KR20170019480A

KR20170019480A - 아실-ＣｏＡ 신세타제 호몰로그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 그 용도

Info

Publication number: KR20170019480A
Application number: KR1020177003767A
Authority: KR
Inventors: 미사 오치아이
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2010-02-01
Filing date: 2011-02-01
Publication date: 2017-02-21
Anticipated expiration: 2031-02-01
Also published as: EP2537927A4; EP2537927B1; CN102906259A; JP2016034275A; EP2772538A1; WO2011093509A1; CN104388439B; AU2011211291A1; EP2930236B1; US9822354B2; KR101709384B1; CN104388438A; CA2907905A1; JP6150857B2; EP2772538B1; EP2537927A1; AU2011211291B2; DK2537927T3; US20120322992A1; BR112012019295A2

Abstract

본 발명은 모르티에렐라속 미생물의 아실-CoA 신세타제 호몰로그 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 등에 관한 것이다. 본 발명은, 예컨대, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)의 아실-CoA 신세타제 호몰로그 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오타이드, 아실-CoA 신세타제 호몰로그 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 이들 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터 및 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하는 지질 또는 지방산의 제조 방법, 또는 그러한 제법에 의해 제조된 지질 또는 지방산을 함유하는 식품 등을 제공한다.

Description

아실-ＣｏＡ 신세타제 호몰로그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 그 용도{POLYNUCLEOTIDE ENCODING ACYL-COA SYNTHETASE HOMOLOG AND METHOD FOR USING THE SAME}

본 발명은 아실-CoA 신세타제 호몰로그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 그 이용 방법에 관한 것이다.

불포화 결합을 2개소 이상 함유하는 지방산은 고도 불포화 지방산(PUFA:polyunsaturated)이라고 총칭되며, 아라키돈산(ARA)이나 디호모 γ-리놀렌산(DGLA), 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사헥사엔산(DHA) 등이 알려져 있다. 고도 불포화 지방산에는 동물체 내에서 합성할 수 없는 것도 존재한다. 따라서, 그러한 고도 불포화 지방산은 필수 지방산으로서 음식물로부터 섭취할 필요가 있다.

고도 불포화 지방산은 널리 분포되어 있으며, 예컨대, 아라키돈산은 동물의 부신선 및 간장에서 추출한 지질로부터 분리할 수 있다. 그러나, 동물 장기에 포함되는 고도 불포화 지방산은 소량이기 때문에 동물 장기부터의 분리 추출만으로는 충분한 공급을 얻을 수 없다. 따라서, 다양한 미생물을 배양함으로써 고도 불포화 지방산을 생산하는 방법이 개발되어 왔다. 그 중에서도 모르티에렐라(Mortierella)속 미생물은 아라키돈산 등의 고도 불포화 지방산 함유 지질을 생산하는 미생물로서 널리 알려져 있다.

또한, 식물체 내에서 고도 불포화 지방산을 생산하는 시도도 이루어지고 있다. 고도 불포화 지방산은 트리아실글리세롤 등의 저장 지질을 구성하며, 미생물의 균체 내 또는 식물 종자 중에 축적되는 것이 알려져 있다.

아실-CoA 신세타제(ACS)는 지방산과 코엔자임 A(CoA)를 티오에스테르화하는 효소로서, 이하의 반응을 촉매한다.

지방산 + CoASH + ATP → 아실 - CoA + AMP + PPi

ACS에 의해 생성되는 아실-CoA는 지질의 생합성이나 리모델링, β-산화에 의한 에너지 생산, 단백질의 아실화, 지방산에 의한 발현 조절 등을 포함하는 다양한 생명 현상에 관여하고 있다. 또한, ACS는 세포 밖으로부터의 지방산의 취입이나 세포 내의 지방산 수송 등에도 관여하는 것이 보고되고 있다(비특허문헌 1 및 2). 이상을 감안하면, 미생물이나 식물을 이용하여 고도 불포화 지방산 등을 생산하는 경우에는 ACS의 활성을 컨트롤하는 것이 중요하다고 생각된다.

모델 진핵 생물인 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서는 6개의 아실-CoA 신세타제 유전자(ScFAA1, ScFAA2, ScFAA3, ScFAA4, ScFAT1, ScFAT2)가 알려져 있다(비특허문헌 1). 이들 유전자로 코딩되는 단백질은 기질 특이성, 발현 시기, 세포 내에서의 국재 및 기능에 있어서 서로 다르다.

특허문헌 1에는 스키조키트리움속(Schizochytrium sp.) 유래의 아실-CoA 신세타제 유전자(ScACS)로서 9개의 유전자가 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 1에는 스키조키트리움속 PUFA 신세타제계를 코딩하는 유전자와 ScACS를 공발현시킨 경우 ScACS를 공발현시키지 않는 경우와 비교하여 DPA(n-6)(도코사펜타엔산(n-6))나 DHA의 생산이 증가한 것이 기재되어 있다.

그 밖에, 동물 및 식물 유래의 아실-CoA 신세타제 유전자에 대해서도 보고되고 있다(비특허문헌 2 및 특허문헌 2).

특허문헌 1 : 일본 특허 공표 JP 2009-529890 특허문헌 2 : 국제 공개 공보 WO0209295

비특허문헌 1 : B. B. A. 1771, 286-298, 2007 비특허문헌 2 : Exp. Biol. Med., 233(5), 507-521, 2008

상기와 같은 상황 하에서 숙주 세포에 있어서 발현시켰을 때 상기 숙주 세포의 지방산의 생산량을 증가시키거나, 또는 생산되는 지방산의 조성을 변화시키는 새로운 유전자의 단리가 요구되고 있다.

본 발명자들은 예의 연구한 결과, 지질 생산균인 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)(이하, "M. alpina")의 ACS 호몰로그(MaACS)를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 것에 성공하여 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 이하의 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 발현 벡터, 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하는 지질 또는 지방산 조성물 및 식품 등의 제조 방법 및 그러한 제법에 의해 제조된 식품 등을 제공한다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

[1] 이하의 (a) 내지 (e)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오타이드:

(a) 서열 번호 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31, 36, 41, 46, 51 및 56에 나타낸 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드;

(b) 서열 번호 2, 7, 12, 17, 22, 27, 32, 37, 42, 47, 52 및 57에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드;

(c) 서열 번호 2, 7, 12, 17, 22, 27, 32, 37, 42, 47, 52 및 57에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 100개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드;

(d) 서열 번호 2, 7, 12, 17, 22, 27, 32, 37, 42, 47, 52 및 57에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열에 대해, 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및

(e) 서열 번호 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31, 36, 41, 46, 51 및 56에 나타낸 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드와 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오타이드로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.

[2] 이하의 (f) 또는 (g) 중 어느 하나에 기재된 상기 [1]에 따른 폴리뉴클레오타이드:

(f) 서열 번호 2, 7, 12, 17, 22, 27, 32, 37, 42, 47, 52 및 57에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서 1 내지 10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및

(g) 서열 번호 2, 7, 12, 17, 22, 27, 32, 37, 42, 47, 52 및 57에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열에 대해, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.

[3] 서열 번호 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31, 36, 41, 46, 51 및 56에 나타낸 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 함유하는 상기 [1]에 따른 폴리뉴클레오타이드.

[4] 서열 번호 2, 7, 12, 17, 22, 27, 32, 37, 42, 47, 52 및 57에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 상기 [1]에 따른 폴리뉴클레오타이드.

[5] DNA인 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드.

[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드로 코딩되는 단백질.

[7] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터.

[8] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 상기 [7]에 따른 벡터가 도입된 비인간 형질전환체.

[9] 상기 [8]에 따른 형질전환체의 배양물로부터 지질 또는 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 지질 또는 지방산 조성물의 제조 방법.

[10] 상기 지질이 트리아실글리세롤인 상기 [9]에 따른 방법.

[11] 상기 지방산이 탄소수 18 이상의 고도 불포화 지방산인 상기 [9]에 따른 방법.

[12] 상기 [9]에 따른 제조 방법에 의해 채취된 지질 또는 지방산 조성물을 함유하는 식품, 의약품, 화장품 또는 비누.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 적절한 숙주 세포의 형질전환에 이용할 수 있고, 그와 같이 하여 얻어지는 형질전환체는 지방산 조성물, 식품, 화장료, 의약, 비누 등의 제조에 이용할 수 있다.

보다 구체적으로는, 본 발명의 형질전환체는 지질 및 지방산의 생산 효율이 매우 높다. 따라서, 본 발명은 대량의 지질 또는 지방산을 필요로 하는 의약품 혹은 건강 식품의 제조에 유효하게 사용할 수 있다.

도 1은 MaACS-1의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열과의 대응을 도시한 도면이다.
도 2a는 MaACS-1의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 도시한 도면이다.
도 2b는 도 2a의 계속을 도시한 도면이다.
도 3a는 MaACS-2의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열과의 대응을 도시한 도면이다.
도 3b는 도 3A의 계속을 도시한 도면이다.
도 4a는 MaACS-2의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 도시한 도면이다.
도 4b는 도 4a의 계속을 도시한 도면이다.
도 4c는 도 4b의 계속을 도시한 도면이다.
도 5는 MaACS-3의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열과의 대응을 도시한 도면이다.
도 6a는 MaACS-3의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 도시한 도면이다.
도 6b는 도 6a의 계속을 도시한 도면이다.
도 7a는 MaACS-4의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열과의 대응을 도시한 도면이다.
도 7b는 도 7a의 계속을 도시한 도면이다.
도 8a는 MaACS-4의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 도시한 도면이다.
도 8b는 도 8a의 계속을 도시한 도면이다.
도 8c는 도 8b의 계속을 도시한 도면이다.
도 9a는 MaACS-5의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열과의 대응을 도시한 도면이다.
도 9b는 도 9a의 계속을 도시한 도면이다.
도 10a는 MaACS-5의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 도시한 도면이다.
도 10b는 도 10a의 계속을 도시한 도면이다.
도 11a는 MaACS-6의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열과의 대응을 도시한 도면이다.
도 11b는 도 11a의 계속을 도시한 도면이다.
도 12a는 MaACS-6의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 도시한 도면이다.
도 12b는 도 12a의 계속을 도시한 도면이다.
도 13은 MaACS-7의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열과의 대응을 도시한 도면이다.
도 14a는 MaACS-7의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 도시한 도면이다.
도 14b는 도 14a의 계속을 도시한 도면이다.
도 15a는 MaACS-8의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열과의 대응을 도시한 도면이다.
도 15b는 도 15a의 계속을 도시한 도면이다.
도 16a는 MaACS-8의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 도시한 도면이다.
도 16b는 도 16a의 계속을 도시한 도면이다.
도 16c는 도 16b의 계속을 도시한 도면이다.
도 17은 MaACS-9의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열과의 대응을 도시한 도면이다.
도 18a는 MaACS-9의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 도시한 도면이다.
도 18b는 도 18a의 계속을 도시한 도면이다.
도 19a는 MaACS-10의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열과의 대응을 도시한 도면이다.
도 19b는 도 19a의 계속을 도시한 도면이다.
도 20a는 MaACS-10의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 도시한 도면이다.
도 20b는 도 20a의 계속을 도시한 도면이다.
도 20c는 도 20b의 계속을 도시한 도면이다.
도 21a는 MaACS-11의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열과의 대응을 도시한 도면이다.
도 21b는 도 21a의 계속을 도시한 도면이다.
도 22a는 MaACS-11의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 도시한 도면이다.
도 22b는 도 22a의 계속을 도시한 도면이다.
도 23a는 MaACS-12의 cDNA 서열과 추정 아미노산 서열과의 대응을 도시한 도면이다.
도 23b는 도 23a의 계속을 도시한 도면이다.
도 24a는 MaACS-12의 게놈 서열과 CDS 서열의 얼라이먼트를 도시한 도면이다.
도 24b는 도 24a의 계속을 도시한 도면이다.
도 25a는 에스. 세레비시아(S. cerevisiae) 유래의 FAA 단백질(FAA: Fatty Acid Activation)과 비교적 높은 아미노산 서열의 상동성을 갖는 MaACS와 상기 FAA 단백질과의 얼라인먼트를 도시한 도면이다. 1중 밑줄 부분은 ATP-AMP 모티브를 나타내고, 이중 밑줄 부분은 FACS/VLACS-FATP 모티브를 나타낸다.
도 25b는 도 25a의 계속을 도시한 도면이다.
도 25c는 도 25b의 계속을 도시한 도면이다.
도 26a는 S. cerevisiae 유래의 FAT 단백질(FAT: Fatty Acid Transferase)과 비교적 높은 아미노산 서열의 상동성을 갖는 MaACS와 상기 FAT의 단백질과의 얼라인먼트를 도시한 도면이다. 1중 밑줄 부분은 ATP-AMP 모티브를 나타내고, 이중 밑줄 부분은 FACS/VLACS-FATP 모티브를 나타낸다.
도 26b는 도 26a의 계속을 도시한 도면이다.
도 27은 MaACS-10을 과잉 발현시킨 M. alpina에서의 균체 당 지질 생산량(도 27A)과 아라키돈산 생산량(도 27B)의 시간 경과에 따른 변화를 도시한 도면이다.
도 28은 MaACS-11을 과잉 발현시킨 M. alpina에서의 균체 당 지질 생산량(도 28A)과 아라키돈산 생산량(도 28B)의 시간 경과에 따른 변화를 도시한 도면이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 이하의 실시 형태는 본 발명을 설명하기 위한 예시로서, 본 발명을 본 실시 형태로만 한정하는 취지가 아니다. 본 발명은 그 요지를 벗어나지 않는 한 다양한 형태로 실시를 할 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 인용한 모든 문헌 및 공개 공보, 특허 공보 그 밖의 특허문헌은 참조로서 본 명세서에 통합하는 것으로 한다. 또한, 본 명세서는 2010년 2월 1일에 출원된 본원 우선권 주장의 기초가 되는 일본 특허 출원(특원 2010-19967호)의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.

