KR20160131073A - Lg4-5에 대해 특이적인 항-라미닌4 항체 - Google Patents

Lg4-5에 대해 특이적인 항-라미닌4 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 상기 항체는 우선적으로 암 또는 종양 세포 또는 조직을 염색할 수 있다. 상기 항체는, 기타 적용 중에서, 암을 검출하고, 암 요법의 효능을 평가하고, 암을 치료하고, 그리고 비만 또는 비만-관련된 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

Description

LG4-5에 대해 특이적인 항-라미닌4 항체{ANTI-LAMININ4 ANTIBODIES SPECIFIC FOR LG4-5}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 하기의 이점을 주장한다: US 출원 번호 61/952,132(2014년 3월 12일 출원), US 출원 번호 62/023,760(2014년 7월 11일 출원), 및 US 출원 번호 62/068,349(2014년 10월 24일 출원, 이들 각각은 그 전체가 참고로 다목적으로 본원에 편입되어 있다.
서열목록에 대한 참조
파일 459012SEQLIST.txt에서 쓰여진 서열목록은 141 킬로바이트이고, 2015년 3월 5일에 만들어졌고 참고로 편입되어 있다.
암은 주요 공중 건강 문제이다. 미국에서 사망 4명 중 1명은 암 때문이고, 침습성 암으로 진단되는 수명 개연성은 대략 40%이다. Siegel 등, CA Cancer J. Clin. 62:10-29 (2012). 추정된 500,000 미국인이 매년 암으로 사망한다. (Siegel 등, CA Cancer J. Clin. 62:10-29 (2012)). 종래의 화학요법 및 결과적인 부작용의 특이성의 부족은 대다수의 암 세포를 제거하기 위해 필요한 약물 투여량의 전달을 제한한다.
라미닌 α4 사슬을 함유하는 라미닌 단백질은 일부 유형의 암에서 발현된 것으로 보고되었다. 라미닌 α4의 결합 파트너인 것으로 보고된 신데칸은, 일부 유형의 암에서 발현된 것으로 또한 보고되었다.
청구된 발명의 요약
본 발명은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5모듈 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일부 항체는 라미닌 α4의 MCAM에의 결합을 저해하지 않는다. 일부 항체는 LG4 내의 에피토프에 결합한다. 일부 항체는 LG5 내의 에피토프에 결합한다. 일부 항체는 LG4 및 LG4 둘 모두가 잔기에 기여하는 에피토프에 결합한다. 일부 항체는 라미닌 α4의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 예컨대 신데칸-1, -2, -3, -4, 글리피칸, 베타글리칸, CD44, 퍼레칸, 아그린, 또는 콜라겐 XVIII에의 결합을 저해한다.
상기 항체의 일부는 대조군 샘플과 비교될 때, 암 세포, 예컨대 흑색종 세포를 포함하는 생물학적 샘플에 선택적으로 결합하고, 임의로 상기 대조군 샘플 및 상기 생물학적 샘플은 동일한 조직 기원의 세포를 포함하고 임의로 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 결합은 상기 항체의 상기 대조군 샘플에의 결합보다. 적어도 2-배 또는 5-배 더 크다.
상기 항체의 일부는 서열식별번호:16의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:17의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 항체 15F7, 또는 서열식별번호:26의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:27의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 항체 6C12, 또는 서열식별번호:36 또는 37의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:38의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 항체 13G10 을 갖는 라미닌 α4에 결합하기 위해 경쟁한다. 상기 항체의 일부는 서열식별번호:16의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:17의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 항체 15F7, 또는 서열식별번호:26의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:27 또는 94의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 항체 6C12, 또는 서열식별번호:36 또는 37의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:38의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 항체 13G10 을 갖는 라미닌 α4에 결합하기 위해 경쟁한다.
상기 항체의 일부는 15F7, 6C12, 또는 13G10와 라미닌 α4 상의 동일한 에피토프에 결합한다.
상기 항체의 일부는 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함하고, 여기서 각각의 CDR은 15F7 (서열식별번호:16 및 17 각각), 6C12 (서열식별번호:26 및 27 각각), 또는 13G10 (서열식별번호:36/37 및 38 각각)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터 상응하는 CDR에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 상기 항체의 일부는 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함하고, 여기서 각각의 CDR은 15F7 (서열식별번호:16 및 17 각각), 6C12 (서열식별번호:26 및 27/94 각각), 또는 13G10 (서열식별번호:36/37 및 38 각각)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터 상응하는 CDR에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다.
상기 항체의 일부는 15F7, 6C12, 또는 13G10의 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함한다.
상기 항체의 일부는 단클론성이다. 상기 항체의 일부는 키메라성, 인간화된, 베니어드, 또는 인간이다. 상기 항체의 일부는 인간 IgG1 카파 아이소타입을 갖는다.
본 발명은 추가로, 라미닌 α4에 특이적으로 결합하는 인간화된 또는 키메라성 15F7 항체를 제공하고, 여기서 15F7은 서열식별번호:16의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:17의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 마우스 항체이다. 임의로 상기 인간화된 항체는 15F7 중쇄 가변 영역 (서열식별번호:16)의 3개의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄 및 15F7 경쇄 가변 영역 (서열식별번호:17)의 3개의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄를 포함한다. 임의로 상기 인간화된 항체는 서열식별번호:58과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간화된 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:5와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간화된 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 임의로, 상기 인간화된 항체는 15F7 중쇄 가변 영역 (서열식별번호:16)의 3개의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄 및 15F7 경쇄 가변 영역 (서열식별번호:17)의 3개의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄를 포함한다. 임의로, 서열식별번호:16 및 17 각각으로부터 성숙한 중쇄 가변 영역 및 성숙한 경쇄 가변 영역의 CDR에서의 임의의 차이는 위치 H60-H65에 있다. 일부 인간화된 항체에서 위치 L42, L49, 및 L69 중 적어도 하나는 N, S, 및 K 각각에 의해 점거되고, 그리고 위치 H1, H20, H27, H30, H38, H40, H48, H66, H67, H75, H82A, 및 H91 중 적어도 하나는 E, L, Y, T, K, R, I, K, A, S, R, 및 F 각각에 의해 점거된다. 일부 인간화된 항체에서 위치 L42, L49, 및 L69는 N, S, 및 K 각각에 의해 점거되고, 그리고 H1, H20, H27, H30, H38, H40, H48, H66, H67, H75, H82A, 및 H91은 E, L, Y, T, K, R, I, K, A, S, R, 및 F 각각에 의해 점거된다. 일부 인간화된 항체에서 위치 L8, L45, 및 L80 중 적어도 하나는 S, R, 및 T 각각에 의해 점거된다. 일부 인간화된 항체에서 위치 L8, L45, L80, 및 L104 중 적어도 하나는 S, R, T, 및 V 각각에 의해 점거된다. 일부 인간화된 항체에서 위치 H41 및 H69 중 적어도 하나는 A 및 L 각각에 의해 점거된다. 일부 인간화된 항체에서 위치 L8, L45, 및 L80은 S, R, 및 T 각각에 의해 점거된다. 일부 인간화된 항체에서 위치 L104는 V에 의해 점거된다. 일부 인간화된 항체에서 위치 H41 및 H69는 A 및 L 각각에 의해 점거된다. 일부 인간화된 항체는 서열식별번호:58과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:59와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 인간화된 항체에서, 상기 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:57의 아미노산 서열을 가지며 상기 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:59의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 인간화된 항체에서, 상기 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:57의 아미노산 서열을 가지며 상기 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:60의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 인간화된 항체에서, 상기 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:58의 아미노산 서열을 가지며 상기 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:59의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 인간화된 항체에서, 상기 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:58의 아미노산 서열을 가지며 상기 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:60의 아미노산 서열을 갖는다.
상기 기재된 항체 중 임의의 것은 온전한 항체, 단일-사슬 항체, Fab, 또는 Fab'2 단편일 수 있다. 항체 중 임의의 것에서, 성숙한 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역에 융합될 수 있고 성숙한 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 융합될 수 있다. 임의로, 중쇄 불변 영역은 천연 인간 중쇄 불변 영역에 관한 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합을 갖는 천연 인간 중쇄 불변 영역의 돌연변이체 형태이다. 임의로 중쇄 불변 영역은 IgG1 아이소타입이다. 임의로, 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:61의 서열을 갖는 중쇄 불변 영역에 융합되고/되거나 상기 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:62의 서열을 갖는 경쇄 불변 영역에 융합된다. 임의로, 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:61, 89, 또는 101의 서열을 갖는 중쇄 불변 영역에 융합되고/되거나 상기 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:62 또는 90의 서열을 갖는 경쇄 불변 영역에 융합된다. 상기 항체 중 임의의 것은 치료적 또는 세포독성 약물, 예컨대 사포린 또는 방사선동위원소에 접합될 수 있다.
본 발명은 추가로, 상기 항체 중 임의의 것 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로, 상기 기재된 항체 중 임의의 것, 예컨대 서열식별번호:63-64, 67-68, 71-73, 및 77-80 중 임의의 것의 중쇄 및/또는 경쇄(들)을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 추가로, 상기 기재된 항체 중 임의의 것은, 예컨대 서열식별번호:63-64, 67-68, 71-73, 77-80, 92-93, 99-100, 또는 102 중 임의의 것의 중쇄 및/또는 경쇄(들)을 인코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 추가로, 상기 기재된 핵산 및 그와 같은 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 추가로, 하기 단계들을 포함하는, 항체를 인간화하는 방법을 제공한다: (a) 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 결정하는 단계; (b) 상기 마우스 항체 중쇄의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄를 인코딩하는 핵산 및 상기 마우스 항체 경쇄의 CDR을 포함하는 인간화된 경쇄를 인코딩하는 핵산을 합성하는 단계; (c) 숙주세포에서 상기 핵산을 발현시켜 인간화된 항체를 생산하는 단계; 상기 마우스 항체는 15F7, 6C12, 또는 13G10이다.
본 발명은 추가로, 인간화된, 키메라성, 또는 베니어드 항체를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다: (a) 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산으로 형질전환된 세포를 배양하고, 이로써 상기 세포가 항체를 분비하는 단계; 및 (b) 세포 배양 배지로부터의 상기 항체를 정제하는 단계; 상기 항체는 인간화된, 키메라성, 또는 베니어드 형태의 15F7, 6C12, 또는 13G10이다.
본 발명은 추가로, 인간화된, 키메라성, 또는 베니어드 항체를 생산하는 세포주를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다: (a) 선별 마커 및 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 벡터를 세포에 도입하는 단계; (b) 벡터의 증가된 복제수를 갖는 세포를 선별하기 위한 조건 하에서 상기 세포를 전파시키는 단계; (c) 단일 세포를 상기 선택된 세포로부터 단리하는 단계; 및 (d) 항체의 수율을 기준으로 선택된 단일 세포로부터 클로닝된 세포를 뱅킹하는 단계; 상기 항체는 인간화된, 키메라성, 또는 베니어드 형태의 15F7, 6C12, 또는 13G10이다. 임의로, 상기 방법은 추가로, 상기 세포를 선택적 조건 하에서 전파시키고 적어도 100 mg/L/106 세포/24h를 천연적으로 발현시키고 분비하는 세포주를 스크리닝하는 것을 포함한다.
본 발명은 추가로, 암을 가지고 있거나 그 위험이 있는 환자에서 암을 치료하거나 그것의 예방에 영향을 주는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 환자에게 효과적인 레짐의 상기 기재된 항체 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함한다. 일부 방법에서, 환자는 암, 및 상기 암은 흑색종, 유방암, 폐암, 또는 결장직장암이 있다.
본 발명은 추가로, 생물학적 샘플에서 세포 부착을 저해하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 유효량의 상기 기재된 항체 중 임의의 것과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 방법에서, 세포 부착은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 의해 매개된다. 일부 방법에서, 생물학적 샘플은 암 세포를 포함한다.
본 발명은 추가로, 생물학적 샘플에서 암, 예컨대 흑색종의 존재를 검출하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다: (a) 상기 생물학적 샘플을 상기 항체 중 임의의 것과 접촉시키는 단계; (b) 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 결합을 검출하는 단계; (c) 대조군 샘플을 상기 항체와 접촉시키는 단계; (d) 상기 항체의 상기 대조군 샘플에의 결합을 검출하는 단계; 및 (e) 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 결합을 상기 항체의 상기 대조군 샘플에의 결합과 비교하는 단계로서, 이로써 상기 대조군 샘플과 비교된 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 증가된 결합은 생물학적 샘플에서 암의 존재를 나타내는 단계. 임의로 대조군 샘플 및 생물학적 샘플은 동일한 조직 기원의 세포를 포함한다. 임의로 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 결합은 상기 항체의 상기 대조군 샘플에의 결합보다. 적어도 2-배 또는 5-배 더 크다.
본 발명은 추가로, 암이 있는 것으로 진단된 환자에서 치료제의 효능을 평가하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다: (a) 치료제에 의한 치료 전에 수득된, 환자로부터의 제1 생물학적 샘플을, 상기 항체 중 임의의 것과 접촉시키는 단계; (b) 상기 항체의 상기 제1 생물학적 샘플에의 결합을 검출하는 단계; (c) 치료제에 의한 치료 다음에 수득된, 환자로부터의 제2 생물학적 샘플을, 상기 항체와 접촉시키는 단계; (d) 상기 항체의 제2 생물학적 샘플에의 결합을 검출하는 단계; (e) 상기 항체의 상기 제1 생물학적 샘플에의 결합을 상기 항체의 제2 생물학적 샘플에의 결합과 비교하는 단계로서, 이로써 상기 제1 생물학적 샘플과 비교된 상기 항체의 상기 제2 생물학적 샘플에의 감소된 결합은, 상기 치료제가 환자에서 암을 치료하는데 효과이라는 것을 나타내는 단계.
본 발명은 추가로, 생물학적 샘플에서 라미닌 α4의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에의 결합을 저재하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 상기 항체 중 임의의 것과 접촉시키는 단계를 포함한다. 임의로, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-1, -2, -3, 또는 -4 또는 글리피칸, 베타글리칸, CD44, 퍼레칸, 아그린, 또는 콜라겐 XVIII이다.
본 발명은 추가로, 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈이 질환의 진행에 기여하는 질환을 치료하거나 그것의 예방에 영향을 주하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 질환을 가지고 있거나 그 위험이 있는 환자에게 효과적인 레짐의 상기 항체 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함한다. 임의로, 질환은 암, 예컨대 흑색종, 유방암, 폐암, 또는 결장직장암이다. 임의로 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈은 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과의 상호작용에 의하여 질환의 진행에 기여한다. 임의로, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-1, -2, -3, 또는 -4이다. 임의로, 질환은 건선, 유육종증, 다발성 경화증, 또는 건선성 관절염이다.
본 발명은 추가로, 자가면역 질환을 가지고 있거나 그 위험이 있는 환자에서 자가면역 질환을 치료하거나 그것의 예방에 영향을 주는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 환자에게 효과적인 레짐의 상기 기재된 항체 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함한다. 임의로, 질환은 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 강직인 증후군, 류마티스성 관절염, 중증 근무력증, 전신 홍반성 낭창, 소아지방변증, 건선, 건선성 관절염, 유육종증, 강직 척추염, 쇼그렌 증후군, 또는 포도막염이다.
본 발명은 추가로, 환자에서 혈관신생을 저해하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 환자에게 효과적인 레짐의 상기 기재된 항체 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함한다. 임의로 환자는 암이 있다.
본 발명은 추가로, 비만 또는 비만-관련된 질환을 가지고 있거나 그 위험이 있는 환자에서 비만 또는 an 비만-관련된 질환을 치료하거나 그것의 예방에 영향을 주는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기 환자에게 효과적인 레짐의 상기 기재된 항체 중 임의의 것을 투여하는 것을 포함한다. 임의로, 비만-관련된 질환은 비-알코올성 지방간염 (NASH), 프라다-윌리 증후군, 두개인두종, 바데트-비들 증후군, 코헨 증후군, 또는 MOMO 증후군이다.
도 1은 LG1-5, LG1-3, 및 LG4-5를 함유하는 LAMA4 단편을 나타내는 293 세포에 대한 LG1-3-특이적 LAMA4 항체 및 6C12, 13G10, 및 15F7 항체의 유세포측정에 의해 평가된 것으로서의 결합을 나타낸다.
도 2a-c는 ForteBio에 의해 평가된 것으로서 각각 15F7, 6C12, 및 13G10 항체에 대한 상대적인 결합 및 온/오프율(on/off rate)을 나타낸다.
도 3은 유세포측정에 의해 평가된 것으로서, LAMA4를 나타내는 293 세포에 대해 결합하기 위한 연속으로 희석된 6C12, 13G10 및 15F7 항체의 수용력을 나타낸다.
도 4a-c는 경쟁하는 차단 항체의 감소하는 비(5:1, 1:1, 및 1:5)의 존재 하에서 LAMA4를 나타내는 293 세포에 대한 6C12, 13G10, 및 15F7 항체 각각의 FACS 분석에 의한 결합의 평가를 나타낸다.
도 5a-c는 15F7 항체를 사용한, 인간 유방, 결장, 및 폐 종양 각각에 대한 종양 마이크로어레이 슬라이드의 염색을 나타낸다.
도 6은, 재조합 LG4-5-코팅된 ELISA 플레이트가 20 ug/ml의 15F7, 6C12, 13G10, 및 마우스 IgG1 대조군과 인큐베이션된 다음 WM-266-4 인간 흑색종 세포에 결합하기 위한 그것의 능력에 대해 분석된 세포 부착 검정을 나타낸다.
도 7은 15F7 항체 및 사포린-접합된 항-마우스 2차 항체와 함께 인큐베이션된 경우, WM-266-4 세포에 대한 독성을 나타낸다.
도 8은 유세포측정에 의해 평가된 것으로서, LAMA4를 나타내는 세포에 결합하기 위한 연속으로 희석된 키메라성 15F7 및 인간화된 15F7 변종 H1L1, H1L2, H2L1, 및 H2L2의 수용력을 나타낸다.
도 9는 LG1-5, LG1-3, 및 LG4-5를 함유하는 LAMA4 단편을 나타내는 키메라성 15F7 및 인간화된 15F7 변종 H1L1, H1L2, H2L1, 및 H2L2 내지 293 세포의 유세포측정에 의해 평가된 것으로서의 결합을 나타낸다.
도 10a-b는 ForteBio에 의해 평가된 것으로서, 도 10a에서 m15F7, 키메라성 15F7 및 인간화된 15F7 변종 H1L1, H1L2, H2L1, 및 H2L2에 대한, His-LAMA4로 로딩된 후 15F7 항체의 회합 및 해리된 항-His 센서, 및 도 10b에서 항체로 로딩된 후 His-LAMA4의 회합 및 해리된 염소 항-인간 Fc 센서와의 상대적인 결합 및 온/오프율(on/off rates)을 나타낸다.
도 11a 및 b는 라미닌 411 또는 BSA 대조군으로 및 15F7 또는 mIgG1 대조군으로 처리된 인간 흑색종 세포에서 Akt에 대한 pAkt의 상대적인 수준을 나타낸다. 도 11a는 각각의 개별적인 샘플에 대한 비를 나타내고, 도 11b는 각 그룹(n=3)에 대한 평균 및 표준 오차를 나타낸다.
서열의 간단한 설명
수반되는 서열목록에서 열거된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 염기에 대한 표준 글자 약어, 및 아미노산에 대한 3-문자 암호를 사용하여 보여진다. 뉴클레오타이드 서열은 서열의 5' 말단에서 시작하고 3' 말단으로 정방향(즉 각각의 라인에서 왼쪽으로부터 오른쪽으로)으로 진행하는 표준 협약을 따른다. 각각의 뉴클레오타이드 서열 중 단 하나의 가닥이 보여지지만, 상보적 가닥은 표시된 가닥에 대한 임의의 참조에 의해 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단에서 시작하고 카복시 말단으로 정방향(즉 각각의 라인에서 왼쪽으로부터 오른쪽으로)으로 진행하는 표준 협약을 따른다.
서열식별번호:1은 UniProt 번호 Q16363에 의해 제공된 바와 같이 라미닌 α4의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:2은 유전자은행 수납 번호 NP001098676에 의해 제공된 바와 같이 라미닌 α4의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:3은 유전자은행 수납 번호 NP001098677에 의해 제공된 바와 같이 라미닌 α4의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:4은 라미닌 α4의 G 도메인의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:5은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG1 모듈의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:6은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG2 모듈의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:7은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG3 모듈의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:8은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG1-3 모듈의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:9은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4 모듈의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:10은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG5 모듈의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:11은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:12은 UniProt 번호 P18827에 의해 제공된 바와 같이 신데칸-1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:13은 UniProt 번호 P34741에 의해 제공된 바와 같이 신데칸-2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:14은 UniProt 번호 O75056에 의해 제공된 바와 같이 신데칸-3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:15은 UniProt 번호 P31431에 의해 제공된 바와 같이 신데칸-4의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:16은 마우스 15F7 성숙한 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:17은 마우스 15F7 성숙한 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:18 은 15F7 중쇄 가변 영역 신호 펩타이드의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:19은 15F7 경쇄 가변 영역 신호 펩타이드의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:20은 카밧에 의해 정의된 마우스 15F7 중쇄의 CDR1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:21은 카밧에 의해 정의된 마우스 15F7 중쇄의 CDR2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:22은 카밧에 의해 정의된 마우스 15F7 중쇄의 CDR3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:23은 카밧에 의해 정의된 마우스 15F7 경쇄의 CDR1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:24은 카밧에 의해 정의된 마우스 15F7 경쇄의 CDR2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:25은 카밧에 의해 정의된 마우스 15F7 경쇄의 CDR3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:26은 마우스 6C12 성숙한 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:27은 마우스 6C12 성숙한 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 버전 1을 제시한다.
서열식별번호:28은 6C12 중쇄 가변 영역 신호 펩타이드의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:29은 6C12 경쇄 가변 영역 신호 펩타이드의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:30은 카밧에 의해 정의된 마우스 6C12 중쇄의 CDR1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:31은 카밧에 의해 정의된 마우스 6C12 중쇄의 CDR2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:32은 카밧에 의해 정의된 마우스 6C12 중쇄의 CDR3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:33은 카밧에 의해 정의된 마우스 6C12 경쇄의 CDR1의 아미노산 서열, 버전 1을 제시한다.
서열식별번호:34은 카밧에 의해 정의된 마우스 6C12 경쇄의 CDR2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:35은 카밧에 의해 정의된 마우스 6C12 경쇄의 CDR3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:36은 마우스 13G10 성숙한 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 버전 1을 제시한다.
서열식별번호:37은 마우스 13G10 성숙한 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 버전 2를 제시한다.
서열식별번호:38은 마우스 13G10 성숙한 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:39은 13G10 중쇄 가변 영역 신호 펩타이드의 아미노산 서열, 버전 1을 제시한다.
서열식별번호:40은 13G10 중쇄 가변 영역 신호 펩타이드의 아미노산 서열, 버전 2를 제시한다.
서열식별번호:41은 13G10 경쇄 가변 영역 신호 펩타이드의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:42은 카밧에 의해 정의된 마우스 13G10 중쇄의 CDR1의 아미노산 서열, 버전 1을 제시한다.
서열식별번호:43은 카밧에 의해 정의된 마우스 13G10 중쇄의 CDR2의 아미노산 서열, 버전 1을 제시한다.
서열식별번호:44은 카밧에 의해 정의된 마우스 13G10 중쇄의 CDR3의 아미노산 서열, 버전 1을 제시한다.
서열식별번호:45은 카밧에 의해 정의된 마우스 13G10 중쇄의 CDR1의 아미노산 서열, 버전 2를 제시한다.
서열식별번호:46은 카밧에 의해 정의된 마우스 13G10 중쇄의 CDR2의 아미노산 서열, 버전 2를 제시한다.
서열식별번호:47은 카밧에 의해 정의된 마우스 13G10 중쇄의 CDR3의 아미노산 서열, 버전 2를 제시한다.
서열식별번호:48은 카밧에 의해 정의된 마우스 13G10 경쇄의 CDR1의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:49은 카밧에 의해 정의된 마우스 13G10 경쇄의 CDR2의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:50은 카밧에 의해 정의된 마우스 13G10 경쇄의 CDR3의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:51은 NCBI 수탁 코드 ACF36857.1, 버전 1에 의해 제공된 바와 같이 인간 VH 수용체 FR의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:52은 NCBI 수탁 코드 BAC01530.1, 버전 1에 의해 제공된 바와 같이 인간 VH 수용체 FR의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:53은 NCBI 수탁 코드 AAY33350.1에 의해 제공된 바와 같이 인간 VL 수용체 FR의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:54은 NCBI 수탁 코드 BAC01583.1, 버전 1에 의해 제공된 바와 같이 인간 VL 수용체 FR의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:55은 복귀돌연변이 또는 다른 돌연변이 없는 인간화된 15F7 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:56은 복귀돌연변이 또는 다른 돌연변이 없는 인간화된 15F7 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:57은 인간화된 15F7 중쇄 가변 영역 버전 1 (H1)의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:58은 인간화된 15F7 중쇄 가변 영역 버전 2 (H2)의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:59은 인간화된 15F7 경쇄 가변 영역 버전 1 (L1)의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:60은 인간화된 15F7 경쇄 가변 영역 버전 2 (L2)의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:61은 예시적인 인간 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:62은 N-말단 아르기닌 없는 예시적인 인간 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:63은 쥣과 15F7 중쇄 가변 영역의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:64은 쥣과 15F7 경쇄 가변 영역 버전의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:65은 15F7 중쇄 가변 영역 신호 펩타이드의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:66은 15F7 경쇄 가변 영역 신호 펩타이드의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:67은 쥣과 6C12 중쇄 가변 영역의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:68은 쥣과 6C12 경쇄 가변 영역, 버전 1의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:69은 6C12 중쇄 가변 영역 신호 펩타이드의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:70은 6C12 경쇄 가변 영역 신호 펩타이드의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:71은 쥣과 13G10 중쇄 가변 영역, 버전 1의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:72은 쥣과 13G10 중쇄 가변 영역, 버전 2의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:73은 쥣과 13G10 경쇄 가변 영역의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:74은 13G10 중쇄 가변 영역 신호 펩타이드, 버전 1의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:75은 13G10 중쇄 가변 영역 신호 펩타이드, 버전 2의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:76은 13G10 경쇄 가변 영역 신호 펩타이드의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:77은 인간화된 15F7 중쇄 가변 영역 버전 1 (H1)의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:78은 인간화된 15F7 중쇄 가변 영역 버전 2 (H2)의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:79은 인간화된 15F7 경쇄 가변 영역 버전 1 (L1), 버전 1의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:80은 인간화된 15F7 경쇄 가변 영역 버전 2 (L2)의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:81은 라미닌 α4의 G 도메인의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:82은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG1 모듈의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:83은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG2 모듈의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:84은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG3 모듈의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:85은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG1-3 모듈의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:86은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4 모듈의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:87은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG5 모듈의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:88은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:89은 IgG1 G1m3 동종이인자형의 예시적인 인간 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:90은 N-말단 아르기닌을 갖는 예시적인 인간 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:91은 C-말단 라이신 없는 예시적인 인간 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:92은 IgG1 G1m3 동종이인자형의 예시적인 인간 IgG1 불변 영역의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:93은 N-말단 아르기닌을 갖는 예시적인 인간 카파 경쇄 불변 영역의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:94은 마우스 6C12 성숙한 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열, 버전 2를 제시한다.
