KR20170044061A

KR20170044061A - 간세포의 분화 상태의 판정 방법 및 이것에 사용되는 신규한 분화 마커

Info

Publication number: KR20170044061A
Application number: KR1020167035101A
Authority: KR
Inventors: 유키노부 하야시다
Original assignee: 와꼬 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2014-08-20
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2017-04-24
Also published as: US10711307B2; EP3184643A1; JPWO2016027842A1; WO2016027842A1; CN106661604A; US20170342490A1; EP3184643B1; EP3184643A4; JP6593335B2

Abstract

미분화 간세포의 분화 상태를 분화의 초기 단계에서 판정할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명은, 「간세포의 FOXB2 유전자의 발현을 검출하고, 그 결과에 기초하여 판정을 실시하는 세포의 분화 상태의 판정 방법」 및 「FOXB2 유전자 유래의 mRNA 또는 단백질에서 선택되는 분화 마커」 에 관한 것이다. 본 발명은, 간세포의 품질 관리나 분화 세포의 조제·단리 방법에 응용할 수 있다. 또한 본 발명은 배양 초기에서 분화한 세포를 판정할 수 있으므로, 세포의 조기 스크리닝이나 간세포의 품질 관리에 유용하고, 배양 기간의 단축, 배지대의 경비 삭감 등을 기대할 수 있다.

Description

간세포의 분화 상태의 판정 방법 및 이것에 사용되는 신규한 분화 마커 {METHOD FOR DETERMINING STATE OF DIFFERENTIATION OF STEM CELLS, AND NOVEL DIFFERENTIATION MARKER USED THEREFOR}

본 발명은 간세포의 분화 상태를 분화의 초기 단계에서 판정할 수 있는 신규한 분화 마커에 관한 것이다.

ES 세포 (Embryonic Stem cell, 배성 간세포) 나 iPS 세포 (Induced Pluripoent Stem Cell, 인공 다능성 간세포) 등의 다능성 간세포는, 그 다능성을 유지하기 위해서, 예를 들어 피더 세포와 공배양하는 피더 유래의 조건 배지 (CM) 에서 배양하는 배지에 basic FGF (bFGF/FGF2, basic Fibroblast Growth Factor, 염기성 섬유아 세포 증식 인자) 나 LIF (leukemia inhibitory factor) 를 첨가하는 등의 기술이 필요하다. 그렇지 않으면, 환경이나 세포의 컨디션이 원인으로 다분화능을 상실하여, 용이하게 분화되어 버리는 경우가 있다. 그 때문에, 간세포의 미분화 상태 (다능성을 갖는 상태) 나 분화 상태를 정확하게 아는 것은 중요하다.

또, 재생 의료 분야에서는, 다능성 간세포를 목적으로 하는 세포로 분화시키고 나서 이식을 실시하지만, 그 이식시키는 세포에 미분화 세포가 혼입되어 있는 경우에는, 그것이 종양 형성의 원인이 될 위험성이 있다. 그래서, 분화 유도 처리한 다능성 간세포 중에 미분화 간세포가 혼입되어 있는지의 여부를 판정하는 기술은 중요하다.

그러나, 세포의 분화 상태를 세포의 외관으로부터 판단하는 것은 어렵다.

그래서, 다능성 간세포의 분화 상태를 판정하는 방법으로서, 분화 상태의 지표가 되는 마커를 검출하는 방법이 실시되고 있다. 예를 들어, 다능성 간세포의 다능성 마커로서, 알칼리 포스파타아제 (Alkaline Phosphatase), Nanog, Oct4, TRA-1-60, Sox, LIF-R 등이 알려져 있다. 다능성 간세포는, 미분화 상태에서 이들 마커를 발현하고 있으므로, 이들 마커를 검출함으로써, 간세포가 미분화 상태를 유지하고 있는지의 여부를 판단할 수 있다. 그러나 이들 마커는, 간세포가 어느 정도 분화된 상태 (예를 들어 3 배엽 중 어느 것까지) 가 아니면 분화 상태를 판정할 수 없다. 그 때문에, 미분화 세포가 그 미분화 상태 (다능성) 를 유지하고 있는지, 장래 분화할 분화능을 획득한 상태인지를 분화 유도 후의 분화의 초기 단계에서 판단하는 것은 곤란하였다.

한편, Fox (Forkhead box) 라고 불리는 포크헤드 또는 윙드·헬릭스 DNA 결합 도메인을 갖는 전사 인자의 1 군이 알려져 있고 (비특허문헌 1), 인간에서는 약 50 종류 존재하고 있는 것이 알려져 있다 (FOXB1, FOXB2 등). Fox 의 발현 단백질은, 주로 발생 조절 인자, 조직 특이적 조절 인자, 세포 주기 조절 인자로서 기능하고 있는 것을 알고 있지만, 거의 작용이 해명되어 있지 않은 것도 있다.

Eddy H van Roon, et al. Clinical Epigenetics 2013, Jan 16 ; 5(1) : 2. doi : 10.1186/1868-7083-5-2

본 발명의 과제는, 미분화 간세포의 분화 상태를 분화의 초기 단계에서 판정할 수 있는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명은 상기 과제를 해결할 목적에서 이루어진 것으로, 이하의 구성으로 이루어진다.

(1) 간세포의 FOXB2 유전자의 발현을 검출하고, 그 결과에 기초하여 판정을 실시하는 세포의 분화 상태의 판정 방법.

(2) FOXB2 유전자 유래의 mRNA 또는 단백질에서 선택되는 분화 마커.

basic FGF (bFGF, FGF2, basic Fibroblast Growth Factor, 염기성 섬유아 세포 증식 인자) 를 첨가한 배지에서 ES 세포나 iPS 세포 등의 미분화 세포를 배양하면, 당해 미분화 세포는 장기에 걸쳐, 그 미분화 상태를 유지한 채로 증식하는 것으로 알려져 있다.

본 발명자 등은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토한 결과, bFGF 무첨가 배지에서 iPS 세포를 배양하면 (분화 유도 처리), 배양 개시 후 3 ∼ 5 일에서, iPS 세포의 FOXB2 mRNA 발현이 검출되고, 또한 그 발현량이 현저하게 증가하는 현상을 확인하였다. 또, bFGF 를 첨가한 배지에서 배양하여 미분화 상태를 유지한 iPS 세포에서는, FOXB2 mRNA 의 발현은 확인되지 않는 것도 확인하였다. 이상으로부터, FOXB2 mRNA 가 ES 세포나 iPS 세포의 분화 마커로서 유용한 것, 그리고 그 발현을 측정함으로써, 분화의 초기 단계의 세포를 선별할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키는 데에 이르렀다.

본 발명의 방법을 실시함으로써, 간세포의 분화 상태를 분화의 초기 단계에서 판정할 수 있다. 또, 본 발명은, 간세포의 품질 관리나 분화 세포의 조제·단리 방법에 응용할 수 있다. 또한 본 발명은 배양 초기에서 분화된 세포를 판정할 수 있으므로, 세포의 조기 스크리닝이나 간세포의 품질 관리에 유용하고, 배양 기간의 단축, 배지대 (培地代) 의 경비 삭감 등을 기대할 수 있다.

도 1 은, 실시예 1 에 있어서 얻어진 hiPS 세포의 FOXB2 mRNA 의 발현을 RT-PCR 법에 의해 검출한 결과를 나타내는 전기 영동도이다. 도 1 에 있어서, (1) 은 FOXB2 mRNA 의 발현을 검출한 결과를, (2) 는 GAPDH mRNA 의 발현을 검출한 결과를, (3) 는 OCT3/4 mRNA 의 발현을 검출한 결과를, (4) 는 NANOG mRNA 의 발현을 검출한 결과를, (5) 는 SOX2 mRNA 의 발현을 검출한 결과를 각각 나타낸다.
도 2 는, 실시예 2 에 있어서 얻어진 FOXB2 mRNA 의 발현을 RT-PCR 법에 의해 검토한 결과를 나타내는 전기 영동도이다.
도 3 은, 실시예 3 에 있어서 얻어진 FOXB2 mRNA 의 발현을 RT-PCR 법에 의해 검토한 결과를 나타내는 전기 영동도이다.
도 4 는, 실시예 4 에 있어서 얻어진 Foxb2 mRNA 의 발현을 RT-PCR 법에 의해 검토한 결과를 나타내는 전기 영동도이다.
도 5 는, 참고예 1 에 있어서 얻어진 bFGF 무첨가 배지에서 배양한 hiPS 세포의 사진 (도 5(1)), 및 bFGF 첨가 배지에서 배양한 hiPS 세포의 사진 (도 5(2)) 이다.

본 발명에 관련된 간세포로는, 이른바 자기 복제 능력과 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 분화능을 갖는 세포를 들 수 있다. 예를 들어 다분화능 (다능성) 을 갖는 미분화 세포인 ES 세포, iPS 세포 외에, ntES 세포 (nuclear transfer Embryonic Stem Cell), EG 세포 (Embryonic Cell, 배성 생식 세포), EC 세포 (Embryonic Cell, 배성 암 줄기 세포) 등을 들 수 있다.

또, 간세포의 유래 동물로는, 예를 들어 인간, 소, 말, 개, 모르모트, 마우스, 래트 등의 포유 동물을 들 수 있다.

본 발명의 세포의 분화 상태의 판정 방법에 제공되는 피검세포인 간세포로는, 공지된 분화 유도 처리를 실시한 간세포나, 미분화 상태를 유지하는 처리를 실시한 간세포, 공지된 다능성 유도 처리를 실시하여 탈분화시킨 체세포 등을 들 수 있다.

미분화 간세포를 분화 유도 처리하는 방법으로는, 자체 공지된 방법이면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 공지된 분화 유도 물질로 세포를 처리한 후 배양하는 방법, bFGF 나 LIF 를 함유하지 않는 배지에서 배양하는 등의 미분화 간세포를 분화 유도되는 환경에서 배양하는 방법 등을 들 수 있다.

미분화 간세포의 분화를 유도하는 화학 물질 (분화 유도 물질) 로는, 예를 들어 신경 세포에의 분화를 유도하는 레티노산 (Retinoic Acid), 심근 세포에의 분화를 유도하는 스페르민 (Spermine), 부티르산나트륨 (Sodium Butyrate), 트리코스타틴 A (Trichostatin A), 마우스 ES 세포의 인슐린 산생 세포에의 분화를 유도하는 DNA 메틸트랜스페라제 저해제 (DNA Methyltransferase Inhibitor) 등이 알려져 있다.

「미분화 상태」 란, 예를 들어, 세포가 상기한 자기 복제 능력과 여러 가지 세포로 분화할 수 있는 분화능을 갖는 상태에 있는 것을 의미한다.

「미분화 상태를 유지하는 처리」 란, 예를 들어 공지된 간세포의 미분화 상태를 유지하는 처리이면 되지만, 예를 들어 피더 세포와의 공배양, 배지 중으로의 bFGF 나 LIF 의 첨가 처리 등을 들 수 있다.

본 발명에 관련된 FOXB2 유전자란, 판정에 제공되는 세포가 유래하는 동물종에 존재하는 FOXB2 단백질을 코드하는 유전자 DNA, RNA 등을 의미한다. 또, FOXB2 단백질의 동족체, 변이체, 및 유도체 등을 코드하는 유전자도 포함된다. 또한, 이들 유전자와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 염기 배열 및 이것을 함유하는 유전자나, FOXB2 유전자와 70 ％, 바람직하게는 80 ％, 보다 바람직하게는 95 ％, 더욱 더 바람직하게는 97 ％ 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 갖는 유전자 등도 포함된다.

구체적으로는, 예를 들어 인간 FOXB2 유전자로는, 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 (인간 FOXB2 mRNA 의 염기 배열) 에 대응하는 유전자나, 배열 번호 2 로 나타내는 단백질을 코드하는 염기 배열을 갖는 유전자, 또는 이들 염기 배열과 70 ％, 바람직하게는 80 ％, 보다 바람직하게는 95 ％, 더욱 더 바람직하게는 97 ％ 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 갖는 유전자를 들 수 있다.

예를 들어 마우스 Foxb2 유전자로는, 배열 번호 34 로 나타내는 염기 배열 (마우스 Foxb2 mRNA 의 염기 배열) 에 대응하는 유전자나, 배열 번호 35 로 나타내는 단백질을 코드하는 염기 배열을 갖는 유전자, 또는 이들의 염기 배열과 70 ％, 바람직하게는 80 ％, 보다 바람직하게는 95 ％, 더욱 더 바람직하게는 97 ％ 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 갖는 유전자를 들 수 있다.

본 발명에 관련된 FOXB2 mRNA 로는, 판정에 제공되는 세포가 유래하는 동물종에 존재하는 FOXB2 유전자로부터 전사된 mRNA, 예를 들어 상기한 FOXB2 유전자 유래의 mRNA 를 들 수 있다.

FOXB2 유전자 유래의 mRNA 로는, 예를 들어 인간 FOXB2 mRNA 로는, 이하의 것 등을 들 수 있다.

·배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열 (GenBank 등록 번호 NM_001013735) 을 갖는 mRNA

·배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열과 70 ％, 바람직하게는 80 ％, 보다 바람직하게는 95 ％, 더욱 더 바람직하게는 97 ％ 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 갖는 mRNA

·배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열을 코드하는 mRNA

·배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열의 1 ∼ 몇 개, 바람직하게는 1 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 혹은 치환된 아미노산 배열을 코드하는 mRNA

·배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열과 70 ％, 바람직하게는 80 ％, 보다 바람직하게는 95 ％, 더욱 더 바람직하게는 97 ％ 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열을 코드하는 mRNA.

예를 들어 마우스 Foxb2 mRNA 로는, 이하의 것 등을 들 수 있다.

·배열 번호 34 로 나타내는 염기 배열 (GenBank 등록 번호 NM_008023) 을 갖는 mRNA

·배열 번호 34 로 나타내는 염기 배열과 70 ％, 바람직하게는 80 ％, 보다 바람직하게는 95 ％, 더욱 더 바람직하게는 97 ％ 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 갖는 mRNA

·배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열을 코드하는 mRNA

·배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열의 1 ∼ 몇 개, 바람직하게는 1 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 혹은 치환된 아미노산 배열을 코드하는 mRNA

·배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열과 70 ％, 바람직하게는 80 ％, 보다 바람직하게는 95 ％, 더욱 더 바람직하게는 97 ％ 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열을 코드하는 mRNA

본 발명에 관련된 FOXB2 단백질로는, 판정에 제공되는 세포가 유래하는 동물종에 존재하는 FOXB2 유전자로부터 번역된 단백질을 들 수 있다. 이와 같은 FOXB2 단백질의 동족체, 변이체 및 유도체이어도 된다.

예를 들어 인간 FOXB2 단백질로는, 이하의 것 등을 들 수 있다.

·배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열 또는 그 1 개 혹은 몇 개, 바람직하게는 1 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 갖는 것

·배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열과 70 ％, 바람직하게는 80 ％, 보다 바람직하게는 95 ％, 더욱 더 바람직하게는 97 ％ 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열을 갖는 것

마우스 FOXB2 단백질로는, 이하의 것 등을 들 수 있다.

·배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열 또는 그 1 개 혹은 몇 개, 바람직하게는 1 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 갖는 것

·배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열과 70 ％, 바람직하게는 80 ％, 보다 바람직하게는 95 ％, 더욱 더 바람직하게는 97 ％ 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열을 갖는 것

<I. 본 발명의 세포의 분화 상태의 판정 방법>

본 발명의 세포의 분화 상태의 판정 방법은, 「간세포의 FOXB2 유전자의 발현을 검출하고, 그 결과에 기초하여 판정을 실시하는 세포의 분화 상태의 판정 방법」이다.

<I-1. FOXB2 유전자의 발현을 검출하는 방법>

FOXB2 유전자의 발현을 검출하는 방법으로는, FOXB2 mRNA 의 발현을 검출하는 방법, 또는 FOXB2 단백질의 발현을 검출하는 방법을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 「발현을 검출하는」 이라고 하는 경우, 「FOXB2 유전자가 발현했는지의 여부 (예를 들어 FOXB2 mRNA 또는 FOXB2 단백질의 존재의 유무) 를 검출하는」 경우와, 「FOXB2 유전자가 발현한 양 (예를 들어 FOXB2 mRNA 의 양, 또는 FOXB2 단백질의 양) 을 측정하는」 경우를 포함한다.

