해 효소 사이를 자가 절단(self-cleavage)할 수 있다.

또한 본 발명의 상기 제2 재조합 발현 벡터로 발현된 단백질 분해 효소는 상기 제1 재조합 발현 벡터로 발현된 수용성 융합 단백질의 활성 억제 부위를 제거하여 트랜스 글루타미나아제를 활성형으로 만들 수 있다. 본 발명의 구체예에서, 상기 발현된 단백질 분해 효소는 발현 구조 내에 있는 단백질 분해 효소 절단 부위를 인식하여 수용성 발현 유도용 단백질과 활성 억제 서열을 제거하는 것일 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 형질전환 미생물의 배양은 유가식 배양방법으로 배양할 수있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 배양 온도는 20 내지 40 ℃ 일 수 있으며, 본 발명의 상기 재조합 발현 벡터를 형질전환한 미생물은 28℃ 이상에서도 100% 수용성 융합단백질로 발현될 수 있으며, 37℃ 이상에서 50% 이상의 수용성 융합단백질로 발현될 수 있다.

본 발명의 구체예에서, 상기 형질전환된 미생물은 대장균일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게 E. coli MG1655 또는 BL21 일 수 있다.

본 발명의 상기 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법은 재조합 트랜스 글루타미나아제를 생산 및 분비하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으며, 상기 생산, 분비된 트랜스 글루타미나아제를 정제 및 분리하는 공정을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한,

수용성 발현 유도용 단백질을 암호화하는 유전자, 재조합 트랜스 글루타미나아제의 세포 내 활성 억제 서열(proteolytic-resistant sequence), 단백질 분해 효소 인식부위를 암호화하는 유전자 및 트랜스 글루타미아나제를 암호화하는 유전자; 수용성 발현 유도용 단백질을 암호화하는 유전자 및 단백질 분해 효소를 암호화하는 유전자를 차례로 포함하는 재조합 트랜스 글루타미나아제 생산용 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 도 9로 표시되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 재조합 발현 벡터는 균체 내에서 동시에 트랜스 글루타미나아제와 단백질 분해 효소를 발현시킬 수 있다.

본 발명의 구체예에서는, pACYC MBP-proTGase::MBP-TEV 발현 벡터를 E. coli MG1655와 BL21 균주에 형질 전환하여 플라스크 배양한 결과, 세포 내에서 발현된 TEV 단백질이 수용성 억제서열 결합 융합 단백질 형태의 트랜스 글루타미나아제를 100% 분해하여 활성형의 트랜스글루타미나아제로 생성하는 것을 확인하였다.

본 발명에 따른 활성형 트랜스 글루타미나아제의 대량 생산 방법은 세포 내 기작에 영향을 주지 않아 활성형 효소의 대량 생산이 가능하다. 또한, 추가적인 재접힘(refolding) 과정이 불필요하여 생산 방법이 간단하다.