서열식별번호:95은 카밧에 의해 정의된 마우스 6C12 경쇄의 CDR1의 아미노산 서열, 버전 2을 제시한다.
서열식별번호:96은 NCBI 수탁 코드 ACF36857.1, 버전 2에 의해 제공된 바와 같이 인간 VH 수용체 FR의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:97은 NCBI 수탁 코드 BAC01530.1, 버전 2에 의해 제공된 바와 같이 인간 VH 수용체 FR의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:98은 NCBI 수탁 코드 BAC01583.1, 버전 2에 의해 제공된 바와 같이 인간 VL 수용체 FR의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:99은 쥣과 6C12 경쇄 가변 영역, 버전 2의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:100은 인간화된 15F7 경쇄 가변 영역 버전 1 (L1), 버전 2의 핵산 서열을 제시한다.
서열식별번호:101은 IgG1 G1m3 동종이인자형의 예시적인 인간 IgG1 불변 영역의 아미노산 서열을 제시한다.
서열식별번호:102은 N-말단 아르기닌 없는 예시적인 인간 카파 경쇄 불변 영역의 핵산 서열을 제시한다.
정의
단클론성 항체 또는 다른 생물학적 독립체가 단리된 형태로 전형적으로 제공된다. 이는, 항체 또는 다른 생물학적으로 독립체가 그것의 생산 또는 정제로부터 발생하는 간섭 단백질 및 다른 오염물질의 전형적으로 적어도 50% w/w 순수하지만, 단클론성 항체가 이의 사용을 촉진하기 위해 의도된 과잉의 약제학적으로 허용가능한 담체(들) 또는 다른 비히클(vehicle)과 배합되어 있는 가능성을 배재한다. 때때로 단클론성 항체는 생산 또는 정제로부터의 간섭 단백질 및 오염물질중 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% w/w 순수하다. 흔히 단리된 단클론성 항체 또는 다른 생물학적 독립체는 그것의 정제 후 남아있는 우세한 거대분자 종이다.
그것의 표적 항원에 대한 항체의 특이적 결합은 적어도 106, 107, 108, 109, 또는 1010 M-1의 친화성을 의미한다. 특이적 결합은 규모에서 검출가능하게 더 크고 적어도 하나의 관련없는 표적에 대해 발생하는 비-특이적 결합으로부터 구별할 수 있다. 특이적 결합은 특정한 작용기 또는 특정한 공간 피트(예를 들면, 록(lock) 및 키(key) 유형) 사이의 결합 형성의 결과일 수 있는 반면에 비특이적 결합은 보통 반데르발스 힘(van der Waals forces)의 결과이다. 특이적 결합은, 그러나 필연적으로 항체가 하나 및 단 하나의 표적에 결합함을 내포하지 않는다.
염기성 항체 구조 단위는 서브유닛의 사량체이다. 각각의 사량체는 폴리펩타이드 사슬의 2개의 동일한 쌍을 포함하며 각각의 쌍은 하나의 "가벼운"(약 25 kDa) 및 하나의 "무거운" 사슬(약 50-70 kDa)을 갖는다. 각각의 사슬의 아미노-말단부는 항원 인식에 주로 관여하는 약 100 내지 110 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 이러한 가변 영역은 초기에 발현되어 절단가능 신호 펩타이드에 연결된다. 신호 펩타이드가 없는 가변 영역은 때때로 성숙한 가변 영역으로 불린다. 따라서, 예를 들면, 경쇄 성숙한 가변 영역은 경쇄 신호 펩타이드가 없는 경쇄 가변 영역을 의미한다. 각각의 사슬의 카복시-말단부는 효과기 기능에 주로 관여하는 불변 영역을 정의한다.
경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤(mu), 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 아이소타입을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 정의한다. 경쇄 및 중쇄내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄 또한 약 10 또는 그 초과 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 참고 일반적으로, Fundamental Immunology (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989), Ch. 7 (그 전체가 다목적으로 참고로 편입됨).
각각의 경/중쇄 쌍의 성숙한 가변 영역은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 온전한 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 이작용성 또는 이중특이적 항체를 제외하고, 2개의 결합 부위는 동일하다. 사슬 모두는 3개의 초가변성 영역, 또한 소위 상보성 결정 영역 또는 CDR에 의해 연결된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반적인 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 2개의 사슬로부터의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 정렬되어, 특이적인 에피토프에 대한 결합이 가능하도록 한다. N-말단으로부터 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 둘 다는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 배정은 다음의 문헌의 정의에 따른다: Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987 및 1991), 또는 Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia 등, Nature 342:878-883 (1989). 카밧(Kabat)은 또한 널리 사용된 넘버링 조약(카밧 넘버링)을 제공하며, 여기서 상이한 중쇄 사이 또는 상이한 경쇄 사이의 상응하는 잔기는 동일한 수로 배정된다.
용어 “항체”는 온전한 항체 및 이의 결합 단편을 포함한다. 전형적으로, 단편은, 이들이 별개의 중쇄, 경쇄 Fab, Fab', F(ab')2, F(ab)c, Dabs, 나노바디, 및 Fv를 포함하는 표적에 대한 특이적 결합에 대해 유도되었던 온전한 항체와 경쟁한다. 단편은 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 온전한 면역글로불린의 효소 또는 화학적 분리에 의해 생산될 수 있다. 용어 “항체”는 또한 이중특이적 항체 및/또는 인간화된 항체를 포함한다. 이중특이적 또는 이기능적 항체는 2개의 상이한 무거운/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다(참고, 예를 들면, Songsivilai 및 Lachmann, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny 등, J. Immunol., 148:1547-53 (1992)). 일부 이중특이적 항체에서, 2개의 상이한 무거운/경쇄 쌍은 15F7에 의해 결합된 것보다. 라미닌 α4에서 상이한 에피토프에 대해 특이적인 인간화된 15F7 중쇄/경쇄 쌍 및 중쇄/경쇄 쌍을 포함한다.
일부 이중특이적 항체에서, 하나의 중쇄 경쇄 쌍은 하기에 추가로 개시된 바와 같은 인간화된 15F7 항체이고 무거운 경쇄 쌍은 혈액 뇌 장벽, 예컨대, 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 (IGF) 수용체, 렙틴 수용체, 또는 지질단백질 수용체, 또는 트랜스페린 수용체에 발현된 수용체에 결합하는 항체로부터 기원한다(참고: Friden 등, PNAS 88:4771-4775, 1991; Friden 등, Science 259:373-377, 1993). 그와 같은 이중특이적 항체는 수용체-매개된 통과세포외배출에 의해 혈액 뇌 장벽을 통과하여 이동될 수 있다. 이중특이적 항체의 뇌 흡수는 이중특이적 항체를 추가로 엔지니어링함으로써 추가로 증대되어 혈액 뇌 장벽 수용체에 대한 그것의 친화성을 감소시킬 수 있다. 수용체에 대한 감소된 친화성은 뇌에서 보다. 광범위한 분포를 초래한다(참고, 예를 들면, Atwal. 등, Sci. Trans. Med. 3, 84ra43, 2011; Yu 등, Sci. Trans. Med. 3, 84ra44, 2011).
예시적인 이중특이적 항체는 또한 다음 (1) 내지 (5)일 수 있다: (1) 이중-가변-도메인 항체(DVD-Ig)(여기서 각각의 경쇄 및 중쇄는 2개의 가변 도메인을 짧은 펩타이드 연결부를 통해 일렬로 함유한다)(참고: Wu 등, Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)); (2) 각각의 표적 항원에 대해 2개의 결합 부위를 갖는 4가 이중특이적 항체를 생성하는 2개의 단일 사슬 디아보디의 융합체인, 탄다브(Tandab); (3) 다가 분자를 생성하는 디아바디와 scFv의 조합인, 플렉시바디(flexibody); (4) Fab에 적용하는 경우 상이한 Fab 단편에 연결된 2개의 동일한 Fab 단편으로 이루어진 3가 이중특이적 결합 단백질을 수득할 수 있는, “이량체화 및 도킹 도메인을 기반으로 하는 소위 “독(dock) 및 록(lock)" 분자; (5) 예를 들면, 인간 Fc-영역의 종말 둘 다에 융합된 2개의 scFvs를 포함하는 소위 전갈 분자. 이중특이적 항체를 제조하는데 유용한 플랫폼의 예는 BiTE(Micromet), DART(MacroGenics), Fcab 및 Mab2 (F-star), Fc-조작된 IgGl(Xencor) 또는 DuoBody(Fab 아암 교환을 기반으로 함, Genmab)을 포함한다.
용어 “에피토프”는, 항체가 결합하는 항원 상의 부위를 말한다. 에피토프는 하나 이상의 단백질의 3차 폴딩에 의해 나란히 놓인 인접 아미노산 또는 비인접 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산(선형 에피토프로도 공지됨)으로부터 형성된 에피토프는 변성 용매에 대한 노출시전형적으로 유지되는 반면에 3차 폴딩(형태적 에피토프로도 공지됨)에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매로 처리시 전형적으로 상실된다. 에피토프는 독특한 공간 형태 속에 적어도 3, 및 보통 그 이상, 적어도 5 또는 8-10개의 아미노산을 전형적으로 포함한다. 에피토프의 공간 형태를 측정하는 방법은, 예를 들면, x-선 결정학 및 2-차원 핵자기 공명을 포함한다. 참고, 예를 들면, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996).
동일하거나 중첩되는 에피토프를 인식하는 항체는 표적 항원에 대한 또 다른 항체의 결합과 경쟁하는 하나의 항체의 능력을 나타내는 단순한 면역검정에서 확인될 수 있다. 항체의 에피토프는 또한 접촉 잔기를 확인하기 위한 그것의 항원에 대해 결합된 항체의 X-선 결정학으로 정의될 수 있다. 대안적으로, 2개의 항체는, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원내 모든 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 동일한 에피토프를 갖는다. 2개의 항체는, 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 일부 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 중첩 에피토프를 갖는다.
항체 사이의 경쟁은, 시험 하의 항체가 공통의 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에 의해 결정된다(참고, 예를 들면, Junghans 등, Cancer Res. 50:1495, 1990). 시험 항체는, 과잉의 시험 항체(예를 들면, 적어도 2x, 5x, 10x, 20x 또는 100x)가 경쟁적 결합 검정에서 측정된 것으로서 적어도 50%까지 참조 항체의 결합을 억제하는 경우 참조 항체와 경쟁한다. 일부 시험 항체는 참조문헌 항체의 결합을 적어도 75%, 90% 또는 99%까지 억제한다. 경쟁 검정(경쟁하는 항체)에 의해 확인된 항체는 참조 항체와 동일한 에피토프에 대해 결합하는 항체 및 발생할 입체 장애에 대해 참조 항체에 의해 결합된 에피토프에 대해 충분히 근위인 인접한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
용어 “약제학적으로 허용가능한”은, 캐리어, 희석제, 부형제, 또는 보조제가 제형의 다른 성분과 양립가능하며 이의 수령체에 대해 실질적으로 유해하지 않음을 의미한다.
용어 “환자”는 예방적 또는 치료적 처치를 제공받는 인간 및 다른 포유동물 대상체를 포함한다.
개인은, 대상체가 개인을 위험 인자가 없는 개인보다. 질환으로 발달할 통계적으로 유의미한 더 큰 위험에서의 위험 인자를 지닌 개인으로 두는 적어도 하나의 공지된 위험-인자 (예를 들면, 유전적, 생화학적, 가족력, 및 상황적 노출)를 갖는 경우 질환의 위험이 증가되어 있다.
용어 “생물학적 샘플”은 생물학적 공급원, 예를 들면, 인간 또는 포유동물 대상체내에 또는 이로부터 수득가능한 생물학적 물질의 샘플을 말한다. 이러한 샘플은 기관, 세포소기관, 조직, 조직의 섹션, 체액, 말초 혈액, 혈장, 혈청, 세포, 분자, 예컨대 단백질 및 펩타이드, 및 이로부터 유도된 임의의 부분 또는 조합일 수 있다. 용어 생물학적 샘플은 또한 샘플을 가공하여 유도된 임의의 물질을 포함할 수 있다. 유도된 물질은 세포 또는 그것의 자손을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플의 프로세싱은 하나 이상의 여과, 증류, 추출, 농축, 고착, 간섭 성분의 불활성화 등을 포함할 수 있다.
용어 “대조군 샘플”은 암성 세포를 포함하는 것으로 공지되지 않거나 의심되거나, 또는 주어진 유형의 암성 세포를 포함하는 것으로 적어도 공지되지 않거나 예측된 생물학적 샘플을 말한다. 대조군 샘플은 암 또는 암의 특이적으로 선택된 유형으로 괴로워하지 않는 개인으로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 대조군 샘플은 암 또는 암의 특이적으로 선택된 유형으로 괴로운 환자로부터 수득될 수 있다. 이러한 샘플은 암을 포함하는 것으로 고려된 생물학적 샘플과 동일한 상이한 시기에 또는 상이한 시기에 수득될 수 있다. 생물학적 샘플 및 대조군 샘플 둘 모두는 동일한 조직(예를 들면, 종양 조직 및 주변의 정상 조직을 함유하는 조직 단면)으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 대조군 샘플은 정상의, 건강한 세포로 본질적으로 또는 전적으로 이루어지며 암 세포 또는 암 세포의 특정한 유형을 포함하는 것으로 고려된 생물학적 샘플과 비교하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 대조군 샘플 속의 세포는 생물학적 샘플(예를 들면, 폐 또는 뇌)에 존재하는 것으로 고려되는 암 세포와 동일한 조직 기원을 갖는다. 바람직하게는, 생물학적 샘플 속에 존재하는 것으로 고려된 암 세포는 대조군 샘플에서의 세포 유형과 동일한 세포형(예를 들면, 뉴런, 상피성, 간엽, 조혈)으로부터 발생한다.
용어 “질환”은 생리적 기능을 부여하는 임의의 비정상 병태를 말한다. 상기 용어는, 생리적 기능이 병인이 특성과 무관하게 손상된 임의의 장애, 병, 비정상, 병리학, 질병, 상태, 또는 증후군을 포함하여 광범위하게 사용된다.
용어 “증상”은 대상체에 의해 감지된 것으로서, 질환의 대상체 증거, 예컨대 변경된 보행을 말한다. "징후"는 의사에 의해 관측된 질환의 객관적인 증거를 말한다.
보존적 또는 비보존적으로서 아미노산 치환을 분류하기 위한 목적으로, 아미노산은 하기와 같이 그룹화된다: 그룹 I (소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; 그룹 II (중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III (산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV (염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V (사슬 방향에 영향을 주는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI (방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 클래스의 아미노산 사이의 치환을 포함한다. 비-보존적 치환은 또 다른 구성원에 대한 이들 클래스 중 하나의 구성원의 교환을 구성한다.
백분율 서열 동일성은 카밧 넘버링 협약에 의해 최대로 정렬된 항체 서열로 결정된다. 정렬 후에, 대상체 항체 영역(예를 들면, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙한 가변 영역)을 참조 항체의 동일한 영역과 비교하는 경우, 대상체와 참조 항체 사이의 백분율 서열 동일성은 대상체와 참조 항체 둘 다에서 동일한 아미노산에 의해 점거된 위치의 수를 갭이 카운트되지 않은, 2개의 영역의 정렬된 위치의 총 수로 나누고, 100을 곱하여 백분율로 전환시킨다.
하나 이상의 인용된 요소를 “포함하는” 또는 “포괄하는” 조성물 또는 방법은 특이적으로 인용되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체를 “포함하는” 또는 “포괄하는” 조성물은 항체를 단독으로 또는 다른 성분과 병행하여 함유할 수 있다.
값의 범위의 지정은 범위내 또는 범위를 정의하는 모든 정수, 및 범위내 정수에 의해 정의된 모든 부분범위를 포함한다.
맥락으로부터 다르게 분명하지 않는 한, 용어 “약”은 측정의 표준 오차 한계내의 값(예를 들면, SEM)의 언급된 값을 포함한다.
통계적 유의도는 p≤0.05를 의미한다.
물품의 단수 형태(“a,” “an,” 및 “the”)는, 맥락이 명확히 다르게 기술하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 예를 들면, 용어 “화합물” 또는 “적어도 하나의 화합물”은 이들의 혼합물을 포함하는, 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
상세한 설명
I. 일반론
본 발명은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 항체는, 정상 조직에 대해 암 세포를 선택적으로 염색하는 능력을 갖는다. 항체는 또한 라미닌- α4-매개된 암 또는 종양 세포 부착을 억제하는 능력을 갖는다. 상기 항체는, 기타 적용 중에서, 암을 검출하고, 암 요법의 효능을 평가하고, 암을 치료하고, 그리고 비만 또는 비만-관련된 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
II. 표적 분자
라미닌은 세포외 매트릭스 당단백질의 패밀리이며 기저 막의 주요 비 -교원성 성분이다. 이들은 다른 공정들 중에서 세포 부착, 분화, 이동, 신호전달, 신경돌기 결과물, 및 전이를 포함하는, 생물학적 과정에 관여된 것으로 보고되어 왔다. 라미닌은 다음의 3개의 사슬의 헤테로트리머 단백질이다: 알파 사슬, 베타 사슬, 및 감마 사슬. 3개의 사슬은 상이한 사슬에 의해 각각 형성된, 3개의 짧은 암(arm), 및 모든 3개의 사슬로 구성된 긴 암으로 이루어진 십자형 구조를 형성한다. 포유동물에서, 5개의 상이한 알파 사슬, 3개의 상이한 베타 사슬, 및 3개의 상이한 감마 사슬은 15개의 상이한 헤테로트리머 조합으로 조립될 수 있는 것으로 확인되어 왔다.
라미닌 알파 사슬은 약 200 아미노산의 5개의 탠덤 상동성 라미닌 G-유사 모듈(LG1-5)을 갖는 큰 C-말단 구상 도메인(G 도메인)을 갖는다. 예를 들면, 라미닌 α4의 G 도메인은 아미노산 위치 833-1820(서열식별번호: 4)로서 UniProt 서열 Q16363에 의해 정의되며, 라미닌 α4의 5개의 LG 모듈은 하기와 같이 UniProt 서열 Q16363으로 정의된다: LG1(서열식별번호: 5)은 아미노산 위치 833-1035를 포함하고, LG2(서열식별번호: 6)는 아미노산 위치 1047-1227을 포함하고, LG3(서열식별번호: 7)은 아미노산 위치 1234-1402를 포함하며, LG4(서열식별번호: 9)는 아미노산 위치 1469-1640을 포함하고 LG5(서열식별번호: 10)는 아미노산 위치 1647-1820을 포함한다. 일부 사례에서, G 도메인은 서열식별번호: 4일 수 있으며; 다른 사례에서 이는 UniProt 서열 Q16363의 아미노산 위치 833-1820을 포함할 수 있다. 일부 사례에서, LG1 모듈은 서열식별번호: 5일 수 있으며; 다른 사례에서 이는 UniProt 서열 Q16363의 아미노산 위치 833-1035를 포함할 수 있다. 일부 사례에서, LG2 모듈은 서열식별번호: 6일 수 있으며; 다른 사례에서 이는 UniProt 서열 Q16363의 아미노산 위치 1047-1227을 포함할 수 있다. 일부 사례에서, LG3 모듈은 서열식별번호: 7일 수 있으며; 다른 사례에서 이는 UniProt 서열 Q16363의 아미노산 위치 1234-1402를 포함할 수 있다. 일부 사례에서, LG4 모듈은 서열식별번호: 9일 수 있으며; 다른 사례에서 이는 UniProt 서열 Q16363의 아미노산 위치 1469-1640을 포함할 수 있다. 일부 사례에서, LG5 모듈은 서열식별번호: 10일 수 있으며; 다른 사례에서 이는 UniProt 서열 Q16363의 아미노산 위치 1647-1820을 포함할 수 있다. LG1-3 모듈 (서열식별번호: 8)은 링커 도메인에 의해 LG4-5 모듈(서열식별번호: 11)에 연결된다. 라미닌 α4 사슬(LAMA4, 라미닌 서브유닛 α4, 라미닌-14 서브유닛 알파, 라미닌-8 서브유닛 알파, 및 라미닌-9 서브유닛 알파로도 공지됨)은 200 kDa이며 가장 짧은 변종이다. α1, α2, 및 α5 사슬과 비교하여, 라미닌 α4는 끝이 잘린 N-말단을 갖는다. 라미닌 α4는 성인 및 발달 동안 둘 다에서 널리 분배된다. 이는 라미닌-8 (라미닌 411 또는 알파4/베타1/감마1), 라미닌-9 (라미닌 421 또는 알파4/베타2/감마1), 및 라미닌-14 (라미닌 411 또는 알파4/베타1/감마1)내에 존재한다.
맥락으로부터 다르게 분명하지 않지만, 라미닌 α4 또는 그것의 단편, 도메인, 또는 모듈에 대한 참조는 동형체 및 이의 대립유전자 변종을 포함하는 천연 인간 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 인간 서열은 UniProt 번호 Q16363 및 유전자은행 수납 번호 NP001098676 및 NP001098677 (각각 서열식별번호: 1, 2, 및 3)로 지정된다. 일부 항체는 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈내에서 에피토프에 결합한다. 에피토프는 LG4내, LG5내에 존재할 수 있거나, 분할되어 에피토프를 형성하는 잔기가 LG4 및 LG5 둘 다로부터 올 수 있다.
라미닌 α4는 신데칸에 대한 결합 파트너인 것으로 보고되어 왔다. 예를 들면, 신데칸-2 또는 -4를 과발현시키는 세포는 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4 모듈에 결합하는 것으로 보고되어 왔다. 참고: Matsuura 등, J. Invest. Dermatol. 122:614-620 (2004). 신데칸은 세포 표면에서 헤파란 설페이트의 주요 생리적 형태를 구성하는 막통과 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 수용체이다. 신데칸 단백질 패밀리의 4개의 보고된 구성원이 존재한다: 신데칸-1(SYND1, SDC1, SDC, 또는 CD138로도 공지됨), 신데칸-2(SYND2, SDC2, 피브로글리칸, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 코어 단백질, HSPG, HSPG1, 및 CD362로도 공지됨), 신데칸-3(SYND3 및 SDC3로도 공지됨), 및 신데칸-4(SYND4, SDC4, 암피글리칸, 및 리우도칸 코어 단백질로도 공지됨). 신데칸은 짧은 세포질 도메인, 단일-스판(span) 막통과 도메인, 및 세포외 도메인을 갖는다. 이들은 성장 인자, 사이토카인, 및 세포외 매트릭스 단백질에 결합하는 것으로 보고되어 왔다. 신데칸은 다른 공정들 중에서 세포 성장, 분화, 혈관신생, 및 부착을 조절하는 것을 포함하는, 많은 보고된 생물학적 역활을 갖는다. 맥락으로부터 다르게 분명하지 않지만, 신데칸 또는 그것의 단편 또는 도메인에 대한 참조는 동형체 및 이의 대립유전자 변종을 포함하는 천연 인간 아미노산 서열을 포함한다. 예시적인 인간 서열은 UniProt 번호 P18827(신데칸-1), P34741(신데칸-2), O75056(신데칸-3), 및 P31431(신데칸-4)(각각 서열식별번호: 12-15)로 지정된다.
LG4 및 라미닌 α4의 G 도메인의 LG5 모듈 또한 다음 단백질을 포함하는 다른 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에 결합한다: 세포 표면 단백질, 예컨대 글리피칸, 베타글리칸, 및 CD44(예를 들면, Swiss Prot. P16070), 및 매트릭스 단백질, 예컨대 퍼레칸(예를 들면, Swiss Prot. P98160), 아그린(예를 들면, Swiss Prot. Q00468), 및 콜라겐 XVIII (예를 들면, Swiss Prot. P39060). 임의의 또는 모든 이들 또는 다른 프로테오글리칸에 대한 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈의 결합은 그것의 성장 촉진 특성, 염증, 혈관신생, 및 암의 성장 및 전이에 기여할 수 있다.
III. 암
상기 표적 분자는 암의 발달 및/또는 진행에 관여되어 있다. 암은 조절되지 않은 세포 성장 및 증식에 의해 전형적으로 특징화된 포유동물내 생리적 조건이다. 암은 조혈 악성종양 또는 고형 종양, 즉, 전-암성 병변을 포함하는, 과도한 세포 성장 또는 증식으로부터 초래되는 세포의 덩어리일 수 있다. 전이암은, 이것이 처음 시작된 위치로부터 신체내 다른 위치로 확산되는 암을 말한다. 전이암 세포에 의해 형성된 종양은 전이성 종양 또는 전이로 분리며, 이는, 암 세포가 신체의 다른 부위로 확산되는 공정을 말하는데 또한 사용된다. 일반적으로, 전이암은 최초, 또는 일차, 암으로서 암세포의 동일한 명칭 및 동일한 유형을 갖는다. 고형 종양의 예는 흑색종, 암종, 모세포종, 및 육종을 포함한다. 혈액성 악성종양은 백혈병 또는 림프모양 악성종양, 예컨대 림프종을 포함한다. 이러한 암의 보다. 특정한 예는 편평상피 세포 암 또는 암종, 폐암, 복막의 암, 간세포 암, 위 또는 위장 암을 포함하는 위암, 췌장암, 신경아교종, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 암 또는 자궁 암종, 타액샘 암종, 신장 또는 신장 암, 전립선암, 외음부 암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 뿐만 아니라 두경부 암을 포함한다.