FOXB2 유전자의 발현의 검출은, 분화 유도 처리 후의 피검세포가, FOXB2 mRNA 또는 FOXB2 단백질을 검출할 수 있을 정도로까지 발현한 후에 실시한다. 구체적으로는 피검세포를 분화 유도 처리한 후, 상한은 7 일 이내, 바람직하게는 6 일 이내, 보다 바람직하게는 5 일 이내, 하한은 1 일 이상, 바람직하게는 2 일 이상, 더욱 바람직하게는 3 일 이상 배양 후에 세포를 채취하여, 이하의 FOXB2 유전자의 발현의 검출을 실시하면 된다. 이 동안, 매일 세포를 채취하여, FOXB2 유전자의 발현의 검출을 실시해도 된다.

(1) FOXB2 mRNA 의 발현을 검출하는 방법

FOXB2 mRNA 의 발현을 검출하는 방법은, 자체 공지된 mRNA 를 검출하는 방법이면 특별히 제한되지 않고, 공지된 방법으로부터 적절히 선택하면 된다.

예를 들어, RT-PCR 법 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, 역전사 폴리메라아제 연쇄 반응), 리얼타임 RT-PCR 법, 컴페티티브 PCR 법, in situ PCR 법, in situ 하이브리다이제이션법, DNA 어레이법, 노던 하이브리다이제이션 (Northern hybridization), FISH 법, 도트 블로트법, RNase 프로텍션 어세이법, RT-LAMP 법 외에, 금 나노 입자에 결합한 표적 RNA 에 대한 상보 사슬 (포착 사슬) 과 포착 사슬의 상보 사슬인 리포터 사슬을 사용하는 SmartFlare^TM 법, 표적 RNA 에 대응하는 배열을 갖는 2 종류의 형광 프로브 (Reduction-triggered Fluorescence activation probe, RETF probe) 를 사용한 검출법, 방향족 구핵 치환 반응을 이용한 검출법 (표적 RNA 에 상보적인 DNA 를 결합한 2-시아노-4-니트로벤젠술포닐기로 보호한 아미노쿠마린을 수식한 CNs-AMCA 프로브와, 표적 RNA 에 상보적인 DNA 를 결합한 티오페놀기로 수식된 MBA 프로브를 사용한 방법) 등의 방법을 들 수 있다.

1) RT-PCR 법

RT-PCR 법이란, 표적의 FOXB2 유전자 (예를 들어 FOXB2 mRNA) 를 주형으로 하여, 역전사 반응에 의해 cDNA 를 합성 후, PCR 에 의한 DNA 의 증폭을 실시하는 방법 [Kawasaki, E. S., et al., Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27 (1991)] 이다. 역전사 반응 및 DNA 의 증폭 반응의 조건은 특별히 한정되는 것은 아니며, 적절히 최적인 조건을 채용할 수 있다. 또, 당해 표적의 유전자 (예를 들어 FOXB2 mRNA) 의 증폭 영역은, 반드시 전체 길이일 필요는 없고, 증폭 산물의 확인에 지장이 없으면, 당해 유전자의 일부 영역이어도 된다. 증폭된 cDNA 량 (mRNA 량에 상당한다) 은, 예를 들어, 상기 DNA 증폭 반응액을 전기 영동에 제공한 후, 목적 증폭 단편에 특이적으로 하이브리다이즈하는 프로브를 사용함으로써 검출하면 된다.

구체적으로는, 예를 들어 먼저 공지된 방법으로, 피검세포로부터 mRNA 를 추출·분리한다. 이어서 FOXB2 mRNA 의 염기 배열에 대응하는 염기 배열을 갖는 뉴클레오티드 사슬을 증폭용 프라이머로서 사용하고, 상기에서 얻어진 mRNA 를 주형으로 하여 RT-PCR 법을 실시하여, FOXB2 mRNA 또는 그 일부 영역에 대해 상보적인 1 본쇄 DNA (cDNA) 를 합성·증폭시킨다. 그리고 그 증폭 산물 (cDNA) 의 유무나 다소 (양) 를 검출함으로써, 세포의 FOXB2 mRNA 의 존재나 양을 검출할 수 있다.

상기에서 사용하는 증폭용 프라이머로는, 예를 들어 인간의 FOXB2 mRNA 를 검출하는 경우의 증폭 프라이머로는, 예를 들어 배열 번호 4 로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머를 들 수 있다. 마우스의 Foxb2 mRNA 를 검출하는 경우의 증폭 프라이머로는, 예를 들어 배열 번호 37 로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머를 들 수 있다.

또한 상기의 방법으로 증폭된 cDNA 를 주형으로 하여, FOXB2 mRNA 의 염기 배열을 기초로, FOXB2 mRNA 의 표적의 영역을 증폭시킬 수 있도록 조제한 프라이머쌍을 사용하여, 통상적인 방법에 따라 추가로 PCR 법 등의 핵산 증폭 반응을 실시하여, 증폭 산물의 유무나 다소 (양) 를 검출하면, FOXB2 mRNA 의 존재나 양을 보다 정확하게 검출할 수 있다. 이 증폭 산물의 검출은, 증폭 산물을 검출하는 전기 영동법 등의 통상적인 방법으로 실시하면 된다.

상기의 방법으로 증폭된 cDNA 를 주형으로 하여 핵산 증폭 반응을 실시하는 경우, 리얼타임 증폭 검출법에 의해 실시해도 된다. 리얼타임 증폭 검출법에 의한 검출법으로는, 예를 들어 리얼타임 PCR 검출법을 들 수 있다.

리얼타임 PCR 검출법의 예로는, 인터칼레이터 (예를 들어 SYBR^TM Green I) 를 이용하여 리얼타임 PCR 을 실시하는 통상적인 인터칼레이터법, TaqMan^TM 리얼타임 PCR 법, MGB Eclipse Probe System 법, Molecular Beacons Probe Technology 법, LUX Fluorogenic Primer 법, Quenching probe-PCR (QP) 법, 사이클링 프로브법 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

상기 PCR (리얼타임 PCR 을 포함한다) 에 사용되는 「FOXB2 mRNA 의 표적의 영역을 증폭시킬 수 있도록 조제한 프라이머쌍」 으로는, FOXB2 mRNA 의 염기 배열 또는 그 특정 영역 (부분 배열) 을 증폭시키는 프라이머쌍을 들 수 있다.

그러한 프라이머쌍으로는, 예를 들어 인간의 FOXB2 mRNA (배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열) 또는 그 특정 영역 (부분 배열) 을 증폭시키는 프라이머쌍을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열의 45 ∼ 223 번째의 179 bp 의 영역 (배열 번호 3) 을 표적으로 했을 경우, 배열 번호 9 로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머와 배열 번호 10 으로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머의 프라이머쌍을 들 수 있다.

또, 예를 들어 마우스의 Foxb2 mRNA (배열 번호 34 로 나타내는 염기 배열) 또는 그 특정 영역 (부분 배열) 을 증폭시키는 프라이머쌍도 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 배열 번호 34 로 나타내는 염기 배열의 132 ∼ 300 번째의 169 bp 의 영역 (배열 번호 36) 을 표적으로 했을 경우, 배열 번호 45 로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머와 배열 번호 46 으로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머의 프라이머쌍을 들 수 있다.

FOXB2 mRNA 증폭용의 프라이머는 각종 시판되어 있으므로, 그것을 사용해도 된다.

RT-PCR 법에 의한 인간 FOXB2 mRNA 의 검출법을 예로 들어 구체적으로 나타내면, 이하와 같다.

피검세포로부터 추출하여, DNase 처리한 총 RNA (Total RNA) 500 ng ∼ 10 ㎍ 에, FOXB2 mRNA 의 증폭 프라이머 (예를 들어 배열 번호 4 의 염기 배열을 갖는 프라이머) 1 ∼ 10 μM 를 1 ㎕ 첨가하고, 65 ∼ 80 ℃, 2 ∼ 5 분간 보온한 후, 빙랭하에서, 5 × Buffer 4 ㎕, 2.5 mM dNTP 4 ㎕, RNase 저해제 0.5 ㎕ (20 U), 역전사 효소 (ReverTra Ace) 1 ㎕ (100 U) 를 첨가하고, 증류수로 전체량 20 ㎕ 로 하여 혼합하고, 37 ∼ 50 ℃, 20 ∼ 60 분간 보온함으로써 역전사 반응을 실시한다. 그 후 통상적인 방법에 의해, 얻어진 cDNA 를 회수한다.

이어서 얻어진 cDNA 1 ㎕, 증류수 5 ㎕, 2 × PCR Buffer 12.5 ㎕, 2 mM dNTP 4 ㎕, DNA 폴리메라아제 (KOD FX Neo) 0.5 ㎕ (0.5 U), 포워드 프라이머 (예를 들어 배열 번호 9 의 염기 배열을 갖는 프라이머) 5 ∼ 10 μM 를 1 ㎕, 리버스 프라이머 (예를 들어 배열 번호 10 의 염기 배열을 갖는 프라이머) 5 ∼ 10 μM 를 1 ㎕ 혼합한다. 이어서, 예를 들어 94 ℃ 2 분간, 98 ℃ 10 초간 → 56 ℃ 20 초간 → 68 ℃ 30 초간의 반응을 28 ∼ 30 사이클 정도 실시한다.

PCR 종료 후, 예를 들어 전기 영동으로 증폭 산물의 검출·해석을 실시하여, FOXB2 mRNA 를 검출한다.

또는, cDNA 를 회수한 후, 인터칼레이터 (예를 들어 SYBR^TM Green I) 및 예를 들어 상기와 동일한 포워드 프라이머와 리버스 프라이머를 사용하여, 상기에서 얻어진 cDNA 를 주형으로 하여 사용하여, Taq DNA 폴리메라아제 등의 폴리메라아제를 사용한 리얼타임 PCR 을 실시한다. 그리고, 증폭 산물의 증폭량과 상관하여 인터칼레이션하는 인터칼레이터의 형광 강도를 측정함으로써 증폭 산물의 검출·해석을 실시하여, FOXB2 mRNA 를 검출한다.

또한, 상기의 방법으로 증폭된 cDNA 를 주형으로 하여 핵산 증폭 반응을 실시한 후의 증폭 산물의 검출·해석을, 캐필러리 전기 영동법 (J. Chromatogr. 593 253-258 (1992), Anal. Chem. 64 1926-1932 (1992), WO2007/027495 등), 캐필러리 칩 전기 영동법으로 실시해도 된다. 즉, cDNA 를 회수한 후, 예를 들어 형광 물질 등의 표식 물질로 표식한 프라이머나 인터칼레이터를 사용하여, 캐필러리 칩 전기 영동으로 분리된 표식 PCR 증폭 산물 유래의 시그널을 검출기로 검출하면 된다. 검출기로는, 시차 굴절 검출기, 형광 검출기, UV 검출기 등의 기기에 의해 이루어지면 되고, 그 중에서도, UV 검출기, 형광 검출기가 바람직하고, 형광 검출기가 보다 바람직하다. 예를 들어 LiBASys (시마즈 제작소 (주) 제조) 등의 자동 면역 분석 장치를 사용하면, PCR 로부터 전기 영동까지의 조작을 리얼타임으로 실시할 수 있다.

2) 노던 하이브리다이제이션법

노던 하이브리다이제이션법으로부터 FOXB2 mRNA 를 검출하는 방법으로는, 예를 들어, 피검세포로부터 추출·분리한 mRNA 를 적당한 담체에 고정시키고, 이것과 FOXB2 mRNA 에 상보적인 염기 배열을 갖는 표식 프로브 (cDNA 이어도 된다) 와 하이브리다이제이션을 실시하여, 그 정도를 검출함으로써, 피검세포의 FOXB2 mRNA 를 검출하는 방법을 들 수 있다. 여기서 사용하는 프로브는, FOXB2 mRNA 의 염기 배열의 상보 배열의 전부로 이루어지는 것이어도 되고, 그 일부의 염기 배열로 이루어지는 것이어도 된다. 또, 이 검출법에, 그 프로브를 고정화시킨 마이크로 어레이, DNA 칩을 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명에 관련된 FOXB2 mRNA 를 검출하는 방법에 사용되는 시약 중에는, 통상적으로 이 분야에서 사용되는 시약류, 예를 들어 완충제, 안정화제, 방부제 등으로서, 공존하는 시약 등의 안정성을 저해하지 않고, PCR 등의 핵산 증폭 반응이나 하이브리다이제이션 반응을 저해하지 않는 것을 사용할 수 있다. 또, 그 농도도, 통상적으로 이 분야에서 통상적으로 사용되는 농도 범위에서 적절히 선택하면 된다.

완충액의 구체예를 들면, 예를 들어 트리스 완충액, 인산 완충액, 베로날 완충액, 붕산 완충액, 굿 완충액 등, 통상적인 PCR 등의 핵산 증폭 반응이나 하이브리다이제이션 반응을 실시하는 경우에 사용되고 있는 완충액은 모두 들 수 있다. 그 pH 도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 5 ∼ 9 의 범위를 들 수 있다.

또, 필요에 따라 핵산 합성 효소 (DNA 폴리메라아제, RNA 폴리메라아제, 역전사 효소 등), 효소에 따른 기질 (dNTP, rNTP 등), 또 2 본쇄 인터칼레이터 (에티듐브로마이드, SYBR^TM Green 등) 혹은 FAM 이나 TAMRA 등의 표식 검출 물질 등이 사용된다.

또한, in situ PCR 법이나 in situ 하이브리다이제이션법을 실시한 경우에는, 피검세포를 파괴하지 않고 FOXB2 mRNA 의 검출을 실시할 수 있다.

(2) FOXB2 단백질의 발현을 검출하는 방법

1) 세포를 파괴하지 않고 검출하는 방법

FOXB2 단백질은 전사 인자이므로, 세포의 핵내에 존재한다.

세포를 파괴하지 않고 핵내 물질을 염색하는 기술이 개발되어 있으므로, 그 기술을 사용하여, 세포를 파괴하지 않고 핵내의 FOXB2 단백질을 검출할 수 있다. 예를 들어, Triton ^TM, NP-40, Tween 20 ^TM, Saponin, Digitonin ^TM, Leucoperm ^TM 등의 계면 활성제를 함유하는 완충액을 사용하여, 피검세포의 핵막을 부분적으로 가용화한다. 그렇게 하면 세포막의 구조를 파괴하지 않고 항체가 통과할 수 있을 정도의 간극이 만들어지므로, 계속해서 형광 물질 등으로 표식한 항 FOXB2 항체로 핵단백질의 염색을 실시하면, 핵내의 FOXB2 단백질을 검출할 수 있다.

또, 핵내 물질을 염색하는 각종 시약도 시판되고 있다. 그래서, 이들의 시판되는 시약을 사용하여 핵내의 FOXB2 단백질을 염색하여, FOXB2 단백질의 발현을 검출해도 된다.

2) 세포를 파괴하여 검출하는 방법

또, 세포를 파괴하는 이하의 방법을 실시하여, FOXB2 단백질을 검출할 수도 있다.

먼저 피검세포 배양물을 여과 또는 원심 분리 등의 통상적인 방법에 부여하여 균체 혹은 세포를 모아 적당한 완충액에 현탁하고, 예를 들어 계면 활성제 처리, 초음파 처리, 라이소자임 처리, 동결 융해 등의 방법으로 세포 등의 세포벽 및/또는 세포막을 파괴한 후, 원심 분리나 여과 등의 방법으로 FOXB2 단백질을 함유하는 추출액을 얻는다.

이어서, 얻어진 추출액 중의 FOXB2 단백질을, 단백질을 검출하는 자체 공지된 방법으로 검출하면 된다.

