KR20170008151A

KR20170008151A - 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 코딩 유전자를 함유하는 미생물 변이체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20170008151A
Application number: KR1020160075640A
Authority: KR
Inventors: 서영빈; 이기성; 박재연; 박중민; 박우찬; 이종주; 이혜성; 강경현
Original assignee: 에스케이이노베이션 주식회사
Priority date: 2015-07-13
Filing date: 2016-06-17
Publication date: 2017-01-23

Abstract

본 발명은 메틸말로닐-CoA (methylmalonyl-CoA)를 메틸말로네이트 세미알데하이드(methylmalonate semialdehyde)로 전환하는 활성을 가지는 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 코딩 유전자를 함유하는 미생물 변이체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 아키아 (Archaea)계 유래 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈를 코딩하는 유전자가 도입된 미생물 변이체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 코딩 유전자를 함유하는 미생물 변이체 및 이의 용도 {Mutant Microorganism Comprising Gene Coding Methylmalonyl-CoA Reductase and Use Thereof}

메타크릴산 및/또는 메틸메타크릴산 (또는 메틸메타크릴레이트)은 코팅, 투명플라스틱, 접착제와 같은 중합체 제조에 사용 가능한 물질이다. 메타크릴산을 생합성하기 위한 공정 개발 및 이의 적용이 진행중이다. 예를 들어, Evonik사는 합성가스 예를 들어, 암모니아, 메탄, 아세톤, 메탄올로부터 2-HIBA (2-hydroxybutyric acid)를 거쳐 (2-HIBA의 탈수 반응후 에스터화반응) 메틸메타크릴산을 합성하는 공정을 개발하였다.

이러한 메타크릴산 및/또는 메틸메타크릴산 (또는 메틸메타크릴레이트)으로 전환될 수 있는 생물적 중간체는 2-HIBA 뿐 아니라, 이타콘산 (itaconic acid), 이소부티릭산 (isobutyric acid), 이소부틸렌 (isobutylene), 3-HIBA 등으로 알려져 있다.

메틸메타크릴산의 생물학적 합성과 관련하여, 미국등록특허 제8865439호는 탄소원으로부터 3-HIBA를 거쳐 메틸메타크릴산을 생물학적으로 합성하는 경로 및 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 개시하고 있다.

메틸메타크릴산의 생물학적 합성 경로 중, 가장 높은 이론 수율을 확보 예상 가능한 3-HIBA를 도 1에서와 같이 글루코스로부터 생물적으로 효율적으로 제조하기 위해서는 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈가 필수적으로 필요한 것으로 알려져 있다. 그러나, 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈는 아직 자연계 상태에서 발견되지 않은 효소이다.

따라서, 3-HIBA의 생합성을 위한 도 1에 따른 대사 경로를 구축하기 위해서는 메틸말로닐-CoA (methylmalonyl-CoA)를 메틸말로네이트 세미알데하이드(methylmalonate semialdehyde)로 전환하는 효소인 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈의 탐색이 가장 필요한 상황이다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 말로닐-CoA를 말로네이트 세미알데하이드로 전환하는 효소(MCR) 중에서 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 활성을 나타내는 효소 및 그 유전자를 선별하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 MMCR (methylmalonyl-CoA reductase)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 3-HIBA (3-hydroxyisobutyric acid) 생성능을 가지는 미생물 변이체 및 이의 용도를 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탄소원으로부터 숙시닐-CoA 생성능을 가지는 미생물에서 다음의 효소를 코딩하는 유전자를 함유하고 3-HIBA (3-hydroxyisobutyric acid) 생성능을 가지는 미생물 변이체에 있어서,

(i) 메틸말로닐-CoA 뮤테이즈 (methylmalonyl-CoA mutase);

(ii) 메틸말로닐-CoA 에피머라제 (methylmalonyl-CoA epimerase);

(iii) 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 (methylmalonyl-CoA reductase, MMCR); 및

(iv) 3-하이드록시이소부티레이트 디하이드로게나아제 (3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase), 상기 (iii)의 효소는 말로닐-CoA 리덕테이즈 (malonyl-CoA reductase, MCR) 활성을 가진 효소 중 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 (methylmalonyl-CoA reductase, MMCR) 활성을 나타내는 것임을 특징으로 하는 미생물 변이체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 미생물 변이체를 배양하여 3-HIBA를 생성하는 단계; 및 상기 생성된 3-HIBA를 회수하는 단계를 포함하는 3-HIBA의 제조방법을 제공한다.

자연계에 MMCR이 존재하지 않기 때문에 포도당을 포함한 탄소원으로부터 3-HIBA를 생산하기 위해서는 대사경로를 우회할 수 밖에 없었으나, MCR 활성을 가진 효소 중 MMCR 활성을 나타내는 효소를 사용함으로써 빠른 대사경로로 3-HIBA를 제조할 수 있다. 본 발명에 따라 제조된 3-HIBA는 미생물에서 MAA (Methacrylic acid) 및/또는 MMA (Methylmethacrylic acid)를 제조하는데 사용될 수 있으며, 이는 기존의 화학공정으로부터 제조되던 MAA (Methacrylic acid) 또는 MMA (Methylmethacrylic acid)와 달리 HCN, ACN, 포름아마이드 등 유해 물질이 수반되지 않아 친환경적이면서도, 경제적이라는 장점이 있다.

도 1은 글루코스로부터 3-HIBA를 제조하기 위한 대사경로를 도시한 것이다.
도 2는 MMCR 후보 유전자들을 PCR을 이용하여 복제한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 MMCR 후보 유전자들을 ligation하여 벡터에 삽입한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 MMCR 후보 유전자들이 형질전환된 균주를 배양하여 각 효소의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 메틸말로닐-CoA (methylmalonyl-CoA)를 반응 기질로 하였을 때 MMCR 후보의 역가 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 메틸말로닐-CoA를 반응 기질로 하였을 때 반응산물을 MS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 3-HIBA 생산 균주 배양액을 HPLC로 분석하여 3-HIBA 생산을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 탄소원으로부터 숙시닐-CoA 생성능을 가지는 미생물에서 다음의 효소를 코딩하는 유전자를 함유하고 3-HIBA (3-hydroxyisobutyric acid) 생성능을 가지는 미생물 변이체에 있어서, (i) 메틸말로닐-CoA 뮤테이즈 (methylmalonyl-CoA mutase); (ii) 메틸말로닐-CoA 에피머라제 (methylmalonyl-CoA epimerase); (iii) 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 (methylmalonyl-CoA reductase, MMCR); 및 (iv) 3-하이드록시이소부티레이트 디하이드로게나아제 (3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase), 상기 (iii)의 효소는 말로닐-CoA 리덕테이즈 (malonyl-CoA reductase, MCR) 활성을 가진 효소 중 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 (methylmalonyl-CoA reductase, MMCR) 활성을 나타내는 것임을 특징으로 하는 미생물 변이체에 관한 것이다.

