KR20170026580A - 변형된 폰 빌레브란트 인자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인자 VIII와 결합하는 변형된 폴리펩티드를 제공한다. 변형된 폴리펩티드는 서열번호 3에 개시된 서열을 포함하며, 상기 서열은 변형된 폴리펩티드가 변형되지않은 서열번호 3을 포함하는 참조 폴리펩티드보다 적어도 5배 낮은 오프 비율로 인자 VIII와 결합하도록 위치 1 또는 3에서 적어도 하나의 변형을 포함한다.

Description

변형된 폰 빌레브란트 인자{MODIFIED VON WILLEBRAND FACTOR}

본 발명은 폴리펩티드, 특히 인자 VIII(Factor VIII, FVIII)에 대한 개선된 결합친화도를 나타내는 변형된 폰 빌레브란트 인자에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 폴리펩티드 및 FVIII를 포함하는 복합체, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다. 그리고, 본 발명은 출혈성 질환들을 치료하기 위해 본 발명의 폴리펩티드 또는 복합체를 치료적 또는 예방적으로 사용하는 것에 관한 것이다.

혈액응고인자들의 결핍으로 인한 다양한 출혈성 질환들이 존재한다. 가장 흔한 질환들은 A형 및 B형 혈우병이며, 이는 각각 혈액응고인자 VIII 및 IX의 결핍으로 인해 발병한다. 다른 알려져 있는 출혈성 질환은 폰 빌레브란트 질병이다.

혈장에는, FVIII가 VWF와 비공유 복합체로 우선적으로 존재하며, 막 결합된 활성화 인자 X 생성 복합체내에서 활성화 인자 IX에 대한 보조인자로서 작용한다.

세포성 수용체들과의 상호작용을 감소시킴으로써(WO 03/093313A2, WO 02/060951A2), FVIII에 폴리머들을 공유부착함으로써(WO 94/15625, WO 97/11957 및 US 4970300), FVIII를 캡슐화함으로써(WO 99/55306), 새로운 금속결합 부위들을 도입함으로써(WO 97/03193), 펩티드(WO 97/40145 및 WO 03/087355) 또는 디설파이드 결합(WO 02/103024A2)에 의해 A2 도메인을 A3 도메인에 공유부착함으로써 또는 A1 도메인을 A2 도메인에 공유부착함으로써(WO2006/108590) 비-활성화 FVIII의 반감기를 연장시키기 위한 여러 시도들이 있어왔다.

FVIII 또는 VWF의 기능적인 반감기를 개선하기 위한 다른 접근법은 FVIII의 페길레이션(PEGylation)(WO 2007/126808, WO 2006/053299, WO 2004/075923)에 의한 방법이다. VWF의 페길레이션(WO 2006/071801)은 또한, 혈장내에 존재하는 FVIII의 반감기를 간접적으로 개선하기 위한 노력으로 시도되어 왔다. 또한, FVIII의 융합단백질들이 설명되어 있다(WO 2004/101740, WO2008/077616 및 WO 2009/156137).

다른 형태의 폰 빌레브란트 질병(VWD)이 없거나, 기능적으로 결함이 있거나 감소된 양으로만 사용가능한 VWF는 혈장내에 존재하는 다중결합의 부착성 당단백질이며, 다수의 생리학적 기능들을 가진다. 1차 지혈동안, VWF는 혈소판 표면 상의 특정 수용체들과, 콜라겐과 같은 세포외 기질의 성분들 사이의 매개체로서 작용한다. 그리고, VWF는 응혈원 FVIII을 위한 담체 및 안정화 단백질로서 제공한다. VWF는 2813개의 아미노산 전구물질 분자로서 내피세포 및 거핵세포들내에서 합성된다. 야생형 VWF의 아미노산 서열 및 cDNA 서열은 Collins et al. 1987, Proc Natl. Acad. Sci. USA 84:4393-4397에 개시되어 있다. 전구체 폴리펩티드, 프리-프로-VWF는 혈장내에서 발견된 22-잔기 신호 펩티드, 741-잔기 프로-펩티드 및 2050-잔기 폴리펩티드로 구성된다(Fischer et al., FEBS Lett. 351: 345-348, 1994). 소포체내 신호 펩티드를 분열시킨 후, VWF의 두 단량체들 사이에 C-말단 디설파이드 브릿지가 형성된다. 분비 경로를 통해 추가로 수송하는 동안, 12개의 N이 결합된 및 10개의 O가 결합된 탄수화물 측쇄들이 부가된다. 중요하게는, VWF 이량체들이 N-말단 디설파이드 브릿지를 통해 다중결합되며, 741개의 아미노산들의 프로펩티드가 후기 골지체내 효소 PACE/퓨린에 의해 분열된다. VWF의 고분자량 다량체들(VWF-HMWM) 뿐만 아니라 프로펩티드는 내피세포의 바이벨-팔레이드(Weibel-Pallade)체 또는 혈소판의 α-과립들내에 저장된다.

혈장내에 일단 분비되면, 프로테아제 ADAMTS13은 VWF의 A1 도메인내에서 VWF를 분열시킨다. 혈장 VWF는 500kDa의 단일 이량체로부터, 10,000kDa 이상의 분자량의 20개 이상의 이량체들로 구성된 다량체들의 다량체들 범위로 구성된다. 일반적으로, VWF 고분자량 다량체들(VWF-HMWM)은 가장 강력한 지혈 활성을 가지며, 이는 리스토세틴 보조인자 활성에서 측정될 수 있다(VWF:RCo). VWF:RCo/VWF 항원의 비율이 높을 수록, 고분자량 다량체들의 상대량도 높다.

VWF내 결함들은 폰 빌레브란트 질병(VWD)의 원인이 되며, 이는 다소 확연한 출혈 표현형에 의해 특징화된다. VWD 타입 3은 VWF가 완전히 소실되는 가장 심각한 형태이며, VWD 타입 1은 VWF의 정량적인 손실에 관한 것이며, 및 그의 표현형이 매우 순할 수 있다. VWD 타입 2는 VWF의 정성적인 결함에 관한 것이며, VWD 타입 3만큼 심각할 수 있다. VWD 타입 2는 많은 서브 형태들을 가지며, 그들 중 일부는 고분자량 다량체들의 손실 또는 감소와 관련되어 있다. 폰 빌레브란트 VWD 타입 2a는 중간 및 대형 다량체들 모두의 손실에 의해 특징화된다. VWD 타입 2B는 최고분자량 다량체들의 손실에 의해 특징화된다.

VWD는 사람에게 가장 빈번한 유전적인 출혈질병이며, 혈장 또는 재조합 기원의 VWF를 함유하는 농축물에 의해 치료법을 대체함으로써 치료될 수 있다. VWF는 예를 들면, EP 05503991에 설명되어 있는 바와 같이 사람 혈장으로부터 제조될 수 있다. EP 0784632에는 재조합 VWF를 제조 및 분리하는 방법이 설명되어 있다.

혈장에서 FVIII는 VWF에 대하여 높은 친화도로 결합하며, 이는 조숙 이화작용(premature catabolism)으로부터 VWF를 보호하며, 따라서 1차 지혈에 더해 FVIII의 혈장수준 조절에 있어서 중요한 역할을 하며, 및 결과적으로 2차 지혈을 조절하는데 있어서 중심인자이다. VWF에 결합된 비-활성화 FVIII의 반감기는 혈장내에서 약 12내지 14시간이다. 폰 빌레브란트 질병 타입 3에서, VWF가 존재하지 않거나, 거의 존재하지 않는 경우 FVIII의 반감기는 겨우 약 6시간이며, 감소된 FVIII의 농도로 인해 상기 환자들에서 중간 내지 보통의 A형 혈우병 증상을 일으킨다. FVIII에 대한 VWF의 안정화 효과는 또한, CHO 세포내 FVIII의 재조합 발현을 보조하는데 사용되어 왔다(Kaufman et al. 1989, Mol Cell Biol).

발명의 요약

제1 양태에서, 본 발명은 인자 VIII와 결합하는 변형된 폴리펩티드를 제공하며, 상기 변형된 폴리펩티드는 서열번호 3에 개시된 서열을 포함하며, 이 서열은 변형된 폴리펩티드가 변형되지않은 서열번호 3을 포함하는 참조 폴리펩티드보다 적어도 5배 낮은 오프 비율(off rate)을 갖는 인자 VIII와 결합하도록 위치 1 또는 3에서 적어도 변형을 포함한다.

제2 양태에서, 본 발명은 인자 VIII와 결합하는 변형된 폴리펩티드를 제공하며, 상기 변형된 폴리펩티드는 서열번호 3에 개시된 서열을 포함하며, 이 서열은 변형된 폴리펩티드가 변형되지않은 서열번호 3을 포함하는 참조 폴리펩티드보다 낮은 오프 비율(off rate)을 갖는 인자 VIII와 결합하도록 적어도 위치 3에서 변형을 포함한다.

제3 양태에서, 본 발명은 인자 VIII와 결합하는 변형된 폴리펩티드를 제공하며, 상기 변형된 폴리펩티드는 서열번호 3에 개시된 서열을 포함하며, 이 서열은 변형된 폴리펩티드가 변형되지않은 서열번호 3을 포함하는 참조 폴리펩티드보다 낮은 오프 비율(off rate)을 갖는 인자 VIII와 결합하도록 적어도 위치 1에서 변형을 포함하며, 상기 위치 1에서의 잔기는 G, P, E, Y, A 및 L로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명은 또한, 본 발명의 인자 VIII 분자 및 변형된 폴리펩티드를 포함하는 복합체, 및 변형된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 3의 위치 1 및 3 또는 위치 3 및 9, 또는 위치 3 및 43에서의 잔기들이 변경되도록 VWF 아미노산 서열의 D' 도메인으로 적어도 2개의 돌연변이들을 도입시키는 단계를 포함하는, VWF의 인자 VIII 결합 친화도를 증가시키는 방법을 제공한다.

VWF

본원에 사용된 용어 "폰 빌레브란트 인자" 또는 "VWF"는 야생형 VWF의 생물학적 활성, 특히 인자 VIII과 결합할 수 있는 능력을 갖는 임의의 폴리펩티드를 의미한다. 야생형 VWF를 인코딩하는 유전자는 9kb mRNA로 전사되며, 이는 310,000Da의 추정 분자량을 갖는 2813개의 아미노산들의 전-프로폴리펩티드(pre-propolypeptide)로 번역된다. 전-프로폴리펩티드는 22개의 아미노산 신호 펩티드, 741개의 아미노산 프로-폴리펩티드 및 성숙 서브유닛을 함유한다. N-말단으로부터 741개의 아미노산 프로폴리펩티드를 분열시키면, 2050개의 아미노산들로 구성된 성숙 VWF가 생성된다. VWF 전-프로폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 2에 개시되어 있다. 다르게 지시되지 않는한, VWF 분자가 서열번호 2의 모든 잔기들을 포함할 필요가 없어도, 본원에서 VWF 잔기들의 아미노산 넘버링은 서열번호 2를 의미한다. 성숙 VWF의 아미노산 서열은 서열번호 4에 개시되어 있다. 본원에서 사용된 용어 "VWF"는 다르게 지시되지 않는한 VWF의 성숙 형태를 의미한다.

야생형 VWF의 프로폴리펩티드는 하기 순서로 배열된 다중 도메인들을 포함한다:

D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK

D1 및 D2 도메인은 분열되어 성숙 VWF가 얻어지는 프로펩티드를 나타낸다. D' 도메인은 서열번호 2의 아미노산 764 내지 865를 포함한다. 야생형 VWF의 D' 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 3에 개시되어 있다. 카르복시 말단 90개의 잔기들은 단백질의 "시스테인 노트(cystein knot)" 상과(superfamily)와 상동인 "CK" 도메인을 포함한다. 상기 과 멤버들은 디설파이드 결합들을 통해 이량화(dimerise)하는 경향을 갖는다.

바람직하게는, 야생형 VWF는 서열번호 4에 개시된 바와 같이, 성숙 VWF의 아미노산 서열을 포함한다. 또한, VWF의 생물학적 활성, 특히 FVIII와 결합할 수 있는 능력이 길게 보존되는한, VWF의 부가, 삽입, N-말단, C-말단 또는 내부 결실도 또한 포함된다. 결실을 갖는 VWF가 야생형 VWF의 생물학적 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 75%를 보유한다면, 본 발명의 관점에서 생물학적 활성이 보유되어 있다. 야생형 VWF의 생물학적 활성은 당업자에 의해, 리스토세틴 보조인자 활성을 위한 방법(Federici AB et al. 2004. Haematologica 89:77-85), 혈소판 당단백질 복합체 Ib-V-IX의 GP Ibα에 대한 VWF의 결합(Sucker et al. 2006. Clin Appl Thromb Hemost. 12:305-310), 또는 콜라겐 결합 분석(Kallas & Talpsep. 2001. Annals of Hematology 80:466-471)을 사용하여 측정될 수 있다. VWF의 생물학적 활성이 FVIII와 결합할 수 있는 능력인 경우, 이는 여러 방법들로 측정될 수 있지만, 본원의 실시예 1에 설명된 방법으로 측정되는 것이 바람직하다.

인자 VIII

본원에서는 용어들 "혈액 응고 인자 VIII", "인자 VIII" 및 "FVIII"가 서로 바꿔서 사용된다. "혈액 응고 인자 VIII"은 야생형 혈액 응고 FVIII의 응혈촉진 활성을 갖는 야생형 혈액 응고 FVIII의 유도체들 뿐만 아니라 야생형 혈액 응고 FVIII를 포함한다. 유도체들은 야생형 FVIII의 아미노산 서열과 비교되는 결실들, 삽입들 및/또는 부가들을 가질 수 있다. 용어 FVIII은 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 예를 들면 활성화전 형태와 같은, FVIII의 단백질가수분해적으로 처리된 형태들을 포함한다.

용어 "FVIII"은 야생형 인자 VIII의 생물학적 활성의 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 75%를 갖는 임의의 FVIII 변종 또는 변이체들을 포함한다.

비-제한적인 예로서, FVIII 분자들은 APC 분열을 예방 또는 감소시키는 FVIII 변이체들(Amano 1998. Thromb. Haemost. 79:557-563), A2 도메인을 더욱 안정화시키는 FVIII 변이체들(WO 97/40145), 발현이 증가된 FVIII 변이체들(Swaroop et al. 1997. JBC 272:24121-24124), 면역원성이 감소된 FVIII 변이체들(Lollar 1999. Thromb. Haemost. 82:505-508), 상이하게 발현된 중쇄 및 경쇄들로부터 재구성된 FVIII(Oh et al. 1999. Exp. Mol. Med. 31:95-100), HSPG와 유사한 FVIII의 대사를 이끄는 수용체들에 대한 결합이 감소된 FVIII 변이체들(헤파란 설페이트 프로테오글리칸들) 및/또는 LRP(저밀도 지질단백질 수용체관련 단백질)(Ananyeva et al. 2001. TCM, 11:251-257), 디설파이드 결합-안정화된 FVIII 변이체들(Gale et al., 2006. J. Thromb. Hemost. 4:1315-1322), 개선된 분비 특성들을 갖는 FVIII 변이체들(Miao et al., 2004. Blood 103:3412-3419), 증가된 보조인자 특이적 활성을 갖는 FVIII 변이체들(Wakabayashi et al., 2005. Biochemistry 44:10298-304), 개선된 생합성 및 분비, 감소된 ER 샤프론 상호반응, 개선된 ER-골지 수송, 증가된 활성화 또는 불활성화에 대한 내성 및 개선된 반감기(Pipe 2004. Sem. Thromb. Hemost. 30:227-237에 의해 요약됨)를 포함한다. 다른 특히 바람직한 예는 Zollner et al 2013, Thrombosis Research, 132:280-287에 설명된 바와 같은 재조합 형태의 FVIII이다. 모든 이러한 FVIII 변이체들 및 변종들은 이후에 참고로 통합된다.

