KR20170012326A - 암 백신 개발용 변형된 아데노바이러스 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아데노바이러스 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로, 바이러스 캡시드가 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 촉진할 수 있는 폴리펩타이드로 코팅된 것이다. 또한, 본 발명은 펩타이드 특이적 면역 반응을 유발하는 폴리펩타이드로 코팅된 아데노바이러스 벡터에 의해, 예를 들어, 암과 같은 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정 펩타이드로 아데노바이러스 벡터를 코팅하는 방법 및 아데노바이러스 벡터의 캡시드를 코팅하기에 적합한 펩타이드를 동정하는 방법에 관한 것이다.

Description

암 백신 개발용 변형된 아데노바이러스{Modified adenoviruses for cancer vaccines development}
본 발명은 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector) 및 이의 용도에 관한 것으로, 바이러스 캡시드(viral capsid)가 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 촉진할 수 있는 폴리펩타이드로 코팅된 것이다. 또한, 본 발명은 펩타이드 특이적 면역 반응을 유발하는 폴리펩타이드로 코팅된 아데노바이러스 벡터에 의해, 예를 들어, 암과 같은 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 특정 펩타이드로 아데노바이러스 벡터를 코팅하는 방법 및 아데노바이러스 벡터의 캡시드를 코팅하기에 적합한 펩타이드를 동정하는 방법에 관한 것이다.
암은 더욱 효과적인 치료가 필요한 치명적인 질병이다. 종양살상 바이러스(oncolytic virus)는 다른 표준 치료법보다 안전하고 효과적일 가능성이 있기 때문에 주요 관심 대상이다. 그러나, 암 환자에서 전반적인 치료 효과는 그다지 대단하지 않았다. 치료를 위한 최적의 도구를 찾기 위해 아데노바이러스 벡터를 변형하는 것에 대해 많은 연구가 있다. 아데노바이러스의 기능을 조절하는 한 가지 측면은 바이러스 표면을 변형하는 것이다. 아데노바이러스 표면의 유전자 변형 및 비유전자 변형 모두가 잘 알려져 있다.
예를 들면, Stevenson M 등은(Cancer Gene Therapy (2007) 14, 335-345) 표적 부위로의 아데노바이러스 벡터의 전달을 향상시키는데 집중한다. Stevenson 등은 아데노바이러스 벡터가 전이성 종양 세포 상에서 선택적으로 발현되는 인테그린(integrin)을 통해 세포를 감염시키는 것을 목표로 하는 연구를 개시하고 있다. 이를 위해 라미닌(laminin) 유래 펩타이드(-SIKVAV-)를 중합체-코팅된 바이러스의 표면에 도입하였다.
WO2013/116778은 암에 대한 면역학적으로 향상된 아데노바이러스를 개시하고 있다. 종양 항원이 바이러스의 복제 주기 동안 발현되고 직접 MHC-I에 직접 제시되는 방식으로, 종양 항원 형질전환 유전자(transgene)를 이의 게놈에 삽입함으로써 아데노바이러스를 변형시켰다. 이러한 방법은 다양한 모든 종양 항원에 대해 새로운 바이러스의 생성이 필요하기 때문에(예를 들어, 발현되기를 원하는 모든 펩타이드에 대해 새로운 바이러스를 복제해야 함), 개인 맞춤형 요법에 대해 매우 느리고 힘들고 비용이 많이 든다.
실제로, 간단하고 개선된 아데노바이러스의 치료 도구 및 방법, 특히 개인 맞춤형 요법에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은, 펩타이드의 전달 시스템으로서 바이러스를 사용하지만 바이러스의 유전자 조작을 수반하지 않는, 대상에서 면역 반응을 유도하기 위한 아데노바이러스의 적용을 제공한다.
본 발명은 환자 및 질병 특이적 펩타이드를 전달하고 그 결과 항-캡시드 면역을 펩타이드 특이적 면역 반응(예를 들어, 항-종양 면역)으로 전환시키는 플랫폼으로서 종양살상 아데노바이러스의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 새롭고 강력한 맞춤형 면역 바이러스 요법(immunovirotherapy)(예를 들어, 암 면역 바이러스 요법) 플랫폼을 제공한다. 본 발명의 목적은 변형된 바이러스 표면을 갖는 아데노바이러스 벡터, 이의 용도 및, 예를 들어, 비효율적이고, 느리고, 비용이 많이 들고, 힘든 아데노바이러스 요법(adenoviral therapy)뿐만 아니라 개인 맞춤형 의료에 대한 아데노바이러스 요법의 부적합성과 같은 문제점을 해결하기 위해 펩타이드 특이적(즉, 항-펩타이드) 면역 반응을 자극함으로써 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 목적은 독립항에 명시된 것을 특징으로 하는 장치 및 방법에 의해 달성된다. 본 발명의 바람직한 실시형태는 종속항에 개시되어 있다.
본 발명에 의해, 예를 들어, 특이성의 결핍 및 종양살상 아데노바이러스의 면역 우세와 같은 종래 기술의 문제점이 극복될 수 있다.
아데노바이러스 감염에 의해 생성된 면역 반응은 주로 종양이 아니라 바이러스를 대상으로 한다. 또한, 바이러스 면역의 대부분은 캡시드의 단백질에 대한 것이다. 본 발명은 이러한 문제점들을 극복할 것이다. 실제로, 본 발명은 종양 단백질에서 유래된 펩타이드로 바이러스 캡시드를 코팅하여 바이러스 면역을 종양으로 향하게 하는 것을 기반으로 한다(도 3). 종양살상 아데노바이러스 캡시드에 탑재된, 주조직 적합성 복합체 I(major histocompatibility complex I, MHC-I)-제한된 펩타이드는 캡시드 면역을 항-종양 면역으로 전환시킨다.
요약하면, 펩타이드(들)와 바이러스(들)가 물리적으로 연결된 단일 개체로서 투여될 때, 위험 신호(바이러스)와 종양-항원(펩타이드) 모두는 최대 항-종양 효과를 위해 동일한 항원 제시 세포에 진입할 것이다. 펩타이드 백신접종만으로는 종양의 성장을 조절할 수 없는 일시적이고 차선적인 면역 반응만을 유발한다는 것을 임상 경험은 이미 보여주었다1. 따라서, 종양살상 바이러스는 단일요법으로서의 가능성을 보여 주지만, 이들이 유도하는 면역 반응은 주로 종양이 아니라 바이러스를 대상으로 한다. 펩타이드와 바이러스가 동일한 해부학적 위치에 주입되더라도, 이들은 단일 치료 개체에서 결합되지 않기 때문에, 이들은 적절한 최대의 면역 활성화를 달성하는데 매우 중요한 동일한 세포-측면에 비효율적으로 진입한다2. 단일 치료 개체에서 펩타이드와 아데노바이러스 바이러스의 물리적 결합은 기존의 바이러스 및 펩타이드 암 백신 기술에 비해 현저한 개선이다. 하나의 종양 관련 항원 또는 펩타이드를 발현하도록 조작된 종래 기술의 재조합 바이러스와는 달리, 본 발명은 이전보다 훨씬 빠르고 비용 효율적인 방식으로 개인 맞춤형 의료를 달성할 수 있게 한다. 실제로, 본 발명에 따르면, 바이러스 캡시드 상에 부착되는 펩타이드는 아데노바이러스 벡터에 의해 암호화되지 않는다.
본 발명의 일 양태는 (MHC-I 제한된) 작은 펩타이드로서 종양 항원 제시의 일정하고 신속한 모니터링을 가능하게 하는 기술이다. 본 발명은 아데노바이러스 요법 전후 종양 세포(즉, 치료 후 마스킹되거나 편집되지 않는) 상에 그리고 아데노바이러스 요법 이후 수지상 세포(dendritic cell, DC) 상에 동시에 존재하는, 질환 특이적(예를 들어, 종양 특이적) 및 환자 특이적 펩타이드를 활용한다. 이들 특정 펩타이드를 동정한 이후, 이들을 합성하여 종양살상 아데노바이러스 캡시드에 장착함으로써 높은 항-종양 면역을 달성할 수 있다. 이러한 방식으로, 종양은 바이러스요법 이후에도 세포독성 T 세포(cytotoxic T-cell, CTL)에 효과적으로 표적이 되는 것을 보장할 수 있고, 따라서 면역계가 바이러스를 표적으로 함에 따라 면역학적 탈출이 불가능하게 할 수 있다. 반대로, 종양의 존재 또는 부재 하에 바이러스 요법 이후 DC 상에 나타나는 펩타이드를 비교함으로써, "바이러스-전용" 펩타이드를 제거할 수 있고 또한 CTL 반응을 유도하는 종양 세포에서 유래된 것들을 발견할 수 있다.
개인 맞춤형의 코팅된 아데노바이러스는 생검에서 최소 2 주 이내에 수득될 수 있다. 이는 MHC’s 및 자동화 합성으로부터의 펩타이드의 분리 및 시퀀싱이 신속한 공정이고, 바이러스(예를 들어, 모든 펩타이드에 대해 동일한 백본 바이러스)가 코팅을 기다리기 위해 대량으로 비축 될 수 있기 때문에 가능해진다. 코팅 자체는 한 시간 후에 수행되며, 이후 코팅된 아데노바이러스는 주입될 준비가 된다. 이는 바이러스의 유전자 조작을 우회하여 "개인 맞춤형 백신 치료법"을 불가능하게 하는 과정을 늦추기 때문에 본 시스템의 매우 독특한 특징이다.
본 발명은 또한 신규한 면역원성 종양 특이적 펩타이드를 발견하는 것을 가능하게 한다.
암 치료 외에도, 본 발명의 코팅된 아데노바이러스는 보다 높은 펩타이드 특이적 면역 반응이 필요한 상황에서 그 밖의 다른 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 펩타이드 특이적 면역 반응을, 이를 필요로 하는 대상에서 자극하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드를 포함하는 바이러스 벡터를 대상에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 펩타이드 특이적 면역 반응을, 이를 필요로 하는 대상에서 자극하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 바이러스 캡시드에 부착된 폴리펩타이드를 포함하는 바이러스 벡터를 대상에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 상기 아데노바이러스 벡터에 의해 유전적으로 암호화되지 않은 것이다.
본 발명은 또한 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드를 포함하는 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드를 포함하는 아데노바이러스 벡터에 관한 것으로, 상기 폴리펩타이드는 상기 아데노바이러스 벡터에 의해 유전적으로 암호화되지 않은 것이다.
본 발명은 또한 암의 치료를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은, 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있고 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 대상에 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 암의 치료를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은, 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있고 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 대상에 투여하는 단계를 포함하며, 상기 폴리펩타이드는 상기 아데노바이러스 벡터에 의해 유전적으로 암호화되지 않은 것이다.
또한, 본 발명은 대상에서 암을 치료하는데 사용하기 위한, 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있고 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드를 포함하는 아데노바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 대상에서 암을 치료하는데 사용하기 위한, 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있고 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드를 포함하는 아데노바이러스 벡터에 관한 것으로, 상기 폴리펩타이드는 상기 아데노바이러스 벡터에 의해 유전적으로 암호화되지 않은 것이다.
또한, 본 발명은 아데노바이러스 벡터에 관한 것으로, 바이러스 캡시드에 폴리펩타이드가 부착되어 있으며, 폴리펩타이드가 부착된 아데노바이러스 벡터는 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있다.
또한, 본 발명은 아데노바이러스의 캡시드를 코팅하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은, 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있는 폴리펩타이드를 아데노바이러스 캡시드와 공유 또는 비공유 결합시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 아데노바이러스의 캡시드를 변형시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은, 폴리리신-변형된(polylysine-modified) 폴리펩타이드를 아데노바이러스 캡시드와 공유 또는 비공유 결합시키는 단계를 포함하며, 변형된 아데노바이러스 벡터는 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있다.
또한, 본 발명은, 폴리펩타이드를 캡시드에 공유 또는 비공유 부착 또는 결합시킴으로써 아데노바이러스의 캡시드를 코팅하기 위한, 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있는 폴리펩타이드(예를 들어, 폴리리신-변형된 폴리펩타이드)의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터 및 방법은 항바이러스 면역을 항-펩타이드 면역으로 전환시키는데 사용된다. 본 발명의 변형된 바이러스 벡터는 대상에서 항-펩타이드 반응을 일으킨다.
또한, 본 발명은 본 발명의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 대상으로부터 종양 특이적 및 MHC-I 특이적 폴리펩타이드를 동정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은,
i) 아데노바이러스 벡터로 대상의 종양 세포를 감염시키는 단계;
ii) 아데노바이러스 벡터로 대상의 수지상 세포를 감염시키는 단계;
iii) 단계 i)의 종양 세포 및 단계 ii)의 수지상 세포로부터 MHC-I 분자를 분리하고 두 그룹으로부터 MHC-I 관련 폴리펩타이드를 동정하는 단계;
iv) 감염되지 않은 종양 세포로부터 MHC-I 분자를 분리하고 MHC-I 관련 폴리펩타이드를 동정하는 단계;
v) 단계 iii) 및 단계 iv)의 감염된 및 감염되지 않은 종양 및 단계 iii)의 수지상 세포에 의해 제시된 폴리펩타이드를 동정하는 단계를 포함한다.
다음과 같이, 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 바람직한 실시형태에 의해 더욱 상세히 설명될 것이다.
도 1은 변형된 아데노바이러스가 항바이러스 면역 반응을 종양으로 향하게 하면서 암 세포를 복제 및 사멸시킬 수 있는 본 발명의 개략도를 도시하고 있다.
도 2는 종양 반응(우측 막대)에 대한 항-아데노바이러스 반응(좌측 막대)의 면역우세(immunodominance)를 도시하고 있다. 마우스) B16-OVA 종양을 갖는 C57BL/6 마우스를 PBS(모의), Ad5D24(변형되지 않은 종양살상 바이러스) 및 Ad5D24-CpG(더욱 면역원성인 종양살상 바이러스)로 처리하였다. 종양으로부터 T 세포를 수득하고, IFNgamma ELISPOT을 수행하여 항-종양 반응 및 항-아데노바이러스 반응을 평가하였다. 암 환자) IFNgamma ELISPOT은 GMCSF-무장 종양살상 아데노바이러스(Ad5D24-GMCSF)로 치료받은 환자의 PBMC에서 수행하였다15. ELISPOT 전에 PBMC를 자극하기 위해 Ad5 유래 펩타이드(항-바이러스성) 및 서비빈(survivin) 유래 펩타이드(항-종양)를 사용하였다.
도 3은 본 발명의 코팅된 아데노바이러스가 기존 기술에 대해 장점을 나타내는 것을 보여주고 있다. A) 종양살상 아데노바이러스는 APC가 바이러스 항원(항바이러스 반응을 일으킴)(도 3A의 세포 상에 제시된 다른 항원)뿐만 아니라, 부작용으로서, 항종양 면역을 유도하는 종양 항원(도 3A의 세포 상에 제시된 다른 항원)을 제시할 수 있도록 하는 능력을 갖는다. 항-종양 T 세포는 T 세포 그룹의 두 개의 맨 아래의 세포로 도시되어 있다. B) 본 발명의 코팅된 아데노바이러스는, 이의 캡시드가 MHC-I 사용할 준비가 된 종양 특이적 항원(펩타이드)에 의해 덮여 있기 때문에, 종양 항원 제시(도 3B의 세포 상에 제시된 두 항원으로 도시됨)를 촉진할 것이다. 이러한 방식으로 항-캡시드 면역은 항-종양 면역으로 복귀될 수 있다. 항-종양 T 세포는 T 세포 그룹의 네 개의 맨 아래의 세포로 도시되어 있다. 본원에서 사용된 APC는 항원 제시 세포(antigen presenting cell)를 의미하고, TAA는 종양 관련 항원(tumor associated antigen)을 의미하며, "PRR 활성화"는 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptor) 활성화를 의미한다. PRR은, 예를 들어, 미생물 병원균과 관련된 병원체 관련 분자 패턴을 확인하기 위해 선천적 면역계의 세포에 의해 발현되는 단백질이다.
