KR20160148065A - 영장류 다능성 줄기 세포의 조혈계 세포로의 분화 - Google Patents

영장류 다능성 줄기 세포의 조혈계 세포로의 분화 Download PDF

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Abstract

과립구-마크로파지 집락 자극 인자 (GMCSF) 및 골 형태형성 단백질 4 (BMP-4) 을 포함하는 여러개의 외인성 싸이토카인을 이용한 영장류 다능성 줄기 세포의 조혈계 세포로의 분화 방법이 개시된다.

Description

영장류 다능성 줄기 세포의 조혈계 세포로의 분화 {DIFFERENTIATION OF PRIMATE PLURIPOTENT STEM CELLS TO HEMATOPOIETIC LINEAGE CELLS}
본 출원은 2008 년 3 월 27 일에 출원된 임시 출원 61/039,835, 및 2008 년 7 월 16 일에 출원된 임시 출원 61/081,242 에 대해 우선권을 청구하며, 이들 두 문헌은 본원에 전부 참고문헌으로 포함된다.
본 발명은 줄기 세포 생물학 분야에 관한 것이다.
다능성 줄기 세포는 배양 중 계속적인 증식 및, 적당한 조건 하에서의, 세가지 원형적 배엽, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로 나타나는 계열 제한 세포 유형으로의 분화의 두가지 능력을 모두 갖는다 (U.S. 특허 5,843,780; 6,200,806; 7,029,913; Shamblott 등, (1998) Proc. Natl. Acad. Set USA 95: 13726; Takahashi 등, (2007) Cell 131(5): 861; Yu 등, (2007) Science 318:5858). 특별한 계열 제한 세포 유형에 대한 적당한 성장 조건의 규정은 연구 및 치료 적용에서의 용도를 위한 상기 세포 유형의 실제적으로 무한정한 공급을 제공할 것이다.
다능성 줄기 세포를 조혈계 세포로 분화시키는 것은 특별히 유용하다. 조혈계 세포는 중배엽층으로부터 발생하며, 백혈구 및 적혈구를 모두 포함하고, 이들은 각각 면역 및 순환계를 구성한다. 상기 세포들의 무한정 공급은 면역 및 순환계 모두의 발생 및 기능의 두가지 모두를 더욱 완전하게 이해하기 위해 필요한 도구를 제공할 것이다. 이는 또한, 유리한 것 및 해로운 것을 모두 포괄하여, 면역 응답성 조절을 위한 전략에 대한 통찰을 제공할 것이다.
면역계는 선천적 또는 비-특이적 면역 응답성 뿐만 아니라 후천적 또는 특이적 면역 응답성을 제공한다. 후천적 면역 응답성은 장기간 지속되는 보호적인 응답성이고, 이는 대부분의 백신 프로토콜이 자극하기 위해 찾아내려는 응답성이다. 후천적 면역 응답성으로의 세포 참여자에는 림프구 (T 세포 및 B 세포) 뿐만 아니라 수지상 세포 (DC) 가 포함된다. T 세포 및 B 세포는 항원 상에 발현되는 항원성 에피토프를 특이적으로 인식함으로써 표적 병원체를 제거한다. T 세포는 바이러스 감염성 및 종양 세포를 표적화하는데 있어서 특히 능숙한 세포독성 능성을 갖는다. B 세포는 표적 항원에 결합하고, 상기 표적의 옵소닌화 및 세포용해를 촉진하는 보체 시스템을 활성화시키는 항체를 분비한다. 두 응답성 모두 기억 응답성으로서의 특징을 나타내며, 따라서 일정 기간에 걸쳐 보호적이다. DC 는 후천적 면역 응답성 개시에서 중요한 역할을 한다. 이들은 적당한 주 조직적합 복합체 (MHC) 의 맥락에서 림프구에 대한 항원을 제시하고, 따라서 후천적 면역 응답성을 마운팅하기 위한 개시 자극을 제공한다. DC 의 즉각적인 공급은 숙주에서의 치료 또는 예방 면역 응답성 생성을 위한 수단을 제공한다.
후천적 면역 응답성 생성에 대한 비히클로서의 DC 의 잠재성을 증명하기 위한 여러개의 연구가 있었고 (참고문헌은, 예를 들어 Mayordomo 등, (1995) Nature Med 1 : 1297; Celluzi 등, (1996) J. Exp. Med. 183:283; Su 등, (1998) J. Exp. Med. 188:809), 여기에는 DC 에 방사선조사하는 유효성을 조사한 연구가 포함된다 (참고문헌은, 예를 들어, Cao 등 (2004) Cell Biology International 28:223; Merrick 등, (2005) British Journal of Cancer 92:1450; Young 등 (1993) Blood 81(1 1):2987; Denfield 등 (2001) Journal of Leukocyte Biology 69:548; Dudda 등 (2004) Journal of Investigative Dermatology 122:945).
다능성 줄기 세포의 유망성과 함께 수지상 세포의 잠재력은, 다능성 줄기 세포를 DC 또는 그의 전구체로 분화시키기 위해 시도한 몇가지 연구를 이끌었다 (참고문헌은, 예를 들어 U.S. 특허 7,247,480; U.S. 특허 출원: 2002/0086005; 2003/0153082; 2006/0275901; 2006/0147432; 2006/0063255; 2006/0147432; Fairchild 등, (2005) International Immunopharmacology 5:13; Tacken 등, (2007) Nature Reviews Immunology 7:790; Senju 등, (2007) Stem Cell 25(11):2720; Sluvkin 등, (2006) J of Immunology 176:2924; Li 등, (2001) Blood 98(2):335; Kaufman 등, (2001) Proc Natl Acad Sci 98(19):10716; Chadwick 등, (2003) Blood 102(3):906; Zhan 등, (2004) Lancet 364:163; Fairchild 등, (2000) Current Biology 10:1515; Kennedy 등, (2007) Blood 109(7):2679; Ng 등, (2005) Blood 106(5):1601 ; Fehling 등, (2003) Development 130:4217; Lu 등, (2004) Blood 103(11):4134; Zambidis 등, (2005) Blood 106(3):860; Bandi 등, (2008) AIDS Research and Therapy 5: 1; Pick 등, (2007) Stem Cells 25:2206).
대다수의 상기 연구자들은 간질 세포 및/또는 피더 세포 (feeder cell) 에 의존하여 그의 줄기 세포를 성장 및/또는 분화시켰다. 피더 세포 및 간질 세포의 이용은 번잡하고, 비용이 많이 들고, 시간도 많이 소요되며, 규모를 확장하기가 어렵다. 이들 연구자들 중 일부는 그의 프로토콜에 동물 혈청과 같은 동물 생산물을 이용했다. 그러나, 동물 생산물의 이용은 동물에 의해 만들어진 감염성 제제의 오염 위험을 안고 있다. 또다른 연구자들은 무작위적이거나 또는 열악하게 제형화된 분화 프로토콜에 의존하여, 예측불가한 결과 및 일반적으로 낮은 수율로 생성물을 제공했다.
다능성 줄기 세포로부터 분화된 조혈계 세포, 및 규모조정가능하고, 경제적이고, 효율적이며, 신뢰성있고, 안전하며, 양호한 수율의 생성물을 제공할 수 있는 세포의 제조 방법을 필요로 한다. 본원에 기재된 본 발명의 다양한 구현예는 이러한 필요 및 다른 필요들에까지도 부응한다.
발명의 개요
특정 구현예에서, 본 발명은 영장류 다능성 줄기 세포 (pPS) 의 조혈계 세포로의 시험관내 분화를 제공한다. pPS 세포는 인간 조혈계 세포로의 분화에 적합한 인간 다능성 줄기 세포일 수 있다. 조혈계 세포에는, 예를 들어 미숙형 수지상 세포 (imDC), 성숙형 수지상 세포 (mDC), 골수 전구체 세포, 단핵구를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포의 중배엽 세포로의 시험관내 분화 방법을 제공한다.
pPS 세포의 조혈계 세포로의 분화는, 세포 집단의 본질적으로 동일한 유전자형을 유지하면서도 상이한 표현형, 예를 들어 조혈계 세포의 표현형으로 분화하도록, 시험관내에서의 세포, 예를 들어 pPS 세포의, 여러개의 외인성 싸이토카인 및/또는 세포 표면 상에 발현되는 단백질들에 대한 여러개의 외인성 리간드 (예를 들어, 싸이토카인 수용체에 특이적으로 결합하는 항체와 같은, 싸이토카인 수용체에 대한 외인성 리간드 포함) 와의 접촉을 포함할 수 있다. 적합한 외인성 싸이토카인에는, 하기과 같은 여러개의 것이 포함될 수 있다: 과립구-마크로파지 집락 자극 인자 (GM-CSF), 골 형태형성 단백질 4 (BMP-4), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 줄기 세포 인자 (SCF), 트롬보포이에틴 (TPO), 태아 간 키나아제 리간드 (FLT3L), 인터류킨 4 (IL-4) 및 인터류킨 3 (IL-3).
동일한 유전자형을 가진 세포를 언급하는 것은, 세포가 인간의 손에 의해 유전자적으로 취급되어서는 안되는 경우를 의미하는 것도 (유전자적으로 변경된 세포를 포함하는 구현예는 이후에 기재함), 또는 아주 미미한 변화 (예를 들어, 전체 게놈의 소소한 백분율 미만) 가 자발적으로 일어나서는 안되는 경우 (예를 들어, 비-코딩 영역에서) 를 의미하는 것도 아니며, 단지 pPS 세포로부터 조혈계 세포로의 세포 분화 작용이 그 자체로는 변경된 유전자형을 제공하지 않는다는 점을 시사하는 것 뿐이다. 일반적으로, 부모 (미분화 세포) 및 그의 분화된 자손 간의 유전자적 동일성은 동일한 쌍생아 사이에서 발견되는 유전자적 동일성과 유사하다.
특정 구현예에서, pPS 세포의 조혈계 세포로의 시험관내 분화 방법은 무혈청에서 실행될 수 있다. 일부 구현예에서, pPS 세포의 조혈계 세포로의 분화 방법은 피더 없이 실행될 수 있다. 각종 구현예에서, pPS 세포의 조혈계 세포로의 분화 방법은 간질 세포 없이 실행될 수 있다. 특정 구현예에서, pPS 세포의 조혈계 세포로의 분화 방법은 외인성 IL-3 의 첨가 또는 IL-3 수용체에 대한 외인성 리간드의 첨가없이 실행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 GM-CSF 및 BMP-4 를 포함하는 여러개의 외인성 싸이토카인을 pPS 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, pPS 세포의 시험관 내에서의 imDC 로의 분화 방법을 제공한다. 여러개의 외인성 싸이토카인은 추가로 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다: VEGF, SCF, TPO, FLT3L 및 IL-3. 일부 구현예에서, IL-4 가 또한 상기 분화 칵테일에 포함될 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, pPS 세포의 시험관내에서의 mDC 로의 분화 방법을 제공한다:
1) pPS 세포를 imDC 로 분화시키기에 적합한, 여러개의 외인성 싸이토카인 및/또는 세포 표면 상에 발현되는 단백질, 예를 들어 싸이토카인에 대한 여러개의 외인성 리간드를 포함하는 분화 칵테일에 pPS 세포를 접촉시킴으로써, pPS 세포를 imDC 로 분화시키는 단계; 및
2) imDC 의 mDC 로의 성숙화를 촉진하기에 적합한, 여러개의 외인성 싸이토카인 및/또는 세포 표면 상에 발현되는 단백질, 예를 들어 싸이토카인 수용체에 대한 외인성 리간드를 포함하는 성숙화 칵테일과 imDC 를 접촉시킴으로써, imDC 를 mDC 로 분화시키는 단계. 분화 칵테일은 하기의 여러개의 것을 포함할 수 있다: GM-CSF, VEGF, BMP-4, SCF, TPO, FLT3L 및 IL-3. 성숙화 칵테일은 하기의 여러개의 것을 포함할 수 있다: 종양 괴사 인자 α (TNFα), 인터류킨 1β (IL 1β), 인터페론 γ (IFNγ), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 폴리이노신산: 폴리시티딜산 (POLY I:C), 인터페론 α (IFNα), CD40L 및 GM-CSF.
한 구현예에서, 본 발명은 BMP-4, GM-CSF, VEGF 및 SCF 을 함유하는 분화 칵테일 및 적합한 성숙화 칵테일, 예를 들어 GM-CSF, IFNγ, TNFα, IL 1β 및 PGE2 을 함유하는 성숙화 칵테일과 pPS 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, pPS 세포의 시험관내에서의 mDC 로의 분화 방법을 제공한다. 상기 구현예에서, IL-4 가 또한 분화 칵테일에 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 분화 칵테일의 조성은 pPS 세포의 조혈계 세포로의 분화 과정에 걸쳐 동일하게 유지될 수 있다. 예를 들어, 분화 칵테일은 pPS 세포의 imDC 로의 분화 과정 내내 BMP-4, GM-CSF, VEGF 및 SCF 를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-4 가 또한 분화 칵테일에 포함될 수 있다.
다른 구현예에서, 분화 칵테일은 분화 프로토콜 과정에 걸쳐 변화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예에서, 분화 칵테일은 프로토콜의 하나 이상의 단계에 대해 4 가지 외인성 싸이토카인, 또는 세포 표면 단백질에 대한 4 가지 외인성 리간드를 함유하면서, 분화 프로토콜의 다른 단계에서는, 분화 칵테일이 3, 2, 또는 1 가지 외인성 싸이토카인(들) 또는 세포 표면 단백질에 대한 외인성 리간드(들) 을 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포는 먼저 BMP-4, VEGF 및 SCF (GM-CSF 는 선택적으로는 상기 제 1 단계에 포함될 수 있음) 을 함유하는 분화 칵테일에 접촉시키고, 이어서 VEGF, SCF 및 GM-SCF 을 함유하는 분화 칵테일에 후속하여, SCF 및 GM-CSF 을 함유하는 분화 칵테일에 이어, GM-CSF 를 함유하는 분화 칵테일에 이어, GM-CSF 및 인터류킨 4 (IL-4) 를 함유하는 분화 칵테일에 접촉시킴으로써, pPS 세포를 imDC 로 분화시킬 수 있다. 이어서, imDC 는 적합한 성숙화 칵테일, 예를 들어 IFNγ, TNFα, IL 1β 및 PGE2 를 함유하는 성숙화 칵테일에 접촉시킬 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포를 시험관내에서 하기의 하나 이상을 발현하는 세포로 분화시키는 방법을 제공하는데: CD83, CD14, MHC I, MHC II, CD11c 및 CD11b, 상기 방법은 pPS 세포를 여러개의 하기의 것에 접촉시키는 것을 포함한다: GM-CSF, BMP-4, VEGF, SCF, FLT3L, TPO, 및 IL-3 및/또는 세포 표면 단백질에 대한 외인성 리간드.
또다른 구현예에서, 본 발명은 단계 특이적 태아성 항원 3 (SSEA3), 단계 특이적 태아성 항원 4 (SSEA4) 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81 로 지정된 항체를 이용하여 검출가능한 마커를 발현하는 세포를, 하기의 하나 이상을 발현하는 세포로 분화시키는 방법을 제공하는데: CD83, CD14, MHC I, MHC II, CD11c 및 CD11b, 상기 방법은 pPS 세포를 여러개의 하기의 것에 접촉시키는 것을 포함한다: GM-CSF, BMP-4, VEGF, SCF, FLT3L, TPO, 및 IL-3 및/또는 세포 표면 단백질에 대한 외인성 리간드.
또다른 추가 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포를 시험관내에서 CD83 CD 14, MHC I, MHC II, CD11c 및 CD11b 을 발현하는 세포로 분화시키는 방법을 제공하는데, 이는 GM-CSF 및 BMP-4 및/또는 세포 표면 수용체에 대한 외인성 리간드를 포함하는 여러개의 외인성 싸이토카인과 pPS 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 여러개의 외인성 싸이토카인은 추가로 하기의 하나 이상의 포함할 수 있다: VEGF, SCF, FLT3L, TPO 및 IL-3 및/또는 세포 표면 단백질에 대한 외인성 리간드. 세포 표면 단백질의 예시에는 상기에서 언급한 싸이토카인들 중 하나에 대한 수용체가 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포를 시험관내에서 하기의 하나 이상의 발현하는 세포로 발현시키는 방법을 제공하는데: MHC-I, MHC-II, CD83, CD205, CD11b, CCR7, CD40, CD86, CD123, CD11c, 이는 pPS 세포를 1) 분화 칵테일과 접촉시키고, 이어서 1) 의 세포를 성숙화 칵테일과 접촉시키는 것을 포함한다. 분화 칵테일은 하기의 여러개의 것을 포함할 수 있다: GM-CSF, BMP-4 VEGF, SCF, FLT3L, TPO, IL-4 및 IL-3 및/또는 세포 표면 단백질에 대한 외인성 리간드. 성숙화 칵테일은 하기의 여러개의 것을 포함할 수 있다: GM-CSF, TNFα, IL 1β, IFNγ, PGE2, POLY I:C, IFNα 및/또는 세포 표면 단백질에 대한 외인성 리간드. 세포 표면 단백질의 예시는 상기 언급한 싸이토카인들 중 하나에 대한 수용체를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포를 분화 칵테일 및 성숙화 칵테일과 접촉시키는 것을 포함하는, pPS 세포의 시험관 내에서의 CD83 발현 세포로의 분화 방법을 제공한다. 분화 칵테일은 GM-CSF 및 BMP-4 및/또는 세포 표면 단백질에 대한 외인성 리간드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 분화 칵테일은 추가로 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다: VEGF, SCF, FLT3L, TPO, IL-4 및 IL-3. 성숙화 칵테일은 여러개의 하기의 것을 포함할 수 있다: TNFα, IL 1β, IFNγ, PGE2, POLY I:C, IFNα, CD40L 및 GM-CSF. 일부 구현예에서, CD83 발현 세포는 또한 하기의 하나 이상의 발현할 수 있다: CD86, CD14, CD11b, CD11c, CD205, MHC I 및 MHC II. 일부 구현예에서, 분화 칵테일은 세포 표면 단백질에 대한 외인성 리간드, 예컨대 싸이토카인 수용체를 포함할 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포를 시험관내에서 CD45 및 CD11c 를 발현하는 세포 집단으로 발현하는 방법을 제공하며, 이는 pPS 세포를 GM-CSF 및 BMP-4 및/또는 세포 표면 단백질에 대한 외인성 리간드를 함유하는 여러개의 외인성 싸이토카인에 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 여러개의 외인성 싸이토카인은 추가로 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다: VEGF, SCF, FLT3L, TPO, 및 IL-3 및/또는 세포 표면 단백질에 대한 외인성 리간드. CD45 발현 세포는 CD45hi 세포일 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명은 단계 특이적 태아성 항원 3 (SSEA3), 단계 특이적 태아성 항원 4 (SSEA4) 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81 로 지정된 항체를 이용하여 검출가능한 마커를 발현하는 세포의, CD45 및 CD11c 발현 세포 집단으로의 분화 방법을 제공하며, 이는 단계 특이적 태아성 항원 3 (SSEA3), 단계 특이적 태아성 항원 4 (SSEA4) 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81 로 지정된 항체를 이용해 검출가능한 마커를 발현하는 세포를 GM-CSF 및 BMP-4 및/또는 세포 표면 수용체에 대한 외인성 리간드를 포함하는 여러개의 외인성 싸이토카인에 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 여러개의 외인성 싸이토카인은 추가로 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다: VEGF, SCF, FLT3L, TPO, 및 IL-3 및/또는 세포 표면 단백질에 대한 외인성 리간드. CD45 발현 세포는 CD45hi 세포일 수 있다.
