KR20160143775A - iNOS-억제 조성물들 및 이들의 유방암 치료제로서의 용도 - Google Patents

iNOS-억제 조성물들 및 이들의 유방암 치료제로서의 용도 Download PDF

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Abstract

하나 이상의 포유류 암들을 치료하는 방법들, 특히 하나 또는 그 이상의 iNOS 패스웨이 억제 화합물을 적용하여, 그 자체로만, 또는 하나 또는 그 이상의 칼슘 채널 길항제들을 포함하거나 또는 그 자체만 포함하는 선택적인 항고혈압제들과 조합하고, 및 더 나아가 하나 또는 그 이상의 기존의 화학료법제 또는 항암치료제들과 조합하여 인간의 유방암을 치료하는 방법을 공개한다. 또한 이들의 조성들을 포함한 특정한 치료 처방들 및 이들을 난치성, 전이성 및 재발성 암들을 치료하는 데 사용하는 방법들, 및 특히 삼중-네가티브 인간 유방암의 치료저항성을 관리하거나 역전시키는 방법들을 공개한다.

Description

iNOS-억제 조성물들 및 이들의 유방암 치료제로서의 용도{INOS-INHIBITORY COMPOSITIONS AND THEIR USE AS BREAST CANCER THERAPEUTICS}
관련 출원과의 교차-참고(Cross-Reference)
본 출원은 2014년 4월 8일 제출된 미국 가출원(Provisional Patent Application) No. 61/976,956(pending; Atty. Dkt. No. 37182.170)에 대한 우선권으로써 청구한다; 본 내용이 특별히 여기에 전부 참고로 표현되어 병합되었다.
연방정부의 지원된 연구 개발에 대한 서술
본 발명은 정부지원으로 국립보건원(National Institutes of Health; NIH) 연구비 R01-CA138197의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 일부 권리를 갖는다.
공동연구 파트너의 이름들
적용대상 아님
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 의료 및 암생물학 분야와 관련이 있다. 특히, 이 발명은 하나 또는 그 이상의 인간 암들의 증상을 치료 및/또는 완화시키는 개선된 화학치료요법제 조성들을 제공한다. 보여주는 예시들에서는 iNOS 패스웨이의 하나 또는 그 이상의 이펙터들(effectors)을 투여하여 인간 유방암을 치료하는 방법들이 제공된다. 보기 예시들에서, iNOS 억제제들을, 예를 들어 NG-모노메틸-L-아르기닌(L-NMMA;C9H2ON4O4; MW 248.28), 단독으로 또는 칼슘채널 길항제를 포함한 항고혈압제제하나 또는 그 이상과 병행하여, 포유류 유방암들, 특히 사람의 삼중-네가티브 유방암 (TNBC)의 치료, 기존의 화학요법제에 내성을 나타내는 저항성인 형태의 질병, 예후가 나쁜 질병을 치료하는 치료처방으로 제공한다.
관련 기술
유방암의 생물학에 많은 진전이 있었음에도 불구하고 고도로 진행된 유방암에 대한 치료의 진전에는 한계가 있어 왔으며, 지난 수 십년 동안 치료에 불응하는 여성의 전이성 유방암의 전체적인 생존율을 거의 변화시키지 못하였다. 약 40,000 명의 전이성 유방암 여성들이 매년 치료 불응 및 현재의 치료법에 실패하여 죽고 있다. 고전적인 발암 모델들에서는 세포의 돌연변이들이 제대로 조합되어 축적됨으로서 어떤 세포도 형질전환 될 수 있어 발암은 산발적이거나 또는 확률적이라고 서술될 수 있다.
다른 모델에서는 세포의 부차집단(subpopulations) 또는 클론들이 발암을 유도하는 자체-재생은 물론 분화의 능력을 포함하는 핵심 스템-유사(stem-like) 성질들을 그대로 유지하고 있어 이들이 세포의 불균일성 (이종성)에 기여한다는 모델이다. 이러한 종양 내의 클론적인 이종성을 뒷받침하는 실험적인 증명은 딕스 (Dick et al.) 등에 의해 인간 백혈병에서 처음 보고되었다. 그 후 이러한 개념들은 다른 그룹들에 의해 고형종양들에도 확장되었으며 인간의 유방암들이 세포표면에 CD44+/CD24-/low3 를 발현하는 특징을 가지는 스템-유사 세포에 의해 유도된다는 것을 보여 주었다. 대규모의 고형암들에 대한 서열분석으로 각각의 종양들 내에 광범위한 이종성이 있음이 더 증명되고 있다. 이 종양 내의 이종성이 아마도 치료에 대한 내성 및 치료 실패의 주된 요인이 될 것이다. 다른 부차 집단들은 잡다한 단백질의 기능과 연관되어 있을 수 있으며 이로써 종양 적응성을 길러 다윈적인 선택으로 치료실패를 야기할 수 있다. 그러므로 이종(heterogeneous)의 커다란 종양 내에 스템-유사 성질을 가진 세포의 부차 집단들은 종양의 시작과 재발에 원인이 되는 것으로 보여진다.
세 그룹들이 각각 독립적으로 신경교아세포종양(glioblastomas(GBM)), 편평상피세포종양(squamous skin tumors) 및 장내 양성종양(intestinal adenomas)에서 가계추적 실험 및 더 나아가 암의 계층적 성질 확인을 통해 스템-유사 성질을 가진 세포들이 존재한다는 직접적이고 기능적인 증거를 제공하였다. 이 각각의 독립적인 그룹들은 세포의 커다란 종양 내의 일부만이 클론생성적인(clonogenic) 잠재력이 있으며 이 부분이 본질적으로 화학요법제에 내성을 보이는 것을 확인했다.
삼중- 네가티브 유방암(Triple-Negative Breast Cancer)
삼중-네가티브 유방암(Triple negative breast cancer; TNBC)은 에스트로겐(ERα), 프로제스테론(PR) 및 인간 상피세포 성장인자 (HER-2) 수용체들이 없고, 허가된 표적 치료제의 선택이 없는 악성이고 치명적인 형태의 암이다. 수 많은 진전이 있었음에도 불구하고, 치료 내성 및 전이는 TNBC 환자들의 사망의 주 원인이다. 전통적인 치료에의 내성 및 전이의 개시는 종양-시작 능력이 있는 부차집단의 세포들로부터 일어날 수도 있다. 화학요법치료 후에 남은 종양들은 CD44+/CD24-/ low 가 풍부해진 세포로 자체-재생능력과 간엽성(mesenchymal) 성질들을 보여준다. 이 암줄기세포(스템셀,CSCs)들은 종양 성장을 다시-시작할 수 있고 전이의 기원이 될수 있다. 그러므로 전통적인 화학요법치료와 항-CSC 화합물들과의 조합된 치료는 종양의 부담을 감소시키고, 재발은 물론 다른 기관으로의 전이도 감소시키는 데 요구될 것이다. 불행하게도 현재는 일상적인 임상에서의 사용이 가능한 그러한 조합은 없다.
현재, TNBC에 대한 표적치료제는 없다. 유도성 산화질소합성효소 (Inducible nitric oxide synthase (iNOS))는 유방암의 악성화를 증강시키는 것으로 발견되었다. 선행 연구들에서 내생적인 iNOS의 발현이 높은 것은 TNBC 환자의 생존율이 나쁜 것과 상관관계가 있고 그래서 나쁜 생존율을 예측한다는 것을 보여 주었다. 유방암 치료에서 오늘날까지 해온 진전에도 불구하고, 임상가들은 그러나 이러한 치료에, 특히 TNBC의 치료에, 사용을 위한 새로운 화학요법치료제로서-활성이 있는 제제들의 개발이 아직도 많이 필요하다는 것에 의견 일치하고 있다.
정말로, 고도로 증식적인 질병들, 특히 기존의 전통적인 화학요법치료제들에 내성이되고 있는 유방암들, 의 치료에 효과적인 새로운 제제들에 대한 아직도 상당히 충족되지 않은 의학적 요구가 있다.
유방암 환자들에서 고혈압 동반 질환(Hypertension Comorbidity)
고혈압은 유방암이 있는 여성 환자의 치사율을 증강 시키는 가장 흔한 질병이다(Sarfati et al., 2013; Gampenrieder et al., 2014). 화학요법으로-유도된 고혈압은 전이성 및 TNBC 에서 환자의 치사율을 증가시키는 일반적인 효과이다 (Cameron et al., 2013; Fan et al., 2014). 그러므로, 화학요법치료제 투여의 부작용인 불리한 고혈압을 역전시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 항-고혈압 약물들의 동시 투여는 환자의 건강을 증진시키고 생존율을 증가시키는데 중요하게 고려할 대표적인 점이다 .
본 발명은 TNBC를 치료하는데 생체 밖 및 생체 내에서의 모델로 칼슘채널 차단제들(현재 임상에서 전통적인 항-고혈압약물들로 사용되고 있는)을 같이 투여한 상승효과들을 보여주고 있다.
발명의 요약
본 발명은 iNOS 억제제들, 단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 칼슘이온 길항제들과 (느린-채널 차단제들) 조합하여, 포유류의 암들 및 특히 전이성 또는 TNBC 와 같은 인간의 유방암들을 치료하는 화학요법치료제들로서, 의 조성물을 제공함으로서 관련되는 암생물학적 및 약학적 분야 고유의 충족지 못한 이러한 및 다른 부족함에 대해 말하고자 하였다. 본 발명은 또한 iNOS 억제제 화합물들을 사용하여 새로운 암치료 증상에 사용하는 다른 목적으로의 사용방법을 제공하며, 이는 유리하게도 그러한 치료를 필요로 하는 환자들에게 기대하지 않았던 유익한점을 제공하였다.
전체적이고 일반적인 면에서, 이 발명은 일차로 이를 필요로 하는 포유류에서 암의 증상 하나 또는 그 이상을 치료 및/또는 완화시키기 위한 약학적 조성물들을 제공한다. 전형적인 예들에서, 그러한 화학요법치료제 조성물에 다음이 포함된다; 치료적으로-효과적인 양의 적어도 일차로 iNOS-억제 화합물, 1) 그 자체만으로, 2) 다른 것과 조합하여: a) 칼슘채널 길항제와 같은 항-고혈압제 하나 또는 그 이상의 치료요법적으로 효과 있는 양과 함께; c) 하나 또는 그 이상의 전통적인 화학요법치료화합물, 치료화합물, 진단화합물 또는 완화화합물; b) 칼슘채널 길항제와 같은 치료요법적으로 효과 있는 양의 하나 또는 그 이상의 항-고혈압제; 또는 3) b)로부터의 항-고혈압제 및 c)로부터의 하나 또는 그 이상의 전통적인 화합물들과 함께.
이 발명을 실행하는데 있어, 전형적인 iNOS-억제 화합물들에는, 제한없이NG-모노에틸-L-아르기닌(NG-monomethyl-L-arginine[L-NMMA]),(N-[[3-(아미노에틸]페닐]메틸]-에탄이미다미이드) [1400W] {(N-[[3-(aminomethyl)phenyl]methyl]-ethanimidamide) [1400W]}, (N5-[이미노(니트로아미노)메틸]-L-오르니틴 메틸 에스터) {[L-NAME],(N5-[imino(nitroamino)methyl]-L-ornithine methyl ester) [L-NAME]}, 은 물론 이들의 염들, 유도체들, 및 이들의 조합이 포함된다.
이와 마찬가지로, 이 발명을 실행하는데 있어, 전형적인 칼슘 채널 길항제들에는, 제한 없이, 암로디핀(amlodipine), 펠로디핀(felodipine), 락시디핀(lacidipine) 니카르디핀(nicardipine), 니발디핀(nivaldipine), 아젤니디핀(azelnidipine) 및 이들의 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택된, 하나 또는 그 이상의 항-고혈압제가 포함된다.
보여주는 예시에서, 발명자들은 하나 또는 그 이상의 iNOS 억제제들과 하나 또는 그 이상의 칼슘채널 길항제들과 동시에 투여했을 때 상승적인 치료효과가 나온다는 것을 보여주었다. 그런 한 예에서, iNOS 억제제, L-NMMA, 와 칼슘채널 길항제, 암로디핀 베실레이트 (amlodipine besylate) (NORVASC®, 3-에틸-5-메틸 (±)-2-[(2-아미노에톡시)메틸]4-(2-클로로페닐)-1,4-디하이드로-6-메틸-3,5,-피리딘디카복실레이트, 모노벤젠설포네이트; C20H25CIN2O5C6H6O3S; MW = 567.1)(NORVASC®, 3-ethyl-5-methyl (±)-2-[(2-aminoethoxy)methyl]4-(2-chlorophenyl)-1,4-dihydro-6-methyl-3,5-pyridinedicarboxylate, monobenzenesulphonate; C20H25CIN2O5C6H6O3S; MW = 567.1) 와 동시에 TNBC 세포주에 투여했을 때 특히 놀랍고 예상하지 못했던 상승효과가 얻어졌다.
선택적으로, 본 발명의 조성물은 더 나아가 하나 또는 그 이상의 추가로 별개의 다른 iNOS 억제제들, 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가로 별개의 항-고혈압제들, 및/또는 하나 또는 그 이상의 추가로 별개의 전통적인 치료들을 포함 할수 있다.
어떤 예들에서는, 발명자들은 이것에만 국한 하지는 않으나, 하나 또는 그 이상의 항-고혈압, 항종양, 세포독성제, 세포정지제, 또는 화학요법치료제 또는 이들의 조합을 포함하는 하나 또는 그 이상의 추가의 활성 성분들과 같이 조성된 하나 또는 그 이상의 iNOS 억제제 화합물들을 포함하는 동시-치료들의 조성물을 심사숙고하고 있다.
전형적인 화학요법치료제들에는, 이것에만 국한 하지는 않으나, 항암화합물로서 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 독소루비신(doxorubicin), 5-풀루오로유라실(5-fluorouracil), 도세탁셀(docetaxel), 파크리탁셀(paclitaxel), 트라스투쭈맵(trastuzumab), 메토트렉세이트(methotrexate), 에피루비신(epirubicin), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 비노렐빈(vinorelbine), 카페시타빈 (capecitabine), 겜시타빈(gemcitabine), 미토잔트론(mitoxantrone), 이사베필론(isabepilone), 에리불린(eribulin), 라파티닙 (lapatinib), 카뮤스틴(carmustine), 나이트로젠머스타드(nitrogen mustard), 설퍼 머스타드 (sulfur mustard), 플라틴 테트라니트레이트 (platin tetranitrate), 빈브라스틴(vinblastine), 에토포사이드 (etoposide), 캠토테신 (camptothecin), 토포아이소머레이즈 억제제들(topoisomerase inhibitors) (토포아이소머레이즈 I 및 II 억제제 포함) 은 물론 이들의 유도체, 유사체, 염들, 활성대사체들 또는 이들의 하나 또는 그 이상의 조합을 포함한다.
전형적인 치료제들에는, 이것에만 국한 하지는 않으나, 하나 또는 그 이상의 면역조절제, 신경활성 제제, 항염증제, 항-지질제(anti-lipidemic agent), 홀몬, 수용체 친화제(agonist) 또는 길항제, 또는 항-감염제, 또는 단백질, 펩타이드, 항체, 효소, RNA, DNA, siRNA, mRNA, 라이보자임, 홀몬, 보조인자(cofactor), 스테로이드, 안티센스 분자,및 이들의 조합 을 포함한다.
마찬가지로, 여기서 공개되는 화학요법치료 조성물의 투여는 이것만 국한하자 않으나 더 나아가 치료를 하고 있는 포유류에게 치료적으로-효과적인 양의 방사선의 투여를 포함하는 하나 또는 그 이상의 추가의 암 치료로 증강될 수 있다.
본 발명의 실행에 있어서, 공개되는 화학요법치료제 조성물들은 동물에게 전신적으로 일회투여로 투여할 수 있거나, 또는 아니면, 치료요법을 담당하고 있는 주치의가 필요하다고 생각하면 일주일 또는 몇주일 에서 한 달 또는 몇달에 걸쳐 여러번 투여할 수 있다.
바람직하게는, iNOS-억제제, 여기서 공개되는 항-암 조성물들은 하나 또는 그 이상의 약학적으로-수용할만한 운반제들, 버퍼들, 희석제들, 매체(vehicles), 부형제들 (excipients), 또는 포유류 숙주세포 및 특히 인간 숙주세포에 투여하기 에 적절한 이들의 조합이 포함한다.
다른 예에서는, 이 발명은 이를 필요로 하는 동물에서 하나 또는 그 이상의 암의 증상을 치료하거나 완화시키는 한 방법을 제공한다. 그런 방법은 전반적이고 일반적인 면에서 적어도 이를 필요로하는 동물에게 하나 또는 그 이상의 여기서 공개하는 화학요법치료제 조성물들의 효과적인 양을 동물의 암의 하나 또는 그 이상의 증상을 치유되거나 완화시키는데 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함한다.
다른 예에서는, 이 발명은 포유류 개체에서 하나 또는 그 이상의 암의 증상을 치료하거나 완화시키는 한 방법을 제공한다. 전반적이고 일반적인 면에서, 이 방법에는 적어도 이를 필요로 하는 포유류 개체에 치료적으로-효과 있는 양의 하나 또는 그 이상의 여기서 공개 되는 화학요법치료제 조성물들을 개체의 암의 하나 또는 그 이상의 증상들이 치유되거나 완화시키는데 효과적인 시간동안 투여하는 단계를 포함한다.
어떤 특정 예에서는, 발명자는 공개되는 화학요법치료제 조성물들이 예를 들어. 치료-내성이고, 삼중-네가티브인 유방암이라고 진단되거나 동정된 암을 포함한 저항성이고, 전이성이고, 재발성이고, 또는 치료-내성인 암이라고 진단되거나 동정된 암들의 상태들에 특히 유용할 것이라고 신중히 생각한다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 동물에서 하나 또는 그 이상의 암의 증상을 치유시키거나 완화시키는 한 방법을 제공한다. 그런 방법은 일반적으로 동물에게 (전신적으로, 또는 하나 또는 그 이상의 부분들 또는 부분내의 자리에 국소적으로 또는 동물의 몸체에) ) 적어도 일차 여기서 공개하는 화학요법치료제 iNOS-억제 조성물, 또는 유사체, 아고니스트, 길항제, 또는 이들의 유도체나 염을 그 자체만으로 또는 하나 또는 그상의 칼슘 채널 길항제들과 함께 효과적인 양을 동물의 암의 하나 또는 그 이상의 증상을 치유되거나 완화 시키는데 충분한 시간동안 투여하는 단계를 적어도 포함한다.
더나간 관점에서, 본 발명은 또한 동물에서 암세포 또는 종양의 성장을 억제시키는 한 방법을 제공한다. 이 방법은 전반적이고 일반적인 면에서 하나 또는 그이상의 세포들이나 이를 필요로하는 동물의 몸의 조직들에 여기서 공개되는 하나 또는 그 상의 화학요법치료제 iNOS-억제 조성믈의 양을 암세포나 종양의 성장을 억제하는 데 효과 있는 양 시간 동안 제공하는 것을 포함한다.
다른 관점에서는, 본 발명은 개체 및 바람직하게는 사람에서 암을 치료하는 한 방법을 제공한다. 전반적이고 일반적인 면에서, 이 방법은 일반적으로 이를 필요로 하는 개체에게, 치료적으로-효과적인 양의 하나 또는 그 이상의 여기서 공개하는 iNOS-억제, 화학요법치료 조성물들을, 단독으로, 또는 여기서 공개되는 하나 또는 그 이상의 항-고혈압 칼슘채널 길항제 화합물들과 같은 칼슘채널 길항제들 하나 또는 그 이상과 함께, 하나 또는 그 이상의 추가의 화학요법치료제들, 치료요법적으로 효과적인 양의 이온화 방사성조사, 또는 이들의 조합과 같은 조합으로 투여하는 것을 포함한다. 전형적인 추가 조성물들에는, 개체에게 동시-투여할 수도 있으며, 이것에만 국한 하지 않고, 하나 또는 그 이상의 전통적인 항-암 약물들이 포함된다. 다른 한편으로는, 본 발명의 방법들에는 또한 종양절제와 같은 하나 또는 그 이상의 외과적인 개입이 포함될 수 있고, 또는 더 나아가 선택적으로 하나 또는 그 이상의 치료요법적으로 효과적인 이온화 방사선조사(즉 방사선 치료) 이 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 포유류의 하나 또는 그 이상의 암의 증상들을 치료하거나 완화시키는 한 방법을 제공한다. 그런 방법은 일반적으로 포유류에게 여기서 공개하는 iNOS-억제, 화학요법치료 조성물들의 효과적인 양을 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 항-고혈압제와 함께 및 특히 칼슘채널 길항제들 단독으로, 또는 더 나아가 하나 또는 그 이상의 전통적인 화학요법치료제들과 조합하여, 포유류에서 하나 또는 그 이상의 암의 증상들을 완화시키는데 충분한 시간동안 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 동물 개체에서 암의 치료에 사용되는 약학적 조성물을 제공한다, 여기서 조성물은 하나 또는 그 이상의 여기서 공개하는 iNOS-억제, 화학요법치료 조성물들, 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 칼슘채널 길항제들과 조합하는 것을 포함하고, 및 사람 개체의 악성 유방암의 하나 또는 그 이상의 증상들을 치료하거나 완화시키는 그런 용도를 포함할 수 있다.
본 발명은 이것에만 국한하지 않으나, 유방암, 페암, 전립선암, 섬유육종, 활액사르코마 (synovial sarcoma), 췌장암 및 이 질병의 다른 형태들을 포함하는 하나 또는 그 이상의 포유류 암의 형태들을 가지고 있다고 의심되거나 또는 진단이 된 동물의 몸 또는 주위에 포유류의 세포들을 변경시키고, 영향을 주고, 파괴하고, 죽이는 방법을 제공한다. 그런 방법들에는 일반적으로 하나 또는 그 이상의 동물 세포들에게 치료요법적으로-효과적인 양의 공개된 iNOS-억제, 화학요법치료 조성물들, 단독으로, 또는 특히 칼슘채널 길항제들을 포함하는 하나 또는 그 이상의 항-고혈압제와 함께 , 하나 또는 그 이상의 동물의 암의 증상들이 치료하고 및/또는 완화시키는데 충분한 시간을 제공하는 것이 포함된다.
여기서 또 제공하는 것은 필요로하는 개체의 하나 또는 그 이상의 세포들, 조직들 및/또는 기관들에게 하나 또는 그 이상의 공개하는 iNOS-억제, 화학요법치료 조성물들을 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 칼슘채널 길항제들과 조합하여, 세포들이나 조직들, 기관들 및/또는 몸 내에 자라는 고도의 증식성 세포 생성 과정에 관여하는 한 구성성분, 경로, 효소, 또는 단계를 변화시키고, 수정시키고, 조절시키고, 증가 및/또는 약화시키는데 효과적인 시간동안 효과적인 양 만큼 제공함으로서 동물의 몸 내부에 또는 몸 주위에 자란 고도의 증식성 세포생성 과정에 관여하는 적어도 한 구성 성분, 경로, 효소, 또는 단계를 변화시키고, 수정시키고, 조절시키고, 증가 및/또는 약화시키는 방법 들이다.