본 발명자들은 후술하는 실시예에 있어서 상세하게 기재하는 바와 같이, 지질 생산균인 M. alpina 유래의 ACS 호몰로그의 유전자(MaACS-1 내지 12)의 전체 길이 cDNA의 클로닝에 처음으로 성공했다. 또한, 본 발명자들은 M. alpina 유래의 MaACS-1 내지 12의 게놈 DNA의 염기 서열 및 추정 아미노산 서열도 동정했다. MaACS 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12의 ORF 서열, 추정 아미노산 서열, CDS 서열, cDNA 서열 및 게놈 서열은 각각 서열 번호 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31, 36, 41, 46, 51 및 56(이하, 이들 서열을 통합하여 "MaACS-1 내지 12의 ORF 서열"이라고 함), 서열 번호 2, 7, 12, 17, 22, 27, 32, 37, 42, 47, 52 및 57(이하, 이들 서열을 통합하여 "MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열"이라고 함), 서열 번호 3, 8, 13, 18, 23, 28, 33, 38, 43, 48, 53 및 58(이하, 이들 서열을 통합하여 "MaACS-1 내지 12의 CDS 서열"이라고 함), 서열 번호 4, 9, 14, 19, 24, 29, 34, 39, 44, 49, 54 및 59(이하, 이들 서열을 통합하여 "MaACS-1 내지 12의 cDNA 서열"이라고 함) 및 서열 번호 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 및 60(이하, 이들 서열을 통합하여 "MaACS-1 내지 12의 게놈 서열"이라고 함)이다. 이들 폴리뉴클레오타이드 및 단백질은 후술하는 실시예에 기재한 방법, 공지의 유전자 공학적 방법, 공지의 합성 방법 등에 의해 취득하는 것이 가능하다.

1. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드

먼저, 본 발명은, 이하의 (a) 내지 (g)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다:

(a) MaACS-1 내지 12의 ORF 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드;

(b) MaACS-1 내지 12의 cDNA 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드;

(c) MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드;

(d) MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서, 1 내지 100개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 및/또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드;

(e) MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 60% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 및/또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드;

(f) MaACS-1 내지 12의 ORF 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드와 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오타이드로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 및/또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및

(g) MaACS-1 내지 12의 cDNA 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드와 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오타이드로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 및/또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.

본 명세서에 있어서, "폴리뉴클레오타이드"란 DNA 또는 RNA를 의미한다.

본 명세서에 있어서, "스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오타이드"란 예컨대 MaACS-1 내지 12의 ORF 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열 또는 MaACS-1 내지 12의 cDNA 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열과 상보적인 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드, 또는 MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부를 프로브로 하여, 콜로니 하이브리다이제이션법, 플라크 하이브리다이제이션법 또는 서던 하이브리다이제이션법 등을 이용함으로써 얻어지는 폴리뉴클레오타이드를 말한다. 하이브리다이제이션의 방법으로는, 예컨대, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001" 및 "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997" 등에 기재되어 있는 방법을 이용할 수 있다.

본 명세서에 있어서, "스트린젠트한 조건"이란 저스트린젠트한 조건, 중스트린젠트한 조건 및 고스트린젠트한 조건의 어느 것일 수도 있다. "저스트린젠트한 조건"은, 예컨대, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 32℃의 조건이다. 또한, "중스트린젠트한 조건"은, 예컨대, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 42℃ 또는 5×SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 50% 포름아미드, 42℃의 조건이다. "고스트린젠트한 조건"은, 예컨대, 5×SSC, 5×덴하르트 용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 50℃ 또는 0.2×SSC, 0.1% SDS, 65℃의 조건이다. 이들 조건에 있어서, 온도를 올릴수록 높은 동일성을 갖는 DNA가 효율적으로 얻어지는 것을 기대할 수 있다. 단, 하이브리다이제이션의 스트린젠시에 영향을 미치는 요소로는 온도, 프로브 농도, 프로브의 길이, 이온 강도, 시간, 염 농도 등의 복수 개의 요소를 생각할 수 있으며, 당업자라면 이들 요소를 적당히 선택함으로써 동일한 스트린젠시를 구현하는 것이 가능하다.

또한, 하이브리다이제이션에 시판 키트를 사용하는 경우에는, 예컨대 Alkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare)를 이용할 수 있다. 이 경우에는, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 표지한 프로브와의 인큐베이션을 하룻밤 수행한 후, 멤브레인을 55℃의 조건 하에서 0.1%(w/v) SDS를 포함하는 일차 세정 버퍼로 세정한 후, 하이브리다이즈한 DNA를 검출할 수 있다. 혹은, MaACS-1 내지 12의 ORF 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열 또는 MaACS-1 내지 12의 cDNA 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열과 상보적인 염기 서열, 또는 MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열의 전부 또는 일부에 기초하여 프로브를 제작할 때, 시판하는 시약(예컨대, PCR 라벨링 믹스(Roche Diagnostics) 등)을 이용하여 상기 프로브를 디곡시제닌(DIG) 라벨한 경우에는, DIG 핵산 검출 키트(Roche Diagnostics)를 이용하여 하이브리다이제이션을 검출할 수 있다.

상기 이외에 하이브리다이즈 가능한 폴리뉴클레오타이드로는, FASTA, BLAST 등의 상동성 검색 소프트웨어에 의해 디폴트의 파라미터를 이용하여 계산했을 때, MaACS-1 내지 12의 ORF 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열 또는 MaACS-1 내지 12의 cDNA 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 염기 서열의 DNA, 또는 MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA와 50% 이상, 51% 이상, 52% 이상, 53% 이상, 54% 이상, 55% 이상, 56% 이상, 57% 이상, 58% 이상, 59% 이상, 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 DNA를 들 수 있다.

또한, 아미노산 서열이나 염기 서열의 동일성은 FASTA(Science 227 (4693): 1435-1441, (1985))나 칼린 및 아서에 의한 알고리즘 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873, 1993)를 이용하여 결정할 수 있다. BLAST의 알고리즘에 기초한 blastn, blastx, blastp, tblastn이나 tblastx라고 불리는 프로그램이 개발된 바 있다(Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403, 1990). blastn을 이용하여 염기 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는, 예컨대 score=100, wordlength=12로 한다. 또한, blastp를 이용하여 아미노산 서열을 해석하는 경우에는, 파라미터는, 예컨대 score=50, wordlength=3으로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우에는, 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 이용한다.

상기한 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 공지의 유전자 공학적 방법 또는 공지의 합성 방법에 의해 취득하는 것이 가능하다.

2. 본 발명의 단백질

본 발명은 다음에 나타낸 단백질을 제공한다.

(i) 상기 (a) 내지 (g) 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드로 코딩되는 단백질.

(ii) MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 단백질.

(iii) MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수 개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 및/또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질.

(iv) MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 및/또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질.

상기 (iii) 또는 (iv)에 기재된 단백질은, 대표적으로는 천연에 존재하는 MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질의 이변체인데, 예컨대, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997", "Nuc. Acids. Res., 10, 6487(1982)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)", "Gene, 34, 315(1985)", "Nuc. Acids. Res., 13, 4431(1985)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488(1985)" 등에 기재된 부위 특이적 이변 도입법을 이용하여 인위적으로 취득할 수 있는 것도 포함된다.

본 명세서에 있어서, "MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수 개의 아미노산이, 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 및/또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질"로는, MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열에 있어서, 예컨대, 1 내지 100개, 1 내지 90개, 1 내지 80개, 1 내지 70개, 1 내지 60개, 1 내지 50개, 1 내지 40개, 1 내지 39개, 1 내지 38개, 1 내지 37개, 1 내지 36개, 1 내지 35개, 1 내지 34개, 1 내지 33개, 1 내지 32개, 1 내지 31개, 1 내지 30개, 1 내지 29개, 1 내지 28개, 1 내지 27개, 1 내지 26개, 1 내지 25개, 1 내지 24개, 1 내지 23개, 1 내지 22개, 1 내지 21개, 1 내지 20개, 1 내지 19개, 1 내지 18개, 1 내지 17개, 1 내지 16개, 1 내지 15개, 1 내지 14개, 1 내지 13개, 1 내지 12개, 1 내지 11개, 1 내지 10개, 1 내지 9개(1 내지 수개), 1 내지 8개, 1 내지 7개, 1 내지 6개, 1 내지 5개, 1 내지 4개, 1 내지 3개, 1 내지 2개 또는 1개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 및/또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가의 수는 일반적으로는 작을수록 바람직하다.

또한, 이러한 단백질로는 MaACS-1 내지 12의 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열과 60% 이상, 61% 이상, 62% 이상, 63% 이상, 64% 이상, 65% 이상, 66% 이상, 67% 이상, 68% 이상, 69% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가지며, 아실-CoA 신세타제 활성, 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 및/또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질을 들 수 있다. 상기 동일성의 수치는 일반적으로 클수록 바람직하다.

본 발명의 단백질의 아미노산 서열에 있어서 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되었다란, 동일 서열 중의 임의의 하나 또는 복수 개의 아미노산 서열 중의 위치에 있어서, 하나 또는 복수 개의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가가 있는 것을 의미하여, 결실, 치환, 삽입 및 부가 중 2종 이상이 동시에 발생할 수도 있다.

이하, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 예를 나타낸다. 동일 군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능하다. A 군: 로이신, 이소로이신, 노르로이신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, o-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌; B군: 아스파라긴산, 글루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베린산; C군: 아스파라긴, 글루타민; D군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2, 3-디아미노프로피온산; E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린; F군: 세린, 트레오닌, 호모세린; G군: 페닐알라닌, 티로신.

