KR20160105928A - Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형 - Google Patents

Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형 Download PDF

Info

Publication number
KR20160105928A
KR20160105928A KR1020167023706A KR20167023706A KR20160105928A KR 20160105928 A KR20160105928 A KR 20160105928A KR 1020167023706 A KR1020167023706 A KR 1020167023706A KR 20167023706 A KR20167023706 A KR 20167023706A KR 20160105928 A KR20160105928 A KR 20160105928A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
ser
fviii
thr
lys
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020167023706A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101904630B1 (ko
Inventor
클라크 큐. 판
존 이. 머피
베이종 메이
조나단 에스. 스트라우스
헨드리 탄드라
지안민 첸
토마스 바넷
리앙 탕
드키안 왕
Original Assignee
바이엘 헬스케어 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36337298&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20160105928(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 바이엘 헬스케어 엘엘씨 filed Critical 바이엘 헬스케어 엘엘씨
Publication of KR20160105928A publication Critical patent/KR20160105928A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101904630B1 publication Critical patent/KR101904630B1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/02—Local antiseptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Orthopedics, Nursing, And Contraception (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)

Abstract

본 발명은 N-말단이 아닌 소정의 부위에서 폴리에틸렌 글리콜과 같은 1종 이상의 생체적합성 중합체에 공유적으로 결합되는 제VIII 인자에 관한 것이다. 이 뮤테인 컨쥬게이트는 FVIII 응고촉진 활성을 유지하고, 향상된 약물동태학적 특성을 갖는다.