여기서 더 나가 제공하는 것은 적어도, 이것에만 국한하지는 않으나, 인간 유방암, 및 인간 치료-내성이고, 삼중-네가티브 유방암을 포함한 적어도 포유류 암의 증상을 치료 및/또는 완화시키는 방법들이다.
iNOS -억제 화합물들 및 이들의 조성물들
여기서 주목된대로 본 발명의 iNOS-억제, 화학요법치료 조성물들을 단독 암 치료 사용법으로 쓸수 있으며, 다른 한편으로는 하나 또는 그 이상의 추가 화학요법치료제, 진단제 및/또는 그와 같은것들과 조합 하여 사용 될수 있다, 그와 같은것 들에는, 이것에만 국한하지 않으며, 하나 또는 그 이상의 단백질들, 펩타이드들, 폴리펩타이드들 (효소들, 항체들 항원들, 항원결합조각들, 등이 제한없이 포함); RNA 분자들 (siRNAs, iRNAs, mRNAs, tRNAs 및 라이보자임 및 그와 비슷한 촉매 RNAs 등이 제한 없이 포함); DNA 분자들 (올리고뉴크레오타이드들, 폴리뉴크레오타이드들, 유전자들, 코딩시퀀스들 (CDS), 인트론들, 엑손들, 플라즈미드들, 코스미드들, 파지미드들, 바큘러바이러스, 벡터들 [바이러스벡터들, 비리온들, 바이러스파티클들 및 이와 비슷한것 들이 제한 없이 포함] 등 제한없이 포함); 펩타이드 뉴클레익 에시드들, 검출제(detection agents), 이미징제들, 검출가능한 가스(detectable gas), 방사성핵종 (radionuclides) 또는 그와 비슷한것 들 및 하나 또는 그 이상의 추가의 화학치료요법제들, 외과적 중재 (예, 종양절제), 방사선치료, 및 이와 비슷한것, 또는 질병에 걸린 환자를 다원적이고, 다중 촛점적으로 치료하느 계획의 일부로 이들의 어느조합들을 사용하는 것이 포함된다.
본 발명의 화학요법치료 조성물들을 또한 더 나아가 선택적으로 iNOS-억제제, 화학요법치료 조성물들의 전달을 도와주거나, 촉진시키거나, 또는 개선시키기 위해 제한없이 하나 또는 그 이상의 리포좀, 입자들, 지질복합체를 포함 한 하나 또는 그 이상의 추가 성분을 포함할 수 있으며 및 더 나아가 선택적으로 하나 또는 그 이상의 결합제, 세포표면 활성제들, 계면활성제들, 지질복합체를, 니오좀 (niosomes), 에토좀(ethosomes), 트란스페로좀(transferosomes), 인지질 (포스포리피드,phospholipid), 스핑고리피드들(sphingolipids), 스핑고좀(sphingosomes), 또는 이들의 조합들이 포함될 수 있으며, 또한 하나 또는 그 이상의 나노입자들, 마아크로입자들, 나노캡슐, 마이크로캡슐, 나노스페어(nanospheres), 마이크로스페어 (microspheres) 또는 이들의 어떤 조합이든 포함하는 약학적 조성물 내에서 선택적으로 제공될 수 있다
약학적 조성물들은 또한 하나 또는 그 이상의 약학적으로-수용가능한 운반체들, 희석제들, 부형제들과, 또는 이들의 어느 조합으로 섞을 수 있으며, 더 나아가 선택적으로 리포좀, 계면활성제, 니오좀, 에토좀, 트란스페로좀, 인지질, 스핑고좀, 나노입자, 마이크로입자 또는 이들의 어떤 조합을 포함하여 조성 될수 있다.
바람직하게는, 여기서 공개되는 화학요법치료 조성물들은 적어도 pH 약 4.2 에서 부터 약 8.2에서 꽤 안정할 것이고, 더 바람직하게는, pH 약 5.0 에서 부터 약 7.5에서 꽤 안정할 것이다. 바람직하게는, 활성 성분들은 이들이 투여되는 동물의 생리적 조건들에서 꽤 활성이 있을 것이다.
화학요법치료 방법 및 용도
본 발명의 또 다른 주요한 관점은 공개되는 iNOS-억제, 화학요법치료 조성물들을 예를 들어 삼중-네가티브 유방암과 같은 치료-내성인 유방암들을 포함한 하나 또는 그 이상의 형태의 유방암의 증상들을 치료 또는 완화시키는데 사용하는 방법들에 관한 것이다. 그런 방법들은 일반적으로 포유류에게(특히 이를 필요로 하는 사람에게), 하나 또는 그 이상의 공개되는 항암조성물들을 질병에 걸려있는 포유류의 유방암을 치료하는데 (또는 다른 한편으로 하나 또는 그 이상의 증상을 완화 시키는데) 충분한 양 및 시간동안 투여하는 것을 포함한다.
어떤 예에서는, 여기서 서술되는 화학요법치료 조성물들은 암을 치료하는데 필요 만큼 동물들에게 일회 처치 사용법 (일회 투여하거나 또는 다른 한편으로 몇시간에서 몇 일 또는 몇 주간의 기간에 걸쳐 여러번 투여로)으로 제공될 수 있다. 다른 한편으로는, 다른 예들에서는, 몇주에서 몇달 또는 더 긴 기간 동안 처치를 계속하거나 또는 이를 하나 또는 그 이상의 추가의 치료법과 조합하는 것을 포함 하는것이 바람직하기도 하다. 다른 예들에서는, 하나 또는 그 이상의 이미 존재하는 또는 전통적인 치료요법과 조합한 치료법을 제공하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 공개되는 화학요법치료 조성물들을 치료약물 제조하는데 사용하는 용도 및/또는 암의 하나 또는 그 이상의 증상을 완화시키는데, 및 특히 사람의 유방암과 같은 포유류 암의 하나 또는 그 이상의 증상을 치료 및/또는 완화시키는 약물을 제조하는 용도를 제공한다
본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 공개되는 iNOS-억제/칼슘채널 길항제 조성물들을, 암의 치료, 특히 사람의 치료-내성, 삼중-네가티브 유방암의 치료를 위한 약물의 제조에 사용하는 용도를 제공한다.
치료 킷트들
하나 또는 그 이상의 공개되는 iNOS-억제 조성물들 및 이 킷트를 특정한 암의 치료방법으로 사용하는 안내서를 포함하는 치료 킷트들은 본 발명의 바람직한 관점들을 나타낸다. 이 키트들은 더 나아가 선택적으로 하나 또는 그 이상의 추가의 항-암 화합물들을, 하나 또는 그 이상의 진단시약들, 또는 하나 또는 그 이상의 추가 치료 화합물, 약물 또는 이와 비슷한 것들을 포함할 수 있다.
본 발명의 킷트들은 상업적 배포를 위한 포장이 될 수 있으며, 더 나아가 선택적으로 하나 또는 그 이상의 화학요법치료 조성물들을 동물에 전달되도록 개조된 하나 또는 그 이상의 전달 도구를 포함한다 (예, 주사기들, 주입가능물질 및 이와비슷한 것들). 그러한 킷트들은 전형적으로 적어도 한 바이알, 시함관, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기를 포함하며 이 용기들에는 약학적조성물(들)이넣을수있으며 바람직하게는 적절히 분주될수 있다. 2차 약물이 또한 제공되는 곳에서는,이 킷트는 제2의 조성물들이 들어 있는 제 2의 별도의 용기를 포함 할 수 있다. 다른 한편으로, 여기서 공개되는 약학적 조성물들의 대다수는 현탁액, 또는 용액과 같은 단순 혼합물로 제조될 수 있으며, 또한 바이알, 플라스크, 주사기, 카테터, 카눌라, 병, 또는 다른 적절한 일회 용기와 같은 일회 용기로 포장될 수 있다.
본 발명의 킷트들은 또한. 예를들어, 파손, 햇빛에의 노출, 또는 다른 바람직하지 않은 요소들을 최소화하거나 ,막기 위해, 또는 킷트내에 포함되어 있는 조성물들의 바로 사용을 허용하기 위해 요구되는 바이알(들)또는 다른 용기(들)이 들어있는 주사 또는 불로우-몰드 플라스틱용기들(blow-moldeplastic containers)과 같이 상업적인 판매를 위해 바이알(들) 또는 다른 용기들을 아주 제한적으로 포함 시키거나 유지시키 하기 위해 전형적으로 정체 장치를을 포함 할 수 있다.
약학적 조성물
어떤 예들에서, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 동물의 세포 또는 조직에 단독으로, 또는 하나 또는 그 이상의 다른 진단, 에방, 및/또는 치료 요법괴 조합하여 전달되게 하기 위한, 약학적으로 수용가능한 조성물에 하나 또는 그 이상의 화학요법치료제 및/또는 진단 화합물 조성에 관여한다. 약학적으로 수용가능한 부형제 및 운반제 용액들의 조성은 이분야에 전문가들에게는 잘 알려져 있으며, 적절한 용량의 개발 및 여기서 서술되는 각 다양한 치료요법들의 특정한 조성물을 사용한 치료요법들의 개발도 마찬가지다.
어떤 경우에는, 이것에만 국한되는 것은 아니며, 피하로, 비경구적으로, 정맥주사로, 근육내로, 포막내로, 구강으로, 복강으로, 경피로, 국부로를 포함하는 하나 또는 그 이상의 표준 전달 장치로, 구강 또는 비강흡입로, 또는 동물 내의 또는 몸 주위에의 하나 또는 그 이상의 세포들, 조직들, 기관들에의 직접주사로서 하나 또는 그 이상의 공개되는 화학치료요법 조성물들을 적절히-조성된 약학적 매체를 통해 전달되는 것이 바람직할 것이다
투여 방법들에는 또한 미국특허 Patent Nos. 5,543,158; 5,641,515, 및 5,399,363에 서술된 그 요법들이 포함 될수 있으며, 이들 각각을 특별히 여기서 그 전문을 참고문헌으로 덧붙여 표현하여 병합하였다. 활성 있는 화합물들 용액은 후리염기로 또는 약리학적으로 수용가능 한 염들로 멸균수에 제조할 수 있으며, 하이드록시프로필셀루로즈와 같은 하나 또는 그 이상의 계면활성제와 적절히 섞을 수 있다. 분산도 글리세롤, 액체폴리에틸렌 글라이콜들, 오일들, 또는 이들의 혼합물들에 제조될 수 있다. 일반적인 저장과 사용 조건들에서는, 이들 제제들은 미생물들의 성장을 막기 위해 방부제를 함유한다.
주사가능 한 수용액의 투여를 위해, 제한없이, 용액은 필요하면, 적절히 버퍼화될 수 있으며, 액체희석제는 먼저 충분한 식염수와 글루코즈로 등장(isotonic)이 되도록 한다. 이들 특별한 수용액들은 정맥, 근육, 피하 (subcutaneous), 경피(transdermal), 피하(subdermal), 및/또는 복강투여에 특히 적합하다. 이런 면에서, 본 발명의 조성물들은 예를 들어 멸균 수용 미디아, 버퍼들, 희석제들 등을 포함하는 하나 또는 그 이상의 약학적으로 수용가능 한 매체로 조성할 수 있다. 예를 들어, 활성 성분(들)의 주어진 용량을 등장용액 (예: 등장 NaCl-베이스 용액)의 일정부피에 녹일 수 있으며, 그리고나서 예정된 부위에 투여하거나, 정맥주입에 적합한 매체로 더 나아가 희석시킬 수도 있다.("Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pp. 1035-1038 및 1570-1580). 치료할 대상의 커디션, 치료 정도, 및 투여부위에 따라 용량의 일부 변화는 필요할것이나, 투여 담당하는 사람은 그럼에도 불구하고, 의학적 및 약학적 분야의 일반적인 지식을 사용하여 각개개의 대상에 적합한 정확한 용량을 결정할 수 있어야 할 것이다.
멸균 주사가능한 조성물들은 공개되는 조성물들의 요구되는 양만큼을 적절한 용매에 위에 열거한 몇몇의 다른 성분들과 필요한 대로 병합하고 이어서 휠터 멸균하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산제들도 선택한 멸균된 활성성분들을 염기성의 분산 미디움 및 위에 열거된 필요로 하는 다른성분들을 포함하는 멸균 매체에 병합하여 제조될 수 있다. 여기서 공개하는 조성물들은 또한 중성 또는 염의 형태로도 조성 될수 있다.
약학적으로 수용가능한 염들에는 산 첨가 염들[단백질의 후리 아미노(free amino)그룹들과 형성]이 포함 되며, 이들은, 제한 없이, 염산, 또는 인산과 같은 무기산, 또는제한 없이, 초산, 수산, 타타르산, 만델릭산 및 이와 비슷한 것과 같은 유기산과 형성된다. 후리 카복실 그룹들과 형성된 염들은 또한, 제한 없이, 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 또는 훼릭 하이드록사이드들과 같은 무기염기들 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 및 이와 비슷한 유기염기로부터도 유도될 수 있다. 조성된 후에는, 용액들은 용량 조성물과 호완되는 방식으로 및 적용하려고 하는데 효과적인 만큼의 그런 양으로 투여 될것이다. 조성물들은 주사가능한 용액으로, 국소제제들로, 지속적-방출 캡슐로, 하이드로겔들, 콜로이드들, 점액성겔들, 경피시약들, 비강내 및 흡입제들 및 이와 비슷한 제제를 포함한 구강조성물들 등과 같은 여러 다양한 용량의 형태로 바로 투여 된다.
여기서 공개 되는 화학요법치료제의 양, 용량법, 조성 및 투여는 지금 알려준 이점을 알고 있는 이분야의 일반적인-숙련자들의 견지 범위내에 있을것이다. 그러나, 공개되는 조성물의 치료적-효과(즉, 약학적으로-효과적인)가 있는 양의 투여는, 제한 없이, 그러한 과정을 밟고 있는 환자에게 필요한 만큼의 이점을 제공하기 위해 충분한 양이 전달되는 제제를 일회 주사하는 것과 같은 방법의 일회투여로 달성될 수 있기도 하다. 다른 한편으로는, 어떤 경우에는, 선택된 개인에게 그런 조성물투여를 감독하는 의사에 의해 결정될 수도 있듯이 상대적으로 짧은 기간 또는 상대적으로 긴 기간 동안에 걸쳐 조성물을 여러번 또는 연속적으로 투여하도록 제공하는 것이 바람직하기도 하다.
전형적으로, 여기서 서술되는 하나 또는 그 이상의 조성물의 조성들은 적어도 화학요법치료적으로-효과가 있는 양의 첫번째 활성제를 포함 할것이다. 활성 성분(들)의 퍼센트는, 물론, 다양할 수 있으며, 전체 조성에 근거하여 편리하게 0.01% 에서부터 약 90 무게% 또는 부피% 까지, 또는 0.1% 에서부터 약 80 무게% 또는 부피% 까지, 더 바람직하게는, 0.2% 에서부터 약 60 무게% 또는 부피% 까지의 양이 존재하기도 하지만, 바람직하게는, 조성은 적어도 0.001% 정도의 각 활성 성분을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 적어도 0.01% 정도의 활성 성분을 포함할 수 있다. 자연적으로, 각 조성물에서의 활성 성분(들)의 양은 그 화합물의 주어진 어떤 단위 용량에서 적절한 용법양이 얻어질 수 있는 방법 대로 제조될 수 있다. 그러한 약학적 조성물을 제조하는 분야에 익숙한 일반 사람은 용해도, 생물학적이용도, 생물학적 반감기, 투여루트, 제품의 유효기간과 같은 요소들은 물론 그외 다른 약리학적으로 고려할 요소들을 심사숙고할 것이며, 그러므로 다양한 용법양들 및 치료법들이 요구되기도 할것이다.
여기서 공개되는 화학요법치료 조성물들의 투여는 제한 없이, 비경구적으로, 정맥주사로, 근육내, 또는 예를 들어 미국 특허 Patent Nos. 5,543,158; 5,641,515; 및 5,399,363 (이들 각각은 특별히 전부를 참고 문헌으로 여기에 포함하여 덧붙여 표현)에 서술된 대로 복강 내 투여와 같은 어떤 효과적인 방법으로도 투여될 수 있다. 후리-염기 또는 약리학적으로 수용가능 한 염들로서의 활성화합물들의 용액들은 하이드록시푸로필셀루로즈 또는 다른 비슷한 형태의 계면활성제와 적절히 함께 섞은 물에 제조할 수 있다. 주사로 투여 적합하게 한 약학적 제형에는 멸균수용액 또는 분산제 및 미국 특허 Patent No. 5,466,468 (특별히 전부를 참고 문헌으로 여기에 포함하여 덧붙여 표현)에 서술된 것을 포함한, 제한 없이, 멸균주사용액으로 또는 분산제로의 즉석 제조가 되는 멸균 파우더들이 포함된다. 이 모든 경우에, 형태는 멸균 형태이어야 하며, 쉽게 주사기에 넣을 수 있을 정도의 유동성이 있어야 한다. 적어도 이는 제조나 저장 조건하에서 충분히 안정성이 있어야만 하며, 바이러스, 박테리아, 곰팡이 및 그와 같은 미생물들의 오염으로부터 보호되는 것이어야만 한다.
운반제(들)는 추가의 약학적으로- 수용가능한 성분들도 포함될수 있으나, 제한 없이, 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글라이콜, 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 및 이와 같은 것들 또는 이들의 조합), 하나 또는 그 이상의 식물성 오일들, 또는 이들의 어느 조합을 포함하는 용매 또는 분산 미디움이 될 수 있다.
여기서 공개하는 약학적 조성물들의 적절한 유동성은 예를 들면 레시틴(lecithin)과 같은 코팅제 사용으로, 분산의 경우 요구되는 입자크기의 유지로, 계면활성제 사용으로, 또는 이 기술들의 어떤 조합을 사용하여 유지 시킬수 있다, 미생물들의 작용을 억제시키거나 또는 예방시키는데는 하나 또는 그 이상의 항생제 또는 항진균제, 예를 들면, 제한 없이, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빅 에시드, 티메로살(thimerosal), 또는 이와 비슷한 것들로 성취할 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를들어, 제한 없이, 하나 또는 그 이상의 설탕들, 또는 소듐 클로라이드, 또는 이들의 어떤 조합을 포함 시키는것이 바람직 할것이다. 주사가능한 조성물들의 장기흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들면, 제한 없이, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴, 또는 이들의 조합들을 조성물에 사용하여 성취 할 수 있다.
본 발명의 많은 예들에서 전신적인 투여가 효과적이라고 심사숙고 하면서, 여기서 공개하는 조성물들은 몸의 하나 또는 그 이상의 기관들, 조직들 또는 세포 타입들에 직접 주사하기에도 적절하다고 심사 숙고한다. 공개되는 조성물들의 투여는 관련되는 의료기술에 일반적으로 숙련된 사람에게 알려진 방법을 포함한 적절한 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
여기에 공개하는 약학적 조성물들은 단지 사람에게만 또는 영장류에 또는 포유류에만 사용하도록 어떻든 제한 하는것은 아니다. 어떤 특정 예들에서는, 여기서 공개하는 방법 및 조성들은 조류, 양서류, 파충류 및 다른 동물 종에도 적용될 수 있다. 바람직한 예들에서는, 그러나, 본 발명의 조성물들은 포유류에, 특히 사람에게, 투여를 위해 다양한 진단 및/또는 치료요법들으로 바람직하게 조성되었다. 여기서 공개되는 조성물들은, 제한없이, 선택된가축류, 외래 또는 가축화한 동물들, 반려동물들(애완동물 및 이와 비슷한 것), 사람이 아닌 영장류는, 물론, 동물학상으로 또는 아니면 포획된 시료들 및 이와 비슷한 것들을 포함 하는것에의 수의학적 투여에 수용가능 한 조성물로 제공된다.
발명의 원리들의 이해를 증진시키기 위해 예들 또는 예시들에서 참고 문헌이 만들어 질것이며, 그림들로 보여주며, 같은 것을 서술하는데 특별한 언어가사용 될 것이다. 그럼에도 불구하고, 이로서 발명 범위의 한계는 없다는 것이 이해될 것이다. 본 발명과 관련 있는 이분야에 일반적으로 익숙한 사람들에게서는 보통 일어나는 듯이 서술되는 예들에서 어떤 변화들 및 더 나아가 수정들 및 여기 서술된 본 발명의 원리의 응용들을 심사숙고 하게 될것이다.
