KR20170002500A - 항muc1 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 암 세포에 고발현하는 당쇄(糖鎖) 구조를 가지는 MUC1에 특이성을 가지는 항체, 이 항체의 제조 방법, 및 상기 항체에 의한 암의 진단과 예방 및/또는 치료의 새로운 수단 및 방법을 제공한다. 본 발명은, 인간 MUC1에 대한 모노클로날(monoclonal) 항체로서, 인간 MUC1 탠덤(tandem) 유닛 및 상기 인간 MUC1 탠덤 유닛의 아미노산 서열 중의 트레오닌 및 세린 중 어느 하나에 O-결합형 당쇄 코어 0(Tn)을 가지는 당 펩티드를 특이적으로 인식하는, 상기 항체. 인간 체액 샘플 중의 MUC1을 검출하는 방법. 상기 모노클로날 항체를 포함하는 키트. 상기 모노클로날 항체를 유효 성분으로서 함유하는, 악성 종양의 예방 및/또는 치료용의 의약 조성물.

Description

항MUC1 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 및 그 용도{ANTI-MUC1 ANTIBODY OR ANTIGEN-BINDING FRAGMENT OF SAME, AND USE THEREOF}
본 발명은, 항MUC1 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 및 그 용도에 관한 것이다. 더욱 특정하면 MUC1 당 펩티드에 대한 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 및 이것을 사용한 악성 종양의 진단 기술 및 예방 및/또는 치료 기술에 관한 것이다.
MUC1은 뮤신(mucin) 당단백질의 일종이며, MUC1 유전자(MUC1)에 코딩된 코어 단백질과 O-형 당쇄 결합을 통하여 코어 단백질에 결합한 무수한 당쇄를 가진다. 뮤신에는 표피 세포 등이 생산하는 분비형 뮤신과, 소수성(疏水性)의 막 관통 부위를 가지고 세포막에 결합한 상태로 존재하는 막결합형 뮤신이 있다. MUC1은, 표피 세포의 막결합형 뮤신이며, 정상(正常) 세포에서는 유선(乳腺) 세포의 선단면이나 유지방적(乳脂肪滴), 또는 췌장, 신장이나 몇 몇 선상피(腺上皮) 세포에 존재한다(비특허 문헌 1). 분자 사이즈는 400 kDa 이상이며, 그 50%를 O-결합형 당쇄가 차지한다. 본 당단백질은, 짧은 N말단 영역, 수산기를 가지는 아미노산이 25%를 차지하는 탠덤(tandem) 리피트로 이루어지는 중앙 영역, 31 아미노산으로 이루어지는 막관통 영역, 세포질 측의 짧은 말단 영역으로 이루어지고, 중앙 영역을 포함하는 세포외 영역은 각종 조건에서 절단되어 유리(遊離)한다. 각 탠덤 리피트(탠덤 유닛)는, 5개의 O-당쇄 수식(修飾) 가능한 부위를 가지는 20 아미노산(Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala)으로 이루어진다. 탠덤 리피트의 개수는 대립 유전자 의존적으로 20∼125의 사이에서 변동하므로, 이 영역은 VNTR(variable number of tandem repeats)이라고 한다. VNTR 영역은, 개체에 의해 발현되는 반복수가 유전적으로 상이한 사이즈 다형(多形)을 생기게 하는 동시에, 특정 아미노산의 유전자 변이에 의한 4종의 서열 다형이 알려져 있다. 서열 다형 중에서는 Pro-Asp-Thr-Arg(PDTR)로부터 Pro-Glu-Ser-Arg(PESR)로의 변이 빈도가 높다(비특허 문헌 2).
MUC1은, 유방암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 대장암, 난소암 등 많은 암에서 과잉 발현하는 것이 알려져 있고, 특히 유방암, 난소암, 췌장암에서는 90% 이상에서 과잉 발현이 인정된다. 또한, MUC1의 고발현은 각종 암의 예후 불량을 동반하고, 암환자에서는 혈중의 유리 MUC1 농도가 상승한다(비특허 문헌 1).
MUC1의 VNTRs 영역의 세린, 트레오닌 잔기로의 O-당쇄 수식으로 최초로 전이 되는 당은, GalNAc(Tn으로 표기되는 경우가 있음)의 경우가 가장 많고, 그 결과 Tn 항원이 생성된다. Tn은 정상 MUC1에서는 거의 관찰할 수 없지만, 암 유래의 MUC1로 인정된다. 이어서, Tn에 시알산, 갈락토스, 또는 GlcNAc가 부가되어, 각각 sialyl-Tn(STn), 코어 1(T) 또는 코어 2가 생성된다. 코어 2에 시알산이 부가되면 시알릴 T(ST)가 생성된다. STn에 또 다른 당쇄가 부가되지는 않지만, Tn에는 GlcNAc, GalNAc가 전이(轉移)된다. 암 세포에 있어서, O-형 당쇄는 불완전하게 처리되어, 암에 일반적인 당 항원 Tn(GalNAc α-1-Ser/thr), STn(Sia α2-6 GalNAc α1-O-Ser/Thr), T(Gal β1-3 GalNAc α-1-O-Ser/Thr), 코어 2(GlcNAc β1-3 GalNAc α1-O-Ser/Thr), ST(Sia α2-3 Gal β1-3 GalNAc α1-O-Ser/Thr/Sia α2-6(Gal β1-3)GalNAc α1-O-Ser/Thr)의 발현을 가져온다. 암이 진행하는 동안, MUC1의 탠덤 리피트 중의 5개의 O-당쇄 수식 가능한 부위로의 이와 같은 상이한 당쇄 수식에 기인하여 항원 구조(에피토프)는 변화한다(비특허 문헌 4). 그리고, 최초에 GalNAc가 전이된 O-글리칸의 코어 구조는 다양한 종류가 알려져, 번호가 부여되어 있고, 코어 0, 1 및 2의 코어 구조를 이하에 나타낸다.
코어 0(Tn antigen) GalNAc
코어 1(T antigen) Galβ1-3GalNAc
코어 2: Galβ1-3(GlcNAcβ1-6) GalNAc
MUC1 코어 단백질의 O-글리코실화에 의한 당쇄 부가는, 표피 세포 표층의 보호, 면역 반응, 세포 접착, 염증 반응, 및 암화(癌化), 암 전이에 중요한 역할을 하고 있다. 암화에 의한 MUC1의 과잉 발현이나, O-글리코실화의 극적인 변화와 암화 및 암 전이와의 관련성이 보고되어 있다. 또한, MUC1에 대한 모노클로날 항체가, 유방암이나 난소암을 대상으로 한 진단약 및 치료약으로서의 연구 개발이 진행되고 있다(비특허 문헌 1). 또한 최근, 암 진행 및 전이에는 MUC 당 단백질과 갈렉틴의 상호 작용이 중요한 것으로 인정되고 있다(비특허 문헌 5).
종래, 정제한 MUC1 및 MUC1로부터 유래하는 합성 펩티드 및 글리코펩티드에 대한 다수의 모노클로날 항체가 보고되어 있다(특허 문헌 1-5, 비특허 문헌 6, 7). 이들 항체의 대부분의 최소 서열 인식은, MUC1의 탠덤 리피트의 펩티드 중의 Ala-Pro-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro에 존재하는 것으로 여겨진다. 이 서열 중에 포함되는 트레오닌에 대해서는, 중도(重度)로 O-글리코실화되어 있으므로, MUC1에 결합하는 항체의 선택성 및 친화성에 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 그러나, 전술한 보고 중의 어느 모노클로날 항체도, 에피토프인 펩티드의 당쇄 결합의 유무에 의한 차이는 인식할 수 있더라도, 그 당쇄 구조의 차이까지는 인식할 수 없었다. 이에 따라, 암 세포에 대한 선택성은 불충분했다. 여기에 대하여 본 발명자들은, MUC1의 암관련 구조 STn에 대한 정상 조직 관련 구조의 교차 반응성 비율이 높은 항체를 제조하였다(특허 문헌 6, 7). 그러나, 이들 항체도, MUC1의 코어 펩티드 구조 및 코어 펩티드에 O-글리코실화된 각종 당 펩티드 구조의 차이를 정확하게 식별하는 것은 곤란했다.
일본 특허 제3698370호 명세서 일본 일본특표2002-502621 공보 일본특표 2003-519096 공보 미국 특허 출원 공보 2006/0292643 일본특표 2010-505775 공보 WO02010/050528 WO02011/135869 일본공개특허 제2006-111618호 공보
Beatson 등, I㎜unother.2: 305-327 (2010) Engelmann 등, J. Biol. Chem. 276: 27764-27769 (2001) Bafina 등, Oncogene 29: 2893-2904 (2010) Clin. Cancer Res.19: 1981-1983 (2013) Liu 등, Nature Rev Cancer 5: 29-41 (2005) Danielczyk 등, Cancer I㎜unol. I㎜unother. 55: 1337-1347 (2006) Cao 등, Histochem. Cell Biol.115: 349-356 (2001) Ohyabu 등, J. Am. Chem. Soc. 131: 17102-17109 (2009) Matsusita 등, Biochim. Biophy. Acta 1840: 1105-1116 (2014) Hashimoto 등, Chem. Eur. J. 17: 2393-2404 (2011) Lu-Gang 등, J. Biol. Chem.282: 773-781 (2007)
본 발명자들은, 항체의 특이성 해석 및 에피토프 매핑을 정확하게 실시할 수 있는, 고감도·고성능의 당 펩티드 고정화 마이크로 어레이를 개발하고, 참된 에피토프 구조를 결정하는 새로운 방법을 확립하였다. 이 방법을 이용하여 상기한 기존의 7개의 항MUC1 항체의 에피토프 해석을 행하였다. 그 결과, 어느 항체도 MUC1의 코어 펩티드 구조 및 코어 펩티드에 O-글리코실화된 당 펩티드 구조의 차이를 인식할 수 없는 것으로 밝혀졌다(비특허 문헌 8, 9).
또한 본 발명자들은, 항MUC1 항체의 에피토프 영역에서는 측쇄에 결합하는 당쇄의 구조 특이적으로 주쇄(主鎖) 펩티드의 콘포메이션 변화가 유기되어 있는 것을 NMR에 의해 증명했다. 또한, 펩티드의 콘포메이션이 특정한 아미노산 잔기에서의 당쇄 수식(修飾)에 의해 민감하게 변화되고 있고, 이것이 항MUC1 항체의 항원 구조를 규정하고 있는 것을 밝혀냈다(비특허 문헌 8). 또한, 뮤신 유래의 합성 당 펩티드의 3차원 구조의 변화를 MS 및 NMR를 사용하여 해석했다. 이로써, 당 펩티드의 콘포메이션이, 펩티드에 수개 존재하는 트레오닌 잔기로의 당쇄 수식에 의해 영향을 받아 특정 위치의 당쇄 수식이 펩티드 주쇄가 안정된 콘포메이션을 가져온다는 새로운 지견(知見)을 나타내었다(비특허 문헌 10).
전술한 지견에 입각하여, 본 발명은, 암 세포에서 고발현하는 O-결합형 당쇄를 가지는 당 펩티드에 특이적인 항MUC1 항체를 제공하는 것을 해결해야 할 과제로 한다. 여기서, 「O-결합형 당쇄를 가지는 당 펩티드에 특이적」이란, MUC1의 코어 펩티드 구조 및 코어 펩티드에 O-글리코실화된 각종 당 펩티드 구조의 차이를 정확하게 식별할 수 있는 것을 의미한다.
또한 본 발명은, 이 항체 제조에 적합한 항원이 되는 합성 당 펩티드를 제공하는 것을 해결해야 할 과제로 한다. 또한, 본 발명은, 상기 항체에 의한 암의 진단과 예방 및/또는 치료의 새로운 수단 및 방법을 제공하는 것도 해결해야 할 과제로 한다.
본 발명자는, 당쇄 및 당 펩티드에 대하여 본 발명자들이 얻은 새로운 기술과 지견을 응용하여, 전술한 과제를 해결하기 위하여, MUC1의 VNTRs 영역의 세린, 트레오닌 잔기로의 O-당쇄 수식으로 최초에 전이되는 코어 당 구조인 Tn을 가지는 당 펩티드를 인공적으로 합성하고, 이 인공적으로 합성한 당 펩티드를 항원에 사용하여 모노클로날 항체를 제조하였다. 상기 Tn을 가지는 당 펩티드(이하, Tn 항원이라고 하는 경우가 있음)로부터 얻어진 항MUC1 항체 중 몇 개에 대하여, 항원에 사용한 당 펩티드를 포함하는 각종 뮤신의 VNTRs 영역으로부터 유래하는 당 펩티드를 탑재한 마이크로 어레이를 사용하여 항체의 특이성 해석을 행하고, 항체의 특성을 검토했다. 또한 이들 항체는, 각종 암 세포에 발현한 MUC1로의 결합·집적, 암환자 혈청에 대한 반응, 암 세포 증식 억제 작용, 암 전이 억제 작용 등에 대하여 검토했다. 이러한 검토를 행한 결과, MUC1의 코어 펩티드 구조 및 코어 펩티드에 O-글리코실화된 각종 당 펩티드 구조의 차이를 정확하게 식별할 수 있는 항체를 발견하고, 여기에 기초하여 본 발명은 완성되었다.
본 발명은, 하기와 같다.