바람직하게는, FVIII은 서열번호 13에 개시된 바와 같이 FVIII의 전장 서열을 포함한다. 또한, FVIII의 생물학적 활성이 보유되는한, FVIII의 부가, 삽입, 치환, N-말단, C-말단 또는 내부 결실들도 포함된다. 변형들을 갖는 FVIII이 야생형 FVIII의 생물학적 활성의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 가장 바람직하게는 적어도 75%를 보유한다면, 본 발명의 관점에서 생물학적 활성이 보유되어 있다. FVIII의 생물학적 활성은 이하에 설명된 바와 같이 당업자들에 의해 측정될 수 있다.

FVIII의 생물학적 활성을 측정하기 위한 적당한 시험은 예를 들면, 1단계 또는 2단계 응고분석(Rizza et al. 1982. Coagulation assay of FVIII:C and FIXa in Bloom ed. The Hemophilias. NY Churchchill Livingston 1992) 또는 색원체성 기질 FVIII:C 분석(S. Rosen, 1984. Scand J Haematol 33: 139-145, suppl.)이다. 상기 참고문헌들의 내용은 이하에 참고로 통합된다.

인간 혈액응고 FVIII의 성숙 야생형 형태의 아미노산 서열은 서열번호 13에 개시되어 있다. 특정한 서열의 아미노산 위치에 대한 참조는 FVIII 야생형 단백질내 상기 아미노산의 위치를 의미하며, 인용되는 서열내 다른 위치들에 변이들, 예를 들면 결실들, 삽입들 및/또는 치환들이 존재하는 것을 배제하지 않는다. 예를 들면, 서열번호 13를 인용하는 "Glu2004"에서의 돌연변이는 변형된 상동체에서 서열번호 13의 위치 1 내지 2332의 하나 이상의 아미노산들이 소실되는 것을 배제하지 않는다.

상기 정의내에서 "FVIII" 및/또는 "VWF"는 또한, 존재할 수 있고, 한 개체에서 다른 개체로 일어날 수 있는, 천연 대립유전자 변이들을 포함한다. 상기 정의내 "FVIII" 및/또는 "VWF"는 FVIII 및/또는 VWF의 변종들을 추가로 포함한다. 상기 변종들은 야생형 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기들에서 상이하다. 상기 상이함의 예들은 보존적 아미노산 치환들, 즉 유사한 특성들을 갖는 아미노산 그룹들, 예를 들면 (1) 소형 아미노산들, (2) 산성 아미노산들, (3) 극성 아미노산들, (4) 염기성 아미노산들, (5) 소수성 아미노산들, 및 (6) 방향족 아미노산들 내에서의 치환을 포함할 수 있다. 상기 보존적 치환들의 예들은 표 1에 개시되어 있다.

(1)	알라닌	글리신
(2)	아스파르트산	글루탐산
(3)	아스파라긴	글루타민	세린	트레오닌
(4)	아르기닌	히스티딘	리신
(5)	이소류신	류신	메티오닌	발린
(6)	페닐알라닌	티로신	트립토판

변형된 VWF

본 발명의 변형된 VWF는 야생형 VWF의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 가진다. 본 발명에 따르면, 변형된 VWF는 서열번호 3에 개시된 바와 같이, 야생형 VWF의 D' 도메인의 아미노산 서열과 비교되는, 그의 D' 도메인내에 적어도 하나의 아미노산 치환을 가진다.

변형된 VWF의 D' 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 3에 대하여 하나 이상의 아미노산 치환들을 가질 수 있다. 변형된 VWF의 D' 도메인의 아미노산 서열은 바람직하게, 서열번호 3에 대하여 1개 또는 2개의 아미노산 치환들을 가진다.

서열번호 3의 위치 1에서의 S가 G, P, V, E, Y, A 및 L로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환되는 것이 바람직하다.

서열번호 3의 위치 3에서의 S가 Y, I, M, V, F, H, R 및 W로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산에 의해 치환되는 것이 또한 바람직하다.

치환들의 바람직한 조합들은 S764G/S766Y, S764P/S766I, S764P/S766M, S764V/S766Y, S764E/S766Y, S764Y/S766Y, S764L/S766Y, S764P/S766W, S766W/S806A, S766Y/P769K, S766Y/P769N, S766Y/P769R 및 S764P/S766L을 포함한다.

본 발명의 양태에 따르면, FVIII에 대한 본 발명의 폴리펩티드의 결합친화도는 서열번호 3에서의 변형을 제외하고 같은 아미노산 서열을 갖는 참조 폴리펩티드의 결합친화도보다 높다.

인자 VIII 분자에 대한 VWF 분자의 결합친화도는 당 분야에 사용된 결합분석에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, VWF 분자는 고체 지지체 상에 고정될 수 있으며, 증가된 농도의 인자 VIII이 적용되며, 특정 기간동안 배양되고, 및 세척후 결합된 인자 VIII이 색원체성 분석에 의해 측정된다. 친화도 상수 또는 해리 상수는 스캐차드 분석 또는 다른 적당한 분석에 의해 측정될 수 있다. 폰 빌레브란트 인자에 대한 인간 인자 VIII의 결합친화도를 측정하는 방법은 Vlot et al. (1995), Blood, Volume 85, Number 11, 3150-3157에 설명되어 있다. 그러나, 바람직하게는 인자 VIII에 대한 VWF의 친화도는 본원의 실시예 1에 설명된대로 측정된다.

해리 상수를 포함한, 친화도에 대한 본원의 임의의 설명은 FVIII에 대한 본 발명의 변형된 VWF 또는 본 발명의 폴리펩티드의 결합을 의미하는 것이 바람직하다. FVIII의 단일쇄의 아미노산 서열은 서열번호 14에 개시되어 있다.

VWF와 FVIII의 상호반응이 높은 온-비율(on-rate)을 가짐에 따라, 해리 상수의 변화는 오프-비율(off-rate)의 변화에 크게 의존한다. 따라서, VWF가 FVIII와 연합하는 것이 증가하는데 있어서 주요 초점은 FVIII와 VWF 사이의 오프-비율을 감소시키기 위한 노력을 포함한다. 바람직하게, 야생형 VWF 및 FVIII와 비교하여 변형된 VWF 및 FVIII의 오프-비율은 적어도 2배 낮고, 보다 바람직하게는 적어도 5배 낮고, 바람직하게는 적어도 10배 낮고, 및 보다 바람직하게는 적어도 20배 낮다.

VWF 및 FVIII로 구성된 복합체의 해리 상수는 바람직하게는 0.2nmol/L 이하, 보다 바람직하게는 0.175nmol/L 이하, 보다 바람직하게는 0.15nmol/L 이하, 보다 바람직하게는 0.125nmol/L 이하, 보다 바람직하게는 0.1nmol/L 이하, 보다 바람직하게는 0.05nmol/L 이하, 가장 바람직하게는 0.01nmol/L 이하이다.

본 발명의 폴리펩티드와 서열번호 13의 인자 VIII의 복합체의 해리 상수 KD는 일반적으로, 참조 폴리펩티드(예를 들면, 서열번호 4의 폴리펩티드)와 서열번호 13의 인자 VIII의 복합체의 해리 상수 KD의 90% 미만이다. 본 발명의 폴리펩티드와 서열번호 13의 인자 VIII의 복합체의 해리 상수 KD는 바람직하게는 참조 폴리펩티드(예를 들면, 서열번호 4의 폴리펩티드) 및 서열번호 13의 인자 VIII의 복합체의 해리 상수 KD의 75% 미만, 보다 바람직하게는 50% 미만, 보다 바람직하게는 25% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만이다.

참조 폴리펩티드는 VWF의 D' 도메인내 돌연변이를 제외하고는, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 즉, 참조 폴리펩티드는 바람직하게는, 참조 폴리펩티드내 D' 도메인이 서열번호 3에 개시된 아미노산 서열로 구성된 조건하에, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 가진다. 다시 말해서, 본 발명의 폴리펩티드와 참조 폴리펩티드 사이의 서열에 있어서 유일한 차이는 D' 도메인의 아미노산 서열에 있다. 참조 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드와 같은 조건하에서 바람직하게 제조되어 왔다.

본 발명의 폴리펩티드는 변형된 VWF로 구성될 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 추가의 아미노산 서열, 바람직하게는 이종성 아미노산 서열을 포함한다. 이종성 아미노산 서열은 일반적으로 사실상 VWF에 융합되지 않는다.

본 발명은 특히, 개선된 반감기를 갖는 VWF 변종이 사용되는 경우에 유용하다. 이는 예를 들면 인간 혈청 알부민에 VWF를 융합시킴으로써 달성될 수 있다. 상기 융합의 상세한 설명은 미국특허 제8,575,104에 개시되어 있으며, 이의 내용은 이후에 참고로 통합된다.

한 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 변형된 VWF 및 반감기 개선 단백질(HLEP)을 포함한다. 바람직하게는, HLEP는 알부민이다.

하나 이상의 HLEP는 예를 들면, FVIII, 혈소판, 헤파린 또는 콜라겐에 대한 VWF의 결합능력들을 방해하지 않도록, VWF의 C-말단부에 융합될 수 있다.

한 구현예에서, 변형된 VWF는 하기 구조를 가진다:

[구조식 1]

N - VWF - C - L1 - H

(상기 구조식 1에서,

N은 VWF의 N-말단부이며,

L1은 화학결합 또는 링커 서열이며,

H는 HLEP이며, 및

C는 VWF의 C-말단부이다)

L1은 하나 이상의 아미노산들, 예를 들면 1 내지 50개, 1 내지 30개, 1 내지 20개, 1 내지 15개, 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 3개(예를 들면, 1, 2 또는 3개)의 아미노산들로 구성되고, 서로 동일하거나 상이할 수 있는 화학결합 또는 링커 서열일 수 있다. 일반적으로, 링커 서열은 야생형 응고인자내 대응 위치에 존재하지 않는다. L1 내에 존재하는 적당한 아미노산들의 예들은 Gly 및 Ser를 포함한다.

바람직한 HLEP 서열은 아래에 설명된다. HLEP의 하나 이상의 아미노산들의 N-말단 결실을 포함하는, 각 HLEP의 정확한 "N-말단 아미노산"에 대한 융합 또는 각 HLEP의 "N-말단부"에 대한 융합도 마찬가지로 본 발명에 의해 포함된다.

변형된 VWF 또는 FVIII과 본 발명의 변형된 VWF의 복합체는 하나 이상의 HLEP 서열, 예를 들면 2 또는 3개의 HLEP 서열들을 포함할 수 있다. 이러한 다중 HLEP 서열들은 예를 들면 연속적인 반복으로서, VWF의 C-말단부에 나란히 융합될 수 있다.

링커 서열들

본 발명에 따르면, 치료용 폴리펩티드 모이어티는 펩티드 링커에 의해 HLEP 모이어티에 결합될 수 있다. 링커는 비-면역원성이어야 하며, 비-제거가능한 또는 제거가능한 링커일 수 있다.

비-제거가능한 링커들은 WO2007/090584에 예시된 바와 같이 교대하는 글리신 및 세린 잔기들로 조성될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, VWF 모이어티와 알부민 모이어티 사이의 펩티드 링커는 펩티드 서열들로 구성되며, 이는 인간 단백질에서 천연 도메인간 링커들로 제공한다. 바람직하게는, 상기 천연 환경에서 상기 펩티드 서열들은 단백질 표면에 가깝게 위치되어 있으며, 면역계에 접근가능해서 이 서열에 대한 천연 내성을 취할 수 있다. WO2007/090584에 그 예들이 제공되어 있다.

분열가능한 링커들은 프로테아제들에 의해 분열되기에 충분하게 유연해야 한다. 바람직한 구현예에서, 융합단백질이 변형된 FVIII인 경우, 융합단백질내 FVIII의 활성화에 따라 링커의 분열이 비교할 수 있을만큼 신속하게 진행한다.

분열가능한 링커는 바람직하게,

(a) 치료용 폴리펩티드의 활성화동안 단백질분해적으로 분열된 단백질분해성 분열부위를 함유하는 경우 자체 투여되는 치료용 폴리펩티드,

(b) 치료용 폴리펩티드의 관여에 의해 활성화 또는 형성되는 프로테아제에 의해 분열된 기질 폴리펩티드, 또는

(c) 응고 또는 섬유소분해에 관여되는 폴리펩티드

로부터 유도된 서열을 포함한다.

보다 바람직한 구현예에서 링커 영역은 VWF의 서열을 포함하며, 발현된 융합 단백질의 신생항원 특성들이 생길 위험이 감소해야 한다.

링커 펩티드는 응고시스템의 프로테아제들, 예를 들면 FIIa, FIXa, FXa, FXIa, FXIIa 및 FVIIa에 의해 바람직하게 분열가능하다.

치료용 폴리펩티드, 분열가능한 링커 및 HLEP의 예시적인 조합들은 WO2007/090584(예를 들면, 표 2 및 도 4) 및 WO2007/144173(예를 들면, 표 3a 및 3b)에 나열된 구조물들을 포함하지만, 여기에 국한되지는 않는다.

반감기 개선 폴리펩티드(HLEP)

본원에 사용된 "반감기 개선 폴리펩티드"는 알부민, 알부민-과(family) 멤버, 면역글로불린 G의 불변영역 및 그의 단편들, 및 생리적인 조건하에 알부민에, 알부민 과 멤버에, 뿐만 아니라 면역글로불린 불변영역의 일부에 결합할 수 있는 영역 및 폴리펩티드들로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 그것은 본원에 설명된 전장 반감기-개선 단백질(예를 들면, 알부민, 알부민-과 멤버, 또는 면역글로불린 G의 불변영역) 또는 응고인자의 치료적 활성 또는 생물학적 활성을 안정화시키거나 연장시킬 수 있는 하나 이상의 단편들일 수 있다. 상기 단편들은 길이가 10개 이상의 아미노산일 수 있으며, 또는 HLEP 서열로부터의 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 25, 적어도 약 30, 적어도 약 50, 적어도 약 100, 또는 그 이상의 인접한 아미노산들을 포함할 수 있으며, 또는 HLEP 단편이 야생형 VWF와 비교하여 적어도 25%의 기능성 반감기 연장을 제공하는한, 각 HLEP의 특정 도메인들의 일부 또는 전체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제시된 응고인자 삽입 구조물들의 HLEP 부분은 정상 HLEP의 변종일 수 있다. 용어 "변종"은 삽입들, 결실들 및 치환들을 포함하며, 보존적 또는 비-보존적이며, 이 경우 상기 변화들은 활성 부위, 또는 변형된 VWF의 생물학적 활성들을 부여하는 활성 도메인을 실질적으로 변경시키지 않는다.