도 4는 종양살상 아데노바이러스에 노출된 수지상 세포의 상향 조절된 생체 가능 네트워크를 도시하고 있다. 인간 1차 수지상 세포를 수득하고 IL4 및 GMCSF로 2 주 동안 배양하였다. 세포를 10 VP/세포에서 종양살상 아데노바이러스(Ad5D24)로 펄스(pulse)하였다. 72 시간 후, 총 RNA를 수득하고 Agilent SurePrint G3 인간 8x60k(mRNA) 상에서 분석하였다. Ingenuity Pathway 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
도 5는 신규한 면역원성 종양 관련 MHCI 제한된 펩타이드의 발견을 나타내는 개략도를 도시하고 있다. 다른 조건은 종양이 발현하고 있는 펩타이드를 수지상 세포가 나타내는 동일한 종양의 펩타이드와 일치시킬 수 있게 한다. 이는 면역원성 펩타이드의 동정을 용이하게 하는 시스템의 주요 특징이다. A) 수지상 세포를 종양 세포용해질(oncolysate)로 펄스하여 종양 항원 제시를 허용하였다. B) 펄스되지 않은 수상상 세포를 성숙시키고 분석하였다. 이는 DC에 의해 제시된 자기 펩타이드를 이후에 제거하기 위한 대조군으로서의 역할을 한다. C) 감염된 종양 세포주(조건 A와 동일)를 종양살상 아데노바이러스에 감염시키고 완전히 용해되기 이전에(48 시간 미만) 분석하였다. 이 조건은 아데노바이러스가, 제시된 종양 항원의 품질에 중요한 영향을 미치는지를 구별하는데 도움이 된다. D) 이는 MHCI 상에 종양 항원과 자기 펩타이드(물론 이 둘은 동일할 수 있음)를 제시하는 감염되지 않은 종양이다.
도 6은 OVA 특이적 코팅된 바이러스의 개략도를 도시하고 있다. A) 이 경우, 본 발명자들은 닭 난백알부민(ovalbumin, OVA)의 모든 가공 펩타이드를 알고 있으므로, OVA 특이적 면역원성 펩타이드(SIINFEKL)(SEQ ID NO: 1)로 바이러스를 코팅하였다. 이어서, SIINFDL(SEQ ID NO: 2)(antagonist) 및 FILKSINE(SEQ ID NO: 3)(스크램블(scramble))뿐만 아니라 코팅되지 않은 바이러스와 같은 대조군으로 사용될 그 밖의 코팅되지 않은 바이러스를 생성하였다. B) 개념 증명이 입증되고 난 후, 다양한 펩타이드로 코팅된 II 세대 아데노바이러스에 대한 분석을 시작하였다. (PeptiCRAd는 펩타이드로 코팅된 종양살상 아데노바이러스를 의미한다.)
도 7은 펩타이드-코팅된 종양살상 아데노바이러스를 생성하기 위한 세 가지 상이한 전략을 나타내는 개략도를 도시하고 있다.
도 8은 종양살상 아데노바이러스와 종양 특이적 펩타이드 간의 복합체 형성 및 변형된 에피토프와 종양살상 아데노바이러스 간의 상호작용을 도시하고 있다. 도 8A는 Ad5D24 종양살상 아데노바이러스와 종양 특이적 펩타이드 간의 복합체 형성을 나타낸다. "Z-전위" 라인) 1×1010 개의 바이러스 입자를 다양한 농도의 양전하를 띤 종양 특이적 펩타이드와 접합하였다. 반응 후, 단일 입자의 Z-전위를 측정하였다. "크기" 라인) 1×1010 개의 바이러스 입자를 다양한 농도의 양전하를 띤 종양 특이적 펩타이드와 접합하였다. 이후, 단일 입자의 크기를 측정하고 펩타이드 농도의 함수로 기록하였다. Z-전위가 -20 mV 내지 +20 mV 사이에 있을 때, 고도의 다분산성(바이러스 응집 가능성)을 나타내는 복합체의 크기가 급격하게 변화하지만, 이러한 상태는 고농도의 펩타이드에서 정상으로 돌아가고, 이는 복합체(PeptiCRAd)가 응집체의 형성을 촉진시키는 쌍극자를 형성할 가능성이 없도록 코팅이 완료된 것을 시사한다(높은 다분산성). 도 8B는 변형된 MHC-I 에피토프 SIINFEKL 및 종양살상 아데노바이러스 간의 상호작용을 보여준다. 바이러스/펩타이드 상호작용은 SPR로 측정하였다. APTES 실리카 SiO2 센서를 Ad5D24로 코팅하였으며, 증가하는 농도(0.15, 0.3, 0.6, 1.2, 2.4 및 7.2 μM)의 SIINFEKL(점선) 또는 polyK-SIINFEKL(실선)을 유수계(flowing system)에 주입하였다. SPR 신호 응답은 실험 기간과 관련하여 나타나 있다.
도 9는 본 발명의 코팅된 아데노바이러스 Ad5D24(PeptiCRAd)가 코팅되지 않은 종양살상 바이러스에 비해 향상된 세포 사멸 활성을 나타내는 것을 도시하고 있다. 대표적인 세포 생존력 분석(MTS 분석)을 폐암 선암 세포주(A549)에서 수행하였다. 세포를 0 일에 접종하고, 1 일째 지시된 감영 다중도에서 감염시켰으며, 테스트를 중단하고 3 일째 분석하였다.
도 10은 OVA 특이적 아데노바이러스가 OVA 특이적 면역을 향상시키는 것을 도시하고 있다. 피하 B16-OVA 종양을 갖는 마우스에 PBS, 종양살상 바이러스(Ad5D24), 종양살상 바이러스+SIINFEKL 펩타이드(복합체화되지 않음), 종양살상 바이러스+SIINFEKL(단일 개체로서 복합체화됨, PeptiCRAd)를 종양내 주입하였다. A) 종양 성장을 측정하고 도시된 시점에서 기록하였다. B) SIINFEKL 특이적 면역을 유세포 분석기(오량체 분석(pentamer analysis))로 평가하였다.
도 11은 펩타이드 코팅 기술의 농도를 도시하고 있다. 이 도면은 변형된 펩타이드(6K-SIINFEKL)로 코팅된 두 가지 다른 종양살상 아데노바이러스의 순전하(net charge)를 보여준다. 본 실시예에서 사용된 두 가지 바이러스는 Ad5D24-CpG(CpG 섬에서 풍부한 게놈을 갖도록 유전자 변형된 종양살상 아데노바이러스)와 체외 및 체내 이미징을 용이하게 하기 위한 적색 형광 단백질을 암호화하는 종양살상 아데노바이러스인 Ad5D24-RFP이다. (RFP는 적색 형광 단백질(Red Fluorescent Protein)을 의미한다).
도 12는 PeptiCRAd의 순전하 및 이의 크기 간의 상관 관계를 도시하고 있다. 본 실시예에서, 본 발명자들은 노출 바이러스(대략 -25-30 mV의 순전하)로 시작한 다음 증가하는 농도의 펩타이드를 첨가하여, 본 발명자들이 PeptiCRAd라 명명한 복합체를 형성하였다. 더욱 많은 펩타이드를 첨가할수록 바이러스의 순전하는 더욱 더 음에서 양의 값으로 바뀌고, 결국, PeptiCRAd 복합체가 형성될 때, 펩타이드로 코팅된 바이러스의 순전하는 대략 +30 내지 35 mV인 것을 보여준다.
도 13은 바이러스 캡시드에 흡착되거나 흡착되지 않은 MHC-I에 대한 변형된 SIINFEKL 유사체의 교차 제시를 도시하고 있다. C57BL/6 마우스(H-2Kb)에서 비장을 채취하고, 10% FBS가 함유된 RPMI-1640 성장 배지에서 단일 세포 현탁액을 제조하였다. (A) 변형되지 않은 SIINFEKL(양성 대조군), 아미노 카프로산 함유 SIINFEKL-AHX-polyK(음성 대조군), C-말단 연장 SIINFEKL-polyK 또는 N-말단-연장 폴리-K-SIINFEKL(0.19 μg/μl)을 함유하는 200 μm의 배지로 총 2×106 개의 비장 세포를 배양하였다. 37℃에서 2 시간 배양 후, 세포를 세척하고 SIINFEKL 또는 이소타입 대조군에 결합된 APC 항-H-2Kb로 염색하였다. (B) (A)와 유사하게, 신선한 쥐의 비장 세포를 OVA-PeptiCRAd(100 vp/세포 + 37.5 μg 펩타이드) 및 37.5 μg의 SIINFEKL(양성 대조군) 또는 polyK-SIINFEKL로 감염시켰다. 배양 2 시간 후, 샘플을 세척하고 유세포 분석기로 분석하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n=2)으로 나타내었다. 본페로니의 다중 비교 검정(Bonferroni’s multiple comparison test)으로 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 사용하여 유의성을 평가하였다; * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001.
도 14는 PeptiCRAd가 완전한 종양살상 활성을 보유하고 낮은 CAR 발현을 갖는 세포주에서 증가된 감염성을 나타내는 것을 도시하고 있다. (A) 세포를 웰당 당 1×104 세포의 밀도로 접종하고, 다양한 vp/세포 비율(0.1, 1, 10 및 100)을 사용하여 OVA-PeptiCRAd 또는 노출 Ad5D24로 감염시켰다. 펩타이드 polyK-SIINFEKL(점선, 원)을 대조군으로 포함시켰다. 이어서, 세포 생존력을 MTS 분석으로 측정하였다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)으로 나타내었다. (B) ICC에 의한 바이러스 감염성 분석. 웰당 총 2×105 개의 세포를 24-웰 플레이트에 접종하고, 다음 날 OVA-PeptiCRAd 또는 Ad5D24(대조군)를 함유하는 100 μl의 바이러스 희석액(10 vp/세포)으로 로 감염시켰다. 배양 2 일 후, 항-헥슨(anti-hexon) ICC를 수행하고, 디지털 현미경을 사용하여 5 개의 겹치지 않는 이미지를 얻었다. 시야 당 평균 스팟 수를 나타내었다. 대표 실험의 데이터는 평균 ± SEM(n=2-3)으로 나타내었다. 웰치 교정(Welch's correction)으로 언페어드 t-테스트(unpaired t-test)를 사용하여 유의성을 평가하였다; * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001.
도 15는 PeptiCRAd의 항-종양 효능 및 항원-특이 CD8+ T 세포 및 DC의 면역학적 분석을 도시하고 있다. (A) C57BL/6 마우스는(n=6) 양 옆구리에서 3×105 개의 B16-OVA 세포를 투여 받았다. 처리는 9 일 후에 시작되었으며, 식염수(모의), 펩타이드(SIINFEKL) 단독, 바이러스(Ad5D24-CpG) 단독, 바이러스와 펩타이드의 혼합물(Ad5D24-CpG+SIINFEKL) 및 바이러스-펩타이드 복합체(OVA-PeptiCRAd)를 포함하였다. 마우스를 세 번 처리하였다(0 일, 2 일 및 7 일). 이후 종양 크기를 측정하고 시간의 함수로서 평균 ± SEM으로 나타내었다. 본페로니의 다중 비교 검정으로 이원 분산분석을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. 종양, 비장 및 서혜부 림프절을 7 일(초기)(B) 및 16 일(후기)(C)의 두 시점에서 마우스(n=3-4)에서 채취하였다. 이어서, CD19+ 세포를 제거하여 SIINFEKL 특이적 CD8+ T 세포의 비율을 측정하였다. CD8+OVA+ T 세포의 비율은 평균 ± SEM으로 나타내었다. (D) 실험이 끝나는 시점에서 평균 종양 크기(선형 Y 축)를 이중 양성 CD8+OVA+ T 세포의 평균 백분율(log10 x 축)에 대해 플로팅하였다. 피어슨(Pearson)의 r 및 r2 값을 또한 계산하였고 각 샘플 세트에 대해 그래프로 나타내었다. (E) MHC-I 분자 상에서 숙성한 프로파일 및 교차 제시 SIINFEKL을 나타내는 DC의 배수 변화를 측정하였다. 성숙한 DC는 CD19-CD3-CD11c+CD86high 세포로 정의되었다. 선택된 DC 풀에서 MHC-I에 대한 SIINFEKL의 교차 제시를 추적하기 위해 SIINFEKL에 결합된 APC 항-마우스 H-2Kb를 사용하였다.
도 16은 PeptiCRAd로 두 가지 종양 항원을 표적으로 하는 것이 처리된 종양 및 원거리의 처리되지 않은 종양 모두의 성장을 감소시키는 것을 도시하고 있다. 1×105 개의 B16-F10 흑색종 세포를 사용하여 하나의 원발성 종양(primary tumor)을 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 이식하였다. 처리는 10 일째 시작하였다. 16 일째, 마우스는 좌측 옆구리에서 3×105 개의 B16-F10 세포를 투여 받았다. (A) 원발성 종양(우측)의 성장을 기록하고, 데이터는 평균 ± SEM(n=5)으로 나타내었다. 본페로니의 다중 비교 검정으로 이원 분산분석을 사용하여 유의성을 측정하였다; * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. (B) 실험이 끝나는 시점에서 속발성(secondary) 종양(좌측)의 크기를 log2 스케일 상에서 척도로 기록하였다. 만-위트니 U-테스트(Mann-Whitney U test)를 사용하여 유의성을 평가하였다; * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. (C) 비장 및 서혜부 림프절을 채취하고, TRP-2 특이적 및 hgp100 특이적 CD8+ T 세포의 수준을 MHC-I 오량체 염색(pentamer staining)에 의해 각 장기에서 측정하였다. 각각의 기관에서 발견되는 에피토프 특이적 CD8+ T 세포의 백분율은 모의(mock)에 대해 표준화되었고 각각의 실험군에 대한 누적 상대 반응으로 나타내었다.
도 17은 인간 흑색종을 갖는 인간화 마우스에서의 PeptiCRAd의 효능을 도시하고 있다. 삼중 녹아웃 NGS 마우스는 각각 옆구리에서 2×106 개의 인간 흑색종 세포(SK-MEL-2)를 투여 받았다. 종양이 평균 직경 4-5 mm에 도달했을 때, 한 그룹의 마우스는(n=3) HLA-A와 일치하는 건강한 기증자로부터 인간 PBMC를 투여 받은 반면, 다른 그룹은(n=2) PBMC를 투어 받지 못하였다. 이어서, i) 식염수(모의), ii) Ad5D24-GM-CSF, 및 iii) MAGE-A1 PeptiCRAd 중 하나를 사용하여 마우스를 처리하였다(0, 2 및 4 일). 인간화 마우스(A)의 종양 부피는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 본페로니의 다중 비교 검정으로 이원 분산분석을 사용하여 중요성을 평가하였다; * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001. (B) 인간화 마우스의 각 그룹에 대해, 종양의 크기에 대한 곡선 하 면적(area under the curve, AUC)이 나타나 있다. (C) 비인간화 마우스의 종양 부피는 평균 ± SEM으로 기록되어 있다(**** P<0.0001).
종양 면역학 및 면역 펩타이드군( immunopeptidome )
수지상 세포(Dendritic cell, DC)는 골수 유래 전문 항원 제시 세포이다. DC는 CD8+ 및 CD4+ T 세포에 종양 항원 에피토프를 제시하기 위한 최적의 항원 제시 세포이다3. 외인성 항원은 CD8+ T 세포에 대한 "교차 제시"를 위해 MHC 클래스 I 상에 탑재될 수 있다4. 교차 제시는 DC의 활성화 상태에 의해 결과가 결정되는 현상이다5. 암 세포에서, 종양-항원 교차 제시를 유발하는 DC 성숙도는 일반적으로 적대적인 종양 미세 환경 및 국소 림프절에서의 종양 유래 면역억제로 인해 매우 낮다. 이러한 장애는, 종양 파괴 바이러스가 DC 활성화를 유도하고 숨겨진 면역원성 항원을 노출시키기 위해 종양 면역억제를 방해하는데 필요한 "위험 신호"를 제공하기 때문에, 종양살상 바이러스 요법에 의해 극복할 수 있다6 -8.