본 발명에서 (iii)의 효소는 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 활성을 나타내는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 메틸말로닐-CoA를 메틸말로네이트 세미알데하이드로 전환하는 단일 관능성 (monofunctional) 이거나, 메틸말로닐-CoA를 메틸말로네이트 세미알데하이드로 전환하는 것 뿐 아니라, 메틸말로네이트 세미알데하이드를 3-HIBA로 전환하는 공정에도 관여하는 이관능성 (bifunctional)일 수 있으며, 바람직하게 단일 관능성일 수 있다.

효소 중 (i) 메틸말로닐-CoA 뮤테이즈 (methylmalonyl-CoA mutase)는 탄소원으로부터 제조된 숙시닐-CoA를 (R)-메틸말로닐-CoA로 전환에 관여하고, (ii) 메틸말로닐-CoA 에피머라제는 (R)-메틸말로닐-CoA를 (S)-메틸말로닐-CoA로의 전환에 관여하며, (iii) 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈는 (S)-메틸말로닐-CoA를 메틸말로네이트 세미알데하이드로 전환하는데 관여하며, (iv) 3-하이드록시이소부티레이트 디하이드로게나아제는 메틸말로네이트 세미알데하이드를 3-HIBA로 전환하는데 관여하는 효소이다. 구체적 경로는 도 1에 나타낸 바와 같다.

"3-HIBA (3-히드록시이소부티르산, 3-hydroxyisobutyric acid)"는 C₄-카르복실산을 의미하며, 산 형태 (3-히드록시이소부티르산), 염기 형태 (3-히드록시이소부티레이트) 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있으며, (R) 및 (S) 입체이성질체를 모두 포함할 수 있다. 3-HIBA는 MAA (Methacrylic acid) 및/또는 MMA (Methylmethacrylic acid)를 제조하기 위한 중간 물질로 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

3-HIBA 제조 과정에서, 자연계에 메틸말로닐-CoA (methylmalonyl-CoA)를 메틸말로네이트 세미알데하이드(methylmalonate semialdehyde)로 전환하는 효소인 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈가 존재하지 않기 때문에, 포도당을 포함한 탄소원으로부터 3-HIBA를 제조하기 위해서는 isobutyric acid, 2-methyl-1,3-propanediol 등의 중간체를 거쳐 생합성하는 방식으로 대사경로를 우회할 수 밖에 없었다(Karsten Lang, Katja Buehler and Andreas Schmid, Multistep Synthesis of (S)-3-Hydroxyisobutyric acid from glucose using Pseudomonas taiwanensis VLB120 B83 T7 catalytic biofilms, Advanced Synthesis & Catalysis, 357(8), 1919-1927 (2015)).

그러나, 본 발명은 MCR 중 메틸말로닐-CoA (methylmalonyl-CoA)를 메틸말로네이트 세미알데하이드(methylmalonate semialdehyde)로 직접 전환하는 효소 즉, 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 (methylmalonyl-CoA reductase, MMCR) 기능이 있는 효소를 확인함으로써, 빠른 대사경로를 통해 3-HIBA를 제조할 수 있도록 하였다.

이 때, 상기 효소는 아키아 (Archaea)계 유래 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈일 수 있다. 본 출원의 발명자들은 MMCR과 기질은 다르지만 기능적으로는 유사한 말로닐코에이 리덕테이즈 (MCR)로부터 여러 효소를 탐색하여 그 중 메틸말로닐-CoA도 기질로 사용할 수 있는 효소를 선별하였다. 또한, 메틸말로닐-CoA와 반응시킨 후 cofactor로 사용되는 NADH와 NADPH의 양의 변화를 흡광도로 측정함으로써 메틸말로닐-CoA와 반응성이 있는 효소를 탐색하였다.

그 결과, 하나의 실시예에서, 상기 메틸말로닐-CoA를 반응기질로 하여 반응성이 있는 효소는 예를 들어 Candidatus Caldiarchaeum subterraneum, Sulfolobales archaeon Acd1 및 Sulfolobus acidocaldarius Ron12/I로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아키아계 유래 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈일 수 있다.

이 때, 상기 메틸말로닐-CoA를 반응기질로 하여 반응성이 있는 효소의 서열을 분석한 결과, 서열번호 23의 서열과 60% 이상의 상동성 또는 80% 이상의 유사성이 있는 서열을 포함함을 알 수 있었다.

이를 바탕으로, 하나의 실시예에서 상기 효소는 서열번호 23으로 표시되는 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상동성을 나타내는 서열을 가질 수 있다.

또 하나의 실시예에서, 상기 효소는 서열번호 23으로 표시되는 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 유사성을 나타내는 서열을 가질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "상동성"또는 은 두 개의 비교대상 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 모이티 사이의 동일성 퍼센트를 의미한다. 또한 "유사성"은 비교창(comparison window)을 통해 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 기반하여 서열이 기능적 또는 구조적으로 동일한 정도를 의미한다. 서열 상동성 또는 유사성은 표준 소프트웨어를 사용, 예를 들면 BLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873-5877, 1993)에 기초하여 개발된 BLASTN 이나 BLASTX라 불리는 프로그램에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다.

상기 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈는 서열번호 3 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 서열과 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 바람직하게 90% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%의 서열 상동성을 나타내는 서열을 가질 수 있다.

경우에 따라서, 본 발명에 따른 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈는 3-HIBA의 제조 효율을 높이기 위해 당업계에 알려진 공지의 기술을 적용하여 변이시킬 수도 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 미생물 변이체에 (v) 3-하이드록시이소부티레이트 디하이드라타아제 (3-hydroxyisobutyrate dehyrotase)를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 메틸메타크릴산(Methylmethacrylic acid) 생성능을 가지는 미생물 변이체에 관한 것이다. 상기 3-하이드록시이소부티레이트 디하이드라타아제는 3-HIBA를 메틸메타크릴산으로 전환하는데 관여하는 효소이다.