또한, 본 발명의 단백질은 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, Advanced Automation Peptide Protein Technologies사 제조, Perkin Elmer사 제조, Protein Technologies사 제조, PerSeptive사 제조, Applied Biosystems사 제조, SHIMADZU사 제조 등의 펩타이드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드로 코딩되는 단백질 또는 본 발명의 단백질은 모두 ACS의 호몰로그 단백질로서, 아실-CoA 신세타제 활성에 중요한 ATP-AMP 모티브 및 FACS/VLACS-FATP 모티브가 보존되어 있기 때문에 아실-CoA 신세타제 활성을 갖는 것이라고 생각된다. 여기서, ATP, AMP, FACS, VLACS 및 FATP는 각각 아데노신 트리포스페이트(Adenosine Triphosphate), 아데노신 모노포스페이트(Adenosine Monophosphate), 지방 아실 CoA 신세타제(Fatty Acyl CoA Synthetase), 매우 장쇄의 아실-CoA 신세타제(Very Long Chain Acyl-CoA Synthetase) 및 지방산 수송 단백질(Fatty Acid Transport Protein)을 의미한다. 본 발명의 단백질에 포함되는 ATP-AMP 모티브 및 FACS/VLACS-FATP 모티브의 구체적인 아미노 서열은 도 25 및 도 26의 각각 1중 밑줄 부분 및 2중 밑줄 부분에 표시되어 있다. ATP-AMP 모티브 및 FACS/VLACS-FATP 모티브의 대표적인 아미노 서열에 대해서는 pfam(http://pfam.sanger.ac.uk/) 등의 데이터베이스에서 참조할 수 있다.

여기서, "아실-CoA 신세타제 활성(ACS 활성)"은 지방산과 코엔자임 A와의 사이에 티오에스테르 결합을 발생시키며, 아실-CoA를 생성하는 반응(하기의 화학 반응식)을 촉진하는 활성을 의미한다.

지방산 + 코엔자임 A → 아실-CoA + H₂O

아실-CoA 신세타제 활성은, 예컨대, 본 발명의 폴리펩타이드를 도입한 숙주 세포를 일정 기간 배양한 후에 상기 숙주 세포의 세포 용해물을 조제하고, 상기 세포 용해물과 표지한 지방산(예컨대, 방사성 동위체로 표지한 고도 불포화 지방산 등)과 코엔자임 A를 혼합하여 일정 시간 반응시키고, 그 후 n-헵탄으로 유리 지방산을 추출하여 제거하고, 수층에 포함되는 상기 반응에 의해 생긴 지방산-CoA의 양을 신틸레이션 계수기에 의해 방사능 레벨로서 측정함으로써 정량적으로 확인할 수 있다. 아실-CoA 신세타제 활성의 확인 방법의 상세한 내용에 대해서는 Black PN et al.(J.B.C., 272(8), 4896-4903, 1997)을 참조할 수 있다. 혹은, 본원 실시예 2의 "ACS 활성의 평가"에 기재되는 바와 같이 방사성 라벨을 사용하지 않는 방법에 의해 아실-CoA 신세타제 활성을 측정하는 것도 가능하다.

"숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성"이란 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내에 도입(형질전환)하여 상기 숙주 세포 내에서 발현시킨 경우에, 상기 숙주 세포와 동일주 유래이며, 상기 폴리뉴클레오타이드를 도입하지 않은 대조 세포(컨트롤)와 비교하여 지방산의 총 생산량을 증가시키는 활성을 의미한다.

또한, "숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 조성을 변화시키는 활성"이란 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내에 도입(형질전환)하여 상기 숙주 세포 내에서 발현시킨 경우에, 상기 숙주 세포와 동일주 유래이며, 상기 폴리뉴클레오타이드를 도입하지 않은 대조 세포(컨트롤)와 비교하여 세포에 의해 생산되는 각종 지방산의 양 또는 비율을 변화시키는 활성을 의미한다.

본 명세서에 있어서, "지방산"이란 일반식 RCOOH(R은 알킬기)로 표시되는 지방족 모노카르복실산(카르복실기를 한 개 가지며, 탄소 원자가 쇄형으로 연결된 카르복실산)을 말한다. 지방산에는 탄화수소 쇄 중에 이중 결합을 갖지 않는 포화 지방산과 이중 결합을 포함하는 불포화 지방산이 포함된다. 바람직하게는, 지방산은 불포화 지방산이며, 더욱 바람직하게는, 탄화수소 쇄 중에 복수 개의 이중 결합을 포함하는 고도 불포화 지방산이다. 또한, 고도 불포화 지방산의 바람직한 예로는, 탄소수 18 이상의 불포화 지방산, 예컨대, 탄소수 18 또는 20의 불포화 지방산이며, 그 예로는 올레인산, 리놀레산, 리놀렌산(γ-리놀렌산 및 디호모 γ-리놀렌산 등), 아라키돈산 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다. 특히 바람직하게는, 고도 불포화 지방산은 리놀레산, γ-리놀렌산, 디호모 γ-리놀렌산 및 아라키돈산이고, 보다 바람직하게는, 리놀레산, 디호모 γ-리놀렌산 및 아라키돈산이며, 가장 바람직하게는, 디호모 γ-리놀렌산 및 아라키돈산이다.

본 발명에 있어서, "숙주 세포"란 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 도입했을 때 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현할 수 있는 세포라면 특별히 한정되지 않는다. 이러한 세포에는 포유 동물(인간을 제외함), 곤충, 식물, 진균, 세균 등에서 유래되는 세포가 포함되며, 바람직하게는, 식물 및 진균에서 유래되는 세포이고, 특히 바람직하게는 진균에서 유래되는 세포이다. 특히 지질 생산균 또는 효모가 바람직하다.

지질 생산균의 예로는 MYCOTAXON, Vol. XLIV, No. 2, pp. 257-265(1992)에 기재되어 있는 지질 생산균을 들 수 있는데, 이에 한정되지 않는다. 구체적인 예로는, 모르티에렐라속에 속하는 미생물을 들 수 있다. 모르티에렐라속에 속하는 미생물의 구체적인 예로는, 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata) IFO8570, 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) IFO8571, 모르티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila) IFO5941, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS 219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 등의 모르티에렐라아속(subgenus Mortierella)에 속하는 미생물 또는 모르티에렐라 이자벨리나(Mortierella isabellina) CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308, IFO7884, 모르티에렐라 나나(Mortierella nana) IFO8190, 모르티에렐라 라마니아나(Mortierella ramanniana) IFO5426, IFO8186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185, IFO8287, 모르티에렐라 비나세아(Mortierella vinacea) CBS236.82 등의 마이크로뮤코 아속(subgenus Micromucor)에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 특히, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)가 바람직하다.

효모의 구체적인 예로는 사카로마이세스속(Saccharomyces), 칸디다속(Candida), 자이고사카로마이세스속(Zygosaccharomyces), 피치아속(Pichia), 한세뉼라속(Hansenula)을 들 수 있으며, 사카로마이세스속(Saccharomyces)으로는 바람직하게는, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)를 들 수 있다. 그러나, 사카로마이세스 세레비시아 등의 야생주 효모는 그 세포 내에 있어서 주로 탄소수 18 이하의 포화 지방산 또는 1가 불포화 지방산은 합성할 수 있는데, 고도 불포화 지방산은 합성할 수 없다. 따라서, 사카로마이세스 세레비시아 등의 효모를 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 상기 효모 세포는 유전자 재조합 등에 의해 고도 불포화 지방산을 합성하는 능력이 부여되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 고도 불포화 지방산을 합성하는 능력은 이미 고도 불포화 지방산을 합성하는 능력을 갖는 생물에서 유래되는 단백질로서, 지방산 합성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 도입함으로써 부여할 수 있다.

"이미 고도 불포화 지방산을 합성하는 능력을 갖는 생물"의 예로는, 지질 생산균을 들 수 있다. 지질 생산균의 구체적인 예는 앞에서 진술한 바와 같다.

또한, 이미 고도 불포화 지방산을 합성하는 능력을 갖는 생물에서 유래되는 단백질로서, "지방산 합성에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자"의 예로는, Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자, Δ6 지방산 불포화화 효소 유전자, GLELO 지방산 쇄 길이 연장 효소 유전자 및 Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다. Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자, Δ6 지방산 불포화화 효소 유전자, GLELO 지방산 쇄 길이 연장 효소 유전자 및 Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자의 염기 서열은 GenBank 등의 데이터베이스에 액세스함으로써 입수하는 것이 가능하며, 예컨대, GenBank에 있어서는 각각 No. AB020033, No. AB020032, No. AB193123 및 No. AB188307의 등록 번호(accession number)를 입력함으로써 각 서열을 입수할 수 있다.

상기한 지방산 합성 관련 단백질의 유전자는 적절한 벡터(예컨대, pESC(Stratagene) 또는 pYES(Invitrogen) 등)에 삽입한 후에 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)), 아세트산 리튬법(J. Bacteriology, 153, p163(1983)) 및 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 등에 기재된 방법으로 효모에 도입할 수 있다.

지방산은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 형질전환한 숙주 세포로부터 이하와 같이 하여 추출할 수 있다. 숙주 세포에 대해 배양 종료 후 원심 분리법, 여과 등의 통상법을 따라 배양 세포를 얻는다. 세포를 충분히 수세하고, 바람직하게는 건조한다. 건조는 동결 건조, 풍건 등에 의해 수행할 수 있다. 건조 세포를 필요에 따라 다이노밀이나 초음파 등에 의해 파쇄한 후, 바람직하게는 질소 기류 하에서 유기 용매에 의해 추출 처리한다. 유기 용매로는 에테르, 헥산, 메탄올, 에탄올, 클로로포름, 디클로로메탄, 석유 에테르 등을 사용할 수 있고, 또는 메탄올 및 석유 에테르의 교대 추출 또는 클로로포름-메탄올-물의 1층계의 용매를 이용한 추출에 의해서도 양호한 결과를 얻을 수 있다. 추출물로부터 감압 하에서 유기 용매를 증류 제거함으로써 지방산을 함유하는 지질을 얻을 수 있다. 추출한 지방산은 염산 메탄올법 등에 의해 메틸에스테르화할 수도 있다.

또한, 각종 지방산의 양 또는 비율은 상기한 바와 같이 하여 추출한 지방산을 각종 크로마토그래피법으로 분석함으로써 측정할 수 있다. 크로마토그래피법의 예로는 고속 액체 크로마토그래피 및 가스 크로마토그래피를 들 수 있으며, 특히 바람직한 예로서 가스 크로마토그래피를 들 수 있는데, 이에 한정되지 않는다.

3. 본 발명의 벡터 및 이를 도입한 형질전환체

본 발명은 또한 다른 실시 형태에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터는 통상적으로

(i) 숙주 세포 내에서 전사 가능한 프로모터;

(ii) 상기 프로모터에 결합한, 상기 (a) 내지 (g) 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오타이드; 및

(iii) RNA 분자의 전사 종결 및 폴리아데닐화에 관해 숙주 세포 내에서 기능하는 시그널을 구성 요소로서 포함하는 발현 카세트

를 포함하도록 구성된다.

이와 같이 구축되는 벡터는 숙주 세포에 도입된다. 본 발명에 있어서 사용되는 적절한 숙주 세포의 예는 앞에서 진술한 바와 같다.

본 발명의 벡터로 형질전환된 이들 숙주 세포는 본 발명의 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포에 비해 ACS 활성이 증가했거나, 보다 많은 지방산을 생산하거나, 또는 세포 내에 함유되는 각종 지방산의 양 또는 비율이 변화되었다.

지질 생산균에 도입할 때 사용하는 벡터로는, 예컨대, pDura5(Appl. Microbiol. Biotechnol., 65, 419-425, (2004))가 이용 가능한데, 이에 한정되지 않는다.

효모에 도입할 때 사용하는 벡터로는 효모 세포 내에서 인서트를 발현하는 활성을 갖는 벡터라면 특별히 한정되지 않으나, 예로는 pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)을 들 수 있다.

숙주 세포 중에서의 유전자 발현을 조절하기 위한 프로모터/터미네이터로는 숙주 세포 중에서 기능하는 한 임의의 조합일 수도 있다. 예컨대, 지질 생산균에서 이용하는 경우에는 histon H4.1 유전자의 프로모터, 글리세르알데히드-3-인산 데히드로게나제 유전자의 프로모터 등이 이용 가능하다.

형질전환 시에 사용하는 선택 마커로는 영양 요구성 마커(ura5, niaD), 하이그로마이신 내성 유전자, 제오신 내성 유전자, 제네티신 내성 유전자(G418r), 구리 내성 유전자(CUP1)(Marin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984), 셀레닌 내성 유전자(fas2m, PDR4)(각각 이노코시 준지 등, 생화학, 64, 660, 1992; Hussain et al., gene, 101, 149, 1991) 등이 이용 가능하다.