조건부 복제 가능 아데노바이러스(Conditionally Replicating adenovirus, CRAds)라고도 알려진 종양살상 아데노바이러스는 유전적으로 변형되어 암 세포만을 복제하고 죽인다9 ,10. 바이러스 유도 종양 세포사멸 및/또는 괴사는, 종양 배출 림프절에서 종양 관련 DC에 의한 효율적인 교차 제시를 유도하는 항원 제시 세포에 의해 정상적으로 접근할 수 없는 다량의 종양 관련 단백질의 방출을 유도하는 것으로 알려져 있다11 -13.
암의 바이러스 요법은 일반적으로 내성이 좋은 것으로 밝혀졌지만, 전반적인 치료 효능은 미미한 수준으로 유지되고 있으며; 바이러스 요법의 면역학적 효과를 정밀 분석한 결과, 종양에 대한 바이러스의 명백한 우세가 마우스 및 인간 모두에서 관찰되었다(도 2). 아데노바이러스의 캡시드를 합성 MHC-I 제한된 종양 특이적 펩타이드로 코팅하는 것은 바이러스의 일부로서 이들 종양 항원을 제시하도록 항원 제시 세포(APC)를 "속일(trick)" 것이다. 다시 말해서, MHC-I 제한된 펩타이드를 전달하기 위한 지지체로서 아데노바이러스 캡시드를 이용하는 본 발명은 면역 반응을 바이러스로부터 그 대신 종양을 향해 이동시킬 것이다.
본원에서 사용된 "주조직 적합성 복합체 I" 분자는 주조직 적합성 복합체(MHC) 분자의 2 가지 주요 종류 중 하나를 의미하고 (다른 하나는 MHC 클래스 II), 신체의 거의 모든 유핵 세포 상에서 발견된다. 이들의 기능은 세포 내에서 T 세포로의 단백질 단편을 나타내는 것이고; 건강한 세포는 무시되는 반면, 이질 단백질을 포함하는 세포는 면역계에 의해 공격받게 될 것이다. 클래스 I MHC 분자는 프로테아좀(proteasome)에 의해 주로 세포질 단백질(cytosolic protein)의 분해로부터 생성된 펩타이드를 결합한다. MHC I:펩타이드 복합체는 이후 세포의 원형질 막에 삽입된다. 펩타이드는 클래스 I MHC 분자의 세포외 부분에 결합된다. 따라서, 클래스 I MHC의 기능은 세포내 단백질을 세포독성 T 세포(CTL)로 제시하는 것이다. 그러나, 클래스 I MHC는 또한 교차 제시로 알려진 과정에서 외인성 단백질로부터 생성되는 펩타이드를 제시할 수 있다. 본원에서 사용된 "MHC-I 특이적 폴리펩타이드"는 MHC-I, 즉 클래스 I MHC 분자의 세포외 부분에 결합되고, CTL로 제시되는 펩타이드를 의미한다.
모든 MHC-I 펩타이드(MIP)는 집합적으로 면역 펩타이드군(immunopeptidome)으로 지칭된다14. 바로 최근에, 첨단 기술을 사용하여 MHC-I 면역 펩타이드군을 조사하기 시작할 가능성이 있었다. 전체 면역 펩타이드군을 광범위하게 스크리닝하고자 하는 다른 전략과 비교할 때, 본 발명에서 중요한 차이점은 본 발명이 치료 전후에 종양 세포(즉, 치료 후 마스킹되거나 편집되지 않는) 상에 그리고 치료 이후 DC 상에 동시에 존재하는 특정 펩타이드에 초점을 맞추고 있다는 것이다(도 3).
본 발명 및 종래의 펩타이드-기반 면역요법 간의 중요한 차이점은, 본 발명이 바이러스, 특히 아데노바이러스가 DC와 상호작용하는 특권이 있는 수단을 갖는다는 사실을 충분히 이용한다는 것이다(따라서, DC를 표적화할 의무가 없다). 아데노바이러스는 몇몇의 패턴 인식 수용체 (PRR), 톨 유사 수용체16 ,17, NOD 유사 수용체군1 8 및 염증조절복합체(inflammasome)19를 자극하여, DC가 강력한 항원 제시 및 CTL 활성화에 취약하게 한다20. 이를 위해, 본 발명자들은 종양살상 아데노바이러스로 펄스된 인간 1차 DC가 세포 부착, 세포간 상호작용 및 신호 전달, 성숙 및 항원 제시와 관련된 경로를 활성화시켜 아데노바이러스가 미성숙 1차 수지상 세포의 성숙 및 이동을 촉진시킬 수 있음을 입증한다(도 4).
본원에서 사용된 "펩타이드 특이적 면역 반응을 자극하는" 것은 특정 펩타이드를 나타내는 세포가 공격받고 파괴되는 면역 반응을 일으키는 것을 의미한다. "면역 반응"은 림프구(즉, 백혈구), 즉, T 또는 B 림프구 또는 이들 모두를 포함하는 시스템을 의미한다. T 림프구는 항원을 직접 공격하여 면역 반응을 조절하는데 도움을 준다. 이들은 또한 전체 면역 반응을 조절하는 사이토카인(cytokines)이라고 알려진 화학 물질을 방출한다. B 림프구는 항체를 생산하는 세포가 된다. 항체는 특정 항원에 부착되고, 면역 세포가 항원을 파괴하는 것을 용이하게 한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 바이러스 캡시드 상에 부착되는 하나 이상의 폴리펩타이드는 티로시나제(tyrosinase) 관련 단백질 2(TRP-2)의 단편, 인간 흑색종 항원 gp100(hgp100)의 단편, 흑색종 관련 항원 A1(MAGE-A1)의 단편, SIINFEKL, polyK-SIINFEKL, SIINFEKL-polyK, SLFRAVITK(SEQ ID NO: 4), polyK-SLFRAVITK, SLFRAVITK-polyK, SVYDFFVWL(SEQ ID NO: 5), polyK-SVYDFFVWL, SVYDFFVWL-polyK, KVPRNQDWL(SEQ ID NO: 6), polyK-KVPRNQDWL 및 KVPRNQDWL-polyK로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 바이러스 캡시드 상에 부착되는 하나 이상의 유형의 폴리펩타이드는 SIINFEKL, SLFRAVITK, SVYDFFVWL 또는 KVPRNQDWL을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, TRP-2 및 hgp100의 폴리펩타이드 단편(예를 들어, SVYDFFVWL 또는 KVPRNQDWL)이 아데노바이러스 캡시드에 부착된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명에서 사용되는 폴리펩타이드는 폴리리신(polyK) 변형된 것이다. 본원에서 사용된 polyK는 3K-15K, 3K-10K, 3K-8K, 5K-8K, 5K-7K 및 6K로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 본원에서 사용된 "폴리리신-변형된 폴리펩타이드"는 폴리리신 서열이 삽입된 폴리펩타이드를 의미한다. 폴리펩타이드에 폴리리신 서열을 첨가하면 펩타이드의 전하를 변화시키고 결과적으로 바이러스의 표면 상에 흡수되게 한다.
아데노바이러스 벡터
펩타이드로 코팅된 아데노바이러스는 임의의 유형 및 종의 아데노바이러스과(adenoviridae)일 수 있다(예를 들어, 인간 아데노바이러스로 제한되지 않음). 본 발명의 일 실시형태에서, 아데노바이러스는 항-바이러스 면역 반응을 종양으로 향하게 하면서 암 세포를 복제 및 사멸시킬 수 있다(도 1). 환자 유래의 종양 특이적 면역 활성화 펩타이드로 코팅된 본 발명의 암 파괴 바이러스는 항-바이러스 면역을 강화시켜 항-종양 면역으로 전환시킨다
본 발명에서 사용되는 아데노바이러스 벡터는 인간 또는 동물을 치료하기에 적합한 임의의 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 대안적으로, 다양한 유형의 아데노바이러스 벡터가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 또한, 본 기술 분야에 공지된 임의의 방법으로, 예를 들어, 모든 바이러스 영역을 삭제, 삽입, 변이 또는 변경함으로써 벡터를 변형시킬 수 있다. 벡터는 복제와 관련하여 종양 특이적으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터는 종양 특이적 프로모터의 삽입, 영역의 결실 및 형질전환 유전자의 삽입과 같은 E1, E3 및/또는 E4의 변형을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 종양살상 아데노바이러스 벡터(oncolytic adenoviral vector)이다. 본원에서 사용된 "종양살상 아데노바이러스 벡터"는 종양 대 정상 세포에서 선택적 복제에 의해 암 세포를 감염시키고 사멸시킬 수 있는 아데노바이러스 벡터를 의미한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 벡터는 Rb-경로, 특히 Rb-p16 경로에서 결함을 갖는 세포에서만 복제 가능하다. 이러한 결함 세포는 동물과 인간의 모든 종양 세포를 포함한다. 본원에서 사용된 "Rb-경로의 결함"은 경로의 임의의 유전자 또는 단백질에서의 돌연변이 및/또는 후성적 변화를 의미한다. 종양 특이적 종양살상 아데노바이러스는 예를 들어 E1의 불변 영역 2(CR2) 24 개 염기쌍(base pair)(D24)을 결실시킴으로써 조작될 수 있다. 본원에서 사용된 "D24" 또는 "24 bp 결실"은 Heise C. 등에 따른 벡터의 아미노산 122-129에 상응하는 뉴클레오티드의 결실을 의미한다(2000, Nature Med 6, 1134-1139). 본 발명의 일 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 24bp 결실(종양살상 바이러스) 또는 E1 유전자 결실(제 2 세대 바이러스)을 포함하거나 벡터는 헬퍼-의존성 벡터(Helper-dependent vector)이다. E1 유전자 결실은 E1 영역의 부분 또는 전체 결실일 수 있다. 본원에서 사용된 "헬퍼-의존성 벡터"는 복제에 필요한 효소 및/또는 구조 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하지 않고 따라서 복제하기 위해 헬퍼 바이러스의 도움에 의존하는 벡터를 의미한다.
아데노바이러스 벡터의 골격(backbone)은 임의의 혈청형일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터 골격의 혈청형은 혈청형 3 또는 혈청형 5에서 선택된다. 본원에서 사용된 "아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 핵산 골격"은 Ad5의 게놈을 의미하며, "아데노바이러스 혈청형 3(Ad3) 핵산 골격"은 Ad3의 게놈을 의미한다.
또한, 벡터는 예를 들어 Ad5/3, Ad3/5 또는 Ad5/35 벡터와 같은 키메라 벡터(chimeric vector)일 수 있다. 일례로서, "Ad5/3 벡터"는 Ad5 및 Ad3 벡터의 일부를 갖는 키메라 벡터를 의미한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 캡시드 변형(즉, 바이러스의 캡시드를 형성하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에서의 변형)을 포함한다. 아데노바이러스의 "캡시드"는 바이러스의 단백질 껍질을 의미한다. 캡시드는 프로토머(protomer)라 불리는 단백질로 형성된 몇 개의 올리고머 구조 서브유닛으로 구성되어 있다.
또한, 벡터의 섬유 혹(fiber knob) 영역은 변형될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 Ad5 핵산 골격 및 Ad3 섬유 혹, Ad35 섬유 혹, Ad5/3 키메라 섬유 혹 및 Ad5/35 키메라 섬유 혹으로 이루어진 군에서 선택되는 섬유 혹을 포함하는 Ad5/3 또는 Ad5/35이다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 종양살상 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 핵산 골격을 기반으로 하고, D24 결실, 임의로 형질전환 유전자 및 선택적으로 CpG 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 종양살상 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 핵산 골격을 기반으로 하며, 캡시드(예를 들어, Ad3 섬유 혹), 임의로 D24 결실 및 임의로 형질전환 유전자의 변형을 포함한다.
외인성 요소의 삽입은 표적 세포에서 벡터의 효과를 향상시킬 수 있다. 외인성 조직 또는 종양 특이적 프로모터의 사용은 재조합 벡터에서 일반적이며, 이들은 또한 본 발명에서 이용될 수 있다. 적합한 프로모터는 본 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 이들은 hTERT, CMV, E2F를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
아데노바이러스 벡터는 또한 임의의 형질전환 유전자(예를 들어, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)의 발현을 유발할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 형질전환 유전자를 포함한다. 적합한 형질전환 유전자의 한 예는 사이토카인이며, 이는 질병에 의해 영향을 받는 부위, 예를 들어, 종양 영역에서 면역 세포의 증가된 이동(trafficking) 조절한다. 본 발명에서 사용되는 사이토카인은 본 기술 분양의 임의의 공지된 사이토카인으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 형질전환 유전자는 케모카인(chemokine) 및 사이토카인 및 특히 T 세포, 수지상 세포, 대식세포, 자연 살해 세포와 관련된 것들에 대한 종양 부위의 면역 간질의 동원 또는 조작을 위한 신호 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 바이러스 벡터는 하나 또는 수개의 형질전환 유전자, 예를 들어, 사이토카인(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상)을 암호화할 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 예를 들어 면역학적 체크포인트(예를 들어, CTLA4, PD1, PDL1)를 특이적으로 차단하는 단일클론 항체를 발현할 수 있다.
형질전환 유전자는 아데노바이러스 벡터의 다양한 위치에 배치될 수 있다. 형질전환 유전자는 예를 들어 E3 프로모터 또는 외인성 프로모터 하에서 부분적으로 또는 완전히 결실된 E3 영역에, 또는 E1 프로모터 또는 외인성 프로모터 하에서 부분적으로 또는 완전히 결실된 E1 영역에 배치될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 코팅용 아데노바이러스 벡터는 Ad5D24, Ad5D24CpG 또는 Ad5D24-GMCSF이다. Ad5D24-GMCSF에서, GM-CSF 형질전환 유전자는 E3 프로모터의 제어 하에 결실된 E3 영역(즉, 결실된 6.7K/ gp19K)의 위치에 존재한다(Cerullo V et al, 2010, Cancer Research 70: 4297-4309). 본원에서 사용된 CpG는 아데노바이러스 게놈에 첨가되어 바이러스를 더욱 면역자극성이 되게 하는 CpG 잔기를 의미한다. 아데노바이러스 골격에 CpG-풍부 영역을 삽입하면 항원 제시 세포에서 아데노바이러스가 TLR9를 자극하는 능력을 향상시키고, 이는 T 세포 자극 및 성숙뿐만 아니라 NK 활성화를 증가시킨다(Nayak S, Herzog RW, Gene Ther. Mar, 17 (3): 295-304.).
본 발명에서 이용된 바이러스 벡터는 또한 상기한 것 이외의 변형을 포함할 수 있다. 임의의 추가적인 성분 또는 변형이 선택적으로 사용될 수 있지만 본 발명에서 필수적인 것은 아니다.
아데노바이러스 벡터의 코팅
본 발명에 따르면, 아데노바이러스의 캡시드는 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있는 합성 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 코팅된다. 아데노바이러스 벡터를 코팅하기 위해 사용되는 폴리펩타이드는 상기 아데노바이러스 벡터에 의해 유전적으로 암호화되지 않은 것이다. 본원에서, 용어 "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 나타내기 위해 상호 교환적으로 사용된다.
폴리펩타이드는 임의의 공지된 적절한 화학적 또는 생화학적 방법에 의해 캡시드에 부착될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 펩타이드는 바이러스 캡시드 상에 공유 또는 비공유 부착되어 있다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 폴리펩타이드는 정전기, 이황화 또는 아미드 결합에 의해 캡시드에 부착되거나 단일 나노입자 내에서 캡시드에 공동 전달되어 부착된다. 나노입자(들)는 또한 예를 들어 정전기, 이황화 또는 아미드 결합에 의해 캡시드에 공유 또는 비공유 부착될 수 있다. 본원에서 사용된, "나노입자"는 크기가 1 내지 100 나노미터 인 임의의 입자를 의미한다. 정전기적 결합 전략은 아데노바이러스 캡시드가 전체적으로 순 음전하를 갖는다는 사실을 이용하며, 이는 해당 펩타이드에 부착된 작은 링커에 부착된 폴리리신으로 이루어진 양전하를 띤 펩타이드의 합성을 의미한다. 첫 번째 전략은 다음과 같은 잠재적인 두 가지 장점을 갖는다: 1) 신속하다(예를 들어 실온에서 대략 15 내지 30 분 또는 실온에서 대략 20 분), 이는 개인 맞춤형 약물의 핵심 기능이 될 수 있으며, 2) 양이온 중합체로 복합체화된 아데노바이러스의 형질도입이 현저하게 증가한다26 ,29.