본 발명에서 사용된 효소 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 이외에도, 메틸말로닐-CoA 뮤테이즈, 메틸말로닐-CoA 에피머라제, 및 3-하이드록시이소부티레이트 디하이드로게나아제 코딩 유전자의 유래 및 서열은 다음과 같다.

[표 1] 3-HIBA로 전환 하는데 관여하는 효소 후보군

"미생물"은 아키아, 박테리아 또는 진핵생물의 도메인에 포함되는 임의의 생물체를 포함할 수 있고, 임의의 종류의 원핵생물 또는 진핵생물 예를 들어, 아키아, 박테리아, 효모 또는 진균류 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, E. coli, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 칸디다 블랑키이 (C. blankii) 또는 칸디다 루고사 (C. rugosa) 등이 사용될 수 있다.

상기 효소 코딩 유전자는 외인성으로, "외인성"은 숙주 미생물에 아키아 (Archaea)계 유래 MMCR (methylmalonyl-CoA reductase)을 코딩하는 유전자가 도입되는 것을 의미한다. 상기 도입은 예를 들어 플라스미드와 같은 물질 즉, 염색체 또는 비-염색체성 유전 물질내로의 삽입에 의해 MMCR 코딩 유전자를 숙주 미생물의 유전물질에 도입함으로써 이루어질 수 있다.

사용될 수 있는 탄소원의 예로는 포도당(glucose), 과당(fructose), 자당(sucrose), 유당(lactose), 맥아당(maltose), 전분(starch) 및 셀룰로스(cellulose)와 같은 탄수화물(carbohydrate), 대두유(soybean oil), 해바라기유(regular sunflower oil), 피마자유(castor oil), 코코넛유(coconut oil)와 같은 지방, 팔미트산(palmitic acid), 스테아린산(stearic acid) 및 리놀레산(linoleic acid)과 같은 지방산, 글리세롤(glycerol) 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산(organic acids) 등이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 미생물 변이체를 배양하는 단계를 포함하는 3-HIBA의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 상기 미생물 변이체를 배양하는 단계를 포함하는 메틸메타크릴산의 제조방법에 관한 것이다.

상기 미생물 변이체는 약 20-45℃의 온도에서 탄소원의 존재하에 배양될 수 있으며, 공지의 방법에 따라 예를 들어, (i) 단당류 포함 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 수크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분 또는 셀룰로스, (ii) 오일 및 지방, 예를 들어 대두유, 해바라기 오일, 땅콩유 또는 코코넛 지방, (iii) 지방산, 예를 들어 팔미트산, 스테아르산 또는 리놀산, (iv) 알콜, 예를 들어 글리세롤 또는 메탄올, (v) 아미노산, 예를 들어 L-글루타메이트 또는 L-발린 (vi) 유기산, 예를 들어 아세트산 등을 단독 또는 혼합으로 사용하여 배양할 수 있다. 경우에 따라서, 공지의 질소원, 인 공급원, 성장을 위해 요구되는 금속염, 전구체 또는 pH 조절제 등이 포함될 수 있다.

배양되어 발현된 3-HIBA 또는 메틸메타크릴산을 분리 및 회수할 수 있으며, 배양액을 필터에 통과시키거나, 원심분리기 또는 침강 장치를 사용하여 배양액과 발현된 3-HIBA 또는 메틸메타크릴산을 분리할 수 있으며, 추가적 삼투 또는 정제방법을 이용하여 순수한 3-HIBA 또는 메틸메타크릴산을 회수할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1] MMCR 탐색

Uniprot을 이용하여 MMCR과 기질은 다르지만 말로닐-CoA (malonyl-CoA)를 말로네이트 세미알데하이드 (malonate semialdehyde)로 전환할 수 있어 기능적으로는 유사한 MCR (malonyl-CoA reductase)로부터 여러 효소를 스크리닝하였다. 그 중 메틸말로닐-CoA (methylmalonyl-CoA)도 기질로 사용할 수 있는 효소를 선별하고 그 산물을 파악하는 방식을 이용하여 MMCR (methylmalonyl-CoA reductase)을 탐색하였다. MMCR의 후보군은 기존에 구조가 알려진 Sulfolobus tokodaii 유래 MCR을 BLAST 서치하여 유사한 단백질 서열을 가진 효소들을 선정하였다. Uniprot을 통해 위와 같은 과정을 거쳐 효소를 선정한 결과, MMCR 기능을 하는 2 종의 MCR과 4종의 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제 (Aspartate-semialdehyde dehydrogenase)를 확보하였다 (표 2).

[표 2] MMCR 후보군

표 2의 MMCR 후보 유전자들을 표 3의 primer를 합성하여 98℃에서 10초, 55℃에서 5초 72℃에서 1분간 30 cycle을 반응시키는 PCR을 이용하여 복제하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 이후, T4 DNA ligase를 사용하여 pET21b vector에 삽입하였다 (도 3). 원하는 구조물 (construct)이 만들어진 것을 도 3을 통해 확인한 후, 해당 구조물 들은 발현용 균주인 E. coli BL21(DE3)에 형질전환시켜 균주를 제작하였다.

[표 3] 프라이머 서열

제작된 균주 (형질전환체)는 LBA 배지에서 37˚C, 200 rpm에서 배양하였으며, 600 nm에서의 OD값이 0.5~0.8사이에 도달하였을 때 1 mM의 이소프로필 1-티오-β-갈락토시드(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG)를 첨가한 후 16˚C에서 overnight 배양을 실시하여 표 1의 MMCR 각각을 발현시켰다. 각각의 발현 결과는 도 4에 나타내었다.

배양한 배양액은 원심 분리하여 상등액을 제거한 뒤, 세포를 모아 sonicator로 파쇄한 후 원심 분리하여 상등액을 모아 효소액을 준비하였다. 각 효소의 농도를 Pierce BCA kit를 이용하여 37℃에서 30분간 발색반응 시킨 후 Microplate spectrophotometer 기기로 562 nm에서 흡광도를 측정하는 방식으로 정량 분석한 결과를 표 4에 나타내었다.

[표 4] 배양한 형질전환체 세포 내 단백질 농도 정량 결과

수득한 효소액을 표 5에 따른 구성성분을 포함하고, 메틸말로닐-CoA를 기질로 하여 반응시킨 후 cofactor로 사용되는 NADH와 NADPH 양의 변화를 Microplate spectrophotometer로 365 nm에서의 흡광도로 측정함으로써, 메틸말로닐-CoA와 반응성이 있는지 여부를 1차적으로 탐색하였다.