추출액 중의 FOXB2 단백질을 검출하는 방법으로는, 예를 들어 FOXB2 단백질에 대하여 친화성을 갖는 물질 (예를 들어 항체 등) 을 사용한, 이른바 효소 면역 측정법 (EIA), 방사 면역 측정법 (RIA), 효소 결합 면역 흡착 측정법 (ELISA), 형광 면역 측정법 (FIA), 웨스턴 블로트법, 면역 조직 화학법, 항체 어레이법, 간이 이뮤노크로마토그래피에 의한 측정법 등의 자체 공지된 면역학적 측정법에 준한 방법 외에, 이들과 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC), 전기 영동법, 캐필러리 전기 영동법, 캐필러리 칩 전기 영동법 등의 조합에 의한 방법 등을 들 수 있다. 그 측정 원리로는, 예를 들어 샌드위치법, 경합법, 2 항체법 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 이들 측정법의 구체적인 조건은 당업자가 적절히 설정할 수 있다.

또, 예를 들어, 면역 비롱법 (比朧法), 면역 비탁법 등의 면역 응집법에 준한 측정법으로, FOXB2 단백질을 검출해도 된다. 이들의 검출법도 자체 공지된 방법에 준하여 실시하면 된다.

상기 1) 및 2) 의 방법에 있어서, FOXB2 단백질을 검출하기 위해서 사용되는 FOXB2 단백질에 대한 항체 (항 FOXB2 항체) 는, FOXB2 단백질이나 그 부분 펩티드, 또는 그들의 염을 인식할 수 있는 항체이면 되고, 특별히 한정되지 않는다.

예를 들어 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 중 어느 것이어도 되고, 이들을 단독으로 혹은 이들을 적절히 조합하여 사용하는 등은 임의이다. 또, 이들 항체는, 필요하면 펩신, 파파인 등의 효소를 사용하여 소화하여 F(ab')₂, Fab', 혹은 Fab 로서 사용해도 된다. 또한, FOXB2 단백질에 대한 시판되는 항체를 사용할 수도 있다.

당해 항체는 표식 물질로 표식되어 있어도 된다. 표식하기 위해서 사용되는 표식 물질로는, 예를 들어 EIA (ELISA) 에 있어서 사용되는 알칼리포스파타아제, β-갈락토시다아제, 퍼옥시다아제, 마이크로퍼옥시다아제, 글루코오스옥시다아제, 글루코오스-6-인산 탈수소 효소, 아세틸콜린에스테라아제, 말산 탈수소 효소, 루시페라아제 등의 효소류, 예를 들어 RIA 에서 사용되는 ^99mTc, ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹⁴C, ³H 등의 방사성 동위 원소, 예를 들어 FIA 에서 사용되는 플루오레세인, 단실, 플루오레사민, 쿠마린, 나프틸아민 혹은 이들의 유도체 등의 형광성 물질, 예를 들어 루시페린, 이소루미놀, 루미놀, 비스(2,4,6-트리플로로페닐)옥살레이트 등의 발광성 물질, 예를 들어 페놀, 나프톨, 안트라센 혹은 이들의 유도체 등의 자외부에 흡수를 갖는 물질, 예를 들어 4-아미노-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-옥실, 3-아미노-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘-1-옥실, 2,6-디-t-부틸-α-(3,5-디-t-부틸-4-옥소-2,5-시클로헥사디엔-1-일리덴)-p-톨릴옥실 등의 옥실기를 갖는 화합물로 대표되는 스핀 라벨화제로서의 성질을 갖는 물질 등을 들 수 있다.

FOXB2 단백질에 대한 항체의 구체예로는, 예를 들어 「배열 번호 2 로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 단백질에 대한 항체」 나 「배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 단백질에 대한 항체」 등을 들 수 있다.

또, 상기한 FOXB2 단백질을 검출하기 위해서 사용되는, 시약 및 그 검출시의 농도, 검출을 실시할 때의 측정 조건 등 (반응 온도, 반응 시간, 반응시의 pH, 측정 파장, 측정 장치 등) 은, 모두 자체 공지된 상기한 바와 같이 면역학적 측정법의 측정 조작법에 준하여 설정하면 되고, 사용하는 자동 분석 장치, 분광 광도계 등도 통상적으로 이 분야에서 사용되고 있는 것은 어느 것도 예외없이 사용할 수 있다.

<I-2. 세포의 분화 상태의 판정 방법>

상기의 방법에 의해 간세포의 FOXB2 유전자의 발현을 검출하고 얻어진 결과에 기초하여, 피검세포의 분화 상태를 판정한다.

본 발명에 있어서 「분화한/된」 또는 「분화한 상태」란, 세포가 「분화의 초기 단계」 의 상태, 「장래 분화하는 분화능을 획득한 (분화 유도된)」상태, 및 「분화한」 상태 중 어느 상태에 있는 경우를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에 있어서 「분화한/된」 또는 「분화한 상태」 란, 세포가 「분화의 초기 단계」 의 상태 또는 「장래 분화하는 분화능을 획득한 (분화 유도된)」 상태 중 어느 상태에 있는 경우이다.

본 발명에 있어서 「분화의 초기 단계」 란, 분화 유도 처리 후의 조기, 구체적으로는 분화 유도 처리를 실시하고 나서 7 일째까지, 바람직하게는 6 일째까지, 보다 바람직하게는 3 ∼ 5 일째까지의 시기를 말한다.

또는, 본 발명에 있어서 「분화의 초기 단계」 란, 미분화 간세포가 3 배엽 중 어느 것으로 분화하기 전의 단계, 및 분화 유도 처리 후 미분화 마커 (예를 들어 OCT3/4, NANOG, SOX2 등) 가 소실되기 전의 단계를 포함한다.

본 발명의 분화 상태의 판정 방법으로는, 예를 들어 이하의 방법을 들 수 있다.

(1) FOXB2 mRNA 의 발현을 검출한 결과에 기초하여 판정하는 방법

FOXB2 mRNA 를 검출한 결과에 기초하여 판정하는 방법으로는, 예를 들어 이하의 방법을 들 수 있다.

1) 상기 방법에 의해 피검세포의 FOXB2 mRNA 의 검출을 실시하여, FOXB2 mRNA 가 검출되었을 경우에, 그 피검세포는 분화한 상태인 것으로 판정된다.

2) 피검세포의 FOXB2 mRNA 의 검출을 실시함과 함께, 비교로서 미분화 상태인 것이 확인된 미분화 간세포를 사용하여 동일하게 FOXB2 mRNA 의 검출을 실시한다. 그리고, 피검세포의 FOXB2 mRNA 의 검출량이, 비교 대상의 미분화 간세포의 FOXB2 mRNA 의 검출량보다 많은 경우에, 그 피검세포는 분화한 상태인 것으로 판정된다. 이 때, 피검세포의 FOXB2 mRNA 의 검출량이 비교 대상의 미분화 간세포의 FOXB2 mRNA 의 검출량과 비교하여 많은지의 여부에 대해서는, 양자를 비교하여 상대적으로 판단하면 된다.

3) 피검세포의 FOXB2 mRNA 의 검출량이 비교 대상의 미분화 간세포의 FOXB2 mRNA 의 검출량과 비교하여 많은지의 여부에 대하여, 피검세포의 FOXB2 mRNA 의 검출량과, 미리 측정된 미분화 간세포의 FOXB2 mRNA 의 검출량을 비교함으로써 실시해도 된다. 그리고, 피검세포의 FOXB2 mRNA 의 검출량이, 미리 측정된 미분화 간세포의 FOXB2 mRNA 의 검출량보다 많은 경우에, 그 피검세포는 분화한 상태인 것으로 판정된다.

4) 피검세포가 분화한 상태인지의 여부를 판단할 수 있는 경계값 (컷 오프값) 을 미리 설정해 두고, 피검세포의 FOXB2 mRNA 검출량이 당해 경계값보다 높은지의 여부로 피검세포의 분화 상태를 판단해도 된다. 이 경우, 피검세포의 FOXB2 mRNA 의 검출량이 컷 오프값보다 높은 경우에, 그 피검세포는 분화한 상태인 것으로 판정된다.

(2) FOXB2 단백질을 검출한 결과에 기초하여 판정하는 방법

FOXB2 단백질을 검출한 결과에 기초하여 판정하는 방법으로는, 예를 들어 이하의 방법을 들 수 있다.

1) 상기 방법에 의해 피검세포의 FOXB2 단백질의 검출을 실시하여, FOXB2 단백질이 검출되었을 경우에, 그 세포가 분화한 상태인 것으로 판정된다.

2) 피검세포의 FOXB2 단백질의 검출을 실시함과 함께, 비교로서 미분화 상태인 것이 확인된 미분화 간세포를 사용하여 동일하게 FOXB2 단백질의 검출을 실시한다. 그리고, 피검세포의 FOXB2 단백질의 검출량이, 비교 대상의 미분화 간세포의 FOXB2 단백질의 검출량보다 많은 경우에, 그 피검세포는 분화한 상태인 것으로 판정된다. 이 때, 피검세포의 FOXB2 단백질의 검출량이 비교 대상의 미분화 간세포의 FOXB2 단백질의 검출량과 비교하여 많은지의 여부에 대해서는, 양자를 비교하여 상대적으로 판단하면 된다.

3) 피검세포의 FOXB2 단백질의 검출량이 비교 대상의 미분화 간세포의 FOXB2 단백질의 검출량과 비교하여 많은지의 여부에 대해, 미리 측정된 미분화 간세포의 FOXB2 단백질의 검출량과, 피검세포의 FOXB2 단백질의 검출량을 비교함으로써 실시해도 된다. 그리고, 피검세포의 FOXB2 단백질의 검출량이, 미리 측정된 미분화 간세포의 FOXB2 단백질의 검출량보다 많은 경우에, 그 피검세포는 분화한 상태인 것으로 판정된다.

4) 또한, 피검세포가 분화한 상태인지의 여부를 판단할 수 있는 경계값 (컷 오프값) 을 미리 설정해 두고, 피검세포의 FOXB2 단백질 검출량이 당해 경계값보다 높은지의 여부로 피검세포의 분화 상태를 판단해도 된다. 이 경우, 피검세포의 FOXB2 단백질의 검출량이 컷 오프값보다 높은 경우에, 그 피검세포는 분화한 상태인 것으로 판정된다.

본 발명의 세포의 분화 상태의 판정 방법을 실시하기 위해서는, 구체적으로는 예를 들어 이하의 방법으로 실시하면 된다.

iPS 세포 또는 ES 세포 등의 미분화 간세포 (피검세포) 를 공지된 방법으로 분화 유도 처리한다. 이어서 분화 유도 처리 후 상한은 7 일 이내, 바람직하게는 6 일 이내, 보다 바람직하게는 5 일 이내, 하한은 1 일 이상, 바람직하게는 2 일 이상, 더욱 바람직하게는 3 일 이상 배양한 후에 세포를 채취하고, 상기의 방법으로 FOXB2 유전자의 발현 (FOXB2 mRNA 의 발현, 또는 FOXB2 단백질의 발현) 을 검출한다. 그리고, FOXB2 유전자의 발현이 확인되었을 경우에, 그 세포는 분화한 상태인 것으로 (「그 세포군 중에 분화된 상태의 세포가 존재하는」 경우를 포함한다. 이하 동일.) 판정된다.

또는, 피검세포의 FOXB2 유전자의 발현의 검출 (FOXB2 mRNA 또는 FOXB2 단백질의 검출) 을 실시함과 함께, 비교로서 미분화 상태인 것이 확인된 미분화 간세포를 사용하여 동일하게 FOXB2 유전자 발현의 검출을 실시한다. 그리고, 피검세포의 FOXB2 유전자 발현의 검출량 (FOXB2 mRNA 의 발현량, 또는 FOXB2 단백질의 발현량) 이, 비교 대상의 미분화 간세포의 FOXB2 유전자 발현의 검출량보다 많은 경우에, 그 피검세포는 분화한 상태인 것으로 판정된다.

또, 미리 측정된 미분화 간세포의 FOXB2 유전자 발현의 검출량 (FOXB2 mRNA 또는 FOXB2 단백질의 검출량) 과, 피검세포의 FOXB2 유전자 발현의 검출량을 비교하여, 피검세포의 FOXB2 유전자 발현의 검출량이 비교 대상의 미분화 간세포의 FOXB2 유전자 발현의 검출량과 비교하여 많은 경우에, 그 피검세포는 분화한 상태인 것으로 판정된다.

또한 피검세포가 분화한 상태인지의 여부를 판단할 수 있는 경계값 (컷 오프값) 을 미리 설정해 두고, 피검세포의 FOXB2 mRNA 의 검출량 또는 FOXB2 단백질의 검출량이 당해 경계값보다 높은 경우에, 그 피검세포는 분화한 상태인 것으로 판정된다.

추가로 또, 분화 유도 처리를 실시하지 않은 미분화 간세포에 대하여, 본 발명의 분화 상태의 판정 방법을 실시하면, 그 미분화 간세포가 미분화 상태를 유지하고 있는지의 여부를 확인할 수도 있다.

(3) 본 발명의 응용

본 발명의 세포의 분화 상태의 판정 방법은, 또한 이하의 방법에 응용할 수 있다.

1) 세포의 스크리닝 방법에의 응용

어느 세포군을 함유하는 시료에 대해, 본 발명의 방법에 의해 세포군을 구성하는 세포의 FOXB2 mRNA 를 검출한다. 그리고, FOXB2 mRNA 가 검출된 경우에는 그 시료로 분화한 상태의 세포 (「분화한 상태」 의 의미는 상기한 바와 같다. 이하 동일.) 가 존재하는 것으로 판정하고, FOXB2 mRNA 가 검출되지 않는 경우에는 그 시료에 분화한 상태의 세포가 존재하지 않는 것으로 판정하면 된다. 또는, FOXB2 단백질의 발현을 검출하여, FOXB2 단백질이 검출된 경우에는 그 시료에 분화한 상태의 세포가 존재하는 것으로 판정하고, FOXB2 단백질이 검출되지 않는 경우에는 그 시료에 분화한 상태의 세포가 존재하지 않는 것으로 판정하면 된다.

2) 간세포의 품질 관리에의 응용

공지된 분화 유도 처리를 실시한 간세포에 대하여 본 발명의 방법에 의해 FOXB2 유전자의 발현을 검출함 (FOXB2 mRNA 또는 FOXB2 단백질을 검출함) 으로써, 당해 세포가 분화한 상태에 있는지, 또는 미분화 간세포가 혼입되어 있는 상태인지를 판정할 수 있다. 그 때문에, 본 발명의 방법은 분화 세포의 품질 관리에 응용할 수 있다.

또, 미분화 상태를 유지하는 처리를 실시한 간세포에 대하여, 본 발명의 방법으로 FOXB2 유전자의 발현을 검출함 (FOXB2 mRNA 또는 FOXB2 단백질을 검출함) 함으로써, 당해 세포가 미분화 상태를 유지하고 있는지를 확인할 수 있다. 그 때문에, 본 발명의 방법은 미분화 간세포의 품질 관리에 응용할 수 있다.

3) 배지의 품질 검사 방법에의 응용

미분화 간세포를, 그 미분화 상태를 유지한 채로 배양하기 위해서는, 그 배지가, 예를 들어 분화 유도 인자를 함유하지 않고, 미분화 세포의 미분화 상태를 유지한 채로 배양할 수 있는 배지일 필요가 있다. 본 발명의 분화 상태의 판정 방법을 사용하면, 그러한 배지의 품질 검사를 실시할 수 있다.

예를 들어, 미분화 간세포를 판정 대상의 배지 중에서 수일간, 예를 들어 3 ∼ 7 일 정도, 통상은 5 ∼ 6 일 정도 배양한 후, 세포의 FOXB2 mRNA 의 발현을 검출하고, FOXB2 mRNA 가 검출되지 않았던 경우에, 당해 배지가 간세포의 미분화 상태를 유지하면서 배양할 수 있는 배지인 것으로 판정할 수 있다. 또는 배양 후의 당해 세포 중의 FOXB2 단백질의 발현을 검출하여, FOXB2 단백질이 검출되지 않았던 경우에, 당해 배지가 간세포의 미분화 상태를 유지하면서 배양할 수 있는 배지인 것으로 판정할 수 있다.

4) 분화 세포의 조제·단리 방법에의 응용

본 발명의 방법을 응용하여, 분화 세포를 조제·단리할 수 있다.