도 1은 본 발명의 융합 단백질 형태의 발현 벡터를 나타낸다(a: pKPM::MBP-pro-TEV site-TGase 벡터; b: pKPM::pro-TEV site-TGase 벡터; c: pET::MBP-TEV site-TEV 벡터; T7: T7 프로모터; MBP: 말토오스 결합 도메인(maltolse-binding domain); linker: proteolytic-resistant sequences, TGase: 트랜스 글루타미나아제 codon-optimized gene; H6: 6XHistidine tag; TEV: codon-optimized gene; T7t: T7 터미네이터; 화살표를 통해, 각각의 재조합 단백질 밴드를 나타냄).
도 2는 대장균에서 도 1의 새가지 벡터를 배양 온도별로 발현시킨 웨스턴 블롯 결과이다(a: pKPM::pro-TEV site-TGase 벡터 발현 결과, b: pKPM::MBP-pro-TEV site-TGase 벡터 발현 결과; c: pET::MBP-TEV site-TEV 벡터 발현 결과임).
도 3은 5L 발효조를 이용한 pKPM::MBP-pro-TEV site-TGase 벡터의 유가식 배양 결과이다.
도 4는 본 발명의 활성형의 트랜스 글루타미나아제의 대량 생산 방법의 모식도이다.
도 5는 in-vitro 조건에서 본 발명의 활성형 트랜스 글루타미나아제의 생산을 위한 벡터에 클로닝된 모든 효소들의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.
도 6은 in-vivo 시스템에서 본 발명의 활성형의 트랜스 글루타미나아제의 대량 생산하기 위한 방법의 모식도이다.
도 7은 in-vivo 시스템 적용하기 위한 pACYC MBP-proTGase::MBP-TEV 발현 벡터의 모식도이다.
도 8은 In-vivo 발현 조건에서 pACYC MBP-proTGase::MBP-TEV 발현 벡터를 E. coli MG1655와 BL21 균주에 형질 전환한 후의 활성형 트랜스 글루타미나아제의 생성을 확인한 단백질 발현 결과이다.
도 9는 본 발명의 활성형 트랜스 글루타미나아제를 Ni 컬럼을 이용해 정제한 결과이다(레인 1은 정제 전 시료이며, 레인 4~9(E1~E6)는 활성형 트랜스 글루타미나아제 정제 프랙션을 나타낸다).
도 10은 발효조를 이용한 in-vivo 시스템에서의 트랜스 글루타미나아제 발현 양상을 확인한 결과이다(숫자는 IPTG 발현 유도 후의 시간을 나타내며, 16I와 16S는 각각 16시간 후 불용해성 분획물과 용해성 분획물을 나타낸다).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 이 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 재조합 발현벡터의 제조

트랜스 글루타미나아제(이하, TGase로 혼용됨)와 TEV protease를 코딩하는 유전자를 코돈 최적화하여 대장균에서 발현가능한 벡터를 도 1과 같이 제조하였다.

알려진 유전정보를 기반으로 미국의 DNA2.0사에서 코돈 최적화를 수행하였다. 코돈 최적화된 글루타미나아제(CpTgase-optEc)는 5` 말단에 EcoR I, 3` 말단에 Xho I 제한효소 사이트를 삽입하여 pJ204 벡터에 삽입하여 제작되었으며, CpTgase-optEc-pJ204로 명명하였다. 유전자 서열 132번째 아미노산 phenylalanine(F)을 valine(V), 142번째 아미노산 alanine(A)을 aspartic acid(D), 255번째 아미노산 glycine(G)을 aspartic acid(D)로 변경하였다. 코돈 최적화된 TEV(CpTEVp-optEc)는 5` 말단에 EcoR I, 3` 말단에 Xho I 제한효소 사이트를 삽입하여 pJ204 벡터에 삽입하여 제작되었으며, CpTEVp-optEc-pJ204로 명명하였다. 유전자 서열 17번째 아미노산 threonine(T)을 serine(S), 56번째 아미노산 leucine(L)을 valine(V), 68번째 아미노산 asparagine(N)을 aspartic acid(D), 77번째 아미노산 isoleucine(I)을 valine(V), 135번째 아미노산 serine(S)을 glycine(G), 219번째 아미노산 serine(S)을 valine(V)로 변경하였다.

최적화된 글루타미나아제와 TEV의 플라스미드를 EcoR I과 Xho I 제한 효소 처리 후, 같은 제한 효소로 분해된 pKPM::MBP 벡터와 pKPM 벡터에 도입되었다. 이 플라스미드는 pKPM::pro-TEVsite-TGase, pKPM::MBP-pro-TEVsite-TGase와 pKPM::MBP-TEV로 최종 명명하였다.

< 실시예 2> 플라스크에서 단백질 발현결과

상기 실시예 1에 따른 각각의 벡터로 대장균을 형질전환하여 발현을 유도하였다.