숙주 세포의 형질전환 방법으로는 일반적으로 이용되는 공지의 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, 지질 생산균의 경우, 일렉트로포레이션법(Mackenxie D. A. et al. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4655-4661, 2000)이나 파티클 딜리버리법(일본 특허 공개 2005-287403 "지질 생산균의 육종 방법"에 기재된 방법)을 이용할 수 있다. 또한, 효모의 경우에는, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978)), 아세트산 리튬법(J. Bacteriology, 153, p163(1983)), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 p1929(1978), Methods in yeast genetics, 2000 Edition: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual 등에 기재된 방법으로 실시 가능하나, 이들에 한정되지 않는다.

그 밖에 일반적인 클로닝 기술에 관해서는 "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001", "Methods in Yeast Genetics, A laboratory manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)" 등을 참조할 수 있다.

4. 본 발명의 지질 또는 지방산 조성물의 제조 방법

본 발명은 또한 다른 실시 형태에 있어서, 상기한 형질전환체를 이용하는 지질 또는 지방산 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 명세서에 있어서, "지질"이란 지방산과 알콜이 에스테르 결합한 화합물(예컨대, 글리세라이드) 또는 그 유사체(예컨대, 콜레스테롤 에스테르) 등을 포함하는 단순 지질, 단순 지질의 일부에 인산, 아미노산, 당 등이 더 결합한 복합 지질 및 지질의 가수 분해물로서 물에 녹지 않는 유도 지질을 말하는 것으로 한다.

본 명세서에 있어서, "유지"란 글리세롤과 지방산의 에스테르(글리세라이드)를 말한다.

"지방산"에 대해서는 앞에서 기재한 바와 같다.

본 발명의 지질 또는 지방산 조성물의 추출 방법은 앞에서 진술한 지방산의 추출 방법과 동일하다.

지방산을 함유하는 지질로부터의 지방산의 분리는 혼합 지방산 또는 혼합 지방산 에스테르의 상태에서 통상법(예컨대, 우레아 부가법, 냉각 분리법, 칼럼 크로마토그래피법 등)에 의해 농축 분리함으로써 수행할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조되는 지질은, 바람직하게는 불포화 지방산이며, 더욱 바람직하게는, 고도 불포화 지방산을 포함한다. 고도 불포화 지방산의 바람직한 예로는, 탄소수 18 이상의 불포화 지방산, 예컨대, 탄소수 18 또는 20의 불포화 지방산이며, 그 예로는 올레인산, 리놀레산, 리놀렌산(γ-리놀렌산 및 디호모 γ-리놀렌산 등), 아라키돈산 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다. 특히 바람직하게는, 고도 불포화 지방산은 리놀레산, γ-리놀렌산, 디호모 γ-리놀렌산 및 아라키돈산이고, 보다 바람직하게는 리놀레산, 디호모 γ-리놀렌산 및 아라키돈산이며, 가장 바람직하게는 디호모 γ-리놀렌산 및 아라키돈산이다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 생성되는 지질 및 상기 지질에 포함되는 지방산의 조성은 상기한 지질의 추출 방법, 지방산의 분리 방법 또는 이들의 조합에 의해 확인할 수 있다.

본 발명의 제조 방법에 의해 얻어진 지질 또는 지방산 조성물은 통상법을 따라, 예컨대, 유지를 포함하는 식품, 의약품, 공업 원료(화장료, 비누 등의 원료)의 제조 등의 용도에 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명의 형질전환체를 이용하는 식품, 화장료, 의약, 비누 등의 제조 방법을 제공한다. 이 방법은 본 발명의 형질전환체를 이용하여 지질 또는 지방산을 생성하는 공정을 포함한다. 생성된 지질 또는 지방산을 함유하는 식품, 화장료, 의약, 비누 등의 조제는 통상법에 의한다. 이와 같이 본 발명의 제조 방법에 의해 제조된 식품, 화장료, 의약, 비누 등은 본 발명의 형질전환체를 이용하여 생성된 지질 또는 지방산을 함유한다. 본 발명은 나아가, 그러한 방법에 의해 제조된 식품, 화장료, 의약, 비누 등을 제공한다.

본 발명의 화장품(조성물) 또는 의약품(조성물)의 제형은 특별히 한정되지 않으며, 용액형, 페이스트형, 겔형, 고체형, 분말형 등 임의의 제형을 취할 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물 또는 의약 조성물은 오일, 로션, 크림, 유액, 젤, 샴푸, 헤어 린스, 헤어 컨디셔너, 에나멜, 파운데이션, 립스틱, 분, 팩, 연고, 향수, 파우더, 오데코롱, 치약, 비누, 에어로졸, 클렌징 폼 등의 화장료 또는 피부 외용약 이외에 피부 노화 방지 개선제, 피부 염증 방지 개선제, 목욕용제, 양모제, 피부 미용액, 썬스크린제 혹은 외상, 살틈, 손발 갈라짐 등으로 인한 피부 거칠음의 방지 개선제 등에 이용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 필요에 따라 그 밖의 유지 및/또는 색소, 향료, 방부제, 계면 활성제, 안료, 산화 방지제 등을 적당히 더 배합할 수 있다. 이들의 배합 비율은 목적에 따라 당업자가 적당히 결정할 수 있다(예컨대, 유지는 조성물 중에 1 내지 99.99 중량%, 바람직하게는 5 내지 99.99 중량%, 보다 바람직하게는 10 내지 99.95 중량% 함유될 수 있다). 또한, 본 발명의 의약 조성물은 필요에 따라 그 밖의 의약 활성 성분(예컨대, 소염 성분) 또는 보조 성분(예컨대, 윤활 성분, 담체 성분)을 더 포함하고 있을 수도 있다. 예컨대, 화장료 혹은 피부 외용약에 있어서 그 밖의 상용 성분으로는 여드름용 약제, 비듬 및 가려움 방지제, 제한 방취제, 열상용 약제, 진드기·이 방지제, 각질 연화제, 건피증용 약제, 항바이러스제, 경피 흡수 촉진제 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품의 예로는 영양 보조 식품, 건강 식품, 기능성 식품, 유아용 식품, 유아용 조제유, 미숙아용 조제유, 노인용 식품 등을 들 수 있다. 본 명세서에 있어서, 식품은 고체, 유동체 및 액체, 그리고 이들의 혼합물로서 섭식 가능한 것의 총칭이다.

영양 보조 식품이란 특정 영양 성분이 강화되어 있는 식품을 말한다. 건강 식품이란 건강적인 또는 건강에 좋다고 하는 식품을 말하며, 영양 보조 식품, 자연 식품, 다이어트 식품 등을 포함한다. 기능성 식품이란 몸의 조절 기능을 하는 영양 성분을 보급하기 위한 식품을 말하며, 특정 보건 용도 식품과 동일한 의미이다. 유아용 식품이란 약 6세까지의 아이에게 제공하기 위한 식품을 말한다. 노인용 식품이란 무처리 식품과 비교하여 소화 및 흡수가 용이하도록 처리된 식품을 말한다. 유아용 조제유란 약 1세까지의 아이에게 제공하기 위한 조제유를 말한다. 미숙아용 조제유란 미숙아가 생후 약 6개월이 될 때까지 제공하기 위한 조제유를 말한다.

이들 식품의 형태의 예로는, 고기, 생선, 너츠 등의 천연 식품(유지로 처리한 것), 중화 요리, 라면, 스프 등의 조리시에 유지를 가하는 식품, 튀김, 후라이, 유부, 볶음밥, 도넛, 조청유과 등의 열 매체로서 유지를 이용한 식품, 버터, 마가린, 마요네즈, 드레싱, 초콜릿, 즉석 라면, 카라멜, 비스킷, 쿠키, 케익, 아이스크림 등의 유지 식품 또는 가공시에 유지를 가한 가공 식품, 오가키, 하드 비스킷, 팥빵 등의 가공 마무리시에 유지를 분무 또는 도포한 식품 등을 들 수 있다. 그러나, 유지를 포함하는 식품에 한정되는 것은 아니며, 예컨대, 빵, 면류, 밥, 과자류(캔디, 츄잉검, 구미, 정과, 화과자), 두부 및 그 가공품 등의 농산식품, 청주, 약용주, 미림, 식초, 간장, 된장 등의 발효 식품, 요구르트, 햄, 베이컨, 소시지 등의 축산 식품, 어묵, 어묵튀김, 한펜 등의 수산 식품, 과즙 음료, 청량 음료, 스포츠 음료, 알콜 음료, 차 등일 수도 있다.

본 발명의 식품은 또한 캡슐 등의 의약 제제의 형태, 또는 단백질, 당류, 지방, 미량 원소, 비타민류, 유화제, 향료 등에 본 발명의 유지가 배합된 자연 유동식, 반소화태 영양식 및 성분 영양식, 드링크제, 경장 영양제 등의 가공 형태일 수도 있다.

이상에 기재하는 바와 같이, 본 발명의 ACS 호몰로그의 유전자를 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써 효율적으로 지방산을 생성시키는 것이 가능하다.

또한, 상기 유전자의 발현량을 지표로 하여 지방산 생산을 효율적으로 수행하기 위한 배양 조건의 검토, 배양 관리 등에도 이용할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 한정되지 않는다.

[실시예 1] 모르티에렐라 알피나( Mortierella alpina )의 게놈 해석

M. alpina 1S-4주를 100ml의 GY2:1 배지(2% 글루코오스, 1% 효모 엑기스 pH 6.0)에 식균하고, 28℃에서 2일간 진탕 배양했다. 여과에 의해 균체를 집균하고, DNeasy(QIAGEN)를 이용하여 게놈 DNA를 조제했다. 상기 게놈 DNA의 염기 서열을 Roche 454 GS FLX Standard를 이용하여 결정했다. 그 때, 프래그먼트 라이브러리의 염기 서열 결정을 2런분, 메이트 페어 라이브러리의 염기 서열 결정을 3런분 수행했다. 얻어진 염기 서열을 어셈블리함으로써 300개의 Super Contig가 얻어졌다.

cDNA의 합성과 cDNA 라이브러리의 제작

M. alpina 1S-4주를 100ml의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0)에 식균하고, 3일간 28℃에서 전배양했다. 10L 배양조(Able Co., 도쿄)에 5L의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 대두 가루, 0.1% 올리브유, 0.01% 아데카놀, 0.3% KH₂PO₄, 0.1% Na₂SO₄, 0.05% CaCl₂·2H₂O, 0.05% MgCl₂·6H₂O, pH 6.0)를 넣고, 전배양물을 전량 식균하고, 300rpm, 1vvm, 26℃의 조건에서 8일간 통기 교반 배양했다. 배양 1, 2 및 3일째에 각각 2%, 2% 및 1.5% 상당의 글루코오스를 첨가했다. 배양 1, 2, 3, 6 및 8일째의 각 스테이지에 균체를 회수하고, 염산 구아니딘/CsCl법으로 총 RNA를 조제했다. Oligotex-dT30 <Super> mRNA Purification Kit(Takara Bio Inc.)를 이용하여 총 RNA로부터 poly(A)+RNA의 정제를 수행했다. 각 스테이지의 cDNA 라이브러리를 ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)를 이용하여 제작했다.