특히, 본 발명의 제안된 VWF HLEP 융합 구조물들은 HLEP의 자연발생 이형 변종 및 단편들을 포함할 수 있다. HLEP는 임의의 척추동물, 특히 임의의 포유동물, 예를 들면 인간, 원숭이, 암소, 양 또는 돼지로부터 유도될 수 있다. 비-포유동물 HLEP는 암탉 및 연어를 포함하지만, 여기에 국한되지 않는다.

HLEP로서 알부민

용어 "인간 혈청 알부민"(HSA) 및 "인간 알부민"(HA) 및 "알부민"(ALB)은 본원에서 서로 바꿔서 사용된다. 용어들 "알부민" 및 "혈청 알부민"은 더 광의적이며, 인간 혈청 알부민(및 그의 단편들 및 변종들) 뿐만 아니라 다른 종들로부터의 알부민(및 그의 단편들 및 변종들)을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "알부민"은 알부민의 하나 이상의 기능적인 활성들(예를 들면, 생물학적 활성들)을 갖는, 알부민 폴리펩티드 또는 아미노산 서열, 또는 알부민 단편 또는 변종을 총괄하여 의미한다. 특히, "알부민"은 인간 알부민 또는 그의 단편들, 특히 본원의 서열번호 15에 개시된 인간 알부민 또는 다른 척추동물로부터의 알부민의 성숙 형태 또는 그의 단편들, 또는 상기 분자들의 유사체들 또는 변종들 또는 그의 단편들을 의미한다.

특히, 본 발명의 제시된 VWF 융합 구조물들은 인간 알부민의 자연발생 다형성 변종들 및 인간 알부민의 단편들을 포함할 수 있다. 일반적으로 말하면, 알부민 단편 또는 변종은 적어도 10개, 바람직하게는 적어도 40개, 가장 바람직하게는 70개 이상의 아미노산 길이를 가질 것이다. 알부민 변종은 알부민의 적어도 하나의 전체 도메인 또는 상기 도메인들, 예를 들면 도메인 1(서열번호 15의 아미노산들 1-194), 2(서열번호 15의 아미노산들 195-387), 3(서열번호 15의 아미노산들 388-585), 1+2(서열번호 15의 1-387), 2+3(서열번호 15의 195-585) 또는 1+3(서열번호 15의 아미노산들 1-194 + 서열번호 15의 아미노산들 388-585)의 단편들로 우선적으로 구성되거나 또는 대안적으로 포함할 수 있다. 각 도메인은 2개의 상동성 서브도메인들, 즉 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 및 512-585로 자체 형성되며, 유연성 서브도메인간 링커 영역들은 잔기들 Lys106 내지 Glu119, Glu292 내지 Val315 및 Glu492 내지 Ala511을 포함한다.

본 발명의 제안된 VWF 융합 구조물들의 알부민 부분은 HA의 적어도 하나의 서브도메인 또는 도메인 또는, 그의 보존적 변형들을 포함할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 알부민의 N-말단은 변형된 VWF의 아미노산 서열의 C-말단에 융합된다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 하기 구조를 가질 수 있다:

N - mVWF - C - L1 - A

(상기 구조에서, N은 VWF의 N-말단부이며, mVWF는 본원에 설명된 변형된 VWF이며, C는 VWF의 C-말단부이며, L1은 화학결합 또는 링커 서열이며, 및 A는 위에 정의된 알부민이다)

HLEP로서의 면역글로불린

면역글로불린 G(IgG) 불변영역들(Fc)은 치료용 단백질의 반감기를 증가시키는 것으로 당 분야에 알려져 있다(Dumont JA et al. 2006. BioDrugs 20:151-160). 중쇄의 IgG 불변 영역은 3개의 도메인들(CH1-CH3) 및 힌지 영역으로 구성된다. 면역글로불린 서열은 임의의 포유동물로부터, 하위분류 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4로부터 각각 유도될 수 있다. 항원-결합 도메인없는 IgG 및 IgG 단편들은 HLEP로서사용될 수도 있다. 치료용 폴리펩티드 부분은 바람직하게 항체 또는 펩티드 링커의 힌지 영역을 통해 IgG 또는 IgG 단편들에 연결되며, 이는 심지어 분열가능할 수 있다. 치료용 단백질의 생체내 반감기를 개선하기 위해 면역글로불린 불변영역에 치료용 단백질들을 융합시키는 것이 여러 특허 및 특허출원에 설명되어 있다. US 2004/0087778 및 WO 2005/001025는 펩티드의 반감기를 증가시키며, 그렇지 않으면 생체내에서 신속하게 제거되는 생물학적으로 활성인 펩티드들을 갖는 면역글로불린 불변영역들의 적어도 일부 또는 Fc 도메인들의 융합 단백질들을 설명하고 있다. 개선된 생물학적 활성, 연장된 순환하는 반감기 및 더 큰 용해도가 이뤄진 Fc-IFN-β 융합 단백질이 설명되어 있다(WO 2006/000448). 연장된 혈청 반감기 및 증가된 생체내 효능을 갖는 Fc-EPO 단백질들(WO 2005/063808) 뿐만 아니라, G-CSF와의 Fc 융합(WO 2003/076567), 글루카곤-유사 펩티드-1(WO 2005/000892), 응고 인자들(WO 2004/101740) 및 인터류킨-10(미국특허 제6,403,077호)이 개시되어 있으며, 이들은 모두 반감기 개선 특성들을 가진다.

다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 폴리펩티드와 착화된 FVIII의 기능성 반감기는 야생형 VWF, 또는 야생형 VWF와 착화된 FVIII, 또는 위에 정의된 참조 폴리펩티드의 반감기와 비교하여 더 오래 계속된다. 15% 이상, 예를 들면 적어도 20% 또는 적어도 50% 증가될 수 있다. 다시, 상기 기능성 반감기값들은 변형된 VWF 또는 FVIII와 변형된 VWF의 복합체가 투여된 후, 상기 포유동물로부터 다른 시간간격으로 채취된 혈액샘플들에서 시험관내 측정될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 폴리펩티드와 착화된 FVIII은 야생형 VWF 또는 야생형 VWF와 착화된 FVIII, 또는 위에 정의된 참조 폴리펩티드와 착화된 FVIII와 비교하여 개선된 생체내 회수율을 나타낸다. 생체내 회수율은 대응하는 야생형 VWF 또는 위에 정의된 참조 폴리펩티드와 비교하여 정맥내 투여후 곧(5 내지 10분) 순환시에 항원 또는 활성 분석들에 의해 발견되는 FVIII의 증가된 비율이 기대된, FVIII 녹아웃 마우스와 같이, 예를 들면 정상 동물 또는 A형 혈우병의 동물 모델들에서 생체내 측정될 수 있다.

생체내 회수율은 야생형 VWF 또는 위에 정의된 참조 폴리펩티드와 착화된 FVIII와 비교하여, 바람직하게는 적어도 10%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 및 보다더 바람직하게는 적어도 40%까지 증가된다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 면역글로불린 불변영역들 또는 그의 일부들은 HLEP로 사용된다. 바람직하게는, CH2 및 CH3 도메인으로 조성된 Fc 영역 및 IgG, 보다 바람직하게는 IgG1 또는 그의 단편들 또는 변종들의 힌지 영역이 사용되며, 변종들은 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합력을 개선시키는 돌연변이들을 포함한다.

폴리뉴클레오티드들

본 발명은 또한, 본원에 설명된 바와 같이 변형된 VWF를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"은 일반적으로, 변형되지않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥 DNA, 단일-가닥 또는 이중-가닥 RNA일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"은 또한, 하나 이상의 변형된 염기들 및/또는 특이한 염기들, 예컨대 이노신을 포함하는 DNA 또는 RNA를 포함한다. 당업자들에게 공지된 많은 유용한 목적들을 제공하는 DNA 및 RNA로 다양한 변형들이 이루어질 수 있음이 분명할 것이다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "폴리뉴클레오티드(들)"은 상기 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 폴리뉴클레오티드들 뿐만 아니라 예를 들면 간단한 및 복잡한 세포들을 포함하는, 바이러스 및 세포들의 DNA 및 RNA 특성의 화학적 형태들을 수용한다.

당업자는 유전자 코드의 퇴보로 인해, 주어진 폴리펩티드가 다른 폴리뉴클레오티드들에 의해 인코딩될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 "변종"들은 본 발명에 의해 포함된다.

바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드이다. 용어 "분리된" 폴리뉴클레오티드는 다른 핵산 서열들, 예컨대 다른 염색체의 및 염색체외 DNA 및 RNA에 국한되지 않은 것들로부터 실질적으로 유리된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 분리된 폴리뉴클레오티드들은 숙주 세포로부터 정제될 수 있다. 분리된 폴리뉴클레오티드들을 얻기 위해, 당업자들에게 공지된 종래의 핵산 정제방법들이 사용될 수 있다. 이 용어는 또한, 재조합 폴리뉴클레오티드들 및 화학합성된 폴리뉴클레오티드들을 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 변형된 VWF 또는, 변형된 VWF를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드를 함께 인코딩하는 폴리뉴클레오티드들의 그룹에 관한 것이다. 이 그룹내 제1 폴리뉴클레오티드는 변형된 VWF의 N-말단부를 인코딩할 수 있으며, 제2 폴리뉴클레오티드는 변형된 VWF의 C-말단부를 인코딩할 수 있다.

본 발명의 또다른 양태는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터이다. 바람직하게는, 플라스미드 또는 벡터는 발현 벡터이다. 특정 구현예에서, 벡터는 인간 유전자 치료법에 사용하기 위한 전이 벡터이다.

본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드들 그룹을 포함하는 플라스미드 또는 벡터들의 그룹에 관한 것이다. 제1 플라스미드 또는 벡터는 제1 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있으며, 및 제2 플라스미드 또는 벡터는 상기 제2 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다.

대안적으로, 코딩서열들 모두 성숙 VWF의 생성을 개선하기 위해 예를 들면, 발현 퓨린에 향하도록 사용될 수 있는 내부 리보솜 유입점(IRES) 요소 및 2개의 별도의 프로모터 서열 또는 하나의 프로모터를 사용하여 하나의 발현 벡터로 클로닝된다.

본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 또는 벡터, 또는 본원에 설명된 폴리뉴클레오티드 그룹, 또는 플라스미드 또는 벡터들의 그룹을 포함하는 숙주세포이다.

본 발명의 숙주세포들은 본 발명의 일부인 상기 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드 또는 변형된 VWF를 제조하는 방법에 사용될 수 있다. 그 방법은:

(a) 원하는 변형된 단백질이 발현되도록 하는 조건하에 본 발명의 숙주세포들을 배양하는 단계; 및

(b) 숙주세포로부터, 또는 배양 배지로부터 원하는 변형된 단백질을 선택적으로 회수하는 단계

를 포함한다.

본 발명의 변형된 VWF, 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드를 80% 이상의 순도, 보다 바람직하게는 95% 이상의 순도로 정제하는 것이 바람직하며, 및 오염 거대분자들, 특히 다른 단백질들 및 핵산들에 관해 99.9% 이상 순수하고, 감염원 및 발열원이 없는 약학적으로 순수한 상태가 특히 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명의 분리된 또는 정제된 변형된 VWF, 또는 본 발명의 폴리펩티드는 다른, 관련되지 않은 폴리펩티드들이 실질적으로 없다.

본 발명의 다양한 생성물들은 약제로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 변형된 VWF 또는 상기 설명된 바와 같이 상기 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한, A형 혈우병 또는 B형 혈우병, 또는 VWD와 같은 혈액 응고 질환으로 고통받는 대상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 유효량의 (i)FVIII 및 변형된 VWF, 또는 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드 또는 (ii)FVIII와 변형된 VWF와의 복합체, 또는 (iii)위에 설명한 바와 같이, 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드와 FVIII와의 복합체를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 그 방법은 유효량의 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 플라스미드 또는 벡터를 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 그 방법은 본원에 설명된 유효량의 본 발명의 숙주세포들을 대상에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

제안된 변이체들의 발현

적당한 숙주세포내에서 재조합 변이체 단백질들을 높은 수준으로 제조하는 데는 당업자들에게 공지된 방법들에 따른 다양한 발현 시스템들에서 번식될 수 있는 재조합 발현벡터내 적당한 조절요소들과 함께 효과적인 전사유닛들로 상기 변형된 cDNA를 조립할 필요가 있다. 효과적인 전사 조절요소들은 그들의 천연 숙주로서 동물 세포들을 갖는 바이러스로부터, 또는 동물 세포들의 염색체 DNA로부터 유도될 수 있다. 바람직하게는, 시미안(Simian) 바이러스 40, 아데노바이러스, BK 폴리오마 바이러스, 인간 사이토메갈로바이러스, 또는 로우스(Rous) 사코마 바이러스의 긴 말단 반복으로부터 유도된 프로모터-개선제 조합들, 또는 베타-액틴 또는 GRP78과 같이 동물 세포내 강하게 구성적으로 전사된 유전자들을 포함하는 프로모터-개선제 조합들이 사용될 수 있다. cDNA로부터 전사된 안정적인 높은 수준의 mRNA를 얻기 위해, 전사 유닛은 전사 종결-폴리아데닐화 서열을 인코딩하는 DNA 영역을 그의 3'-근위부에 함유하여야 한다. 바람직하게는, 이 서열은 시미안 바이러스 40 초기 전사영역, 토끼 베타-글로빈 유전자, 또는 인간 조직 플라스미노겐 활성화제 유전자로부터 유도된다.

그후, cDNA는 변형된 FVIII 및/또는 VWF 단백질의 발현을 위한 적당한 숙주세포주의 게놈으로 통합된다. 바람직하게는, 이 세포주는 배양 배지로의 분비 뿐만 아니라 정확한 폴딩, 디설파이드 결합형성, 아스파라긴-결합 글리코실화 및 다른 후-번역 변형들을 보장하기 위해 척추동물 기원의 동물 세포주이어야 한다. 다른 후-번역 변형들에 대한 예들은 초기 폴리펩티드 사슬의 티로신-O-황산화 및 단백질분해적 처리이다. 사용될 수 있는 세포주들의 예들은 원숭이 COS-세포들, 마우스 L-세포들, 마우스 C127-세포들, 햄스터 BHK-21 세포들, 인간 배아 신장 293 세포들, 및 햄스터 CHO-세포들이다.

대응하는 cDNA를 인코딩하는 재조합 발현벡터는 여러 다른 방법들에서 동물 세포주에 도입될 수 있다. 예를 들면, 재조합 발현벡터는 다른 동물 바이러스들에 기초한 벡터들로부터 형성될 수 있다. 이들의 예들은 배큘로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 바람직하게는 소 유두종 바이러스에 기초한 벡터들이다.

대응하는 DNA를 인코딩하는 전사 유닛들은 그들의 게놈으로 재조합 DNA가 통합된 특정 세포 클론들의 분리를 용이하게 하기 위해 상기 세포들내에서 우성 선택성 마커로서 기능할 수 있는 다른 재조합 유전자와 함께 동물 세포들내에 도입될 수도 있다. 상기 종류의 우성 선택성 마커 유전자들의 예들은 젠타마이신(G418)에 대한 내성을 부여하는, Tn5 아미노 글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 및 퓨로마이신에 대한 내성을 부여하는 퓨로마이신 아세틸 트랜스퍼라제이다. 상기 선택성 마커를 인코딩하는 재조합 발현 벡터는 원하는 단백질의 cDNA를 인코딩하는 벡터와 같은 벡터 상에 존재하거나, 숙주세포의 게놈에 동시에 도입 및 통합되는 별도의 벡터 상에서 인코딩될 수 있어서, 다른 전사 유닛들 사이에 단단한 물리적 결합을 종종 생성한다.