예를 들어, 상기의 「(2) FOXB2 단백질의 발현을 검출하는 방법」 에 기재한 「1) 세포를 파괴하지 않고 검출하는 방법」 에서, 표식 물질로 표식한 항 FOXB2 단백질 항체를, 분화한 상태의 세포를 함유하거나가 혹은 함유하는 것으로 예상되는 세포와 반응시킨 후, 형광 표식된 세포만을 플로우 사이토메트리 등의 방법에 의해 분리, 정제하면, 분화한 상태의 세포를 조제·단리할 수 있다.

또한, 상기와 동일한 방법으로, 형광 표식되어 있지 않은 세포만을 플로우 사이토메트리 등의 방법에 의해 분리, 정제하면, 미분화 간세포를 조제·단리할 수 있다.

5) 분화 유도 인자의 스크리닝 방법에의 응용

본 발명을 어느 물질이 미분화 간세포의 분화 유도능을 갖는지를 확인하는 방법에 응용할 수 있다.

예를 들어, 미분화 간세포를, 피검물질을 함유하는 배지 중에서 수일간, 예를 들어 3 ∼ 7 일, 통상은 5 ∼ 6 일 정도 배양한 후, 배양 세포의 FOXB2 mRNA 의 발현을 검출하고, FOXB2 mRNA 가 검출되었을 경우에, 피검물질은 미분화 간세포의 분화를 유도하는 것이 확인된다. 또는 당해 배양 세포 중의 FOXB2 단백질의 발현을 검출하여, FOXB2 단백질이 검출되었을 경우에, 피검물질은 미분화 간세포의 분화를 유도하는 것이 확인된다.

<II. 본 발명의 분화 마커>

본 발명의 분화 마커로는, 「FOXB2 유전자 유래의 mRNA 또는 단백질에서 선택되는 분화 마커」 를 들 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 분화 마커는, 간세포의 분화 마커이다. 간세포의 구체예는 상기한 바와 같다.

「FOXB2 유전자 유래의 mRNA 또는 단백질」 로는, 상기한 본 발명에 관련된 FOXB2 mRNA 및 FOXB2 단백질을 들 수 있다. 그 구체예는, 상기한 바와 같다.

보다 구체적으로는, 예를 들어 하기 (i) ∼ (vii) 에서 선택되는 분화 마커를 들 수 있다.

(i) 배열 번호 1 혹은 배열 번호 34 로 나타내는 염기 배열을 갖는 mRNA

(ii) 배열 번호 1 혹은 배열 번호 34 로 나타내는 염기 배열과 70 ％, 바람직하게는 80 ％, 보다 바람직하게는 95 ％, 더욱 더 바람직하게는 97 ％ 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 갖는 mRNA

(iii) 배열 번호 2 혹은 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열을 코드하는 mRNA

(iv) 배열 번호 2 혹은 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열의 1 ∼ 몇 개, 바람직하게는 1 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 코드하는 mRNA

(v) 배열 번호 2 혹은 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열과 70 ％, 바람직하게는 80 ％, 보다 바람직하게는 95 ％, 더욱 더 바람직하게는 97 ％ 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열을 코드하는 mRNA

(vi) 배열 번호 2 혹은 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열 또는 그 1 개 혹은 몇 개, 바람직하게는 1 ∼ 5 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 갖는 단백질

(vii) 배열 번호 2 혹은 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열과 70 ％, 바람직하게는 80 ％, 보다 바람직하게는 95 ％, 더욱 더 바람직하게는 97 ％ 이상의 배열 상동성을 갖는 아미노산 배열을 갖는 단백질

을 들 수 있다.

<III. 본 발명에 관련된 분화 상태 판정용 키트>

본 발명에 관련된 세포의 분화 상태 판정용 키트로는, FOXB2 유전자의 발현을 검출하는 시약을 구비한 키트, 또는 FOXB2 유전자의 발현량을 측정하는 시약을 구비한 키트를 들 수 있다.

예를 들어, 이하의 것을 들 수 있다.

(a) FOXB2 mRNA 의 발현을 검출하거나 또는 그 발현량을 측정하기 위해서 사용되는 프라이머, 또는 그들의 표식물을 구비한 키트

(b) FOXB2 단백질의 발현을 검출하거나 또는 그 발현량을 측정하기 위해서 사용되는 FOXB2 단백질에 대한 항체 (FOXB2 단백질을 인식하는 항체, 바람직하게는 FOXB2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체) 또는 그 항체의 표식물 등을 구비한 키트

상기 키트를 구성하는 구성 시약의 바람직한 양태 및 구체예는 상기한 바와 같다.

상기 (a) 에 관련된 「FOXB2 mRNA 의 발현을 검출하거나 또는 그 발현량을 측정하기 위해서 사용되는 프라이머」 의 예로는, 예를 들어 「배열 번호 1 혹은 배열 번호 34 로 나타내는 염기 배열 또는 그 부분 배열을 검출하기 위해서 사용되는 프라이머」 를 들 수 있다.

보다 구체적으로는, 예를 들어

(a-1) 역전사 반응으로 얻어진 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 을 실시할 때에 사용되는 프라이머쌍, 또는

(a-2) 역전사 반응에 사용되는 증폭 프라이머와, 역전사 반응으로 얻어진 cDNA 를 주형으로 하여 PCR 을 실시할 때에 사용되는 프라이머쌍의 조합을 들 수 있다.

(a-1) 의 프라이머쌍을 구성하는 프라이머는, 필요에 따라 적어도 일방이 표식 물질로 표식되어 있어도 된다.

(a-1) 의 프라이머쌍의 구체예로는, 「배열 번호 9 로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머와 배열 번호 10 으로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머의 프라이머쌍」 또는 「배열 번호 45 로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머와 배열 번호 46 으로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머의 프라이머쌍」 을 들 수 있다.

(a-2) 의 구체예로는, 「배열 번호 4 로 나타내는 프라이머와, 배열 번호 9 로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머와 배열 번호 10 으로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머의 프라이머쌍의 조합」 또는 「배열 번호 37 로 나타내는 프라이머와, 배열 번호 45 로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머와 배열 번호 46 으로 나타내는 염기 배열을 갖는 프라이머의 프라이머쌍의 조합」 을 들 수 있다.

상기 (b) 에 관련된 「FOXB2 단백질의 발현을 검출하거나 또는 그 발현량을 측정하기 위해서 사용되는 FOXB2 단백질에 대한 항체」 의 구체예는 상기한 바와 같다.

예를 들어 「배열 번호 2 혹은 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열을 갖는 단백질에 대한 항체」 를 들 수 있다.

상기 (a-1) 또는 (a-2) 를 구성 요건으로서 포함하는 키트에는, 추가로 RT-PCR 법에 사용하는 역전사 효소나, 필요에 따라 추가로 핵산 합성 효소 (DNA 폴리메라아제, RNA 폴리메라아제 등), 효소에 따른 기질 (dNTP, rNTP 등), 또 2 본쇄 인터칼레이터 (SYBR^TM Green, 에티듐브로마이드 등) 혹은 FAM 이나 TAMRA 등의 표식 검출 물질 등을 함유하고 있어도 된다.

또, 상기 (a-1) 또는 (a-2) 를 구성 요건으로서 포함하는 키트에는, 예를 들어 완충제, 안정화제, 방부제 등으로서, 공존하는 시약 등의 안정성을 저해하지 않고, PCR 이나 하이브리다이제이션 반응을 저해하지 않는 것이 함유되어 있어도 된다. 또, 그 농도도, 통상적으로 이 분야에서 통상적으로 사용되는 농도 범위에서 적절히 선택하면 된다.

완충액의 구체예를 들면, 예를 들어 트리스 완충액, 인산 완충액, 베로날 완충액, 붕산 완충액, 굿 완충액 등, 통상적인 PCR 이나 하이브리다이제이션 반응을 실시하는 경우에 사용되고 있는 완충액은 모두 들 수 있다. 그 pH 도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 5 ∼ 9 의 범위를 들 수 있다.

상기 (b) 를 구성 요건으로서 포함하는 키트에 함유되는 시약 중에는, 통상적으로 이 분야에서 사용되는 시약류, 예를 들어 완충제, 증감제, 계면 활성제, 방부제 (예를 들어 아지화나트륨, 살리실산, 벤조산 등), 안정화제 (예를 들어 알부민, 글로불린, 수용성 젤라틴, 계면 활성제, 당류 등), 부활제, 공존 물질의 영향 회피제, 그 밖에 이 분야에서 사용되고 있는 것으로서, 공존하는 시약과의 안정성을 저해하거나, 항원 항체 반응을 저해하지 않는 것을 가지고 있어도 된다. 또 이들 시약류 등의 농도 범위 등도, 자체 공지된 그 측정 방법에 있어서 통상적으로 사용되는 농도 범위 등을 적절히 선택하여 사용하면 된다. 완충제 등의 구체예, 그 pH 및 농도는 상기한 바와 같다.

또, 본 발명에 관련된 세포의 분화 상태 판정용 키트에 함유되는 (a-1), (a-2), (b-1) 등은, 적당한 완충액 중에 현탁시킨 현탁액 등의 용액 상태의 것, 혹은 이것을 동결한 동결품이나 동결 건조시킨 동결 건조품이어도 된다. 이 목적에 사용되는 완충제 등의 구체예, 그 pH 및 농도는 상기한 바와 같다.

추가로 또 본 발명의 키트에는, 본 발명에 관련된 간세포의 FOXB2 유전자의 발현 (예를 들어 FOXB2 mRNA 의 발현 또는 FOXB2 단백질의 발현) 을 검출하는 방법에 사용하기 위한 설명서, 또는 본 발명의 세포의 분화 상태를 판정하는 방법을 실시하기 위한 설명서 등을 포함시켜 두어도 된다. 당해 「설명서」 란, 당해 방법에 있어서의 특징·원리·조작 순서, 판정 순서 등이 문장 또는 도표 등에 의해 실질적으로 기재되어 있는 당해 키트의 취급 설명서, 첨부 문서, 혹은 팸플릿 (리플릿) 등을 의미한다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 전혀 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1.

분화 유도 처리한 hiPS 세포의 FOXB2 mRNA 및 공지된 미분화 마커의 발현을 RT-PCR 법에 의해 검출하였다.

(1) 간세포의 배양과 분화 유도 처리

hiPS 세포 (201B7 주, 쿄토 대학 iPS 세포 연구소 (iPS 아카데미아 재팬 주식회사)), 및 비교로서, 분화된 세포인 HDF 세포 (인간 정상 세포 유래 섬유아 세포, 론자 재팬 (주) 제조) 를, bFGF 첨가 (100 ng/㎖) 또는 무첨가의 배지 (StemSure hPSC Medium, 와코우 순약 공업 (주) 제조) 에서 3 회 계대 배양하고, 배양 5 일째에 세포를 회수하였다.

(2) 총 RNA 의 추출

시판되는 핵산 추출 시약인 키트 ISOGEN (닛폰 진 제조) 을 사용하여, 현품 설명서에 따라, 상기 (1) 에서 회수한 세포로부터 총 RNA 를 추출하였다.

(3) DNase 처리

상기 (2) 에서 추출한 총 RNA 의 1 ㎍ 에, 전체량 17 ㎕ 가 되도록 증류수를 첨가하고, 10X Reaction Buffer (프로메가 (주) 제조) 를 2 ㎕, RQ1 RNase-Free DNase (프로메가 (주) 제조) 를 1 ㎕ (1 U) 를 첨가하여 혼합하고, 37 ℃, 20 분간 인큐베이션하였다. 그 후, Stop Buffer (20 mM EGTA) (프로메가 (주) 제조) 를 1 ㎕ 첨가하여 혼합하고, 65 ℃, 10 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 반응물에 결합 Buffer (5.5 M 구아니딘염산염 (와코우 순약 공업 (주) 제조), 20 mM Tris-HCl pH6.6) 을 100 ㎕ 첨가하여 혼합한 후, 에코노스핀 (핵산 정제용 실리카 멤브레인 스핀 칼럼, (주) 진 디자인 제조) 으로 옮기고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여, 튜브의 용액을 제거하였다. 이어서, 튜브에 세정 Buffer (2 mM Tris-HCl pH7.5 ((주) 닛폰 진), 80 ％ 에탄올 (와코우 순약 공업 (주) 제조)) 을 500 ㎕ 첨가하고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여, 튜브의 용액을 제거하였다. 추가로 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리한 후, 에코노스핀 (mRNA 가 결합하고 있다) 을 새로운 튜브로 교환하고, 용출 Buffer (10 mM Tris-HCl pH8.0) (닛폰 진 (주) 제조) 를 50 ㎕ 첨가하고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여 총 RNA 를 회수하였다. 그 후, 에탄올 침전을 실시하고, 얻어진 침전물을 증류수 9.5 ㎕ 에 용해시켰다.

(4) 역전 전사 반응

상기 (3) 에서 DNase 처리한 총 RNA 9.5 ㎕ 에, 하기의 각 mRNA 를 표적으로 하는 증폭 프라이머를 함유하는 혼합 프라이머 (각 5 μM) 1 ㎕ 를 첨가하였다. 하기 프라이머는 모두 시그마 알도리치사 제조이다.

·FOXB2 mRNA 의 증폭 프라이머, CAGAAGCTACCCTTGCCAG (배열 번호 4, GenBank 등록 번호 NM_001013735 : 242-260 (GenBank 등록 번호 NM_001013735 의 염기 배열의 242-260 번째의 염기 배열의 상보 사슬의 염기 배열에 상당한다. 이하 동일.)),

·OCT3/4 mRNA 의 증폭 프라이머, GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG (배열 번호 5, GenBank 등록 번호 NM_002701 : 641-661),

·NANOG mRNA 의 증폭 프라이머, GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC (배열 번호 6, GenBank 등록 번호 NM_024865 : 631-651),

·SOX2 mRNA 의 증폭 프라이머, GACCACACCATGAAGGCATTC (배열 번호 7, GenBank 등록 번호 NM_003106 : 572-592),

·GAPDH mRNA 의 증폭 프라이머, GTCTACATGGCAACTGTGAGG (배열 번호 8, GenBank 등록 번호 NM_002046 : 1303-1323)

(GAPDH : 글리세르알데히드-3-인산데하이드로게나아제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제)

각각의 혼합물을 72 ℃, 3 분간 인큐베이션한 후, 즉시 빙랭하였다. 이어서, 5 × Buffer (토요보 (주) 제조) 4 ㎕, 2.5 mM dNTP (닛폰 진 (주) 제조) 4 ㎕, RNase 저해제, super (와코우 순약 공업 (주) 제조) 0.5 ㎕ (20 U), ReverTra Ace (토요보 (주) 제조) 1 ㎕ (100 U) 첨가하여 혼합하고, 42 ℃, 50 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 결합 Buffer (5.5 M 구아니딘염산염 (와코우 순약 공업 (주) 제조), 20 mM Tris-HCl pH6.6 (와코우 순약 공업 (주) 제조)) 을 100 ㎕ 첨가하여 혼합하고, 에코노스핀 (핵산 정제용 실리카 멤브레인 스핀 칼럼, (주) 진 디자인 제조) 으로 옮기고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여, 튜브의 용액을 제거하였다. 그 후, 세정 Buffer (2 mM Tris-HCl pH7.5 (닛폰 진 (주) 제조), 80 ％ 에탄올 (와코우 순약 공업 (주) 제조)) 을 500 ㎕ 첨가하고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여, 튜브의 용액을 제거하였다. 그 후, 추가로 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리한 후, 새로운 튜브로 교환하고, 용출 Buffer (10 mM Tris-HCl pH8.5) (닛폰 진 (주) 제조) 를 25 ㎕ 첨가하고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여, 얻어진 침전물을 증류수 1 ㎕ 에 용해시켜 cDNA 를 회수하였다.

또한, 본 실험계에 게놈 DNA 가 혼재되어 있지 않은 것을 확인하기 위해서, 동일한 시료를 사용하여, RTase (ReverTra Ace (토요보 (주) 제조), 역전사 효소) 를 첨가하지 않는 것 이외에는 상기와 동일한 반응을 실시하였다.

(5) PCR 반응

상기 (4) 에서 얻어진 cDNA 1 ㎕ 와, 증류수 5 ㎕, 2 × PCR Buffer for KOD FX Neo (토요보) 12.5 ㎕, 2 mM dNTP (토요보) 4 ㎕, KOD FX Neo (토요보) 0.5 ㎕ (0.5 U), 각 포워드 프라이머 (10 μM) 1 ㎕, 각 리버스 프라이머 (10 μM) 1 ㎕ 를 혼합하였다.