[표 5]

단백질 사용량 대비 NADH, NADPH가 소모되는 속도를 activity로 계산하였으며, 그 결과 NADH를 cofactor로 사용하였을 때 ASDcc, ASDsar, ASDsac1에서 메틸말로닐-CoA와 반응성이 보임을 확인할 수 있었다 (도 5).

[실시예 2] 메틸말로네이트 세미알데하이드 생산

1차적으로 선별한 효소 중 가장 우수한 성능을 보인 ASDsac1의 메틸말로네이트 세미알데하이드 생산능을 확인하기 위하여 0.5 g/L의 메틸말로닐-CoA와 반응을 실시하였으며, 반응물을 MS로 분석한 결과, ASDsac1의 반응물에서 도 6과 같이 메틸말로네이트 세미알데하이드가 제조되는 것을 확인하였다.

[실시예 3] 대장균에서의 3-HIBA생산 균주 제작

메틸말로네이트 세미알데하이드가 제조되는 것을 확인한 ASDsac1를 대장균에서 최적 발현되도록 코돈 최적화(codon optimization) tool () 을 이용하여 최적화하였으며, 도 1과 같이 대장균에서 3-HIBA를 생산하는 균주 제작에 이용하였다([표 6]).

표 6의 대장균에서 3-HIBA 생산 경로 유전자들을 표 7의 프라이머를 합성하여 98℃에서 10초, 55℃에서 5초 72℃에서 1분간 30 cycle을 반응시키는 PCR을 이용하여 복제하였으며, T4 DNA ligase를 사용하여 pET21b, pET26b 벡터에 각각 삽입하였다. 원하는 구조물 (construct)이 만들어진 것을 확인한 후, 해당 구조물 들은 발현용 균주인 E. coli BL21(DE3)에 형질전환시켜 균주를 제작하였다.

[표 6] ASDsac1 유전자를 포함한 대장균에서 3-HIBA생산 균주 설계

[표 7] 대장균에서 3-HIBA생산 경로 유전자 클로닝을 위한 프라이머

[실시예 4] 대장균에서의 3-HIBA생산 발효

실시예 3에서 제조한 재조합 대장균의 배양을 위해 250ml 플라스크에 30ml 2xM9 (Na2HPO4-2H2O, KH2PO4, NaCl, NH4Cl)최소배지를 넣고 추가적으로 글루코즈(10g/L), Trace metal solution 100x (EDTA 5 g /L, FeCl3-6H2O 0.83 g/L, ZnCl2 84 mg/L, CuCl2-2H2O 13 mg/L, CoCl2-2H2O 10 mg/L, H3BO3 10 mg/L, MnCl2-4H2O 1.6 mg/L) 600ul, 비타민12(Vitamin12) 60ug/l, 바이오틴(Biotin) 1mg/ml, 다이아민 (Thiamin) 1mg/ml, MgSo₄ 0.25g/L, Kanamycin 50ug/ml, Ampicillin 100ug/ml 를 넣은 다음 37℃ 배양기에서 배양하여 흡광도(OD, optical density)=0.8에서 0.1mM IPTG로 발현을 유도하였다.

IPTG 첨가 후에는 배양온도를 30℃로 바꾸고 3-HIBA 생산 위한 기질로 Sodium succinate를 5g/L 추가적으로 넣어준 후, 200rpm에서 72시간 동안 추가 배양 하였다. 배양 중에는 72시간째에 배양액 중 일부를 취하여 흡광도(OD) 및 3-HIBA 생산을 확인하였다.

[실시예 5] 3-HIBA 분석

실시예 4에서 배양한 72시간 배양액은 centrifuge (13,000rpm 10min, 4℃) 하여 cell을 제거하였다. Cell이 제거된 상층액 Sample 40ml은 동결건조기(ilShinBioBase, Korea)를 사용한 동결건조 방법으로 24시간 건조 후 2ml distilled water에 녹여 약 13배 농축된 3ml HPLC sample을 만들었다.

주입 부피가 10 μl인 Agilent 1200 HPLC system (Agilent, USA)을 사용하여 샘플을 분석하였다. HPLC에서 Hyper Carb Column (150 mm X 4.6mm) (Thermo, USA)을 30℃로 유지하고 1ml min-1 의 유량으로 DIW(0.1% Sulfuric acid, ACN(0.1% Sulfuric acid) 이동상을 사용하여 DAD detector (Agilent, USA) 로 분석하였다.

분석을 통해 실시예 3에서 제작한 2,3 번 균주 72시간 배양액을 13배 농축시 3-HIBA가 69, 21 ppm의 양으로 생산됨을 도 7과 같이 확인하였다.