하나 이상의 마커를 발현하는 세포 분화라는 언급은, 기준으로 하는 마커의 발현이 출발 세포 집단 (예를 들어, 분화된 세포 집단에 대해 전구체 세포 집단) 에 비해 (예를 들어, 분화의 결과로) 증가되는 구현예를 포함할 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포를 여러개의 외인성 싸이토카인을 함유하는 분화 칵테일과 접촉시키는 것을 포함하는, pPS 세포의 시험관 내에서의 중배엽으로의 분화 방법을 제공한다. 분화 칵테일은 하기의 여러개의 것들을 함유할 수 있다: BMP-4, VEGF, SCF, FLT3L 및 GM-CSF 및/또는 세포 표면 단백질 상의 외인성 리간드. 한 구현예에서, 분화 칵테일은 BMP-4, VEGF, SCF 를 함유할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포를 포함하는 세포의 제 1 집단 및 조혈계 세포를 포함하는 세포의 제 2 집단을 포함하는 세포 배양을 제공한다. 조혈계 세포는 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다: 혈액모세포, 조혈 줄기 세포, 골수 전구 세포, 그래뉼로모노싸이트 전구 세포, 단핵구, imDC 및 mDC. 일부 구현예에서, 세포 배양은 여러개의 외인성 싸이토카인 및/또는 세포 표면 단백질에 대한 리간드, 예컨대 싸이토카인 수용체를 포함할 수 있다. 적합한 외인성 싸이토카인은 하기를 포함할 수 있다: GM-CSF, VEGF, BMP-4, SCF, FLT3L, IL-4, TPO, TNFα, IL 1β, IFNγ, PGE2, POLY I:C, IFNα. 세포 배양은 또한 외인성 CD40L 을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양은 선택적으로는 외인성 IL-3 또는 IL-3 수용체에 대한 외인성 리간드를 포함하지 않을 수도 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양은 피더가 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양은 간질 세포가 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양은 혈청이 없을 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포를 포함하는 세포의 제 1 집단 및 DC, 예를 들어 mDC, imDC 를 포함하는 세포의 제 2 집단을 포함하는 세포 배양을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포 배양은 여러개의 외인성 싸이토카인을 포함할 수 있다. 적합한 외인성 싸이토카인은 하기를 포함할 수 있다: GM-CSF, VEGF, BMP-4, SCF, TPO, TNFα, FLT3L, IL 1β, IL-4, IFNγ, PGE2, POLY I:C, IFNα. 세포 배양은 또한 외인성 CD40L 을 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포를 포함하는 세포의 제 1 집단 및 DC, 예를 들어 mDC, imDC 및 외인성 BMP-4 및 GM-CSF 를 포함하는 세포의 제 2 집단을 포함하는 세포 배양을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포 배양은 선택적으로는 외인성 IL-3 또는 IL-3 수용체에 대한 외인성 리간드를 포함하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양은 피더가 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양은 간질 세포가 없을 수 있다. 각종 구현예에서, 세포 배양은 혈청이 없을 수 있다. 특정 구현예에서, 세포 배양은 방사선조사될 수 있다. 예를 들어, 방사선조사된 세포 배양은 mDC 를 포함하는 세포 배양을 포함할 수 있다. 방사선조사된 세포 배양은 하나 이상의 pPS 세포를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는 세포 분열을 저해하기에 적합한 화학적 제제, 예컨대 화학치료제, 예를 들어 미토마이신, 시스플라틴과 접촉시킬 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명은 세포 배양을 방사선 조사원 또는 화학적 제제와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 배양에서의 세포 분열을 저해하는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양은 하나 이상의 pPS 세포 및 pPS 세포로부터 시험관내에서 분화된 mDC 를 포함한다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 면역 조절제의 제조 방법을 제공한다: 1) 적어도 일부의 pPS 세포의 집단을 mDC 세포로 분화시킴으로써 mDC 및 하나 이상의 pPS 세포를 포함하는 세포의 혼합된 집단을 수득하는 단계, 및 2) 1) 의 혼합된 세포 집단과 방사선원 또는 화학적 제제를 접촉시킴으로써, 면역 조절 제제를 수득하는 단계. 상기 방법은 추가로 mDC 를 포함하는 혼합 세포 집단과 항원, 예를 들어 단백질 또는 펩티드를 접촉시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 세포의 집단은, 세포를 방사선조사와 접촉시키기 전에 항원과 접촉시킬 수 있다. 면역 조절 제제는 항원에 대한 면역 응답성을 자극할 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 면역 조절 제제의 제조 방법을 제공한다: 1) 적어도 일부의 pPS 세포 집단을 imDC 세포를 포함하는 집단으로 분화시킴으로써, imDC 및 하나 이상의 pPS 세포를 포함하는 세포의 혼합 집단을 수득하는 단계; 2) imDC 를 포함하는 집단을 항원을 인코딩하는 핵산과 접촉시키는 단계; 3) imDC 가 mDC 로 성숙화되도록 2) 의 세포의 집단을 성숙화 칵테일과 접촉시키는 단계, 여기서 상기 집단은 하나 이상의 pPS 세포를 함유함, 및 4) 3) 의 세포의 혼합된 집단을 방사선원 또는 화학적 제제와 접촉시킴으로써, 면역 조절 제제를 수득하는 단계. 면역 조절 제제는 항원에 대한 면역 응답성을 자극할 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 면역 조절 제제의 제조 방법을 제공한다: 1) 적어도 일부의 pPS 세포의 집단을 imDC 세포를 포함하는 집단으로 분화시킴으로써, mDC 및 하나 이상의 pPS 세포를 포함하는 세포의 혼합 집단을 수득하는 단계; 2) 1) 의 세포의 집단을 성숙화 칵테일과 접촉시켜, 세포의 집단이 하나 이상의 pPS 세포를 포함하는 곳에서 imDC 가 mDC 로 성숙화되도록 하는 단계, 3) mDC 를 포함하는 세포의 집단을 항원을 인코딩하는 핵산과 접촉시키는 단계; 및 4) 3) 의 세포의 혼합 집단을 방사선원 또는 화학적 제제와 접촉시킴으로써 면역 조절 제제를 수득하는 단계. 면역 조절 제제는 항원에 대한 면역 응답성을 자극할 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포의 시험관내 자손인 유사분열 불활성화 mDC 를 함유하는 면역 조절 조성물을 제공한다. 조성물에는 세포를 유사분열 불활성화하기 위해, 방사선조사를 하거나 또는 세포 분열 저해에 적합한 화학적 제제, 예컨대 화학치료제, 예를 들어 미토마이신, 시스플라틴으로 처리할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 면역 조절 조성물은 방사선조사에 앞서 DC, 예를 들어 mDC 또는 항원을 인코딩하는 핵산 또는 항원과 접촉시킨 imDC 를 함유할 수 있다. 상기 면역 조절 응답성은 항원에 대한 면역 응답성을 자극하는 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 면역 응답성을 자극하는 방법을 제공한다: a) 시험관내에서 pPS 세포로부터 분화된 mDC 를 수득하는 단계; b) 상기 mDC 를 항원 또는 항원을 인코딩하는 핵산 분자에 접촉시키는 단계; c) b) 의 mDC 를 방사선원 또는 세포 분열을 억제하기에 적합한 화학적 제제, 예를 들어 미토마이신에 접촉시키는 단계; d) c) 의 mDC 를 면역학적 컴피턴트 세포와 접촉시켜 항원에 대한 면역 응답성을 자극하는 단계.
다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 항원에 대한 면역 응답성을 자극하는 방법을 제공한다: a) 시험관내에서 pPS 세포로부터 분화된 imDC 를 수득하는 단계; b) 상기 imDC 를 항원을 인코딩하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계; c) 상기 imDC 를 성숙화 칵테일 (본원에 기재됨) 과 접촉시켜, imDC 를 mDC 로 성숙화시키는 단계, d) c) 의 mDC 를 방사선원 또는 세포 분열 억제에 적합한 화학적 제제, 예를 들어 미토마이신에 접촉시키는 단계; e) d) 의 mDC 를 면역학적 컴피턴트 세포에 접촉시켜 항원에 대한 면역 응답성을 자극하는 단계.
다른 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 항원에 대한 면역 응답성 자극 방법을 제공한다: a) pPS 가 mDC 로 분화되도록 pPS 세포를 분화 칵테일 및 성숙화 칵테일에 접촉시키는 단계; b) a) 의 상기 mDC 를 항원 또는 항원을 인코딩하는 핵산 분자와 접촉시키는 단계; c) b) 의 상기 mDC 를 면역학적 컴피턴트 세포에 접촉시켜 항원에 대한 면역 응답성을 자극하는 단계. 분화 칵테일은 세포 표면 단백질에 대한 여러개의 외인성 싸이토카인 및/또는 여러개의 외인성 리간드를 함유한다. 분화 칵테일은 GM-CSF, BMP-4, VEGF, SCF, FLT3L, TPO, IL-4 및 IL-3 를 함유할 수 있다. 성숙화 칵테일은 하나 이상의 하기의 것을 함유할 수 있다: GM-CSF, TNF-α, IL 1β, IFNγ, PGE2, POLY I:C, IFNα. 일부 구현예에서, 세포 배양물은 선택적으로는 외인성 IL-3 또는 IL-3 수용체에 대한 외인성 리간드를 함유하지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양에는 피더가 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양에 간질 세포가 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양은 혈청이 없을 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 항원에 대한 면역 응답성을 자극하기 위한 키트를 제공한다: 1) pPS 세포 및 DC 를 함유하는 세포 배양, 및 2) 하나 이상의 용기. DC 는 mDC 또는 imDC 일 수 있다. 세포 배양은 외인성 싸이토카인 및/또는 세포 표면 단백질에 대한 외인성 리간드를 함유할 수 있다. 외인성 싸이토카인 및/또는 세포 표면 단백질에 대한 외인성 리간드는 여러개의 하기의 것을 포함할 수 있다: GM-CSF, VEGF, BMP-4, SCF, FLT3L, TPO, IL-4, IL-3, TNFα, IL 1β, IFNγ, PGE2, POLYLC, IFNα, CD40L. 일부 구현예에서, 세포 배양은 선택적으로는 외인성 IL-3 또는 IL-3 수용체에 대한 외인성 리간드를 포함하지 않을 수도 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양에는 피더가 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양에는 간질 세포가 없을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양에는 혈청이 없을 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 항원에 대한 면역 응답성을 자극하기 위한 키트를 제공한다: 1) pPS 세포의 시험관내 자손인, 방사선조사된 mDC, 및 2) 하나 이상의 용기.
또다른 구현예에서, 하기를 포함하는, 항원에 대한 면역 응답성을 자극하기 위한 키트가 제공된다: 1) pPS 세포의 시험관내 자손인 유사분열 불활성화 mDC; 및 2) 하나 이상의 용기. mDC 는 세포를 유사분열적으로 불활성화시키기 위해 세포 분열 억제에 적합한 화학적 제제와 접촉시킬 수 있다. 세포 분열 억제에 적합한 화합물에는, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C 가 포함될 수 있다. 대안적으로, mDC 는 방사선원에 접촉시켜 세포를 유사분열적으로 불활성화시킬 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 유사분열 불활성 항원 제시 세포의 제조를 위한 계를 제공한다: a) pPS 세포를 포함하는 제 1 단리 세포 집단, 및 b) pPS 세포의 일부의 시험관내 자손인 유사분열 불활성화 성숙형 수지상 세포를 포함하는 제 2 단리 세포 집단. 성숙형 수지상 세포는 방사선조사에 의해 또는 화학적 제제와의 접촉에 의해 유사분열 불활성화될 수 있다. pPS 세포를 포함하는 제 1 단리된 세포 집단 (예를 들어, 이 부분은 mDC 제조에 이용되지 않음) 를 포함하는 제 1 단리 세포 집단은 생체내에서 세포의 제 1 집단을 분화시킴으로 더 많은 제 2 단리된 집단을 만들기 위해 이용될 수 있다는 것이 고려될 것이다.
본 발명의 임의의 구현예들은 하기의 pPS 세포의 서브클래스의 하나 이상을 치환함으로써 본 발명의 임의의 구현예가 실행될 수 있다는 점이 고려된다: 인간 배아 줄기 세포, 인간 배아 줄기 세포, 붉은털원숭이 줄기 세포, 마모셋 줄기 세포, 핵 이식 줄기 세포 및/또는 유도된 다능성 줄기 세포, 이들 전부는 하기에 기재됨.
정의
본원에 사용된 "약" 은, 언급한 양 또는 값의 + 또는 - 5% 를 의미하는 양 또는 값을 지칭한다.
세포 배양은, 본원에 사용된 바, 경시적으로 시험관내에서 성장한 여러개의 세포들을 지칭한다. 세포 배양은 여러개의 pPS 세포로부터 또는 단일 pPS 세포로부터 기원하는 것일 수 있고, 1) 배양의 전생애에 걸쳐 세포 배양이 거쳐 온 계대 또는 분열 회수; 및 2) 배양의 생애에 걸쳐 배양 내에서의 (예를 들어, 배양 내 하나 이상의 pPS 세포의 분화로 인한) 하나 이상의 세포에 대한 표현형에서의 임의의 변화와는 무관하게, 기원 세포 또는 세포들의 자손 전부를 포함할 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바, 세포 배양은 하나 이상의 pPS 세포가 있는 하나 이상의 적합한 용기의 최초 시딩으로 시작하고, 본래 확립자(들)의 최후의 생존하는 자손들이 수합되거나 또는 사멸할 때 종결된다. 본래 확립자 세포의 자손을 이용한 하나 이상의 추가적인 배양 용기의 시딩은 또한 본래 세포 배양의 일부로 간주된다.
싸이토카인은, 본원에 사용된 바, 또다른 세포 또는 동일 세포 또는 이들 두가지 모두의 거동에 영향을 주는 세포에 의해 분비되는 분자를 지칭한다.
용어 "배아체" 는, 본원에 사용된 바, 영장류 다능성 줄기 세포가 현탁 배양 또는 응집물에서 비특이적 방식으로 분화하도록 할 때 나타나는, 비분화성, 분화성 및 부분 분화성 세포를 포함하는 비균질 클러스터를 지칭한다.
본원에 사용된 바, "배아 줄기 세포" (ES) 는 세포의 세가지 배엽으로의 실질적인 분화 전에 배반포로부터 유도되는 다능성 줄기 세포를 지칭한다. 다른 설명이 필요한 경우를 제외한다면, 상기 용어는 1 차적 조직 및 ES 세포의 표현형적 특징을 가진 확립된 세포, 및 각각의 세가지 배엽의 표현형적 특성을 가진 자손 세포를 제공할 역량을 여전히 갖고 있는 상기 세포주의 자손을 포함한다. ES 세포는 인간 ES 세포 (hES) 일 수 있다. 프로토유형 "인간 배아 줄기 세포" (hES 세포) 는 Thomson 등 (Science 282:1145, 1998; U.S. 특허 6,200,806) 이 기재했고, 그곳에 기재된 확립된 세포주도 포함한다.
본원에 사용된 바, 외인성은 세포 배양과 같은 계에 추가되는 제제를 지칭한다. 상기 제제는 인간의 손을 거쳐 계에 추가될 수 있다.
본원에 사용된 바, "피더 세포" 는 pPS 세포와 함께 배양되고, pPS 세포에 지지를 제공하는 비-pPS 세포를 지칭한다. 지지는, pPS 세포 배양에 pPS 세포를 실질적으로 미분화된 상태로 유지하도록 이상의 세포 인자를 pPS 세포 배양에 제공함으로써 pPS 세포 배양의 성장 및 유지를 촉진하는 것을 포함할 수 있다. 피더 세포는 pPS 세포와는 상이한 게놈 또는 pPS 세포와 동일한 게놈을 가질 수 있고, 마우스와 같은 비-영장류 종으로부터 유래될 수 있거나, 또는 영장류 기원, 예를 들어 인간의 것일 수 있다. 피터 세포의 예시에는 쥐과동물 섬유아세포, 인간 섬유아세포와 같은 연결 조직의 표현형을 가진 세포를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바, "피더가 없는" 은 기준 조성물이 첨가된 피더 세포를 포함하지 않는 상태를 지칭한다. 명확히 하기 위해, 용어 피더가 없는은, 특히 최초의 배양으로부터의 피더 중 일부가 두번째 배양에 존재하더라도, 배양물에 첨가되는 피더 없이 약간의 피더를 함유할 수도 있는 배양으로부터 계대된 영장류 다능성 줄기 세포인 경우도 포함한다.
조혈계 세포는, 본원에 사용된 바, pPS 세포 및/또는 그의 자손으로부터 시험관내에서 분화된 세포를 지칭하며, 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다: 혈액모세포, 조혈 줄기 세포, 일반적인 림프구 전구체 세포, 림프구, 일반적인 골수 전구 세포 (CMP), 그래뉼로모노싸이트 전구 세포 (GMP), 단핵구, 마크로파지, imDC 및 mDC.
면역학적 컴피턴트 세포는, 본원에 사용된 바, 항원에 응답할 수 있는 세포를 지칭한다. 응답은, 예를 들어 항원에 대한 응답에서의 세포 증식, 항원에 대한 응답에서의 하나 이상의 싸이토카인의 분비, 항원에 대한 응답에서의 하나 이상의 전사 인자의 발현이 포함된다. 면역학적 컴피턴트 세포의 예시에는 림프구가 포함된다.
영장류 다능성 줄기 세포의 시험관내 자손은, 본원에 사용된 바, 다능성 상태에서 비-다능성 상태로 분화된 세포, 예를 들어 미숙형 DC, 성숙형 DC 를 지칭한다.
본원에 사용된 바, "영장류 다능성 줄기 세포" (pPS) 는 임의의 공급원으로부터 유도된 것일 수 있고, 적당한 조건 하에 3 가지 배엽층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽) 의 전부의 유도체인 상이한 세포 유형의 영장류 자손을 생산할 수 있는 세포를 지칭한다. pPS 세포는 8 내지 12 주령 SCID 마우스에서 테라토마를 형성하는 능력 및/또는 조직 배양에서 3 가지 배엽층 전부의 식별가능한 세포를 형성하는 능력을 가질 수 있다. 영장류 다능성 줄기 세포의 정의에는, 인간 배아 줄기 (hES) 세포 (참고문헌은, 예를 들어 Thomson 등 (1998) Science 282: 1145) 및 인간 배아 생식 (hEG) 세포 (참고문헌은, 예를 들어 Shamblott 등, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13726,) 를 포함하는 각종 유형의 배아 세포; 기타 영장류 유래의 배아 줄기 세포, 예컨대 붉은털 원숭이 줄기 세포 (참고문헌은, 예를 들어 Thomson 등, (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844), 마모셋 줄기 세포 (참고문헌은, 예를 들어 (1996) Thomson 등, Biol. Reprod. 55:254,), 핵이식 기법으로 창출된 줄기 세포 (U.S. 특허 출원 공개 번호 2002/0046410), 뿐만 아니라 유도된 다능성 줄기 세포 (참고문헌은, 예를 들어 Yu 등, (2007) Science 318:5858); Takahashi 등, (2007) Cell 131(5):861) 가 포함된다.
본원에 사용된 바, "미분화 영장류 다능성 줄기 세포" 는 집단 내 실질적인 비율의 영장류 다능성 줄기 세포 및그의 유도체가 미분화 세포의 형태적 특징을 나타내는 세포 배양물을 지칭한다. 집단 내 미분화 세포의 집락이 부분적으로 분화된 이웃 세포에 의해 둘러쌓여 있을 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 사용된 바, "유전자적으로 변경된", "트랜스펙션된", 또는 "유전자적으로 형질전환된" 은 폴리뉴클레오티드가 인공적인 취급의 임의의 적합한 수단에 의해 세포로 이동되거나, 또는 해당 세포가 본래 변경된 세포의 자손이고, 폴리뉴클레오티드를 물려받는 프로세스를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 종종 관심대상의 단백질을 인코딩하는 전사가능한 서열을 포함하고, 이는 세포로 하여금 해당 단백질을 상승된 수준으로 발현할 수 있게 하거나, 또는 그 자체로는 단백질을 인코딩하지 않으면서 단백질의 발현에 영향을 주는 siRNA 또는 안티센스 RNA 와 같은 분자를 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다 (비개질 세포에 의해 발현되거나 또는 또다른 폴리뉴클레오티드 서열의 도입의 결과로서 발현됨). 유전자 변경은, 변경된 세포의 자손이 동일한 변경을 갖는 경우, "유전가능" 이라고 일컫는다.
무혈청은, 본원에 사용된 바, 소 태아혈청, 소 혈청, 말 혈청과 같은 동물 혈청이 첨가되지 않고, B-27 과 같은 시판되어 입수가능한 혈청 대체 보충물이 첨가되지 않은 조직 배양 성장 조건을 지칭한다. 무혈청은, 예를 들어 인간 알부민, 인간 트랜스페린 및 재조합 인간 인슐린을 포함할 수 있는 배지를 포함한다.
자발적 분화 pPS 세포는, 본원에 사용된 바, 무작위적으로 및 자발적으로 비-pPS 표현형으로 분화된, 즉 pPS 세포 상에서는 발현되지 않는 하나 이상의 마커를 발현하고/하거나 pPS 세포 상에서 발현되는 하나 이상의 마커를 발현하는, 세포 배양 중의 pPS 세포를 지칭한다.
간질 세포는, 본원에 사용된 바, 하나 이상의 세포 인자를 제공함으로써 pPS 세포 집단의 원하는 표현형, 예를 들어 조혈계 세포로의 분화를 촉진하기 위해 또다른 집단, 예를 들어 pPS 세포 집단과 공동배양될 수 있는 세포를 지칭한다. 간질 세포는 포유류의 골수로부터 유도될 수 있다. OP9 및 S 17 세포가 간질 세포의 예시이다.
간질 세포가 없음은, 본원에 사용된 바, 간질 세포, 또는 간질 세포에 의해 조건화된 배지가, 미분화 pPS 세포의 배양물 또는 조혈계 세포로 분화 중인 pPS 세포의 배양물에 첨가되지 않음을 의미한다.
MHC-I 및 HLA-I 는 호환되어 사용되며, MHC-II 및 HLA-II 도 마찬가지이다.
발명의 상세한 설명
특정 구현예에서, 본 발명은 시험관 내에서의 pPS 세포의 조혈계 세포로의 분화를 위한 개선된 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 특정 구현예는, pPS 세포의 조혈계 세포, 예컨대 DC (imDC 및 mDC 포함) 로의 분화에 적합한 최소 갯수의 외인성 인자 (예컨대 싸이토카인) 을 필요로 하는 규정 조건을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 최소 갯수의 외인성 싸이토카인, 예를 들어 7 개 이하, 6 개 이하, 5 개 이하, 4 개 이하, 3 개 이하의 외인성 싸이토카인을 함유하는 분화 칵테일과 pPS 세포의 접촉을 제공한다. 한 구현예에서, 규정된 조건은 4 개 이하로 첨가되는 외인성 싸이토카인, 예를 들어 BMP-4, GM-CSF, SCF 및 VEGF 을 함유하는 분화 칵테일을 제공할 수 있다. 다른 구현예에서, 규정 조건은 3 개 이하로 첨가된 외인성 싸이토카인, 예를 들어 a) BMP-4, GM-CSF, SCF; b) BMP-4, GM-CSF, VEGF 를 함유하는 분화 칵테일을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 싸이토카인 수용체에 대한 리간드는 각각의 싸이토카인을 대체할 수 있고/있거나 각각의 싸이토카인에 추가하여 제공될 수 있다. 조혈계 세포가 imDC 인 구현예에서, 분화 칵테일은 추가로 IL-4 를 함유할 수 있다. imDC 는 추가로 성숙화 칵테일과 접촉하여 mDC 를 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포의 조혈계 세포, 예컨대 DC 로의 분화를 위한 단순화된 배양 조건을 제공한다. 단순화된 배양 조건은 무혈청에, 피더 없고, 간질 세포 없고, 임의로는 외인성 IL-3 의 첨가를 필요로 하지 않는 조직 배양에서 pPS 세포를 DC 로 분화시키는 것을 포함할 수 있다. pPS 의 조혈계 세포로의 분화는 pPS 를 적합한 고체 표면 상에 플레이팅함으로써 배아체 (EB) 형성의 필요를 회피하여 수행될 수 있다. 상기 단순화된 배양 조건은 감염성 제제에 대한 노출의 위험을 없에고, 또한 치료 및 연구 적용에 충분한 양의 imDC 를 더욱 빠르게 비용을 절약하며 수득하는 방법을 제공한다.
pPS 세포의 분화 방법
pPS 세포를 조혈계 세포로 분화시키기 위한 출발 물질에는 무혈청이고, 피더가 없고, 간질 세포가 없이 배양된 pPS 세포가 포함된다. 피더 없이 그리고 무혈청에서 pPS 세포를 배양하기 위한 조건은 참고문헌, 예를 들어 Xu 등, (2001) Nat Biotechnol 19:971 ; Li 등, (2005) Biotechnol Bioeng 91 :688 에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 세포 응집물, 예를 들어 배아체 (EB) 형성에 적합한 조건 하에 pPS 세포를 배양하는 것이 유리할 수 있다. EB 의 형성은 선행기술에서 참고문헌, 예를 들어 U.S. 특허 공개 2006/0063255 및 PCT 공개 번호 WO 01/51616 에 기재되어 있다. 간략하게, 미분화 pPS 세포는 콜라게나아제 처리에 의해 수합되고, 클러스터 또는 세포의 스트립으로 단리되고, 응집물로서 비-부착성 세포 배양으로 계대될 수 있다. 수합한 pPS 세포는 일부 자발적으로 분화된 세포를 포함할 수 있다. 자발적으로 분화되는 세포의 수는, 세포가 EB 를 형성하고 이후에 조혈계 세포로 분화됨에 따라 경시적으로 줄어들 수 있다. 응집물은 적합한 배지, 예를 들어 X-VIVO 10; X-VIVO 15 를 이용해 주입될 수 있다. pPS 세포는 EB 의 형성 전후에 모두, 피더 없이, 혈청 없이, 그리고 간질 세포 없이 성장할 수 있다.
다른 구현예에서, EB 형성 단계는 생략될 수 있다. 따라서, pPS 세포는 적합한 지지체, 예컨대 조직 배양 플라스크 또는 웰에 직접 플레이팅되어, 분화 칵테일을 함유하는 배지에서 배양될 수 있다.