[1]
인간 MUC1에 대한 모노클로날 항체로서, 인간 MUC1 탠덤 유닛 및 상기 인간 MUC1 탠덤 유닛의 아미노산 서열 중의 트레오닌 및 세린 중 어느 하나에 O-결합형 당쇄 코어 0(Tn)을 가지는 당 펩티드를 특이적으로 인식하는, 상기 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
[2]
상기 인간 MUC1 탠덤 유닛의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 O-결합형 당쇄 코어 0(Tn)은 상기 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 8번 위치의 트레오닌에 결합하는, [1]에 기재된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
[3]
상기 인간 MUC1 탠덤 유닛의 아미노산 서열은 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 O-결합형 당쇄 코어 0(Tn)은 상기 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 8번 위치의 세린에 결합하는, [1]에 기재된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
[4]
하기 i)∼iii)에 나타낸 결합 특성을 가지는 [1]∼[3] 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
i) 상기 O-결합형 당쇄 코어 0(Tn)이, O-결합형 당쇄 T 또는 STn으로 치환된 당 펩티드에 결합하지 않고
ii) 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드(naked peptide)에 결합하지 않고, 또한
iii) MUC2의 탠덤 유닛 펩티드 또는 MUC4의 탠덤 유닛 펩티드에 Tn이 수식된 당 펩티드에 결합하지 않는다.
[5]
면역 글로불린 중쇄(重鎖) 가변 영역(VH) 도메인 및 면역 글로불린 경쇄(輕鎖) 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 적어도 1개의 항원 결합 부위를 가지고 있고, 상기 중쇄 가변 영역 도메인은, 그 서열 중에, 상보성(相補性) 결정 영역 CDR1, CDR2, CDR3를 포함하고, CDR1은 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2는 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR3는 서열 번호 10의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역 도메인은, 그 서열 중에, 상보성 결정 영역 CDR1', CDR2', CDR3'를 포함하고, CDR1'는 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2'는 서열 번호 12의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR3'는 서열 번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는, [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
[6]
면역 글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 면역 글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 적어도 1개의 항원 결합 부위를 가지고 있고, 상기 중쇄 가변 영역 도메인은, 그 서열 중에, 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, CDR3를 포함하고, CDR1은 서열 번호 16의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2는 서열 번호 17의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR3는 서열 번호 18의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역 도메인은, 그 서열 중에, 상보성 결정 영역 CDR1', CDR2', CDR3'를 포함하고, CDR1'는 서열 번호 19의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2'는 서열 번호 20의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR3'는 서열 번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는, [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
[7]
서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 가지는, [5]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
[8]
서열 번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 가지는, [6]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
[9]
상기 항원 결합성 단편은, 상기 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', 및 CDR3 '중 적어도 1개를 포함하는 펩티드인, [1]∼[8] 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
[10]
상기 항원 결합성 단편은, Fab, F(ab')2, Fab', 다이아바디(diabody), 단일쇄 항체(예를 들면, scFv, dsFv), 2가의 특이적 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체인 [1]∼[9] 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
[11]
MUC1의 특이적 검출에 사용하기 위한 [1]∼[10] 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
[12]
인간 체액 샘플 중의 MUC1을 특이적으로 검출하는 방법으로서,
(a) 상기 샘플을 [1]∼[10] 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편과 접촉시키고,
(b) 접촉 후의 샘플에서의 항체(또는 그의 항원 결합성 단편)-항원 복합체의 형성을 측정하는 것을 포함하는, 상기 방법.
[13]
상기 체액 샘플 중의, MUC1의 이상(異常) 발현이 관찰되는 악성 종양의 유무의 검출에 사용하기 위한 [12]에 기재된 방법.
[14]
상기 악성 종양이 유방암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 대장암, 및 난소암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, [13]에 기재된 방법.
[15]
(a) [1]∼[10] 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편과,
(b) 항체(또는 그의 항원 결합성 단편)-항원 복합체를 측정하기 위한 시약을 포함하는, [12]∼[14] 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 사용하기 위한 키트.
[16]
[1]∼[10] 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 유효 성분으로서 함유하는, 악성 종양의 예방 및/또는 치료용의 의약 조성물.
[17]
상기 악성 종양이 유방암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 대장암, 및 난소암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, [16]에 기재된 조성물.
본 발명에 의해, 인간 MUC1에 대한 모노클로날 항체이며, 또한 MUC1의 탠덤 유닛 펩티드의 O-결합형 당쇄가 코어 0(Tn)인 MUC1을 특이적으로 인식하고, 상기 O-결합형 당쇄가 부가하고 있지 않은 펩티드(naked peptide)나 상기 O-결합형 당쇄가 Tn 이외인 MUC1 당 펩티드를 식별하고 결합하지 않는, 항MUC1 항체 및 항체를 제조하기 위한 항원 당 펩티드를 사용한 방법이 제공된다. 본 발명의 항MUC1 항체를 사용함으로써, 특이적으로 또한 고감도로, 신뢰성을 가지고, 또한 간편하게 MUC1 단백질을 검출할 수 있고, 정상 대조군에 대하여 MUC1 발현의 변화가 인정되는 악성 종양이나 염증 질환을 판정하는 것이 가능하게 된다. 또한 본 발명의 항MUC1 항체로 암의 진행이나 전이를 억제함으로써, 암의 예방 및/또는 치료약으로서 사용할 수 있는 것이 나타낸다.
도 1a 및 도 1b는 MUC1 유래 당 펩티드의 MALDI-TOFMS 스펙트럼이다.
도 2는 MUC2 유래 당 펩티드의 MALDI-TOFMS 스펙트럼이다.
도 3은 MUC4 유래 당 펩티드의 MALDI-TOFMS 스펙트럼이다.
도 4는 당 펩티드 고정화 마이크로 어레이에 의한 SN-101 및 SN-102의 반응 특이성을 평가한 도면다.
도 5는 항체 SN-101 또는 항체 SN-102에 의한 MUC1 발현 세포의 면역 형광 염색 결과이다.
도 6은 항체 SN-101에 의한 세포 증식 저해 실험 결과이다.
도 7은 항체 SN-101 및 SN-102의 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 8은 항체 SN-101의 가변 영역을 포함하는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 항체 SN-102의 가변 영역을 포함하는 아미노산 서열을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
1. 항원 당 펩티드 및 항체
본 발명에 따른 항체는, 인간 MUC1에 대한 모노클로날 항체로서, 인간 MUC1 탠덤 유닛 및 상기 인간 MUC1 탠덤 유닛의 아미노산 서열 중의 트레오닌 및 세린 중 어느 하나에 O-결합형 당쇄 코어 0(Tn)을 가지는 당 펩티드를 특이적으로 인식한다, 상기 항체이다.
본 발명에 따른 항체의 일례는, 상기 인간 MUC1 탠덤 유닛의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 O-결합형 당쇄 코어 0(Tn)은 상기 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 8번 위치의 트레오닌에 결합하는 모노클로날 항체이다. 본 발명에 따른 항체의 다른 일례는, 상기 인간 MUC1 탠덤 유닛의 아미노산 서열은 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 O-결합형 당쇄 코어 0(Tn)은 상기 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 8번 위치의 세린에 결합하는 모노클로날 항체를 들 수 있다.
이들 본 발명의 항체는, 하기 i)∼iii)에 나타낸 결합 특성을 추가로 구비할 수 있다.
i) 상기 O-결합형 당쇄 코어 0(Tn)이, O-결합형 당쇄 T 또는 STn으로 치환된 당 펩티드에 결합하지 않고
ii) 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드(naked peptide)에 결합하지 않고, 또한
iii) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 MUC2의 탠덤 유닛 펩티드 또는 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 MUC4의 탠덤 유닛 펩티드에 Tn이 수식된 당 펩티드에 결합하지 않는다.
1-1. 항원 당 펩티드
MUC1의 탠덤 리피트의 O-결합형 당쇄로서 최초에 코어 펩티드에 전이되는 당은 GalNAc인 경우가 가장 많고, 그 결과 Tn 항원이 생성된다. Tn은 정상 MUC1에서는 거의 관찰할 수 없으며, 암 유래의 MUC1로 인정된다.
인간 MUC1의 탠덤 유닛 펩티드는, 하기 아미노산 서열을 가진다.
Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr(서열 번호 1)
또한, 인간 MUC1의 탠덤 유닛 펩티드 변이체는, 하기 아미노산 서열을 가진다.
Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Glu-Ser-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr(서열 번호 2)
항원 제조에 있어서는, 상기 어느 하나의 펩티드의 소정의 아미노산에 O-결합형 당쇄를 부가한 당 펩티드를 항원으로서 사용할 수 있다. 이 O-결합형 당쇄를 부가한 당 펩티드는, 인공적으로 합성한 것이다.
상기 O-결합형 당쇄는, Tn의 코어 구조(GalNAc)를 가지는 당쇄이다. 또한, 상기 O-결합형 당쇄는, 상기 서열 번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 탠덤 유닛 펩티드의 8번째의 아미노산인 트레오닌(Thr) 또는 세린(Ser)에 결합한다.
항원 당 펩티드의 합성은, 본 발명자들이 개발한, 마이크로파와 효소 합성 법을 고도로 활용한 합성 기술에 의해 행할 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 비특허 문헌 9나 특허 문헌 6∼8에 기재된 방법에 준하여 실시할 수 있다. 비특허 문헌 9 및 특허 문헌 6∼8의 전체 기재는, 여기에서 특히 개시(開示)로서 원용된다.
1-2. 항체:
본 발명의 항체는, 1-1에 기재된 당 펩티드를 항원으로서 사용하여 통상적인 방법에 의해 조제할 수 있다. 항원 당 펩티드는, 항원성을 높이기 위하여 캐리어(carrier) 단백질과 결합시켜도 되며, 이러한 경우에, 상기 당 펩티드의 C 말단에 캐리어 단백질과의 결합에 필요한 Cys를 부가한 것을 합성하여, 항원 당 펩티드로서 사용할 수 있다. 캐리어 단백질로서는, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청알부민(BSA), 오보알부민(OVA) 등이 있고, 당 기술 분야에서는 공지되어 있으며 시판 중인 키트도 판매되고 있다. 항원을 포유류, 예를 들면, 마우스, 토끼, 랫 등에 투여한다. 면역은 주로 정맥 내, 피하, 복강 내, 발바닥에 주입함으로써 행해진다. 또한 면역의 간격은 특별히 한정되지 않고, 몇 일부터 수주 간격으로, 1∼5 회의 면역을 행한다. 최종 면역일부터 몇 일부터 90일 후에 항체 생산 세포를 채집한다. 항체 생산 세포로서는, 림프절 세포, 비장 세포, 말초 혈세포 등을 들 수 있다. 하이브리도마를 얻기 위하여, 항체 생산 세포와 골수종 세포와의 세포 융합을 행한다. 골수종 세포는, 일반적으로 입수 가능한 주화(株化) 세포를 사용할 수 있다. 사용하는 세포로서는, 약제 선택성을 가지고, 미융합 상태에서는 HAT 선택 배지(히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘을 포함함)에서 생육하지 못하고, 항체 생산 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 성질을 가지는 것이 바람직하다. 골수종 세포로서는, 예를 들면, SP2, P3X63-Ag.8. UI(P3U I), NS-1 등의 골수종 세포주가 있다.
세포 융합 후의 세포로부터 목적으로 하는 하이브리도마를 선별한다. 예를 들면, 세포 현탁액을 우태아 혈청 함유 RPM-1640 배지 등으로 적절하게 희석한 후, 미량정량판(microtiter plate) 상에 파종한다. 각 웰에 선택 배지(예를 들면, HAT 배지)를 가하고, 그 후 적절하게 선택 배지를 교환하여 세포 배양을 행한다. 그 결과, 선택 배지에서 배양 개시한 후, 10∼30 일 정도 생육되어 가는 세포를 하이브리도마로서 얻을 수 있다. 다음으로, 하이브리도마 상청액을, MUC1에 반응하는 항체가 존재하는지의 여부에 대하여, 효소 결합 면역 흡착 어세이(ELISA) 등을 사용하여 스크리닝한다. 융합 세포의 클로닝은, 한계 희석법 등에 의해 행하고, 목적으로 하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 수립한다.
수립한 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 채취하는 방법으로서, 통상의 세포 배양법 또는 복수(腹水) 형성법 등을 채용할 수 있다. 항체의 정제는, 유안 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 친화성(affinity) 크로마토그래피 등의 공지의 방법을 적절하게 선택하거나, 또는 이들을 조합함으로써 정제할 수 있다.
본 발명에 있어서 사용 가능한 모노클로날 항체의 글로불린 타입은, 특별히 한정되지 않고, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 중 어느 하나라도 되지만, IgG 및 IgM이 바람직하다.
상기 하이브리도마를 사용하여 제조되는 본 발명의 항MUC1 모노클로날 항체는 마우스 항체이지만, 마우스 항체는 공지의 몇 개의 확립된 기법을 사용하여, 키메라 항체, 또는 인간화 항체로 변환하여 제조할 수 있고(변환 방법은 후술함), 본 발명의 항마우스 MUC1 모노클로날 항체와 동일한 항원 특이성을 가지는 키메라 항체, 및 인간화 항체도 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 본 발명의 항마우스 MUC1 모노클로날 항체와 동일한 항원 특이성을 가지고, 또한 상이한 항원 특이성을 가지는 2가의 특이적 항체도, 본 발명의 항체에 포함된다.
본 발명의 모노클로날 항체의 구체예는, 실시예에도 기재되어 있는 모노클로날 항체 SN-101 및 SN-102이다. 모노클로날 항체 SN-101은, 부다페스트 조약에 기초하여 독립 행정법인 제품 평가 기술 기반 기구 특허 미생물 기탁 센터(NPMD)(우편번호 292-0818 일본 지바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8)에 2014년 4월 16일에 수탁번호 NITE BP-01845로서 기탁된 하이브리도마 세포계로부터 분비되는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체 SN102는, 하이브리도마주 C10-E11(실시예 참조)에 의해 분비되는 모노클로날 항체이다.