ACS 호몰로그의 탐색

효모의 ACS인 ScFAA1(YOR317W), ScFAA2(YER015W), ScFAA3(YIL009W), ScFAA4(YMR246W), ScFAT1(YBR041W), ScFAT2(YBR222C)의 아미노산 서열을 query 서열로 하여 M. alpina 1S-4의 게놈 염기 서열에 대해 tblastn 검색을 수행했다. 그 결과, 12종류의 서열이 히트되었다. 즉, 서열 번호 5, 서열 번호 10, 서열 번호 15, 서열 번호 20, 서열 번호 25, 서열 번호 30, 서열 번호 35, 서열 번호 40, 서열 번호 45, 서열 번호 50, 서열 번호 55, 서열 번호 60의 서열을 포함하는 Super Contig가 히트되었다. 서열 번호 5에 따른 유전자를 MaACS-1, 서열 번호 10에 따른 유전자를 MaACS-2, 서열 번호 15에 따른 유전자를 MaACS-3, 서열 번호 20에 따른 유전자를 MaACS-4, 서열 번호 25에 따른 유전자를 MaACS-5, 서열 번호 30에 따른 유전자를 MaACS-6, 서열 번호 35에 따른 유전자를 MaACS-7, 서열 번호 40에 따른 유전자를 MaACS-8, 서열 번호 45에 따른 유전자를 MaACS-9, 서열 번호 50에 따른 유전자를 MaACS-10, 서열 번호 55에 따른 유전자를 MaACS-11, 서열 번호 60에 따른 유전자를 MaACS-12로 했다.

ACS 호몰로그의 클로닝

MaACS-1 내지 12의 유전자에 대응하는 cDNA를 클로닝하기 위해, 상기 cDNA 라이브러리의 스크리닝을 수행했다. 또한, 프로브의 라벨링은 ExTaq(Takara Bio Inc.)를 이용한 PCR에 의해 수행했다. 즉, ExTaq에 첨부된 dNTP 믹스 대신 PCR 라벨링 믹스(Roche Diagnositcs)를 이용하여 증폭되는 DNA를 디곡시제닌(DIG) 라벨한 프로브를 제작했다.

하이브리다이제이션의 조건은 다음과 같다.

버퍼: 5×SSC, 1% SDS, 50mM Tris-HCl(pH7.5), 50% 포름아미드;

온도: 42℃(하룻밤);

세정 조건: 0.2×SSC, 0.1% SDS 용액 중(65℃)에서 20분간×3회;

검출은 DIG 핵산 검출 키트(Roche Diagnositcs)를 이용하여 수행했다. 스크리닝에 의해 얻어진 파지 클론으로부터 인비보 엑시전에 의해 플라스미드를 잘라내어 각 플라스미드 DNA를 얻었다.

이하에 각 유전자의 스크리닝에 사용한 프로브 제작용 프라이머, 얻어진 각 유전자의 CDS의 염기수, CDS의 염기 서열로부터 유도되는 아미노산 서열의 아미노산 수 및 게놈 DNA 서열과 CDS 서열의 비교에 따른 엑손, 인트론의 수를 기재한다.

서열 해석

M. alpina 유래의 12종류의 ACS 호몰로그의 CDS 염기 서열간의 동일성을 표 1에, 아미노산 서열간의 동일성을 표 2에 나타냈다. MaACS-11과 MaACS-12는 염기 서열에서 80.2%, 아미노산 서열에서 84.3%로 높은 동일성을 나타냈다.

MaACS-1 내지 12의 CDS 서열의 추정 아미노산 서열을 query 서열로 하여, GenBank에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대해 BLASTp 검색을 수행했다. MaACS-1 내지 12의 추정 아미노산 서열과 가장 높은 스코어로 히트한 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 아미노산 서열과 MaACS-1 내지 12의 추정 아미노산 서열과의 동일성을 표 3에 나타냈다. 또한, S. cerevisiae 유래의 아실CoA 신세타제의 아미노산 서열에 대한 MaACS-1 내지 12의 추정 아미노산 서열의 동일성을 표 4에 나타냈다.

또한, MaACS-1 내지 12 중 S.cerevisiae 유래의 FAA 단백질과 비교적 높은 아미노산 서열의 상동성을 갖는 MaACS와 상기 FAA 단백질과의 얼라인먼트를 도 25에 나타냈다. 또한 S. cerevisiae 유래의 FAT 단백질과 비교적 높은 아미노산 서열의 상동성을 갖는 ACS 호몰로그의 얼라인먼트를 도 26에 나타냈다. 도 25 및 도 26에 나타낸 어느 그룹의 ACS 호몰로그도 ACS 활성에 중요한 모티브인 ATP-AMP 모티브와 FACS/VLACS-FATP 모티브의 영역이 고도로 보존되어 있다.

발현 벡터의 구축

효모 발현용 벡터 pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)을 이용하여 이하와 같이 MaACS-1, MaACS-10, MaACS-11, MaACS-6, MaACS-8, MaACS-9를 각각 효모에서 발현시키기 위한 벡터를 구축했다.

MaACS-6을 스크리닝하여 얻어진 서열 번호 29를 포함하는 플라스미드를 제한 효소 BamHI 및 XhoI로 소화하고, 얻어진 약 2.1kbp의 DNA 단편과 벡터 pYE22m을 제한 효소 BamHI 및 SalI로 소화한 DNA 단편을 ligation high(TOYOBO)를 이용하여 연결함으로써 플라스미드 pYE-ACS-6을 얻었다.

MaACS-8의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하고, 이하의 프라이머를 사용하여 ExTaq(Takara Bio Inc.)를 이용한 PCR 증폭에 의해 얻어진 DNA 단편을 TOPO-TA cloning Kit(Invitrogen)로 클론화했다.

인서트 부분의 염기 서열을 확인하고, 올바른 염기 서열을 갖는 플라스미드를 제한 효소 EcoRI 및 SmaI로 소화하여 얻어진 약 2.1kbp의 DNA 단편과 벡터 pYE22m을 제한 효소 EcoRII 및 SmaI로 소화한 DNA 단편을 ligation high(TOYOBO)를 이용하여 연결함으로써 플라스미드 pYE-ACS-8을 얻었다.

MaACS-9의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하고, 이하의 프라이머를 사용하여 ExTaq(Takara Bio Inc.)를 이용한 PCR 증폭에 의해 얻어진 DNA 단편을 TOPO-TA cloning Kit(Invitrogen)로 클론화했다.

인서트 부분의 염기 서열을 확인하고, 올바른 염기 서열을 갖는 플라스미드를 제한 효소 EcoRI 및 BamHI로 소화하여 얻어진 약 2.0kbp의 DNA 단편과 벡터 pYE22m을 제한 효소 EcoRII 및 BamHI로 소화한 DNA 단편을 ligation high(TOYOBO)를 이용하여 연결함으로써 플라스미드 pYE-ACS-9를 얻었다.

MaACS-1의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하고, 이하의 프라이머를 사용하여 ExTaq(Takara Bio Inc.)를 이용한 PCR 증폭에 의해 얻어진 DNA 단편을 TOPO-TA cloning Kit(Invitrogen)로 클론화했다.

인서트 부분의 염기 서열을 확인하고, 올바른 염기 서열을 갖는 플라스미드를 제한 효소 EcoRI 및 SalI로 소화하여 얻어진 약 1.9kbp의 DNA 단편과 벡터 pYE22m을 제한 효소 EcoRI 및 SalI로 소화한 DNA 단편을 ligation high(TOYOBO)를 이용하여 연결함으로써 플라스미드 pYE-ACS-1을 얻었다.

MaACS-10의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하고, 이하의 프라이머를 사용하여 ExTaq(Takara Bio Inc.)를 이용한 PCR 증폭에 의해 얻어진 DNA 단편을 TOPO-TA cloning Kit(Invitrogen)로 클론화했다.

인서트 부분의 염기 서열을 확인하고, 올바른 염기 서열을 갖는 플라스미드를 제한 효소 EcoRI 및 KpnI로 소화하여 얻어진 약 2.1kpb의 DNA 단편과 벡터 pYE22m을 제한 효소 EcoRI 및 KpnI로 소화한 DNA 단편을 ligation high(TOYOBO)를 이용하여 연결하여 MaACS-10의 CDS의 5' 측에 벡터 pYE22m의 GAPDH 프로모터가 있는 방향으로 연결된 것을 선택함으로써 플라스미드 pYE-ACS-10을 얻었다.

MaACS-11의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하고, 이하의 프라이머를 사용하여 ExTaq(Takara Bio Inc.)를 이용한 PCR 증폭에 의해 얻어진 DNA 단편을 TOPO-TA cloning Kit(Invitrogen)로 클론화했다.

인서트 부분의 염기 서열을 확인하고, 올바른 염기 서열을 갖는 플라스미드를 제한 효소 SacI 및 BamHI로 소화하여 얻어진 약 2.0kbp의 DNA 단편과 벡터 pYE22m을 제한 효소 SacI 및 BamHI로 소화한 DNA 단편을 ligation high(TOYOBO)를 이용하여 연결함으로써 플라스미드 pYE-ACS-11을 얻었다.

효모에서의 발현

형질전환주의 취득

플라스미드 pYE22m, pYE-MaACS-6, pYE-MaACS-8, pYE-MaACS-9를 각각 이용하여 아세트산 리튬법에 의해 효모 S. cerevisiae EH13-15주(trp1, MATα)(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)를 형질전환했다. 형질전환주는 SC-Trp(1 l당 Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7g, 글루코오스 20g 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25g, 아르기닌 0.6g, 아스파라긴산 3g, 글루타민산 3g, 히스티딘 0.6g, 로이신 1.8g, 리신 0.9g, 메티오닌 0.6g, 페닐알라닌 1.5g, 세린 11.25g, 티로신 0.9g, 발린 4.5g, 트레오닌 6g, 우라실 0.6g을 혼합한 것) 1.3g) 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것을 기준으로 선발했다.

효모의 배양

각각의 플라스미드를 이용하여 형질전환하여 얻어진 임의의 1주씩을 이하의 배양 실험에 제공했다.

전배양으로서 SC-Trp 배지 10ml에 효모를 플레이트로부터 1백금이 식균하고, 30℃에서 1일간 진탕 배양을 수행했다. 본배양은 SC-Trp 배지에 전배양액을 1ml 첨가하고 30℃에서 1일간 진탕 배양을 수행했다.

균체의 지방산 분석

효모의 배양액을 원심 분리함으로써 균체를 회수했다. 10ml의 멸균수로 세정하고, 원심 분리에 의해 다시 균체를 회수하여 동결 건조했다. 염산 메탄올법에 의해 균체의 지방산을 메틸에스테르에 유도한 후, 헥산으로 추출, 헥산을 증류 제거하고 가스 크로마토그래피에 의해 분석을 수행했다.

배지 당 지방산 생산량을 표 5에 나타냈다. pYE22m로 형질전환한 컨트롤과 비교하여 ppYE-MaACS-6, pYE-MaACS-8 또는 pYE-MaACS-9로 형질전환한 주에서는 배지 당 지방산 생산량이 상승되어 있었다.

아라키돈산 생산 효모에서의 발현

(1) 아라키돈산 효모의 육종

아라키돈산 생산 효모(S. cerevisiae)를 육종하기 위해 이하의 플라스미드를 구축했다.

먼저, M. alpina 1S-4주로부터 조제한 cDNA를 주형으로 하고, 이하의 프라이머 Δ12-f 및 Δ12-r, Δ6-f 및 Δ6-r, GLELO-f 및 GLELO-r 또는 Δ5-f 및 Δ5-r의 조합에 의해 ExTaq를 이용하여 PCR을 수행하고, M. alpina 1S-4주의 Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자(GenBank accession No. AB020033)(이하, "Δ12 유전자"), Δ6 지방산 불포화화 효소 유전자(GenBank accession No.AB020032)(이하, "Δ6 유전자"), GLELO 지방산 쇄 길이 연장 효소 유전자(GenBank accession No. AB193123)(이하, "GLELO 유전자") 및 Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자(GenBank accession No. AB188307)(이하, "Δ5 유전자")를 증폭했다.

이들을 TOPO-TA-cloning Kit에 의해 클론화했다. 염기 서열을 확인하고, Δ12 유전자, Δ6 유전자, GLELO 유전자 및 Δ5 유전자의 염기 서열을 포함하는 클론을 각각 플라스미드 pCR-MAΔ12DS(Δ12 유전자의 염기 서열을 포함함), pCR-MAΔ6DS(Δ6 유전자의 염기 서열을 포함함), pCR-MAGLELO(GLELO 유전자의 염기 서열을 포함함), pCR-MAΔ5DS(Δ5 유전자의 염기 서열을 포함함)로 했다.