각종 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포의 조혈계 세포 및/또는 중배엽 세포로의 분화 방법을 제공한다. 조혈계 세포는 imDC 를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포에서 조혈계 세포, 예를 들어 BMP-4 및 GM-CSF 로의 분화에 적합한 여러개의 외인성 첨가 싸이토카인을 함유하는 분화 칵테일을 제공한다. 분화 칵테일의 예시에는, 하기의 것들 중 임의의 것을 포함할 수 있다: a) BMP-4, GM-CSF, VEGF, SCF, FLT3L, TPO 및 IL-3; b) BMP-4, GM-CSF, VEGF, SCF 및 FLT3L; c) BMP-4, GM-CSF, VEGF 및 SCF; d) BMP-4, GM-CSF, SCF; 및 e) BMP-4, GM-CSF, VEGF. 특정 구현예에서, IL-4 는 상기 언급한 싸이토카인에 추가하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 싸이토카인 수용체에 대한 리간드는 해당 싸이토카인 대신 또는 그에 추가하여 사용될 수 있다.
세포를 분화 칵테일에 노출시키는 시간의 양을 조정하여 각종 조혈계 세포가 수득될 수 있다는 점을 발견했다. 일부 구현예에서, 본 발명은 세포로부터의 중배엽 세포를 함유하는 배양으로의 분화를 위해 분화 칵테일을 이용해 약 5 일 동안 배양한 pPS 세포를 제공한다. 본 발명의 또다른 구현예에서, pPS 세포는, 세포를 조혈 줄기 세포를 함유하는 배양으로 분화시키기 위해 분화 칵테일과 약 10 일 동안 배양한다. 본 발명의 또다른 구현예에서, pPS 세포는 세포를 일반적인 골수 전구 세포를 함유하는 배양으로 분화시키기 위해 분화 칵테일을 이용해 약 15 일 동안 배양한다. 본 발명의 또다른 구현예에서, pPS 세포는 세포를 그래뉼로모노싸이트 전구 세포를 함유하는 배양으로 분화시키기 위해 분화 칵테일을 이용해 약 20 일 동안 배양한다. 본 발명의 또다른 구현예에서, pPS 세포는 세포를 단핵구를 함유하는 배양으로 분화시키기 위해 분화 칵테일과 약 25 일 동안 배양한다. 본 발명의 또다른 구현예에서, pPS 세포는 세포를 imDC 를 함유하는 배양으로 분화시키기 위해 분화 칵테일과 약 30 일 동안 배양한다.
본 발명의 일부 구현예는 imDC 를 여러개의 외인성 싸이토카인을 함유하는 적합한 성숙화 칵테일과 접촉시켜, imDC 의 mDC 로의 성숙화를 제공한다. 성숙화 칵테일은 GM-CSF 를 함유할 수 있다. 적합한 성숙화 칵테일의 예시에는, 하기의 임의의 것이 포함된다: a) GM-CSF, TNFα, IL-1β, IFNγ, 및 PGE2; b) GM-CSF, TNFα, IL-1β, IFNγ, PGE2 및 CD40L; c) GM-CSF, TNFα, IL-1β, IFNγ, PGE2, POLY I:C, 및 IFNα; d) GM-CSF, TNFα, IL-1β, IFNγ, POLY I:C, 및 IFNα; e) GM-CSF, TNFα, IL-1β, IFNγ, POLY I:C, IFNα, 및 CD40L; f) TNFα, IL-1β, PGE2 및 IL-6; g) GM-CSF, IL-1β, PGE2, 및, IFNγ; h) GM-CSF, TNFα, PGE2, 및 IFNγ; i) GM-CSF, IL-1β, IFNγ 및 CD40L. 일부 구현예에서, 하나 이상의 싸이토카인 수용체에 대한 리간드는 싸이토카인 대신 및/또는 그에 추가하여 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 다른 방법들이 imDC 의 mDC 로의 성숙화에 이용될 수 있다. 예시에는, imDC 의 리포폴리사카라이드 (LPS) 와의 접촉, imDC 의 CpG 포함 올리고사카라이드와의 접촉, 대상체 내 염증 부위로의 imDC 의 주사 등이 포함된다.
imDC 는 mDC 제조를 위해, 성숙화 칵테일의 존재 하에, 적어도 약 12 내지 15 시간, 적어도 1 일, 적어도 약 2 일, 적어도 약 3 일 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, imDC 는 mDC 제조를 위해, 성숙화 칵테일의 존재 하에 약 24 시간 동안 배양될 수 있다. 다른 구현예에서, imDC 는 mDC 제조를 위해 성숙화 칵테일의 존재 하에 약 48 시간 동안 배양될 수 있다.
mDC 는 CD83, CD86, MHC I 및 MHC II 과 같은, 그러나 CD 14 는 아닌 하나 이상의 마커를 발현할 수 있고, 생체내에서 분화된 성숙형 DC 와 유사한 기능적 특성을 가질 수 있다. 기능적 특성에는, 면역학적 컴피턴트 세포로의 프로세스 및 항원 제시 능력이 포함될 수 있다. 프로세스 및 항원 제시는 예를 들어, 표적 단백질의 단백질가수분해 뿐만 아니라, 표적 항원을 인코딩하는 핵산의 발현 및 프로세싱을 포함할 수 있다. mDC 는 또한 말초 및 림프구 조직 내로 이동하는 능력을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 pPS 세포로부터 분화된 mDC 는 MIP3β 과 같은 적당한 자극에 대한 응답으로 이동하도록 유도될 수 있다. mDC 는 하나 이상의 싸이토카인, 예컨대 하나 이상의 전-염증성 싸이토카인을 분비할 수 있다. 본 발명에 따라 DC 에 의해 분비되는 싸이토카인은 IL-12, IL-10 및 IL-6 을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 본 발명의 각종 구현예는 pPS 세포의 pPS 세포로의 분화 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 기재된 방법에 따라 제조된 pPS (예를 들어, mDC 및 imDC 를 포함하는 임의의 조혈계세포) 뿐만 아니라 분화된 집단 내의 원치않는 pPS 세포까지도 포함하는 각종 유형의 세포들을 유사분열적으로 불활성화하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예는 DC 세포를 단백질 또는 펩티드 항원 또는 항원을 인코딩하는 핵산에 접촉시키는 것, 및 DC, 예를 들어 mDC 를 방사선원 또는 세포 분열 억제에 적합한 화학적 제제에 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. mDC 의 방사선원 또는 화학적 제제에 대한 노출은, mDC 가 하나 이상의 pPS 세포를 포함하는 세포의 집단에 포함되어 있을 때 바람직할 수 있다. 세포에 방사선조사하거나 또는 세포를 화학적 제제로 처리하는 것은 세포 분열을 억제할 것이며, mDC 의 기능은 유지하고 있을 것이다. 더욱이, 세포를 방사선원 또는 화학적 제제로 처리하는 것은 집단 내 pPS 세포의 존재로 인한 임의의 바람직하지 않은 영향을 최소화할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포를 여러개의 외인성 싸이토카인, 예컨대 BMP-4, VEGF, SCF 및 선택적으로는 GM-CSF 를 함유하는 분화 칵테일과 접촉시키고, 상기 세포를 적어도 1 일 동안 배양함으로써 pPS 세포를 중배엽으로 분화시키는 것을 포함하는, pPS 세포를 중배엽으로 분화시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포는 분화 칵테일과 적어도 약 2 일, 적어도 약 3 일, 적어도 약 4 일, 적어도 약 5 일 동안 배양하여 pPS 를 중배엽으로 분화시킬 수 있다. 특정 구현예에서, pPS 세포는, pPS 세포를 중배엽으로 분화시키기 위해, 분화 칵테일고 약 5 일 동안 배양할 수 있다. 일부 구현예에서, 분화 칵테일은 선택적으로는 추가로 하기의 하나 이상을 함유할 수 있다: FLT3L, TPO, IL-4 및 IL-3. 중배엽 세포는 중배엽 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 인자 또는 마커를 발현할 수 있다. 예를 들어, pPS 연합 전사 인자 Oct4 및 Tra-160 의 감소된 발현과 함께 중배엽 연합 전사 인자, Brachyury 의 증가되는 발현은 pPS 세포의 중배엽 세포로의 분화의 표시일 수 있다. 배양물이 분화 칵테일의 존재 하에 성장을 지속하도록 하는 것은 중배엽 세포의, 예를 들어 조혈계 세포로의 추가적인 분화를 촉진할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 세포 배양물은, 중배엽 세포를 지나 세포들이 기타 조혈계 세포로 분화하도록 적합한 길이의 시간 동안 분화 칵테일의 존재 하에 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 세포는 본원에 기재된 분화 칵테일과 함께 적어도 약 6 일, 적어도 약 7 일, 적어도 약 8 일, 적어도 약 9 일, 적어도 약 10 일 동안 성장시켜, pPS 세포를 조혈 줄기 세포로 분화시킬 수 있다. 상기 세포들은 조혈 줄기 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 마커를 발현할 수 있다. 적합한 마커에는 CD45, CD34 및 HoxB4 이 포함될 수 있다. 또다른 구현예에서, 세포들은 본원에 기재된 분화 칵테일과 적어도 약 22 일, 적어도 약 23 일, 적어도 약 24 일, 적어도 약 25 일, 적어도 약 26 일, 적어도 약 27 일, 적어도 약 28 일 성장시켜, pPS 세포를 단핵구로 분화시킬 수 있다. 상기 세포들은 단핵구에 의해 발현되는 하나 이상의 마커를 발현할 수 있다. 적합한 마커에는 CD 14, CD45 및 CD11c 가 포함된다. 추가 구현예에서, 세포들은 본원에 기재된 분화 칵테일과 적어도 약 20 일, 적어도 약 23 일, 적어도 약 25 일, 적어도 약 30 일, 적어도 약 31 일, 적어도 약 32 일, 적어도 약 33 일 동안 성장시켜, pPS 세포를 imDC 로 분화시킬 수 있다. 상기 세포들은 imDC 에 의해 발현되는 하나 이상의 마커를 발현할 수 있다. 적합한 마커에는 CD86, CD83, 및 MHC II 가 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포가 하나 이상의 조혈계 세포 유형으로 분화되도록, pPS 세포를 하나 이상의 분화 칵테일과 접촉시키는 것을 포함하는, 조혈계 세포에서의 pPS 세포의 분화 방법을 제공한다. 상기 방법은 하나 이상의 단계에서 그 결과로서 조혈계의 중간체 세포 유형의 분화를 제공하는, 다중 단계를 포함하여 이루어질 수 있다. 본 발명은 하기에 제시된 모든 단계의 수행 뿐만 아니라, 조혈계의 원하는 중간체 또는 전구체 세포 유형을 수득하기 위한 하나 이상의 개별적인 단계의 수행도 또한 고려한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 pPS 세포의 중배엽으로의 분화 방법을 제공한다: 1) pPS 세포를 BMP-4, VEGF, SCF 및 선택적으로는 GM-CSF 를 함유하는 제 1 분화 칵테일과 접촉시킴으로써, pPS 세포를 중배엽 세포로 분화시키는 단계. 세포는 상기 분화 칵테일과 약 1 내지 5 일 동안 배양시킬 수 있다. 추가 구현예에서, 단계 1) 로부터의 중배엽 세포는 후속하여, VEGF, SCF, GM-CSF 를 함유하는 제 2 분화 칵테일과 접촉시킴으로써 중배엽을 조혈 줄기 세포로 분화시킬 수 있다. 세포는 상기 분화 칵테일과 약 1 내지 5 일 동안 배양시킬 수 있다. 추가 구현예에서, 조혈 줄기 세포는, 상기 조혈 줄기 세포를 GM-CSF 를 함유하는 분화 칵테일과 접촉시킴으로써 일반 골수 전구체 (CMP) 세포로 추가로 분화될 수 있다. 상기 단계를 위해, 분화 칵테일은 추가로 SCF 를 함유할 수 있다. 세포들은 상기 분화 칵테일과 약 1 내지 10 일 동안 배양시킬 수 있다. 일부 구현예에서, CMP 는 추가로, CMP 를 GM-CSF 를 함유하는 제 3 분화 칵테일과 접촉시킴으로써 일반 과립구/단핵구 전구체 (GP) 세포로 분화될 수 있다. 세포는 상기 분화 칵테일과 약 1 내지 5 일 동안 배양할 수 있다. 추가 구현예에서, GMP 는 추가로, GM-CSF 를 함유하는 분화 칵테일과 GMP 를 접촉시킴으로써 단핵구로 분화시킬 수 있다. 세포는 상기 분화 칵테일과 약 1 내지 10 일 동안 배양시킬 수 있다. 또다른 구현예에서, 단핵구는 추가로, GM-CSF 및 IL-4 를 함유하는 분화 칵테일과 상기 단핵구를 접촉시킴으로써 imDC 로 분화될 수 있다. 세포는 상기 분화칵테일과 약 1 내지 5 일 동안 배양할 수 있다. 또다른 구현예에서, imDC 는, 상기 imDC 를 본원에 상기 기재된 임의의 성숙화 칵테일과 접촉시킴으로써 mDC 로 성숙화시킬 수 있다. 세포는 상기 성숙화 칵테일과 약 12 내지 72 시간 동안 배양할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 상기 성숙화 칵테일과 약 24 시간 동안 배양할 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는 상기 성숙화 칵테일과 약 48 시간 동안 배양할 수 있다.
또다른 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포를 하기를 함유하는 분화 칵테일과 접촉시키는 것을 포함하는, pPS 세포의 imDC 로의 분화 방법을 제공한다: 1) 약 10 ng/ml 내지 약 75 ng/ml 범위의 BMP-4; 및 2) 약 25 ng/ml 내지 약 75 ng/ml 범위의 GM-CSF.
또다른 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포를 하기를 함유하는 분화 칵테일과 접촉시키는 것을 포함하는, pPS 세포의 imDC 로의 분화 방법을 제공한다: 1) 약 10 ng/ml 내지 약 75 ng/ml 범위의 BMP-4; 2) 약 25 ng/ml 내지 약 75 ng/ml 범위의 VEGF; 3) 약 5 ng/ml 내지 약 50 ng/ml 범위의 SCF; 및 4) 약 25 ng/ml 내지 약 75 ng/ml 범위의 GM-CSF.
또다른 구현예에서, 본 발명은, CD45+ Hi 세포 집단 및 CD45+ low 세포 집단을 포함하는 세포 배양으로부터 CD45+ Hi 세포 집단을 단리하는 것을 포함하는, 골수 전구 세포 집단 풍부화 방법을 제공한다. 추가 구현예에서, 본 발명은 CD45+ Hi 세포 집단 및 CD45+ low 세포 집단을 포함하는 세포 배양으로부터 CD45+ low 집단을 단리하는 것을 포함하는, 과립구 전구체 세포의 단리 방법을 제공한다. High 및 low 는 상대적인 용어이다. 따라서, 당업계에 공지된 임의의 검정법, 예를 들어 형광 검출기, 예를 들어 Fluorescent Activated Cell Sorter (FACS) 를 이용하여 측정되는 바와 같은 면역형광으로 측정하여, CD45+ low 세포 집단은 상기 백그라운드에 비해 약 1 내지 2 자릿수의 규모의 CD45 발현이 있는 세포를 지칭할 수 있으며, CD45+ Hi 세포는 백그라운드에 비해 2 자릿수를 초과하는 CD45 발현이 있는 세포를 지칭할 수 있다. 표적 세포 집단을 단리하는 것은 당업계에 공지된 임의의 수단을 이용하여 할 수 있다. 예를 들어, 세포 집단은 시판되어 입수가능한 (FACS) 를 이용하여 단리할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 표지된 리간드를 이용하여 염색되는 마커의 형광 강도를 기준으로 단리될 수 있다. 표지된 리간드는 세포에 직접적으로 결합할 수 있거나, 또는 인간의 손을 거쳐 세포에 결합된 또다른 리간드를 통해 세포에 간접적으로 결합할 수 있다. 세포 집단은 세포 분류기 상의 전방 및 측방 스캐터를 기준으로 크기 및 밀도를 기준으로 단리될 수 있다. 예시로서, CD45+ Hi 및 CD45+ low 집단은 크기 및 과립성을 기준으로 세포 분류기를 이용하여 단리될 수 있다.
본 발명의 각종 구현예를 수행하기에 유용한 싸이토카인 조합은 원하는 효과를 달성하기 위한 임의의 적합한 최종 작용 농도로 사용될 수 있다. 예를 들어, BMP-4 는 약 1 ng/ml 내지 약 120 ng/ml; 약 5 ng/ml 내지 약 100 ng/ml; 약 10 ng/ml 내지 약 80 ng/ml; 약 25 ng/ml 내지 약 75 ng/ml; 약 30 ng/ml 내지 약 60 ng/ml 의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 약 50 ng/ml 의 BMP-4 가 사용될 수 있다. VEGF 는 약 1 ng/ml 내지 약 120 ng/ml; 약 5 ng/ml 내지 약 100 ng/ml; 약 20 ng/ml 내지 약 80 ng/ml; 약 25 ng/ml 내지 약 75 ng/ml; 약 30 ng/ml 내지 약 60 ng/ml 의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 약 50 ng/ml 의 VEGF 가 사용될 수 있다. GM-CSF 는 약 1 ng/ml 내지 약 120 ng/ml; 약 5 ng/ml 내지 약 100 ng/ml; 약 20 ng/ml 내지 약 80 ng/ml; 약 25 ng/ml 내지 약 75 ng/ml; 약 30 ng/ml 내지 약 60 ng/ml 의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 약 50 ng/ml 의 GM-CSF 가 사용될 수 있다. SCF 는 약 1 ng/ml 내지 약 350 ng/ml; 약 5 ng/ml 내지 약 300 ng/ml; 약 10 ng/ml 내지 약 250 ng/ml; 약 15 ng/ml 내지 약 200 ng/ml; 약 20 ng/ml 내지 약 150 ng/ml; 약 5 ng/ml 내지 약 50 ng/ml 의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 약 20 ng/ml 의 SCF 가 사용될 수 있다. FLT3L 은 약 1 ng/ml 내지 약 350 ng/ml; 약 5 ng/ml 내지 약 300 ng/ml; 약 10 ng/ml 내지 약 250 ng/ml; 약 15 ng/ml 내지 약 200 ng/ml; 약 20 ng/ml 내지 약 150 ng/ml 의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 약 20 ng/ml 의 FLT3L 가 사용될 수 있다. IL-3 은 약 1 ng/ml 내지 약 80 ng/ml; 약 5 ng/ml 내지 약 75 ng/ml; 약 10 ng/ml 내지 약 50 ng/ml; 약 20 ng/ml 내지 약 40 ng/ml 의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 약 25 ng/ml 의 IL-3 이 사용될 수 있다. TPO 는 약 1 ng/ml 내지 약 150 ng/ml; 약 5 ng/ml 내지 약 100 ng/ml; 약 10 ng/ml 내지 약 80 ng/ml; 약 20 ng/ml 내지 약 60 ng/ml 의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 약 20 ng/ml 의 TPO 가 사용될 수 있다. IL-4 는 약 1 ng/ml 내지 약 120 ng/ml; 약 5 ng/ml 내지 약 100 ng/ml; 약 20 ng/ml 내지 약 80 ng/ml; 약 25 ng/ml 내지 약 75 ng/ml; 약 30 ng/ml 내지 약 60 ng/ml 의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 약 50 ng/ml 의 IL-4 가 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 여러개의 싸이토카인을 함유하는 성숙화 칵테일이 imDC 을 mDC 로 성숙화하기 위해 사용될 수 있다. 성숙화 칵테일의 싸이토카인 구성원의 적합한 최종 작용 농도는 imDC 를 mDC 로 유효하게 성숙화하는 임의의 농도를 포함할 수 있다. 예를 들어, IFNγ 는 약 1 ng/ml 내지 약 150 ng/ml; 약 5 ng/ml 내지 약 100 ng/ml; 약 10 ng/ml 내지 약 100 ng/ml; 약 15 ng/ml 내지 약 80 ng/ml; 약 20 ng/ml 내지 약 60 ng/ml 의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 약 25 ng/ml 의 IFNγ 가 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서, 약 10 ng/ml 의 IFNγ 가 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 구현에에서, 약 5 ng/ml 의 IFNγ 가 사용될 수 있다. TNFα 는 약 1 ng/ml 내지 약 200 ng/ml; 약 10 ng/ml 내지 약 150 ng/ml; 약 20 ng/ml 내지 약 100 ng/ml; 약 30 ng/ml 내지 약 80 ng/ml; 약 40 ng/ml 내지 약 75 ng/ml 의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 약 10 ng/ml 의 TNFα 가 사용될 수 있다. IL-1β 는 약 1 ng/ml 내지 약 200 ng/ml, 약 5 ng/ml 내지 약 150 ng/ml; 약 8 ng/ml 내지 약 75 ng/ml; 약 10 ng/ml 내지 약 50 ng/m 의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 약 10 ng/ml 의 IL-1β 가 사용될 수 있다. PGE2 는 약 0.1 ug/ml 내지 약 150 ug/ml; 약 0.5 ug/ml 내지 100 ug/ml; 약 0.8 ug/ml 내지 75 ug/ml; 약 1 ug/ml 내지 50 ug/ml 의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 약 1 ug/ml 의 PGE2 가 사용될 수 있다. POLY I:C 는 약 1 ug/ml 내지 50 ug/ml, 약 5 ug/ml 내지 40 ug/ml, 약 10 ug/ml 내지 30 ug/ml, 약 15 ug/ml 내지 25 ug/ml 의 범위의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 약 20 ug/ml 의 POLY I:C 가 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 의 세포가 조혈계의 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 마커 또는 인자를 발현하는, 조혈계 세포에서의 pPS 세포의 분화를 제공한다.
영장류 다능성 줄기 세포 및 그의 분화된 자손을 함유하는 세포 배양
특정 구현예에서, 본 발명은 pPS 세포를 포함하는 세포의 제 1 집단 및 조혈계 세포 및/또는 중배엽 세포를 포함하는 세포의 제 2 집단을 포함하는 세포 배양을 제공한다. 조혈계 세포 및/또는 중배엽 세포는, pPS 세포를 표적 세포 유형, 예를 들어 중배엽 세포, 골수 전구체 세포, 단핵구, 수지상 세포 등으로 분화시키는 것을 선호하는 특이적 성장 조건의 결과로서 배양물 중에 나타날 수 있다. 상기 성장 조건은 하나 이상의 분화 칵테일 (상기에 기재함) 을 제공하는 것을 포함할 수 있고, 일부 구현예에서, 성숙화 칵테일 (상기에 기재함) 을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 세포 배양은 하기한 것들 중 하나 이상이 없을 수 있다: 피더 세포, 간질 세포, 동물 혈청 및/또는 시판되어 입수가능한 혈청 대체물, 예컨대 B27, 및 외인성 IL-3.
일부 구현예에서, 세포의 제 2 집단은 중배엽 세포를 포함할 수 있다. 배 발생에서, 중배엽은 외배엽 및 내배엽 사이에 위치해 있다. 연결 조직, 뼈, 연골, 근육, 조혈계 세포, 혈구 및 혈관, 림프계, 림프구 장기, 척색, 흉막, 심막, 복막, 신장 및 생식샘은 전부 중배엽으로부터 기원한다. 중배엽 세포는 전사 인자 brachyury 의 발현을 포함하여, 각종 마커들을 발현할 수 있다. brachyury 의 발현 수준은, 중배엽 세포로의 분화 전 pPS 세포와 비교시, 약 3 내지 6 배 증가할 수 있다. 중배엽에 대한 다른 마커들에는 goosecoid 가 포함될 수 있다. Goosecoid 는 단백질의 짝지워진 (PRD) 호모박스 (homobox) 패밀리의 비코이드 서브패밀리의 구성원이다. 인코딩된 단백질은 전사 인자로서 작용하고, 자가조절성일 수 있다.