이때 사용된 대장균은 B 계열 대장균 BL21(DE3) (E. coli B F- dcm opmT hsdS(rB- mB -a) gal λ,Novagen, USA)과 K 계열 대장균인 MG1655(DE3) [F- λ- ilvG- rfb -50 rph -1]를 효소 유전자 발현을 위한 숙주세포로 사용하였으며, 상기 형질 전환체는 50 μg/ml 의 kanamycin을 함유하는 auto induction 배지(표 1)를 이용하여 37°C, 28°C, 22℃에서 각각 약 16시간 동안 배양하였다. 발현시스템은 일반적으로 고가의 IPTG를 이용하여 T7 promotor를 작동시켜 단백질의 과발현을 유도하나 본 연구에서 사용된 auto induction 배지를 이용하여 이 IPTG 대신에 락토오즈를 유도 물질로 대체하여, 재조합 균주의 세포농도 증식과 단백질 과발현을 유도하였다.

Auto induction 배지 조성

성분	g/L
Glucose	30
Glycerol	20
Lactose	15
MgSO₄-7H₂O	2
Yeast extract	20
Casein peptone	10
(NH₄)₂SO₄	10
NaCl	0.5
Trace element(ml)	1
Antiform(ml)	0.5
KH₂PO₄	3
Na₂HPO₄-12H₂O	3

그 결과, pKPM::pro-TEV site-TGase 벡터를 형질 전환한 균주는 37도 배양에서는 모두 불용성의 단백질로 발현 되었으며, 28도 배양에서는 50%의 단백질만이 수용성, 22도 배양에서는 100% 모두 수용성으로 발현되었다(도 2a). pKPM::MBP-pro-TEVsite-TGase 벡터를 형질 전환한 균주는 37도 배양에서 단백질 중 50%가 수용성으로 발현 되었으며, 28도와 22도 배양에서는 100% 수용성으로 발현되었다(도 2b). pET::MBP-TEV site-TEV 벡터를 형질 전환한 균주는 세포 내에서 TEV 단백질이 발현되어 발현 구조내에 있는 TEV site를 인식하여 MBP와 TEV 사이를 자가 절단(self-cleavage)하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과, 37도 배양에서 수용성으로 발현된 MBP 단백질 밴드(42kDa)와 TEV(25kDa) 단백질 밴드를 확인하였다(도 2c).

< 실시예 3> 발효조에서 단백질 발현결과

pKPM::MBP-pro-TEVsite-TGase 벡터를 형질 전환한 균주를 5L 발효조에서 배양하여, 단백질의 대량발현을 유도하였다. 발효조 배양을 위한 배지의 조성은 표 2와 같다. 초기의 포도당 농도를 15 g/L로 하고, 이 포도당이 다 고갈되어 pH, DO가 급격하게 증가하는 시점에서 대체 유도물질인 락토오즈를 15 g/L을 일시적으로 공급함과 동시에 대장균의 생존에 필요한 최소한의 탄소원 공급을 위해 600 g/L의 포도당을 이용하여 6 g/L/h로 지속적으로 공급하였다. 배양 결과, 균체는 155.2 OD 정도의 고농도로 성장하였으며, 배양 후 전기영동을 통한 단백질 발현 분석결과, 배양말기에 TGase 발현양은 총단백질의 45% 였으며, 모두 수용성으로 12.62 g/L가 발현된 것을 확인하였다.

