KR20170017006A - 점막 면역 부활화제 및 hpv 감염증 치료용 경구 의약 조성물 - Google Patents

점막 면역 부활화제 및 hpv 감염증 치료용 경구 의약 조성물 Download PDF

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Abstract

점막 면역 부활화제는 자양강장 작용을 갖는 한방약 및 점막 애주번트를 함유한다. HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물은 HPV의 E7 폴리펩티드와 자양강장 작용을 갖는 한방약을 적어도 포함한다.

Description

점막 면역 부활화제 및 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물{MUCOSAL IMMUNITY-STIMULATING AGENT, AND ORAL PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING HPV INFECTION}
본 발명은 점막 면역 부활화제 및 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 점막 애주번트(adjuvant)와 자양강장 작용을 갖는 한방약을 함유하는 점막 면역 부활화제, 그리고 HPV 백신과 자양강장 작용을 갖는 한방약을 함유하는 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물에 관한 것이다.
인유두종 바이러스(HPV)는 DNA 바이러스로서, 현재까지 100종류 이상의 다른 형태가 보고되고 있다. 상기 HPV는 피부(예를 들면 HPV-1, HPV-2)나 점막 표면(예를 들면 HPV-6, HPV-11)에 감염됨으로써 수개월부터 수년 단위로 존재하는 양성 종양(사마귀)을 형성한다.
또한, 상기 HPV의 일부(예를 들면 HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33)는 점막에 장기간 감염됨으로써 악성 종양을 일으킨다.
여성 특유의 암으로서 유방암에 이어 이환율이 높은 자궁경부암에 대해서는, 그 거의 100%가 상기 HPV의 생식기에의 장기간 감염에 의해 발증하는 것이며, 세계에서 50만명, 일본에서도 1만 5천명의 신규 환자가 매년 보고되고 있다.
자궁경부암에 의한 연간 사망자수는 세계에서 27만명, 일본에서도 3,500명에 이른다.
이론적으로는, 상기 HPV 감염의 전부를 미연에 막을 수 있다면, 상기 자궁경부암은 완전히 근절할 수 있다.
상기 HPV의 감염은, 상기 자궁경부암 이외에도, 외음암, 항문암, 구강암, 질암, 음경암, 인두암, 그리고 첨규콘딜로마(성기 사마귀)에도 관련되어 있는 것이 밝혀지고 있어, 이들 암 및 성감염증의 예방을 위해 상기 HPV의 감염에 대한 예방 백신은 유효하다고 생각된다.
상기 HPV 중에서도, 특히 HPV16과 HPV18이 일본인 여성의 상기 자궁경부암의 발증 원인의 약 65%, 특히 20대에서는 자궁경부암의 발증 원인의 약 90%를 차지하고 있다.　
상기 HPV16과 상기 HPV18은, 상기 외음암에 선행하여 보여지는 외음 상피내 종양의 고도병변에 있어서도 발증 원인의 50% 가까이를 차지하고, 또한 상기 질암으로 진행할 가능성이 있는 질 상피내 종양의 발증의 85%에도 관련되어 있는 것이 알려져 있다.
요즘은 HPV 감염 예방 백신, 특히 상기 자궁경부암에 대한 예방 백신으로서 상기 HPV16과 상기 HPV18에 특이적인 2가백신(상표명：서버릭스)(특허문헌 1 참조)과, 상기 HPV16, 상기 HPV18에 더하여 첨규콘딜로마의 발증 원인의 약 90%를 차지하는 HPV6 및 HPV11에도 특이적인 4가백신(상표명：가다실)(특허문헌 2 참조)이 사용되고 있다. 이들 2개의 백신 모두, 상기 HPV 유래의 L1 단백질 바이러스 유사입자를 포함하고 있다.
그러나, 보다 광범위의 상기 HPV에 대한 예방 백신이 개발되어 그것이 세계중의 상기 HPV에 미감염된 사춘기 여성에게 100% 적용되지 않는 한, 상기 자궁경부암 및 그 전암병변을 갖는 환자가 없어지는 것은 기대할 수 없다. 그 때문에, 현재에도 자궁경부 세포진단 비용만으로도 방대한 것이 되고 있다.
인비트로(in vitro)에 있어서, 상기 HPV의 E7 단백질은 Rb 단백질과의 결합능을 가지고, 상기 Rb 단백질과 결합함으로써 전사인자 E2F와 상기 Rb 단백질의 결합을 저해한다. 그 결과, 상기 Rb 단백질로부터 유리(遊離)한 상태에 있는 상기 E2F는 활성화되어 세포의 세포주기를 G1기로부터 S기로 이행시킨다.
한편, 상기 HPV의 또 하나의 단백질, E6 단백질은, p53 단백질과 결합하여 유비퀴틴화를 촉진함으로써 상기 p53 단백질은 분해된다.
이러한 것으로부터, 상기 E7 단백질 및 상기 E6 단백질의 기능에 의해, 상기 HPV에 감염된 세포는 세포주기 체크 포인트의 기구나 상기 p53 단백질이 제어하고 있는 아폽토시스를 회피하여 암화에 이르는 것이 예상되었다.
실제로 자궁경부암 세포에 있어서는 HPV의 E7 및 E6의 mRNA가 항상 고발현하고 있다.
또, 자궁경부암 세포에 있어서의 HPV의 E6, E7의 발현을 안티센스 등으로 억제하면, 상기 자궁경부암 세포의 증식활성은 억제된다.
또한, 안티센스 등으로 E6 및 E7의 발현을 억제한 상기 자궁경부암 세포는, 마우스에 이식해도 그 조종양능(造腫瘍能)을 잃고 있는 것도 나타내어져 있다.
이상의 것으로부터, 상기 HPV의 E6 및 E7이 상기 자궁경부암 및 그 외의 HPV 관련 암의 병태나 발암 과정에 기능적으로 깊게 관여하는 것은 분명하다.
상기 HPV 감염에 의한 상기 자궁경부암의 전암병변인 자궁경부 상피내 종양(Cervical intraepithelial neoplasia；CIN)의 대부분이 자궁의 이행대로 불리는 부분에 발생한다. 상기 이행대에 있어서, 자궁질부(자궁경부의 아래쪽 절반, 질에 돌출하고 있는 부분)에 미란(erosion)이 발생한 경우의 수복 시에는 편평상피화생(질내의 예비세포의 편평상피화)이 일어난다. 그때, 발생한 상피의 기저세포에의 HPV 감염이 자궁경부암의 기원인 것으로 생각되고 있다.
상피의 기저세포에 감염된, 상기 HPV의 DNA는 세포 1개당 수십에서 백 카피 정도이며, 상기 E6, 상기 E7의 발현은 적다.
통상의 상기 HPV의 감염 초기의 상기 E6, 상기 E7의 발현이 낮은 상태에 있어서, 상기 자궁경부암의 발증의 고위험군에 속하는 상기 HPV를 포함해 상기 HPV의 상당수는 잠복 상태가 되고, 상기 HPV의 증식은 멈추어 있다.
자궁경부 HPV 감염 가운데 침윤암으로 진행하는 것은 그 중의 0.13% 이하라는 보고가 미국 질병예방관리센터에 의해 이루어지고 있다.
한편, 상기 자궁경부암의 발생 과정에서는, 기저세포에의 상기 HPV의 증식이 지속 상태에 이르러, 저레벨이었던 상기 E6와 상기 E7의 발현이 지속적으로 항진되는 변화가 생기는 것으로 생각된다.
상기 E6와 상기 E7의 발현은, CIN1(경도 이형성)에서는 매우 낮은 데 비해, CIN2(중도 이형성)와 CIN3(고도 이형성)에서는 고발현이 인지되는 것으로부터, 상기 E6와 상기 E7의 발현의 지속적인 항진은 상기 CIN1의 단계에서 일어나는 것으로 생각된다.
상기 HPV의 감염이 제어되는 것은 숙주의 면역 응답에 의한 것으로 생각되고, 실제로 HIV 감염자나 장기이식 환자 등, 면역 응답이 저하되어 있는 여성에서는 상기 자궁경부암의 발증율이 높은 것도 보고되고 있다.
HPV 등의 바이러스에 대한 숙주의 면역 응답은, NK세포나 대식세포 등의 세포군이나 인터페론이 기능함으로써 감염 직후부터 작동하는 자연 면역으로 불리는 비특이적인 기구와, 그것과는 다른 바이러스 항원 특이적인 면역 응답인 획득 면역으로 불리는 기구가 있다.
상기 획득 면역은 감염 후 몇일이 지나 작용하는 면역 기구로서, 액성 면역과 세포성 면역으로 나뉘어진다.
HPV의 감염 배제에 관한 면역 응답은 상기 NK세포와 상기 세포성 면역에 관련되는 세포장해성 T세포(CTL)에 의한 세포성의 응답이 주체인 것으로 생각되고 있다.
상기 NK세포는 상기 HPV의 감염 초기에 작동하는 면역세포이다.
한편, HPV 특이적 세포 면역에 관해서는, 상기 HPV16의 상기 E7 단백질에 대한 지연형 알레르기 반응이 CIN퇴축과 상관하는 것, 상기 E7에 특이적인 헬퍼 T세포가 상기 HPV의 감염 제어에 중요한 기능을 담당하고 있는 것이 나타내어져 있다(비특허문헌 1 참조).
이미 기술한 바와 같이, 상기 HPV의 상기 E6 단백질과 상기 E7 단백질, 그 중에서도 특히 상기 E7 단백질이 HPV 관련암에 대한 치료용 백신의 개발에 있어서 매우 매력적인 타겟이라고 생각된다.
지금까지도 상기 HPV의 상기 E7 단백질을 항원으로 한 상기 치료용 백신이 이미 몇 가지 개발되어 있지만, 그들이 환자 자궁경부의 전암병변(상기 CIN)이나 암 세포를 배제하는 것까지는 나타나 있지 않아, 실제로 치료 효과를 가진 백신의 개발이 강하게 요망되고 있었다(비특허문헌 2~4 참조).
최근, 본 발명자들은 상기 HPV16의 상기 E7 단백질에 있어서, 상기 Rb 단백질과의 결합에 관여하는 제21번째의 Asp, 제24번째의 Cys 및 제26번째의 Glu를 모두 Gly로 치환한 변이형 E7 단백질을, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)에 발현시키고, 열처리에 의해 사균화한 것을 건조, 분말화한 백신(LacE7)을 마우스에 경구투여함으로써, 비장뿐 아니라 점막에서도 E7 특이적 세포성 면역 응답을 유도할 수 있는 것을 나타냈다(비특허문헌 5 참조).