다음의 도들은 현재의 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 관점들을 보여주기 위해 포함 시켰다. 본 출원은 적어도 칼라로 진행된 한 그림도 포함 한다. 이 특허의 복사본들 또는 칼라 그림이 있는 특허 출원은 요구시 및 필요한 값을 지불하면 "Patent and Trademark Office" 를 통해 제공될 것이다. 이 발명은 수반되는 그림들과 연관되어 서술된 다음의 서술을 참조하면 더 잘 이해될 것이며, 참고 문헌 수는 비슷한 요소들은 동정 하며, 여기에서;
도 1A, 도　1B, 도　1C, 도　1D, 도　1E, 및 도　 1F 는 침투적인 TNBC 에서 환자의 나쁜 생존율과 연관되는 증강된 NOS2 발현을 보여준다. 암유전자 지도 (The Cancer Genome Atlas) (TCGA)데이타베이스 의 언코마인 암 마이크로 어레이 분석(도 1A 및 도　1B). 도 1A: 비-TNBC 대비 침투성 TNBC 에서의 더 높은 NOS2 mRNA 발현. P　=　3.85E-5, t-test. 도 1B: 높은 NOS2 발현은 침투성 유방 카르시노마에서 5 년에 사망하는 것과 관련이 있다. P　=　0.037, t-test. 반 데 비즈버 (Van de Vijver)(n　=　69; p　=　0.04)(도　1C) 및 커티스(Curtis) (n=260; p=0.01) (도　1D) 에서 카풀란-마이어 생존 분석 (Kaplan-Meier survival analysis)(윌콕스 테스트) 유방 데이타베이스들은 높은 NOS2 발현은 TNBC 환자들의 전체 생존율이 더 나쁨을 보여준다(도　1E) TNBC 사람 샘플의 iNOS 단백질 발현에 대한 면역조직학적 분석. 약함-에서- 중간(3-4), 중간-에서-강함(5-6) 및 강함(7)은 생존 분석을 더하기 위해 정해 놓은 컷오프(cut-off)이다. 몇몇 샘플에서는 종양(T) 및 스트로말(S)세포 [본래 광학 대물렌즈 (original optical objective): 20X] 모두에서 발현을 보여준다. NOS2-에대한 shRNA (shRNA1) 또는 빈벡터(EV)로 감염시킨 MDA-MB-231 세포는 iNOS 염색에 대한 음성 또는 양성 컨트롤로 각각 사용되었다(본래 광학 대물렌즈: 10X). 대비 염색:헤마톡실린. 도 1F: 낮은 iNOS 발현에 비해 증가된 iNOS 발현은 환자의 낮은 생존율과 연관된다. TNBC 사람 환자 샘플들의 카프란-마이어 생존율 분석 (n　=83). P　=　0.05, Log-Rank test;
도 2A, 도 2B, 도 2C, 도 2D, 도 2E, 및 도 2F는 TNBC 세포주들의 종양형성에 대한 iNOS 억제제의 효과를 보여준다. 1400W 및 L-NMMA 로 96 시간 동안 처리한 MDA-MB-231 및 SUM159 세포주들의 증식(도　2A 및 도 2B), 첫 번째(primary 도 2C) 및 두 번째(secondary 도 2D) 맘모스페어(mammospheres) 및 이동지수(migration index, 도 2E 및 도 2F). 결과는 매체 대비하여 정상화 하였다(노말라이즈). 데이타는 평균±SEM 으로 표시된다.****　p　<　0.0001, ***　p　<　0.001, **　p　<　0.01, *　p　<　0.05, 한-방향 아노바 (One-way ANOVA) 및 본페로니의 포스트-혹 테스트(Bonferroni's post-hoc test);
도 3A, 도 3B,도 3C, 도 3D, 도 3E, 도 3F, 도 3G, 도 3H, 도 3I, 및 도 3J 는 iNOS 녹다운이 HIF1α 및 소포체(endoplasmic reticulum)(ER) stress/TGFβ/AFT4/ATF3 두 가지에 이중으로 영향을 주면서 종양형성 및 EMT 를 손상시킴을 보여준다. 두 가지 다른 NOS2에 대한 shRNAs (shRNA1, shRNA2) 로 감염시킨 MDA-MB-231 세포들의 빈 벡터 (shRNA-EV) 대비 이들의 증식 (도　3A), 이동(migration) (도　3B), 및 자가-재생능력 (self-renewal capacity )(첫 번째 및 두 번째 맘모스페어들) (도　3C). 1400W (도 3D) 및 shRNA-매개한 NOS2 녹다운 (도　3E)으로 처리시킨 MDA-MB-231 및 SUM159 세포주들에서 NOS 아이소폼들(iNOS, eNOS, nNOS) 및 EMT 전사인자들의 웨스턴 블럿분석. 선택적인 iNOS 억제는 MDA-MB-231 및 SUM159 세포에서 하이폭시아(HIF1α), ER 스트레스마커들(IRE1α, ATF4) (도　3F), phospho-Smad2/3, Smad2/3 및 성숙 TGFβ1 단백질 수준들(도　3G)을 감소시킨다. 도 3H: 재조합 TGFβ1 (10　ng/mL, 24　시간동안)는 MCF10A 에서 ERK/eIF2α /ATF4/ATF3 축을 활성화시킨다. 도 3I: MCF10A 세포들에서 재조합 TGFβ1 (10　ng/mL) 및 1400W (4　mM)로 동시 처치했을 때의 PERK/eIF2α/ATF4/ATF3 축에 대한 효과들. 96 시간동안 siRNA-매개한 NOS2 녹다운 (siRNA20) MCF10A 세포들에서의 iNOS, ATF4, ATF3 및 성숙 TGFβ 단백질 레벨. 도 3J: 선택적인 iNOS 억제는 IF1α, ER stress (IRE1α/XBP1) 및 ATF4, ATF3 와 TGFβ사이의 상호연결(크로스토크)에 영향을 줌으로서 EMT 및 종양세포 이동을 손상시킨다고 가정한다. 결과들은 빈벡터에 대비하여 정상화 (normalized)시켰다. 데이타는 평균± SEM 으로 나타낸다.****　p　<　0.0001, ***　p　<　0.001, **　p　　<　0.01. 한-방향 아노바 (One-way ANOVA) 및 본페로니의 포스트-혹 테스트(Bonferroni's post-hoc test);
도 4A, 도 4B, 도 4C, 및 도 4D는 MDA-MB-231 이종이식(xenografts)에서 종양 시작과 폐전이가 감소되는 것을 보여준다. 도 4A: L-NAME (80mg/kg, i.p.) 을 매일 투여한 후 MDA-MB-231 유방 이종이식(xenografts) (n=5/g그룹)의 종양부피. 양방-아노바(Two-way ANOVA) 및 본페로이의 포스트 혹 테스트(Bonferroni's post hoc). 도 4B: 종양 조직에서 분리된 암세포들의 일차 및 이차 MSFE. 스투던트의 t-테스트 (Student's t-test). 도 4C: 제한적 희석 방법으로 검정한 종양세포의 종양-개시 능력. 휫셔의 정확 테스트 (Fisher's exact test). 도 4D: 매체(vehicle)- 및 L-NAME-로 처치된 쥐의 폐에서의 MDA-MB-231 L/G 암 세포들의 발광. 스튜던트 t-테스트(Student's t-test). 결과들은 매체 대비 정성화 하였다(normalized to vehicle). 데이타는 평균 ± SEM로 표현되었다. ***　p　<　0.001, **　p　<　0.01, *　　p　<　0.05;
도 5A, 도 5B, 도 5C, 도 5D, 도 5E, 및 도 5F는 MDA-MB-231 이종이식들에서 L-NMMA의 생체내 효과들을 보여준다. 도 5A: 매체, L-NMMA, 화학요법, 및 이들의 조합으로 처치한 MDA-MB-231 유방 이종이식들(n　=　10/그룹)에서의 종양 부피, 양방 아노바 및 본페로니의 포스트-혹 테스트. 도 5B: 매체, L-NMMA, 도세탁셀 (docetaxel) 및 조합그룹에서의 Ki67 염색의 예시 이미지들. 본래의 광학 대물렌즈(original optical objective):10x. 대비염색:헤마톡실린. 도 5C: 종양 이종이식의 세포 증식을 Ki67 양성 세포로 묘사하였다. 10개의 다른 곳에서 1,000 세포들을 세었으며 %로 측정되었다. 도 5D: Chemo 및 Combo 그룹에서의 핵에서 쪼개진 카스페이즈-3의 염색; 10곳의 다른 곳에서 1,000 세포들을 세었으며 %로 측정되었다. 도 5E: 종양 조직에서부터 분리된 유방암세포들의 일차 및 이차 MSFE. 한-방향 아노바 (One-way ANOVA) 및 본페로니의 포스트-혹 테스트(Bonferroni's post-hoc test); 도 5F: 제한적 희석 방법으로 검정한 종양세포의 종양-개시 능력. 휫셔의 정확 테스트 (Fisher's exact test). 결과들은 매체 대비 정성화 하였다(normalized to vehicle). 데이타는 평균 ± SEM로 표현되었다. ****　　p　<　0.0001, ***　p　<　0.001, **　p　<　0.01, *　p　<　0.05;
도 6A, 도 6B, 도 6C, 도 6D, 및 도 6E 는 TNBC 의 오르토토픽 마우스모델에서 (orthotopic mouse models)에서 L-NMMA 의 임상적으로 관련 있는 용량법을 나타낸다. 도 6A: 이 연구에서 제안된 한 사이클의 용량율을 준 마우스 (n=5)의 평균 최대수축기 혈압. 한-방향 아노바 및 본페로니의 포스트-혹 테스트. 도 6B: 한 사이클 처치의 마지막 주사 후 30 분 및 24시간 후에 마우스의 (n　=　5) 평균 최대수축기 혈압. 한-방향 아노바 및 본페로니의 포스트-혹 테스트. 도 6C: 매체, 암로디핀, 도세탁셀, 및 조합 (도로탁셀+ L-NMMA)으로 처치한 MDA-MB-231 유방 이종이식(n　=　10/그룹))의 종양 부피. 쌍-방향 아노바 및 본페로니의 포스트-혹 테스트. 도 6D: 매체-, 화학요법-, 및 콤보(combo)-처치한 MDA-MB-231 이종이식을 지닌 마우스의 카플란-마이어 생존 커브. 윌콕스 테스트. 도 6E: 매체, 암로디핀, 도세탁셀, 및 조합 (도로탁셀+ L-NMMA)으로 처치한 SUM159 유방 이종이식의 종양 부피. 쌍-방향 아노바 및 본페로니의 포스트-혹 테스트. 데이타들은 평균± SEM 으로 나타내었다. ****　p　<　0.0001, ***　p　<　0.001;
도 7A 및 도 7B 는 iNOS 억제제들로 처치한 MDA-MB-231 세포들에서 맘모스페어의 대표적인 이미지들을 보여준다. 1400W, L-NMMA (Vehicle, 1, 2, 4　mM) 및 L-NAME (Vehicle, 1, 2, 5　mM)으로 96 시간동안 처치한 후 일차 (도　7A) 및 이차 (도　7B) 맘모스페어들의 예증적인 이미지들;
도 8A 및 도 8B 는 iNOS 억제제들로 처치한 SUM159 세포들에서 맘모스페어의 대표적인 이미지들을 보여준다. 1400W, L-NMMA (Vehicle, 1, 2, 4　mM) 및 L-NAME (Vehicle, 1, 2, 5　mM)으로 96 시간동안 처치한 후 일차 (도　8A) 및 이차 (도　8B) 맘모스페어들의 예증적인 이미지들;
도 9A, 도 9B, 도 9C, 도 9D, 및 도 9E 는 TNBC 세포주들의 종양형성에서 L-NAME 및 1400W의 마이크로몰 농도 및 L-NMMA 의 효과들을 보여준다. L-NAME으로 처치한 MDA-MB-231 및 SUM159 세포주들에서의 증식 (도 9A), 일차(도 9B) 및 이차 (도　9C) 맘모스페어. 1400W (도　9D) 및 L-NMMA (도　9E)의 마이크로몰 농도에서의 MDA-MB-231 및 SUM159 세포들의 이동지수에의 영향. 결과들은 매체 대비하여 정상화 (normalized)하였다. 데이타들은 평균± SEM 으로 나타내었다. ****　p　<　0.0001, ***　p　<　0.001, **　p　<　0.01, *　p　<　0.05, 한-방향 아노바 및 본페로니의 포스트-혹 테스트;
도 10A, 도 10B, 도 10C, 도 10D, 도 10E, 도 10F, 및 도 10G 는 iNOS 억제제들로 처치한 TNBC 세포주들에서 NOS 아이소폼들, EMT 전사인자들의 이주 및 웨스턴 불럿 및 하이폭시아를 보여준다. (도　10A) MDA-MB-231 및 SUM159 세포주들에서 L-NAME 으로 처치한 후의 종양세포의 이주. 1400W (도　10B) 및 L-NMMA (도 10C)으로 처치한 MDA-MB-231 및 SUM159 세포들에서 NOS 아이소폼들 (iNOS, eNOS 및 nNOS)의 웨스턴 불럿. 마이크로몰 농도의 1400W (도　10D) 또는 L-NMMA (도　10E)로 처치한 후의 MDA-MB-231 및 SUM159 세포들에서의 EMT 마커단백질들의 레벨들. (도　10F) L-NAME으로 처치한 MDA-MB-231 및 SUM159 세포주들에서 NOS 아이소폼들 및 EMT 전사인자들의 웨스턴 불럿 분석. (도 10G) 1400W 로 처치한 MDA-MB-231 및 SUM159 세포에서 β-액틴 대비 HIF1α 단백질 레벨의 정량. 결과들은 매체 대비하여 정상화 하였다. 데이타들은 평균±SEM로 표시된다.**　p　<　0.01, *　p　<　0.05, 한-방향 아노바 및 본페로니의 포스트-혹 테스트;
도 11A, 도 11B, 도 11C, 도 11D, 도 11E, 도 11F, 도 11G, 도 11H, 및 도 11I 는 NOS2 녹다운(knockdown)은 세포의 종양형성성 감소, EMT 전사인자들 감소, 쪼개진 XBP1 및 Smad2/3 신호를 감소시킨다는 것을 보여준다. ER 스트레스 및 TGFβ간의 크로스토크. 빈 벡터(shRNA-EV)와 비교하여 NOS2-대한 두 개의 다른 shRNAs (shRNA1, shRNA2)로 감염시킨 SUM159 세포들에서의 증식 (도 11A), 이주 (도 11B) 및 일차 및 이차 맘모스페어(도　11C). 도 11D: shRNA-매개한 NOS2 녹다운 MDA-MB-231 및 SUM159 세포들에서의 EMT 전사인자들 Snail 및 Slug. 도 11E: NOS2-에 대한 두개의 다른 siRNA (siRNA18, siRNA20; 100nM siRNA)로 96시간 동안 감염시킨 SUM159 세포들에서 Zeb1 및 Twist1 단백질 레벨의 변화가 확인되었다. 도 11F: 1400W로 96 시간 동안 처치한 MDA-MB-231 세포로 부터의 쪼개지지 않은 XBP1 (uXBP1), 쪼개진 XBP1 (sXBP1) 및 β-액틴(β-Actin) RT-PCR cDNA 앰플리콘들. 도 11G: 단백질-단백질 상호 작용 분석(STRING 9.1)은 NOS2, TGFβ1 과 F4/ATF3 축의 연결을 해독하였다. 도 11H: iNOS 억제제 1400W는 MDA-MB-231세포를 재조합 TGFβ1 (10　ng/mL)로 72　시간동안 처치했을 때 Smad2/3 신호체계 (signaling)를 감소시킬 수 있다. 도 11I: 투니카마이신 (5　μM)은 ER 스트레스 및 TGFβ 사이에 ATF4/ATF3 전사인자를 통해 크로스토크를 한다는 것을 확인시켰다. 결과들은 빈 벡터 대비하여 정상화 하였다. 데이타들은 평균± SEM 로 표시 된다. ****　p　<　0.0001, ***　p　<　0.001, **　p　<　0.01, *　p　<　0.05, 한-방향 아노바 및 본페로니의 포스트-혹 테스트;
도 12A, 도 12B, 도 12C, 및 도 12D 는 shRNA-매개한 NOS2 녹다운 세포들에서 대표적인 맘모스페어들의 이미지들 및 상처회복에세이(wound healing assay)를 보여준다. NOS2-대한 두 개의 다른 shRNAs (shRNA1, shRNA2) 또는 빈 벡터(sRNA-EV)로 감염시킨 SUM159 및 MDA-MB-231 에서 일차 및 이차 맘모스페어들(도　12A 및 도 12B) 및 이동(상처회복에세이)(도　12C 및 도 12D)의 예증적 이미지들;
도 13A, 도 13B, 도 13C, 도 13D, 도 13E, 및 도 13F는 SUM159 이종이식에서 L-NMMA의 생체내 효과를 보여준다. 도 13A: 매체(vehicle), L-NMMA, 화학요법, 및 조합으로 처치한 SUM159 유방 이종이식(n　=　10/그룹)의 종양 부피. 양방-아노바 및 본페로니의 포스트=혹 테스트. 도 13B: 매체, L-NMMA, 화학요법 (도세탁셀), 및 조합 그룹들에서의 Ki67 염색의 예증적 이미지들. 본래광학 대물렌즈 10X. 대비염색:헤마톡실린. (도　13C) 종양 이종이식들의 세포증식은 Ki67 양성 세포들로 묘사 된다. 10곳의 다른 곳에서 1,000 개의 세포들을 세어 퍼센트(%)를 측정했다. 한방-아노바 및 본페로니의 포스트-혹 테스트. 종양조직으로부터 분리된 유방암 세포들의 일차 및 이차 MSFE(도　13D 및 도 13E). 한방-아노바 및 본페로니의 포스트=혹 테스트. 도 13F: 제한적 희석 방법으로 검정한 종양세포의 종양-개시 능력. 휫셔의 정확 테스트. 결과들은 매체에 대비 정상화 시켰다. 데이타들은 평균± SEM 으로 표시된다. ****　p　<　0.0001, ***　p　<　0.001, **　p　<　0.01, *　p　<　0.05.
도 14A, 도 14B, 도 14C, 도 14D, 도 14E, 및 도 14F 는 플라즈마 및 종양 조직에서 NMMA 의 레벨을 보여준다. L-NMMA- 처치한 이종이식들에서 CD44+/CD24-/low 집단. 매체, L-NMMA, 도세탁실 및 조합 (도세탁실 + L-NMMA)으로 처치된 마우스의 SUM159 (도 14A) 및 MDA-MB-231 (도 14B) 이종이식된 종양 조직으로부터 분리된 CD44+/CD24-/low 세포의 풀로 사이토메트리 분석(% Parent). 도 14C 및 도 14D: LC-MS/MS (Student's t-test)에 의한 플라즈마 및 종양조직 (MDA-MB-231 및 SUM159의 이종이식들)에서의 메틸알기닌(methylarginine)의 비율적인 정량. 도 14E: iNOS 는 L-알기닌 (L-Arginine)을 L-시투룰린 (L-Citrulline) + 나이트릭 옥사이드( nitric oxide)(NO)로 반응시키는 것을 촉진시킨다. 시투룰린 SUM159 이종이식조직 LC-MS/MS 의 비율적 (Ratiometric) 정량 (Student's t-test). 도 14F: L-NMMA 및 1400W (4　mM)로 0.5, 2, 6 및 24 시간동안 처치한 SUM159 세포 들에서의 총 니트릭 옥사이드 생산. 결과들은 매체에 대비 정상화 시켰다. 데이타들은 평균±SEM 으로 표시된다. ****　p　<　0.0001, ***　p　<　0.001, **　p　<　0.01, *　p　<　0.05. 한-방향 아노바 및 본페로니의 포스트-혹 테스트;
도 15A, 도 15B, 도 15C, 도 15D,도 15E, 및 도 15F 는 칼슘 채널 길항제들의 MDA-MB-231 세포들의 증식에 대한 효과를 보여준다 (증식 감소 퍼센트를 바(bars)위에 보여준다);
도 16A, 도 16B, 도 16C, 도 16D, 도 16E, 및 도 16F 는 칼슘 채널 길항제들의 SUM159 세포들의 증식에 대한 효과를 보여준다 (증식 감소 퍼센트를 바(bars)위에 보여준다);
도 17A 및 도 17B 는 삼중-네가티브 유방암의 암로디핀 마우스 모델들의 항-종양 활성을 설명한다;
도 18A 및 도 18B 는 MDA-MB-231 및 SUM159 세포들의 이동을 "상처 회복" 에세이로 보여준다. 간략하게, 3　X105 세포들을 6-웰 플레이트에 성장 미디움에서 충분히 모일 때까지 플레이트 하였다. 단층으로 있는 세포들을 1400W (0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 2, 4　mM)로 혈청이 낮은 조건(1%) 에서 72시간 동안 처치했으며, 24 시간동안은 보통 성장 미디움에서 억제제 존재하에 24 시간 (총 96 시간)처치했다. 그후 세포 단층에 "상처(wound)"를 만들었다. 이미지는 0 및 24시간에 찍었다. 상처-회복 능력은 소프트웨어 Image J 로 결정하였다. 데이타는 3번의 독립적인 실험으로 반복했다. 결과들은 매체에 대비하여 정상화 시켰다.
도 19A 및 도 19B 는 상피-간엽 (EMT)-유도 요소들에 대한 선택적인 iNOS 억제효과를 MDA-MB-231 및 SUM159 세포주들에서 웨스턴 불럿으로 테스트한 것을 보여준다. 세포들은 1400W (0.1, 1, 10, 100　μM; 1, 2, 4　mM)로 96 시간 동안 처치 되었다. iNOS 및 EMT-유도 인자들의 단백질 레벨들은 항체로 웨스턴 불럿으로 측정하였다, 사용된 항체는 iNOS (N-20) 및 Twist1 (L-21) (산타 크르즈 생명공학,Santa Cruz Biotechnology), Snail (C15D3), Slug (C19G7) 및 TCF8/Zeb1 (D80D3) (Cell Signaling) (1:1000 dilution). β-액틴 (Cell Signaling; 1:2000)은 컨트롤로 사용되었다; 및
도 20A, 도 20B, 도 20C, 및 도 20D 는 MDA-MB-231 및 SUM159 세포들 (3　 X 106) 을 암컷 SCID 베이지 마우스 (SCID Beige mice)(n　=　10/그룹)의 오른쪽 유선 지방 페드에 주사한 것을 보여준다. 임상적으로-해당되는 용량법은 L-NMMA (400　mg/kg 1일에, 및 200　mg/kg 을 추가로 4일 동안 구강으로 튜부로 먹이기)와 같이 주기 12 시간 전에 도세탁셀 (20　mg/kg, i.p., 0 일에)의 두 사이클 과 0 일에 암로데핀 (10　 mg/kg, i.p., 매일 6 일동안)으로 구성된다. 도세탁셀 자체만과 식염수 (i.p.) + 멸균수 (구강 튜부로 먹이기)를 컨트롤들로 사용했다. L-NMMA 과 도세탁셀의 혼합은 MDA-MB-231 및 SUM159 이종이식에서 종양의 성장을 감소시킬 수 있었다(도 20A 및 도 20D). 암로피딘은 L-NMMA-에의해 유도되는 혈압 증가를 막는다(도 20B). 이 용량법은 또한 MDA-MB-231 이종이식에서 도세탁셀 혼자만과 비교했을 때 생존율을 증가 시킨다(도 20C). ****　p　<　0.0001, ***　p　<　0.001.
서열번호들의 간략한 서술
서열번호 1 는 본 발명의 한 관점에 따라 사용되는 전방향 프라이머의 전형적인 DNA 올리고뉴클레오타이드
서열번호 2 는 본 발명의 한 관점에 따라 사용되는 후방향 프라이머의 전형적인 DNA 올리고뉴클레오타이드
서열번호 3 본 발명의 한 관점에 따라 사용되는 전방향 프라이머의 전형적인 DNA 올리고뉴클레오타이드
서열번호 4 본 발명의 한 관점에 따라 사용되는 후방향 프라이머의 전형적인 DNA 올리고뉴클레오타이드.
본 발명의 예증적인 예들이 아래에 서술된다. 투명하게 하기 위해, 실제 실행하는데 모든 특징을 다 이 세목에서 서술하지는 않는다. 물론 이런한 어떤 실제 예의 전개과정에서, 각 실행 예들에 따라 다른 시스템-연관되고 사업-연관된 제약들에 따라 개발자들의 특별한 목표를 달성하기 위해 여러가지 실행-특이적인 결정들을 해야 할 때가 있다는 것을 알것이다. 게다가, 그러한 개발노력은 복잡하고 시간-소모적일 수도 있다, 그러나 이런한 공개의 이점을 가지고 있는 이분야에 숙련된 보통 사람에게는 일상적인 일일 것이다.
나와 나의 공동연구자들은 줄기-유사 (stem-like)성질을 가진 유방암 세포들이 전통적인 치료법에 본래적으로 저항성이 있다는 것을 보여준 첫 번째 그룹들 중에 하나 일것이다. 이러한 초기 관찰들 이래, 다른 그룹들이 이런 세포들이 기존의 전통적인 화학요법 치료 및 방사성 치료에 저항성을 형성한다고 함으로서 이 관점을 확인했다. 이 연구들 및 다른 연구들에서 줄기-유사 세포군 들의 증가는 더 나쁜 예후와 관련이 있다는 우리의 발견을 또한 지지하고 있다. 이런한 발견들은 기본적인 임상적 영향들을 끼치고 있다. 현재 개발되는 암치료제들은 주로 동물 모델이나 임상시험에서 대체적인 종양쇠퇴를 일으킬 수 있는 능력을 가진 제제들을 동정하는데 근거를 두고 있다: 그러나, 활발히 세포주기를 돌고 있거나, 또는 전적으로 분화된 세포들을 죽여서 종양쇠퇴를 끌어내는 약물들에 전적으로 촛점을 맞추는 것은 치료-저항성 세포들의 중요한 군들을 놓칠 수 있다. 이런한 관찰들은 최근 유방암까지 확장 되었으며, 나는 전체적인 일차 종양 내에 있는 화학요법저항성 세포들의 아군집들이 일련의 다른 적응 기전으로 전이 경향이 있다는 것을 보여준다.
나는 환자의 유방암 생체검체로부터 종양형성 시그니쳐를 동정했으며, 이어서, 이 유전자 셋트로부터 치료 저항성을 나타내는 새로운 타겟들을 동정하기 위해 기능적 접근을 사용하였다. 종양형성 시그니쳐에 있는 477 유전자들의 shRNA 녹다운을 사용하여, 고속도의 맘모스페어 형성 효율(MSFE) 스크린을 수행하였다. 이 접근방법으로 두 개의 타겟 단백질 RPL39 및 MLF2이 동정되었다. RPL39는 정자형성 및 단백질 번역의 역할을 하는 것으로 제안된 염색체 X (XQ24) 에 위치 해있는 60S 라이보좀 집합체의 한 성분으로 이전에 인지되었다. MLF2는 염색체 12에 위치 해 있으며 염색체 이상 (aberrations)과 세포 방어 반응들에 참여할 수 있다. 암에서의 RPL39의 역할에 대해 알려진 것이 적으며, MLF2에 대해 알려진 것은 더욱 적다. MLF2의 Ser 144, 152 및 238의 아미노산 연속수정들 및 체세포 돌연변이(Phe80Cys)는 직장암과 연관된다. 명백하게, RPL39 및 MLF2 과발현은 세포 이동, 증식 및 맘모스페어 형성을 증가시키며, 이는 이 두 유전자들이 암에서 중요한 기능을 함을 제시한다. 이 두 유전자가 새로운 암타겟이라는 것을 확인하기 위해 RPL39 및 MLF2의 작용기전을 포괄적으로 이해하는 것은 현저한 사전 필요조건이다. 암유전자 지도(The Cancer Genome Atlas)(TCGA) 데이타베이스를 사용하여 RPL39 및 MLF2의 상호 배타성 분석으로 RPL39 및 MLF2 가 배타적으로 같이-나타남이 발견되었으며, 이는 이 두유전자들이 기전적인 경로를 공유한다는 것을 제시한다. 마이크로 어레이 분석을 사용하여, "실데나필(비아그라)[sildenafil(Viagra)]의 세포 효과들" 즉 나이트릭 옥사이드(NO) 신호체계가 RPL39 및 MLF2 둘을 연결시키는 일차적인 경로인 것으로 동정 되었다. NO 신호체계의 역할은 RPL39 및 MLF2의 과발현으로 iNOS (유도성 나이트릭 옥사이드 합성효소, inducible nitric oxide synthase)단백질을 유도시키고, siRNA (작은 방해 RNA, small interfering ribonucleic acid)로 RPL39 및 MLF2 발현을 중지시켜 iNOS 단백질 레벨을 감소시킴으로서 확인되었다. 문헌에서는 유방암 생물학에서의 NOS 신호체계의 역할은 심도있게 연구되지는 않고 있다. 오늘날까지의 보고들은 높은 NO 농도들은 암세포들에 세포독성이 있으며 반면에 낮은 NO 농도들은 종양 성장을 증강시킨다고 제시하고 있다.