발효조 배양 배지 조성

성분	g/L (초기)	g/L (첨가)
Glucose	15	600
Lactose	-	15
MgSO₄	1	-
Yeast extract	20	-
Casein peptone	15	-
(NH₄)₂SO₄	8	-
NaCl	1	-
Trace element(ml)	1	-
Antiform(ml)	0.5	-
KH₂PO₄	1.6	-
K₂HPO₄	4.4	-

< 실시예 4> 발효조에서 활성형의 MBP - TGase 분리 결과 확인

실시예 2에서 발현 확인된 세포를 소니케이션으로 파쇄하고 상층액으로부터 Ni-NTA agaros 레진을 이용하여 pro-TGase, MBP-pro-TGase, TEV 단백질을 정제하였다. 정제된 단백질은 50mM NaH₂PO₄ _ㆍ2H₂O, 250mM NaCl pH7.5 버퍼로 투석하였다. Pro-TGase와 TEV 단백질, MBP-pro-TGase와 TEV 단백질을 20ug씩 혼합하여 37℃에서 1시간 반응하였다.

도 5의 레인 1과 4는 정제된 MBP-proTGase와 proTGase 단백질, 레인 3과 6은 정제된 TEV 단백질, 레인 2는 MBP-proTGase와 TEV 혼합 후 37℃에서 1시간 반응 후의 시료, 5는 proTGase와 TEV 혼합 후 37℃에서 1시간 반응 후의 시료이다. 즉, MBP-pro-TGase와 pro-TGase의 형태로 발현된 단백질들을 TEV에 의한 절단을 통해, 활성형 TGase를 분리하는 시도한 결과, TEV에 의해서 활성형 TGase가 분리되는 것을 확인하였다(도 5).

< 실시예 5> in vivo 조건에서 트랜스 글루타미나아제의 활성화 확인

본 발명에서 활성형의 트랜스 글루타미나아제를 생성하기 위해서 확립한 방법은 기질로 이용되는 두 가지 형태의 TGase와 TEV를 모두 정제한 단백질을 이용한 것이다. 활성형 트랜스 글루타미나아제 분리 공정 단계를 최소화하고 TEV 단백질 분해 효소의 효율을 높이기 위해서 in-vivo에서 트랜스 글루타미나아제와 TEV 단백질을 동시 발현하는 벡터를 개발하였다(도 7).

활성형 TGase만을 획득하기 위하여 TGase 단백질의 C 말단에 his tag을 첨가하고 TEV 단백질에는 tag을 부착하지 않았다. 실시예 1에서 구축된 pKPM MBP-pro-TEV site-TGase 플라스미드의 T7 promotor와 T7 terminator를 포함하도록 프라이머를 디자인 하였으며 프라이머의 양 말단에 Hind III 제한 효소를 도입하였다. 증폭된 DNA는 In-fusion™ Advantage PCR cloning kit (Clontech, USA)를 이용하여 Hind III로 분해된 pACYC184에 삽입하였다. 구축된 플라스미드는 pACYC MBP-pro-TGase 로 명명하였다.

pKPM MBP-TEV의 T7 promotor와 T7 terminator를 포함하도록 양 말단에 Sal I 효소를 포함하는 프라이머를 이용하여 증폭하였다. PCR 산물은 In-fusion™ Advantage PCR cloning kit (Clontech, USA)를 이용하여 Sal I으로 분해된 pACYC184 MBP-pro-TGase에 각각 삽입하였다. 구축된 플라스미드는 pACYC MBP-pro-TGase :: MBP-TEV로 최종 명명하였다. 본 발명의 in-vivo 발현 시스템은 도 6으로 모식화하였다.

프라이머 서열 정보

이름	서열(5`-3`)	서열번호
Hind III For	GTTTGACAGCTTATCATCGAT aagctt AATTAATACGACTCACTATAG	11
Hind III Rev	CTGTGATAAACTACCGCATTAaagcttCAAAAAACCCCTCAAGACCCG	12
Sal I For	CAGGAGTCGCATAAGGGAGAGC gtcgac AATTAATACGACTCACTATAG	13
Sal I Rev	GAAGGCTCTCAAGGGCATCG gtcgac CAAAAAACCCCTCAAGACCCG	14

상기의 방법으로 제작된 발현벡터를 E. coli MG1655와 BL21 균주에 형질 전환하였다. 상기 형질 전환체는 25 μg/ml 의 chloramphenicol을 함유하는 LB 배지에서 37°C에서 3시간 배양 후(OD 0.4) 0.04mM, 0.4mM의 IPTG를 첨가하여 200rpm, 25°C에서 각각 약 16시간 동안 배양하였다.