다른 구현예에서, 조혈계 세포는 혈액모세포 세포를 포함할 수 있다. 혈액모세포 세포는 각종 유형의 림프구 세포, 각종 유형의 골수 세포, 및 내피 세포로 추가로 분화하는 능력을 갖는다. 혈액모세포는 CD34 및 CD133 을 발현할 수 있다. Loges 등, (2004). Stem Cells and Development 13 (1): 229. 혈액모세포에 대한 기타 마커에는 키나아제 삽입 도메인 수용체인 FIk-I 가 포함된다.
또다른 구현예에서, 조혈계 세포는 조혈 줄기 세포를 포함할 수 있다. 조혈 줄기 세포는, 림프구 세포 (그의 자손이 T 세포 및 B 림프구를 포함) 및 골수 세포 (그의 자손이 각종 유형의 과립구, 및 단핵구, 마크로파지, DC, 거대핵세포, 혈소판, 적혈구모세포 및 적혈구를 포함) 를 포함하는, 혈구 세포에서 발견되는 임의의 세포 유형으로 분화될 수 있다. 조혈 줄기 세포에 대한 마커에는 CD34+, CD59+, Thyl/CD90+, CD38lo/-, C-kit/CD-/lo 이 포함될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 조혈 줄기 세포와 연관된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 백분율은 약 1% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 17%, 약 10% 내지 약 15% 의 범위이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 세포 배양 중 약 15% 의 세포가 조혈 줄기 세포와 연관된 하나 이상의 마커를 발현한다.
추가 구현예에서, 조혈계 세포는 일반적인 골수 전구 세포를 포함할 수 있다. 골수 전구 세포는, 적당한 성장 조건 하에, 과립구, 단핵구, 마크로파지, DC, 거핵구/적혈구 전구 세포를 포함하는 각종 골수 세포로 분화될 수 있다. 골수 전구 세포에 대한 마커는 CD13, CD34, IL-3Rα (CD123), 및 CD45RA 을 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 골수 전구 세포와 연관된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 백분율은 약 1% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 45%, 약 6% 내지 약 38% 의 범위이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 세포 배양 중의 약 35% 의 세포가 골수 전구 세포와 연관된 하나 이상의 마커를 발현한다.
또다른 구현에에서, 조혈계 세포는 그래뉼로모노싸이트 전구 세포를 포함할 수 있다. 그래뉼로모노싸이트 전구 세포는, 적당한 조건 하에, 과립구, 단핵구, 마크로파지 및 DC 로 분화될 수 있다. 그래뉼로모노싸이트 전구 세포에 대한 마커에는 CD64 (EP0708336) 가 포함될 수 있다.
추가 구현예에서, 조혈계 세포는 단핵구를 포함할 수 있다. 적당한 성장 조건 하에, 단핵구는 DC, 마크로파지 및 과립구 세포로 분화될 수 있다. 단핵구에 대한 마커에는 CD14, CD45hi, CD11a, CD11b, 및 CD15 이 포함된다. 단핵구 형태는 커다란 이엽 (bi-lobed) 핵의 존재를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 단핵구와 연관된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 백분율은 약 1% 내지 약 75%, 약 5% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 65% 의 범위이다. 본 발명의 일부 구현예에서, 세포 배양물 중 약 65% 의 세포가 단핵구와 연관된 하나 이상의 마커를 발현한다.
또다른 구현예에서, 조혈계 세포는 imDC 를 포함할 수 있다. imDC 는 항원을 취하고 가공하는 능력을 갖는다. 적당한 성장 조건 하에, imDC 는 면역학적 컴피턴트 세포에 항원을 제시하기에 적합한 mDC 가 되도록 성숙화를 거질 수 있다. imDC 에 대한 마커에는, CD11chi, CD11b, MHC I, MHC IIlo , CD14-/lo, CD205-, 및 CD83lo 이 포함될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, imDC 와 연관된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 백분율은 약 10% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 99% 일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 세포 배양 중 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10% 의 세포가 imDC 와 연관된 하나 이상의 마커를 발현한다.
또다른 구현예에서, 조혈계 세포는 mDC 를 포함할 수 있다. mDC 는 적당한 자극, 예를 들어 MIP3β 에 응답하여 이동하고, 면역학적 컴피턴트 세포, 예컨대 T 림프구에 항원을 제시하는 능력을 가질 수 있다. mDC 는 세포로부터 발해지는 분지형 돌출부 또는 수지상 조직의 존재를 포함하는 독특한 형태를 가질 수 있다. mDC 에 대한 마커에는, CD83, CCR7, CD11chi, CD205, CD86, CD40, MHC I, MHC II 및 CD14- 이 포함될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, mDC 와 연관된 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 백분율은 약 10% 내지 약 99%, 약 20% 내지 약 99% 의 범위이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 세포 배양 중의 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10% 의 세포가 mDC 와 연관된 하나 이상의 마커를 발현한다.
조직 특이적 마커는 적합한 면역학적 기법, 예컨대 면역 유세포분석 (flow immunocytometry) 또는 세포 표면 마커에 대한 친화성 흡수, 세포내 또는 세포 표면 마커에 대한 (예를 들어, 고정된 세포 또는 조직 섹션의) 면역화학, 세포 추출물에 대한 웨스턴 블롯 분석 및 세포 추출물 또는 배지로 분비된 생성물에 대한 세포 효소 연계 면역검정을 이용하여 검출될 수 있다. 세포에 의한 항원의 발현은, 선택적으로는 세포의 고정 후, 및 선택적으로는 표지된 2 차 항체를 이용하여, 표준 면역세포화학 또는 유세포분석 검정에서, 유의할 검출가능한 양의 항체가 항원에 결합하는 경우 항원 검출가능한 것으로 지칭한다.
조직 특이적 유전자 생성물의 발현은 또한 노던 블롯 분석, 돗트-블롯 혼성화 분석에 의해 또는 공지되어 이용가능한 서열 데이터 (GenBank) 를 이용하는 표준 증폭 방법에서 서열 특이적 프라이머를 이용하는 역전사효소 개시 중합 연쇄 반응 (RT-PCR) 에 의해 mRNA 수준에서도 검출될 수 있다. 단백질 또는 mRNA 수준에서 검출되는 조직 특이적 마커의 발현은, 상기 수준이 미분화 영장류 다능성 줄기 세포의 것에 비해 적어도 약 2 배, 약 10 또는 50 배 초과인 경우, 양성으로 간주한다.
조직 특이적 유전자 생성물의 발현은 또한 노던 블롯 분석, 돗트-블롯 혼성화 분석에 의해 또는 공지되어 이용가능한 서열 데이터 (GenBank) 를 이용하는 표준 증폭 방법에서 서열 특이적 프라이머를 이용하는 역전사효소 개시 중합 연쇄 반응 (RT-PCR) 에 의해 mRNA 수준에서도 검출될 수 있다. 더욱 상세한 사항에 대한 참고문헌은, U.S. 특허 5,843,780. 본 개시에서 열거하는 특별한 마커들에 대한 서열 데이터는 GenBank 와 같은 공중 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. mRNa 수준에서의 발현은, 전형적인 통제 실험에서 표준 과정에 따라 세포 샘플 상에서의 검정 수행이 명백하게 판별가능한 혼성화 또는 중합 생성물을 제공하는 경우, 본 개시에서 기재된 검정들 중 하나에 따라 "검출가능함" 으로 지칭한다. 단백질 또는 mRNA 수준에서 검출되는 것과 같은 조직 특이적 마커의 발현은, 해당 수준이 미분화 영장류 다능성 줄기 세포의 것보다 적어도 약 2 배, 약 10 또는 약 50 배 더 많은 경우, 양성인 것으로 건주된다.
마커가 일단 원하는 표현형의 세포 표면 상에서 식별되면, 이들은 면역확장 (immunopanning) 또는 항체-매개 FACS 와 같은 기법에 의해 집단을 더욱더 풍부화하기 위한 면역선별용으로 이용될 수 있다.
pPS 세포로부터 분화된 DC 의 방사선조사
본 발명은 pPS 세포로부터 시험관내에서 분화된, 즉 pPS 세포의 시험관내 자손인 mDC 또는 imDC 를 포함하는 세포의 집단 및 pPS 세포로부터 시험관내에서 분화된 mDC 또는 imDC 를 포함하는 방사선조사된 세포 배양에 방사선조사하는 방법을 고려한다. 본 발명의 다른 구현예들은 방사선조사된 면역조절 제제 및 그의 제조 방법 뿐만 아니라, mDC 를 포함하는 방사선조사된 세포 집단을 이용하는 면역 응답성의 자극 방법을 고려한다. 본 발명의 또다른 구현예는 방사선조사된 mDC 를 포함하는 키트를 고려한다.
pPS 세포로부터 분화된 mDC 에 방사선조사하는 것은 임의의 추가적인 세포 분열을 억제함으로써, mDC 로 완전하제 분화되지 않은 세포 (예를 들어, pPS 세포) 에 의해 야기되는 테라토마 형성과 같은 임의의 위험을 줄인다. 방사선조사된 mDC 는 방사선조사되지 않은 DC, 예컨대 PBMC 유도성 DC 와 연관된 기능적 특성을 유지할 수 있고, 이에 따라 방사선조사된 mDC 는 면역학적 컴피턴트 세포에 항원을 프로세싱 및 제시하고, 해당 세포가 제시된 항원에 응답하도록 할 수 있다. 방사선조사된 mDC 는 또한 화학주성 자극에 응답하여 이동하는 능력을 유지할 수 있다. 더욱이, 방사선조사된 mDC 는 또한 전형적으로 mDC, 예를 들어 PBMC 유도성 mDC 에서 발견되는 마커의 발현을 계속할 수 있다. 상기 마커들은 HLA-II, HLA-I, 및 CD83 를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 mDC 는 방사선원에 대한 노출 전에 항원 또는 항원을 인코딩하는 핵산과 접촉시킬 수 있다.
일부 구현예에서, mDC 는 항원, 예를 들어 단백질 또는 펩티드와 접촉시킨 후 방사선조사할 수 있다. 다른 구현예에서, mDC 는, 예를 들어 임의의 다른 적합한 트랜스펙션 수단을 이용하여 전기천공 또는 접촉시키고, RNA 분자와 같은 핵산과 접촉시킨 후 방사선조사할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 핵산과 접촉시킨 후, 약 24 시간 동안 (예를 들어 37℃ 및 5% CO2 에서) 휴지시킬 수 있다. 이어서, 세포를 임의의 적합한 극저온 배지 (예를 들어, DMSO 를 함유하는 것) 에 위치시킨 후, 약 -80℃ 에서 냉동시킬 수 있다. 이어서, 냉동된 세포들은 방사선조사하고 (예를 들어, 드라이 아이스 상에서), 이후 추가 사용이 필요할 때까지 냉동하여 (예를 들어 액체 질소 중에서) 저장할 수 있다.
임의의 적합한 방사선조사원이 본 발명에 따라 mDC 에 방사선조사하기 위해 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 방사선원은 이온화 방사선원일 수 있다. 한 예시로서, X-선은 적합한 방사선원을 제공할 수 있다. 적합할 수 있는 기타 유형의 방사선은 UV 조사, 예를 들어 감마 조사를 포함할 수 있다.
pPS 세포로부터 시험관내에서 분화된 mDC 를 함유하는 세포 집단은 적합한 길이의 시간 동안, 예를 들어 세포 분열이 억제될 만큼 방사선조사될 수 있다. 파라미터, 예컨대 방사선조사 투여량, 세포 집단 크기 및 노출 시간은 경험적으로 최적화될 수 있고, 이어서 방사선조사 후 세포를 배양하고 세포가 분열을 계속하는지 여부를 결정함으로써 시험할 수 있다. 세포 분열의 결정은 혈구계수기를 이용해 세포를 수동으로 계수하여 수행할 수 있다. 대안적으로, 자동화된 세포 계수기를 이용할 수도 있다.
방사선원이 X-선인 경우, 적합한 방사선 조사량은 약 300 rad 내지 약 3500 rad; 약 400 rad 내지 약 3000 rad; 약 500 rad 내지 약 2500 rad; 약 500 rad 내지 약 2000 rad; 약 400 rad 내지 약 1500 rad 의 범위일 수 있다. 한 구현예에서, 약 2000 rad 가 mDC 를 포함하는 세포 집단에 적용된다. 또다른 구현예에서, 약 1500 rad 이 mDC 를 포함하는 세포 집단에 적용된다. 추가 구현예에서, 약 1000 rad 이 mDC 를 포함하는 세포 집단에 적용된다. 또다른 구현예에서, 약 500 rad 이 mDC 를 포함하는 세포 집단에 적용된다.
방사선원이 UV 조사인 경우, 적합한 조사량은 약 10 J/m2 내지 약 3,000 J/m2; 약 20 J/m2 내지 약 2,000 J/m2; 약 25 J/m2 내지 약 1,500 J/m2; 약 30 J/m2 내지 약 500 J/m2; 약 50 J/m2 내지 약 200 J/m2 의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 약 50 J/m2 이 이용될 수 있다. 또다른 구현예에서, 약 100 J/m2 이 이용될 수 있다. 또다른 구현예에서, 약 200 J/m2 이 이용될 수 있다. 또다른 구현예에서, 약 300 J/m2 이 이용될 수 있다. 또다른 구현예에서, 약 500 J/m2 이 이용될 수 있다.
방사선원이 X-선인 경우, 세포는 방사선원에 대한 노출 전에 적합한 배지 또는 완충액에 현탁될 수 있다. 적합한 배지는 줄기 세포의 성장 또는 분화에 이용가능한 임의의 시판되는 배지를 포함할 수 있다. 예시로서, AIM V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 가 사용될 수 있다. 적합한 완충액은 임의의 등장성 완충액, 예를 들어 PBS 를 포함할 수 있다. 사용되는 배지의 부피는 방사선조사될 세포 집단의 크기에 좌우될 것이다. 약 3.0 x 1O5 내지 약 4.O x 1O5 의 범위의 세포 집단에 대해, 적합한 부피는 배지 또는 완충액의 약 5 내지 20 ml 의 범위일 수 있다. 한 구현예에서, 약 15 ml 의 배지 또는 완충액이 사용될 수 있다.
방사선원이 UV 광인 경우, 세포는 조직 배양 플라스크와 같은 기판에 결합되어 성장하고 방사선원에 노출될 수 있다. 세포는 방사선에 대한 노출 동안 적합한 완충액 또는 배지에서 유지될 수 있다.
한 구현예에서, 약 3.0 x 105 세포 내지 약 4.0 x 1O5 세포 범위의 세포 집단이 X-선 광원으로부터 약 2000 rad 로 방사선조사된다. 또다른 구현예에서, 약 3.0 x 105 세포 내지 약 4.0 x 1O5 세포 범위의 세포 집단은 X-선 광원으로부터 약 1500 rad 로 방사선조사된다. 또다른 구현에에서, 약 3.0 x 105 세포 내지 약 4.0 x 1O5 세포 범위의 세포 집단은 X-선 광원으로부터 약 1000 rad 로 방사선조사된다. 또다른 구현에에서, 약 3.0 x 105 세포 내지 약 4.0 x 1O5 세포 범위의 세포 집단은 X-선 광원으로부터 약 500 rad 로 방사선조사된다. 세포들은 pPS 세포로부터 시험관내에서 분화된 mDC 를 포함하여 이루어질 수 있다.
또한, 세포 분열 억제에 적합한 화학적 제제는 방사선원을 대체할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, pPS 세포로부터 시험관내에서 분화된 mDC 를 포함하는 세포 집단은 세포 분열 억제에 적합한 화학적 제제와 접촉시킬 수 있다. 적합한 화합물의 예시에는, 화학치료제, 예컨대 미토마이신 C 및 시스플라틴이 포함된다. 다른 적합한 화학물에는 다음의 하나 이상이 포함될 수 있다: 아라비노사이드, 플루오로-데옥시유리딘 및 유리딘.
수지상 세포 제조계
특정 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 성숙형 수지상 세포의 시험관내 제조를 위한 계를 고려한다: a) pPS 세포를 포함하는 제 1 단리 세포 집단, 및 b) 상기 제 1 세포 집단의 일부의 시험관내 자손인 성숙형 수지상 세포를 포함하는 제 2 단리 세포 집단.
다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 유사분열 불활성 항원제시 세포 제조계를 고려한다: a) pPS 세포를 포함하는 제 1 단리 세포 집단, 및 b) 상기 제 1 세포 집단의 일부의 시험관내 자손인 유사분열 불활성화 성숙형 수지상 세포를 포함하는 제 2 단리 세포 집단.
mDC 는 pPS 세포의 일부로부터 시험관내에서 분화될 수 있고, pPS 세포를 포함하는 제 1 단리 세포 집단의 일부는 비축되어 유지될 수 있으며, 시험관내에서의 세포의 제 1 집단을 분화시킴으로써 더 많은 제 2 단리 집단을 만들기 위해 이용될 수 있다. 상기 계는, pPS 세포를 포함하는 제 1 세포 집단이 본원에 기재된 방법을 이용하여 DC 로 분화될 수 있는 집단의 일부, 및 장래의 이용을 위해 보존, 예를 들어 미분화된 상태로 배양 중에 유지 또는 분취물로 (적합한 배지 중에) 냉동하고 -80℃ 또는 액체 질소에 저장할 수 있는 집단의 일부를 포함할 수 있음을 고려한다. pPS 세포는 배양 중에서 미분화된 (다능성) 상태에서 무한 복제할 수 있기 때문에, 상기 계는 본원에 기재된 방법에 따라 분화된 DC 의 무제한 공급을 제공하는 수단을 제공한다. 더욱이, DC, 예를 들어 pPS 로부터 시험관내에서 분화된 imDC 는 또한 배양 중에서 복제할 수 있으므로, 상기 계는 추가적인 DC 를 생산할 수 있는 제 2 집단을 제공한다. 따라서, 상기 계는 DC 와 같은 단일 생성물을 지속적으로 대량 제조하는 수단을 제공한다. 상기 계는 또한 집단들 중 하나 또는 두가지 모두가 상기 기재된 바와 같이 유사분열 불활성화되어 있는 구현예를 포함한다.
pPS 세포를 포함하는 세포의 제 1 집단 및 DC 세포를 포함하는 세포의 제2 집단의 두가지 모두의 특징적인 마커 및 형태는 본원에 기재된다. DC 세포는 관심대상의 항원, 예를 들어 종양 항원, 예컨대 hTERT 를 로오딩한 mDC 일 수 있다. 상기 DC 세포는 세포를 유사분열적으로 불활성화하기 위해 본 발명에 따라 방사선조사될 수 있고, 따라서 DC 를 포함하는 세포의 제 2 집단에 존재할 수 있는 pPS 세포의 임의의 잠재적인 위험을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 의 mDC 가 CD83, CD86, MHC II 및 CCR7 로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현할 수 있다.
키트
특정 구현예에서, 본 발명은 면역 응답성을 자극하기 위한 키트를 제공한다. 한 구현예에서, 상기 키트는 pPS 세포 및 DC 를 포함하는 세포 배양, 및 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 키트는 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다: a) 면역 응답성을 자극하기 위한 지시사항; b) DC 를 배양하기 위한 지시사항; c) 성숙화 칵테일로서, 제공되는 DC 가 imDC 인 것; c) 하나 이상의 적합한 배양 용기; d) 면역 응답성을 자극하기 위한 하나 이상의 항원; e) 하나 이상의 면역학적 컴피턴트 세포; 및 f) 자극된 면역 응답성을 측정하기 위한 적합한 시약. 상기 키트는 시험관내 또는 생체내에서 면역 응답성을 자극하기 위해 이용될 수 있다. DC 는 imDC 또는 mDC 일 수 있다. 일부 구현예에서, DC 는 냉동되어 제공될 수 있다. 세포는 액체 질소 중에 냉동되거나 또는 약 -140℃ 로 저장될 수 있다. 대안적으로, DC 는 냉장, 예를 들어 약 4℃ 에서 포장 및 저장될 수 있다. 성숙화 칵테일은 미리 혼합되거나 또는 각각의 구성원들이 따로따로 포장되어 공급될 수 있다. 항원은 단백질 또는 펩티드 또는 핵산, 예를 들어 항원을 인코딩하는 DNA, RNA 로서 제공될 수 있다. 키트는 또한 DC 에 항원을 로오딩하기 위한 지시사항을 제공할 수 있다. 로오딩은 면역학적 컴피턴트 세포에 제시되도록 DC 를 항원에 접촉시키는 것을 지칭한다. 키트는 추가로, DC 와 항원의 접촉을 위해, DC 와 면역학적 컴피턴트 세포의 접촉을 위해, 배양에서 DC 를 성장시키기 위한 지시사항을 포함할 수 있다. 자극된 면역 응답성에 대한 적합한 시약은 세포 증식 측정을 위한 3H 티미딘, 항원에 대한 면역 응답 동안 분비되는 싸이토카인, 예컨대 IL-2, IFN 을 포함할 수 있다.
또다른 구현예에서, 키트는 pPS 세포로부터 시험관내에서 분화된 방사선조사된 mDC 및 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 임의로는, 키트는 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다: a) 면역 응답성을 자극하기 위한 지시사항; b) 면역 응답성을 자극하기 위한 하나 이상의 미리 로오딩된 항원; c) 하나 이상의 면역학적 컴피턴트 세포; 및 d) 자극된 면역 응답성을 측정하기 위한 적합한 시약. 키트는 시험관내에서 또는 생체내에서 면역 응답성을 자극하기 위해 이용될 수 있다. 미리 로오딩된 항원은 단백질 또는 펩티드로서 또는 핵산, 예를 들어 항원을 인코딩하는 DNA, RNA 로서 제공될 수 있다. 로오딩은 면역학적 컴피턴트 세포에 제시되도록 DC 와 항원을 접촉시키는 것을 지칭한다. 자극된 면역 응답성을 검출하기 위해 적합한 시약은 세포 증식을 측정하기 위한 3H 티미딘, 항원에 대한 면역 응답 동안 분비된 싸이토카인에 대한 항체, 예컨대 IL-2, IFN 을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은, 화학적으로 처리된 mDC 가 방사선조사된 mDC 를 대체할 수 있는, 상기 기재된 바와 같은 키트를 제공한다. 화학적으로 처리된 mDC 는 세포 분열 억제에 적합한 화학적 제제와 접촉시킨 mDC 일 수 있다. 적합한 화학적 제제는 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C 를 포함할 수 있다.
ES-분화된 조혈계 세포의 용도
본 발명은 조혈 및/또는 중배엽 계의 여러개의 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 세포 집단은 많은 중요한 연구, 개발 및 상업적 목적에 이용될 수 있다.