이 두 새로운 암유전자들은 (RPL39 및 MLF2) 이전에 치료저항성과 폐전이에 역할을 한다고 동정되었다. NO 신호체계의 상승조절은 이 두 유전자들의 공통 기전 경로라는 것이 보여졌다. LNMMA로 NO 신호체계를 억제하는 것은 치료저항성 세포의 수는 줄이는 것은 물론이고 사람 TNBC 세포주들에서 폐전이도 줄인다.
약학적 조성물들
본 발명의 약학적 조성물들은 더 나아가 특히 사람 환자에게 투여하기 위하여 조성되는 하나 또는 그 이상의 부형제들, 버퍼들, 또는 희석제들을 포함할 수 있다. 조성물은 더 나아가 선택적으로 하나 또는 그 이상의 마이크로스피어들(microspheres), 마이크로입자들, 나노스피어(nanospheres), 또는 나노입자들을 포함할 수 있고, 암 치료 특히 유방암의 치료를 받고 있는 사람의 하나 또는 그 이상의 세포들, 조직들, 기관들, 또는 몸에 투여하기 위하여 조성될 수 있다.
약학적으로-수용가능한 부형제들 및 운반제 용액들의 조성은 이 분야에 숙련된 사람들에게는 잘 알려져 있으며, 여러가지 치료요법들, 예를들어, 제한 없이, 구강, 비경구, 정맥, 비강내, 종양내 및 근육내 투여를 포함하는 다양한 치료요법에서 여기서 서술되고 있는 특별한 조성을 사용하기 위한 적절한 용량 및 치료요법의 개발도 마찬가지다.
본 발명의 iNOS-억제 화학요법치료제 조성물들의 활성 성분(들)의 퍼센트는, 물론, 변할 수 있으며 편리하게 총 조성물의 무게 또는 부피의 약 1% 또는 2% 와 약 70% 또는 80% 또는 그 이상의 사이 일수 있긴 하지만, 전형적으로, 적어도 약 0.1%의 활성 화합물 또는 그 이상을 함유하도록 조성될 수 있다. 자연적으로, 각 진단학적으로나- 또는 치료학적으로- 유용한 조성물에서의 활성 화합물(들)의 양은 여기서 공개되는 화학요법치료제 조성물들의 어떤 주어진 단위 용량에서 진단 또는 치료제들의 적절한 용량이 얻어질 수 있는 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 약학적 조성물 제조 분야에 익숙한 사람들은 용해성, 생물학적이용도(bioavailability), 생물학적 반감기, 투여경로, 생산품의 유효기간은 물론이고 다른 약리학적인 고려사항들과 같은 인자들을 심사숙고할 것이며, 그래서 다양한 용량법 및 치료요법들이 바람직할 것이다.
적용하는 조성물들의 특정한 양, 및 투여하는 특정한 시간, 또는 공개되는 iNOS-억제 화학요법치료제 조성물들을 적용하는 조성물들의 용량법은 현재 알려주는 이점을 알고 있는 이 분야에 익숙한 보통 사람의 권한 내 일 것이다. 그러나, 진단학적으로나- 또는 치료학적으로- 효과 있는 양의 공개되는 조성물들의 투여는, 그러한 치료를 받고 있는 환자에게 바람직한 화학요법치료의 유익한점이 제공되도록 효과적인 시간 동안 조성물의 하나 또는 이상의 용량을 투여함으로서 달성될 수 있기가 쉽다. 그러한 용량법은 특별한 컨디션 또는 환자, 암의진행 정도 등에 따라 화학요법치료제의 투여를 감독하고 있는 의료의사가 결정할 수 있다.
공개되는 조성물들에서 활성 성분들의 조성들은 주어진 환자의 특별한 치료요법을 위한 효과적인 양을 포함할 것이다. 바람직하게는, 활성 성분(들)의 퍼센트는, 물론, 변할 수 있으며, 편리하게 총 조성물에 근거하여, 무게% 또는부피% 로 약 0.5 에서 80%, 또는 1% 에서 70%, 더 바람직하게는 약 2 %에서 약 50%로 있을 수 있지만, 전형적으로, 적어도 약 0.1%의 각 활성 화합물을 포함할 수 있다. 자연적으로, 활성 화합물(들)의 양은 그 화합물의 어떤 주어진 단위 용량에서 적절한 용량이 얻어질 수 있는 방법으로 제조될 수 있다. 이러한 약학적 조성물 제조 분야에 익숙한 사람들은 용해성, 생물학적 이용도(bioavailability), 생물학적 반감기, 투여경로, 생산품의 유효기간은 물론이고 다른 약리학적인 고려사항들과 같은 인자들을 심사숙고할 것이며, 그래서 다양한 용량법 및 치료요법들이 바람직할 것이다.
약물들 제조의 조성물들
본 발명의 또 다른 중요한 관점은 공개되는 조성물들 (이들을 포함하는 제형들도 물론이다)을 척주 포유류와 같은 동물에서 여러가지 질병들, 기능장애, 또는 결핍등 여러 증상들을 치료하거나 완화시키는 약물들을 제조하는데 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히 사람에서 하나 또는 그 이상의 암종류의 화학요법치료제 치료로서 공개되는 조성물들의 사용이 심시 숙고되고 있으며, 특히 여자의 TNBC 치료에의 사용을 심사숙고하고 있다.
그러한 사용은 일반적으로 이들을 필요로 하는 포유류에 하나 또는 그 이상의 공개되는 iNOS-억제 화학요법치료제 조성물들을 암에 영향을 받고 있는 포유류의 하나 또는 그 이상의 증상을 치료하거나, 약화시키거나, 또는 완화시키는데 충분한 양이나 시간 동안 투여하는 것이 관여된다.
하나 또는 그 이상의 공개되는 화학요법치료제들을 포함하는 약학적 제제(조성물)들이 또한 본 발명의 일부를 구성하며, 더 나아가 특히 적어도 하나 또는 그 이상의 포유류 유방암 증상들을 치료하거나 완화시키는데 사용하기 위한 약학적으로 수용 가능한 부형제를 포함한 조성물들, 특히, 여자사람에서 TNBC의 하나 또는 그 이상의 증상을 치료하거나 완화시키는데 사용하는 그런 조성물들이다.
화학요법치료제들 및 이들의 조성물들
나이트릭 옥사이드 (NO)는 암세포들 및 종양들 내부에서 농도 의존적으로 친-종양성 및 항-종양성 의 다발성 효과를 보인다. NO 는 세 개의 다른 아이소폼의 나이드릭 옥사이드 합성효소 (nitric oxide synthase (NOS))에 의해 생산된다;뉴론의(nNOS/NOS1), 유도성 (iNOS/NOS2), 및 내피의 (eNOS/NOS3). 증가되는 iNOS의 발현이 유방암을 물론 폐, 대장, 흑색세포종 및 교아종등과 같은 다른 암들에서도 발견되었다. 이전의 보고들에서는 높은 iNOS 발현과 유방암의 공격성 및 유방암 환자들의 예후가 나쁜것과 연관성이 있음을 보여주었다. 증가된 iNOS 발현은 최근에 interleukin-8 (IL-8), CD44, c-Myc (7)의 유도 및 전사인자 Ets-1의 활성화를 통해 에스트로겐 수용체-없는 것과 비슷한 유방암 을가진 환자의 생존율을 감소시키는 예후 인자로 제안되었다. 본 발명에서는, 내생 iNOS의 증강된 발현은 CSC의 자가-재생 성질들 및 종양들의 이동을 조절하여 종양의 재발 및 전이를 촉진시켜 환자의 생존율을 나쁘게 유도 한다고 가정한다. 더 나아가 전통적인 기존의 화학요법과 조합하여 내생 iNOS를 억제하는 것은 잔여 TNBC 세포들의 공격성은 물론이고, 간엽성 특징을 줄이고, 먼 기관으로의 전이 수를 줄여 TNBC를 가진 환자의 생존율을 증가시킨다고 가정한다.
다음의 예들에서, 선택적인 iNOS 억제제로서 1400W (N-[[3-(아미노에틸)페닐]메틸]-에탄이미다마이드)(N-[[3-(aminomethyl)phenyl]methyl]-ethanimidamide), 및 두 개의 총-NOS (pan-NOS) 억제제들로서 L-NMMA(NG-모노메틸-L-아르기닌)(NG-monomethyl-L-arginine) 및 L-NAME (N5-[이미노(니트로아미노)메틸]-L-오르니틴메틸에스터)(N5-[imino(nitroamino)methyl]-L-ornithine methyl ester)을 포함한 작은 분자량의 억제제들로 iNOS를 억제하는 것을 보여준다. L-NMMA은 수 백명의 심장쇼크 환자들에서 광범위하게 연구되었으며, 이때문에 광범위한 전임상 테스트 없이 바로 사람에의 임상 시험을 할수 있다는 것으로 간주 될 수 있다.
암로디핀 ( Amlodipine )
암로디핀은 디하이드로피리딘 칼슘 길항제로서 칼슘이온들의 세포막을 거쳐 혈관 평활근 및 심장근육으로 유입되는 것을 억제한다. 실험 데이타들에서 암로디핀은 디하이드로피리딘 결합 부위 및 비-디하이드로피리딘 결합 부위 둘 다 결합 하는것으로 제안 되었다. 심장근육 및 혈관평활근의 수축과정은 특별한 이온채널을 통해 세포 밖의 칼슘이온들이 이들 세포들로 이동하는 것에 따른다. 암로디핀은 칼슘이온들이 세포막을 통과하여 유입되는 것을 선택적으로 억제하여 치료용량에서 온전한 동물들의 혈관에서 큰 효과를 보여준다. 혈중 칼슘농도는 암로디핀에 의해 영향을 받지 않는다. 생리적 pH 범위내에서, 암로디핀은 이온화된 화합물(pKa　=　8.6)이며, 이의 칼슘채널 수용체와의 동적인 상호작용은 수용체 결합 부위와 점차적인 결합 및 분리의 특징을 가지고 있고, 이로서 점차적으로 개시되는 효과가 있다.
암로디핀은 말초동맥 혈관확장제로서 혈관 평활근에 직접 작용하여 말초 혈관 저항성을 줄이고 혈압을 줄이게한다.암로디핀이 협심증을 경감시키는 정확한 기전은 아직 완전히 정확하게 설명되고 있지 않으나 다음과 같은 것이 포함된다고 생강된다;
격심한 협십증: 격심한 협심증환자에서는, 암로디핀은 심장이 작동하는 대상인 총 말초저항성(내보낸후, afterload) 을 감소시키며, 압력생성율을 줄여서 이로서 어떠한 주어진 운동수준에서도 심장근육의 산소 요구량을 감소시킨다.
혈관경련성 협십증: 암로디핀은 동물모델 실험과 사람의 관상동맥혈관의 실험관내에서의 실험에서 칼슘, 포타슘 에피네피린, 세로토닌 및 트롬복산A2 유사체의 반응에 따라 관상 동맥 및 소동맥에서의 수축을 차단하여 혈액 흐름을 회복시키는것으로 나타났다. 이러한 관상동맥 경련의 억제는 혈관경련성 협심증에서 암로디핀의 효과에 기인한다.
전형적인 정의
본 발명에 따라, 폴리뉴클레오타이드들, 핵산조각, 핵산 서열들, 및 이와 비슷한 것들은, 이것에만 국한 하는 것은 아니지만, DNA들(이것에만 국한 하지않으나유전체 DNA 또는 비유전 체DNA (extragenomic DNA)들의 다 포함 한다), 유전자들, 펩타이드 핵산 (PNAs) 또는 RNAs (이것에만 국한 하지 않으나 rRNAs, mRNAs 및 tRNAs 포함), 뉴크레오사이드들, 및 자연적인 소스로부터 얻거나 또는 화학적으로 합성, 수정하거나, 또는 아니면 사람의 손으로 전부 또는 일부를 합성하여 제조한 적절한 핵산조각들을 포함한다.
달리 정의 하지 않는 한, 여기서 사용된 기술적 및 과학적인 용어들은 이 발명이 속해 있는 기술분야에 익숙한 보통사람들이 공통으로 이해하는 것과 같은 의미를 가진다. 여기서 서술되는 것과 비슷하거나 또는 같은 어떠한 방법들과 조성물들이 본 발명을 실행하거나 테스트하기 위해 사용될 수 있다 하더라도, 선호저인 방법들괴 조성물둘은 여기에 서술한다. 본 발명의 목적을 위하여, 다음의 용어들을 투명히하고 참고를 쉽게 할 목적으로 아래에 정의 한다.
그동안 오랜동안의 특허법의 전례에 따라, "a" 및 "an," 는 청구사항을 포함 한 이 출원에 사용될 때는, "하나 "또는 그 이상" 을 나타낸다.
용어 "약 (about)" 또는 "대략 (approximately)"이라는 용어는 여기서는 서로 바뚜어 쓸수 있으며 이는 주어진 숫자를 중심으로 한 숫자의 범위를 의미하는 것을 물론이고 다시 인용한 범위의 수안이 모든들의 의미한다(예, "약 5 내지 15" 는 별도로 언급하지 않는 한 "약 5에서 약 15"를 의미한다). 게다가 여기서 모든 숫자의 범위들은 그 범위에 있는 정수들을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"생물학적 적합성(Biocompatible)" 이란 살아 있는 세포에 노출시켰을 때 세포의 살아가는 사이클의 변화, 세포증식율의 변화 또는 세포독성 효과와 같은 바람직하지 않은 효과를 보이지 않고 세포에 적절한 해당하는 세포활성을 지지하는 재료를 의미한다.
여기서 사용된 대로, "버퍼(완충, buffer)"라는 용어는 버퍼를 포함한 산 또는 알카리가 용액이나 조성물에 첨가되었을 때 pH 변화에 저항성을 보이는 하나 또는 그 이상의 조성물 또는 이들의 수용액을 포함한다. 그러므로, 완충능력을 보이는 용액들 또는 다른 조성물들은 버퍼 또는 버퍼용액(완충용액)이라고 불리운다. 버퍼들은 일반적으로, 용액이나 조성물들의 pH 유지 능력을 무제한적으로 가지는 것은 아니며; 오히려 이들은 전형적으로 예를 들어 pH 약 5 내지 7의 범위 내와 같은 일정한 범위 내에서 pH를 유지할 수 있다.
여기서 사용 된대로, "운반체 (carrier)" 는 어떤 것이든 용매(들),분산미디움, 코팅(제), 희석제(들), 버퍼들, 등장제(들), 용액(들), 현탁액(들), 콜로이드(들), 불활성(들). 또는 이와같은 것들, 또는 관련되는 동물에게 투여하는데 약학적으로 수용가능 하거나 또는 치료 목적이나 진단 목적에 적용되기에 적합한 이들의 조합을 포함하려는 의도이다.
여기서 사용된 "효과적인 양(effective amount)" 이란 용어는 질병이나 컨디션을 치료하거나 완화시키는 능력이 있는 양 또는 의도한 대로의 치료 효과를 나타내는 양을 의미한다.
여기서 사용한 "예를 들어 (for example)"또는 "e.g.,"는 어느 제한을 의도한것은 아니며 단지 예시로 사용할 뿐이며 이 설명서에서 명시적으로 열거한 목록들만을 의미하는것이라고 해석해서는 안된다.
여기서 사용된대로, "치료를 필요로하는 (in need of treatment)" 이란 용어는 의사나 수의사와 같은 환자의 치료를 돌보는 사람에 의해 행해지는 판단(또는 한가지 또는 여러가지로 유익하개 할)을 의미한다. 그러한 판단은 환자를 돌보는 사람의 전문성의 범위내의 여러 인자들에 근거 하여 만들어지며, 여기에는 환자가 여기서 설명하는 것과 같은 하니 또는 그 이상의 화합물이나 약학적 조성물로 치료될수 있는 질병의 상태로 아프고 있다는 것은 알고 있는 것도 포함 될수 있다.
여기서 사용된 대로, "킷트 (kit)"라는 용어는 적어도 한 셋트의 시약들, 구성 성분들, 또는 약학적으로-조성된 본 발명의 조성물들을 포함하는, 가지고 다닐 수 있고, 독립된 봉입물의 여러 종류를 서술하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 그런한 킷트는 예를 들어 실험실 또는 임상적으로 함유된 조성물들을 사용하는데 필요한 설명을 하는 하나 또는 그 이상의 설명서 셋트들을 포함할 수 있다.
여기서 사용되는 대상물에 적용되는 "자연적으로-존재하는(naturally-occurring)" 이란 용어는 이 대상물을 자연에서 발견할 수 있다는 사실은 의미한다. 예를 들어, 자연에 존재하는 소스로부터 분리할 수 있는 생물(바이러스 포함)에 있는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이며 실험실에서 사람의 손에의해 의도적으로 수정되지 않은 것은 "자연적으로-존재하는" 것이라고 할 수 있다. 여기서 사용된대로, 고전적인 유전적인 방법에 따라 선택적으로 사육한 쥐들의 실험실 품종들은 자연적으로-존재하는 동물 이라고 할 수 있다.
여기서 사용되는 "핵산(nucleic acid)"이란 용어는 하나 또는 그 이상의 타입을 포함한다:폴리디옥시뉴클레오타이드 (2-디옥시-D-라이보즈를 함유), 폴리라이보뉴클레오타이드 (D-라이보즈를 함유), 및 퓨린 및 피리미딘 염기의 N-글라이코사이드 또는 수정된 퓨린 및 피리미딘 염기들의 (염기없는 부위 포함) 어떤 다른 타입의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 여기서 사용되는 "핵산(nucleic acid)"이란 용어는 또한 전형적으로 서브유닛들과 포스포다이에스터 연결로 그러나 어떤 경우에는 포스포로티오에이트들, 메틸포스포네이트들 및 이와 비슷한 연결로 공유결합된 라이보뉴클레오사이드들 또는 디옥시라이보뉴클레오사이드들의 폴리머들을 포함한다. "핵산" 에는 싱글- 및 더블-스트렌드 DNA는 물론, 싱글- 및 더블-스트렌드 RNA도 포함된다. 전형적인 핵산에는, 제한없이, gDNA; hnRNA; mRNA; rRNA, tRNA, 마이크로 RNA (miRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA), 작은소핵RNA (snORNA), 작은핵RNA (snRNA), 및 작은 일시적 (small temporal) RNA (stRNA), 및 이와 비슷한 것들 및 이들의 어떤 조합들을 다 포함 한다.
여기서 사용되는, "환자" (또한 "수용자", "숙주", 또는 "대상자" 라고도 상호교환적으로 의미함)라는 용어는 여기서 논의되는 혈관접근성 장치 하나 또는 그 이상을 수용하는자가 될 수 있는 숙주를 의미한다. 어떤 관점에서는, 수용자는 척추동물이 될 것이며, 이는 어떤 동물의 종도 표시할 의도가 있다 (바람직하게는 사람과 같은 포유류 종). 어떤 예들에서는 "환자"라는 용어는, 이것에만 국한 하는것은 아니지만, 사람 및 사람이 아닌 영장류, 조류, 파충류, 양서류, 소, 개, 염소, 카빈(cavines), 까마귀. 에핀(epines), 말, 고양이, 염소, 라핀(lapines), 토끼,루피너스(lupines), 생쥐, 양, 돼지,라신 (racines), 여우 및 제한없이, 가축화한 가축류, 무리지거나 이주성인 동물들 또는 새들, 외래종 또는 동물학적 견본은 물론, 반련 동물들, 애완동물, 및 수의사의 보호 아래 있는 어느 동물들을 포함하는 유사한 것들의 어느것이 든 동물 숙주를 의미한다.
"약학적으로-수용할만한 (pharmaceutically-acceptable)" 이란 구절은 사람, 특히 사람의 눈에 투여되었을 때 알러지나 이와 비슷한 나쁜 반응을 나타내지 않는 분자 실체들 및 조성물들 의미한다. 단백질들을 활성인자로 포함하고 있는 수용액 조성물 제제들은 이 분야에서 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이런 조성물들은 액체 용액들이나, 또는 현탁액들로서 주사가능하게 제조된다. 다른 한편으로는, 주사하기전에 액체에 용액이나 현탁액으로 하기에 적합한 고체형태로 제조된다.
여기서 사용되는대로, "약학적으로-수용할만한 염 (pharmaceutically-acceptable salt)"이란 모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 유지하고 있으며 원하지 않는 독성적인 효과를 내지 않는 염을 의미한다. 이런 염들의 예들에는, 이것에만 국한되는 것은 아니지만, 무기산, 예를 들어 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 및 이와 비슷한 것들로 형성된 산-첨가 염들이 포함된다;그리고, 예를 들어, 아세틱 에시드, 옥살릭 에시드, 타르타릭 에시드, 석시닉 에시드, 말레익 에시드, 후말릭 에시드, 글루코닉 에시드, 시트릭 에시드, 말릭 에시드, 아스코르빅 에시드, 벤조익 에시드, 탄닉 에시드, 파모익(엠보닉)에시드, 알기닉 에시드, 나프토익 에시드, 폴리글루타믹 에시드, 나프탈렌설포닉 에시드들, 나프탈렌디설포닉 에시드들, 폴리갈락투로닉 에시드(polygalacturonic acid)들과 같은 유기산들로 형성된 염들; 아연, 칼슘, 비스머스, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 닉켈, 카드뮴 및 이와 같은 다가 금속 양이온들로 이루어진 염들; N,N'-디벤질에틸렌디아민 (N,N'-dibenzylethylenediamine) 또는 에틸렌디아민(ethylenediamine)로 부터 형성된 유기 양이온으로 형성된 염들; 및 이들의 조합.
여기서 사용된 대로, "폴리펩타이드"라는 용어는 단일 "폴리펩타이드"는 물론 복수 "폴리펩타이드"로도 포함 하려고 했으며, 두 개 또는 그 이상의 아미노산들의 어느 체인 또는 체인들을 포함한다. 그러므로, 여기서 사용한대로, 이것에만 국한 하지는 않지만, "펩타이드", "디펩타이드", "트리펩타이드", "단벡질", "효소", "아미노산 체인" 및 "인접한 아미노산 서열"을 포함한 용어들은 모두 "폴리펩타이드"의 정의 내에 포함되며 "폴리펩타이드"라는 용어는 이들 어느 용어들을 대신하여 또는 서로 바꾸어서 사용될수 있다. 이 용어는 더 나아가 하나 또는 그 이상의 후번역 수정들, 예를 들어, 이것에만 국한하지는 않지만, 글라코실레이션(당쇄화), 아세틸레이션, 인산화, 아미데이션, 유도체화, 단백질 분해적 분해, 후-번역 과정, 또는 하나 또는 그 이상 비자연적으로 존재하는 아미노산들을 포함하는 수정을 거친 폴리펩타이드를 포함 한다. 전통적인 명명은 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 분야에 존재한다. 한 예로, 아미노산을 서술하는데 한-글자 및 세-글자 약어들이 널리 적용된다: 알라닌 (A; Ala), 아르기닌 (R; Arg), 아스파라긴 (N; Asn), 아스파르틱 에시드 (D; Asp), 시스테인 (C; Cys), 글루타민 (Q; Gln), 글루타믹 에시드 (E; Glu), 글라이신 (G; Gly), 히스티딘(H; His), 아이소루이신 (I; Ile), 루이신 (L; Leu), 메타이오닌 (M; Met), 페닐알라닌 (F; Phe), 프로린 (P; Pro), 세린 (S; Ser), 트레오닌 (T; Thr), 트립토판 (W; Trp), 타이로신 (Y; Tyr), 발린 (V; Val), 및 라이신 (K; Lys)이다. 여기서 서술된 아미노산 잔기들은 바람직하게는 "L" 아이소폼이다. 그러나, "D" 아이소폼으로 있는 잔기들은 바람직한 폴리펩타이들의 성질이 그대로 유지된다면"'L " 아이소폼으로 대신 대체될 수 있다.