원하는 단백질의 cDNA와 함께 사용될 수 있는 다른 종류의 선택성 마커 유전자들은 디하이드로폴레이트 환원효소(dhfr)를 인코딩하는 다양한 전사유닛들에 기초한다. 내인성 dhfr-활성이 없는 세포들, 우선적으로 CHO-세포들(DUKX-B11, DG-44)에 이 종류의 유전자를 도입한 후, 뉴클레오시드가 없는 배지내에서 이들이 성장할 수 있게 할 것이다. 상기 배지의 예는 하이폭산틴, 티미딘 및 글리신이 없는 Ham's F12이다. 상기 dhfr-유전자들은 같은 벡터 상에서, 또는 다른 벡터들 상에서 결합된, 상기 종류의 CHO-세포들에 FVIII cDNA 전사 유닛들과 함께 도입될 수 있어서, 재조합 단백질을 생성하는 dhfr-양성 세포주들을 형성한다.

상기 세포주들이 세포독성 dhfr-억제제 메토트렉세이트의 존재하에 성장한다면, 메토트렉세이트에 대한 내성인 새로운 세포주들이 나타날 것이다. 상기 세포주들은 결합된 dhfr의 증폭된 수로 인한 증가된 비율로 재조합 단백질 및 원하는 단백질의 전사 유닛들을 생성할 수 있다. 증가하는 농도의 메토트렉세이트(1-10000nM)에서 상기 세포주들을 번식시킬때, 원하는 단백질을 매우 높은 비율로 생성하는 새로운 세포주들이 얻어질 수 있다.

원하는 단백질을 생성하는 상기 세포주들은 현탁액 배양액내에서 또는 다양한 고체 지지체 상에서, 대규모로 성장될 수 있다. 상기 지지체들의 예들은 덱스트란 또는 콜라겐 매트릭스에 기초한 마이크로 담체들, 또는 중공 섬유 또는 다양한 세라믹 재료 형태의 고체 지지체들이다. 세포 현탁액 배양액내에서, 또는 마이크로 담체 상에서 배양할때, 상기 세포주들의 배양은 배쓰 배양으로서 또는, 연장된 시간동안 조건배지가 연속생성되는 관류 배양으로서, 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면, 상기 세포주들은 원하는 재조합 변이체 단백질들을 제조하기 위한 산업적 방법을 개발하는데 매우 적합하다.

정제 및 배합

상기 종류의 분비 세포들의 배지내에 축적하는, 재조합 변형된 VWF 단백질은 세포 배양 배지내 원하는 단백질과 다른 물질들 사이의, 크기, 전하, 소수성, 용해도, 특정 친화도 등의 차이를 이용하는 방법들을 포함하는, 다양한 생화학적 및 크로마토그래피 방법들에 의해 농축 및 정제될 수 있다.

상기 정제법의 예는 예를 들면, HLEP, 바람직하게는 인간 알부민에 대한, 또는 고체 지지체 상에서 고정된 각 응고인자에 대한, 모노클론 항체에 재조합 변이체 단백질을 흡수시키는 방법이다. 변형된 VWF를 지지체에 흡수하고, 세척하고 및 탈착한후, 단백질은 상기 특성들에 기초한 다양한 크로마토그래피 기술들에 의해 추가로 정제될 수 있다.

정제 단계들의 순서는 예를 들면, 단계들의 생산능력 및 선택성, 지지체 또는 다른 양태들의 안정성에 따라 선택된다. 바람직한 정제 단계들은 이온교환 크로마토그래피 단계들, 면역친화도 크로마토그래피 단계들, 친화도 크로마토그래피 단계들, 소수성 상호반응 크로마토그래피 단계들, 염색 크로마토그래피 단계들, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 단계들, 다중모드 크로마토그래피 단계들, 및 크기배제 크로마토그래피 단계들을 포함하지만, 여기에 국한되지는 않는다.

바이러스 오염의 이론적인 위험을 최소화하기 위해, 바이러스를 효과적으로 불활성화시키거나 제거하는 추가 단계들이 공정에 포함될 수 있다. 상기 단계들은, 예를 들면, 액체 또는 고체 상태에서의 열처리, 용매 및/또는 세제에 의한 처리, 가시광선 또는 UV 스펙트럼에서의 방사선, 감마-방사선 또는 나노여과이다.

본 발명의 변형된 폴리뉴클레오티드들(예를 들면, DNA)은 사람 유전자 치료법에 사용하기 위한 전이 벡터로 통합될 수도 있다.

본원에 설명된 다양한 구현예들은 서로 조합될 수 있다. 본 발명은 이하의 실시예들에 보다 상세히 추가로 설명될 것이다. 본 발명의 특정 구현예들은 첨부된 도면들과 결합하여 설명될 것이다.

본 발명에 설명된 바와 같은 변형된 VWF는 치료적 용도를 위한 약학적 제제로 배합될 수 있다. 정제된 단백질은 첨가될 수 있는 종래의 생리적으로 적합한 수성 버퍼 용액, 선택적으로 약학적 제제를 제공하기 위한 약학적 부형제내에 용해될 수 있다.

상기 약학적 담체들 및 부형제들 뿐만 아니라 적당한 약학적 제형들은 당 분야에 잘 알려져 있다(예를 들면, "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) or "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3rd edition, Kibbe et al., Pharmaceutical Press (2000) 참조). 표준 약학적 배합기술들은 당업자들에게 잘 알려져 있다(예를 들면, 2005 Physicians' Desk Reference®, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed., Gennaro et al., Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000 참조). 특히, 본 발명의 폴리펩티드 변종을 포함하는 약학적 조성물은 동결건조된 또는 안정한 액체 형태로 배합될 수 있다. 폴리펩티드 변종은 당 분야에 공지된 다양한 과정들에 의해 동결건조될 수 있다. 동결건조된 제형들은 주사용 멸균수 또는 멸균 생리식염용액과 같은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제들을 첨가하여 사용하기 전에 재구성된다.

조성물의 제형들은 임의의 약학적으로 적당한 투여수단들에 의해 각각에 전달된다. 다양한 전달시스템들이 공지되어 있으며, 임의의 편리한 경로에 의해 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 우선적으로는, 본 발명의 조성물은 전신투여된다. 전신사용을 위해, 본 발명의 단백질은 종래 방법들에 따른 비경구적(예를 들면, 정맥내, 피하, 근육내, 복강내, 뇌내, 폐내, 코내 또는 경피) 또는 장내(예를 들면, 경구, 질내 또는 직장내) 전달을 위해 배합된다. 가장 우선적인 투여경로들은 정맥내 및 피하 투여이다. 제형들은 주입 또는 볼루스 주사에 의해 연속투여될 수 있다. 일부 제형들은 서방 시스템들을 포함한다.

본 발명의 단백질은 견딜 수 없는 유해 부작용들을 생성하는 투여량에 도달하지 않으면서 치료되는 질환 또는 증상의 심각도 또는 확산도를 막거나 줄이는, 원하는 효과를 내기에 충분한 투여량을 의미하는, 치료적으로 유효한 투여량으로 환자들에게 투여된다. 정확한 투여량은 많은 요소들, 예를 들면 증상, 제형 및 투여방법에 따라 다르며, 각 증상에 대한 임상전 및 임상 실험에서 측정되어야 한다.

본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제들과 조합하여 투여될 수 있다. 상기 제제들은 동일한 약제의 일부로서 포함될 수 있다. 상기 제제의 한 예는 변형된 VWF와 FVIII와의 조합이다.

본원에 언급된 서열들은 표 2에 요약되어 있다.

서열번호	설명
1	서열번호 2를 인코딩하는 DNA의 뉴클레오티드 서열
2	인간 VWF 전-프로폴리펩티드의 아미노산 서열
3	인간 VWF의 D' 도메인의 아미노산 서열
4	성숙 인간 VWF의 아미노산 서열
5	S764G/S766Y
6	S764P/S766I
7	S764P/S766M
8	S764V/S766Y
9	S764E/S766Y
10	S764Y/S766Y
11	S764L/S766Y
12	S764P/S766W
13	S766W/S806A
14	S766Y/P769K
15	S766Y/P769N
16	S766Y/P769R
17	S764P/S766L
18	인간 인자 VIII의 아미노산 서열
19	성숙 단일-사슬 인자 VIII의 아미노산 서열
20	인간 혈청 알부민의 아미노산 서열

실시예들

실시예 1

개선된 FVIII 결합을 갖는 vWF 점 돌연변이체

배경

위에 설명한 바와 같이, 대부분의 순환하는 FVIII은 VWF와의 복합체이다. 인간에 있어서, FVIII는 VWF의 부재하에 및 존재하에 각각, 약 2시간 및 16시간의 t_1/2에 의해 혈액으로부터 클리어된다. VWF가 FVIII 반감기 증가를 부여하더라도, 그의 반감기에 의해 지시된 t_1/2에 대한 상한이 있다. 미국특허 제8,575,104호에는 VWF-알부민 융합 단백질이 개시되어 있다. 이 융합 단백질은 설치류 모델에서 야생형 VWF보다 5배 긴 반감기를 가진다. 이 융합 단백질과 FVIII 사이의 안정한 복합체는 FVIII에 대하여 추가적인 반감기 이득을 부여할 수 있다. FVIII/vWF 상호작용을 위한 평형 결합상수가 높더라도, 결합 동역학은 빠르며, VWF-알부민 융합 단백질과의 복합체내 임의의 FVIII은 융합시에 내인성 vWF와 신속하게 교환할 것이다. 따라서, VWF-알부민 융합에 의한 FVIII의 오프-비율이 네이티브 VWF에 의한 FVIII의 오프-비율과 실질적으로 균등하다면, 그후 VWF-알부민 융합은 FVIII의 반감기에 임의의 실질적인 증가를 제공하지 않을 것이다.

따라서, FVIII의 반감기를 연장하기 위해 VWF-알부민 융합의 더 긴 반감기의 잇점을 취하기 위해, VWF-알부민 융합에 의해 FVIII의 오프-비율을 감소시킬 필요가 있다. VWF의 수준이 정상이지만 FVIII와 연합할 수 있는 VWF의 능력이 심각하게 감소되는, 타입 2N 폰 빌레브란트 질병을 갖는 환자들에게서 측정의 잇점을 얻는 모델링 연구로부터, FVIII 반감기를 임상적으로 관련하여 개선하기 위해서는 오프-비율의 적어도 5배 감소가 필요하다는 것이 추정된다. FVIII VWF-알부민 융합 오프-비율 감소와 FVIII 반감기 증가 사이의 상정된 관계는 표 3에 개시되어 있다.

FVIII VWF-알부민 융합 오프-비율 감소	FVIII 반감기의 상정된 증가 (5x 반감기가 연장된 VWF를 갖는, 50 IU/kg의 FVIII 및 100 IU/kg의 VWF)
2배	2.2
3배	2.6
5배	3
10배	3.6
20배	4.1

FVIII VWF-알부민 융합 오프-비율을 감소시키기 위한 노력에서, 변이체 VWF-알부민 융합 단백질이 유의미하게 더 느린 FVIII 오프-비율을 제공할 수 있는지 여부를 평가하기 위해 실험을 진행하여, VWF-알부민 융합 단백질과의 안정적인 연합을 통해 FVIII의 반감기를 연장시키기 위한 실현가능한 옵션을 제공하였다.

결합된 FVIII의 해리 속도를 늦추기 위한 의도로, vWF의 아미노산 위치들 764, 765, 766, 768, 769, 773, 806 및 809 주위에서 일련의 변이체들을 구조하였다. 이 실험들에서, FVIII의 재조합 형태가 사용되었다. 이 FVIII은 Zollner et al 2013, Thrombosis Research, 132:280-287에 설명되어 있다. 초기에 시스테인을 제외한, 모든 유전적 인코딩된 아미노산들로 돌연변이된 상기 잔기들 중 하나를 가진 vWF 구조물들에 대하여 FVIII 결합을 측정하였다. 그리고, 알부민 융합에 의해 제공된 반감기 연장이 FcRn-매개된 재순환에 의존함에 따라, 변이체들의 수를 pH 5.5에서 시험하였다. 다양한 돌연변이들에 대한 결과들은 표 4 내지 19에 개시되어 있다.

방법들

인간 폰 빌레브란트 인자(vWF; 아미노산들(aa) 764-1270; GenBank 등록번호 NP_000543 및 Zhou et al 2012 Blood 120: 449-458에 의해 설명된 도메인 경계들에 기초함)의 D' 및 D3 도메인들을 인코딩하는 합성, 코돈-최적화 cDNA는 GeneART AG(Regensberg, Germany)로부터 입수하였다. 이는 5' 말단에서 그의 신호 펩티드(aa1-22)를 인코딩하기 위해, 및 3' 말단에서 C-말단 8xHis-태그를 인코딩하기 위해 변형되었다. 구조물(Hu-vWF[764-1270]-8His)은 오픈리딩 프레임의 3' 말단에서 개시 메티오닌 및 이중 정지코돈(TGA)의 Kozak 컨센서스 서열(GCCACC) 업스트림 및 자동화 시퀀싱에 의해 확인된 플라스미드 서열을 갖는, pcDNA3.1 포유동물 발현벡터(Invitrogen, USA)로 방향성있게 클로닝되었다. 그후, 이 발현 플라스미드는 표준 PCR 기술들을 사용하여 Ser764, Leu765, Ser766 또는 Lys773에서 단일, 이중 또는 삼중 잔기변화들을 이루기 위한 주형으로서 사용되었으며, 그 구조물들을 pcDNA3.1로 클로닝하고, 상기 설명한 바와 같이 시퀀싱하였다. C-말단 FLAG 태그(DYKDDDDK)를 갖는 Hu-vWF의 D1 및 D2 도메인들(aa1-762)을 인코딩하는 제2 코돈-최적화 cDNA도 또한 합성하였으며, GeneArt으로부터 입수하였으며; 이는 상기와 같이 pcDNA3.1로 클로닝되고, 및 시퀀싱되었다.

전이 포유동물 발현을 위해, 프리스타일TM 293 서스펜션 세포들(Invitrogen)을 5㎖ 프리스타일 발현 배지(Freestyle Expression)(Invitrogen)내에서 1.1 × 10⁶ 세포들/㎖로 성장시켰다. 7μL 293Fectin(Invitrogen) 트랜스펙션 제제를 167μL Opti-MEM I 배지(Invitrogen)와 5분간 사전-배양한후, 2.5㎍ 플라스미드 DNA 인코딩 야생형/변이체 Hu-vWF[764-1270]-8His 플러스 2.5㎍ 플라스미드 DNA 인코딩 Hu-vWF[1-762]-FLAG에 첨가하고, 및 그 혼합물을 추가로 20분동안 배양하였다. DNA-293Fectin 복합체를 세포들에 첨가하고, 셰이킹 배양기내에서 250rpm에서 37℃, 8% CO₂에서 6일간 배양하였다. 2000rpm에서 5분간 원심분리에 의해 배양액 상층액을 수확하고, 4℃에서 분석을 위해 저장하였다.