Description

ＦＶＩＩＩ의 부위 지향 변형{SITE-DIRECTED MODIFICATION OF FVIII}
본 발명은 1종 이상의 생체적합성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜에, 한정된 부위에서 결합할 수 있게 하는 제VIII 인자(FVIII) 뮤테인에 관한 것이다. 또한, 관련 제제, 투여량 및 치료 목적을 위한 이의 투여 방법이 제공된다. 이들 변형 FVIII 변이체, 및 관련 조성물 및 방법은 A형 혈우병에 걸린 개체에 대하여 감소된 주사 빈도 및 감소된 면역원성 반응의 치료 옵션을 제공하는데 유용하다.
A형 혈우병은 5000명의 남성 당 1명의 추정 발생빈도를 갖는 가장 통상적인 유전 응고 장애이다. 이는 혈액 응고의 내인 경로의 중요한 성분인 FVIII의 결핍 또는 구조적 결함에 의해 유발된다. A형 혈우병에 대한 현재의 치료는 인간 FVIII의 정맥내 주사를 수반한다. 인간 FVIII는 대략 300 kD의 단일쇄 분자로서 재조합되어 생성되었다. 이는 A1-A2-B-A3-C1-C2의 구조적 도메인으로 이루어진다 (문헌 [Thompson, 2003, Semin. Hematol. 29, pp. 11-22]). 전구체 생성물은 골지체에서 200 kD(중) 및 80 kD(경)의 2가지 폴리펩티드쇄로 처리되며, 금속 이온으로 2가지 쇄를 결합시킨다(문헌 [Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, p. 6352]; [Andersson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83, p. 2979]).
B-도메인 결실 FVIII (BDD, 90 kD A1-A2 중쇄 및 80 kD 경쇄) 또한 A형 혈우병에 대한 대체 요법으로서 효과적임을 나타냈기 때문에, FVIII의 B-도메인은 필수적이지 않은 것으로 보인다. B-도메인 결실 FVIII 서열은 B-도메인의 14 아미노산 대부분의 결실을 함유한다.
A형 혈우병 환자는 현재 필요시 또는 일주일에 수차례 투여되는 예방적 요법으로서 FVIII의 정맥내 투여에 의해 치료된다. 예방적 요법을 위해, 일주일에 3차례 15 내지 25 IU/kg(체중)의 제VIII 인자가 주어진다. 환자에게는 일정하게 요구된다. 인간에서의 이의 짧은 반감기로 인하여, FVIII은 자주 투여되어야 한다. 전체 길이의 단백질에서의 300 kD보다 큰 이의 크기에도 불구하고, FVIII은 단지 약 11시간의 인간에서의 반감기를 갖는다(문헌 [Ewenstein et al, 2004, Semin. Hematol. 41, pp.1-16]). 빈번한 정맥내 주사의 필요는 환자의 순응도에 대한 중대한 장벽을 형성한다. 만일 FVIII 생성물이 더 긴 반감기를 가져서 덜 빈번한 투여를 필요로 하게 개발되었다면, 환자에게 보다 편할 수 있다. 게다가, 치료 비용도, 반감기가 증가되었다면, 더 적은 투여량이 필요할 수 있으므로, 감소될 수 있다.
현재의 요법에 대한 추가적인 단점은 약 25 내지 30%의 환자가 FVIII 활성을 억제하는 항체를 발달시키고 있다는 것이다(문헌 [Saenko et al, 2002, Haemophilia 8, pp. 1-11]). 억제 항체의 주된 에피토프는 잔기 484-508에서 A2 도메인, 잔기 1811-1818에서 A3 도메인 및 C2 도메인 내에 위치하고 있다. 항체의 발달은 대체 요법으로서의 FVIII을 사용하지 못하게 하며, 이러한 환자군으로 하여금 고복용량의 재조합 제VIIa 인자 및 면역 내성 요법을 사용하는 훨씬 더 고가의 치료를 찾게 한다.
이하의 연구는 억제 항체의 FVIII 에피토프를 식별하였다. 25개의 억제 혈장 샘플의 연구에서, 11개는 트롬빈 생성 73 kD 경쇄 분획 A3C1C2에 결합하고, 4개는 A2 도메인에, 10개는 양쪽 모두에 결합하는 것으로 발견되었다(문헌 [Fulcher, C. et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. 2(22), pp. 7728-32]). 또다른 연구에서, 환자로부터의 8개의 A2 도메인 억제제 중 6개가 재조합 A2 폴리펩티드에 의해 중화되었다(문헌 [Scandella, D. et al., 1993, Blood 82(6), pp.1767-75]). 환자로부터의 9개의 억제제 중 6개에서의 에피토프가 A2 잔기 379-538에 맵핑되었다(문헌 [Scandella, D. et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. 85(16), pp. 6152-6]). 18개의 중쇄 억제제 중 한 에피토프가 A2 도메인의 동일한 N-말단 18.3 kD 영역에 국소화되었다(문헌 [Scandella, D. et al., 1989, Blood 74(5), pp.1618-26]).
인간 A2 도메인 잔기 387-604를 동종 돼지 서열로 대체하여 생성된, 활성 재조합 하이브리드 인간/돼지 FVIII 분자는 인간 A2 억제제에 내성이 있고(문헌 [Lubin, I. et al., 1994, J. Biol. Chem. 269(12), pp. 8639-41]), A2에 결합하기 위한 환자의 A2 억제제와 경쟁하는 마우스 모노클로날 항체 mAB 413 IgG에 내성이 있다(문헌 [Scandella, D. et al., 1992, Thromb Haemost. 67(6), pp.665-71]). 이 A2 도메인 에피토프는, 실험이 mAB 413 IgG 및 4개의 환자 억제제가 A2 도메인 잔기 484-508이 돼지의 것으로 대체된 하이브리드 인간/돼지 FVIII를 억제하지 못했을 때, A2 도메인 잔기 484-508에 추가로 국소화되었다(문헌 [Healey, J. et al., 1995, J. Biol. Chem. 270(24), pp.14505-9]). 또한, 이 하이브리드 FVIII는 스크리닝된 23의 환자 혈장 중 반 이상에 대하여 더 내성을 가졌다(문헌 [Barrow, R. et al., 2000, Blood 95(2), pp. 564-8]). 돌연변이 유발을 스캐닝하는 알라닌은 시험된 5 모두의 환자 억제제에 결합하는데 중요한 잔기 487을 식별하였고, 잔기 484, 487, 489 및 492는 모두 mAB 413 IgG와의 상호작용에 모두 중요하였다(문헌 [Lubin, I., J. Biol. Chem. 272(48), pp. 30191-5]). R484A/R489A/P492A 돌연변이주를 수용하지만 R484A/R489A 돌연변이주를 수용하지 않은 마우스에서의 억제 항체가는 대조 인간 BDD FVIII을 수용한 마우스에서보다 현저하게 낮았다(문헌 [Parker, E. et al., 2004, Blood 104(3), pp. 704-10]). 요약하면, A2 도메인의 484-508 영역이 FVIII 활성의 억제제를 위한 결합 부위로 여겨진다.
FVIII에 대한 면역 반응의 발달 이외에, 통상의 요법의 또다른 문제는 생체내 FVIII의 짧은 반감기로 인하여 빈번한 투여가 필요하다는 것이다. 순환으로부터 FVIII의 제거 메카니즘이 연구되었다.
순환으로부터 FVIII 제거는, 폭넓은 리간드 특이성을 갖는 간의 제거 수용체인 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질(LRP)으로의 특이적인 결합에 부분적으로 기인한다(문헌 [Oldenburg et al., 2004, Haemophilia 10 Suppl 4, pp. 133-139]). 최근, 저밀도 지단백질(LDL) 수용체 또한 FVIII의 혈장 수준을 조절하는데 LRP와 함께 작용하는 것과 같이 FVIII 제거에서 중요한 역할을 한다는 점이 드러났다(문헌 [Bovenschen et al., 2005, Blood 106, pp. 906-910]). 양쪽 모두의 상호작용은 세포 표면 헤파린 술페이트 프로테오글리칸(HSPG)에 결합하여 촉진된다. 마우스에서 혈장의 반감기는, LRP가 차단될 때 3.3배로, 또는 LRP 및 세포 표면 HSPG 모두가 차단될 때 5.5배로 연장될 수 있다(Sarafanov et al., 2001, J. Biol. Chem. 276, pp. 11970-11979]). HSPG는 세포 표면 상의 FVIII를 농축시키고 이를 LRP로 전달하는 것으로 여겨진다. FVIII 상에서의 LRP 결합 부위는 A2 잔기 484-509(문헌 [Saenko et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp. 37685-37692]), A3 잔기 1811-1818(문헌 [Bovenschen et al., 2003, J. Biol. Chem. 278, pp. 9370-9377]) 및 C2 도메인에서의 에피토프(문헌 [Lenting et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, pp. 23734- 23739])로 국소화되었다.
또한, FVIII는 단백질분해효소의 작용에 의해 순환으로부터 제거된다. 이 효과를 이해하기 위해서는 FVIII가 혈액 응고에 관여하는 메카니즘을 이해하여야 한다. FVIII는 vWF에 결합된 중쇄 및 경쇄의 헤테로다이머(heterodimer)로서 순환한다. VWF 결합은 FVIII 잔기 1649-1689(문헌 [Foster et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, pp. 5230-5234]) 및 C1 도메인의 일부(문헌 [Jacquemin et al., 2000, Blood 96, pp. 958-965]) 및 C2 도메인의 일부(문헌 [Spiegel, P. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(51), pp. 53691-8])와 관련된다. FVIII는 트롬빈에 의해 활성화되며, 이는 잔기 372, 740 및 1689 이후의 펩티드 결합을 절단하여 A1 , A2 및 A3-C1-C2 도메인의 헤테로트리머를 생성시킨다(문헌 [Pittman et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 276, pp. 12434-12439]). 활성화되었을 때, FVIII는 vWF로부터 해리되고, 인지질로의 결합에 의해 혈소판의 세포 표면에 농축된다. 인지질 결합은 FVIII 잔기 2199, 2200, 2251 및 2252와 관련된다(문헌 [Gilbert et al., 2002, J. Biol. Chem. 277, pp. 6374-6381]). 여기서 FVIII 잔기 558-565(문헌 [Fay et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, pp. 20522-20527]) 및 1811-1818(문헌 [Lenting et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp. 1935- 1940])과의 상호작용을 통해 FIX에, 그리고 FVIII 잔기 349-372(문헌 [Nogami et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, pp. 15763-15771])와의 상호작용을 통해 FX에 결합하고, 내인 응고 경로의 필수 성분인 FX의 FIX 활성화에 대한 공동인자로서 작용한다. 활성화된 FVIII (FVIIIa)는 FVIII 잔기 336 및 562 이후의 절단을 통해 단백질분해효소 활성화 단백질 C(APC)에 의해 부분적으로 불활성화된다(문헌 [Regan et al., 1996, J. Biol. Chem. 271, pp. 3982-3987]). 그러나, 불활성화의 주된 결정인자는 A1 및 A3-C1-C2로부터의 A2 도메인의 해리이다(문헌 [Fay et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, pp. 8957-8962]).
단백질의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있다고 증명된 한가지 방법은 PEG화이다. PEG화는 장쇄 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자의 단백질 또는 다른 분자로의 공유적인 부착이다. PEG는 선형 또는 분지형일 수 있어서 상이한 특징을 갖는 상이한 분자를 생성시킬 수 있다. 펩티드 또는 단백질의 반감기를 증가시키는 것 이외에, PEG화는 항체 발달을 감소시키고, 단백질분해효소의 소화로부터 단백질을 보호하고, 신장 여과물로부터 물질을 유지하는데 사용되었다(문헌 [Harris et al., 2001, Clinical Pharmacokinetics 40, pp. 539-51]). 또한, PEG화는 단백질의 전체적인 안정성 및 가용성을 증가시킬 수도 있다. 마지막으로, PEG화된 단백질의 지속적인 혈장 농도는 약물의 피크 수준으로 저점을 감소시켜서 초기 시점에서 단백질의 초생리학적인 수준을 도입할 필요를 제거하여, 유해한 부작용 정도를 감소시킬 수 있다.
PEG 및 덱스트란과 같은 거대 중합체로 일차 아민(N-말단 및 라이신)을 표적화하는 것에 의한 FVIII의 랜덤 변형은 여러가지의 성공도로 시도되었다(WO 94/15625, US 특허 4970300, US 특허 6048720). 가장 극적인 향상은, 1994년 특허출원에서 공개되었고(WO 94/15625), 4배의 반감기 향상을 나타내지만, 전체 길이의 FVIII을 50배의 몰과량의 PEG와 반응시킨 후 2배의 활성 손실의 대가를 나타낸다. WO 2004/075923은 랜덤 변형을 통해 생성되는 FVIII 및 폴리에틸렌 글리콜의 컨쥬게이트를 개시한다. 랜덤하게 PEG화된 단백질, 예컨대 인터페론-알파(문헌 [Kozlowski et al, 2001, BioDrugs 15, pp. 419-429])는 과거에 치료제로서 허용되었다.
그러나, 이러한 랜덤 접근법은 헤테로다이머 FVIII에 대해서는 보다 더 문제가 있다. FVIII는 158개의 라이신, 2개의 N-말단, 및 다수의 히스티딘, 세린, 트레오닌 및 티로신을 비롯한 수백개의 잠재적인 PEG화 부위를 가지며, 이들 모두는 일차 아민을 우선적으로 표적으로 하는 시약으로 잠재적으로 PEG화될 수 있다. 예를 들어, PEG화된 인터페론 알파-2b에 대한 주된 위치 이성질체는 히스티딘임을 보였다(문헌 [Wang et al., 2000, Biochemistry 39, pp. 10634-10640]). 게다가, 전체 길이의 FVIII의 불균일 처리는 PEG화된 생성물에서의 더 심한 복잡함을 유발하는 출발 물질의 혼합물을 유발할 수 있다. FVIII 상에서의 PEG화 부위를 조절하지 않는 것에 대한 부가적인 단점은, PEG가 결정적인 활성 부위에서 또는 그 주위에 부착되어 있다면, 특히 하나 보다 많은 PEG 또는 단일의 거대 PEG가 FVIII에 컨쥬게이션되어 있다면, 잠재적인 활성 감소이다. 랜덤 PEG화가 다량의 다수의 PEG화된 생성물을 늘 생성할 수 있기 때문에, 단지 모노-PEG화된 생성물을 얻기 위한 정제는 극적으로 총 수율을 낮추게 할 수 있다. 마지막으로, 생성물 프로파일에서 막대한 불균일성은 각각의 무리의 일정한 합성 및 특징화를 거의 불가능하게 할 수 있다. 우수한 제조는 일정하고 잘 특징화된 생성물을 필요로 하기 때문에, 생성물 불균일성은 상업화에 대한 장벽이 된다. 이러한 모든 이유로, 보다 특이적인 FVIII의 PEG화 방법이 요구된다.
다양한 부위 지향 단백질 PEG화 전략은 최근의 리뷰에서 요약되었다(문헌 [Kochendoerfer, G., Curr. Opin. Chem. Biol. 2005], 2005년 10월 15일 다이렉트 오브젝트 아이덴티파이어 (direct object identifier) doi:10.1016/j.cbpa.2005.10.007로 온라인으로 입수가능함). 한 접근법은 화학적 합성 또는 재조합 발현에 의한 단백질로의 비천연 아미노산의 도입 후, 비천연 아미노산과 특이적으로 반응할 수 있는 PEG 유도체의 부가와 관련된다. 예를 들어, 비천연 아미노산은 천연 단백질에서 발견되지 않는 케토기를 함유하는 것일 수 있다. 그러나, 단백질의 화학적 합성은 FVIII와 같이 거대한 단백질에 대해서는 실행가능하지 않다. 펩티드 합성의 현재의 한계는 약 50 잔기이다. 몇가지 펩티드가 결찰되어 더 큰 폴리펩티드 조각을 형성할 수 있지만, B-도메인 결실 FVIII를 생성하기 위해서는 20 결찰보다 더 많은 것이 필요할 것이며, 이는 이상적인 반응 조건 하에서도 1% 화복률 미만을 야기할 것이다. 비천연 아미노산을 사용한 단백질의 재조합 발현은 주로 비포유동물 발현계로 아직까지는 제한되어 있다. 이러한 접근법은 포유동물계에서 발현될 필요가 있는 FVIII와 같은 거대하고 복잡한 단백질에 대해서는 문제가 있는 것으로 예측된다.
단백질의 부위 특이적 PEG화에 대한 또다른 접근법은 N-말단 골격의 아민을 PEG-알데히드로 표적화하는 것이다. 그러나, 다른 아민기에 대한 특이성을 달성하기 위해 이 방법 하에서 요구되는 낮은 pH는 FVIII의 안정화에 필요한 좁은 거의 중성의 pH 범위와는 적합하지 않다(문헌 [Wang et al., 2003, International J. Pharmaceutics 259, pp. 1-15]). 게다가, FVIII의 N-말단 PEG화는, 이 영역이 혈장 제거에 관련되지 않는다면, 증가된 혈장 반감기를 유도할 수 없을 것이다. 실제로, FVIII 경쇄의 N-말단 영역은, 순환에서 FVIII 생존에 결정적인 캐리어 단백질인 폰빌레브란드 인자(von Willebrand factor; vWF)에 결합하는데 관련되어 있다. 제VIII 인자의 N-말단 변형에 의해, 결정적으로 중요한 vWF와의 연관이 붕괴되거나 약해질 수 있다. 따라서, FVIII의 N-말단 PEG화는 FVIII의 혈장 반감기를 감소시키는 반대 효과를 가질 수 있다.
WO 90/12874는 또다른 아미노산에 시스테인을 삽입하거나 또는 아미노산을 시스테인으로 치환한 후, 술프히드릴 반응기를 갖는 리간드를 부가하여 인간 IL-3, 과립구집락자극인자 및 적혈구생성인자 폴리펩티드의 부위 특이적 변형을 개시한다. 리간드는 시스테인 잔기에 선택적으로 결합한다. FVIII의 변형 또는 이의 임의의 변이체는 개시되어 있지 않다.
상기 언급한 이유로, 생체내에서 보다 긴 작용 기간 및 감소된 면역원성을 가지면서 관능 활성을 유지하는 향상된 FVIII 변이체에 대한 필요가 존재한다. 게다가, 이러한 단백질이 일정한 방식으로 균일한 생성물로서 생성되는 것이 바람직하다.
<발명의 요약>
본 발명의 목적은 향상된 약물동태학적 특성 및 치료 특성을 갖는 생체적합성 중합체 컨쥬게이션된 관능성 FVIII 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 향상된 약물동태학적 특성을 갖는 생체적합성 중합체 컨쥬게이션된 B 도메인 결실 FVIII 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질(LRP), 저밀도 지단백질(LDL) 수용체, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸(HSPG) 및/또는 FVIII에 대한 억제 항체에 대한 감소된 결합을 갖는 생체적합성 중합체 컨쥬게이션된 관능성 FVIII 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 생체내에서 보다 긴 작용 기간 및 감소된 면역원성을 가져서 일정한 방식으로 균일한 생성물로서 생성될 수 있는 향상된 FVIII 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 한 측면에서, 폴리펩티드 상의 하나 이상의 소정의 부위에서 1종 이상의 생체적합성 중합체에 공유적으로 부착된 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드를 포함하는 제VIII 인자 응고촉진 활성을 갖는 컨쥬게이트가 제공되며, 여기서 소정의 부위는 N-말단 아민이 아니다. 또한, 본 발명은, 소정의 부위에서 시스테인 잔기에 대한 코딩 서열로 치환하기 위해 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 돌연변이시키는 단계; 시스테인 강화 뮤테인을 생성하기 위해 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계; 뮤테인을 정제하는 단계; 컨쥬게이트가 형성되도록 실질적으로 도입된 시스테인 잔기에서만 폴리펩티드와 반응하도록 활성화된 생체적합성 중합체와 뮤테인을 반응시키는 단계; 및 컨쥬게이트를 정제하는 단계를 포함하는 이러한 컨쥬게이트의 제조 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 컨쥬게이트 및 제약적으로 허용가능한 보강제를 포함하는 제약 조성물 및 상기 조성물을 이를 필요로 하는 포유류에 치료 유효량만큼 투여하여 혈우병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, (a) 제VIII 인자 뮤테인의 노출 표면 상의 아미노산 잔기에 대한 시스테인 대체물을 갖는 부위 지향 제VIII 인자 뮤테인을 발현시키는 단계 (시스테인은 캡핑되어 있음); (b) 시스테인 뮤테인을 서서히 환원시키고 캡을 배출시키는 조건 하에서 시스테인 뮤테인을 환원제와 접촉시키는 단계; (c) 시스테인 뮤테인으로부터 캡 및 환원제를 제거하는 단계; 및 (d) 환원제의 제거로부터 약 5 분 이상 후에 PEG화 제VIII 인자 뮤테인이 생성되는 조건 하에서 술프히드릴 결합 잔기를 포함하는 PEG로 시스테인 뮤테인을 처리하는 단계를 포함하는 제VIII 인자 뮤테인의 부위 지향 PEG화 방법에 관한 것이다.
본 발명은 FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드가 N-말단 아민에서가 아닌 소정의 부위에서 생체적합성 중합체에 공유적으로 부착될 수 있고, 이러한 폴리펩티드가 실질적으로 이의 응고 활성을 유지한다는 발견에 기초한 것이다. 게다가, 이들 폴리펩티드 컨쥬게이트는 향상된 순환 시간 및 감소된 면역원성을 갖는다. 본 발명의 컨쥬게이트는 FVIII에 랜덤 중합체 부착 또는 N-말단에서의 부착을 갖는 종래 기술의 컨쥬게이트에 비해 유리한 것이다. 부위 지향 부착은 생물학적 활성에 필요한 영역을 피해서 실질적인 FVIII 활성을 유지하는 변형을 디자인할 수 있게 한다. 또한, FVIII 제거에 관련된 부위에서의 결합을 막기 위해 중합체를 부착시키도록 디자인할 수 있게 한다. 또한, 부위 지향 부착은 랜덤 중합체 결합에 의해 종래 기술에서 생성된 불균일한 컨쥬게이트에 비해 균일한 생성물을 가능케 한다. 경쇄의 N-말단 아민에서의 부착을 피해서, 본 발명의 컨쥬게이트는 FVIII 폴리펩티드의 활성 부위에서 리간드를 부착하는 것으로부터의 활성의 가능한 손실을 피한다. 경쇄의 N-말단 영역은 순환에서 안정화와 관련된 FVIII의 vWF 인자와 관련된 것으로 여겨진다.
<정의>
생체적합성 중합체. 생체적합성 중합체로는 폴리알킬렌 옥사이드, 예컨대 (이로 제한되지 않음) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 덱스트란, 콜로민산 또는 다른 카르보하이드레이트계 중합체, 아미노산 중합체, 비오틴 유도체, 폴리비닐 알콜(PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 폴리옥사졸린, 폴리아크릴로일모르폴린, 헤파린, 알부민, 셀룰로스, 키토산 가수분해물, 전분, 예컨대 히드록시에틸-전분 및 히드록시프로필-전분, 글리코겐, 아가로스 및 이의 유도체, 구아검, 풀루란, 이눌린, 크산탄검, 카라기난, 펙틴, 알긴산 가수분해물, 다른 생체중합체 및 이의 임의의 등가물을 들 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜이 바람직하고, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이 보다 바람직하다. 다른 유용한 폴리알킬렌 글리콜 화합물은 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리부틸렌 글리콜(PBG), PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG), 분지 폴리에틸렌 글리콜, 선형 폴리에틸렌 글리콜, 분기된 폴리에틸렌 글리콜 및 여러 갈래 또는 "초분지" 폴리에틸렌 글리콜(star-PEG)이다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG). 본원에서 사용되는 "PEG" 및 "폴리에틸렌 글리콜"은 상호교환가능하며 임의의 수용성 폴리(에틸렌 옥사이드)를 포함한다. 전형적으로, 본 발명에 따라 사용하기 위한 PEG는 다음의 구조 "-(OCH2CH2)n-" (여기서, n은 2 내지 4000임)를 포함한다. 또한, 본원에 사용되는 바와 같이, 말단 산소가 치환되는지 여부에 따라, PEG는 "-CH2CH2-O(CH2CH2O)n-CH2CH2-" 및 "-(OCH2CH2)nO-"도 포함한다. 명세서 및 청구범위 전체에서, 용어 "PEG"는 다양한 말단기 또는 "말단 캡핑"기, 예컨대 (이로 제한되지 않음) 히드록실 또는 C1-20 알콕시기를 갖는 구조를 포함한다. 또한, 용어 "PEG"는 대다수, 즉 50% 초과로 -OCH2CH2- 반복 하위단위를 함유하는 중합체를 의미한다. 구체적인 형태와 관련하여, PEG는 임의의 수의 다양한 분자량 뿐만 아니라 구조 또는 기하형태, 예컨대 분지, 선형, 분기 및 다관능성을 가질 수 있다.
PEG화(PEGylation). PEG화는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 단백질과 같은 분자에 공유적으로 부착되는 과정이다.
활성화 또는 활성 관능기. 생체적합성 중합체와 같은 관능기가 활성화된 것으로 기술된 경우, 관능기는 또다른 분자 상의 친전자체 또는 친핵체와 쉽게 반응한다.
B 도메인 결실 FVIII (BDD). 본원에 사용되는 바와 같이, BDD는 FVIII의 B-도메인의 거의 모든 14 아미노산의 결실을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다. B-도메인의 처음의 4개의 아미노산 (SFSQ, 서열번호:1)은 B-도메인의 10개의 이후의 잔기 (NPPVLKRHQR, 서열번호:2)에 연결되어 있다(문헌 [Lind, P. et al, 1995, Eur. J. Biochem. 232, pp. 19-27]). 본원에 사용되는 BDD는 서열번호:3의 아미노산 서열을 갖는다.
FVIII. 혈액 응고 제VIII 인자 (FVIII)는 간에 의해 합성되어 혈류 내로 배출된 글리코단백질이다. 순환 혈액에서, 이는 폰빌레브란드 인자(vWF, 제VIII 인자 관련 항원으로도 알려짐)에 결합되어 안정한 복합체를 형성한다. 트롬빈에 의해 활성화되면, 이는 복합체로부터 해리되어 응고 연속반응에서 다른 응고 인자와 상호작용하며, 궁극적으로 혈전 형성에 이르게 한다. 전체 길이의 인간 FVIII는, 대립 변이체가 가능하지만, 서열번호:4의 아미노산 서열을 갖는다.
관능성 제VIII 인자 폴리펩티드. 본원에 사용되는 바와 같이, 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드는 예를 들어 A형 혈우병의 특징인 인간 제VIII 인자의 결핍을 생체내 또는 시험관내에서 교정할 수 있는 관능성 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 조합을 나타낸다. 제VIII 인자는 자연 상태에서 다중 분해 또는 처리 형태를 갖는다. 이들은 본원에 나타낸 바와 같이 전구체인 일쇄 단백질로부터 단백질분해효소에 의해 유도된다. 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드는 이러한 단일쇄 단백질을 포함하며, 인간 제VIII 인자 결핍을 교정하는 생물학적 활성을 갖는 이들의 다양한 분해 생성물도 제공한다. 대립 변이도 존재한다. 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드는, 인간 제VIII 인자의 관능성 구역을 함유하고 필수적이고 특징적인 인간 제VIII 인자의 관능 활성이 본질적으로 영향받지 않는 한, 제VIII 인자의 유도체를 생성하는 모든 이러한 대립 변이, 글리코실화 형태, 변형 및 분획을 포함한다. 필수적인 관능 활성을 갖는 제VIII 인자의 이들 유도체는 본원에 기술된 직접적인 시험관내 시험에 의해 쉽게 식별될 수 있다. 게다가, 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드는 제IXa 인자, 칼슘 및 인지질의 존재 하에 제X 인자의 제Xa 인자로의 전환에 촉매 작용을 할 수 있을 뿐만 아니라 A형 혈우병을 앓는 개체로부터 유도된 혈장에서의 응고 결함을 교정할 수 있다. 인간 제VIII 인자 아미노산 서열 및 관능 영역의 본원에서의 개시로부터, DNA의 제한 효소 절단 또는 인간 제VIII 인자 단백질의 단백질분해효소적 또는 다른 분해를 통해 유도될 수 있는 분획은 당업자에게 명확할 것이다.
FIX. 본원에 사용되는 바와 같이, FIX는 인간 응고 제IX 인자 또는 혈장 트롬보플라스틴 성분으로도 알려진 응고 제IX 인자를 의미한다.
FX. 본원에 사용되는 바와 같이, FX는 인간 응고 제X 인자 또는 에포님 스튜어트-프라워(Stuart-Prower) 인자로도 알려진 응고 제X 인자를 의미한다.
약물동태학. "약물동태학" ("PK")는 신체에서 약물의 흡수, 분배, 대사 및 제거 특성을 기술하는데 사용되는 용어이다. 약물의 약물동태학에서의 향상은 약물을 치료제로서 생체내에서 보다 더 효과적으로 하는 이의 특징, 특히 신체에서 이의 유용한 지속시간에서의 향상을 의미한다.