모노클로날 항체 SN-101은, 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 가지는 항체이다. 또한, 모노클로날 항체 SN-101은, 면역 글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 면역 글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 적어도 1개의 항원 결합 부위를 가지고 있고, 상기 중쇄 가변 영역 도메인은, 그 서열 중에, 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, CDR3를 포함하고, CDR1은 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2는 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR3는 서열 번호 10의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역 도메인은, 그 서열 중에, 상보성 결정 영역 CDR1', CDR2', CDR3'를 포함하고, CDR1'는 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2'는 서열 번호 12의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR3'는 서열 번호 13의 아미노산 서열로 이루어진다.
모노클로날 항체 SN-102는, 서열 번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 가진다. 또한, 모노클로날 항체 SN-102는, 면역 글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 면역 글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 적어도 1개의 항원 결합 부위를 가지고 있고, 상기 중쇄 가변 영역 도메인은, 그 서열 중에, 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, CDR3를 포함하고, CDR1은 서열 번호 16의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2는 서열 번호 17의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR3는 서열 번호 18의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역 도메인은, 그 서열 중에, 상보성 결정 영역 CDR1', CDR2', CDR3'를 포함하고, CDR1'는 서열 번호 19의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2'는 서열 번호 20의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR3'는 서열 번호 21의 아미노산 서열로 이루어진다.
모노클로날 항체 SN-101은, 하기 i)∼v)에 나타낸 결합 특성을 가진다.
i) MUC1 유래의 당 펩티드 Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro- Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys에 결합하고,
ii) 상기 MUC1 유래의 당 펩티드의 Tn 당쇄가, T 또는 STn으로 치환된 당 펩티드에 결합하지 않고
iii) 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드(naked peptide)에 결합하지 않고,
iv) 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 MUC2의 탠덤 유닛 펩티드 또는 서열 번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 MUC4의 탠덤 유닛 펩티드에 Tn이 수식된 당 펩티드에 결합하지 않는다.
그리고, 모노클로날 항체 SN-101은, C 말단에 Cys를 가지지 않는, MUC1 유래의 당 펩티드 Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr에도 결합하고, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드(naked peptide)에는 결합하지 않는다.
모노클로날 항체 SN-102는, 하기 i)∼vi)에 나타낸 결합 특성을 가진다.
i) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드의 8번 위치의 트레오닌에 Tn 당쇄가 결합한 당 펩티드 Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr에 결합하고,
ii) 상기 MUC1 유래의 당 펩티드의 Tn 당쇄가, T 또는 STn으로 치환된 당 펩티드에 결합하지 않거나, 결합해도 약한 결합이며,
iii) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드(naked peptide)에 결합하지 않고,
iv) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드의 14번 위치의 세린, 15번 위치의 트레오닌에 Tn 당쇄가 수식된 당 펩티드에는 결합하지 않고,
v) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드의 트레오닌, 세린의 전체에 Tn 당쇄가 수식된 당 펩티드에는 결합하고,
iv) MUC2의 탠덤 유닛 펩티드 또는 MUC4의 탠덤 유닛 펩티드에 Tn이 수식된 당 펩티드에 결합하지 않는다.
그리고, 모노클로날 항체 SN-102는, C 말단에 Cys를 가지는, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드의 8번 위치의 트레오닌에 Tn 당쇄가 결합한 당 펩티드 Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys에도 결합하고, 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드(naked peptide)에는 결합하지 않는다.
본 발명은, 상기 모노클로날 항체에 더하여, 상기 모노클로날 항체의 항원 결합성 단편을 포함한다. 상기 항원 결합성 단편은, 상기 SN-101 또는 SN-102의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', 및 CDR3' 중 적어도 1개를 포함하는 펩티드이다. 상기 항원 결합성 단편은, 예를 들면, Fab, F(ab')2, Fab', 다이아바디(diabody), 단일쇄 항체(예를 들면, scFv, dsFv)일 수 있다. 다만, 항원 결합성 단편은, 상기로 한정할 의도는 없으며, 상기 SN-101 또는 SN-102의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', 및 CDR3' 중 적어도 1개를 포함하는 펩티드이며, SN-101과 마찬가지의 상기 i)∼v)에 나타낸 결합 특성을 가지는 것, 또는 SN-102와 마찬가지의 상기 i)∼vi)에 나타낸 결합 특성을 가지는 것이면 된다. 또한, 키메라 항체 및 인간화 항체, 및 2가의 특이적 항체는, 면역 글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 면역 글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 도메인이, 상기 SN-101 또는 SN-102의 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', 및 CDR3'를 포함하는 펩티드이며, SN-101과 마찬가지의 상기 i)∼v)에 나타낸 결합 특성을 가지는 것, 또는 SN-102와 마찬가지의 상기 i)∼vi)에 나타낸 결합 특성을 가지는 것이면 된다.
항원 결합성 단편과 그 제조 방법의 예에 대하여 이하에서 설명한다.
[ Fab , F(ab')2, Fab ']
제조법(1) : 마우스 모노클로날 항체를 소정의 효소로 소화하거나, 환원 처리에 의해 디술피드 결합을 절단함으로써 제조할 수 있다.
·Fab: 파파인(Papain)에 의한 소화.
·F(ab')2: 펩신(Pepsin)에 의한 소화.
·Fab': 펩신(Pepsin)에 의한 소화 및 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)을 사용한 환원 처리에 의한 디술피드 결합의 절단.
제조법(2): 유전자 재조합 기술을 사용한 단백질 발현 기술에 의해 제조할 수 있다.
·Fab:
·VH(H쇄 가변 영역)와 CH1(H쇄 정상 영역 도메인 1)을 코딩하는 염기 서열
·VL(L쇄 가변 영역)과 CL(L쇄 정상 영역)을 코딩하는 염기 서열
상기 2개의 서열을 대장균 또는 동물 세포(CHO, HEK293, 곤충 세포)에서 발현시키기 위하여, 각각의 세포에 적절한 발현 벡터에 포함시킨 후, 세포에 유전자 도입하여 재조합 단백질로서 생산함으로써 Fab를 얻는다.
·F(ab')2, Fab':
·VH(H쇄 가변 영역)와 CH1(H쇄 정상 영역 도메인 1), 2량체를 형성하기 위한
시스테인을 포함하는 힌지 영역을 코딩하는 염기 서열
·VL(L쇄 가변 영역)과 CL(L쇄 정상 영역)를 코딩하는 염기 서열
상기 2개의 서열을 대장균 또는 동물 세포(CHO, HEK293, 곤충 세포)에서 발현시키기 위하여, 각각의 세포에 적절한 발현 벡터에 포함시킨 후, 세포에 유전자 도입하여 재조합 단백질로서 생산함으로써 F(ab')2 및 Fab'를 얻는다.
[ scFv , dsFv ]
제조법: 유전자 재조합 기술을 사용한 단백질 발현 기술에 의해 제조할 수 있다.
·scFv:
·VH(H쇄 가변 영역)를 코딩하는 염기 서열
·링커 서열: 「GSSSGSSSSGSSSSGSSSS」 등, 플렉시블한 아미노산을
코딩하는 염기 서열
·VL(L쇄 가변 영역)을 코딩하는 염기 서열
-이어지는 VH-linker-VL 또는 VL-linker-VH의 융합 단백질로서 대장균 또는 동물 세포(CHO, HEK293, 곤충 세포)에서 발현시키기 위하여, 각각의 세포에 적절한 발현 벡터에 포함시킨 후, 세포에 유전자 도입하여 재조합 단백질로서 생산함으로써 scFv를 얻는다.
·dsFv:
·VH(H쇄 가변 영역)를 코딩하는 염기 서열
·VL(L쇄 가변 영역)을 코딩하는 염기 서열
VH, VL의 C 말단 측에 시스테인을 삽입하고, 대장균 또는 동물 세포(CHO, HEK293, 곤충 세포)에서 발현시키기 위하여, 각각의 세포에 적절한 발현 벡터에 포함시킨 후, 세포에 유전자 도입하여 재조합 단백질로서 생산함으로써 dsFv를 얻는다.
[ 다이아바디 ( diabody )]
제조법: 유전자 재조합 기술을 사용한 단백질 발현 기술에 의해 제조할 수 있다.
(1) 항원 X에 대한 VH(H쇄 가변 영역)를 코딩하는 염기 서열
(2) 항원 X에 대한 VL(L쇄 가변 영역)을 코딩하는 염기 서열
(3) 항원 Y에 대한 VH(H쇄 가변 영역)를 코딩하는 염기 서열
(4) 항원 Y에 대한 VL(L쇄 가변 영역)을 코딩하는 염기 서열
(5) 링커 서열: 「GSSSGSSSSGSSSSGSSSS」 등, 플렉시블한 아미노산을 코딩하는 염기 서열
-이어지는 VH(1)-linker(5)-VL(4)와 VH(3)-linker(5)-VL(2)를 융합 단백질로하여 대장균 또는 동물 세포(CHO, HEK293, 곤충 세포)에서 발현시키기 위하여, 각각의 세포에 적절한 발현 벡터에 포함시킨 후, 세포에 유전자 도입하여 재조합 단백질로서 생산함으로써 다이아바디(diabody)를 얻는다.
[ 키메라 항체, 또는 인간화 항체]
·키메라 항체:
제조법: 유전자 재조합 기술을 사용한 단백질 발현 기술에 의해 제조할 수 있다.
·마우스 VH(H쇄 가변 영역)와 인간 항체 H쇄 정상 영역을 코딩하는 염기 서열
·마우스 VL(L쇄 가변 영역)과 인간 항체 L쇄 정상 영역을 코딩하는 염기 서열
상기 2개의 서열을 동물 세포(CHO, HEK293, 곤충 세포)에서 발현시키기 위하여, 각각의 세포에 적절한 발현 벡터에 포함시킨 후, 세포에 유전자 도입하여 재조합 단백질로서 생산함으로써 키메라 항체를 얻는다.
·인간화 항체:
제조법: 유전자 재조합 기술을 사용한 단백질 발현 기술에 의해 제조할 수 있다.
·마우스 VH(H쇄 가변 영역)를 구성하는 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 중 CDR1, CDR2, CDR3를 인간 항체 가변 영역 VH의 FR1, FR2, FR3, FR4의 사이에 삽입한 인간화 VH와 인간 항체 H쇄 정상 영역을 코딩하는 염기 서열
·마우스 VL(L쇄 가변 영역)을 구성하는 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 중 CDR1, CDR2, CDR3를 인간 항체 가변 영역 VL의 FR1, FR2, FR3, FR4의 사이에 삽입한 인간화 VL과 인간 항체 L쇄 정상 영역을 코딩하는 염기 서열
상기 2개의 서열을 동물 세포(CHO, HEK293, 곤충 세포)에서 발현시키기 위하여, 각각의 세포에 적절한 발현 벡터에 포함시킨 후, 세포에 유전자 도입하여 재조합 단백질로서 생산함으로써 인간화 항체를 얻는다.
2-1. 인간 체액 샘플 중의 MUC1을 특이적으로 검출하는 방법
본 발명은, 인간 체액 샘플 중의 MUC1을 특이적으로 검출하는 방법을 포함하고, 이 방법은 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함한다.
(a) 상기 샘플을 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편과 접촉시키고,
(b) 접촉 후의 샘플에서의 항체(또는 그의 항원 결합성 단편)-항원 복합체의 형성을 측정한다.
2-2. 인간 MUC1의 면역학적 측정용 키트
본 발명의 키트는, 상기 본 발명의 인간 MUC1 검출 방법에서 사용하기 위한 키트로서,
(a) 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편과,
(b) 항체(또는 그의 항원 결합성 단편)-항원 복합체를 측정하기 위한 시약을 포함한다.
상기 키트에 사용되는 본 발명의 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편(간단하게, 항MUC1 항체라고 하는 경우도 있음)은, 담체에 고정화할 수 있다. 담체는, 항원이 부착할 수 있는, 당업자에게 공지의 임의의 물질일 수 있다. 예를 들면, 담체는, 미량정량판의 시험 웰 또는 니트로셀롤로오스 또는 다른 적절한 막일 수 있다. 또는, 담체는, 비즈(beads) 또는 디스크(예를 들면, 유리, 섬유 유리, 라텍스, 또는 폴리스티렌 또는 폴리염화비닐과 같은 플라스틱 물질)일 수 있다. 담체는 또한, 자성 입자 또는 광학 섬유 센서일 수 있다.
본 발명의 항MUC1 항체는, 방사성 동위원소, 효소, 형광 물질, 발광 물질, 또는 육안으로 판정 가능한 간이 측정법 등에서는 금 콜로이드나 착색 라텍스 등에 의해 표지될 수 있다. 표지에 사용되는 방사성 동위원소로서는, 14C, 3H, 32P, 125I, 131I 등이며, 특히, 125I가 바람직하게 사용된다. 이들은, 클로라민 T법, 퍼옥시다제법, Iodogen법, 볼턴 헌터(Bolton-Hunter)법 등에 의해, 모노클로날 항체에 결합 될 수 있다. 표지에 사용할 수 있는 효소로서는, 예를 들면, β갈락토시다아제(βGAL), 알칼리포스파타아제(ALP), 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 등을 포함한다. 이들은 통상적인 방법에 의해 모노클로날 항체에 결합될 수 있다. 표지에 사용하는 형광 물질로서는, 플루오레세인, 플루오레사민, 플루오레세인이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트 등이 있다. 표지에 사용하는 발광 물질로서는, 루시페린, 루미놀 유도체, 아크리디늄에스테르 등이 있다. 간이 측정법 등에서는, 금 콜로이드나 착색 라텍스를 사용해도 된다.