또한, 본 발명자들은, 제제화 LacE7에 관해서, 상기 자궁경부암의 상기 전암병변(CIN)에 대한 탐색적 임상시험을 실시하여 안전성 평가와 병리학적 유효성을 검토했다.
또, 자궁경부 임파구, 말초혈 중의 E7 특이적 세포성 면역의 유도에 대해서도 해석했다.
HPV16 양성의 전암병변(CIN3) 환자 7명에게, 1캅셀(250mg) 1일 1회 5일간 경구투여를 1쿠르로서, 1캅셀/일 투여군(n=1), 2캅셀/일 투여군(n=3), 4캅셀/일 투여군(n=3)으로, 제1, 2, 4, 8주의 합계 4쿠르, LacE7 제제의 투여를 실시했다.
그 결과, 상기 1캅셀/일 투여군 및 상기 2캅셀/일 투여군은 시험 종료 후에 원추 절제 되었지만, 상기 4캅셀/일 투여군은 상기 CIN3가 완전 소실하여 그 후의 악화도 보이지 않았다.
면역학적 해석에서는, 상기 자궁경부 임파구 중에 상기 HPV16에 대한 상기 E7 특이적 세포성 면역의 유도(E7 특이적 IFN-γ 산생(産生)세포, E7 특이적 그란자임 B 산생세포의 유도)가 인정되었다.
병리학적으로도, 투여전의 상기 전암병변에 볼 수 없었던 상기 전암병변 내로의 매우 분명한 임파구의 침윤이 인정되었다.
따라서, 본 발명자들이 개발한 상기 LacE7은 상기 전암병변(CIN3) 환자에 대한 첫 치료 백신이 될 수 있을 것으로 기대되고 있다.
그러나, 상기 전암병변 환자뿐만이 아니라, 자궁경부암 환자에 대해서도 충분한 임상 효과를 갖는 치료용 HPV 백신으로서 아직 만족스러운 것을 찾아내지 못하고 있는 것이 현상이다.
즉, 여전히 자궁경부암 환자에 대해서도 충분한 임상 효과를 갖는 치료용 HPV 백신이 제공되고 있지 않다는 문제가 있다.
또, 보다 소량, 단기간의 상기 LacE7의 경구투여나, 상기 LacE7 이외의 HPV 백신의 경구투여에 의해서도, 효과적으로 상기 HPV에 대한 획득 면역을 유도하는 방법, 특히 점막에서의 HPV 특이적 세포성 면역 유도 방법이 미개발이라는 문제도 있다.
상기 HPV나 HIV 등의 바이러스를 포함하는 많은 병원체는, 점막을 통해 숙주에 침입하여 감염이 성립하므로, 국소 점막에 존재하는 점막 면역계가 숙주의 감염 방어 기구에 있어서 중요한 역할을 수행하고 있는 것으로 생각된다.
상기 국소 점막에 있어서의 액성 면역에 관해서는 분비형의 IgA 항체가 중요한 역할을 수행하고 있다.
상기 IgA 항체는, B세포나 T세포, 대식세포로부터 분비되는 트랜스포밍 증식인자(TGF)-β, 인터류킨(IL)-4나 IL-6 등의 사이토카인에 의해서 그 산생이 제어되고 있고, 그들 액성 인자의 기능이 상기 점막에 있어서의 상기 액성 면역의 유지·조절에 중요하다.
근년, 상기 국소 점막에 있어서의 면역으로서 세포 장해성 T세포(CTL)를 중심으로 한 세포성 면역 응답이 소화관이나 생식기의 점막에 있어서 유도되는 것이 밝혀지고 있다. 항원 특이적인 상기 CTL의 활성화에는 인터페론(IFN)-γ 등이 관여하고 있다.
한방약인 십전대보탕과 보중익기탕 및 점막 애주번트는 점막에 있어서 획득 면역의 하나인 액성 면역을 부활화하는 점막 면역 부활화제로서 이미 알려져 있다.
한방약(일중 생약) 중에는 한방의학의 「상한론」에 있는 바와 같이 감염증의 치료에도 이용되는 일군의 생약이 있다.
현대에 있어 상기 한방약은 감기나 인플루엔자, 바이러스성 간염, 헬리코박터 파일로리 감염 등의 각종 감염증이나 감염증 관련 질환의 치료에 사용되고, 유효성도 보이고 있다. 그 작용은, 원인 바이러스나 원인 세균에 대한 직접적인 작용뿐만이 아니라, 면역 조절 작용을 통한 생태방어 기구의 증강에 의한 것이 많다.
현대 의료에서는, 세균 감염증의 치료에는 항생 물질이 이용되고, 바이러스 감염증의 예방에는 백신이 일반적으로 이용된다. 이것에 대해, 상기 한방약의 일부는 숙주측의 면역 능력을 높이는 것에 의한 감염 방어 효과를 갖는 것이 알려져 있다.
예를 들면 인플루엔자 감염에 있어서, 갈근탕은 인플루엔자 바이러스에 대한 직접적인 증식 억제효과는 인정되지 않지만, 그 대신에 해열 효과나 폐렴의 개선 효과, 사망률의 저하 등의 치료 효과를 발휘한다.
마우스에 상기 인플루엔자 바이러스를 경비감염시키면 혈청 중의 IFN의 양이 상승하고, 이어서 IL-1α의 양이 상승하여, 뇌내 사이클로옥시게나제 활성이 상승함으로써 프로스타글란딘 E2의 양이 상승해 발열한다.
아스피린이 상기 사이클로옥시게나제를 저해하는 데 비해, 상기 갈근탕은 상기 IFN에 의해 유도되는 상기 IL-1α의 산생을 억제함으로써 해열 효과를 나타낸다.
십전대보탕이나 보중익기탕은 수술후, 병후, 산후, 만성 질환에 의한 소모, 피로 축적, 여름을 타는 등 쇠약해진 때의 전신 권태감, 식욕 부진 등의 치료에 이용되는 한방약이다. 상기 십전대보탕이 빈혈 등에도 이용되는 데 비해, 상기 보중익기탕은 감기가 길어졌을 때, 허약한 사람이 감기에 걸렸을 때의 미열, 기침, 식은 땀, 동계 등의 증상 개선이나 체질 개선에 이용된다.
상기 십전대보탕이나 상기 보중익기탕은 모두 장관이나 기관의 점막에 있어서 B세포에 의한 액성 면역 기구를 활성화하는 것도 나타내어져 있다(특허문헌 3 및 비특허문헌 6 참조). 즉, 십전대보탕 및 보중익기탕은 점막의 액성 면역을 부활화하는 점막 면역 부활화제인 것이 밝혀져 있다.
그 밖에 소시호탕(小紫胡湯)이나 소청룡탕(小靑龍湯) 등도 감염증의 치료나 예방에 사용되는데, 이들도 숙주의 면역 기구를 활성화시키는 것으로 생각되고 있다.
면역학에 있어서 일반적으로 애주번트로 불리는 것은, 항원과 함께 주사됨으로써 항원성의 증강(면역 촉진)에 사용되는 시약으로서, 상기 항원을 불용화함으로써 길게 유지하여 상기 항원을 서서히 장기간 유리시키는 것이나, 상기 항원을 투여한 부분에 염증을 일으키게 함으로써 대식세포가 모여, 상기 항원이 탐식되기 쉬워져 항원 제시를 촉진하는 것이나, 면역세포를 활성화시키는 것 등이 고려되고 있지만, 그러한 작용 기구는 여러 가지이며 불명한 것도 많다.
상기 갈근탕, 십전대보탕, 보중익기탕, 소시호탕, 소청룡탕 등의 이른바 자양강장 작용을 갖는 한방약도, 액성 면역의 증강 효과를 갖는 점에 있어서 넓은 의미의 애주번트라고 할 수 있다.
점막 애주번트로서 잘 알려져 있는 것은, 세균 유래의 콜레라 독소(cholera toxin：CT)와 독소원성 대장균의 이열성 독소(heat-labile enterotoxin：LT), 장관 출혈성 대장균의 베로 독소(verotoxin：VT), 디프테리아 독소(diphteria toxin：DT), 백일해 독소(pertussis toxin：PT)로, 그들은 면역원성이 강하고 실험상으로는 가장 효과적인 애주번트이다.
세균 유래의 상기 점막 애주번트는 모두 점막 및 전신에 뛰어난 애주번트 효과를 발휘하지만, 시신경 마비 등의 심각한 부작용을 나타내는 것이 밝혀져 있기 때문에 그대로 사람의 치료에 이용할 수는 없다.
그래서, 최근 들어 상기 부작용을 회피할 수 있는 변이형 점막 애주번트가 새롭게 개발되어 이용 가능하게 되었다.
또, 세균 유래의 야생형과 변이형의 상기 점막 애주번트 이외에도, 부작용이 없고, 임상에서 사용 가능한 점막 애주번트로서 합성 세라미드인 αGalCer(α-galactosylceramide), CpG 올리고 뉴클레오티드, 인지질과 아포 단백질로 이루어지는 생체 계면활성제를 포함하는 폐계면활성제단백질-C(pulmonary Surfactant Protein-C, SP-C, 별명：서팩텐(SURFACTEN)), 폐계면활성제단백질-B(SP-B), 야생형 또는 변이형 IFN-α, 2중 가닥 RNA, 그리고 활성증폭형 TNF 변이체 등이 사용 가능하다(특허문헌 4~6 및 비특허문헌 7~11 참조).
그러나, 상기 HPV 등의 바이러스 및 세균의 감염 방어 혹은 감염증의 치료에 있어서, 상기 바이러스 및 상기 세균에 대한 백신과 병용 투여하는 점막 면역 부활화제로서 아직 만족스러운 것을 찾아내지 못하고 있는 것이 현상이다.
즉, 여전히, 점막에 있어서 세포성 면역의 부활화에 충분한 효과를 갖는, HPV 백신 등의 바이러스 백신 및 세균 백신과 병용 투여 가능한 점막 면역 부활화제가 제공되고 있지 않다는 문제가 있다.