사용한 각 프라이머의 염기 배열은 이하와 같다. 하기 프라이머는 모두 시그마 알도리치사 제조이다.

FOXB2 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_001013735 : 45-67, 201-223

포워드 프라이머 : CTACTCTTACATCTCGCTGACCG (배열 번호 9)

리버스 프라이머 : GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG (배열 번호 10)

증폭 사슬 길이 : 179 bp

※배열 번호 9 의 포워드 프라이머와 배열 번호 10 의 리버스 프라이머는, 각각 FOXB2 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_001013735 의 45-67 번째의 염기 배열 및 201-223 번째의 염기 배열을 기초로 설계되었다. 이하 동일.

따라서, 이 프라이머 페어를 사용한 핵산 증폭 반응에 의해, FOXB2 유전자 (배열 번호 1 로 나타내는 염기 배열) 의 45 ∼ 223 번째의 179 bp 의 영역 (배열 번호 3) (GenBank 등록 번호 NM_001013735.1 의 position 45-223) 이 증폭된다.

OCT3/4 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_002701 : 340-361, 515-535

포워드 프라이머 : CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG (배열 번호 11)

리버스 프라이머 : CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG (배열 번호 12)

증폭 사슬 길이 : 196 bp

NANOG cDNA, GenBank 등록 번호 NM_024865 : 284-305, 528-550

포워드 프라이머 : CACCTATGCCTGTGATTTGTGG (배열 번호 13)

리버스 프라이머 : CATTGAGTACACACAGCTGGGTG (배열 번호 14)

증폭 사슬 길이 : 267 bp

SOX2 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_003106 : 31-54, 443-464

포워드 프라이머 : GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG (배열 번호 15)

리버스 프라이머 : CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG (배열 번호 16)

증폭 사슬 길이 : 434 bp

GAPDH cDNA, GenBank 등록 번호 NM_002046 : 240-260, 618-638

포워드 프라이머 : GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC (배열 번호 17)

리버스 프라이머 : GGCATTGCTGATGATCTTGAG (배열 번호 18)

증폭 사슬 길이 : 399 bp

각각의 혼합물을 서멀 사이클로에 세트하고 94 ℃ 2 분간, 98 ℃ 10 초간 → 56 ℃ 20 초간 → 68 ℃ 30 초간을 OCT3/4 cDNA, NANOG cDNA, SOX2 cDNA 및 FOXB2 cDNA 를 증폭시키는 경우에는 28 사이클, GAPDH cDNA 를 증폭시키는 경우에는 20 사이클 실시한 후, 68 ℃ 2 분간 반응시켰다.

(6) 전기 영동

상기 (5) 에서 얻어진 PCR 증폭 산물 5 ㎕ 와, 6 × Loading Buffer Double Dye (닛폰 진 (주) 제조) 1 ㎕ 를 혼합하고, 이것을 1.5 ％ 아가로오스 겔로 전기 영동하였다. 염색은 GelRed 핵산 겔 염색액 (와코우 순약 공업 (주) 제조) 으로 실시하였다.

또한, 상기 (4) 에서 RTase 를 첨가하지 않고 반응을 실시하여 얻어진 반응물에 대해서도, 상기의 (5) ∼ (6) 의 처리를 실시하였다.

(7) 결과

결과를 도 1 에 아울러 나타낸다.

도 1 의 결과로부터 분명한 바와 같이, 일반적으로 자주 확인되고 있는 미분화 마커인 OCT3/4 mRNA (도 1(3)), NANOG mRNA (도 1(4)) 및 SOX2 mRNA (도 1(5)) 는, 미분화·다능성을 유지하고 있는 상태의 hiPS 세포 (hiPS·bFGF (+)·RTase (+) 의 경우) 에서는 발현하고 있었다. 또, 분화 유도 처리 후 5 일째의 hiPS 세포 (hiPS·bFGF (-)·RTase (+) 의 경우) 에도, 아직 발현하고 있는 (밴드가 확인된) 것이 확인되었다. 그러나, OCT3/4 mRNA, NANOG mRNA 및 SOX2 mRNA 는 분화한 세포인 HDF 세포에서는 발현하고 있지 않았다.

한편, FOXB2 mRNA (도 1(1)) 는, 분화 유도 처리 후 5 일째의 hiPS 세포 (hiPS·bFGF (-)·RTase (+) 의 경우) 에서는 발현하고 있는 (밴드가 확인된) 것이 확인되었다. 그러나, FOXB2 mRNA 는 미분화·다능성을 유지하고 있는 상태의 hiPS 세포 (hiPS·bFGF (+)·RTase (+) 의 경우) 와, 분화한 세포 (특히 분화가 완료한 세포) 인 HDF 세포에서는 발현하고 있지 않았다.

또한, 모든 mRNA 의 검출 결과에서 RTase (-) 의 경우에 밴드가 확인되지 않았던 점에서, 본 실험계에는 게놈 DNA 의 혼입이 없는 것이 확인되었다.

또, GAPDH mRNA 의 검출 결과 (도 1(2)) 를 보면, "hiPS·bFGF (+)·RTase (+)", "hiPS·bFGF (-)·RTase (+)", "HDF·RTase (+)" 의 경우에 밴드가 확인되고, "hiPS·bFGF (+)·RTase (-)", "hiPS·bFGF (-)·RTase (-)", "DF·RTase (-)" 의 경우에 밴드가 확인되지 않았다. 이런 점에서 본 실험계에서는 mRNA 는 분해되어 있지 않은 것이 확인되었다.

따라서, FOXB2 mRNA 가 분화 마커로서 유용하고, FOXB2 mRNA 를 검출함으로써, 세포의 분화 상태를 판정할 수 있는 것이 분명해졌다. 또, 일반적으로 측정되고 있는 미분화 마커 (OCT3/4, NANOG, SOX2) 의 발현의 변화가 검출되어 있지 않은 단계에서도 현저하게 FOXB2 mRNA 의 발현이 검출된 점에서, FOXB2 mRNA 는 종래의 미분화 마커보다 분화의 초기 단계에서 세포의 분화 상태를 판정할 수 있는 것을 알 수 있었다.

실시예 2.

(1) 간세포의 배양과 분화 유도 처리

hiPS 세포 (201B7 주, 쿄토 대학 iPS 세포 연구소 (iPS 아카데미아 재팬 주식회사)) 를 bFGF 첨가 또는 무첨가의 배지 (StemSure hPSC Medium, 와코우 순약 공업 (주) 제조) 에서 배양하고, 배양 3 일째, 5 일째, 7 일째에 세포를 회수하였다.

또, 비교로서 및 분화한 세포인 HDF 세포 (인간 정상 세포 유래 섬유아 세포, 론자 재팬 (주) 제조) 를 MEM 배지 (+10 ％ FBS) (와코우 순약 공업 (주) 제조) 에서 배양하고, 배양 7 일째에 세포를 회수하였다.

(2) 총 RNA 의 추출

실시예 1(2) 와 동일한 방법으로, 상기 (1) 에서 회수한 배양 3 일째, 5 일째, 7 일째의 세포로부터, 각각 총 RNA 를 추출하였다.

또, 비교로서 HMSC-bm 세포 (인간 골수 유래 간엽계 간세포) 의 총 RNA (ScienCell Research Laboratories 사 제조) 를 사용하였다.

(3) DNase 처리

실시예 1(3) 과 동일한 방법으로 상기 (2) 에서 추출한 총 RNA, 및 HMSC-bm 세포의 총 RNA 의 1 ㎍ 을 각각 DNase 처리하였다.

(4) 역전 전사 반응

상기 (3) 에서 DNase 처리한 총 RNA 9.5 ㎕ 에, 하기의 프라이머를 함유하는 혼합 프라이머 (각 5 μM) 1 ㎕ 를 첨가하였다. 하기 프라이머는 모두 시그마 알도리치사 제조이다.

·FOXB2 mRNA 의 증폭 프라이머, CAGAAGCTACCCTTGCCAG (배열 번호 4, GenBank 등록 번호 NM_001013735 : 242-260),

각각의 혼합물에 대하여, 실시예 1(4) 와 동일한 방법으로, 역전사 반응을 실시하여, 각각 cDNA 를 회수하였다.

(5) PCR 반응

상기 (4) 에서 얻어진 cDNA 1 ㎕, 증류수 5 ㎕, 2 × PCR Buffer for KOD FX Neo (토요보 (주) 제조) 12.5 ㎕, 2 mM dNTP (토요보 (주) 제조) 4 ㎕, KOD FX Neo (토요보 (주) 제조) 0.5 ㎕ (0.5 U), 각 포워드 프라이머 (10 μM) 1 ㎕, 각 리버스 프라이머 (10 μM) 1 ㎕ 를 혼합하였다.

FOXB2 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_001013735 : 45-67, 201-223

포워드 프라이머 : CTACTCTTACATCTCGCTGACCG (배열 번호 9)

리버스 프라이머 : GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG (배열 번호 10)

증폭 사슬 길이 : 179 bp

OCT3/4 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_002701 : 340-361, 515-535

포워드 프라이머 : CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG (배열 번호 11)

리버스 프라이머 : CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG (배열 번호 12)

증폭 사슬 길이 : 196 bp

NANOG cDNA, GenBank 등록 번호 NM_024865 : 284-305, 528-550

포워드 프라이머 : CACCTATGCCTGTGATTTGTGG (배열 번호 13)

리버스 프라이머 : CATTGAGTACACACAGCTGGGTG (배열 번호 14)

증폭 사슬 길이 : 267 bp

SOX2 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_003106 : 31-54, 443-464

포워드 프라이머 : GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG (배열 번호 15)

리버스 프라이머 : CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG (배열 번호 16)

증폭 사슬 길이 : 434 bp

GAPDH cDNA, GenBank 등록 번호 NM_002046 : 240-260, 618-638

포워드 프라이머 : GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC (배열 번호 17)

리버스 프라이머 : GGCATTGCTGATGATCTTGAG (배열 번호 18)

증폭 사슬 길이 : 399 bp

각각의 혼합물을 서멀 사이클로에 세트하고 94 ℃ 2 분간, 98 ℃ 10 초간 → 56 ℃ 20 초간 → 68 ℃ 30 초간을 OCT3 /4 cDNA, NANOG cDNA, SOX2 cDNA 및 FOXB2 cDNA 를 증폭시키는 경우에는 28 사이클, GAPDH cDNA 를 증폭시키는 경우에는 20 사이클 실시한 후, 68 ℃ 2 분간 반응시켰다.

(6) 전기 영동

PCR 증폭 산물 5 ㎕ 와, 6 × Loading Buffer Double Dye (닛폰 진 (주) 제조) 1 ㎕ 를 혼합하고, 이것을 1.5 ％ 아가로오스 겔로 전기 영동하였다. 염색은 GelRed 핵산 겔 염색액 (와코우 순약 공업 (주) 제조) 으로 실시하였다.

(7) 결과

결과를 도 2 에 아울러 나타낸다.

도 2 의 결과로부터 분명한 바와 같이, hiPS 세포를 bFGF 무첨가 배지에서 배양하고 분화 유도 처리했을 경우, FOXB2 mRNA 는 배양 기간이 길어지는 데에 비례하여, 발현량이 증가하였다.

이에 대해, FOXB2 mRNA 이외의 공지된 미분화 마커 (OCT3 /4 mRNA, NANOG mRNA, SOX2 mRNA, GAPDH mRNA) 는, bFGF 무첨가 배지에서 배양하고 분화 유도 처리해도, 분화 유도 처리 후 7 일까지는 아직 소실되지 않고 발현하고 있는 것이 확인되었다.

한편, HMSC-bm (인간 골수 유래 간엽계 간세포) 을 bFGF 무첨가 배지에서 배양해도, FOXB2 mRNA 의 발현도, 공지된 미분화 마커 (OCT3 /4 mRNA, NANOG mRNA, SOX2 mRNA, GAPDH mRNA) 의 발현도 확인되지 않았다. HMSC-bm 은, 간세포 (RS 세포) 로부터 중배엽을 거쳐 형성되는 체성 간세포이다. 이런 점에서, 미분화 간세포의 분화가 이 정도까지 진행되어 버리면, FOXB2 mRNA 는 발현하지 않게 되는 것, 바꿔 말하면 FOXB2 mRNA 는 세포의 분화의 초기에 특이적으로 발현하는 것으로 추찰된다.

또, 배양 5 일째의 HDF 세포는, FOXB2 mRNA 의 발현도, 공지된 미분화 마커 (OCT3/4 mRNA, NANOG mRNA, SOX2 mRNA, GAPDH mRNA) 의 발현도 확인되지 않았다.

또한, 모든 mRNA 의 검출 결과에서 RTase (-) 의 경우에 밴드가 확인되지 않았던 점에서, 본 실험계에는 게놈 DNA 의 혼입이 없는 것이 확인되었다. 또, GAPDH mRNA 는 RTase (+) 의 모든 경우에서 검출되어 있으므로, 이 본 실험계에서는 mRNA 는 분해되지 않고, mRNA 의 발현을 올바르게 검출하고 있는 것이 확인되었다.

이상의 결과로부터 분명한 바와 같이, FOXB2 mRNA 의 발현이, 일반적으로 측정되고 있는 미분화 마커 (OCT3 /4, NANOG, SOX2) 의 발현의 변화가 검출되는 것보다도 빨리 검출되었다. 이런 점에서, FOXB2 mRNA 는 세포의 분화의 초기 단계의 분화 마커로서 특히 유용한 것, 바꿔 말하면, FOXB2 mRNA 의 발현을 검출함으로써, 세포의 분화 상태를 분화의 초기 단계에서 판정할 수 있는 것이 분명해졌다.

실시예 3.

(1) 간세포의 배양과 분화 유도 처리

hiPS 세포 (201B7 주, 쿄토 대학 iPS 세포 연구소 (iPS 아카데미아 재팬 주식회사)), 및 비교로서, 분화한 세포인 HDF 세포 (인간 정상 세포 유래 섬유아 세포, 론자 재팬 (주) 제조) 를, bFGF 첨가 (100 ng/㎖) 또는 무첨가의 배지 (StemSure hPSC Medium, 와코우 순약 공업 (주) 제조) 에서 3 회 계대 배양하고, 배양 6 일째에 세포를 회수하였다.

(2) 총 RNA 의 추출

시판되는 핵산 추출 시약인 키트 ISOGEN ((주) 닛폰 진 제조) 을 사용하여, 현품 설명서에 따라, 상기 (1) 에서 회수한 세포로부터 총 RNA 를 추출하였다.

(3) DNase 처리

실시예 1(3) 과 동일한 방법으로, 상기 (2) 에서 추출한 총 RNA 의 1 ㎍ 을 각각 DNase 처리하였다.