스크리닝
본 발명의 세포는, 상기 세포 및 그의 각종 자손의 특성에 영향을 주는 인자들 (예컨대, 용매, 소분자 약물, 펩티드, 올리고뉴클레오티드) 또는 환경 조건 (예컨대, 배양 조건 또는 취급) 에 대한 스크리닝을 위해 시판되어 이용될 수 있다. 특징들은 세포의 표현형 또는 기능적 특성을 포함할 수 있다.
일부 적용에서, pPS 세포 (미분화 또는 분화된) 는 이후 단계의 조혈 전구체 또는 최종적으로 분화되는 세포로의 성숙화를 촉진하거나 또는 상기 세포의 장기간 배양에서의 증식 및 유지를 촉진하는 인자들을 스크리닝하기 위해 이용된다. 예를 들어, 후보 성숙화 인자 또는 성장 인자들은 이들을 상이한 웰들 중의 세포에 첨가한 후 초래되는 임의의 표현형 변화를 추가 배양 및 세포의 이용에 대한 바람직한 기준들에 따라 측정함으로써 시험된다.
본 발명의 기타 스크리닝 적용은 조혈계 세포 및/또는 중배엽 세포에 대한 그들의 유효성에 대한 약제학적 화합물의 시험에 관한 것이다. 화합물이 세포에 대한 약학적 유효성을 갖도록 고안되었거나, 또는 화합물이 해당 조직 유형의 세포에 의도하지 않는 부작용을 가질 수도 있는, 예상 밖의 유효성을 갖도록 고안되었기 때문에, 스크리닝이 수행될 수 있다. 기타 스크리닝 적용은, 발암성 또는 기타 독성 유효성에 대해 화합물을 스크리닝하는 것을 포함할 수 있다. 표적 화합물이 표적 세포에 대해 유리하거나 또는 해로운 효과를 갖는지 여부를 결정하기 위해, 상기 스크리닝은 본 발명의 임의의 전구체 세포 또는 최종 분화된 세포를 이용해 수행될 수 있다.
표준 교과서, In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997 를 일반적으로 참조한다. 후보 약제학적 화합물의 활성 평가는 일반적으로 상기 후보 화합물을, 단독으로 또는 다른 약물과 병용하여, 본 발명의 세포와 조합하는 것을 수반한다. 연구자들은 화합물에 기인하는 (비처리 세포 또는 불활성 화합물로 처리한 세포와 비교함) 세포의 형태, 마커 표현형, 또는 기능에서의 임의의 차이를 결정하고, 이어서 관찰된 차이를 해당 화합물의 유효성과 연관시킨다.
세포독성은 제 1 경우에서 세포 생존력, 생존, 형태 및 특정 마커 및 수용체의 발현에 대한 유효성에 의해 결정될 수 있다. 염색체 DNA 에 대한 약물의 유효성은 DNA 합성 또는 회복을 측정하여 결정될 수 있다. 특히 세포 주기에서의 계획하지 않은 시점에, 또는 세포 복제에 필요한 수준을 넘어선 [3H]-티미딘 또는 BrdU 혼입은 약물 유효성과 일치한다. 원하지 않는 유효성은 또한 중기 확산 (metaphase spread) 으로 결정되는, 비정상적인 자매 염색분체 교환 비율을 포함할 수 있다. 추가 상세사항에 대해서는, A. Vickers (In vitro Methods in Pharmaceutical Research, Academic Press, 1997 의 pp 375-410) 를 참조한다.
유효성이 관찰된 경우, 화합물의 농도는 적가하여 중간 유효 투여량 (ED50) 을 결정할 수 있다.
면역 응답성의 조절
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 세포, 예를 들어 pPS 세포로부터 분화된 DC 를 항원과 접촉시키는 것을 포함하는, 항원에 대한 면역 응답성을 자극하는 방법을 제공한다. 상기 항원은 단백질 또는 펩티드를 포함하여 이루어질 수 있거나, 또는 대안적으로는 핵산, 예를 들어 DNA, RNA 를 포함하여 이루어질 수 있다. 항원이 단백질 또는 펩티드인 경우, 수지상 세포는 단백질 또는 펩티드를 취하고, 그것을 MHC 의 맥락에서 제시하기 위해 프로세스한다. 전형적으로는, 프로세싱은 항원이 MHC 의 그루브에 맞게 되도록 하는 단백질가수분해를 포함한다. 항원이 단백질인 경우, DC 세포는 imDC 일 수 있다. 항원이 전장 단백질의 펩티드 절편인 경우, DC 는 mCD 일 수 있다. 항원이 핵산인 경우, 본 발명은 세포질로의 전달을 위해 핵산을 세포막에 통과시켜 수송하기 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하는 것을 고려한다. 한 구현예에서, 핵산이 세포막을 통과하도록 세포를 전자천공할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포를 항원에 접촉시키기 위해 전자천공을 이용하는 경우, 적합한 세포는 imDC 일 수 있다. 다른 구현예에서, 세포를 항원에 접촉시키기 위해 전자천공을 이용하는 경우, 적합한 세포는 mDC 일 수 있다. 세포는 다음의 파라미터를 이용하여 Gene Pulse Xcell (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 를 이용해 전자천공할 수 있다: 300 V, 15O uF, 및 1OO Ohms. 단백질 발현 수준은 유세포분석 또는 웨스턴 블롯 방법으로 결정될 수 있다. 전자천공된 세포가 imDC 인 경우, 세포는 본원에 기재된 바와 같이 성숙화 칵테일과 접촉시킬 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이 imDC 는 imDC 로 성숙화된다.
또다른 구현예에서, 항원을 인코딩하는 핵산을 세포, 예를 들어 mDC, imDC 로 수송하기 위해 바이러스 벡터가 이용될 수 있다. 바이러스 벡터가 세포를 항원에 접촉시키기 위해 이용하는 경우, 적합한 세포는 imDC 일 수 있다. 적합한 바이러스 벡터의 예시에는, 아데노바이러스 벡터 및 pox 바이러스 벡터가 포함된다. 다른 구현에에서, 시판되어 입수가능한 트랜스펙션 시약이, 항원을 인코딩하는 핵산을 세포로 수송하기 위해 이용될 수 있다. 적합한 예시에는 카티온성 지질 제형물, 예컨대 Lipofectamine® 가 포함된다.
본 발명은 임의의 공급원 유래의 항원의 이용을 고려한다. 따라서, 항원은 종양 항원, 에컨대 인간 텔로머라아제 역전사효소 (reverse transcriptase) 또는 감염제, 예컨대 바이러스 박테리아 또는 기생 동물로부터 발현되는 항원일 수 있다.
이어서, mDC 를, 생체내에서 또는 시험관내에서, 면역 컴피턴트 세포, 예컨대 림프구와 접촉시킬 수 있다. 림프구의 면역 응답성은 면역학적 컴피턴트 세포의 세포 증식 (예를 들어, 3H 티미딘 혼입) 및/또는 mDC 또는 면역학적 컴피턴트 세포에 의한 싸이토카인 (예를 들어, IL-2, IFN, IL-6, IL-12) 제조를 측정하여 모니터링할 수 있다. 상기 연구들은 항원에 대한 면역 응답성의 유형 및 정도를 맞춤하기에 유용할 수 있다. 상기 연구들은 또한 가장 적당한 면역 응답성을 이끌어내기 위한, 항원의 최선의 에피토프를 선별함에 있어 유용할 수 있다. 면역 응답성은 시험관내에서 또는 적당한 동물 모델을 이용하여 생체내에서 자극될 수 있다.
치료 투여용 세포 조성물의 적합성을 결정하기 위해, 세포는 먼저 적합한 동물 모델에서 시험할 수 있다. 적합한 동물 모델은 인간화된 면역계를 가진 마우스를 포함할 수 있다. 참고문헌은, 예를 들어 Goldstein (2008) AIDS Res Ther 5(1):3. 특이적 항원에 대해 준비된 mDC 는 동물에게 투여하여 동물이 해당 항원에 대한 특이적인 면역 응답성을 서서히 증가시키는지 여부를 결정할 수 있다. 상기 동물 및 DC 는 MHC I 위치에서 매치되거나 또는 부분적으로 매치될 수 있다. 항원 및 세포의 투여량, 투여 및 제형물은 연구하여 항원에 대한 면역 응답성을 맞춤할 수 있고, 림프계에서의 투여된 세포의 이동은 모니터링될 수 있다. 면역 응답성의 정도는 항원에 대한 응답에서의 싸이토카인 제조 및 림프구 증식의 측면에서 특징으로 할 수 있다. 동물은 항원에 대한 항체 응답성 뿐만 아니라 임의의 이례적인 면역 반응, 예를 들어 과민감성, 자가면역 반응에 대해 모니터링될 수 있다. 생성된 항체는 연구 시약 또는 치료제로서의 용도를 위해 단리될 수 있다.
imDC 는 항체 특이적 용인성을 유도하는 것으로 공지되어 있고, 참고문헌은, 예를 들어 Cools 등, (2007) J Leukoc Biol 82(6): 1365 이다. 따라서, imDC 는, 본원에 기재된 바와 같이, 대상체에서의 용인성을 유도하기 위해 사용될 수 있다. imDC 세포는 본원에 기재된 바와 같이 항원, 예를 들어 단백질 또는 펩티드 항원 또는 항원을 인코딩하는 핵산과 접촉시킬 수 있다. 이어서, 세포는 대상체에서의 용인성을 유도하기 위해 대상체에 투여될 수 있다. 대안적으로, imDC 는 mDC 로 성숙화될 수 있고, 면역 응답성 자극에 이용될 수 있다.
조혈 세포의 재건
본 발명에 따라 제조된 조혈계 세포는 대상체에서의 하나 이상의 조혈 세포 집단의 재건에 이용될 수 있다. 예시로서, 골수 전구 세포는 결핍된 세포 집단을 재건하여 혈구감소증과 연관된 하나 이상의 징후를 개선하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 골수 전구체는 혈소판 수가 적거나 또는 혈구수가 적은 대상체의 상태 개선에 이용될 수 있다. 또다른 예시에서, 조혈계 세포, 예컨대 골수 전구세 세포는 유전적 결함, 예컨대 혈병형성 인자와 관련된 결핍이 있는 대상체의 하나 이상의 징후를 개선하기 위해 이용될 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 일부 구현예에 따라 제조된 세포는 혈병형성 인자, 예컨대 인자 VIII 또는 인자 IX 의 수준을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 또다른 구현예에서, 조혈계 세포는 HIV 가 있는 환자에서의 림프구 집단, 예를 들어 CD4 림프구 집단을 재건하기 위해 이용될 수 있다.
인간에 대한 투여
본 발명에 따라 제조된 mDC 는 기능면에서 PBMC 로부터 단리된 mDC 와 필적할만하다. 예를 들어, 본 발명의 mDC 는 항원을 프로세스 및 제시할 수 있고; 특이적 항원의 제시에 응답하여 T 세포 증식을 자극할 수 있고, 표적 세포의 항원 특이적 T 세포 매개 세포 용해를 유도할 수 있다. 추가적으로, 본 발명에 따른 mDC 의 기능은 심지어 방사선조사 후에도 유지된다. 따라서, 본 발명의 mDC 는, 미분화된 세포 및 병원체성 제제에 대한 노출의 위험을 최소화하면서도, 특이적 항체에 대한 면역 응답성을 자극하기 위해 인간 대상체에 대한 투여를 위한 DC 의 공급원을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 mDC 는 대상체에서의 면역 응답성을 자극하기 위해 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 투여 전, imDC 는 관심대상의 항원과 접촉시키고, 이어서 mDC 로 성숙화될 수 있다. 항원은 그것이 MHC I 및/또는 MHC II 의 맥락에서 세포 표면 상에 제시되도록 내재화되고 가공될 수 있으며, 따라서 항원에 대한 특이적인 면역 응답성을 자극할 수 있다. 일부 구현예에서, 특이적인 면역 응답성은 치료 유효성을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 면역 응답성은 예방 유효성을 제공할 수 있다. 또다른 구현예에서, 특이적 면역 응답성은 항원 특이적 세포, 예컨대 세포독성 T 세포 또는 B 림프구 또는 항원을 특이적으로 인식하는 항원의 공급원을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 세포의 투여는 정맥내, 피내 또는 근육내 주사에 의한 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는 피하로 주사될 수 있다. 세포는 적당한 완충액, 예컨대 PBS 및/또는 적당한 부형제와 제형화될 수 있다. 세포는 적합한 아쥬반트와 제형화될 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예시는 문헌 Remington 's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000 에 기재되어 있다.
의약 제형물에서의 일반적인 원칙을 위해, 다음의 문헌을 참고한다: Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, G. Morstyn & W. Sheridan 편저, Cambridge University Press, 1996; 및 Hematopoeitic Stem Cell Therapy, E, D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000. 세포 부형제 및 조성물의 임의의 동반 구성원들의 선택은 투여 경로 및 투여에 사용되는 기구에 따라 채택될 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 선택적으로는 바람직한 목적, 예컨대 질환 상태 개선하거나 또는 면역 응답성 자극을 위한 조혈계 세포 기능의 재건에 대해 기재한 지시사항과 함께 적합한 용기에 포장될 수 있다.
기타 용도
본 발명의 세포는 다른 계열로부터의 세포에서 우세하게 발현되는 cDNA 로 비교적 오염되지 않는 cDNA 라이브러리를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 조혈계 세포는 1000 rpm 에서 5 분 동안 원심분리하여 수집한 후, mRNA 를 제조하고, 역전사시킨다. 조혈계 세포의 발현 패턴은 기타 세포 유형, 예를 들어 pPS 세포와, Fritz 등의 문헌 (2000) Science 288:316 에서 일반적으로 개요한 마이크로어레이 분석에 의해 비교할 수 있다. 세포는 이들이 분화한 부모 pPS 세포주와 실제적으로 유전자적으로 동일하기 때문에, 이들은 조혈계 세포의 분화 및 성숙에 수반되는 유전자 연구용으로는 특별히 잘 맞는 시스템이다. 예를 들어, 부모 세포주 및 조혈 자손 유래의 핵산 라이브러리를 제조할 수 있고, 공제 혼성화 (subtractive hybridization) 를 채용하여 자손 세포의 분화 및 성숙화에 중요한 유전자들을 단리할 수 있다.
본 발명의 세포의 분화는 또한 조혈계 세포의 마커에 대해 특이적인 항체 제조에 이용될 수 있다. 폴리클로날 항체는 척추동물에게 면역원 형태의 본 발명의 세포를 주입하여 제조할 수 있다. 모노클로날 항체의 제조는 Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, U.S. 특허 4,491,632, 4,472,500 및 4,444,887, 및 Methods in Enzymology 73B:3 (1981) 과 같은 표준 참고문헌에 기재되어 있다.
영장류 다능성 줄기 세포
본 발명은 pPS 세포의 조혈계 세포로의 분화 방법을 제공한다. pPS 세포에는 임의의 영장류 다능성 세포를 포함한다. 다능성 세포는, 적당한 성장 조건 하에, 중배엽, 내배엽 및 외배엽의 3 개의 기본적인 배엽층 각각으로부터 하나 이상의 세포 유형을 형성할 수 있다. pPS 세포는 예비 배아 (pre-embryonic), 배아, 또는 태아 조직 또는 성숙형 분화된 세포로부터 기원할 수 있다. 대안적으로, 확립된 pPS 세포주는 본 발명의 수행을 위한 세포의 적합한 공급원일 수 있다. 전형적으로는, pPS 세포는 악성 (malignant) 공급원으로부터 유도되지 않는다. pPS 세포는 면역 결핍 마우스, 예를 들어 SCID 마우스에 이식될 경우 테라토마를 형성할 것이다.
현미경 하에서, 영장류 다능성 줄기 세포는 높은 핵/세포질 비율, 두드러진 핵소체, 및 세포 연결을 알아보기 힘든 압축된 집락 형성과 함께 보인다. 영장류 다능성 줄기 세포는 전형적으로는 단계-특이적 태아성 항원 (SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81 로 지정된 항체를 이용하여 검출가능한 마커를 발현한다. 미분화 인간 배아 줄기 세포도 또한 전형적으로는 전사 인자 Oct-3/4, Cripto, 가스트린-방출 펩티드 (GRP) 수용체, 포도칼릭신-형 단백질 (PODXL), nanog 및 RT-PCR 로 검출되는 텔로머라아제 역전사효소, 예를 들어 hTERT (US 2003/0224411 Al) 를 발현한다.
본 발명의 임의의 구현예에 사용될 수 있는 pPS 세포에는, 이에 제한되지 않으나, 배아 줄기 세포, 예컨대 인간 배아 줄기 세포 (hES) 가 포함된다. 배아 줄기 세포는 영장류 종의 배반포로부터 단리될 수 있다 (U.S. 특허 5,843,780; Thomson 등,(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844,). hES 세포는 예를 들어, 하기 문헌에 기재된 기법을 이용하여 인간 배반포 세포로부터 제조될 수 있다: U.S. 특허 6,200,806; Thomson 등, (1998) Science 282:1 145; Thomson 등 (1998) Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff. 및 Reubinoff 등, (2000) Nature Biotech. 18:399.
기타 영장류 다능성 줄기 세포 유형에는, 이에 제한되지 않으나, WO 01/51610 에 기재되어 있는 원시 외배엽-형 (EPL) 세포 및 인간 배아 생식 (hEG) 세포 (Shamblott 등, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726) 가 포함된다.
본 발명의 임의의 구현예에 사용하기에 적합한 pPS 세포에는 또한 유도된 영장류 다능성 줄기 (iPS) 세포가 포함된다. iPS 세포는, pPS 세포의 표현형을 획득하도록, 예를 들어 하나 이상의 적당한 벡터를 이용한 트랜스펙션으로 유전자적으로 개질된 세포를 지칭한다. 상기 핵초기화 세포에 의해 획득되는 표현형 특성에는, 배반포로부터 단리된 줄기 세포를 닮은 형태, 표면 항원 발현, 유전자 바현 및 모든 유사한 배반포 유도성 세포인 텔로머라아제 활성이 포함된다. iPS 세포는, 각각 기본적인 하기 각 배엽의 하나 이상의 세포 유형으로 분화하는 능력을 가질 수 있다: 외배엽, 내배엽 및 중배엽. iPS 세포는 또한 면역-결핍 마우스 예를 들어 SCID 마우스에 주입되는 경우 테라토마를 형성할 수 있다 (Takahashi 등, (2007) Cell 131(5):861 ; Yu 등, (2007) Science318: 1917).
본 발명에 사용되는 배아 줄기 세포는 확립된 배아 줄기 세포주로부터 선택될 수 있거나, 또는 1 차적인 배아 조직으로부터 직접 수득될 수 있다. 이에 제한되지 않으나, 하기를 포함하는 다수의 배아 줄기 세포주가 확립되어 있다: H1, H7, H9, H13 또는 H14 (Thompson 의 참고문헌); hESBGN-01, hESBGN-02, hESBGN- 03 (BresaGen, Inc., Athens, GA); HES-I, HES-2, HES-3, HES-4, HES-5, HES-6 (from ES Cell International, Inc., Singapore); HSF-I, HSF-6 (from University of California at San Francisco); I 3, 1 3.2, 1 3.3, 1 4, 1 6, 1 6.2, J 3, J 3.2 (Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel 에서 유도함); UCSF-I 및 UCSF-2 (Genbacev 등, (2005) Fertil. Steril. 83(5): 1517); 세포주 HUES 1-17 (Cowan 등, (2004) NEJM 350(13): 1353); 및 세포주 ACT-14 (Klimanskaya 등, (2005) Lancet, 365(9471):1636).
특정 구현예에서, 본 발명에 사용된 pPS 세포는 피더가 없는 방식으로 유도될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Klimanskaya 등, (2005) Lancet, 365(9471): 1636). 특정 구현예에서, pPS 는 무혈청 환경에서 사용 전에 배양될 수 있다.
영장류 다능성 줄기 세포에 대한 배양 조건
pPS 세포는 당업게에 공지된 각종 물질, 배지 및 기타 보충물 및 인자들을 이용하여 배양될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 기판에는 하기에서의 하나 이상의 것을 포함하여 이루어지는 매트릭스가 포함된다: 라미닌, 콜라겐, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 헤파린 설페이트 프로테오글리칸. 일부 구현예에서, 매트릭스는 Matrigel™ (BD Biosciences, San Jose, CA) 로 시판되어 입수가능한 쥐과동물 EHS 육종 유래의 기저막의 가용성 추출물을 함유할 수 있다. 다른 구현에에서, 매트릭스는 인간, 인간화된, 또는 쥐과동물 기원의 하나 이상의 단리된 매트릭스 단백질, 예를 들어 CELLstart™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 포함할 수 있다. 영장류 다능성 줄기 세포는 분화는 저해하면서 증식은 촉진하는 배양 조건 하에 배양 중에서 계속하여 번식할 수 있다. 예시 배지는 80% DMEM (예컨대, Knock-Out DMEM, Gibco), 20% 의, 규정 우태아 혈청 (FBS, Hyclone) 또는 혈청 대체물 (US 2002/0076747 Al, Life Technologies Inc.), 1% 불필수 아미노산, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM β-메르캅토에탄올을 이용해 제조될 수 있다. 기타 적합한 배지에는 X-VIVO™ 10 (Lonza, Walkersville, MD) 와 같은, 무혈청 규정 배지가 포함된다.
특정 구현예에서, pPS 세포는 첨가되는 피더 세포 없이 미분화 상태에서 유지될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 (2004) Rosier 등, Dev. Dynam. 229:259). 피더가 없는 배양은 전형적으로는 분화 없이 세포의 증식을 촉진하는 인자들을 함유하는 영양 배지에 의해 지지된다 (참고문헌은, 예를 들어 U.S. 특허 6,800,480). 특정 구현예에서, 상기 인자들을 함유하는 조건화된 배지가 사용될 수 있다. 조건화된 배지는 해당 배지를 그러한 인자들을 분비하는 세포와 배양하여 수득될 수 있다. 적합한 세포에는, 방사선조사된 (약 4,000 rad) 1 차적인 마우스 배아 섬유아세포, 텔로머화된 마우스 섬유아세포, 또는 영장류 다능성 줄기 세포로부터 유도된 세포 (U.S. 특허 6,642,048) 가 포함된다. 배지는 20% 혈청 대체물 및 4 ng/mL bFGF 으로 보충한 KO DMEM 와 같은 무혈청 배지에서 피더를 플레이팅하여 조건화될 수 있다. 1 내지 2 일 동안 조건화된 배지에는 추가로 bFGF 를 보충하고, pPS 세포 배양을 1 내지 2 일 동안 지지하기 위해 사용된다 (참고문헌은, 예를 들어 WO 01/51616; Xu 등, (2001) Nat. Biotechnol 19:971, 2001).