여기서 사용된 대로, "예방한다 (prevent)", "예방하는(preventing)" "예방(prevention)", "억제한다 (suppress)" "억제하는(suppressing)" 및 "억제(supression)" 라는 용어는 여기서 사용한대로 질병상태의 시작이 일어나기 이전에 어떤 증상, 질병 상태의 양상, 또는 성질을 예방하기 위해 화합물 단독으로 또는 약학적 조성물로 포함하여 투여하는 것을 의미한다.
"단백질"은 여기서는 "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"와 서로 교환적으로 사용되며, 합성적으로나, 재조합적으로, 또는 실험관 내에서 생산된 펩타이드들 및 폴리펩타이드들 모두를 포함하며, 숙주 동물 또는 사람 대상에 핵산 서열을 투여하여 생체내에서 발현된 펩타이드들 및 폴리펩타이드들도 포함된다. "폴리펩타이드" 라는 용어는 바람직하게는 둘 내지 20 아미노산 잔기 길이를 가진 짧은 펩타이드들, 10 내지 100 아미노산 잔기 길이의 올리고펩타이드들, 및 100 아미노산들 또는 그 이상의 아미노산들을 포함하는 긴 폴리펩타이드를 포함하는 어떤길이의 아미노산 체인 길이도 의미하고자 한다. 더 나아가, 이 용어는 또한, 즉, 적어도 하나의 아미노산 폴리머를 포함하는 기능적 바이오분자들인 효소들을 포함하고자 한다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 단백질들은 또한 후번역적으로 수정된 폴리펩타이드 및 단백질들을 포함하며, 아미노산 체인 백본에 첨가된 당이나 다른 유도체(들) 또는 접합체(들)을 포함한다.
"여기서 사용한 대로의 "정제한(Purified)"이란, 많은 다른 화합물들이나 실체들로부터 분리되는 것을 의미한다. 부분적으로 정제되거나, 상당히 정제 또는 순수하게 정제 될수 있다. 한 화합물이나 실체는 모든 다른 화합물들이나 실체들로부터 상당히 분리 되었을 때, 즉 바람직하게 적어도, 약 90%, 더 바람직하게는 적어도 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 99% 이상 순수 할 때, 순수하다고 간주 될수 있다. 부분적으로, 또는 상당히 정제된 화합물이나 실체는 자연적으로 발견되는 재료로부터, 예를 들어 세포 단백질들 및/또는 핵산들과 같은 세포 재료들로 부터, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80% 가 분리 될 수 있다.
여기서 사용된 "대상(subject)"이라는 용어는 본 발명에 따른 조성물들로 처치가 제공될 수 있는 영장류와 같은 포유류들을 포함한 생물체를 나타낸다. 공개되는 처치방법으로 이익을 볼 수 있는 포유류 종들에는, 이것에만 국한하지 않으나, 유인원들; 침판지들; 오랑우탕들; 사람들; 원숭이들;개 및 고양이와 같은 가축화된 동물들; 말, 소, 돼지, 양, 염소, 및 닭과 같은 가축류; 및 생쥐(mice), 큰쥐(rat), 기니픽 및 햄스터와 같은 다른 동물들을 포함한다.
여기서 사용된대로 성분의 양과 관련하여 "상당히 없음 (substantially free)" 또는 "본질적으로 없음(essentially free)" 이라는 용어는 바람직하게는 무게 퍼센트로 10% 보다 적은 양의 성분을 의미하며, 바람직하게는 5% 미만, 및 더 바람직하게는 1% 미만의 무게 퍼센트의 화합물을 의미한다. 바람직한 예들에서, 이용어들은 0.5 무게% 미만, 0.1 무게% 미만, 또는 0.01무게% 미만을 의미한다.
여기서 사용된대로 "플라즈미드", 또는"벡터"는 유전물질로 이루어진 유전적구조물을 의미한다. 전형적으로. 한 플라즈미드, 또는 한 벡터는 박테리아 숙주 세포, 예, 대장균 (Escherichia coli), 에서 기능을 하는 복제 시작점 및 플라즈미드를 포함 하는 숙주세포를 검출할 수 있는 선택마커를 함유한다. 플라즈미드들 및 벡터들은 여기서 서술된 대로 삽입된 코딩서열이 적절한 발현 세포들에서 전사 및 번역이 될 수 있도록 배열된 하나 또는 그 이상의 유전적 요소들을 포함할 수 있다. 더불어, 플라즈미드들 및 벡터들은 하나 또는 그 이상의 자연적 및/또는인공적인 소스로부터 얻어지거나 유도된 하나 또는 그 이상의 핵산조각들, 유전자들, 프로모터들, 인핸서들(enhancers), 활성인자들, 여러클로닝부위들(multiple cloning regions), 또는 이들의 어느 조합,을 포함 할수 있다
"서열번호 X에서 설명하는 것과 본질적으로 같은 서열(a sequence essentially as set forth in 서열번호 X)"이란 용어는 서열이 상당히 서열번호 X 부분에 해당하며, 서열번호 X 의 핵산들 (또는 아미노산들)과 또는 이에 해당하는 생물학적 기능과 동등하지 않은 핵산들 (또는 폴리펩타이드인 경우에는 아미노산들)의 서열은 상대적으로 거의 없다는 것을 의미한다. "해당하는 생물학적 기능(biologically functional equivalent)"이란 용어는 이 분야에서는 잘 이해되고 있으며, 여기서 더 상세히 정의한다. 따라서, 여기서 제공되는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열과 동등하거나 또는 기능적으로 해당하는 핵산 서열의 약 85% 에서 약 90%의 서열을 갖거나; 더 바람직하게는 약 91%에서 약 95% ; 더욱더 바람직하게는 약 96% 에서 99%;의 핵산서열은 갖는 것은 특히 본 발명을 실행하는데 유용할 것이라고 신중히 생각한다.
본 발명에서 적절한 표준 하이브리디제이션(혼성) 조건들에는, 예를 들어, 50% 포름아마이드, 5X 덴하아드 용액(5X Denhardt's solution), 5X SSC, 25 mM 소듐 포스페이트, 1% SDS 및 100 μg/ml 변성시킨 연어정자 DNA 를 포함 하는 용액에서 42℃ 로 16시간 동안 혼성시키고 이어서 배경 시그날을 원하는 만큼 제거하기 위하여 1시간 동안 0.1X SSC, 0.1% SDS 용액으로 순차적으로 60℃ 에서 세척시키는 것을 포함한다. 본 발명에서의 엄격성 (stringency, 스트린젼시)을 낮춘 혼성조건에는, 예를들어, 35% 포름아마이드, 5X 덴하아드 용액(5X Denhardt's solution), 5X SSC, 25 mM 소듐 포스페이트, 0.1% SDS 및 100 μg/ml 변성시킨 연어정자 DNA 또는 대장균 DNA를 포함하는 용액에서 42℃ 로 16시간 동안 혼성시키고 이어서 0.8X SSC, 0.1% SDS 로 55℃에서 순차적으로 세척하는 것을 포함한다.
자연적으로, 현 발명은 또한 여기서 특별히 언급하는 하나 또는 그 이상의 특이한 핵산 서열들에 상보적인, 본질적으로 상보적인, 및/또는 상당히 상보적인 핵산 조각을 포함 한다. "상보적인 (complementary)" 핵산 서열은 왓슨-크릭의 상보성 규칙에 따른 염기-짝을 이룰수 있는 것들이다. 여기서 사용된 대로, "상보성 서열"이란 용어는, 위에서 설명한 대로 같은 핵산 비교로 평가 할 수 있듯이, 또는 여기서 공개되는 특이한 핵산조각 하나 또는 그 이상과 바로 위에서 서술된 것과 같은 비교적 스트린젼시가 있는 조건들하에서 혼성될 수 있는 것으로 정의된 것과 같은 의미의 상당히 상보성인 핵산 서열들을 의미한다.
위에서 서술된 대로, 현 발명에서 프로브들 및 프라이머들은 어떤 길이도 될수 있다. 서열에 숫자 값을 부여하여, 예를 들어, 첫 번째 잔기는 1, 번째 잔기는 2 등으로, 주어진 서열 내에 포함하는 모든 프로브들 및 프라이머들을 정의하는 알고리즘은 다음과 같이 제안될 수 있다:
n 에서 n + y, 여기서 n 은 1 에서 서열의 마지막 수까지의 정수이고 y 는 프로브 또는 프라이머의 길이 마이너스 1이며, 여기서 n + y 는 서열의 마지막 숫자를 넘지 않는다. 그러므로 25-염기쌍 (베이스페어) 프로브 또는 프라이머[즉 "25-머(25-mer)"]에서, 프로브들 또는 프라이머들의 집단은 염기들 1에서 25, 염기들 2에서 26, 염기들 3 에서 27, 염기들 4 에서 28 및 등등 서열 전체 길이에 다 해당된다. 마찬가지로, 35-염기쌍 프로브 또는 프라이머(즉 "35-머")에서, 전형적인 프라이머 또는 프로브 서열에는, 제한 없이, 염기들 1에서 35, 염기들 2 에서 36, 염기들 3 에서 37, 염기들 4 에서 38, 및 등등 서열 전체 길이에 해당되는것을 다 포함한다. 마찬가지로, 40-머(40-mers)에서, 그런 프로브들 또는 프라이머들은 핵산 서열 1 번째 베이스페어(bp) 에서 40 번째 bp, 서열의 두 번째 bp에서 41번째 bp, 3 번째 bp 에서 bp 42 및 등등에 해당할 수 있으며, 50-머 에서는 그런 프로브들 또는 프라이머들은 핵산 서열 bp 1 에서부터 확장하여 bp 50 까지, bp 2 에서 bp 51까지, bp 3 에서 bp 52 까지, bp 4 에서 bp 53 까지 및 등등에 해당할 수 있다. 여기서 사용된대로 "치료하는 (Treating)" 또는 "치료의(treatment of)" 는 대상에게 어느 형태의 의학적인 또는 외과적인 처치를 제공하는 것을 의미한다. 치료는, 이것에만 국한하지 않고, 대상에게 치료적인 제제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다. "치료하는"은 대상에게 질병, 장애, 또는 컨디션 또는 하나 또는 그 이상의 증상 또는 질병, 장애, 또는 컨디션의 징후와 같은 것들의 치유, 역전, 완화, 심각성감소, 진행억제, 또는 감소의 목적으로 본 발명의 화합물 또는 조성물을 투여하거나 적용하는 어떤 것이든 포함한다. 어떤 관점에서는, 현 발명의 조성물들은 예방적으로 투여될 수 있다, 즉, 그 컨디션의 증상이나 징후가 나타나기 이전이며, 여기서 그런 예방은 보증된다. 전형적으로, 이런 경우에는, 그 대상은 가족력, 의료기록의 결과, 또는 하나 또는 그 이상의 진단적 또는 예후적 검사들을 하여 후에 그러한 질병 또는 장애로 발전 될 성향을 보이는 결과 때문에 그런 질병 또는 장애로 발전 될 "위험성(at risk)"이 있다고 진단된 대상이 될 것이다.
"치료적으로 실질적인 시간동안" (therapeutically practical time period)" 이란 용어는 활성 제제가 치료적으로 효과를 내는데 필요한 시간동안을 의미한다. "치료적으로 효과적인(therapeutically effective)" 이란 증상들의 심각성 및/또는빈도수를 감소시키고, 증상들 및/또는 잠재적인 원인을 제거, 증상 및/또는 이들의 잠재적 원인의 출현의 예방, 및 손상을 개선 또는 교정시키는 것을 의미한다.
"치료적 제제 (therapeutic agent)"는 대상의 목표 부위에 바람직한 효과를 주는 생리학적으로 또는 약리학적으로 활성이 있는 어느 물질이다. 치료적 제제는 화학요법치료제제, 면역억제적인 제제, 사이토카인, 세포독성제제, 핵산분해 화합물, 방사성 동위원소, 수용체, 및 프로-드럭 활성효소가 될수 있으며, 이들은 자연적으로 존재하거나, 합성 또는 재조합 방법으로 생산 되거나 또는 이들의 조합으로 생산될 수 있다. 빈카 알카로이드들(vinca alkaloids )[예, 빈브라스틴(vinblastine) 및 빈크리스틴(vincristine)], 안트라사이클린들(anthracyclines) [예,독소루비신 (doxorubicin) 및 다우노루비신 (daunorubicin)], RNA 전사억제제 [예, 액티노마이신-D (actinomycin-D)]및 마이크로듀불(microtubule) 안정화 약물들 (예, 파클리탁셀 paclitaxel)과 같은 고전적인 다중약물저항성에 의해 영향을 받는 약물들은 특히 치료적 제제로서의 이용도를 가질수 있다. 사이토카인들 역시 치료적 제제로서 사용될 수 있다. 그러한 사이토카인들의 예들에는 림포카인들, 모노카인들, 및 전통적인 폴리펩타이드 홀몬들이 있다. 암 화학치료요법 제제는 바람직한 치료적 제제가 될 수 있다. 항암제의 좀 더 상세한 서술에 대해서는, 이 분야에 익숙한 사람들은, 이것에만 국한하지 않고, "의사들의 책상 참고서 (Physician's Desk Reference)" 및 "굿만 및 길만의 치료제들의 약리적 기초" [Goodman and Gilman's "Pharmacological Basis of Therapeutics" tenth edition, Eds. Hardman et al., 2001.] 를 포함하는 여러 개의 지시적 메뉴얼들을 참조 한다.
"전사조절 요소 (Transcriptional regulatory element)" 는 단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 핵산 서열들과 조합하여 전사를 활성화시키는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 전사조절 요소에는, 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 프로모터들, 하나 또는 그 이상의 반응요소들, 하나 또는 그 이상의 네가티브 조절요소들, 및/또는 하나 또는 그 이상의 증진제들 (인핸서, enhancers)을 포함 할수 있다.
여기서 사용한 대로, "전사인자 인식부위(transcription factor recognition site)" 및 "전사인자 결합부위(transcription factor binding site)" 는 폴리뉴클레오타이드 서열(들) 또는 서열 모티브(들)로서, 하나 또는 그 이상의 전사인자들이 직접 단백질-DNA 결합의 형태를 자주 취하면서 서열-특이적으로 상호작용하는 부위들이다. 전형적으로, 전사인자 결합부위는 DNA 훗프린팅, 젤이동성변화 에세이 및 이와 비슷한 방법으로 동정될 수 있으며, 그리고/또는 알려진 공통 서열을 근거로 예측할 수 있거나, 또는 이 분야에 익숙한 사럼들에게 알려진 다른 방법으로 동정될 수 있다.
"전사 유닛트 (Transcriptional unit)"는. 적어도 첫 번째 구조유전자가 적어도 시스-로 작용하는 (cis-acting) 프로모터 서열과 사용될 수 있게 연결되어 있고, 선택적으로 구조 유전자 서열의 효과적인 전사에 필요한 하나 또는 그 이상의 다른 시스-로 작용하는 핵산 서열과 사용될 수 있게 연결되어 있고, 그리고 적어도 구조유전자 서열의 적절한 조직-특이적 및 발생적 전사에 필요할 수도 있는 첫 번째 먼 부위의 조절요소가 사용될 수 있게 프로모터 및/또는 인핸서요소들은 물론 효율적인 전사와 번역에 필요한 [예, 폴리아데닐레이션(들), mRNA 안정성 조절 서열(들) 등]추가의 시스-로 작용하는 어떤 서열들의 조절하에 있도록 위치해 있는 것을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
"상당히 보완적인 (substantially complementary)" 란 용어는 아미노산 또는 핵산 서열을 정의하기 위해 사용될 때는 특별한 대상서열이, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드 서열, 선택한 서열의 모두 또는 일부분에 상당히 보완적인 것을 의미하며, 그러므로 선택된 서열이 코딩하는 mRNA의 부분과 특이적으로 결합할 것이다. 그래서, 전형적으로 서열들은 mRNA "타겟" 서열과 매우 보완적일 것이며, 보완적인 부분내의 서열들에서는 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10 또는 그 정도 이하의 베이스 불일치(mismatch)만을 갖을 것이다. 많은 경우에, 서열이 정확하게 일치되는 것이 바람직할 것이다, 즉, 올리고뉴클레오타이드가 특별히 붙는 서열과 완전히 보완적이고, 그러므로, 보완적인 부분에서는 비메치가 0 이다. 그래서, 매우 보완적인 서열은 전형적으로 꽤 특별하게 mRNA의 타겟서열 부위에 결합하며, 그러므로 타겟 mRNA 서열의 폴리펩타이드 산물로의 번역을 훨씬 효율적으로 감소시키고 그리고/또는 억제시키기까지 한다.
상당히 보완적인 핵산서열들은 핵산이 특이적으로 결합하는 해당 핵산 타겟 서열의 약 80% 보완성 (또는 % 완전-메치)보다 클것이며, 더 바람직하게는 핵산이 특이적으로 결합하는 해당 핵산 타겟 서열의 85% 보완성보다 클것이다. 위에서 서술된 대로 어떤 관점에서는, 이 발명을 실행적으로 사용하기 위해서는 좀 더 상당히 보완성을 가진 핵산 서열이 바람직할 것이며, 이런 경우, 핵산이 특이적으로 결합하는 해당 핵산 타겟 서열들의 약 90% 이상일 것이며, 어떤 예들에서는 핵산이 특이적으로 결합하는 해당 핵산 타겟서열들의 95%이상 보완성을 가질것이며, 그리고 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 까지도 포함하고, 및 계획된 핵산이 특이적으로 결합하는 타겟 서열의 모두 또는 일부분에 약 100% 정확한 메치까지 되는 것을 포함한다.
공개되는 어떤 핵산 서열들의 % 유사성 또는 % 보완성은, 예를 들어, 위스콘신대학교 유전학 컴프터 그룹 (University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG)에서 얻을수 있는 GAP 컴프터 프로그램, 버전 6.0,를 사용하여 서열 정보를 비교하여 결정되어질 수 있다. GAP 프로그램은 니들만 및 운쉬 [Needleman and Wunsch (1970)]의 정렬방법 (alignment method)을 사용한다. 간략하게, GAP 프로그램에서는 유사성(similarity)을 정렬된 비슷한 심볼(즉, 핵산들, 또는 아미노산들)들의 수를 두 서열들의 짧은 부분에서의 총 심볼들의 수로 나눈값으로 정의 한다. GAP 프로그램에 바람직한 불이행 특성값(매개변수,default parameters)에는 (1) 핵산은 단일체 비교 행렬(unary comparison matrix )(동일성은 값 1 및 비-동일성은 값 0 을 포함 한다) 및 그리스코브와 버게스의[Gribskov and Burgess (1986)]의 가중치비교행렬, (2) 각 차이(gap)에서 3.0 벌점 및 각 차이에서 각 심볼에 추가 0.1 벌점; 및 (3)끝의 차이들에서는 벌점 없음이 포함된다.
여기서 사용된 대로," 형질전환되 세포"란 용어는 하나 또는 그 이상의 외부의 폴리뉴클레오타이드를 세포 안으로 넣어서 숙주세포의 핵산보완이 바뀐 것을 의미하고자 하였다.
여기서 사용된 대로, "형질전환 (transformation)"이란 용어는 일반적으로 외부의 폴리뉴클레오타이드 서열을(예, 바이러스 벡터, 플라즈미드, 또는 재조합 DNA 또는 RNA 분자) 숙주 세포 또는 원형질체에 넣어서 외부의 폴리뉴클레오타이드가 적어도 숙주 염색체에 병합되거나 또는 형질전환된 숙주세포에서 자동적으로 복제되는 능력을 가지게 되는 과정을 의미하고자 하였다. 트란스펙션(Transfection), 일렉트로포레이션 (Transfection) 및 "노출된 (naked )" 핵산 흡수 등 모든 대표적인 기술의 예들을 사용하여 숙주세포를 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드로 형질 전환 시킨다.
여기서 사용한 대로, "치료한다 (treat)" "치료하는 (treating)" 및 "치료(trreatment)" 라는 용어는 하나 또는 그 이상의 화합물들(단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 약학적 조성물에 포함 된)을 어떤 질병상태의 임상적 증상들이 나타난 후 이 증상, 관점 또는 질병상태의 특징을 감소시키거나 또는 제거하기 위해 투여함을 의미한다. 그러한 치료하는 것은 의료적으로 유용하다고 생각하는데 절대적일 필요는 없다. "치료한다 (treat)" "치료하는 (treating)" 및 "치료(trreatment)" 라는 용어는 질병의 정도나 심각성에 있어서 이들이 나타나기 전이나 후에 환자를 괴롭히는 하나 또는 그 이상의 증상을 치료 또는 완화 또는 감소시키는 것을 의미한다.
어떤 예들에서는, 하이브리디제이션 에세이 (혼성 검사)에서 주어진 타겟 서열이 있는지를 결정하기 위해 레블된 폴리뉴클레익 에시드 프로브들을 사용하는 경우와 같이 현 발명의 하나 또는 그 이상의 핵산 서열 조각을 적절한 검사마커 [즉, "표지(레블)]"와 조합하여 사용하는 것이 유리할 것이다. 올리고 뉴클레오타이드 프로브들을 레블하는데는, 제한없이, 형광물질, 방사성동의원소, 효소 또는 아비딘/바이오틴과 같은 다른 리간들 등 적절한 에세이에서 검출될수 있는 것들을 포함한 여러 다양한 적절한 지시 화합물들 및 조성물들이 이 분야에서 알려져있다. 어떤 특별한 예에서는, 방사성동위원소나 환경적으로 덜-바람직한 다른 시약들을 사용하는 대신에 하나 또는 그 이상의 형광 레블 또는 유레이즈 (urease), 알카라인 포스파테이즈 (alkaline phosphatase) 또는 퍼옥시데이즈 (peroxidase)와 같은 효소태그를 또한 사용할 수도 있다. 효소태그인 경우, 비색계(칼로리메트릭,colorimetric), 발색체적(클로모제닉,chromogenic), 또는 형광발색적 (플루오로제닉,fluorogenic) 지시 기질이 알려졌으며, 이들을 사용하여 하나 또는 그 이상의 보완적인 또는 상당히 보완적인 핵산 서열들을 함유하고 있는 샘플들과의 특이적 혼성을 동정하기 위해 사람의 눈으로 또는 신티크램, 풀루오로메트리, 스펙트로메트리 및 이와 비슷한 분석 방법으로 검출할수 있는 방법이 제공된다. 소위 말하는 두 개 또는 그 이상의 레불 된 프로브들이 동시에 또는 연속적으로 검출되는 "멀티플렉싱" 에세이 경우, 첫 번째 올리고뉴클레오타이드 프로브를 첫 번째 검출 성질 또는 파라미터를 [예,방출(emission) 및/또는 흥분(excitation) 스펙트럼이 최대} 갖는 첫 번째 레블로 레블시키고, 두 번째 올리고뉴클레오타이드 프로브를 다른 두 번째 검출 성질 또는 파라미터를 (첫 번째와는 분별이 있거나 식별되는)갖는 두 번째 레불로 레불시키는것이 바람직하다. 멀티플렉싱 에세이들의 사용은, 특히 유전학적 증폭/검출 프로토콜들의 내용인 측면에서 분자유전학 분야에 익숙한 보통 사람들에게는 잘 알려져있다.
전체적으로 사용되는 섹션의 머리글자들은 조직적인 목적으로만 사용되고 있으며 서술되는 주제들을 제한하여 설명하여고자 하는 것은 아니다. 이것에만 국한된것은 아니지만 특허들, 특허출원들, 논문들, 및 조약들을 포함하는 출원에서 인용된 모든 서류들, 또는 서류들의 일부분들은, 여기서 참고 문헌으로 어떤 목적으로든지 전부 명백히 병합되고 있다. 하나 또는 그 이상의 병합된 문헌 및 비슷한 재료들이 이출원에서 정의한 용어와 상반되는 방식으로 정의 할때는 이출원가 조절한다.