뮤테인. 뮤테인은 단백질 또는 폴리펩티드로의 실험적으로 유도된 돌연변이의 결과로서 발생한 유전적으로 처리된 단백질이다.
단백질. 본원에 사용되는 바와 같이, 단백질 및 폴리펩티드는 동의어이다.
FVIII 제거 수용체. 본원에 사용되는 바와 같이 FVIII 제거 수용체는 순환으로부터 FVIII를 제거하는 1종 이상의 다른 분자와 결합하거나 또는 이와 연관되는 관능성 FVIII 폴리펩티드 상의 수용체 영역을 의미한다. 제VIII 인자 제거 수용체는, 이에 제한되지 않지만, LRP, LDL 수용체 및/또는 HSPG와 결합하는 FVIII 분자의 영역을 들 수 있다.
<검토>
임의의 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드는 소정의 부위에서 돌연변이된 후, 본 발명의 방법에 따라 그 부위에서 생체적합성 중합체에 공유적으로 부착될 수 있다는 점이 고려된다. 유용한 폴리펩티드로는, 이로 제한되지 않지만, 서열번호:4에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 전체 길이의 제VIII 인자 및 서열번호:3에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 BDD FVIII를 들 수 있다. BDD FVIII이 바람직하다.
본 발명의 컨쥬게이트에 사용되는 생체적합성 중합체는 상기 언급된 임의의 중합체일 수 있다. 생체적합성 중합체는 약물동태학에 있어서 바람직한 향상을 제공하도록 선택된다. 예를 들어, 활성에서의 허용가능하지 않은 감소 없이 FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드의 순환 반감기를 향상시키거나 폴리펩티드의 면역원성을 감소시키도록 중합체의 동질성, 크기 및 구조가 선택된다. 바람직하게는, 중합체는 PEG를 포함하며, 보다 더 바람직하게는 이의 분자량의 50% 이상이 PEG이다. 한 실시태양에서, 중합체는 히드록실, 알콕시, 치환 알콕시, 알켄옥시, 치환 알켄옥시, 알킨옥시, 치환 알킨옥시, 아릴옥시 및 치환 아릴옥시와 같은 말단-캡핑 잔기로 말단이 캡핑된 폴리에틸렌 글리콜이다. 메톡시폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 중합체가 보다 더 바람직하다. 3 kD 내지 100 kD, 보다 바람직하게는 5 kD 내지 64 kD 또는 5 kD 내지 43 kD 범위의 크기를 갖는 메톡시폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 중합체가 더 바람직하다.
바람직하게는, 중합체는 반응성 잔기를 갖는다. 예를 들어, 한 실시태양에서, 중합체는 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드 상의 자유 시스테인과 반응할 수 있는 술프히드릴 반응성 잔기를 가져서 공유 결합을 형성할 수 있다. 이러한 술프히드릴 반응성 잔기로는, 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, S-피리딜 또는 말레이미드 잔기를 들 수 있다. 말레이미드 잔기가 바람직하다. 한 실시태양에서, 중합체는 선형이고, 술프히드릴에 대해 강하게 반응성이 아닌 한 말단(예컨대, 메톡시)에서 "캡"을 갖고, 다른 말단에서 술프히드릴 반응성 잔기를 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 컨쥬게이트는 PEG-말레이미드를 포함하고, 5 kD 내지 64 kD 범위의 크기를 갖는다.
유용한 생체적합성 중합체를 선택하기 위한 추가의 설명이 이하의 실시예에 제공된다.
FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 부위 지향 돌연변이는 당업계에 알려진 방법에 의해 이루어질 수 있다. 바람직한 방법은 중합체의 공유적인 부착을 위해 선택된 부위에서 시스테인 코돈을 도입하여 돌연변이를 발생시키는 것을 포함한다. 이는 상업적으로 입수가능한 부위 지향 돌연변이 발생 키트, 예컨대 스트라타진 씨퀵체인지(Stratagene cQuickChangeTM) II 부위 지향 돌연변이 발생 키트, 클론테크 트랜스포머(Clontech Transformer) 부위 지향 돌연변이 발생 키트 번호 K1600-1, 인비트로겐 젠테일러(Invitrogen GenTaylor) 부위 지향 돌연변이 발생 시스템 번호 12397014, 프로메가 얼터드 사이츠(Promega Altered Sites) II 시험관내 돌연변이 발생 키트 번호 Q6210, 또는 타카라 미루스 바이오(Takara Mirus Bio) LA PCR 돌연변이 발생 키트 번호 TAK RR016을 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트는, 먼저 관능성 FVIII 폴리펩티드 표면 상의 하나 이상의 아미노산에 대한 코돈을 시스테인에 대한 코돈으로 대체하고, 재조합 발현 시스템에서 시스테인 뮤테인을 생성하고, 뮤테인을 시스테인 특이적 중합체 반응물과 반응시키고, 뮤테인을 정제하여 제조될 수 있다.
이 시스템에서, 시스테인 부위에서 중합체의 부가는 중합체의 말레이미드 활성 관능을 통해 달성될 수 있다. 이 기술의 예는 아래에 제공되어 있다. 사용되는 술프히드릴 반응성 중합체의 양은 유도되는 시스테인의 몰량과 등몰량 이상이어야 하며, 바람직하게는 과량으로 존재한다. 바람직하게는, 술프히드릴 반응성 중합체의 5배 이상의 몰 과량이 사용되고, 보다 더 바람직하게는, 이 중합체의 10배 이상의 과량이 사용된다. 공유적인 부착에 유용한 다른 조건은 당업자의 기술 범위 내에 있다.
이하의 실시예에서, 뮤테인은 당업계에 통상적인 방식으로 명명된다. 돌연변이를 명명하는 관례는 서열번호:4에 제공된 바와 같은 성숙한 전체 길이의 제VIII 인자에 대한 아미노산 서열에 기초한다. 분비된 단백질과 같이, FVIII은 번역 과정 동안 단백질분해효소에 의해 절단된 신호 서열을 함유한다. 19개의 아미노산 신호 서열의 제거 후, 분비된 FVIII 생성물의 제1 아미노산은 알라닌이다.
통상적으로 그리고 본원에 사용되는 바와 같이, BDD FVIII에서 돌연변이되는 아미노산을 지칭하는 경우, 돌연변이되는 아미노산은 전체 길이의 FVIII의 서열에서 이의 위치로 나타낸다. 예를 들어, 이하에 논의되는 PEG6 뮤테인은, 전체 길이의 서열에서 1808와 유사한 위치에서 라이신(K)을 시스테인(C)으로 변화시키기 때문에, K1808C로 나타낸다.
중합체의 공유 결합을 위한 소정의 부위는, FVIII 활성에 또는 vWF로의 결합과 같이 생체내에서 FVIII를 안정화시키는 다른 메카니즘에 관련되지 않는 폴리펩티드의 표면 상에 노출된 부위로부터 최선으로 선택된다. 또한, 이러한 부위는 FVIII가 불활성화되거나 순환으로부터 제거되는 메카니즘에 관련된다고 알려진 부위로부터 최선으로 선택된다. 이들 부위의 선택은 이하에서 상세하게 설명된다. 바람직한 부위는 (a) 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질, (b) 헤파린 술페이트 프로테오글리칸, (c) 저밀도 지단백질 수용체 및/또는 (d) 제VIII 인자 억제 항체에 대한 결합 부위 또는 그 부근의 아미노산 잔기를 포함한다. "결합 부위 또는 그 부근"이란 그 부위에 대한 생체적합성 중합체의 공유적인 부착이 결합 부위의 입체 장애를 야기할 수 있도록 결합 부위에 충분히 근접한 잔기를 의미한다. 이러한 부위는 예를 들어 결합 부위의 20 Å 이내에 있을 것으로 여겨진다.
본 발명의 한 실시태양에서, 생체적합성 중합체는, (a) 위에서 정의된 바와 같은 제VIII 인자 제거 수용체, (b) 제VIII 인자를 분해할 수 있는 단백질분해효소에 대한 결합 부위 및/또는 (c) 제VIII 억제 항체에 대한 결합 부위 또는 그 부근의 아미노산 잔기에서 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드에 공유적으로 부착되어 있다. 단백질분해효소는 활성화 단백질 C(APC)일 수 있다. 또다른 실시태양에서, 생체적합성 중합체는 폴리펩티드에 대한 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질의 결합이 컨쥬게이션되지 않았을 때의 폴리펩티드에 대한 것보다 적게 되도록, 바람직하게는 2배 초과로 더 적게 되도록 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드 상의 소정의 부위에 공유적으로 부착되어 있다. 한 실시태양에서, 생체적합성 중합체는 폴리펩티드에 대한 헤파린 술페이트 프로테오글리칸의 결합이 컨쥬게이션되지 않았을 때의 폴리펩티드에 대한 것보다 적게 되도록, 바람직하게는 2배 초과로 더 적게 되도록 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드 상의 소정의 부위에 공유적으로 부착되어 있다. 추가의 실시태양에서, 생체적합성 중합체는 폴리펩티드에 대한 제VIII 인자 억제 항체의 결합이 컨쥬게이션되지 않았을 때의 폴리펩티드에 대한 것보다 적게 되도록, 바람직하게는 2배 초과로 더 적게 되도록 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드 상의 소정의 부위에 공유적으로 부착되어 있다. 또다른 실시태양에서, 생체적합성 중합체는 폴리펩티드에 대한 저밀도 지단백질 수용체의 결합이 컨쥬게이션되지 않았을 때의 폴리펩티드에 대한 것보다 적게 되도록, 바람직하게는 2배 초과로 더 적게 되도록 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드 상의 소정의 부위에 공유적으로 부착되어 있다. 또다른 실시태양에서, 생체적합성 중합체는 혈장 단백질분해효소가 폴리펩티드가 컨쥬게이션되지 않았을 때보다 적게 폴리펩티드를 분해하도록 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드 상의 소정의 부위에서 공유적으로 부착되어 있다. 추가의 실시태양에서, 혈장 단백질분해효소에 의한 폴리펩티드의 분해가 동일 조건 하에서 동일 기간에 걸쳐 측정될 때 컨쥬게이션되지 않았을 때의 폴리펩티드의 분해보다 2배 초과로 더 적다.
FVIII에 대한 LRP, LDL 수용체 또는 HSPG의 결합 친화도는 표면 플라즈몬(plasmon) 공명 기술(바이아코어(Biacore))을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, FVIII는 직접적으로 또는 FVIII 항체를 통해 간접적으로 바이아코어(BiacoreTM) 칩에 코팅될 수 있고, 다양한 농도의 LRP를 칩 상으로 통과시켜 상호작용이 이루어지는 비율 및 이루어지지 않은 비율 모두를 측정할 수 있다(문헌 [Bovenschen N. et al., 2003, J. Biol. Chem. 278(11), pp. 9370-7]). 두가지 비율의 비는 친화도의 측정치를 나타낸다. PEG화했을 때 친화도에서 2배, 바람직하게는 5배, 보다 바람직하게는 10배, 더 바람직하게는 30배 감소가 바람직할 수 있다.
단백질분해효소 APC에 의한 FVIII의 분해는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 측정될 수 있다.
한 실시태양에서, 생체적합성 중합체는 제VIII 인자 아미노산 위치 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 및 2284 중 하나 이상에서 폴리펩티드에 공유적으로 부착된다. 또다른 실시태양에서, 생체적합성 중합체는 제VIII 인자 아미노산 위치 377, 378, 468, 491, 504, 556, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911 및 2284 중 하나 이상에서 폴리펩티드에 공유적으로 부착되고, (1) 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질에 대한 컨쥬게이트의 결합이 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질에 대한 컨쥬게이션되지 않은 폴리펩티드의 결합보다 적거나; (2) 저밀도 지단백질 수용체에 대한 컨쥬게이트의 결합이 저밀도 지단백질 수용체에 대한 컨쥬게이션되지 않은 폴리펩티드의 결합보다 적거나; 또는 (3) 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 및 저밀도 지단백질 수용체 모두에 대한 컨쥬게이트의 결합이 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 및 저밀도 지단백질 수용체에 대한 컨쥬게이션되지 않은 폴리펩티드의 결합보다 더 적다.
추가의 실시태양에서, 생체적합성 중합체는 제VIII 인자 아미노산 위치 377, 378, 468, 491, 504, 556 및 711 중 하나 이상에서 폴리펩티드에 공유적으로 부착되고, 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 대한 컨쥬게이트의 결합이 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 대한 컨쥬게이션되지 않은 폴리펩티드의 결합보다 더 적다. 추가의 실시태양에서, 생체적합성 중합체는 제VIII 인자 아미노산 위치 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 및 2284 중 하나 이상에서 폴리펩티드에 공유적으로 부착되고, 컨쥬게이트가 컨쥬게이션되지 않은 폴리펩티드보다 제VIII 인자 억제 항체에 더 적게 결합한다. 추가의 실시태양에서, 생체적합성 중합체는 제VIII 인자 아미노산 위치 81, 129, 377, 378, 468, 487, 491, 504, 556, 570, 711, 1648, 1795, 1796, 1803, 1804, 1808, 1810, 1864, 1903, 1911, 2091, 2118 및 2284 중 하나 이상에서, 바람직하게는 위치 377, 378, 468, 491, 504, 556 및 711 중 하나 이상에서 폴리펩티드에 공유적으로 부착되고, 컨쥬게이트가 컨쥬게이션되지 않은 폴리펩티드보다 제VIII 인자를 분해할 수 있는 혈장 단백질분해효소에 의해 더 적게 분해된다.
추가의 실시태양에서, 생체적합성 중합체는 아미노산 위치 129, 491, 1804 및/또는 1808에서, 보다 바람직하게는 491 또는 1808에서 B-도메인 결실 제VIII 인자에 공유적으로 부착된다. 추가의 실시태양에서, 생체적합성 중합체는 제VIII 인자 아미노산 위치 1804에서 폴리펩티드에 부착되고, 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 바람직하게는, 생체적합성 중합체의 부착을 위한 하나 이상의 소정의 부위는 부위 특이적 시스테인 돌연변이에 의해 조절된다.
관능성 제VIII 인자 폴리펩티드 상의 하나 이상, 바람직하게는 하나 또는 둘이 중합체 부착을 위한 소정의 부위일 수 있다. 특정 실시태양에서, 폴리펩티드는 모노PEG화되거나 디PEG화된다.
또한, 본 발명은, 소정의 부위에서 시스테인 잔기에 대한 코딩 서열로 치환하기 위해 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 돌연변이시키는 단계; 시스테인 강화 뮤테인을 생성하기 위해 돌연변이된 뉴클레오티드 서열을 발현시키는 단계; 뮤테인을 정제하는 단계; 컨쥬게이트가 형성되도록 실질적으로 감소된 시스테인 잔기에서만 폴리펩티드와 반응하도록 활성화된 생체적합성 중합체와 뮤테인을 반응시키는 단계; 및 컨쥬게이트를 정제하는 단계를 포함하는 컨쥬게이트의 제조 방법에 관한 것이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은, (a) 제VIII 인자 뮤테인의 노출 표면 상의 아미노산 잔기에 대한 시스테인 대체물을 갖는 부위 지향 제VIII 인자 뮤테인을 발현시키는 단계 (시스테인은 캡핑되어 있음); (b) 시스테인 뮤테인을 서서히 환원시키고 캡을 배출시키는 조건 하에서 시스테인 뮤테인을 환원제와 접촉시키는 단계; (c) 시스테인 뮤테인으로부터 캡 및 환원제를 제거하는 단계; 및 (d) 환원제의 제거로부터 약 5 분 이상, 바람직하게는 15 분 이상, 더 바람직하게는 30분 이상 후에 PEG화 제VIII 인자 뮤테인이 생성되는 조건 하에서 술프히드릴 결합 잔기를 포함하는 PEG로 시스테인 뮤테인을 처리하는 단계를 포함하는 제VIII 인자 뮤테인의 부위 지향 PEG화 방법을 제공한다. PEG의 술프히드릴 결합 잔기는 티올, 트리플레이트, 트레실레이트, 아지리딘, 옥시란, S-피리딜 및 말레이미드 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 말레이미드이다.
또한, 본 발명은 치료 유효량의 본 발명의 컨쥬게이트 및 제약적으로 허용가능한 보강제를 포함하는 비경구 투여를 위한 제약 조성물에 관한 것이다. 제약적으로 허용가능한 보강제는 활성 성분에 첨가되어 제제화를 돕거나 제제를 안정화시키고 환자에 심각한 해로운 독소 효과를 일으키지 않을 수 있는 성분이다. 이러한 보강제의 예는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 물, 당, 예컨대 말토스 또는 수크로스, 알부민, 염제 등을 들 수 있다. 다른 보강제는 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 유효량의 본원의 컨쥬게이트를, 호스트에 대한 효과적인 투여에 적합한 제약적으로 허용가능한 조성물을 제조하기 위한 적합한 양의 비히클과 함께 함유할 수 있다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 출혈 경력의 심각도에 따라 변할 수 있는 용량으로 A형 혈우병을 앓는 대상에 비경구로 투여될 수 있다. 정맥내로 투여되는 평균 용량은 시술전 징후에 대해서는 40 단위/kg, 경증 출혈에 대해서는 15 내지 20 단위/kg 및 유지 용량을 위한 8시간 기간에 걸쳐 투여되는 20 내지 40 단위/kg의 범위이다.
한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 표면 BDD 아미노산을 시스테인으로 대체하고, 포유동물의 발현 시스템에서 시스테인 뮤테인을 생성하고, 성장 배지로부터 시스테인에 의해 발현되는 동안 캡핑된 시스테인을 환원시키고, BDD 디술파이드를 재형성시키기 위해 환원제를 제거하고, 시스테인 특이적 생체적합성 중합체 반응물, 예컨대 PEG-말레이미드와 반응시키는 것을 포함한다. 이러한 반응물의 예는 넥타 쎄라퓨틱스(Nektar Therapeutics; 미국 캘리포니아주 샌카를로스)로부터 각각 넥타 카탈로그 번호 2D2M0H01 mPEG-MAL MW 5,000 Da, 2D2M0P01 mPEG-MAL MW 20 kD, 2D3X0P01 mPEG2-MAL MW 40 kD로 입수가능한 5, 22 또는 43 kD와 같은 PEG 크기, 또는 노프 코포레이션(NOF Corporation, 일본 도꾜)으로부터 각각 노프 카탈로그 번호 선브라이트(Sunbright) ME-120MA 및 선브라이트 ME-300MA로 입수가능한 12 또는 33 kD와 같은 PEG 크기를 갖는 PEG-말레이미드이다. PEG화 생성물은 이온교환 크로마토그래피를 사용하여 정제되어 비반응된 PEG를 제거하고, 크기배제 크로마토그래피를 사용하여 비반응된 BDD를 제거한다. 이 방법은 임의의 바람직하지 않은 FVIII과의 상호작용, 예컨대 수용체 매개 제거, 억제 항체 결합 및 단백질분해효소에 의한 분해를 식별하고 선택적으로 막는데 사용될 수 있다. 본 발명자들은 넥타 또는 노프에 의해 5 kD로 공급되는 PEG 반응물은 본 발명자들의 실험에서 6 kD로 시험되었고, 유사하게 선형 20 kD로 공급된 PEG 반응물을 22 kD로 시험되었고, 40 kD로 공급된 것은 43 kD로 시험되었고, 60 kD로 공급된 것은 64 kD로 시험되었음을 유의하였다. 혼란을 피하기 위해, 본 발명자들이 제조업자가 확인한 바와 같이 5 kD로 기록된 5 kD PEG를 제외하고, 본 발명자들은 본원에서의 설명에서 본 발명자들의 실험에서 시험된 바와 같은 분자량을 사용한다.
BDD의 위치 419 및 1808에서의 시스테인 돌연변이 (상기에 개시됨) 이외에, 위치 487, 496, 504, 468, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803 및 1804를 시스테인으로 돌연변이시켜서 PEG화했을 때 잠재적으로 LRP 결합의 차단을 가능케 하였다. 또한, 위치 377, 378 및 556을 시스테인으로 돌연변이시켜서 PEG화했을 때 LRP 및 HSPG 결합 모두의 차단을 가능케 하였다. 위치 81, 129, 422, 523, 570, 1864, 1911, 2091 및 2284를 BDD 상에서 동일하게 이격되도록 선택하여, 본래의 글리코실화 부위 (41, 239 및 2118) 및 LRP 결합 부위에서의 PEG화 함께 이들 위치에서 거대한 PEG (> 40 kD)를 이용한 부위 지향 PEG화가 BDD 표면을 완전히 덮고 BDD에 대한 새로운 제거 메카니즘을 식별하도록 하였다.
한 실시태양에서, 세포 배양 배지는 디술파이드 결합을 형성하여 뮤테인 상에서의 시스테인 잔기를 "캡핑"하는 시스테인을 함유한다. 컨쥬게이트의 제조시, 재조합 시스템에서 생성된 시스테인 뮤테인은 배지로부터의 시스테인으로 캡핑되고, 이 캡은 시스테인 특이적 중합체 반응물을 첨가하기 전에 캡을 배출하는 온화한 환원에 의해 제거된다. FVIII의 부위 특이적 돌연변이에 대하여 당업계에 알려진 다른 방법 또한 사용될 수 있으며, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명은 향상된 약물동태학적 특성 및 치료 특성을 갖는 생체적합성 중합체 컨쥬게이션된 관능성 FVIII 폴리펩티드를 제공한다.
도 1. PEG 뮤테인에 대한 벡터 맵 및 돌연변이 유발 전략.
도 2. 모노클로날 FVIII 항체 크로마토그래피 칼럼 상에서 정제된 PEG2 단백질에 대한, 시간에 대한 280 nm에서의 UV 흡수 프로파일. 크로마토그래피는 아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience)로부터의 AKTA(등록상표) 익스플로러(Explorer) 100 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행되었다.
도 3. 3단계 부위 지향 PEG화 방법. PEG는 PEG-말레이미드와 같이 시스테인 반응성 PEG를 나타낸다. 폐쇄된 막대기는 디술파이드 형성을 나타내고, 열린 막대기는 환원된 시스테인을 나타낸다.
도 4. PEG2의 부위 지향 PEG화.
도 5. PEG6의 부위 지향 PEG화.
도 6a. BDD, PEG2, 4, 5 및 6의 부위 지향 PEG화. 위쪽 패널은 중쇄(H) 항체로 염색되었고, 아래쪽 패널은 경쇄(L) 항체로 염색되었다. "U"는 H 및 L 모두를 함유하는 처리되지 않은 물질이다.
도 6b. 대조군으로서의 PEG2 및 PEG6이 있는 PEG15 및 PEG7의 PEG화. 정제된 출발 PEG 뮤테인("S")은 TCEP로 환원되고, 환원제("R")의 제거 후 12 kD("12") 또는 22 kD("22") PEG로 PEG화된다. 샘플은 6% 트리스-글리신 SDS PAGE 상에서 실행되었고, 좌측 패널에서는 중쇄("HC") 항체로 또는 우측 패널에서는 경쇄("LC") 항체로 염색되었다. "U"는 HC 및 LC 모두를 함유하는 처리되지 않은 물질이다. PEG화 밴드는 점들로 표시되어 있다.
도 6c. 대조군으로서의 PEG2 및 PEG6이 있는 PEG2+6의 PEG화. PEG2, PEG6 또는 PEG2+6은 TCEP로 환원되고, 환원제("R")의 제거 후 5 kD("5") 또는 43 kD("43") PEG로 PEG화된다. 또한, PEG2+6는 12, 22 및 33 kD PEG로 PEG화된다. 샘플은 6% 트리스-글리신 SDS PAGE 상에서 실행되었고, 좌측 상의 단백질에 대해서는 쿠마시로, 또는 중쇄(H) 또는 경쇄(L) 항체로 염색되었다. "U"는 H 및 L 모두를 함유하는 처리되지 않은 물질이다. PEG화 밴드는 점들로 표시되어 있다.
도 6d. 대조군으로서 PEG2가 있는 전체 길이의 야생형 FVIII (KG-2)의 PEG화. 좌측 겔은 단백질에 대한 쿠마시 염료로 염색되었고, 우측 겔은 PEG에 대한 요오드로 염색되었다. "BDD U"는 H 및 L 모두를 함유하는 처리되지 않은 BDD 물질이다. PEG화 밴드는 점들로 표시되어 있다.
도 7. PEG화된 PEG2의 트롬빈 절단. A2 도메인의 N-말단 절반부는 청색으로 C-말단 절반부는 녹색으로 착색되었으며, R8B12 항체 에피토프는 암녹색으로 표시되어 있다(우측 FVIII 모델). PEG2 (1번 레인) 및 22 kD PEG화 PEG2 (2번 레인)는 트롬빈으로 처리되었고(각각 3번 및 4번 레인), 그 후 7% 트리스-아세테이트 겔(인비트로겐) 상에서 실행되었고, R8B12 항체로 염색되었다. 각각의 레인은 약 50 ng의 FVIII을 함유한다.
도 8. 전체 길이의 PEG화된 야생형 FVIII (KG-2)의 트롬빈 절단. "S" = 출발 KG-2 물질. "R" = 환원된 KG-2 및 제거된 환원제. "P" = 43 kD PEG로 PEG화된 "R". "순수" = 과량의 PEG로부터 정제된 "P". "L" = 경쇄. PEG화 밴드는 점들로 표시되어 있다.
도 9. PEG화 PEG2의 요오드 염색. 22 또는 43 kD PEG화 PEG2를 6% 트리스글리신 겔 상에서 실행하고, R8B12 FVIII 항체 (1번 및 2번 레인) 또는 요오드 (3번 및 4번 레인)로 염색하였다. 2가지 염료는 이의 분자량 마커 레인에 따라 정렬되었다. 1번 및 2번 레인 각각은 약 30 ng의 FVIII를 함유하고, 3번 및 4번 레인은 약 2 ㎍을 함유한다.
도 10. PEG화 및 비PEG화 PEG2의 MALDI 질량 분석법에 의한 분석. MALDI 질량 분석을 PEG2 (도 10a) 또는 22 kD PEG화 PEG2 (도 10b) 상에서 수행하였다. PEG화된 때, PEG2의 중쇄(H) 피크는 크게 감소되고, 111 kD에 중심을 둔 (22 kD PEG + 89 kD 중쇄) 새로운 피크(H+PEG)가 나타난다. 100 kD (22 kD PEG + 83 kD 경쇄)에 중심을 둘 것으로 예상되는 PEG화 경쇄(L) 피크는 탐지되지 않는다.
도 11. 트롬빈 절단 후의 PEG화 및 비PEG화 PEG2의 MALDI 질량 분석법에 의한 분석.
도 12. 트롬빈 절단 전후의 PEG화 PEG6의 MALDI 질량 분석법에 의한 분석.
도 13. 크기배제 칼럼 상에서 정제된 PEG화 PEG2의 280 nm에서의 UV 흡수 프로파일.
도 14. 양이온교환 칼럼 상에서 정제된 PEG화 및 비PEG화 PEG6의 280 nm에서의 UV 흡수 프로파일.
도 15. 크기배제 칼럼 상에서 정제된 PEG화 및 비PEG화 PEG6의 280 nm에서의 UV 흡수 프로파일.
도 16. 발색 분석 및 응고 분석에 의해 측정되어 PEG화 단백질의 활성을 비PEG화 단백질의 활성과 대비하고 있다. 정제된 전체 길이의 FVIII은 KG-2로 나타나 있다. 기록된 %활성은 환원 및 환원제 제거 후에 PEG로 처리된 샘플 값을 PEG화 수율을 고려한 버퍼 대조군으로 처리된 샘플 값으로 나누어 측정되었다.
도 17. PEG2와 대비한 PEG화 PEG2의 토끼 PK 연구.
도 18. BDD 및 PEG2와 대비한 PEG화 PEG2의 토끼 PK 연구. P-값은 PEG화 PEG2 및 BDD 간의 대비치이다.
도 19. BDD 및 PEG6와 대비한 PEG화 PEG6의 토끼 PK 연구.
도 20. 변형되지 않은 전체 길이의("fl") FVIII와 대비한 전체 길이의 PEG화된 야생형 FVIII의 토끼 PK 연구.
도 21. PEG6 및 BDD와 대비한 PEG화 PEG6의 혈우병 마우스 PK 연구.
도 22. BDD와 대비한 22 및 43 kD PEG화 PEG2의 정상 마우스 PK 연구.
도 23. 전체 시간 과정에서 BDD와 대비한 22 kD PEG화 PEG2의 정상 마우스 PK 연구.
도 24. 혈우병 마우스 분석에서 2종의 BDD 제VIII 인자의 반감기의 약물동태학적 평가를 나타내는 혈우병 마우스(BDD) 제VIII 인자 회복 막대그래프.
도 25. BDD와 대비한 22 kD PEG화 PEG2의 혈우병 마우스 신장 열상 연구. 비히클 처리 마우스는 25 ㎕/g(체중)의 혈액 손실을 갖는다.
도 26. 증가량의 FVIII 항체의 존재 하에서의 PEG화 PEG2 및 BDD의 발색 활성. 항체 에피토프는 괄호에 나타나 있다.
도 27. 증가량의 FVIII mAB 413 항체의 존재 하에서의 PEG화 PEG2의 발색 활성.
도 28. FVIII에 대한 발달된 억제제를 갖는 환자로부터 유도된 인간 혈장에 존재하는 BDD, 43 kD PEG화 PEG2, 33 kD PEG화 PEG6, 및 33 kD 디PEG(diPEG)화 PEG2+6의 발색 활성. 억제제 역가 및 혈액 수집 일자는 상부에 기록되어 있다. 위의 두개의 패널은 5 내지 405배의 환자 혈장 희석에서 수집되었다. 아래에서 왼쪽 패널은 환자의 HRF-828 혈장에 대해 1:15배 희석에 촛점을 맞춘 것이다. 아래에서 오른쪽 패널은 위의 두개의 패널 중 각각의 FVIII 샘플에 사용된 0.064 IU/mL가 포화 용량이 아니었음을 확인하게 한다.
도 29. PEG화 스크리닝 방법 및 확인. 위쪽 패널은 일시적으로 발현된 PEG 뮤테인의 PEG화 스크리닝을 개략적으로 나타낸다. 아래쪽 패널은 중쇄("H") 특이적 항체(왼쪽) 또는 경쇄("L") 특이적 항체(오른쪽)를 사용하는 PEG화 생성물의 웨스턴 분석을 나타낸다. PEG화 밴드는 점들로 표시되어 있다. "U"는 H 및 L을 모두 함유하는 처리되지 않은 물질이다.