대안적으로, 신선한 또는 비-조건화 배지가 사용될 수 있는데, 여기에는 미분화 형태의 세포의 증식을 촉진하는 첨가 인자 (섬유아세포 성장 인자 또는 포르스콜린과 같은) 를 보충한다. 예시는, X-VIVO™ 10 (Lonza, Walkersville, MD) 또는 QBSF™-60 (Quality Biological Inc. Gaithersburg, MD) 와 같은, bFGF 로 40 내지 80 ng/mL 를 보충하고, 임의로는 SCF (15 ng/mL), 또는 Flt3 리간드 (75 ng/mL) (참고문헌은, 예를 들어 Xu 등, (2005) Stem Cells 23(3):315) 를 포함하는 기본 배지이다. 상기 배지 제형물은 다른 시스템에서의 속도보다 2 내지 3 배 세포 성장을 지지해 준다는 장점을 갖는다 (참고문헌은, 예를 들어 WO 03/020920). 일부 구현예에서, pPS 세포, 예컨대 hES 세포는 bFGF 및 TGFβ 를 함유하는 배지에서 배양될 수 있다. bFGF 의 적합한 농도에는 약 80 ng/ml 가 포함된다. TGFβ 의 적합한 농도에는 약 0.5 ng/ml 가 포함된다. 기타 시판되어 입수가능한 배지 제형물이 본 발명의 특정 구현예에서 사용될 수 있다. 적합한 배지 제형물에는, X-VIVO™ 15 (Lonza, Walkersville, MD); mTeSR™ (Stem Cell Technologies,Vancouver, CA); hTeSR™ (Stem Cell Technologies,Vancouver, CA), StemPro™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 Cellgro™ DC (Mediatech, Inc.,Manassas,VA) 이 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 영장류 다능성 줄기 세포는 15,000 세포/cm-2 를 초과하여 (최적으로는 90,000 cm-2 내지 170,000 cm-2) 로 플레이팅될 수 있다. 전형적으로는, 효소 소화는 세포를 완전히 분산시키기 전에 중단될 수 있다 (예를 들어, 콜라게나아제 IV 를 사용해서는 약 5 분). 이어서, 약 10 내지 2,000 개 세포의 무리가 추가적인 분산없이 적합한 기판 상에 직접 플레이팅될 수 있다. 대안적으로, 세포는, 세포를 약 5 분 동안 PBS 중의 0.5 mM EDTA 의 용액에서 인큐베이션하거나, 또는 플레이트로부터 원하는 세포를, 예컨대 스크래핑하거나 또는 가느다란 피펫을 이용한 단리로 단순히 떼어내어, 플레이트가 컨플루언트에 도달하기 전에 효소없이 수합될 수 있다. 배양 용기로부터의 세척 후, 세포는 추가 분산없이 새로운 배양으로 플레이팅될 수 있다. 추가 설명을 하자면, 피더 없이 배양된 컨플루언트 인간 배아 줄기 세포는 0.05% (wt/vol) 트립신 (Gibco®, Carlsbad ,CA) 및 0.05 mM EDTA 의 용액과 5 내지 15 분 동안 37℃ 에서 인큐베이션하여 플레이트로부터 떼어낼 수 있다. 플레이트에 남은 세포는 제거할 수 있고, 세포들을 단독 세포들 및 작은 클러스터들을 포함하는 현탁액으로 부서지게 할 수 있고, 이후 50,000 내지 200,000 세포/cm2 의 밀도로 플레이팅하여, 생존 및 제한 분화를 촉진한다.
특정 구현예에서, pPS 세포는 일반적으로 배아 또는 태아 조직으로부터 유도된 섬유아세포인 피더 세포의 층 상에서 배양될 수 있다 (Thomson 등, (1998) Science 282: 1145). 특정 구현예에서, 상기 피더 세포는 인간 또는 쥐과동물 공급원으로부터 유도될 수 있다. 인간 피더 세포는 각종 인간 조직으로부터 단리될 수 있거나 또는 인간 배아 줄기 세포의 섬유아세포로의 분화에 의해 유도될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 WO O1/51616). 특정 구현예에서, 사용될 수 있는 인간 피더 세포에는, 이에 제한되지 않으나, 태반 섬유아세포 (참고문헌은, 예를 들어 Genbacev 등, (2005) Fertil. Steril. 83(5): 1517), 난관 내피 세포 (참고문헌은, 예를 들어 Richards 등, 92002) Nat. Biotechnol., 20:933), 포피 섬유아세포 (참고문헌은, 예를 들어 Amit 등, (2003) Biol. Reprod. 68:2150), 자궁 내막 세포 (참고문헌은, 예를 들어 Lee 등, (2005) Biol. Reprod. 72(1):42) 가 포함된다.
본 발명의 실행에서, 세포 배양에 이용될 수 있는 각종 고체 표면이 있다. 그러한 고체 표면들에는, 이에 제한되지 않으나, 표준 시판 세포 배양 플레이트, 예컨대 6-웰, 24-웰, 96-웰 또는 144-웰 플레이트가 포함된다. 기타 고체 표면에는, 이에 제한되지 않으나, 마이크로캐리어 및 디스크가 포함된다. 특정 구현예에서, 마이크로캐리어는 비드이다. 상기 비드는 여러가지 형태, 예컨대 세포 결합을 증가시키기 위한 양전하가 있는 Cytodex Dextran 마이크로캐리어 비드, 세포 결합을 위한 젤라틴/콜라겐 코팅된 비드, 및 세포 결합을 위한 상이한 다공성을 지닌 마크로포러스 마이크로캐리어 비드로 되어 있다. Cytodex dextran, 젤라틴-코딩 및 마크로포러스 마이크로캐리어 비드는 시판되어 입수가능하다 (Sigma-Aldrich, St. Loius, MO or Solohill Engineering Inc., Ann Arbor, MI). 특정 구현예에서, 비드는 크기가 90 내지 200 μm 이고, 면적이 350 내지 500 cm2 이다. 비드는 각종 재료, 예컨대, 이에 제한되지 않지만, 유리 또는 플라스틱으로 이루어질 수 있다. 특정 구현에에서, 디스크는 세포의 결합을 위해 교반 탱크 생물 반응기에 이용될 수 있다. 디스크는 New Brunswick Scientific Co, Inc. (Edison, NJ) 와 같은 회사에서 판매한다. 특정 구현예에서, 디스크는 Fibra-cel Disks 로, 폴리에스테르/폴리프로필렌 디스크이다. 상기 디스크 1 그램은 1200 cm2 의 표면적을 제공한다.
pPS 세포 성장에 적합한 고체 표면은, 이에 제한되지 않지만, 유리 또는 플라스틱, 예컨대 폴리스티렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리카르보네이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 멜리넥스 또는 테르마녹스로 제조될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 고체 표면은 형태상 3 차원의 것일 수 있다. 예시되는 3 차원 고체 표면은, 예를 들어 US 20050031598 에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 세포는 본 발명 동안 단독-세포 현탁액 중에 있다. 단독 세포 현탁액은, 이에 제한되지 않으나, 스피너 플라스크, 진탕기 플라스크 또는 퍼멘터에서의 배양을 포함하는 각종 방식으로 수행될 수 있다. 사용될 수 있는 퍼멘터에는, 이에 제한되지 않으나, Celligen Plus (New Brunswick Scientific Co, Inc., Edison, NJ), 및 STR 또는 Stirred-Tank Reactor (Applikon Inc., Foster City, CA) 이 포함된다. 특정 구현예에서, 생물 반응기는 배지로 계속하여 살포될 수 있거나 또는 주입-뱃치 방식으로 사용될 수 있다. 생물 반응기는 2.2 L, 5 L, 7.5 L, 14 L 또는 20 L 를 포함하는 상이한 크기로 존재한다.
일반적인 기법
본 발명의 실행에 유용한 일반적인 기법의 추가적인 수식을 위해, 실무자는 세포 생물학, 조직 배양, 발생학 및 면역학 분야의 표준 교과서 및 개론서를 참고할 수 있다.
조직 및 세포 배양 및 배아 줄기 세포에 관해, 당업계에서 입수가능한 임의의 여러개의 출판물, 예를 들어, Terato carcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (EJ. Robertson, 편저, IRL Press Ltd. 1987); Guide to Techniques in Mouse Development (P.M. Wasserman 등 편저, Academic Press 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (M. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225:900, 1993); Properties and Uses of Embryonic Stem Cell: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (P. D. Rathjen 등, Reprod. Fertil. Dev. 10:31, 1998; 및 R.I. Freshney, Culture of Animal Cells, Wiley-Liss, New York, 2000) 을 참고할 수 있다. 조혈계 세포의 생물학에 관해, 임의의 면역학 교과서, 예를 들어 Immunobiology: The Immune System in Health and Disease (Janeway 등, 2001 Garland Publishing) 를 참고할 수 있다.
영장류 다능성 줄기 세포의 확립된 세포주로부터 유도되는 경우, 본 발명의 세포 집단 및 단리된 세포는 그들이 유도되어 온 세포주와 동일한 게놈을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는, 영장류 다능성 줄기 세포 및 분화된 자손 세포 사이에서 염색체 DNA 가, RFLP 또는 SNP 분석에서 본질적으로 동일하다는 것을 의미한다 (세포가 인공적으로 유전자조작되지 않았음을 가정함). 예를 들어 비-코딩 영역에서의 변경과 같은 미미한 변화가 가능하지만, pPS 세포주 및 각각의 자손 사이의 유전자적 동일성은 동일 쌍생아에서 나타나는 것에 필적할 만하다는 것이 이해될 것이다.
분화된 세포의 유전자 변경
본 발명의 세포는 분화 전후로 세포의 유전자적 조작에 의해 하나 이상의 유전자 변경을 포함하도록 될 수 있다 (US 2002/0168766 Al). 예를 들어, 일부 구현예에서, 세포는 그들이 제한된 발생 계통 세포 또는 최종 분화 세포로 진행되기 전후에, 세포를 텔로머라아제 역전사효소를 발현하도록 유전자적으로 변경하여 그의 복제 잠재성을 증가시키도록 프로세스될 수 있다 (US 2003/0022367 A1).
본 발명의 세포는 또한 면역 응답성 조절에 수반되는 그의 능력을 증강시키거나 또는 투여 부위에 대한 치료 유전자의 전달을 증각시키기 위해 유전자적으로 변경될 수 있다. 벡터는, 분화된 세포 유형에서 특이적으로 활성이거나 또는 범특이적인 프로모터에 작동적으로 연결된, 원하는 유전자에 대한 공지된 인코딩 서열을 이용하여 고안된다. 대안적으로, 프로모터는 유전자 변경의 때에 알맞은 발현을 허용하는 유도성 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 세포는 응답성을 증강시키거나 또는 응답성을 약화시킴으로써 면역 응답성을 조절하는 싸이토카인을 발현하도록 유전자적으로 조작될 수 있다.
하기 실시예에서, 인간 배아 세포 (hES) 를 이용한 모든 실험은 확립된 hES 세포주를 이용하여 수행했다.
도 1A 는 pPS 세포를 mDC 로 분화시키기 위해 사용된 분화 프로토콜의 도식적 다이어그램을 제공한다.
도 IB 는 X- VIVO™ 10 배지에서 성장시킨 hES 세포의 광학현미경 영상의 사진이다.
도 1C 는 미분화 hES 에서 나타나는 각종 마커들의 발현 수준을 나타내는 유세포분석 히스토그램이다.
도 2 는 배아체 및 선구 세포 (하단 좌측 패널) 의 현미경사진이다.
도 3A 및 3B 는 분화 중인 세포 배양에서 경시적인 각종 전사 인자의 발현을 나타내는 그래프이다.
도 3C 는 분화 중인 세포 배양에서의 유세포분석에 의해 측정된 경시적인 CD34 및 CD45 의 발현을 보여준다.
도 3D 는 포낭 배아체의 현미경사진이다.
도 3E 는 분화 중인 세포 배양에서의 유세포분석으로 측정된 경시적인 CD13 및 CD14 의 발현을 보여준다.
도 3F 는 유세포분석으로 측정한 CD45hi 집단 (상단 2 개 패널) 및 CD45lo 집단 (하단 2 개 패널) 의 두가지 모두에서의 CD14 의 발현을 보여준다.
도 3G 는 유세포분석으로 측정한 CD45hi 집단에서의 CD11c, CD11b, CD83, CD86 (하단 2 개 패널), HLA-I 및 HLA-II (상단 우측 패널) 의 발현을 보여준다. 상단 좌측 패널은 CD45hi 및 lo 집단의 게이팅을 보여준다.
도 4A 는 imDC 에 대한 마커의 유세포분석 히스토그램 분석을 보여준다.
도 4B 는 mDC 에 대한 마커의 유세포분석 히스토그램 분석을 보여준다.
도 4C 는 경시적으로 세포 배양 분화에서의 전사 인자 발현을 나타내는 그래프이다.
도 4D 는 DC 클러스터의 현미경사진이다.
도 4E 는 메이 그룬발트 (May Grunwald) 염료로 염색한 DC 의 현미경사진이다.
도 5A 는 수지상 세포 (R1) (상단 패널) 에 대한 유세포분석에 의한 세포의 게이팅을 나타내며, 수지상 세포에 대해 게이트된 세포 집단이 모델 항원 DQ-OVA (하단 패널) 을 취해 단백질가수분해 프로세스를 진행할 수 있다는 것을 증명한다.
도 5B 는 DC 가 유행성 이하선염 항원을 프로세스 및 제시하여 T 림프구에 의한 IFNγ 생산을 유도할 수 있다는 것을 보여주는 그래프이다 .
도 6A 내지 C 는 imDC 및 mDC 의 싸이토카인 프로파일을 비교하는 그래프이다.
도 6D 는 MIP3β 에 응답하는 DC 이동을 나타내는 그래프이다.
도 7A 는 mDC 가 혼합 림프구 반응 (MLR) 에서 동종 세포를 자극할 수 있음을 보여주는 그래프이다.
도 7B 는 mDC (ES-DC) 에 의해 HLA-A2 상에 제시된 CMV 펩티드 항원에 응답하는, 효과기 T 세포에 의한 IFN-γ 분비의 자극을 보여주는 그래프이다.
도 7C 는 mDC (ES-DC) 에 의해 HLA-A2 상에 제시된 CMV 펩티드에 대한 응답하는, CFSE 표지된 T 림프구 증식의 유세포분석을 보유준다.
도 8 은 mDC (hES-DC) 에 의해 HLA-A2 상에 제시된 hTERT 펩티드 항원에 대해 응답하는, 효과기 T 세포에 의한 IFN-γ 분비의 자극을 보여주는 그래프이다.
도 9 는 mDC 에 의해 HLA-A2 상에 제시된 hTERT 펩티드 항원에 응답하는, CFSE 표지된 T 림프구 증식의 유세포분석을 보여준다.
도 10 은 펩티드 항원으로 펄스되거나 또는 펄스되지 않은, 방사선조사된 mDC (hES-DC) 와 비-방사선조사된 mDC (hES-DC) 에 의한 항원 특이적 T 세포 응답의 자극을 비교하는 그래프이다.
도 11 은 방사선조사된 mDC (hES-DC) 와 비-방사선조사된 mDC (hES-DC) 의 화학주성 리간드 MIP3β 에 응답하는 DC 이동을 비교하는 그래프이다.
도 12 는 X-Vivo-10™ 또는 mTeSR™ 배지에서 성장한 hES 세포에서의 mDC 수율을 비교하는 그래프이다.
도 13 은 hES 세포로부터 시험관 내에서 분화되고 Cellgro™ 또는 X Vivio-15™ 배지에서 성숙화된 DC 의 표면 마커 발현을 비교하는 그래프이다.
도 14 는 Cellgro™ 또는 X-Vivo-15™ 에서 배양된 hES 유도성 mDC 의 세포 이동을 비교하는 그래프이다.
도 15 는 성숙화 칵테일에 대한 외인성 IL-4 의 첨가 존재 또는 부재 하의, Cellgro™ 또는 X-Vivo-15™ 배지에서 배양된 hESC 유도성 DC 로부터의 IL-12 생산을 비교하는 그래프이다.
도 16 은 GFP 로 트랜스펙션된 mDC; hTERT-LAMP 로 트랜스펙션된 mDCS 와 공동인큐베이션한 TERT 특이적 T 세포 및 단독적인 T 세포 (mDC 세포와의 공동인큐베이션 않음) 로부터의 IFNγ 생산을 비교하는 그래프이다.
실시예
실시예 1: 분화 칵테일을 다양화한 hES 세포에서 mDC 로의 분화
본 실시예에서, pPS 세포는, 먼저 pPS 세포를 분화 칵테일과 함께 배양하여 imDC 를 수득하고, 이어서 imDC 를 성숙화 칵테일과 함께 배양함으로써 mDC 로 분화되었다. 분화 칵테일은, imDC 단계로 세포가 분화할 때 실험 과정에 걸쳐 변화하는 외인성 싸이토카인을 함유했다 (도 1a). 인간 ES 세포주 H1 (Thomson 등, (1998) Science 282: 1 145) 을 동물 유도성 생성물 없이 규정 무혈청 배지에서 피더 없이 배양했다 (Xu 등, (2001) Nat Biotechnol 19:971; Li 등, (2005) Biotechnol Bioeng 91 :688) (도 1b). 세포는 또한 분화 및 성숙화 프로토콜 내내 간질 세포 없이 배양했다.
hES 세포를 배아체 (EB) 형성을 허용하는 조건 하에 배양했다. 간략하게, Hl 세포를 콜라게나아제 D (Invitrogen, Carlsbad, CA) 로 처리하고, 1 X PBS 로 1 회 세척하고, 세포 스크레이퍼 (Corning Life Sciences, Corning, NY) 를 이용하여 세포를 플레이트로부터 조심스럽게 긁어냈다. 이어서, 세포를 6 웰 울트라 로우 결합 플레이트 (Corning Life Sciences, Corning, NY) 에 웰 당 3 백만개의 세포로 하여, 1 mM Na-피루베이트 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1x 불필수 아미노산 (Invitrogen, Carlsbad), CA, 2 mM L-글루타민 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 5 x 10-5 M 2-메르캅토에탄올 (Sigma, St Louis, MO), 및 10 mM HEPES (Invitrogen, Carlsbad, CA) 를 보충한 X-VIVO 15 배지 (Lonzo, Walkersville, MD) 중에 플레이팅하고, 배아체가 형성되도록 했다. 하기의 성장 인자들을 배지에 첨가했다: SCF (20 ng/ml), VEGF (50 ng/ml), BMP-4 (50 ng/ml), 및 GM-CSF (50 ng/ml). 모든 성장 인자들은 R&D Systems (R&D Systems, Minneapolis MN) 에서 구입했다. 각 웰은 4 ml 의 배지를 포함했다. 세포에는 매 2 내지 3 일마다 1:3 배지 교환하여 주입했다.
5 일 째에 BMP-4 를 성장 인자 칵테일로부터 제외하고, 10 일째에 VEGF 를 성장 인자 칵테일로부터 제외하고, 15 일째에는 SCF 를 성장 인자 칵테일로부터 제외했다 (도 1A). 대략 d17 내지 d25 정도에, 둥글고 빛나는 조혈 전구 세포가 보였다 (도 2). 웰에서 약 100,000 내지 약 1 백만개의 떠다니는 빛나는 전구체 세포가 보일 때, 이들을 수합하고, 스핀 다운시키고, 본래의 6 웰 울트라 로우 결합 플레이트에 다시 시딩하고, GM-CSF (50 ng/ml) 및 IL-4 (50 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN) 가 있는 X-VIVO 15 (Lonzo, Walkersville, MD) 에서 배양하여 imDC 를 생성했다. 본래의 EB 를 약 40 내지 50 일 동안 새로운 6 웰 울트라 로우 결합 플레이트에 옮겨 놓고, GM-CSF (50 ng/ml) 를 함유하는 배지를 매 2 내지 3 일마다 (1:3 배지 교환) 주입하고, 빛나는 조혈 세포 생산을 계속하고, 이것을 수합하고, 이후 GM-CSF 및 IL-4 을 이용해 추가 배양 및 분화시켜 추가적인 imDC 를 제조했다.
hES 세포에 대한 유세포분석은 다음과 같이 수행했다: 세포를 50 μl 의 Flow 완충액 (PBS + 0.1% BSA + 2 mM EDTA) 에 재현탁시키고, 항-FC 수용체 항체 (Miltenyi, Aurburn, CA) 를 이용하여 10 분 동안 4℃ 에서 블로킹하고, 이어서 표적 마커에 대한 항체를 첨가했다 (항체는 하기 표 1 에 제공함). 20 분 동안 4℃ 에서 인큐베이션 후, 세포를 Flow 완충액으로 2 회 세척하고, 5 분 후 시료마다 시료 분석 2 ul 7AAD (0.25 ug/1x106 세포) (BD Bioscience, San Jose, CA) 를 첨가하여 세포 생존력을 평가했다. 시료 데이터를 FACSCalibur™ (Becton Dickinson, San Jose, CA) 를 이용하여 수집하고, FlowJo® 소프트웨어 (Treestar, Ashland, OR) 를 이용하여 분석했다. 세포내 Oct-4 염색에 대해서, 세포는 세포내 고정 완충액 (eBioscience, San Diego, CA) 을 이용하여 고정하고, 제조사의 지시에 따라 투과 완충액 (eBioscience, San Diego, CA) 을 이용하여 투과성으로 만들었다. 예상한 바와 같이, 세포는 hES 세포의 두 마커 Oct-4 및 SSEA-4 를 발현했다. 추가로, 세포는 VEGF 에 대한 두 수용체 Flt-I 및 Flk-I 뿐만 아니라, SCF 에 대한 수용체 CD117 도 발현했다. GM-CSF 수용체인 CD116 는 검출되지 않았다 (도 1C).
imDC 는 하기 마커들에 대해 유세포분석 (상기 기재된 바와 같음) 으로 분석했다: CD 14, HLA-I, HLA-II, CD83, CD205 및 CD11b. 세포는 HLA-I, HLA-II, CD83, 및 CD11b 에 대해 양성인 것으로 나타났다 (도 4A). 4 내지 6 일 후, 상기 미숙형 DC 를 스핀 다운시키고, 하기 싸이토카인 IFN-γ (25 ng/ml), IL-I -β (10 ng/ml), TNF-α (10 ng/ml), PGE2 (1 μg/ml) 및 GM-CSF (50 ng/ml) 을 함유하는 X-VIVO 15 배지 (성숙화 칵테일) 에 재현탁시켰다. 세포를 추가로 48 시간 동안 배양 중에서 유지하여 성숙화 DC 를 생성했다. mDC 는 FAC (상기 기재된 바와 같음) 로 분석하고, 하기의 마커들을 발현하는 것으로 나타났다: HLA-I, HLA-II, CD40, CD86, CD83, CD205, CD11chi, 및 CCR7. 세포는 CD14 에 대해 음성이었다 (도 4B). CD83 은 수지상 세포 성숙화에 대한 마커이다. CCR7 은 DC 이동에 수반되는 케모카인 수용체이다. 발현 프로파일은 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 로부터 유도된 DC 에 필적했다. 세포는 또한 하기의 전사 인자 발현에 대해 실시간 정량적 PCR 로 분석했다: NF-κB, CIITA 및 Spi-B (도 4C). Spi-B 는 PBMC 로부터 유도된 DC 에서 발현되는 것으로 나타났다 (Schotte 등, (2003) Blood 101(3):1015; Rissoan 등, (2002) Blood 100(9):3295; Schotte 등, (2004) J. Exp. Med. 200(11): 1503; Chicha 등, (2004) J. Exp. Med. 200(11): 1519. NF-κB 는 공동자극 분자 발현과 연관되어 있고, DC 활성화 프로세스에 필요하다. CIITA 는 HLA-II 발현의 마스터 조절자이다.