국제공개 제2003/078455호 팜플렛 국제공개 제2000/045841호 팜플렛 일본국 특개 2006-070217호 공보 국제공개 제2007/018152호 팜플렛 국제공개 제2004/028561호 팜플렛 일본국 특개 2005-097267호 공보
R. Hopfl et al., Lancet, 2000, vol. 356, pp. 1985-1986 C.L. Trimble and I.H. Frazer, Lancet Oncol., 2009, vol. 10, pp. 975-980 H. Poo et al., Int J. Cancer, 2006, vol. 119, pp. 1702-1709 N.G. Cortess-Perez et al., Vaccine, 2007, vol. 25, pp. 6581-6588 K. Adachi et al., Vaccine, 2010, vol. 28, pp. 2810-2817 H. Kiyohara et al., Evid. Based Complement. Alternat. Med., 2006, vol. 3, pp. 459-467 A. Dalpke et al., Immunology, 2001, vol. 204, pp. 667-676 D. Mizuno et al., Vaccine, 2011, vol. 29, pp. 5368-5378 H. Kayamuro et al., Biomaterials, 2009, vol. 30, pp. 5869-5876 H. Fujita et al., J. Immunol., 2009, vol. 183, pp. 254-260 Y. Morishima et al., Eur. J. Immunol., 2005, vol. 35, pp. 2803-2814
본 발명은 종래의 상기 여러 문제를 해결하고, 이하의 목적을 달성하는 것을 과제로 한다. 즉, 본 발명은 점막에 있어서의 세포성 면역의 부활화에 충분한 효과를 갖는, HPV 백신 등의 바이러스 백신 및 세균 백신과 병용 투여 가능한 자양강장 작용을 갖는 한방약과 점막 애주번트를 함유하는 점막 면역 부활화제, 그리고 자궁경부암이나 외음암, 항문암, 구강암, 질암, 음경암, 인두암과 그들의 전암병변 및 첨규콘딜로마의 치료에 사용 가능한 HPV 백신으로서의 HPV의 E7 폴리펩티드와 자양강장 작용을 갖는 한방약을 함유하는 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물을 제공하는 것도 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명자들은 예의 검토한 결과, 이하의 지견을 얻었다.
즉, 본 발명자들은 상기 HPV 백신과, 한방 애주번트로서 액성 면역 증강 효과는 알려져 있었던 상기 십전대보탕이나 상기 보중익기탕 등의 자양강장 작용을 갖는 한방약을 병용 투여함으로써 비장에서의 상기 HPV 백신 특이적인 세포성 면역이 증강되는 것을 새롭게 찾아냈다. 또한, 상기 HPV 백신과, 상기 십전대보탕이나 상기 보중익기탕 등의 자양강장 작용을 갖는 한방약과 점막 애주번트를 병용 투여함으로써 점막 부분에서의 상기 HPV 백신 특이적인 세포성 면역 응답이 증강되는 것도 새롭게 찾아냈다. 상기 십전대보탕이나 상기 보중익기탕 등의 자양강장 작용을 갖는 한방약과 점막 애주번트를 함유하는 점막 면역 부활화제는 HPV 백신에 대한 효과적인 점막 면역 부활화제로서 기능할 뿐만 아니라, 다른 바이러스 백신 및 세균 백신에 대한 점막 면역 부활화제로서의 효과가 기대된다.
본 발명은, 본 발명자들에 의한 상기 지견에 근거하는 것으로, 상기 과제를 해결하기 위한 수단은 이하와 같다. 즉, 본 발명의 점막 면역 부활화제는 자양강장 작용을 갖는 한방약과 점막 애주번트를 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물은 HPV의 E7 폴리펩티드와 자양강장 작용을 갖는 한방약을 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 종래의 상기 여러 문제를 해결하고 상기 목적을 달성할 수 있어, 점막에서의 세포성 면역의 부활화에 충분한 효과를 갖는 HPV 백신 등의 바이러스 백신 및 세균 백신과 병용 투여 가능한 자양강장 작용을 갖는 한방약과 점막 애주번트를 함유하는 점막 면역 부활화제, 그리고 자궁경부암이나 외음암, 항문암, 구강암, 질암, 음경암, 인두암과 그들의 전암병변 및 첨규콘딜로마의 치료에 사용 가능한 HPV 백신으로서의 HPV의 E7 폴리펩티드와 자양강장 작용을 갖는 한방약을 함유하는 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 LacE7 경구투여에 있어서, 십전대보탕(JTT) 또는 보중익기탕(HET)을 동시 투여하는 것에 의한 전신성 및 점막에서의 1형 T세포 응답에의 영향을 나타내는 도면이다.
도 2는 LacE7 경구투여에 있어서, 십전대보탕(JTT) 또는 보중익기탕(HET)과 LTB를 동시 투여하는 것에 의한 전신성 및 점막에서의 1형 T세포 응답에의 영향을 나타내는 도면이다.
도 3a는 LacE7 경구투여에 있어서, 십전대보탕(JTT) 또는 보중익기탕(HET)과 LTB를 동시 투여하는 것에 의한 전신성의 액성 면역 응답에의 영향을 나타내는 도면이다.
도 3b는 LacE7 경구투여에 있어서, 십전대보탕(JTT) 또는 보중익기탕(HET)과 LTB를 동시 투여하는 것에 의한 점막에서의 액성 면역 응답에의 영향을 나타내는 도면이다.
도 4a는 LacE7 경구투여에 있어서, 십전대보탕(JTT) 또는 보중익기탕(HET)과 LTB를 동시 투여하는 것에 의한 점막에서의 1형 세포 응답에의 영향을 나타내는 도면이다.
도 4b는 LacE7 경구투여에 있어서, 십전대보탕(JTT) 또는 보중익기탕(HET)과 LTB를 동시 투여하는 것에 의한 점막에서의 2형 T세포 응답에의 영향을 나타내는 도면이다.
도 5는 LacE7 경구투여에 있어서, 보중익기탕(HET)과 α갈락토실세라미드(αGalCer) 또는 LTB를 동시 투여하는 것에 의한 점막에서의 E7 특이적 1형 T세포 응답에의 영향을 나타내는 도면이다.
도 6은 LacE7 경구투여에 의해 E7 특이적 CTL이 장관 점막 상내피로 유도되어 있는 것을 나타내는 도면이다.
도 7은 LacE7 경구투여에 의해 E7 특이적 CTL이 장관 점막 상내피로 유도되어 있는 것을 나타내는 도면이다.
(점막 면역 부활화제)
본 발명의 면역 부활화제는 자양강장 작용(면역 증강 작용)을 갖는 한방약(면역 증강 한방약)과 점막 애주번트를 적어도 포함하고, 필요에 따라서 적절히 선택한 그 외의 성분을 포함한다.
＜면역 증강 한방약＞
자양강장 작용(면역 증강 작용)을 갖는 상기 면역 증강 한방약으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 갈근탕, 십전대보탕, 보중익기탕, 소시호탕, 소청룡탕 등을 들 수 있다. 이들은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
이들 중에서도 십전대보탕과 보중익기탕이 바람직하다.
＜＜십전대보탕＞＞
상기 십전대보탕은 한방약의 일종으로, 황기(Astragalus Root), 인삼(Ginseng), 계피(Cinnamon Bark), 당귀(Japanese Angelica Root), 천궁(Cnidium Rhizome), 작약(Peony Root), 숙지황(Rehmannia Root), 창출(Atractylodes Lancea Rhizome) 또는 백출(Atractylodes Rhizome), 복령(Poria Sclerotium) 및 감초(Glycyrrhiza)로 이루어진다. 예를 들면, 일국(일본약국방) 황기 3.0g, 일국 인삼 3.0g, 일국 계피 3.0g, 일국 당귀 3.0g, 일국 천궁 3.0g, 일국 작약 3.0g, 일국 숙지황 3.0g, 일국 창출 3.0g, 일국 복령 3.0g 및 일국 감초 1.5g을 혼합한 혼합 생약 5.0g을 전체량 7.5g 중에 함유하는 것이어도 되고, 또한 상기 혼합 생약 이외에 일국 스테아린산마그네슘과 일국 유당수화물 등이 첨가되어 있어도 된다.
상기 십전대보탕은 시판품이어도 되고, 해당 시판품으로는, 예를 들면, 츠무라 십전대보탕 엑기스과립(식별 코드：츠무라/48) 등을 들 수 있다.
＜＜보중익기탕＞＞
상기 보중익기탕은 한방약의 일종으로 황기, 인삼, 창출 또는 백출, 당귀, 감초, 시호(Bupleurum Root), 진피(Citrus Unshiu Peel), 대추(Jujube), 생강(Ginger) 및 승마(Cimicifuga Rhizome)로 이루어진다. 예를 들면, 일국 황기 4.0g, 일국 인삼 4.0g, 일국 창출 4.0g, 일국 당귀 3.0g, 일국 감초 1.5g, 일국 시호 2.0g, 일국 진피 2.0g, 일국 대추 2.0g, 일국 생강 0.5g, 및 일국 승마 1.0g을 혼합한 혼합 생약 5.0g을 전체량 7.5g 중에 함유하는 것이어도 되고, 또한 상기 혼합 생약 이외에 일국 스테아린산마그네슘과 일국 유당수화물 등이 첨가되어 있어도 된다.
상기 보중익기탕은 시판품이어도 되고, 해당 시판품으로는, 예를 들면, 츠무라 보중익기탕 엑기스과립(식별 코드：츠무라/41) 등을 들 수 있다.
＜점막 애주번트＞
상기 점막 애주번트로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 바이러스나 세균 등의 단백질에서 유래하는 경구 백신 특이적인 획득 면역을 더욱 증강하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 세균 독소, 합성 세라미드(αGalCer), CpG 올리고 뉴클레오티드, SP-C(서팩텐), SP-B, IFN-α(야생형 또는 변이형), 2중 가닥 RNA 및 활성증폭형 TNF 변이체를 들 수 있고, 그들을 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
세균 독소에서 유래하는 애주번트(세균 독소 유래 애주번트)가 종전부터 점막 애주번트로서 빈번히 사용되고 있는 점에서 바람직하다.　
세균 독소에서 유래하지 않는다는 점에 있어서는, 합성 세라미드(αGalCer), CpG 올리고 뉴클레오티드, SP-C(서팩텐), SP-B, IFN-α(야생형 또는 변이형), 2중 가닥 RNA 및 활성증폭형 TNF 변이체 등의 애주번트가 바람직한데, 그들 중에서도 상기 합성 세라미드(αGalCer)가 사람에 대한 애주번트 효과가 확인되어 있는 점에서 보다 바람직하다.
복수의 항원에 대한 애주번트 효과가 알려져 있는 점에서는 상기 세균 독소와 상기 합성 세라미드(αGalCer)가 바람직하다.