바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드는 모두 동일한 펩타이드이거나 둘 이상의 유형의 다양한 종양 항원에서 선택되는 상이한 펩타이드일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 아데노바이러스는 하나 이상의 유형의 펩타이드로 코팅된다. 펩타이드는 예를 들어 동일한 항원의 상이한 MHC-I 특이적 폴리펩타이드, 상이한 항원의 MHC-I 폴리펩타이드 또는 MHC-I 및 MHC-II 제한된 펩타이드의 조합일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 바이러스 캡시드 상에 부착되는 폴리펩타이드는 클래스 I의 주조직 적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex of class I, MHC-I) 특이적 폴리펩타이드(MHC-I에 결합하는 폴리펩타이드), 클래스 II의 주조직 적합성 복합체(MHC-II) 특이적 폴리펩타이드(MHC-II에 결합하는 폴리펩타이드), 질병 특이적 폴리펩타이드(질병과 관련된 폴리펩타이드), 종양 특이적 폴리펩타이드(종양 또는 특정 종양과 관련된 폴리펩타이드) 및 DC 특이적 폴리펩타이드(DC에 결합하는 폴리펩타이드)로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 바이러스 캡시드 상에 부착되는 폴리펩타이드는 종양 특이적 MHC-I 제한된 펩타이드이다. 이들 펩타이드는 도 5에 도시된 공정으로 환자의 종양으로부터 직접 분리될 수 있다. 도 5의 방법을 이용함으로써, 바이러스 캡시드 상에 부착되는 폴리펩타이드는 종양의 MHC-I 상에 그리고 종양 세포용해질을 공급받은 DC로부터 동시에 제시될 수 있다. 본원에서 사용된 "종양 특이적 폴리펩타이드"는 종양 세포에 의해 제시되는 폴리펩타이드를 의미한다. 본원에서 사용된 "DC 특이적 폴리펩타이드"는 DC에 의해 제시되는 폴리펩타이드를 의미한다. 본원에서 사용된 "질환 특이적 폴리펩타이드"는 질병 표현형을 갖는 세포에 의해 제시되거나 질병에 감염되는 폴리펩타이드를 의미한다.
아데노바이러스 벡터의 캡시드에 부착되는 폴리펩타이드는 질환 또는 종양 세포 및 환자의 수지상 세포 (예를 들어, 종양 항원 또는 이로부터 유래된 펩타이드)에 의해 동시에 제시되는 임의의 폴리펩타이드를 포함한다. 적합한 펩타이드의 예는 gp100을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
캡시드 상의 폴리펩타이드의 농도는 다양할 수 있으며, 본 발명의 일 실시형태에서, 폴리펩타이드는 적어도 500 nM의 농도이다.
본 발명에 따라, 환자-맞춤형 폴리펩타이드로 코팅된 아데노바이러스의 생산에 있어서 질병 세포 유래 또는 종양 유래 MHC-I 탑재된 펩타이드를 분리 및 동정하고, 합성한 후 DC-자극성 종양살상 아데노바이러스의 캡시드 상에 혼합할 수 있다. 그러나, 상기 방법은 적어도 2 개의 단계를 포함한다. 첫째, MHC-I 상에 탑재된 가장 면역원이 강한 폴리펩타이드가 동정되고, 둘째, 이들 폴리펩타이드는 종양살상 아데노바이러스 캡시드 상에 탑재된다.
약학적 조성물
본 발명은 장애를 치료하기 위한 치료 방법 및 용도뿐만 아니라 상기 방법 및 치료 용도에 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 이러한 약학적 조성물은, 단독으로 또는 치료학적 유효제 또는 유효제들 및/또는 약학적으로 허용 가능한 비히클 또는 비히클들과 같은 다른 약제와 함께, 코팅된 아데노바이러스를 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 비히클은 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 용매, 희석제, 보조제, 부형제, 완충제, 담체, 방부제, 충전제, 안정화제 및 증점제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 선택적으로, 해당 제품에 일반적으로 포함되는 다른 성분이 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 약학적 조성물은 폴리펩타이드로 코팅된 아데노바이러스 및 약학적으로 허용 가능한 비히클을 포함한다.
약학적 조성물은 고체, 반고체 또는 액체 형태와 같은 투여에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 제형은 예를 들어 용액, 에멀젼 또는 현탁액으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 약학적 제제를 제형화하기 위한 수단 및 방법은 본 기술 분야의 숙련자에게 공지되어 있으며, 공지된 그 자체의 방식으로 제조될 수 있다.
치료법
치료될 수 있고, 진행이 완화될 수 있고, 또는 질환에 의해 유발된 비정상 세포에 대한 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극함으로써 증상이 개선될 수 있는 모든 질환 또는 장애가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 일 실시형태에서, 펩타이드 특이적 면역 반응은 항-종양(원발성 및/또는 속발성 종양에 대한), 항-암(원발성 및/또는 속발성 악성 종양에 대한), 항-감염 및 항-바이러스 면역 반응으로 이루어진 군에서 선택된다. 이들의 경우, 면역 반응은 종양(악성 및 양성 종양뿐만 아니라 원발성 및 이차 종양 포함), 암(즉, 원발성 또는 속발성 악성 종양), 전염병(예를 들어, 말라리아), 바이러스(바이러스 감염의 경우, 예를 들어, 인플루엔자, SARS-CoV 또는 HIV) 등에 대한 것이다. 예를 들어, 임의의 암은 본 발명의 코팅된 아데노바이러스의 표적이 될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 암은 비인두암(nasopharyngeal cancer), 활막암(synovial cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 신장암, 결합 조직의 암, 흑색종, 폐암, 장암, 결장암, 직장암, 대장암, 뇌종양, 인후암, 구강암, 간암, 골암, 췌장암, 융모암, 가스트리노마(gastrinoma), 크롬친화세포종(pheochromocytoma), 프로락틴종(prolactinoma), T 세포 백혈병/림프종, 신경종, 폰 히펠-린다우병(von Hippel-Lindau disease), 졸링거-엘리슨 증후군(Zollinger-Ellison syndrome), 부신암, 항문암, 담도암, 방광암, 수뇨관암, 뇌종양, 핍지교종(oligodendroglioma), 신경아세포종(neuroblastoma), 수막종(meningioma), 척수종양, 골암, 골연골종(osteochondroma), 연골육종(chondrosarcoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 원발 부위가 알려지지 않은 암, 유암종, 위장관 암종, 섬유육종(fibrosarcoma), 유방암, 페제트병(Paget’s disease), 자궁경부암, 대장암, 직장암, 식도암, 담낭암, 두부암, 안암, 경부암, 신장암, 윌름스 종양(Wilms’ tumor), 간암, 카포시 육종(Kaposi’s sarcoma), 전립선암, 폐암, 고환암, 호지킨병(Hodgkin’s disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin’s lymphoma), 구강암(oral cancer), 피부암, 중피종(mesothelioma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 난소암, 내분비 췌장암(endocrine pancreatic cancer), 글루카곤종(glucagonoma), 췌장암, 부갑상선암(parathyroid cancer), 음경암(penis cancer), 뇌하수체암(pituitary cancer), 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 망막아세포종(retinoblastoma), 소장암, 위암, 흉선암(thymus cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 영양막암(trophoblastic cancer), 포상기태(hydatidiform mole), 자궁암, 자궁 내막암(endometrial cancer), 질암(vagina cancer), 외음암(vulva cancer), 청각 신경종(acoustic neuroma), 균상식육종(mycosis fungoides), 인슐린종(insulinoma), 카르시노이드 증후군(carcinoid syndrome), 소마토스타티노마(somatostatinoma), 치은암, 심장암, 구순암, 뇌수막암(meninges cancer), 구강암(mouth cancer), 신경암(nerve cancer), 경구개암(palate cancer), 귀밑샘암(parotid gland cancer), 복막암(peritoneum cancer), 인두암(pharynx cancer), 늑막암(pleural cancer), 침샘암(salivary gland cancer), 설암(tongue cancer) 및 편도암(tonsil cancer)으로 이루어진 군에서 선택된다.
본원에서 사용된 용어 " 치료" 또는 "치료하는"은 적어도 코팅된 아데노바이러스 벡터 또는 코팅된 아데노바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 대상에 투여하는 것을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "치료하는"뿐만 아니라 이로부터 유래되는 단어는 반드시 100% 또는 완전한 치료 또는 증가를 의미하지는 않는다. 오히려, 본 기술 분야의 숙련자가 잠재적 이익 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인식하는 정도로 다양하다. 이 점에 있어서, 본 발명의 방법 및 용도는 질병의 치료 또는 예방의 정도를 제공할 수 있다. 따라서, "치료하는"은 완전한 치료뿐만 아니라 예를 들어 암, 종양, 전염병 또는 바이러스 감염과 같은 해당 질환과 관련된 장애 또는 증상의 예방, 개선 또는 완화를 포함한다. 치료 효과는 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 환자의 증상 또는 혈액 중의 질병 표지를 모니터링함으로써 평가할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "대상"은 동물, 포유동물 또는 인간으로 이루어지는 군에서 선택되는 대상을 의미한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 대상은 인간 또는 동물이다.
폴리펩타이드로 코팅된 아데노바이러스는 펩타이드 특이적 면역 반응을 일으키는 치료학적 유효량으로 대상에게 투여된다. 본원에서 사용된 용어 "치료학적 유효량"은, 질병 또는 장애(예를 들어, 암)의 유해한 효과가 최소한 개선되는, 코팅된 아데노바이러스의 양을 의미한다. 유해한 영향은 통증, 현기증 또는 부종과 같은 대상의 검출 가능한 또는 현저한 영향을 포함한다.
본 발명의 코팅된 아데노바이러스 벡터 또는 약학적 조성물의 단독 투여만이 치료 효과를 가질 수 있다. 반면, 치료는 몇 가지 투여를 포함할 수 있다. 아데노바이러스 벡터 또는 약학적 조성물은 예를 들어 2 주, 3 주, 4 주 또는 8 주 동안 예를 들어 1회 내지 10 회 투여될 수 있다. 치료 기간은 다양할 수 있으며, 예를 들어 2 개월 내지 12 개월 이상 지속될 수 있다. 경우에 따라, 한 환자에게 다양한 치료 기간을 사용할 수도 있다.
벡터의 효과적인 투여량은 적어도 치료를 필요로 하는 대상, 질환 유형 및 질환의 단계에 따라 달라진다. 투여량은 예를 들어 대략 1×108 개의 바이러스 입자(VP) 내지 대략 1×1014 개의 VP, 특히 대략 1×109 개의 VP 내지 대략 1×1013 개의 VP 및 더욱 구체적으로는 대략 5×109 개의 VP 내지 대략 1×1012 개의 VP로 다양할 수 있다.
코팅된 아데노바이러스를 투여하는 단계는 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 적절한 방법을 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계는 종양내(intratumoral), 동맥내(intra-arterial), 정맥내(intravenous), 흉강내(intrapleural), 방광내(intravesicular), 강내(intracavitary) 또는 복막(peritoneal) 주사, 또는 경구 투여를 통해 수행된다. 다른 투여 경로를 결합하는 것도 가능하다.
코팅된 아데노바이러스는 또한 다른 치료제 또는 치료 방법 또는 치료의 조합과 함께 (동시에 또는 순차적으로) 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법 또는 용도는 방사선 요법, 화학 요법, 다른 약물의 투여 또는 임의의 임상 수술을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 치료에 적합한 인간 또는 동물 환자를 분류하기 전에, 임상의는 환자를 검사할 수 있다. 정상에서 벗어나고 암과 같은 질환을 발견하는 결과를 근거로, 임상의는 환자에 대한 본 발명의 방법 또는 치료를 제시할 수 있다.
코팅을 위한 특정 펩타이드의 동정
본 발명은 대상으로부터 적어도 종양 특이적 및 MHC-I 특이적 폴리펩타이드를 동정하는 방법을 개시한다. 방법은 특히 시험관 내에서 종양 용 해물에 노출된 종양 및 DC의 MHC-I 면역 펩타이드군에 대한 질적 및 정량적 분석을 이용한다. 간단히 도 5에 요약되어 있는 방법론은 종양 세포 및 시험관 내에서 종양 세포용해질로 펄스된 DC(바이러스 감염된 종양 세포) 모두로부터의 MHC-I의 분리 및 질량 분석법 기반 기술에 의한 MHC 관련 폴리펩타이드의 시퀀싱을 포함한다. 면역학적으로 관련된 펩타이드는 종양 세포 및 종양 용해물로 펄스된 수지상 세포 모두에 의해 제시될 것이다. 예를 들어, OVA 발현 마우스 모델의 사용은 시스템의 검증을 용이하게 할 수 있고, 실제로 주지의 면역원성 OVA 유래 펩타이드(예를 들어, SIINFEKL)는 마우스 실험을 기원으로하며 양성 대조군의 역할을 할 수 있다.
바이러스 감염으로 인해 세포에 의해 제시되는 폴리펩타이드를 차단하기 위해, 시험관 내 아데노바이러스 감염 전후의 대상의 종양 세포가 이 방법에서 사용된다. 종양 항원의 제시를 위해, 시험관 내에서 종양 세포용해질로 펄스된 DC가 또한 이 방법에서 사용된다. 종양 특이적 펩타이드의 분리를 위해 종양뿐만 아니라 종양 세포용해질로 펄스된 DC를 사용하는 이점은 면역학적 활성 펩타이드를 더욱 양호하게 동정하는 것이다(종양 및 DC 모두에 펩타이드가 존재할 때만, 효율적인 면역 반응이 있을 것이다). 종양 세포 및 수지상 세포로부터의 MHC-I 분자의 분리는 본 기술 분야의 임의의 적절한 분리 방법에 의해 수행될 수 있다. 이후, 폴리펩타이드의 시퀀싱은 MHC 관련 펩타이드를 동정하기 위한 임의의 적절한 질량 분석법 기반 기술(예를 들어, LC-MS/MS)에 의해 수행될 수 있다. 종양 및 수지상 세포에 의해 제시되는 폴리펩타이드는 이들 세포에 의해 제시되는 폴리펩타이드를 비교함으로써 동정될 수 있다. 두 그룹의 공통적인 폴리펩타이드, 즉, 펄스되지 않은 DC를 제외한(DC-자기 펩타이드를 제거하기 위해) 용해질로 펄스된 DC 에 의해 제시되는 폴리펩타이드 및 바이러스-감염된 종양 및 감염되지 않은 종양(바이러스 특이적 펩타이드를 제거하기 위해)에 의해 제시되는 폴리펩타이드가 아데노바이러스를 코팅하기에 적합하다. 폴리펩타이드의 비교는 수동으로 또는 본 기술 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 생물정보학 방법에 의해 수행될 수 있다. 임의의 특정 폴리펩타이드에 대해, 선택적으로 시험관 내, 체외 및/또는 체내 검증 또는 이들의 조합을 수행할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 감염된 및 감염되지 않은 종양 세포뿐만 아니라 감염된 수지상 세포로부터 MHC-I 분자를 분리하는 것 이외에, 상기 방법은 감염되지 않은 수지상 세포로부터 MHC-I 분자를 분리하고 MHC-I 관련 폴리펩타이드를 동정하는 단계; 및 단계 iii) 및 단계 iv)의 감염된 및 감염되지 않은 종양에 의해 및 감염되지 않은 수지상 세포가 아닌 단계 iii)의 감염된 수지상 세포에 의해 제시되는 폴리펩타이드를 동정하는 단계를 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터에 의한 종양 세포 및 DC의 감염은 시험관 내에서 발생한다. 본 발명의 방법에 사용되는 아데노바이러스 벡터는 임의의 아데노바이러스 벡터, 예를 들어, 이전 장에 기술된 벡터 중 임의의 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 대상으로부터 종양 특이적 및 MHC-I 특이적 폴리펩타이드를 동정하는 방법은 아데노바이러스 캡시드를 코팅하기 위한 하나 이상의 종양 특이적 및 MHC-I 특이적 폴리펩타이드를 선별하는데 사용된다. 이들 종양 특이적 및 MHC-I 특이적 폴리펩타이드 또는 이들의 조합 중 임의의 것이 코팅에 사용될 수 있다.