항체(또는 그의 항원 결합성 단편)-항원 복합체를 측정하기 위한 시약은, 사용되는 면역학적 측정 방법에 따라, 적절하게 결정할 수 있다. 인간 체액 샘플 중에 인간 MUC1이 포함되는 경우에 형성되는 항체-항원 복합체를 검출할 수 있는 공지의 시약을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「인간 체액 샘플」이란, 예를 들면, 인간의 혈장, 혈청, 혈액, 오줌, 타액, 암 조직 분비물 등의 인간 MUC1을 포함할 가능성이 있는 시료이다.
본 발명의 MUC1의 특이적 검출 방법은, 항체로서 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 사용하는 점 이외에는, 종래 공지의 면역학적 측정 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 종래 공지의 면역학적 측정 방법으로서는, 예를 들면, 면역 조직 화학 염색법 및 면역 전자 현미경법, 및 면역 어세이[효소 면역 어세이(ELISA, EIA), 형광 면역 어세이, 방사성 면역 어세이(RIA), 면역 크로마토그래피법, 면역 응집법 및 웨스턴 블롯법 등] 등이 있다. 공정(b)에서의 접촉 후의 샘플에 형성된 항체-항원 복합체 형성을 측정하는 방법은, 면역학적 측정 방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
면역학적 측정법에 대하여 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편(제1 모노클로날 항체)을 고상(固相)에 고정하고, 항원을 포함하는 시료와 함께 인큐베이트하는 공정, 또한 표지한 제2 모노클로날 항체를 가하여, 얻어진 혼합물을 인큐베이트하는 공정, 및 혼합물 중의 생성된, 표지된 항원 항체 복합체를 검출하는 공정을 포함하는 샌드위치 면역학적 측정법이 예시된다. 또한, 본 발명의 면역학적 측정법에서는, 시료와 고상화한 제1 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편 및 표지한 제2 모노클로날 항체를 동시에 인큐베이트해도 된다. 샌드위치 면역학적 측정법으로서는, 그 검출 방법에 따라, 샌드위치 방사 면역 측정법(RIA법), 샌드위치 효소 면역 측정법(EIA법), 샌드위치 형광 면역 측정법(FIA법), 샌드위치 발광 면역 측정법(CLIA법), 샌드위치 발광 효소 면역 측정법(CLEIA법), 샌드위치법에 기초한 면역 크로마토그래피법 등의 모든 샌드위치 면역 측정법이 응용될 수 있다. 정량을 위해는, RIA법, EIA법이 바람직하다.
바람직한 실시형태에 의하면, 샌드위치 RIA법이 행해질 수 있다. 샌드위치 RIA법은, 구체적으로는, 표준 용액 또는 시료에, 제1 모노클로날 항체(본 발명의 모노클로날 항체)를 고상된 비즈를 가하여 혼화(混和)하고, 4℃∼45℃, 바람직하게는 25℃∼37℃에서, 1∼4 시간, 바람직하게는 2시간 인큐베이트한다(제1 반응). 세정한 후, 예를 들면, 125I로 표지한 제2 모노클로날 항체를 포함하는 용액을 가하여, 4℃∼45℃, 바람직하게는 25℃∼37℃에서, 1∼4 시간 바람직하게는 2시간 인큐베이트하고, 비즈 상에 항체/항체 복합체를 형성한다(제2 반응). 세정한 후, 비즈에 결합한 항원 항체 복합체의 방사 활성을 감마-카운터 등으로 검출함으로써의 양을 측정할 수 있다. 다른 바람직한 실시형태에 의하면, 샌드위치 EIA법이 행해질 수 있다. 샌드위치 EIA법은, 구체적으로는, 표준 용액 또는 시료에, 제1 모노클로날 항체를 고정한 비즈를 가하여 혼화하고, 4℃∼45℃, 바람직하게는 25℃∼37℃에서, 1∼4 시간, 바람직하게는 2시간 인큐베이트한다(제1 반응). 세정한 후, 효소 표지, 예를 들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)로 표지한 제2 모노클로날 항체를 포함하는 용액을 가하고, 4℃∼45℃, 바람직하게는 25℃∼37℃에서, 1∼4 시간, 바람직하게는 2시간 인큐베이트하고, 비즈 상에 항체-항체로 이루어지는 면역 복합체를 형성한다(제2 반응). 비즈 상의 효소 활성을, 효소에 특이적인 기질, 예를 들면, 표지 효소가 HRP이면 테트라메틸벤지딘(TMB)을 통하여 비색법(比色法)에 의해 측정하고, 이로써, 비즈 상에 포획된 양을 측정할 수 있다. 비색 정량은, 통상의 분광 광도계 등에 의해 행해질 수 있다.
2-3. 인간 MUC1의 검출
본 발명의 방법은, 체액 샘플 중의 MUC1의 이상 발현이 관찰되는 악성 종양의 유무의 검출에 사용할 수 있다. MUC1의 이상 발현이 관찰되는 악성 종양으로서는, 예를 들면, 유방암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 대장암, 및 난소암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다. 본 발명의 항체는, 전술한 바와 같이, MUC1와 특이적으로 반응하기 때문에, 인간 MUC1와 관련된, 유방암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 대장암, 및 난소암 등의 악성 종양의 검출에 유효하다.
MUC1의 과잉 발현이 유방암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 대장암, 난소암 등의 악성 종양에 있어서 보고되어 있다. 특히 유방암, 난소암, 및 췌장암에서는 90% 이상에서 MUC1의 과잉 발현이 인정되고 있다. MUC1의 고발현은 각종 암의 예후 불량을 수반하고, 암 환자에서는 혈중의 유리(遊離) MUC1 농도가 상승한다(비특허 문헌 1).
또한, 암화나 암 진행, 전이에 따라, MUC1의 O-글리칸의 극적인 변화가 일어나는 것으로 보고되어 있다(비특허 문헌 1). MUC1의 VNTRs 영역에서 관찰되는 O-당쇄 수식은, 정상 상피 조직에서는 통상 8∼10 개의 단당 유닛을 포함하는 폴리락토사민형의 장쇄(長鎖) 및 분지쇄 당으로 구성된다. 정상 MUC1은 세포외 영역이 이와 같은 많은 당쇄로 수식됨으로써, 점막의 보호나 수화, 윤활 작용, 세균이나 이물질의 공격으로부터의 보호 작용, 세포간 및 세포 매트릭스간 상호 작용의 조절 작용을 나타낸다. 또한, MUC1은 정상 세포에서는 세포 정단(apical)에 발현하지만, 암 세포에서는 정단 발현이 없어져 무극성 발현이 되고, 세포 표층 전체에 MUC1이 표출한다. 이 때, VNTR 영역의 O-당쇄 수식의 패턴은 일변하여, 정상 세포에서 관찰되는 장쇄 및 분지쇄로 구성되는 복잡한 당쇄로 바뀌고, 단순하고 짧은 당쇄에 의한 O-당쇄 수식이 인정된다. 암화에 따른 MUC1의 무극성 발현 및 저당쇄 수식은, 정상인 잠재적(cryptic) 펩티드에피토프의 노출 및 신규 탄수화물 에피토프를 창출시킨다. 따라서, MUC1의 이들 에피토프 중의, 수식 당쇄가 Tn인 에피토프에 특이적으로 반응하는 본 발명의 항체는, 정상 및 암의 MUC1을 구별하여 인식할 수 있고, 인간 MUC1와 관련된 악성 종양의 검출에 있어서 사용할 수 있다. 또한 암 세포에 양성의 MUC1만을 공격하는 경우에 이용하는 것도 가능하게 된다.
본 발명의 면역학적 측정용 키트는, 전술한 본 발명의 항MUC1 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 포함하는 것이다. 따라서, 본 발명의 키트를 사용하여, 질환으로의 이환(罹患) 또는 장애의 존재가 의심되는 피검체로부터 채취한 샘플 중에 포함되는 인간 MUC1을 특이적으로 검출함으로써, 상기 피검체의 질환 또는 장애의 존재를 신속하고 간편하게 판정하기 위해 이용할 수 있다. 이와 같은 면역학적 측정 방법을 이용한 질환 또는 장애의 판정용 시약은 이미 알려져 있으며, 당업자라면, 항체 이외의 적당한 성분을 용이하게 선택할 수 있다. 또한 본 발명의 면역학적 측정용 키트는, 면역학적 측정 방법을 행하기 위한 방법이면 어떤 방법에서도 이용할 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 항체를 사용하는 암의 진단법, 본 발명의 항체를 포함하는 진단제, 또는 항체를 포함하는 진단 키트를 제공할 수도 있다. 본 발명의 암의 진단법, 진단제 또는 진단 키트에 있어서 포함되는 항체는, 전술한 본 발명의 항체이다. 본 발명의 항체는, 전술한 특정한 암에 특이적으로 결합할 수 있으므로, 이들의 암의 진단에 사용될 수 있다.
본 발명의 항체는, 전술한 악성 종양의 진단을 위해 또는 환자에서의 질환의 진행을 모니터링하기 위한 마커로서 사용될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 환자의 암은, 환자로부터 얻어지는 생물학적 샘플에 대한 MUC1 레벨을 본 발명의 항체를 사용하여 구하고, 그 결과를 사전에 결정된 컷 오프값과 비교하여 평가함으로써 악성 종양의 진단 등에도 이용할 수 있다.
상기 (b)에서 얻어진 측정 결과와 대조 샘플에 있어서 동일한 (a) 및 (b)의 공정을 거쳐 얻어진 측정 결과를 비교하여, 측정된 체액 샘플에서의 악성 종양의 유무의 검출에 사용할 수 있다. 대조 샘플은, 정상인으로부터 입수한 체액 샘플일 수 있다.
암의 존재 또는 비존재를 결정하기 위하여, 고상 지지체에 결합하여 머무는 리포터기로부터 검출되는 시그널은, 일반적으로, 사전에 결정된 컷 오프값에 대응하는 시그널과 비교된다. 일실시형태에 있어서, 컷 오프값은, 고정된 항체가 암을 가지지 않는 환자로부터의 샘플과 함께 인큐베이트된 경우에 얻어지는 시그널의 평균값이다. 일반적으로, 사전에 결정된 컷 오프값을 상회하는 3개의 표준편차인 시그널을 발생하는 샘플은, 암에 대하여 양성인 것으로 여겨진다. 컷 오프값은, 예를 들면, 진단 시험 결과 각각의 가능한 컷 오프값에 대응하는 진정한 양성의 비율(즉, 감수성) 및 위양성의 비율(100%-특이성)의 조합의 플롯(plot)으로부터 결정될 수 있다. 상부 좌측 모서리에 가장 가까운 플롯 상의 컷 오프값(즉, 최대 영역을 포함하는 값)은 가장 정확한 컷 오프값이며, 그리고, 본 발명의 방법에 의해 결정되는 컷 오프값보다 높은 시그널을 발생하는 샘플은 양성인 것으로 여겨질 수 있다. 또는, 컷 오프값은, 플롯에 따라, 위양성의 비율을 최소로 하기 위하여 좌측으로 시프트할 수 있고, 또는 위음성의 비율을 최소로 하기 위해 우측으로 시프트할 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 의해 결정되는 컷 오프값보다 높은 시그널을 발생하는 샘플은, 그 암에 대하여 양성이면 된다.
3. 의약 조성물
본 발명의 의약 조성물은, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 유효 성분으로서 함유하는 악성 종양의 예방 및/또는 치료용의 의약 조성물이며, 임의로 의약적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 악성 종양이 유방암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 대장암, 난소암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 항MUC1 항체 및 그의 항원 결합성 단편은, 각각 MUC1이 관련된 질환의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. MUC1가 관련된 질환으로서는, 유방암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 대장암, 난소암 등의 악성 종양이 있다. 이들 악성 종양의 환자에 있어서는, MUC1의 발현의 이상, MUC1의 당쇄 구조의 이상 및 그에 따른 기능의 이상이 인정되므로, 본 발명의 항MUC1 항체는 악성 종양을 억제하는 작용에 의해, 악성 종양을 예방 및/또는 치료할 수 있다.
본 발명의 항MUC1 항체 및 그의 항원 결합성 단편은, 각각 MUC1 발현의 이상, MUC1의 당쇄 구조의 이상 및 그에 따른 기능의 이상이 인정되는 유방암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 대장암, 난소암에 대하여, 이들 이상에 의해 일어나는 세포 증식의 항진이나 암 세포 전이 등을 억제함으로써, 암의 예방 및/또는 치료를 행할 수 있다.