도 30. PEG 15-17의 PEG화 스크리닝. 중쇄("H") 특이적 항체 (R8B12 및 58.12) 또는 경쇄("L") 특이적 항체 (C7F7 및 GM)를 사용하는 PEG화 생성물의 웨스턴 분석. 모든 3가지 뮤테인이 PEG15~PEG16>PEG17의 상대적인 PEG화 효율로 중쇄에 대해 선택적이다. PEG화 밴드는 점들로 표시되어 있다. "U"는 H 및 L을 모두 함유하는 처리되지 않은 물질이다.
도 31. 환원제 농도의 함수로 PEG2+14의 PEG화를 나타내는 겔. PEG2+14를 4℃에서 30분 동안 67 내지 670 μM의 TCEP로 처리하였다. 환원제를 스핀 칼럼에 의해 제거한 후, 12 kD PEG로 PEG화하였다. 중쇄 및 경쇄 FVIII를 각각 "H" 및 "L"로 표시하였다. 2개의 점들은 PEG화된 중쇄 및 경쇄를 나타낸다.
도 32. 67 내지 670 μM의 TCEP로 처리한 후 환원제를 제거한 PEG2+14의 역콘볼루션(deconvolution)된 질량 스펙트럼.
실시예
FVIII의 구조 활성 관계 분석. FVIII 및 BDD FVIII는 생물학적 반응에 관련된 다수의 상이한 부위를 갖는 매우 거대한 복합 분자이다. 이들을 공유적으로 변형하여 약물동태학적 특성을 향상시키고자 하는 이전의 시도들은 여러 결과를 나타냈다. 이 분자들은 특이적으로 변형된 후 중합체가 부위 특이적인 방식으로 부가될 수 있었던 점은 놀라웠다. 게다가, 이전의 중합체 컨쥬게이트가 비특이적인 부가 및 감소된 활성을 일으키는 문제가 있었다는 점을 고려하면, 향상된 약물동태학적 특성 및 유지된 활성의 결과 또한 놀라웠다.
한 실시태양에서, 본 발명은 PEG-말레이미드와 같은 시스테인 특이적 리간드를 사용한 부위 지향 돌연변이 발생에 관한 것이다. 비돌연변이된 BDD는 PEG-말레이미드와 반응할 수 있는 임의의 이용가능한 시스테인을 갖지 않으며, 따라서 돌연변이된 시스테인 위치만이 PEG화 부위일 수 있다. 보다 구체적으로, BDD FVIII는 19개 시스테인을 가지며, 이 중 16개는 디술파이드를 형성하고, 이 중 다른 3개는 자유 시스테인이다(문헌 [McMullen et al., 1995, Protein Sci. 4, pp. 740-746]). BDD의 구조적인 모델은 모든 3개의 자유 시스테인이 숨겨지는 것을 제안한다(문헌 [Stoliova-McPhie et al., 2002, Blood 99, pp. 1215-1223]). 산화된 시스테인이 PEG-말레이미드에 의해 PEG화될 수 없기 때문에, BDD에서 디술파이드를 형성하는 16개의 시스테인은 먼저 환원되지 않으면 PEG화될 수 없다. BDD의 구조적인 모델에 기초하여, BDD 중 3개의 자유 시스테인은, 이들 시스테인을 PEG 반응물에 노출시키기 위해 단백질을 먼저 변성시키지 않으면, PEG화될 수 없다. 따라서, 이의 기능을 거의 대부분 파괴할 수 있는 BDD 구조를 극적으로 변화시키지 않으면, 본래의 시스테인 잔기에서 PEG화에 의해 BDD의 특이적 PEG화를 달성하는 것이 실행가능한 것으로 보이지 않는다.
전체 길이의 FVIII의 B 도메인 중 4개의 시스테인의 산화환원 상태는 알려져 있지 않다. B 도메인 중 4개의 시스테인의 PEG화는, 이들이 디술파이드를 형성하지 않고 표면 노출되어 있다면, 가능할 수 있다. 그러나, 전체 길이의 FVIII 및 BDD는 유사한 약물동태학(PK) 프로파일 및 유사한 생체내 반감기를 갖기 때문에(문헌 [Gruppo et al., 2003, Haemophilia 9, pp. 251-260]), B 도메인 PEG화는, PEG가 B 도메인이 아닌 영역 또한 보호하게 되지 않는다면, 향상된 혈장 반감기를 야기하지 않을 것이다.
제VIII 인자 활성을 유지하고 약물동태학적 특성을 향상시킬 수 있는 중합체 부착을 위한 FVIII 활성을 갖는 폴리펩티드 상의 소정의 부위를 결정하기 위해, 이하의 가이드라인이 BDD FVIII에 기초하여 제공된다. 변형은 LRP, HSPG, APC 및 억제 항체 결합 부위와 같은 제거, 불활성 및 면역원성 메카니즘을 대상으로 하여야 한다. 문헌 [Stoilova-McPhie. S. et al., 2002, Blood 99(4), pp. 1215-23]는 BDD의 구조를 나타낸다. 예를 들어, 반감기를 연장하기 위해, 단일 PEG가 A2 잔기 484-509 및 A3 잔기 1811-1818에서 LRP 결합 부위 또는 그 부근의 특이적인 위치에 도입될 수 있다. 이들 부위에서 거대한 PEG의 도입이 LRP를 결합시키는 FVIII의 능력을 붕괴시키고, 순환으로부터의 FVIII의 제거를 감소시켜야 한다. 또한, 활성에 심각하게 영향을 끼치지 않으면서 반감기를 연장시키기 위해, PEG가 잔기 1648 위치에 도입될 수 있으며, 이는 전체 길이의 분자 중 그리고 A2 및 A3 도메인 사이의 BDD의 14 아미노산 중의 B 도메인 및 A3 도메인의 접합이다.
PEG화의 특이성은 재조합 DNA 돌연변이 유발 기술을 사용하여 A2 또는 A3 도메인 내로 단일 시스테인 잔기를 처리한 후, PEG-말레이미드와 같은 시스테인 특이적인 PEG 반응물로 도입된 시스테인의 부위 특이적 PEG화를 시켜서 달성될 수 있다. 484-509 및 1811-1818에서의 PEG화의 또다른 장점은 이들 2개의 에피토프가 환자의 억제 항원 부위 중 3개의 주요군 중 2개를 나타낸다는 것이다. 향상된 순환 반감기 및 면역원성 반응의 감소의 최대 효과를 달성하기 위해, A2 및 A3 LRP 결합 부위 모두가 PEG화되어 디PEG화 생성물을 산출할 수 있다. 1811-1818 영역 내에서의 PEG화는, 이 영역 또한 FIX 결합에 관련되기 때문에, 활성의 심각한 손실을 일으킬 수 있음을 유의하여야 한다. 558-565 내에서의 부위 지향 PEG화는 HSPG 결합을 파괴하여야 하지만, 이 영역 또한 FIX에 결합하기 때문에 활성도 감소시킬 수 있다.
추가적인 표면 부위가 FVIII의 새로운 제거 메카니즘을 식별하기 위해 PEG화될 수 있다. A2 도메인의 PEG화는 A2 도메인이 활성화되면 FVIII로부터 해리되고 순환으로부터 이의 보다 작은 크기로 인하여 FVIII 분자의 다른 것보다 빠르게 제거될 수 있다는 추가의 장점을 제공할 수 있다. 다르게는, PEG화 A2는 신장 제거를 피할 수 있도록 충분히 크고 FVIII의 나머지에 비해 상당한 혈장 반감기를 가지므로, 생체내에서 활성화 FVIII를 재구성할 수 있다.
A2 및 A3 영역에서 PEG화 부위의 식별. 잠정 A2 LRP 결합 영역 또는 그 부근의 5개의 위치(PEG 1-5 위치에 대응하는 Y487, L491, K496, L504 및 Q468)는 이들의 Cα에서 Cβ 궤도로의 외부 방향 및 높은 표면 노출에 기초하여 부위 지향 PEG화에 대한 예로 선택되었다. 게다가, 이들 잔기는 분자의 3차원 구조에서 서로 개략적으로 등거리에 있어서, 이들 모두 이의 전체 영역을 나타낼 수 있다. 잠정 A3 LRP 결합 영역 또는 그 부근의 8개의 위치(PEG6-14에 대응하는 1808, 1810, 1812, 1813, 1815, 1795, 1796, 1803, 1804)는 부위 지향 PEG화에 대한 예로 선택되었다. PEG6(K1808)은 1811-1818 및 1810에서의 천연 N-연결 글리코실화 부위 주위에 있다. 위치 1810(PEG7)에서의 PEG화는 당을 PEG로 대체할 수 있다. PEG8 위치 T1812에서의 돌연변이 또한 글리코실화 부위를 파괴할 수 있다. PEG9 위치(K1813)가 내부를 겨냥하는 것으로 예측되지만, 구조 모델이 정확하지 않은 경우 선택되었다. PEG 10(Y1815)는 LRP 결합 루프 내에서 거대한 소수성 아미노산이고, 소수성 아미노산이 전형적으로 단백질-단백질 상호작용의 중심에서 발견되기 때문에, 중요한 상호작용 잔기일 수 있다. 1811-1818 영역이 LRP 및 FIX 결합 모두에 관련되어 있다고 보고되었기 때문에, 이 루프 내에서의 PEG화는 감소된 활성을 야기할 수 있는 것으로 고려되었다. 따라서, PEG11-PEG14(1795, 1796, 1803, 1804)는 1811-1818 루프 부근에 있지만 이 루프 내에 있지 않도록 디자인되어서 상이한 PEG 크기를 갖는 LRP 및 FIX 결합을 해리할 수 있게 한다.
LRP 결합 부위들을 동시에 차단하기 위해, 예를 들어 PEG2 및 PEG6 위치에서의 이중 PEG화를 생성할 수 있다.
558-565 영역이 HSPG 및 FIX 모두에 결합하는 것으로 나타났으므로, 어떠한 부위도 이 영역 내로 디자인되지 않았다. 대신에, PEG15-PEG17(377, 378 및 556)은 A2 LRP 및 HSPG 결합 영역 사이로 디자인되어서, 부착된 PEG가 양쪽의 상호작용을 간섭하고 이들 사이의 가능한 상호작용을 붕괴시킬 수 있다. 표면 노출되어 있고 외부를 겨냥하는 추가의 부위 또한 LRP 및 HPSG 결합 영역 내 또는 그 부근에서 선택될 수 있다. 새로운 제거 메카니즘을 식별하기 위해, FVIII는 계통적으로 PEG화될 수 있다. PEG1-17에 더하여, 3가지 다른 천연 글리코실화 부위, 즉 PEG18-20에 대응하는 N41, N239 및 N2118가, 이들이 표면 노출되어야 하므로, PEG화에 대한 구속점으로서 사용될 수 있다. PEG2, PEG6 및 4개의 글리코실화 부위의 Cβ 원자로부터 20 Å 반경 이내의 표면 구역이, vWF, FIX, FX, 인지질 및 트롬빈에 대한 관능성 상호작용 부위에 더하여, BDD 모델 상으로 맵핑되었다.
그 다음에, Y81, F129, K422, K523, K570, N1864, T1911, Q2091 및 Q2284에 대응하는 PEG21-29가, 이들의 Cβ 원자 각각으로부터 20 Å 반경을 갖는 전체 잔여 BDD 표면을 거의 뒤덮을 수 있는 이들의 능력에 기초하여 선택되었다. 또한, 이들 위치는, 이들이 전체적으로 노출되고, 외부를 겨냥하고, 가능한 부정확한 디술파이드 형성을 최소화하기 위해 천연 시스테인으로부터 이격되어 있기 때문에, 선택되었다. 20 Å 반경은, 거대한 PEG, 예컨대 64 kD 분지 PEG가 약 20 Å 반경을 갖는 구체를 뒤덮을 수 있는 능력을 갖는 것으로 기대되기 때문에, 선택된다. 글리코실화 부위 PEG18, 19 및 20 및 PEG2 및 PEG6와 PEG21-29의 PEG화는 FVIII의 전체의 비관능화 표면을 거의 보호할 수 있다.
향상된 PK 프로파일, 더 높은 안정성 또는 감소된 면역원성과 같은 증강된 특성을 유도하는 PEG화 위치들은 조합되어 최대로 증강된 특성을 갖는 다중 PEG화 생성물을 생성할 수 있다. PEG30 및 PEG31은 A2 및 A3 도메인에 각각 노출된 디술파이드를 제거하여 디자인되었다. PEG30 또는 C630A는 PEG화를 위한 이의 디술파이드 파트너인 C711을 자유롭게 해야 한다. 유사하게, PEG31, C1899A는 C1903을 PEG화하게 해야 한다.
돌연변이 발생. FVIII의 부위 지향 PEG화를 위한 기질은 PEG화를 위해 선택된 부위에서 시스테인 코돈을 도입하여 생성될 수 있다. 스트라타진 씨퀵체인지 II 부위 지향 돌연변이 발생 키트를 사용하여 모든 PEG 돌연변이를 만들었다(스트라타진 코포레이션(미국 캘리포니아주 라졸라)으로부터의 스트라타진 키트 200523). 씨퀵체인지 부위 지향 돌연변이 발생 방법은 푸 터보(Pfu Turbo)(등록상표) DNA 중합효소 및 온도 순환기를 사용하여 수행된다. 바람직한 돌연변이를 함유하는 2개의 우수한 올리고뉴클레오티드 프라이머를, 프라이머를 치환하지 않는 푸 터보를 사용하여 연장시킨다. 야생형 FVIII 유전자를 함유하는 dsDNA는 주형으로서 사용된다. 다수 연장 사이클 이후, 생성물은 메틸화 DNA에 특이적인 Dpnl 핵속핵산분해효소로 소화된다. 돌연변이를 함유하는 새로이 합성된 DNA는 메틸화되지 않지만, 모체 야생형 DNA는 메틸화되어 있다. 그 다음에, 소화된 DNA를 사용하여 XL-1 블루 초적격세포를 형질전환시킨다.
돌연변이 발생 효율은 거의 80%이다. 돌연변이 발생 반응은 pSK207+BDD C2.6 또는 pSK207+BDD에서 수행되었다(도 1). 성공적인 돌연변이 발생이 DNA 서열분석에 의해 확인되었고, 돌연변이를 함유하는 적절한 분획을 포유동물 발현 벡터 pSS207+BDD 중의 FVIII 골격 내로 전달하였다. 전달 후, 모든 돌연변이에 대해 다시 서열을 확인하였다. A3 뮤테인 PEG 6, 7, 8, 9 및 10에 대해, 돌연변이 발생을 벡터 pSK207+BDD C2.6에서 수행하였다. 서열분석에 의해 확인한 후, 돌연변이 분획 Kpnl/Pme을 pSK207+BDD 내로 서브클로닝하였다. 그 다음에, BDD 뮤테인을 pSS207+BDD 발현 벡터 내로 서브클로닝하였다. A3 뮤테인 PEG 11, 12, 13, 14에 대해, 돌연변이 발생을 직접 벡터 pSK207+BDD에서 수행하였고, 그 다음에 서열 확인된 돌연변이 BDD를 pSS207+BDD 내로 서브클로닝하였다. A2 뮤테인 PEG 1, 2, 3, 4, 5에 대해, 돌연변이 발생을 pSK207+ BDD C2.6 벡터에서 수행하였다. 서열 확인된 돌연변이를 pSK207+BDD 내로 서브클로닝한 후, pSS207+BDD로 서브클로닝하였다.
돌연변이 발생을 위해 사용된 프라이머(인식된 것만)가 각각의 반응에 대하여 열거되어 있음:
Figure pat00001
Figure pat00002
뮤테인 발현. 하이그로마이신 B에 대한 내성을 부여하는 벡터에 삽입한 후, PEG 뮤테인을 제조업자의 지시에 따라 293 펙틴 트랜스펙션 리애전트(Fectin Transfection Reagent)(인비트로겐 코프(Invitrogen Corp.) Cat#12347-019)로 복합화된 HKB11 세포(미국 특허 6,136,599) 내로 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 후 3일에서의 FVIII 발현을 코우테스트(Coatest) 발색 분석(크로모제닉스 코프(Chromogenix Corp.) Cat#821033, 실시예 12 발색 분석 참조)에 의해 분석하였다 (표 1). 그 다음에 트랜스펙션된 세포를 5% FBS로 보충된 성장 배지에 Hyg B의 50 □g/ml와 함께 선택적인 압력 하에 위치시켰다. Hyg B-내성 세포군이 나타났을 때, 이들을 손으로 집어내어 코우테스트 발색 분석에 의해 FVIII 발현에 대해 스크리닝하였다. 그 다음에, FVIII 발현 안정 세포를 HPPS 보충물을 함유하는 배지에 적합하게 하였다. 세포를 새로운 배지를 갖는 혼합 플라스크에 1 × 106 세포/ml에서 확장시키고 시딩하였다. 3일 후 얻은 조직 배양액(TCF)을 FVIII BDD 뮤테인의 정제에 사용하였다. TCF의 FVIII 활성을 코우테스트에 의해 분석하였다(표 1).
Figure pat00003
뮤테인 정제. 선택된 뮤테인 FVIII 단백질을 함유하는 세포 배양 상청액을 수집할 때, 상청액을 임의의 잔류 세포를 제거하기 위해 0.2 ㎛ 막 필터를 통해 여과시킨다. 그 다음에, 상청액을 초미세여과 또는 이온교환에 의해 농축시킨다. 그 다음에, 세포 배양 배지 성분 및 다수의 호스트 세포 단백질 불순물이 제거되는 면역친화 칼럼으로 적용된다. 그 다음에, 면역친화 칼럼 용출물이 수크로스 및 냉동물을 함유하는 제제 버퍼 내로의 여과에 의해 버퍼 교환된다. 모노클로날 FVIII 항체 칼럼에 걸친 단백질의 수율 및 회복률을 발색 분석에 의해 평가하였다. 하중, 관류, 다양한 용출 분획, 스트립 및 크로마토그래피 실행의 여과된 용출물의 샘플을 FVIII 활성에 대해 평가하였다(표 2). 표 2는 모노클로날 항체 칼럼으로부터의 PEG2 뮤테인의 회복률을 나타낸다. 항체는 C7F7 항체이다. 표 2에서 %회복률은 발색 분석에 의해 결정되었다. 최종 수율은 73%였다. 도 2에 모노클로날 FVIII 항체 크로마토그래피 칼럼에서 정제된 PEG2 단백질에 대한 시간에 대한 280 nm에서의 UV 흡수도의 플롯을 나타내었다. 크로마토그래피를 아머샴 바이오사이언스로부터의 AKTA(등록상표) 익스플로러 100 크로마토그래피 시스템을 사용하여 수행하였다. 이 기기는 다중 파장 UV-가시광 모니터 및 2 mm 유동 세포를 사용한다. PEG2 뮤테인을 고염의 존재 하에 칼럼으로부터 용출시키고, 용출 피크를 280 nm에서의 흡수도 및 FVIII 활성 분석 모두에 의해 나타내었다.
Figure pat00004
PEG화. 천연의 전체 길이의 FVIII 또는 BDD는 100배가 넘는 과량의 PEG:단백질 비(데이타는 나타내지 않음)에서의 환원 및 변성 없이 시스테인 특이적 PEG에 의해 PEG화될 수 없으며, 이는 모든 천연 시스테인이 디술파이드를 형성하거나 또는 FVIII 내에 숨겨지는 BDD 구조 모델에 기초한 가설을 확인시킨다. 상기 열거된 표준 프로토콜을 사용하여 발현되고 정제된 FVIII 시스테인 뮤테인은 시스테인 특이적 PEG 말레이미드 반응물로 PEG화될 수 없었으며, 이는 도입된 FVIII 시스테인이 세포 성장 배지에 존재하는 시스테인 및 β-머캅토에탄올과 같은 술프히드릴기와 반응하여 "캡핑"되기 때문으로 추정된다. 이 조직은 배양 배지로부터 시스테인 및 β-머캅토에탄올을 제거하여 잠재적으로 용해될 수 있지만, 이는 더 낮은 FVIII 생성을 유발하고, 도입된 FVIII 시스테인을 차단하는 것으로부터 세포에 의해 배출되는 술프히드릴을 막을 수는 없다.
본 발명의 또다른 측면에서, 3단계 방법이 FVIII의 부위 특이적 PEG화를 하는데 개발되었다(도 3). 단계 1에서, 약 1 μM에서 정제된 FVIII 시스테인 뮤테인이 약 0.7 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP) 또는 0.07 mM 디티오트레이톨(DTT)과 같은 환원제로 4℃에서 30분 동안 서서히 환원되어 "캡"을 배출한다. 단계 2에서, 환원제가 샘플을 스핀 칼럼(바이오래드(BioRad)(등록상표))을 통해 실행하는 것과 같은 크기배제 크로마토그래피(SEC) 방법에 의해 "캡"과 함께 제거되어, 도입된 시스테인을 유리되게 그리고 감소되도록 하는 동안 FVIII 디술파이드를 재형성시킬 수 있다. 단계 3에서, 환원제의 제거 후 30분 이상 유리된 FVIII 시스테인 뮤테인을 4℃에서 1 시간 이상 동안 5 내지 64 kD의 크기를 갖는 10배 이상의 몰과량의 PEG 말레이미드(넥타 쎄라퓨틱스 및 노프 코포레이션)로 처리하였다. 이 방법은 상이한 개체에 의해 반복되는 다수의 반응에서 재현가능한 데이타를 갖는 매우 일관적인 생성물 프로파일을 산출한다.
TCEP의 제거를 위한 스핀 칼럼 방법은 측정할 수 있지 않기 때문에, 겔 여과 탈염 크로마토그래피를 선택하였다. 그러나, TCEP 스파이크 샘플을 사용하는 이 방법으로 시험하는 경우, TCEP가 칼럼 공간에서 측정가능한 수준에서 용출되고, 이의 저분자량을 갖는 분자로부터 기대되는 것과 같은 염 분획에서는 용출되지 않았다. 웨스턴 블롯 분석은 아마 TCEP의 불완전한 제거로 인하여 심각한 배경 PEG화를 나타냈다. 그런데, 다른 실험은 C7F7 정제 물질이 염 구배를 갖는 음이온교환 크로마토그래피 배지를 사용하여 다른 단백질 불순물로부터 더 현저하게 정제될 수 있음을 나타냈다. 그 다음에, 상기에 기술된 바와 같이 TCEP로 C7F7 물질을 환원시킨 후 음이온교환 칼럼 상에서 이 물질을 처리하는 것으로 결정하였다. 전하의 차이로 인하여, FVIII 단백질은 TCEP가 칼럼을 관류하고 유지되지 않는 동안 유지될 수 있었다. 염 구배 용출과 동시에 FVIII 단백질을 대다수의 잔류 단백질 불순물로부터 정제하여 제거할 수 있었다. 이는 이후 발생하는 PEG화가 더 순수한 출발 물질을 갖는 이론적으로 보다 균일한 것이라는 점을 의미하였다. 그러나, TCEP의 스파이크 샘플로 시험한 경우, 측정가능한 수준의 TCEP는 FVIII를 갖는 구배에서 용출되는 것이 발견되었음을 나타냈다. 따라서, 음이온교환 크로마토그래피 이후의 겔 여과 탈염 크로마토그래피를 실시하도록 결정하여, 순차적으로 사용하는 경우 이 2단계가 완전한 TCEP의 제거 및 비특이적 PEG화의 제거를 나타낼 수 있었다.
SDS PAGE 및 웨스턴 블롯에 의한 PEG화 분석. PEG화 생성물을 환원 6% 트리스글리신 SDS 폴리아크릴아미드 겔(인비트로겐) 상에서의 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 전기영동 이후, 겔을 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색하여 모든 단백질을 식별하거나 또는 표준 웨스턴 블롯 프로토콜을 수행하여 FVIII의 상이한 영역 상의 PEG화 패턴을 식별할 수 있다. FVIII 중쇄의 C-말단 영역 또는 VIII 경쇄의 N-말단 영역 각각에 수행한 마우스 모노클로날 R8B12 또는 C7F7 항체를 사용한 블롯의 염색은 각각의 쇄의 PEG화를 식별하여야 한다. FVIII의 484-509 영역에 대한 413 항체를 사용한 염색은 PEG화가 실제로 비특이적이거나 또는 PEG1-4와 같은 뮤테인에 대한 것이 아닌지 여부를 결정할 수 있다. 유사하게, FVIII의 1801-1823 영역을 인식하는 CLB-CAg A 항체를 사용한 염색은 PEG화가 부위 특이적인지 또는 PEG6-10과 같은 뮤테인에 대한 것이 아닌지 여부를 결정할 수 있다.
PEG2 (L491C) PEG화는 경쇄에 비해 중쇄에 선택적이고, 특히 484-509 영역에 대해 선택적임을 나타내었고(도 4), PEG6 (K1808C)는 중쇄에 비해 경쇄에 선택적임을 나타내었다(도 5).
도 4에 나타낸 연구에서, PEG2 뮤테인(1번 및 8번 레인)을 TCEP로 환원시킨 후, TCEP를 제거하고(2번 및 9번 레인), 5, 12, 22, 33 또는 43 kD PEG-말레이미드로 처리하였다(3-7번 및 10-14번 레인). 비PEG화된 FVIII는 비처리된(H+L) 그리고 처리된 중쇄(H) 및 경쇄(L) 밴드와 같이 실행되었다. 모든 세가지 밴드가 쿠마시 블루로 염색된 겔(아래에서 오른쪽) 상에서 탐지될 수 있었지만, 쇄-특이적 항체를 사용한 웨스턴 염색은 단지 비처리되고 대응하는 쇄를 나타내었다. R8B12 염색(위에서 왼쪽)을 사용하여, PEG2를 PEG-말레이미드로 처리하였을 때, 중쇄(H) 밴드가 극적으로 강도가 감소하였고, 새로운 밴드가 PEG의 크기에 비례하는 모체 H 밴드 보다 더 크게 실행하도록 생성되었다. C7F7 염색(아래에서 왼쪽)을 사용하여, 경쇄(L) 밴드 (불균일한 글리코실화로 인한 다중 밴드)는 강도가 변하지 않았다. 양쪽 염색에 대하여 비처리된 H+L 밴드는 H쇄가 비처리된 FVIII의 일부이기 때문에 이동되었다. 또한, 쿠마시 염색은 경쇄보다 중쇄의 더 많은 PEG화, 즉 H 밴드 강도의 감소를 확인하였다. 마지막으로, PEG화 밴드는, 아마도 413 항체의 484-509로의 결합을 차단하는 491의 부위 특이적 PEG화로 인해 PEG 크기 의존적인 방식으로 R8B12 염색보다 413 항체 염색(위에서 오른쪽) 상에서 상대적으로 더 많은 강도를 손실하였다. 레인 당 하중된 FVIII의 양은 2개의 왼쪽 겔에 대해서는 약 30 ng이고, 위에서 오른쪽 겔에 대해서는 약 1000 ng이고, 아래에서 오른쪽 겔에 대해서는 약 2000 ng이다.
환원제의 제거 후의 환원은 FVIII의 이동을 변화시키지 않았다(1번 레인 대 2번 레인, 및 8번 레인 대 9번 레인). 22 kD PEG의 PEG2로의 부가는 413 항체의 결합을 차단하고, 491 위치에서의 특이적 PEG화와 일관되었다(도 4 위에서 오른쪽 겔). 또한, 이는 PEG화 PEG2가, 413 항체가 인간 A2 억제 항체와 동일한 에피토프를 갖는 것으로 나타났기 때문에 인간에서 더 낮은 면역원성을 가질 수 있음을 제시한다(문헌 [Scandella et al., 1992, Thromb. Haemost. 67, pp. 665-71]).
도 5에 나타낸 연구에서, PEG6 뮤테인을 TCEP로 환원한 후, TCEP를 제거하고(1번 레인 및 6번 레인), 5, 12, 22 또는 33 kD PEG-말레이미드로 처리하였다(2-5번 레인 및 7-10번 레인). 비PEG화된 FVIII는 비처리된(H+L) 그리고 처리된 중쇄(H) 및 경쇄(L) 밴드와 같이 실행되었다. PEG6 (K1808) 돌연변이가 경쇄 상에 존재하기 때문에, PEG화는 단지 경쇄 상에서만 탐지되었고, 중쇄 상에서는 탐지되지 않았다. 레인 당 하중된 FVIII의 양은 왼쪽 겔에 대해서는 약 100 ng이고, 오른쪽 겔에 대해서는 약 30 ng이다.
대조군으로서 실행된 BDD는 상기에 기술된 환원 및 환원제 제거 절차 이후에도 100배보다 많은 몰과량의 PEG-말레이미드로 처리하였을 때 어떠한 중요한 PEG화를 나타내지 않았다(도 6a). 또한, 동일한 방법을 PEG4 및 PEG6에 적용하였다(도 6a). PEG2와 대비하면, 이들 뮤테인은 효율적으로 PEG화되지 않았지만, 이들은 PEG2(L491C)와 유사한 중쇄에 대해 선택적이었다. PEG6 (K1808C) PEG화 효율은 상대적으로 낮았고, 이는 아미도 위치 1808에서 PEG화를 차단할 수 있는 N1810에서의 N-연결 글리코실화 부위와 매우 밀접하기 때문이다. 따라서, 본 발명자들은 1810에서 천연 글리코실화 부위를 제거하도록 PEG7 (N1810C)을 디자인하였다. PEG7이 머리-대-머리(head-to-head) 대비시 PEG6에 비해 향상된 PEG화 효율을 나타낸다(도 6b). 유사하게 PEG15는 PEG2보다 약간 우수한 PEG화 효율을 나타낸다. BDD의 이중 돌연변이인 PEG2+6은, PEG2가 중쇄 시스테인 돌연변이이고 PEG6이 경쇄 돌연변이이므로 중쇄 및 경쇄 모두에서 PEG화될 수 있다(도 6c). 또한, 이 방법은 전체 길이의 야생형 FVIII에 적용되었다(도 6d). PEG화는 A1, A2 및 대부분의 B 도메인을 포함하는 중쇄의 가장 거대한 분획에서 탐지되었다. PEG화 패턴은 모노PEG화를 제시하였고, 여기에는 단일 시스테인 PEG화만이 있었다.
트롬빈 절단 및 웨스턴 블롯에 의한 PEG화 분석. PEG화 생성물을 37℃에서 30분 동안 트롬빈(40 IU/㎍ FVIII)으로 처리할 수 있다. 또한, 사용된 트롬빈은 오염물로서 APC를 함유한다. 트롬빈 절단은 중쇄로부터 50 kD A1 및 43 kD A2 도메인을 생성하고, APC 절단은 A2 도메인을 21 및 22 kD 분획으로 더 분할시킬 수 있다(도 7). 중쇄의 C-말단을 인식하는 R8B12 항체를 사용한 염색은 손상되지 않은 A2 도메인 및 21 kD C-말단 분획(FVIII 562-740)만을 식별할 수 있다. 따라서, PEG2 PEG화가 위치 491에 특이적이라면, 43 kD A2 도메인은 PEG화되어야 하지만 21 kD C-말단 분획은 그렇지 않다. 이는 실제로 도 7에 나타낸 22 kD PEG화 PEG2에 대한 웨스턴 블롯에 의해 확인되었다. 따라서, 제거에 의해, PEG2 PEG화는 A2 도메인의 N-말단 22 kD 분획(FVIII 373-561)에 국소화되었다. PEG-말레이미드가 pH 6.8에서 시스테인에 완전하게 선택적이고 단지 373-561 내의 천연 FVIII 시스테인만이 528 및 554 사이의 숨겨진 디술파이드로부터 오기 때문에, PEG2는 위치 491에서 도입된 시스테인 상에서 거의 PEG화될 수 있다. FVIII 중쇄 N-말단 항체로 트롬빈-처리된 PEG화된 PEG2의 웨스턴 염색은 A1 도메인의 어떠한 PEG화를 나타내지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 트롬빈 절단 방법을 사용한 PEG2의 선택적 PEG화 또한 5, 12, 33 및 43 kD의 PEG에 대해 확인되었다(데이타는 나타내지 않음). PEG화된 전체 길이의 야생형 FVIII의 트롬빈 절단은 B 도메인만이 PEG화되는 것을 나타낸다(도 8).
요오드 염색에 의한 PEG화 분석. 쿠마시 블루 및 웨스턴 염색시 새로 생성된 밴드는 실제로 PEG 밴드임을 확인하기 위해, PEG에 특이적인 바륨-요오드 염색을 사용하였다(도 9). PEG화 PEG2를 6% 트리스글리신 겔(인비트로겐) 상에서 수행하고, R8B12 중쇄 항체 또는 바륨-요오드 용액으로 염색하였다(문헌 [Lee et al, Pharm Dev Technol. 19994:269-275]). 이들을 정렬하기 위해 분자량 마커를 사용하여 2개의 염료 사이의 PEG화 밴드를 맞춰보고, FVIII 중쇄 PEG화를 확인하였다.
MALDI-질량 분석법에 의한 PEG화 분석. 중쇄 중의 A2 도메인의 PEG화를 확인하기 위해, PEG화 전후의 rFVIII 샘플을 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화(MALDI) 질량 분석법에 의해 분석하였다. 샘플을 30% 아세토니트릴, 0.1% TFA 중의 시나핀산 매트릭스를 갖는 MALDI 표적 플레이트 상에 혼합하고 결정화시켰다. 그 다음에, 이들을 포지티브 선형 모드에서 보이저(Voyager) DE-PRO 분광계에서 분석하였다. 도 10에 나타낸 결과는 83 kD에 중심이 있는 PEG2의 경쇄 및 89 kD에 중심이 있는 중쇄(HC)를 나타냈다. PEG화 샘플에 대해 얻은 스펙트럼은 HC 피크에서의 감소 및 111 kD에 중심을 둔 새로운 피크가 형성되었음을 나타냈다. 이는 중쇄의 PEG화를 확인한다. PEG화 경쇄(105 kD)는 상기 탐지 한계에서 관찰되지 않았다.
그 다음에, 샘플에 37℃에서 30분 동안 20 단위 트롬빈/mg FVIII에서 트롬빈 소화를 모두 수행한 후, 아미노산 분석(커몬웰쓰 바이오테크놀로지즈 인크(Commonwealth Biotechnologies, Inc))에 의해 FVIII 농도 측정을 하였다. 중쇄를 46 kD (A1) N-말단 분획 및 43 kD (A2) 분획으로 절단하였다. PEG화 샘플에 대해 얻은 MALDI 스펙트럼(도 11)은 43 kD 피크의 손실 및 새로운 65 kD 피크의 발달을 나타내고, 이는 PEG화 A2 도메인에 기인한 것이다. LC의 PEG화는 상기 탐지 한계에서 역시 관찰되지 않았다. 이들 결과는 FVIII의 A2 도메인의 PEG화를 다시 확인한다. 동일한 분석을 PEG화 PEG6에 적용하였고, 경쇄 A3C1C2 분획의 PEG화를 확인하였다(도 12).