기술이 발전함에 따라, 본 발명의 개념이 다양한 방식으로 구현될 수 있다는 것은 본 기술 분야의 숙련자에게 자명할 것이다. 본 발명 및 이의 실시형태는 상기한 예로 제한되지 않고 청구 범위 내에서 변경될 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 적어도 종양 특이적 폴리펩타이드의 분리 및 선별을 위한 종양 MHC-I 면역 펩타이드군의 분석, 종양 특이적 폴리펩타이드-코팅된 종양살상 아데노바이러스의 생성 및 물리적 특성화, 및 동물 모델에서의 코팅된 아데노바이러스의 특성화(예를 들어, i) 치료 효능, ii) 항-바이러스 면역을 항-종양 면역으로 전환시키는 능력, 및 iii) 면역계의 세포를 모집하고 T 세포 반응을 촉진시키는 능력)를 입증한다.
종양살상 아데노바이러스 제작
모든 종양살상 아데노바이러스(OAd)는 앞서 기술된 바와 같이(8) 표준 프로토콜을 사용하여 생성되고 증식되었다. 간단히, 바이러스는 30의 감염 다중도(multiplicity of infection, MOI)에서 70-80% 컨플루언트 A549 세포로 10 개의 T175 플라스크를 감염시킴으로써 증폭되었다. 감염 후 3 일째, 세포를 채취하고 4 회의 동결(-80℃) 및 해빙(37℃) 사이클을 통해 용해시켰다. 이어서, 아데노바이러스 입자를 CsCl 구배의 2 개의 초원심 분리법(22,000 및 27,000 rpm)에 의해 세포 잔해 및 불순물로부터 분리하였다. 회수된 밴드를 연속 교반하면서 A195 완충액에 대해 4℃에서 밤새 투석하여 정제하였다. 구체적으로, 10,000 kDa의 분자량 컷오프를 갖는 투석 카세트(Pierce, Life Technologies)를 사용하였다. 정제된 바이러스를 카세트로부터 회수하고, 분주한 후 -80℃에서 보관하였다.
아데노바이러스 게놈의 무결성은 E3 유전자에 특이적인 프라이머 및 E1A 유전자에서의 D24 결실을 사용하여 PCR로 평가하였다.
바이러스 입자 역가(titer)는 분광 광도법(spectrophotometric method)을 사용하여 측정한 반면, 감염 역가는 본 섹션의 다른 부분에서 기술한 바와 같이 면역세포화학적 염색(immunocytochemical staining)으로 측정하였다. 바이러스 제제의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 분석 염료 시약 농축액(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하여 Bradford 분석법으로 측정하였다. 모든 분광 광도 측정은 SPECTROstar Nano 분광 광도계(BMG Labtech, Ortenber, Germany)를 사용하여 수행하였다.
본 작업에 사용된 모든 바이러스는 이전에 보고 된 바 있다: Ad5D24는 E1A 유전자에서 24-염기쌍 결실(D24)을 특징으로 하는 아데노바이러스이고(9), Ad5D24-CpG는 E3 유전자에서 CpG-풍부 게놈을 갖는 OAd이며(30), Ad5D24-GM-CSF는 바이러스 E3 프로모터의 제어 하에 GM-CSF를 발현하는 OAd이다(8).
종양 특이적 펩타이드를 분리 및 선별하기 위한 종양 MHC -I 면역 펩타이드군 의 분석
방법 1a:
마우스 CD11c+분류 골수 수지상 세포를 C57BL/6 마우스로부터 수득하고 1 주간 배양하였다23. 이어서,
A) 대조군으로서 PBS,
B) B16-OVA 세포로부터의 종양 세포용해질(종양 세포용해질은 종양살상 아데노바이러스 Ad5D24로 완전히 용해될 때까지 감염시킨 B16-OVA에서 유래됨),
C) 세포의 냉동 및 해동에 의해 얻어진 B16-OVA 세포 용해물에 세포를 노출시켰다.
다양한 시점에서, 펩타이드가를 탑재된 MHC-I를 약산성 용리액을 사용하여 생존 DC로부터 분리하였다25. 분석시, 펩타이드를 수용액에 용해시키고 LTQ-Orbitrap Elite 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific) 상에서 나노 LC-MS/MS로 분석하였다. 데이터베이스 검색은 51536 개의 서열과 24497860 개의 잔기를 함유하는 국제 단백질 지수 마우스 데이터베이스 버전 3.23에 대해 수행하였다(http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html). 펄스되지 않은 DC를 제외한(DC-자기 펩타이드를 제거하기 위해) 용해질로 펄스된 DC 및 감염되지 않은 B16-OVA를 제외한(바이러스 특이적 펩타이드를 제거하기 위해) 감염된 B16-OVA 바이러스 두 그룹에 공통적으로 존재하는 펩타이드에 의해 형성된 그룹에 관련 펩타이드가 존재했다.
방법 1b:
본 발명자들은 우선 가상 환경에서(in silico) 방법 1a의 면역 펩타이드군의 복잡도를 줄였다. MHC-I 클래스 펩타이드의 예측 (http://www.syfpeithi.de/home.htm). 단백질의 기능적 주석(http://david.abcc.ncifcrf.gov) 및 (http://www.ingenuity.com)을 사용하였다.
다양한 인간의 암 및 세포주에서의 소정 단백질의 발현 수준을 나타내기 위해 온코민(Oncomine) 분석(https://www.oncomine.org)을 사용하였다. 가장 중요한 것은, 본 발명자들이 에피토프 툴 예측인자(predictor)를 사용하여 펩타이드를 검증한 것이다([17]).
실험적으로, 가장 면역성이 강한 펩타이드를 선별하기 위해, 본 발명자들은 C57BL/6 마우스에서 채취되고 방법 1a에서 분리한 모든 펩타이드로 펄스된 비장 세포, 종양 세포 및 림프절에 대해 마우스 IFN-감마 ELISPOT(Mabtech AB, Sweden)를 사용하였다.
간략하게, B16-OVA 종양을 갖는 C57BL/6 마우스를 종양살상 아데노바이러스(Ad5D24)로 치료하였다. 치료 1-2 주 후에, 마우스를 안락사시키고 장기와 종양을 수득한 후 IFN-감마 ELISPOT 분석(Mabtech, Palo Alto CA)용 단일 세포 현탁액으로 환원시켰다. 이후, 본 발명자들은 가장 면역성이 강한 몇 가지 펩타이드를 동정하고 난 후, MHC-I 분자에서 이들 펩타이드를 인식하는 특정 CD8 T 세포의 유세포 분석 기반 검출용 맞춤형 사량체(tetramer) 또는 오량체(Proimmune, UK)를 생성하였다.
종양 특이적 펩타이드 -코팅된 종양살상 아데노바이러스의 생성 및 물리적 특성화
OVA 유래 펩타이드는 개념 증명으로 매우 잘 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 우선 OVA 특이적 코팅된 바이러스를 생성하였다(도 6). 더욱 상세하게, SIINFEKL-코팅된 아데노바이러스(SIINFEKL(SEQ ID NO: 1)는 가장 면역성이 강한 OVA 유래 펩타이드임); SIINFEDL-코팅된 바이러스(SIINFEDL(SEQ ID NO: 7)는 SIINFEKL 펩타이드의 길항제임); FILKSINE-코팅된 바이러스(FILKSINE(SEQ ID NO: 3)는 SIINFEKL의 스크램블 펩타이드임)를 생성하였다.
방법 2a:
펩타이드-코팅된 종양살상 아데노바이러스를 생성하기 위해, 다양한 전략이 고려되었다(도 7).
한 가지는 바이러스와 펩타이드 간의 정전기적 결합을 사용하고 다른 두 가지는 바이러스와 펩타이드 간의 공유 결합을 포함할 것이다.
I. 정전기적 상호작용. 음의 바이러스 캡시드와 복합체화된 양전하를 띤 펩타이드26.
II. 공유 결합. 캡시드 단백질의 시스테인과의 이황화 결합(disulphide bond)27,28.
III. 공유 결합. 아미드 결합. 캡시드 리신의 아민기와의 숙신이미딜 에스테르(succinimidyl ester) 반응28.
결합 방법은 해당 참조 문서에 개시되어 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 펩타이드-코팅된 종양살상 아데노바이러스는 다음과 같이 제조되었다
PeptiCRAd 복합체 형성
본 작업에서 설명되는 모든 PeptiCRAd 복합체는 다음 프로토콜에 따라 ("종양살상 아데노바이러스 제작"이라는 제목으로 설명된 바와 같이) 종양살상 바이러스 및 polyK-에피토프를 1:500의 비율로 혼합하여 제조하였다(도 8A 및 도 12 참조): i) 사용된 바이러스 제제의 1 마이크로리터에 대해, 존재하는 단백질의 마이크로그램의 상응하는 수를 계산하였고; 이후, ii) 바이러스 단백질의 1 마이크로그램에 대해, 500 μm의 펩타이드를 첨가하였고. iii) 와동(vortexing) 후, 혼합물을 상온(RT)에서 15 분 동안 배양하였고; 및 iv) 용액을 와동시키고 분석 또는 동물 주입에 사용하였다. 새로운 PeptiCRAds는 신선한 시약을 사용하여 각각의 실험 전에 준비되었다. 배양 전에 필요한 모든 바이러스와 펩타이드의 희석은 pH 7.4로 조절된 멸균 Milli-Q 물에서 수행하였다. 이어서, PeptiCRAds를 분석에 필요한 완충액으로 희석하였다.
방법 2b:
방법 2a로부터의 펩타이드로 코팅된 바이러스의 감염성은 다양한 세포주(인간 및 쥐)에서 루시퍼라제 분석(luciferase assay) 및 qPCR에 의해 시험관 내에서 평가하였다3 0. 감염성을 평가하기 위해, 다양한 CAR 발현 수준을 갖는 다양한 종양 세포주를 루시퍼라제(Ad5D24-Luc)(1, 10, 100, 1000 VP/세포)를 발현하는 다양한 농도의 코팅된 바이러스에 감염시켰고; 코팅되지 않은 바이러스는 항상 대조군으로 사용하였다. 다양한 시점에서, 루시퍼라제 발현을 정량화하였다. 동시에, 총 DNA를 수득하고 바이러스 DNA 복제를 qPCR로 정량화하였다. 시험관 내 종양살상 활성은 TCID50 및 MTS 분석법에 의해 평가하였다31.
본 발명의 일 실시형태에서, 감염성을 다음과 같이 ICC에 의해 분석하였다:
ICC 에 의한 감염성 분석
종양 세포를 3 또는 5 복제에서 24-웰 플레이트 상에 웰당 2.0×1015 개의 세포로 접종하였다. 다음날, 세포를 100 μl의 바이러스 희석액으로 감염시켰다. 플레이트를 37℃에서 1,000 rcf로 90 분간 원심분리 한 후 48 시간 배양하였다. 배양 기간 후, 배양 배지를 제거하고, 세포를 250 μl의 빙냉 메탄올로 15 분 동안 배양하여 고정시켰다. 메탄올을 제거하고 난 후, 세포를 1% 소 혈청 알부민 (BSA)이 보충된 300 μl의 PBS로 3 회 세척하였다. 이어서, 세포를 1:2,000으로 희석한 250 μl의 마우스 단일클론 항-헥슨 항체(Novus Biologicals, Littleton, CO, USA)로 어두운 실온에서 1 시간 동안 염색하였다. 이어서, 세포를 세척하고 PBS/1% BSA로 1:500으로 희석한 250 μl의 비오틴-스트렙타비딘-접합된 염소 항-마우스 항체로 어두운 실온에서 1 시간 동안 염색하였다. 이후, 세포를 1:200로 희석한 250 μl의 엑스트라비딘-페록시다아제(extravidin-peroxidase)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 세포를 광범위하게 세척하고 DAB 염색 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 제조자의 지시에 따라 제조하였다. 이어서, 총 250 μl의 DAB 염색 용액을 각각의 웰에 가하고 세포를 현미경으로 관찰하여 검은 반점을 확인하였다. 최적의 신호 대 잡음비에 도달하면, PBS/1% BSA(웰당 500 μl)를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 각각의 복제물(즉, 웰)에 대해, AMG EVOS XL 현미경(AMG group, Life Technologies)을 사용하여 겹치지 않는 필드의 5 개의 이미지를 획득하였다. 다음 공식을 사용하여 감염 역가를 측정하였다:
Figure pct00001
감염성 비교를 위해, 데이터는 각각 필드에서 평균 반점 수로 나타나 있다.
방법 2의 지원:
음전하를 띤 아데노바이러스 캡시드를 종양 특이적 펩타이드로 정전기 방식으로 코팅하였다. 이 복합체는 펩타이드의 양에 비례하는 Z-전위의 변화를 갖는다. Z-전위의 이러한 변화는 양전하를 띤 펩타이드가 전하의 역전을 결정하는 바이러스 캡시드에 결합한다는 것을 보여 주었다(도 8A의 점을 갖는 선). 캡시드의 모든 음전하가 포화되면, Z-전위는 안정한 상태에 도달한 것으로 보였다(도 12의 원을 갖는 선). 체외 및 체내 효능이 되도록 500 nM 이상의 폴리펩타이드의 농도로 균일한 단분산(monodispersed) 복합체를 형성할 수 있다.
펩타이드로 코팅된 아데노바이러스 복합체를 더 특성화하기 위해, 본 발명자들은 PeptiCRAd의 세포 살생 효능을 코팅되지 않은 종양살상 바이러스와 비교하는 여러 생존력 분석(MTS 분석)을 수행하였다(도 9). 결과는 바이러스의 코팅이 코팅되지 않은 종양살상 바이러스와 비교하여 변하지 않는 또는 더욱 양호한 세포 살상 활성을 야기한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 일 실시형태에서, 생존력 분석은 다음과 같이 수행되었다:
생존력 분석
종양 세포를 5% FBS를 함유하는 성장 배지에서 96-웰 플레이트 상에 웰당 1.0×104 세포로 접종하였다. 다음 날, 배지를 제거하고, 2% FBS를 함유하는 성장 배지로 희석된 50 μl의 바이러스를 사용하여 37℃에서 2 시간 동안 세포를 감염시켰다. 이후, 5% FBS를 함유하는 100 μl의 성장 배지를 첨가하고, 세포를 다시 37℃에서 배양하였다. 성장 매체는 격일로 교체하였다. 가장 감염 가능성이 높은 조건(100 vp/세포)이 광범위한 세포 변성 효과(> 90%)를 나타낼 때, 제조사의 프로토콜(CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay; Promega, Nacka, Sweden)에 따라 MTS 분석에 의해 세포 생존력을 측정하였다. 분광 광도 데이터는 Varioskan Flash Multimode Reader(Thermo Scientific, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 수득하였다.
연구 설계
샘플 크기는 다음 방정식을 사용하여 측정하였다:
Figure pct00002
여기서 C는 α와 β 값을 기반으로 한 상수이고, s는 추정된 변동성이며, d는 관찰되는 효과이다(34). 모든 동물 실험에 대해, 최소 80%의 검정력(power)(1-β)과 0.05의 유의성(α)이 고려되었다. 데이터 수집을 중지하는 규칙은 i) 하나 이상의 그룹에서 60% 이상의 마우스의 사망 및 ii) 종양의 완전한 제거이다. 실험이 끝나기 전에 사망한 모든 마우스를 분석의 통계적 완전성을 보존하기 위해 성장 곡선에서 제외하였다.