세포를 형태적으로 분석했고, DC 의 전형적인 형태를 갖는 것으로 나타났다 (도 4D). mDC 의 형태를 더 연구하기 위해, 세포를 May-Grunwald 염색으로 염색했다. 세포를 1 x PBS 로 세척하고, 50 ul 의 1 x PBS 에 재현탁시키고, 싸이토스핀 기구를 이용해 제작한 유리 슬라이드 상에 추가했다. 10 ul 의 세포 현탁액을 슬라이드에 적용했다. 슬라이드를 1200 rpm 에서 5 분 동안 ShandonCytospin3 (Thermo Scientific, Waltham MA) 을 이용해 스피닝했다. 이어서, 세포를 May Grunwald 염색 용액 (Sigma, St Louis, MO) 으로 5 분 동안 25℃ 에서 염색하고, dH2O 로 3 회 세척하고, 밤새 공기건조시켰다. 시료 영역을 Permount® (Sigma, St Louis, MO) 로 코팅하고, 유리 커버 슬립을 적용하고, 슬라이드를 밤새 건조되도록 했다. 100x 평면 대물렌즈 및 4Ox Plan-Neofluar 대물렌즈 (Zeiss, Peabody, MA) 가 있는 업라이트 현미경으로 영상을 찍었다. 도 4E 에 나타낸 결과는 mDC 가, 분지형 돌출부 및 세포로부터 나온 수상돌기들을 포함하는 PBMC 로부터 단리된 수지상 세포의 전형적 형태를 가졌음을 증명했다. 세포는 또한 CD19, CD3, CD235a 및 CD41 (각각 B 세포, T 세포, 적혈구, 및 혈소판, 거대핵구의 표식임) 에 대해 유세포분석 (상기에 기재된 바와 같음) 으로 분석했으나, 이들 마커 전부에 대해 미검출로 나타났다. 제제는 5 내지 20% 과립구 및 5 내지 20% 전구체 세포를 갖는 것으로 나타났다. 세포 집단은 약 50% 내지 약 90% DC 의 범위였다.
실시예 2: 분화중인 세포 배양의 시간 경과 분석
pPS 의 imDC 로의 분화 프로세스 동안 일어나는 전구체 세포 집단을 특징분석하기 위해, 실시예 1 에 기재된 세포 배양을 RT PCR 및 실시간 정량 PCR (하기에 기재된 바와 같음) 및 유세포분석 (상기 기재된 바와 같음) 을 이용하여 세포 표면 마커의 발현에 대해 경시적으로 전사 인자 발현에 대해 평가했다.
실시간 정량적 PCR 을 위해, 표적 세포를 수합하고, 전체 RNA 를 표준 Qiagen RNeasy® Mini Prep 프로토콜 (Qiagen, Valencia, CA) 에 따라 단리했다. Qiagen QiaShredder (Qiagen, Valencia, CA) 는 세포용해물을 균질화하기 위해 이용했다. 단리된 RNA 는 -80℃ 에서 저장했다. cDNA 합성을 위해, 1 μg RNA 시료를 DNase (Ambion, Austin TX) 로 처리해, RNA 제제로부터 임의의 게놈 DNA 불순물을 제거했다. 역전사효소 PCR (RT-PCR) 을 Superscript II™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) 제 1 가닥 합성 시스템 (first strand synthesis system) 을 이용하여 수행해 cDNA 를 제조했다. cDNA 생성물을 물에서 1:5 로 희석하고, Taqman® PCR Cycle Threshold (CT) Real Time Quantitation (Applied Biosystems, Foster City, CA) 을 위한 템플레이트로서 사용했다. 시료를 Applied BioSystems 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) 상에서 진행시켰다. 제 0 일째의 표적 시그널에 대해 표적 시그널을 정규화하여, 데이터를 상대적인 발현 수준에 대해 분석했다. 도 3a 및 3b 는 결과를 제공한다. 5 일째까지, Oct-4 의 발현은 20 배 감소했다. 5 일째까지 brachyury 의 5 배 증가는, 세포가 중배엽으로 분화했음을 표시했다. FIk-I 은 조혈 줄기 세포에서 발견된다. FIk-I 의 발현 증가는 조혈 세포 집단의 분화를 시사했다. Tie-2 의 발현은 혈액모세포의 분화를 시사했다. 혈액모세포는 조혈 및 내피 잠재성의 두가지 모두를 가진 세포를 포함하여 이루어진다.
도 3b 은 경시적으로 추가적인 전사 인자의 발현 수준을 보여준다. HoxB4 및 Gata2 의 두가지의 발현 수준 증가는, 세포가 조혈 세포 집단으로 분화했음을 시사했다. HoxB4 는 조혈 줄기 세포 갱신 및 생존에서 한 역할을 한다 (Antonchuk 등, (2002) Cell 109(l):39. Gata2 는 GMP 에서도 발현되는 조기 조혈 전사 인자이다.
유세포분석은 실시예 1 에 기재된 바와 같이 수행했다. 모든 유세포분석 실험에 사용된 항체들은 하기 표 1 에 제시한다.
Figure pat00001
도 3c 및 3d 는 CD45 및 CD34 의 발현에 대한 경시적인 유세포분석 연구의 결과를 보여준다. 5 일째까지의 CD34 이 발현은 조기 조혈의 표식이다. 5 일째까지, 배양의 형태는 포낭성 배아체의 출현을 포착했다 (도 3e). 15 일째까지, 범-조혈 세포 마커 CD45 의 발현이 분명해졌다. 동시에, 전사인자 PU.1 가 실시간 정량 PCR 로 검출되었다 (도 3b). PU.1 발현이 조기 조혈 세포에서 나타났고, 그의 발현 수준은 세포가 수지상 세포로 분화함에 따라 감소했다 (Guerriero 등, (2000) Blood/95(3): 879; Nutt 등, (2005 J Exp. Med. 201(2):221). 골수 계열 마커 CD 13 발현은 15 일이 되자 명확해졌다 (도 3F). 이는 그 시점까지 SCF 가 분화 칵테일로부터 제거되었고, 세포들은 이미 조혈 및 골수 계열에 진입했음을 시사했다. 단핵구 마커 CD 14 는 20 일째에 발현되었다 (도 3F). CD 13 및 CD 14 의 두가지 모두의 발현은 시간에 따라 증가했다 (도 3F).
20 일째에, 배양 내에 2 개의 CD45+ 집단이 있음이 분명해졌다: CD45hi 및 CD45lo (도 3G). CD14 의 발현은 CD45hi 집단에서 경시적으로 증가했다. 32 일째에, 65% 의 세포가 CD14 및 CD45 를 발현했다. CD14 발현은 CD4510 집단에서는 보이지 않았다 (도 3G). 정방향 분산 대 측방향 분산 곡선에서, CD45hi 집단은 (R1) 로 지칭한 단핵구/수지상 세포 게이트에서의 세포와 상관관계가 있었으며, CD45lo 집단은 (R2) 로 지칭한 과립구 전구체 세포 게이트와 상관관계가 있었다 (도 3G). CD45hi 집단은 32 일째에, 분화 프로토콜로 추가 특징분석했으며, CD11c, CD11b, HLA-I, HLA-IIlo/neg 및 CD86 에 대해 양성인 것으로 나타나 (도 3H), 이들은 전부 세포가 imDC 임을 시사했다. CD86 은 T-세포 활성화에 수반되는 공동자극 분자이고, CD83 은 mDC 마커이다. CD83 발현이 없음은 세포가 mDC 이 아님을 나타낸다.
실시예 3: 항원 프로세싱 및 제시
hES 유도성 imDC 가 항원을 프로세스하는 능력을 시험하기 위해, 형광 염료, DQ-OVA (Invitrogen, Carlsbad, CA) 를 PBS 에 1 mg/ml 로 용해시키고, 실시예 1 에 기재된 바와 같이 유도된 imDC 에 100 μg/ml 로 첨가했다. 단백질은 pH 불감성 BODIPY-F1 염료로 표지했다. 상기 염료는 단백질이 온전한 경우 자체 소광되지만, 단백질이 변성되거나 또는 단백질가수분해를 겪는 경우, 밝은 녹색 형광을 낸다. 세포를 37℃ 또는 4℃ (백그라운드 형광을 위한 대조군) 에서 인큐베이션하고, 유동 완충액으로 2 회 세척했다. 데이터는 FL1 에서 FACSCalibur™ (Becton Dickinson, San Jose, CA) 로 수집했다. 대조군 세포는 그렇지 않았지만, 처리한 세포는 형광으로 나타나, 해당 단백질이 imDC 에 의해 단백질가수분해되었음을 나타냈다 (도 5a).
후속하여, 실시예 1 의 방법에 따라 제조한 DC 가, 후천적 면역 응답성의 한 특징인 IFNγ 의 항원 특이적 림프구 분비를 자극할 수 있는지 여부를 알아보기 위해 관능 검정을 수행했다. 이하선염 단백질 (Biodesign, Saco, ME) 을 자극 항원으로서 이용했다. 실시예 1 에 기재된 바와 같이 hES 로부터 유도된 imDC 에 상기 단백질을 1 시간 동안 100 ug/ml 로 첨가했다. 기재한 성숙화 칵테일은 조기에 IFN-γ (25 ng/ml), IL-I-β (10 ng/ml), TNF-α (10 ng/ml), PGE2 (1 μg/ml) 및 GM-CSF (50 ng/ml) 를 후속해 첨가했다. 24 시간 후, 이하선염 단백질로 처리하지 않거나 또는 처리한 성숙화 DC 를 수집하고, AIM-V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 로 2 회 세척했다. DC 를 1x105 PBMC/웰 (Cellular Technologies LTD, Shaker Heights, OH) 과 함께 1x104 세포/웰로 플레이팅했다. IFNγ ELISPOT 플레이트 (Millipore Corp. Bedford, MA) 는 검독용으로 이용했다. ELISPOT 플레이트는 항-IFNγ Ab (Mabtech, Mariemont, OH) 을 1O ug/ml 으로 밤새 (16 내지 24 시간) 코팅했다. 검정 플레이트는 37℃ 및 5% CO2 에서 16 내지 24 시간 동안 두고, Mabtech 에서 제공하는 지시사항에 따라 현상시켰다. 스팟들은 CTL 분석기 (Cellular Technology Limited, Decatur, IL) 를 이용하여 카운팅했다. 도 5B 에 제시된 결과는 본 발명의 mDC 에 의해 IFNγ 생산이 비-처리 대조군에 비해 3 배 차이남을 증명한다.
실시예 4: 싸이토카인 제조
Human Cytokine Array III 및 V 키트 (Raybiotech, Norcross, GA) 를 이용해, 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 수득된 imDC 및 mDC 의 두가지 모두에 대해 정량적 싸이토카인 어레이 분석을 수행했다. 상기 검정은 제조사의 지시사항에 따라 수행했다. mDC 는 하기의 전염증성 싸이토카인을 제공하는 것으로 나타났다: IL-6, IL-7, IL-8, 및 11-10. IL-7 는 T 세포 생존에 중요할 것으로 여겨진다. IL-8 은 화학주성 자극으로 여겨진다. 싸이토카인 IL-6, IL-1O 및 IL-12 는 제조사의 지시사항에 따라 BD Cytometric Bead Array (BD Biosciences, San Jose, CA) 를 이용하여 정량했다. hES 로부터 유도된 미숙형 및 성숙형 DC 로부터의 상청액을 수집하고, Amicon Ultra-15 10,000 NMWL (Millipore, Bedford, MA) 원심분리관을 이용하여 농축했다. 상청액을 인간 IL-6, IL-10, 및 IL-12 비드 플렉스 셋트 (BD Biosciences, San Jose, CA) 에 추가하고, 1 시간 동안 25℃ 에서 인큐베이션했다. PE (BD Biosciences, San Jose, CA) 에 콘쥬게이션한 항체 검체 시약을 첨가하고, 추가 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션했다. 시료를 1 회 세척하고, 세척 완충액 (BD Biosciences, San Jose, CA) 에 재현탁시키고, FACSCaliber™ (Becton Dickinson, San Jose, CA) 를 이용한 유세포분석으로 수집했다. 싸이토카인 농도를 FCAP 어레이 소프트웨어 (BD Biosciences, San Jose CA) 를 이용하여 결정했다. 도 6A 에 제시된 결과는 유의한 수준의 세가지 모든 싸이토카인이 mDC 에 의해 제공된다는 것을 증명한다.
실시예 5: mDC 의 화학주성 분석
AIM-V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 를 8.0 uM 포어 크기 삽입체 (Corning, Corning, NY) 를 포함하는 Transwell 24 웰 플레이트의 상단 및 하단 챔버에 추가하고, 37℃, 5% CO2 에서 밤새 인큐베이션했다. 각 웰에서의 배지 제거 후, 케모카인 MIP3β (100 ng/ml) 의 존재 또는 부재 하의 0.6 ml 의 AIM-V 를 하단 챔버에 첨가했다. hES 로부터 유도된 성숙형 DC (실시예 1 에 기재된 바와 같음) 를 수합하고, AIM-V 배지에서 2 회 세척했다. 세포를 AIM-V 배지에 2.0 x 106 세포/ml 로 재현탁시키고, 0.1 ml 를 상단 챔버에 첨가했다. 트랜스웰 플레이트를 2 시간 동안 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션했다. 바닥 챔버에 이동한 세포의 갯수를 혈구계수기를 이용하여 측정했다. 도 6D 에 제시된 결과는 본 발명에 따른 mDC 가 MIP3β 에 응답하여 이동했음을 증명한다.
실시예 6: 수지상 세포의 면역자극 역량
실시예 1 의 방법에 따라 제조된 mDC 의 면역 응답성을 자극하는 능력을 특징분석하기 위해 몇가지 검정을 수행했다. 먼저, 혼합된 림프구 반응 (MLR) 검정을 수행하여 mDC 가 강한 나이브 동종-응답성 (allo-response) 을 자극하는 능력을 가졌음을 증명했다.
PBMC 유도성 DC 는 말초혈 단핵 세포 (PBMCs) 를 신선한 건강한 공여자 연막 제제로부터 단리하여 제조했다. PBMC 는 조직 배양 플라스크에 결합시켜 AIM-V 배지에서 2 시간 동안 둔 후, 따뜻한 PBS 로 세척해 비결합 세포들을 제거했다. 남아있는 결합 세포들은, 대부분 단핵구를 포함했고, 37℃ 및 5% CO2 에서 6 일 동안 재조합성 인간 인터류킨 4 (rhlL-4)(R&D Systems, Minneapolis MN) 및 재조합성 인간 GM-CSF (rhGM-CSF)(R&D Systems, Minneapolis MN) 와 함께 1000 U/ml 로 인큐베이션시켜, imDC 를 생성했다. 이어서, imDC 는 24 시간 동안 AIM-V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에서 800 U/ml rhGM-CSF, 10 ng/ml TNFα, 10 ng/ml ILl-β 및 10 ng/ml IL-6 및 1.0 ug/ml PGE2 (R&D Systems, Minneapolis MN) 를 이용하여 성숙화시켰다.
MLR 검정을 위해, PBMC 를 건강한 자원자 (Stanford Blood Bank) 로부터 수득한 연막으로부터, 세포를 Ficoll-Paque gradient (Amersham Pharmacia Biotech AB, Buckinghamshire, UK) 상에서 원심분리하여 단리했다. 단리된 세포들은 세척하고, 10% FBS (Clonetech, Mountain View, CA) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 이 있는 완전 RPMI 1640 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에 재현탁시켰다. 96-웰 U-바닥 플레이트 (Becton Dickinson, San Jose, CA) 에, 5 x 104 PBMC 및 상이한 갯수의 방사선조사된 자극자 세포 (hESC, 단핵구 유도성 DC 및 hES 유도성 DC 에 대해 2000 rad) 를 96-웰 U-바닥 플레이트 (Becton Dickinson, San Jose, CA) 에서 혼합하고, 5% CO2 및 37℃ 에서 5 일 동안 인큐베이션했다. 이어서, 세포를 웰 당 1 uCi 3H 티미딘을 이용해 18 시간 동안 5% CO2 및 37℃ 에서 펄스했다. 세포를 Filtermate Harvester (Perkin Elmer, Waltham, MA) 를 이용해 UniFilter-96 GF/C (PerkinElmer, Waltham, MA) 상에서 수합하고, 3H 티미딘 혼입을 TopCount 신틸레이션 카운터 (Perkin Elmer, Waltham, MA) 를 이용해 카운트했다. 결과는 실시예 1 에 따라 제조된 mDC 가 양호한 동종이계 자극 활성을 갖는다는 것을 증명했다 (도 7A).
이후, 항원 특이적 효과기 T 세포를 자극하는 mDC 의 능력을 연구했다. CMV 펩티드 pp65 (아미노산 서열 495 내지 503) 를 사용해 CD 8+ 림프구에 대한 DC 항원 제시를 증명했다. CD8 림프구를 포함하는 특징분석된 PBMC 응답자들은 pp65 펩티드를 특이적으로 인식하는데, 이를 사용했다. CD8 T 림프구 및 DC 에는 공통적인 HLA-A2 대립유전자가 있다. CMV 특이적 항원 제시를 위해, 성숙화 PBMC-DC 및 hES 유도성 DC 를, 10 μg/ml CMV pp65 펩티드를 보충하거나 또는 보충하지 않은 150 ul 의 무혈청 AIM-V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에 재현탁시켰다. 세포를 37℃ 및 5% CO2 에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 AIM-V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 로 2 회 세척했다. DC 는 ELISPOT 플레이트 상에 1 x 104 세포/1OO ul/웰로, 10:1 의 응답자 대 자극자 비율로 플레이팅했다. CMW 에 특이적인 특징분석된 PBMC 응답자 (Cellular Technologies Limited, Decatur, IL) 을 37℃ 수조에서 해동하고, 2 회 세척하고, AIM-V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에 재현탁시키고, 1 x 105 세포/100 ul/웰로 ELISPOT 플레이트 (Millipore, Bedford MA) 상에 플레이팅했다. ELISPOT 플레이트를 항-IFNγ Ab (Mabtech, Mariemont, OH) 을 이용해 1O ug/ml 로 밤새 (16 내지 24 시간) 코팅했다. 검정 플레이트를 37℃ 및 5% CO2 에서 16 내지 24 시간 동안 정치시킨 후, Mabtech 에서 제공하는 지시사항에 따라 현상시켰다. 스팟들은 CTL 분석기 (Cellular Technology Limited, Decatur, IL) 를 이용해 카운팅했다. 도 7b 에 나타낸 결과는, mDC (도면에서 ES-DC 로 표지됨) 가 PBMC-DC 와 필적하게 IFNγ 생산을 자극할 수 있다는 것을 증명했다.
후속하여, 시험관내에서 T 세포 증량을 자극하는 mDC 의 능력을 시험했다. CMV T 세포주 (67% 특이성) (Prolmmune, Bradenton, FL) 를 37℃ 에서 해동하고, 1 mM Na-피루베이트, 불필수 아미노산, 2 mM L-글루타민, 5 x 10-5 M 2-메르캅토에탄올, 및 HEPES 을 보충한 1640 RPMI 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) + 5% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA) 로 2 회 세척했다. 이어서, T 세포는 37℃ 및 5% CO2 에서 2 시간 동안 인큐베이션했다. 5 mM CellTrace CFSE 원액 용액 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 사용 직전에 DMSO (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에 용해시켰다. T 세포는 미리 데운 PBS/0.1% BSA 에 1 x 106/ml 로 재현탁시켰다. 염료를 최종 농도 2 uM 로 세포에 첨가하고, 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션했다. Celltrace 염료는 5X 빙냉 배양 배지 첨가로 켄칭했다. 세포를 검정 설정 전에 2 회 세척했다.
hES 로부터 유도된 DC 는 10 μg/ml 의 CMV495-503 pp65 펩티드 (Anaspec, San Jose, CA) (HPLC 로 순도가 >95%) 와 함께 2 시간 동안 37℃ 에서 예비펄스하고, 2 회 세척한 후, 2 x 104/웰로 96 웰 U 바닥 Falcon™ 플레이트 (BD, San Jose, CA) 에 플레이팅했다. CFSE 표지 T 세포를 2 x 105 세포/웰로 플레이팅했다. 5 일째에, 세포를 수합하고, 백만개의 세포 당 APC (Prolmmune, Bradenton, FL) 로 표지한 5 μl 의 CMV495-503 특이적 오량체로 25℃ 에서 10 분 동안 염색했다. 이는 CMV 펩티드 495-503 에 특이적인 T 세포를 인식한다. 이는 CFSE 분석을 위해 세포의 상기 특이적인 집단 상에서의 FACS 게이팅을 허용한다. 세포는 유동 완충액으로 2 회 세척하고, 7AAD 를 이용해 5 분 동안 염색한 후, 시료 FACSCalibur™ (Becton Dickinson, San Jose, CA) 상에서 진행시켰다. 죽은 세포들은 7AAD 에 의한 분석으로 배제시켰다. 염료 표지의 희석 (다중 피크) 은 T 세포 증식의 표식이다. 도 7C 에 나타낸 바와 같이, 실시예 1 에 따라 제조한 DC (도면에서 ES-DC) 는 PBMC-DC 에 필적하는 T 세포 증식을 제공했다. CD8 T 림프구 및 수지상 세포에는 공통적인 HLA- A2 대립유전자가 있었다.
실시예 7: 분화 칵테일의 비교
hES 세포의 imDC 및 mDC 로의 성장 및 분화를 위한 배양 조건은, 사용한 분화 칵테일을, 각종 외인성 싸이토카인을 함유하는 분화 칵테일을 비교하기 위해 교체한 점을 제외하고, 실시예 1 에 기재된 바와 같이 수행했다. 7, 5, 4 및 3 개 싸이토카인 (성장 인자) 의 각종 조합을, hES 세포를 imDC 로 분화시키는 그의 능력에 대해 시험했다. 표 2 는 분화 칵테일이 7, 5 및 4 개 외인성 싸이토카인 (플러스 표시는 인자의 존재를 표시하며/마이너스 표시는 인자가 사용되지 않음을 표시함) 을 함유하는 실험들에 대한 상세사항을 제공한다. 표의 절반 이후 아래쪽의 숫자들은 상기 백분율 바로 위에 표시된 해당 칵테일을 사용하여 수득된 각 세포 마커들의 백분율을 나타낸다. 표 3 은 분화 칵테일이 4 및 3 개 외인성 싸이토카인을 함유하는 상세사항을 제공한다 (플러스 표시는 인자의 존재를 나타내고/마이너스 표시는 인자가 사용되지 않음을 나타냄). 해당하는 칵테일에 비해 수득되는 마커의 백분율에 대한 설정은, 백분율이 수치 데이터 위에 나타낸 칵테일에 해당하는, 표의 절반 이후에 나타낸다. 표 4 내지 6 은 실험의 시간대별 분화 칵테일 (표 2 및 3 에 기재되어 있음) 의 조성에 관한 상세사항을 제공한다 ("X" 는 인자가 특정 기간 동안 존재함을 나타냄) ("d" 는 "일 (day)" 에 대한 약어로서 상기 표에 사용됨).
imDC 는 두가지 상이한 성숙화 칵테일을 이용해 mDC 로 성숙화시켰다. 표 2 에 기재된 실험에서, GM-CSF, II-1β, IFN-γ, CD40L 및 IFNα 를 함유하는 2 가지 상이한 성숙화 칵테일이 사용되었다. 표 3 에 기재된 실험에서, TNFα, IL 1β, IFNγ 및 PGE2 를 함유하는 성숙화 칵테일이 사용되었다. 표 7 은 시험한 각각의 싸이토카인 (성장 인자) 의 농도 및 공급원을 제공한다.