＜＜세균 독소 유래 애주번트＞＞
상기 세균 독소 유래 애주번트로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 CT, LT, VT, DT, PT 등에서 유래하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 이들은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
이들 중에서도 사람에의 경구투여에 있어서 심각한 부작용이 생기지 않도록 미리 변이가 도입된 변이형 세균 독소 유래 애주번트가 바람직하다.
- 변이형 세균 독소 유래 애주번트 -
상기 변이형 세균 독소 유래 애주번트로는 사람에의 경구투여에 있어서 심각한 부작용을 일으키지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 변이형 CT, 변이형 LT, 변이형 VT, 변이형 DT, 변이형 PT 등을 들 수 있다.
변이형 CT, 변이형 LT, 변이형 VT, 변이형 DT, 변이형 PT로는, 예를 들면, 이미 문헌(국제공개 제98/042375호, 국제공개 제00/037609호, 국제공개 제2006/100108호, 국제공개 제1996/006627호)에 기재되어 있는 것을 들 수 있다. 이들은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
-- LTB 폴리펩티드 --
상기 LT에서 유래하는 폴리펩티드로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, LTB 폴리펩티드가 바람직하다. 상기 LTB 폴리펩티드는 LT의 B서브유닛(LTB)에서 유래하고, 점막 애주번트 효과를 갖는 것 이외에는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 전체 길이의 LTB 단백질 등을 들 수 있다.
상기 LTB는 LT의 A서브유닛(LTA)과 2량체(홀로톡신)의 형태에서는 독성을 나타내지만, 상기 LTB는 단독으로는 독성을 가지지 않는다.
그럼에도 불구하고, 경구나 경비투여에 의해 상기 LTB 단백질은 단독으로 점막에 있어서 애주번트로서 기능하는 것이 나타내어져 있다(국제공개 제99/026654호).
따라서, 사람에게 투여하는 경구 백신의 제조에 있어서도 상기 LTB 폴리펩티드를 점막 애주번트로서 사용하는 것이 가능하다.
상기 LTB 폴리펩티드로는 시판품이어도 되고, 해당 시판품으로는, 예를 들면, 시그마알드리치(Sigma-Aldrich)사의 이열성 엔테로톡신 B서브유닛(LTB) 대장균 유래(카탈로그 번호：E8656) 등을 들 수 있다.
＜＜합성 세라미드(αGalCer)＞＞
담도암 마우스를 이용한 인비보(in vivo) 분석에서 항종양 효과를 나타내는 천연화합물의 스크리닝에 의해, 해면 유래의 아젤리페린류(ageliferins)가 단리되었다. 또한, 보다 항종양 효과가 강한 상기 아젤리페린류의 유도체로서 상기 합성 세라미드(αGalCer)는 취득되었다. 그 후의 연구에서, 상기 합성 세라미드(αGalCer)는, 항원 제시 세포에 흡수된 후에 NK세포와 T세포의 양쪽의 성질을 갖는 NKT 세포와 회합하고, IFN-γ및 IL-4의 산생을 유도하는 것으로부터, 이른바 애주번트인 것이 나타내어져 있다. 상기 합성 세라미드(αGalCer)는 경비투여함으로써 코로 IgA 산생을 유도할 수 있는 것이 보고되고 있기 때문에 점막 애주번트이기도 하다.
상기 합성 세라미드(αGalCer)는 시판품이어도 되고, 해당 시판품으로는, 예를 들면, 교와핫코기린(Kyowa Hakko Kirin)사의 알파-갈락토실세라미드(α-galactosylceramide)(KRN7000) 등을 들 수 있다.
＜그 외의 성분＞
상기 그 외의 성분으로는 특별히 제한은 없고, 본 발명의 효과를 저해하지 않는 범위 내에서 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 의약적으로 허용될 수 있는 담체 등을 들 수 있다.
＜＜담체＞＞
상기 담체로는 특별히 제한은 없고, 예를 들면 후술하는 상기 점막 면역 부활화제의 제형 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 또, 상기 점막 면역 부활화제 중의 상기 그 외의 성분의 함유량도 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
- 제형 -
상기 제형으로는 경구투여할 수 있는 것인 것 이외에 특별히 제한은 없고, 예를 들면 경구 고형제(정제, 피복정제, 과립제, 산제, 캅셀제 등), 경구 액제(내복액제, 시럽제, 엘릭시르제 등) 등을 들 수 있다.
＜용도＞
상기 점막 면역 부활화제는 환자에 대해 경구로 투여할 수 있다. 그 경우, 상기 점막 면역 부활화제는 환자의 점막에 있어서, 그 전후 또는 동시에 투여되는 항원에 특이적인 세포성 면역을 부활화한다.
＜＜항원＞＞
상기 점막 면역 부활화제에 대해, 그 전후 또는 동시에 경구투여되는 상기 항원으로는, 바이러스 또는 세균에서 유래하고, 백신으로서 사용할 수 있는 펩티드인 것 이외에 특별히 제한은 없다. 상기 항원은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다. 자궁경부암 등의 HPV 관련 암에 대한 치료 용도에 있어서는 항원으로서 HPV에서 유래하는 폴리펩티드(HPV 유래 폴리펩티드)가 바람직하다.
- HPV 유래 폴리펩티드 -
상기 HPV 유래 폴리펩티드로는 항원성을 갖는 것이면 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 HPV 유래 단백질의 전체 길이여도 된다. 또, 상기 HPV 유래 폴리펩티드는 1부터 수 개의 아미노산을 결실(Deletion), 치환 또는 부가하는 변이를 갖는 것이어도 된다. 상기 HPV 유래 폴리펩티드는 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
상기 HPV 유래 폴리펩티드를 백신으로서 사용하기 위한 제조 방법으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 화학 합성이나 유전자 재조합 기술을 이용하는 제조 방법 등을 들 수 있다.
이들 제조 방법 중에서도 형질전환 세균을 이용하는 유전자 재조합에 의한 제조 방법이 코스트 등의 점에서 바람직하다.
상기 숙주에 이용하는 세균으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 선택할 수 있으며, 예를 들면 효모, 대장균, 고초균, 유산균 등을 들 수 있지만, 유산균이 바람직하고, 유산균 중에서도 락토바실러스(Lactobacillus)속(屬)이 보다 바람직하며, 헬퍼 T세포 1형(Th1) 세포의 유도능이 확인되어 있는 점에서 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)가 특히 바람직하다.
숙주 세균에 있어서의 발현에 알맞은 발현벡터는 적절히 선택할 수 있다.
상기 HPV 유래 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한 발현벡터(HPV 유래 폴리펩티드 발현벡터)를 이용하여, 목적에 따라 적절히 선택한 형질전환 방법으로 상기 숙주 세균을 형질전환할 수 있다.
상기 HPV 유래 폴리펩티드는 상기 발현벡터를 적절히 선택함으로써 상기 숙주 세균의 세포 표면 혹은 세포 내에 발현, 또는 세포 외에 분비시킬 수 있다.
상기 HPV 유래 폴리펩티드 발현벡터로 형질전환된 숙주 세균(HPV 유래 폴리펩티드 발현 숙주 세균)의 배양 방법으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
백신으로서 사용하기 위해 배양 후의 상기 HPV 유래 폴리펩티드 발현 숙주 세균의 배양물로부터 상기 HPV 유래 폴리펩티드를 정제해도 되지만, 상기 HPV 유래 폴리펩티드 발현 숙주 세균을 그대로 백신으로서 사용할 수도 있다.
상기 HPV 유래 폴리펩티드 발현 숙주 세균을 그대로 백신으로서 사용할 때에는 목적에 따라 균체를 열처리하는 등 하여 사균화해도 된다.
사균화한 상기 HPV 유래 폴리펩티드 발현 숙주 세균을 배지로부터 회수한 후에, 건조·분체상으로 한 것을 백신으로서 사용할 수 있다.
사용할 때까지, 상기 건조·분체상으로 한 것을 저온에서 보존할 수 있다.
또, 락토바실러스 카제이를 사균화시킨 분체에 상기 HPV 유래 폴리펩티드를 첨가한 것을 백신으로서 사용할 수도 있다.
-- HPV의 E7 폴리펩티드 --
상기 HPV 유래 폴리펩티드로는 상기 HPV의 E7 폴리펩티드가 바람직하다. 상기 HPV의 E7 폴리펩티드로는 특별히 제한이 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 암에 관하여 고위험군에 속하는 HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, HPV82, HPV26, HPV53 및 HPV63으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 HPV의 E7에서 유래하는 것이 보다 바람직하다.
이들 중에서도 HPV16 및 HP18 중 적어도 어느 하나의 HPV의 E7에서 유래하는 것이 특히 바람직하고, HPV16의 E7에서 유래하는 것이 가장 바람직하다.
상기 HPV의 E7 폴리펩티드는 항원성을 갖는 것이면 되고, 예를 들면 전체 길이의 E7 단백질이어도 된다.
상기 E7 폴리펩티드로서 야생형 E7에서 유래하는 것 외에, 변이형 E7에서 유래하는 변이형 E7 폴리펩티드를 사용해도 된다.
--- 변이형 E7 폴리펩티드 ---
상기 변이형 E7 폴리펩티드로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 1부터 수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가됨으로써 Rb 단백질과의 결합성을 잃은 것 등을 들 수 있다. 상기 변이형 E7 폴리펩티드는 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
이들 변이형 E7 폴리펩티드 중에서도 HPV16의 야생형 E7 단백질(서열번호 1)에 있어서의 제21번째의 Asp, 제24번째의 Cys 및 제26번째의 Glu에 상당하는 E7 단백질의 Rb 단백질과의 결합에 관여하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 것이 바람직하다. 예를 들면, HPV16의 야생형 E7 단백질(서열번호 1)의 상기 제21번째의 Asp, 제24번째의 Cys 및 제26번째의 Glu의 모두를 Gly로 치환한 것으로서 HPV16의 변이형 E7 단백질(서열번호 2)을 들 수 있다.
본 발명의 점막 면역 부활화제는 면역원으로서 경구투여되는 바이러스 항원이나 세균 항원 등의 백신과 함께 경구투여된 경우에 상기 백신에 대해서 특이적인 획득 면역, 특히 세포성 면역을 증강한다.
(HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물)
본 발명의 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물은, HPV의 E7 폴리펩티드와, 자양강장 작용(즉, 면역 증강 효과)을 갖는 한방약(면역 증강 한방약)을 적어도 포함하고, 필요에 따라서 적절히 선택한 그 외의 성분을 포함한다.