한편, 플라스미드 pURA34(일본 특허 공개 2001-120276)를 제한 효소 HindIII로 소화하여 얻어진 약 1.2kb의 DNA 단편을 벡터 pUC18(Takara Bio Inc.)을 제한 효소 EcoRI와 SphI로 소화한 후 말단을 평활화하고, 셀프 라이게이션하여 얻어진 벡터의 HindIII 사이트에 삽입하고, 벡터의 EcoRI 사이트 측이 URA3의 5' 측인 클론을 pUC-URA3으로 했다. 또한, YEp13을 제한 효소 SalI와 XhoI로 소화하여 얻어진 약 2.2kb의 DNA 단편을 벡터 pUC18의 SalI 사이트에 삽입하고, 벡터의 EcoRI 측이 LUE2의 5' 측인 클론을 pUC-LEU2로 했다.

다음, 플라스미드 pCR-MAΔ12DS를 제한 효소 HindIII로 소화한 후에 말단을 평활화한 것을 제한 효소 XbaI로 소화하여 얻어진 약 1.2kbp의 DNA 단편과 벡터 pESC-URA(STRATAGENE)를 제한 효소 SacI로 소화한 후에 말단을 평활화한 것을 제한 효소 SpeI로 소화한 약 6.6kbp의 DNA 단편을 연결하여 플라스미드 pESC-U-Δ12를 얻었다. 플라스미드 pCR-MAΔ6DS를 제한 효소 XbaI로 소화한 후에 말단을 평활화한 것을 제한 효소 HindIII으로 소화하여 얻어진 약 1.6kbp의 DNA 단편과 플라스미드 pESC-U-Δ12를 제한 효소 SalI로 소화한 후에 말단을 평활화한 것을 제한 효소 HindIII으로 소화한 약 8kbp의 DNA 단편을 연결하여 플라스미드 pESC-U-Δ12:Δ6을 얻었다. 이것을 제한 효소 PvuII로 부분 소화하여 얻어진 약 4.2kb의 단편을 pUC-URA3의 SmaI 사이트에 삽입하여 플라스미드 pUC-URA-Δ12:Δ6을 얻었다.

또한, 플라스미드 pCR-MAGLELO를 제한 효소 XbaI와 SacI로 소화하여 얻어진 약 0.95kbp의 DNA 단편과 벡터 pESC-LEU(STRATAGENE)를 제한 효소 XbaI와 SacI로 소화하여 얻어진 약 7.7kbp의 DNA 단편을 연결하여 플라스미드 pESC-L-GLELO를 얻었다. 플라스미드 pCR-MAΔ5DS를 제한 효소 XbaI로 소화한 후에 말단을 평활화한 것을 제한 효소 HindIII으로 소화하여 얻어진 약 1.3kbp의 DNA 단편과 플라스미드 pESC-L-GLELO를 제한 효소 ApaI로 소화한 후에 말단을 평활화한 것을 제한 효소 HindIII으로 소화하여 얻어진 약 8.7kbp의 DNA 단편을 연결하여 플라스미드 pESC-L-GLELO:Δ5를 얻었다. 이것을 제한 효소 PvuII로 소화하여 얻어진 약 3.2kbp 단편을 pUC-LEU2의 SmaI 사이트에 삽입하여 플라스미드 pUC-LEU-GLELO:Δ5를 얻었다. 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) YPH499주(STRATAGENE)를 플라스미드 pUC-URA-Δ12:Δ6과 플라스미드 pUC-LEU-GLELO:Δ5로 동시형질전환(co-transformation)했다. 형질전환주는 SC-Leu, Ura 한천 배지 상에서 생육하는 것을 기준으로 선발했다. 이와 같이 하여 얻어진 주 중 임의의 1주를 ARA3-1주로 했다. 이 주는 갈락토스를 포함하는 배지에서 배양함으로써 GAL1/10 프로모터로부터 Δ12 지방산 불포화화 효소 유전자, Δ6 지방산 불포화화 효소 유전자, GLELO 유전자, Δ5 지방산 불포화화 효소 유전자를 발현시킬 수 있다.

(2) 아라키돈산 생산 효모에의 형질전환과 해석

ARA3-1주를 플라스미드 pYE22m, pYE-ACS-1, pYE-ACS-10, pYE-ACS-11로 각각 형질전환했다. 형질전환주는 SC-Trp, Leu, Ura(1L 당 Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO) 6.7g, 글루코오스 20g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25g, 아르기닌 0.6g, 아스파라긴산 3g, 글루타민산 3g, 히스티딘 0.6g, 리신 0.9g, 메티오닌 0.6g, 페닐알라닌 1.5g, 세린 11.25g, 티로신 0.9g, 발린 4.5g, 트레오닌 6g을 혼합한 것) 1.3g) 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것을 기준으로 선발했다. 각각의 플라스미드 도입주 중에서 임의의 4주를 이하의 배양 실험에 사용했다.

이들 주를 상기 SC-Trp, Leu, Ura 액체 배지 10ml에서 30℃, 1일간 배양했다. 그 중 1ml를 SG-Trp, Leu, Ura(1L 당 Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO) 6.7g, 갈락토스 20g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25g, 아르기닌 0.6g, 아스파라긴산 3g, 글루타민산 3g, 히스티딘 0.6g, 리신 0.9g, 메티오닌 0.6g, 페닐알라닌 1.5g, 세린 11.25g, 티로신 0.9g, 발린 4.5g, 트레오닌 6g을 혼합한 것) 1.3g) 액체 배지 10ml에 식균하고, 15℃, 6일간 배양했다. 집균하고 수세한 후 동결 건조했다. 염산 메탄올법에 의해 건조 균체 내의 지방산을 메틸에스테르에 유도하고 가스 크로마토그래피에 의해 지방산 분석을 수행했다. 플라스미드 pYE22m으로 형질전환한 컨트롤주 및 모르티에렐라 유래의 각 ACS 호몰로그로 형질전환한 주의 총 지방산에 대한 각 PUFA의 조성비를 표 6에 나타냈다.

표 6에 나타낸 바와 같이, 모르티에렐라 유래의 ACS 호몰로그를 발현시킴으로써 지방산의 조성을 개변시킬 수 있었다. 특히, MaACS-11 발현주에서는 컨트롤주에 비해 아라키돈산의 조성비가 약 1.8배, 리놀레산은 약 1.5배, γ-리놀렌산은 2.4배로 증가해 있었다. 또한, MaACS-1 발현주에서는 컨트롤주에 비해 아라키돈산량은 약 1.5배로 증가해 있었다. 나아가, MaACS-10 발현주에서는 컨트롤주와 비교하여 리놀레산은 약 2배, γ-리놀렌산은 약 4배로 증가해 있었다.

[실시예 2] 발현 벡터의 구축

효모용 발현 벡터

MaACS-12를 효모에서 발현시키기 위한 벡터 pYE-ACS-12를 이하와 같이 구축했다. MaACS-12의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하여,

를 사용하여 KOD-plus-(TOYOBO)를 이용한 PCR로 증폭한 DNA 단편을 Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(인비트로젠)로 클론화했다. 인서트 부분의 염기 서열을 확인하고, 올바른 염기 서열을 갖는 플라스미드를 제한 효소 EcoRI와 SmaI로 소화하여 얻어진 약 2kbp의 DNA 단편과 벡터 pYE22m을 제한 효소 BamHI로 소화한 후 Blunting Kit(TAKARA 바이오)를 이용하여 말단을 평활화하고, 계속해서 EcoRI로 소화한 DNA 단편을 Ligation High(TOYOBO)를 이용하여 연결하여 플라스미드 pYE-ACS-12를 얻었다.

M. alpina용 발현 벡터

MaACS-10과 MaACS-11을 M. alpina에서 발현시키기 위해 이하와 같이 벡터를 구축했다.

먼저, 벡터 pUC18을 제한 효소 EcoRI와 HindIII으로 소화하고, 올리고 DNA MCS-for-pUC18-F2와 MCS-for-pUC18-R2를 어닐링시킨 어댑터를 삽입하고, 플라스미드 pUC18-RF2를 구축했다.

M. alpina의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 Not1-GAPDHt-F와 프라이머 EcoR1-Asc1-GAPDHt-R을 사용하여 KOD-plus-(TOYOBO)를 이용한 PCR로 증폭한 약 0.5kbp의 DNA 단편을 Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(인비트로젠)로 클론화했다. 인서트 부분의 염기 서열을 확인한 후, 제한 효소 NotI와 EcoRI로 소화하여 얻어진 약 0.9kbp의 DNA 단편을 플라스미드 pUC18-RF2의 NotI 및 EcoRI 사이트에 삽입하여 플라스미드 pDG-1을 구축했다.

M. alpina의 게놈을 주형으로 하고, 프라이머 URA5g-F1과 프라이머 URA5g-R1을 사용하여 KOD-plus-(TOYOBO)를 이용한 PCR로 증폭한 DNA 단편을 Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(인비트로젠)로 클론화했다. 인서트 부분의 염기 서열을 확인한 후, 제한 효소 SalI로 소화하여 얻어진 약 2kbp의 DNA 단편을 플라스미드 pDG-1의 SalI 사이트에 삽입하고, URA5 유전자의 5' 측이 벡터의 EcoRI 측이 되는 방향으로 삽입된 것을 플라스미드 pDuraG로 했다.

계속해서, M. alpina의 게놈을 주형 프라이머 hisHp+URA5-F와 프라이머 hisHp+MGt-F를 사용하여 KOD-plus-(TOYOBO)를 이용한 PCR로 증폭한 약 1.0kbp의 DNA 단편과, pDuraG를 주형으로 하고 프라이머 pDuraSC-GAPt-F와 프라이머 URA5gDNA-F를 사용하여 KOD-plus-(TOYOBO)를 이용한 PCR로 증폭한 약 5.3kbp의 DNA 단편을 In-Fusion(등록 상표) Advantage PCR Cloning Kit(TAKARA 바이오)를 사용하여 연결하여 플라스미드 pDUra-RhG를 얻었다.

플라스미드 pDUra-RhG를 주형으로 하고, 프라이머 pDuraSC-GAPt-F와 프라이머 pDurahG-hisp-R을 사용하여 KOD-plus-(TOYOBO)를 이용한 PCR로 약 6.3kbp의 DNA 단편을 증폭했다.

MaACS-10의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하여

을 사용하여 KOD-plus-(TOYOBO)를 이용한 PCR로 약 2.1kbp의 DNA 단편을 증폭했다. 얻어진 단편을, 상기 6.3kbp의 DNA 단편과 In-Fusion(등록 상표) Advantage PCR Cloning Kit(다카라 바이오)를 사용하여 연결하여 플라스미드 pDUraRhG-ACS-10을 얻었다.

MaACS-11의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 주형으로 하여,

를 사용하여 KOD-plus-(TOYOBO)를 이용한 PCR로 약 2.1kbp의 DNA 단편을 증폭했다.

얻어진 단편을 상기 6.3kbp의 DNA 단편과 In-Fusion(등록 상표) Advantage PCR Cloning Kit(TAKARA 바이오)를 사용하여 연결하여 플라스미드 pDUraRhG-ACS-11을 얻었다.

ACS 활성의 평가

플라스미드 pYE22m, pYE-ACS-5, pYE-ACS-8, pYE-ACS-10, pYE-ACS-11, pYE-ACS-12로 효모 EH13-15를 각각 형질전환하여 얻어진 임의의 2주를 이하와 같이 배양했다. 전배양으로서 SC-Trp 배지 10ml에 균체를 1백금이 식균하고, 30℃, 1일 진탕 배양했다. 본배양으로서 SD-Trp 배지 100ml에 전배양액을 1% 식균하고, 28℃에서 1일 진탕 배양했다.

조효소액의 조제는 이하와 같이 수행했다. 원심 분리로 집균 후 수세하고, -80℃에서 균체를 일시적으로 보존했다. 균체를 Buffer B(50mM 인산나트륨 buffer(pH 6.0), 10% 글리세롤, 0.5mM PMSF) 5ml에 현탁하고, 프렌치 프레스(16kPa, 3회)로 균체를 파쇄했다. 1,500xg, 4℃에서 10분간 원심 분리하고, 얻어진 상청을 조효소액으로 했다.