(4) 역전 전사 반응

·FOXB2 mRNA 의 증폭 프라이머, CAGAAGCTACCCTTGCCAG (배열 번호 4, GenBank 등록 번호 NM_001013735 : 242-260)

·OCT3 /4 mRNA 의 증폭 프라이머, GTTCTTGAAGCTAAGCTGCAG (배열 번호 5, GenBank 등록 번호 NM_002701 : 641-661)

·NANOG mRNA 의 증폭 프라이머, GTTCTGGAACCAGGTCTTCAC (배열 번호 6, GenBank 등록 번호 NM_024865 : 631-651)

·SOX2 mRNA 의 증폭 프라이머, GACCACACCATGAAGGCATTC (배열 번호 7, GenBank 등록 번호 NM_003106 : 572-592)

·FGF5 mRNA 의 증폭 프라이머, CTCCCTGAACTTGCAGTCATC (배열 번호 19, GenBank 등록 번호 NM_004464 : 709-729)

·CDX2 mRNA 의 증폭 프라이머, CCTGAGGAGTCTAGCAGAGTC (배열 번호 20, GenBank 등록 번호 NM_001265 : 1359-1379)

·GATA4 mRNA 의 증폭 프라이머, GATTACGCAGTGATTATGTCCC (배열 번호 21, GenBank 등록 번호 NM_001308094 : 1110-1131)

·GATA6 mRNA 의 증폭 프라이머, CATCTTGACCCGAATACTTGAG (배열 번호 22, GenBank 등록 번호 NM_005257 : 1961-1982)

·SOX17 mRNA 의 증폭 프라이머, CCCAGGAGTCTGAGGATTTCC (배열 번호 23, GenBank 등록 번호 NM_022454 : 1515-1535)

각각의 혼합물을 72 ℃, 3 분간 인큐베이션한 후, 즉시 빙랭하였다. 이어서, 5 × Buffer (토요보 (주) 제조) 4 ㎕, 2.5 mM dNTP ((주) 닛폰 진 제조) 4 ㎕, RNase 저해제, super (와코우 순약 공업 (주) 제조) 0.5 ㎕ (20 U), ReverTra Ace (토요보 (주) 제조) 1 ㎕ (100 U) 첨가하여 혼합하고, 42 ℃, 50 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 결합 Buffer (5.5 M 구아니딘염산염 (와코우 순약 공업 (주) 제조), 20 mM Tris-HCl pH6.6 (와코우 순약 공업 (주) 제조)) 을 100 ㎕ 첨가하여 혼합하고, 에코노스핀 ((주) 진 디자인 제조) 으로 옮기고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여, 튜브의 용액을 제거하였다. 그 후, 세정 Buffer (2 mM Tris-HCl pH7.5 ((주) 닛폰 진 제조), 80 ％ 에탄올 (와코우 순약 공업 (주) 제조) 을 500 ㎕ 첨가하고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여, 튜브의 용액을 제거하였다. 그 후, 추가로 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리한 후, 새로운 튜브로 교환하고, 용출 Buffer (10 mM Tris-HCl pH8.5) ((주) 닛폰 진 제조) 를 25 ㎕ 첨가하고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여, 얻어진 침전물을 증류수 1 ㎕ 에 용해시켜 cDNA 를 회수하였다.

(5) PCR 반응

사용한 각 프라이머의 염기 배열은 이하와 같다. 하 기 프라이머는 모두 시그마 알도리치사 제조이다.

FOXB2 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_001013735 : 45-67, 201-223

포워드 프라이머 : CTACTCTTACATCTCGCTGACCG (배열 번호 9)

리버스 프라이머 : GAATCTTGATGAAGCAGTCGTTG (배열 번호 10)

증폭 사슬 길이 : 179 bp

OCT3 /4 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_002701 : 340-361, 515-535

포워드 프라이머 : CTTGGAGACCTCTCAGCCTGAG (배열 번호 11)

리버스 프라이머 : CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG (배열 번호 12)

증폭 사슬 길이 : 196 bp

NANOG cDNA, GenBank 등록 번호 NM_024865 : 284-305, 528-550

포워드 프라이머 : CACCTATGCCTGTGATTTGTGG (배열 번호 13)

리버스 프라이머 : CATTGAGTACACACAGCTGGGTG (배열 번호 14)

증폭 사슬 길이 : 267 bp

SOX2 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_003106 : 31-54, 443-464

포워드 프라이머 : GTATCAGGAGTTGTCAAGGCAGAG (배열 번호 15)

리버스 프라이머 : CAGCTCCGTCTCCATCATGTTG (배열 번호 16)

증폭 사슬 길이 : 434 bp

FGF5 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_004464 : 462-482, 615-637

포워드 프라이머 : GCAGAGCAGTTTCCAGTGGAG (배열 번호 24)

리버스 프라이머 : GTATTCCTACAATCCCCTGAGAC (배열 번호 25)

증폭 사슬 길이 : 176 bp

CDX2 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_001265 : 923-944, 1176-1196

포워드 프라이머 : CAAATATCGAGTGGTGTACACG (배열 번호 26)

리버스 프라이머 : GACACTTCTCAGAGGACCTGG (배열 번호 27)

증폭 사슬 길이 : 274 bp

GATA4 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_001308094 : 795-816, 1020-1040

포워드 프라이머 : CAGCTCCTTCAGGCAGTGAGAG (배열 번호 28)

리버스 프라이머 : CGGGAGACGCATAGCCTTGTG (배열 번호 29)

증폭 사슬 길이 : 246 bp

GATA6 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_005257 : 1682-1703, 1842-1864

포워드 프라이머 : GCTTGTGGACTCTACATGAAAC (배열 번호 30)

리버스 프라이머 : GCTGCAATCATCTGAGTTAGAAG (배열 번호 31)

증폭 사슬 길이 : 183 bp

SOX17 cDNA GenBank 등록 번호 NM_022454 : 1286-1306, 1490-1511

포워드 프라이머 : CGGAATTTGAACAGTATCTGC (배열 번호 32)

리버스 프라이머 : GCTCCTCCAGGAAGTGTGTAAC (배열 번호 33)

증폭 사슬 길이 : 226 bp

GAPDH cDNA, GenBank 등록 번호 NM_002046 : 240-260, 618-638

포워드 프라이머 : GTCACCAGGGCTGCTTTTAAC (배열 번호 17)

리버스 프라이머 : GGCATTGCTGATGATCTTGAG (배열 번호 18)

증폭 사슬 길이 : 399 bp

각각의 혼합물을 서멀 사이클로에 세트하고 94 ℃ 2 분간, 98 ℃ 10 초간 → 56 ℃ 20 초간 → 68 ℃ 30 초간을 OCT3 /4 cDNA, NANOG cDNA 및 SOX2 cDNA 를 증폭시키는 경우에는 24 사이클, FOXB2 cDNA, FGF5 cDNA, GATA4 cDNA, GATA6 cDNA 및 SOX17 cDNA 를 증폭시키는 경우에는 28 사이클, GAPDH cDNA 를 증폭시키는 경우에는 20 사이클, 68 ℃ 2 분간 반응시켰다.

(6) 전기 영동

상기 (5) 에서 얻어진 PCR 증폭 산물 5 ㎕ 와, 6 × Loading Buffer Double Dye ((주) 닛폰 진 제조) 1 ㎕ 를 혼합하고, 이것을 1.5 ％ 아가로오스 겔로 전기 영동하였다. 염색은 GelRed 핵산 겔 염색액 (와코우 순약 공업 (주) 제조) 으로 실시하였다.

또한, 상기 (4) 에서 RTase 를 첨가하지 않고 반응을 실시하여 얻어진 반응물에 대해서도 상기의 (5) ∼ (6) 의 처리를 실시하였다.

(7) 결과

결과를 도 3 에 아울러 나타낸다.

도 3 의 결과로부터 분명한 바와 같이, hiPS 세포를 bFGF 무첨가 배지에서 배양하고 분화 유도했을 경우, 분화 유도 후 (hiPS·bFGF (-)·RTase (+) 의 경우) 6 일째여도, 미분화 마커인 OCT3 /4 mRNA, NANOG mRNA 및 SOX2 mRNA 는 아직 발현하고 있는 (밴드가 확인된) 것이 확인되었다.

또, 공지된 분화 마커인 FGF5 mRNA (외배엽 분화 마커), CDX2 mRNA (외배엽 분화 마커), GATA4 mRNA (내배엽 분화 마커), GATA6 mRNA (내배엽 분화 마커), SOX7 mRNA (내배엽 분화 마커), SSEA -1 mRNA (분화 마커) 는, 분화 유도 처리 후 6 일째의 hiPS 세포에서는, 아직 발현하고 있지 않은 (밴드가 확인되지 않은) 것이 확인되었다.

한편, FOXB2 mRNA 는 분화 유도 처리 후 6 일째의 hiPS 세포 (hiPS·bFGF (-)·RTase (+) 의 경우) 에서는 발현하고 있는 (밴드가 확인된) 것이 확인되었다.

또, GAPDH mRNA 의 검출 결과를 보면, "hiPS·bFGF (+)·RTase (+)", "hiPS·bFGF (-)·RTase (+)", "HDF·RTase (+)" 의 경우에 밴드가 확인되고, "hiPS·bFGF (+)·RTase (-)", "hiPS·bFGF (-)·RTase (-)", "DF·RTase (-)" 의 경우에 밴드가 확인되지 않았다. 이런 점에서 본 실험계에서는 mRNA 는 분해되어 있지 않은 것이 확인되었다.

따라서, FOXB2 mRNA 가 분화 마커로서 유용하고, FOXB2 mRNA 를 검출함으로써, 세포의 분화 상태를 판정할 수 있는 것이 분명해졌다. 또, 일반적인 미분화 마커 (OCT3 /4, NANOG, SOX2) 의 발현의 변화가 검출되어 있지 않은 단계에서도 현저하게 FOXB2 mRNA 의 발현이 검출되었다.

또한, 현재 가장 유망한 분화 마커로서 알려져 있는 FGF5 mRNA 가 아직 발현되어 있지 않은 단계에서, FOXB2 mRNA 의 발현이 검출되었다. 즉, FOXB2 mRNA 는 종래의 분화 마커나 미분화 마커보다 분화의 빠른 단계 (초기 단계) 에서, 세포의 분화 상태를 판정할 수 있는 것을 알 수 있었다.

이상으로부터, FOXB2 mRNA 는 종래의 분화·미분화 마커보다 매우 유용한 분화 마커인 것이 분명해졌다. 또, 배양 초기에서 분화된 세포를 판정할 수 있으므로, 세포의 조기 스크리닝이나 간세포의 품질 관리 등에 유용하고, 배양 기간의 단축, 배지대의 경비 삭감 등을 기대할 수 있다.

실시예 4.

마우스 ES 세포를 LIF 무첨가 배지에서 배양하고 분화 유도 처리하여, FOXB2 mRNA 및 공지된 미분화 마커의 발현을 RT-PCR 법에 의해 검출하였다.

(1) 간세포의 배양과 분화 유도 처리

mES 세포 (D3 주, ATCC, b723512) 를, LIF 첨가 (1000 Unit) 또는 무첨가의 배지 (StemSure DMEM, StemSure Serum replacement, MEM 비필수 아미노산 용액, L-글루타민 용액, StemSure 2-메르캅토에탄올 용액, 와코우 순약 공업 (주) 제조) 에서 3 회 계대 배양하고, 배양 3 일째, 5 일째, 7 일째에 세포를 회수하였다.

(2) 총 RNA 의 추출

(3) DNase 처리

상기 (2) 에서 추출한 총 RNA 의 1 ㎍ 에, 전체량 17 ㎕ 가 되도록 증류수를 첨가하고, 10X Reaction Buffer (프로메가 (주) 제조) 를 2 ㎕, RQ1 RNase-Free DNase (프로메가 (주) 제조) 를 1 ㎕ (1 U) 를 첨가하여 혼합하고, 37 ℃, 20 분간 인큐베이션하였다. 그 후, Stop Buffer (20 mM EGTA) (프로메가 (주) 제조) 를 1 ㎕ 첨가하여 혼합하고, 65 ℃, 10 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 반응물에 결합 Buffer (5.5 M 구아니딘염산염 (와코우 순약 공업 (주) 제조), 20 mM Tris-HCl pH6.6) 을 100 ㎕ 첨가하여 혼합한 후, 에코노스핀 (핵산 정제용 실리카 멤브레인 스핀 칼럼, (주) 진 디자인 제조) 으로 옮기고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여, 튜브의 용액을 제거하였다. 이어서, 튜브에 세정 Buffer (2 mM Tris-HCl pH7.5 ((주) 닛폰 진 제조), 80 ％ 에탄올 (와코우 순약 공업 (주) 제조) 을 500 ㎕ 첨가하고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여, 튜브의 용액을 제거하였다. 추가로 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리한 후, 에코노스핀 (mRNA 가 결합하고 있다) 을 새로운 튜브로 교환하고, 용출 Buffer (10 mM Tris-HCl pH8.0) ((주) 닛폰 진 제조) 를 50 ㎕ 첨가하고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여 총 RNA 를 회수하였다. 그 후, 에탄올 침전을 실시하고, 얻어진 침전물을 증류수 9.5 ㎕ 에 용해시켰다.

(4) 역전 전사 반응

·Foxb2 mRNA 의 증폭 프라이머, CATGATGAACTTGTAGATGTC (배열 번호 37, GenBank 등록 번호 NM_008023 : 302-322)

·Oct3 /4 mRNA 의 증폭 프라이머, CATGTTCTTAAGGCTGAGCTGC (배열 번호 38, GenBank 등록 번호 NM_013633 : 617-638)

·Nanog mRNA 의 증폭 프라이머, CTGAATCAGACCATTGCTAGTC (배열 번호 39, GenBank 등록 번호 NM_028016 : 388-408)

·Sox2 mRNA 의 증폭 프라이머, CAACGATATCAACCTGCATGG (배열 번호 40, GenBank 등록 번호 NM_011443 : 2120-2140)

·Klf2 mRNA 의 증폭 프라이머, GAACTGGTGGCAGAGTCATTTTC (배열 번호 41, GenBank 등록 번호 NM_008452 : 1205-1227)

·Esrrb mRNA 의 증폭 프라이머, GATTCGAGACGATCTTAGTCAATG (배열 번호 42, GenBank 등록 번호 NM_011934 : 957-980)

·Fgf5 mRNA 의 증폭 프라이머, GACGCATAGGTATTATAGCTG (배열 번호 43, GenBank 등록 번호 NM_010203 : 729-749)

·Gapdh mRNA 의 증폭 프라이머, CTTGATGTCATCATACTTGGC (배열 번호 44, GenBank 등록 번호 NM_001289726 : 843-863)

각각의 혼합물을 72 ℃, 3 분간 인큐베이션한 후, 즉시 빙랭하였다. 이어서, 5 × Buffer (토요보 (주) 제조) 4 ㎕, 2.5 mM dNTP ((주) 닛폰 진 제조) 4 ㎕, RNase 저해제, super (와코우 순약 공업 (주) 제조) 0.5 ㎕ (20 U), ReverTra Ace (토요보 (주) 제조) 1 ㎕ (100 U) 첨가하여 혼합하고, 42 ℃, 50 분간 인큐베이션하였다. 그 후, 결합 Buffer (5.5 M 구아니딘염산염 (와코우 순약 공업 (주) 제조), 20 mM Tris-HCl pH6.6 (와코우 순약 공업 (주) 제조) 을 100 ㎕ 첨가하여 혼합하고, 에코노스핀 ((주) 진 디자인 제조) 으로 옮기고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여, 튜브의 용액을 제거하였다. 그 후, 세정 Buffer (2 mM Tris-HCl pH7.5 ((주) 닛폰 진 제조), 80 ％ 에탄올 (와코우 순약 공업 (주) 제조) 을 500 ㎕ 첨가하고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여, 튜브의 용액을 제거하였다. 그 후, 추가로 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리한 후, 새로운 튜브로 교환하고, 용출 Buffer (10 mM Tris-HCl pH8.5) ((주) 닛폰 진 제조) 를 25 ㎕ 첨가하고, 12000 × g, 실온, 1 분간 원심 분리하여, 얻어진 침전물을 증류수 1 ㎕ 에 용해시켜 cDNA 를 회수하였다.