＜HPV의 E7 폴리펩티드＞
상기 HPV의 E7 폴리펩티드로는 특별히 제한이 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 암에 관하여 고위험군에 속하는 HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51, HPV52, HPV56, HPV58, HPV59, HPV68, HPV73, HPV82, HPV26, HPV53 및 HPV63으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1개의 HPV의 E7에서 유래하는 것이 바람직하다.
이들 중에서도 HPV16 및 HP18 중 적어도 어느 하나의 HPV의 E7에서 유래하는 것이 보다 바람직하고, HPV16의 E7에서 유래하는 것이 특히 바람직하다.
상기 HPV의 E7 폴리펩티드는 항원성을 갖는 것이면 되고, 예를 들면 전체 길이의 E7 단백질이어도 된다.
상기 E7 폴리펩티드로서 야생형 E7에서 유래하는 것 외에, 변이형 E7에서 유래하는 변이형 E7 폴리펩티드를 사용해도 된다.
＜＜변이형 E7 폴리펩티드＞＞
상기 변이형 E7 폴리펩티드로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 1부터 수 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가됨으로써 Rb 단백질과의 결합성을 잃은 것 등을 들 수 있다. 상기 변이형 E7 폴리펩티드는 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
이들 변이형 E7 폴리펩티드 중에서도 HPV16의 야생형 E7 단백질(서열번호 1)에 있어서의 제21번째의 Asp, 제24번째의 Cys 및 제26번째의 Glu에 상당하는 E7 단백질의 Rb 단백질과의 결합에 관여하는 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환한 것이 바람직하다. 예를 들면, HPV16의 야생형 E7 단백질(서열번호 1)의 상기 제21번째의 Asp, 제24번째의 Cys 및 제26번째의 Glu의 모두를 Gly로 치환한 것으로서 HPV16의 변이형 E7 단백질(서열번호 2)을 들 수 있다.
상기 E7 폴리펩티드를 백신으로서 사용하기 위한 제조 방법으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 화학 합성이나 유전자 재조합 기술을 이용하는 제조 방법 등을 들 수 있다.
이들 제조 방법 중에서도 형질전환 세균을 이용하는 유전자 재조합에 의한 제조 방법이 코스트 등의 점에서 바람직하다.
상기 숙주에 이용하는 세균으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 선택할 수 있으며, 예를 들면 효모, 대장균, 고초균, 유산균 등을 들 수 있지만, 유산균이 바람직하고, 유산균 중에서도 락토바실러스속이 보다 바람직하며, 헬퍼 T세포 1형(Th1) 세포의 유도능이 확인되어 있는 점에서 락토바실러스 카제이가 특히 바람직하다.
숙주 세균에 있어서의 발현에 알맞은 발현벡터는 적절히 선택할 수 있다.
상기 E7 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한 발현벡터(E7 발현벡터)를 이용하여, 목적에 따라 적절히 선택한 형질전환 방법으로 상기 숙주 세균을 형질전환할 수 있다.
상기 E7 폴리펩티드는 상기 발현벡터를 적절히 선택함으로써 상기 숙주 세균의 세포 표면 혹은 세포 내에 발현, 또는 세포 외로 분비시킬 수 있다.
상기 E7 발현벡터로 형질전환된 숙주 세균(E7 발현 숙주 세균)의 배양 방법으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
백신으로서 사용하기 위해 배양 후의 상기 E7 발현 숙주 세균의 배양물로부터 상기 E7 폴리펩티드를 정제해도 되지만, 상기 E7 발현 숙주 세균을 그대로 백신으로서 사용할 수도 있다.
상기 E7 발현 숙주 세균을 그대로 백신으로서 사용할 때에는, 목적에 따라 균체를 열처리하는 등 하여 사균화해도 된다.
사균화한 상기 E7 발현 숙주 세균을 배지로부터 회수한 후에, 건조·분체상으로 한 것을 백신으로서 사용할 수 있다.
사용할 때까지, 상기 건조·분체상으로 한 것을 저온에서 보존할 수 있다.
또, 락토바실러스 카제이를 사균화시킨 분체에 상기 E7 폴리펩티드를 첨가한 것을 백신으로서 사용할 수도 있다.
＜면역 증강 한방약＞
자양강장 작용(면역 증강 작용)을 갖는 상기 면역 증강 한방약으로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 갈근탕, 십전대보탕, 보중익기탕, 소시호탕, 소청룡탕 등을 들 수 있다. 이들은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
이들 중에서도 십전대보탕과 보중익기탕이 바람직하다.
＜＜십전대보탕＞＞
상기 십전대보탕에 대해서는 상기한 바와 같다.
＜＜보중익기탕＞＞
상기 보중익기탕에 대해서는 상기한 바와 같다.
＜그 외의 성분＞
상기 그 외의 성분으로는 특별히 제한은 없고, 본 발명의 효과를 저해하지 않는 범위 내에서 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면, 점막 애주번트, 의약적으로 허용될 수 있는 담체 등을 들 수 있다. 또, 상기 의약 조성물 중의 상기 그 외의 성분의 함유량도 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다.
＜＜점막 애주번트＞＞
상기 점막 애주번트로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면, 상기 십전대보탕이나 상기 보중익기탕과 협조하여, 상기 HPV의 상기 E7 폴리펩티드 등의 경구 백신 특이적인 액성 면역과 세포성 면역을 더욱 증강하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 세균 독소, 합성 세라미드(αGalCer), CpG 올리고 뉴클레오티드, SP-C(서팩텐), SP-B, IFN-α(야생형 또는 변이형), 2중 가닥 RNA 및 활성증폭형 TNF 변이체를 들 수 있고, 그들을 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
세균 독소 유래 애주번트가 종전부터 점막 애주번트로서 빈번히 사용되고 있는 점에서 바람직하다.　
세균 독소에서 유래하지 않는다는 점에 있어서는, 합성 세라미드(αGalCer), CpG 올리고 뉴클레오티드, SP-C(서팩텐), SP-B, IFN-α(야생형 또는 변이형), 2중 가닥 RNA 및 활성증폭형 TNF 변이체 등의 애주번트가 바람직한데, 그들 중에서도 상기 합성 세라미드(αGalCer)가 사람에 대한 애주번트 효과가 확인되어 있는 점에서 보다 바람직하다.
복수의 항원에 대한 애주번트 효과가 알려져 있는 점에서는 상기 세균 독소와 상기 합성 세라미드(αGalCer)가 바람직하다.
상기 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물에 관해서, 상기 점막 애주번트는 필수 성분은 아니지만, 첨가됨으로써 상기 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물의 효과를 현저하게 증강할 수 있는 점에서 함유하는 것이 바람직하다.
- 세균 독소 유래 애주번트 -
상기 세균 독소 유래 애주번트로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 CT, LT, VT, DT, PT 등에서 유래하는 폴리펩티드를 들 수 있다. 이들은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
이들 중에서도 사람에의 경구투여에 있어서 심각한 부작용이 생기지 않도록 미리 변이가 도입된 변이형 세균 독소 유래 애주번트가 바람직하다.
-- 변이형 세균 독소 유래 애주번트 --
상기 변이형 세균 독소 유래 애주번트로는 사람에의 경구투여에 있어서 심각한 부작용을 일으키지 않는 것이면 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 변이형 CT, 변이형 LT, 변이형 VT, 변이형 DT, 변이형 PT 등을 들 수 있다.　
변이형 CT, 변이형 LT, 변이형 VT, 변이형 DT, 변이형 PT로는, 예를 들면 이미, 문헌(국제공개 제98/042375호, 국제공개 제00/037609호, 국제공개 제2006/100108호, 국제공개 제1996/006627호)에 기재되어 있는 것을 들 수 있다. 이들은 1종 단독으로 사용해도 되고, 2종 이상을 병용해도 된다.
--- LTB 폴리펩티드 ---
상기 LT에서 유래하는 폴리펩티드로는 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 적절히 선택할 수 있지만, LTB 폴리펩티드가 바람직하다. 상기 LTB 폴리펩티드에 대해서는 상기한 바와 같다.
- 합성 세라미드(αGalCer) -
상기 합성 세라미드(αGalCer)에 대해서는 상기한 바와 같다.
＜＜담체＞＞
상기 담체로는 특별히 제한은 없고, 예를 들면 후술하는 상기 의약 조성물의 제형 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
- 제형 -
제형으로는 경구투여할 수 있는 것인 것 이외에 특별히 제한은 없고, 예를 들면 경구 고형제(정제, 피복정제, 과립제, 산제, 캅셀제 등), 경구 액제(내복액제, 시럽제, 엘릭시르제 등) 등을 들 수 있다.
＜용도＞
상기 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물은 자궁경부암 전암병변 환자 및 자궁경부암 환자 등의 환자의 점막에 있어서, HPV의 E7 폴리펩티드(HPV 백신)에 특이적인 세포성 면역을 부활화시키기 위해 사용할 수 있다.
실시예
이하에 본 발명의 실시예를 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 조금도 한정되는 것은 아니다.
(실시예 1)
＜인비보 해석을 위한 마우스의 면역＞
마우스의 LacE7 제제에 의한 경구 면역은, K. Adachi et al., Vaccine, 2010, vol. 28, pp. 2810-2817에 기재된 방법에 따라 실시했다. 그때, 필요에 따라 십전대보탕(이하 「JTT」라고 한다)과 보중익기탕(이하 「HET」라고 한다), 또한 필요에 따라 LTB 폴리펩티드 또는 합성 세라미드(αGalCer)를 마우스에 경구투여했다.
＜＜LacE7 제제의 제조＞＞
LacE7 제제는 공지의 방법에 따라 제조했다(Poo H. et al., Int. J. Immunol., 2006, vol. 119, pp. 1702-1709). 간단히 말하면, HPV16 유래의 변이형 E7 단백질(서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 야생형 E7 단백질의 Rb 결합 부위의 3개의 아미노산 잔기가 치환된 것)을, 헬퍼 T세포 1형(Th1 세포)의 유도능이 확인되어 있는 락토바실러스 카제이에 발현벡터를 이용해 도입했다. 배양 후의 재조합체(LacE7)는 열로 사균화했다. 배지로부터 정제한 LacE7을 증류수로 몇 번 세정한 후, 건조·분체화하고(LacE7 제제), 사용할 때까지 4℃에서 보존했다. 상기 LacE7 제제는 수성 용매에 불용성이었다.