활성 측정
응고 분석. 응고 FVIII:C 시험 방법은 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)에 기초한 1단계 분석이다. FVIII은 제X 인자에서 제Xa 인자로의 효소 변환에서 제IXa 인자, 칼슘 및 인지질의 존재 하에 공인자로서 작용한다. 이 분석에서, 희석된 시험 샘플을 FVIII 결핍 혈장 기질 및 aPTT 반응물의 혼합물과 함께 37℃에서 배양한다. 염화칼슘을 배양된 혼합물에 첨가하고, 응고를 개시한다. 역관계가 응고가 형성되는데 걸리는 시간(초) 및 FVIII:C의 농도의 로그 사이에 존재한다. 활성이 알려진 표준 물질의 일련의 희석물로부터 구성된 커브와 시험 물질의 다양한 희석물의 응고 시간을 비교하여 알려지지 않은 샘플에 대한 활성 수준을 삽입하고, mL 당 국제 단위 (IU/mL)로 기록하였다.
발색 분석. 발색 분석 방법은 2가지 연속 단계로 이루어지며, 여기서 색상의 강도가 FVIII 활성에 비례한다. 1단계에서, 제X 인자는 최적량의 칼슘 이온 및 인지질의 존재 하에 이의 공인자인 FVIIIa와 함께 FIXa에 의해 FXa로 활성화된다. 과량의 제X 인자는 제X 인자의 활성화 속도가 FVIII의 양에만 의존하도록 존재한다. 2단계에서, 제Xa 인자는 발색 기질을 가수분해하여 발색단을 산출하고, 색상 강도는 405 nm에서 광도계로 측정된다. 알려지지 않은 것의 강도가 계산되며, 분석의 유효성은 슬로프-비율 통계법으로 확인된다. 활성은 mL 당 국제 단위(IU/mL)로 기록된다.
1811-1818 루프는 FIX으로의 결합에 관련되지만, 이 루프 내에서의 개별 위치의 중요성은 결정되지 않았다. PEG7-10 뮤테인은 천연 FVIII에 대해 거의 동일한 발색 비활성을 나타낸다(표 3). 표 3은 BDD에 대한 PEG 뮤테인 및 PEG화 PEG2 또는 PEG6의 % 비활성(S.A.)을 나타낸다. S.A.는 발색, 응고 또는 vWF 결합 활성을 총 항원 ELISA (TAE) 값으로 나누어서 결정되었다. 그 다음에, PEG화 뮤테인의 S.A.는 BDD의 S.A.(8 IU/㎍ 발색, 5 IU/㎍ 응고 및 1 vWF/TAE)로 나누고, 100을 곱하여 표제의 발색, 응고 및 vWF/TAE로 표 3에 열거된 %S.A.를 얻었다.
Figure pat00005
표 3에 사용된 바와 같이, "PEG2 레드"는 환원제로 처리된 후 환원제를 제거한 PEG2 뮤테인이다. 이 환원 절차는 FVIII의 3가지 관능 활성을 중대하게 변화시키지 않았다. 5 kD(PEG2-5kD) 내지 43 kD(PEG2-43kD) 범위의 PEG로 컨쥬게이션된 PEG2 뮤테인은 상당량의 발색 활성을 손실하지 않았지만, 5 kD 보다 크게 PEG 크기가 증가할 수록 훨씬 더 낮게 응고 활성을 가졌다. 또한, 보다 큰 크기의 PEG화 PEG2에 대한 vWF 결합에서의 가장 온화한 감소가 있을 수 있다.
총 항원 ELISA (TAE). FVIII를 폴리클로날 FVIII 항체로 코팅된 미량 역가판 상에 포획하였다. 결합된 FVIII를 비오틴화 폴리클로날 rFVIII 항체 및 스트렙타비딘 당근과산화효소(HRP) 컨쥬게이트로 탐지하였다. 과산화효소-스트렙타비딘 복합물은 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질의 첨가시 색상 반응을 산출한다. 샘플 농도는 4가지 파라미터 적합 모델을 사용하여 표준 커브로부터 삽입한다. FVIII 결과는 ㎍/mL로 기록된다.
vWF 결합 ELISA. 심각한 혈우병 혈장 용액에서 FVIII이 vWF에 결합하게 하였다. 그 다음에, FVIII-vWF 복합물을 vWF 특이적 모노클로날 항체로 코팅된 미세 역가판 상에 포획시켰다. vWF에 결합된 FVIII를 FVIII 폴리클로날 항체 및 당근과산화효소-항토끼 컨쥬게이트로 탐지하였다. 과산화효소 컨쥬게이션된 항체 복합물은 기질의 첨가시 색상 반응을 산출한다. 샘플 농도는 4가지 파라미터 적합 모델을 사용하여 표준 곡선으로부터 삽입된다. FVIII 결합 결과는 ㎍/mL로 기록된다. PEG화시 어떠한 활성에 대한 중대한 영향은 없었으며, 이는 B 도메인에서의 PEG화와 일관될 수 있다.
Figure pat00006
이온교환 크로마토그래피에 의한 PEG화 FVIII의 정제. 단백질이 칼럼에 결합하고 임의의 과량의 자유 PEG 반응물은 결합하지 않고 관류에서 제거되는 음이온교환 칼럼 또는 양이온교환 칼럼에 PEG화 FVIII를 적용한다. 그 다음에, PEG 뮤테인을 염화나트륨 구배를 갖는 칼럼으로부터 용출시킨다. 하중, 관류 및 구배 분획의 바륨-요오드 염색 4-12% 비스-트리스 겔을 사용하여 칼럼 용출 분획이 PEG화 뮤테인을 갖는 것을 확인하였다.
크기배제 크로마토그래피에 의한 PEG화 FVIII의 정제. 다수의 PEG 뮤테인을 함유하는 음이온교환 분획을 모으고, 초미세여과로 농축한 후, 크기배제 칼럼에 적용한다. 그 다음에, 칼럼을 제제화 버퍼를 사용하여 용출시킨다. PEG가 단백질에 결합되어 있는지 여부에 따라 단백질의 크기 및 형상에서의 차이로 인해, 이 칼럼은 PEG화되지 않은 임의의 잔류 PEG2로부터 PEG화 PEG2 뮤테인을 분리한다. PEG화 뮤테인 FVIII 분획을 대부분의 FVIII 활성을 갖는 것에 기초하여 모은 후, 후속 동물 연구 및 분자 특성화를 위해 냉동시킨다. 도 13은 비PEG화 PEG2 뮤테인의 용출물을 43 kD PEG화 PEG2 뮤테인에 대하여 비교한다. PEG화 PEG2는 상당히 빨리 용출되고, 이는 공유적으로 부착된 PEG로부터의 이의 크기 및 형상에서의 증가를 나타낸다.
PEG화의 더 낮은 효율, 즉 50% 미만을 나타내는 PEG6과 같은 뮤테인으로는, 매우 순수한 모노-PEG화 생성물을 산출하기 위한 가장 효율적인 정제 체계는 양이온교환 크로마토그래피 후 크기배제 크로마토그래피를 조합하여 사용하는 것이다. 예를 들어, PEG6으로는, 양이온교환 크로마토그래피로 다수의 비PEG화 PEG6(도 15, 후에 용출되는 분획)으로부터 PEG화 PEG6(도 14, 조기에 용출되는 분획)을 정제하는 것이다. 그 다음에, 크기배제 크로마토그래피로 잔류 비PEG화 단백질(도 15, 후에 용출되는 분획)로부터 PEG화 단백질(도 15, 조기에 용출되는 분획)을 마무리하는 것이다.
활성에 대한 PEG 크기의 효과. PEG 크기가 PEG화시 FVIII의 응고 및 발색 활성 모두에 효과를 갖는 것인지 여부를 시험하기 위해, 정제된 전체 길이의 FVIII, PEG2, PEG6 및 PEG14를 TCEP로 환원시킨 후, 환원제를 제거하고, 6 kD 내지 64 kD 범위의 PEG 또는 버퍼 대조군과 반응시켰다. 생성된 PEG화 FVIII를 과량의 PEG 또는 비PEG화 FVIII의 제거 없이 직접 분석하였다. 대조 실험은 과량의 PEG가 FVIII의 활성에 아무런 효과를 갖지 않음을 나타내었다.
도 16은 본 연구의 결과를 나타낸다. 정제된 전체 길이의 FVIII는 도 16에서 KG-2로 나타나 있다. 도 16에 기록된 %활성은 환원 및 환원제 제거 후 PEG로 처리된 샘플의 값을 PEG화 수율을 고려한 버퍼 대조군으로 처리된 샘플의 값으로 나누어서 결정되었다. PEG화 수율은 임의의 소정의 FVIII 구조물에 대한 모든 PEG에 걸쳐 상당한 것이었다. 이는 KG-2, PEG2 및 PEG14에 대해 약 80%이고, PEG6에 대해 약 40%이다. 예를 들어, 처리된 PEG14 버퍼 대조군은 6.8 IU/mL의 응고 활성을 가졌고, 12 kD PEG화 PEG14 샘플에서는 3.2 IU/mL였다. 그러나, PEG화 효율은약 80%였으며, 이는 3.2 IU/mL가 약 80% PEG화 및 약 20% 비PEG화의 응집 활성을 나타냄을 의미한다. 비PEG화 샘플이 버퍼 대조군으로 처리된 PEG14와 동일한 활성을 갖는다고 가정하면, PEG화 PEG14에 대한 비PEG화의 %활성은 34%로 나온다(3.2-6.8배 20%)/(6.8배 80%).
BDD의 PEG2, PEG6 또는 PEG14 위치에서의 A2 또는 A3 도메인 내에서의 PEG화는 PEG 크기가 6 kD보다 크게 증가할 때 응고 활성의 급격한 손실로 유도하였다. 그러나, 전체 길이의 FVIII의 천연 B-도메인 시스테인에서 B 도메인 내에서의 PEG화는 응고 활성에 아무런 효과를 갖지 않았다. 흥미롭게도, 발색 활성은 모든 PEG화 구조물에 영향을 끼치지 않았다. 이는 분석의 차이점에 기인할 수 있다. 작은 발색 펩티드 기질이 응고 분석에 사용된 더 큰 단백질 기질보다 PEG화 FVIII/FIX/FX 복합물에 더 빠른 접근을 가질 수 있다. 다르게는, PEG는 뮤테인의 활성에 영향을 끼칠 수 있다. 이는 2단계 발색 분석보다 1단계 응고 분석에 의해 보다 쉽게 탐지될 수 있다.
PEG2, 6 및 14의 응고 활성에 대한 PEG 효과의 관찰을 확인하기 위해, 몇개의 PEG화 구조물을 과량의 PEG 및 비PEG화된 것으로부터 정제하였다. PEG가 발색 활성에 아무런 효과를 갖지 않으므로, 발색 대 응고 활성 비는 응고 활성에 대한 PEG의 상대적인 효과에 대한 좋은 평가이다(표 5). PEG2와 같은 소정의 위치에서의 더 거대한 PEG 및 PEG2+6 구조물을 갖는 경우에서와 같은 더 많은 수의 PEG가 응고 활성의 더 큰 손실을 유발한다.
Figure pat00007
토끼 PK 연구. FVIII의 약물동태학(PK)에 대한 PEG화의 효과를 이해하기 위해, PK 연구를 다수의 종에 수행하였다. NZW SPF 토끼를 이 연구를 위해 사용하였다: 10마리의 암컷, 그룹당 5마리의 토끼, 2 그룹(PEG2 FVIII 및 22 kD PEG화 PEG2). 샘플을 100 IU/mL (발색 단위)의 최종 농도를 갖는 무균 PBS로 희석시켰다. 각각의 토끼는 귀 모서리 정맥을 통해 희석된 시험 또는 대조군 기질 1 ml/kg (100 IU/kg)의 용량을 받았다. 다양한 주사후 시간에서, 혈액 샘플(1 mL)을 투여 후 소정의 시간 지점에서 귀 중심 동맥으로부터 1 mL 주사기(3.8% Na-시트레이트 100 ㎕로 채워짐)로 취하였다. 혈장 샘플을 투여된 인간 FVIII을 특이적으로 포획하기 위한 96-웰 플레이트 상에 코팅된 R8B12 중쇄 항체로 배양하였다. 포획된 FVIII의 활성을 발색 분석에 의해 측정하였다(도 17). 또한, PEG화 PEG2 및 PEG화 PEG6를 BDD와 함께 대비하였으며(도 18 및 19), PEG화 뮤테인은 BDD에 비해 혈장 회복률에서의 향상을 나타내었다. PEG화 전체 길이의 야생형 FVIII는 많은 향상을 나타내는 것으로 보이지 않았다 (도 20).
마우스 PK 연구. 두번째 종으로서, ICR 정상 또는 혈우병, FVIII 결핍, 마우스(타코닉(Taconic), 미국 뉴욕주 허드슨)를 PK 연구에 사용하였다. 정상 마우스를 연구에 사용하였고, 시간 지점 당 그룹 당 5마리의 마우스였다. 시험 물질을 25 IU/mL의 공칭 최종 농도로 제제화 버퍼 내로 희석시켰다. 각각의 마우스에 대정맥을 통해 희석 시험 물질 4 mL/kg (~0.1 mL 총 부피)을 투여하였다. 혈액 샘플(정상 또는 혈우병 마우스 연구 각각에서 0.45 또는 0.3 mL)을 정해진 시간 지점에서 하대정맥으로부터 1 mL 주사기(정상 또는 혈우병 마우스 연구 각각에서 50 또는 30 ㎕의 3.8% Na-시트레이트로 채워짐)로 취하였다 (샘플당 하나의 동물). 혈장 샘플을 상기 기술된 발색 분석 방법을 사용하여 FVIII 농도에 대해 분석하였다. PEG화 PEG6는 BDD 또는 PEG6에 비해 더 높은 혈장 회복률을 나타낸다(도 21). PEG화 PEG2는 BDD에 비해 더 높은 혈장 회복률을 나타낸다(도 22 및 23).
Figure pat00008
Figure pat00009
혈우병 마우스(BDD) 제VIII 인자 회복률. 도 24에 나타낸 혈우병 마우스(BDD) 제VIII 인자 회복률 막대그래프는 혈우병 마우스 분석에서 BDD 제VIII 인자의 2 종의 반감기의 약물동태학적(PK) 평가를 도시한다. 이 분석은 BDD 제VIII 인자(도 24에서 "wt" 또는 야생형 BDD 제VIII 인자로 나타냄) 및 BDD 제VIII 인자의 PEG2+6 이중 PEG화 변이체(BDD 제VIII 인자의 L491C, K1808C 이중 변이체로서 본원에서 달리 나타냄) 모두의 혈장 농도를 마우스 모델 중 정맥내 투여 후 3가지 시간 지점에서 측정하도록 디자인되었다. 0.8 및 4 시간 지점 모두에서의 PK 평가가 대비될만 하지만, 16시간 평가는 특히 주목만할 만하다. 16시간에서, 이중으로 PEG화된 BDD 제VIII 인자 변이체(PEG2+6) 만큼 대략 4배(400%)가 비PEG화 분자에 비해 투여후 16시간 마우스 혈장에 남아 있었다.
신장 열상 모델. PEG화 FVIII 뮤테인이 혈우병 마우스에서의 출혈을 정지시키는데 효율적인지 여부를 측정하기 위해, 신장 열상 모델을 사용하였다. 혈우병 마우스(붕괴된 FVIII 유전자를 갖는 C57/BL6)를 이소플루오란 하에서 마취시키고 칭량하였다. 하대정맥을 노출시키고, 100 ㎕의 염수 또는 FVIII을 31 게이지 바늘을 사용하여 주사하였다. 바늘을 조심스럽게 제거하고, 출혈을 방지하기 위해 30-45초 동안 주사 측에 압력을 가하였다. 2분 후, 오른쪽 신장을 노출시키고, 수직축을 따라 집게 사이로 유지시켰다. #15 스캘펠을 사용하여, 신장을 3 mm의 깊이로 수평으로 절단하였다. 환부의 균일한 깊이를 보장하기 위해, 신장을 약간 가운데로 유지하여 집게의 양쪽 측면에 동일한 조직을 노출하게 하였다. 신장의 노출된 표면을 집게의 깊이로 절단하였다. 혈액 손실을 상기에 기술된 바와 같이 정량화하였다. FVIII의 상이한 투여량을 마우스에 대하여 시험하여 신장 출혈에 대한 FVIII의 투여량 반응 관계를 특징화하였다. PEG화 PEG2는 마우스 신장 손상 이후 혈액 손실 감소에서 BDD에 상당하는 능력을 나타낸다(도 25). 따라서, PEG화 PEG2의 응고 활성이 BDD보다 낮지만, 이 신장 열상 모델은 PEG화 PEG2의 생체내 효율이 BDD에 비해 측정가능하게 감소되지 않는 것으로, 발색 분석 데이타와 일관되게 나타났다.
항체 억제 분석. 구체적으로 위치 491(즉, PEG2)에서 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 고분자량 중합체를 부가하는 것은, 다수의 환자가 동일한 mAB 413 에피토프에 대한 억제 항체를 발달시키기 때문에, 확대하면 환자의 억제 항체의 큰 비율로, mAB 413에 대한 결합 및 민감도를 감소시켜야 한다. 이를 시험하기 위해, 증가량의 mAB 413을 비포화량(0.003 IU/mL)의 BDD 또는 43 kD PEG화 PEG2로 배양시키고, 발색 분석에서의 관능 활성에 대해 시험하였다(도 26). 비억제 항체 R8B12 및 C2 도메인을 표적으로 하는 억제 항체 ESH4를 대조군으로서 사용하였다. 실제로 PEG화 PEG2는 BDD보다 mAB 413 억제에 더 내성이며, 491 위치 부근에서 결합하지 않는 대조 항체의 존재 하에 유사한 억제 패턴을 나타낸다. 게다가, mAB 413 억제에 대한 PEG의 보호 효과는 PEG 크기에 의존하며, 더 큰 PEG가 더 큰 효과를 갖는다(도 27). PEG화 FVIII이 환자로부터의 억제 항체에 대해 더 내성을 갖는지 여부를 시험하기 위해, 발색 활성을 FVIII에 대한 억제제를 발달시킨 A형 혈우병 환자로부터 유도된 혈장 패널의 존재 하에 측정하였다. 시험된 8 환자의 혈장 중 43 kD PEG화 PEG2가 4 환자의 혈장 샘플 중의 BDD보다 환자의 혈장 억제에 더 내성을 가졌다. 예를 들어, PEG화 PEG2, PEG6 또는 PEG2+6는 한 환자 혈장에서 BDD보다 더 큰 잔류 활성을 나타냈지만 다른 혈장에서는 그렇지 않았다(도 28). 디PEG화된 PEG2+6는 모노PEG화된 PEG2 또는 PEG6보다 더 내성을 갖는 것으로 나타난다. 이들 결과는 PEG화 PEG 뮤테인이 FVIII에 대한 억제제를 발달시킨 환자를 치료하는데 더 효과적일 수 있음을 제시한다.
고속 PEG화 스크리닝. 특정 PEG 뮤테인의 PEG화 효율은, 특히 BDD의 직접적인 구조 정보가 없어서 예측가능하지 않다. 예를 들어, BDD의 구조적인 모델에 기초하여, PEG4 및 PEG5의 PEG화 효율이 PEG2 및 PEG15와 유사하게 모든 세개의 위치가 표면 노출되어 있고 구조에 따라 외부를 겨냥하고 있으므로 매우 높을 것으로 예측할 수 있다. 따라서, PEG를 계통적인 PEG화를 통해 새로운 제거 메카니즘에 대한 탐색에 사용하는 것은 스크리닝되는 상당량의 뮤테인을 필요로 할 수 있다.
빠르게 상당량의 PEG 뮤테인을 스크리닝하기 위해, 새로운 고속 방법이 일시적으로 트랜스펙션된 뮤테인으로부터 PEG화 생성물의 PEG화 효율 및 관능 활성을 시험할 수 있도록 개발되었다. 0.1 내지 0.2 IU/mL만큼 낮은 FVIII 발색치를 갖는 일시적으로 발현된 PEG 뮤테인의 5 내지 10 mL와 같이 적은양을 아미콘-센트라 울트라(Amicon-centra Ultra) 장치 MWCO 30K를 사용하여 약 50배까지 농축시켜서, FVIII의 농축이 FVIII 상호작용에 대한 항체의 친화 범위 부근의 약 1 nM보다 높이 도달하게 한다. 농축된 PEG 뮤테인(~300 ㎕)을 4℃에서 밤새 C7F7 FVIII 항체 수지 ~30 ㎕로 배양하고, 세척하고, 용출하고, 투석하고, 환원시켰다. 환원제를 제거하고, 환원된 PEG 뮤테인을 PEG화시키고, 상기에 기술된 바와 같이 웨스턴 분석을 실행하였다(도 29 및 30). 일시적으로 발현된 PEG 뮤테인의 상대적인 PEG화 효율을 정확하게 정제된 PEG 뮤테인과 맞추었다.
다수의 PEG 뮤테인을 한달 내지 두달에 이 방법에 의해 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, PEG 14 (K1804C BDD)는 12 kD PEG를 갖는 경쇄의 약 80% 이상의 PEG화 및 중쇄의 비PEG화를 가져서(데이타는 나타내지 않음) 경쇄에 위치한 K1804C 돌연변이와 일치하였다. K1804 및 K1808(PEG6 위치) 사이의 C□ 내지 C□의 거리는 BDD 구조에 기초하여 단지 8.4 Å이며, 이는 이 위치에서의 43 kD PEG의 도입이 보다 많은 PEG 수율의 장점을 가지면서 33 kD PEG화 PEG6과 같은 PK에서의 유사한 향상을 가질 것임을 제시한다. 모든 PEG 뮤테인에 대한 상대적인 PEG화 수율이 표 8에 요약되어 있다. PEG화는 시스테인 돌연변이가 도입되는 특정 FVIII 쇄에 매우 선택적이었고, 여기서 중쇄에 시스테인을 갖는 모든 뮤테인은 중쇄에서만 PEG화를 갖는 반면, 경쇄에 시스테인을 갖는 모든 뮤테인은 경쇄에 PEG화를 갖는다. 뮤테인 번호 2 내지 31은 열거된 위치에서 본래의 아미노산을 시스테인으로 대체한 BDD의 시스테인 돌연변이를 나타낸다. PEG2+6은 위치 491 및 1808이 시스테인으로 치환된 BDD의 이중 뮤테인이다. A1 및 A2 (및 전체 길이의 FVIII인 KG-2에 대한 B 도메인)는 중쇄에 속하지만, A3, C1 및 C2는 경쇄에 속한다. PEG화 효율은 SDS PAGE 상의 PEG화 생성물을 비PEG화 밴드를 갖는 PEG 밴드의 강도를 비교하여 평가하였다: +++ ~>80% PEG화 수율, ++ ~30-70% 수율, + ~10-30% 수율 및 - ~<10% 수율.
Figure pat00010
환원된 PEG 뮤테인의 질량 분석법에 의한 분석. PEG 뮤테인 또는 전체 길이의 FVIII의 직접 PEG화를 방지하는 "캡"의 동일성을 결정하기 위해, PEG2+14를 TCEP로 67 μM 내지 670 μM 범위의 농도에서 환원시켰다. PEG화 수율은 증가량의 TCEP에 비례하여 증가하였다(도 31). 또한, 동일한 샘플을 PEG화 이전에 질량 분석법에 의해 분석하였다(도 32). 직접 연구할 수 있는 단백질 도메인을 갖기 위해, 샘플을 37℃에서 30분 동안 20 단위/mg FVIII의 비율에서 트롬빈으로 소화시켰다. 트롬빈 절단은 채워지지 않은 글리코실화 부위 및 잔기 372 내지 740을 포함하는 A2 분획을 산출한다. 소화된 샘플을 C4 역상 액체 크로마토그래피 시스템 상으로 주입하고, 칼럼으로부터의 용출물을 전자스프레이 인터페이스를 통해 사중극자 비행시간형 질량 분광계 내로 직접 도입하였다. A2 도메인에 대응하는 크로마토그래피 피크로부터의 질량 스펙트럼을 역콘볼루션하여 단백질의 완전한 질량치를 제공하였다. 환원 이전에, PEG2+14의 A2 도메인은 이론적으로 예측된 것보다 더 큰 118 달톤인 질량을 산출한다. TCEP 농도가 증가할 수록, A2 도메인의 정확히 예측된 질량을 갖는 새로운 피크가 나타난다. 이 새로운 피크의 비율은 TCEP 농도가 증가할 수록 증가한다. 118 달톤의 차이는 시스테인을 갖는 디술파이드 형성을 통한 잔기 Cys 491 (119 Da)에서의 시스테인화 및 산업적인 정확도로 설명될 수 있다. 따라서, 이는 PEG 뮤테인이 직접 PEG화를 방지하는 시스테인에 의해 캡핑되어 있음을 보여준다.
본원에 개시된 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> Clark, Pan <120> Site-Directed Modification of FVIII <130> US 07430-00236 <150> US 60/627277 <151> 2004-11-12 <160> 35 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The first four amino acids for the B-domain of Human Factor VIII Sequence <400> 1 Ser Phe Ser Gln 1 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The last ten amino acids for the B-domain of Human Factor VIII Sequence <400> 2 Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 1457 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Derived from human factor VIII sequence <400> 3 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Val His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 180 185 190 Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 195 200 205 Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 210 215 220 Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp 225 230 235 240 Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr 245 250 255 Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 260 265 270 Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 275 280 285 Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser 290 295 300 Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met 305 310 315 320 Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His 325 330 335 Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 340 345 350 Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp 355 360 365 Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser 370 375 380 Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400 Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415 Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn 420 425 430 Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 435 440 445 Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu 450 455 460 Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 485 490 495 His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 500 505 510 Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 515 520 525 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 545 550 555 560 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 565 570 575 Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590 Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 595 600 605 Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp 610 615 620 Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640 Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655 Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720 Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 725 730 735 Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 740 745 750 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu 755 760 765 Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln 770 775 780 Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu 785 790 795 800 Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe 805 810 815 Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp 820 825 830 Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln 835 840 845 Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr 850 855 860 Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His 865 870 875 880 Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile 885 890 895 Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser 900 905 910 Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg 915 920 925 Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val 930 935 940 Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp 945 950 955 960 Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu 965 970 975 Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His 980 985 990 Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe 995 1000 1005 Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn 1010 1015 1020 Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 1025 1030 1035 Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr 1040 1045 1050 Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr 1055 1060 1065 Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe 1070 1075 1080 Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met 1085 1090 1095 Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met 1100 1105 1110 Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly 1115 1120 1125 Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser 1130 1135 1140 Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg 1145 1150 1155 Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro 1160 1165 1170 Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser 1175 1180 1185 Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro 1190 1195 1200 Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe 1205 1210 1215 Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp 1220 1225 1230 Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu 1235 1240 1245 Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn 1250 1255 1260 Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1265 1270 1275 Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly 1280 1285 1290 Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys 1295 1300 1305 Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn 1310 1315 1320 Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln 1325 1330 1335 Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu 1340 1345 1350 Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val 1355 1360 1365 Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys 1370 1375 1380 Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu 1385 1390 1395 Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp 1400 1405 1410 Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr 1415 1420 1425 Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala 1430 1435 1440 Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 1445 1450 1455 <210> 4 <211> 2332 <212> PRT <213> Homo Sapiens <220> <223> Human factor VIII sequence <400> 4 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn 130 135 140 Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160 His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu 165 170 175 Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu 180 185 190 His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205 His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220 Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg 225 230 235 240 Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255 Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270 Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285 Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300 Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met 305 310 315 320 Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg 325 330 335 Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350 Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380 Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe 565 570 575 Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln 580 585 590 Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605 Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620 Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720 Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Pro Ser Thr Arg 740 745 750 Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Asp Ile Glu Lys 755 760 765 Thr Asp Pro Trp Phe Ala His Arg Thr Pro Met Pro Lys Ile Gln Asn 770 775 780 Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu Met Leu Leu Arg Gln Ser Pro Thr Pro 785 790 795 800 His Gly Leu Ser Leu Ser Asp Leu Gln Glu Ala Lys Tyr Glu Thr Phe 805 810 815 Ser Asp Asp Pro Ser Pro Gly Ala Ile Asp Ser Asn Asn Ser Leu Ser 820 825 830 Glu Met Thr His Phe Arg Pro Gln Leu His His Ser Gly Asp Met Val 835 840 845 Phe Thr Pro Glu Ser Gly Leu Gln Leu Arg Leu Asn Glu Lys Leu Gly 850 855 860 Thr Thr Ala Ala Thr Glu Leu Lys Lys Leu Asp Phe Lys Val Ser Ser 865 870 875 880 Thr Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala 885 890 895 Gly Thr Asp Asn Thr Ser Ser Leu Gly Pro Pro Ser Met Pro Val His 900 905 910 Tyr Asp Ser Gln Leu Asp Thr Thr Leu Phe Gly Lys Lys Ser Ser Pro 915 920 925 Leu Thr Glu Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Ser Glu Glu Asn Asn Asp 930 935 940 Ser Lys Leu Leu Glu Ser Gly Leu Met Asn Ser Gln Glu Ser Ser Trp 945 950 955 960 Gly Lys Asn Val Ser Ser Thr Glu Ser Gly Arg Leu Phe Lys Gly Lys 965 970 975 Arg Ala His Gly Pro Ala Leu Leu Thr Lys Asp Asn Ala Leu Phe Lys 980 985 990 Val Ser Ile Ser Leu Leu Lys Thr Asn Lys Thr Ser Asn Asn Ser Ala 995 1000 1005 Thr Asn Arg Lys Thr His Ile Asp Gly Pro Ser Leu Leu Ile Glu 1010 1015 1020 Asn Ser Pro Ser Val Trp Gln Asn Ile Leu Glu Ser Asp Thr Glu 1025 1030 1035 Phe Lys Lys Val Thr Pro Leu Ile His Asp Arg Met Leu Met Asp 1040 1045 1050 Lys Asn Ala Thr Ala Leu Arg Leu Asn His Met Ser Asn Lys Thr 1055 1060 1065 Thr Ser Ser Lys Asn Met Glu Met Val Gln Gln Lys Lys Glu Gly 1070 1075 1080 Pro Ile Pro Pro Asp Ala Gln Asn Pro Asp Met Ser Phe Phe Lys 1085 1090 1095 Met Leu Phe Leu Pro Glu Ser Ala Arg Trp Ile Gln Arg Thr His 1100 1105 1110 Gly Lys Asn Ser Leu Asn Ser Gly Gln Gly Pro Ser Pro Lys Gln 1115 1120 1125 Leu Val Ser Leu Gly Pro Glu Lys Ser Val Glu Gly Gln Asn Phe 1130 1135 1140 Leu Ser Glu Lys Asn Lys Val Val Val Gly Lys Gly Glu Phe Thr 1145 1150 1155 Lys Asp Val Gly Leu Lys Glu Met Val Phe Pro Ser Ser Arg Asn 1160 1165 1170 Leu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu His Glu Asn Asn Thr His 1175 1180 1185 Asn Gln Glu Lys Lys Ile Gln Glu Glu Ile Glu Lys Lys Glu Thr 1190 1195 1200 Leu Ile Gln Glu Asn Val Val Leu Pro Gln Ile His Thr Val Thr 1205 1210 1215 Gly Thr Lys Asn Phe Met Lys Asn Leu Phe Leu Leu Ser Thr Arg 1220 1225 1230 Gln Asn Val Glu Gly Ser Tyr Asp Gly Ala Tyr Ala Pro Val Leu 1235 1240 1245 Gln Asp Phe Arg Ser Leu Asn Asp Ser Thr Asn Arg Thr Lys Lys 1250 1255 1260 His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Gly Glu Glu Glu Asn Leu Glu 1265 1270 1275 Gly Leu Gly Asn Gln Thr Lys Gln Ile Val Glu Lys Tyr Ala Cys 1280 1285 1290 Thr Thr Arg Ile Ser Pro Asn Thr Ser Gln Gln Asn Phe Val Thr 1295 1300 1305 Gln Arg Ser Lys Arg Ala Leu Lys Gln Phe Arg Leu Pro Leu Glu 1310 1315 1320 Glu Thr Glu Leu Glu Lys Arg Ile Ile Val Asp Asp Thr Ser Thr 1325 1330 1335 Gln Trp Ser Lys Asn Met Lys His Leu Thr Pro Ser Thr Leu Thr 1340 1345 1350 Gln Ile Asp Tyr Asn Glu Lys Glu Lys Gly Ala Ile Thr Gln Ser 1355 1360 1365 Pro Leu Ser Asp Cys Leu Thr Arg Ser His Ser Ile Pro Gln Ala 1370 1375 1380 Asn Arg Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lys Val Ser Ser Phe Pro Ser 1385 1390 1395 Ile Arg Pro Ile Tyr Leu Thr Arg Val Leu Phe Gln Asp Asn Ser 1400 1405 1410 Ser His Leu Pro Ala Ala Ser Tyr Arg Lys Lys Asp Ser Gly Val 1415 1420 1425 Gln Glu Ser Ser His Phe Leu Gln Gly Ala Lys Lys Asn Asn Leu 1430 1435 1440 Ser Leu Ala Ile Leu Thr Leu Glu Met Thr Gly Asp Gln Arg Glu 1445 1450 1455 Val Gly Ser Leu Gly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys 1460 1465 1470 Lys Val Glu Asn Thr Val Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr 1475 1480 1485 Ser Gly Lys Val Glu Leu Leu Pro Lys Val His Ile Tyr Gln Lys 1490 1495 1500 Asp Leu Phe Pro Thr Glu Thr Ser Asn Gly Ser Pro Gly His Leu 1505 1510 1515 Asp Leu Val Glu Gly Ser Leu Leu Gln Gly Thr Glu Gly Ala Ile 1520 1525 1530 Lys Trp Asn Glu Ala Asn Arg Pro Gly Lys Val Pro Phe Leu Arg 1535 1540 1545 Val Ala Thr Glu Ser Ser Ala Lys Thr Pro Ser Lys Leu Leu Asp 1550 1555 1560 Pro Leu Ala Trp Asp Asn His Tyr Gly Thr Gln Ile Pro Lys Glu 1565 1570 1575 Glu Trp Lys Ser Gln Glu Lys Ser Pro Glu Lys Thr Ala Phe Lys 1580 1585 1590 Lys Lys Asp Thr Ile Leu Ser Leu Asn Ala Cys Glu Ser Asn His 1595 1600 1605 Ala Ile Ala Ala Ile Asn Glu Gly Gln Asn Lys Pro Glu Ile Glu 1610 1615 1620 Val Thr Trp Ala Lys Gln Gly Arg Thr Glu Arg Leu Cys Ser Gln 1625 1630 1635 Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr 1640 1645 1650 Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile 1655 1660 1665 Ser Val Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp 1670 1675 1680 Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr 1685 1690 1695 Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser 1700 1705 1710 Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro 1715 1720 1725 Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe 1730 1735 1740 Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu 1745 1750 1755 Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val 1760 1765 1770 Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser 1775 1780 1785 Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg 1790 1795 1800 Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys 1805 1810 1815 Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys 1820 1825 1830 Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His 1835 1840 1845 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu 1850 1855 1860 Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu 1865 1870 1875 Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu 1880 1885 1890 Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu 1895 1900 1905 Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly 1910 1915 1920 Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln 1925 1930 1935 Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile 1940 1945 1950 His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys 1955 1960 1965 Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe 1970 1975 1980 Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val 1985 1990 1995 Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu 2000 2005 2010 Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala 2015 2020 2025 Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr 2030 2035 2040 Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser 2045 2050 2055 Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val 2060 2065 2070 Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly 2075 2080 2085 Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile 2090 2095 2100 Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn 2105 2110 2115 Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser 2120 2125 2130 Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr 2135 2140 2145 Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg 2150 2155 2160 Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu 2165 2170 2175 Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser 2180 2185 2190 Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala 2195 2200 2205 Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val 2210 2215 2220 Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met 2225 2230 2235 Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr 2240 2245 2250 Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly 2255 2260 2265 His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe 2270 2275 2280 Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp 2285 2290 2295 Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp 2300 2305 2310 Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala 2315 2320 2325 Gln Asp Leu Tyr 2330 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG1 used for Mutagenesis <400> 5 gatgtccgtc ctttgtgctc aaggagatta cca 33 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG2 used for Mutagenesis <400> 6 ttgtattcaa ggagatgccc aaaaggtgta aaac 34 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG3 used for Mutagenesis <400> 7 ttaccaaaag gtgtatgcca tttgaaggat tttc 34 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG4 used for Mutagenesis <400> 8 aaggattttc caatttgccc aggagaaata ttc 33 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG 5 used for Mutagenesis <400> 9 gattatattt aagaattgcg caagcagacc atat 34 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG6 used for Mutagenesis <400> 10 tagaaaaaac tttgtctgcc ctaatgaaac caaaac 36 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG7 used for Mutagenesis <400> 11 aactttgtca agccttgcga aaccaaaact tac 33 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG8 used for Mutagenesis <400> 12 gtcaagccta atgaatgcaa aacttacttt tgga 34 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PEG9 Primer used for Mutagenesis <400> 13 caagcctaat gaaacctgca cttacttttg gaaag 35 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG10 used for Mutagenesis <400> 14 ctaatgaaac caaaacttgc ttttggaaag tgcaac 36 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG11 used for Mutagenesis <400> 15 atttcttatg aggaatgcca gaggcaagga gca 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG12 used for Mutagenesis <400> 16 tcttatgagg aagattgcag gcaaggagca gaa 33 <210> 17 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG13 used for Mutagenesis <400> 17 caaggagcag aaccttgcaa aaactttgtc aagcct 36 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG14 used for Mutagenesis <400> 18 ggagcagaac ctagatgcaa ctttgtcaag cct 33 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG15 used for Mutagenesis <400> 19 cgctcagttg ccaagtgtca tcctaaaact tgg 33 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG16 used for Mutagenesis <400> 20 tcagttgcca agaagtgtcc taaaacttgg gta 33 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG17 used for Mutagenesis <400> 21 ctcctcatct gctactgcga atctgtagat caa 33 <210> 22 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG18 used for Mutagenesis <400> 22 caaaatcttt tccattctgc acctcagtcg tgtac 35 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG19 used for Mutagenesis <400> 23 gtcaatggtt atgtatgcag gtctctgcca ggt 33 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG20 used for Mutagenesis <400> 24 cagacttatc gaggatgttc cactggaacc tta 33 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG21 used for Mutagenesis <400> 25 atccaggctg aggtttgtga tacagtggtc att 33 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG22 used for Mutagenesis <400> 26 gaagatgata aagtctgtcc tggtggaagc cat 33 <210> 27 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG23 used for Mutagenesis <400> 27 cagcggattg gtaggtgtta caaaaaagtc cga 33 <210> 28 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG24 used for Mutagenesis <400> 28 gaagatgggc caacttgctc agatcctcgg tgc 33 <210> 29 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG25 used for Mutagenesis <400> 29 cagataatgt cagactgcag gaatgtcatc ctg 33 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG26 used for Mutagenesis <400> 30 cacactaaca cactgtgtcc tgctcatggg aga 33 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG27 used for Mutagenesis <400> 31 cagatggaag atccctgctt taaagagaat tat 33 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG28 used for Mutagenesis <400> 32 acccagggtg cccgttgcaa gttctccagc ctc 33 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG29 used for Mutagenesis <400> 33 aaagtaaagg ttttttgcgg aaatcaagac tcc 33 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG30 used for Mutagenesis <400> 34 ttgcagttgt cagttgcttt gcatgaggtg gca 33 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer PEG31 used for Mutagenesis <400> 35 aatatggaaa gaaacgctag ggctccctgc aat 33 7