상기 형질 전환체의 플라스크 배양결과, MG1655 균주에서 TEV에 의해 융합 단백질이 100% 분해되어 활성형의 트랜스 글루타미나아제가 생성됨을 확인하였다(도 8).

발현 확인된 세포는 소니케이션으로 파쇄하고 상층액으로부터 Ni-NTA agarose 레진을 이용하여 정제하여 순도 90%의 활성형 TGase를 분리하였다(도 9).

분리된 활성형 트랜스 글루타미나아제는 한국기초과학연구소에 N-말단 분석을 의뢰하여 활성형 트랜스 글루타미나아제의 단백질 서열을 확인하였다. Microbial transglutaminase assay kit (Zedira)을 사용하여 단백질 활성을 확인한 결과, 31.17U/mg의 활성을 가짐을 확인하였다.

또한, 유가식 배양을 통해서도 TGase가 in vivo에서 활성화가 되는 것을 확인하였다(도 10). 구체적으로, pACYC MBP-pro-TGase :: MBP-TEV 플라스미드를 형질 전환한 MG1655균주를 5L 발효조에서 배양하여, 단백질의 대량발현을 유도하였다. 발효조 배양을 위한 배지의 조성은 표 4와 같다. 초기의 포도당 농도를 15 g/L로 하고, 이 포도당이 다 고갈되어 pH, DO가 급격하게 증가하는 시점에서 대장균의 생존에 필요한 최소한의 탄소원 공급을 위해 600 g/L의 포도당을 이용하여 6 g/L/h로 지속적으로 공급하였다. 균체가 8 OD가 되었을 때 유도물질인 IPTG 0.04mM을 첨가하였다. 수용성의 단백질 발현을 유도하기 위해 배양 온도는 25℃로 낮추었다. 배양 결과, 균체는 26.48 OD 정도로 성장하였으며, 배양 후 전기영동을 통한 단백질 발현 분석결과, 배양말기에 TGase 발현양은 총단백질의 3.1% 였으며, 모두 수용성으로 156mg/L가 발현된 것을 확인하였다.

발효조 배양 배지 조성

성분	g/L (초기)	g/L (첨가)
Glucose	15	600
IPTG	-	0.04mM
MgSO₄	1	-
Yeast extract	20	-
Casein peptone	15	-
(NH₄)₂SO₄	8	-
NaCl	1	-
Trace element(ml)	1	-
Antiform(ml)	0.5	-
KH₂PO₄	1.6	-
K₂HPO₄	4.4	-