＜＜마우스에의 LacE7 제제의 경구투여＞＞
6주령의 암컷 SPF C67BL 마우스(니혼쿠레아(Clea Japan)사)에 대해서, 상기 LacE7 제제를 경구투여함으로써 면역했다.
1마리당 1.0mg의 상기 LacE7 제제를 제1주, 제2주, 제4주 및 제6주의 합계 4쿠르 투여했다. 모든 투여는 상기 LacE7 제제를 200μL의 PBS에 현탁한 것을 경위 튜브(intra-gastric tube)를 이용해 매주 연속 5일간, 1일 1회 3시간의 절식 후에 실시했다.
＜＜마우스에의 십전대보탕과 보중익기탕의 경구투여＞＞
1일 1마리당 40mg의 JTT(츠무라(Tsumura)사 제조) 또는 HET(츠무라사 제조)를 5g의 분말 사료에 혼합한 상태로, 1개의 게이지에 들어있는 5마리의 마우스 각각에 완전히 섭취시켰다. LacE7 제제가 투여되는 6주간(제1주~제6주) 사이, 매일 JTT 또는 HET 중 어느 한쪽을 섭취시켰다.
＜＜마우스에의 LTB 폴리펩티드 경구투여＞＞
LTB 폴리펩티드는 상기 LacE7 제제와 함께 1마리당 10㎍, 매 쿠르의 3일째에 경구투여했다. LTB 폴리펩티드로는 시그마알드리치사의 이열성 엔테로톡신 B서브유닛(LTB) 대장균 유래(카탈로그 번호：E8656)를 이용했다.
＜＜마우스에의 αGalCer 경구투여＞＞
합성 세라미드(αGalCer)는 상기 LacE7 제제와 함께 1마리당 2㎍, 매 쿠르의 3일째에 경구투여했다. 합성 세라미드(αGalCer)로는 교와핫코기린사의 알파-갈락토실세라미드(KRN7000)를 이용했다.
＜비장, 장세정액, 말초혈시료 및 점막 조직의 회수＞
상기 LacE7 제제의 마지막 접종으로부터 1주일 후(접종 개시로부터 7주째)에 임파구, 혈청 및 장세정액을 회수했다.
상기 LacE7 제제를 접종한 5마리의 마우스를 해부하여 비장, 장 및 말초혈을 채취했다. 상기 비장은 HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)로 세정했다. 상기 장은 배설물을 제거한 후, 장관 내부를 프로테아제 저해제를 더한 HBSS 10mL로 세정하고, 회수한 액을 장세정액으로 했다. 회수한 혈청과 장세정액은 -80℃에서 보존했다.
마찬가지로 상기 LacE7 제제를 접종한 25마리의 마우스를 해부하여 점막 조직으로서 장관 상피를 회수했다. 상기 장관 상피를 4% 파라포름알데히드를 포함하는 인산완충 생리식염수(PBS) 중에서 실온으로 1시간 고정한 후, PBS로 헹구고, OCT 콤파운드(Tissue-Tek(등록상표), 사쿠라파인텍(Sakura Finetek)사, 네델란드 쥬트르바우드(zoeterwoude))에 샘플을 포매(包埋)하여 동결시켜 -80℃에서 보존했다. 크라이오스탯(CM1510S, 라이카(Leica)사)을 이용해 동결 절편(두께 6㎛)을 제작하고, 면역조직학 해석을 위해서 슬라이드글라스에 올렸다.
＜마우스의 비장 세포 및 점막 임파구의 조제＞
장은 세로 방향으로 절개하고 10질량% FBS, 100units/mL 페니실린 및 100㎍/mL 스트렙토마이신을 첨가한 RPMI1640(10질량% 비활성화 우태아 혈청, 2mM L-글루타민, 1mM 피루빈산나트륨, 1×비필수아미노산, 50mM 2-메르캅토에탄올 함유) 배지에서 37℃, 30분간 세차게 진탕했다. 회수한 세포 현탁액은 BD Falcon(상표) 셀 스트레이너(BD 바이오사이언스(BD Bioscience)사, 미국)로 조직잔해(tissue debris)를 제거하고, 이어서 70질량%와 40질량%의 퍼콜 플러스(Percoll PLUS)를 중층한 15mL 튜브를 이용한 불연속 농도 기울기 원심을 실시했다. 약 107개~108개의 세포를 위에 중층하고, 600×g, 실온에서 20분간 원심함으로써 70질량%와 40질량%의 퍼콜 플러스의 계면에 점막 임파구(생존률 95%)가 모였다.　
비장 세포는, PBS 중에서 비장을 천천히 가름으로써 얻어졌다. 괴상(塊狀)의 잔해는 원심으로 제거했다.
각각, 약 5×106개~10×106개의 점막 임파구와 약 107개의 비장 세포가 각 마우스로부터 얻어졌다.
＜ELISPOT 분석＞　
장점막 임파구 또는 비장 세포(5×106세포/mL)의 현탁액 50μL를, 24시간, 37℃에서 항원제시 세포와 함께 배양했다. 50μL의 비장 세포(5×106세포/mL)에 대해서는, 마이트마이신으로 처리한 후, 3회 PBS로 세정했다. 마우스 IFN-γ용 ELISPOT 키트(마브테크 AB(Mabtech AB)사, 스웨덴)의 제조사 프로토콜에 따라, HPV16의 E7 단백질(서열번호 1)에 있어서 CTL 에피토프(Epitope)로서 보고되고 있는 E7 단백질의 제49번부터 제57번의 아미노산 서열로 이루어지는 10μL의 합성 펩티드(1μg/mL), 미토겐(Mitogen)(포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate) 40ng/mL＋이오노마이신(Ionomycin) 4μg/mL), 또는 배지만(컨트롤)을, 항마우스 IFN-γ항체로 코팅된 96 웰 플레이트(예를 들면, ELIIP 플레이트, 미리포아(Millipore)사, 미국)에 적하했다. 96 웰 플레이트 상의 IFN-γ양성의 스폿수를 해석했다. 그때, KS ELISPOT(칼자이스 비전(Carl Zeiss Vision)사, 독일)의 컴퓨터 완전보조 비디오 영상 해석시스템을 이용했다.
＜ELISA 분석＞
혈청 중의 IgG 및 장세정액 중의 IgA를, 마우스 IgG 또는 마우스 IgA에 대한 ELISA 정량 세트(베틸 라보라토리즈(Bethyl Laboratories)사, 미국)를 이용해 정량했다. HPV16의 E7 단백질에 대해 특이적인 IgG와 IgA의 양은, His 태그를 부가한 E7 단백질을 항원으로서 정량한다. 방법은 제조사 프로토콜에 따랐다.
간단히 말하면, 96 웰 플레이트(예를 들면, 이뮤노플레이트(Immunoplate), 눙크(Nunc)사, 덴마크)를 100ng/웰 His 태그-E7(50mM 탄산염-중탄산염 pH9.6의 코팅완충액에 현탁), 4℃에서 하룻밤 둠으로써 코팅했다. 그 후, 블로킹 처리를 실시한 상기 플레이트에 대해 2배 희석한 혈청 또는 장세정액을 적용했다. 세정 후에 2차 항체로서 페록시다아제 표지 항마우스 IgG 항체 또는 항마우스 IgA 항체를 각 웰에 더하고(각각 1：60,000배, 1：20,000배 희석), 37℃에서 1시간 배양했다. 세정, 발색처리 후에 흡광도 450nm를 측정했다. 비면역 마우스의 혈청 및 장세정액을 네거티브 컨트롤로 했다. 항E7 항체가(抗體價)는 항E7 IgG/전(全)IgG 또는 항E7 IgA/전IgA(상대값)로서 나타냈다.
＜사이토카인 농도의 측정＞
장세정액 중의 사이토카인 농도는 5마리의 마우스의 것을 합하여 마우스 Th1/Th2 ELISA Ready SET Go(등록상표) 키트(BD 바이오사이언스사, 미국)를 이용해 측정했다. Th1 세포가 발현하는 사이토카인으로서 IFN-γ를, Th2 세포가 발현하는 사이토카인으로서 IL-4를 측정에 이용했다. 각 샘플에 대해 적어도 3회 동일 측정을 반복했다.
＜통계 해석＞
ELISPOT 및 ELISA의 데이터를 평균값±표준 편차로 나타냈다. 이들 값 또는 상대값은 면역 그룹(각 그룹은 마우스 5마리) 간에서 비교했다. 그때, 양측 스튜던트 티이검정(Student's t-test)을 실시했다. p값이 ＜0.05의 경우 유의(有意)로 간주했다.
＜면역 조직학적 해석＞
LacE7을 경구투여한 마우스에 있어서의 E7 단백질 특이적인 세포장해성 T세포(E7 특이적 CTL)의 유도 및 그 조직내 침윤을 T-Select mouse MHC 테트라머(의학 생물학 연구소(Medical ＆ Biological Laboratories)사 제조)를 이용해 조사했다. 제조사 프로토콜에 따라 MCH 및 E7 펩티드 복합체를 바이오틴화하고, 피코에리트린 표지화 스트렙티아비딘에 의해 이것을 4량체(테트라머)화 함으로써, E7 특이적 MHC 테트라머를 제작했다. E7 펩티드로서, HPV16의 E7 단백질(서열번호 1)에 있어서 CTL 에피토프로서 보고되고 있는 E7 단백질의 제49번부터 제57번의 아미노산 서열로 이루어지는 합성 펩티드(1μg/mL)를 이용했다.
상술한 바와 같이, LacE7을 경구투여한 마우스로부터 장관 상피의 절편을 제작하고, 상기 E7 특이적 MHC 테트라머를 이용한 E7 펩티드 인식 MHC의 검출, 또는 상기 E7 특이적 MHC 테트라머 및 항CD8 항체를 이용한 이중 염색을 실시했다. 구체적으로는, 상기 장관 상피의 절편 시료를 0.1 질량% Triton-X100을 포함하는 PBS를 이용해 30분간 투과 처리한 후, 시료를 헹구고, 5질량% 스킴밀크를 포함하는 PBS로 30분간 침투시켰다. 이들을 상기 E7 특이적 MHC 테트라머(희석율 1：25) 및 경우에 따라 1：50으로 희석한 항CD8 항체(Rat Anti-Mouse CD8a/Lyt-2 FITC(Clone 53-6.7), 베크만쿨터(Beckman Coulter)사)와 함께 4℃에서 하룻밤 배양했다. 각 공정에 대해서, 상기 E7 특이적 MHC 테트라머 및 항체를 1질량% 스킴밀크 및 0.1질량% Triton-X100을 포함하는 PBS로 희석했다. DAPI(4＇,6-Diamidine-2-phenylindole dihydrochloride, 로슈(Roche)사)로 핵을 염색한 후, 절편을 PBS/글리세롤(1/1) 중에 두고, 형광 현미경(LSM 700, 차이스(Zeiss)사)으로 관찰했다.