Claims (1)

  1. 폴리펩티드 상의 하나 이상의 소정의 부위에서 1종 이상의 생체적합성 중합체에 공유적으로 부착되는 관능성 제VIII 인자 폴리펩티드를 포함하며, 소정의 부위가 N-말단 아민이 아닌, 제VIII 인자의 응고촉진 활성을 갖는 컨쥬게이트의 용도.
KR1020167023706A 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형 Expired - Fee Related KR101904630B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US62727704P 2004-11-12 2004-11-12
US60/627,277 2004-11-12
PCT/US2005/041205 WO2006053299A2 (en) 2004-11-12 2005-11-14 Site-directed modification of fviii

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147018134A Division KR101654011B1 (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187027821A Division KR20180110192A (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160105928A true KR20160105928A (ko) 2016-09-07
KR101904630B1 KR101904630B1 (ko) 2018-10-04

Family

ID=36337298

Family Applications (7)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137007423A Expired - Fee Related KR101468345B1 (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
KR1020167023706A Expired - Fee Related KR101904630B1 (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
KR1020127028644A Ceased KR20120136413A (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
KR1020147018134A Expired - Fee Related KR101654011B1 (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
KR1020147002721A Expired - Lifetime KR101483917B1 (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
KR1020187027821A Ceased KR20180110192A (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
KR1020077013131A Expired - Lifetime KR101243564B1 (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137007423A Expired - Fee Related KR101468345B1 (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형

Family Applications After (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127028644A Ceased KR20120136413A (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
KR1020147018134A Expired - Fee Related KR101654011B1 (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
KR1020147002721A Expired - Lifetime KR101483917B1 (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
KR1020187027821A Ceased KR20180110192A (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
KR1020077013131A Expired - Lifetime KR101243564B1 (ko) 2004-11-12 2005-11-14 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형

Country Status (32)

Country Link
US (4) US7632921B2 (ko)
EP (9) EP3243834A1 (ko)
JP (5) JP2008524117A (ko)
KR (7) KR101468345B1 (ko)
CN (6) CN103214569B (ko)
AU (1) AU2005304622B2 (ko)
BE (1) BE2019C523I2 (ko)
BR (2) BRPI0517795B8 (ko)
CA (1) CA2586379C (ko)
CY (3) CY1119292T1 (ko)
DK (3) DK2363414T3 (ko)
ES (4) ES2930143T3 (ko)
FR (1) FR19C1031I2 (ko)
HN (1) HN2007015683A (ko)
HR (2) HRP20070268B1 (ko)
HU (5) HUE059193T2 (ko)
IL (3) IL182903A (ko)
LT (5) LT2363414T (ko)
LU (1) LUC00118I2 (ko)
MA (1) MA29663B1 (ko)
MX (3) MX2007005466A (ko)
NL (1) NL300989I2 (ko)
NO (3) NO20210454A1 (ko)
NZ (1) NZ555032A (ko)
PH (2) PH12014500352B1 (ko)
PL (3) PL2363414T3 (ko)
PT (4) PT2363414T (ko)
RU (1) RU2423380C2 (ko)
SI (4) SI3130601T1 (ko)
UA (1) UA95225C2 (ko)
WO (1) WO2006053299A2 (ko)
ZA (1) ZA200703696B (ko)

Families Citing this family (108)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ542586A (en) 2003-04-09 2009-11-27 Biogenerix Ag Method of forming a covalent conjugate between a G-CSF peptide and PEG
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
CA2571292C (en) 2004-06-30 2013-05-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor ix moiety conjugates
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
EP3061461A1 (en) 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
KR101468345B1 (ko) 2004-11-12 2014-12-03 바이엘 헬스케어 엘엘씨 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
US9029331B2 (en) 2005-01-10 2015-05-12 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
EP1871795A4 (en) 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE
WO2006134173A2 (en) 2005-06-17 2006-12-21 Novo Nordisk Health Care Ag Selective reduction and derivatization of engineered proteins comprising at least one non-native cysteine
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US7855279B2 (en) 2005-09-27 2010-12-21 Amunix Operating, Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
WO2007056191A2 (en) 2005-11-03 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Nucleotide sugar purification using membranes
US20090252720A1 (en) * 2006-05-24 2009-10-08 Novo Nordisk Health Care Ag Prolonged FIX Analogues and Derivatives
US20080242607A1 (en) 2006-07-21 2008-10-02 Neose Technologies, Inc. Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
US8969532B2 (en) 2006-10-03 2015-03-03 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography
AU2007333049B2 (en) 2006-12-15 2014-02-20 Takeda Pharmaceutical Company Limited Factor VIIa-(poly)sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
CN101796063B (zh) 2007-04-03 2017-03-22 拉蒂奥法姆有限责任公司 使用糖聚乙二醇化g‑csf的治疗方法
US9493499B2 (en) 2007-06-12 2016-11-15 Novo Nordisk A/S Process for the production of purified cytidinemonophosphate-sialic acid-polyalkylene oxide (CMP-SA-PEG) as modified nucleotide sugars via anion exchange chromatography
AU2008323768A1 (en) * 2007-11-09 2009-05-14 Baxter Healthcare S.A. Modified recombinant Factor VIII and von Willebrand Factor and methods of use
DK2257311T3 (da) * 2008-02-27 2014-06-30 Novo Nordisk As Konjugerede Faktor VIII-Molekyler
JP5997443B2 (ja) 2008-05-16 2016-09-28 バイエル・ヘルスケア・エルエルシーＢａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＬＬＣ 標的化凝固因子およびそれを使用する方法
AU2009256093A1 (en) * 2008-06-04 2009-12-10 Bayer Healthcare Llc FVIII muteins for treatment of von Willebrand disease
DK2865760T3 (en) 2008-06-24 2018-01-15 Csl Behring Gmbh Factor VIII, Von Willebrand Factor or complexes thereof with extended in vivo half-life
WO2010019263A2 (en) * 2008-08-15 2010-02-18 Genzyme Corporation Soluble flt constructs for treating cancers
JP5785872B2 (ja) * 2008-10-17 2015-09-30 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 低度の水溶性ポリマーを含む改変血液因子
KR20110093775A (ko) * 2008-11-03 2011-08-18 바이엘 헬스케어 엘엘씨 혈우병 치료 방법
WO2010060081A1 (en) * 2008-11-24 2010-05-27 Bayer Healthcare Llc Method of determining pegylated blood coagulation factor activity in a silica-based activated partial thromboplastin time assay
US20120121613A1 (en) * 2009-01-19 2012-05-17 Bayer Healthcare Llc Protein conjugate having an endopeptidase- cleavable bioprotective moiety
CN108530543B (zh) 2009-02-03 2023-06-23 阿穆尼克斯制药公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
JP2012518029A (ja) * 2009-02-19 2012-08-09 ノヴォ・ノルディスク・アー／エス 第ｖｉｉｉ因子の修飾
SG174320A1 (en) * 2009-03-20 2011-10-28 Hanmi Holdings Co Ltd Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate
CN102427823A (zh) * 2009-03-24 2012-04-25 拜耳医药保健有限公司 因子viii变体及使用方法
US8637640B2 (en) 2009-07-27 2014-01-28 Baxter International Inc. Blood coagulation protein conjugates
RU2744370C2 (ru) 2009-07-27 2021-03-05 Баксалта Инкорпорейтед Конъюгаты белков свертывания крови
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
WO2011012850A2 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
CN102741275B (zh) 2009-08-24 2016-08-03 阿穆尼克斯运营公司 凝血因子ix组合物及其制备和使用方法
WO2011069164A2 (en) 2009-12-06 2011-06-09 Biogen Idec Ma Inc. Factor viii-fc chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
WO2011075185A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Oligasis Targeted drug phosphorylcholine polymer conjugates
JP5914363B2 (ja) 2010-02-16 2016-05-11 ノヴォ ノルディスク アー／エス 低減されたｖｗｆ結合を有する因子ｖｉｉｉ分子
ES2769629T3 (es) * 2010-02-21 2020-06-26 Bayer Healthcare Llc Procedimiento de activación y conjugación de biomoléculas
ES2742216T3 (es) 2010-04-15 2020-02-13 Kodiak Sciences Inc Polímeros que contienen zwitteriones de alto peso molecular
GB201007357D0 (en) * 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIII
GB201007356D0 (en) 2010-04-30 2010-06-16 Leverton Licence Holdings Ltd Conjugated factor VIIa
EP3508573A1 (en) * 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
SG10201509149VA (en) 2010-11-05 2015-12-30 Baxter Int A new variant of antihemophilic factor viii having increased specific activity
EP2651433A1 (en) * 2010-12-16 2013-10-23 Novo Nordisk A/S Aqueous factor viii solution
PL2654794T3 (pl) 2010-12-22 2020-07-27 Baxalta GmbH Materiały i sposoby sprzęgania rozpuszczalnej w wodzie pochodnej kwasu tłuszczowego z białkiem
EP2714093A1 (en) * 2011-05-27 2014-04-09 Baxter International Inc. Therapeutic proteins with increased half-life and methods of preparing same
CA2838833A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Biogen Idec Ma Inc. Pro-coagulant compounds and methods of use thereof
US9382305B2 (en) 2011-07-01 2016-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
AU2012282875B2 (en) 2011-07-08 2016-04-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII chimeric and hybrid polypeptides, and methods of use thereof
MY167234A (en) 2011-09-23 2018-08-14 Novo Nordisk As Novel glucagon analogues
KR20130049671A (ko) * 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
WO2013120939A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Csl Behring Gmbh Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity
EP2822577B1 (en) * 2012-02-15 2019-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
LT3564260T (lt) 2012-02-15 2023-01-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Viii faktoriaus kompozicijos ir jų gamybos bei panaudojimo būdai
EP2666782A1 (en) 2012-05-22 2013-11-27 Imnate Sarl Coagulation factor VIII with reduced immunogenicity.
AU2013270682A1 (en) 2012-06-08 2014-12-11 Biogen Ma Inc. Procoagulant compounds
EP3404105A1 (en) 2012-07-06 2018-11-21 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor viii polypeptides and uses thereof
US10391152B2 (en) 2012-10-18 2019-08-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using a fixed dose of a clotting factor
EP3446700A1 (en) 2012-10-30 2019-02-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Methods of using fviii polypeptide
JP2016518321A (ja) * 2013-03-15 2016-06-23 バイエル・ヘルスケア・エルエルシーＢａｙｅｒ ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ ＬＬＣ 組み換え因子ｖｉｉｉ配合物
TWI828269B (zh) 2013-03-15 2024-01-01 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ix多肽調配物
ES2926798T3 (es) 2013-03-15 2022-10-28 Bioverativ Therapeutics Inc Formulaciones de polipéptido de factor VIII
MY174727A (en) 2013-04-18 2020-05-11 Novo Nordisk As Stable, protracted glp-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
ES2657291T3 (es) 2013-04-22 2018-03-02 Csl Ltd. Un complejo covalente de factor de von Willebrand y factor VIII asociado por un puente disulfuro
TW201519900A (zh) * 2013-04-28 2015-06-01 Bayer Healthcare Llc 用於誘導對凝血因子蛋白之免疫耐受性的組成物及方法
US20160311885A1 (en) 2013-08-14 2016-10-27 Biogen Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
TWI667255B (zh) 2013-08-14 2019-08-01 美商生物化學醫療公司 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
WO2015035342A2 (en) 2013-09-08 2015-03-12 Oligasis Llc Factor viii zwitterionic polymer conjugates
EA201690817A1 (ru) * 2013-10-22 2016-08-31 Дбв Текнолоджиз Способ лечения гемофилии индукцией толерантности к факторам крови
WO2015070014A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Biogen Idec Ma Inc. Procoagulant fusion compound
RU2546297C1 (ru) * 2013-11-19 2015-04-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Средство, улучшающее реологические свойства крови
EP3082848B1 (en) 2013-12-06 2023-10-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Population pharmacokinetics tools and uses thereof
SG11201605242YA (en) 2014-01-10 2016-07-28 Biogen Ma Inc Factor viii chimeric proteins and uses thereof
AU2015207472B2 (en) 2014-01-20 2018-11-22 Octapharma Ag A process for manufacturing factor VIII having an improved ratio of FVIII:C/FVIII:Ag
EP3102589A1 (en) 2014-02-04 2016-12-14 Biogen MA Inc. Use of cation-exchange chromatography in the flow-through mode to enrich post-translational modifications
EP3114138B1 (en) 2014-03-05 2021-11-17 Pfizer Inc. Improved muteins of clotting factor viii
SG11201607642RA (en) 2014-03-24 2016-10-28 Biogen Ma Inc Lyophilized factor ix formulations
WO2015154090A1 (en) * 2014-04-04 2015-10-08 Bloodworks Routine laboratory and point-of-care (poc) testing for hemostasis
EP3129463B1 (en) 2014-04-10 2021-05-26 Bayer Healthcare LLC Compounded media powder formulation and method of preparation of liquid medium for cell culture
US10570184B2 (en) 2014-06-04 2020-02-25 Novo Nordisk A/S GLP-1/glucagon receptor co-agonists for medical use
BR112016030950A2 (pt) 2014-07-02 2018-03-27 Csl Ltd polipeptídeo modificado que se liga ao fator viii, complexo, composição farmacêutica, métodos para tratar uma coagulopatia, para produzir um polipeptídeo que compreende um vwf modificado e para aumentar a afinidade de ligação ao fator viii do vwf e a meia-vida do fator viii, uso de um polipeptídeo modificado ou de um complexo, polinucleotídeo, plasmídeo ou vetor, e, célula hospedeira.
MA40864A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères
CA2978374A1 (en) 2015-03-06 2016-09-15 Csl Behring Recombinant Facility Ag Modified von willebrand factor having improved half-life
SG10201910896UA (en) 2015-05-22 2020-01-30 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
US10772936B2 (en) 2015-05-22 2020-09-15 CSL Behring Lengnau AG Methods for preparing modified von Willebrand factor
IL257231B (en) 2015-08-03 2022-09-01 Bioverativ Therapeutics Inc Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
US9849125B1 (en) 2015-11-03 2017-12-26 Banner Lifie Sciences LLC Anti-overingestion dosage forms
MX2018008337A (es) 2016-01-07 2018-09-17 CSL Behring Lengnau AG Factor de von willebrand truncado mutado.
AU2017205776B2 (en) 2016-01-07 2020-09-10 CSL Behring Lengnau AG Mutated von Willebrand factor
KR102219859B1 (ko) * 2016-06-24 2021-02-25 재단법인 목암생명과학연구소 재조합 단쇄 fviii 및 그 화학 접합물
KR20190085021A (ko) 2016-11-11 2019-07-17 체에스엘 베링 렝나우 아게 혈우병을 치료하기 위한 절단된 폰 빌레브란트 인자 폴리펩타이드
TW201828974A (zh) 2016-11-11 2018-08-16 瑞士商Ｃｓｌ貝林重組技能公司 用於血管外施予以治療或預防凝血疾病之截短型類血友病因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）多肽類
WO2018093766A1 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Bayer Healthcare Llc Red blood cell targeted factor viii and method of using the same
JP2019536794A (ja) 2016-12-02 2019-12-19 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 凝固因子に対する免疫寛容を誘導する方法
MX2019006444A (es) 2016-12-02 2019-10-30 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos de tratamiento de artropatía hemofílica utilizando factores de coagulación quiméricos.
WO2018144623A1 (en) 2017-01-31 2018-08-09 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor ix fusion proteins and methods of making and using same
US10335375B2 (en) 2017-05-30 2019-07-02 Patheon Softgels, Inc. Anti-overingestion abuse deterrent compositions
KR20190086269A (ko) * 2018-01-12 2019-07-22 재단법인 목암생명과학연구소 체내 지속형 재조합 당단백질 및 이의 제조방법
SI3793588T1 (sl) 2018-05-18 2025-07-31 Bioverativ Therapeutics Inc. Postopki zdravljenja hemofilije A
WO2019219049A1 (zh) 2018-05-18 2019-11-21 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 改进的fviii融合蛋白及其应用
AU2020364071A1 (en) 2019-10-10 2022-05-26 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
WO2021091881A1 (en) * 2019-11-04 2021-05-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York High concentration cell penetrating caspase inhibitor conjugates compositions and methods thereof
WO2021113800A1 (en) * 2019-12-06 2021-06-10 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for modulating factor viii function