ACS 활성의 측정은 참고 문헌(J.B.C., 272(8), 1896-4903, 1997)의 기재를 따라 이하의 순서로 수행했다. 반응액은 200mM Tris-HCl(pH7.5), 2.5mM ATP, 8mM MgCl₂, 2mM EDTA, 20mM NaF, 0.1% Triton X-100, 지방산 50μg/ml, 50μM CoA, 조효소액(적당히 버퍼 B로 희석) 100μl를 포함하며, 이것을 전량 500μl로 하여 28℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후 정지액(이소프로판올 : n-헵탄 : 1M 황산(40 : 20 : 1)) 2.5ml를 첨가하고 잘 교반했다. 또한, n-헵탄 2ml를 첨가하고 잘 교반한 후 원심 분리하여 상층을 회수했다. 하층에 2ml의 n-헵탄을 더 가하고, 동일한 방법으로 상층을 회수했다. 회수한 상층을 합하고, 원심 농축기로 건고시킨 후, 내부 표준으로서 0.2mg/ml의 트리코산산(23:0)을 50μl 첨가하고, 염산 메탄올법에 의해 지방산을 메틸에스테르에 유도하고, 가스 크로마토그래피에 의해 지방산 분석을 수행했다. 검출된 지방산량으로부터 아실-CoA로 되었기 때문에 상기 조작으로 하층에 분배된 지방산량을 산출했다. 이하의 표에 결과를 나타냈다. 또한, ACS 활성은 조효소액의 단백질량 당, 상기 조작으로 하층에 분배된 지방산량으로서 나타내었다. 컨트롤이란 pYE22m으로 형질전환한 주로서, 그 밖에는 각각의 유전자의 발현 벡터를 도입한 주이다.

팔미틴산을 기질로 한 경우, MaACS-5, MaACS-10, MaACS-11, MaACS-12는 컨트롤의 2 내지 4배 정도의 ACS 활성을 나타냈다.

올레인산을 기질로 한 경우, MaACS-10, MaACS-11, MaACS-12는 컨트롤의 2배 정도의 ACS 활성을 나타냈다.

리놀레산을 기질로 한 경우, MaACS-5, MaACS-8, MaACS-12는 컨트롤의 수 배(각각 3배, 3배, 6배 정도)의 ACS 활성을 나타낸 데 반해, MaACS-10과 MaACS-11은 컨트롤의 수십 배(각각 40배, 20배 정도)의 ACS 활성을 나타냈다.

γ-리놀렌산을 기질로 한 경우, MaACS-5, MaACS-8, MaACS-10, MaACS-11, MaACS-12는 모두 컨트롤의 2 내지 10배 정도의 ACS 활성을 나타냈다.

디호모 γ-리놀렌산을 기질로 한 경우, MaACS-10, MaACS-11, MaACS-12는 모두 컨트롤의 수십 배(각각 60배, 40배, 30배) 정도의 ACS 활성을 나타냈다.

아라키돈산을 기질로 한 경우, MaACS-10, MaACS-11, MaACS-12는 수십 배(각각 90배, 30배, 10배) 정도의 활성을 나타냈다.

이와 같이 특히 MaACS-10, MaACS-11, MaACS-12는 디호모γ-리놀렌산이나 아라키돈산 등 탄소수 20의 고도 불포화 지방산에 대한 활성이 높았다.

ACS를 발현시킨 효모의 아라키돈산 취입 활성

플라스미드 pYE22m, pYE -ACS-10, pYE -ACS-11, pYE -ACS-12로 효모 EH13-15를 각각 형질전환하여 얻어진 임의의 2주를 이하와 같이 배양했다. 전배양으로서 SC-Trp 10ml에 1백금이 식균하고, 30℃, 1일간 진탕 배양했다. 본배양으로서 SC-Trp에 50μg/ml가 되도록 아라키돈산을 첨가한 배지 10ml에 전배양의 배양물을 100μl 첨가하고, 25℃, 1일 진탕 배양했다. 집균 후 동결 건조하고, 지방산 분석하고, 첨가한 아라키돈산 중 균체 내에 취입된 아라키돈산의 비율을 구했다. 결과를 표 14에 나타내었다. 컨트롤이란 pYE22m로 형질전환한 주로서, 그 이외는 각각의 유전자의 발현 벡터를 도입한 주이다.

M. alpina 형질전환주의 취득

국제 공개 공보 WO2005/019437("지질 생산균의 육종 방법")에 기재된 방법에 따라 M. alpina 1S-4주로부터 유도한 우라실 요구성 주 Δura-3을 숙주로 하여 파티클 딜리버리법으로 플라스미드 pDUraRhG-ACS-10과 pDUraRhG-ACS-11을 이용하여 각각 형질전환을 수행했다. 형질전환주의 선택에는 SC 한천 배지(Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco) 0.5%, 황산암모늄 0.17%, 글루코오스 2%, 아데닌 0.002%, 티로신 0.003%, 메티오닌 0.0001%, 아르기닌 0.0002%, 히스티딘 0.0002%, 리신 0.0004%, 트립토판 0.0004%, 트레오닌 0.0005%, 이소로이신 0.0006%, 로이신 0.0006%, 페닐알라닌 0.0006%, 한천 2%)를 사용했다.

형질전환 M. alpina 의 평가

얻어진 형질전환주를 GY 배지 4ml에 식균하고, 28℃에서 2일간 진탕 배양을 수행했다. 균체를 여과에 의해 회수하고, RNeasy plant kit(QIAGEN)를 이용하여 RNA를 추출했다. 수퍼스크립트 퍼스트 스트랜드 시스템 for RT-PCR(인비트로젠)에 의해 cDNA를 합성했다. 도입한 컨스트럭트로부터의 각 유전자의 발현을 확인하기 위해 이하의 프라이머의 조합으로 RT-PCR을 수행했다.

과잉 발현을 확인할 수 있는 주 중 각 1주에 대해 GY 배지(글루코오스 2%, 효모 엑기스 1%) 10ml에 식균하고, 28℃, 300rpm으로 3일간 진탕 배양했다. 이것을 GY 배지 500ml(2L 사카구치 플라스크)에 전량 옮기고, 28℃, 120rpm으로 진탕 배양했다. 이로부터 3일 후, 7일 후, 10일 후, 12일 후에 각각 5ml, 10ml씩 분취하고, 이것을 여과했다. 균체를 120℃에서 건조시키고, 염산 메탄올법에 의해 지방산을 메틸에스테르에 유도하고, 가스 크로마토그래피에 의해 지방산 분석을 수행했다. 건조 균체 당 지방산 생산량 및 아라키돈산 생산량의 시간 경과에 따른 변화를 조사했다. 또한, 형질전환의 숙주인 Δura-3주를 컨트롤로 했다. 결과를 도 27(MaACS-10) 및 도 28(MaACS-11)에 나타냈다.