<110> Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology <120> MASS PRODUCTION METHOD OF RECOMBINANT TRANS GLUTAMINASE <130> p14r16d1756 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 367 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> maltose binding protein <400> 1 Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr 355 360 365 <210> 2 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> proteolytic-resistant sequence <400> 2 Asp Asn Gly Ala Gly Glu Glu Thr Lys Ser Tyr Ala Glu Thr Tyr Arg 1 5 10 15 Leu Thr Ala Asp Asp Val Ala Asn Ile Asn Ala Leu Asn Glu Ser Ala 20 25 30 Pro Ala Ala Ser Ser Ala Gly Pro Ser Phe Arg Ser Pro 35 40 45 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tobacco etch virus cleavage site <400> 3 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 4 <211> 339 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Transglutaminase <400> 4 Asp Ser Asp Asp Arg Val Thr Pro Pro Ala Glu Pro Leu Asp Arg Met 1 5 10 15 Pro Asp Pro Tyr Arg Pro Ser Tyr Gly Arg Ala Glu Thr Val Val Asn 20 25 30 Asn Tyr Ile Arg Lys Trp Gln Gln Val Tyr Ser His Arg Asp Gly Arg 35 40 45 Lys Gln Gln Met Thr Glu Glu Gln Arg Glu Trp Leu Ser Tyr Gly Cys 50 55 60 Val Gly Val Thr Trp Val Asn Ser Gly Gln Tyr Pro Thr Asn Arg Leu 65 70 75 80 Ala Phe Ala Ser Phe Asp Glu Asp Arg Phe Lys Asn Glu Leu Lys Asn 85 90 95 Gly Arg Pro Arg Ser Gly Glu Thr Arg Ala Glu Phe Glu Gly Arg Val 100 105 110 Ala Lys Glu Ser Phe Asp Glu Glu Lys Gly Phe Gln Arg Ala Arg Glu 115 120 125 Val Ala Ser Val Met Asn Arg Ala Leu Glu Asn Ala His Asp Glu Ser 130 135 140 Ala Tyr Leu Asp Asn Leu Lys Lys Glu Leu Ala Asn Gly Asn Asp Ala 145 150 155 160 Leu Arg Asn Glu Asp Ala Arg Ser Pro Phe Tyr Ser Ala Leu Arg Asn 165 170 175 Thr Pro Ser Phe Lys Glu Arg Asn Gly Gly Asn His Asp Pro Ser Arg 180 185 190 Met Lys Ala Val Ile Tyr Ser Lys His Phe Trp Ser Gly Gln Asp Arg 195 200 205 Ser Ser Ser Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Asp Ala Phe Arg 210 215 220 Pro Ala Pro Gly Thr Gly Leu Val Asp Met Ser Arg Asp Arg Asn Ile 225 230 235 240 Pro Arg Ser Pro Thr Ser Pro Gly Glu Gly Phe Val Asn Phe Asp Tyr 245 250 255 Gly Trp Phe Gly Ala Gln Thr Glu Ala Asp Ala Asp Lys Thr Val Trp 260 265 270 Thr His Gly Asn His Tyr His Ala Pro Asn Gly Ser Leu Gly Ala Met 275 280 285 His Val Tyr Glu Ser Lys Phe Arg Asn Trp Ser Glu Gly Tyr Ser Asp 290 295 300 Phe Asp Arg Gly Ala Tyr Val Ile Thr Phe Ile Pro Lys Ser Trp Asn 305 310 315 320 Thr Ala Pro Asp Lys Val Lys Gln Gly Trp Pro Leu Glu His His His 325 330 335 His His His <210> 5 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized tobacco etch virus protease <400> 5 Gly Glu Ser Leu Phe Lys Gly Pro Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser Ser 1 5 10 15 Ser Ile Cys His Leu Thr Asn Glu Ser Asp Gly His Thr Thr Ser Leu 20 25 30 Tyr Gly Ile Gly Phe Gly Pro Phe Ile Ile Thr Asn Lys His Leu Phe 35 40 45 Arg Arg Asn Asn Gly Thr Leu Val Val Gln Ser Leu His Gly Val Phe 50 55 60 Lys Val Lys Asp Thr Thr Thr Leu Gln Gln His Leu Val Asp Gly Arg 65 70 75 80 Asp Met Ile Ile Ile Arg Met Pro Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro Gln 85 90 95 Lys Leu Lys Phe Arg Glu Pro Gln Arg Glu Glu Arg Ile Cys Leu Val 100 105 110 Thr Thr Asn Phe Gln Thr Lys Ser Met Ser Ser Met Val Ser Asp Thr 115 120 125 Ser Cys Thr Phe Pro Ser Gly Asp Gly Ile Phe Trp Lys His Trp Ile 130 135 140 Gln Thr Lys Asp Gly Gln Cys Gly Ser Pro Leu Val Ser Thr Arg Asp 145 150 155 160 Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Ala Ser Asn Phe Thr Asn Thr Asn 165 170 175 Asn Tyr Phe Thr Ser Val Pro Lys Asn Phe Met Glu Leu Leu Thr Asn 180 185 190 Gln Glu