IV. 항체
A. 결합 특이성 및 기능적 특성
본 발명은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈내 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들면, 라미닌 α4 UniProt 서열 Q16363에 정의된 것으로서, LG4(서열식별번호: 9)는 아미노산 위치 1469-1640을 포함하고, LG5(서열식별번호: 10)는 아미노산 위치 1647-1820을 포함하며, 및 LG4-5(서열식별번호: 11)는 아미노산 위치 1469-1820을 포함한다. 에피토프는 LG4내, LG5내에 존재할 수 있거나, 분할되어 에피토프를 형성하는 잔기가 LG4 및 LG5 둘 다로부터 올 수 있다. 에피토프는 특히 LG4-5내 세그먼트, 예컨대, 위치 1469-1519, 1520-1570, 1571-1621, 1622-1672, 1673-1723, 1724-1774, 및 1775-1820 범위의 라미닌 α4 UniProt 서열 Q16363로부터의 세그먼트일 수 있다. 에피토프는 선형, 예컨대, 예를 들면, LG4, LG5, LG4-5로부터 2-5, 3-5, 3-10, 3-15, 3-20, 5-10, 5-15, 또는 5-20 인접 아미노산의 에피토프, 또는 상기 명시된 인접 세그먼트의 임의의 세그먼트 또는 쌍일 수 있다. 에피토프는 또한 예를 들면, LG4, LG5, LG4-5의 임의의 조합으로부터의 2-5, 3-5, 3-10, 3-15, 3-20, 5-10, 5-15, 또는 5-20의 비-인접 아미노산, 및 임의의 상기 명시된 세그먼트를 포함하는, 형태적 에피토프일 수 있다.
15F7, 6C12, 및 13G10로 지정된 항체는3개의 이러한 예시적인 마우스 항체이다. 이들 3개의 단클론성 항체는 LG4 및/또는 라미닌 α4의 G 도메인의 LG5 모듈내 에피토프에 각각 특이적으로 결합한다. 이들 항체는 그것의 라미닌 α4의 G 도메인의 LG1-3 모듈에 대한 유의미한 결합의 결여에 의해 추가로 특징화된다(예를 들면, 무관한 대조군 항체로서 실험적인 오차내에서 동일하거나, LG1-3 모듈에 대해 특이적인 항체보다. 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 덜 결합함(예를 들면, 유세포측정 결합 검정에 의해 측정됨)). 일부 항체는 그것의 다른 라미닌 알파 사슬, 예를 들면, 라미닌 α1, 라미닌 α2, 라미닌 α3, 및 라미닌 α5에 대한 유의미한 결합의 결여에 의해 특징화된다(예를 들면, 무관한 대조군 항체로서 실험적인 오차내에서 동일하거나, 관련된 다른 라미닌 알파 사슬에 대해 특이적인 항체보다. 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 또는 10-배 덜 결합함(예를 들면, 유세포측정 결합 검정에 의해 측정됨)). 일부 항체는 흑색종 샘플을 사용한 예 2에 나타낸 바와 같이, 대조군 샘플과 비교하는 경우 암 세포(예를 들면, 종양 조직의 샘플)를 포함하는 생물학적 샘플에 선택적으로 결합하는 그것의 수용력(예를 들면, 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 결합은 상기 항체의 상기 대조군 샘플에의 결합보다. 적어도 1.5-배, 2-배, 5-배, 또는 10-배 더 크다)에 의해 추가로 특징화된다. 바람직하게는, 대조군 샘플 및 생물학적 샘플은 동일한 조직 기원의 세포를 포함한다. 특이적인 단백질, 모듈, 또는 도메인에 결합하는 능력은 실시예에 제공된 예시적인 검정 포맷에서 실증될 수 있다. 마찬가지로, 종양 조직에 선택적으로 결합하여 이를 염색하는 능력은 실시예에 제공된 예시적인 검정 포맷에 의해 실증될 수 있다.
LG4-5 내에서 결합하는 일부 항체는 라미닌 α4의 MCAM에의 결합을 억제하는 수용력을 결여한다. (즉, 무관한 대조군 항체와 실험적인 오차내에서 동일한 저해 정도). 일부 항체는 신데칸, 예컨대 신데칸-1, 신데칸-2, 신데칸-3, 또는 신데칸-4에 대한 라미닌 α4의 결합을 억제한다. 일부 항체는 임의의 또는 모든 글리피칸, 베타글리칸, 및 CD44, 및 매트릭스 단백질, 예컨대 퍼레칸, 아그린, 및 콜라겐 XVIII을 포함하는 몇 개의 다른 세포 표면 단백질을 포함하는 다른 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에 대한 라미닌 α4의 결합을 억제한다. 개시된 항체 중의 일부는 임의의 또는 모든 이들 프로테오글리칸에 대한 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈의 결합을 저해할 수 있고, 결과적으로 또는 달리 암의 혈관신생, 염증 및 성장 및 전이를 억제할 수 있다.
결합 파트너, 예를 들면, 신데칸 또는 다른 프로테오글리칸에 대한 라미닌 α4의 결합의 저해는, 항체가 재조합 라미닌 α4 단백질, 라미닌- α4-양성 조직, 또는 라미닌- α4-표시 세포와 함께 프레-인큐베이션되고, 이후에, 재조합 프로테오글리칸 또는 프로테오글리칸-발현 세포가 라미닌 α4에 결합하는 이들의 능력에 대해 평가되는 결합 검정에서 시험될 수 있다. 임의로, 시험 항체의 저해는 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈내에서 결합하지 않는 무관한 대조군 항체와 비교시 또는 비히클 결여 임의의 항체와 비교시 실증될 수 있다.
일부 항체는 암 세포의 라미닌- α4-매개된 세포 부착, 바람직하게는 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 의해 매개된 세포 부착을 저해하는 수용력을 갖는다. 예시적인 세포 부착 검정은 실시예에 기재된다.
일부 항체는 또한 라미닌- α4-유도된 pAkt 활성화를 억제하는 수용력을 갖는다. 예시적인 검정은 실시예에 기재된다.
저해는 다음의 저해를 의미한다: 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 75%, (예를 들면, 10%-75% 또는 30%-70%)의 라미닌 α4 단독에 의해 또는 신데칸 또는 임의의 그것의 기능적 활성에 또한 기여하는 어떤 것(예를 들면, 다른 프로테오글리칸)과 함께 매개된 결합, 세포 부착 및/또는 다른 기능적 활성. 저해는, 항체가 약 20 ug/ml의 농도에서 존재하는 경우 보통 실증될 수 있다. 항체는 적어도 30%의 라미닌- α4-매개된 세포 부착, 예컨대, 예를 들면, 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 의해 매개된 세포 부착의 억제를 나타낼 수 있다.
바람직한 항체는 암 발달 또는 진행, 또는 이의 임의의 측면, 예컨대, 동물 모델 또는 임상시험에서 나타낸 바와 같은 전이를 억제한다. 인간 암 세포가 면역 결핍된 실험실 동물, 예컨대, 마우스 또는 랫트, 또는 실험실 동물이 인간 종양유전자를 발현하거나 녹 아웃된(knocked out) 종양 억제제 유전자를 갖는 트랜스제닉 모델내로 주사된 암의 동물 모델이 널리 이용가능하다. 또한, 암 세포의 특정한 특성에 대한 세포 기반 검정, 예컨대 증식 검정, 성장 검정, 생존 검정, 이동 검정, 침습 검정, 및 기타는 널리 이용가능하다.
일부 항체는 15F7, 6C12, 또는 13G10로 지정된 항체로서 동일하거나 중첩되는 에피토프에 결합한다. 이들 항체의 중쇄 및 경쇄 성숙한 가변 영역의 서열은 각각 서열식별번호: 16 및 17, 26 및 27, 및 36/37 및 38으로 지정된다. 6C12의 경쇄 성숙한 가변 영역의 또 다른 버전은 서열식별번호: 94이다. 그와 같은 결합 특이성을 갖는 다른 항체는 마우스를 라미닌 α4, 또는 원하는 에피토프를 포함하는 이의 일부로 면역화시키고, 수득되는 항체를 임의로 15F7, 6C12, 또는 13G10과의 경쟁시 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 대한 결합에 대해 스크리닝함으로써 생산할 수 있다. 그와 같은 검정에 의해 확인된 항체는 이후에 실시예 또는 달리 기재된 바와 같이 LG4-5 모듈에 특이적으로 결합하지만 라미닌 α4의 G 도메인의 LG1-3 모듈에 결합하지 않는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 항체는 또한 실시예 또는 달리 기재된 바와 같이 종양 조직을 선택적으로 염색하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 항체는 또한 실시예 또는 달리 기재된 바와 같이 라미닌- α4-매개된 종양 세포 부착을 억제하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.
하나 이상의 명시된 잔기를 포함하는 에피토프에 결합하는 항체는 이들 하나 이상의 잔기를 포함하는 라미닌 α4의 단편으로 면역화시킴으로써 생성시킬 수 있다. 단편은, 예를 들면, 서열식별번호: 11로부터 100, 50, 25, 10 또는 5개 이하의 인접 아미노산을 가질 수 있다. 이러한 단편은 보통 서열식별번호: 11의 적어도 5, 6, 7, 8 또는 9개 이상의 인접 잔기를 가진다. 단편은 단편에 대한 항체 반응을 유발하는데 도움을 주는 캐리어에 연결될 수 있고/있거나 그와 같은 반응을 유발하는 아쥬반트(adjuvant)와 조합될 수 있다. 대안적으로, 원하는 잔기에 결합하는 항체는 전장 라미닌 α4(서열식별번호: 1) 또는 라미닌 α4의 전장 G 도메인(서열식별번호: 4) 또는 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈(서열식별번호: 11) 또는 이들 중 임의의 단편을 면역화시킴으로써 수득될 수 있다. 이러한 항체는 이후에 G 도메인의 상이한 LG 모듈, 예컨대 LG1-3, LG1-5, LG4-5, LG4, 또는 LG5(각각 서열식별번호: 8, 4, 11, 9, 및 10)을 함유하는 라미닌 α4의 버전에 대한 차별적인 결합 또는 명시된 잔기의 돌연변이체와 비교하여 야생형 라미닌 α4에 대한 차별적인 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. G 도메인의 상이한 LG 모듈을 사용한 라미닌 α4의 버전에 대한 스크리닝은 라미닌 α4의 G 도메인내의 어떤 LG 모듈에 대한 항체 결합을 맵핑한다. 돌연변이체에 대한 스크리닝은 결합 특이성을 보다. 정확하게 정의하여 이의 결합이 특정한 잔기의 돌연변이유발에 의해 저해되고 다른 예시된 항체의 저해제 특성을 공유하는 경향이 있는 항체의 확인을 허용한다.
선택된 쥣과 항체의 결합 특이성을 지닌 인간 항체(예를 들면, 15F7, 6C12, 또는 13G10)는 또한 파아지 디스플레이 방법의 변종을 사용하여 생산할 수 있다. 참고: Winter, WO 92/20791. 이러한 방법은 인간 항체를 생산하는데 특히 적합하다. 이러한 방법에서, 선택된 쥣과 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 개시 물질로서 사용된다. 예를 들면, 경쇄 가변 영역이 개시 물질로서 선택되는 경우, 구성원이 동일한 경쇄 가변 영역 (즉, 쥣과 개시 물질) 및 상이한 중쇄 가변 영역을 나타내는 파아지 라이브러리가 작제된다. 중쇄 가변 영역은 예를 들면, 재배열된 인간 중쇄 가변 영역의 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 대해 강한 특이적 결합(예를 들면, 적어도 108 및 바람직하게는 적어도 109 M- 1)을 나타내는 파아지가 선택된다. 이러한 파아지로부터의 중쇄 가변 영역은 이후에 추가 파아지 라이브러리를 작제하기 위한 개시 물질로서 제공된다. 이러한 라이브러리에서 각각의 파아지는 동일한 중쇄 가변 영역(즉, 제1의 디스플레이라이브러리로부터 확인된 영역) 및 상이한 경쇄 가변 영역을 디스플레이한다. 경쇄 가변 영역은 예를 들면, 재배열된 인간 가변 경쇄 영역의 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 다시, 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 대해 강한 특이적 결합을 나타내는 파아지가 선택된다. 수득한 항체는 보통 쥣과 개시 물질과 동일하거나 유사한 에피토프 특이성을 갖는다.
다른 항체가 예시적인 항체의 중쇄 및 경쇄, 예컨대 15F7, 6C12, 또는 13G10을 암호화하는 cDNA의 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다. 성숙한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열내 15F7, 6C12, 또는 13G10에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하고 그것의 기능적 특성을 유지하고/하며, 작은 수의 기능적으로 하찮은 아미노산 치환(예를 들면, 보존적 치환), 결실, 또는 삽입에 의해 각 항체와 상이한 단클론성 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 카밧에 의해 정의된 것으로서 15F7, 6C12, 또는 13G10의 상응하는 CDR에 대해 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 적어도 하나 또는 모두 6개의 CDR(들)을 갖는 단클론성 항체가 또한 포함된다.
본 발명은 또한 항체를 제공하며 이는 일부 또는 모든(예를 들면, 3, 4, 5, 및 6) CDR을 15F7, 6C12, 또는 13G10로부터 전적으로 또는 실질적으로 갖는다. 이러한 항체는 15F7, 6C12, 또는 13G10의 중쇄 가변 영역으로부터 전적으로 또는 실질적으로 적어도 2, 및 보통 모든 3개의 CDR을 갖는 중쇄 가변 영역 및/또는 15F7, 6C12, 또는 13G10의 경쇄 가변 영역으로부터 전적으로 또는 실질적으로 적어도 2, 및 보통 모든 3개의 CDR을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 다를 포함할 수 있다. CDR은, 이것이 4, 3, 2, 또는 1 치환, 삽입, 또는 결실을 함유하는 경우 상응하는 15F7, 6C12, 또는 13G10 CDR로부터 실질적으로 존재하며, 단, CDRH2(카밧에 의해 정의된 경우)는 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 치환, 삽입, 또는 결실을 가질 수 있다. 이러한 항체는 성숙한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열내 15F7, 6C12, 또는 13G10에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 가질 수 있으며 그것의 기능적 특성을 유지할 수 있고/있거나, 작은 수의 기능적으로 하찮은 아미노산 치환(예를 들면, 보존적 치환), 결실, 또는 삽입에 의해 15F7, 6C12, 또는 13G10과는 상이하다.
B. 비-인간 항체
라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 대한 다른 비-인간 항체, 예를 들면, 쥣과, 기니아 피그, 영장류, 토끼 또는 랫트의 생산은, 예를 들면, 동물을 라미닌 α4 또는 그것의 단편으로 면역화시켜 달성할 수 있다. 참고 Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (CSHP NY, 1988) (다목적으로 참고로 편입됨). 그와 같은 면역원은 천연 공급원으로부터, 펩타이드 합성에 의해, 또는 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 임의로, 면역원은 캐리어 단백질과 융합되거나 달리 복합되어 투여될 수 있다. 임의로, 면역원은 아쥬반트와 함께 투여될 수 있다. 몇 개의 유형의 아쥬반트가 아래에서 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 완료된 프로인트 아쥬반트(Freund's adjuvant)에 이은 불완전한 아주반트가 실험실 동물의 면역화를 위해 바람직하다. 토끼 또는 기니아 피그는 다클론성 항체를 제조하기 위해 전형적으로 사용된다. 마우스는 단클론성 항체를 제조하기 위해 전형적으로 사용된다. 항체는 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 대한 특이적 결합을 위해 스크리닝된다. 이러한 스크리닝은 라미닌 α4 변종, 예컨대 G 도메인의 LG1-3 모듈, G 도메인의 LG1-5 모듈, 및 G 도메인의 LG4-5 모듈을 함유하는 라미닌 α4 변종의 수집에 대한 항체의 결합을 측정하고, 어느 라미닌 α4 변종이 항체에 결합하는지를 측정함으로써 달성될 수 있다. 결합은 예를 들면, 웨스턴 블랏, FACS 또는 ELISA에 의해 평가될 수 있다.
C. 인간화된 항체
인간화된 항체는 비-인간 “공여체” 항체로부터의 CDR이 인간 “수용체” 항체 서열로 그래프팅된 유전적으로 조작된 항체이다(참고, 예를 들면, Queen, US 5,530,101 및 5,585,089; Winter, US 5,225,539, Carter, US 6,407,213, Adair, US 5,859,205 6,881,557, Foote, US 6,881,557). 수용체 항체 서열은 예를 들면, 성숙한 인간 항체 서열, 이러한 서열의 복합체, 인간 항체 서열의 공통 서열, 또는 생식계열 영역 서열일 수 있다. 따라서, 인간화된 항체는 전적으로 또는 실질적으로 공여체 항체로부터의 일부 또는 모든 CDR 및 가변 영역 프레임워크 서열 및 존재한다면, 전적으로 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터의 불변 영역을 갖는 항체이다. 유사하게, 인간화된 중쇄는 전적으로 또는 실질적으로 공여체 항체 중쇄로부터의 적어도 하나, 2개 및 보통 모든 3개의 CDR, 및 존재한다면, 실질적으로 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 유사하게, 인간화된 경쇄는 전적으로 또는 실질적으로 공여체 항체 경쇄로부터의 적어도 하나, 2개 및 보통 모든 3개의 CDR, 및 존재한다면, 실질적으로 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 나노바디 및 dAbs 이외에, 인간화된 항체는 인간화된 중쇄 및 인간화된 경쇄를 포함한다. 인간화된 항체내 CDR은, 상응하는 잔기의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%(카밧에 의해 정의된 바와 같음)가 각 CDR 사이에서 동일한 경우, 비-인간 항체내 실질적으로 상응하는 CDR으로부터 기원한다. 항체 사슬의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 사슬의 불변 영역은 카밧에 의해 정의된 상응하는 잔기의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 동일한 경우 실질적으로 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역 각각으로부터 기원한다.
인간화된 항체는 흔히 마우스 항체로부터의 모두 6개의 CDR (바람직하게는 카밧에 의해 정의됨)을 편입한다고 해도, 이들은 또한 마우스 항체로부터의 모든 CDR 미만(예를 들면, 적어도 3, 4, 또는 5개의 CDR)로 제조할 수 있다(예를 들면, Pascalis 등, J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos 등, Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi 등, Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al, Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000).
일부 항체에서, CDR의 부분 만이, SDR로 명명된, 결합에 필요한 CDR 잔기의 서브셋이 인간화된 항체에서 결합을 보유하는데 필요하다. 항원과 접촉하지 않고 SDR내에서 존재하지 않는 CDR 잔기는 다음으로부터 확인될 수 있다: 이전의 연구를 기반으로(예를 들면, CDR H2내 잔기 H60-H65는 흔히 필요하지 않다), 쵸티아 초가변성 루프의 외부에 있는 카밧 CDR의 영역으로부터(Chothia, J. Mol. Biol. 196:901, 1987), 분자 모델링에 의해 및/또는 실험적으로, 또는 다음 문헌에 기재된 바와 같이: Gonzales 등, Mol. Immunol. 41: 863, 2004. 하나 이상의 공여체 CDR 잔기가 부재하거나 전체 공여체 CDR이 생략된 위치에서의 이러한 인간화된 항체에서, 상기 위치를 점거하는 아미노산은 수용체 항체 서열내 상응하는 위치(카밧 넘버링에 의함)를 점거하는 아미노산일 수 있다. CDR내 공여체 아미노산에 대한 수용체의 이러한 치환의 수는 경쟁하는 고려사항들의 밸런스를 반영한다. 이러한 치환은 인간화된 항체내 마우스 아미노산의 수를 감소시키고 결과적으로 잠재적인 면역원성을 감소시키는데 있어 잠재적으로 유리하다. 그러나, 치환은 또한 친화성의 변화를 유발할 수 있으며, 친화성에 있어서 유의미한 감소는 바람직하게는 피해진다. CDR내 치환 위치 및 치환하기 위한 아미노산은 또한 실험적으로 선택될 수 있다.
인간 수용체 항체 서열은 하기 사이에서 많은 공지된 인간 항체 서열중으로부터 임의로 선택되어 고도의 서열 동일성을 제공할 수 있다(예를 들면, 65-85% 동일성): 인간 수용체 서열 가변 영역 프레임워크 및 공여체 항체 사슬의 상응하는 가변 영역 프레임워크 사이.
중쇄에 대한 수용체 서열의 예는 NCBI 수탁 코드 ACF36857.1 및 BAC01530.1(각각 서열식별번호: 51 및 52)를 지닌 인간 성숙한 중쇄 가변 영역이다. ACF36857.1 및 BAC01530.1의 다른 버전은 각각 서열식별번호: 96 및 97이다. 이들 수용체 서열은 마우스 15F7 중쇄와 동일한 표준 형태를 갖는 2개의 CDR을 포함한다. 경쇄에 대한 수용체 서열의 예는 NCBI 수탁 코드 AAY33350.1 및 BAC01583.1(각각 서열식별번호: 53 및 54)을 지닌 인간 성숙한 경쇄 가변 영역이다. BAC01583.1의 또 다른 버전은 서열식별번호: 98이다. 이들 수용체 서열은 마우스 15F7 경쇄와 동일한 표준 형태를 갖는 3개의 CDR을 포함한다.
인간 가변 영역 프레임워크 잔기로부터의 어떤 아미노산도 CDR 형태에 있어서 그것의 가능한 영향 및/또는 항원에 대한 결합을 기반으로 치환을 위해 선택될 수 있다. 이러한 가능한 영향의 조사는 모델링, 특정한 위치에서 아미노산의 특성의 시험, 또는 특정한 아미노산의 치환 또는 돌연변이유발의 효과의 경험적 관찰에 의한다.
예를 들면, 아미노산이 쥣과 가변 영역 프레임워크 잔기와 선택된 인간 가변 영역 프레임워크 잔기 사이에서 상이한 경우, 인간 프레임워크 아미노산은, 아미노산이 다음과 같은 것으로 상당히 기대되는 경우 마우스 항체로부터의 동일한 프레임워크 아미노산에 의해 치환될 수 있다:
(1) 직접적으로 항원에 비공유적으로 결합한다,
(2) 쵸티아에 의해 정의되나 카밧에 의해서는 정의되지 않은 CDR 영역에 인접하거나 CDR 내에 있다,
(3) 기타의 경우 CDR 영역(예를 들면, CDR 영역의 약 6 Å 이내이다), (예를 들면, 상동성 공지된 면역글로불린 사슬의 해결된 구조에서 경쇄 또는 중쇄를 모델링함으로써 확인됨)과 상호작용한다, 또는
(4) VL-VH 인터페이스에서 관여하는 잔기이다.
Queen, US 5,530,101에 의해 정의된 클래스 (1) 내지 (3)으로부터의 프레임워크 잔기는 때때로 대안적으로 표준적 및 베르니어(vernier) 잔기로 불린다. CDR 루프의 형태를 정의하는데 도움을 주는 프레임워크 잔기는 때때로 표준적 잔기로 불린다(Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Thornton & Martin, J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). 항원-결합 루프 형태를 지지하고 항체 대 항원의 피트(fit)를 미세하게-조율하는데 역할을 담당하는 프레임워크 잔기는 때때로 베르니어 잔기로 불린다(Foote & Winter, J. Mol. Viol 224:487-499 (1992)).
치환을 위한 후보자인 다른 프레임워크 잔기는 잠재적인 당화 부위를 생성하는 잔기이다. 치환을 위한 또 다른 후보자는 그러한 위치에서 인간 면역글로불린에 대해 흔치않은 수용체 인간 프레임워크 아미노산이다. 이들 아미노산은 마우스 공여체 항체의 동일한 위치로부터 또는 더욱 전형적인 인간 면역글로불린의 동일한 위치로부터의 아미노산으로 치환될 수 있다.
예시적인 인간화된 항체는, Hu15F7로 지정된, 마우스 15F7 항체의 인간화된 형태이다. 마우스 항체는 각각 서열식별번호: 16 및 서열식별번호: 17을 포함하는 아미노산 서열을 갖는 성숙한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명은 2개의 예시된 인간화된 성숙한 중쇄 가변 영역을 제공한다: Hu15F7VHv1 (H1; 서열식별번호: 57) 및 Hu15F7VHv2 (H2; 서열식별번호: 58). 본 발명은 추가로, 2개의 예시된 인간 성숙한 경쇄 가변 영역을 제공한다: Hu15F7VLv1 (L1; 서열식별번호: 59) 및 Hu15F7VLv2 (L2; 서열식별번호: 60).
항원에 대한 CDR 형태 및/또는 결합에 있어서 가능한 영향, 중쇄와 경쇄 사이의 매개하는 상호작용, 불변 영역과의 상호작용, 원하는 또는 원하지 않는 번역후 변형을 위한 부위가 되는 것, 인간 가변 영역 서열내 그것의 위치에 대해 흔치않은 잔기 및 따라서 잠재적으로 면역원성이 되는 것, 잠재적으로 응집되는 것, 및 다른 이유와 같은 이유로, 하기 20개의 가변 영역 프레임워크 위치는 실시예에서 추가로 명시된 바와 같이, 2개의 예시된 인간 성숙한 경쇄 가변 영역 및 2개의 예시된 인간 성숙한 중쇄 가변 영역에서 치환을 위한 후보자로서 고려되었다: L8 (P8S), L42 (K42N), L45 (K45R), L49 (Y49S), L69 (T69K), L80 (P80T), H1 (Q1E), H20 (V20L), H27 (G27Y), H30 (S30T), H38 (R38K), H40 (A40R), H41 (P41A), H48 (M48I), H66 (R66K), H67 (V67A), H69 (I69L), H75 (T75S), H82A (S(82A)R), 및 H91 (Y91F). 또한, L104 (L104V)는 2개의 예시된 인간 성숙한 경쇄 가변 영역에서 치환을 위한 후보자로서 고려되었다.
여기서, 다른 곳에서와 같이, 첫 번째 언급된 잔기는 그래프팅 카밧 CDR에 의해 인간 수용체 프레임워크내로 형성된 인간화된 항체의 잔기이며, 두 번째 언급된 잔기는 이러한 잔기를 대체하기 위한 것으로 고려되는 잔기이다. 따라서, 가변 영역 프레임워크내에서, 첫 번째 언급된 잔기는 인간이고, CDR내에서, 첫 번째 언급된 잔기는 마우스이다.
예시된 항체는 예시된 성숙한 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 임의의 순열 또는 조합을 포함한다(예를 들면, VHv1/VLv1 또는 H1L1, VHv1/VLv2 또는 H1L2, VHv2/VLv1 또는 H2L1, 및 VHv2/VLv2 또는 H2L2). 예를 들면, 아래에 기재된 바와 같이, 14개의 중쇄 복귀돌연변이 또는 다른 돌연변이 및 6개의 경쇄 복귀돌연변이를 포함하는 H1L1 항체는 라미닌 α4에 결합하여 키메라성 19C12 항체에 대해 우수하지 않은 경우와 같이 실질적으로 동일한 수준에서 라미닌 α4에 대한 MCAM 결합을 저해한다(참고: 도 8-10). 비교할만한 결과는 H1L2, H2L1, 및 H2L2 항체로 보여진다(참고: 도 8-10).