<110> Sk Innovation Co.,Ltd. <120> Mutant Microorganism Comprising Gene Coding Methylmalonyl-CoA Reductase and Use Thereof <130> 159 <150> KR 15/099,352 <151> 2015-07-13 <160> 41 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 359 <212> PRT <213> Sulfolobus tokodaii <400> 1 Met Ile Leu Met Arg Arg Thr Leu Lys Ala Ala Ile Leu Gly Ala Thr 1 5 10 15 Gly Leu Val Gly Ile Glu Tyr Val Arg Met Leu Ser Asn His Pro Tyr 20 25 30 Ile Lys Pro Ala Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Ser Val Gly Lys Pro Tyr 35 40 45 Gly Glu Val Val Arg Trp Gln Thr Val Gly Gln Val Pro Lys Glu Ile 50 55 60 Ala Asp Met Glu Ile Lys Pro Thr Asp Pro Lys Leu Met Asp Asp Val 65 70 75 80 Asp Ile Ile Phe Ser Pro Leu Pro Gln Gly Ala Ala Gly Pro Val Glu 85 90 95 Glu Gln Phe Ala Lys Glu Gly Phe Pro Val Ile Ser Asn Ser Pro Asp 100 105 110 His Arg Phe Asp Pro Asp Val Pro Leu Leu Val Pro Glu Leu Asn Pro 115 120 125 His Thr Ile Ser Leu Ile Asp Glu Gln Arg Lys Arg Arg Glu Trp Lys 130 135 140 Gly Phe Ile Val Thr Thr Pro Leu Cys Thr Ala Gln Gly Ala Ala Ile 145 150 155 160 Pro Leu Gly Ala Ile Phe Lys Asp Tyr Lys Met Asp Gly Ala Phe Ile 165 170 175 Thr Thr Ile Gln Ser Leu Ser Gly Ala Gly Tyr Pro Gly Ile Pro Ser 180 185 190 Leu Asp Val Val Asp Asn Ile Leu Pro Leu Gly Asp Gly Tyr Asp Ala 195 200 205 Lys Thr Ile Lys Glu Ile Phe Arg Ile Leu Ser Glu Val Lys Arg Asn 210 215 220 Val Asp Glu Pro Lys Leu Glu Asp Val Ser Leu Ala Ala Thr Thr His 225 230 235 240 Arg Ile Ala Thr Ile His Gly His Tyr Glu Val Leu Tyr Val Ser Phe 245 250 255 Lys Glu Glu Thr Ala Ala Glu Lys Val Lys Glu Thr Leu Glu Asn Phe 260 265 270 Arg Gly Glu Pro Gln Asp Leu Lys Leu Pro Thr Ala Pro Ser Lys Pro 275 280 285 Ile Ile Val Met Asn Glu Asp Thr Arg Pro Gln Val Tyr Phe Asp Arg 290 295 300 Trp Ala Gly Asp Ile Pro Gly Met Ser Val Val Val Gly Arg Leu Lys 305 310 315 320 Gln Val Asn Lys Arg Met Ile Arg Leu Val Ser Leu Ile His Asn Thr 325 330 335 Val Arg Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ile Leu Ala Ala Glu Leu Leu Val 340 345 350 Glu Lys Gly Tyr Ile Glu Lys 355 <210> 2 <211> 357 <212> PRT <213> Metallosphaera sedula <400> 2 Met Arg Arg Thr Leu Lys Ala Ala Ile Leu Gly Ala Thr Gly Leu Val 1 5 10 15 Gly Ile Glu Tyr Val Arg Met Leu Ala Asp His Pro Tyr Ile Lys Pro 20 25 30 Thr Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Ser Val Gly Lys Pro Tyr Gly Glu Ile 35 40 45 Val Arg Trp Gln Thr Val Gly Asn Val Pro Lys Glu Val Ala Asn Gln 50 55 60 Glu Val Lys Pro Thr Asp Pro Lys Leu Met Asp Asp Val Asp Ile Ile 65 70 75 80 Phe Ser Pro Leu Pro Gln Gly Ala Ala Gly Pro Val Glu Glu Gln Phe 85 90 95 Ala Lys Leu Gly Phe Asn Val Ile Ser Asn Ser Pro Asp His Arg Phe 100 105 110 Asp Met Asp Val Pro Met Ile Ile Pro Glu Val Asn Pro His Thr Val 115 120 125 Thr Leu Ile Asp Glu Gln Arg Lys Arg Arg Asp Trp Lys Gly Phe Ile 130 135 140 Val Thr Thr Pro Leu Cys Thr Ala Gln Gly Ala Ala Ile Pro Leu Thr 145 150 155 160 Pro Ile Tyr Gln Asn Phe Lys Met Ser Gly Val Met Ile Thr Thr Met 165 170 175 Gln Ser Leu Ser Gly Ala Gly Tyr Pro Gly Ile Ala Ser Leu Asp Ile 180 185 190 Val Asp Asn Ala Leu Pro Leu Gly Asp Gly Tyr Asp Ala Lys Thr Val 195 200 205 Lys Glu Ile Thr Arg Ile Leu Ser Glu Val Lys Arg Asn Val Gln Glu 210 215 220 Pro Gly Val Asn Glu Ile Thr Leu Asp Ala Thr Thr His Arg Ile Ala 225 230 235 240 Thr Ile His Gly His Tyr Glu Val Ala Tyr Val Thr Phe Lys Glu Asp 245 250 255 Thr Asp Val Arg Lys Val Met Glu Ser Met Glu Ser Phe Lys Gly Glu 260 265 270 Pro Gln Asp Leu Lys Leu Pro Thr Ala Pro Glu Lys Pro Ile Ile Val 275 280 285 Thr Thr Gln Asp Ala Arg Pro Gln Val Phe Phe Asp Arg Trp Ala Gly 290 295 300 Asn Pro Pro Gly Met Ser Val Val Val Gly Arg Leu Lys Gln Val Asn 305 310 315 320 Pro Arg Thr Ile Arg Phe Val Ser Leu Ile His Asn Thr Val Arg Gly 325 330 335 Ala Ala Gly Gly Gly Val Leu Thr Ala Glu Leu Leu Val Glu Lys Gly 340 345 350 Tyr Ile Asp Lys Arg 355 <210> 3 <211> 350 <212> PRT <213> Candidatus Caldiarchaeum subterraneum <400> 3 Met Lys Thr Tyr Ser Val Ala Ile Leu Gly Ala Thr Gly Met Val Gly 1 5 10 15 Gln His Tyr Ile Arg Met Leu Tyr Arg His Pro Trp Phe Arg Ile Thr 20 25 30 Ala Leu Thr Gly Lys Glu Ser Val Gly Arg Lys Tyr Val Glu Ala Val 35 40 45 Arg Gly Glu Ala Pro Glu Pro Pro Lys Glu Ile Ala Glu Met Glu Val 50 55 60 Leu Pro Thr Asp Pro Lys Lys Val Asp Ala Asp Phe Val Phe Ser Cys 65 70 75 80 Leu Pro Thr Glu Ala Ala Arg Glu Ala Glu Pro Lys Phe Ala Glu Ala 85 90 95 Gly Phe Pro Val Phe Ser Asp Ala Ala Ala Tyr Arg Met Glu Glu Asp 100 105 110 Val Pro Leu Ile Val Pro Glu Ile Asn His Asp His Leu Asn Met Val 115 120 125 His Ile Gln Arg Lys Lys Arg Gly Trp Glu Gly Tyr Ile Val Thr Thr 130 135 140 Pro Asn Cys Thr Thr Val Gly Leu Val Leu Pro Leu Gln Pro Leu Lys 145 150 155 160 Gln His Leu Gly Val Lys Lys Val Ile Val Thr Thr Met Gln Ala Val 165 170 175 Ser Gly Ala Gly Tyr Pro Gly Val Ala Ser Leu Ser Ile Leu Gly Asn 180 185 190 Val Ile Pro Tyr Ile Ser Gly Glu Glu Arg Lys Val Glu Thr Glu Thr 195 200 205 Ala Lys Ile Leu Gly Arg Tyr Gly Asp Gly Arg Phe Thr His Asp Ser 210 215 220 Val Glu Val His Ala Thr Cys Thr Arg Val Pro Thr Leu Asp Gly His 225 230 235 240 Met Glu Ser Ile Tyr Leu Glu Thr Ala Lys Pro Ala Asp Glu Glu Thr 245 250 255 Val Ala Glu Leu Leu Ala Glu Tyr Val Ser Leu Pro Gln Glu Leu Asn 260 265 270 Leu Pro Thr Ala Pro Ala Arg Pro Ile Val Val Arg Arg Glu Leu Asp 275 280 285 Arg Pro Gln Thr Arg Ile Asp Val Asp Ala Gly Thr Val Pro Gly Met 290 295 300 Ser Val Ser Val Gly Arg Ile Arg Val Asn Gly Glu Lys Val Arg Phe 305 