Family Cites Families (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59172425A (ja) * 1983-03-18 1984-09-29 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規な血液凝固因子誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血液凝固促進剤
US7138505B1 (en) 1984-01-12 2006-11-21 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Factor VIII:C nucleic acid molecules
US4970300A (en) 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
US5422260A (en) 1986-05-29 1995-06-06 Genetics Institute, Inc. -Legal Affairs Human factor VIII:c muteins
US5451521A (en) 1986-05-29 1995-09-19 Genetics Institute, Inc. Procoagulant proteins
IE69026B1 (en) 1987-06-12 1996-08-07 Immuno Ag Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
EP0690126B1 (en) 1987-06-12 2001-11-28 Baxter Aktiengesellschaft Novel proteins with factor VIII activitiy: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
AU2473388A (en) * 1987-11-16 1989-06-22 Scripps Clinic And Research Foundation Treatment of factor viii inhibitors
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
US5766897A (en) 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US6376463B1 (en) 1992-04-07 2002-04-23 Emory University Modified factor VIII
US6037452A (en) 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
WO1994007510A1 (en) 1992-10-02 1994-04-14 Kabi Pharmacia Ab Composition comprising coagulation factor viii formulation, process for its preparation and use of a surfactant as stabilizer
WO1994015625A1 (en) 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
EP0730660A4 (en) 1993-10-29 1998-02-25 Incyte Pharma Inc CHIMEAN PROTEINE PROTEASE NEXIN-1 CONTAINING VARIANTS
IL113010A (en) 1994-03-31 1999-10-28 Pharmacia & Upjohn Ab Pharmaceutical formulation comprising factor viii with an activity of at least 500iu/ml and an enhancer for improved subcutaneous intramuscular or intradermal administration
BE1008491A3 (fr) * 1994-07-14 1996-05-07 Croix Rouge De Belgique Depart Sequence polypeptidique antigenique du facteur viii, fragments et/ou epitopes de celle-ci.
EP0788375A2 (en) 1994-11-09 1997-08-13 Robin Ewart Offord Functionalized polymers for site-specific attachment
EP0776530A4 (en) * 1995-06-21 1998-06-10 Motorola Inc METHOD AND ANTENNA PRODUCING AN OMNIDIRECTIONAL RADIATION DIAGRAM
WO1997003195A1 (en) 1995-07-11 1997-01-30 Chiron Corporation Novel factor viii:c polypeptide analogs with altered protease sites
SE9503380D0 (sv) * 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
AT403438B (de) 1996-05-24 1998-02-25 Immuno Ag Pharmazeutische präparation mit faktor viii prokoagulationsaktivität und vwf-bindungsaktivität
US6458563B1 (en) * 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
IL128229A0 (en) * 1996-08-02 1999-11-30 Ortho Mcneil Pharm Inc Polypeptides having a single covalently bound n-terminal water-soluble polymer
CA2225189C (en) 1997-03-06 2010-05-25 Queen's University At Kingston Canine factor viii gene, protein and methods of use
US6753165B1 (en) * 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
CN1269805A (zh) 1997-07-14 2000-10-11 博尔德生物技术公司 生长激素和相关蛋白的衍生物
CA2306629A1 (en) * 1997-10-17 1999-04-29 Harvest Technologies Corporation Precipitation of growth-factor-enriched fibrinogen concentrate from platelet rich plasma
EP0922446A1 (en) 1997-12-03 1999-06-16 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Solution-phase site-specific preparation of GRF-PEG conjugates
CA2329768C (en) 1998-04-27 2008-06-10 Opperbas Holding B.V. Pharmaceutical composition comprising factor viii and neutral liposomes
US6759216B1 (en) 1998-11-06 2004-07-06 Emory University Glycosylated, low antigenicity low immunogenicity factor VIII
DK1129186T4 (da) 1998-11-10 2017-02-06 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Et faktor VIII-polypeptid med faktor VIII:C-aktivitet
US6136599A (en) 1998-12-10 2000-10-24 Bayer Corporation Human hybrid host cell for mammalian gene expression
US6358703B1 (en) 1998-12-10 2002-03-19 Bayer Corporation Expression system for factor VIII
JP2002534119A (ja) * 1999-01-14 2002-10-15 ボルダー バイオテクノロジー， インコーポレイテッド 自由システイン残基を有するタンパク質の生産方法
WO2000071714A2 (en) 1999-05-24 2000-11-30 The American National Red Cross Methods of reducing factor viii clearance and compositions therefor
EP1982732A3 (en) * 2000-02-11 2011-06-08 Bayer HealthCare LLC Factor VII or VIIA-like conjugates
EP1319016A4 (en) 2000-09-19 2006-05-10 Univ Emory MODIFIED FACTOR VIII
EP1351986A2 (en) 2001-01-12 2003-10-15 The American National Red Cross Methods and compositions for reducing heparan sulfate proteoglycan-mediated clearance of factor viii
IL157842A0 (en) * 2001-03-22 2004-03-28 Novo Nordisk Healthcare Ag Coagulation factor vii derivatives
WO2002096454A1 (en) 2001-05-31 2002-12-05 D. Collen Research Foundation Vzw Recombinant molecules with reduced immunogenicity, methods and intermediates for obtaining them and their use in pharmaceutical compositions and diagnostic tools
WO2002098454A2 (en) 2001-05-31 2002-12-12 D. Collen Research Foundation Vzw Onderwijsen Navorsing Campus Gasthuisberg K.U. Leuven Recombinant molecules with reduced immunogenicity, methods and intermediates for obtaining them and their use in pharmaceutical compositions and diagnostic tools
EP2110385A1 (en) 2001-06-14 2009-10-21 The Scripps Research Institute Stabilized factor VIII with engineered disulfide bonds
ATE417618T1 (de) 2001-10-05 2009-01-15 Expression Therapeutics Llc Faktor-viii-polypeptide auf hohem expressionsniveau codierende nukleinsäure- und aminosäuresequenzen und verwendungsverfahren
WO2003087161A1 (en) 2002-04-18 2003-10-23 Merck Patent Gmbh Modified factor viii
JP4412461B2 (ja) 2002-11-20 2010-02-10 日油株式会社 修飾された生体関連物質、その製造方法および中間体
US8003117B2 (en) 2002-11-20 2011-08-23 Nof Corporation Polyalkylene glycol derivative and modified bio-related substance
WO2004060966A2 (en) 2002-12-31 2004-07-22 Nektar Therapeutics Al, Corporation Maleamic acid polymer derivatives and their bioconjugates
JP4490290B2 (ja) 2002-12-31 2010-06-23 ネクター セラピューティクス アラバマ，コーポレイション 加水分解安定性マレイミド末端ポリマー
AU2004204136B2 (en) 2003-01-06 2008-10-09 Nektar Therapeutics Thiol-selective water-soluble polmer derivatives
WO2004075923A2 (en) 2003-02-26 2004-09-10 Nektar Therapeutics Al, Corporation Polymer-factor viii moiety conjugates
US20050176108A1 (en) 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
US20040180054A1 (en) 2003-03-13 2004-09-16 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
EP1626983B8 (en) 2003-05-12 2010-12-22 Affymax, Inc. Novel poly (ethylene glycol) modified erythropoietin agonists and uses thereof
ES2725808T3 (es) 2003-05-23 2019-09-27 Nektar Therapeutics Derivados de PEG que contienen dos cadenas de PEG
EP1502921A1 (en) 2003-07-29 2005-02-02 ZLB Behring GmbH Recombinant mutated human factor VIII (FVIII) with improved stability
WO2005046583A2 (en) 2003-10-30 2005-05-26 Emory University Modified fviii having reduced immunogenicity through mutagenesis of a2 and c2 epitopes
US7211559B2 (en) 2003-10-31 2007-05-01 University Of Maryland, Baltimore Factor VIII compositions and methods
ATE463572T1 (de) 2003-12-03 2010-04-15 Univ Rochester Rekombinanter faktor viii mit erhöhter spezifischer aktivität
WO2006027111A1 (en) 2004-09-06 2006-03-16 Zlb Behring Gmbh Modified coagulation factor viii with enhanced stability
KR101468345B1 (ko) 2004-11-12 2014-12-03 바이엘 헬스케어 엘엘씨 Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
WO2006103298A2 (en) 2005-04-01 2006-10-05 Novo Nordisk Health Care Ag Blood coagulation fviii analogues
KR20080108147A (ko) * 2006-03-31 2008-12-11 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 페질화된 인자 ｖｉｉｉ
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
CY2019024I2 (el) 2019-11-27
DK1824988T3 (en) 2017-08-07
MA29663B1 (fr) 2008-08-01
LUC00118I1 (ko) 2019-05-13
CN101124331B (zh) 2013-04-24
HUE033776T2 (en) 2018-01-29
NZ555032A (en) 2010-02-26
RU2423380C2 (ru) 2011-07-10
UA95225C2 (ru) 2011-07-25
EP3323829B1 (en) 2020-07-15
EP2363414A3 (en) 2012-03-21
EP3243833A1 (en) 2017-11-15
HUE059193T2 (hu) 2022-10-28
JP2015134780A (ja) 2015-07-27
HK1182121A1 (en) 2013-11-22
EP3153181A1 (en) 2017-04-12
EP2772500A1 (en) 2014-09-03
JP2013067621A (ja) 2013-04-18
HRP20070268A2 (en) 2007-09-30
PH12014500352A1 (en) 2015-07-20
LT2371856T (lt) 2022-08-25
CN107082806A (zh) 2017-08-22
EP1824988A4 (en) 2008-12-31
US20130274445A1 (en) 2013-10-17
HUE060016T2 (hu) 2023-01-28
KR20070110260A (ko) 2007-11-16
CN103102406A (zh) 2013-05-15
EP2772500B1 (en) 2019-12-25
KR20130036780A (ko) 2013-04-12
SI3130601T1 (sl) 2020-11-30
HRP20070268B1 (hr) 2018-04-20
US9096656B2 (en) 2015-08-04
FR19C1031I1 (ko) 2019-06-28
HUE050542T2 (hu) 2020-12-28
DK2363414T3 (da) 2022-08-08
CN105148287A (zh) 2015-12-16
PL2363414T3 (pl) 2022-09-05
KR20140019489A (ko) 2014-02-14
EP2371856B1 (en) 2022-05-18
EP3243834A1 (en) 2017-11-15
LTPA2019509I1 (lt) 2019-08-26
MX2007005466A (es) 2007-10-19
CN101124331A (zh) 2008-02-13
CA2586379C (en) 2012-04-03
HRP20180481A2 (hr) 2018-06-29
KR20120136413A (ko) 2012-12-18
ES2930143T3 (es) 2022-12-07
ES2821832T3 (es) 2021-04-27
JP2017105773A (ja) 2017-06-15
PT3130601T (pt) 2020-10-01
JP2017101028A (ja) 2017-06-08
NL300989I2 (nl) 2019-11-28
PT2371856T (pt) 2022-08-12
KR101654011B1 (ko) 2016-09-05
KR101468345B1 (ko) 2014-12-03
LT2363414T (lt) 2022-10-25
KR101483917B1 (ko) 2015-01-16
HN2007015683A (es) 2011-07-11
EP3243833B1 (en) 2020-06-17
MX350293B (es) 2017-09-04
ES2930159T3 (es) 2022-12-07
HK1117875A1 (en) 2009-01-23
AU2005304622A1 (en) 2006-05-18
RU2007121517A (ru) 2008-12-20
US20160051633A1 (en) 2016-02-25
BRPI0517795B8 (pt) 2021-05-25
MX392760B (es) 2025-03-24
US7632921B2 (en) 2009-12-15
HK1218718A1 (zh) 2017-03-10
PL2371856T3 (pl) 2022-08-22
IL182903A0 (en) 2007-08-19
NO345800B1 (no) 2021-08-09
EP2371856A3 (en) 2012-03-14
KR101904630B1 (ko) 2018-10-04
BRPI0517795B1 (pt) 2020-03-31
EP3130601A1 (en) 2017-02-15
SI2371856T1 (sl) 2022-09-30
NO344606B1 (no) 2020-02-10
EP3323829A1 (en) 2018-05-23
EP2371856A2 (en) 2011-10-05
CY1119292T1 (el) 2018-02-14
EP1824988B1 (en) 2017-04-19
JP6559642B2 (ja) 2019-08-14
AU2005304622B2 (en) 2012-03-29
KR20140091618A (ko) 2014-07-21
CN103102406B (zh) 2015-05-27
BRPI0517795A (pt) 2008-10-21
SI1824988T1 (sl) 2017-11-30
IL182903A (en) 2014-09-30
JP6018238B2 (ja) 2016-11-02
PH12014500352B1 (en) 2019-09-25
ZA200703696B (en) 2008-08-27
JP6487895B2 (ja) 2019-03-20
CN105148287B (zh) 2019-07-09
CY2019024I1 (el) 2019-11-27
BR122016022033B1 (pt) 2021-03-02
HUS1900026I1 (hu) 2022-04-28
PT2363414T (pt) 2022-08-04
HRP20180481B1 (hr) 2022-02-18
CN103214569B (zh) 2016-12-28
EP2363414A2 (en) 2011-09-07
LTC1824988I2 (lt) 2021-02-25
ES2633916T3 (es) 2017-09-26
NO20210454A1 (no) 2007-06-27
SI2363414T1 (sl) 2022-09-30
BE2019C523I2 (ko) 2025-02-10
BR122016022033B8 (pt) 2021-05-25
LT3130601T (lt) 2020-09-10
PT1824988T (pt) 2017-07-21
WO2006053299A3 (en) 2006-08-24
CA2586379A1 (en) 2006-05-18
IL232540A0 (en) 2014-06-30
PH12019501613A1 (en) 2020-09-14
EP1824988A2 (en) 2007-08-29
US20060115876A1 (en) 2006-06-01
PL1824988T3 (pl) 2018-01-31
EP2363414B1 (en) 2022-05-18
DK2371856T3 (en) 2022-08-08
LT1824988T (lt) 2017-10-25
IL232540A (en) 2017-08-31
WO2006053299A2 (en) 2006-05-18
KR20180110192A (ko) 2018-10-08
EP3130601B1 (en) 2020-07-15
US20100081615A1 (en) 2010-04-01
FR19C1031I2 (fr) 2020-06-05
JP2008524117A (ja) 2008-07-10
NO20200044A1 (no) 2007-06-27
CY1123384T1 (el) 2021-12-31
BRPI0517795A8 (pt) 2018-12-26
KR101243564B1 (ko) 2013-03-27
NL300989I1 (nl) 2019-05-22
IL234433B (en) 2019-11-28
CN103214569A (zh) 2013-07-24
NO20072997L (no) 2007-06-27
US9364520B2 (en) 2016-06-14
JP6109523B2 (ja) 2017-04-05
CN105753968A (zh) 2016-07-13
LUC00118I2 (ko) 2019-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101483917B1 (ko) Ｆｖｉｉｉ의 부위 지향 변형
AU2012203813B2 (en) Site-directed modification of FVIII
AU2020256332A1 (en) Site-directed modification of FVIII

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
PA0104 Divisional application for international application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A16-div-PA0104

St.27 status event code: A-0-1-A10-A18-div-PA0104

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

T11-X000 Administrative time limit extension requested

St.27 status event code: U-3-3-T10-T11-oth-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E90F Notification of reason for final refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

T11-X000 Administrative time limit extension requested

St.27 status event code: U-3-3-T10-T11-oth-X000

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

St.27 status event code: A-1-2-D10-D22-exm-PE0701

A107 Divisional application of patent
GRNT Written decision to grant
PA0104 Divisional application for international application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A16-div-PA0104

St.27 status event code: A-0-1-A10-A18-div-PA0104

PR0701 Registration of establishment

St.27 status event code: A-2-4-F10-F11-exm-PR0701

PR1002 Payment of registration fee

Fee payment year number: 1

St.27 status event code: A-2-2-U10-U12-oth-PR1002

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20210827

Year of fee payment: 4

PR1001 Payment of annual fee

Fee payment year number: 4

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

PC1903 Unpaid annual fee

Not in force date: 20220928

Payment event data comment text: Termination Category : DEFAULT_OF_REGISTRATION_FEE

St.27 status event code: A-4-4-U10-U13-oth-PC1903

PC1903 Unpaid annual fee

Ip right cessation event data comment text: Termination Category : DEFAULT_OF_REGISTRATION_FEE

Not in force date: 20220928

St.27 status event code: N-4-6-H10-H13-oth-PC1903