(5) PCR 반응

Foxb2 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_008023 : 132-152, 279-300

포워드 프라이머 : CTTTCCAAGAGGCGTTAAGGC (배열 번호 45)

리버스 프라이머 : CTCAGAGGCAGCATCTTCTCAG (배열 번호 46)

증폭 사슬 길이 : 169 bp

Oct3 /4 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_013633 : 163-186, 480-501

포워드 프라이머 : GAACCTGGCTAAGCTTCCAAG (배열 번호 47)

리버스 프라이머 : GCTTGGCAAACTGTTCTAGCTC (배열 번호 48)

증폭 사슬 길이 : 339 bp

Nanog cDNA, GenBank 등록 번호 NM_028016 : 110-134, 388-408

포워드 프라이머 : GCATTAGACATTTAACTCTTCTTTC (배열 번호 49)

리버스 프라이머 : CTTGAAGAGGCAGGTCTTCAG (배열 번호 50)

증폭 사슬 길이 : 299 bp

Sox2 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_011443 : 1652-1674, 1836-1859

포워드 프라이머 : GAATCGGACCATGTATAGATCTG (배열 번호 51)

리버스 프라이머 : CATTTGATTGCCATGTTTATCTCG (배열 번호 52)

증폭 사슬 길이 : 208 bp

Klf2 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_008452 : 910-931, 1159-1182

포워드 프라이머 : GAAGCCTTATCATTGCAACTGG (배열 번호 53)

리버스 프라이머 : CTGTCCTAAGGTCCAATAAATAGC (배열 번호 54)

증폭 사슬 길이 : 273 bp

Esrrb cDNA, GenBank 등록 번호 NM_011934 : 552-573, 760-782

포워드 프라이머 : GCAAGAGCTACGAGGACTGTAC (배열 번호 55)

리버스 프라이머 : GTTTGGTGATCTCACATTCATTG (배열 번호 56)

증폭 사슬 길이 : 231 bp

Fgf5 cDNA, GenBank 등록 번호 NM_010203 : 445-465, 617-639

포워드 프라이머 : GAACATAGCAGTTTCCAGTGG (배열 번호 57)

리버스 프라이머 : GTTGCTGAAAACTCCTCGTATTC (배열 번호 58)

증폭 사슬 길이 : 195 bp

Gapdh cDNA, GenBank 등록 번호 NM_001289726 : 224-246, 512-534

포워드 프라이머 : GTTCCAGTATGACTCCACTCACG (배열 번호 59)

리버스 프라이머 : CATTGCTGACAATCTTGAGTGAG (배열 번호 60)

증폭 사슬 길이 : 311 bp

각각의 혼합물을 서멀 사이클로에 세트하고 94 ℃ 2 분간, 98 ℃ 10 초간 → 57 ℃ 20 초간 → 68 ℃ 30 초간을 Oct3 /4 cDNA, Nanog cDNA, Sox2 cDNA, Klf2 cDNA, 및 Esrrb cDNA 를 증폭시키는 경우에는 25 사이클, Fgf5 cDNA 및 FOXB2 cDNA 를 증폭시키는 경우에는 30 사이클, Gapdh cDNA 를 증폭시키는 경우에는 20 사이클, 68 ℃ 2 분간 반응시켰다.

(6) 전기 영동

(7) 결과

결과를 도 4 에 아울러 나타낸다.

도 4 의 결과로부터 분명한 바와 같이, FOXB2 mRNA 는 분화 유도 처리 후 7 일째의 ES 세포 (LIF (-)·RTase (+) 의 경우) 에서는 발현되어 있는 (밴드가 확인된) 것이 확인되었다. 그러나, FOXB2 mRNA 는 미분화·다능성을 유지하고 있는 상태의 ES 세포 (LIF (+)·RTase (+) 의 경우) 에서는 발현하고 있지 않았다.

분화 마커인 Fgf5 mRNA 는 분화 유도 처리 후 7 일째의 ES 세포 (LIF (-)·RTase (+) 의 경우) 에서 발현하고 있는 (밴드가 확인된) 것이 확인되었다.

또, 미분화 마커인 OCT3 /4 mRNA, NANOG mRNA 및 SOX2 mRNA 는 미분화·다능성을 유지하고 있는 상태의 ES 세포 (LIF (+)·RTase (+) 의 경우) 에서는 발현하고 있었다. 또, 분화 유도 처리 후 7 일째의 ES 세포 (LIF (-)·RTase (+) 의 경우) 에서도, 아직 발현하고 있는 (밴드가 확인된) 것이 확인되었다.

또, GAPDH mRNA 의 검출 결과를 보면, "LIF (+)·RTase (+)" 와 "LIF (-)·RTase (+)" 의 경우에 밴드가 확인되고, "LIF (+)·RTase (-)" 와 "LIF (-)·RTase (-)" 의 경우에 밴드가 확인되지 않았다. 이런 점에서 본 실험계에서는 mRNA 는 분해되어 있지 않은 것이 확인되었다.

이상의 결과로부터 분명한 바와 같이, FOXB2 mRNA 의 발현은, 현재 분화 마커로서 가장 유망하다고 여겨지는 Fgf5 mRNA 와 동일한 정도의 조기에 검출되었다. 또, FOXB2 mRNA 의 발현은, 일반적인 미분화 마커 (OCT3 /4, NANOG, SOX2) 의 발현의 변화가 검출되어 있지 않은 단계에서도 현저하게 검출되었다. 또한, 나이브 마커로서 알려져 있는 Klf2 mRNA 나 Esrrb mRNA 가 아직 소실되지 않은 분화 유도 후 7 일째의 단계에서 FOXB2 mRNA 의 발현이 확인되었다.

이상으로부터, FOXB2 mRNA 는 종래의 미분화 마커보다 분화의 초기 단계에서 ES 세포의 분화 상태를 판정할 수 있는 것을 알 수 있었다. 또, 배양 초기에서 분화된 세포를 판정할 수 있으므로, 세포의 조기 스크리닝이나 간세포의 품질 관리 등에 유용하고, 배양 기간의 단축, 배지대의 경비 삭감 등을 기대할 수 있다.

참고예 1. 세포의 분화 상태의 확인

(1) 간세포의 배양과 분화 유도 처리

hiPS 세포 (201B7 주, 쿄토 대학 iPS 세포 연구소 (iPS 아카데미아 재팬 주식회사)) 를 이하의 배지에서 배양하였다.

hiPS 세포를 +bFGF 및 +ROCK 저해제의 첨가 또는 무첨가의 hPSCΔ배지 (와코우 순약 공업 (주) 제조) 20000 개 세포/웰이 되도록 4 장의 웰에 파종하고, 1 일 배양하였다.

2 일째부터는 4 장의 웰을 2 장씩, 배지를 (1) hPSCΔ배지, +bFGF, (2) hPSCΔ배지, +bFGF (100 ㎎/㎖) 로 하고, 각각 매일 배지 교환하였다. 6 일간 배양 후, 세포를 관찰하였다.

(2) 결과

결과를 도 5 에 나타낸다.

도 5 에 있어서, (1) 은 bFGF 무첨가 배지에서 배양한 (분화 유도 처리) hiPS 세포의 사진이다. (2) 는 bFGF 첨가 배지에서 배양한 hiPS 세포의 사진이다.

bFGF 무첨가 배지에서 배양함으로써 hiPS 를 배양했을 경우, iPS 세포는 신경 세포계의 세포로 분화 유도되는 것을 알 수 있다.

도 5(1) 로부터 분명한 바와 같이, bFGF 무첨가 (-bFGF) 배지에서 배양했을 경우, 배양 6 일째에서 세포의 형태가 돌기상 또는 섬유상으로 변화하고 있는 모습이 확인되었다 (콜로니의 가장자리가 삐죽삐죽하다).

그러나, 도 5(2) 로부터 분명한 바와 같이, bFGF 첨가 (+bFGF) 배지에서 배양했을 경우, bFGF 무첨가 배지에서 배양했을 경우와 같은 세포의 형태의 변화는 관찰되지 않았다.

이상으로부터, bFGF 무첨가 배지에서 배양했을 경우, hiPS 세포의 분화가 유도되는 것이 확인되었다.

실험예 1. FOXB2 단백질의 검출 1

1) 항인간 FOXB2 단백질 항체 고정화 ELISA 용 마이크로 플레이트의 조제

항인간 FOXB2 단백질 항체의 용액 (50 mM MOPS 완충액 (pH7.0)) 을 ELISA 용 마이크로 플레이트 (Nunk 사 제조) 의 각 웰에 분주 후 24 시간 가만히 정지시키고, 항인간 FOXB2 단백질 항체를 고정화시킨 마이크로 플레이트를 얻는다.

2) 퍼옥시다아제 표식 항 FOXB2 단백질 항체의 조제

항인간 FOXB2 단백질 항체를 통상적인 방법에 의해 퍼옥시다아제 표식한다.

3) 시료의 조제

분화 유도 후 3 일째의 hiPS 세포를 회수하고, 소니케이션에 의해 hiPS 세포를 파괴하여, 세포의 라이세이트를 얻는다. 얻어진 라이세이트를 완충액에 용해시켜 시료로 한다.

4) 측정

상기 3) 에서 조제한 시료를, 상기 1) 에서 조제한 항 FOXB2 단백질 항체 고정화 ELISA 용 마이크로 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 37 ℃ 에서 1 시간 정도 반응시킨다. 이어서 각 웰을 완충액으로 세정한다.

상기 2) 에서 조제한 퍼옥시다아제 표식 항 FOXB2 단백질 항체를 각각 각 웰에 분주하고, 37 ℃ 에서 1 시간 정도 반응시킨다. 각 웰을 완충액으로, 이어서 증류수로 세정하고, TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 용액 (와코우 순약 공업 (주) 제조) 을 각 웰에 50 ㎕ 씩 첨가하고, 25 ℃, 30 분간 반응시킨다. 그 후, 반응 정지액 (1 M 인산 용액) 을 각 웰에 50 ㎕ 씩 첨가하여 반응을 정지시킨다. 450 ㎚ 에 있어서의 흡광도를 Vmax (몰레큘러 디바이스사 제조) 를 사용하여 측정한다.

그 결과, FOXB2 단백질이 검출된 경우에는, 시료로서 사용한 hiPS 세포는 분화한 상태인 것으로 판정된다. 또는, 시료로서 사용한 hiPS 세포의 세포군에는, 분화한 상태의 세포가 함유되는 것으로 판정된다.

실험예 2. FOXB2 단백질의 검출 2

1) 시료의 조제

2) 퍼옥시다아제 표식 항 FOXB2 단백질 항체의 조제

3) 웨스턴 블로팅

상기 1) 에서 얻어진 시료를 SuperSep^TM (전기 영동용 겔, 와코우 순약 공업 (주), 5 - 20 ％ 의 그래디언트 겔) 에 어플라이하여, SDS-PAGE 전기 영동 (정전류 25 ㎃) 을 실시한다. 이어서, 영동 후의 획분을 세미드라이 블로팅법으로 PVDF 멤브레인에 전사한다.

PBS-T (Phosphate Buffered Saline with Tween^TM 20, pH7.4) 에 블록 에이스 (DS 파머 바이오메디칼 (주) 제조) 를 용해시켜 블로킹액으로 한다. 이 블로킹액에 상기 전사 후의 PVDF 멤브레인을 침지시키고, 1 시간 실온에서 블로킹 처리한 후, PVDF 멤브레인을 세정하고, 블로킹액에 침지시킨다.

이어서, 상기 2) 에서 얻어진 퍼옥시다아제 표식 항인간 FOXB2 단백질 항체를 블로킹액에 첨가하고 실온에서 1 시간 정도 침지시킨다. PVDF 멤브레인을 세정하고, ECL^TM Prime Western Blotting Detection Reagent (퍼옥시다아제의 화학 발광 기질, GE Healthcare 제조) 로 발광시켜, LAS4000 (후지 필름 (주) 제조) 을 사용하여, 노광 시간 10 초 동안 검출한다.

그 결과, FOXB2 단백질이 검출된 경우에는, 시료로서 사용한 hiPS 세포는 분화한 상태인 것으로 판정된다. 또는, 시료로서 사용한 hiPS 세포의 세포군에는, 분화한 상태의 세포를 함유하는 것으로 판정된다.