또한 최근, 유방암이나 대장암 등의 암 전이에는 MUC1와 갈렉틴의 상호 작용이 중요한 것으로 인정되고 있다(비특허 문헌 11). 암 세포가 침윤이나 전이할 때는, 원발 부위를 떠나 주변의 세포외 매트릭스 및 내피 세포에 침윤하고, 혈관 및 임파관에 침투하여, 최종적으로 2차 부위에 부착되어 증식한다. 암 세포를 순환으로부터 전이 부위로의 유출은, (i) 순환하는 암 세포의 정지 및 암 세포와 혈관 내피 세포와의 일과성이 약한 접촉(도킹) (ii) 각종 접착 수용체(인테그린이나 카드헤린 등)와 그의 리간드의 발현/국재(局在) 변화의 유도, 및 거기에 계속되는 (iii) 암 세포의 혈관 내피 세포로의 강한 부착(록킹)의 프로세스를 거치지만, 이들 3개의 프로세스에 MUC1와 갈렉틴 3의 상호 작용이 주요한 역할을 하고 있는 것을 알게 되었다. 갈렉틴은, β-갈락토시드 구조를 인식하여 결합 또는 당쇄끼리를 가교하는 단백질을 총칭하지만, 갈렉틴 3은 15종 있는 갈렉틴의 1종이며, 내피 세포나 면역 세포의 세포질 내, 핵, 세포 표면, 세포외 매트릭스 등에 존재하는 것으로 알려져 있다. 암 세포의 MUC1이 갈렉틴 3에 결합하는 것, 전이 암 환자의 혈중 갈렉틴 3 농도는, 정상 대조에 비해 상승하고 있는 것, 순환 암 세포의 혈관 내피 세포로의 접착이 암 세포의 MUC1 발현 및 내피 세포의 세포외 갈렉틴 3의 존재에 의존하는 것, 세포외 갈렉틴 3의 암 세포 MUC1으로의 결합에 의해 MUC1의 세포 표층의 국재가 현저하게 변화하여 암 세포와 혈관 내피 세포의 결합이 강하게 이루어지는 것 등이 지금까지 인정되고 있고, 혈중 갈렉틴과 MUC1의 상호 작용이 암 세포의 원격 장기로의 전이에 중요한 기본적 분자 기구(機構)인 것이 밝혀지고 있다. 따라서, MUC1와 갈렉틴 3과의 결합을 블록할 수 있으면, 상기한 암전이 프로세스의 (i)∼(iii)은 모두 억지되어, 암 전이는 억제되는 것이 가능하게 될 것으로 여겨진다.
후술하는 실시예에 있어서, 본 발명의 항체가, MUC1와 갈렉틴 3의 결합을 저해하는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 항체를 사용하여, 암화에 의해 MUC1을 과잉 발현하는 암의 전이의 예방 및/또는 치료가 가능한 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 항MUC1 모노클로날 항체는 마우스 항체이다. 본 발명의 의약 조성물에 사용하는 항체는, 마우스 항체를 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 2가의 특이적 항체로 변환한 것이 바람직하다. 마우스 항체의 키메라 항체, 또는 인간화 항체로의 변환은, 예를 전술한 바와 같이, 공지의 방법을 사용하여 행할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 본 발명의 항체를 유효 성분으로 하고, 당업자에게 공지의 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들면, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학 상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물성 기름, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비이클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적절하게 조합시켜, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것을 고려할 수 있다. 이들 제제에서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적절한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비이클을 사용하여 통상의 제제 실시를 따라 처방할 수 있다. 주사용 수용액으로서는, 예를 들면, 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함하는 등장액, 예를 들면, D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화 나트륨이 있으며, 적절한 용해 보조제, 예를 들면, 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트 80(TM), HCO-60과 병용해도 된다.
유성액으로서는 참기름, 대두유를 예로 들 수 있고, 용해 보조제로서 벤조산 벤질, 벤질알코올과 병용할 수도 있다. 또한, 완충제, 예를 들면, 인산염 완충액, 아세트산 나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면, 염산 프로카인, 안정제, 예를 들면, 벤질알코올, 페놀, 산화 방지제와 배합할 수도 있다. 조제된 주사액은 통상, 적절한 앰플에 충전시킨다. 또한, 리포솜도 세포 송달을 위해 상기 약제를 캡슐화하기 위하여 사용 가능하다.
투여는, 경구 또는 비경구이며, 바람직하게는 비경구 투여이며, 구체적으로는, 주사제형, 경비(經鼻) 투여제형, 경폐(經肺) 투여제형, 경피 투여형 등을 예로 들 수 있다. 주사제형의 예로서는, 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.
본 발명의 항체의 용량 및 투여 방법은, 환자의 연령, 체중, 성별, 치료해야 할 증상의 성질 또는 중증도 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 본 항체를 함유하는 의약 조성물의 투여량으로서는, 예를 들면, 1회에 대하여 체중 1 kg당 0.0001 mg으로부터 1,000 mg의 범위에서 선택할 수 있다. 또는, 환자당 0.01∼100,000 mg/body의 범위에서 투여량을 선택하는 것이 가능하지만, 이들 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량, 투여 방법은, 환자의 연령, 체중, 성별, 증상 등에 따라 변동하지만, 당사자가 적절하게 선택할 수 있다.
[실시예]
이하에서 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은, 이들로 한정되는 것은 아니다.
당 펩티드의 합성
항체의 특이성 평가를 위한 당 펩티드의 합성법을 이하에 나타낸다. 어느 화합물도 특이성 평가에 사용하기 위한 가교용의 케톤을, 또한 화합물 1∼4에는 Cys를 결합시킨 서열의 화합물을 합성하였다.
5- oxohexanoyl - Gly -Val- Thr - Ser -Ala-Pro-Asp- Thr - Arg -Pro-Ala-Pro- Gly - Ser -Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH2(화합물 1)의 합성
당 펩티드 고상 합성은, 고상 담체로서 TentaGel SRAM resin(0.24 ㎜ol/g, 50 mg, 12㎛ol)을 사용하였다. 아미노산 신장(伸長) 반응은, 마이크로파 조사(照射)(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, Fmoc 아미노산 유도체(48㎛ol), HBTU(48μ mol)와 HOBt(48㎛ol), DIEA(72㎛ol)의 DMF 용액에서 6분간 반응하였다. 무수 아세트산/DIEA/DMF(10:5:85, v/v/v) 용액으로 실온 하 1분간 처리하여 미반응의 아미노기의 아세틸화를 실시하였다. 이어서, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, 20% 피페리딘/DMF로 3분간 처리하여 Fmoc기를 탈보호하였다. 당 펩티드의 합성은, 이들 3공정 (1) 각종 Fmoc 아미노산에서의 신장, (2) 아세틸화 처리, (3) 탈Fmoc화를 순차적으로 반복하였다. 얻어진 고상 수지를 트리플루오로아세트산:물(95:5, v/v)로 2시간 처리하였다. 반응액을 여과하고 에테르를 가하여 침전시켜, 조(粗)결정을 얻었다. 조생성물을 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 1을 얻었다 (6.3 mg, 수율 22%).
5- oxohexanoyl - Gly -Val- Thr - Ser -Ala-Pro-Asp- Thr ( Tn )- Arg -Pro-Ala-Pro- Gly -Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH2(화합물 2)의 합성
당 펩티드 고상 합성은, 고상 담체로서 TentaGel SRAM resin(0.24 ㎜ol/g, 100 mg, 36㎛ol)을 사용하였다. 아미노산 신장 반응은, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, Fmoc 아미노산 유도체(144㎛ol), HBTU(144㎛ol)와 HOBt(144㎛ol), DIEA(216㎛ol)의 DMF 용액에서 6분간 반응하였다. 당쇄 치환 아미노산 신장 반응은, Fmoc-Thr[Ac3GalNAcα(1→O)](43㎛ol), HBTU(43㎛ol)와 HOBt(43㎛ol), DIEA(108㎛ol)의 DMF 용액에서 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 또한, HBTU(43㎛ol)와 HOBt(43㎛ol)를 가하고 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 무수 아세트산/DIEA/DMF(10:5:85, v/v/v) 용액으로 실온 하 1분간 처리하여 미반응의 아미노기의 아세틸화를 실시하였다. 이어서, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, 20% 피페리딘/DMF로 3분간 처리하여 Fmoc기를 탈보호하였다. 당 펩티드의 합성은, 이들 3공정 (1) 각종 Fmoc 아미노산에서의 신장, (2) 아세틸화 처리, (3) 탈Fmoc화를 순차적으로 반복하였다. 얻어진 고상 수지를 트리플루오로아세트산:물(95:5, v/v)로 2시간 처리하였다. 반응액을 여과하고 에테르를 가하여 침전시켜, 조결정을 얻었다. 조생성물을 메탄올에 용해하고, 1 N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH 12.0∼12.5로 조정하고 실온 하 1시간 처리하였다. 10% 아세트산을 가하여 pH를 7 부근으로 조정한 후, 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사(殘渣)를 역상(逆相) 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 2를 얻었다(13.3 mg, 수율 15%).
5- oxohexanoyl - Gly -Val- Thr - Ser -Ala-Pro-Asp- Thr (T)- Arg -Pro-Ala-Pro- Gly -Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys-NH2(화합물 3)의 합성
당 펩티드 고상 합성은, 고상 담체로서 TentaGel SRAM resin(0.24 ㎜ol/g, 200 mg, 48㎛ol)을 사용하였다. 아미노산 신장 반응은, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, Fmoc 아미노산 유도체(192㎛ol), HBTU(192㎛ol)와 HOBt(192㎛ol), DIEA(288㎛ol)의 DMF 용액에서 6분간 반응하였다. 당쇄 치환 아미노산 신장 반응은, Fmoc-Thr[Ac4Galβ(1→3) Ac2GalNAcα(1→O)(58㎛ol), HBTU(58㎛ol)와 HOBt(58㎛ol), DIEA(144㎛ol)의 DMF 용액에서 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 또한, HBTU(58㎛ol)와 HOBt(58㎛ol)를 가하고 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 무수 아세트산/DIEA/DMF(10:5:85, v/v/v) 용액으로 실온 하 1분간 처리하여 미반응의 아미노기의 아세틸화를 실시하였다. 이어서, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, 20% 피페리딘/DMF로 3분간 처리하여 Fmoc기를 탈보호하였다. 당 펩티드의 합성은, 이들 3공정 (1) 각종 Fmoc 아미노산에서의 신장, (2) 아세틸화 처리, (3) 탈Fmoc화를 순차적으로 반복하였다. 얻어진 고상 수지를 트리플루오로아세트산:물(95:5, v/v)로 2시간 처리하였다. 반응액을 여과하고 에테르를 가하여 침전시켜, 조결정을 얻었다. 조생성물을 메탄올에 용해하고, 1 N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH 12.0∼12.5로 조정하고 실온 하 1시간 처리하였다. 10% 아세트산을 가하여 pH를 7 부근으로 조정한 후, 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 3을 얻었다 (22.0 mg, 수율 17%).
5- oxohexanoyl - Gly -Val- Thr - Ser -Ala-Pro-Asp- Thr ( Sialyl -T)- Arg -Pro-Ala-Pro-Gly- Ser - Thr -Ala-Pro-Pro-Ala-His- Gly -Val- Thr - Cys -NH2(화합물 4)의 합성
화합물 3(10 mM, 300μl, water)을 1000 mM HEPES 버퍼(pH 7.0, 30μl), 1000 mM HEPES 버퍼(pH 7.0, 30μl), 1000 mM MnCl2(6μl), 150 mM CMP-NeuAc(60μl), 1.4 U/mL α2,3-(O)-Sialyltransferase, Rat, Reconbinant, S. frugiperda(30μl, Calbiochem), water(74μl)를 혼합한 반응액에 혼합하였다. 25℃에서 24시간 인큐베이트한 후, 반응액을 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 4를 얻었다(5.5 mg, 수율 60%).
5- oxohexanoyl - Gly -Val- Thr - Ser -Ala-Pro-Asp- Thr - Arg -Pro-Ala-Pro- Gly - Ser -Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2(화합물 5)의 합성
당 펩티드 고상 합성은, 고상 담체로서 Rink Amide-ChemMatrix resin(0.45 ㎜ol/g, 100 mg, 45㎛ol, 바이오타지사 제조)을 사용하였다. 아미노산 신장 반응은, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, Fmoc 아미노산 유도체(180㎛ol), HBTU(180μ mol)와 HOBt(180㎛ol), DIEA(270㎛ol)의 DMF 용액에서 6분간 반응하였다. 무수 아세트산/DIEA/DMF(10:5:85, v/v/v) 용액으로 실온 하 1분간 처리하여 미반응의 아미노기의 아세틸화를 실시하였다. 이어서, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, 20% 피페리딘/DMF로 3분간 처리하여 Fmoc기를 탈보호하였다. 당 펩티드의 합성은, 이들 3공정 (1) 각종 Fmoc 아미노산에서의 신장, (2) 아세틸화 처리, (3) 탈Fmoc화를 순차적으로 반복하였다. 얻어진 고상 수지를 트리플루오로아세트산:물(95: 5, v/v)로 2시간 처리하였다. 반응액을 여과하고 에테르를 가하여 침전시켜, 조결정을 얻었다. 조생성물을 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 5를 얻었다 (45.8 mg, 수율 45%).