＜E7 특이적 1형 T세포 응답에 있어서의 한방약의 애주번트 효과＞
HPV의 E6 단백질과 E7 단백질의 발현에 의해서 불사화된 세포의 클리어런스에는 IFN-γ를 산생하는 CD4＋ 헬퍼 T세포와 HPV의 E7 단백질을 인식하는 CD8＋ CTL에 의한 E7 특이적인 T세포 응답(이하 「1형 T세포 응답」이라고 한다)이 필요하다.
그래서, E7 특이적인 상기 1형 T세포 응답에 대한 LacE7 백신과 한방약의 경구투여의 영향을 조사하기 위해, ELISPOT 분석으로, 점막 임파구 및 비장 세포 중의 IFN-γ 산생 세포의 수를 조사했다(도 1).
각 그룹 5마리의 마우스에 LacE7 단독, 또는 LacE7과 JTT 혹은 HET를 경구투여했다. 마지막 면역으로부터 1주일 후에 장관 점막 임파구 및 비장 세포를 채취하여, 점막 및 전신성 면역에 대한 상기 JTT와 상기 HET의 효과를 조사했다.
HPV16의 E7의 제49번째~제57번째의 아미노산 잔기 부분은 C57BL/6마우스의 CD4＋ 및 CD8＋ T세포에 의해서 인식되는 E7-CTL 에피토프로서 알려져 있다. 그래서, 상기 HPV16의 상기 E7 단백질에 대한 상기 1형 T세포 응답의 ELISPOT 분석에는, 상기 E7-CTL 에피토프 부위에 상당하는 아미노산 서열로 이루어지는 합성 펩티드를 사용했다.
면역하지 않았던 마우스와 비교하여, LacE7로 면역한 마우스에서는 점막 임파구와 비장의 양쪽에서 E7 특이적인 IFN-γ 산생 세포의 수가 증가했다. LacE7에 의한 경구 면역은 비장보다 점막 임파구에서 보다 현저하게(대략 1.5배~2배) E7 특이적 IFN-γ 산생 세포의 레벨을 상승시켰다.
또한 놀랄 만한 것은, 상기 LacE7을 상기 JTT 또는 상기 HET와 동시 투여함으로써 비장에 있어서의 E7 특이적인 1형 T세포 응답이 현저하게 상승했다(도 1).
상기 JTT와 상기 HET에 관해서, 예방 백신 애주번트로서 사용함으로써 액성 면역을 증강시키는 효과는 시사되어 있었다.
그러나, 상기 JTT와 상기 HET가 전신성의 세포성 면역을 증강시키는 것은 지금까지 알려져 있지 않았고, 본 발명자들에 의한 새로운 지견이다.
한편, 점막에 있어서의 1형 T세포 응답에 관해서는, 상기 JTT 또는 상기 HET의 LacE7과의 동시 경구투여에 의한 현저한 효과는 볼 수 없었다(도 1).
＜점막 면역 반응에 대한 한방약 및 LBT 폴리펩티드의 애주번트 효과＞　
E7 단백질에 대한 점막 세포의 면역 응답성을 최적화하기 위해서는, 상기 JTT 또는 상기 HET 이외에 애주번트를 이용하는 것을 검토하는 것이 필요하다고 생각되었다.
그래서, LTB 폴리펩티드를 LacE7 경구투여 기간 중에 상기 JTT 또는 상기 HET와 동시에 투여했다.
LacE7 단독 투여에 비해, LacE7과 LTB 폴리펩티드의 동시 투여에 의해서 마우스에 있어서의 E7 특이적인 1형 T세포 응답의 레벨은, 점막 임파구 및 비장에서 1.5배~2배 상승했다(도 2). JTT 또는 HET를 상기 LacE7 및 상기 LTB 폴리펩티드와 동시에 투여하면, 상기 LacE7과 상기 LTB 폴리펩티드의 동시 투여와 비교하여 전신성의 1형 T세포 응답 레벨이 상승했다. 그 효과는 HET에 있어서 특히 현저했다.　
또한 기대한 바와 같이, 점막에 있어서의 1형 T세포 응답도 LacE7과 LTB의 동시 투여에 비해, JTT 또는 HET를 추가로 동시 투여함으로써 2배~2.5배 상승했다(도 2).
즉, JTT 및 HET는, LTB와 동시에 투여함으로써, 경구 백신에 의한 전신성 및 점막에 있어서의 1형 T세포 응답을 현저하게 상승시키는 것이 밝혀졌다.
＜한방약 애주번트에 의한 E7에 대한 액성 면역 응답의 증강 효과＞
다음으로 LacE7의 경구투여를 받은 마우스에 있어서의 한방약, LTB 또는 그 양쪽을 동시 투여하는 것에 의한 HPV16의 E7에 대한 액성 면역 응답에의 영향을 조사했다(도 3a, 도 3b). 각 그룹 5마리의 마우스에 LacE7 단독 또는 LacE7과 JTT 혹은 HET를 경구투여하고, 마지막 면역으로부터 1주일 후에 장관 점막 임파구 및 비장 세포를 채취한 상기 마우스에 대해서, 최종 면역 후 1주일째에 혈액 및 장세정액도 채취했다. 상기 LacE7의 경구투여에 의한 전신성 및 점막에 있어서의 액성 면역에 관해서, 혈청 중의 항E7 IgG 항체 및 장세정액 중의 항E7 IgA 항체의 양을 샌드위치 ELISA로 조사했다(도 3a, 도 3b). 샘플링에 있어서의 바이어스(Bias)를 없애기 위해서 항E7 항체가는 샘플 중의 전IgG 및 전IgA량에 대한 상대값으로 표시했다.
전IgG 또는 전IgA량에 대한 항E7 항체의 량비(항E7 IgG/전IgG, 항E7 IgA/전IgA)는 각각 E7 단백질에 대한 전신성 및 점막에 있어서의 액성 면역 응답을 표시하고 있다. LacE7으로 면역하고 있지 않은 마우스의 상기 량비를 1로 하고, 그에 대한 비로 나타냈다.
LacE7이 단독으로 경구투여된 마우스에서는 혈청 중의 항E7 IgG 항체가가 7배 이상 상승하고 있었다. LTB를 LacE7과 동시 투여한 경우에, LBT는 상기 항E7 IgG 항체가에 거의 영향을 주지 않았다.　
그에 비해, LacE7 및 LTB와 동시에 HET를 투여한 마우스에서는, LacE7 단독, 그리고 LacE7과 LTB가 동시 투여된 마우스와 비교하여, 혈청 중의 항E7 IgG의 항체가가 2배 상승하고 있었다.
한편, JTT를 LacE7, LTB와 동시 투여해도 항E7 IgG의 항체가에는 거의 영향을 주지 않았다(도 3a).
장세정액 중의 항E7 IgA에 관해서도, HET가 LacE7과 LTB와 동시에 투여된 경우에 현저한 항체가의 상승을 볼 수 있었다(도 3b).
이러한 결과는, HET와 LBT는 상승적으로, 경구 백신에 의한 전신성 및 점막에 있어서의 액성 면역을 항진시키는 것을 강하게 시사하고 있다.
＜LacE7에 의한 점막에서의 사이토카인 산생에 대한 한방 애주번트의 영향＞
한방약을 LacE7과 동시에 경구투여하는 것에 의한 점막 조직에 있어서의 1형 T세포 응답을 촉진하는 사이토카인, 및 Th2 세포에 의한 세포 응답(이하 「2형 T세포 응답」이라고 한다)을 촉진하는 사이토카인의 산생을 조사했다.
LacE7을 경구투여한 마우스로부터 얻어진 장세정액 중의 IFN-γ와 IL-4의 레벨을, 각각 상기 1형 T세포 응답 및 상기 2형 T세포 응답의 지표로 했다.
면역하고 있지 않은 마우스에 비하여, LacE7로 면역한 마우스에서는, 장세정액 중의 상기 IFN-γ와 상기 IL-4의 양쪽의 양이 현저하게 상승하고 있었다. LacE7과 JTT를 동시 투여한 경우에는 IFN-γ, IL-4의 양쪽의 양이 3배 상승하고 있었다. 한편, 상기 LacE7과 상기 HET 또는 상기 LTB를 동시 투여한 경우에는 상기 LacE7만을 단독 투여한 경우와 현저한 차이는 인지되지 않았다.　
LacE7과 JTT 또는 HET에 더하여, LTB를 동시에 투여한 경우에는, IFN-γ의 양이 6배~8배로, IL-4의 양이 3배~4배로 상승하고 있었다(도 4a, 도 4b).
즉, 사이토카인 산생을 지표로한 경우, 경구 백신에 의한 점막에서의 1형 세포 응답에는 JTT가 HET보다 더 강한 효과를 갖는 것, LTB를 함께 사용함으로써 JTT와 HET의 효과가 더욱 앙진되는 것, 및 1형 T세포 응답과 2형 T세포 응답의 양쪽이 동일한 경향을 나타내는 것이 분명해졌다.
또, 비장에 있어서는, 1형 T세포 응답 및 2형 T세포 응답은 각각 세포성 면역 및 액성 면역을 유도하는 것과는 달리, JTT, HET의 점막에 있어서의 세포성 면역 및 액성 면역의 유도 효과와 1형 T세포 응답 및 2형 T세포 응답 사이에 현저한 상호 관련성을 인지할 수 없었다.
이것은, 점막에 있어서는 Th1와 Th2 뿐만 아니라, Th17 등, 다른 T세포도 세포성 면역 및 액성 면역의 유도에 관여하고 있을 가능성을 시사하고 있다.
＜점막 면역 반응에 대한 한방약 및 합성 세라미드의 애주번트 효과＞　
E7 단백질과 한방약과 점막 애주번트와의 동시 투여에 있어서, 임상에서 사용 가능한 점막 애주번트인 αGalCer를 이용한 경우에서도 점막에 있어서의 1형 T세포 응답의 상승이 관찰되는지를 조사했다.
그래서, LTB 폴리펩티드를 대신하여 αGalCer를, LacE7 경구투여 기간 중에 상기 JTT와 동시에 투여하고, ELISPOT 분석에 의해 E7 특이적인 1형 T세포 응답의 레벨을 조사했다.