실시예들 :
다음의 예시들은 본 발명의 바람직한 예들을 보여주기 위해 포함시켰다. 이 분야에 익숙한 사람들은 다음의 예시들에서 공개되는 기술들은 본 발명을 실행하는데 기능이 잘 되도록 하기 위해 본 발병자들에 의해 발견된 기술들을 대표한다고 인지해야 할 것이며, 그러므로, 실행을 위해 바람직한 방식으로 구성되었다고 간주할 수 있다. 그러나, 이 분야에 익숙한 사람들은 현 공개에 비추어, 공개되는 특별한 예들에서 많은 변경들이 있을 수 있고 그래도 이 발명의 정신이나 범위를 벗어남이 없이 같은 또는 비슷한 결과를 얻을 것이라는 것을 인지해야 할것이다.
TNBC 에 대한 효과적인 표적 치료로서의 iNOS 억제
위에서 주목한대로, TNBC 는 효과적인 표적 치료가 없는 유방암의 공격적인 형태이다. iNOS 는 종양의 공격성을 증가시킴으로서 유방암환자들의 나쁜 생존율과 연관이 있다. 내부유래 iNOS를 억제하는것은 상피세포-간엽 전환 유도 인자들 [epithelial-mesenchymal transition (EMT)]의 조절을 통해 종양 개시 및 전이를 감소시켜 TNBC의 공격성을 감소시킨다고 가정되었다.
이 예시는 iNOS 억제제들을 TNBC의 표적치료로서 사용하는 것을 서술한다. 83개의 사람 TNBC 조직에서 iNOS 단백질 수준들이 측정되었으며 임상적 결과와 연관시켰다. iNOS 억제후 증식, 맘모스페어-형송효율, 이동, EMT 전사인자들이 실험괸내에서 평가되었다. TNBC 마우스 모델들에서 잠재적인 치료로서 내부 iNOS를 표적으로 하는것이 평가 되었다.
유전자 발현분석은 물론 면역조직학적 분석에서 높은 내부 iNOS 발현은 TNBC 환자들의 나쁜 예후와 관련 있는 것으로 나타났다. 선택적인 iNOS (1400W) 및 pan-NOS (L-NMMA 및 L-NAME) 억제제들은 EMT 전사인자들 (Snail, Slug, Twist1, 및 Zeb1) 억제와 함께, 실험관 내에서 세포 증식, CSC 자가-재생, 및 세포 이동을 감소시켰다. HIF1α, 소포체 스트레스(endoplasmic reticulum stress)((IRE1α/XBP1) 및 ATF4/ATF3 와 TGFβ사이의 연결의 손상이 관찰되었다. iNOS 억제는 종양 성장을 상당히 감소시키고, 세포증식을 줄게하고, 그리고 많은 폐전이를 줄이는 것은 물론이고 종양 개시 및 자가-재생 능력을 감소시킨다. L-NMMA 가 종양 성장을 줄이고 TNBC의 생존율을 증강시킨다는 성공에 근거하여, 발명자는 일반적으로 iNOS 억제제들을 다른목적으로서, 특히 팬-NOS (pan-NOS) 억제제 L-NMMA (이는 이미 심장쇼크 에서 심도있게 연구되었음) 를 항암 치료료법제로서 효과적인 표적치료 요법으로 제안한다.
재료들 및 방법들
언코마인 (Oncomine ) 유전자 발현 데이타 분석.
사람의 삼중-네가티브 유방암에서 NOS2 mRNA 발현을 암유전자지도 (The Cancer Genome Atlas )(TCGA) 데이타 베이스 (n　=　593)의 언코마인 (Oncomine) 암 마이크로어레이 데이타 분석으로 조사하였다. 환자 생존율 분석은 두 개의 다른 유전자 발현 데이타 셋트로 부터 얻었다.
세포 배양.
간엽-유사 ( Mesenchymal-like)성 삼중-네가티브 유방암 세포주들인 MDA-MB-231 및 SUM159,은 미국 세포주 수집처( American Type Culture Collection) 및 에스터랜드(Asterand)dpt 각 각 구매 했다. 특별히 언급하지 않으면, 세포들은 매일 1400W (0.1, 1, 10, 100μ　M; 1, 2, 4　mM), L-NMMA (0.1, 1, 10, 100　μM; 1, 2, 4　mM) 또는 L-NAME (0.1, 1, 10, 100　μM; 1, 2, 5　mM)로 96 시간동안 처치되었다. 맘모스페어 형성 효율(MSFE), 세포 증식, 및 이동 에세이들은 아래에 상세히 서술된다.
면역조직화학.
파라핀에 끼워있는 사람 환자의 부위, MDA-MB-231 및 SUM159 오르토토픽 종양 조직은 항-iNOS (1:50 희석) 또는 항-Ki67 (1:100 희석) 항체와 배양시켰다. 슬라이드들은 헤마톡실린으로 대비염색을 시켰다. 추가 정보는 아래에 포함되어 있다.
동물 연구.
암컷 SCID Beige 마우스 (4-5주령) 를 표준연구실 컨디션에서 키웠다(22℃; 12 시간/12 시간 낮/밤 사이클 및 음식과 물은 자유롭게 접할수 있게함). 모든 동물 과정 및 실험 프로토콜들은 기관 및 연방정부에서-승인된 동물 보호 및 사용 가이드라인을 사용하여 수행되었다. 상세한 정보는 아래에 서술된다.
통계분석.
데이타들은 평균 ±SEM 으로서 표현된다. p 값 0.05 미만은 유효하다고 간주된다.
시약들.
N-[[3-(아미노메틸)페닐]메틸]-에탄이미다미이드(1400W) 및 N5-[이미노(니트로아미노)메틸]-L-오르니틴 메틸 에스터(L-NAME) 는 케이마 화학(Cayman Chemical에서 구입했다. 틸아르기닌(NG-모노메틸-L-아르기닌)[Tilarginine(NG-Monomethyl-L-arginine)(L-NMMA) 은 엔조 라이프 사이언스(Enzo Life Sciences )로부터 얻었으며 아르기녹스 제약회사(Arginox Pharmaceuticals) 에서 친절하게 공급되었다. 투니카미이신 (Tunicamycin) 및 재조합 인간 TGF-β1 (CHO 세포주에서 유래)는 애비ㅁ및 펩프로텍 (Abcam and Peprotech)으로 부터 각각 얻었다, 항-iNOS (N-20), 항-eNOS (C-20), 항-nNOS (R-20), 항-Twist1 (L-21), 항-Twist1 (2C1a), 항-ATF3 (C-19) 및 항-CR-2 (C-20) (ATF4) 항체들은 산타 크르즈 바이오텍 회사(Santa Cruz Biotechnology, Inc)로부터 구했다. 항체들 항-Snail (C15D3), 항-Slug (C19G7),항-TCF8/Zeb1 (D80D3), 항-PERK (C33E10), 항-TGFβ, 항-phospho-Smad2 (Ser465/467)/Smad3 (Ser423/425) (D6G10), 항-Smad2/3, 항-IRE1α (14C10), 항-phospho-PERK (Thr980) (16F8), 항-PERK (C33E10), 항-phospho-eIF2α (Ser51) (119A11), 항-eIF2α, 항-β-Actin (13E5), 항-토끼 및 항-마우스 IgG (HRP-linked) 들은 셀 시그날링 테크놀로지회사( Cell Signaling Technology Inc)롭부터 구했다. 항-HIF1α (EP1215Y)는 애비캠(Abcam)으로부터 구했다. 면역조직화학을 위해, 항-Ki67 (SP6)은 애비캠(Abcam)으로부터, 항-iNOS (K13-A)는 노버스 바이오로지칼 (Novus Biologicals)로 부터, 그리고 항-갈라진 케스페이즈-3 (cleaved caspase-3) (Asp175)는 셀 시그날링 (Cell Signaling)으로부터 구했다. XBP1 및 β-Actin 의 PCR 프라이머들은 인비트로젠 (Invitrogen)으로부터 구했다. 마우스 항-인간 CD24-FITC (클론 ML5) 및 마우스 항-인간 CD44-APC (클론 G44-26)들은 BD 바이오사이언스(BD Biosciences)로부터 구했다. 항-마우스 MHC 클래스 I (H-2Kd)-PE (클론 SF1-1.1.1)는 이바이오사이언스(eBioscience)로 부터 구했다.
세포 배양 및 맘모스페어 형성 효율 에세이
간엽-유사 ( Mesenchymal-like)성 삼중-네가티브 유방암 세포주들인 MDA-MB-231 및 SUM159 들이 [미국 세포주 수집처( American Type Culture Collection) 및 에스터랜드(Asterand)에서 각각 구매했다] 높은 EMT 마커들의 발현, 전이성 성질들, CD44+/CD24- 세포들의 퍼센트(MDA-MB-231: ~80-90%; SUM159: ~40-50%) 및 iNOS 단백질 수준들에 근거하여 선택되었다. 세포들은 10% 태아송아지세혈청( fetal bovine serum)(Thermo Scientific) 및 1% 항생제-항곰팡이제 (antibiotic-antimycotic)(Gibco)가 보충된 둘벡코의 수정된 이글 배지 (ecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco) 에서 길렀다. iNOS 억제제들(1400W, L-NMMA, 및 L-NAME)의 저장용액들은 1X PBS에 만들어졌다. 억제제들은 세포들에 첨가 되기전에 세포배양 배지에 더 희석시켰다. 특별히 언급하지 않으면, 세포들은 매일 1400W (0.1, 1, 10, 100μ　M; 1, 2, 4　mM), L-NMMA (0.1, 1, 10, 100　μM; 1, 2, 4　mM) 또는 L-NAME (0.1, 1, 10, 100　μM; 1, 2, 5　mM)로 96 시간동안 처치되었다. 맘모스페어-형성 효율 (MSFE)에세이를 위해, 2,000 (SUM159) 및 5,000 (MDA-MB-231)세포들/웰들을 0.5% 메틸셀루로즈 (Methocult H4100, StemCell Technologies) 및 10% 맘모컬르 증식 보충제 (Mammocult proliferation supplement), 4　μg/mL 헤파린 및 0.48　μg/mL 하이드로코티존 (hydrocortisone) (StemCell Technologies)으로 보충된 맘모컬트 기본배지(Mammocult basal medium)에서 배양시켰다. 1, 2, 및 4　mM (1400W 및 L-NMMA) 또는 1, 2, 및 5　mM L-NAME로 96 시간동안 처치한 후, 일차 맘모스페어들(MS)이 스캔 되었으며, 콜로니 카운터(GelCount, Oxford Optronicx) 를 사용하여 세었다. 일차 MSFE 는 맘모스페아 수를 세포 수로 나눈 값으로 평가되었다. 일차 MS를 트립신으로 처리한 후, 단 세포들은 0.5% 메틸셀루로즈 및 맘모스페에 배지 (위에서술된대로)에 서 처치없이 길렀다. 2차 MS가 스캔 되었으며, 수를 세고, 그리고 2차 MSFE가 평가되었다. 폐 전이의 마우스모델을 위해, MDA-MB-231 세포들을 루시페라제/GFP-근거한 (luciferase/GFP-based)이중-프로모터 플라즈미드로 트란스펙션(transfected) 시켰으며 및 안정화된 클론 (MDA-MB-231 L/G)들을 1　mg/mL 블라스시티딘 [blasticidin (InvivoGen)]으로 선택하였다.
세포 증식 에세이.
세포 증식에서의 iNOS 억제 효과가 WST-1 방법으로 에세이 되었다. 간단히, 500 (SUM159) 및 1,000 (MDA-MB-231) 세포들/웰을 96-웰 플레이트에 플레이트 하였고, 1, 2, 및 4　mM (1400W 및L-NMMA) 또는 1, 2, 및 5　mM L-NAME로 96시간 동안 처리되었다. 미리 섞은 WST-1 시약 (Clontech)을 첨가하여 증식율을 측정하였다. 37℃에서 3 시간 동안 배양시킨 후, 450　nm (참조 파장은 690　nm)에서 흡광도를 읽었다.
세포 이동 능력
세포 이동은 "상처 치유 에세이(wound healing assay)"로 결정했다. 간략하게, 3　 X 105 세포들/웰 을 6-웰 플레이트들에서 융합될때(confluence)까지 길렀다. 단층으로 있는 세포들은 아사조건 하(1% serum)에서 각기 다른 농도의 1400W, L-NMMA, 및 L-NAME 로 72 시간동안 처치되었다. 세포증식에의 영향을 피하기 위해, 낮은 농도의 혈청 배지는 억제제 존재하에서 정규 성장 배지로 바꾸어 24 시간동안 두었다 (총 96 시간). 그리고나서 "상처"는 100-μL 파이펫 팁으로 세포 단층에 만들어졌다. 이미지를 0 시간에 찍어두고, 세포들은 상처가 치유되도록 12 시간동안 두었다. 상처-치유 능력은 소프트웨어 이미지 J(Image J)로 결정하였다. 데이타는 3 번의 독립된 실험으로 반복 되었다.
렌티바이러스 - 중개 shRNA 넉다운
GIPZ NOS2 렌티바이러스 shRNA 클론들 (shRNA1-V3LHS_360691; shRNA2-V2LHS_111769) 및 GIPZ 렌티바이러스 빈 백터 shRNA 컨트롤들은 서머 사이언티픽사(Thermo Scientific) 으로부터 구입했다. MDA-MB-231 및 SUM159 세포들은 렌티바이러스의 입자들 및 폴리브랜 (6　μg/mL) (Sigma-Aldrich)으로 48시간 동안 처치되었다. shRNA-함유하는 세포 클론들은 일주일 동안 퓨로마이신 (puromycin (2　μg/mL) (Sigma-Aldrich)으로 처치하여 선택하였다. 세포들은 그 후 모으고 증식, 맘모스페어, 상처치유, 및 웨스턴 불럿 에세이를 위해 플레이트 되었다.
siRNA -중개- NOS2 녹다운
SUM159 및 MDA-MB-231 세포들을 섞인siRNA(scrambled siRNA), siRNA18 (s9618) 또는 siRNA20 (s9620) (Silencer Select, Ambion)로 96 시간 동안 감염시켰다. 간략하게, 6-웰 플레이트(100,000 세포들/웰)에 자란 세포들을 혈청-, 항생제/항곰팡이제-없는 DMEM 배지에서 리포펙타민 (Lipofectamine) RNAiMAX (Invitrogen) 에 싸인 NOS2 siRNA 또는 섞인 (scrambled siRNA) (100　nM) 로 6 시간동안 감염 시켰다. 완전한 DMEM 배지를 첨가시키고 세포를 96 시간동안 키웠다.
SUM159 세포에서 나이트릭 옥사이드의 생산
세포들을 L-NMMA 또는 1400W 로 페놀 레드- 및 혈청-없는 DMEM 배지에서 24시간 동안 처치하였다. 나이트레이트(nitrate)/나이트릿트 (nitrite) 풀루오로메트릭 에세이 킷트(fluorometric assay kit)(Cayman Chemical)로 제조사의 지시에 따라 나이트레이트(nitrate) + 나이트릿트 (nitrite) (총 나이트릭 옥사이드) 생산을 측정하기 위해 세포 배양액 상등액의 일정 부분을 0, 0.5, 2, 6 및 24　시간에 꺼냈다.
웨스턴 불럿 .
세포들은 6-웰 플레이트에서 2.5　X　105 세포들/웰 의 밀도로 iNOS 억제제와 함께 또는 없이 96 시간 동안 배양되었다. 세포들은 1X 용해 버퍼(Cell Signaling Technology, Inc.) 및 1X 프로테아제(protease)/포스파타제(phosphatase) 억제제 칵테일(Thermo Scientific)에 다시 현탁시겼다. 샘플들(30　μg 단백질)을 β-머르캅토에타놀(β-mercaptoethanol)(Sigma Aldrich)을 함유하는 4X LDS 샘플버퍼(Thermo Scientific) 에서 끓이고 4-20% 폴리아크릴아미이드 겔 (polyacrylamide gels )(Bio-Rad)에서 SDS-PAGE 전기영동을 하였다. 단백질들은 나이트로셀루로즈 멤브레인들에(Bio-Rad) 옮기고 비-특이적 결합을 피하기 위하여 1X 트리스-버퍼된 생리식염수(Tris-buffered saline)(TBS)에 있는 5% 비-지방 건조우유 (non-fat dry milk)에서 한 시간동안 배양시켰다. 멤브레인들은 4°C 에서 하룻밤 동안 일차 항체들(1:1,000 희석; 항-β-액틴, 1:2,000 희석)과 배양시켰다. 세척 후 및 적절한 2차 항체들 (1:2,000 희석)로 1 시간동안 배양시킨 후, 멤브레인들을 세척시키고 증강된 화학발광 (캠일루미네샌스, chemiluminescence)기질과 배양시켰다. 단백질 밴드들은 방사성자동사진법 (autoradiography) 필름 (Denville Scientific, Inc.)에 현상 시켰다.
쪼개진 XBP1의 RT- PCR 분석
총 RNA는 MDA-MB-231 및 SUM159 세포들에서 RNeasy 마이크로 킷트 (RNeasy micro kit) (Qiagen)로 추출하였으며, cDNA는 iScript cDNA 합성 킷트(iScript cDNA Synthesis kit) (Bio-Rad)로 제조사의 지시에 따라 합성되었다. PCR 증폭 (50　ng cDNA)은 2.5　U/μL의 Taq DNA 폴리머레이즈 (Taq DNA polymerase) (native, 5　U/μL), 2　mM dNTP, 1.5　mM MgCl2 (50　mM) 및 0.5 μM 의 각 프라이머로 수행 되었다. 프라이머들은 :
XBP1-앞5'-GGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC-3' (서열번호 1)
XBP1-뒤 5'-TTACGAGAGAAAACTCATGGC-3' (서열번호 2)
β-Actin-앞 5'-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3' (서열번호 3)
β-Actin-뒤 5'-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3' (서열번호 4)
PCR 조건들은 95℃ 에서 5　분 동안 1 사이클, 95℃에서 30　초, 50℃ 에서 1분 및 68℃에서 1분 으로 25 사이클, 이어서 1 사이클은 68℃에서 5　분 동안 하였다. 증폭된 cDNA 들은 2% 아가로즈(agarose)로 분리되었다.
면역조직화학
파라핀에 끼워있는 사람 환자의 부위, MDA-MB-231 및 SUM159 오르토토픽 종양 조직은 Tris-HCl 버퍼 (pH　=　9.0) 를 사용하여 항원 복구를 하도록 하였으며 하이드로젠 퍼옥사이드를 사용하여 5분간 차단시켰다. 사람환자 샘플들과 이식된종양들은 상온에서 1 시간동안 항-iNOS (1:50 희석), 항-Ki67 (1:100 희석) 및 항-쪼개진 카스페제-3 (anti-cleaved caspase-3 (1:50) 항체와 배양시켰다. 샘플들은 퍼옥시데이즈-근거한 EnVision kit(Dako)로 발색 시켰으며 위양성을 배재하기 위해 네가티브 컨트롤과 비교 하였다. 슬라이드들은 헤마톡실린으로 대비염색 시켰다. iNOS 스코아 방법: 강도(0-3):네가티브, 약함, 중간, 강함;분포(0-4):<10%, 10-30%, >30-50%, >50-80%, >80%. 총 스코아는 4 그룹들로 나눌 수 있다: 네가티브(0-1), 약함(2-3), 중간(4-5), 및 강함(6-7). MDA-MB-231 세포들은 NOS2-대한 shRNA (shRNA1) 또는 빈 벡터 (empty vector) (EV)로 감염시켰으며 iNOS 염색의 음성 또는 양성 컨트롤로 각 각 사용 되었다.
동물 연구들.
암컷 SCID Beige 마우스 (4-5주령) (Harlan Laboratories)를 표준연구실 컨디션에서 키웠다(22℃; 12 시간/12 시간 낮/밤 사이클 및 음식과 물은 자유롭게 접할수 있게함). MDA-MB-231 또는 SUM159 세포들 (3　X106) 을 오른쪽 유방 지방 패드에 주사했다. 일단 종양이 150-200　mm3 이 되면 마우스는 다음과 같이 다른 그룹으로 임의로 나누었다(n　=　10/그룹): 1) 매체(식염수, i.p.), 2) L-NMMA (80　mg/kg 또는 200　mg/kg, i.p., 매일), 3) 도세탁셀 (Docetaxel (20　mg/kg), 4) 컴보 (Combo) (L-NMMA 및 도세탁셀).
폐 전이-예방 연구를 위해, MDA-MB-231 L/G 세포들을 위에서 서술된 대로 이식 시켰다. 마우스들을 임의로 추출하여 세포가 주사 된지 48시간 후에 처치가 시작 되었다(n　=　5/그룹): 1) 매체(식염수, i.p.), 2) L-NAME (80　mg/kg, i.p., 매일 35 일 동안). 루시페린(luciferin) 사전주사로, 폐는 제거되고 차거운 DMEM + 10% FBS　+　1% 항생제/항곰팡이제 에 세척시켰다. 그 후, 폐는 50μM 루시페린이 포함된 차거운 DMEM 배지에 10분간 배양시켰다. 이 프로토콜은 폐추출과 루시페린에의 노출 사이에 시간적인 경과를 피한다. 형광 암세포들은 IVIS-200 생체 이미지 시스템 (IVIS-200in vivo imaging system) (Perkin Elmer, Inc.)으로 검출되었다.
임상적으로 관계있는 용량법은 0 번째 날에 L-NMMA (400　mg/kg, 1 번째날, 및 200　mg/kg 추가 4일간 구강튜브로)와 조합되기 12 시간 전에 두 사이클의 도세탁셀(20　mg/kg, i.p., 0 째날)및 암로디핀 (10　mg/kg, i.p., 매일, 6 일 동안)으로 구성 된다. 도세탁셀 단독은 물론 식염수(i.p.)+ 멸균수(구강튜브)가 컨트롤로 사용되었다.
자가-재생 및 종양-개시 능력은 종양 조직에서 분리된 단일 세포들에서 MSFE 및 제한적-희석 에세이들 (limiting-dilution assays)로 각각 결정되었다. 간단하게, 유방암 조직들을 잘게 자르고, DMEM:F12 배지에서 100　U/mL 의 콜라게네이즈 타입 3 (collagenase type 3)(Worthington) 및 0.8　U/mL 의 디스파제(dispase) (Gibco)로 37℃ 에서 45　분간 소화시켰다. MSFE는 분리된 단일 세포들에서 위에 언급된 대로 에세이 되었다. 제한적-희석 에세이( limiting dilution assay) (LDA)는 5　X 104 또는 2　X 104 의 종양으로 부터 분리된 세포들을 SCID Beige 마우스의 유방 지방 패드에 주사하여 수행하였다. CD44+/CD24-/low 세포집단의 풀루오 사이토메트릭 분석( Flow cytometric analysis)은 발표된 방법을 사용하여 에세이 되었다.
액체 크로마토그래피-탠덤 메스 스펙트로메트리 (LC-MS/MS) 에 의한 대사 프 로화일링(Metabolite profiling)
동물 연구(L-NMMA 매일 투여한)로부터 얻은 MDA-MB-231 및 SUM159 이식 조직은 물론 플라즈마 샘플들도 이미 전에 서술된 대로 준비 되었다(2). L-NMMA (200　mg/kg)을 암컷 SCID Beige 마우스(n　=　5)에 구강 튜브로 구강으로 투여하였다. L-NMMA 투여하기 전 (기본라인, 0　시간) 및 후(0.5, 2, 12, 24　시간)에 피를 뽑았다. 대사 프로화일을 위한 LC-MS/MS 플렛폼(LC-MS/MS platform)은 이전에 서술되었다. 메틸아르기닌 (methylarginine)(L-NMMA) 및 시투룰린(citrulline)의 비율적 정량은 (Ratiometric quantification) 플라즈마와 종양조직에서 이온의 풍부한 수준들로 측정되었다.