5- oxohexanoyl - Gly -Val- Thr - Ser -Ala-Pro-Asp- Thr ( Tn )- Arg -Pro-Ala-Pro- Gly -Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2(화합물 6)의 합성
당 펩티드 고상 합성은, 고상 담체로서 Rink Amide-ChemMatrix resin(0.45 ㎜ol/g, 100 mg, 45㎛ol)을 사용하였다. 아미노산 신장 반응은, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, Fmoc 아미노산 유도체(180㎛ol), HBTU(180μ mol)와 HOBt(180㎛ol), DIEA(270㎛ol)의 DMF 용액에서 6분간 반응하였다. 당쇄 치환 아미노산 신장 반응은, Fmoc-Thr[Ac3GalNAcα(1→O)](54㎛ol), HBTU(54㎛ol)와 HOBt(54㎛ol), DIEA(135㎛ol)의 DMF 용액에서 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 또한, HBTU(54㎛ol)와 HOBt(54㎛ol)를 가하여 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 무수 아세트산/DIEA/DMF(10:5:85, v/v/v) 용액으로 실온 하 1분간 처리하여 미반응의 아미노기의 아세틸화를 실시하였다. 이어서, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, 20% 피페리딘/DMF로 3분간 처리하여 Fmoc기를 탈보호하였다. 당 펩티드의 합성은, 이들 3공정 (1) 각종 Fmoc 아미노산에서의 신장, (2) 아세틸화 처리, (3) 탈Fmoc화를 순차적으로 반복하였다. 얻어진 고상 수지를 트리플루오로아세트산:물(95:5, v/v)로 2시간 처리하였다. 반응액을 여과하고 에테르를 가하여 침전시켜, 조결정을 얻었다. 조생성물을 메탄올에 용해하고, 1 N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH 12.0∼12.5로 조정하고 실온 하 1시간 처리하였다. 10% 아세트산을 가하여 pH를 7 부근으로 조정한 후, 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 6을 얻었다(43.2 mg, 수율 39%).
5- oxohexanoyl - Gly -Val- Thr - Ser -Ala-Pro-Asp- Thr - Arg -Pro-Ala-Pro- Gly -Ser(Tn)-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2(화합물 7)의 합성
당 펩티드 고상 합성은, 고상 담체로서 Rink Amide-ChemMatrix resin(0.45 ㎜ol/g, 100 mg, 45㎛ol)을 사용하였다. 아미노산 신장 반응은, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, Fmoc 아미노산 유도체(180㎛ol), HBTU(180μ mol)와 HOBt(180㎛ol), DIEA(270㎛ol)의 DMF 용액에서 6분간 반응하였다. 당쇄 치환 아미노산 신장 반응은, Fmoc-Ser[Ac3GalNAcα(1→O)](54㎛ol), HBTU(54㎛ol)와 HOBt(54㎛ol), DIEA(135㎛ol)의 DMF 용액에서 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 또한, HBTU(54㎛ol)와 HOBt(54㎛ol)를 가하고 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 무수 아세트산/DIEA/DMF(10:5:85, v/v/v) 용액으로 실온 하 1분간 처리하여 미반응의 아미노기의 아세틸화를 실시하였다. 이어서, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, 20% 피페리딘/DMF로 3분간 처리하여 Fmoc기를 탈보호하였다. 당 펩티드의 합성은, 이들 3공정 (1) 각종 Fmoc 아미노산에서의 신장, (2) 아세틸화 처리, (3) 탈Fmoc화를 순차적으로 반복하였다. 얻어진 고상 수지를 트리플루오로아세트산:물(95:5, v/v)로 2시간 처리하였다. 반응액을 여과하고 에테르를 가하여 침전시켜, 조결정을 얻었다. 조생성물을 메탄올에 용해하고, 1 N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH 12.0∼12.5로 조정하고 실온 하 1시간 처리하였다. 10% 아세트산을 가하여 pH를 7 부근으로 조정한 후, 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 7을 얻었다(21.1 mg, 수율 19%).
5- oxohexanoyl - Gly -Val- Thr - Ser -Ala-Pro-Asp- Thr - Arg -Pro-Ala-Pro- Gly - Ser -Thr(Tn)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2(화합물 8)의 합성
당 펩티드 고상 합성은, 고상 담체로서 Rink Amide-ChemMatrix resin(0.45 ㎜ol/g, 100 mg, 45㎛ol)을 사용하였다. 아미노산 신장 반응은, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, Fmoc 아미노산 유도체(180㎛ol), HBTU(180μ mol)와 HOBt(180㎛ol), DIEA(270㎛ol)의 DMF 용액에서 6분간 반응하였다. 당쇄 치환 아미노산 신장 반응은, Fmoc-Thr[Ac3GalNAcα(1→O)](54㎛ol), HBTU(54㎛ol)와 HOBt(54㎛ol), DIEA(135㎛ol)의 DMF 용액에서 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 또한, HBTU(54㎛ol)와 HOBt(54㎛ol)를 가하고 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 무수 아세트산/DIEA/DMF(10:5:85, v/v/v) 용액으로 실온 하 1분간 처리하여 미반응의 아미노기의 아세틸화를 실시하였다. 이어서, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, 20% 피페리딘/DMF로 3분간 처리하여 Fmoc기를 탈보호하였다. 당 펩티드의 합성은, 이들 3공정 (1) 각종 Fmoc 아미노산에서의 신장, (2) 아세틸화 처리, (3) 탈Fmoc화를 순차적으로 반복하였다. 얻어진 고상 수지를 트리플루오로아세트산:물(95:5, v/v)로 2시간 처리하였다. 반응액을 여과하고 에테르를 가하여 침전시켜, 조결정을 얻었다. 조생성물을 메탄올에 용해하고, 1 N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH 12.0∼12.5로 조정하고 실온 하 1시간 처리하였다. 10% 아세트산을 가하여 pH를 7 부근으로 조정한 후, 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 8을 얻었다(48.2 mg, 수율 43%).
5- oxohexanoyl - Gly -Val- Thr ( Tn )- Ser ( Tn )-Ala-Pro-Asp- Thr ( Tn )- Arg -Pro-Ala-Pro-Gly-Ser(Tn)-Thr(Tn)-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2(화합물 9)의 합성
당 펩티드 고상 합성은, 고상 담체로서 Rink Amide-ChemMatrix resin(0.45 ㎜ol/g, 100 mg, 45㎛ol)을 사용하였다. 아미노산 신장 반응은, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, Fmoc 아미노산 유도체(180㎛ol), HBTU(180μ mol)와 HOBt(180㎛ol), DIEA(270㎛ol)의 DMF 용액에서 6분간 반응하였다. 당쇄 치환 아미노산 신장 반응은, Fmoc-Thr[Ac3GalNAcα(1→O)] 또는 Fmoc-Ser[Ac3GalNAcα(1→O)](54㎛ol), HBTU(54㎛ol)와 HOBt(54㎛ol), DIEA(135㎛ol)의 DMF 용액에서 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 또한, HBTU(54㎛ol)와 HOBt(54 mol)를 가하고 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 무수 아세트산/DIEA/DMF(10:5:85, v/v/v) 용액으로 실온 하 1분간 처리하여 미반응의 아미노기의 아세틸화를 실시하였다. 이어서, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, 20% 피페리딘/DMF로 3분간 처리하여 Fmoc기를 탈보호하였다. 당 펩티드의 합성은, 이들 3공정 (1) 각종 Fmoc 아미노산에서의 신장, (2) 아세틸화 처리, (3) 탈Fmoc화를 순차적으로 반복하였다. 얻어진 고상 수지를 트리플루오로아세트산:물(95:5, v/v)로 2시간 처리하였다. 반응액을 여과하고 에테르를 가하여 침전시켜, 조결정을 얻었다. 조생성물을 메탄올에 용해하고, 1 N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH 12.0∼12.5로 조정하고 실온 하 1시간 처리하였다. 10% 아세트산을 가하여 pH를 7 부근으로 조정한 후, 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 9를 얻었다(37.8 mg, 수율 25%).
5- oxohexanoyl - Gly -Val- Thr - Ser -Ala-Pro-Asp- Thr (T)- Arg -Pro-Ala-Pro- Gly -Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-NH2(화합물 10)의 합성
당 펩티드 고상 합성은, 고상 담체로서 Rink Amide-ChemMatrix resin(0.90 ㎜ol/g, 200 mg, 90㎛ol)을 사용하였다. 아미노산 신장 반응은, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, Fmoc 아미노산 유도체(360㎛ol), HBTU(360μ mol)와 HOBt(360㎛ol), DIEA(540㎛ol)의 DMF 용액에서 6분간 반응하였다. 당쇄 치환 아미노산 신장 반응은, Fmoc-Thr[Ac4Galβ(1→3) Ac2GalNAcα(1→O)](108㎛ol), HBTU(108㎛ol)와 HOBt(108㎛ol), DIEA(270㎛ol)의 DMF 용액에서 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 또한, HBTU(108㎛ol)와 HOBt(108㎛ol)를 가하고 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 무수 아세트산/DIEA/DMF(10:5:85, v/v/v) 용액으로 실온 하 1분간 처리하여 미반응의 아미노기의 아세틸화를 실시하였다. 이어서, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, 20% 피페리딘/DMF로 3분간 처리하여 Fmoc기를 탈보호하였다. 당 펩티드의 합성은, 이들 3공정 (1) 각종 Fmoc 아미노산에서의 신장, (2) 아세틸화 처리, (3) 탈Fmoc화를 순차적으로 반복하였다. 얻어진 고상 수지를 트리플루오로아세트산:물(95:5, v/v)로 2시간 처리하였다. 반응액을 여과하고 에테르를 가하여 침전시켜, 조결정을 얻었다. 조생성물을 메탄올에 용해하고, 1 N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH 12.0∼12.5로 조정하고 실온 하 1시간 처리하였다.10% 아세트산을 가하여 pH를 7 부근으로 조정한 후, 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 10을 얻었다(110 mg, 수율 46%).
5- oxohexanoyl - Gly -Val- Thr - Ser -Ala-Pro-Asp- Thr ( Sialyl -T)- Arg -Pro-Ala-Pro-Gly- Ser - Thr -Ala-Pro-Pro-Ala-His- Gly -Val- Thr -NH2(화합물 11)의 합성
화합물 8(10 mM, 496μl, water)을 1000 mM HEPES 버퍼(pH 7.0, 30μl), 1000 mM MnCl2(8μl), 200 mM CMP-NeuAc(95μl), 1.4 U/mL α2,3-(O)-Sialyltransferase, Rat, Reconbinant, S. frugiperda(28μl, Calbiochem), water(212μl)를 혼합한 반응액에 혼합하였다. 25℃에서 24시간 인큐베이트한 후, 반응액을 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 11을 얻었다(14 mg, 수율 96%)
5- oxohexanoyl -Pro-Pro- Thr - Thr - Thr -Pro- Ser -Pro-Pro-Pro- Thr - Ser - Thr - Thr - Thr-Leu-Pro-Pro-Thr-NH2(화합물 12)의 합성
펩티드 고상 합성은, 고상 담체로서 Rink Amide-ChemMatrix resin(0.48 ㎜ol/g, 25 mg, 12㎛ol)를 사용하였다. 아미노산 신장 반응은, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, Fmoc 아미노산 유도체(48㎛ol), HBTU(48㎛ol)와 HOBt(48㎛ol), DIEA(72㎛ol)의 DMF 용액에서 9분간 반응하였다. 무수 아세트산/DIEA/DMF(10:5:85, v/ v/v) 용액으로 실온 하 1분간 처리하여 미반응의 아미노기의 아세틸화를 실시하였다. 이어서, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, 20% 피페리딘/DMF로 3분간 처리하여 Fmoc기를 탈보호하였다. 당 펩티드의 합성은, 이들 3공정 (1) 각종 Fmoc 아미노산에서의 신장, (2) 아세틸화 처리, (3) 탈Fmoc화를 순차적으로 반복하였다. 얻어진 고상 수지를 트리플루오로아세트산: 물: 트리이소프로필실란(95: 2.5: 2.5, v/v/v)으로 1시간 처리하였다. 반응액을 여과하고 에테르를 가하여 침전시켜, 조결정을 얻었다. 조생성물을 메탄올에 용해하고, 1 N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH 12.0∼12.5로 조정하고 실온 하 1시간 처리하였다. 10% 아세트산을 가하여 pH를 7 부근으로 조정한 후, 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 12를 얻었다(7.2 mg, 수율 30%).
5- oxohexanoyl -Pro-Pro- Thr - Thr ( Tn )- Thr ( Tn )-Pro- Ser -Pro-Pro-Pro- Thr - Ser -Thr-Thr(Tn)-Thr(Tn)-Leu-Pro-Pro-Thr-NH2(화합물 13)의 합성
당 펩티드 고상 합성은, 고상 담체로서 Rink Amide-ChemMatrix resin(0.48 ㎜ol/ g, 25 mg, 12㎛ol)을 사용하였다. 아미노산 신장 반응은, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, Fmoc 아미노산 유도체(48㎛ol), HBTU(48㎛ol)와 HOBt(48㎛ol), DIEA(72㎛ol)의 DMF 용액에서 9분간 반응하였다. 당쇄 치환 아미노산 신장 반응은, Fmoc-Thr[Ac3GalNAcα(1→O)](14㎛ol), PyBOP(14㎛ol)와 HOAt(14㎛ol), DIEA(36㎛ol)의 DMF 용액에서 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 또한, PyBOP(14㎛ol)와 HOAt(14㎛ol)를 가하고 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 무수 아세트산/DIEA/DMF(10:5:85, v/v/v) 용액으로 실온 하 1분간 처리하여 미반응의 아미노기의 아세틸화를 실시하였다. 이어서, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, 20% 피페리딘/DMF로 3분간 처리하여 Fmoc기를 탈보호하였다. 당 펩티드의 합성은, 이들 3공정 (1) 각종 Fmoc 아미노산에서의 신장, (2) 아세틸화 처리, (3) 탈Fmoc화를 순차적으로 반복하였다. 얻어진 고상 수지를 트리플루오로아세트산:물:트리이소프로필실란(95:2.5:2.5, v/v/v)으로 1시간 처리하였다. 반응액을 여과하고 에테르를 가하여 침전시켜, 조결정을 얻었다. 조생성물을 메탄올에 용해하고, 1 N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH 12.0∼12.5로 조정하고 실온 하 1시간 처리하였다. 10% 아세트산을 가하여 pH를 7 부근으로 조정한 후, 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 13을 얻었다(4.7 mg, 수율 14%).