본 발명은 H1L1 인간화된 15F7 항체의 변종을 제공하며, 여기서 인간화된 성숙한 중쇄 가변 영역은 H1(서열식별번호: 57)에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 나타내고 인간화된 성숙한 경쇄 가변 영역은 L1 (서열식별번호: 59)에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 나타낸다. 일부 이러한 항체에서, H1L1내 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 모든 20개의 복귀돌연변이 또는 다른 돌연변이는 유지된다. 본 발명 또한 H2L1 인간화된 15F7 항체의 변종을 제공하며, 여기서 인간화된 성숙한 중쇄 가변 영역은 H2(서열식별번호: 58)에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 나타내고 인간화된 성숙한 경쇄 가변 영역은 L1(서열식별번호: 59)에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일성을 나타낸다. 일부 이러한 항체에서, H2L1내 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 모든 18개의 복귀돌연변이 또는 다른 돌연변이가 유지된다. 일부 항체에서, Vh 영역내 위치 H1, H20, H27, H30, H38, H40, H48, H66, H67, H75, H82A, 및 H91 중 적어도 하나는 E, L, Y, T, K, R, I, K, A, S, R, 및 F 각각에 의해 점거된다. 일부 항체에서, Vh 영역내 위치 H1, H20, H27, H30, H38, H40, H48, H66, H67, H75, H82A, 및 H91은 예컨대 버전 H2에서 E, L, Y, T, K, R, I, K, A, S, R, 및 F 각각에 의해 점거된다. 일부 항체, Vh 영역내 위치 H41 및 H69 중 적어도 하나는 A 및 L 각각에 의해 점거된다. 일부 항체, Vh 영역내 위치 H41 및 H69는 예컨대, 버전 H1에서 A 및 L 각각에 의해 점거된다. 일부 항체에서, Vk 영역내 위치 L42, L49, 및 L69 중 적어도 하나는 N, S, 및 K 각각에 의해 점거된다. 일부 항체에서, Vk 영역내 위치 L42, L49, 및 L69는 예컨대 버전 L2에서 N, S, 및 K 각각에 의해 점거된다. 일부 항체에서, Vk 영역내 위치 L8, L45, 및 L80 중 적어도 하나는 S, R, 및 T 각각에 의해 점거된다. 일부 항체에서, Vk 영역내 위치 L8, L45, L80, 및 L104 중 적어도 하나는 S, R, T, 및 V 각각에 의해 점거된다. 일부 항체에서, Vk 영역내 위치 L8, L45, 및 L80은, 예컨대 버전 L1에서 S, R, 및 T 각각에 의해 점거된다. 일부 항체에서, L104는, 예컨대 버전 L2에서 V에 의해 점거된다. 이러한 인간화된 항체의 CDR 영역은 H1L1의 CDR 영역과 동일할 수 있거나 실질적으로 동일할 수 있으며, 이는 마우스 공여체 항체의 것들과 동일하다. CDR 영역은 임의의 종래의 정의로 정의될 수 있으나(예를 들면, 쵸티아) 바람직하게는 카밧에 의해 정의된다.
본 발명은 또한 다른 예시된 Hu15F7 항체의 변종을 제공한다. 이러한 변종은 예시된 인간화된 15F7 H1L2, H2L1, 또는 H2L2 항체의 성숙한 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 대해 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 성숙한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 갖는다. 이러한 인간화된 항체의 CDR 영역은 마우스 공여체 항체의 것들과 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있다. CDR 영역은 임의의 종래의 정의로 정의될 수 있으나(예를 들면, 쵸티아) 바람직하게는 카밧에 의해 정의된다. 가변 영역 프레임워크 위치는 다르게 언급되지 않으면 카밧 넘버링에 따른다. 다른 이러한 변종은 작은 수(예를 들면, 전형적으로 1, 2, 3, 5, 10, 또는 15개 이하)의 대체, 결실 또는 삽입에 의해 예시된 Hu15F7 항체의 서열과는 전형적으로 상이하다. 이러한 차이는 프레임워크내에서 일반적이지만 또한 CDR내에서 발생할 수 있다.
인간화된 15F7 변종내에서 추가의 변화에 대한 가능성은 가변 영역 프레임워크내 추가의 복귀돌연변이이다. 인간화된 mAb내에서 CDR과 접촉하지 않는 많은 프레임워크 잔기는 공여체 마우스 mAb 또는 다른 마우스 또는 인간 항체의 상응하는 위치로부터의 아미노산의 치환을 수용할 수 있으며, 심지어 많은 잠재적인 CDR-접촉 잔기가 또한 치환에 대해 잘 받아들여진다. 심지어 CDR내 아미노산은 예를 들면, 가변 영역 프레임워크를 제공하기 위해 사용된 인간 수용체 서열의 상응하는 위치에서 발견된 잔기로 변경될 수 있다. 또한, 대체 인간 수용체 서열은 예를 들면, 중쇄 및/또는 경쇄에 사용될 수 있다. 상이한 수용체 서열이 사용되는 경우, 상응하는 공여체 및 수용체 잔기가 복귀돌연변이없이도 이미 동일하므로 상기 권고된 복귀돌연변이 중 하나 이상은 수행될 수 없다.
바람직하게는, Hu15F7내 대체 또는 복귀돌연변이(보존적이거나 보존적이지 않다고 해도)는 인간화된 mAb의 결합 친화도 또는 효력, 즉, 라미닌 α4 또는 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 결합하는 그것의 능력에 있어 실질적인 효과는 없다(예를 들면, 변종 인간화된 15F7 항체의 본 실시예에 기재된 검정중 일부 또는 모두에 있어서의 효력은 쥣과 15F7 또는 H1L1의 것과 같이, 즉, 실험적인 오차내에서 본질적으로 동일하다).
D. 키메라성 및 베니어드 항체
본 발명은 추가로, 비-인간 항체, 특히 실시예의 15F7, 6C12, 또는 13G10 항체의 키메라성 및 베니어드 형태를 제공한다.
키메라성 항체는, 비-인간 항체(예를 들면, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 성숙한 가변 영역이 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 조합된 항체이다. 이러한 항체는 실질적으로 또는 전적으로 마우스 항체의 결합 특이성을 보유하며, 인간 서열의 약 3분의 2이다.
베니어드 항체는 인간화된 항체의 유형이며, 이는 CDR의 일부 및 보통 모두 및 비-인간 항체의 비-인간 가변 영역 프레임워크 잔기의 일부를 보유하지만, B- 또는 T-세포 에피토프에 기여할 수 있는 다른 가변 영역 프레임워크 잔기, 예를 들면 노출된 잔기(Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991)는 인간 항체 서열의 상응하는 위치로부터의 잔기로 대체되어 있다. 결과는, CDR이 비-인간 항체로부터 전적으로 또는 실질적으로 기원하고 비-인간 항체의 가변 영역 프레임워크가 치환체에 의해 보다. 인간-유사하게 된 항체이다. 15F7 항체의 베니어드 형태는 본 발명에 포함된다.
E. 인간 항체
라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 대한 인간 항체는 하기 기재된 다양한 기술에 의해 제공된다. 일부 인간 항체는 경쟁적 결합 실험에 의해, 상기 윈터(Winter)의 파아지 디스플레이 방법에 의해 선택되거나, 달리는, 특정한 마우스 항체, 예컨대 실시예에 기재된 마우스 단클론성 항체 중 하나와 동일한 동일한 에피토프 특이성를 가지도록 선택된다. 인간 항체는 또한 표적 항원으로서, 라미닌 α4의 단편, 예컨대, G 도메인의 LG4-5 모듈 만을 함유하는 라미닌 α4 변종만을 사용하여, 및/또는 변종, 예컨대 G 도메인의 LG1-3 모듈, G 도메인의 LG1-5 모듈, 및 G 도메인의 LG4-5 모듈을 함유하는 라미닌 α4 변종의 수집에 대한 스크리닝 항체에 의해 특정한 에피토프 특이성에 대해 스크리닝될 수 있다.
인간 항체를 생산하는 방법은 다음의 방법을 포함한다: 트리오마 방법(trioma method)(Oestberg 등, Hybridoma 2:361-367 (1983); Oestberg, 미국 특허 번호 4,634,664; 및 Engleman 등, 미국 특허 4,634,666), 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 유전자이식 마우스의 사용(참고: 예를 들면, Lonberg 등, WO93/12227 (1993); US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991)) 및 파아지 디스플레이 방법(참고: 예를 들면, Dower 등, WO 91/17271 및 McCafferty 등, WO 92/01047, US 5,877,218, US 5,871,907, US 5,858,657, US 5,837,242, US 5,733,743 및 US 5,565,332).
F. 불변 영역의 선택
키메라성, 인간화된(베니어드 포함), 또는 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 인간 불변 영역의 적어도 한 부분에 연결될 수 있다. 불변 영역의 선택은, 부분적으로, 항체-의존적 보체 및/또는 세포성 매개된 세포독성이 요구되는지의 여부에 의존한다. 예를 들면, 인간 아이소타입 IgG1 및 IgG3는 보체-매개된 세포독성을 가지고 있고 인간 아이소타입 IgG2 및 IgG4는 그렇지 않다. 인간 IgG1 및 IgG3 또한 인간 IgG2 및 IgG4보다. 더 강력한 세포 매개된 효과기 작용을 포함한다. 항체에서 봉입체에 적합한 인간 IgG1 불변 영역은 서열식별번호: 61의 서열을 가질 수 있다. 서열식별번호: 61의 C-말단 라이신은 생략될 수 있으며, 이 경우에, IgG1 불변 영역은 서열식별번호: 91의 아미노산 서열을 갖는다. 경쇄 불변 영역은 람다. 또는 카파일 수 있다. 항체내 봉입체에 적합한 인간 카파 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 90의 서열을 가질 수 있다. 서열식별번호: 90은 서열식별번호: 93의 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 서열식별번호: 90의 N-말단 아르기닌은 생략될 수 있으며, 이 경우에, 카파 경쇄 불변 영역은 서열식별번호: 62의 아미노산 서열을 갖는다. 서열식별번호: 62는 서열식별번호: 102의 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 항체는 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 함유하는 사량체로서, 별도의 중쇄, 경쇄로서, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv로서, 또는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인이 스페이서를 통해 연결된 단일 사슬 항체로서 표현될 수 있다.
인간 불변 영역은 상이한 개인 사이의 동형이인자형 변화 및 이소동형이인자형 변화를 나타내는데, 즉, 불변 영역은 상이한 개인내 하나 이상의 다형성 위치에서 상이할 수 있다. 동종동질이형체는, 동종동질이형체를 인식하는 혈청이 하나 이상의 다른 아이소타입의 비-다형성 영역에 결합한다는 점에서 동종이인자형과 상이하다. 따라서, 예를 들면, 또 다른 중쇄 불변 영역은 IgG1 G1m3 동종이인자형이며 서열식별번호: 89의 아미노산 서열을 갖는다. 서열식별번호: 89는 서열식별번호: 92의 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. IgG1 G1m3 동종이인자형의 또 다른 중쇄 불변 영역은 서열식별번호: 101의 아미노산 서열을 갖는다. 인간 불변 영역에 대한 참조는 임의의 천연 동종이인자형 또는 천연 동종이인자형내 다형성 위치를 점거하는 잔기의 임의의 순열을 지닌 불변 영역을 포함한다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카복시 말단에서 한개 또는 몇 개의 아미노산, 예컨대 중쇄의 C-말단 라이신은 분자의 부분 또는 모두에서 누락될 수 있거나 유도될 수 있다. 치환은 불변 영역내에서 이루어져 효과기 기능, 예컨대 보체-매개된 세포독성 또는 ADCC를 감소시키거나 증가시킬 수 있거나(참고, 예를 들면, Winter 등, 미국 특허 번호 5,624,821; Tso 등, 미국 특허 번호 5,834,597; 및 Lazar 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), 또는 인간에서 반감기를 연장시킬 수 있다. (참고: 예를 들면, Hinton 등, J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). 예시적인 치환은 항체의 반감기를 증가시키기 위한 위치 250에서 Gln 및/또는 위치 428에서 Leu(EU 넘버링)를 포함한다. 임의의 위치 234, 235, 236 및/또는 237에서 치환은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 수용체에 대한 친화성을 감소시킨다(참고, 예를 들면, 미국 6,624,821). 인간 IgG1의 위치 234, 235, 및 237에서 알라닌 치환은 효과기 작용을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 임의로, 인간 IgG2에서 위치 234, 236 및/또는 237은 알라닌으로 및 위치 235는 글루타민으로 치환된다. 참고, 예를 들면, 미국 5,624,821. 일부 항체에서, 인간 IgG1의 EU 넘버링에 의한 위치 241, 264, 265, 270, 296, 297, 322, 329, 및 331 중 하나 이상에서 돌연변이가 사용된다. 일부 항체에서, 인간 IgG1의 EU 넘버링에 의한 하나 이상의 위치 318, 320, 및 322에서 돌연변이가 사용된다. 일부 항체에서, 위치 234 및/또는 235는 알라닌으로 치환되고/되거나 위치 329는 글리신으로 치환된다. 일부 항체에서, 위치 234 및 235는, 예컨대, 서열식별번호: 101에서와 같이, 알라닌으로 치환된다. 일부 항체에서, 아이소타입은 인간 IgG2 또는 IgG4이다.
G. 재조합 항체의 발현
항체-발현 세포주 (예를 들면, 하이브리도마)를 사용하여 키메라성 및 인간화된 항체를 생산하기 위한 수많은 방법이 공지되어 있다. 예를 들면, 항체의 면역글로불린 가변 영역은 잘 알려진 방법을 사용하여 클로닝하고 서열분석할 수 있다. 한 가지 방법에서, 중쇄 가변 VH 영역은 하이브리도마 세포로부터 제조된 mRNA를 사용하여 RT-PCR에 의해 클로닝된다. 공통 프라이머는 5' 프라이머 및 g2b 불변 영역 특이적인 3' 프라이머로서 번역 개시 코돈을 포함하는 VH 영역 리더 펩타이드에 대해 이용된다. 예시적인 프라이머는 Schenk 등에 의한 미국 특허 공개공보 US 2005/0009150에 기술되어 있다. (이하에서 “Schenk”). 다수의, 독립적으로 유도된 클론으로부터의 서열을 비교하여 증폭 동안 변화가 도입되지 않도록 보증할 수 있다. VH 영역의 서열은 또한 5' RACE RT-PCR 방법론 및 3' g2b 특이적인 프라이머에 의해 수득된 VH 단편을 서열분석함으로써 결정되거나 확인될 수 있다.
경쇄 가변 VL 영역은 유사한 방식으로 클로닝될 수 있다. 하나의 접근법에서, 공통 프라이머 세트는 번역 개시 코돈을 포함하는 VL 영역에 하이브리드화하도록 설계된 5' 프라이머 및 V-J 결합 영역의 Ck 영역 다운스트림에 대해 특이적인 3' 프라이머를 사용하여 VL 영역을 증폭시키기 위해 설계된다. 제2 접근법에서는, 5'RACE RT-PCR 방법론을 이용하여 VL 암호화 cDNA를 클로닝한다. 예시적인 프라이머는 상기 Schenk에 기재되어 있다. 이후에, 클로닝된 서열을 인간(또는 다른 비-인간 종) 불변 영역을 암호화하는 서열과 합한다. 인간 불변 영역을 암호화하는 예시적인 서열은 인간 IgG1 불변 영역을 암호화하는 서열식별번호: 61, 및 인간 카파 경쇄 불변 영역을 암호화하는 서열식별번호: 62를 포함한다.
하나의 접근법에서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 각각의 VDJ 또는 VJ 접합의 하부의 스플라이스 공여체 서열을 암호화하도록 재-조작되어 포유동물 발현 벡터, 예컨대, 중쇄의 경우 pCMV-h1 및 경쇄의 경우 pCMV-Mcl내로 클로닝된다. 이들 벡터는 삽입된 가변 영역 카세트 하부의 엑손 단편으로서 인간 1 및 Ck 불변 영역을 암호화한다. 서열 입증에 이어서, 중쇄 및 경쇄 발현 벡터는 CHO 세포내로 동시-형질감염되어 키메라성 항체를 생산한다. 조정된 배지는 형질감염 후 48 시간째에 수집되어 항체 생산에 대해 웨스턴 블랏 분석으로 또는 항원 결합에 대해 ELISA로 분석된다. 키메라성 항체는 상기에서 기재된 바와 같이 인간화된다.
키메라성, 베니어드, 인간화된, 및 인간 항체는 재조합 발현에 의해 전형적으로 생산된다. 재조합 폴리뉴클레오타이드 작제물은 천연적으로 관련된 또는 이종성 발현 조절 요소, 예컨대, 프로모터를 포함하는 항체 사슬의 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 조절 서열을 전형적으로 포함한다. 발현 조절 서열은 진핵 또는 원핵 호스트 세포를 형질전환 또는 형질 감염시킬 수 있는 벡터내의 프로모터 시스템일 수 있다. 벡터가 적절한 호스트내로 편입되면, 호스트는 뉴클레오타이드 서열의 높은 수준의 발현 및 교차반응하는 항체의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에서 유지된다.
이들 발현 벡터는 에피솜으로서 또는 호스트 염색체 DNA의 일체부로서 호스트 유기체내에서 전형적으로 복제가능하다. 통상적으로, 발현 벡터는 선택 마커, 예를 들면, 암피실린 내성 또는 하이그로마이신 내성을 함유함으로써, 원하는 DNA 서열로 형질전환된 이들 세포의 검출을 허용한다.
E. 콜리 는 항체, 특히 항체 단편을 발현시키는데 유용한 하나의 원핵 호스트다. 미생물, 예컨대 효모도 또한 발현에 유용하다. 사카로마이세스 는, 요구되는 것으로서, 발현 조절 서열, 복제 기점, 종결 서열 등을 갖는 적합한 벡터를 지닌 효모 호스트다. 전형적인 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 다른 당분해 효소를 포함한다. 유도성 효모 프로모터는, 특히, 알코올 탈수소효소, 이소사이토크롬 C, 및 말토오스 및 갈락토오스 이용에 관여하는 효소로부터의 프로모터를 포함한다.
포유동물 세포는 면역글로불린 또는 그것의 단편을 암호화하는 뉴클레오타이드 세그먼트를 발현하는데 사용될 수 있다. 참고: Winnacker, From Genes to Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). 온전한 이종성 단백질을 분비할 수 있는 수많은 적합한 호스트 세포주가 개발되어 왔으며, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, HEK293 세포, L 세포, 및 Sp2/0 및 NS0을 포함하는 비-항체-생산 골수종을 포함한다. 세포는 비인간일 수 있다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 다음을 포함할 수 있다: 발현 조절 서열, 예컨대, 복제 기점, 프로모터, 인핸서(Queen 등, Immunol. Rev. 89:49 (1986)), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열. 발현 조절 서열은 내인성 유전자, 사이토메갈로바이러스, SV40, 아데노바이러스, 소 파필로마바이러스 등으로부터 유도된 프로모터를 포함할 수 있다. 참고: Co 등, J. Immunol. 148:1149 (1992).
대안적으로, 항체 코딩 서열은 트랜스제닉 동물의 게놈내로의 도입 및 트랜스제닉 동물의 밀크 속에서 차후의 발현을 위해 이식유전자내에 편입될 수 있다. (참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,741,957, 미국 특허 번호 5,304,489, U.S. 특허 번호 5,849,992). 적합한 이식유전자는 유선 특이 유전자, 예컨대 카세인 또는 베타 락토 글로불린으로부터의 프로모터 및 인핸서와 작동 가능하게 연결된 경쇄 및/또는 중쇄에 대한 코딩 서열을 포함한다.
목적한 DNA 세그먼트를 함유하는 벡터는 세포 호스트의 유형에 따른 방법에 의해 호스트 세포내로 이동될 수 있다. 예를 들면, 염화칼슘 형질감염은 원핵 세포에 통상적으로 이용되는 반면, 칼슘 포스페이트 처리, 전기천공, 리포펙션, 바이오리스틱, 또는 바이러스-기반 형질감염은 다른 세포성 호스트에 사용될 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환하는데 사용된 다른 방법은 폴리브렌, 원형질 융합, 리포좀, 전기천공, 및 미세주입의 사용을 포함한다. 트랜스제닉 동물의 생산을 위해, 이식유전자를 수정된 난모 세포내로 미세 주사하거나 또는 배아 줄기 세포의 게놈, 및 제핵된 난모세포내로 이동된 이러한 세포의 핵내로 편입시킬 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 벡터(들)가 세포 배양물내로 도입되면, 세포 풀(cell pool)을 무혈청 배지 속에서 성장 생산성 및 생성물 품질에 대해 스크리닝할 수 있다. 이후에, 최고-생산 세포 풀을 FACS-기반 단일-세포 클로닝에 적용시켜 단클론성 라인을 생성한다. 7.5 g/L의 배양물보다. 더 큰 생산물 역가에 상응하는, 세포 / 1일당 50 pg 또는 100 pg 초과의 특이적인 생산성이 사용될 수 있다. 단일 세포 클론에 의해 생산된 항체를 또한 탁도, 여과 특성, PAGE, IEF, UV 스캔, HP-SEC, 탄수화물-올리고당 맵핑, 질량 분광분석법, 및 결합 검정, 예컨대 ELISA 또는 비아코어(Biacore)에 대해 시험할 수 있다. 이후에, 선택된 클론을 다중 바이알 속에 저장하고 차후 사용을 위해 냉동하여 보관한다.
일단 발현되면, 항체는 단백질 A 포착, HPLC 정제, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등 (참고: 일반적으로, Scopes, 단백질 정제 (Springer-Verlag, NY, 1982))을 포함하는, 당해 분야의 표준 절차에 따라 정제할 수 있다.
코돈 최적화, 프로모터의 선택, 전사 요소의 선택, 종결자의 선택, 무혈청 단일 세포 클로닝, 세포 뱅킹(banking), 복제수의 증폭을 위한 선택 마커의 사용, CHO 종결자, 또는 단백질 역가의 향상을 포함하는, 항체의 상업적 생산을 위한 방법론도 이용될 수 있다. (참고, 예를 들면, US 5,786,464, US 6,114,148, US 6,063,598, US 7,569,339, W02004/050884, W02008/012142, W02008/012142, W02005/019442, W02008/107388, 및 W02009/027471, 및 US 5,888,809).
H. 핵산
본 발명은 추가로, 상기 기재된 임의의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산을 제공한다(예를 들면, 서열식별번호: 63-64, 67-68, 71-73, 및 77-80). 서열식별번호: 92-93, 99-100, 및 102는 상기 기재된 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산의 추가의 예이다. 전형적으로, 핵산은 또한 성숙한 중쇄 및 경쇄에 융합된 신호 펩타이드(예를 들면, 서열식별번호: 65, 69, 74, 및 75 각각 (중쇄) 및 66, 70, 및 76 각각 (경쇄)에 의해 인코딩될 수 있는 서열식별번호: 18, 28, 39, 및 40 (중쇄) 및 19, 29, 및 41 (경쇄)의 아미노산 서열을 갖는 신호 펩타이드)를 인코딩한다. 핵산의 코딩 서열은 코딩 서열, 예컨대, 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 전사 종료 신호 등의 발현을 보증하는 조절 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산은 단리된 형태로발생할 수 있거나 하나 이상의 벡터내로 클로닝될 수 있다. 핵산은 예를 들면, 중첩 올리고뉴클레오타이드의 고체 상태 합성 또는 PCR에 의해 합성될 수 있다. 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산은 하나의 인접 핵산으로서, 예를 들면, 발현 벡터내에서 연결되거나, 분리될 수 있는데, 예를 들면, 그것 자체의 발현 벡터내로 각각 클로닝될 수 있다.
I. 접합된 항체
항원, 예컨대 암 및 종양에 우선적으로 존재하는, 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 특이적으로 결합하는 항체는 파괴를 위해 암 또는 종양 세포를 표적화하는데 유용하다. 마찬가지로, 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 특이적으로 결합하는 항체는 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈의 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개된 자가면역 질환 또는 임의의 다른 질환에 관여된 세포를 표적화하는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 이러한 항체는 다른 치료적 또는 세포독성 약물과 접합될 수 있다. 참고: WO 03/057838. 마찬가지로, 이러한 항체는 다른 단백질, 다른 항체, 및/또는 검출가능한 표지와 접합될 수 있다. 참고: WO 03/057838; US 8,455,622. 이러한 치료제는 환자에서 원치않는 상태 또는 질환을 치료하거나, 완치시키거나, 완화시키거나, 예방하거나, 향상시키는데 사용될 수 있는 임의의 제제일 수 있다. 이러한 상태 또는 질환의 예는 암 및 자가면역 질환을 포함한다. 치료제는 세포독성 약물, 세포증식억제제, 방사선요법 제제, 면역조절물질, 또는 항체의 활성을 촉진하거나 향상시키는 임의의 생물학적 활성 제제를 포함한다. 이러한 세포독성 약물은 세포에 대해 독성인 임의의 제제일 수 있다. 세포증식억제제는 세포 증식을 억제하는 임의의 제제일 수 있다. 면역조절물질은 면역적 반응의 발달 또는 유지를 자극하거나 억제하는 임의의 제제일 수 있다. 방사선요법 제제는 방사선을 방출하는 임의의 분자 또는 화합물일 수 있다. 이러한 치료적 또는 세포독성 약물은 종양 특이적 항체, 예컨대, 본원에 기재된 항체에 커플링되며, 커플링된 치료적 또는 세포독성 약물은 정상 세포보다. 종양 세포 또는 암 세포에 대해 특이적인 친화성을 가질 것이다. 마찬가지로, 커플링된 치료적 또는 세포독성 약물은 다른 세포보다. 라미닌- α4-발현 세포에 대해 특이적인 친화성을 가질 것이다. 결과적으로, 접합된 항체의 투여는 주변의 정상적인, 건강한 조직을 최소 손상시키면서 암 세포를 직접적으로 표적화한다. 이것은 너무 독성이어서 자체로 투여될 수 없는 치료적 또는 세포독성 약물에 특히 유용할 수 있다. 또한, 더 작은 양의 치료적 또는 세포독성 약물이 사용될 수 있다.
항체는 면역독소로서 작용하도록 개질될 수 있다. 참고, 예를 들면, 미국 특허 번호 5,194,594. 예를 들면, 식물로부터 유도된 세포성 독소인, 리신은 항체용 이작용성 시약 S-아세틸머캅토석신성 무수물 및 리신용 석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트를 사용함으로써 항체에 커플링시킬 수 있다. 참고: Pietersz 등, Cancer Res. 48(16):4469-4476 (1998). 커플링은 리신의 A-사슬의 잠재적인 독성 또는 항체의 활성을 손상시키지 않으면서, 리신의 B-사슬 결합 활성의 손실을 초래한다. 유사하게, 사포린, 리보솜 어셈블리의 저해제는 화학적으로 삽입된 설프하이드릴 그룹 사이의 디설파이드 결합을 통해 항체에 커플링될 수 있다. 참고: Polito 등, Leukemia 18:1215-1222 (2004).