혈압 측정
혈압(BP)은 15 마리 암컷 SCID Beige 마우스에서 3 일 동안 측정되었고, 이어서 다음과 같이 임상적으로 관계 있는 용량법의(n　=　5/그룹) 한 사이클로 처치 하였다: 암로디핀 (amlodipine) (10　mg/kg, i.p.) 6 일동안 (0 번째 날에 시작)), L-NMMA (200　mg/kg, 구강튜브) 5 일 동안 (1일에 시작)) 및 조합 (L-NMMA + 암로디핀). 평균 매일 혈압은 컴프터화된 테일 커프 모니터 (tail cuff monitor) (BP-2000 Series II, Visitech)를 사용하여 사이클 처치의 최종 연속 3일의 20번 측정중 최종 10번의 평균을 평균하여 정하였다.
통계적 분석.
모든 데이타들은 GraphPadTM 프리즘 소프트웨어 (GraphPadTM Prism software) (GraphPad Sofware, Inc.)를 사용하여 분석되었다. 데이타는 평균± SEM으로 나타낸다. 두 그룹간의 통계적 유의성은 두가지-꼬리의 스튜던트의 t-테스트( two-tailed Student's t-test)로 분석 되었다. 세 그룹들 이상으로의 실험은 한-방향 아노바 (one-way ANOVA)(변이 분석) 로 분석되고 이어서 본페로니의 포스트-혹 테스트로 (Bonferroni's post-hoc test)분석되었다. 종양 부피의 통계적 분석 양-방향 아노바 (two-way ANOVA) 및 본페로니의 포스트-혹 테스트로 (Bonferroni's post-hoc test)평가 되었다. 휫셔의 정확 테스트는 (Fisher's exact test)는 제한-희석 에세이에서 중요한 차이를 결정하기 위하여 사용되었다. 생존비율은 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법을 상용하여 평가되었다. 증식, MSFE, 이동지수, 및 Ki67 염색은 매체그룹(Vehicle group) (100%)에 대비하여 정상화시켰다. p-값 0.05 이하는 의미있다고 간주된다.
결과들
증강된 iNOS 발현은 침투적 TNBC에서 환자의 나쁜 생존율과 관련된다
iNOS 는 다른 암 타입들에서 전이의 매개체라고 서술되고 있다. 증가된 iNOS 의 발현은 ERα-네가티브 유방암환자들에서 나쁜 생존율과 연결되어 왔다. 발명자는 TNBC 에서의 증가된 iNOS 발현은 환자의 나쁜 생존율과 전이와 관련있다고 가정한다.
유방암에서 NOS2 (iNOS mRNA 발현) 발현의 언코마인 암 마이크로어레이 데이타베이스 분석이 수행되었다. 암유전자 지도 (The Cancer Genome Atlas (TCGA))데이타베이스 분석은 침투적인 TNBC 환자 샘플들에서(n　=　46) 비-TNBC (n　=　250)대비 NOS2 mRNA 발현이 훨씬 높았다는 것을 보여 주었다(fold change 1.425, p　=　3.85X10-5, Student's t-test) (도　1A). 환자-생존 분석은 증가된 NOS2 발현과 침투적인 덕탈 유방 카르시노마 (ductal breast carcinoma) 환자들의 5년에 생존율이 아주 나쁜갓과 관련 있다고 보여준다(n　=　79) (fold change 1.275, p= 0.037, Student's t-test). 이중에서 49명의 샘플들은 TNBC 이었다 ((n　=　37 은 NOS2 발현이 높고; n　=　9은 iNOS 발현이 ㄴ낮다) (도　1B). 본 발명자와 동료들은 더 나아가 NOS2 발현이 TNBC 환자들의 두개의 추가의 데이타베이스들에서 아주나쁜 생존율과 관계있는지 조사하였다. 반 데 비즈버 (Van de Vijver (n　=　69 샘플) 및 커티즈 (Curtis (n　=　260 샘플들)데이타베이스들의 분석으로 높은 NOS2 발현과 TNBC 환자들의 생존율과는 연관된다는 것이 확인 되었ㄷ다 (도　1C 및 도 1D).
다음으로는, 본 발명자와 동료들은 면역조직화학적으로 83개의 외과적으로 절제된 TNBC-일차유방암 샘플들에서 iNOS 단백질 발현을 조사하였으며, 발현과 알려진 환자의 결과와 관련 시켰다. iNOS 는 주로 사이토플라즘에 있으나, 어떤 세포들에서는 사이토플라즘과 핵에도 위치해 있음을 보였다(도　1E). 전체적인 스코어는 iNOS 수준들은 14 샘플(16.9%)에서는 약함에서 중간(스코어 3-4) (도　1E,도 3 및 도 4), 50 샘플들(60.2%)에서는 중간에서 강함(스코어 5-6)(도　1E),및 19 샘플(22.9%) 에서 강함(스코어 7)(도　1E)을 보였다. 이 계층화 분류는 카플란-마이어분석을 사용하여 iNOS 발현과 환자의 생존과의 관계를 연관시키는 분석에 사용되었다. mRNA 마이닝 분석과 일관 되게 (도 1C 및 도 1D), 본 발명자는 증강된 iNOS 단백질 수준들은 낮은 iNOS 발현과 비교 해 보았을때 더 나쁜 환자 생존과 관계가 있음을 확인했다 (p　=　0.05, Chi-square test) (도　1F). 이 결과들은 침투적 TNBC에서 iNOS mRNA 및 단백질 발현증가는 환자의 생존율이 나쁜것과 관련됨을 보여준다.
iNOS 억제는 TNBC 세포의 종양형성성질을 감소시킨다.
본 발명자와 동료들은 SUM159 및 MDA-MB-231 세포주들을 선택적인 iNOS 억제제, 1400W, 및 pan-NOS 억제제들, L-NMMA 및 L-NAME 로 96 시간동안 처치한 후 증식에서 iNOS 억제효과를 평가 하였다(도　2A). 높은 농도의 1400W (1, 2 및 4　mM)는 두 세포주 다 상당히 증식을 감소시킬 수 있었다(도 2A). L-NAME 으로 처치한후에도 비슷한 결과들이 관찰되었다(도　9A). L-NMMA는 제일 높은 농도(4　mM)에서 두 세포주에서 항-증식 활성을 보였다(도 2B).
치료에 저항성이고 전이는 불균질한 일차 암내에 있는 종양 성장을 다시 시작하게 하고, 전이의 씨가 되게 하는 암 줄기세포(cancer stem cells )(CSC)의 아집단으로부터 일어날 수도 있다. 여기서는, 본 발명자와 동료들은 맘모스페어 형성 효율 (mammosphere forming efficiency) (MSFE) 에세이를 사용하여 iNOS 억제의 암 줄기세포에의 자가-재생 효과를 조사하였다. iNOS 억제는 두 세포에서 모두 일차 맘모스페어(MS)의 MSFE를 감소시켰다 (도　2C). L-NAME 에 대해서도 비슷한 효과들이 얻어졌다(도　9B). 본 발명자는 두 세포주에서 테스트한 모든 억제제들에서 감소된 2차 MSFE를 동정했다 (도　2D; 도 9C). 침투적인 TNBC에서 증강된 iNOS 발현을 발견했으므로(도　1A), 본 발명자는 상처 치유 에세이를 사용하여 세포 이동에서의 iNOS의 역할을 조사하였다. 1400W로 선택적인 iNOS 억제를 하면 두 세포주에서 밀리몰 (도 2E) 및 마이크로몰 (도　9D) 범위에서 용량-의존적으로 현저하게 이동 감소의 원인이 된다. L-NMMA-처치한 세포들은 이동 능력의 감소를 보인다 (도　2F). 마이크로몰 범위의 더 낮은 농도들에서는 일정하지 않으며 덜 효과적이다(도　9E). L-NAME에 대해서도 비슷한 결과들이 발견되었다 (도 10A). 이 결과들은 더 나아가 shRNA-매개하는 iNOS (NOS2) 녹다운 MDA-MB-231 (도 3A, 도 3B 및 도 3C) 및 SUM159 세포들에서 (도　11A, 도 11B 및 도 11C)확인 되었다. 일괄하여, 이 결과들은 iNOS의 기저 레벨은 TNBC 세포주에서 CSC 증식에는 덜 뚜렷한 효과를 내면서 CSC 자가-재생 및 이동 성질에서는 주 역할을 하는 것을 제시한다.
내부유래 iNOS의 억압은 HIF1α와 소포체 (endoplasmic reticulum)(ER) 스트레스/TGFß/AFT4/ATF3 크로스톡을 손상시켜 EMT 및 세포이동을 손상시킨다. 종양 침투 및 전이 동안에 극성을 띤 표피세포들의 간엽성 세포(메젠키말 세포, mesenchymal cells) (EMT)로의 분화전환이 유발된다. 본 발명자는 그래서 간염성 세포-와 같은 TNBC MDA-MB-231 및 SUM159 세포들에서 EMT-유도성 전사인자들에 대한 iNOS 억제의 효과를 웨스턴 불럿으로 고려했다. 본 발명자는 먼저 선택적- 또는 총-억제(도　3D; 도 10B, 도 10C 및 도 10F)후 NOS 아이소폼들(iNOS, eNOS, and nNOS)에 대한효과를 조사하였다. 1400W로 선택적으로 iNOS를 차단하면 두 세포들 모두에서 밀리몰(도 　3D) 및 마이크로몰 농도들에서(도　10D) EMT 전사인자들인 Snail, Slug, 및 Twist1의 단백질 레벨이 줄어드는 원인이 된다는것이 발견되었다. Zeb1 단백질 수준들은 밀리몰 농도에서 감소 되었다(도　3D). 덜 일정하지만, 비슷한 결과들이 범-NOS 억제제들에서도 발견되었다(도　10E 및 도 10F). shRNA로의 iNOS 녹다운은 Zeb1 및 Twist1 단백질 수준들의 감소와 관련되었다 (도3E). Snail 및 Slug 들은 SUM159 에서만 차단되었다(도　11D); 본 발명자는 두주 동안의 클론 선별후 MDA-MB-231 에서 비슷한 결과를 발견했다. SUM159 세포에서 일시적 iNOS 녹다운으로 Zeb1 및 Twist1가 감소되는 것이 확인되었다 (도　11E). 전반적으로, 이 데이타들은 선택적인 iNOS 억제는 TNBC 세포주들의 이동을 효율적으로 감소시키며, 이는 EMT 전사인자들의 감소와 시종일관 하게 관련이 있음을 제시한다.
서로 다른 경로들이 EMT 유도 및 종양세포 전이에 관련된다; 이중에서 나이트릭 옥사이드가 HIF1α 및 소포제 (ER) 스트레스의 공통분모이다. 이 발견은 선택적 iNOS 억제가 용량-의존적으로 두 세포주에서 (도 3F)에서 모두 하이폭시아 hypoxia (HIF1α)감소(도　3F; 도 10G), ER스트레스 마커들 IRE1α/splicedXBP1 (도　3F; 도 11F) 및 ATF4 감소의 결과를 가져온다는 것을 제시한다 (splicedXBP1는 SUM159 세포에서는 검출되지 않음, 데이타 보이지 않음). 기능적 단백질-단백질 상호작용(STRING 9.1) 분석은 iNOS와 TGFβ1의 연결고리를 밝혀냈다(도　11G). 연구들에서는 1400W가 아직 결정되지 않은 기전으로 재조합 TGFβ1가 없고 (도 3G) 있는(10　ng/mL으로 72　시간 동안)(도　11H) 상태에서 TGFβ 신호체계를(TGFβsignaling) (phospho-Smad2/3, Smad2/3 및 성숙 TGFβ)억제 시킬 수 있다는 것을 확인했다. 추가로 단백질-단백질 상호작용 분석은 둘 다 TGFβ와 상호작용하는 전사인자들인 ATF4 와 ATF3 (도　11G)가 상호작용함을 보여주었다. 실험들에서 ER 스트레스와 TGFß사이에서 ATF4/ATF3를 통해 크로스톡 한다는 것을 확인했다; 비슷하게, 재조합 TGFß1 (10　ng/mL 24　시간동안)는 PERK/eIF2α/ATF4/ATF3 axis 를 유도한다(도.　3H). iNOS 억제제 1400W (4　mM) 및 재조합 TGFß1를 24 시간 동안 동시에 처치하면 PERK/eIF2α경로와는 독립적으로 TGFß1에 의한 ATF4 및 ATF3 단백질 수준의 자극을 억제할 수 있다는 결과를 보여준다. 이 결과는 siRNA-매개하는 iNOS (NOS2) 녹다운 세포에서 더 확인 되었다(도　3I). 전반적으로, 이 데이타들은 iNOS 억제는 ER 스트레스 (IRE1α/XBP1) 와 ATF4, ATF3,와 TGFβ사이의 크로스톡을 손상시킴으로서 EMT 및 종양세포 이동을 손상시킬수 있다는 것을 보여준다.
iNOS 억제는 종양 성장, 종양 개시능력을 감소시키고, 삼중-네가티브 유방암의 마우스모델에서 전이를 막는다. 실험관 내 데이타에 근거하여, 본 발명자는 다음으로 iNOS 억제가 종양 개시를 예방할 수 있고, 폐전이 된 마우스 모델에서 유방종양 세포의 전이를 예방 할수 있을 것인지 아닌지를 조사 하였다. MDA-MB-231 이식된 마우스에게 35일 동안 매일 80　mg/kg L-NAME 의 복강주사를 주었다. L-NAME은 종양 성장을 유의있게 감소시켰으며(p　=　0.001) (도　4A) 일차 MS의 MSFE도 감소시켰다(도　4B). 2차 MSFE 역시 감소 되었지만 매체그룹(vehicle group)들과 비교하였을 때 유이성이 있지 않았다(도　4B). 추가로, 종양 조직으로부터 분리한 단일세포들 (5　　X 105 또는 1　X　105 세포)을 오른쪽 유선지방패드에 주사하여 제한적희석에세이(limiting dilution assay) (LDA)로 CSC의 종양-개시 능력을 평가하였다. 매체그룹 (vehicle group) (n　=　5) 의 모든 동물들은 종양을 발현시킨 반면에 L-NAME 처치한 5　X　105 세포를 가진 동물 5 중 3 마리가 1.5 주에 종양을 나타냈다. 1　X　105 세포를 주사한 매체그룹에서는 L-NAME-처치한 그룹 (0/5 종양)에 비해 2.5주에 같은 결과가 관찰되었다(p　<　0.05, Fisher's exact test) (도　4D).
본 발명자는 그 후 iNOS 억제가 TNBC 이식모델에서 폐로의 전이를 억제할 수 있는지 조사하였다. 루시페라제/GFP-근거한 MDA-MB-231 (MDA-MB-231L/G) 이식 마우스 모델은 환자에서 폐로의 전이과정을 모방한다. 이 폐전이 모델에서, 이식 후 35일 후에 세포는 일차 종양으로부터 전이되었다. MDA-MB-231 L/G 세포는 SCID 마우스 오른쪽 유방지방패드에 주사되었고 80mg/kg 의 L-NAME을 매일 35일 동안 주었다. 루시페라제 존재하에 폐의 엑스 비보 이미지 (Ex vivo imaging)는 L-NAME 그룹에서보다 매체 그룹에서 높은 형광을 보여주었다(도 4C). 이 결과들은 매일 L-NAME 로 iNOS 억제하는 것은 TNBC 마우스모델에서 폐로의 전이도 예방할 수 있음을 제시한다.
이 결과들을 미래의 임상시험으로 해석하기 위해, 범-NOS 억제제, L-NMMA을 선택하여 추가로 심도있는 연구를 하였다. 비록 L-NMMA 가 이전에 심장적 쇼크에서 조사 되었고, 몇 천명의 그런 적응증 환자에게 투여했었지만, 현 발명은 이 화합물을 항암제 적응증의 다른 목적으로 (re-purposing)사용하는 첫 번째 보고를 제공하며, 이들 결과들을 선행하는 데이타가 거의 없어 항-암치료제로서의 효과적일수있는 전임상용량을 제시하기 어렵다.
이 의문에 답하기 위해, 매일 80　mg/kg L-NMMA 를 처음에 SUM159 이식-함유하는 마우스 단독으로 또는 도세탁셀과(20　mg/kg)같이주었다. 10일 후에, 그룹간에다른 효과 차이가 관찰되지 않아 매일의 용량을 200　mg/kg으로 증가 시켰다. L-NMMA 단독 투여로 혹은 도데탁셀과 조합한 투여로 종양성장은 효율적으로차단 되었다(도　13A). 본 발명자는 면역조직화학법으로 (Ki67) 이 결과들을 종양 세포성장과 관련시켰다. L-NMMA 와 조합그룹에 비해 매체(vehicle)와 화학요법치료 그룹에서 높은 증식율이 관찰되었다 (도　13B 및 도 13C). 본 발명자는 이어서 MSFE 에세이로 CSC 자가-재생에 대한 효과를 분석했다. 도세탁셀은 유방종양 조직에서 분리한 단일 종양세포들의 일차 및 이차 MSFE 가 극적으로 증가함을 보였다. 이 증가는 L-NMMA (조합 그룹)의 첨가로 효율적으로 차단 되었다 (도　13D). LDA 는 5　X　104 세포로 7주에서, 매체, L-NMMA, 도세탁셀 및 조합 그룹이 각 각 12/12, 4/12, 12/12, 6/12 의 종양들을 보여주었다. 9번째 주에서 2　X104 세폴를 가진 다른 그룹에서 상당히 감소된 종양-개시 능력이 관찰되었다; 매체(vehicle), L-NMMA, 도세탁셀 및 조합에서 각각 7/12, 0/12, 3/12, 0/12 종양들 이 관찰되었다 (p　<　0.05, Fisher's exact test) (도 14E).
L-NMMA의 역할이 그후 다른 TNBC 마우스 모델에서 L-NMMA 단독으로 또는 도세탁셀과 조합되어 조사되었다. 도세탁셀 (20　mg/kg 0 번째날 및 21째날) 및 200　mg/kg L-NMMA(매일)을 MDA-MB-231 이식-함유 마우스에 31일 동안 주었다. 첫째로, 매체에 비해 L-NMMA 그룹에서 종양성장의 감소가 발견되었으며, 그러나 도세탁셀 과 조합그룹 간에는 변화가 없었다(도 5A). 이 결과들은 면역조직화학에서 보여준 대로(도　5B 및 도 5C) L-NMMA과 조합그룹들에서 낮은 증식율과 관련이 있었다. 추가적으로, 도세탁셀-처치한 이식에서 높은 사멸수준(도 5D이 발견되었다; 이 결과들은 조합그룹에 대비하여 높은 증식율을 상쇄하기도 한다 (도 5D).일차 MS는 매체 및 화학요법 단독 그룹들에 비해 L-NMMA 과 조합에서 모두 적다. L-NMMA 처치는 이차 MS를 감소시킬수 있다, 그러나 조합그룹에서는 변화가 관찰되지 않았다 (도5E). 풀루오 사이토메트리 분석에서는 CD44+/CD24-/low 집단 에서의 변화는 없는 것으로 보여졌다. LDA는 매체-처치한 및 도세탁실-처치한 그룹들은 12/12 및 8/12 종양들을 각각 나타내며, 5주에서 5　X104 세포로 이식하고 L-NMMA-처치한 (1/12) 및 조합-처치한(4/12)이식에서는 상당한 감소를 보였다. 6 주후에는, 매체와 도세탁실그룹에 비해(6/12 및 8/12, 각 각) L-NMMA 및 조합 그룹에서 (3/12 및 5/12, respectively) 감소를 보였다 (p　<　0.05, Fisher's exact test) (도　5F). 조사에서 L-NMMA 플라즈마 레벨은 빨리 없어진다는 것을(도　14C)보여 주었으며, 반면에 종양조직에서는 축적되고(도　14D), L-아르기닌 이 L-시투룰린으로 전환되는것을 억제하고 처치완료 후 24시간에 iNOS (도　14E) 에 의해 NO로 전환된다. 이 억제는 SUM159 세포에서 보듯이 총 NO생산의 감소를 유도한다(도　14F).전반적으로, 이 결과들은, L-NMMA로 생체내에서 iNOS 를 억제하는 것은 종양성장, 세포 증식, 및 CSC의 종양-개시 능력을 감소시키고 폐전이를 상당히 줄이는 것을 보여주고 있다.
임상 적용잠재력을 가진 L- NMMA 과 도세탁셀의 효율적인 용량법
임상적으로, L-NMMA은 구조성의 eNOS를 억제시켜 급성 혈압상승을 일으킨다. 여기서, 항-고혈압 (이 예에서는, 암로디핀)제와 함께 약해진 지속성을 가진 iNOS 억제제(이 경우 L-NMMA)의 TNBC (MDA-MB-231 및 SUM159 이식)의 두개의 다른마우스모델에서 2 사이클을 위한 용법이 서술된다. 표준 도세탈셀 20　mg/kg 를 매 2주에 한번 투여한다. L-NMMA를 화학요법 후 24 시간에 주고, 전에 임상적으로 보고된 것에 해당되는 용량 200　mg/kg 씩 5 일 동안 준다. 혈압증가는 칼슘채널 차단제 암로디핀 (10　mg/kg, 매일 6일동안, i.p.).를 사용하여 반대로 작용하게 한다. 구강 L-NMMA는 마우스에서 기저수준 (120　mmHg)에 비해 평균 수축기혈압 (147　mmHg)을 상당히 증가시키며, 이 증가는 암로디핀 (10　mg/kg)으로 효율적으로 상쇄시킬수 있다 (도　6A). 이 BP 증가는 일시적이며 최종 L-NMMA 주사후 24시간에 사라진다(도　6B).
L-NMMA과 도세탁셀의 조합은 MDA-MB-231 오토트로픽 모델에서 종양의 성장을 감소시킬수 있다(도 6C). 이 용량용법은 또한 도세탁셀-처치한 그룹과 비교해서 생존율을 개선 시킨다(p　=　0.0001, Wilcoxon test) (도.　6D). 비슷한 결과들이 SUM159 이식에서도 발견되었다(도 6E). 전반적으로, 데이타는 여기서 제안하는 용량용법은 종양 성장을 감소시키는데 효과적이고, 더 큰 생존율의 결과를 갖온다는 것을 보여준다. 적어도 프로토콜 일부에서 iNOS억제제 투여를 항-고혈압제와 함께 투여와 조합함으로서, 일시적으로 BP를 올리는 iNOS 억제제의 불리한 부작용 효과를 최소화 및/또는 극복할수 있다.
더 나아가 iNOS 억제제 치료와 하나 또는 그 이상의 도세탁실과 같은 기존의 화학요법치료제와의 조합은 추가의 상승치료효과의 이점을 제공하며, 불치성이고, 전이성 및 TNBC 환자에서 치료 저항성을 극복하는데 새로운 전략을 대표한다.
여기서 논의 된대로, TNBC는 극도로 공격성이고, 치명적인 형태의 암으로 효과적인 표적치료제가 부족하다. TNBC 환자는 전이 및 종양재발 위험도가 더 높음을보여준다. iNOS 수준은 기저-와 유사한 에스트로겐 수용체-네가티브 유방암에서 환자의 더 나쁜 생존율을 예측하게 하며, 암줄기세포 (CSC)를 조절함으로서 종양의 공격성을 증가시키고 세포의 전이성 경향을 증가시킨다고 제안되었다. 현 발명은 iNOS 경로의 억제가 세포증식에 영향을 주고, CSC 자가-재생, 및 /또는 세포 이동에 영향을 줌으로서 TNBC세포들의 종양 형성성질을 감소 시킬수 있다고 보여준 최초의 보고이다. 이 출원에서 보여주는 생체내 연구는 몇몇의 예시적인 L-NMMA와 같은 작은 분자의 iNOS 억제제들의 효력을 TNBC와 같은 난치성 암들을 가지고 있는 암환자들을 위한 새로운 표적치료제로서 보여주며, 이 결과들을 즉시 사람 임상 시험으로 전환시킬 필요가 있음을 제공한다.