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
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Figure pat00007
실시예 8: 성숙화 칵테일의 비교
본 발명의 각종 구현예에 따라 imDC 로 분화된 pPS 세포는 상이한 싸이토카인/인자의 조합을 이용하여 mDC 로 성숙화되었다. 0.05 x 106 세포/웰의 세포 농도로 96 웰 플레이트에 플레이팅하고, 24 시간 동안 표 8 에 제시한 각종 싸이토카인/인자의 조합으로 보충한 X VIVO-15 배지에서 배양했다. 사용한 인자들의 농도는 표 7 에 제시했다. Poly I:C 에 대해서는 10 ug/ml 를 이용하고; PGE2 에 대해서는 1 ug/ml 를 이용하고; iL-6 에 대해서는 10 ng/ml 를 이용했다. 모든 시험한 성숙화 칵테일이 50 ng/ml 의 GM-CSF 를 포함했다. 24 시간째에 상청액으로부터의 IL-12 및 IL-10 수준은, imDC 의 mDC 로의 성숙화의 표식으로서의 BD™ Cytometric Bead Array (BD Biosciences, Franklin lakes. NJ) 를 이용하여 측정했다. 상기 결과는 4 개 정도의 외인성 싸이토카인이 imDC 의 mDC 로의 성숙화를 자극할 수 있음을 시사한다.
Figure pat00008
6 개의 웰 플레이트에서 0.2 x 106 세포/웰의 세포 농도를 이용하여 실험을 반복했으나, 이번에는 상이한 패널의 싸이토카인을 시험했다. 싸이토카인 농도는 다음과 같았다: TNFα 10 ng/ml; IL-1β 10 ng/ml; IFN γ 20 ng/ml PGE2 1 ug/ml; IL-6 10 ng/ml. 현탁액을 Amicon Ultra-15 10,000 NMWL 원심분리 관 (Millipore Corp, Bedford, MA) 을 이용하여 농축하고, DC 성숙화의 표식으로서의 IL-12 및 IL-6 제조를 위한 각종 성숙화 칵테일에 대한 48 시간 노출 후 분석했다. 앞서의 실험에서와 같이, 모든 성숙화 칵테일은 또한 50 ng/ml 의 GM-CSF 를 포함했다. 양성 대조군으로서 인간 PBMC 로부터 생성된 단핵구-유도성 DC 를 포함했다. 결과는 표 9 에 제시한다.
Figure pat00009
실시예 9: hTERT T 세포주의 생성
PBMC 는 Ficoll Plaque-Plus (GE Healthcare Bioscience AB, Piscataway, NJ) 분리 방법을 이용하여 건강한 인간 공여자의 HLA-A2+ 연막으로부터 단리했다. imDC 를 생성하기 위해, HLA-A2+ PBMC 유래의 단핵구를 CD 14+ 마이크로비드 (Miltenyi, Aurburn, CA) 를 이용해 단리하고, rhGM-CSF (1000U/ml) (Berlex, Richmond, CA) 및 rhIL-4 (1000U/ml) (R&D systems, Minneapolis, MN) 을 함유하는 무혈청 AIM-V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에 옮기고, 37℃ 5% CO2 에서 5 일 동안 인큐베이션했다. DC 는 TNFα (lOng/ml) (R&D systems), IL-1 β (10ng/ml) (R&D systems), IL-6 (10 ng/ml) (R&D systems) 및 PGE2 (1 ug/ml) (R&D systems) 을 함유하는 싸이토카인 칵테일을 첨가하여 24 시간 동안 성숙화시켰다. mDC 를 수합하고, AIM-V 배지에서 2 회 세척하고, 200 ul 의 AIM-V 배지에 재현탁시키고, hTERT 단백질 (100 ug/ml) (AnaSpec Inc, San Jose, CA) 의 아미노산 540 으로 시작하는 9 머를 이용해 2 시간 동안 37℃ 및 5% CO2 에서 펄스했다.
자가조직 CD8+ T 세포를, CD8+ T 세포 마그네틱 분리 키트 (Miltenyi, Aurburn, CA) 를 이용하여 비 CD8+ 세포를 결핍시켜 PBMC 로부터 단리했다. CD8+ 세포는 10% 인간 AB 혈청 (Valley Biomedical, Winchester, VA) 을 함유하는 AIM-V 배지에 재현탁시키고, 1.0 내지 2.0 x 106 세포/ml 의 농도로 24 웰 플레이트에 옮겼다. 540 hTERT 펄스된 DC 를, 자극자 대 응답자 비율을 1:10 으로 하여 웰에 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2 에서 인큐베이션했다. 이튿날, 재조합성 인간 IL-7 (10ng/ml) (R&D systems) 및 IL-2 (lOU/ml) (R&D systems) 를 배양에 첨가했다.
펩티드 hTERT 540 활성화는 매 7 내지 10 일마다 수행했다. 활성화를 위해, 자가조직 PBMC 를 항원 제시에 이용했다. 자가조직 PBMC 는 무혈청 AIM-V 배지 및 hTERT 540 펩티드 (1O ug/ml) 를 포함하는 웰 당 2.0 내지 3.0 x 106 세포의 농도로 24 웰 플레이트에 옮겼다. PBMC 는 37℃ 및 5% CO2 에서 2 시간 동안 유지하여, 세포의 플레이트로의 결합을 촉진했다. 미결합 세포들은 AIM-V 배지를 이용한 2 회 세척으로 제거했다. 결합된 PBMC 는 540 hTERT 펩티드 (10ug/ml) 로 추가 2 시간 동안 펄스하고, 이어서 2000 rads 에서 방사선조사했다.
540 hTERT 펄스된 DC 를 이용한 초기 프라이밍으로부터의 CD8+ T 세포를 수합하고, 1 회 세척하여, 540 hTERT 펄스된, 방사선조사되고 결합된 PBMC 를 포함하는 웰에 옮겼다. IL-12 (10 ng/ml) (R&D systems) 를 배양에 첨가했다. 이튿날, 재조합성 인간 IL-7 (10 ng/ml) 및/또는 IL-2 (10 U/ml) 를 배양에 첨가했다. 매 3 내지 4 일마다, 배지의 절반을 제거하고, 적당한 때 IL-7 및/또는 IL-2 를 포함하는 신선한 배지를 첨가했다. 540 hTERT 펄스되고, 방사선조사된 자가조직 결합 PBMC 를 이용해 3 회 이상의 활성화를 수행했다.
APC (Prolmmune, Bradenton, FL) 및 항-인간 CD 8 FITC 콘쥬게이션된 Ab (Proimmune, Bradenton, FL) 로 표지된 540 오량체를 이용해 세포를 염색하여, FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Ashland, OR) 를 이용해 백분율 양성 540 hTERT 특이적 CD8+ T 세포를 측정했다. TERT 특이적 CD8+ 세포를 FACSCaliber™ (Becton Dickinson, San Jose, CA) 를 이용한 유세포분석으로 수집하고, 후속 실험에 사용했다.
실시예 10: 540 hTERT T 세포주의 ELISpot IFNγ 검정
hES 유도성 mDC (실시예 1) 를 200 ul 의 무혈청 AIM-V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에 재현탁시키고, 540 hTERT 펩티드 (100ug/ml) 로 2 시간 동안 37℃ 및 5% CO2 에서 펄스했다. 비-펄스 mDC 를 대조군으로 제공했다. 비-펄스 hES 유도성 mDC 는 대조군으로 제공했다. mDC 는 AIM-V 배지에서 2 회 세척하고, AIM-V 배지에 재현탁시키고, 항-IFN-γ Ab (lOug/ml) (Mabtech, Mariemont, OH) 로 코팅한 ELISpot 플레이트에 자극자 대 응답자 비율을 1:10 로 하여 540 hTERT T 세포주를 플레이팅했다. 검정 플레이트는 37℃ 및 5% CO2 에서 16 내지 24 시간 동안 정치시키고, 제조사에 의해 제공된 지시사항에 따라 현상시켰다. 스팟들은 CTL 분석기 (Cellular Technology Limited, Decatur, IL) 를 이용하여 계수했다. 결과는 도 8 에 나타냈고, hES 로부터 분화된 mDC 가 hTERT 항원에 대한 특이적인 T 세포 응답성을 자극한다.
실시예 11: 540 hTERT T 세포주의 증식
540 hTERT T 세포주는 미리 데운 PBS/0.1% BSA 에서 1.0 x 106 /ml 로 재현탁시켰다. CFSE (Invitrogen, Carlsbad, CA) 를 세포에 최종 농도 2 uM 로 첨가하고, 37℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션했다. 염색은 10% FBS (Clonetech, Mountain View, CA) 를 포함하는 미리 차갑게 한 AIM-V 배지의 첨가로 켄칭했다. 세포를 검정 설정 전에 2 회 세척했다. 성숙형 hES 유도성 DC (실시예 1) 를 10 μg/ml 의 540 hTERT 펩티드 (Anaspec, San Jose, CA) 로 2 시간 동안 37℃ 및 5% CO2 에서 펄스하고, AIM-V 배지에서 2 회 세척한 후, 2 x 104/웰로 96 웰 U bottom Falcon™ 플레이트 (BD, San Jose, CA) 에서 플레이팅했다. CFSE 표지된 540 hTERT T 세포주를 2 x 105 세포/웰로 플레이팅했다. 비-펄스 hES 유도성 mDC 는 대조군으로 제공했다. 4 일째에, 세포를 수합하고, APC (Prolmmune, Bradenton, FL) 에 콘쥬게이션된 540 오량체 시약으로 염색했다. 세포를 FACS 완충액으로 2 회 세척하고, 7AAD 로 염색하고, 이후 FACSCaliber™ (Becton Dickinson, San Jose, CA) 를 이용하여 수집했다. 분석은 FlowJo 소프트웨어 (Tree Star, Ashland, OR) 를 이용하여 수행했다. 결과는 도 9 에 제시하고, hES 세포로부터 분화된 mDC 가 HLA-A2 의 맥락에서 hTERT 항원을 제시할 수 있고, 항원 특이적 T 세포 증식을 자극할 수 있다는 점을 증명한다.
실시예 12: 방사선조사된 mDC 의 면역자극 역량
성숙형 수지상 세포는 시험관내에서 실시예 1 에서 기재한 방법에 따라 pPS 세포로부터 시험관내에서 분화시켰다. hES 세포로부터 시험관 내에서 분화된 수지상 세포 (hESC-DC) 에 대한 방사선조사의 유효성을 다루기 위해, T 세포의 항원 특이적 효과기 응답성을 자극하는 방사선조사된 및 비-방사선조사된 hESC-DC 의 능력을 비교했다. CMV 펩티드 pp65 (아미노산 서열 495 내지 503) 를 CD8+ 림프구에 대한 hESC-DC 항원 제시 증명에 이용했다. 특징분석된 PBMC 응답자들 (Cellular Technology Limited, Decatur, IL) 은, HLA-A2 에 복합체화된 pp65 를 인식하는 CD8+ T 세포를 포함하는데, 응답자 세포로서 이용했다. pp65 특이적 항원 제시를 위해, 성숙화 hESC-DC 를, 10 μg/ml pp65 펩티드를 보충하거나 또는 보충하지 않은 150 ul 의 무혈청 AIM-V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에 재현탁시켰다. 세포를 37℃ 및 5% CO2 에서 2 시간 동안 인큐베이션했고, 이어서 AIM-V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 로 2 회 세척했다. pp65 펄스 및 비-펄스 hESC-DC 의 일부를 X-ray 로 2,000 rad, Torrex 150D X-선 인스펙션 시스템 (EG&G Astrophysics Research Corporation, Long Beach, CA) 을 이용하여 4 분 14 초 동안 방사선조사했다. 방사선조사된 및 비-방사선조사된 hESC-DC 를 ELISPOT 플레이트 상에 1 x 104 세포/100 ul/웰로, 응답자 대 자극자 비율을 10:1 로 하여 플레이팅했다. 특징분석된 PBMC 응답자들은 37℃ 수조에서 해동하고, 2 회 세척하고, AIM-V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에 재현탁시키고, 1 x 105 세포/100 ul/웰로 ELISPOT 플레이트 (Millipore, Bedford MA) 상에 플레이팅했다. ELISPOT 플레이트는 항-IFNγ Ab (Mabtech, Mariemont, OH) 를 이용해 1O ug/ml 로 밤새 (16 내지 24 시간) 코팅했다. 검정 플레이트는 37℃ 및 5% CO2 에서 16 내지 24 시간 동안 정치시키고, Mabtech 에서 제공하는 지시사항에 따라 현상했다. 스팟들은 CTL 분석기 (Cellular Technology Limited, Decatur, IL) 를 이용하여 계수했다. 도 10 에 나타낸 결과들은 방사선조사된 hESC-DC 이 항원 특이적 방식으로 IFNγ 생산을 자극하는 역량을 유지한다는 것을 증명한다.
실시예 13: 방사선조사된 mDC 의 화학주성 이동
성숙형 수지상 세포를 실시예 12 에서 이용한 것과 동일한 프로토콜에 따라 분화시켰다. 화학주성 리간드 MIP3β (MIP3b in 도 11) 의 존재 하에 이동하는, 방사선조사된 및 비-방사선조사된 mDC (hESC-DCs) 의 역량은 시험관내에서 트랜스웰 검정을 이용하여 연구했다. AIM-V 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 를 8.0 uM 포어 크기 삽입물 (Corning, Corning, NY) 을 포함하는 트랜스웰 24 웰 플레이트의 상단 및 하단 챔버에 첨가하고, 밤새 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션하여 멤브레인을 평형화시켰다. mDCs 를 수합하고, AIM-V 배지에서 2 회 세척했다. 세포를 AIM-V 배지에 1.5 x 106 웰/ml 로 재현탁시키고, 상기 세포들 중 일부를 Torrex 150D X-ray 인스펙션 시스템 (EG&G Astrophysics Research Corporation, Long Beach, CA) 을 이용하여 2,000 rad 에서 X-선 방사선조사했다. 트랜스웰로부터 배지 제거 후, 케모카인 MIP3β (100ng/ml) 의 존재 또는 부재 하 0.6 ml 의 AIM-V 를 하단 챔버에 첨가했다. 부피 0.1 ml 의 방사선조사된 또는 비-방사선조사된 mDC (0.15 x 106 세포) 를 상단 챔버에 첨가했다. 트랜스웰을 2 시간 동안 37℃, 5% CO2 에서 인큐베이션했다. 바닥 챔버로 이동한 세포의 수는 혈구계수기를 이용하여 결정했다. 도 11 에 제시된 결과는 방사선조사는, MIP3β 에 대한 응답으로 이동하는 mDC 의 능력에 영향을 주지 않음을 증명했다.
실시예 14: 시판되어 입수가능한 배지로부터의 세포 수율의 비교
두가지 시판되어 입수가능한 배지, mTeSR™ 무혈청 배지 (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada) 및 XVIVO-10™ (Lonza, Walkersville, MD) 의 mDC 세포 수율에 대한 유효성을 조사했다. H1 hESC 배양 및 분화 방법은 실시예 1 에 기재된 바와 같이 수행했다. 각 수합물에서의 성숙형 DC 의 갯수는 XVIVO-10 또는 mTeSR 클러스터로부터 기원한 hESC 간에 비교했다, 도 12. 총 3 가지 수합물을 초기 분화로부터 수행했다. 두가지 배지가 모두 hES 로부터 시험관내에서 분화된 mDC 를 성공적으로 제조했으며, 결과는 mTeSR 에서 배양된 hESC 가 XVIVO-10 보다는 더 나은 세포 수율을 제공한다는 점을 시사한다.
실시예 15: 시판되어 입수가능한 배지에서 배양한 hESC-유도성 DC 의 성숙화
성숙형 DC 는 T 세포 응답성을 자극하는 역량을 보유한다; 따라서, hESC-유도성 DC 에 대한 성숙화 프로세스를 최적화하는 것이 바람직하다. (참고문헌은, 예를 들어 Chiara 등, 2007). 미숙형 및 성숙형 hESC-유도성 DC 의 생성 단계 동안 Cellgro DC 배지를 이용한 점을 제외하고는, 실시예 1 에 기재된 바와 같이 H1 hESC 를 분화시켰다. 성숙화 24 시간 후, 세포를 수합하고 다음을 근거로 성숙형 DC 표현형의 존재성에 대해 평가했다: 1) 세포 표면 마커 발현, 2) 이동, 및 3) IL-12 발현.
실시예 2 에 기재된 유세포분석을 DC 연관 마커의 세포 표면 발현을 분석하기 위해 이용했다: MHC 클래스 II, CD83, CD86, 및 CCR7. Cellgro™ DC 배지에서 배양한 성숙형 hESC-유도성 DC 에서는, MHC 클래스 II, CD83, 및 CCR7 의, XVIVO-15™ 배양 DC 의 세포 백분율 양성 (%) 및 발현 수준 (MFI) 의 두가지 모두가 상승했다, 도 13. CD86 를 발현하는 세포의 % 는 변함없이 남아있었지만, 중간값 형광 강도 (MFI) 는 Cellgro™ DC 배지를 이용하면 더욱 높다. 상기 데이터는 Cellgro™ DC 배지가 더욱 강력한 성숙형 DC 표면 표현형의 생성을 촉진한다는 것을 시사한다.
후속하여, Cellgro™ DC 및 XVIVO- 15™ 배지에서 배양한 hESC-유도성 성숙형 DC 의 이동 효율을, 실시예 5 에 기재한 트랜스웰 검정을 이용하여 연구했다. XVIVO-15™ 에서 배양한 hESC-유도성 DC 는 유효한 이동을 위해서 적어도 48 시간의 성숙화 동안 성숙화되어야 할 필요가 있다. 대조적으로, Cellgro™ DC 배지에서 배양 및 성숙화된 hESC-유도성 성숙형 DC 는 24 시간째에, XVIVO-15™ 에 비해, MIP3 베타에 대한 응답으로서의 이동에 대해 증가된 역량을 갖는다 (도 14). 상기 데이터는, Cellgro™ DC 배지에서 배양한 hESC-유도성 DC 가 성숙화 24 시간 후 개선된 이동을 갖는다는 점을 시사한다.
IL-12 은 ThI 유형 면역 응답성 촉진을 보조한다; 따라서, 성숙형 hESC-유도성 DC 로부터의 IL-12 의 발현을 최적화하는 것이 유용하다. IL-12 발현 수준은 실시예 4 에 기재된 것과 같이 검출되었다. Cellgro™ DC 에서 배양한 hESC-유도성 성숙형 DC 은 XVIVO-15™ 배양 DC 에 비해 더 높은 IL-12 발현 수준 (3.4 배) 를 갖는다, (도 15). 성숙화 칵테일에 대한 IL-4 의 첨가는 DC 로부터의 IL-12 발현을 증강시킬 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Ebner 등 (2001) J. Immunology 166:633). IL-4 는 두 배지 조건 모두에서 IL-12 의 발현을 증가시키지만, Cellgro™ DC 배지에서 배양한 hESC-유도성 성숙형 DC 는 IL-12 제조의 특히 더욱 높은 수준을 갖는다 (5.6 배), (도 15). 취합하면, 이들 데이터는 Cellgro™ DC 배지에서 배양한 hESC-유도성 성숙형 DC 는 XVIVO- 15™ 에서 배양한 DC 보다 더 높은 수준으로 IL-12 를 발현하는 역량을 갖는다는 점을 시사한다.
실시예 16: hTERT-LAMP 를 인코딩하는 RNA 로 트랜스펙션된 hESC-유도성 DC 에 의한 540 hTERT T 세포주의 자극
H1 hESC 는, mTeSR™ 를 hESC-유도성 미숙형 및 성숙형 DC 를 생성하기 위해 hESCs 및 Cellgro™ DC 를 배양하기 위해 사용한 점을 제외하고, 실시예 1 에 기재된 방법에 따라 분화시켰다. 다음의 파라미터를 이용하는 Biorad Gene Pulser Xcell (Biorad, Hercules, CA) 를 이용하여, 0.4cm 큐벳에서, hTERT-LAMP 또는 GFP 를 인코딩하는 RNA 를 이용하여, hESC-유도성 성숙형 DC 를 2.0 내지 4.0e6 사이 전기천공시켰다 (Biorad, Hercules, CA): 300V, 15OuF, 및 100Ω. 전기천공된 세포는 Cellgro™ DC 배지에서 1 회 세척하고, 세포를 추가 6 시간 동안 성숙화 배지에 옮겼다. GFP- 및 hTERT-LAMP RNA 전기천공한 hESC-유도성 성숙형 DC 를 수합하고, 540 hTERT T 세포주와 함께 인큐베이션하여, 실시예 9 및 10 에 기재된 바와 같이 IFNγ 발현을 검출했다. 결과는, hTERT-LAMP RNA 로 전기천공한 hESC-유도성 성숙형 DC 는 540 hTERT 특이적 T 세포주로부터의 IFNγ 의 수준을, GFP-RNA 트랜스펙션된 hESC-유도성 DC 에 비해 더 증가시킨다는 것을 증명했다 (도 16). 상기 데이터는 hESC-유도성 DC 가 hTERT 항원을 프로세스 및 제시하는 역량을 갖는다는 점을 시사한다.
본 발명의 여러개의 개질 및 변형이 그의 범위를 벗어나지 않고도 가능하고, 이는 당업자에게는 자명하다. 본원에 기재된 구체적인 구현예들은 오직 예시의 수단으로 제공되고, 임의의 방식으로도 제한을 의도하는 것은 아니다. 본 명세서 및 실시예는 오직 예시로서만 간주되어야 하고, 본 발명의 진정한 범위 및 진의는 하기의 특허청구범위로 나타내는 것을 의도로 한다.

Claims (3)

  1. 하기를 포함하는 유사분열 불활성 항원 제시 세포 제조 시스템:
    a) pPS 세포를 포함하는 제 1 단리 세포 집단, 및
    b) 제 1 단리 세포 집단의 일부의 시험관내 자손인 유사분열 불활성화 성숙형 수지상 세포를 포함하는 제 2 단리 세포 집단.
  2. 제 1 항에 있어서, 5% 이상의 성숙형 수지상 세포가, CD86 및 CD83 로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현하는 시스템.
  3. 제 2 항에 있어서, CD86 및 CD83 로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 발현하는 성숙형 수지상 세포가 후속 MHCII 및 CCR7 의 하나 이상을 추가로 발현하는 시스템.
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