37℃에서 Biacore 4000 바이오센서를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 결합 동역학들을 조사하였다. 항-His 항체에 의해 사전-고정된 CM-5 센서 칩 상에서 40-150RU의 밀도로 세포 배양액 배지로부터 각 변이체를 포획하였다(14,000RU). 초기 스크리닝 연구에서, 1nM에서 5분간 상기 포획된 변이체들 상에 FVIII를 주사하고, 5분간 해리를 모니터링하였다. 그후, 야생형에 대하여 kd 감소를 나타낸 변이체들을 1, 0.5 및 0.25nM에서 5분간 주사된 FVIII에 의해 재-조사하고, 해리를 30분간 모니터링하였다.

(유일하게 고정된 항 His 항체를 함유하는) 참조 스팟으로부터, 및 블랭크 주사로부터 신호들을 공제함으로써 모든 센서그램들을 이중 참조하였다. 이중 참조된 센서그램을 1:1 동역학 모델로 핏팅함으로써, 결합 동역학들을 측정하였다.

결과들

세린 764를 프롤린으로 돌연변이생성하여, 오프-비율이 약 3.5배 감소되고, 친화도가 4.4배 증가된 vWF 변이체를 생성하였다. 위치 765에서의 돌연변이에 의해, 야생형 vWF에 관하여 임의의 양호한 결합제들이 생성되지 않았다. 위치 766에서의 수많은 돌연변이들에 의하면, 야생형 vWF보다 개선된 오프-비율 특성들 및 높은 친화도를 갖는 변이체 vWF 분자들이 생성되었다(His, Arg, Val, Tyr, Trp, Thr, Phe, Ile, Gln, Gly & Asn). 위치 764에서의 프롤린이 오프-비율을 크게 개선한 반면, 위치 766에서의 수많은 돌연변이들이 결합에 긍정적으로 영향을 끼쳤음을 고려하면, S764P 및, 위치 766에서 시스테인을 제외한, 모든 다른 유전적 인코딩된 아미노산들로 구성된 일련의 변이체들이 생성되었다. S764P 및, 위치 765에서 시스테인을 제외한, 모든 다른 유전적 인코딩된 아미노산들을 함유한 유사한 돌연변이들이 생성되었다. 많은 상기 이중 변이체들은 야생형 vWF에 관해 크게 느려진 오프-비율 및 높은 친화도를 가진다. 특히, S766I와 조합한 S764P는 22배 감소된 오프-비율 및 30배 증가한 친화도를 갖는 vWF 변종을 생성한다.

실시예 2

점 돌연변이체와의 인간 혈청 알부민 vWF 융합 및 FVIII 결합

표준 NHS/EDC 커플링 화학을 사용하여, 마우스 항-HSA 항체를 CM5 칩 상에 고정시켰다. 전형적으로, 고정 수준은 10,000 내지 12,000RU이었다. vWF-HSA(단량체들 및 이량체들)의 각 배치를 0.1~1㎍/㎖ 범위의 다양한 농도에서 2분간 각 유동세포내에서 단일 스팟상에 포획하였다. 포획 수준은 40-150RU 범위이었다. 항-vWF가 고정되었지만 vWF-HSA가 포획되지 않은 인접한 스팟을 참조로 사용하였다. FVIII 결합 분석전에 매 주기마다 포획을 수행하였다.

상호반응의 친화도 및 분석의 pH에 따라 다른 다양한 농도에서, 모든 유동 세포들에서 모든 스팟들 상에서 FVIII을 무작위 및 이중으로 주사하였다. FVIII의 연합 및 해리는 최상의 적합한 상호반응이 일어나는 다양한 시간 프레임에 대하여 모니터링되었다.

해리기간후, 25mM 글리신 pH 2.6를 30초 주사하여 표면을 재생하였다. 러닝 버퍼 처리량은 10mM HEPES, 150mM NaCl, 10mM Na 시트레이트, 2.5mM CaCl₂, 0.1% BSA, pH 7.3 및 pH 5이었으며, 반면 유속은 30㎕/분이었다. 각 상호반응은 37℃에서 4회 측정되었다(n=4).

참조 스팟에 대한 결합 반응들은 vWF-HSA 포획된 스팟들의 반응들로부터 공제되었다. 그후 블랭크 주사로부터의 반응들은 다른 모든 샘플들의 반응들로부터 공제되어, 이중-참조된 센서그램들을 생성하였다. 이중 참조된 센서그램들을, 질량이동제한을 위한 용어를 포함하는, 1:1 동역학 모델로 핏팅하였다. 연합 및 해리 속도들을 전반적으로 핏팅하고, Rmax를 국소적으로 핏팅하였다. 얻은 결과들은 표 20 및 21에 개시되어 있다.

S764X 변이체들, 여기에서 X는 시스테인을 제외한, 남은 유전적 인코딩된 아미노산들 중 하나이다.
변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S764P	9.07E+06	3.25E-04	3.58E-11
S764Y	8.07E+06	8.87E-04	1.10E-10
S764E	6.38E+06	7.43E-04	1.16E-10
S764L	8.47E+06	9.95E-04	1.18E-10
S764A	6.85E+06	8.08E-04	1.18E-10
S764G	6.82E+06	8.18E-04	1.20E-10
S764I	9.02E+06	1.27E-03	1.41E-10
S764W	9.46E+06	1.41E-03	1.49E-10
wt	7.33E+06	1.15E-03	1.57E-10
wt	7.43E+06	1.18E-03	1.59E-10
S76R	1.06E+07	1.77E-03	1.67E-10
S764F	8.14E+06	1.40E-03	1.72E-10
S764N	6.21E+06	1.26E-03	2.03E-10
S764M	8.94E+06	1.90E-03	2.12E-10
S764V	7.30E+06	1.69E-03	2.32E-10
S764T	7.17E+06	1.89E-03	2.64E-10
S764D	6.27E+06	1.68E-03	2.68E-10
S76H	8.96E+06	2.78E-03	3.10E-10
S76K	1.59E+07	5.09E-03	3.19E-10
S764Q	2.97E+06	2.04E-03	6.86E-10

L765X 변이체들, 여기에서 X는 시스테인을 제외한, 남은 유전적 인코딩된 아미노산들 중 하나이다.
변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
WT-L765A	3.40E+07	7.88E-03	2.32E-10
WT-L765N	N/D
WT-L765Q	N/D
WT-L765G	N/D
WT-L765I	6.01E+06	1.16E-03	1.92E-10
WT-L765M	6.81E+06	1.95E-03	2.87E-10
WT-L765F	8.91E+06	1.74E-03	1.96E-10
WT-L765P	1.13E+08	4.80E-02	4.25E-10
WT-L765S	3.46E+07	9.13E-03	2.64E-10
WT-L765T	7.53E+07	1.75E-02	2.32E-10
WT-L765W	3.53E+07	1.42E-02	4.03E-10
WT-L765Y	8.44E+07	4.36E-02	5.17E-10
WT-L765V	6.24E+06	4.76E-03	7.63E-10
WT-L765D	N/D
WT-L765E	N/D
WT-L765R	1.32E+08	1.55E-02	1.17E-10
WT-L765H	N/D
WT-L765K	N/D
WT	7.33E+06	1.15E-03	1.57E-10

N/D : 약한 결합, 나쁜 핏, 신속한 오프 비율

S766X 변이체들, 여기에서 X는 시스테인을 제외한, 남은 유전적 인코딩된 아미노산들 중 하나이다.
변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
WT-S766A	7.47E+06	1.54E-03	2.06E-10
WT-S766N	8.71E+06	8.80E-04	1.01E-10
WT-S766Q	7.42E+06	5.16E-04	6.94E-11
WT-S766G	9.34E+06	1.88E-03	2.01E-10
WT-S766I	6.17E+06	7.93E-04	1.29E-10
WT-S766L	7.31E+06	1.21E-03	1.65E-10
WT-S766M	N/D
WT-S766F	7.46E+06	2.74E-04	3.67E-11
WT-S766P	1.16E+07	3.45E-03	2.98E-10
WT-S766T	7.12E+06	4.98E-04	7.00E-11
WT-S766W	6.62E+06	2.03E-04	3.07E-11
WT-S766Y	6.98E+06	1.95E-04	2.79E-11
WT-S766V	6.01E+06	2.60E-04	4.33E-11
WT-S766D	N/D
WT-S766E	2.53E+07	1.89E-03	7.48E-11
WT-S766R	9.04E+06	3.63E-04	4.02E-11
WT-S766H	7.19E+06	3.06E-04	4.25E-11
WT-S766K	1.02E+07	3.22E-03	3.14E-10
WT	7.33E+06	1.15E-03	1.57E-10

N/D : 약한 결합, 나쁜 핏, 신속한 오프 비율

변이체	Ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
WT-K773T	1.42E+07	6.97E-04	4.92E-11
WT-K773A	5.81E+06	8.83E-04	1.52E-10
WT-K773L	1.88E+07	1.10E-03	5.86E-11
WT-K773R	1.45E+07	1.23E-03	8.46E-11
WT-K773Q	8.60E+06	1.45E-03	1.68E-10
WT-K773M	1.57E+07	2.35E-03	1.50E-10
WT-K773S	1.35E+07	3.23E-03	2.40E-10
WT-K773P	9.58E+06	3.33E-03	3.48E-10
WT-K773I	7.66E+07	4.09E-03	5.35E-11
WT-K773V	5.39E+07	5.23E-03	9.70E-11
WT-K773H	1.19E+09	1.57E-01	1.32E-10
WT-K773N	3.61E+09	8.36E-01	2.32E-10
WT-K773W	N/D
WT-K773E	N/D
WT-K773D	N/D
WT-K773G	N/D
WT-K773F	N/D
WT-K773Y	N/D
WT	7.33E+06	1.15E-03	1.57E-10

N/D : 결합이 존재하지만, 정확한 동역학 변수들이 측정될 수 없었다

S764P, L765X 변이체들, 여기에서 X는 시스테인을 제외한, 남은 유전적 인코딩된 아미노산들 중 하나이다.
변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S764P-L765A	3.07E+07	2.78E-02	9.06E-10
S764P-L765N	N/D
S764P-L765Q	8.12E+06	7.14E-03	8.80E-10
S764P-L765G	N/D
S764P-L765I	8.08E+06	9.52E-05	1.18E-11
S764P-L765M	9.76E+06	2.37E-04	2.43E-11
S764P-L765F	1.69E+07	6.32E-04	3.73E-11
S764P-L765P	1.02E+07	2.42E-04	2.38E-11
S764P-L765S	N/D
S764P-L765T	1.39E+07	8.82E-03	6.34E-10
S764P-L765W	7.97E+06	5.14E-03	6.45E-10
S764P-L765Y	6.19E+06	2.20E-03	3.55E-10
S764P-L765V	6.19E+06	2.20E-03	3.55E-10
S764P-L765D	N/D
S764P-L765E	N/D
S764P-L765R	N/D
S764P-L765H	1.16E+07	6.42E-03	5.55E-10
S764P-L765K	N/D
WT	7.33E+06	1.15E-03	1.57E-10

N/D : 약한 결합, 나쁜 핏, 신속한 오프-비율

S764P, S766X 변이체들, 여기에서 X는 시스테인을 제외한, 남은 유전적 인코딩된 아미노산들 중 하나이다.
변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S764P-S766A	1.35E+07	1.66E-04	1.23E-11
S764P-S766N	8.82E+06	9.14E-05	1.04E-11
S764P-S766Q	1.20E+07	1.23E-04	1.02E-11
S764P-S766G	1.79E+07	3.88E-04	2.17E-11
S764P-S766I	9.84E+06	5.14E-05	5.23E-12
S764P-S766L	1.44E+07	8.74E-05	6.06E-12
S764P-S766M	1.18E+07	5.76E-05	4.88E-12
S764P-S766F	1.35E+07	1.00E-04	7.41E-12
S764P-S766P	2.56E+07	2.17E-03	8.48E-11
S764P-S766T	9.01E+06	1.05E-04	1.16E-11
S764P-S766W	1.10E+07	8.00E-05	7.27E-12
S764P-S766Y	1.08E+07	7.71E-05	7.16E-12
S764P-S766V	8.19E+05	7.82E-05	9.56E-11
S764P-S766D	9.41E+06	1.20E-04	1.27E-11
S764P-S766E	8.04E+06	1.28E-04	1.60E-11
S764P-S766R	1.29E+07	1.19E-04	9.21E-12
S764P-S766H	1.40E+07	9.47E-05	6.76E-12
S764P-S766K	2.15E+07	3.01E-04	1.40E-11
WT	7.33E+06	1.15E-03	1.57E-10

N/D : 약한 결합, 나쁜 핏, 신속한 오프-비율

변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S764P-K773R	6.39E+06	7.42E-05	1.16E-11
S764P-K773T	4.68E+06	7.50E-05	1.60E-11
S764P-K773Q	4.44E+06	1.28E-04	2.88E-11
S764P-K773V	1.55E+07	1.57E-04	1.01E-11
S764P-K773I	1.79E+07	1.69E-04	9.43E-12
S764P-K773M	1.58E+07	1.70E-04	1.08E-11
S764P-K773A	6.37E+06	1.89E-04	2.97E-11
S764P-K773S	2.16E+07	3.06E-04	1.42E-11
S764P-K773N	5.50E+06	3.47E-04	6.31E-11
S764P-K773P	2.26E+07	5.01E-04	2.22E-11
S764P-K773L	4.60E+05	5.72E-04	1.24E-09
S764P-K773H	1.65E+07	6.36E-04	3.86E-11
S764P-K773G	1.75E+07	7.62E-04	4.36E-11
S764P-K773F	1.02E+07	1.23E-03	1.21E-10
S764P-K773Y	1.63E+07	1.36E-03	8.35E-11
S764P-K773D	1.77E+07	2.40E-03	1.36E-10
S764P-K773W	1.25E+07	3.21E-03	2.57E-10
S764P-K773E	6.73E+07	5.15E-03	7.65E-11
WT	7.33E+06	1.15E-03	1.57E-10

변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S766Y-K773T	1.20E+07	2.69E-04	2.24E-11
S766Y-K773L	1.79E+07	3.45E-04	1.92E-11
S766Y-K773R	1.40E+07	4.69E-04	3.35E-11
S766Y-K773I	8.02E+06	5.69E-04	7.10E-11
S766Y-K773M	1.97E+07	6.59E-04	3.35E-11
S766Y-K773V	1.74E+07	8.61E-04	4.94E-11
S766Y-K773Q	2.39E+07	9.39E-04	3.93E-11
S766Y-K773A	1.88E+07	1.22E-03	6.51E-11
S766Y-K773S	1.75E+07	1.38E-03	7.85E-11
S766Y-K773G	6.02E+07	1.97E-03	3.27E-11
S766Y-K773P	2.16E+07	2.43E-03	1.12E-10
S766Y-K773F	2.05E+07	3.24E-03	1.58E-10
S766Y-K773W	2.93E+07	3.93E-03	1.34E-10
S766Y-K773Y	2.24E+07	4.04E-03	1.80E-10
S766Y-K773E	1.84E+07	4.81E-03	2.61E-10
S766Y-K773N	5.15E+07	5.07E-03	9.84E-11
S766Y-K773H	5.47E+07	6.20E-03	1.14E-10
S766Y-K773D	1.25E+08	4.27E-02	3.43E-10
WT	7.33E+06	1.15E-03	1.57E-10