방사선동위원소, 예컨대, 예를 들면, 이트륨90 (90Y), 인듐111 (111In), 131I, 99mTc, 라디오실버-111, 라디오실버-199, 및 비스무트213 또한 항체에 연결될 수 있다. 항체에 대한 방사선동위원소의 연결은 종래의 이작용 킬레이트로 수행될 수 있다. 라디오실버-11 및 라디오실버-199 연결의 경우, 황-기반 링커가 사용될 수 있다. 참고: Hazra 등, Cell Biophys. 24-25:1-7 (1994). 은 방사선동위원소의 연결은 면역글로불린을 아스코르브산 산으로 환원시킴을 포함할 수 있다. 방사선동위원소, 예컨대 111In 및 90Y의 경우, 이브리투모맙 티욱세탄이 사용될 수 있으며 이러한 동위원소와 반응하여 각각 111In-이브리투모맙 티욱세탄 및 90Y-이브리투모맙 티욱세탄을 형성할 것이다. 참고: Witzig, Cancer Chemother. Pharmacol., 48 Suppl 1:S91-S95 (2001).
다른 치료제 또한 항체에 연결될 수 있다. 치료제는 보통 세포독성 또는 세포증식억제성이다. 예를 들면, 항체는 독성 화학치료 약물, 예컨대 메이탄신, 젤다나마이신, 튜불린 저해제, 예컨대 튜불린 결합제(예를 들면, 아우리스타틴), 또는 좁은 홈 결합제, 예컨대 칼리키아마이신으로 접합될 수 있다. 다른 대표적인 치료제는 암 또는 자가면역 질환 또는 암 또는 자가면역 질환의 증상의 치료, 관리, 또는 완화에 유용한 것으로 공지된 제제를 포함한다. 이러한 치료제의 예는 본원의 다른 곳에 개시되어 있다.
항체는 또한 다른 단백질과 커플링될 수 있다. 예를 들면, 항체는 파이노머와 커플링될 수 있다. 파이노머는 작은 결합 단백질이며(예를 들면, 7 kDa), 이는 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유도된다. 이들은 안정하고 가용성이며 시스테인 잔기 및 디설파이드 결합을 결여할 수 있다. 파이노머는 항체와 동일한 친화성 및 특이성을 지닌 표적 분자에 결합하도록 조작될 수 있다. 이들은 항체를 기반으로 하는 다중-특이적 융합 단백질을 생성하는데 적합하다. 예를 들면, 파이노머는 항체의 N-말단 및/또는 C-말단에 융합되어 상이한 구조를 지닌 바이- 및 트리 -특이적인 FynomAb를 생성할 수 있다. 파이노머는 FACS, Biacore를 사용하는 스크리닝 기술을 통한 파미노머 라이브러리, 및 최적의 특성을 지닌 파이노머의 효율적인 선택을 허용하는 세포 기반 검정을 사용하여 선택할 수 있다. 파이노머의 예는 하기에서 개시되어 있다: Grabulovski 등, J. Biol. Chem. 282:3196-3204 (2007); Bertschinger 등, Protein Eng. Des. Sel. 20:57-68 (2007); Schlatter 등, MAbs. 4:497-508 (2011); Banner 등, Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69(Pt6):1124-1137 (2013); 및 Brack 등, Mol. Cancer Ther. 13:2030-2039 (2014).
본원에 개시된 항체는 하나 이상의 다른 항체에 커플링되거나 접합될 수 있다(예를 들면, 항체 헤테로콘주게이트를 형성하기 위해). 이러한 다른 항체는 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈 내에서 상이한 에피토프에 결합할 수 있거나 상이한 표적 항원에 결합할 수 있다.
항체는 또한 검출가능한 표지와 커플링될 수 있다. 이러한 항체는 예를 들면, 암 또는 자가면역 질환을 진단하고/하거나, 암 또는 자가면역 질환의 진행을 모니터링하고/하거나, 치료의 효능을 평가하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 암 또는 자가면역 질환을 가지거나 이에 민감한 대상체, 또는 이러한 대상체로부터 수득된 적절한 생물학적 샘플 속에서 이러한 결정을 수행하는데 유용할 수 있다. 항체에 커플링되거나 연결될 수 있는 대표적인 검출가능한 표지는 다양한 효소, 예컨대 호스래디쉬 페록시다아제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라제; 보철 그룹, 예컨대 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴; 형광성 물질, 예컨대 엄벨리페론, 플루오레신, 플루오레신 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 단실 클로라이드 또는 파이코에리트린; 발광성 물질, 예컨대 루미놀; 생물발광 물질, 예컨대 루시퍼라아제, 루시페린, 및 에쿼린; 방사선활성 물질, 예컨대 라디오실버-111, 라디오실버-199, 비스무트213, 요오드 (131I, 125I, 123I, 121I,), 탄소 (14C), 황 (5S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115In, 113In, 112In, 111In,), 테크네튬 (99Tc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브데늄 (99Mo), 크세논 (133Xe), 불소 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 및 117주석; 다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용하는 양전자 발광 금속; 비방사성 상자성 금속 이온; 및 특이적인 방사선동위원소에 방사선표지되거나 접합된 분자를 포함한다.
치료제, 다른 단백질, 다른 항체, 및/또는 검출가능한 표지는, 당해기술에 공지된 기술을 사용하여 중간체 (예컨대, 링커)를 통해 쥣과, 키메라성, 베니어드, 또는 인간화된 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링 또는 접합시킬 수 있다. 참고 예컨대, Arnon 등, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 등 (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom 등, ""Antibodies For Drug Delivery," in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson 등 (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera 등 (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin 등 (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985); 및 Thorpe 등, Immunol. Rev., 62:119-58 (1982). 적합한 링커는, 예를 들면, 절단가능 및 비-절단가능 링커를 포함한다. 산성 또는 환원 조건하에서 또는 특이적인 프로테아제에 대한 노출 시 약물을 방출하는 상이한 링커가 이용될 수 있다. 마찬가지로, 산성 또는 환원 조건하에서, 특이적인 프로테아제에 대한 노출시, 또는 다른 정의된 조건 하에서 커플링된 치료제, 단백질, 항체, 및/또는 검출가능한 표지를 방출하는 상이한 링커가 이용될 수 있다.
V. 치료적 적용
상기 항체는 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈의 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개된 질병을 갖거나 질환의 위험을 갖는 환자에서 질환을 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다. 일부 이러한 질환에서, 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈은 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 예컨대 신데칸-1, 신데칸-2, 신데칸-3, 또는 신데칸-4의 상호작용에 의한 질환의 진행에 기여한다.
그와 같은 질환은 암일 수 있다. 치료되어야 할 예시적인 암은 상기 기재되어 왔다. 상기 방법은 검출가능한 수준의 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈을 나타내는 암의 치료(예를 들면, 개시된 항체 중의 하나를 사용한 면역검정에 의해)에 특히 개선될 수 있다. 일부 이러한 암은 동일한 유형의 암이 없는 조직과 비교하여 라미닌 α4의 증가된 발현을 나타낸다. 일부 이러한 암은 신경아교종 및 신경교 종양을 포함하는 라미닌 α4 발현과 관련된 것으로 보고된 것들이다. (참고, 예를 들면, Nagato 등, Int. J. Cancer 117:41-50 (2005); Ljubimova 등, Cancer 101(3):604-612 (2004)), 간세포 암종(참고, 예를 들면, Huang 등, J Cancer Res. Clin. Oncol. 134(6):705-14 (2008)), 신장 세포 암종(참고, 예를 들면, Vainionpaa 등, Lab Invest. 87(8):780-791 (2007)), 경구 편평세포 암종(참고, 예를 들면, Takkunen 등, Histochem. Cell Biol. 130(3):509-525 (2008)), 전립샘 암(참고, 예를 들면, Sprenger 등, Neoplasia 10(12):1350-1361 (2008)), 및 흑색종(참고, 예를 들면, Lugassy 등, J. Cutan. Pathol. 36(12):1237-1243 (2009)). 일부 이러한 암은 하나 이상의 신데칸의 발현과 관련된 것들, 예컨대 유방암, 자궁 자궁경부의 암, 결장직장암, 자궁내막 암, 섬유육종, 담낭암, 위암, 신경아교종, 두경부 암, 간세포 암종, 유년성 비인두 혈관섬유종, 폐암, 흑색종, 중피종, 골수종, 신경내분비 종양, 구강암, 경구 편평상피 세포 암종, 골육종, 난소암, 췌장암, 및 전립선암이다. 참고, 예를 들면, Theocharis 등, FEBS Journal 277:3904-3923 (2010). 상기 항체의 일부는 흑색종, 유방암, 폐암, 및 결장직장암의 치료에 유용하다. 일부 항체는 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막 암, 섬유육종, 담낭암, 위암, 신경아교종, 두경부 암, 간세포 암종, 유년성 비인두 혈관섬유종, 중피종, 골수종, 신경내분비, 종양, 구강암, 편평상피 세포 암종, 경구 편평상피 세포 암종, 골육종, 췌장암 및/또는 전립선암의 치료에 유용할 수 있다. 일부 항체는 전이성 종양을 치료하는데 유용할 수 있다. 일부 예에서, 환자는 뇌암 또는 또 다른 유형의 CNS 또는 두개내 종양을 갖는다. 예를 들면, 환자는 성상세포 종양 (예를 들면, 별아교세포종, 역형성 별아교세포종, 교모세포종, 모양세포성 별아교세포종, 뇌실막하 거대세포 별아교세포종, 다형성 황색별아교세포종), 희소돌기신경교 종양 (예를 들면, 희소돌기아교세포종, 역형성 희소돌기아교세포종), 뇌질피막 세포 종양 (예를 들면, 뇌실막세포종, 역형성 뇌실막세포종, 점액유두상 뇌실막세포종, 뇌실막밑세포종), 혼합된 신경아교종 (예를 들면, 혼합된 희소돌기별아교세포종, 역형성 희소돌기별아교세포종), 불확실한 기원의 신경상피 종양 (예를 들면, 극성 해면모세포종, 성상모세포종, 대뇌 교종증), 맥락막총의 종양(예를 들면, 맥락막총 유두종, 맥락막총 암종), 뉴런의 또는 혼합된 신경-아교세포 종양 (예를 들면, 신경절세포종, 소뇌의 이형성 신경절세포종, 신경절교종, 역형성 신경절교종, 결합조직형성 유아의 신경절종, 중추 신경세포종, 배엽부전성 신경상피 종양, 후각 신경교세포종), 송과체 실질 종양 (예를 들면, 송과체세포종, 송과체아세포종, 혼합된 송과체세포종/송과체아세포종), 또는 혼합된 신경모세포 또는 교모세포 요소를 지닌 종양(예를 들면, 수질상피종, 수모세포종, 신경교세포종, 망막모세포종, 상의모세포종)을 지닐 수 있다. 일부 항체는 다른 암을 치료하는데 유용할 수 있다.
그와 같은 질환은 자가면역 질환일 수 있다. 자가면역 질환은 전신 자가면역 질환, 기관- 또는 조직-특이적 자가면역 질환, 및 자가면역-유형 발현을 나타내는 질환을 포함한다. 이들 질환에서, 신체는 그것의 자체의 항원 중 하나에 대해 세포성 및/또는 체액성 면역 반응을 발달시켜 그러한 항원의 파괴 및 잠재적으로 심한 손상 및/또는 치명적 결과를 초래한다. 세포성 반응은 존재하는 경우, B-세포 또는 T-세포 또는 둘 모두일 수 있다. 인터루킨 (IL)-17 및 IL-22의 생산에 의해 특징화되는 계통 T 헬퍼 세포, TH17 세포는 조직내로 도입되어 인간에서 다발성 경화증 및 마우스에서 실험적인 자가면역 뇌척수염(EAE)을 포함하는, 병원성 자가면역 반응을 촉진하는 것으로 보고되어 있다. 참고, 예를 들면, Cua 등, Nature 421: 744-748 (2003); Ivonov 등, Cell 126: 1121-1133 (2006). TH17 세포는 조직에 대해 그것의 특이적인 동원 및 조직의 침윤에 의해 염증성 반응을 개시하거나 증식시킬 수 있다.
자가면역 질환의 예는 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 자가면역 다선상 증후군, 인슐린-의존적 진성 당뇨병 (1형 당뇨병), 인슐린-내성있는 진성 당뇨병 (2형 당뇨병), 면역-매개된 불임, 자가면역 애디슨병, 심상성 천포장, 천포창 폴리아세우스, 포진성 피부염, 자가면역 탈모증, 백반증, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 혈소판감소성 자반병, 자가면역 혈소판감소성 자반병, 악성 빈혈, 중증 근무력증, 길랑-바레 증후군, 강직인 증후군, 급성 류마티스성 열, 교감성 안염, 굿파스투어 증후군, 자가면역 포도막염, 일시적 동맥염, 베체트 질환, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 원발성 담도성 간경변증, 자가면역 간염, 자가면역 난소염, 섬유근육통, 다발성근염, 피부섬유근종, 강직 척추염, 다카야스(Takayashu) 동맥염, 지방층염, 유천포창, 미공지된 기원의 혈관염, 안카(anca) 음성 혈관염, 안카 양성 혈관염, 전신 홍반성 낭창, 건선성 관절염, 류마티스성 관절염, 경피증, 전신 괴사성 혈관염, 베게너 육아종증, CREST 증후군, 항인지질 증후군, 쇼그렌 증후군, 호산구 위장염, 비정형 국소 피부염, 심근병증, 후-감염성 증후군, 감염후 심내막염, 소아지방변증, 다발성 경화증, 유육종증, 및 건선을 포함한다.
기전의 이해가 실시에 필요하지 않지만, 하기 기전 중의 어느 것 또는 이의 모두가 암의 치료에 기여할 수 있는 것으로 여겨진다. 항체는 종양 세포 부착을 저해하거나, 라미닌- α4-매개된 신호전달 현상을 저해하거나, 라미닌 α4와 신데칸의 상호작용을 저해함으로써 암을 치료할 수 있다. 항체는 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈의 프로세싱 또는 청소능을 유도함으로써 추가로 또는 대안적으로 암을 치료할 수 있다. 항체는 추가로 또는 대안적으로 암 전이 또는 암 세포 침입을 억제할 수 있다. 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 대한 항체의 결합은 또한 암의 세포 증식, 성장, 세포사 저항, 혈관신생, 또는 다른 특성에 관여된 세포 부착, 신호전달 기전에 영향을 미칠 수 있다. 항체는 Akt 활성화 및 차후의 세포 생존/증식 신호전달을 저해함을 통해 종양 성장을 저해할 수 있다. 일부 예에서, 항체는 내피 Dll4/노치 신호전달을 변경함으로써 혈관신생을 저해하거나 파괴한다. 일부 경우에서, 항체에 의한 혈관신생의 파괴 또는 저해는 라미닌 α4와 인테그린, 예컨대 인테그린 α2, 인테그린 α6, 또는 인테그린 β1을 포함하는 인테그린 사이의 상호작용을 파괴함을 포함한다. 항체-약물 콘주게이트는 전형적으로 암 세포내로 흡수 후, 연결된 제제의 세포독성 또는 세포증식억제성 효과를 포함하는 추가의 작용 기전을 갖는다. 항체-약물 콘주게이트는 또한 다른 표적화된 세포내에서 이러한 작용 기전에 의해 작용할 수 있다. 항체-약물 콘주게이트는 또한 종양-관련된 대식세포 독성을 유도할 수 있다.
본 발명의 항체에 의해 치료가능한 다른 질환은 비만 및 비만-관련된 질환, 예컨대 비만-관련된 오르판(orphan) 질환을 포함한다. 비만은 과도한 음식 에너지 섭취, 신체 활동의 결여, 및/또는 유전적 감수성에 의해 야기된 질환이다. 체질량 지수(BMI) > 35는 중증 비만을 나타내고, BMI > 40은 병적 비만을 나타내며, BMI > 45는 고도 비만을 나타낸다. 비만-관련된 질환은 비만과 관련된, 비만에 의해 야기된, 또는 비만으로부터 초래된 질환 및 장애를 포함한다. 비만-관련된 질환의 예는 심혈관 질환, 2형 당뇨병, 수면 무호흡, 암, 골관절염, 천식, 지방간, 및 비-알코올성 지방간염(NASH)을 포함한다.
NASH는 간 염증 및 지방 축적에 의해 특징화된다. 일차 위험 인자는 비만, 당뇨병, 및 이상지질혈증이다. 간경변 및 간암종과는 강력한 연관이 있다. NASH는 흔히 증상이 없이, 상승된 AST/ALT(아스파르테이트 아미노기전달효소 (AST) 및 알라닌 아미노기전달효소 (ALT)의 농도의 비)와 관련된다. NASH에 대한 치료는 생활방식 변화(다이어트 및 운동), 비만대사 수술, 및 흡수 감소(Xenical/Alli (리파제 저해제)), 식욕 억제(벨비크, 비예타, 심믈린, 크시미아), 및 대사성 자극 (벨로라닙)를 포함하는 기전을 지닌 의약품을 포함한다.
비만-관련된 오르판 질환의 예는 프라더-윌리 증후군(예를 들면, 이상식욕항진증을 지님), 두개인두종(예를 들면, 이상식욕항진증을 지님), 바데트-비들 증후군, 코헨 증후군, 및 MOMO 증후군을 포함한다. 프라더-윌리 증후군은 염색체 15에서 유전자 결실/침묵화에 의해 야기된 드믄 유전적 질환이다. 상기 증상은 신경인지 증상(지적 장애, 자폐성 행동, 조절되지 않는 식욕(시상하부)), 느린 대사, 및 내분비 장애(예를 들면, 성장 호르몬 결핍(GHD), 부신 결핍(AD))을 포함한다.
항체는 치료되는 장애(예를 들면, 암)의 개시를 지연시키고/시키거나, 중증도를 감소시키고/시키거나 악화를 추가로 억제하고/하거나 적어도 하나의 징후 또는 증상을 악화시키고/시키거나 완화시키는 투여량, 투여 경로 및 투여 빈도를 의미하는 효과적인 레짐(regime)으로 투여된다. 환자가 장애로 이미 고생하는 경우, 레짐은 치료적으로 효과적인 레짐으로 언급될 수 있다. 환자가 일반적인 집단에 비해 장애의 상승된 위험에 있으나 아직 증상을 경험하지 않은 경우, 레짐은 예방적으로 효과적인 레짐으로 언급될 수 있다. 일부 예에서, 치료 또는 예방 효능은 동일한 환자에서 병력학적 대조군 또는 과거 경험에 대해 개별 환자에서 관찰될 수 있다. 다른 예에서, 치료 또는 예방 효능은 치료되지 않은 환자의 대조군 집단에 대해 치료된 환자의 집단에서 전임상 또는 임상시험으로 실증될 수 있다.
항체에 대한 예시적인 투여량은 다음과 같다: 0.1-20, 또는 0.5-5 mg/kg 체중(예를 들면, 0.5, 1, 2, 3, 4 또는 5 mg/kg) 또는 10-1500 mg을, 고정된 투여량으로서. 상기 투여량은, 다른 인자 중에서 환자의 상태 및 전처리에 대한 반응, 경우에 따라 치료가 예방적 또는 치료적인지 및 장애가 급성 또는 만성적인지에 의존한다.
투여는 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척추강내, 복강내, 국소, 비강내 또는 근육내일 수 있다. 일부 항체는 정맥내 또는 피하 투여에 의해 체순환내로 투여될 수 있다. 정맥내 투여는 예를 들면, 예컨대 30-90 분의 시간에 걸쳐 주입에 의해 이루어질 수 있다.
투여 빈도는 다른 인자 중에서 순환시 항체의 반감기, 환자의 상태 및 투여 경로에 의존한다. 빈도는 환자의 상태 또는 치료되는 장애의 진행에 있어서 변화에 대한 반응시 매일, 매주, 매달, 분기별, 또는 불규칙한 간격으로 이루어질 수 있다. 정맥내 투여를 위한 예시적인 빈도는, 보다. 또는 덜 빈번한 투여가 또한 가능하다고 해도, 치료의 계속되는 과정에 걸쳐 매주 내지 분기별일 수 있다. 피하 투여의 경우, 보다. 또는 덜 빈번한 투여가 또한 가능하다고 해도, 예시적인 투여 빈도는 매일 내지 매달이다.
투여된 투여량의 수는, 장애가 급성 또는 만성인지 또는 치료에 대한 장애의 반응의 여부에 의존한다. 급성 장애 또는 만성적 장애의 급성 악화의 경우, 1 내지 10회의 투여가 흔히 충분하다. 때때로, 임의로 분할된 형태의, 단일 거환 투여가 급성 장애 또는 만성적 장애의 급성 악화에 충분하다. 치료는 급성 장애 또는 급성 악화의 재발에 대해 반복될 수 있다. 만성적 장애의 경우, 항체는 규칙적 간격, 예를 들면, 매주, 격주로, 매달, 분기별, 매 6 개월마다. 적어도 1, 5 또는 10 년 동안, 또는 환자의 생애 동안 투여될 수 있다.
비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균되고 실질적으로 등장성이며 GMP 조건하에서 제조된다. 약제학적 조성물은 단위 투여량 형태(즉, 단일 투여의 경우 투여량)로 제공될 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 생리적으로 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조물을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 선택된 투여 경로에 의존한다. 주사의 경우, 항체는 수용액, 바람직하게는 생리적으로 양립가능한 버퍼, 예컨대, 한스 용액, 링거액, 또는 생리적 염수 또는 아세테이트 버퍼(주사 부위에서 불편을 감소시키기 위해) 속에 제형화될 수 있다. 용액은 제형제, 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면, 멸균된 발열성물질이 제거된 물을 사용한 구성을 위해 동결건조된 형태일 수 있다.
본원에 기재된 항체를 사용한 치료는 치료되는 장애에 대해 효과적인 다른 치료와 조합될 수 있다. 암의 치료시 사용하는 경우, 항체는 화학요법, 방사선, 줄기 세포 치료, 수술, 또는 HER2 항원에 대해 Herceptin® (트라스투주맙), VEGF에 대해 Avastin® (베바시주맙), 또는 EGF 수용체에 대한 항체, 예컨대 (Erbitux®, 세툭시맙), 및 Vectibix® (파니투무맙)을 포함하는 다른 생물제제를 사용한 치료와 조합될 수 있다. 화학요법 제제는 클로르암부실, 사이클로포스파마이드 또는 멜팔란, 카보플라티늄, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 및 미톡산트론, 메토트렉세이트, 플루다라빈, 및 사이타라빈, 에토포시드 또는 토포테칸, 빈크리스틴 및 빈블라스틴을 포함한다.
VI. 기타 적용
항체는 임상 진단 또는 치료의 맥락에서 또는 조사에서 라미닌 α4를 검출하는데 사용될 수 있다. 더 구체적으로, 항체는 또한, 임상 진단 또는 치료의 맥락에서 또는 조사에서 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈, 또는 그것의 단편을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 항체는, 생물학적 샘플이 암 세포 또는 종양 세포를 포함하는 적응증으로서 생물학적 샘플 속에서 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 결합은 대조군 샘플에 대한 항체의 결합과 비교될 수 있다. 대조군 샘플 및 생물학적 샘플은 동일한 조직 기원의 세포를 포함할 수 있다. 일부 검정에서, 생물학적 샘플 속에 존재할 수 있는 암 세포는 대조군 샘플 속의 세포 유형과 동일한 세포형으로서 생성된다. 대조군 샘플 및 생물학적 샘플은 동일한 개별적인 또는 상이한 개인 및 동일한 경우 또는 상이한 경우에서 수득될 수 있다. 원한다면, 다중 생물학적 샘플 및 다중 대조군 샘플은 다중 경우에 평가되어 샘플 사이의 차이와는 독립적인 랜덤 변화에 대해 보호한다. 이후에, 직접적인 비교를 생물학적 샘플(들)과 대조군 샘플(들) 사이에서 수행하여 생물학적 샘플(들)에 대해 결합하는 항체 (즉, 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈의 존재)이 대조군 샘플(들)에 대한 항체 결합에 대해 증가되는지, 감소되는지, 또는 동일한지를 측정할 수 있다. 대조군 샘플(들)과 비교하여 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 증가된 결합(들)은 생물학적 샘플(들) 속에서 암의 존재를 나타낸다. 일부 예에서, 증가된 항체 결합은 통계적으로 유의미하다. 임의로, 생물학적 샘플에 대한 항체 결합은 대조군 샘플에 대한 항체 결합보다. 적어도 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 20-배, 또는 100-배 더 높다.
또한, 항체를 생물학적 샘플 속에서 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈의 존재를 검출하는데 사용하여 암을 지닌 것으로 진단된 환자를 치료하는데 사용되는 치료제의 효능을 모니터하고 평가할 수 있다. 암을 지닌 것으로 진단된 환자로부터의 생물학적 샘플을 평가하여 치료제를 사용한 요법의 개시 전에 샘플에 대한 항체의 결합에 대한 기준선(즉, 샘플 속에서 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈의 존재에 대한 기준선)을 평가할 수 있다. 일부 예에서, 환자로부터의 다중 생물학적 샘플을 다중 경우에 평가하여 치료와는 독립적인 랜덤 변화의 기준선 및 척도 둘 다를 확립할 수 있다. 이후에, 치료제는 레짐으로 투여된다. 레짐은 일정 기간에 걸친 제제의 다중 투여를 포함할 수 있다. 임의로, 항체의 결합(즉, 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈의 존재)은 환자로부터의 다중 생물학적 샘플 속의 다중 경우에 평가되어, 랜덤 변화의 척도를 확립하고 면역요법에 대한 반응에 대한 경향성을 나타낸다. 생물학적 샘플에 대한 항체 결합의 다양한 평가를 이후 비교한다. 단지 2회의 평가가 이루어진 경우, 직접적인 비교를 2개의 평가 사이에서 이루어서 항체 결합(즉, 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈의 존재)이 2개의 평가 사이에서 증가되는지, 감소되는지, 또는 동일하게 잔류하는지를 측정할 수 있다. 2회 이상의 측정이 이루어진 경우, 측정은, 치료제를 사용한 치료 전에 출발하여 요법의 과정 전체에서의 진행한 시간 경과로서 분석될 수 있다. 생물학적 샘플에 대한 항체 결합이 감소된(즉, 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈이 존재가 감소된) 환자에서, 치료제는 환자에서 암을 치료하는데 효과적이었음으로 결론지을 수 있다. 바람직하게는, 항체 결합에 있어서의 감소는 통계적으로 유의미하다. 임의로, 결합은 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%까지 감소한다. 항체 결합의 평가는 암의 다른 징후 및 증상의 평가와 함께 이루어질 수 있다.