5- oxohexanoyl - Ser -Ala- Ser - Thr - Gly -His-Ala- Thr -Pro-Leu-Pro-Val- Thr -Asp-Thr-Ser-Cys-NH2(화합물 14)의 합성
펩티드 고상 합성은, 고상 담체로서 TentaGel SRAM resin(0.24 ㎜ol/g, 200 mg, 48㎛ol, 랩폴리머사 제조)을 사용하였다. 아미노산 신장 반응은, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, Fmoc 아미노산 유도체(192㎛ol), HBTU(192㎛ol)와 HOBt(192㎛ol), DIEA(288㎛ ol)의 DMF 용액에서 6분간 반응하였다. 무수 아세트산/DIEA/DMF(10:5:85, v/v/v) 용액으로 실온 하 1분간 처리하여 미반응의 아미노기의 아세틸화를 실시하였다. 이어서, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, 20% 피페리딘/DMF로 3분간 처리하여 Fmoc기를 탈보호하였다. 당 펩티드의 합성은, 이들 3공정 (1) 각종 Fmoc 아미노산에서의 신장, (2) 아세틸화 처리, (3) 탈Fmoc화를 순차적으로 반복하였다. 얻어진 고상 수지를 트리플루오로아세트산:물(95:5, v/v)로 2시간 처리하였다. 반응액을 여과하고 에테르를 가하여 침전시켜, 조결정을 얻었다. 조생성물을 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 14를 얻었다(9.0 mg, 수율 11%).
5- oxohexanoyl - Ser -Ala- Ser - Thr - Gly -His-Ala- Thr ( Tn )-Pro-Leu-Pro-Val- Thr -Asp-Thr- Ser - Cys -NH2(화합물 15)의 합성
당 펩티드 고상 합성은, 고상 담체로서 TentaGel SRAM resin(0.24 ㎜ol/g, 200 mg, 48㎛ol, 랩폴리머사 제조)을 사용하였다. 아미노산 신장 반응은, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, Fmoc 아미노산 유도체(192㎛ol), HBTU(192㎛ol)와 HOBt(192㎛ol), DIEA(288㎛ol)의 DMF 용액에서 6분간 반응하였다. 당쇄 치환 아미노산 신장 반응은, Fmoc-Thr[Ac3GalNAcα(1→O)](58㎛ol), HBTU(58㎛ol)와 HOBt(58㎛ol), DIEA(144㎛ol)의 DMF 용액에서 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 또한, HBTU(58㎛ol)와 HOBt(58㎛ol)를 가하고 마이크로파 조사 하 10분간 반응하였다. 무수 아세트산/DIEA/DMF(10:5:85, v/v/v) 용액으로 실온 하 1분간 처리하여 미반응의 아미노기의 아세틸화를 실시하였다. 이어서, 마이크로파 조사(40 W, 2450 MHz, 50℃)의 조건 하, 20% 피페리딘/DMF로 3분간 처리하여 Fmoc기를 탈보호하였다. 당 펩티드의 합성은, 이들 3공정 (1) 각종 Fmoc 아미노산에서의 신장, (2) 아세틸화 처리, (3) 탈Fmoc화를 순차적으로 반복하였다. 얻어진 고상 수지를 트리플루오로아세트산:물(95:5, v/v)로 2시간 처리하였다. 반응액을 여과하고 에테르를 가하여 침전시켜, 조결정을 얻었다. 조생성물을 메탄올에 용해하고, 1 N 수산화나트륨 수용액을 가하여 pH 12.0∼12.5로 조정하고 실온 하 1시간 처리하였다. 10% 아세트산을 가하여 pH를 7 부근으로 조정한 후, 용매를 증류 제거했다. 얻어진 잔사를 역상 고속 액체 크로마토그래피에 의해 정제를 행하여, 동결 건조 분말로서 화합물 15를 얻었다(13.0 mg, 수율 14%).
화합물 1∼15의 동정(同定) 데이터를 이하에 정리하여 기재한다.
MUC1 유래 당 펩티드의 MALDI-TOFMS 스펙트럼(도 1a 및 도 1b)
(a) 화합물 1, m/z calcd for C100H160N30O34S [M + H]+ 2358.151, found 2358.383;
(b) 화합물 2, m/z calcd for C108H173N31O39S [M + H]+ 2561.231, found 2561.457;
(c) 화합물 3, m/z calcd for C114H183N31O44S [M + H]+ 2723.283, found 2723.504;
(d) 화합물 4, m/z calcd for C125H200N32O52S [M + H]+ 3014.379, found 3014.640
(e) 화합물 5, m/z calcd for C97H156N29O33 [M + H]+ 2255.142, found 2254.927;
(f) 화합물 6, m/z calcd for C105H169N30O38 [M + H]+ 2458.221, found 2457.954;
(g) 화합물 7, m/z calcd for C105H169N30O38 [M + H]+ 2458.221, found 2458.077;
(h) 화합물 8, m/z calcd for C105H169N30O38 [M + H]+ 2458.221, found 2458.159
(i) 화합물 9, m/z calcd for C137H221N34O58 [M + H]+ 3270.538, found 3270.308
(j) 화합물 10, m/z calcd for C111H179N30O43 [M + H]+ 2620.274, found 2620.049;
(k) 화합물 11, m/z calcd for C122H196N31O51 [M + H]+ 2911.369, found 2911.207;
MUC2 유래 당 펩티드의 MALDI-TOFMS 스펙트럼(도 2)
(l) 화합물 12, m/z calcd for C90H144N20O31 [M + Na]+ 2024.020, found 2024.111;
(m) 화합물 13, m/z calcd for C122H196N24O51 [M + Na]+ 2836.338, found 2836.501
MUC4 유래 당 펩티드의 MALDI-TOFMS 스펙트럼(도 3)
(n) 화합물 14, m/z calcd for C73H181N20O28S [M + Na]+ 1777.804, found 1777.910;
(o) 화합물 15, m/z calcd for C81H131N21O33S [M + Na]+ 1980.884, found 1981.045;
실시예 1
Gly -Val- Thr - Ser -Ala-Pro-Asp- Thr ( Tn )- Arg -Pro-Ala-Pro- Gly - Ser - Thr -Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr를 항원으로서 사용한 모노클로날 항체의 제조
Gly -Val- Thr - Ser -Ala-Pro-Asp- Thr ( Tn )- Arg -Pro-Ala-Pro- Gly - Ser - Thr -Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr의 C 말단에 캐리어 단백질 결합에 필요한 Cys를 부가한 화합물 Gly -Val- Thr - Ser -Ala-Pro-Asp- Thr ( Tn )- Arg -Pro-Ala-Pro- Gly - Ser - Thr -Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr Cys-NH2(85μg)를 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 콘쥬게이트하고, 마우스 BDF-1 테일 베이스에 투여하여 면역 반응을 야기했다. 17일 후에 동일한 방법으로 화합물 3의 추가 면역을 행하고, 3일 후에 채혈하고 장골(腸骨) 림프절을 채집했다. 채집한 세포는 골수종 세포 SP2와 세포 융합한 후, HAT 선택 배지에서 배양하고 항체 생산 세포를 선택하였다. 다음으로, 얻어진 하이브리도마의 배양 상청액을 ELISA 플레이트 상에 파종하고, 화합물 2와의 결합 반응으로 스크리닝했다.
융합 세포의 클로닝은, 한계 희석법 등에 의해 행하고, 목적으로 하는 모노클로날 항체 SN-101을 생산하는 하이브리도마주 3A9-4B1(NPMD 수탁 번호 NITE BP-01845) 및 목적으로 하는 모노클로날 항체 SN-102를 생산하는 하이브리도마주 3 C10-E11을 수립했다.
실험예 2 모노클로날 항체( SN -101 및 SN -102) 생산 세포주의 배양과 항체의 정제 취득
배양법: SN-101을 생산하는 하이브리도마주 NITE BP-01845를, 10% 우태아 혈청(FBS)을 포함하는 RPMI-1640 배지에서 증식시켰다. 회수한 8.1×106개의 세포에 대하여, 22 ml의 무혈청 배지 Panserin H4000(PAN-Biotech)을 가하여 현탁하고, 배양함으로써, 이 배지에 대한 순화(馴化)를 행하였다. 순화한 세포를 동일 배지에서 1.0×108개 정도까지 증식시키고, 5.0×105/ml로 되도록 계대(繼代)했다. 이것을 2주일 정치(靜置) 배양한 후에, 원심분리에 의해 배양 상청액을 얻었다. 다른 한쪽의 항체 SN-102를 생산하는 하이브리도마주 3C10-E11에 대해도 전술한 방법과 동일한 방법으로 배양하고, 배양 상청액을 얻었다.
정제법: 배양한 하이브리도마주 NITE BP-01845로부터, SN-101을 이하의 방법으로 정제하였다. 배양 상청액 200 mL를 0.45 ㎛의 필터로 여과하여, 항체 정제의 재료로 만들었다. 또는 배양 상청액에 황산암모늄을 가하여 50% 포화로 하고, 10000 g, 20분간의 원심분리에 의해 침전을 회수하였다. 이것을 10 ml의 PBS에 용해하고, 또한 동일한 용액에 대하여 투석한 것을 정제 재료로서, HiTrap Protein G HP 컬럼(GE 헬스케어)에 의한 친화성 크로마토그래피에 제공했다. AKTA explorer 100(GE 헬스케어)에 접속한 HiTrap Protein G HP 컬럼을, 20 mM 인산 나트륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화하고, 시료를 첨가하였다. 동일한 완충액으로 컬럼에 결합하지 않는 불필요한 성분을 세정한 후, 결합한 항체를 0.1 M 글리신 염산 완충액(pH 2.5)으로 용출하고, 소량의 1 M 트리스 염산 완충액(pH 9.0)의 첨가에 의해 중화했다. 또한, 컬럼을 통과한 획분을 반복적으로 컬럼에 첨가, 용출함으로써, 항체의 회수율을 향상시켰다. 여기까지의 작업을 통하여, SN-101을 2.3 mg 얻을 수 있다. 다른 한쪽의 3C10-E11의 배양 상청액 200 mL로부터는, 동일한 정제법을 행한 결과, SN-102를 8.3 mg 얻을 수 있었다.
실시예 3 항체와의 반응 특이성 평가
당 펩티드 고정화 어레이의 제조
당쇄 고정화 어레이용 기판(스미토모 베이크라이트사 제조)을 2 M HCl로 37℃, 2시간 처리하고, tert-부톡시카르보닐기(Boc기)의 탈보호를 행하였다. 물로 2회 세정한 후, 건조시키고, 기판 표면에 아미노옥시기를 제조하였다. 표 1에 나타낸 각각의 합성 당 펩티드에 스포팅 용액(25 mM AcOH/Pyridine, 0.005% Triton X-100, pH 5.4)을 가하여 용해하고, 스포터(BioChip Arrayer, Cartesian사 제조), 스폿 핀(CMP, 핀 직경 0.4 ㎜, Arraylt사)을 사용하여 기판에 스포팅하고, 80℃, 1시간 반응시켜, 기판에 당 펩티드를 고정화했다. 물로 1회 세정한 후, 10 mg/mL의 무수 숙신산에 침지시키고, 실온에서 3시간 반응하고, 미반응의 아미노옥시기의 보호를 행하였다. 물로 2회 세정하고, 건조하였다.
배양 상청액을 하기 반응 용액으로 10배 희석하였다. 당 펩티드 고정화 어레이에 하이브리커버(스미토모 베이크라이트사 제조)를 씌우고, 희석 용액 70μL를 전개하고, 실온에서 2시간 반응하였다. 하이브리커버를 제거하고 하기 세정 용액 및 물로 1회씩 기판을 세정하였다. 기판을 건조시킨 후, 하이브리커버를 씌우고, Anti-IgG(H＋L), Mouse, Goat-Poly, Cy3(록랜드이뮤노케미컬즈사 제조)를 하기 용액으로 1μg/mL로 조제한 것을 기판 상에 전개하고, 실온에서 1시간 반응하였다. 반응 후, 상기 세정액으로 세정하였다. 측정은 스캐너(Typhoon TRIO+, GE 헬스케어)를 사용하여 Cy3의 형광 강도를 측정하였다. 형광 응답의 디지털 화상은 Array VisionTMSoftware version 8(GE 헬스케어)를 사용하여 작성하였다. 결과를 도 4에 나타낸다. 반응 용액: 50 mM Tris·HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, MnCl2, MgCl2, 0.05% Tween 20 세정 용액: 50 mM Tris·HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, MnCl2, MgCl2, 0.05% Tr iton X-100
[표 1]
MUC1 유래 당 펩티드 및 그의 유사체의 서열 데이터
(가교용의 케톤 및 Cys를 결합시킨 서열)
Figure pct00001
화합물 1∼4: 서열 번호 3
화합물 5∼11: 서열 번호 1
화합물 12∼13: 서열 번호 4
화합물 14∼15: 서열 번호 5
항체 SN -101 및 항체 SN -102의 특징
항체 SN-101 및 항체 SN-102는, 각각 MUC1으로부터 유래하는 당 펩티드의 당쇄 Tn 구조 및 수식 위치를 하기와 같이 특이적으로 인식하고 결합하였다.