Ala Gln Gln Trp Val Ser Gly Trp Arg Leu Asn Ala Asp Ser 195 200 205 Val Leu Trp Gly Gly His Lys Val Phe Met Val Lys Pro Glu Glu Pro 210 215 220 Phe Gln Pro Val Lys Glu Ala Thr Gln Leu Met Asn Arg Arg Arg Arg 225 230 235 240 Arg <210> 6 <211> 1101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> maltose binding protein <400> 6 atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac t 1101 <210> 7 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> proteolytic-resistant sequence <400> 7 gacaatggcg cgggggaaga gacgaagtcc tacgccgaaa cctaccgcct cacggcggat 60 gacgtcgcga acatcaacgc gctcaacgaa agcgctccgg ccgcttcgag cgccggcccg 120 tcgttccggt ccccc 135 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tobacco etch virus cleavage site <400> 8 gagaatcttt attttcaggg c 21 <210> 9 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon-optimized trans glutaminase <400> 9 gattctgatg accgcgtaac cccaccagct gaaccactcg atcgcatgcc agacccttat 60 cgcccgtcct atggtcgcgc ggaaacggtc gttaacaact atattcgtaa atggcaacaa 120 gtttacagcc atcgtgacgg tcgtaagcag cagatgacgg aagagcagcg cgagtggctg 180 agctacggtt gcgtcggtgt tacctgggtc aatagcggcc agtacccgac gaaccgtctg 240 gcgtttgcga gcttcgatga ggatcgtttt aagaacgagc tgaagaacgg tcgtccgcgt 300 agcggtgaaa cccgtgcgga gtttgagggc cgtgtcgcaa aagagtcgtt cgatgaagaa 360 aaaggcttcc aacgcgctcg tgaagtggcc agcgtgatga atcgtgcgct ggagaacgca 420 cacgacgaaa gcgcgtacct ggacaatttg aagaaagagc tggcgaatgg caatgatgcg 480 ctgcgtaacg aggatgcgcg cagcccgttt tactctgcct tgcgtaacac cccgtccttc 540 aaagagcgta acggtggtaa tcatgatccg agccgcatga aagcggtgat ctatagcaag 600 catttttgga gcggtcaaga tcgtagcagc agcgcagaca agcgcaaata cggcgacccg 660 gacgcgttcc gccctgcacc gggtaccggc ctggtggata tgagccgcga ccgtaatatc 720 ccgcgtagcc cgacctctcc gggcgaaggt ttcgttaact ttgactacgg ctggttcggt 780 gcccagactg aggcggacgc tgataaaacc gtgtggaccc acggtaatca ctatcacgcc 840 ccgaacggca gcctgggcgc aatgcacgtt tacgaaagca agttccgtaa ttggtccgag 900 ggttacagcg acttcgaccg tggtgcctat gttattacgt ttatcccgaa gtcctggaat 960 acggcaccgg acaaggtgaa acagggttgg ccgctcgagc accaccacca ccaccactga 1020 1020 <210> 10 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tobacco etch virus protease <400> 10 ggtgaatcgc tgtttaaagg tccgcgcgac tataatccga ttagcagctc tatctgtcac 60 ctgacgaatg agagcgatgg tcacaccacc tctctgtacg gcatcggttt tggtccgttc 120 attatcacga ataaacactt gtttcgccgc aataatggca ccctggtcgt tcagagcctg 180 cacggtgtgt tcaaggttaa agacacgacc actctgcagc aacacttggt ggatggccgt 240 gatatgatta tcatccgtat gcctaaagat ttcccgccgt tcccgcagaa gctgaagttc 300 cgcgaaccac aacgtgaaga gcgtatctgc ctggttacga ccaattttca gaccaagagc 360 atgtccagca tggtgagcga cacgtcctgt accttcccga gcggtgatgg catcttttgg 420 aagcattgga ttcaaactaa ggacggtcag tgcggcagcc cgctggttag cacccgtgac 480 ggcttcattg tcggcattca ttcggcgagc aactttacga ataccaataa ctactttacc 540 agcgtcccga agaatttcat ggagttgctg acgaatcaag aggcacaaca atgggtaagc 600 ggttggcgtc tgaacgccga ctccgtgctg tggggtggtc ataaagtgtt catggttaaa 660 ccagaagagc cgtttcagcc ggtcaaagag gcgacccagc tgatgaatcg tcgtcgtcgc 720 cgttaataa 729 <210> 11 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hind III Forward primer <400> 11 gtttgacagc ttatcatcga taagcttaat taatacgact cactatag 48 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hind III Reverse primer <400> 12 ctgtgataaa ctaccgcatt aaagcttcaa aaaacccctc aagacccg 48 <210> 13 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal I Forward primer <400> 13 caggagtcgc ataagggaga gcgtcgacaa ttaatacgac tcactatag 49 <210> 14 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sal I Reverse primer <400> 14 gaaggctctc aagggcatcg gtcgaccaaa aaacccctca agacccg 47