변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S764G/S766Y	1.37E+07	2.69E-05	1.96E-12
S764V/S766Y	2.99E+07	6.41E-05	2.15E-12
S764A/S766Y	2.98E+07	7.21E-05	2.42E-12
S764E/S766Y	1.97E+07	7.64E-05	3.87E-12
S764P-S766Y	1.08E+07	7.71E-05	7.16E-12
S764Y/S766Y	3.19E+07	7.88E-05	2.47E-12
S764L/S766Y	3.52E+07	7.99E-05	2.27E-12
S764N/S766Y	1.28E+07	8.88E-05	6.92E-12
S764R/S766Y	3.23E+07	9.20E-05	2.85E-12
S764F/S766Y	7.68E+06	9.36E-05	1.22E-11
S764I/S766Y	1.03E+07	9.52E-05	9.23E-12
S764W/S766Y	8.88E+06	9.67E-05	1.09E-11
S764M/S766Y	7.15E+06	1.03E-04	1.44E-11
S764Q/S766Y	1.19E+07	1.09E-04	9.18E-12
S764D/S766Y	3.78E+07	1.18E-04	3.12E-12
S764T/S766Y	2.58E+07	1.36E-04	5.27E-12
S764H/S766Y	4.56E+07	2.92E-04	6.39E-12
S764K/S766Y	1.89E+07	8.22E-04	4.35E-11
WT	7.33E+06	1.15E-03	1.57E-10

변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S764P-L765H-S766I	1.56E+06	6.60E-05	4.24E-11
S764P-L765V-S766I	5.62E+07	1.16E-04	2.07E-12
S764P-L765M-S766I	5.69E+07	1.37E-04	2.41E-12
S764P-L765W-S766I	1.11E+06	1.46E-04	1.32E-10
S764P-L765Q-S766I	1.15E+06	2.86E-04	2.48E-10
S764P-L765K-S766I	6.88E+07	1.50E-03	2.18E-11
S764P-L765Y-S766I	5.17E+07	1.90E-03	3.67E-11
S764P-L765T-S766I	1.15E+08	3.31E-03	2.87E-11
S764P-L765I-S766I	6.34E+06	1.03E-02	1.62E-09
S764P-L765G-S766I	5.04E+07	1.22E-02	2.41E-10
S764P-L765R-S766I	7.96E+07	1.73E-02	2.18E-10
S764P-L765E-S766I	1.03E+06	5.50E-02	5.36E-08
S764P-L765F-S766I	N/D
S764P-L765N-S766I	N/D
S764P-L765D-S766I	N/D
S764P-L765P-S766I	N/D
S764P-L765S-S766I	N/D
S764P-L765A-S766I	N/D

N/D : 결합이 존재했지만, 정확한 동역학 변수들은 측정될 수 없었다.

변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
dupS764/S764P/S766I	6.23E+06	1.59E-03	2.55E-10
dupS764/S764P/S766I	1.25E+07	2.50E-03	1.99E-10
dS764-dL765-S766I
dS764-dL765-S766Y	N/D
delS764-S766Y	6.20E+06	2.07E-04	3.34E-11
delS764-S766W	6.60E+06	3.15E-04	4.78E-11
delS764-S766L	6.21E+06	5.85E-04	9.42E-11
delS764-S766M	7.25E+06	7.26E-04	1.00E-10
delS764-S766I	7.09E+06	8.27E-04	1.17E-10
delS764-S766S	7.30E+06	8.46E-04	1.16E-10

N/D : 결합이 존재했지만, 정확한 동역학 변수들은 측정될 수 없었다.

PH 5.5
변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S764P-S766W	2.77E+05	4.75E-05	1.72E-10
S764P-S766M	3.14E+05	9.16E-05	2.92E-10
S764P-S766L	4.45E+05	1.04E-04	2.34E-10
WT	2.03E+06	3.88E-02	1.91E-08
S764P-S766I	N/D
S764P-S766Y	N/D
S764P-S766H	N/D

N/D : 결합이 존재했지만, 정확한 동역학 변수들은 측정될 수 없었다.

S766W, L809X 변이체들, 여기에서 X는 시스테인을 제외한, 남은 유전적 인코딩된 아미노산들 중 하나이다.
변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S766W-L809A	4.45E+06	1.15E-03	2.58E-10
S766W-L809D	4.46E+06	1.90E-03	4.25E-10
S766W-L809E	5.84E+06	1.55E-03	2.65E-10
S766W-L809F	3.26E+06	7.44E-04	2.28E-10
S766W-L809G	6.21E+06	2.26E-03	3.63E-10
S766W-L809H	2.87E+06	1.14E-03	3.97E-10
S766W-L809I	5.23E+06	5.41E-04	1.03E-10
S766W-L809K	7.00E+06	1.53E-03	2.19E-10
S766W-L809M	4.99E+06	5.81E-04	1.17E-10
S766W-L809N	6.15E+06	2.27E-03	3.69E-10
S766W-L809P	NB	NB	NB
S766W-L809Q	5.33E+06	1.13E-03	2.12E-10
S766W-L809R	6.07E+06	2.13E-03	3.52E-10
S766W-L809S	6.54E+06	1.44E-03	2.20E-10
S766W-L809T	8.72E+06	1.41E-03	1.61E-10
S766W-L809V	7.70E+06	9.40E-04	1.22E-10
S766W-L809W	4.81E+06	3.12E-03	6.48E-10
S766W-L809Y	6.77E+06	3.39E-03	5.00E-10
vWF WT	4.98E+06	8.86E-04	1.78E-10

S766W, S806X 변이체들, 여기에서 X는 시스테인을 제외한, 남은 유전적 인코딩된 아미노산들 중 하나이다.
변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S766W-S806A	4.84E+06	3.76E-04	7.78E-11
S766W-S806D	4.20E+06	6.88E-04	1.64E-10
S766W-S806E	5.93E+06	1.29E-03	2.17E-10
S766W-S806F	NB	NB	NB
S766W-S806G	5.46E+06	1.34E-03	2.45E-10
S766W-S806H	8.90E+06	8.28E-04	9.30E-11
S766W-S806I	1.58E+06	4.47E-04	2.83E-10
S766W-S806K	N/D
S766W-S806L	NB	NB	NB
S766W-S806M	2.05E+06	8.72E-04	4.25E-10
S766W-S806N	3.84E+06	5.85E-04	1.52E-10
S766W-S806P	4.26E+06	5.66E-04	1.33E-10
S766W-S806Q	4.33E+06	1.76E-03	4.07E-10
S766W-S806R	8.28E+06	1.07E-02	1.29E-09
S766W-S806T	5.25E+06	6.54E-04	1.25E-10
S766W-S806V	4.17E+06	6.19E-04	1.49E-10
S766W-S806W	NB	NB	NB
S766W-S806Y	NB	NB	NB
vWF WT	4.98E+06	8.86E-04	1.78E-10

N/D : 결합이 존재했지만, 정확한 동역학 변수들은 측정될 수 없었다.

S766Y, P769X 변이체들, 여기에서 X는 시스테인을 제외한, 남은 유전적 인코딩된 아미노산들 중 하나이다.
변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S766Y-P769A	4.90E+06	5.19E-04	1.06E-10
S766Y-P769D	4.63E+06	7.63E-04	1.65E-10
S766Y-P769E	4.42E+06	4.14E-04	9.36E-11
S766Y-P769F	5.54E+06	4.27E-04	7.72E-11
S766Y-P769G	3.70E+06	7.83E-04	2.12E-10
S766Y-P769H	5.16E+06	4.17E-04	8.09E-11
S766Y-P769I	NB	NB	NB
S766Y-P769K	6.31E+06	3.83E-04	6.07E-11
S766Y-P769L	6.44E+06	5.90E-04	9.17E-11
S766Y-P769M	4.75E+06	5.11E-04	1.08E-10
S766Y-P769N	1.60E+07	5.20E-04	3.25E-11
S766Y-P769Q	NB	NB	NB
S766Y-P769R	6.55E+06	2.95E-04	4.50E-11
S766Y-P769S	4.51E+06	5.11E-04	1.13E-10
S766Y-P769T	5.11E+06	5.00E-04	9.79E-11
S766Y-P769V	6.65E+06	5.65E-04	8.49E-11
S766Y-P769W	4.77E+06	4.21E-04	8.82E-11
S766Y-P769Y	4.68E+06	3.96E-04	8.47E-11
vWF WT	4.98E+06	8.86E-04	1.78E-10

S766Y, R768X 변이체들, 여기에서 X는 시스테인을 제외한, 남은 유전적 인코딩된 아미노산들 중 하나이다.
변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S766Y-R768A	6.99E+06	1.48E-03	2.12E-10
S766Y-R768D	4.94E+06	4.48E-03	9.08E-10
S766Y-R768E	5.65E+06	3.22E-03	5.69E-10
S766Y-R768F	6.51E+06	1.82E-03	2.79E-10
S766Y-R768G	3.20E+06	1.02E-03	3.20E-10
S766Y-R768H	4.02E+06	6.90E-04	1.72E-10
S766Y-R768I	5.03E+06	8.99E-04	1.79E-10
S766Y-R768K	3.83E+06	4.17E-04	1.09E-10
S766Y-R768L	4.24E+06	5.48E-04	1.29E-10
S766Y-R768M	4.08E+06	8.01E-04	1.96E-10
S766Y-R768N	4.18E+06	7.98E-04	1.91E-10
S766Y-R768P	6.71E+06	1.43E-03	2.13E-10
S766Y-R768Q	3.48E+06	6.06E-04	1.74E-10
S766Y-R768S	5.33E+06	1.29E-03	2.43E-10
S766Y-R768T	5.59E+06	1.43E-03	2.56E-10
S766Y-R768V	4.51E+06	9.18E-04	2.03E-10
S766Y-R768W	4.42E+06	9.40E-04	2.13E-10
S766Y-R768Y	6.74E+06	1.87E-03	2.77E-10
vWF WT	4.98E+06	8.86E-04	1.78E-10

FVIII에 대한 이량체 결합 (pH7.3)
변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S764P-S766I	1.01E+07 (±3.41E6)	5.00E-05 (±3.37E-6)	3.96E-12 (±2.6E-13)
S764P-S766W	1.24E+07 (±7.28E5)	6.21E-05 (±2.52E-6	4.96E-12 (±1.9E-13)
S766Y	1.03E+07 (±3.01E6)	2.36E-04 (±4.27E-5)	2.51E-11 (±3.83E-12)
S764E-S766Y	7.75E+06 (±1.71E6)	2.36E-04 (±2.90E-5)	3.25E-11 (±4.57E-12)
S764I-S766W	7.54E+06 (±5.15E5)	2.41E-04 (±5.05E-6)	3.25E-11 (±2.25E-12)
S764G-S766Y	1.19E+07 (±9.1E5)	2.63E-04 (±1.41E-5)	2.29E-11 (±3.42E-12)
S766Y-P769R	1.18E+07 (±4.1E5)	2.75E-04 (±1.71E-5)	2.32E-11 (±9.54E-13)
S766Y-P769K	1.09E+07 (±1.37E6)	2.85E-04 (±2.08E-5)	2.68E-11 (±1.55E-12)
S766W-S806A	8.88E+06 (±1.11E6)	3.00E-04 (±1.9E-5)	3.54E-11 (±4.37E-12)
S764Y-S766Y	1.14E+07 (±1.71E6)	3.34E-04 (±2.7E-5)	3.07E-11 (±3.53E-12)
S766Y-S769N	1.21E+07 (±1.11E6)	3.48E-04 (±3.21E-5)	2.89E-11 (±1.75E-12)
S764A	1.26E+07 (±1.38E6)	6.38E-04 (±3.24E-5)	5.14E-11 (±2.81E-12)
WT	1.89E+07 (±2.68E6)	1.47E-03 (±8.92E-5)	8.25E-11 (±7.94E-12)

FVIII에 대한 이량체 결합 (pH5.5)
변이체	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
S764P-S766I	3.10E+06 (±3.05E5)	1.81E-03 (±6.34E-5)	5.98E-10 (±4.93E-11)
S764P-S766W	3.02E+06 (±2.39E5)	1.88E-03 (±1.78E-5)	6.37E-10 (±5.75E-11)
S764E-S766Y	2.43E+06 (±1.6E5)	2.71E-03 (±9.8E-5)	1.12E-09 (±5.29E-11)
S764Y-S766Y	3.22E+06 (±1.24E5)	3.45E-03 (±9.01E-5)	1.07E-09 (±4.67E-11)
S766Y-P769R	4.66E+06 (±1.47E5)	6.54E-03 (±2.02E-4)	1.40E-09 (±2.29E-11)
S764I-S766W	3.28E+06 (±1.22E5)	7.24E-03 (±2.89E-4)	2.21E-09 (±5.78E-11)
S766Y-P769K	4.14E+06 (±2.95E5)	7.40E-03 (±3.9E-4)	1.79E-09 (±1.27E-10)
S766Y	3.50E+06 (±2.5E5)	7.40E-03 (±2.12E-3)	2.92E-09 (±1.38E-10)
S766Y-S769N	2.05E+06 (±2.02E5)	1.02E-02 (±7.84E-4)	5.01E-09 (±2.67E-10)
S766W-S806A	8.13E+05 (±2.83E5)	1.40E-02 (±6.74E-4)	1.43E-08 (±2.38E-9)
S764G-S766Y	2.66E+06 (±4.55E5)	1.85E-02 (±1.12E-3)	7.53E-09 (±1.15E-9)
S764A	2.25E+06 (±1.42E6)	4.01E-02 (±2.54E-3)	5.26E-08 (±3.33E-9)
WT	1.37E+06 (±2.44E5)	4.26E-02 (±3.9E-3)	3.54E-08 (±2.89E-9)