SN -101
(i) 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드의 8번 위치의 트레오닌에 Tn 당쇄가 결합한 당 펩티드 Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Cys에 결합하고
(ii) 상기 MUC1 유래의 당 펩티드의 Tn 당쇄가, T 또는 STn으로 치환된 당 펩티드에 결합하지 않고
(iii) 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드(naked peptide)에 결합하지 않고,
(iv) MUC2의 탠덤 유닛 펩티드 또는 MUC4의 탠덤 유닛 펩티드에 Tn이 수식된 당 펩티드에 결합하지 않았다.
SN -102
(i) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드의 8번 위치의 트레오닌에 Tn 당쇄가 결합한 당 펩티드 Gly-Val-Thr-Ser-Ala-Pro-Asp-(Tn)Thr-Arg-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr에 결합하고
(ii) 상기 MUC1 유래의 당 펩티드의 Tn 당쇄가, T 또는 STn으로 치환된 당 펩티드에 결합하지 않거나, 결합해도 약한 결합이며
(iii) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드(naked peptide)에 결합하지 않고,
(iV) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드의 14번 위치의 세린, 15번 위치의 트레오닌에 Tn 당쇄가 수식된 당 펩티드에는 결합하지 않고
(V) 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드의 트레오닌, 세린의 전체에 Tn 당쇄가 수식된 당 펩티드에는 결합하고
(iv) MUC2의 탠덤 유닛 펩티드 또는 MUC4의 탠덤 유닛 펩티드에 Tn이 수식된 당 펩티드에 결합하지 않았다.
실시예 4 환자 혈청 중의 MUC1 당 펩티드의 검출
항체 SN-101을 사용하여, 유방암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 대장암 및 난소암 검체 혈청 중에 항원 당 펩티드가 검출되는지를 검토했다. 검체수는, 임상적으로 분명하게 상기 질환으로 진단된 환자 혈청 5∼10 예, 음성 컨트롤로서 정상 혈청 수개의 예로 하였다. 정상 혈청에서는 항원 당 펩티드가 검출되지 않지만, 환자 혈청에서는 항원 당 펩티드가 검출되었다.
실시예 5 항체 SN -101 및 항체 SN -102에 의한 MUC1 발현 세포의 면역 형광 염색
유방암 세포주 OCUB-M을 10% FBS를 포함하는 D-MEM 중에서 5% CO2 하, 37℃에서 하룻밤 배양했다. 배지를 흡인 제거하고, PBS로 세포층을 세정한 후, 4% 파라포름알데히드를 포함하는 PBS로 10분간 고정하였다. 이어서, 0.1% Triton XTM-100을 포함하는 PBS로 침투 처리한 후에, 블로킹 버퍼(1% BSA 함유 PBS)로 20분간 블로킹을 행하였다. 다음으로, 블로킹 버퍼로 희석한 항체 SN-101 또는 항체 SN-102의 10 μg/mL 용액을 1시간 반응시켰다. 음성 컨트롤에는, 1차 항체 대신 블로킹액을 반응시킨 것을 준비하였다. 항체 용액을 제외하고, PBS로 세정한 후, 2 μg/mL의 Alexa FluorR 555 표지 항마우스 IgG 항체를 반응시켰다. PBS로 세정하고, 봉입(封入)한 후에, 올인원 형광 현미경 BZ-9000(KEYENCE)로 관찰한 바, 특이적인 염색상(染色像)을 얻을 수 있었다(도 5 참조).
실시예 6 세포 증식 저해 실험
DMEM(10% FBS) 배지에서 배양한 유방암 세포 OCUB-M을 1 웰당 3×103 개가 되도록 96 웰 플레이트에 파종했다. 5% CO2 분위기 하 37℃에서 48 시간 배양한 후, 항체 SN-101을 최종 농도 0.565 mg/mL, 또는 1.13 mg/mL가 되도록 첨가하였다. 5% CO2 분위기 하 37℃에서 48 시간 배양한 후, Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega) 시약을 1 웰당, 20 μL 첨가하고, 5% CO2 분위기 하 37℃에서 2 시간 인큐베이트했다. 490 ㎚의 흡광도를 측정한 결과, 컨트롤과 비교하여 농도 의존적으로 세포수의 감소가 인정되었다(도 6 참조).
실시예 7 갈렉틴 3 결합 저해 실험
8 웰형 챔버 슬라이드에, RPMI-1640(10% FBS)에 부유(浮遊)시킨 유방암 세포 MCF-7을 4.8×103 개씩 첨가하고, 5% CO2 분위기 하, 37℃에서 16시간 배양했다. 배지를 흡인 제거하고, 세포가 2 ㎜ 잠길 정도의 4% 포름알데히드 in PBS를 가하였다. 세포를 15분간 고정하였다. 고정액을 흡인 제거하고, PBS로 각각 5분간, 3회 세정하였다. 블로킹 버퍼(5% BSA 함유 PBS)로 1시간 블로킹을 행하였다. 블로킹액을 흡인 제거하고, 상기 항체만, 다양한 농도의 SN-101로 갈렉틴 3을 혼합하고, 4℃에서 2시간 인큐베이트했다. 항체를 흡인 제거한 후, PBS로 각 5분간, 3회 세정하였다. Cy5 라벨화 항마우스 IgG 항체를 첨가하고, 암실, 실온에서 1시간 인큐베이트하였다. 2차 항체를 흡인 제거한 후, PBS로 각각 5분간, 3회 세정하였다. 올인원 형광 현미경 BZ-9000(KEYENCE)로 관찰한 바, 상기 항체 농도 의존적으로 갈렉틴 3과 MUC1과의 결합 저해가 인정되었다.
[산업상 이용가능성]
본 발명에 의해, 인간 MUC1의 탠덤 유닛 펩티드에 O-결합형 당쇄 Tn으로 수식된 당 펩티드를 극히 특이적으로 인식하는 항체가 제공된다. 본 발명의 항MUC1 항체를 사용함으로써, Tn으로 수식된 당 펩티드에피토프 특이적으로, 고감도로, 신뢰성을 가지고, 또한 간편하게 MUC1의 존재를 검출할 수 있고, MUC1와 관련된 질환으로서 악성 종양을 판정하는 것이 가능하게 되므로, 의료 진단 분야에 있어서 유용할 것으로 여겨진다. 또한, 본 발명의 항MUC1 항체는, MUC1가 관련되는 암 세포의 기능에 영향을 주는 것에 의해, 암 치료 등 의약 분야에 있어서 유용할 것으로 여겨진다.
[서열목록 프리텍스트]
서열 번호 1: 인간 MUC1의 탠덤 유닛 펩티드의 아미노산 서열
서열 번호 2: 인간 MUC1의 탠덤 유닛 펩티드의 변이체의 아미노산 서열
서열 번호 3: 인간 MUC1의 탠덤 유닛 펩티드의 C 말단에 Cys를 부가한 펩티드의 아미노산 서열
서열 번호 4: 인간 MUC2의 탠덤 유닛 펩티드의 아미노산 서열
서열 번호 5: 인간 MUC4의 탠덤 유닛 펩티드의 아미노산 서열
서열 번호 6: SN-101H의 아미노산 서열
서열 번호 7: SN-101L의 아미노산 서열
서열 번호 8: SN-101H의 CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 9: SN-101H의 CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 10: SN-101H의 CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 11: SN-101L의 CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 12: SN-101L의 CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 13: SN-101L의 CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 14: SN-102H의 아미노산 서열
서열 번호 15: SN-102L의 아미노산 서열
서열 번호 16: SN-102H의 CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 17: SN-102H의 CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 18: SN-102H의 CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 19: SN-102L의 CDR1의 아미노산 서열
서열 번호 20: SN-102L의 CDR2의 아미노산 서열
서열 번호 21: SN-102L의 CDR3의 아미노산 서열
독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물 기탁 센터 NITEBP-01845 20140418
SEQUENCE LISTING <110> Medicinal Chemistry Pharmaceuticals, Co., Ltd. <120> Antibody and its Antigenic Bonding Fragment to Mucin1 (MUC1) Glycopeptide and Use thereof <130> 151297H <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 1 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 1 5 10 15 Pro Pro Ala His Gly Val Thr 20 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 2 Gly Val Thr Ser Ala Pro Glu Ser Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 1 5 10 15 Pro Pro Ala His Gly Val Thr 20 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 3 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala 1 5 10 15 Pro Pro Ala His Gly Val Thr Cys 20 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 4 Pro Pro Thr Thr Thr Pro Ser Pro Pro Pro Thr Ser Thr Thr Thr Leu 1 5 10 15 Pro Pro Thr <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 5 Ser Ala Ser Thr Gly His Ala Thr Pro Leu Pro Val Thr Asp Thr Ser 1 5 10 15 Cys <210> 6 <211> 135 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 6 Met Asp Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ile Ile Val Leu Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Ser Glu Val Asn Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His 65 70 75 80 Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95 Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Gly Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 115 120 125 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 7 <211> 132 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 7 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys 130 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 8 Asn Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 9 Gln Ile Arg Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 10 Gly Val Phe Asp Tyr 1 5 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 11 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 12 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 13 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Pro Trp Thr 1 5 10 <210> 14 <211> 139 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 14 Met Lys Cys Ser Trp Ile Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly 1 5 10 15 Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile 35 40 45 Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Thr Glu Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala 65 70 75 80 Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ile Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val His Phe Tyr Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Arg Gly Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 15 <211> 131 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 15 Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 <210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 16 Asp Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 17 Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 18 Phe Tyr Tyr Gly Tyr Asp Val Gly Arg Gly Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 19 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 20 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Homo Sapience <400> 21 Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Thr 1 5

Claims (17)

  1. 인간 MUC1에 대한 모노클로날(monoclonal) 항체로서, 인간 MUC1 탠덤(tandem) 유닛 및 상기 인간 MUC1 탠덤 유닛의 아미노산 서열 중의 트레오닌 및 세린 중 어느 하나에 O-결합형 당쇄(糖鎖) 코어 0(Tn)을 가지는 당 펩티드를 특이적으로 인식하는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인간 MUC1 탠덤 유닛의 아미노산 서열은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 O-결합형 당쇄 코어 0(Tn)은 상기 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 8번 위치의 트레오닌에 결합하는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 인간 MUC1 탠덤 유닛의 아미노산 서열은 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 상기 O-결합형 당쇄 코어 0(Tn)은 상기 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 8번 위치의 세린에 결합하는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 i)∼iii)에 나타낸 결합 특성을 가지는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편:
    i) 상기 O-결합형 당쇄 코어 0(Tn)이, O-결합형 당쇄 T 또는 STn으로 치환된 당 펩티드에 결합하지 않고,
    ii) 서열 번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩티드(naked peptide)에 결합하지 않고, 또한
    iii) MUC2의 탠덤 유닛 펩티드 또는 MUC4의 탠덤 유닛 펩티드에 Tn이 수식(修飾)된 당 펩티드에 결합하지 않음.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 글로불린 중쇄(重鎖) 가변 영역(VH) 도메인 및 면역 글로불린 경쇄(輕鎖) 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 적어도 1개의 항원 결합 부위를 가지고 있고, 상기 중쇄 가변 영역 도메인은, 그 서열 중에, 상보성(相補性) 결정 영역 CDR1, CDR2, CDR3를 포함하고, CDR1은 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2는 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR3는 서열 번호 10의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역 도메인은, 그 서열 중에, 상보성 결정 영역 CDR1', CDR2', CDR3'를 포함하고, CDR1'는 서열 번호 11의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2'는 서열 번호 12의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR3'는 서열 번호 13의 아미노산 서열로 이루어지는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    면역 글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 도메인 및 면역 글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 도메인을 포함하는 적어도 1개의 항원 결합 부위를 가지고 있고, 상기 중쇄 가변 영역 도메인은, 그 서열 중에, 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, CDR3를 포함하고, CDR1은 서열 번호 16의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2는 서열 번호 17의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR3는 서열 번호 18의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 경쇄 가변 영역 도메인은, 그 서열 중에, 상보성 결정 영역 CDR1', CDR2', CDR3'를 포함하고, CDR1'는 서열 번호 19의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR2'는 서열 번호 20의 아미노산 서열로 이루어지고, CDR3'는 서열 번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  7. 제5항에 있어서,
    서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 7의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  8. 제6항에 있어서,
    서열 번호 14의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 15의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합성 단편은, 상기 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2, CDR3, CDR1', CDR2', 및 CDR3' 중 적어도 1개를 포함하는 펩티드인, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합성 단편은, Fab, F(ab')2, Fab', 다이아바디(diabody), 단일쇄 항체(예를 들면, scFv, dsFv), 2가(價)의 특이적 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체인, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    MUC1의 특이적 검출에 사용하기 위한, 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편.
  12. 인간 체액 샘플 중의 MUC1을 특이적으로 검출하는 방법으로서,
    (a) 상기 샘플을 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편과 접촉시키고,
    (b) 접촉 후의 샘플에서의 항체(또는 그의 항원 결합성 단편)-항원 복합체의 형성을 측정하는 것을 포함하는, 인간 체액 샘플 중의 MUC1을 특이적으로 검출하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 체액 샘플 중의, MUC1의 이상(異常) 발현이 관찰되는 악성 종양의 유무의 검출에 사용하기 위한, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 악성 종양이 유방암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 대장암, 및 난소암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  15. (a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편과,
    (b) 항체(또는 그의 항원 결합성 단편)-항원 복합체를 측정하기 위한 시약을 포함하는, 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한, 키트.
  16. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합성 단편을 유효 성분으로서 함유하는, 악성 종양의 예방 및/또는 치료용의 의약 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 악성 종양이 유방암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 대장암, 및 난소암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
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KR20190045626A (ko) * 2017-10-24 2019-05-03 중앙대학교 산학협력단 유방암 진단용 조성물 및 이의 용도

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