본 발명에 의하면, 간세포의 분화 상태를 분화의 초기 단계에서 판정할 수 있다. 또, 본 발명은, 간세포의 품질 관리나 분화 세포의 조제·단리 방법에 응용할 수 있다. 또한 본 발명은 배양 초기에서 분화된 세포를 판정할 수 있으므로, 세포의 조기 스크리닝이나 간세포의 품질 관리에 유용하고, 배양 기간의 단축, 배지대의 경비 삭감 등을 기대할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> WakoPure Chemical industries, ltd. <120> Method of Determining Cell Differentiation <130> 1993PCT <150> JP2014-167800 <151> 2014-08-20 <160> 60 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1299 <212> DNA <213> human FOXB2 <220> <221> CDS <222> (1)..(1299) <400> 1 atg ccg cgg ccg ggg aag agc tcg tac agc gac caa aaa ccg ccc tac 48 Met Pro Arg Pro Gly Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Gln Lys Pro Pro Tyr 1 5 10 15 tct tac atc tcg ctg acc gcc atg gca atc cag cac tcg gcc gag aag 96 Ser Tyr Ile Ser Leu Thr Ala Met Ala Ile Gln His Ser Ala Glu Lys 20 25 30 atg ctg ccg ctg agc gac atc tac aag ttc atc atg gag cgc ttc ccc 144 Met Leu Pro Leu Ser Asp Ile Tyr Lys Phe Ile Met Glu Arg Phe Pro 35 40 45 tac tac cgc gag cac aca cag cgc tgg cag aac agc ctg cgc cac aac 192 Tyr Tyr Arg Glu His Thr Gln Arg Trp Gln Asn Ser Leu Arg His Asn 50 55 60 ctc tcc ttc aac gac tgc ttc atc aag att ccg cgg agg ccc gac cag 240 Leu Ser Phe Asn Asp Cys Phe Ile Lys Ile Pro Arg Arg Pro Asp Gln 65 70 75 80 cct ggc 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cac ctc ccg tca cag ccc ccg cag caa ccg ccc cag cag tcg cag cct 624 His Leu Pro Ser Gln Pro Pro Gln Gln Pro Pro Gln Gln Ser Gln Pro 195 200 205 cag cag ccg tct cac ccc ggc aag atg cag gag gcg gcg gcc gtg gcg 672 Gln Gln Pro Ser His Pro Gly Lys Met Gln Glu Ala Ala Ala Val Ala 210 215 220 gcg gcg gcg gcg gcg gcc gcg gca gcc gcg gtg ggc agc gtg gga cgc 720 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Ser Val Gly Arg 225 230 235 240 ctg tct cag ttc cca ccc tac ggg ctg ggc tcg gcc gcc gcc gct gcc 768 Leu Ser Gln Phe Pro Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala 245 250 255 gcc gcg gcc gcg gcg tcc acg tca ggc ttc aag cac ccc ttt gcc att 816 Ala Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ser Gly Phe Lys His Pro Phe Ala Ile 260 265 270 gag aac att att ggc cgg gac tac aag ggc gtg ctg cag gct gga ggg 864 Glu Asn Ile Ile Gly Arg Asp Tyr Lys Gly Val Leu Gln Ala Gly Gly 275 280 285 ctg ccc ttg gcg tcc gtc atg cac cac ctg ggc tac ccc gtg ccc ggc 912 Leu Pro Leu Ala Ser Val Met His His Leu Gly Tyr Pro Val Pro Gly 290 295 300 cag ctt ggc aac gtc gtc agc tcc gtg tgg ccg cac gtt ggc gtc atg 960 Gln Leu Gly Asn Val Val Ser Ser Val Trp Pro His Val Gly Val Met 305 310 315 320 gat tcg gtg gcc gcc gcc gcg gcc gcc gca gcc gca gcc gga gtc cct 1008 Asp Ser Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro 325 330 335 gta ggc ccg gag tat ggg gcc ttc ggg gtc ccg gtc aag tcc ctg tgc 1056 Val Gly Pro Glu Tyr Gly Ala Phe Gly Val Pro Val Lys Ser Leu Cys 340 345 350 cac tcg gca agc cag agc ctg cct gcc atg ccg gtg ccc atc aag ccc 1104 His Ser Ala Ser Gln Ser Leu Pro Ala Met Pro Val Pro Ile Lys Pro 355 360 365 acg cct gcg ctg ccg ccc gtg tcc gcg ctg cag ccg ggg ctc act gtc 1152 Thr Pro Ala Leu Pro Pro Val Ser Ala Leu Gln Pro Gly Leu Thr Val 370 375 380 ccc gcg gct tcg cag cag cct ccg gcg cca tcc acc gtg tgc tcc gcg 1200 Pro Ala Ala Ser Gln Gln Pro Pro Ala Pro Ser Thr Val Cys Ser Ala 385 390 395 400 gcc gcg gcc tcg ccc gtt gcc tct ctg ctg gag ccc aca gcc cct acc 1248 Ala Ala Ala Ser Pro Val Ala Ser Leu Leu Glu Pro Thr Ala Pro Thr 405 410 415 tcg gcc gaa agc aag ggc ggc tcc ttg cac tcg gtg cta gtg cac tcc 1296 Ser Ala Glu Ser Lys Gly Gly Ser Leu His Ser Val Leu Val His Ser 420 425 430 tag 1299 <210> 2 <211> 432 <212> PRT <213> human FOXB2 <400> 2 Met Pro Arg Pro Gly Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Gln Lys Pro Pro Tyr 1 5 10 15 Ser Tyr Ile Ser Leu Thr Ala Met Ala Ile Gln His Ser Ala Glu Lys 20 25 30 Met Leu Pro Leu Ser Asp Ile Tyr Lys Phe Ile Met Glu Arg Phe Pro 35 40 45 Tyr Tyr Arg Glu His Thr Gln Arg Trp Gln Asn Ser Leu Arg His Asn 50 55 60 Leu Ser Phe Asn Asp Cys Phe Ile Lys Ile Pro Arg Arg Pro Asp Gln 65 70 75 80 Pro Gly Lys Gly Ser Phe Trp Ala Leu His Pro Asp Cys Gly Asp Met 85 90 95 Phe Glu Asn Gly Ser Phe Leu Arg Arg Arg Lys Arg Phe Lys Val Leu 100 105 110 Arg Ala Asp His Thr His Leu His Ala Gly Ser Thr Lys Ser Ala Pro 115 120 125 Gly Ala Gly Pro Gly Gly His Leu His Pro His His His His His Pro 130 135 140 His His His His His His His Ala Ala Ala His His His His His His 145 150 155 160 His Pro Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Met 165 170 175 Val His Tyr Phe His Gln Gln Pro Pro Thr Ala Pro Gln Pro Pro Pro 180 185 190 His Leu Pro Ser Gln Pro Pro Gln Gln Pro Pro Gln Gln Ser Gln Pro 195 200 205 Gln Gln Pro Ser His Pro Gly Lys Met Gln Glu Ala Ala Ala Val Ala 210 215 220 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Ser Val Gly Arg 225 230 235 240 Leu Ser Gln Phe Pro Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala 245 250 255 Ala Ala Ala Ala Ala Ser Thr Ser Gly Phe Lys His Pro Phe Ala Ile 260 265 270 Glu Asn Ile Ile Gly Arg Asp Tyr Lys Gly Val Leu Gln Ala Gly Gly 275 280 285 Leu Pro Leu Ala Ser Val Met His His Leu Gly Tyr Pro Val Pro Gly 290 295 300 Gln Leu Gly Asn Val Val Ser Ser Val Trp Pro His Val Gly Val Met 305 310 315 320 Asp Ser Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro 325 330 335 Val Gly Pro Glu Tyr Gly Ala Phe Gly Val Pro Val Lys Ser Leu Cys 340 345 350 His Ser Ala Ser Gln Ser Leu Pro Ala Met Pro Val Pro Ile Lys Pro 355 360 365 Thr Pro Ala Leu Pro Pro Val Ser Ala Leu Gln Pro Gly Leu Thr Val 370 375 380 Pro Ala Ala Ser Gln Gln Pro Pro Ala Pro Ser Thr Val Cys Ser Ala 385 390 395 400 Ala Ala Ala Ser Pro Val Ala Ser Leu Leu Glu Pro Thr Ala Pro Thr 405 410 415 Ser Ala Glu Ser Lys Gly Gly Ser Leu His Ser Val Leu Val His Ser 420 425 430 <210> 3 <211> 179 <212> DNA <213> Human FOXB2 <400> 3 ctactcttac atctcgctga ccgccatggc aatccagcac tcggccgaga agatgctgcc 60 gctgagcgac atctacaagt tcatcatgga gcgcttcccc tactaccgcg agcacacaca 120 gcgctggcag aacagcctgc gccacaacct ctccttcaac gactgcttca tcaagattc 179 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 4 cagaagctac ccttgccag 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 5 gttcttgaag ctaagctgca g 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 6 gttctggaac caggtcttca c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 7 gaccacacca tgaaggcatt c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 8 gtctacatgg caactgtgag g 21 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 9 ctactcttac atctcgctga ccg 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 10 gaatcttgat gaagcagtcg ttg 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 11 cttggagacc tctcagcctg ag 22 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 12 cttcaggagc ttggcaaatt g 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 13 cacctatgcc tgtgatttgt gg 22 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 14 cattgagtac acacagctgg gtg 23 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Ser Asp Ile Tyr Lys Phe Ile Met Glu 30 35 40 45 cgc ttc ccc tac tac cgc gag cac acg cag cgc tgg cag aac agc ctg 373 Arg Phe Pro Tyr Tyr Arg Glu His Thr Gln Arg Trp Gln Asn Ser Leu 50 55 60 cgc cac aac ctc tcc ttc aac gac tgt ttc atc aag atc cct cgg agg 421 Arg His Asn Leu Ser Phe Asn Asp Cys Phe Ile Lys Ile Pro Arg Arg 65 70 75 ccg gac caa ccc ggt aag ggc agc ttc tgg gcg cta cac cct gac tgc 469 Pro Asp Gln Pro Gly Lys Gly Ser Phe Trp Ala Leu His Pro Asp Cys 80 85 90 ggt gac atg ttc gag aac ggc agc ttc ctg cgg cgc cgc aag cgc ttc 517 Gly Asp Met Phe Glu Asn Gly Ser Phe Leu Arg Arg Arg Lys Arg Phe 95 100 105 aag gtg cta cgc gca gac cac gct cac cta cac tca gga agc agc aag 565 Lys Val Leu Arg Ala Asp His Ala His Leu His Ser Gly Ser Ser Lys 110 115 120 125 ggc gcg ccc ggc acg ggg cca gga ggt cac ctg cat ccc cac cat ccc 613 Gly Ala Pro Gly Thr Gly Pro Gly Gly His Leu His Pro His His Pro 130 135 140 cac cac gca cac cac cac cac cac cat cac cac cac gcc gca cac cat 661 His His Ala His His His His His His His His His Ala Ala His His 145 150 155 cac cac cat cac cac ccg ccg cag ccg ccc ccg ccg ccg ccg ccg cac 709 His His His His His Pro Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His 160 165 170 atg gtg ccc tat ttc cac cag cag ccg gct ccg gct ccg cag cct cca 757 Met Val Pro Tyr Phe His Gln Gln Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Pro 175 180 185 cac ctc ccg tcg cag ccc gcg cag cag cca cag ccg cag tcg cag cct 805 His Leu Pro Ser Gln Pro Ala Gln Gln Pro Gln Pro Gln Ser Gln Pro 190 195 200 205 ccg cag acg tcc cat ccc ggc aag atg cag gag gcg gcg gcc gtg gcg 853 Pro Gln Thr Ser His Pro Gly Lys Met Gln Glu Ala Ala Ala Val Ala 210 215 220 gcg gcc gca gca gcg gcg gcg gcc gca gcg gtg ggc agc gtg ggg cgt 901 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Ser Val Gly Arg 225 230 235 ctg tct cag ttc cca ccc tac ggg ctg ggc tcg gcc gcc gcc gcc gcc 949 Leu Ser Gln Phe Pro Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala 240 245 250 gct gca gcc gcc gcg tcc acc aca ggc ttc aaa cat ccg ttc gcc ata 997 Ala Ala Ala Ala Ala Ser Thr Thr Gly Phe Lys His Pro Phe Ala Ile 255 260 265 gag aac atc atc ggg cgg gac tac aag ggc gtg ctg cag gct gga ggg 1045 Glu Asn Ile Ile Gly Arg Asp Tyr Lys Gly Val Leu Gln Ala Gly Gly 270 275 280 285 ttg cct ttg gcg tcg gtc atg cac cac ttg ggc tac ccc gtg ccg ggc 1093 Leu Pro Leu Ala Ser Val Met His His Leu Gly Tyr Pro Val Pro Gly 290 295 300 cag ctc agc aat gtt gtc ggc tcc gtg tgg cct cat gtt ggc gtg atg 1141 Gln Leu Ser Asn Val Val Gly Ser Val Trp Pro His Val Gly Val Met 305 310 315 gat tcg gta gcc gcg gct gcc gct gct gcc gcc gca gct ggg gtc ccg 1189 Asp Ser Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro 320 325 330 gta ggc ccg gag tat ggg gca ttc ggg gtg cca gtc aag gct ctg tgc 1237 Val Gly Pro Glu Tyr Gly Ala Phe Gly Val Pro Val Lys Ala Leu Cys 335 340 345 cac tcg gca aac cag agc ctg cca gct gta ccg gtg ccc atc aag ccc 1285 His Ser Ala Asn Gln Ser Leu Pro Ala Val Pro Val Pro Ile Lys Pro 350 355 360 365 acg cct gcg cta cca ccc gtg acc acg ctg ccg ccg gcg ttg tct gtc 1333 Thr Pro Ala Leu Pro Pro Val Thr Thr Leu Pro Pro Ala Leu Ser Val 370 375 380 ccc acg gcg tcg cag cag ctg cct gct ccc tcc acc gtg tgc gcg gcc 1381 Pro Thr Ala Ser Gln Gln Leu Pro Ala Pro Ser Thr Val Cys Ala Ala 385 390 395 gcc gcc tca ccc aca gcc cct ctc ttg gag ccc acc gca gcc ggc agg 1429 Ala Ala Ser Pro Thr Ala Pro Leu Leu Glu Pro Thr Ala Ala Gly Arg 400 405 410 gct gac agc aag ggg agc tcc cta cac tcg gtg ttg gtg cat tct 1474 Ala Asp Ser Lys Gly Ser Ser Leu His Ser Val Leu Val His Ser 415 420 425 taggggaccc cgcgaccggt gagaaggcgc ctgtcgagag a 1515 <210> 35 <211> 428 <212> PRT <213> Mouse FOXB2 <400> 35 Met Pro Arg Pro Gly Lys Ser Ser Tyr Ser Asp Gln Lys Pro Pro Tyr 1 5 10 15 Ser Tyr Ile Ser Leu Thr Ala Met Ala Ile Gln His Ser Ala Glu Lys 20 25 30 Met Leu Pro Leu Ser Asp Ile Tyr Lys Phe Ile Met Glu Arg Phe Pro 35 40 45 Tyr Tyr Arg Glu His Thr Gln Arg Trp Gln Asn Ser Leu Arg His Asn 50 55 60 Leu Ser Phe Asn Asp Cys Phe Ile Lys Ile Pro Arg Arg Pro Asp Gln 65 70 75 80 Pro Gly Lys Gly Ser Phe Trp Ala Leu His Pro Asp Cys Gly Asp Met 85 90 95 Phe Glu Asn Gly Ser Phe Leu Arg Arg Arg Lys Arg Phe Lys Val Leu 100 105 110 Arg Ala Asp His Ala His Leu His Ser Gly Ser Ser Lys Gly Ala Pro 115 120 125 Gly Thr Gly Pro Gly Gly His Leu His Pro His His Pro His His Ala 130 135 140 His His His His His His His His His Ala Ala His His His His His 145 150 155 160 His His Pro Pro Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Met Val Pro 165 170 175 Tyr Phe His Gln Gln Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Pro His Leu Pro 180 185 190 Ser Gln Pro Ala Gln Gln Pro Gln Pro Gln Ser Gln Pro Pro Gln Thr 195 200 205 Ser His Pro Gly Lys Met Gln Glu Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala 210 215 220 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Gly Ser Val Gly Arg Leu Ser Gln 225 230 235 240 Phe Pro Pro Tyr Gly Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 245 250 255 Ala Ala Ser Thr Thr Gly Phe Lys His Pro Phe Ala Ile Glu Asn Ile 260 265 270 Ile Gly Arg Asp Tyr Lys Gly Val Leu Gln Ala Gly Gly Leu Pro Leu 275 280 285 Ala Ser Val Met His His Leu Gly Tyr Pro Val Pro Gly Gln Leu Ser 290 295 300 Asn Val Val Gly Ser Val Trp Pro His Val Gly Val Met Asp Ser Val 305 310 315 320 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Val Pro Val Gly Pro 325 330 335 Glu Tyr Gly Ala Phe Gly Val Pro Val Lys Ala Leu Cys His Ser Ala 340 345 350 Asn Gln Ser Leu Pro Ala Val Pro Val Pro Ile Lys Pro Thr Pro Ala 355 360 365 Leu Pro Pro Val Thr Thr Leu Pro Pro Ala Leu Ser Val Pro Thr Ala 370 375 380 Ser Gln Gln Leu Pro Ala Pro Ser Thr Val Cys Ala Ala Ala Ala Ser 385 390 395 400 Pro Thr Ala Pro Leu Leu Glu Pro Thr Ala Ala Gly Arg Ala Asp Ser 405 410 415 Lys Gly Ser Ser Leu His Ser Val Leu Val His Ser 420 425 <210> 36 <211> 169 <212> DNA <213> Mouse FOXB2 <400> 36 ctttccaaga ggcgttaagg cccactgtgg gccggacgga ggtggaagag cctgggaaga 60 tgccacggcc agggaagagt tcctacagcg accaaaagcc gccctactct tacatctcac 120 tgaccgccat ggccatccag cattcggctg agaagatgct gcctctgag 169 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 37 catgatgaac ttgtagatgt c 21 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 38 catgttctta aggctgagct gc 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 39 ctgaatcaga ccattgctag tc 22 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 40 caacgatatc aacctgcatg g 21 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 41 gaactggtgg cagagtcatt ttc 23 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 42 gattcgagac gatcttagtc aatg 24 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 43 gacgcatagg tattatagct g 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 44 cttgatgtca tcatacttgg c 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 45 ctttccaaga ggcgttaagg c 21 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 46 ctcagaggca gcatcttctc ag 22 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 47 gaacctggct aagcttccaa g 21 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 48 gcttggcaaa ctgttctagc tc 22 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 49 gcattagaca tttaactctt ctttc 25 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 50 cttgaagagg caggtcttca g 21 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 51 gaatcggacc atgtatagat ctg 23 <210> 52 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 52 catttgattg ccatgtttat ctcg 24 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Claims

간세포의 FOXB2 유전자의 발현을 검출하고, 그 결과에 기초하여 판정을 실시하는 세포의 분화 상태의 판정 방법.
제 1 항에 있어서,
FOXB2 유전자의 발현의 검출을 FOXB2 mRNA 또는 FOXB2 단백질을 검출함으로써 실시하는 방법.
제 2 항에 있어서,
FOXB2 mRNA 가 검출되었을 경우에, 그 세포가 분화된 상태인 것으로 판정하는 방법.
제 2 항에 있어서,
FOXB2 단백질이 검출되었을 경우에, 그 세포가 분화된 상태인 것으로 판정하는 방법.
제 2 항에 있어서,
FOXB2 mRNA 가, 배열 번호 1 또는 배열 번호 34 로 나타내는 염기 배열을 갖거나, 또는 배열 번호 1 또는 배열 번호 34 로 나타내는 염기 배열과 70 ％ 이상의 상동성을 갖는 방법.
제 2 항에 있어서,
FOXB2 mRNA 가, 배열 번호 2 혹은 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열 또는 그 1 개 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 배열을 코드하는 방법.
제 2 항에 있어서,
FOXB2 단백질이 배열 번호 2 혹은 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열 또는 그 1 개 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 삽입, 치환, 혹은 부가된 아미노산 배열을 갖는 방법.
제 2 항에 있어서,
FOXB2 mRNA 의 검출을 RT-PCT 법에 의해 실시하는 방법.
제 1 항에 있어서,
간세포가 iPS 세포 또는 ES 세포인 방법.
FOXB2 유전자 유래의 mRNA 또는 단백질에서 선택되는 분화 마커.
제 10 항에 있어서,
FOXB2 유전자 유래의 mRNA 가, 배열 번호 1 또는 배열 번호 34 로 나타내는 염기 배열을 갖거나, 또는 배열 번호 1 또는 배열 번호 34 로 나타내는 염기 배열과 70 ％ 이상의 상동성을 갖는 분화 마커.
제 10 항에 있어서,
FOXB2 유전자 유래의 mRNA 가, 배열 번호 2 혹은 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열, 또는 그 1 개 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 배열을 코드하는 것인 분화 마커.
제 10 항에 있어서,
FOXB2 유전자 유래의 단백질이, 배열 번호 2 혹은 배열 번호 35 로 나타내는 아미노산 배열, 또는 그 1 개 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가된 아미노산 배열을 갖는 분화 마커.
제 10 항에 있어서,
간세포의 분화 마커인 분화 마커.
제 14 항에 있어서,
간세포가 iPS 세포 또는 ES 세포인 분화 마커.