항체는 또한 라미닌 α4, 또는 더 구체적으로, 라미닌 α4의 LG4-5 모듈, 또는 그것의 단편 G를 검출하는데 있어서 실험실 조사에 대한 연구 시약으로서 사용될 수 있다. 이러한 용도에서, 항체는 형광성 분자, 스핀-표지된 분자, 효소, 또는 방사선동위원소로 표지될 수 있으며, 라미닌 α4, 또는 더 구체적으로, 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈, 또는 그것의 단편에 대한 검정을 수행하는데 필요한 모든 시약을 사용하여 키트의 형태로서 제공될 수 있다. 항체는 또한 예를 들면, 친화성 크로마토그래피에 의해 라미닌 α4, 라미닌 함유 라미닌 α4, 또는 라미닌 α4의 결합 파트너를 정제하는데 사용될 수 있다.
항체는 또한 생물학적 샘플에서 세포 부착을 억제하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 세포 부착은 라미닌 α4에 의존적이다. 예를 들면, 세포 부착은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 의해 매개된다. 생물학적 샘플은 종양, 암, 또는 이로부터 유도된 세포를 포함할 수 있다. 임의로, 종양 또는 암은 흑색종이다. 예시적인 세포 부착 검정은 실시예에 기재된다. 일부 예에서, 세포 부착은 하기까지 저해된다: 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 75%, (예를 들면, 10%-75% 또는 30%-70%).
항체는 또한 생물학적 샘플에서 신데칸에 대한 라미닌 α4의 결합을 저해하는데 사용될 수 있다. 임의로, 신데칸은 신데칸-1, 신데칸-2, 신데칸-3, 또는 신데칸-4이다. 저해는 항체의 존재 또는 부재하에서 라미닌 α4에 결합하기 위한 신데칸-발현 세포의 능력을 평가하는 결합 검정에서 실증될 수 있다. 임의로, 시험 항체의 저해는 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 결합하지 않는 무관한 대조군 항체에 대한 비교시 또는 임의의 항체를 결여한 비히클에 대한 비교시 실증될 수 있다. 예를 들면, 신데칸에 대한 라미닌 α4의 결합은 하기까지 저해된다: 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 75%, (예를 들면, 10%-75% 또는 30%-70%).
항체는 또한 생물학적 샘플에서 라미닌- α4-유도된 pAkt 활성화를 저해하는데 사용될 수 있다. 예시적인 검정은 실시예에 기재된다. 일부 방법에서, 라미닌- α4-유도된 pAkt 활성화는 하기까지 저해된다: 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 또는 75%, (예를 들면, 10%-75% 또는 30%-70%).
상기 또는 하기 인용된 모든 특허 출원, 웹 사이트, 다른 공보, 수납 번호 등은 각각의 개별적인 항목이 참고로 편입되기 위해 특이적으로 및 개별적으로 표시되는 경우와 동일한 정도로 그 전체가 참고로 다목적으로 편입된다. 서열의 상이한 버전이 상이한 시간에 수납 번호와 관련된 경우, 본원의 효과적인 출원일에 수납 번호와 관련된 버전을 의미한다. 유효한 출원일은 적용 가능한 경우 수납 번호를 언급하는 우선권 출원의 출원일 또는 실제 출원일보다. 앞섬을 의미한다. 마찬가지로, 상이한 버전의 공보, 웹사이트 등이 상이한 시기에 공개된 경우, 달리 명시되지 않으면 출원의 유효한 출원일에 가장 최근 공개된 버전을 의미한다. 본 발명의 임의의 특징, 단계, 성분, 구현예, 또는 측면은 구체적으로 다르게 명시되지 않으면 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명은 명쾌함 및 이해의 목적을 위해 예증 및 실시예의 방식으로 일부 상세히 기술하였지만, 어떤 변화 및 변형도 첨부된 청구범위의 범위내에서 실시될 수 있음이 분명할 것이다.
실시예
실시예 1. LG4-5-도메인-특이적 항- LAMA4 단클론성 항체의 확인
LAMA4 종양 발현은 종양 등급, 재발, 및 생존과 관련되어 있는 것으로 보고되어 있지만, 하향조절은 시험관내 및 생체내에서 종양 침습을 억제하는 것으로 보고되어 왔다. 참고, 예를 들면, Ljubimova 등, Cancer 101: 604-612 (2004) and Nagato 등, Int J Cancer 117: 41-50 (2005). 흥미롭게도, LAMA4 동족체 LAMA3의 G 도메인의 LG4-5 모듈은 편평상피 세포 암종(SCC)에서 배타적으로 발견되지만 정상의 건강한 조직에서는 부재하고/프로세싱되는 것으로 보고되어 왔다. 더욱이, LAMA3의 G 도메인의 LG4-5 모듈은, 다클론성 항체가 SCC 이종이식 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하는 것으로 보고되어 있는 바와 같이, SCC 종양 성장에 필요한 것으로 보고되어 왔다. 참고, 예를 들면, Tran 등, Cancer Res. 68: 2885-2894 (2008). 따라서, (1) LAMA4가 종양에서 유사한 방식으로 가공되는지 및 (2) LG4-5-특이적 항-LAMA4 항체가 LAMA4-양성 종양에서 유효할 수 있는지를 측정하는 것은 큰 관심이 되었다.
LAMA4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 대한 단클론성 항체는 물질 및 방법란에 기재된 바와 같이 생성시켰다. 단클론성 항체와 LAMA4의 G 도메인의 LG4-5 모듈 사이의 특이적 결합은 유세포측정에 의해 LAMA4-단편-표시 인간 배아 신장 293 세포를 염색하는 단클론성 항체의 능력을 평가함으로써 확인하였다. 형광성 신호를 유세포측정 분석을 통해 평가하고 다음에 나타낸 바와 같이 평균 형광 세기(MFI)로 플롯팅하였다: 도 1. LG1-3-특이적 LAMA4 항체는 LG1-5 및 LG1-3을 표시하는 293 세포에 결합할 수 있었지만, LAMA4 단백질의 LG4-5에는 결합할 수 없었다. 반대로, 클론 6C12, 13G10, 및 15F7은 LG1-5 및 LG4-5를 나타내는 293 세포에는 특이적으로 결합할 수 있었지만, LG1-3에는 그렇지 않았다.
15F7, 6C12, 및 13G10 항체에 대한 상대적인 결합 및 온/오프율(on/off rate)을 다음에 나타낸 바와 같이 ForteBio로 분석하였다: 각각 도 2a-c. 항체 농도를 100 nM에서 일정하게 유지시키고, LAMA4의 농도를 다음에 표시된 바와 같이 변화시켰다: 도 2a-c. LAMA4의 각각의 농도에 대해, 2개의 선을 다음에 나타낸다: 도 2a-c: 굵은 선은 미가공 데이타를 나타내고 및 굵지 않은 선은 미가공 데이타의 통계적인 핏팅을 나타낸다. 상세한 결합 동력학 파라미터(결합 속도 (ka), 해리 속도 (kd), 및 결합 친화도 상수 (KD))를 표 1에 나타낸 바와 같이, Biacore에 의해 13G10, 15F7, 및 6C12에 대해 측정하였다. 15F7 항체는 ForteBio 및 Biacore 검정에서 최고 결합 규모 및 최저 오프율을 나타내었다.
표 1
LAMA4에 대한 15F7, 13G10, 및 6C12의 결합을 비교하는 Biacore 검정
Figure pct00001
마우스 IgG 대조군과 함께, 6C12, 13G10, 및 15F7 항체를 LAMA4-표시 세포에 결합하는 그것의 능력에 대해 시험하였다. LAMA4 결합능을 시험하기 위해, 연속으로 희석된 항체를 LAMA4-표시 인간 293 세포와 함께 예비-인큐베이션한 다음, 항-인간-650 2차 항체를 물질 및 방법란에 기재된 바와 같이 인큐베이션하였다. 결합능을 다음에 나타낸 바와 같이 유세포측정으로 평가하였다: 도 3. 15F7은 다시 최고 결합 규모를 나타내었다.
경쟁 실험을 수행하여 에피토프 결합에 의해 6C12, 13G10, 및 15F7 항체를 차등화하였다. LAMA4-표시 293 세포에 대한 항체의 결합을 음성 대조군으로서 사용되는 마우스 IgG1을 사용하여, 결합 항체에 대한 차단 항체의 감소하는 비(5:1, 1:1, 및 1:5)를 사용하여 평가하였다. 6C12, 13G10, 및 15F7 항체의 결합을 다음에 나타낸 바와 같이 유세포측정으로 평가하였다: 도 4a-c 각각. 형광성 신호를 유세포측정 분석을 통해 평가하고 평균 형광 세기(MFI)로서 플롯팅하였다. 모든 3개의 항체는 LG4-5 결합에 대해 서로 경쟁할 수 있었으며 각각은 5:1 비 ((차단 항체):(결합 항체))에서 보다. 높은 차단 효율을 가지고 비가 감소함에 따라 보다. 낮은 차단 효율을 가진다. 이들 결과는, 이들 항체 모두가 LAMA4 단백질에서 유사한 에피토프에 결합함을 나타낸다.
실시예 2. LG4-5-도메인-특이적 항- LAMA4 단클론성 항체는 인간 및 마우스 흑색종 조직을 배타적으로 염색한다.
LAMA4의 G 도메인의 LG4-5 모듈이 종양 조직속에서 배타적으로 발견되는지를 측정하기 위해, WM-266-4 인간 흑색종 세포를 LAMA4 발현에 대해 다클론성 항-LAMA4 항체를 사용하여 시험하였다. 염색을 MCAM 및 LAMA4 둘 모두에 대해 수행하였다. MCAM-양성 WM-266-4 세포는 LAMA4 발현에 대해 양성이었다.
WM-266-4 종양을 누드 마우스내에 피하로 이식하고 5주 동안 성장하도록 하였다. PBS를 사용한 경심장 관류 후, 종양 및 건강한 조직을 냉동시키고, 절단하여, 물질 및 방법란에 기재된 바와 같은 마우스 IgG 대조군, LG1-3-특이적, 및 LG4-5-특이적 단클론성 항체 6C12, 13G10, 및 15F7로 염색하였다. LG1-3-특이적 및 LG4-5-특이적 항체 둘 다는 WM-266-4 피하 종양 및 맥관구조를 염색할 수 있었다.
추가의 피하 종양 실험을 마우스 흑색종 세포주, B16을 사용하여 수행하였다. B16 마우스 흑색종 세포를 마우스내로 피하 주사 또는 정맥내 주사한 후 폐에 전이되도록 하였다. B16 종양 조직 및 건강한 마우스 뇌, 간, 신장, 및 폐 조직의 염색은 LG1-3-특이적 항체와, 대조군으로서 사용된 마우스 IgG1으로 수행하였다. LG1-3-특이적 항체는 시험된 모든 조직 유형을 건장하게 염색할 수 있었다. B16 종양 조직 및 건강한 마우스 뇌, 간, 신장, 및 폐 조직의 염색을 또한 LG4-5-특이적 항체, 6C12, 13G10, 및 15F7로 수행하였다. LG1-3-특이적 항체와는 대조적으로, 이들 3개의 LG4-5-특이적 항체는 일차 피하 종양내 B16 종양 맥관구조를 배타적으로 염색하였고 임의의 건강한 조직은 건장하게 염색할 수 없었다. B16 폐 전이성 촛점 및 건강한 인접한 폐 조직을 함유하는 샘플의 염색은 LG1-3-특이적 항체, LG4-5-특이적 항체 (6C12, 13G10, 및 15F7), 및 대조군 마우스 IgG1으로 수행하였다. LG1-3-특이적 항체는 전이성 촛점 및 건강한 인접한 조직 둘 다를 건장하게 염색할 수 있었다. 그에 반해서, 6C12, 13G10, 및 15F7 항체는 건강한 인접한 폐 조직을 염색할 수 없었고 전이성 촛점에서 B16 종양 맥관구조를 배타적으로 염색하였다.
2명의 뚜렷이 다른 환자로부터 건강한 인간 피부 및 피부 흑색종의 샘플을 LG4-5-특이적 항체, 15F7로 염색하였다. 상기 기재된 염색 결과와 일치하여, 15F7은 피부 흑색종 샘플 둘 다를 염색할 수 있었으나 건강한 피부 조직은 염색할 수 없었다.
다른 인간 종양 유형 또한 염색되었다. 나타낸 바와 같이(도 5a-c), LG-4-5-특이적 항체, 15F7을 사용하여 인간 유방, 결장, 및 폐 종양 각각에 대한 종양 마이크로어레이 슬라이드를 염색하였다. 정상 조직 대조군을 백색 직사각형내에 봉입한다. 상기에서 기재된 바와 같은 흑색종의 염색과 일치하여, 15F7은 인간 유방, 결장, 및 폐암에 대한 종양 마이크로어레이 슬라이드에서 대다수의 종양 환자 샘플을 우선적으로 염색하였다. 이들 결과는, LAMA4의 G 도메인의 LG4-5 모듈이 다양한 인간 및 마우스 종양 유형에서 배타적으로 발견되는 모델과 일치하며, 이는 LAMA4의 G 도메인의 LG4-5 모듈이 진단 및 표적화된 종양 치료제에 대해 종양 특이적 마커일 수 있음을 나타낸다.
실시예 3. LG4-5-도메인-특이적 항- LAMA4 단클론성 항체는 인간 흑색종 세포 부착을 억제하고 항체-약물 콘주게이트 세포 독성을 구동시킨다.
LAMA4의 G 도메인의 LG4-5 모듈을 항-LG4-5 항체로 표적화하는 것의 기능적 결과를 측정하기 위해, 재조합 LG4-5-코팅된 ELISa 플레이트를 20 ug/ml 15F7, 6C12, 및 13G10 (또는 마우스 IgG1 대조군)과 함께 인큐베이션한 후 물질 및 방법란에서 기재된 바와 같이 인간 흑색종 세포주 WM-266-4에 결합하는 그것의 능력에 대해 평가하였다. 완충제를 음성 대조군으로서 사용하고 헤파린을 양성 대조군으로서 사용하였다. 세포가 없는 샘플을 추가의 음성 대조군으로서 사용하였다. 세포 부착 검정의 결과는 다음에 나타낸다: 도 6. 상기 결과는 임의의 단위 (A.U.)로 y-축에 나타낸다. 마우스 IgG1 대조군은 LAMA4-매개된 세포 부착을 차단하는데 실패하였지만, 모든 3개의 항-LG4-5 항체는 LAMA4-매개된 인간 흑색종 세포 부착을 대략 35% 이상까지 억제할 수 있었으며, 이는, 항-LG4-5 항체가 종양 세포 부착, 증식, 및 전이에 필요한 세포 부착 현상을 차단할 수 있음을 나타낸다.
LAMA4의 LG4-5 도메인은 건강한 인간 조직과 비교하여 다양한 인간 종양 조직내에서 크게 농축되므로, 본 발명자들은 항체-약물 콘주게이트 표적화 전략에 대한 후보자로서 항-LG4-5 항체를 시험하였다. 나타낸 바와 같이(도 7), LAMA4+ WM-266-4 세포를 15F7 항-LG4-5 항체 또는 마우스 아이소타입 대조군과 함께 리보솜 독소 사포린-접합된 항-마우스 2차를 인큐베이션하였다. LAMA4 LG4-5이 가용성 세포외 매트릭스 단백질이라고 해도, 15F7은 사포린-매개된 세포 독성을 강력하게 매개할 수 있었다.
이들 데이타는, 항-LG4-5 항체가 WM-266-4 인간 흑색종 세포 부착을 차단하며 항체-약물 콘주게이트 치료적 접근법에 대한 강한 후보자임을 나타낸다. LG4-5를 표적화하는 것은 종양 성장 및 전이를 지연시키는데 효과적일 수 있다.
실시예 4. 인간화된 15F7 항체의 설계
인간화에 대한 상기 개시점 또는 공여체 항체는 마우스 항체 15F7였다. 성숙한 m15F7의 중쇄 가변 아미노산 서열은 서열식별번호: 16으로 제공된다. 성숙한 m15F7의 경쇄 가변 아미노산 서열은 서열식별번호: 17로서 제공된다. 중쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 20, 21, 및 22(카밧에 의해 정의된 바와 같음)로서 제공된다. 경쇄 CDR1, CDR2, 및 CDR3 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 23, 24, 및 25(카밧에 의해 정의된 바와 같음)로서 제공된다. 카밧 넘버링이 이 실시예 전체에서 사용된다.
m15F7의 가변 카파 (Vk)는 마우스 카밧 하위그룹 5에 속하며, 이는 인간 카밧 하위그룹 1에 상응한다. m15F7의 가변 중쇄 (Vh)는 마우스 카밧 하위그룹 5a에 속하며, 이는 카밧 하위그룹 1에 상응한다. 참고: Kabat 등 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242, 1991. Vk에서 11-잔기 CDR-L1은 표준적 클래스 1에 속하고, 7-잔기 CDR-L2는 표준적 클래스 1에 속하며, 9-잔기 CDR-L3은 표준적 클래스 1에 속한다. 참고 Martin & Thornton, J. Mol. Biol. 263:800-15, 1996. 5-잔기 CDR-H1(카밧에 의해 정의된 바와 같음)은 표준적 클래스 1에 속하고, 17-잔기 CDR-H2는 표준적 클래스 1에 속한다. 참고: Martin & Thornton, J Mol. Biol. 263:800-15, 1996. CDR-H3은 표준적 클래스를 가지지 않지만, 10-잔기 루프는 아마도 하기의 법칙에 따라 뒤틀린 염기(kinked base)를 갖는다: Shirai 등, FEBS Lett. 455:188-97 (1999).
Vk와 Vh 도메인 사이의 인터페이스에서 잔기는 일반적이다.
조사가 PDB 데이타베이스에서 단백질 서열에 걸쳐 이루어져(Deshpande 등, Nucleic Acids Res. 33: D233-7, 2005) 15F7의 대략적인 구조적 모델을 제공할 수 있는 구조를 발견하였다. 단핵구 화학유인물질 단백질 (MCPs)에 대한 항체의 결정 구조를 Vk 구조에 사용하였다. 이는 15F7와 루프에 대해 동일한 표준적 구조를 보유한다(pdb 코드 2BDN, 분해 2.53A). LeuT 돌연변이체에 대한 항체의 중쇄(pdb 코드 3TT1, 분해 3.1A)를 Vh 구조에 사용하였다. 이는 15F7 VH의 것과 같이 CDR-H1 및 CDR-H2에 대해 동일한 표준적 구조, 및 또한 뒤틀린 염기를 지닌 CDR-H3와 동일한 길이를 함유한다. BioLuminate를 사용하여 15F7 Fv의 대략적인 구조를 모델화하였다.
CDR“X”된 15F7 Fv를 사용한 NCBI로부터의 불필요하지 않은 단백질 서열 데이타베이스의 조사는, 쥣과 CDR이 이식되는 적합한 인간 프레임워크의 선택을 허용한다. Vh의 경우, 2개의 인간 Ig 중쇄, ACF36857.1 및 BAC01530.1(각각 서열식별번호: 96 및 97)을 선택한다. 이들은 표준 형태의 15F7 CDR-H1 및 H2를 공유하며, BAC01530.1의 H3는 예상된 뒤틀린 염기를 지닌 10개 잔기의 길이이다. Vk의 경우, NCBI 수탁 코드 AAY33350.1 및 BAC01583.1(각각 서열식별번호: 53 및 98)를 갖는, 2개의 인간 카파 경쇄를 선택하였다. 이들은 친계 Vk에 대해서와 같이 CDR-L1, L2, 및 L3에 대해 동일한 표준적 클래스를 갖는다. 복귀돌연변이 또는 다른 돌연변이가 없는 인간화된 15F7 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열은 서열식별번호: 55 및 56으로 제공된다.
2개의 인간화된 중쇄 가변 영역 변종 및 2개의 인간화된 경쇄 가변 영역 변종은 상이한 순열의 치환 (Hu15F7VHv1-2 (서열식별번호: 57 및 58 각각) 및 Hu15F7VLv1-2 (서열식별번호: 59 및 60 각각))을 함유하도록 작제하였다(표 2-5). 선택된 인간 프레임워크를 기반으로 한 복귀돌연변이 및 다른 돌연변이를 지닌, 예시적인 인간화된 Vh 및 Vk 디자인은 표 2 및 3에 각각 나타낸다. 표 2 및 3에서 제1 칼럼내 회색-색조의 영역은 쵸티아에 의해 정의된 CDR을 나타내고, 표 2 및 3내 잔여 컬럼에서 회색-색조의 영역은 카밧에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 나타낸다. 서열식별번호: 57-60은 표 4에 나타낸 바와 같은 복귀돌연변이 및 다른 돌연변이를 함유한다. Hu15F7VHv1-2 및 Hu15F7VLv1-2내 위치 H1, H20, H27, H30, H38, H40, H41, H48, H66, H67, H69, H75, H82A, H91, L8, L42, L45, L49, L69, 및 L80에서 아미노산은 표 5에 나열되어 있다. Hu15F7VLv1-2내 위치 L104에서 아미노산 또한 표 5에 나열되어 있다.
표 2
인간화된 15F7 Vh 영역
Figure pct00002
인간화된 15F7 Vh 영역
Figure pct00003
인간화된 15F7 Vh 영역
Figure pct00004
인간화된 15F7 Vh 영역
Figure pct00005
표 3
인간화된 15F7 Vk 영역
Figure pct00006
인간화된 15F7 Vk 영역
Figure pct00007
인간화된 15F7 Vk 영역
Figure pct00008
인간화된 15F7 Vk 영역
Figure pct00009
표 4
V H , V L 복귀돌연변이 및 다른 돌연변이
Figure pct00010
표 5
프레임워크 잔기의 카밧 넘버링
인간화된 15F7 항체에서 복귀돌연변이 및 다른 돌연변이에 대한
Figure pct00011
치환을 위한 후보자로서 경쇄 가변 영역내 상기 위치의 선택을 위한 근거는 하기와 같다.
P8S: P는 인간 IgG 프레임워크내에서 S보다. 더 빈번하지만, 프롤린 시스-트랜스 이성질체화가 단백질 폴딩에 영향을 미치므로, P는 하나의 버전에서 시도되었고 S는 다른 버전에서 시도되었다.
K42N: N은 VH내에서 인터페이스 잔기 F91와 접촉하므로 항체 구조를 유지하는데 중요하다.
K45R: R 및 K는 인간 IgG 프레임워크에서 유사한 빈도를 가지므로, R은 하나의 버전에서 시도되었고 K는 다른 버전에서 시도되었다.
Y49S: S는 LCDR2와 접촉하며 중요하다.
T69K: K는 LCDR1과 접촉하며 중요하다.
P80T: P는 인간 IgG 프레임워크내에서 T보다. 더 빈번하지만, 프롤린 시스-트랜스 이성질체화가 단백질 폴딩에 영향을 미치므로, P는 하나의 버전에서 시도되었고 T는 다른 버전에서 시도되었다.
L104V: L은 하나의 버전에서 시도되었고, V는 다른 버전에서 시도되었다.
치환을 위한 후보자로서 중쇄 가변 영역내 상기 위치의 선택의 근거는 하기와 같다.
Q1E: 이것은 돌연변이이지만 복귀돌연변이가 아니다. 파이로글루타메이트 (pE)로의 글루타메이트 (E) 전환은 글루타민 (Q)으로부터 보다. 서서히 발생한다. pE에 대한 글루타민내 일차 아민의 손실로 인하여, 항체는 보다. 산성이 된다. 불완전한 전환은 전하-기반 분석적 방법을 사용한 다중 피크로서 관찰될 수 있는 항체내에서 이종성을 생산한다. 이종성 차이는 공정 대조군의 결여를 나타낼 수 있다.
V20L: L은 인간 IgG 프레임워크에서 V보다. 보다. 빈번하다.
G27Y: 이러한 잔기는 쵸티아에 의해 정의된 바와 같이 HCDR1내에 있으므로, Y는 결합 능력을 유지하기 위해 사용되었다.
S30T: 이러한 잔기는 코티아에 의해 정의된 바와 같이 HCDR1내에 있으므로, T는 결합 능력을 유지하기 위해 사용되었다.
R38K: K는 VH내 2개의 인터페이스 잔기, L45 및 W47와 접촉하므로, 중요하다.
A40R: R은 KQRAGQG (VH 아미노산 38-44) 루프의 말단에 위치하며, 이는 VH내 2개의 인터페이스 잔기, V37 및 L45를 지지한다. 이는 항체 폴딩을 유지하는데 중요하다.
P41A: P는 인간 IgG 프레임워크내에서 A보다. 더 빈번하지만, 프레임워크내로 P의 도입은 일부 형태적 변화를 유발하므로, P는 하나의 버전에서 시도되었고 A는 다른 버전에서 시도되었다.
M48I: I는 VH내에서 HCDR2 및 인터페이스 잔기 V37 및 L45와 접촉한다.
R66K: K는 HCDR2와 접촉한다.
V67A: A는 HCDR2와 접촉한다.
I69L: I는 인간 IgG 프레임워크에서 L보다. 더 빈번하지만, L은 HCDR1 및 HCDR2와 접촉하므로, 본 발명자는 I를 하나의 버전에서 시도하였고 L을 다른 버전에서 시도하였다.
T75S: T 및 S 둘 다는 인간 프레임워크에서 빈번하다.
S(82A)R: R은 HCDR2와 접촉하므로 중요하다.
Y91F: F는 인터페이스 잔기이며 항체 폴딩을 유지하는데 중요하다.
2개의 인간화된 경쇄 가변 영역 변종 및 2개의 인간화된 중쇄 가변 영역 변종은 하기와 같다:
Hu15F7VL 버전 1 (소문자로서 P8S, K42N, K45R, Y49S, T69K, 및 P80T 복귀돌연변이):
DIQMTQSsSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLAWYQQKPGnAPrLLIsGATSLETGVPSRFSGSGSGkDYTLTISSLQtEDFATYYCQQYWSIPYTFGGGTKlEIKR (서열식별번호: 59).
Hu15F7VL 버전 2 (소문자로서 K42N, Y49S, 및 T69K 복귀돌연변이 및 L104V 돌연변이):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASEDIYNRLAWYQQKPGnAPKLLIsGATSLETGVPSRFSGSGSGkDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYWSIPYTFGGGTKvEIKR (서열식별번호: 60).
Hu15F7VH 버전 1 (소문자로서 Q1E 돌연변이 및 V20L, G27Y, S30T, R38K, A40R, P41A, M48I, R66K, V67A, I69L, T75S, S(82A)R, 및 Y91F 복귀돌연변이):
Figure pct00012
(서열식별번호: 57).