Claims

수용성 발현 유도용 단백질을 암호화하는 유전자, 재조합 트랜스 글루타미나아제의 세포 내 활성 억제 서열, 단백질 분해 효소 인식부위를 암호화하는 유전자 및 트랜스 글루타미아나제를 암호화하는 유전자를 포함하는 제1 재조합 발현 벡터; 및 수용성 발현 유도용 단백질을 암호화하는 유전자 및 단백질 분해 효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 제2 재조합 발현 벡터;로 미생물을 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 미생물을 배양하여 활성형의 재조합 트랜스 글루타미나아제를 생산하는 단계; 를 포함하는 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 수용성 발현 유도용 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 말토오스 결합 단백질(Maltose binding protein)인 것을 특징으로 하는 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 재조합 트랜스 글루타미나아제의 세포 내 활성 억제 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분해 저항성(proteolytic-resistant sequence) 서열인 것을 특징으로 하는 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 TEV((Tavacco Etch Virus) 프로테아제인 것을 특징으로 하는 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 재조합 발현 벡터는 도 1a로 표시되는 것인 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 제2 재조합 발현 벡터는 도 1c로 표시되는 것인 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 제1 재조합 발현 벡터 및 제2 재조합 발현 벡터는 수용성 융합 단백질로 동시 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법.
제7항에 있어서, 상기 제2 재조합 발현 벡터로 발현된 단백질 분해 효소는 상기 제1 재조합 발현 벡터로 발현된 수용성 융합 단백질의 활성 억제 부위를 제거하여 트랜스 글루타미나아제를 활성형으로 만드는 것을 특징으로 하는 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 배양 온도는 20 내지 40 ℃ 인 것을 특징으로 하는 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 형질전환된 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 생산된 재조합 트랜스 글루타미나아제를 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 트랜스 글루타미나아제의 생산 방법.
수용성 발현 유도용 단백질을 암호화하는 유전자, 재조합 트랜스 글루타미나아제의 세포 내 활성 억제 서열(proteolytic-resistant sequence), 단백질 분해 효소 인식부위를 암호화하는 유전자 및 트랜스 글루타미아나제를 암호화하는 유전자; 수용성 발현 유도용 단백질을 암호화하는 유전자 및 단백질 분해 효소를 암호화하는 유전자를 차례로 포함하는 재조합 트랜스 글루타미나아제 생산용 재조합 발현 벡터.
제12항에 있어서, 상기 재조합 발현 벡터는 도 7로 표시되는 것인 재조합 트랜스 글루타미나아제 생산용 재조합 발현 벡터.