도 27 및 도 28에 도시된 바와 같이, MaACS-10 및 MaACS-11을 M. alpina에서 과잉 발현시킨 경우, 균체 당 지방산량, 아라키돈산량 모두 컨트롤에 비해 증가해 있었다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 적절한 숙주 세포 내에서 발현시킴으로써 지방산, 특히 고도 불포화 지방산을 효율적으로 생성시킬 수 있다. 본 발명에 의해 숙주 세포 내에서 생성되는 지방산은 식품, 화장료, 의약, 비누 등의 제조에 이용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> SUNTORY HOLDINGS LIMITED <120> Acyl-CoA Synthetase Homologues and Use of the Same <130> PCT11-0003 <150> JP 2010-19967 <151> 2010-02-01 <160> 123 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 1854 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 1 atggatgctg tccctgcagt tgctgctgcg gccatccccg cagccatgta tgtcggctcc 60 aagcttgcaa tcccccgtga tgtcaagtta gctaaaggcc tagtcagtgc caagctaggt 120 tacaggtcct acgagaagaa cgactcgatc aatatctctt atcgttttga agagacctgt 180 aagaagcacc ctcatcgcga agctttggtg tttgaaggca aatcgtacac cttccaggac 240 atccagcgag aatcgaatag ggtgggacac tggctgttgt ccaaaggcgt caagcgagga 300 gagatcgtgt cgctcttcat gcaaaataag ccagagtttc tcttcttctg gcttggactc 360 aacaagatcg gcgctacggg agcattcatc aacacgaacc tctcgggcaa acctctgacg 420 cactcattgc gtaccgcgac agcatccatt ctgattatgg atgcggaact gccgacgccc 480 atttatagtg tcctcgatga agtccttgag atgggatatc agatatattc ctacggagga 540 tcccagcaac acgcctttgc tacacaagtt gaactttctc aaatctcgga tgcggccttg 600 cccaagagtc tgcgaaggaa aaccactgca aatgatattg 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<213> Mortierella alpina <400> 39 tgcttttctc ttcttcgtca ccctccttct tcccattcct ccggtcctcc tccgttccta 60 atcagtttct cagaccctgt ccattcctct ggcctccaca cacaccccac tctcccttga 120 acaaatacct tatccagatc aaagacatgc cttccttcaa aaagtacaac ctcgacaagc 180 agagtgttga ggtccctggc actcggaagc ctggcgcttc aggccactac agacatgccg 240 cctacggcga tgctcttgtc accaacatcc gtgaggcccc tcatatcgaa actctttacg 300 acatgtggca gaactctgtg acaaagtatg gcggcaatga ctttttgggt caccgtccct 360 tcaacactgt tgcccagacc tatggtggct acagttggga gacgtaccgc cagattaacc 420 agcgcgttaa tgcgttcggc agcggtatca tgcacctgaa cgaggtgatc ctcggcaacc 480 gccagcttaa ccgctgggcg ttgggcatct ggtcccacgg tcgccctgag tggttcatta 540 cggagatgag ctgcaactgc tacaacctca tttctgttgc attgtacgac acccttggac 600 ctgatgcagt cgagtacatt gtcaaccacg ccgagattga gattgttgtc tcaagtgcca 660 accatatcgc ctctttgctc gagaacgccg agaagctccc caagctcaag gccattgtca 720 gcatggatgc tcttcacgat accgtccccg tccccggcgc cacctctgcc gcacaggttc 780 ttcgtgcctg gggtgcacaa aagggcatca aggtctatga ctttaacgag 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cacaggccac 180 tacagacatg ccgcctacgg cgatgctctt gtcaccaaca tccgtgaggc ccctcatatc 240 gaaactcttt acgacatgtg gcagaactgt aagttgattc ccgaggacct gggaaatctt 300 tactcggatc tgtctcacaa gaagactcac actctgctct ccacaattac cttgtaacct 360 tcagctgtga caaagtatgg cggcaatgac tttttgggtc accgtccctt caacactgtt 420 gcccagacct atggtggcta cagttgggag acgtaccgcc agattaacca gcgcgttaat 480 gcgttcggca gcggtatcat gcacctgaac gaggtgatcc tcggcaaccg ccagcttaac 540 cgctgggcgt tgggcatctg gtcccacggt cgccctgagt ggttcattac ggagatgagc 600 tgcaactgct acaacctcat ttctgttgca ttgtacgaca cccttggacc tgatgcagtc 660 gagtacattg tcaaccacgc cgagattgag attgttgtct caagtggtaa gtcgcttttt 720 tttttttgct attggcgcct gcttgcttgc ctgcacgtga aaactataat ggtttctgat 780 ctcccttttg tgtacctcct cctttcgatc aacttctttg taattttatt cccgggcatt 840 gactctatat gcagccaacc atatcgcctc tttgctcgag aacgccgaga agctccccaa 900 gctcaaggcc attgtcagca tggatgctct tcacgatacc gtccccgtcc ccggcgccac 960 ctctgccgca caggttcttc gtgcctgggg tgcacaaaag ggcatcaagg tctatgactt 1020 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tcgtgtctct catgcgcgtg cctctatggg acctcagttt 720 tggaaccgat tctatcactt cagtgagagc gacagggtct atctgtcctt gcccttgtac 780 cacagtgctg gcgccatctt gggagtgatt gcttgttgga cctcgggagc aaccttgatc 840 ctggcccgca agttctccgc gacacatttc tgggaggatt gccgcgtgaa caacgcaact 900 gtgattcaat acattggaga aatttgcaga tatctgctca acacgccaga atcacccctg 960 gacaaggcac actcgatacg actggcacat ggtaatggaa tgcgacccga tgtctggact 1020 cgcttcagag atcggttcgg catcccgttg attggcgagt ggtatgcatc gactgaggga 1080 actggagcct tgtcgaatta taacacaggc ccaggcggcg ctggagcgat tggataccgc 1140 ggtacccttg ccagagcatt ggataaagga ctcaggattg cgagatttga tgtccagaca 1200 gaggagttgg ttcgggacaa aaacggttat tgcattgagt gcaaacctgg cgagcccgga 1260 gaattgctga cgcttgttga tgctaaagag ccgaacaaag acttcaaagg ataccatcaa 1320 aaccaggcag cgaccaacaa aaagattgtc aaagatgttt tcaaagccgg cgacatgtac 1380 ttccgtaccg gagatatcct tcggcgcgat agcgatgggt acttttactt tggcgaccgt 1440 gtgggcgata cattccggtg gaagtccgag aatgtgtcta cggccgaggt gtctgaagtc 1500 ctctcgcagt atccggactg tatcgaagtc 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cgaagtcgga cccgccgacg tccagggcga gacccgcatc 60 cgccgctccg tcctctctgc aaagcgcctc atgtcctcgc cctcggatga catcaagacc 120 ctctacgacg tcttcaacca ctccgtcacc gtccgcccca acctcaacgc gatcggatac 180 cgcaaggtcg tcaagattgt cgaggaagaa aaggaggtcg tcaaggttgt caacggcgag 240 gaagtcaagg aaaagaagac ctggaagttc ttcaagatgt ccggctacca ctggctcacc 300 tacaaggatg cgaagcaggt cgtcgacagc atcggatgcg gtcttcgcaa gtttggcgtc 360 gagcccaagg acaagctgac cgttttcggt gccacaaggt aagaaagagg cataacaaga 420 aaatgcaaga gaggcaaaaa aaatggcttg acgtgagagc ataagggaac caacagacag 480 gtgtttgtgt gggttgcgga tagtgggtga gcatgcttcg ttatcgaatg tgggagaaga 540 gagcggacgc gaatatggct ctcgtctctg gcgggatgcg agtggccaag tgtgggatac 600 atatcctcgc ggtggggtgt ccgggtcggc ccttgaatct tgttgaagca tgataatgtg 660 aatgtggacc gcaatcacgc tcagattatg cgtagcaagc gtgttgctag tctacatcat 720 gctcacacgt attcacattt attcattttc actctatctc gctcttagtg ccaactggct 780 cctgcttgcc cacggtgctt tcacccagtc catcaccatt gttaccgcct acgacaccct 840 gggcgaggac ggtcttttgc actctatgaa cgaggccgag gtggccaccg cttacacaaa 900 cgccgacttg ctcaacacta tcaagaacgt tgccggcaaa tgccccaccc tgaagaagat 960 catctacgac ggcgatgcca agcccgcaga tgtcattgcc ctccaggagg cccatcctca 1020 cctccagctc atcaccctcg aggagctgaa gcagctcgga gtggacaacc ctgtcgcccc 1080 aacccctcct gctgccaagg actactgctg catcatgtac acttcgggat cgactggcaa 1140 ccccaaggga gtgttgctga cccatggaaa cctcgttgct gccagtacgt atctttctcg 1200 tcatgatcgt cctcccgcat ttccactgcg cttgttacca tttgatggga aatgtattta 1260 acccgaacca cacatttttt ctttttctca cacttgccac gtcactagtc ggaggtgtga 1320 acaagatgct gacaaagtac gttcacgagg gagacgtctt gctcgcgtac ttgcctcttg 1380 ctcacgttct cgagttcctg gtcgaaaacg tctgtctctt ctggggtgtg actcttggct 1440 acggtaccgt ccgcacattg actgatgcct cagtccgtga gtgccagggt gatatcaagg 1500 agttgcgccc tacattgatg accggtgttc ctgctgtgtg ggagacgatt cgtaagggag 1560 tgttggctca ggtttcccag ggctcacctc ttgttcaaaa gatcttccat gctgctttga 1620 acgccaaggc ctggtgcctg gaccgcaagt tgggtgcgtt gactggaatc ttcgatactg 1680 tcgtcttcaa caaggtcaag cagcagacag gaggacgtct tcgcttcgcc ctttcgggag 1740 gtgcacccat ctctcaggag acccagcgct tcttgacgac agctttgtgc cctatcctcc 1800 agggctacgg tatgacagag tcttgcggca tgtgcgccat tttgaccccc gatgtcttca 1860 actacagccg tgtcggatcc ccagttcctt gcacggaggt caagttggtc gatgtgcccg 1920 atgcaggata ccactcaacg gacttgcctc tcccccgtgg tgaggtctgc attcgtggac 1980 cctccatcac tgctggatac ttcaagaacc ccgaggagac ctccgccaca ttgactgctg 2040 atcgctggct caagactgga gatatcggag agtggcaccc cgacggcact atctcgatca 2100 ttgaccgcaa gaagaacttg gtcaagctgt cacacggaga gtacattgct ttggagaagc 2160 ttgagtctgt ctacaagagc acagcctact gcaacaacat ttgcgtgtat gccgactcga 2220 tgcagaacaa gcccgttgcc attattgttg ccagcgaacc ccgcatcctc gagttggcca 2280 aggccaaggg cattgagagc cgcgactttg ctgctctctg ccacgacaag gttatcatca 2340 aggctgtcca cgatgcctgc ctcgccactg ccaagcgtgc tggactcaag cccgctgaga 2400 tgcttcaggg agtgtacttg gagtcagaag aatggacggc ccaggctggc atgttgactg 2460 ccgctcagaa gctcaagcgc aaggagatca accaggccta tgtctcacag atcaagcagc 2520 tttatggaac ggcctaa 2537 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 61 gtcggctcca agcttgcaat cc 22 <210> 62 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 62 ggacagctcc agcactgtgg taaag 25 <210> 63 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 63 gaccacggga ttccccaagg ctgc 24 <210> 64 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 64 cttggtcgcg cttgttcctg gccac 25 <210> 65 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 65 tacagctttg ttgctgtccc catc 24 <210> 66 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 66 gatgatgggt gtgcttgcaa agatc 25 <210> 67 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 67 aacccaaagc tgcgccaggc tgtcc 25 <210> 68 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 68 ttacagcttg gattcctttt gatgg 25 <210> 69 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 69 gtcgtgcccg atgcggagac gc 22 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 70 tcagtggatc ccgttataca tcag 24 <210> 71 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 71 gcgtccccct ctatgataca ttg 23 <210> 72 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 72 gtgggatgca ggacggcaac atcg 24 <210> 73 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 73 ggatgccgaa caacagcgcg tgg 23 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 74 gcaccctcct cagaaacagc cctc 24 <210> 75 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 75 cagtcgagta cattgtcaac cacg 24 <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 76 gcggttcaag aggcgaggca cagc 24 <210> 77 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 77 gttcatcttc tgctggctgg gtctc 25 <210> 78 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 78 gttgcgttgt tcacgcggca atcc 24 <210> 79 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 79 atggaaacct tggttaacgg aaag 24 <210> 80 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 80 tcagcaaaga tggccttggg ctgg 24 <210> 81 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 81 gtcaagggcg agactcgcat cc 22 <210> 82 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 82 cggtgacgat ggtcatggac tgc 23 <210> 83 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 83 gcgagacccg catccgccgc tcc 23 <210> 84 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 84 gaccgtcctc gcccagggtg tcg 23 <210> 85 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 85 ggatccatgc cttccttcaa aaagtacaac c 31 <210> 86 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 86 cccgggcaaa gagttttcta tctacagctt 30 <210> 87 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 87 gaattcatgg ttgctctccc actcg 25 <210> 88 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 88 ggatccctac tatagcttgg ccttgcc 27 <210> 89 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 89 ggatccatgt atgtcggctc caagcttgc 29 <210> 90 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 90 gtcgactcaa agcctggctt tgccgctgac g 31 <210> 91 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 91 ggatccatgg aaaccttggt taacggaaag 30 <210> 92 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 92 ggtacctaga acttcttcca catctcctc 29 <210> 93 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 93 gagctcatgc caaagtgctt taccgtcaac g 31 <210> 94 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 94 ggatccttac ttggagccat agatctgctt g 31 <210> 95 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 95 tctagaatgg cacctcccaa cactattg 28 <210> 96 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 96 aagcttttac ttcttgaaaa agaccacgtc 30 <210> 97 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 97 tctagaatgg ctgctgctcc cagtgtgag 29 <210> 98 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 98 aagcttttac tgtgccttgc ccatcttgg 29 <210> 99 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 99 tctagaatgg agtcgattgc gcaattcc 28 <210> 100 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 100 gagctcttac tgcaacttcc ttgccttctc 30 <210> 101 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 101 tctagaatgg gtgcggacac aggaaaaacc 30 <210> 102 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 102 aagcttttac tcttccttgg gacgaagacc 30 <210> 103 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 103 gaattcatga caaagtgcct caccgtcg 28 <210> 104 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 104 cccgggactt aggccgttcc ataaagctg 29 <210> 105 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 105 aattcataag aatgcggccg ctaaactatt ctagactagg tcgacggcgc gcca 54 <210> 106 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 106 agcttggcgc gccgtcgacc tagtctagaa tagtttagcg gccgcattct tatg 54 <210> 107 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 107 agcggccgca taggggagat cgaacc 26 <210> 108 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 108 agaattcggc gcgccatgca cgggtccttc tca 33 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 109 gtcgaccatg acaagtttgc 20 <210> 110 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 110 gtcgactgga agacgagcac g 21 <210> 111 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 111 ggcaaacttg tcatgaagcg aaagagagat tatgaaaaca agc 43 <210> 112 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 112 cactcccttt tcttaattgt tgagagagtg ttgggtgaga gt 42 <210> 113 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 113 taagaaaagg gagtgaatcg cataggg 27 <210> 114 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 114 catgacaagt ttgccaagat gcg 23 <210> 115 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 115 attgttgaga gagtgttggg tgagagtg 28 <210> 116 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 116 cactctctca acaatatgga aaccttggtt aacggaaagt 40 <210> 117 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 117 cactcccttt tcttactaga acttcttcca catctcctca atatc 45 <210> 118 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 118 cactcccttt tcttattact tggagccata gatctgcttg a 41 <210> 119 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 119 cactctctca acaatatgcc aaagtgcttt accgtcaac 39 <210> 120 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 120 gtcccgaatg gttcct 16 <210> 121 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 121 agcggttttc tacttgc 17 <210> 122 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 122 aactacaacc gcgtcg 16 <210> 123 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic DNA <400> 123 cggcataaac gcagat 16

Claims

이하의 (a) 내지 (c)로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오타이드:
(a) 서열 번호 56에 나타낸 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 57에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및
(c) 서열 번호 57에 나타낸 아미노산 서열에 대해, 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질로서, 아실-CoA 신세타제 활성, 또는 숙주 세포에서 발현시킨 경우에 상기 숙주 세포가 생산하는 지방산의 양을 증가시키는 활성 또는 조성을 변화시키는 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 서열 번호 56에 나타낸 염기 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 서열 번호 57에 나타낸 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, DNA인 폴리뉴클레오타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드로 코딩되는 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드, 또는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터가 도입된 비인간 형질전환체.
제7항에 따른 형질전환체의 배양물로부터 지질 또는 지방산 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는 지질 또는 지방산 조성물의 제조 방법.
제8항에 있어서, 상기 지질이 트리아실글리세롤인 제조 방법.
제8항에 있어서, 상기 지방산이 탄소수 18 이상의 고도 불포화 지방산인 제조 방법.