이들 예시들은 NOS2가 침투성 TNBC에서보통 증가되고 침투성 유방 카르시노마를 가진 환자의 생존율이 나쁜것과 관련있다고 보여주고 있다. 추가 데이타에서 면역조직화학적으로 83 사람 TNBC 샘플에서 높은 iNOS 단백질수준들을 보여준 것은 역시 환자의 더나쁜 결과와 관계있는 것으로 보여졌으며, 이는 ERα-네가티브 및 침투성 유방 카르시노마에서 일찌기 보고된 것과 일치한다. Van de Vijver 및 Curtis 데이타 베이스의 카플란-마이어 분석은 물론 사람 TNBC 환자 샘플의 분석은 높은 iNOS 발현은 TNBC 환자의 나쁜 전반적인 생존율과 관계됨을 강하게 제시한다. 이 관찰들은 또한 증가된 iNOS 발현은 암환자의 어느 특정한 부류에서 나쁜 예후를 알려줄 수도 있다는 것을 마련하였다.
iNOS 발현은 유방암의 종양 등급과 공격성의 증가와 관련이 있어 왔다. 현 발명은 iNOS 의 CSC 자가-재생, 종양-개시 및 TNBC세포의 이동에 대한 효과를 서술하고있다. iNOS 억제제의 항-종양 활성은 표피 카르시노마, 구강, 교아종, 및 유방암에서 일전에 보고 되었으며,실험관내 및 생체내에서의 발견들이 일치한다. 증가된 iNOS 발현은 교아종 세포에서 종양 개시를 촉진시켜 기존의 치료에 저항을 나타내는것에 기여한다고 서술되어왔다. 추가로, iNOS 는 ERα-네가티브인 유방암에서 CD44 및 c-Myc을 조절하여 CSC 자가-재생에 영향을 준다. 본 발명자는 최초로 iNOS 억제가 실험관 내와 TNBC 생체 모델에서 둘다 CSC 자가-재생 및 종양 개시를 감소시킨다는것을 보여주었다.
니트릭 옥사이드는 내부의 수준에 따라 전이 과정을 증진 또는 억제할 수 있다. NOS 억제제들의 전이에서의 역할은 일전에 연구가 되었으나 그 근거에 대한 기전은 아직 불투명하다. 이전의 연구에서 범-NOS 억제제 L-NAME은 쥐의 유방암 모델 (EMT-6 세포) 에서 종양성장 및 폐전이를 감소 시킬수 있다는 것을 보여주었다. 비슷하게, L-NAME은 두 개의 전이성이 있는 유방 세포주들(C3L5 및 C10)의 침투성 및 이동 잠재력을 억제하였다. 전이성 사람 아데노카르시노마 HRT-18 세포로 한 다른 연구에서, 매일 500　μM 의 선택적 iNOS 억제제 1400W로 처치하면 침투성은 상당히 줄어든다. 좀더 최근에는, 구강 구멍 의 아데노이드 시스틱 칼시노마 마우스 모델에서 1400W 은 자동 폐 전이를 현저히 억제하는것으로 보여졌다.
현 예시는 생체내 TNBC 모델에서 iNOS 억제는 세포이동과 폐전이을 감소시킨다는것을 보여준다. NO 및 iNOS는 IL-8 및 CXC 케모카인 수용체 4 (chemokine receptor 4)를 유도하여 초기 전이를 .초래할수 있다는 것이 제안 되었다. CSCs 는 간엽성 특징을 보여 증가된 세포 이동 및 전이의 결과를 가져오게 한다. iNOS억제는 CSC 자가-재생 및 종약-개시를 감소시켰으며, 그러므로 이 경로에 대항하는 억제제들은 종양 세포들이 좀더 간엽성-유사한 표현형으로 변화되는 것을 되돌릴 수 있다는 것을 제시한다. 세포 이동에 대한 효과와 동일하게, 선택적 iNOS 억제 및NOS2 녹다운은 테스트한 모든 TNBC 세포주에서 EMT를 이끄는 전사안자들을 감소하게한다.
EMT 전사인자들의 감소에 대한 내부 iNOS 억제효과의 기전을 더 이해하기위해, iNOS-선택적 억제제, 1400W, 를 분석했다. EMT는 TGFß, Wnt/β-catenin, Notch, Hedgehog, 및 여러가지 성장인자들과 같은 다른 신호체계경로 로 촉진되기도 한다. EMT 전사인자들(Snail, Slug, Twist1, 또는 Zeb1)은 c-Myc, Ets, HIF1α, 또는 NFκB 와 같은 여러가지 중간 이펙터 (effectors)를에 의해 활성화 된다. 추가로, ER 스트레스가 갑상선, 폐포상피(alveolar epithelial), 및 사람 신장 기부작은관 세포 (human renal proximal tubule cell)에서 PERK, XBP1 또는 Grp78의 활성화를 통해 EMT와 연결되어 있다. 흥미있게도, 이들 종류가 다른 신호 넷트워크들 중에, iNOS 는 HIF1α 및 ER stress 사이에서 공통 분모이다. 내부 iNOS-유도된 NO 생산의 억제는 HIF1α 안정화와 대장 카르시노마에서 단백질 수준을 줄일수 있다. 다른것들 중에 전사인자 Twist1, Snail, Slug, Zeb1는 HIF1α 에 의해 직접, 간접적으로 영향을 받는다.
추가로, 하이폭시아는 ER 스트레스 및 단백질전개반응(unfolded protein response)을 유도하고, 최근에는 유방암 세포에서 하이폭시아 컨디션에서 PERK/ATF4/LAMP3-arm의 활성화를 통해 이동과 스페어형성 (구형성,sphere formation)과 연결 되었다. 이 결과들은 iNOS 억제는 ER stress ATF4/ATF3-axis 를 거쳐 TGFβ신호체계의 손상과 연결되어 있다고 제안 된다. TGFß 는 ATF4 단백질 수준을 자극하여 머리덮개뼈 골아세포 (calvarial osteoblasts) 분화를 억제한다고 알려졌다. PERK/eIF2α axis를 통한 ER 스트레스와 같은 어떤 컨테션들은 ATF4 를 활성화하고 이는 바로 ATF3 전사를 유도한다, 여기서 ATF3 자체는 Twist-1 와 함께 TGFß, 맘모스페어형성(mammosphere formation)및 EMT 를 증깅시키는 활성 전사 인자이다.
이 결과들을 실제 임상에 활용하는 전환은 이 새로운 발견의 다음 단계이다. L-NMMA 은 순환계쇼크의 몇몇 임상 시험에서 심도있게 연구된 범-NOS 억제제이다. 심장쇼크 시험에서, L-NMMA 는 안전하며 일시적 되돌릴 수 있는 고혈압 (transient reversible hypertension) 이외에는 부작용이 거의 없는 것으로 증명되었다. 정상혈압 환자에서, L-NMMA는 전이성 신장세포카르시노마 (metastatic renal cell carcinoma) 환자들에서 인터루킨-2 주입 이전에 투여되었다. 3 및 6　mg/kg용량은 이상적으로 뚜렷한 부작용을 유도하지 않으며, BP은 변하지 않게 유지된다. 12　mg/kg 용량 수준에서는, 환자들은 어떤 증상 없이 수축기 BP가 25　mmHg까지 증가되 는것을 경험하나, 이는 L-NMMA 주입을 멈추면 빠르게 정상화된다. 임상적 적용성에서 안전하고 효과적인 용법을 결정하는 것이 이 전임상 연구의 주된 도전이다. 현 연구에서는 기존의 페혈증 쇼크 환자 임상시험에 근거하여, 수정하여, 용량 비율을 선택했다. 이 결과들은 화학요법치료후, 암로디핀과 함께 L-NMMA을 5 일 동안 약한 용법으로 투여하여 종양 성장을 억제하게 할수 있음을 보여준다. L-NMMA의 임의 추출, 위약-컨트롤, 이중-맹검법 연구는 일전에 패혈증 환자들에서 최대 14 일까지에서 보고 되었다. 다음의 용법은 2.5　mg/kg/hr의 시작 용량 및 그 후 다른 바율(0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 및 20　mg/kg/hr)로 조절 되는 것으로 구성된다. L-NMMA 를 항암치료제로 사용하는데 있어서의 현재의 용량용법은 문헌에 보고된 패혈증 쇼크에서 부다 훨씬 낮다.
결론적으로, 이 예는 증강된 내부 iNOS 발현과 TNBC를 지닌 환자의 나쁜 생존율과의 상관괸계에 대한 증거를 제공한다. iNOS 억제제들로의 표적치료는 종양세포 증식뿐만 아니라 CSC의 자가-재생 및 이동, 종양성장 감소, 종양 개시, 및 폐로의 전이수도 억제함을 보여 주었다. 전이 이밴트의 억제는 HIF1α, ER stress (IRE1α/splicedXBP1) 및 TGFß/ATF4/ATF3 axis 의 억제에 의해 EMT 전사인자들의 감소 때문 일 것이다. 이 결과들로부터, 여기서 서술되는 화합물들을 사용하여, 종양성장을 감소시키고 생체내 생존율을 증강시키게 하는 표적치료 용법이 정의되고, TNBC 환자들에서 이 경로를 타겟으로 하는 임상시험의 중요성이 확립 되었다.
칼슘채널 길항제들의 효과
재료 및 방법들
인비트로 세포 증식 검정.
간염성-유사, TNBC세포주들, MDA-MB-231 및 SUM159,들은 10% 태아소혈청 및 1% 항생제-항곰팡이제로 보충된 DMEM 에서 키웠다. 여러가지 칼슘채널 길항제들(Amlodipine, Nicardipine, Nifedipine, Felodipine, Isradipine, Diltiazem, Verapamil, Lacidipine, Nisoldipine, Nitrendipine, Nivaldipine, Azelnidipine, Barnidipine, Benidipine, Efonidipine, Lercanidipine, Pranidipine, Manidipine)의 저장용액들은 DMSO에 만들었다. 세포증식에의 효과는 WST-1 방법으로 에세이 했다. 간략하게, 1,000 (SUM159) 및 2,000 (MDA-MB-231) 세포/웰 을 96-웰 플레이트에 넣고 다른 농도의 (0, 1, 5, 및 10　μM) 칼슘채널 길항제들로 72 시간동안 처치했다. 증식속도는 premixed WST-1 시약을 넣어 결정했다. 37℃ 에서 3 시간 배양시킨 후에 450　nm (참고 파장 690　nm)에서 흡광도를 읽었다. 결과들은 매체 (vehicle )(100%) 대비 정상화 (normalized)하였다. 길항제들은 증식이 ≥30% 로 감소되었을 때 활성이 있다고 간주 되었다.
Animal Studies.
암컷 SCID Beige 마우스 (4-5주령) 를 표준연구실 컨디션에서 키웠다(22℃; 12 시간/12 시간 낮/밤 사이클 및 음식과 물은 자유롭게 접할수 있게함. MDA-MB-231 또는 SUM159 세포를 (3　X 106) 오른쪽 유방 지방 패드에 주사하였다. 일단 종양이 150　-　200　mm3,에 다다르면, 마우스는 다음과 같이 임의로 다른그룹으로 한다 (n　=　5/그룹): 1) 매체(vehicle) (식염수, i.p.), 2) 암로디핀(Amlodipine (10　mg/kg, i.p.), 0 일과 14 일에 두 사이클 (각 사이클에서는 매일 6 일 동안). 모든 동물 처리 과정들 및 실험 프로토콜들은 기관 및 연방 동물사용 및 보호 가이드라인들을 엄수하여 허가 되었다.
결과들
실험관 내에서의 세포 증식
몇몇 칼슘채널 길항제들의 항-증식 효력은 두 개의 서로 다른 TNBC 세포주들 (MDA-MB-231 및 SUM159)에서 보여졌다. 결과들은 MDA-MB-231 (도　15A, 도 15B, 도 15C, 도 15D, 도 15E, 및 도 15F) 및 SUM159 (도　16A, 도 16B, 도 16C, 도 16D, 도 16E, 및 도 16F)두 균주에서 암로디핀 (amlodipine), 펠로디핀(felodipine), 락시디핀(lacidipine), 니카르디핀(Nicardipine), 니발디핀 (nivaldipine), 및 아젤니디핀(azelnidipine)으로 처치한 후 용량에 의존적으로 증식의 감소가 보여졌다.
동물 연구들 .
생체내 TNBC 모델들에서 얻은 데이타들은 암로디핀(10　mg/kg) 투여는 MDA-MB-231 및 SUM159 오르토토픽 종양들의 성장을 억제 할수 있는 것으로 나타났다. (도　17A 및 도 17B, 각각). 실험관 내의 결과들로부터 동정된 가장 효과적인 길항제들은[암로디핀 (amlodipine), 펠로디핀(felodipine), 락시디핀(lacidipine), 니발디핀 (nivaldipine), 및 아젤니디핀(azelnidipine)] TNBC의 적절한 모델동물( 예를들어, MDA-MB-231 및 SUM159를 포함하여) 에서 생체내 항-종양 활성을 테스트 할수 있다. ~20　mg/kg i. p 의 용량이 효과적인 범위내 라고 생각된다.
참고문헌(References):
다음의 참고 문헌들은, 이들이 예시적인 과정들 또는 여기서 설명된것을 보충하는 다른 상세한 설명들을 제공하는 정도 따라 특별히 여기서 참고문헌으로 그 전부를 합병시켰다:
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여기서 서술된 예시들과 예들은 보여주기 한 목적일 뿐이고, 이들을 고려하여 여러가지 수정이나 변경들을 이 분야에 익숙한 사람들에게 제안하고 이 청구서의 정신이나 범위 내, 및 부속하는 청구의 범위 내에서 포함될 수 있다. 여기서 인용된 모든 참고문헌들은 (논문들, 특허청구서 및 특허들)각 참고문헌들이 개별적으로 및 특별히 지적된 것과 같은 정도로 참고문헌으로 합병되었으며 여기서 전체문헌으로 설면 되었다. 여기서 값의 범위들을 열거한 것은 별도로 다르게 여기서 제시하지 않는 한 단지 이 범위 안에 드는 각각의 값을 개별로 언급하는 짧게하는 방법의 역할을 할 뿐이며, 각 별도의 값은 여기서 개별적으로 열거된 것처럼 세목을 합병된다.
특별히 다르게 언급되거나 또는 명확하게 내용으로 반대되지 않는 한(예, 여기서 서술된 것은 별도로 언급되거나 또는 명확하게 내용으로 반대되지 않는 한, 특별한 요소를 포함하는 조성물이라고 여기서 서술된 것은 그 요소로 구성된 조성물이라고 서술하는 것으로 이해되어야 한다) 요소 또는 요소들에 관하여 여기서 발명의 관점이나 예를 서술하는데 "comprising," "having," "including" 또는 "containing," 이라는 용어를 사용하는 것은 그 특별한 요소나 요소들이 포함되는 "consists of," "consists essentially of," 또는 'substantially comprises" 발명의 비슷한 관점이나 예에 대한 지지를 제공하려는 의도이다.
여기서 공개되고 청구되는 모든 조성물들 및 방법들은 현 공개의 견지에서 과도한 실험 없이 만들어지거나 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물들 및 방법들이 설명적인 예들로서 서술되었지만, 이분야 기술에 익숙한 사람들에게는 조성물들, 방벋,ㄹ. 및/또는 방법의 단계들, 단계의 순서들이 본 발명의 정신, 범위 개념을 벗나지 않는 한 변화를 줄 수 있는 것이 분명하다. 더 특별하게, 화학적으로- 및/또는 생리학적으로-관련 있는, 특정 화합물들은, 같거나 비슷한 결과들을 달성하면서, 여기서 서술된 하나 또는 그 이상의 화합물들로 대치될 수 있다. 모든 그런 대치/또는 수정들은, 관련 분야에 있는 숙련된 한 명 또는 그 이상에게는 분명한 것처럼, 부록 청구항에 정의 한대로 본 발명의 정신, 범위, 및 개념 내에서 생각할 수 있다.
<110> The Methodist Hospital Chang, Jenny Chee Nee <120> INOS-INHIBITORY COMPOSITIONS AND THEIR USE AS BREAST CANCER THERAPEUTICS <130> 2016FPI-09-019 <150> US 61/976,956 <151> 2014-04-08 <150> PCT/US 2015 025009 <151> 2015-04-08 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide XBP1 Forward Primer <400> 1 gggtccaagt tgtccagaat gc 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide XBP1 Reverse Primer <400> 2 ttacgagaga aaactcatgg c 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Beta Actin Forward Primer <400> 3 ctggaacggt gaaggtgaca 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Oligonucleotide Beta Actin Reverse Primer <400> 4 aagggacttc ctgtaacaat gca 23

Claims (26)

1) 화학요법치료적(chemotherapeutically)으로 유효한 양의 첫 번째 iNOS 억제제; 및
2) 치료적으로 유효한 양의
a) 첫 번째 항고혈압(antihypertensive) 제제;
b) 첫 번째 화학요법치료 제제; 또는
c) a) 및 b)의 조합;
을 포함하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 첫 번째 iNOS 억제제는 NG-모노에틸-L-아르기닌[L-NMMA]{NG-monomethyl-L-arginine [L-NMMA]}, (N-[[3-(아미노에틸]페닐]메틸]-에탄이미다미이드) [1400W]{(N-[[3-(aminomethyl)phenyl]methyl]-ethanimidamide) [1400W]}, 또는 (N5-[이미노(니트로아미노)메틸]-L-오르니틴 메틸 에스터) [L-NAME] {(N5-[imino(nitroamino)methyl]-L-ornithine methyl ester) [L-NAME]}를 포함하는 것인 약학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 첫 번째 항고혈압 제제는 첫 번째 칼슘채널 길항제를 포함하는 것인 약학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 항-고혈압제는 암로디핀(amlodipine), 아라니디핀(aranidipine), 아젤니디핀(azelnidipine), 바니디핀(bearnidipine), 베니디핀(benidipine), 클리니디핀(clinidipine), 클레비디핀(clevidipine), 딜티아젬(diltiazem), 에포니티핀(efonidipine), 펜딜린(fendiline), 펠로디핀(felodipine), 갈로파밀(gallopamil), 이스라디핀(isradipine), 락시디핀(lacidipine), 레르카니디핀(lercanidipine), 마니디핀(manidipine), 니카디핀(nicardipine), 니페디핀(nifedipine), 니모디핀(nimodipine), 니솔디핀(nisoldipine), 니트렌디핀(nitrendipine), 니발디핀(nivaldipine), 프라니디핀(pranidipine), 및 베라파밀(verapamil)로 구성된 그룹으로부터 선택된 칼슘 채널 길항제를 포함하는 약학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, 3) 두 번째 별개의 iNOS 억제제(distinct iNOS inhibitor)를 추가적으로 포함하는 약학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, d) 하나 또는 그 이상의 면역조절제(immunomodulating agent), 신경활성제(neuroactive agent), 항-염증제, 항-리피데믹제(nti-lipidemic), 호르몬, 수용체 작용제(agonist), 수용체 길항제(antagonist), 항-감염제, 단백질, 펩타이드, 항체, 항원결합조각, 효소, RNA, DNA, siRNA, mRNA, 리보자임(ribozyme), 호르몬, 코-펙터, 스테로이드, 안티센스 분자, 두 번째 별개의 항고혈압제(distinct antihypertensive agent), 두 번째 별개의 화학료법치료제(distinct chemotherapeutic agent), 또는 이들의 어느 조합을 추가적으로 포함하는 약학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 화학요법치료제는 하나 또는 그 이상의 항 네오플라스틱 화합물들(antineoplastic compounds), 하나 또는 그 이상의 세포독성 화합물들(cytotoxic compounds), 하나 또는 그 이상의 사이토스타틱 화합물들(cytostatic compounds), 또는 이들의 어느 조합들을 포함하는 것인 약학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, 상기 첫 번째 화학요법치료제는 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 트라스트주맙(trastuzumab), 메토트렉세이트(methotrexate), 에피루비신(epirubicin), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 비노렐빈(vinorelbine), 카페시타빈(capecitabine), 젬시타빈(gemcitabine), 미톡산트론(mitoxantrone), 이사베필론(isabepilone), 에리불린(eribulin), 라파티닙(lapatinib), 카무스틴(carmustine), 질소머스터드(nitrogen mustard), 황 머스터드(sulfur mustard), 테트라 플라틴(platin tetranitrate), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포사이드(etoposide), 캄프토테신(camptothecin), 및 이들의 어느 조합으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 약학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, 상기 i) 첫 번째 iNOS 억제제는 L-NMMA을 포함; 및 ii) 첫 번째 항고혈압제는 암로디핀(amlodipine)을 포함하거나 첫 번째 화학요법치료제는 도세탁셀(docetaxel)을 포함하는 약학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, 상기 i) 첫 번째 iNOS 억제제는 L-NMMA를 포함; ii) 첫 번째 항고혈제는 암로디핀을 포함; 및 iii) 첫 번째 화학요법치료제는 도세탁셀을 포함하는 약학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, 리포좀(liposome), 게면활성제(surfactant), 니오솜(niosome), 에토좀(ethosome), 트란스훼로좀(transferosome), 포스포리피드(phospholipid), 스핑고좀(sphingosome), 나노파티클(nanoparticle), 마이크로파티클(microparticle), 또는 이들의 어느 조합을 추가적으로 포함하는 약학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체(carrier), 버퍼, 희석제, 매체(vehicle), 부형제(excipient), 또는 이들의 어느 조합을 추가적으로 포함하는 약학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, 포유류, 바람직하게는 사람에 투여를 위해 제형화된 것인 약학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물, 및 적어도 상기 조성물을 필요로 하는 사람에게 투여를 위한 첫 번째 세트의 지시서(first set of instructions)를 포함하는 치료 키트의 한 파트로 개조되거나 설계된 것인 약학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 포유류 암의 증상을 치료, 예방 또는 경감시키는데 사용하기 위한 것인 약학적 조성물.
상기 어느 한 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 사람의 유방암, 및 특히 사람의 치료-저항적(therapy-resistant)이고, 전이성(metastatic)이거나 또는 삼중-네가티브(triple-negative)인 유방암의 증상을 치료, 예방 또는 경감시키는데 사용하기 위한 것인 약학적 조성물.
치료에 사용하기 위한 청구항 제 1항 내지 제 16항 중 어느 항에 따른 약학적 조성물.
포유류를 대상으로 암 치료에 사용하기 위한 청구항 제 1항 내지 제 16항 중 어느 항에 따른 약학적 조성물.
포유류 암의 하나 또는 그 이상의 증상을 치료하거나, 경감시키기 위해 약물을 제조에서 청구항 제 1항 내지 제 13항 중 어느 항에 따른 약학적 조성물의 용도.
제 19항에 있어서, 사람의 유방암 및 특히, 불치(refractory), 치료-저항성, 재발성(relapsed), 전이성, 또는 삼중-네가타브 유방암의 치료를 위한 약물 제조에의 용도.
청구항 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 유효한 양을 이를 필요로 하는 동물에게 하나 또는 그 이상의 암의 증상을 치료하거나 경감시키는 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함하는, 동물의 하나 또는 그 이상의 암의 증상을 치료하거나 경감시키는 방법.
제 21항에 있어서, 상기 암은 불치성, 전이성, 재발성, 또는 치료-저항성 암이라고 진단 또는 동정된 암인 방법.
제 21항 또는 제 22항에 있어서, 상기 암은 치료-저항성 또는 전이성 암, 특히 치료-저항성, 삼중-네가티브 인간 유방암이라고 진단 또는 동정된 암인 방법.
제 21항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 치료적으로 유효한 양의 방사선(radiation)을 동물에게 투여하는 단계를 추가적으로 포함하는 방법.
제 19항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 일 회 투여, 또는 하루 또는 복수의 일(days), 일주일 또는 복수의 주(weeks), 또는 한 달 또는 복수의 달(months) 또는 그 이상(longer)의 기간에 걸친 일련의 복수 투여로 동물에게 전신적으로 투여되는 것인 방법.
제 19항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 두 번째 별개의 화학요법치료제(distinct chemotherapeutic agent), 또는 두 번째 별개의 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 따른 iNOS 억제제를 포함하는 방법.
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