310 315 320 Ile Ser Leu Ser His Asn Leu Ile Arg Gly Ala Ala Gly Gly Thr Ile 325 330 335 Leu Thr Ala Glu Leu Ala Arg His Met Gly Leu Leu Gly Glu 340 345 350 <210> 4 <211> 357 <212> PRT <213> Sulfolobales archaeon Acd1 <400> 4 Met Arg Arg Thr Leu Lys Ala Ala Ile Leu Gly Ala Thr Gly Leu Val 1 5 10 15 Gly Ile Glu Tyr Val Arg Met Leu Ser Gln His Pro Tyr Ile Lys Pro 20 25 30 Ala Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Ser Val Gly Lys Ala Tyr Ser Glu Val 35 40 45 Val Arg Trp Gln Thr Val Gly Gln Val Pro Lys Glu Val Ala Asp Met 50 55 60 Pro Val Leu Pro Thr Asp Val Asn Glu Ile Lys Lys Ala Gly Val Asp 65 70 75 80 Ile Val Phe Ser Pro Leu Pro Gln Gly Ala Ala Gly Pro Val Glu Glu 85 90 95 Glu Phe Ala Lys Ala Gly Phe Pro Val Ile Ser Asn Ser Pro Asp His 100 105 110 Arg Phe Asp Pro Asp Val Pro Leu Met Ile Pro Glu Val Asn Gly His 115 120 125 Thr Ala Ser Leu Ile Asp Glu Gln Lys Lys Arg Arg Asp Trp Ser Gly 130 135 140 Phe Ile Val Thr Thr Pro Leu Cys Thr Ala Gln Gly Ile Ala Ile Pro 145 150 155 160 Leu Ala Pro Ile Tyr Arg Asp Phe Arg Val Asp Ser Val Phe Ile Thr 165 170 175 Thr Met Gln Ser Leu Ser Gly Glu Gly Tyr Pro Gly Val Ala Ser Leu 180 185 190 Asp Val Val Asp Asn Ile Lys Val Leu Gly Asp Ala Tyr Asp Ala Lys 195 200 205 Thr Val Lys Glu Val Thr Arg Ile Leu Ser Glu Val Lys Arg Asn Val 210 215 220 Pro Gly Thr Met Asp Glu Leu Thr Leu Ser Ala Thr Thr His Arg Ile 225 230 235 240 Ala Thr Ile His Gly His Tyr Glu Val Met Tyr Val Thr Phe Lys Glu 245 250 255 Asp Val Lys Val Glu Lys Val Lys Glu Thr Leu Ala Asn Phe Lys Gly 260 265 270 Glu Pro Gln Asp Met Lys Leu Pro Thr Ala Pro Ser Arg Pro Ile Leu 275 280 285 Ile Thr Glu Leu Asp Asn Arg Pro Gln Pro Tyr Phe Asp Arg Trp Ala 290 295 300 Gly Asp Val Pro Gly Met Ser Val Val Val Gly Arg Leu Lys Gln Val 305 310 315 320 Asn Asn Arg Thr Val Arg Leu Val Ser Leu Ile His Asn Thr Val Arg 325 330 335 Gly Ala Ala Gly Gly Gly Ile Leu Val Ala Glu Tyr Leu Ile Glu Lys 340 345 350 Gly Tyr Ile Pro Lys 355 <210> 5 <211> 354 <212> PRT <213> Sulfolobus acidocaldarius Ron12/I <400> 5 Met Arg Arg Val Leu Lys Ala Ala Ile Leu Gly Ser Thr Gly Leu Val 1 5 10 15 Gly Ile Glu Tyr Val Arg Met Leu Ala Asn His Pro Tyr Ile Lys Val 20 25 30 Ala Tyr Leu Ala Gly Lys Gly Ser Val Gly Lys Pro Tyr Gly Glu Val 35 40 45 Val Arg Trp Gln Thr Ile Gly Gln Ile Pro Lys Glu Val Ala Asn Met 50 55 60 Glu Ile Lys Pro Thr Asp Pro Lys Leu Met Asp Asp Val Asp Leu Val 65 70 75 80 Phe Ser Pro Leu Pro Ala Gly Ala Ala Gly Pro Val Glu Glu Glu Phe 85 90 95 Ala Lys His Gly Phe Lys Val Ile Ser Asp Ser Pro Asp His Arg Phe 100 105 110 Glu Pro Asp Ile Pro Leu Leu Ile Pro Glu Ile Asn Pro His Thr Ile 115 120 125 Thr Leu Ile Asp Glu Gln Arg Lys Lys Arg Asp Trp Lys Gly Phe Ile 130 135 140 Val Thr Thr Pro Leu Cys Ala Ala Gln Gly Val Leu Leu Pro Leu Ala 145 150 155 160 Pro Ile Tyr Gln Asn Phe Lys Val Asp Ser Val Phe Ile Thr Thr Met 165 170 175 Gln Ala Val Ser Gly Glu Gly Tyr Pro Gly Val Ala Ser Leu Asp Ile 180 185 190 Ile Asp Asn Ile Lys Val Leu Gly Glu Asn Tyr Asp Asn Lys Leu Ile 195 200 205 Lys Glu Val His Arg Val Leu Ser Glu Thr Lys Arg Asn Val Asn Asp 210 215 220 Ser Gly Asn Asp Val Thr Leu Ser Ala Thr Thr His Arg Val Ala Thr 225 230 235 240 Ile His Gly His Tyr Glu Ile Ile Tyr Val Thr Phe Lys Glu Asp Val 245 250 255 Asn Val Glu Lys Val Arg Glu Ala Met Asp Asn Phe Lys Gly Glu Pro 260 265 270 Gln Asn Leu Lys Leu Pro Thr Ala Pro Ser Lys Pro Ile Ile Leu Thr 275 280 285 Asn Glu Asp Ser Arg Pro Gln Val Tyr Phe Asp Arg Trp Ala Gly Glu 290 295 300 Ile Pro Gly Met Ser Val Val Val Gly Arg Leu Ser Gln Val Asn Arg 305 310 315 320 Arg Ala Ile Arg Phe Ala Ser Leu Ile His Asn Thr Val Arg Gly Ala 325 330 335 Ala Gly Gly Gly Ile Leu Ala Thr Glu Phe Leu Val Glu Lys Gly Tyr 340 345 350 Met Asp <210> 6 <211> 352 <212> PRT <213> Sulfolobus acidocaldarius Ron12/I <400> 6 Met Arg Arg Val Tyr Lys Ala Ala Ile Leu Gly Ser Thr Gly Leu Val 1 5 10 15 Gly Ile Glu Tyr Val Arg Met Leu Ala Asn His Pro Tyr Ile Lys Pro 20 25 30 Thr Tyr Leu Ala Gly Arg Gly Ser Val Gly Lys Pro Tyr Gly Glu Val 35 40 45 Val Arg Trp Gln Thr Ile Gly Gln Ile Pro Lys Glu Ile Ala Asn Gln 50 55 60 Glu Ile Arg Pro Thr Asp Pro Lys Gln Met Asp Asp Val Asp Leu Val 65 70 75 80 Phe Ser Pro Leu Pro Ala Gly Ser Ala Ala Gln Val Glu Asp Glu Phe 85 90 95 Ala Lys Leu Gly Phe Lys Val Ile Ser Asn Ser Pro Asp His Arg Leu 100 105 110 Glu Pro Asp Ile Pro Leu Ile Ile Pro Glu Val Asn Pro His Ser Leu 115 120 125 Asn Leu Ile Glu Glu Gln Lys Lys Arg Arg Asp Trp Glu Gly Phe Ile 130 135 140 Val Thr Thr Pro Leu Cys Thr Ala Gln Gly Val Leu Ile Pro Leu Val 145 150 155 160 Pro Ile Tyr Gln Asn Phe Arg Val Gln Ser Val Phe Ile Thr Thr Met 165 170 175 Gln Ala Leu Ser Gly Ala Gly Tyr Pro Gly Val Ala Ser Leu Asp Val 180 185 190 Ile Asp Asn Ile Leu Pro Leu Gly Asn Glu Tyr Asp Ala Lys Met Val 195 200 205 Lys Glu Met Thr Lys Val Leu Asn Ser Thr Lys Arg Asn Val Ser Asp 210 215 220 Glu Ser Asn Ile Asn Ile Ser Thr Thr Thr His Arg Val Pro Thr Ile 225 230 235 240 His Gly His Tyr Ala Val Val Tyr Val Thr Phe Lys Glu Asn Val Asp 245 250 255 Leu Gly Lys Ile Arg Glu Ser Leu Val Asn Phe Ser Gly Glu Pro Gln 260 265 270 Ala Leu Lys Leu Pro Thr Ala Pro Glu Lys Val Ile Val Leu Thr Glu 275 280 285 Gln Asp Asn Arg Pro Gln Val Tyr Phe Asp Arg Trp Leu Gly Asp Pro 290 295 300 Pro Gly Met Ser Val Ile Val Gly Arg Leu Thr Gln Val Asp Asn Asn 305 310 315 320 Ala Ile Arg Phe Val Ser Leu Ile His Asn Ser Val Arg Gly Ala Ala 325 330 335 Gly Gly Gly Ile Leu Thr Ala Glu Leu