Hu15F7VH 버전 2 (소문자로서 Q1E 돌연변이 및 V20L, G27Y, S30T, R38K, A40R, M48I, R66K, V67A, T75S, S(82A)R, 및 Y91F 복귀돌연변이):
eVQLQQSGAEVKKPGSSVKlSCKASGyTFtSYGLSWVkQrPGQGLEWiGEIFPRSGNTYYNEKFKGkaTITADKSsSTAYMELrSLRSEDTAVYfCARGVRSPGAMDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 58).
실시예 5. 인간화된 15F7 항체의 결합 동력학 분석
Hu15F7VHv1-2로부터 선택된 중쇄(H1 및 H2) 및 Hu15F7VLv1-2 (L1 및 L2)로부터 선택된 경쇄를 포함하는 인간화된 15F7 항체의 결합 동력학을 특징화하였다.
키메라성 15F7, H1L1, H1L2, H2L1, H2L2, 및 버퍼 단독을 LAMA4-단편-표시 세포에 결합하는 그것의 능력에 대해 시험하였다. LAMA4 결합능을 시험하기 위해, 연속으로 희석된 항체를 LG4-5를 표시하는 인간 293 세포와 함께 예비-인큐베이션한 다음, 항-인간-650 2차 항체를 물질 및 방법란에서 기재된 바와 같이 인큐베이션하였다. 형광성 신호를 유세포측정 분석을 통해 평가하고 다음에 나타낸 바와 같이 평균 형광 세기(MFI)로 플롯팅하였다: 도 8. 연속으로 희석된 H1L1, H1L2, H2L1, 및 H2L2 항체 각각은 키메라성 15F7에 대해 비교할만한 결합능을 나타내었다.
LAMA4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 대한 키메라성 15F7, H1L1, H1L2, H2L1, 및 H2L2 항체의 특이적 결합은 다음에 나타낸 바와 같이, 유세포측정에 의해 LAMA4-단편-표시 293 세포를 염색하는 항체의 능력을 평가함으로써 시험하였다: 도 9. 각각의 항체는 LG1-5 및 LG4-5를 표시하는 293 세포에 특이적으로 결합할 수 있었지만, LG1-3에는 그렇지 않았다.
상대적인 결합 및 온/오프율을 하기에 나타낸 바와 같이 ForteBio로 분석하였다: 도 10a 및 10b. 도 10a에서, 항-His 센서를 10ug/ml의 정제된 His-LAMA4과 함께 로딩한 후 5ug/ml의 m15F7, 키메라성 15F7, H1L1, H1L2, H2L1, 및 H2L2를 로딩하였다. 회합 및 해리를 분석하였다. 도 10b에서, 염소 항-인간 Fc 센서를 5ug/ml에서 나타낸 바와 같이 m15F7, 키메라성 15F7, H1L1, H1L2, H2L1, 및 H2L2와 함께 로딩한 다음 10ug/ml의 His-LAMA4를 로딩하였다. 회합 및 해리를 분석하였다. 상대적인 결합 및 온/오프율은 시험된 모든 항체 중에서 비교할만 하였고, H1L1 및 H2L1은 키메라성 15F7 및 m15F7에 대한 것과 동일하거나 이보다. 더 높은 상대적인 결합을 나타내었다.
항체의 Biacore 완전 결합 동력학 분석을 이후 수행하였다. SPR 분석은 물질 및 방법란에 기재된 바와 같이 수행하였다. 상세한 결합 동력학 파라미터(결합 속도 (k결합), 해리 속도 (k해리), 및 결합 친화도 상수 (Kd))를 키메라성 15F7, 인간화된 H1L1, 및 인간화된 H2L1에 대해 측정하였다. 인간화된 15F7 변종 H1L1 및 H2L1에 대한 결합 동력학 파라미터는 키메라성 15F7에 대한 것과 비교할만한 하였다. (참고 표 6).
표 6
하기의 결합을 비교하는 Biacore 검정
LAMA4에 대한 HU15F7 변종 및 키메라성 15F7
Figure pct00013
실시예 6. 항-라미닌 항체는 라미닌-411-유도된 pAkt 활성화를 억제한다.
WM266.4 인간 종양 흑색종 세포를 24 시간 동안 혈청-고갈시킨 후 10 ug/ml 라미닌 411 (감마1 및 베타1 사슬과 복합된 LAMA4) 및 20 ug/ml 15F7 또는 mIgG1 대조군 항체가 들어있는 무혈청 세포 배양 배지내로 30분 동안 재현탁시켰다. BSA 단백질을 라미닌 411에 대한 대조군으로서 사용하였다. 이후에, 세포를 회전시키고 면역블랏 분석을 위해 용해시켰다. pAkt 및 총 Akt 수준을 면역블랏으로 평가하였다. 이들 수준의 비(pAkt/Akt)를 다음에 나타낸다: 도 11a & b. 각각의 조건(mIgG1 + 라미닌 411; 15F7 + 라미닌 411; 및 mIgG1 + BSA)을 3회 시험하였다. 도 11a는 각각의 개별적인 샘플에 대한 결과를 나타내며, 도 11b는 각각의 조건에 대한 평균 및 표준 오차를 나타낸다. 나타낸 바와 같이(도 11b), 라미닌 411은 BSA 대조군과 비교하여 pAkt 신호전달(즉, 더 높은 pAkt/Akt 비)을 유도하였고, 15F7은 라미닌-411-유도된 pAkt 활성화를 부분적으로 차단하였다(~ 50% 저해).
실시예 7. 노치 신호전달에 있어서 라미닌 411 및 항-라미닌 항체의 효과
노치 리간드 Dll4 전사/번역은 인테그린 결찰 및 차후의 포스포-Akt 신호전달을 필요로 하므로, 항-LAMA4 항체를 노치 신호전달에 있어서의 효과에 대해 시험한다. HUVEC, WM266.4, 및 RAW 세포를 10 ug/ml 라미닌-411 (감마1 및 베타1 사슬과 복합된 LAMA4) 및 20 ug/ml 15F7 또는 아이소타입 대조군 항체가 들어있는 세포 배양 배지에서 24시간 동안 재현탁시킨다. BSA 단백질은 라미닌 411에 대한 대조군으로서 사용된다. 세포를 회전시키고 절단된/활성화된 Notch1, Dll4, MCAM, 액틴, pAkt, 및 Akt에 대한 면역블랏 분석을 위해 용해한다. 또한, Hey1, MCP-1(염증속의 단핵구 화학유인물질), MCAM, LAMA4, 및 GAPDH에 대한 qPCR 분석을 수행한다.
실시예 8. 생체내 비만 모델에서 항-라미닌 항체의 효과
Akt 신호전달은 노치 신호전달에 중요하고, 노치 신호전달은 지방세포의 성장을 조장하므로, LAMA4에 대한 항체를 생체내 비만 모델에서 체중 증가/손실 및 지방세포 대사 및 지방분해에 있어서의 효과에 대해 시험한다. 마우스내 높은-지방 다이어트 (HFD)-유도된 체중 증가를 항-라미닌 411 항체에 대한 반응시 평가한다. 야생형 C57BL/6 마우스에게 고-지방 다이어트(예를 들면, 45% kcal% 지방을 지닌 설치류 다이어트, 예컨대 Research Diets, Inc.로부터의 생성물 #D12451)를 임의로 공급한다. 2개의 실험적인 그룹을 시험한다: (1) 마우스를 대조군 Ig로 처리하고; (2) 마우스를 15F7로 처리한다. 각 그룹에 10마리의 마우스가 있으며 각각의 마우스는 3 내지 4개월 동안 10 mg/kg/주의 항체로 처리한다. 중량 측정은 매 2 내지 4주 동안 수행한다.
지방 조직에 대한 LAMA4의 국재화를 평가하기 위해, 항-LAMA4 항체(아이소타입 대조군 항체와 비교함)를 마우스에게 정맥내로 투여한다. 이후에, 염색을 수행하여 지방 조직에 대한 국재화를 평가한다.
실시예 9. 물질 및 방법
LAMA4 단편 정제
His-태그된 LAMA4 G-도메인 단편을 표준 절차에 의해 클로닝하고 293 세포에서 일시적으로 발현시킨다. 단백질을 니켈-NTA 칼럼을 사용하여 정제하였다.
LAMA4 녹아웃 마우스
Lama4 눌(null) 마우스는 다음으로부터 본래 수득하였다: 카를 트리그보슨(Karl Tryggvason) 박사(카롤린스카 대학).
재조합 MCAM-Fc 단백질의 발생
MCAM-Fc는 인간 또는 마우스 MCAM의 세포외 도메인을 인간 IgG1에 융합시킴으로써 우리 속에서 발생시키고 표준 기술을 사용하여 CHO 세포내에서 생산/정제하였다.
항체 발생
재조합 마우스 라미닌 4(Lama4)는 R&D Systems으로부터 수득하고 10 주령 Lama4 눌 마우스는 카를 트리그보슨 박사(카롤린스카 대학)로부터 구입하여 항체를 발달시키는데 사용하였다. 정제된 라미닌 α4 (LAMA4)를 RIBI 아쥬반트 속에 10 ug LAMA4/25 ul 아쥬반트에서 현탁시켰다. 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 3마리의 마우스를 각각의 뒷 발바닥 또는 뒷 무릎내로 RIBI 아쥬반트 중 5 ug Lama4를 사용하여 면역화시키는 한편 2마리의 마우스를 RIBI 아쥬반트중 12.5 ug Lama4를 각각의 뒷 발바닥 또는 뒷 무릎내로 27 게이지 바늘을 사용하여 면역화시켰다. 마우스에게 상기 절차에 따라 0, 4, 12, 16 및 20일째에 주사하였다. 24일째에, 동물을 안락사시키고 슬와 및 서혜 림프절을 멸균된 후드 속에서 제거하였다. 마디를 해리시키고 PEG 융합 대신에 전기융합을 편입시킨 Kohler 및 Milstein 프로토콜의 변형을 사용하여 SP2/0와 융합시켰다. 융합된 세포를 96 웰 플레이트내로 플레이팅하고 성장시켰다.
세포가 1/2 내지 3/4의 밀집도에 이르면 스크리닝을 시작한다. 간단히, Costar RIA/EIA 플레이트를 PBS 1 중 토끼 항-His 태그(Anaspec #29673)로 1ug/mL, 50uL/웰에서 1 시간 동안 피복하였다. 이후에, 플레이트를 250ul/웰의 1%BSA/PBS로 15분 동안 차단시킨 다음 제거하였다. His-태그된 Lama4를 플레이트에 0.25ug/mL, 50uL/웰에서 1시간 동안 부가한 다음 2x 세정하였다. 융합 플레이트로부터 75uL의 상청액을 부가하고 1시간 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 2x 세정하였다. 염소-항-마우스(Jackson #115-035-164)를 0.5%BSA/PBS/TBST 속에 1:2000 희석으로 1시간 동안 부가한 후, 5x 세정하였다. 플레이트를 50ul/웰 TMB(SurModics #TMBW24)로 5분 동안 전개시키고, 15uL의 2N H2SO4로 중지시키고, 450nm에서 판독하였다. 1.0보다. 더 큰 OD를 지닌 웰들을 추가의 스크리닝을 위해 선택하였다. ELISA에 의해 양성으로 밝혀진 웰들로부터의 세포를 성장시키고 냉동시켰다. 상청액을 하기 기재된 추가의 스크리닝을 위해 제공한다. 하기 기재된 어떤 기준을 충족하는 웰들로부터의 세포를 Clonepix FL을 사용하여 클로닝하고 회사에서 권고한 셋팅을 사용 스크리닝함으로써 단일 세포 클론을 발견하였다. 이들을 증식시키고 항체를 상청액으로부터 정제하였다.
LAMA4 pDisplay 유세포측정 결합 검정
인간 LAMA4 G-도메인 1-5 및 변종을 pDisplay 발현 작제물(Life Technologies)내로 클로닝시키고 표준 절차를 사용하여 293 세포내로 일시적으로 형질감염시켰다. 항-LAMA4 항체를 세포와 함께 30분 동안 4 ℃에서 인큐베이션시킨 다음 항-마우스-650과 함께 30분 동안 4 ℃에서 인큐베이션시켰다. 세포를 표준 절차를 사용한 유세포측정에 의해 항-라미닌 결합에 대해 분석하였다.
WM-266-4 세포 형질감염 및 염색
배양된 WM-266-4 세포를 전장 인간 MCAM-GFP 융합 작제물로 형질감염시키고 표준 절차를 사용하여 항-LAMA4 항체로 염색하였다.
WM-266-4 인간 흑색종 피하 종양 조직
세포를 배양시키고 동물당 5x105 세포를 누드 마우스에서 어깨 위에 피하로 투여하였다. 5주 후, 동물에게 PBS를 경심장으로 살포하고 종양을 절개하여 스냅 냉동시켰다.
B16 마우스 흑색종 피하 종양 조직
세포를 배양시키고 동물당 5x105 세포를 c57bl6 마우스에서 어깨 위로 피하로 투여하였다. 5주 후, 동물에게 PBS를 경심장으로 살포하고 종양을 절개하여 스냅 냉동시켰다.
B16 마우스 흑색종 폐 전이 폐 조직
세포를 배양하고 동물 당 5x105 세포를 Charles River(Caliper LifeSciences 부지밖)로부터의 누드/베이지 마우스내로 정맥내 주사하였다. 3주 후에, 동물에게 PBS로 경심장으로 살포하고, 폐를 절개하여 스냅 냉동하였다.
형광 현미경검사/표준 면역 형광성 방법
마우스 조직을 OCT 속에서 스냅 냉동시키고 10 uM에서 절단하였다. 섹션을 차가운 아세톤 속에 고정시키고 항-LAMA4 항체(R&D systems)로 염색하였다.
인간 흑색종 세포 부착 검정
재조합 10 ug/ml mLAMA4 (R&D systems)을 사용하여 96-웰 플레이트를 밤새 4 ℃에서 피복하였다. PBS 세척 단계에 이어서, 웰들을 1% BSA/MEM로 1시간 동안 실온에서 차단시켰다. 0.1%BSA/MEM 중 20 ug/ml의 항-LAMA4 항체를 플레이트에 1시간 동안 실온에서 부가하였다. WM-266-4 세포를 EDTA로 재현탁시키고, 세척하고 0.1%/MEM 속에서 300,000 세포/ml로 재현탁시킨 다음, 10분 동안 조직 배양 인큐베이터 속에서 37ºC로 튜브 캡을 닫고 현탁시켰다. FACS 버퍼(PBS 중 1% FBS)로 2회 세척한 후, 세포를 650-접합된 항-팬-라미닌 항체 (1:1000; Novus 생물제제)로 재현탁시키고 20분 동안 4 ℃에서 인큐베이션시키고, 다시 세정하였다. 항체 용액을 제거하지 않고, 세포 현탁액을 웰에 부가하고 조직 배양 인큐베이터 속에서 1.5시간 동안 덮지않고 인큐베이션하였다. PBS 세척 단계 후에, 세포를 570 nm에서 플레이트 리더 분석하기 전에 글루타르알데하이드/크리스탈 바이올렛 용액으로 염색/고정시켰다.
Fab 단편의 발생
모든 항체의 Fab 단편은 제조자의 지시(Pierce)에 따라 Fab Micro 제조 키트를 사용하여 발생시켰다. 유리된 Fc의 제거 및 온전한 최종 생성물의 입증은 SDS-PAGE로 모니터링하고, 농도는 바이신코닉 산 검정(Pierce)을 사용하여 측정하였다.
친화성의 SPR 측정
SPR 분석을 Biacore T200을 사용하여 수행함으로써 상이한 라미닌 항체의 결합을 비교하였다. Fab 제조를 위해, 항-6xHis 항체(GE Life Sciences)를 센서 칩 C1 상에 아민 커플링을 통해 고정시키고, 인간 His-라미닌- α4, 마우스 His-라미닌- α4 (둘 다. R & D Systems로부터 구입), 및 관련없는 6xHis-태그된 단백질(반응 대조군으로서)을 25 RU의 최대 결합을 보증하는 수준에서 포착하였다. 300-0.41 nM 범위의 다양한 농도의 Fab 제제를 포착된 리간드 위에서 동시에 50 ul/분의 유속으로 작동 완충제(HBS + 0.05% P-20, 1 mg/mL BSA) 속에서, 240s 회합을 위해 해리의 지속시간을 변화시키면서 통과시켰다. 데이타를 His-태그된 리간드를 함유하지 않는 이중-참조, 및 0 nM 분석물 농도 둘 다에 대해 이중-참조하여 포착 모이어티로부터 리간드의 해리에 대해 설명하였다. 이후에, 데이타를 불균질 리간드 모델 또는 세계적인 1:1 피트를 사용하여 분석하였다.
전체의 IgG를 위해, 항-마우스 항체를 센서 칩 C1(덱스트란 사슬 결여)에서 아민 커플링을 통해 고정시키고, 라미닌 mAb를 50 RU의 분석물의 최대 결합을 보증하는 수준으로 포착하였다. 31.25 nM 내지 0.122 nM 범위의 분석물(재조합 인간 또는 Q826에서 시작하는 마우스 His-라미닌- α4 단편 (R&D Systems))의 다양한 농도를 포착된 리간드 위에 30 ul/분으로 작동 완충제 (기재된 것을 제외하고는, HBS + 0.05% P-20, 1 mg/mL BSA) 속에서 180초의 회합/900초의 해리로 통과시켰다. 데이타를 His-태그된 리간드를 함유하지 않는 이중-참조, 및 0 nM 분석물 농도 둘 다에 대해 이중-참조하여 포착 모이어티로부터 리간드의 해리에 대해 설명하였다. 가능하다면, 데이타를 세계적인 1:1 피트를 사용하여 분석하였다. 동력학 센서그램 곡률이 적절한 모델-핏팅을 허용하지 않을 경우, 정상상태 근사치를 수행하고 기록하였다.
사포린-매개된 WM-266-4 세포 독성 검정
제조자의 설명서(Advanced Targeting Systems)에 따름.
인간 흑색종 조직 및 종양 마이크로어레이 슬라이드
비고정된 건강한 및 흑색종 인간 피부 슬라이드를 Origene으로부터 수득하였다. 아세톤-고정된 종양 마이크로어레이 (TMA) 슬라이드는 Biochain으로부터 수득하였다.
SEQUENCE LISTING <110> TAM, Stephen Jed LIU, Yue BARBOUR, Robin YEDNOCK, Theodore <120> ANTI-LAMININ4 ANTIBODIES SPECIFIC FOR LG4-5 <130> 057450/459012 <150> US 61/952,132 <151> 2014-03-12 <150> US 62/023,760 <151> 2014-07-11 <150> US 62/068,349 <151> 2014-10-24 <160> 102 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1823 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Leu Ser Ser Ala Trp Arg Ser Val Leu Pro Leu Trp Leu Leu 1 5 10 15 Trp Ser Ala Ala Cys Ser Arg Ala Ala Ser Gly Asp Asp Asn Ala Phe 20 25 30 Pro Phe Asp Ile Glu Gly Ser Ser Ala Val Gly Arg Gln Asp Pro Pro 35 40 45 Glu Thr Ser Glu Pro Arg Val Ala Leu Gly Arg Leu Pro Pro Ala Ala 50 55 60 Glu Lys Cys Asn Ala Gly Phe Phe His Thr Leu Ser Gly Glu Cys Val 65 70 75 80 Pro Cys Asp Cys Asn Gly Asn Ser Asn Glu Cys Leu Asp Gly Ser Gly 85 90 95 Tyr Cys Val His Cys Gln Arg Asn Thr Thr Gly Glu His Cys Glu Lys 100 105 110 Cys Leu Asp Gly Tyr Ile Gly Asp Ser Ile Arg Gly Ala Pro Gln Phe 115 120 125 Cys Gln Pro Cys Pro Cys Pro Leu Pro His 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agaaaccagg gcagcctcct aaagtgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gg 342 <210> 69 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6C12 heavy chain variable region signal peptide <400> 69 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcc 57 <210> 70 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6C12 light chain variable region signal peptide <400> 70 atggaatcac agactcaggt cctcatgtcc ctgctgttct gggtatctgg tacctgtggg 60 <210> 71 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13G10 mature heavy chain variable region, v1 <400> 71 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgaa ctggcgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcaca aactatggaa taagctgggt gaagcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagcg atttatccta gaagtggtaa tacttactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacactg 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aatatctggt gcaaccagtt tggaaactgg ggttccttca 180 agattcactg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca gcattaccag tcttcagact 240 gaagatgttg ctacttatta ctgtcaacag tattggagtc ctcctcggac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324 <210> 74 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13G10 heavy chain variable region signal peptide, v1 <400> 74 atggaatgga tctggatctt tctcttcatc ctgtcaggaa ctgcaggtgt ccaatcc 57 <210> 75 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13G10 heavy chain variable region signal peptide, v2 <400> 75 atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcc 57 <210> 76 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13G10 light chain variable region signal peptide <400> 76 atgaagtttc cttctcaact tctgctctta ctgctgtttg gaatcccagg catgatatgt 60 <210> 77 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 77 gaggttcagc tgcagcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctgggagtag tgtgaagctg 60 tcctgcaagg cttcaggcta taccttcaca agttatggtt 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aatcggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggaaatgctc ctaggctctt aatatctggt gcaaccagtt tggaaactgg ggttccttca 180 agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca ccattagcag tcttcagact 240 gaagattttg ctacttatta ctgtcaacag tattggagta ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaaag tggaaataaa acgt 324 <210> 80 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 80 gacatccaga tgacacaatc tccatcctcc ctttctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 attacttgca aggcaagtga ggacatatat aatcggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggaaatgctc ctaagctctt aatatctggt gcaaccagtt tggaaactgg ggttccttca 180 agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat ttcactctca ccattagcag tcttcagcct 240 gaagattttg ctacttatta ctgtcaacag tattggagta ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaaag tggaaataaa acgt 324 <210> 81 <211> 2976 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G domain of human LAMA4 <400> 81 agcaagatcc aagtctccat gatgtttgat ggccagtcag ctgtggaagt gcactcgaga 60 accagtatgg atgacttaaa ggccttcacg tctctgagcc tgtacatgaa accccctgtg 120 aagcggccgg aactgaccga gactgcagat cagtttatcc tgtacctcgg aagcaaaaac 180 gccaaaaaag agtatatggg tcttgcaatc aaaaatgata atctggtata cgtctataat 240 ttgggaacta aagatgtgga gattcccctg gactccaagc ccgtcagttc ctggcctgct 300 tacttcagca ttgtcaagat tgaaagggtg ggaaaacatg gaaaggtgtt tttaacagtc 360 ccgagtctaa gtagcacagc agaggaaaag ttcattaaaa agggggaatt ttcgggagat 420 gactctctgc tggacctgga ccctgaggac acagtgtttt atgttggtgg agtgccttcc 480 aacttcaagc tccctaccag cttaaacctg cctggctttg ttggctgcct ggaactggcc 540 actttgaata atgatgtgat cagcttgtac aactttaagc acatctataa tatggacccc 600 tccacatcag tgccatgtgc ccgagataag ctggccttca ctcagagtcg ggctgccagt 660 tacttcttcg atggctccgg ttatgccgtg gtgagagaca tcacaaggag agggaaattt 720 ggtcaggtga ctcgctttga catagaagtt cgaacaccag ctgacaacgg ccttattctc 780 ctgatggtca atggaagtat gtttttcaga ctggaaatgc gcaatggtta cctacatgtg 840 ttctatgatt ttggattcag cagtggccgt gtgcatcttg aagatacgtt aaagaaagct 900 caaattaatg atgcaaaata ccatgagatc tcaatcattt accacaatga taagaaaatg 960 atcttggtag ttgacagaag 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accttcatgg gatcctgttg ctctgaaact cccagagcgg 1860 aatactccaa gaaactctca ttgccacctt tccaacagcc ctagagcaat agagcacgcc 1920 tatcaatatg gaggaacagc caacagccgc caagagtttg aacacttaaa aggagatttt 1980 ggtgccaaat ctcagttttc cattcgtctg agaactcgtt cctcccatgg catgatcttc 2040 tatgtctcag atcaagaaga gaatgacttc atgactctat ttttggccca tggccgcttg 2100 gtttacatgt ttaatgttgg tcacaaaaaa ctgaagatta gaagccagga gaaatacaat 2160 gatggcctgt ggcatgatgt gatatttatt cgagaaagga gcagtggccg actggtaatt 2220 gatggtctcc gagtcctaga agaaagtctt cctcctactg aagctacctg gaaaatcaag 2280 ggtcccattt atttgggagg tgtggctcct ggaaaggctg tgaaaaatgt tcagattaac 2340 tccatctaca gttttagtgg ctgtctcagc aatctccagc tcaatggggc ctccatcacc 2400 tctgcttctc agacattcag tgtgacccct tgctttgaag gccccatgga aacaggaact 2460 tacttttcaa cagaaggagg atacgtggtt ctagatgaat ctttcaatat tggattgaag 2520 tttgaaattg catttgaagt ccgtcccaga agcagttccg gaaccctggt ccacggccac 2580 agtgtcaatg gggagtacct aaatgttcac atgaaaaatg gacaggtcat agtgaaagtc 2640 aataatggca tcagagattt ttccacctca gtaacaccca agcagagtct ctgtgatggc 2700 agatggcaca gaattacagt tattagagat tctaatgtgg ttcagttgga tgtggactct 2760 gaagtgaacc atgtggttgg acccctgaat ccaaaaccaa ttgatcacag ggagcctgtg 2820 tttgttggag gtgttccaga atctctactg acaccacgct tggcccccag caaacccttc 2880 acaggctgca tacgccactt tgtgattgat ggacacccag tgagcttcag taaagcagcc 2940 ctggtcagcg gcgccgtaag catcaactcc tgtcca 2976 <210> 82 <211> 618 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG1 module of G domain of human LAMA4 <400> 82 agcaagatcc aagtctccat gatgtttgat ggccagtcag ctgtggaagt gcactcgaga 60 accagtatgg atgacttaaa ggccttcacg tctctgagcc tgtacatgaa accccctgtg 120 aagcggccgg aactgaccga gactgcagat cagtttatcc tgtacctcgg aagcaaaaac 180 gccaaaaaag agtatatggg tcttgcaatc aaaaatgata atctggtata cgtctataat 240 ttgggaacta aagatgtgga gattcccctg gactccaagc ccgtcagttc ctggcctgct 300 tacttcagca ttgtcaagat tgaaagggtg ggaaaacatg gaaaggtgtt tttaacagtc 360 ccgagtctaa gtagcacagc agaggaaaag ttcattaaaa agggggaatt ttcgggagat 420 gactctctgc tggacctgga ccctgaggac acagtgtttt atgttggtgg agtgccttcc 480 aacttcaagc tccctaccag cttaaacctg cctggctttg ttggctgcct ggaactggcc 540 actttgaata atgatgtgat cagcttgtac aactttaagc acatctataa tatggacccc 600 tccacatcag tgccatgt 618 <210> 83 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG2 module of G domain of human LAMA4 <400> 83 gccagttact tcttcgatgg ctccggttat gccgtggtga gagacatcac aaggagaggg 60 aaatttggtc aggtgactcg ctttgacata gaagttcgaa caccagctga caacggcctt 120 attctcctga tggtcaatgg aagtatgttt ttcagactgg aaatgcgcaa tggttaccta 180 catgtgttct atgattttgg attcagcagt ggccgtgtgc atcttgaaga tacgttaaag 240 aaagctcaaa ttaatgatgc aaaataccat gagatctcaa tcatttacca caatgataag 300 aaaatgatct tggtagttga cagaaggcat gtcaagagca tggataatga aaagatgaaa 360 atacctttta cagatatata cattggagga gctcctccag aaatcttaca atccagggcc 420 ctcagagcac accttcccct agatatcaac ttcagaggat gcatgaaggg cttccagttc 480 caaaagaagg acttcaattt actggagcag acagaaaccc tgggagttgg ttatggatgc 540 <210> 84 <211> 507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG3 module of G domain of human LAMA4 <400> 84 tctcgcagag catatttcaa tggacagagc ttcattgctt caattcagaa aatatctttc 60 tttgatggct ttgaaggagg ttttaatttc cgaacattac aaccaaatgg gttactattc 120 tattatgctt cagggtcaga cgtgttctcc atctcactgg ataatggtac tgtcatcatg 180 gatgtaaagg gaatcaaagt tcagtcagta gataagcagt acaatgatgg gctgtcccac 240 ttcgtcatta gctctgtctc acccacaaga tatgaactga tagtagataa aagcagagtt 300 gggagtaaga atcctaccaa agggaaaata gaacagacac aagcaagtga aaagaagttt 360 tacttcggtg gctcaccaat cagtgctcag tatgctaatt tcactggctg cataagtaat 420 gcctacttta ccagggtgga tagagatgtg gaggttgaag atttccaacg gtatactgaa 480 aaggtccaca cttctcttta tgagtgt 507 <210> 85 <211> 1803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG1-3 modules of G domain of human LAMA4 <400> 85 agcaagatcc aagtctccat gatgtttgat ggccagtcag ctgtggaagt gcactcgaga 60 accagtatgg atgacttaaa ggccttcacg tctctgagcc tgtacatgaa accccctgtg 120 aagcggccgg aactgaccga gactgcagat cagtttatcc tgtacctcgg aagcaaaaac 180 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tatacattgg aggagctcct ccagaaatct tacaatccag ggccctcaga 1080 gcacaccttc ccctagatat caacttcaga ggatgcatga agggcttcca gttccaaaag 1140 aaggacttca atttactgga gcagacagaa accctgggag ttggttatgg atgcccagaa 1200 gactcactta tatctcgcag agcatatttc aatggacaga gcttcattgc ttcaattcag 1260 aaaatatctt tctttgatgg ctttgaagga ggttttaatt tccgaacatt acaaccaaat 1320 gggttactat tctattatgc ttcagggtca gacgtgttct ccatctcact ggataatggt 1380 actgtcatca tggatgtaaa gggaatcaaa gttcagtcag tagataagca gtacaatgat 1440 gggctgtccc acttcgtcat tagctctgtc tcacccacaa gatatgaact gatagtagat 1500 aaaagcagag ttgggagtaa gaatcctacc aaagggaaaa tagaacagac acaagcaagt 1560 gaaaagaagt tttacttcgg tggctcacca atcagtgctc agtatgctaa tttcactggc 1620 tgcataagta