연구의 목적은 OAd가 펩타이드 암-백신 방법에 대해 유효한 보조제가 될 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 흑색종 모델을 사용하는 것이었다. 또한 두 가지 구체적인 질문이 제기되었다. i) PeptiCRAd는 원거리의 치료되지 않은 종양의 성장을 제한할 수 있는가? ii) PeptiCRAd의 효능은 하나의 종양 항원이 아닌 다수의 종양 항원을 표적으로 함으로써 향상될 수 있는가? 이러한 질문에 답하기 위해, 본 발명자들은 흑색종 종양을 갖는 면역 능력이 있는 마우스 또는 인간화 마우스를 사용하였다. 마우스를 무작위로 각각 실험 그룹에 배정하였고, 맹검(blinding)은 사용하지 않았다.
세포주, 시약 및 인간 샘플
인간 폐 암종 세포주 A549, 인간 대장 선암 세포주 CACO-2, 인간 악성 흑색종 세포주 SK-MEL-2, 인간 흑색종 세포주 HS294T 및 마우스 흑색종 세포주 B16-F10을 미국 Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 닭 OVA를 발현하는 마우스 흑색종 세포주인 B16-OVA(35) 세포주는 Richard Vile 교수(Mayo Clinic, Rochester, MN, USA)로부터 제공받았다.
A549, CACO-2 및 B16-OVA 세포주는 저-포도당 DMEM(Lonza, Basel, Switzerland)에서 배양하였고, HS294T 세포주는 고-포도당 DMEM(Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였고, SK-MEL-2 세포주는 EMEM(ATCC)에서 배양하였으며, B16-F10 세포주는 RPMI-1640(Gibco, Life Technologies)에서 배양하였다. 모든 배지에 10% 소 태아 혈청(FBS, Gibco, Life Technologies), 2 mM GlutaMAX(Gibco, Life Technologies) 및 100 U/ml 페니실린 및 0.1 mg/ml 스트렙토마이신(Gibco, Life Technologies)을 보충하였다. B16-OVA 세포주는 또한 5 mg/ml 게네티신(Gibco, Life Technologies)의 존재 하에 배양하여, OVA-발현 세포의 선별을 보장하였다. 배양 기간 동안 또는 분석이 필요할 때, 세포를 1X 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고 37℃에서 3 분 동안 1X TrypLE Express(Gibco, Life Technologies)로 배양하여 분리시켰다.
SIINFEKL(OVA257 -264), polyK-SIINFEKL, SIINFEKL-polyK, polyK-AHX-SIINFEKL, polyK-SVYDFFVWL(TRP-2180-188), polyK-KVPRNQDWL(hgp10025 -33) 및 polyK-SLFRAVITK(MAGE-A196-104) 펩타이드는 Zhejiang Ontores Biotechnologies Co.(Zhejiang, China)에서 구입하였다. 모든 펩타이드의 순도는 >80%로 추정되었고, 질량 스펙트럼 분석에 의해 분석되었다.
실시예에서, polyK는 6K를 의미한다.
펩타이드의 순전하는 펩타이드 특성 계산기 버전 3.1 온라인 도구(http://www.biosyn.com/PeptidePropertyCalculator/PeptidePropertyCalculator.aspx)에 의해 계산하였다.
SK-MEL-2 세포주의 유전자형은 HLA-A*03 - *26; B*35 - *38; C*04 - *12이다. 건강한 기증자의 연막(buffy coat)은 또한 Finnish Red Cross 서비스로부터 수득하였고, 유전자형은 HLA-A*03 - *03; B*07 - *27; C*01 - *07로 측정되었다.
동물 모델에서 코팅된 아데노바이러스의 특성화
방법 3a:
본 발명자들은 코팅된 바이러스 대 코팅되지 않은 일반 종양살상 바이러스의 효능, 면역원성, 독성, 생체내 분포를 생체 내에서 테스트하였다. 효능 및 면역원성은 B16-OVA 종양을 갖는 C57BL/6 마우스에서 테스트하였다. SIINFEKL-코팅된 바이러스는, 다른 코팅된 바이러스(길항제, 스크램블 및 코팅되지 않은 바이러스)와 비교할 때, 더욱 현저한 종양 통제(효능)로 변환 되는 더욱 강력한 항-OVA 반응을 나타냈다. 동시에, 방사성 표지된 세포(DC 및 T 세포)의 적응성 전달을 통해 종양 미세 환경으로의 이들 세포의 이동을 평가하였다. 마지막으로, 변형된 아데노바이러스 벡터의 독성 및 생체내 분포를 또한 분석하였다.
코팅된 바이러스의 효능을 분석하기 위해, 동종 B16-OVA 종양(마우스당 두 개의 종양)을 갖는 다양한 그룹의 C57BL/6 마우스(그룹당 N=15)를 다음과 같이 치료하였다: a) SIINFEKL-코팅된 바이러스, b) SIINFEDL-코팅된 바이러스, c) FILKSINE-코팅된 바이러스 및 d) 대조군으로서 코팅되지 않은 바이러스. 바이러스 투여 3 일 후부터 시작하여 다양한 시점에서 그룹당 두 마리의 마우스를 안락사 시키고 비장, 림프절 및 종양을 채취하여 ELISPOT, 공동 배양 및 유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁액에 넣었다. 동시에, 종양 성장을 시간의 경과에 따라 표준 캘리퍼스로 측정하였다. 유세포 분석은 종양, 비장 및 림프절(종양 배출 및 미배출)에서 SIINFEKL 특이적 T 세포의 양을 직접 나타내었다. 이 분석을 위해, 본 발명자들은 SIINFEKL 특이적 오량체(예를 들어, 31)를 사용하였다. 마우스 IFN-감마 ELISPOT은 또한 항-OVA (항-SIINFEKL) T 세포 활성화의 정량적 지표를 제공하였다. 공동 배양 실험에서, B16 및 B16-OVA를 사멸시키기 위해 T 세포(실험 쥐로부터 채취함)의 능력을 시험관에서 테스트하였다. 세포를 다양한 세포:표적 비율로 공-배양하고, B16 및 B16-OVA 생존력을 MTS 또는 MTT 분석에 의해 평가하였다. 이 모든 실험에서, OT-1 마우스로부터 채취한 T 세포를 대조군으로 사용하였다. 인간 아데노바이러스가 반-허용성(semi-permissive33)인 OVA를 발현하는 마우스 종양인 CMT64-OVA 모델도 사용하였다.
방법 3b:
i) OVA-펩타이드(SIINFEKL (SEQ ID NO: 1)), ii) B16 펩타이드 TRP2(SVYDFFVWL(SEQ ID NO: 5)), iii) hgp100 펩타이드(KVPRNQDWL (SEQ ID NO: 6)) 또는 iv) 방법 1에서 동정한 새로운 펩타이드로 코팅된 바이러스의 를 항-종양 활성 및 면역원성을 비교하였다.
이들 바이러스를 항-종양 면역 반응을 유도하는 효능 및 능력에 대해 테스트하였다. 항-바이러스 반응을 항-종양 반응과 비교하였다(ELISPOT 및 Pentamer 분석). 상이한 에피토프(예를 들어, OVA-바이러스가 TRP2 반응, 에피토프 확산을 유발함)에 대한 면역 반응을 유도하는 능력도 평가하였다. 이 방법에 사용된 방법은 이미 방법 3a에 설명되어 있다.
방법 2와 3에 기초한 연구:
본 발명자들은 도 7의 전략 I에 기술된 바와 같이 OVA 특이적 정 PeptiCRAd(SIINFEKL-코팅된 종양살상 아데노바이러스)를 생성하였다. 간단히 말해서, 합성 SIINFEKL 펩타이드를 합성하고 폴리-리신 링커(polyK-SIINFEKL)에 부착하여 펩타이드에 양의 순전하를 부여하였으며, 주입 30 분 전에 음의 순전하를 띤 노출 바이러스와 복합체화되었다. 복합체를 피하 B16-OVA 종양을 갖는 마우스에 종양내 투여하였다. 종양 성장을 모니터링하고, 실험이 끝나는 시점에 마우스를 안락사시키고, 종양을 채취하였으며, OVA 특이적 T 세포를 유세포 분석으로 정량화하였다(도 10).
본 실험은 바이러스 단독과 비교하여 그리고 바이러스와 펩타이드가 별도로 투여된 것과 비교하여 본 발명의 변형된 아데노바이러스 벡터의 우수성을 입증한다. 또한 더욱 높은 농도의 펩타이드로는 종양 특이적 T 세포를 덜 유도하는 것으로 보이므로, 코팅된 바이러스의 정확한 제형의 중요성을 보여준다(데이터 미도시).
2 세대 코팅된 아데노바이러스
방법 4:
더욱 강력한 다가 면역 반응을 유도하기 위해 하나 이상의 펩타이드로 종양살상 바이러스를 코팅하여 2 세대 PeptiCRAd를 생성하였다. 이러한 새로운 바이러스는 방법 2에서와 같은 특성화되었고, 효능은 방법 3에서 기술한 바와 같이 평가되었다. 이후, 본 발명자들은 몇 가지 유형의 폴리펩타이드로 사이토카인-무장 종양살상 아데노바이러스를 코팅하였다. 폴리펩타이드는 동일한 항원의 상이한 MHC-I 특이적 펩타이드, 또는 상이한 항원으로부터의 MHC-I 펩타이드, 또는 MHC-I 및 MHC-II 제한된 펩타이드의 조합일 수 있다.
코팅된 종양살상 바이러스를 분석하기 위해 사용되는 방법
제타 전위 및 동적 광산란 ( DLS ) 분석
코팅된 종양살상 바이러스 샘플을 "PeptiCRAdcomplex 제형"이라는 제목으로 기술된 바와 같이 제조하였다. 이후 각 샘플을 와동시키고 pH 7.4로 조절된 멸균 Milli-Q 물로 최종 부피가 700 μl가 되도록 희석시킨 후, 샘플을 일회용 폴리스티렌 큐벳으로 옮겨 복합체의 크기를 측정하였다. 이어서, 샘플을 큐벳에서 회수하고 제타 전위 측정을 위해 DTS1070 일회용 모세 혈관(Malvern, Worcestershire, UK)으로 옮겼다. 모든 측정은 Zetasizer Nano ZS(Malvern)로 25℃에서 수행하였다.
SPR
SPR를 사용하여 polyK-SIINFEKL 또는 SIINFEKL과 OAds와의 상호작용을 평가하였다. 측정은 다중 파라미터 SPR Navi™ 220A 장비(Bionavis Ltd, Tampere, 핀란드)를 사용하여 수행하였다. 이 장비는 통합된 유체 시스템을 갖는 온도-제어 듀얼 플로우 채널 및 버퍼 및 샘플 처리를 위한 자동 샘플러로 구성된다. pH가 7.4로 조절된 Milli-Q 물을 작동 완충액으로 사용하였다. 또한, 실험 전반에 걸쳐 30 μ/분의 일정한 유속을 사용하였고, 온도를 +20℃로 설정하였다. 표면 플라즈몬 여기를 위해 670 nm 파장의 레이저 광을 사용하였다.
SPR 실험 이전에, 이산화규소 표면을 갖는 센서 슬라이드는 3 분의 플라즈마 처리에 의해 활성화되었고, 이어서 1 시간 동안 톨루엔 용액 중 50 mM APTES에서 센서를 배양함으로써 APTES((3-아미노프로필)트리에톡시실란)로 코팅하였다. 이어서, 센서를 SPR 장치에 넣고, 50 μg/ml의 OAd를 Milli-Q 물(pH 7.4)에 대략 12 분 동안 주입함으로써 테스트 채널의 센서 표면 상에 AOd를 제자리에 고정시킨 후, 20 mM의 CHAPS(3-[(3-콜라미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트로 3 분 동안 세척하였다. 두 번째 유동 채널을 기준으로 사용하였고 Milli-Q 물(pH 7.4)을 주입한 후, CHAPS로 세척하였다. 기준선은 시료 주입 전 적어도 10 분 동안 관찰되었다. 이어서, PolyK-SIINFEKL 또는 SIINFEKL을 증가하는 농도로 유동 세포의 두 유동 채널에 동시에 주입하였다.
교차-제시 실험
나이브 C57BL/6 마우스로부터 신선한 비장을 채취하고 70-μm 세포 여과기(Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 통과시켰다. 적혈구는 샘플을 5 ml의 ACK 용해 완충액(Life Technologies)으로 실온에서 5 분 동안 배양하여 용해시켰다. 이후, 비장 세포를 세척하고 분석을 위해 준비하였다(테스트된 각각의 조건에 대해 800 μl의 10% RPMI-1640 배양 배지 중 2×106 개의 세포). 총 200 μl의 SIINFEKL, polyK-SIINFEKL, SIINFEKL-polyK 또는 SIINFEKL-AHX-polyK 펩타이드 희석액(0.19 μg/μl)을 췌장 세포에 첨가하였다. OVA-PeptiCRAd를 테스트하기 위해 100 vp/세포의 감염 조건을 사용하였다(200 μl의 10% RPMI-1640에서 37.5 μg의 polyK-SIINFEKL과 혼합된 총 7.9×109 개의 vp). PeptiCRAd 복합체는 방법 2에 기술된 바와 같이 제조하였다. 이어서, 비장 세포를 37℃에서 2 시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 광범위하게 세척하고 SIINFEKL 또는 APC 마우스 IgG1, κ 이소타입 대조군(BioLegend, San Diego, CA, USA)에 결합된 APC 항-마우스 H-2Kb로 염색하였다. 얼음에서 30 분 배양한 후, 샘플을 세척하고 유세포 분석으로 분석하였다.
유세포 분석
치료된 마우스의 종양, 비장 및 림프절을 채취하고, 70-μm 세포 여과기에 통과시킨 후 10% RPMI-1640 배지에서 밤새 배양하였다. 필요한 경우, 샘플을 RPMI-1640(10% FBS 및 10% DMSO 포함)에서 냉동시키고 -80℃에서 보관하였다. 단일 세포 현탁액을 형광색소-결합 단일클론 항체로 염색하고 BD LSR II(BD Biosciences) 또는 Gallios(Beckman Coulter) 유세포 분석기 및 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Ashland, OR, USA)를 사용하여 분석하였다. 살균 PBS를 염색 완충액으로 사용하였다. 에피토프 특이적 T 세포를 MHC 클래스 I 오량체(ProImmune, Oxford, UK)를 사용하여 분석하였다. 사용된 다른 항체는 다음을 포함하였다: 쥐 및 인간 Fc 블록 CD16/32(BD Pharmingen); FITC 항-마우스 CD8 및 FITC 항-인간 CD8(ProImmune); PE/Cy7 항-마우스 CD3ε, PE/Cy7 항-마우스 CD19, FITC 항-마우스 CD11c, PerCp/Cy5.5 항-마우스 CD86, SIINFEKL 및 APC 마우스 IgG1에 결합된 APC 항-마우스 H-2Kb, κ 이소타입 대조군(BioLegend). 모든 염색 절차는 제조업체의 권장 사항에 따라 수행되었다.
통계 분석
GraphPad Prism 6(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)을 사용하여 통계적 유의성을 측정하였다. 각각의 실험 데이터를 분석하기 위해 사용된 통계 방법에 대한 자세한 설명은 도면의 간단한 설명에서 알 수 있다.