Leu Ile Asn Arg Lys Tyr Ile 340 345 350 <210> 7 <211> 553 <212> PRT <213> Metallosphaera sedula <400> 7 Met Val Thr Pro Glu Arg Val Lys Glu Trp Glu Ser Lys Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Pro Trp Ile Ser Lys Arg Lys Glu Arg Lys Asn Lys Phe Thr Thr Pro 20 25 30 Ser Gly Ile Glu Ile Lys Thr Leu Tyr Thr Pro Leu 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Val Ile Pro 100 105 110 Pro Glu Asp Ile Pro Lys Leu Lys Ala Met Gly Val Asp Asp Val Phe 115 120 125 Leu Pro Gly Thr Ser Leu Lys Glu Ile Ala Gln Arg Val Ser Lys Leu 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Arg Gly Ile Lys Val Glu Gly 145 150 155 <210> 9 <211> 140 <212> PRT <213> Metallosphaera sedula <400> 9 Met Glu Thr Leu Asp Ile Asp His Val Gly Val Ala Val Glu Asn Leu 1 5 10 15 Glu Glu Ala Ile Lys Leu Tyr Thr Glu Lys Met Gly Met Lys Leu Val 20 25 30 His Arg Glu Asp Leu Pro Asp Arg Gly Ile Lys Val Ala Phe Leu Thr 35 40 45 Gly Asn Glu Gly Thr Thr Ala Val Glu Leu Met Glu Pro Met Asn His 50 55 60 Glu Asp Pro Asn Asn Thr Val Ala Lys Phe Leu Lys Thr Arg Gly Gln 65 70 75 80 Gly Met His His Leu Ala Val Lys Val Lys Asp Ile Asn Ser Ser Leu 85 90 95 Arg Asp Leu Glu Gly Lys Gly Leu Thr Leu Ile Asp Lys Asn Gly Arg 100 105 110 Lys Gly Ala Arg Gly His Leu Val Ala Phe Val His Pro Lys Ser Val 115 120 125 Met Gly Leu Leu Leu Glu Leu Val Gln Glu Thr His 130 135 140 <210> 10 <211> 295 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 10 Met Arg Ile Ala Phe Ile Gly Leu Gly Asn Met Gly Ala Pro Met Ala 1 5 10 15 Arg Asn Leu Ile Lys Ala Gly His Gln Leu Asn Leu Phe Asp Leu Asn 20 25 30 Lys Thr Val Leu Ala Glu Leu Ala Glu Leu Gly Gly Gln Ile Ser Pro 35 40 45 Ser Pro Lys Asp Ala Ala Ala Asn Ser Glu Leu Val Ile Thr Met Leu 50 55 60 Pro Ala Ala Ala His Val Arg Ser Val Tyr Leu Asn Asp Asp Gly Val 65 70 75 80 Leu Ala Gly Ile Arg Pro Gly Thr Pro Thr Val Asp Cys Ser Thr Ile 85 90 95 Asp Pro Gln Thr Ala Arg Asp Val Ser Lys Ala Ala Ala Ala Lys Gly 100 105 110 Val Asp Met Gly Asp Ala Pro Val Ser Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala 115 120 125 Ala Gly Thr Leu Thr Phe Met Val Gly Ala Ser Ala Glu Leu Phe Ala 130 135 140 Ser Leu Lys Pro Val Leu Glu Gln Met Gly Arg Asn Ile Val His Cys 145 150 155 160 Gly Glu Val Gly Thr Gly Gln Ile Ala Lys Ile Cys Asn Asn Leu Leu 165 170 175 Leu Gly Ile Ser Met Ile Gly Val Ser Glu Ala Met Ala Leu Gly Asn 180 185 190 Ala Leu Gly Ile Asp Thr Lys Val Leu Ala Gly Ile Ile Asn Ser Ser 195 200 205 Thr 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gaaaacttac tccgtc 26 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASDccR Primer <400> 16 ttctcgagtc attcgcctaa caacca 26 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASDsarF Primer <400> 17 atgagctcat gagaagaact ttgaag 26 <210> 18 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASDsarR Primer <400> 18 ttctcgagtt acttagggat gtaacc 26 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASDsac1F Primer <400> 19 atgacgtcat gagaagagtc ttgaaa 26 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASDsac1R Primer <400> 20 ttctcgagtc aatccatgta accctt 26 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASDsac2F Primer <400> 21 atgagctcat gagaagagtt tacaaa 26 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASDsac2R Primer <400> 22 ttctcgagtc agatgtactt tctgtt 26 <210> 23 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Conserved Domain between ASDsac1 and ASDsar <400> 23 Ile Lys Val Leu Gly Asp Ala Tyr Asp Ala Lys Thr Val Lys Glu Val 1 5 10 15 Thr Arg Ile Leu Ser Glu Val Lys Arg Asn Val Pro Gly Thr Met Asp 20 25 30 Glu Leu Thr Leu Ser Ala Thr Thr His Arg Ile Ala 35 40 <210> 24 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 agctgagctc atgcgtcgcg ttctgaaagc agcga 35 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 tcgactcgag tcaatccata taacccttct ccaca 35 <210> 26 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 ctagctagca tgagtaatga ggatcttttc atctgtatcg 40 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 ccgctcgagt cagttcttcg ggtactgggt g 31 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 cccaagctta tgagcactct gccccgtttt g 31 <210> 29 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 ataagaatgc ggccgcctag gcatcgagcg aagccc 36 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 cccaagctta tgagcagcac ggatcagggg 30 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 ataagaatgc ggccgctcac ttcgcgactc ccaagatatc 40 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 atgagctcat gtctaacgtg cagga 25 <210> 33 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 ccgctcgaga tcatgatgct ggcttatcag attcag 36 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 atgagctcat gaaaacggga tctga 25 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 ttctcgagtc atgatttcgc tcccg 25 <210> 36 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 ggaagatctc aaaaaacccc tcaagacccg ttta 34 <210> 37 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 gcattcctgc attaggttaa tacgactcac tataggggaa ttgtg 45 <210> 38 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 ccggcaccgg cgcaaaaaac ccctcaagac ccgttta 37 <210> 39 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 catggcatgc ttaatacgac tcactatagg ggaattgtg 39 <210> 40 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 catggcatgc caaaaaaccc ctcaagaccc gttta 35 <210> 41 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 ggaagatctt taatacgact cactataggg gaattgtg 38