SEQUENCE LISTING <110> CSL Ltd <120> Modified Von Willebrand Factor <130> A187 <210> 1 <211> 8442 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgattcctg ccagatttgc cggggtgctg cttgctctgg ccctcatttt gccagggacc 60 ctttgtgcag aaggaactcg cggcaggtca tccacggccc gatgcagcct tttcggaagt 120 gacttcgtca acacctttga tgggagcatg tacagctttg cgggatactg cagttacctc 180 ctggcagggg gctgccagaa acgctccttc tcgattattg gggacttcca gaatggcaag 240 agagtgagcc tctccgtgta tcttggggaa ttttttgaca tccatttgtt tgtcaatggt 300 accgtgacac agggggacca aagagtctcc atgccctatg cctccaaagg gctgtatcta 360 gaaactgagg ctgggtacta caagctgtcc ggtgaggcct atggctttgt ggccaggatc 420 gatggcagcg gcaactttca agtcctgctg tcagacagat acttcaacaa gacctgcggg 480 ctgtgtggca actttaacat ctttgctgaa gatgacttta tgacccaaga agggaccttg 540 acctcggacc cttatgactt tgccaactca tgggctctga gcagtggaga acagtggtgt 600 gaacgggcat ctcctcccag cagctcatgc aacatctcct ctggggaaat gcagaagggc 660 ctgtgggagc agtgccagct tctgaagagc acctcggtgt ttgcccgctg ccaccctctg 720 gtggaccccg agccttttgt ggccctgtgt gagaagactt tgtgtgagtg tgctgggggg 780 ctggagtgcg cctgccctgc cctcctggag tacgcccgga cctgtgccca ggagggaatg 840 gtgctgtacg gctggaccga ccacagcgcg tgcagcccag tgtgccctgc tggtatggag 900 tataggcagt gtgtgtcccc ttgcgccagg acctgccaga gcctgcacat caatgaaatg 960 tgtcaggagc gatgcgtgga tggctgcagc tgccctgagg gacagctcct ggatgaaggc 1020 ctctgcgtgg agagcaccga gtgtccctgc gtgcattccg gaaagcgcta ccctcccggc 1080 acctccctct ctcgagactg caacacctgc atttgccgaa acagccagtg gatctgcagc 1140 aatgaagaat gtccagggga gtgccttgtc acaggtcaat cacacttcaa gagctttgac 1200 aacagatact tcaccttcag tgggatctgc cagtacctgc tggcccggga ttgccaggac 1260 cactccttct ccattgtcat tgagactgtc cagtgtgctg atgaccgcga cgctgtgtgc 1320 acccgctccg tcaccgtccg gctgcctggc ctgcacaaca gccttgtgaa actgaagcat 1380 ggggcaggag ttgccatgga tggccaggac gtccagctcc ccctcctgaa aggtgacctc 1440 cgcatccagc atacagtgac ggcctccgtg cgcctcagct acggggagga cctgcagatg 1500 gactgggatg gccgcgggag gctgctggtg aagctgtccc ccgtctatgc cgggaagacc 1560 tgcggcctgt gtgggaatta caatggcaac cagggcgacg acttccttac cccctctggg 1620 ctggcggagc cccgggtgga ggacttcggg aacgcctgga agctgcacgg ggactgccag 1680 gacctgcaga agcagcacag cgatccctgc gccctcaacc cgcgcatgac caggttctcc 1740 gaggaggcgt gcgcggtcct gacgtccccc acattcgagg cctgccatcg tgccgtcagc 1800 ccgctgccct acctgcggaa ctgccgctac gacgtgtgct cctgctcgga cggccgcgag 1860 tgcctgtgcg gcgccctggc cagctatgcc gcggcctgcg cggggagagg cgtgcgcgtc 1920 gcgtggcgcg agccaggccg ctgtgagctg aactgcccga aaggccaggt gtacctgcag 1980 tgcgggaccc cctgcaacct gacctgccgc tctctctctt acccggatga ggaatgcaat 2040 gaggcctgcc tggagggctg cttctgcccc ccagggctct acatggatga gaggggggac 2100 tgcgtgccca aggcccagtg cccctgttac tatgacggtg agatcttcca gccagaagac 2160 atcttctcag accatcacac catgtgctac tgtgaggatg gcttcatgca ctgtaccatg 2220 agtggagtcc ccggaagctt gctgcctgac gctgtcctca gcagtcccct gtctcatcgc 2280 agcaaaagga gcctatcctg tcggcccccc atggtcaagc tggtgtgtcc cgctgacaac 2340 ctgcgggctg aagggctcga gtgtaccaaa acgtgccaga actatgacct ggagtgcatg 2400 agcatgggct gtgtctctgg ctgcctctgc cccccgggca tggtccggca tgagaacaga 2460 tgtgtggccc tggaaaggtg tccctgcttc catcagggca aggagtatgc ccctggagaa 2520 acagtgaaga ttggctgcaa cacttgtgtc tgtcgggacc ggaagtggaa ctgcacagac 2580 catgtgtgtg atgccacgtg ctccacgatc ggcatggccc actacctcac cttcgacggg 2640 ctcaaatacc tgttccccgg ggagtgccag tacgttctgg tgcaggatta ctgcggcagt 2700 aaccctggga cctttcggat cctagtgggg aataagggat gcagccaccc ctcagtgaaa 2760 tgcaagaaac gggtcaccat cctggtggag ggaggagaga ttgagctgtt tgacggggag 2820 gtgaatgtga agaggcccat gaaggatgag actcactttg aggtggtgga gtctggccgg 2880 tacatcattc tgctgctggg caaagccctc tccgtggtct gggaccgcca cctgagcatc 2940 tccgtggtcc tgaagcagac ataccaggag aaagtgtgtg gcctgtgtgg gaattttgat 3000 ggcatccaga acaatgacct caccagcagc aacctccaag tggaggaaga ccctgtggac 3060 tttgggaact cctggaaagt gagctcgcag tgtgctgaca ccagaaaagt gcctctggac 3120 tcatcccctg ccacctgcca taacaacatc atgaagcaga cgatggtgga ttcctcctgt 3180 agaatcctta ccagtgacgt cttccaggac tgcaacaagc tggtggaccc cgagccatat 3240 ctggatgtct gcatttacga cacctgctcc tgtgagtcca ttggggactg cgcctgcttc 3300 tgcgacacca ttgctgccta tgcccacgtg tgtgcccagc atggcaaggt ggtgacctgg 3360 aggacggcca cattgtgccc ccagagctgc gaggagagga atctccggga gaacgggtat 3420 gagtgtgagt ggcgctataa cagctgtgca cctgcctgtc aagtcacgtg tcagcaccct 3480 gagccactgg cctgccctgt gcagtgtgtg gagggctgcc atgcccactg ccctccaggg 3540 aaaatcctgg atgagctttt gcagacctgc gttgaccctg aagactgtcc agtgtgtgag 3600 gtggctggcc ggcgttttgc ctcaggaaag aaagtcacct tgaatcccag tgaccctgag 3660 cactgccaga tttgccactg tgatgttgtc aacctcacct gtgaagcctg ccaggagccg 3720 ggaggcctgg tggtgcctcc cacagatgcc ccggtgagcc ccaccactct gtatgtggag 3780 gacatctcgg aaccgccgtt gcacgatttc tactgcagca ggctactgga cctggtcttc 3840 ctgctggatg gctcctccag gctgtccgag gctgagtttg aagtgctgaa ggcctttgtg 3900 gtggacatga tggagcggct gcgcatctcc cagaagtggg tccgcgtggc cgtggtggag 3960 taccacgacg gctcccacgc ctacatcggg ctcaaggacc ggaagcgacc gtcagagctg 4020 cggcgcattg ccagccaggt gaagtatgcg ggcagccagg tggcctccac cagcgaggtc 4080 ttgaaataca cactgttcca aatcttcagc aagatcgacc gccctgaagc ctcccgcatc 4140 gccctgctcc tgatggccag ccaggagccc caacggatgt cccggaactt tgtccgctac 4200 gtccagggcc tgaagaagaa gaaggtcatt gtgatcccgg tgggcattgg gccccatgcc 4260 aacctcaagc agatccgcct catcgagaag caggcccctg agaacaaggc cttcgtgctg 4320 agcagtgtgg atgagctgga gcagcaaagg gacgagatcg ttagctacct ctgtgacctt 4380 gcccctgaag cccctcctcc tactctgccc ccccacatgg cacaagtcac tgtgggcccg 4440 gggctcttgg gggtttcgac cctggggccc aagaggaact ccatggttct ggatgtggcg 4500 ttcgtcctgg aaggatcgga caaaattggt gaagccgact tcaacaggag caaggagttc 4560 atggaggagg tgattcagcg gatggatgtg ggccaggaca gcatccacgt cacggtgctg 4620 cagtactcct acatggtgac cgtggagtac cccttcagcg aggcacagtc caaaggggac 4680 atcctgcagc gggtgcgaga gatccgctac cagggcggca acaggaccaa cactgggctg 4740 gccctgcggt acctctctga ccacagcttc ttggtcagcc agggtgaccg ggagcaggcg 4800 cccaacctgg tctacatggt caccggaaat cctgcctctg atgagatcaa gaggctgcct 4860 ggagacatcc aggtggtgcc cattggagtg ggccctaatg ccaacgtgca ggagctggag 4920 aggattggct ggcccaatgc ccctatcctc atccaggact ttgagacgct cccccgagag 4980 gctcctgacc tggtgctgca gaggtgctgc tccggagagg ggctgcagat ccccaccctc 5040 tcccctgcac ctgactgcag ccagcccctg gacgtgatcc ttctcctgga tggctcctcc 5100 agtttcccag cttcttattt tgatgaaatg aagagtttcg ccaaggcttt catttcaaaa 5160 gccaatatag ggcctcgtct cactcaggtg tcagtgctgc agtatggaag catcaccacc 5220 attgacgtgc catggaacgt ggtcccggag aaagcccatt tgctgagcct tgtggacgtc 5280 atgcagcggg agggaggccc cagccaaatc ggggatgcct tgggctttgc tgtgcgatac 5340 ttgacttcag aaatgcatgg ggcgcgcccg ggagcctcaa aggcggtggt catcctggtc 5400 acggacgtct ctgtggattc agtggatgca gcagctgatg ccgccaggtc caacagagtg 5460 acagtgttcc ctattggaat tggagatcgc tacgatgcag cccagctacg gatcttggca 5520 ggcccagcag gcgactccaa cgtggtgaag ctccagcgaa tcgaagacct ccctaccatg 5580 gtcaccttgg gcaattcctt cctccacaaa ctgtgctctg gatttgttag gatttgcatg 5640 gatgaggatg ggaatgagaa gaggcccggg gacgtctgga ccttgccaga ccagtgccac 5700 accgtgactt gccagccaga tggccagacc ttgctgaaga gtcatcgggt caactgtgac 5760 cgggggctga ggccttcgtg ccctaacagc cagtcccctg ttaaagtgga agagacctgt 5820 ggctgccgct ggacctgccc ctgcgtgtgc acaggcagct ccactcggca catcgtgacc 5880 tttgatgggc agaatttcaa gctgactggc agctgttctt atgtcctatt tcaaaacaag 5940 gagcaggacc tggaggtgat tctccataat ggtgcctgca gccctggagc aaggcagggc 6000 tgcatgaaat ccatcgaggt gaagcacagt gccctctccg tcgagctgca cagtgacatg 6060 gaggtgacgg tgaatgggag actggtctct gttccttacg tgggtgggaa catggaagtc 6120 aacgtttatg gtgccatcat gcatgaggtc agattcaatc accttggtca catcttcaca 6180 ttcactccac aaaacaatga gttccaactg cagctcagcc ccaagacttt tgcttcaaag 6240 acgtatggtc tgtgtgggat ctgtgatgag aacggagcca atgacttcat gctgagggat 6300 ggcacagtca ccacagactg gaaaacactt gttcaggaat ggactgtgca gcggccaggg 6360 cagacgtgcc agcccatcct ggaggagcag tgtcttgtcc ccgacagctc ccactgccag 6420 gtcctcctct taccactgtt tgctgaatgc cacaaggtcc tggctccagc cacattctat 6480 gccatctgcc agcaggacag ttgccaccag gagcaagtgt gtgaggtgat cgcctcttat 6540 gcccacctct gtcggaccaa cggggtctgc gttgactgga ggacacctga tttctgtgct 6600 atgtcatgcc caccatctct ggtttataac cactgtgagc atggctgtcc ccggcactgt 6660 gatggcaacg tgagctcctg tggggaccat ccctccgaag gctgtttctg ccctccagat 6720 aaagtcatgt tggaaggcag ctgtgtccct gaagaggcct gcactcagtg cattggtgag 6780 gatggagtcc agcaccagtt cctggaagcc tgggtcccgg accaccagcc ctgtcagatc 6840 tgcacatgcc tcagcgggcg gaaggtcaac tgcacaacgc agccctgccc cacggccaaa 6900 gctcccacgt gtggcctgtg tgaagtagcc cgcctccgcc agaatgcaga ccagtgctgc 6960 cccgagtatg agtgtgtgtg tgacccagtg agctgtgacc tgcccccagt gcctcactgt 7020 gaacgtggcc tccagcccac actgaccaac cctggcgagt gcagacccaa cttcacctgc 7080 gcctgcagga aggaggagtg caaaagagtg tccccaccct cctgcccccc gcaccgtttg 7140 cccacccttc ggaagaccca gtgctgtgat gagtatgagt gtgcctgcaa ctgtgtcaac 7200 tccacagtga gctgtcccct tgggtacttg gcctcaaccg ccaccaatga ctgtggctgt 7260 accacaacca cctgccttcc cgacaaggtg tgtgtccacc gaagcaccat ctaccctgtg 7320 ggccagttct gggaggaggg ctgcgatgtg tgcacctgca ccgacatgga ggatgccgtg 7380 atgggcctcc gcgtggccca gtgctcccag aagccctgtg aggacagctg tcggtcgggc 7440 ttcacttacg ttctgcatga aggcgagtgc tgtggaaggt gcctgccatc tgcctgtgag 7500 gtggtgactg gctcaccgcg gggggactcc cagtcttcct ggaagagtgt cggctcccag 7560 tgggcctccc cggagaaccc ctgcctcatc aatgagtgtg tccgagtgaa ggaggaggtc 7620 tttatacaac aaaggaacgt ctcctgcccc cagctggagg tccctgtctg cccctcgggc 7680 tttcagctga gctgtaagac ctcagcgtgc tgcccaagct gtcgctgtga gcgcatggag 7740 gcctgcatgc tcaatggcac tgtcattggg cccgggaaga ctgtgatgat cgatgtgtgc 7800 acgacctgcc gctgcatggt gcaggtgggg gtcatctctg gattcaagct ggagtgcagg 7860 aagaccacct gcaacccctg ccccctgggt tacaaggaag aaaataacac aggtgaatgt 7920 tgtgggagat gtttgcctac ggcttgcacc attcagctaa gaggaggaca gatcatgaca 7980 ctgaagcgtg atgagacgct ccaggatggc tgtgatactc acttctgcaa ggtcaatgag 8040 agaggagagt acttctggga gaagagggtc acaggctgcc caccctttga tgaacacaag 8100 tgtctggctg agggaggtaa aattatgaaa attccaggca cctgctgtga cacatgtgag 8160 gagcctgagt gcaacgacat cactgccagg ctgcagtatg tcaaggtggg aagctgtaag 8220 tctgaagtag aggtggatat ccactactgc cagggcaaat gtgccagcaa agccatgtac 8280 tccattgaca tcaacgatgt gcaggaccag tgctcctgct gctctccgac acggacggag 8340 cccatgcagg tggccctgca ctgcaccaat ggctctgttg tgtaccatga ggttctcaat 8400 gccatggagt gcaaatgctc ccccaggaag tgcagcaagt ga 8442 <210> 2 <211> 2813 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ile Pro Ala Arg Phe Ala Gly Val Leu Leu Ala Leu Ala Leu Ile 1 5 10 15 Leu Pro Gly Thr Leu Cys Ala Glu Gly Thr Arg Gly Arg Ser Ser Thr 20 25 30 Ala Arg Cys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Phe Val Asn Thr Phe Asp Gly 35 40 45 Ser Met Tyr Ser Phe Ala Gly Tyr Cys Ser Tyr Leu Leu Ala Gly Gly 50 55 60 Cys Gln Lys Arg Ser Phe Ser Ile Ile Gly Asp Phe Gln Asn Gly Lys 65 70 75 80 Arg Val Ser Leu Ser Val Tyr Leu Gly Glu Phe Phe Asp Ile His Leu 85 90 95 Phe Val Asn Gly Thr Val Thr Gln Gly Asp Gln Arg Val Ser Met Pro 100 105 110 Tyr Ala Ser Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Thr Glu Ala Gly Tyr Tyr Lys 115 120 125 Leu Ser Gly Glu Ala Tyr Gly Phe Val Ala Arg Ile Asp Gly Ser Gly 130 135 140 Asn Phe Gln Val Leu Leu Ser Asp Arg Tyr Phe Asn Lys Thr Cys Gly 145 150 155 160 Leu Cys Gly Asn Phe Asn Ile Phe Ala Glu Asp Asp Phe Met Thr Gln 165 170 175 Glu Gly Thr Leu Thr Ser Asp Pro Tyr Asp Phe Ala Asn Ser Trp Ala 180 185 190 Leu Ser Ser Gly Glu Gln Trp Cys Glu Arg Ala Ser Pro Pro Ser Ser 195 200 205 Ser Cys Asn Ile Ser Ser Gly Glu Met Gln Lys Gly Leu Trp Glu Gln 210 215 220 Cys Gln Leu Leu Lys Ser Thr Ser Val Phe Ala Arg Cys His Pro Leu 225 230 235 240 Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Ala Leu Cys Glu Lys Thr Leu Cys Glu 245 250 255 Cys Ala Gly Gly Leu Glu Cys Ala Cys Pro Ala Leu Leu Glu Tyr Ala 260 265 270 Arg Thr Cys Ala Gln Glu Gly Met Val Leu Tyr Gly Trp Thr Asp His 275 280 285 Ser Ala Cys Ser Pro Val Cys Pro Ala Gly Met Glu Tyr Arg Gln Cys 290 295 300 Val Ser Pro Cys Ala Arg Thr Cys Gln Ser Leu His Ile Asn Glu Met 305 310 315 320 Cys Gln Glu Arg Cys Val Asp Gly Cys Ser Cys Pro Glu Gly Gln Leu 325 330 335 Leu Asp Glu Gly Leu Cys Val Glu Ser Thr Glu Cys Pro Cys Val His 340 345 350 Ser Gly Lys Arg Tyr Pro Pro Gly Thr Ser Leu Ser Arg Asp Cys Asn 355 360 365 Thr Cys Ile Cys Arg Asn Ser Gln Trp Ile Cys Ser Asn Glu Glu Cys 370 375 380 Pro Gly Glu Cys Leu Val Thr Gly Gln Ser His Phe Lys Ser Phe Asp 385 390 395 400 Asn Arg Tyr Phe Thr Phe Ser Gly Ile Cys Gln Tyr Leu Leu Ala Arg 405 410 415 Asp Cys Gln Asp His Ser Phe Ser Ile Val Ile Glu Thr Val Gln Cys 420 425 430 Ala Asp Asp Arg Asp Ala Val Cys Thr Arg Ser Val Thr Val Arg Leu 435 440 445 Pro Gly Leu His Asn Ser Leu Val Lys Leu Lys His Gly Ala Gly Val 450 455 460 Ala Met Asp Gly Gln Asp Val Gln Leu Pro Leu Leu Lys Gly Asp Leu 465 470 475 480 Arg Ile Gln His Thr Val Thr Ala Ser Val Arg Leu Ser Tyr Gly Glu 485 490 495 Asp Leu Gln Met Asp Trp Asp Gly Arg Gly Arg Leu Leu Val Lys Leu 500 505 510 Ser Pro Val Tyr Ala Gly Lys Thr Cys Gly Leu Cys Gly Asn Tyr Asn 515 520 525 Gly Asn Gln Gly Asp Asp Phe Leu Thr Pro Ser Gly Leu Ala Glu Pro 530 535 540 Arg Val Glu Asp Phe Gly Asn Ala Trp Lys Leu His Gly Asp Cys Gln 545 550 555 560 Asp Leu Gln Lys Gln His Ser Asp Pro Cys Ala Leu Asn Pro Arg Met 565 570 575 Thr Arg Phe Ser Glu Glu Ala Cys Ala 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Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys 1805 1810 1815 Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys 1820 1825 1830 Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His 1835 1840 1845 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu 1850 1855 1860 Asn Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu 1865 1870 1875 Phe Phe Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu 1880 1885 1890 Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu 1895 1900 1905 Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly 1910 1915 1920 Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln 1925 1930 1935 Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile 1940 1945 1950 His Ser Ile His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys 1955 1960 1965 Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe 1970 1975 1980 Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val 1985 1990 1995 Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu 2000 2005 2010 Phe Leu Val Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala 2015 2020 2025 Ser Gly His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr 2030 2035 2040 Gly Gln Trp Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser 2045 2050 2055 Ile Asn Ala Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val 2060 2065 2070 Asp Leu Leu Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly 2075 2080 2085 Ala Arg Gln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile 2090 2095 2100 Met Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn 2105 2110 2115 Ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser 2120 2125 2130 Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr 2135 2140 2145 Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg 2150 2155 2160 Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu 2165 2170 2175 Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser 2180 2185 2190 Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala 2195 2200 2205 Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val 2210 2215 2220 Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met 2225 2230 2235 Lys Val Thr Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr 2240 2245 2250 Ser Met Tyr Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly 2255 2260 2265 His Gln Trp Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe 2270 2275 2280 Gln Gly Asn Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp 2285 2290 2295 Pro Pro Leu Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp 2300 2305 2310 Val His Gln Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala 2315 2320 2325 Gln Asp Leu Tyr 2330 <210> 19 <211> 1444 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> mature single chain Factor VIII <400> 19 Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser Trp Asp Tyr 1 5 10 15 Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro 20 25 30 Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys 35 40 45 Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro 50 55 60 Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu Val 65 70 75 80 Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro Val 85 90 95 Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala 100 105 110 Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys Val 115 120 125 Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn 130 135 140 Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser 145 150 155 160 His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu 165 170 175 Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu 180 185 190 His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp 195 200 205 His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser 210 215 220 Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arg 225 230 235 240 Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His 245 250 255 Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu 260 265 270 Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile 275 280 285 Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly 290 295 300 Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His Asp Gly Met 305 310 315 320 Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg 325 330 335 Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp 340 345 350 Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser Pro Ser Phe 355 360 365 Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp Val His 370 375 380 Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu Val Leu 385 390 395 400 Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro 405 410 415 Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr 420 425 430 Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile 435 440 445 Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile 450 455 460 Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile 465 470 475 480 Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys 485 490 495 His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys 500 505 510 Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys 515 520 525 Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala 530 535 540 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser Val Asp 545 550 555 560 Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe 565 570 575 Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln 580 585 590 Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe 595 600 605 Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val Phe Asp Ser 610 615 620 Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu 625 630 635 640 Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr 645 650 655 Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro 660 665 670 Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp 675 680 685 Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala 690 695 700 Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu 705 710 715 720 Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 725 730 735 Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Arg Ser Thr Arg 740 745 750 Gln Lys Gln Phe Asn Ala Thr Thr Ile Pro Glu Asn Thr Thr Leu Gln 755 760 765 Ser Asp Gln Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met 770 775 780 Lys Lys Glu Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro 785 790 795 800 Arg Ser Phe Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu 805 810 815 Arg Leu Trp Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn 820 825 830 Arg Ala Gln Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln 835 840 845 Glu Phe Thr Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu 850 855 860 Asn Glu His Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu 865 870 875 880 Asp Asn Ile Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser 885 890 895 Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala 900 905 910 Glu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe 915 920 925 Trp Lys Val Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys 930 935 940 Lys Ala Trp Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His 945 950 955 960 Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn 965 970 975 Pro Ala His Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe 980 985 990 Thr Ile Phe Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu 995 1000 1005 Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr 1010 1015 1020 Phe Lys Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met 1025 1030 1035 Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg 1040 1045 1050 Trp Tyr Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile 1055 1060 1065 His Phe Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr 1070 1075 1080 Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val 1085 1090 1095 Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu 1100 1105 1110 Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val 1115 1120 1125 Tyr Ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His 1130 1135 1140 Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp 1145 1150 1155 Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala 1160 1165 1170 Trp Ser Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu 1175 1180 1185 Ala Pro Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln 1190 1195 1200 Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser 1205 1210 1215 Leu Asp Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly 1220 1225 1230 Thr Leu Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys 1235 1240 1245 His Asn Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu 1250 1255 1260 His Pro Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu 1265 1270 1275 Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu 1280 1285 1290 Ser Lys Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe 1295 1300 1305 Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His 1310 1315 1320 Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro 1325 1330 1335 Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr 1340 1345 1350 Gly Val Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr 1355 1360 1365 Val Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp 1370 1375 1380 Thr Leu Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn 1385 1390 1395 Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu 1400 1405 1410 Leu Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln 1415 1420 1425 Ile Ala Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu 1430 1435 1440 Tyr <210> 20 <211> 585 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585