동물 실험과 윤리적 문제
동물 실험은 핀란드 및 유럽의 법률에 따라 수행되었다. 동물 허가증(ESAVI/5924/04.10.03/2012)은 핀란드 당국(헬싱키 대학 및 남부 핀란드 주정부의 동물 실험 위원회)이 개정하고 승인하였다. Scanbur(Karlslunde, Denmark)로부터 완전한 면역 능력이 있는 C57BL/6 마우스를 공급받았고, Jackson Laboratories(Bar Harbor, ME, USA)로부터 면역결핍 삼중-녹아웃 NOD.Cg-Prkdcscid-IL2rgtm1Wj1/SzJ 마우스를 공급받았다. 모든 마우스는 4-6 주령에 구입하였고 분석 전 2 주 동안 격리시켰다. 마우스는 고립되고 조절된 공기 흐름을 갖는 케이지 안에 보관되었으며, 전체 연구 기간 동안 음식에 무제한으로 접근할 수 있었다. 마우스의 건강 상태는 수시로 모니터링되었고, 동물은 통증이나 고통의 첫 징후에서 희생되었다. 모든 절차는 무균 상태에서 바이오 안전성 레벨 2 캐비닛 내에서 수행되었다.
효능 실험을 위해, 종양 세포를 60-70% 컨플루언스(대수 증식기)에서 채취하고 마우스의 옆구리에 피하 주사하였다. 각각의 옆구리에 주입된 종양 세포의 수는 세포주 유형에 따라 3×105 B16-OVA, 1×105 B16-F10 및 2×106 SK-MEL-2로 다양하였다. 모든 실험에서, 3 회의 치료 주사가 주어졌다. 이어서, 종양 성장을 추적하고 종양 부피를 식을 사용하여 측정하였다.
본 발명자들의 면허에 따르면, 인도적인 실험종료는 i) 25%의 체중 감량, ii) 종양 직경 > 15 mm, iii) 통증의 징후(종양의 이동성 또는 궤양 감소)였다. 안락사는 이산화탄소 흡입 후 경추 탈구로 수행되었다.
결과
아데노바이러스 캡시드의 음전하는 양전하를 띤 면역원성 펩타이드를 복합체화하는데 사용되어 PeptiCRAd 를 형성할 수 있다.
아데노바이러스 캡시드는 높은 음의 순전하를 띠고(36); 따라서, 본 발명자들은 양전하를 띤 MHC-I 제한된 펩타이드가 정전기적 상호작용에 의해 캡시드에 결합함으로써, 면역학적으로 관련된 관련 펩타이드(즉, 종양 특이적 MHC-I 제한된 펩타이드)를 덮을 것이라는 가설을 세웠다. 본 발명자들의 가설을 검증하기 위해, 본 발명자들의 B16-OVA 종양 모델(37)을 사용하였다. 이 세포주는 닭 난백알부민(OVA)을 발현하고 MHC-I에서 모델 에피토프로 사용된 OVA 유래 펩타이드 SIINFEKL을 제시하였다.
중성의 소수성 SIINFEKL 펩타이드와 음의 바이러스 표면 사이의 정전기적 상호작용을 허용하기 위해, 본 발명자들은 폴리펩타이드 서열에 폴리리신(polyK) 사슬을 추가하였다. 이 화학적 변형은 생리학적 조건 하에서 펩타이드의 순전하를 0 mV에서 +6 mV로 증가시켰다. 그 다음, 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 바이러스 캡시드와 변형된 펩타이드 간의 상호작용을 분석하였다. 특히, APTES 실리카 SiO2 센서를 OAd로 코팅하고 SIINFEKL 또는 polyK-SIIN의 농도를 유수계에 주입하였다 (도 8B). 변형되지 않은 펩타이드에서는 신호의 증가가 관찰되지 않았고(도 8B, 파선), 변형된 펩타이드에서는 신호의 농도-의존성 증가가 관찰되었으며(도 8B, 실선), 이는 펩타이드의 변형이 아데노바이러스 캡시드와의 상호작용을 증가시킨 것을 나타낸다.
그 다음, 본 발명자들은 바이러스 표면을 효율적으로 덮는데 필요한 펩타이드의 최적 농도를 조사하였다. 이를 위해, 상이한 OAd:펩타이드 비율(1:5, 1:50, 1:100 및 1:500)로 인한 바이러스-펩타이드 복합체의 순전하 및 유체역학 직경을 평가하였다. 반응에서 양전하를 띤 펩타이드의 양과 복합체의 순전하 간의 명확한 관계를 관찰하였다(도 8A). 가장 낮은 비율(1:5)은 바이러스 입자의 전하를 -29.7±0.5에서 +6.3±0.06 mV로 증가시킬 수 있었지만, 이러한 조건 하에서는, 복합체(800±13.5 nm)의 크기의 증가로 나타낸 바와 같은 큰 응집이 관찰되었다. 1:5 이상에서는, 순전하가 증가하여 안정기와 같은 동역학에 도달하였으며, 실제로 각각 1:50, 1:100 및 1:500 비율에 대해 +17.5±0.2, +18.4±0.1 및 +18±0.8 mV의 제타 전위를 측정하였다. 그러나, 단지 1:500의 비율에서는 복합체의 직경이 120 nm 미만으로 감소하였고, 이는 아데노바이러스 입자의 정상 직경을 나타내는 것이다(도 8A). 또한 반복성을 촉진하기 위해 비율이 아닌 펩타이드의 농도로 동일한 실험을 반복하였다(도 12).
PeptiCRAd 상에 흡착된 변형된 MHC -I 에피토프는 효율적으로 교차 제시된다.
효과적인 세포독성 T-림프구-매개 면역 반응을 유도하기 위해, 펩타이드는 APC 상의 MHC-I을 통해 나이브 CD8+ T 림프구에 교차 제시되어야 한다. 따라서, 본 발명자들은 polyK 사슬의 존재와 위치가 교차 제시의 효율성에 영향을 미칠 수 있는지 조사하였다. 이를 위해, 천연 SIINFEKL 또는 두 가지 리신-연장 버전인 polyK-SIINFEKL(N-말단 연장) 및 SIINFEKL-polyK(C-말단 연장) 중 하나를 사용하여 시험관 내에서 배양된 비장 세포(C57BL/6 마우스)를 펄스하였다. 음성 대조군으로, 프로테아좀(proteasome)의 단백질 분해 활성을 억제할 수 있는 공지된 리신 유사체인 아미노 카프로익(AHX) 잔기를 함유하는 연장된 SIINFEKL을 포함시켰다. 이후, 본 발명자들은 SIINFEKL가 탑재된 MHC-I를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 SIINFEKL의 교차 제시를 평가하였다(38).
예상한 바와 같이, SIINFEKL-펄스된 비장 세포의 98.5%가 비장세포막 상의 MHC-I 분자 상에서 SIINFEKL의 존재에 대해 양성이었다(도 13A). 흥미롭게도, 펩타이드의 서열에서 polyK 사슬의 위치는 염색된 세포의 비율을 크게 변화시켰다. 실제로, N-말단-연장 펩타이드로 펄스된 비장 세포의 94.5%가 SIINFEKL을 교차 제시하였다. 대조적으로, 비장세포가 C-말단 연장 SIINFEKL-polyK로 펄스될 때, 염색된 개체군은 27.1%로 감소하였다. 음성 대조군 SIINFEKL-AHX-polyK로 펄스했을 때, 비장세포의 1.36%만이 SIINFEKL 펩타이드를 교차 제시하였다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 추가 분석을 위해 N-말단-연장 버전(polyK-SIINFEKL)을 선택하였다.
그 다음, 본 발명자들은 바이러스 캡시드 상에 변형된 SIINFEKL의 흡착이 이의 교차 제시에 영향을 줄 수 있는지를 조사하였다. 이전 실험에서와 마찬가지로, 펩타이드 SIINFEKL 또는 polyK-SIINFEKL 또는 OVA-PeptiCRAd로 마우스 비장세포를 배양하였다. N-말단-연장 polyK-SIINFEKL이 OTA와 복합체화되어 PeptiCRAd를 형성함으로써 SIINFEKL 펩타이드의 효과적인 MHC-I 제한된 제시를 가능하게 한다는 것을 발견하였다(도 13B).
PeptiCRAd 는 변형되지 않은 바이러스에 비해 변하지 않는 감염성 및 온전한 종양살상 활성을 나타낸다.
OAd는 선택적으로 종양 세포를 감염시킬 수 있으며 OAd 복제 주기를 통해 이들을 용해시킬 수 있다. 따라서 본 발명자들은 변형된 펩타이드로 바이러스를 코팅하는 것이 이들의 생물학적 특성에 영향을 미치는지 조사하였다. 낮은 수준의 콕스사키(coxsackie) 및 아데노바이러스 수용체(CAR)를 발현하는 인간 대장 선암 세포주(CACO-2) 및 높은 수준의 CAR을 발현하는 두 개의 인간 흑색종 세포주(SK-MEL-2와 A2058)를 분석하기로 선택하였다. OVA-PeptiCRAd와 변형되지 않은 바이러스 Ad5D24를 비교하는 체외 생존력 분석을 먼저 수행하였고(도 14a), 결과는 종양살상 활성에 관해서 유의한 차이를 나타내지 않았다. 예상한 바와 같이, 가장 감염성이 높은 상태(100 vp/세포)는 모든 세포주에서 가장 낮은 생존력과 관련이 있다. 또한, 본 발명자들은 펩타이드 polyK-SIINFEKL이 세포에 독성 영향을 미치지 않는 것을 보여주었다.
이후, 본 발명자들은 시험관 내에서 동일한 세포주를 사용하여 면역세포화학(immunocytochemistry, ICC)) 분석에 의해 PeptiCRAd의 감염성을 평가하였다(도 14B). SK-MEL-2 세포주에서 차이가 관찰되지는 않았지만, CACO-2 및 A2058 세포주에서 PeptiCRAd는 노출 아데노바이러스에 비해 감염성이 유의하게 증가하는 것으로 나타났다(P<0.01). 이러한 증가는 PeptiCRAd와 노출 아데노바이러스의 서로 다른 전하로 인한 것일 가능성이 있었다(36).
흑색종 쥐 모델에서 PeptiCRAd 암 백신의 항-종양 효능 및 면역학의 분석.
PeptiCRAd의 항-종양 효능 및 이에 의해 촉진되는 항-종양 면역을 철저하게 분석하기 위해, 본 발명자들은 우선 닭 OVA(B16-OVA)를 과발현하는 흑색종 쥐 모델(B16-OVA)을 사용하였다(35). 구체적으로, B16-OVA를 마우스의 옆구리에 이식한 후, 생성된 종양을 치료하였다. 실험은 E1A(Ad5D24)(37)에서 D24 결실을 지닌 OAd를 사용하여 수행한 다음 면역력을 더욱 높이기 위해 CpG가 풍부한 아데노바이러스(Ad5D24-CpG)(39)로 반복하였다(도 15). 분석 그룹에는 OVA-PeptiCRAd, 비-복합체화 Ad5D24-CpG 및 SIINFEKL(Ad5D24-CpG + SIINFEKL), OAd(Ad5D24-CpG) 또는 펩타이드(SIINFEKL) 단독 또는 식염수(모의)와 함께 치료한 마우스를 포함하였다.
PeptiCRAd 치료는 모의 치료 또는 OAd와 SIINFEKL의 혼합물과 비교하여 종양 성장을 유의하게 감소시켰다(P<0.01). 실험이 끝나는 시점에서, OVA-PeptiCRAd로 치료된 마우스의 평준 종양 부피는 다른 모든 그룹보다 낮았다(120.4±31.6 mm3 대비, 모의에서 697.7±350 mm3, SIINFEKL에서 255±61.5 mm3, Ad5D24-CpG에서 713.7±292.6 mm3, Ad5D24-CpG+SIINFEKL에서 489.7±73.2 mm3; 도 15A).
두 개의 상이한 시점(각각, 초기 및 후기 시점에 대해 7 일 및 16 일)에서 마우스를 희생시키고, 면역학적 분석을 위해 비장, 종양 및 배출 림프절을 채취하였다. 이 분석은 PeptiCRAd로 치료된 마우스 그룹에서 서혜부 배출 림프절에 SIINFEKL 특이적 CD8+ T 세포(CD8+OVA+ T 세포)의 큰 개체군의 존재를 밝혀냈다(7 일째 7.4% 및 16 일째 3.2%). 동일한 분석은 초기 시점에서 종양의 현저한 차이는 보이지 않았지만, 후기 시점에서는 상당한 증가가 관찰되었다(16 일째 OVA-PeptiCRAd에서의 0.23% 대비, 모의에서 0.02%, SIINFEKL에서 0.03%, Ad5D24-CpG에서 0.23% 및 Ad5D24-CpG+SIINFEKL에서 0.02%; 도 15B 및 도 15C).
이후, 본 발명자들은 비장, 림프절 및 종양에서 종양의 크기와 OVA 특이적 T 세포(CD8+OVA+ T 세포)의 개체군 사이의 상관 관계를 분석하였다. 본 발명자들은 상관 관계(음의 값, 음의 상관, 양의 값, 양의 상관)를 추정하기 위해 피어슨의 r 값을 계산하였고 종양의 부피와 항-OVA 반응 정도 간의 음의 상관을 관찰하였으며(도 15D), 더욱 작은 종양을 가진 동물 그룹이 CD8+OVA+ T 세포의 더욱 견고한 개체군을 가진 동물 그룹에 해당한다는 것을 보여 주었다. 이후, 이 상관의 강도를 평가하기 위해 각각의 샘플 세트에 대해 r2 값을 계산하였다(비장, r2=0.5719, 림프절, r2=0.6385, 종양, r2=0.7445). 흥미롭게도, 상관 분석에서, PeptiCRAd 그룹(도 15d의 적색 점)은 가장 작은 종양 부피 및 가장 큰 면역학정 반응을 일관되게 나타내었다.
마지막으로, PeptiCRAd의 메커니즘에 대한 이해를 강화하기 위해, 마우스의 비장에서 MHC-I 상에 SIINFEKL 펩타이드를 나타내는 성숙 DC(CD19-CD3-CD11c+CD86high 세포)의 비율을 평가하였다. 후기 시점에서, 성숙한 SIINFEKL-제시 DC의 비율은 비-복합체화 Ad5D24-CpG+SIINFEKL로 치료된 마우스에서보다 OVA-PeptiCRAd로 치료된 마우스에서 유의하게 높았다(P<0.05). 두 시점 모두 고려할 때, PeptiCRAd만이 CD86highOVA+ DC 개체군에서 9.67 배 증가한 것으로 나타난 바와 같이, 성숙한 SIINFEKL-제시 DC의 증가를 유도하는 유일한 치료법이었다(도 15E).
이러한 결과는 성숙한 및 에피토프 특이적 DC 풀의 확장이 PeptiCRAd의 더욱 높은 항-종양 효능의 기초가 될 수 있음을 시사한다.
다가 항원 PeptiCRAd 는 원거리의 치료되지 않은 흑색종에 대한 항-종양 활성을 향상시킨다.
종양살상 백신을 사용하는 주된 이점 중 하나는 유발된 면역 반응이 원발성 종양뿐만 아니라 파종성 전이의 표적화를 촉진한다는 것이다. 이러한 이유로, 본 발명자들은 흑색종의 쥐 모델에서 치료되지 않은 대측성 종양에 대한 PeptiCRAd의 항-종양 효능을 조사하였다. 동일한 실험 세트에서, 단일 종양이 아닌 두 가지 종양 항원(다가 PeptiCRAd를 통한)을 표적으로 하는 것이 전반적인 효능을 증가시킬 수 있는지 분석하였다. 따라서, 본 발명자들은 종양살상 바이러스 Ad5D24-CpG: SVYDFFVWL(TRP-2180-188; 쥐 MHC-I 분자 H-2Kb로 제한됨) 및 KVPRNQDWL(인간 gp10025 -33 또는 hgp100; 쥐 MHC-I 분자 H-2Db로 제한됨)을 코팅하는 두 가지 종양 특이적 MHC-제한된 에피토프를 선별하였다(40). 이러한 실험에서, 종양 항원 모두를 발현하는 매우 공격적인 흑색종 B16-F10을 사용하였다(41). 펩타이드는 이들의 N-말단에서 polyK 사슬로 변형되어, 이전처럼 SIINFEKL에서와 같이 바이러스 캡시드에 대한 이들의 흡착을 촉진시켰다.