Claims

탄소원으로부터 숙시닐-CoA 생성능을 가지는 미생물에서 다음의 효소를 코딩하는 유전자를 함유하고 3-HIBA (3-hydroxyisobutyric acid) 생성능을 가지는 미생물 변이체에 있어서,
(i) 메틸말로닐-CoA 뮤테이즈 (methylmalonyl-CoA mutase);
(ii) 메틸말로닐-CoA 에피머라제 (methylmalonyl-CoA epimerase);
(iii) 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 (methylmalonyl-CoA reductase, MMCR); 및
(iv) 3-하이드록시이소부티레이트 디하이드로게나아제 (3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase),
상기 (iii)의 효소는 말로닐-CoA 리덕테이즈 (malonyl-CoA reductase, MCR) 활성을 가진 효소 중 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 (methylmalonyl-CoA reductase, MMCR) 활성을 나타내는 것임을 특징으로 하는 미생물 변이체.
제1항에 있어서,
상기 (iii)의 효소는 말로닐-CoA 리덕테이즈 활성을 가진 효소 중 메틸말로닐-CoA를 메틸말로네이트 세미알데하이드로 전환하는 단일 관능성 (monofunctional)의 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 활성을 나타내는 것임을 특징으로 하는 미생물 변이체.
제1항에 있어서,
상기 말로닐-CoA 리덕테이즈 활성을 가진 효소 중 메틸말로닐-CoA 리덕테이즈 활성을 나타내는 효소는 아키아 (Archaea)계 유래인 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
제3항에 있어서,
상기 (iii)의 효소는 Candidatus Caldiarchaeum subterraneum, Sulfolobales archaeon Acd1 및 Sulfolobus acidocaldarius Ron12/I로 이루어진 군에서 선택된 아키아계 유래인 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
제1항에 있어서,
상기 (iii)의 효소는 서열번호 23 (IKVLGDAYDAKTVKEVTRILSEVKRNVPGTM-DELTLSATTHRIA)으로 표시되는 서열과 60% 이상의 상동성 또는 80% 이상의 유사성을 나타내는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
제1항에 있어서,
상기 (iii)의 효소는 서열번호 3 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 서열 중 어느 하나와 60% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
제1항에 있어서,
상기 (iii)의 효소는 서열번호 3 내지 5로 이루어진 군에서 선택되는 서열 중 어느 하나의 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 미생물 변이체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 미생물 변이체를 배양하여 3-HIBA를 생성하는 단계; 및 상기 생성된 3-HIBA를 회수하는 단계를 포함하는 3-HIBA의 제조방법.