atgcctactt taccagggtg gatagagatg tggaggttga agatttccaa 1680 cggtatactg aaaaggtcca cacttctctt tatgagtgtc ccattgagtc ttcaccattg 1740 tttctcctcc ataaaaaagg aaaaaattta tccaagccta aagcaagtca gaataaaaag 1800 gga 1803 <210> 86 <211> 513 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG4 module of G domain of human LAMA4 <400> 86 tatcaatatg gaggaacagc caacagccgc caagagtttg aacacttaaa aggagatttt 60 ggtgccaaat ctcagttttc cattcgtctg agaactcgtt cctcccatgg catgatcttc 120 tatgtctcag atcaagaaga gaatgacttc atgactctat ttttggccca tggccgcttg 180 gtttacatgt ttaatgttgg tcacaaaaaa ctgaagatta gaagccagga gaaatacaat 240 gatggcctgt ggcatgatgt gatatttatt cgagaaagga gcagtggccg actggtaatt 300 gatggtctcc gagtcctaga agaaagtctt cctcctactg aagctacctg gaaaatcaag 360 ggtcccattt atttgggagg tgtggctcct ggaaaggctg tgaaaaatgt tcagattaac 420 tccatctaca gttttagtgg ctgtctcagc aatctccagc tcaatggggc ctccatcacc 480 tctgcttctc agacattcag tgtgacccct tgc 513 <210> 87 <211> 522 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG5 module of G domain of human LAMA4 <400> 87 acaggaactt acttttcaac agaaggagga tacgtggttc tagatgaatc tttcaatatt 60 ggattgaagt ttgaaattgc atttgaagtc cgtcccagaa gcagttccgg aaccctggtc 120 cacggccaca gtgtcaatgg ggagtaccta aatgttcaca tgaaaaatgg acaggtcata 180 gtgaaagtca ataatggcat cagagatttt tccacctcag taacacccaa gcagagtctc 240 tgtgatggca gatggcacag aattacagtt attagagatt ctaatgtggt tcagttggat 300 gtggactctg aagtgaacca tgtggttgga cccctgaatc caaaaccaat tgatcacagg 360 gagcctgtgt ttgttggagg tgttccagaa tctctactga caccacgctt ggcccccagc 420 aaacccttca caggctgcat acgccacttt gtgattgatg gacacccagt gagcttcagt 480 aaagcagccc tggtcagcgg cgccgtaagc atcaactcct gt 522 <210> 88 <211> 1107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LG4-5 modules of G domain of human LAMA4 <400> 88 agaaactctc attgccacct ttccaacagc cctagagcaa tagagcacgc ctatcaatat 60 ggaggaacag ccaacagccg ccaagagttt gaacacttaa aaggagattt tggtgccaaa 120 tctcagtttt ccattcgtct gagaactcgt tcctcccatg gcatgatctt ctatgtctca 180 gatcaagaag agaatgactt catgactcta tttttggccc atggccgctt ggtttacatg 240 tttaatgttg gtcacaaaaa actgaagatt agaagccagg agaaatacaa tgatggcctg 300 tggcatgatg tgatatttat tcgagaaagg agcagtggcc gactggtaat tgatggtctc 360 cgagtcctag aagaaagtct tcctcctact gaagctacct ggaaaatcaa gggtcccatt 420 tatttgggag gtgtggctcc tggaaaggct gtgaaaaatg ttcagattaa ctccatctac 480 agttttagtg gctgtctcag caatctccag ctcaatgggg cctccatcac ctctgcttct 540 cagacattca gtgtgacccc ttgctttgaa ggccccatgg aaacaggaac ttacttttca 600 acagaaggag gatacgtggt tctagatgaa tctttcaata ttggattgaa gtttgaaatt 660 gcatttgaag tccgtcccag aagcagttcc ggaaccctgg tccacggcca cagtgtcaat 720 ggggagtacc taaatgttca catgaaaaat ggacaggtca tagtgaaagt caataatggc 780 atcagagatt tttccacctc agtaacaccc aagcagagtc tctgtgatgg cagatggcac 840 agaattacag ttattagaga ttctaatgtg gttcagttgg atgtggactc tgaagtgaac 900 catgtggttg gacccctgaa tccaaaacca attgatcaca gggagcctgt gtttgttgga 960 ggtgttccag aatctctact gacaccacgc ttggccccca gcaaaccctt cacaggctgc 1020 atacgccact ttgtgattga tggacaccca gtgagcttca gtaaagcagc cctggtcagc 1080 ggcgccgtaa gcatcaactc ctgtcca 1107 <210> 89 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary human IgG1 constant region of IgG1 G1m3 allotype <400> 89 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser 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Gly Ile Ser Asn Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Gln 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 99 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6C12 mature light chain variable region, v2 <400> 99 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctatta aacagtggaa atcaaaagaa ctacttgacc 120 tggtaccaac agaaaccagg gcagcctcct aaagtgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac gg 342 <210> 100 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 100 gacatccaga tgacacaatc ttcatcctcc ctttctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 attacttgca aggcaagtga ggacatatat aatcggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggaaatgctc ctaggctctt aatatctggt gcaaccagtt tggaaactgg ggttccttca 180 agattcagtg gcagtggatc tggaaaggat tacactctca ccattagcag tcttcagact 240 gaagattttg ctacttatta ctgtcaacag tattggagta ttccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaaat tggaaataaa acgt 324 <210> 101 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary human IgG1 constant region of IgG1 G1m3 allotype <400> 101 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 102 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary human kappa light chain constant region without a N-terminal arginine <400> 102 actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60 actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120 aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180 aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240 cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300 ttcaacaggg gagagtgt 318

Claims (95)

  1. 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5모듈 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체.
  2. 청구항 1에 있어서, 라미닌 α4의 MCAM에의 결합를 저해하지 않는, 항체.
  3. 청구항 1에 있어서, LG4 내의 에피토프에 결합하는, 항체.
  4. 청구항 1에 있어서, LG5 내의 에피토프에 결합하는, 항체.
  5. 청구항 1에 있어서, LG4 및 LG4 둘 모두가 잔기에 기여하는 에피토프에 결합하는, 항체.
  6. 청구항 1에 있어서, 라미닌 α4의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에의 결합을 저해하는, 항체.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-1 인, 항체.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-2 인, 항체.
  9. 청구항 6에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-3 인, 항체.
  10. 청구항 6에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-4인, 항체.
  11. 청구항 6에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 글리피칸, 베타글리칸, CD44, 퍼레칸, 아그린, 또는 콜라겐 XVIII인, 항체.
  12. 청구항 1에 있어서, 대조군 샘플과 비교될 때, 암 세포를 포함하는 생물학적 샘플에 선택적으로 결합하는, 항체.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 대조군 샘플 및 상기 생물학적 샘플은 동일한 조직 기원의 세포를 포함하는, 항체.
  14. 청구항 12 또는 13에 있어서, 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 결합은 상기 항체의 상기 대조군 샘플에의 결합보다. 적어도 2-배 큰 것인, 항체.
  15. 청구항 12 또는 13에 있어서, 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 결합은 상기 항체의 상기 대조군 샘플에의 결합보다. 적어도 5-배 큰 것인, 항체.
  16. 청구항 12 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 세포는 흑색종 세포를 포함하는, 항체.
  17. 청구항 1에 있어서, 서열식별번호:16의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:17의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 항체 15F7, 또는 서열식별번호:26의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:27의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 항체 6C12, 또는 서열식별번호:36 또는 37의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:38의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 항체 13G10과 경쟁하는, 항체.
  18. 청구항 1에 있어서, 15F7, 6C12, 또는 13G10와 라미닌 α4 상의 동일한 에피토프에 결합하는, 항체.
  19. 청구항 1에 있어서, 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR으로 포함하고, 여기서 각각의 CDR은 15F7 (서열식별번호:16 및 17 각각), 6C12 (서열식별번호:26 및 27 각각), 또는 13G10 (서열식별번호:36/37 및 38 각각)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터 상응하는 CDR에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 항체.
  20. 청구항 1에 있어서, 15F7, 6C12, 또는 13G10의 3개의 중쇄 CDR 및 3개의 경쇄 CDR을 포함하는, 항체.
  21. 청구항 1 내지 20 또는 88 내지 89 중 어느 한 항에 있어서, 단클론성인, 항체.
  22. 청구항 1 내지 21 또는 88 내지 89 중 어느 한 항에 있어서, 키메라성, 인간화된, 베니어드, 또는 인간인, 항체.
  23. 청구항 1 내지 22 또는 88 내지 89 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG1 카파 아이소타입을 갖는, 항체.
  24. 라미닌 α4에 특이적으로 결합하는 인간화된 또는 키메라성 15F7 항체로서, 15F7은 서열식별번호:16의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:17의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 마우스 항체인, 인간화된 또는 키메라성 15F7 항체.
  25. 청구항 24에 있어서, 15F7 중쇄 가변 영역 (서열식별번호:16)의 3개의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄 및 15F7 경쇄 가변 영역 (서열식별번호:17)의 3개의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄를 포함하는, 인간화된 항체.
  26. 청구항 24에 있어서, 서열식별번호:58과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간화된 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:59와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 인간화된 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화된 항체.
  27. 청구항 26에 있어서, 15F7 중쇄 가변 영역 (서열식별번호:16)의 3개의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄 및 15F7 경쇄 가변 영역 (서열식별번호:17)의 3개의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄를 포함하는, 인간화된 항체.
  28. 청구항 27에 있어서, 위치 L42, L49, 및 L69 중 제공된 적어도 하나는 N, S, 및 K 각각에 의해 점거되고, 그리고 위치 H1, H20, H27, H30, H38, H40, H48, H66, H67, H75, H82A, 및 H91 중 적어도 하나는 E, L, Y, T, K, R, I, K, A, S, R, 및 F 각각에 의해 점거되는, 인간화된 항체.
  29. 청구항 28에 있어서, 제공된 위치 L42, L49, 및 L69는 N, S, 및 K 각각에 의해 점거되고, 그리고 H1, H20, H27, H30, H38, H40, H48, H66, H67, H75, H82A, 및 H91은 E, L, Y, T, K, R, I, K, A, S, R, 및 F 각각에 의해 점거되는, 인간화된 항체.
  30. 청구항 27 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 위치 L8, L45, 및 L80 중 제공된 적어도 하나는 S, R, 및 T 각각에 의해 점거되는, 인간화된 항체.
  31. 청구항 27 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 위치 H41 및 H69 중 제공된 적어도 하나는 A 및 L 각각에 의해 점거되는, 인간화된 항체.
  32. 청구항 30 또는 90에 있어서, 제공된 위치 L8, L45, 및 L80은 S, R, 및 T 각각에 의해 점거되는, 인간화된 항체.
  33. 청구항 31에서, 제공된 위치 H41 및 H69는 A 및 L 각각에 의해 점거되는,인간화된 항체.
  34. 청구항 26에 있어서, 서열식별번호:58과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:59와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 성숙한 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간화된 항체.
  35. 청구항 26에 있어서, 상기 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:57의 아미노산 서열을 가지며 상기 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:59의 아미노산 서열을 갖는, 인간화된 항체.
  36. 청구항 26에 있어서, 상기 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:57의 아미노산 서열을 가지며 상기 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:60의 아미노산 서열을 갖는, 인간화된 항체.
  37. 청구항 26에 있어서, 상기 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:58의 아미노산 서열을 가지며 상기 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:59의 아미노산 서열을 갖는, 인간화된 항체.
  38. 청구항 26에 있어서, 상기 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:58의 아미노산 서열을 가지며 상기 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:60의 아미노산 서열을 갖는, 인간화된 항체.
  39. 청구항 1 내지 38 또는 88 내지 91 중 어느 한 항에 있어서, 온전한 항체인, 항체.
  40. 청구항 1 내지 38 또는 88 내지 91 중 어느 한 항에 있어서, 단일-사슬 항체, Fab, 또는 Fab'2 단편인, 항체.
  41. 청구항 24 내지 40 또는 90 내지 91 중 어느 한 항에 있어서, 상기 성숙한 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역에 융합되고 상기 성숙한 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 융합되는, 인간화된 항체.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 천연 인간 중쇄 불변 영역에 관한 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합을 갖는 천연 인간 중쇄 불변 영역의 돌연변이체 형태인, 인간화된 항체.
  43. 청구항 41 또는 42에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 IgG1 아이소타입인, 인간화된 항체.
  44. 청구항 41에 있어서, 상기 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:61의 서열을 갖는 중쇄 불변 영역에 융합되고/되거나 상기 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:62의 서열을 갖는 경쇄 불변 영역에 융합되는, 인간화된 항체.
  45. 청구항 24 내지 44 또는 90 내지 92 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호:16 및 17 각각으로부터 성숙한 중쇄 가변 영역 및 성숙한 경쇄 가변 영역의 CDR에서의 제공된 임의의 차이는 위치 H60-H65에 있는, 인간화된 항체.
  46. 청구항 1 내지 45 또는 88 내지 92 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 치료적 또는 세포독성 약물에 접합되는, 항체.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 세포독성 약물은 사포린인, 항체.
  48. 청구항 46에 있어서, 상기 세포독성 약물은 방사선동위원소인, 항체.
  49. 청구항 1 내지 48 또는 88 내지 92 중 어느 한 항의 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  50. 청구항 1 내지 45 또는 88 내지 92 중 어느 한 항에서 기재된 항체의 중쇄 및/또는 경쇄(들)을 인코딩하는 핵산.
  51. 청구항 50에 있어서, 서열식별번호:63-64, 67-68, 71-73, 또는 77-80 중 임의의 하나를 포함하는 서열을 갖는, 핵산.
  52. 청구항 50, 51, 또는 93 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  53. 청구항 52의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  54. 하기의 단계들을 포함하는, 항체를 인간화하는 방법:
    (a) 마우스 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 서열을 결정하는 단계;
    (b) 상기 마우스 항체 중쇄의 CDR을 포함하는 인간화된 중쇄를 인코딩하는 핵산 및 상기 마우스 항체 경쇄의 CDR을 포함하는 인간화된 경쇄를 인코딩하는 핵산을 합성하는 단계;
    (c) 숙주세포에서 상기 핵산을 발현시켜 인간화된 항체를 생산하는 단계;
    상기 마우스 항체는 15F7, 6C12, 또는 13G10이다.
  55. 하기의 단계들을 포함하는, 인간화된, 키메라성, 또는 베니어드 항체를 생산하는 방법:
    (a) 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산으로 형질전환된 세포를 배양하고, 이로써 상기 세포가 항체를 분비하는 단계; 및
    (b) 세포 배양 배지로부터의 상기 항체를 정제하는 단계;
    상기 항체는 인간화된, 키메라성, 또는 베니어드 형태의 15F7, 6C12, 또는 13G10이다.
  56. 하기의 단계들을 포함하는, 인간화된, 키메라성, 또는 베니어드 항체를 생산하는 항체를 생산하는 방법:
    (a) 선별 마커 및 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 벡터를 세포에 도입하는 단계;
    (b) 벡터의 증가된 복제수를 갖는 세포를 선별하기 위한 조건 하에서 상기 세포를 전파시키는 단계;
    (c) 단일 세포를 상기 선택된 세포로부터 단리하는 단계; 및
    (d) 항체의 수율을 기준으로 선택된 단일 세포로부터 클로닝된 세포를 뱅킹하는 단계;
    상기 항체는 인간화된, 키메라성, 또는 베니어드 형태의 15F7, 6C12, 또는 13G10이다.
  57. 청구항 56에 있어서, 상기 세포를 선택적 조건 하에서 전파시키고 적어도 100 mg/L/106 세포/24h를 천연적으로 발현시키고 분비하는 세포주를 스크리닝하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  58. 암을 가지고 있거나 그 위험이 있는 환자에서 암을 치료하거나 그것의 예방에 영향을 주는 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 효과적인 레짐의 청구항 1 내지 48 또는 88 내지 92 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  59. 청구항 58에 있어서, 상기 환자는 암이 있고, 상기 암은 흑색종, 유방암, 폐암, 또는 결장직장암인, 방법.
  60. 생물학적 샘플에서 세포 부착을 저해하는 방법으로서, 상기 방법은 생물학적 샘플을 유효량의 청구항 1 내지 48 또는 88 내지 92 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  61. 청구항 60에 있어서, 상기 세포 부착은 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈에 의해 매개되는, 방법.
  62. 청구항 60에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 암 세포를 포함하는, 방법.
  63. 하기의 단계들을 포함하는, 생물학적 샘플에서 암의 존재를 검출하는 방법:
    (a) 상기 생물학적 샘플을 청구항 1 내지 48 또는 88 내지 92 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 결합을 검출하는 단계;
    (c) 대조군 샘플을 청구항 1 내지 48 또는 88 내지 92 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 항체의 상기 대조군 샘플에의 결합을 검출하는 단계; 및
    (e) 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 결합을 상기 항체의 상기 대조군 샘플에의 결합과 비교하는 단계로서, 이로써 상기 대조군 샘플과 비교된 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 증가된 결합은 생물학적 샘플에서 암의 존재를 나타내는 단계.
  64. 청구항 63에 있어서, 상기 대조군 샘플 및 상기 생물학적 샘플은 동일한 조직 기원의 세포를 포함하는, 방법.
  65. 청구항 63 또는 64에 있어서, 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 결합은 상기 항체의 상기 대조군 샘플에의 결합보다. 적어도 2-배 큰 것인, 방법.
  66. 청구항 63 또는 64에 있어서, 상기 항체의 상기 생물학적 샘플에의 결합은 상기 항체의 상기 대조군 샘플에의 결합보다. 적어도 5-배 큰 것인, 방법.
  67. 청구항 63 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 흑색종인, 방법.
  68. 하기의 단계들을 포함하는, 암이 있는 것으로 진단된 환자에서 치료제의 효능을 평가하는 방법:
    (a) 치료제에 의한 치료 전에 수득된, 환자로부터의 제1 생물학적 샘플을, 청구항 1 내지 48 또는 88 내지 92 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 항체의 상기 제1 생물학적 샘플에의 결합을 검출하는 단계;
    (c) 치료제에 의한 치료 다음에 수득된, 환자로부터의 제2 생물학적 샘플을, 청구항 1 내지 48 또는 88 내지 92 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계;
    (d) 상기 항체의 제2 생물학적 샘플에의 결합을 검출하는 단계;
    (e) 상기 항체의 상기 제1 생물학적 샘플에의 결합을 상기 항체의 제2 생물학적 샘플에의 결합과 비교하는 단계로서, 이로써 상기 제1 생물학적 샘플과 비교된 상기 항체의 상기 제2 생물학적 샘플에의 감소된 결합은, 상기 치료제가 환자에서 암을 치료하는데 효과이라는 것을 나타내는 단계.
  69. 생물학적 샘플에서 라미닌 α4의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸에의 결합을 저해하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 청구항 1 내지 48 또는 88 내지 92 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-1 인, 방법.
  71. 청구항 69에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-2 인, 방법.
  72. 청구항 69에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-3 인, 방법.
  73. 청구항 69에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-4인, 방법.
  74. 청구항 69에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 글리피칸, 베타글리칸, CD44, 퍼레칸, 아그린, 또는 콜라겐 XVIII인, 방법.
  75. 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈이 질환의 진행에 기여하는 질환을 치료하거나 그것의 예방에 영향을 미치는 방법으로서, 상기 방법은 질환을 가지고 있거나 그 위험이 있는 환자에게 효과적인 레짐의 청구항 1 내지 48 또는 88 내지 92 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  76. 청구항 75에 있어서, 상기 질환은 암인, 방법.
  77. 청구항 76에 있어서, 상기 암은 흑색종, 유방암, 폐암, 또는 결장직장암인, 방법.
  78. 청구항 75에 있어서, 상기 라미닌 α4의 G 도메인의 LG4-5 모듈은 헤파란 설페이트 프로테오글리칸과의 상호작용에 의하 질환의 진행에 기여하는, 방법.
  79. 청구항 78에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-1인, 방법.
  80. 청구항 78에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-2인, 방법.
  81. 청구항 78에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-3인, 방법.
  82. 청구항 78에 있어서, 상기 헤파란 설페이트 프로테오글리칸은 신데칸-4인, 방법.
  83. 청구항 75에 있어서, 상기 질환은 건선, 유육종증, 다발성 경화증, 또는 건선성 관절염인, 방법.
  84. 자가면역 질환을 가지고 있거나 그 위험이 있는 환자에서 자가면역 질환 을 치료하거나 그것의 예방에 영향을 주는 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 효과적인 레짐의 청구항 1 내지 48 또는 88 내지 92 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  85. 청구항 84에 있어서, 상기 질환은 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 강직인 증후군, 류마티스성 관절염, 중증 근무력증, 전신 홍반성 낭창, 소아지방변증, 건선, 건선성 관절염, 유육종증, 강직 척추염, 쇼그렌 증후군, 또는 포도막염인, 방법.
  86. 환자에서 혈관신생을 저해하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 효과적인 레짐의 청구항 1 내지 48 또는 88 내지 92 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  87. 청구항 86에 있어서, 상기 환자는 암이 있는, 방법.
  88. 청구항 1에 있어서, 서열식별번호:16의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:17의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 항체 15F7, 또는 서열식별번호:26의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:27 또는 94의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 항체 6C12, 또는 서열식별번호:36 또는 37의 성숙한 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호:38의 성숙한 경쇄 가변 영역을 특징으로 하는 항체 13G10와 경쟁하는, 항체.
  89. 청구항 1에 있어서, 3개의 경쇄 CDR 및 3개의 중쇄 CDR을 포함하고, 여기서 각각의 CDR은 15F7 (서열식별번호:16 및 17 각각), 6C12 (서열식별번호:26 및 27/94 각각), 또는 13G10 (서열식별번호:36/37 및 38 각각)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로부터 상응하는 CDR에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 항체.
  90. 청구항 27 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 제공된 위치 L8, L45, L80, 및 L104 중 적어도 하나는 S, R, T, 및 V 각각에 의해 점거되는, 인간화된 항체.
  91. 청구항 90에 있어서, 제공된 위치 L104는 V에 의해 점거되는, 인간화된 항체.
  92. 청구항 41에 있어서, 상기 성숙한 중쇄 가변 영역은 서열식별번호:61, 89, 또는 101의 서열을 갖는 중쇄 불변 영역에 융합되고/되거나 상기 성숙한 경쇄 가변 영역은 서열식별번호:62 또는 90의 서열을 갖는 경쇄 불변 영역에 융합되는, 인간화된 항체.
  93. 청구항 50에 있어서, 서열식별번호:63-64, 67-68, 71-73, 77-80, 92-93, 99-100, 또는 102 중 임의의 하나를 포함하는 서열을 갖는, 핵산.
  94. 비만 또는 비만-관련된 질환을 가지고 있거나 그 위험이 있는 환자에서 비만 또는 비만-관련된 질환을 치료하거나 그것의 예방에 영향을 주는 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 효과적인 레짐의 청구항 1 내지 48 또는 88 내지 92 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  95. 청구항 79에 있어서, 상기 비만-관련된 질환은 비-알코올성 지방간염 (NASH), 프라다-윌리 증후군, 두개인두종, 바데트-비들 증후군, 코헨 증후군, 또는 MOMO 증후군인, 방법.
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