도 2에서도 관찰된 바와 같이, 마우스의 점막 임파구에 있어서의 E7 특이적인 1형 T세포 응답의 레벨은, LacE7 단독 투여에 비하여 LacE7과 LTB 폴리펩티드의 동시 투여에 의해서 상승하고, 또한 HET를 상기 LacE7 및 상기 LTB 폴리펩티드와 동시에 투여하면, 상기 LacE7과 상기 LTB 폴리펩티드의 동시 투여와 비교하여 상승하는 경향이 관찰되었다(도 5).　
E7 단백질과 한방약과 점막 애주번트와의 동시 투여에 있어서, 점막 애주번트로서 HET에 대신하여 αGalCer를 이용한 경우에도, HET를 이용한 경우와 동일한 정도, 혹은 그 이상으로, 마우스의 점막 임파구에 있어서의 E7 특이적인 1형 T세포 응답의 레벨을 현저하게 상승시키는 것이 분명해졌다(도 5). 또한, LacE7과 αGalCer만의 동시 투여는 LacE7과 동등의 응답이었다(데이터는 나타내지 않음).
즉, αGalCer는 LTB와 동시에 투여함으로써 경구 백신에 의한 점막에 있어서의 1형 T세포 응답을 현저하게 상승시키는 것이 분명해졌다.
＜LacE7에 의한 E7 특이적 CTL의 유도 및 조직내 침윤＞　
LacE7을 경구투여한 마우스의 점막 조직에 있어서, E7 단백질 특이적인 세포 장해성 T세포(E7 특이적 CTL)가 유도되어 있는 것을 면역 조직학적 해석에 의해 조사했다. 그 결과, 점막 조직인 장관 상피의 점막면 및 점막 고유층에 있어서, E7펩티드 특이적 MHC가 검출되었다. 따라서, E7 특이적 CTL의 유도가 인지되고, 또한 E7 특이적 CTL이 점막 조직내에 침윤하는 것이 분명해졌다.　
이 결과는, LacE7의 경구투여가 E7 특이적인 점막 면역을 유도하는 것을 나타내는 것이다.
이상의 결과로부터, 십전대보탕 및 보중익기탕 중 어느 하나를 포함한 LacE7 백신은, CIN3 환자뿐만 아니라, 자궁경부암 환자, 또한 다른 HPV 관련 암 환자 및 상기 HPV 관련 암의 전암병변 환자에 대해서도 치료 효과를 가질 가능성을 충분히 기대할 수 있다.　
또한 적당한 면역 애주번트를 함유시킨 십전대보탕 및 보중익기탕 중 어느 하나를 포함한 LacE7 백신은 보다 뛰어난 치료 효과를 갖는 것을 기대할 수 있다.
산업상 이용가능성
본 발명의 점막 면역 부활화제는, HPV 백신 등의 바이러스 백신 및 세균 백신과 병용함으로써 점막 면역을 부활화하기에 알맞다.
본 발명의 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물은, HPV 감염증의 환자에게 투여함으로써, 그 치료용 백신으로서 사용하기에 알맞다.
본 발명의 양태로는, 예를 들면 이하와 같다.
＜1＞　자양강장 작용을 갖는 한방약과 점막 애주번트를 함유하는 것을 특징으로 하는 점막 면역 부활화제이다.
＜2＞　자양강장 작용을 갖는 한방약이, 십전대보탕 및 보중익기탕 중 적어도 어느 하나인 상기 ＜1＞에 기재한 점막 면역 부활화제이다.
＜3＞　점막 애주번트가, 콜레라 독소(CT), 대장균 이열성 독소(LT), 베로 독소(VT), 디프테리아 독소(DT) 및 백일해 독소(PT)에서 유래하는 야생형 폴리펩티드 또는 변이형 폴리펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 그리고 합성 세라미드(αGalCer) 중 적어도 1개인 상기 ＜1＞ 또는 ＜2＞ 중 어느 하나에 기재한 점막 면역 부활화제이다.
＜4＞　점막 애주번트는, LT의 B서브유닛(LTB) 폴리펩티드 및 합성 세라미드(αGalCer) 중 어느 하나인 상기 ＜3＞에 기재한 점막 면역 부활화제이다.
＜5＞　경구로 투여되는 경우에, 환자의 점막에 있어서, 그 전후 또는 동시에 경구투여되는 항원에 특이적인 세포성 면역을 부활화시키는 상기 ＜1＞부터 ＜4＞ 중 어느 하나에 기재한 점막 면역 부활화제이다.　
＜6＞　항원은, 인유두종 바이러스(HPV) 유래의 폴리펩티드인 상기 ＜5＞에 기재한 점막 면역 부활화제이다.
＜7＞　HPV 유래의 폴리펩티드는, 1부터 수 개의 아미노산을 결실, 치환 또는 부가하는 변이를 갖는 상기 ＜6＞에 기재한 점막 면역 부활화제이다.
＜8＞　HPV 유래의 폴리펩티드는, HPV 유래의 폴리펩티드를 발현시킨 락토바실러스 카제이의 재조합체를 사균화시킨 분체에 함유되는, 또는 락토바실러스 카제이를 사균화시킨 분체에 첨가되는 상기 ＜6＞ 또는 ＜7＞ 중 어느 하나에 기재한 점막 면역 부활화제이다.
＜9＞　HPV 유래의 폴리펩티드는, HPV의 E7 폴리펩티드인 상기 ＜6＞부터 ＜8＞ 중 어느 하나에 기재한 점막 면역 부활화제이다.
＜10＞　HPV의 E7 폴리펩티드는, HPV16에서 유래하는 상기 ＜9＞에 기재한 점막 면역 부활화제이다.
＜11＞　HPV의 E7 폴리펩티드는, 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 상기 ＜10＞에 기재한 점막 면역 부활화제이다.
＜12＞　HPV의 E7 폴리펩티드와 자양강장 작용을 갖는 한방약을 함유하는 것을 특징으로 하는 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물이다.
＜13＞　자양강장 작용을 갖는 한방약이, 십전대보탕 및 보중익기탕 중 적어도 어느 하나인 상기 ＜12＞에 기재한 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물이다.
＜14＞　추가로 점막 애주번트를 함유하는 상기 ＜12＞ 또는 ＜13＞ 중 어느 하나에 기재한 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물이다.
＜15＞　HPV의 E7 폴리펩티드는, HPV16에서 유래하는 상기 ＜12＞부터 ＜14＞ 중 어느 하나에 기재한 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물이다.　
＜16＞　HPV의 E7 폴리펩티드는, 1부터 수 개의 아미노산을 결실, 치환 또는 부가하는 변이를 갖는 상기 ＜12＞부터 ＜15＞ 중 어느 하나에 기재한 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물이다.
＜17＞　HPV의 E7 폴리펩티드는, 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 상기 ＜16＞에 기재한 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물이다.
＜18＞　HPV의 E7 폴리펩티드는, HPV의 E7 폴리펩티드를 발현시킨 락토바실러스 카제이의 재조합체를 사균화시킨 분체에 함유되는, 또는 락토바실러스 카제이를 사균화시킨 분체에 첨가되는 상기 ＜12＞부터 ＜17＞ 중 어느 하나에 기재한 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물이다.
＜19＞　환자의 점막에 있어서, HPV의 E7 폴리펩티드 특이적인 세포성 면역을 부활화시키는 상기 ＜12＞부터 ＜18＞ 중 어느 하나에 기재한 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물이다.
＜20＞　환자는, 자궁경부암 전암병변 환자 및 자궁경부암 환자 중 어느 쪽인 상기 ＜19＞에 기재한 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물이다.
＜21＞　점막 애주번트는 CT, LT, VT, DT 및 PT에서 유래하는 야생형 폴리펩티드 또는 변이형 폴리펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 그리고 합성 세라미드(αGalCer) 중 적어도 1개인 상기 ＜14＞부터 ＜20＞ 중 어느 하나에 기재한 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물이다.
＜22＞　점막 애주번트는, LTB 폴리펩티드 및 합성 세라미드(αGalCer) 중 어느 하나인 상기 ＜21＞에 기재한 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물이다.
SEQUENCE LISTING <110> The University of Tokyo <120> MUCOSAL IMMUNITY POTENTIATOR AND ORAL PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF HPV INFECTION <130> NST00413P <150> JP 2012-128943 <151> 2012-06-20 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 1 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 2 <211> 98 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <400> 2 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Gly Leu Tyr Gly Tyr Gly Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro

Claims (7)

  1. 자양강장 작용을 갖는 한방약과, 점막 애주번트를 함유하고,
    상기 자양강장 작용을 갖는 한방약이 십전대보탕 및 보중익기탕 중 적어도 어느 하나이고,
    상기 점막 애주번트가 대장균 이열성 독소인 B서브유닛(LTB) 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 HPV 감염증 치료제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    경구로 투여되는 경우에, 환자의 점막에 있어서, 그 전후 또는 동시에 경구투여되는 항원으로서의 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 HPV의 E7 폴리펩티드에 특이적인 세포성 면역을 부활화시키는 HPV 감염증 치료제.
  3. 제 2 항에 있어서,
    HPV의 E7 폴리펩티드는, HPV의 E7 폴리펩티드를 발현시킨 락토바실러스 카제이의 재조합체를 사균화시킨 분체에 함유되는, 또는 락토바실러스 카제이를 사균화시킨 분체에 첨가되는 HPV 감염증 치료제.
  4. 서열번호 2로 나타내어지는 아미노산 서열로 이루어지는 HPV의 E7 폴리펩티드와, 자양강장 작용을 갖는 한방약과, 점막 애주번트를 함유하고,
    상기 자양강장 작용을 갖는 한방약이 십전대보탕 및 보중익기탕 중 적어도 어느 하나이며,
    상기 점막 애주번트가 대장균 이열성 독소인 B서브유닛(LTB) 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    HPV의 E7 폴리펩티드는, HPV의 E7 폴리펩티드를 발현시킨 락토바실러스 카제이의 재조합체를 사균화시킨 분체에 함유되는, 또는 락토바실러스 카제이를 사균화시킨 분체에 첨가되는 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서,
    환자의 점막에 있어서, HPV의 E7 폴리펩티드 특이적인 세포성 면역을 부활화시키는 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    환자는, 자궁경부암 전암병변 환자 및 자궁경부암 환자 중 어느 하나인 HPV 감염증 치료용 경구 의약 조성물.
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