Claims (45)

1. 인자 VIII와 결합하는 변형된 폴리펩티드로서,
   상기 변형된 폴리펩티드는 서열번호 3에 개시된 서열을 포함하고, 상기 서열은 변형된 폴리펩티드가 변형되지않은 서열번호 3을 포함하는 참조 폴리펩티드보다 적어도 5배 낮은 오프 비율(off-rate)로 인자 VIII와 결합하도록, 위치 1 또는 3에서 적어도 하나의 변형을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 참조 폴리펩티드보다 적어도 10배 낮은 오프 비율로 인자 VIII와 결합하는, 변형된 폴리펩티드.
3. 제1항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 참조 폴리펩티드보다 적어도 5배 낮은 KD로 인자 VIII와 결합하는, 변형된 폴리펩티드.
4. 제3항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 참조 폴리펩티드보다 적어도 10배 낮은 오프 비율로 인자 VIII와 결합하는, 변형된 폴리펩티드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드는 적어도 2개의 변형을 포함하고, 상기 변형은 적어도 서열번호 3의 위치들 1 및 3에 있는, 변형된 폴리펩티드.
6. 인자 VIII와 결합하는 변형된 폴리펩티드로서,
   상기 변형된 폴리펩티드는 서열번호 3에 개시된 서열을 포함하고, 상기 서열은 변형된 폴리펩티드가 변형되지않은 서열번호 3을 포함하는 참조 폴리펩티드보다 낮은 오프 비율로 인자 VIII와 결합하도록, 적어도 위치 3에서 변형을 포함하는 것인, 변형된 폴리펩티드.
7. 제6항에 있어서, 변형된 폴리펩티드는 적어도 2개의 변형을 포함하고, 상기 변형은 적어도 서열번호 3의 위치들 1 및 3에 있는, 변형된 폴리펩티드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 3에서의 잔기가 Y, I, M 및 W로 구성된 그룹으로부터 선택되도록 서열번호 3이 변형되는, 변형된 폴리펩티드.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 위치 1에서의 잔기가 G, P, V, E, Y, A 및 L로 구성된 그룹으로부터 선택되도록 서열번호 3이 변형되는, 변형된 폴리펩티드.
10. 인자 VIII와 결합하는 변형된 폴리펩티드로서,
    상기 변형된 폴리펩티드는 서열번호 3에 개시된 서열을 포함하고, 상기 서열은 변형된 폴리펩티드가 변형되지않은 서열번호 3을 포함하는 참조 폴리펩티드보다 낮은 오프 비율로 인자 VIII와 결합하도록, 적어도 위치 1에서 변형을 포함하고, 위치 1에서의 잔기가 G, P, E, Y, A 및 L로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 변형된 폴리펩티드.
11. 제10항에 있어서, 위치 3에서의 잔기가 Y, I, M, V, F, H, R 및 W로 구성된 그룹으로부터 선택되도록 서열번호 3이 변형되는, 변형된 폴리펩티드.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 서열번호 5(S764G/S766Y)를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 서열번호 6(S764P/S766I)를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 서열번호 7(S764P/S766M)를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
15. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 서열번호 8(S764V/S766Y)를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 서열번호 9(S764E/S766Y)를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
17. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 서열번호 10(S764Y/S766Y)를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
18. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 서열번호 11(S764L/S766Y)를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 서열번호 12(S764P/S766W)를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
20. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 서열번호 13(S766W/S806A)를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 서열번호 14(S766Y/P769K)를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
22. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 서열번호 15(S766Y/P769N)를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
23. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 서열번호 16(S766Y/P769R)를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
24. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 서열번호 17(S764P/S766L)를 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 변형된 폰 빌레브란트 인자(VWF)인, 변형된 폴리펩티드.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 폴리펩티드가 반감기 개선 단백질(HLEP)을 추가로 포함하는, 변형된 폴리펩티드.
27. 제26항에 있어서, HLEP가 알부민인, 변형된 폴리펩티드.
28. 제27항에 있어서, 알부민의 N-말단이 변형된 폴리펩티드 서열의 C-말단에 직접 또는 스페이서를 통해 융합되는, 변형된 폴리펩티드.
29. 제28항에 있어서, 변형된 폴리펩티드의 천연 C-말단에서 1 내지 5개의 아미노산들이 삭제된, 변형된 폴리펩티드.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 인자 VIII 분자 및 변형된 폴리펩티드를 포함하는 복합체.
31. 출혈성 질환을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 변형된 폴리펩티드 또는 제30항의 복합체.
32. 제31항에 있어서, 출혈성 질환이 폰 빌레브란트 질병(VWD) 또는 A형 혈우병인, 변형된 폴리펩티드 또는 복합체.
33. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 변형된 폴리펩티드 또는 제30항의 복합체를 포함하는, 약학적 조성물.
34. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 변형된 폴리펩티드 또는 제30항의 복합체의 약학적으로 효과적인 양을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 출혈성 질환의 치료 방법.
35. 제34항에 있어서, 출혈성 질환이 폰 빌레브란트 질병(VWD) 또는 A형 혈우병인, 방법.
36. 출혈성 질환을 치료하기 위한 약제를 제조하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 변형된 폴리펩티드 또는 제30항의 복합체의 용도.
37. 제36항에 있어서, 출혈성 질환이 폰 빌레브란트 질병(VWD) 또는 A형 혈우병인, 용도.
38. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 변형된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
39. 제38항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 또는 벡터.
40. 제39항에 있어서, 상기 플라스미드 또는 벡터가 발현 벡터인, 플라스미드 또는 벡터.
41. 제38항의 폴리뉴클레오티드 또는 제39항 또는 제40항의 플라스미드를 포함하는 숙주 세포.
42. 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법으로서,
    (i) 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드가 발현되도록 하는 조건하에 제41항의 숙주 세포들을 배양하는 단계; 및
    (ii) 변형된 VWF를 포함하는 폴리펩티드를 숙주 세포들 또는 배양 배지로부터 선택적으로 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
43. VWF의 인자 VIII 결합 친화도를 증가시키는 방법으로서,
    서열번호 3의 위치 1 및 3, 또는 위치 3 및 9, 또는 위치 3 및 43에서의 잔기들이 변경되도록 VWF 아미노산 서열의 D' 도메인으로 적어도 2개의 돌연변이들을 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
44. 제43항에 있어서, 돌연변이후 D' 도메인의 서열이 서열번호 5 내지 17로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 방법.
45. 인자 VIII의 반감기를 증가시키는 방법으로서,
    인자 VIII을 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 변형된 폴리펩티드와 혼합하는 단계를 포함하는, 방법.