본 발명자들은 우선 C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 1×105 개의 B16-F10 세포를 이식하였다. 10 일 후, 치료는 다음과 같이 개시되었다: i) 식염수(모의), ii) 노출 종양살상 바이러스(Ad5D24-CpG) 및 iii) 이중 코팅된 TRP-2-hgp100-PeptiCRAd. 도 6A에 개략적으로 도시된 바와 같이, 치료는 격주로 종양 내 투여되었다. 마지막 주사 접종 2 일 후, 3×105 개의 B16-F10 세포를 마우스의 왼쪽 옆구리에 주입하고 흑색종의 성장을 관찰하였다. 이중 코팅된 PeptiCRAd로 치료한 마우스는 대조군에 비해 종양 성장을 유의하게 감소시킨 것으로 나타났다(P<0.001)(11 일; 도 16A). 속발성 및 치료되지 않은 종양의 분석은 다른 모든 그룹에 비해 이중 코팅된 PeptiCRAd의 이점을 나타냈다. 특히, 실험이 끝나는 시점에서, 이 그룹의 속발성 종양은 식염수 또는 Ad5D24-CpG만을 투여한 대조군에 비해 현저히 작았다(P<0.01; 도 16B).
이러한 결과를 뒷받침하는 메커니즘을 더욱 명확하게 하기 위해, 본 발명자들은 두 epitopes에 대한 특정 T-세포 반응을 분석하기 위해 유세포 분석을 수행하였다. TRP-2-hgp100 PeptiCRAd로 치료한 마우스에서, 본 발명자들은 모든 다른 그룹에서보다 에피토프 특이적 CD8+ T 세포의 더욱 큰 누적 개체군을 관찰하였다(도 16C).
종합하면, 이러한 결과는 PeptiCRAd 접근법이 면역성이 약하고 더욱 공격적인 흑색종 모델에 대해 효과적이라는 것을 입증한다. 또한, 다수의 항원을 표적으로 하는 것은 치료된 종양과 치료되지 않은 종양 모두에 강력한 영향을 미친다. 따라서, 다가 PeptiCRAds를 생성할 수 있고, 이들은 다양한 종양 항원을 표적화함으로써 종양의 일부 면역학적 탈출을 극복할 수 있는 가능성을 제공할 수 있다.
PeptiCRAd 는 인간 종양을 갖는 인간화 마우스에서 향상된 효능 및 항-종양 면역을 나타낸다.
마지막으로, 본 발명자들은 임상 환경으로의 변환의 타당성에 대한 정보를 제공할 수 있는 모델에서 PeptiCRAd의 효능을 평가하고자 하였다. 따라서, 더욱 정교한 인간화 마우스 모델을 선택하였다. 이를 위해, 우선 삼중-녹아웃 마우스(NOD.Cg-Prkdc scid - IL2rg tm1Wj1 /SzJ, 또는 NSG)에 인간 흑색종 세포주 SK-MEL-2를 이식하였다. 종양이 현저한 크기에 도달했을 때, 건강한 기증자로부터의 부분적으로 일치된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs)를 동일한 마우스에 이식하였다. 하루 후, 마우스를 PeptiCRAd, 코팅되지 않은 바이러스 또는 식염수로 처리하였다. 이 실험을 위해, 본 발명자들은 흑색종 관련 항원 A1(MAGE-A196-104; SLFRAVITK)에서 유래한 펩타이드를 선별하고 이를 바이러스 캡시드(polyK-SLFRAVITK)와의 상호작용을 하도록 변형시켰다. 이 실험에서, 본 발명자들은 완전한 인간의 면역계를 분석하면서, 이전에 암 환자를 비롯한 면역 능력이 있는 시스템에서 활성이 증가한 것으로 밝혀진 인간 GM-CSF를 발현하는 OAd를 선별하였다(8).
본 발명자들은 MAGE-A1 PeptiCRAd가 종양 부피의 급격한 감소에 의해 나타나는 바와 같이, 대조군 처리에 비해 효능이 증가된 것을 발견하였다(도 17A 및 도 17B). 마지막으로, 이 모델에서 더욱 강한 면역 반응이 PeptiCRAd의 증가된 항-종양 효능을 설명할 수 있는지 여부를 조사하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 오량체 염색에 의해 MAGE-A196-104 특이적 CD8+ T 세포의 존재를 분석하였고(도 17C), PeptiCRAd로 처리한 마우스의 비장에서 인간 MAGE 특이적 T 세포 (CD8+MAGE-A1+)의 가장 큰 개체군을 발견하였다
이 데이터는 PeptiCRAd가 종양살상 바이러스의 자연 면역원성을 이용하여 종양 특이적 면역 반응을 자극함으로써 암 면역 바이러스요법의 효능을 향상 시킨다는 이전 분석 결과를 확인시켜 준다.
임의의 질병 및 아데노바이러스 캡시드의 코팅에 대한 MHC -I 특이적 폴리펩 타이드의 분석 및 이의 용도
임의의 MHC-I 특이적 폴리펩타이드(들)는 DC로 대표되는 MHC-I 발현 폴리펩타이드 및 대상의 감염된 질병 세포를 비교함으로써 동정된다. 두 세포 군에 의해 제시된 하나 이상의 폴리펩타이드는 아데노바이러스 벡터를 코팅하기 위해 선택된다
임의의 아데노바이러스 벡터를 방법 2에 기재된 임의의 방법에 따라 선택하여 코팅한다.
코팅된 벡터는 환자의 질병을 치료하기 위해 사용된다.
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SEQUENCE LISTING <110> Helsingin yliopisto <120> Modified adenoviruses for cancer vaccines development <130> 2140609PC <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 1 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 2 Ser Ile Ile Asn Phe Asp Leu 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 3 Phe Ile Leu Lys Ser Ile Asn Glu 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 4 Ser Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 5 Ser Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 6 Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu 1 5 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide fragment <400> 7 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Asp Leu 1 5

Claims (26)

  1. 펩타이드 특이적 면역 반응을, 이를 필요로 하는 대상에서 자극하는 방법에 있어서, 상기 방법은 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드를 포함하는 바이러스 벡터를 대상에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 폴리펩타이드는 상기 아데노바이러스 벡터에 의해 유전적으로 암호화되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극하는데 사용하기 위한, 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드를 포함하는 아데노바이러스 벡터에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 아데노바이러스 벡터에 의해 유전적으로 암호화되지 않은 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터의 용도.
  3. 제 1 항에 따른 방법 또는 제 2 항에 따른 아데노바이러스 벡터의 용도에 있어서,
    상기 펩타이드 특이적 면역 반응은 항-종양, 항-암, 항-감염 및 항-바이러스 면역 반응으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법 또는 아데노바이러스 벡터의 용도.
  4. 암의 치료를 필요로 하는 대상에서 암을 치료하는 방법에 있어서, 상기 방법은, 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있고 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드를 포함하는 아데노바이러스 벡터를 대상에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 폴리펩타이드는 상기 아데노바이러스 벡터에 의해 유전적으로 암호화되지 않은 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 대상에서 암을 치료하는데 사용하기 위한, 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있고 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드를 포함하는 아데노바이러스 벡터에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 아데노바이러스 벡터에 의해 유전적으로 암호화되지 않은 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터의 용도.
  6. 제 4 항에 따른 방법 또는 제 5 항에 따른 아데노바이러스 벡터의 용도에 있어서,
    상기 암은 비인두암(nasopharyngeal cancer), 활막암(synovial cancer), 간세포암(hepatocellular cancer), 신장암, 결합 조직의 암, 흑색종, 폐암, 장암, 결장암, 직장암, 대장암, 뇌종양, 인후암, 구강암, 간암, 골암, 췌장암, 융모암, 가스트리노마(gastrinoma), 크롬친화세포종(pheochromocytoma), 프로락틴종(prolactinoma), T 세포 백혈병/림프종, 신경종, 폰 히펠-린다우병(von Hippel-Lindau disease), 졸링거-엘리슨 증후군(Zollinger-Ellison syndrome), 부신암, 항문암, 담도암, 방광암, 수뇨관암, 뇌종양, 핍지교종(oligodendroglioma), 신경아세포종(neuroblastoma), 수막종(meningioma), 척수종양, 골암, 골연골종(osteochondroma), 연골육종(chondrosarcoma), 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 원발 부위가 알려지지 않은 암, 유암종, 위장관 암종, 섬유육종(fibrosarcoma), 유방암, 페제트병(Paget’s disease), 자궁경부암, 대장암, 직장암, 식도암, 담낭암, 두부암, 안암, 경부암, 신장암, 윌름스 종양(Wilms’ tumor), 간암, 카포시 육종(Kaposi’s sarcoma), 전립선암, 폐암, 고환암, 호지킨병(Hodgkin’s disease), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin’s lymphoma), 구강암(oral cancer), 피부암, 중피종(mesothelioma), 다발성 골수종(multiple myeloma), 난소암, 내분비 췌장암(endocrine pancreatic cancer), 글루카곤종(glucagonoma), 췌장암, 부갑상선암(parathyroid cancer), 음경암(penis cancer), 뇌하수체암(pituitary cancer), 연조직 육종(soft tissue sarcoma), 망막아세포종(retinoblastoma), 소장암, 위암, 흉선암(thymus cancer), 갑상선암(thyroid cancer), 영양막암(trophoblastic cancer), 포상기태(hydatidiform mole), 자궁암, 자궁 내막암(endometrial cancer), 질암(vagina cancer), 외음암(vulva cancer), 청각 신경종(acoustic neuroma), 균상식육종(mycosis fungoides), 인슐린종(insulinoma), 카르시노이드 증후군(carcinoid syndrome), 소마토스타티노마(somatostatinoma), 치은암, 심장암, 구순암, 뇌수막암(meninges cancer), 구강암(mouth cancer), 신경암(nerve cancer), 경구개암(palate cancer), 귀밑샘암(parotid gland cancer), 복막암(peritoneum cancer), 인두암(pharynx cancer), 늑막암(pleural cancer), 침샘암(salivary gland cancer), 설암(tongue cancer) 및 편도암(tonsil cancer)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법 또는 아데노바이러스 벡터의 용도.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대상은 인간 또는 동물인 것을 특징으로 하는 방법 또는 아데노바이러스 벡터의 용도.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터를 투여하는 단계는 종양내(intratumoral), 동맥내(intra-arterial), 정맥내(intravenous), 흉강내(intrapleural), 방광내(intravesicular), 강내(intracavitary) 또는 복막(peritoneal) 주사, 또는 경구 투여를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법 또는 아데노바이러스 벡터의 용도.
  9. 아데노바이러스 벡터로서, 바이러스 캡시드에 폴리펩타이드가 부착되어 있으며, 폴리펩타이드가 부착된 아데노바이러스 벡터는 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있는 것을 특징으로 하는 아데노바이러스 벡터.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 바이러스 캡시드에 공유 또는 비공유 부착된 것을 특징으로 하는 방법, 아데노바이러스 벡터의 용도, 또는 아데노바이러스 벡터.
  11. 아데노바이러스의 캡시드를 변형시키는 방법에 있어서, 상기 방법은, 폴리리신-변형된(polylysine-modified) 폴리펩타이드를 아데노바이러스 캡시드와 공유 또는 비공유 결합시키는 단계를 포함하며, 변형된 아데노바이러스 벡터는 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 폴리펩타이드를 캡시드에 공유 또는 비공유 결합시킴으로써 아데노바이러스의 캡시드를 코팅하기 위한, 대상에서 펩타이드 특이적 면역 반응을 자극할 수 있는 폴리리신-변형된 폴리펩타이드의 용도.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩타이드는 정전기, 이황화 또는 아미드 결합에 의해 캡시드에 부착되거나, 단일 나노입자 내에서 캡시드에 공동 전달되어 부착되는 것을 특징으로 하는 방법, 용도, 아데노바이러스 벡터의 용도 또는 아데노바이러스 벡터.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드는 모두 동일한 폴리펩타이드이거나 두 가지 이상의 유형의 상이한 폴리펩타이드로부터 선택되는 상이한 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법, 용도, 아데노바이러스 벡터의 용도 또는 아데노바이러스 벡터.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드는 클래스 I의 주조직 적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex of class I, MHC-I) 특이적 폴리펩타이드, 클래스 II의 주조직 적합성 복합체(MHC-II) 특이적 폴리펩타이드, 질병 특이적 폴리펩타이드, 종양 특이적 폴리펩타이드 및 DC 특이적 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법, 용도, 아데노바이러스 벡터의 용도 또는 아데노바이러스 벡터.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 바이러스 캡시드 상에 부착된 폴리펩타이드는 동시에 모두 MHC-I 특이적 및 질병 특이적 폴리펩타이드, 동시에 모두 MHC-I 특이적 및 종양 특이적 폴리펩타이드, 동시에 MHC-I 특이적, DC 특이적 및 질병 특이적 폴리펩타이드, 또는 동시에 MHC-I 특이적, DC 특이적 및 종양 특이적 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 방법, 용도, 아데노바이러스 벡터의 용도 또는 아데노바이러스 벡터.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    아데노바이러스 벡터 골격(backbone)의 혈청형은 혈청형 3 또는 혈청형 5에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법, 용도, 아데노바이러스 벡터의 용도 또는 아데노바이러스 벡터.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터는 종양살상(oncolytic) 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법, 용도, 아데노바이러스 벡터의 용도 또는 아데노바이러스 벡터.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터는 24bp 결실 또는 E1 유전자 결실을 포함하거나, 벡터는 헬퍼-의존성 벡터(Helper-dependent vector)인 것을 특징으로 하는 방법, 용도, 아데노바이러스 벡터의 용도 또는 아데노바이러스 벡터.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터는 하나 이상의 형질전환 유전자(transgene)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법, 용도, 아데노바이러스 벡터의 용도 또는 아데노바이러스 벡터.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터는 캡시드 변형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법, 용도, 아데노바이러스 벡터의 용도 또는 아데노바이러스 벡터.
  22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터는 Ad5 핵산 골격 및 Ad3 섬유 혹(fiber knob), Ad35 섬유 혹, Ad5/3 키메라 섬유 혹(chimeric fiber knob) 및 Ad5/35 키메라 섬유 혹으로 이루어진 군에서 선택되는 섬유 혹을 포함하는 Ad5/3 또는 Ad5/35인 것을 특징으로 하는 방법, 용도, 아데노바이러스 벡터의 용도 또는 아데노바이러스 벡터.
  23. 제 9 항 내지 제 10 항 또는 제 13 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항의 아데노바이러스를 포함하는 약학적 조성물.
  24. 대상으로부터 종양 특이적 및 MHC-I 특이적 폴리펩타이드를 동정하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    i) 아데노바이러스 벡터로 대상의 종양 세포를 감염시키는 단계;
    ii) 아데노바이러스 벡터로 대상의 수지상 세포를 감염시키는 단계;
    iii) 단계 i)의 종양 세포 및 단계 ii)의 수지상 세포로부터 MHC-I 분자를 분리하고 두 그룹으로부터 MHC-I 관련 폴리펩타이드를 동정하는 단계;
    iv) 감염되지 않은 종양 세포로부터 MHC-I 분자를 분리하고 MHC-I 관련 폴리펩타이드를 동정하는 단계;
    v) 단계 iii) 및 단계 iv)의 감염된 및 감염되지 않은 종양 및 단계 iii)의 수지상 세포에 의해 제시된 폴리펩타이드를 동정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 방법은, 감염되지 않은 수지상 세포로부터 MHC-I 분자를 분리하고MHC-I 관련 폴리펩타이드를 동정하는 단계; 및 단계 iii) 및 단계 iv)의 감염된 및 감염되지 않은 종양에 의해 및 감염되지 않은 수지상 세포가 아닌 단계 iii)의 감염된 수지상 세포에 의해 제시되는 폴리펩타이드를 동정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,
    아데노바이러스 캡시드를 코팅하기 위한 하나 이상의 종양 특이적 및 MHC-I 특이적 폴리펩타이드를 선별하기 위한 방법.
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