KR20170044666A - 혈구 응집 억제 분석(hai)의 자동화 이미징 및 분석 - Google Patents

혈구 응집 억제 분석(hai)의 자동화 이미징 및 분석 Download PDF

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Abstract

시스템 및 방법은 응집 상태의 고 처리량 판정을 제공한다. 상기 시스템은 회전 테이블 및 복수의 플레이트 틸팅 스테이션들을 포함한다. 상기 시스템은 또한 기울어진 및/또는 기울어지지 않은 형상으로 전체 플레이트 배열을 이미지화하도록 배치된 하나 이상의 광로를 포함한다. 시스템은 바람직하게 테스트 웰의 배열의 이미지를 분석하고 이미지 분석에 기초하여 각 웰의 응집 상태를 결정하는 이미지 분석 소프트웨어를 포함한다.

Description

혈구 응집 억제 분석(HAI)의 자동화 이미징 및 분석{AUTOMATED IMAGING AND ANALYSIS OF THE HEMAGGLUTINATION INHIBITION ASSAY(HAI)}
본 발명은 혈구 응집 억제 분석의 자동화 이미징 및 분석에 관한 것이다.
혈구 응집 억제 분석(Hemagglutination Inhibition Assay(HAI))은 70년 전 혈청 내 인플루엔자 특이 항체 수치를 측정하는 수단으로 개발되었다. HAI는 이후 풍진, 홍역, 유행성 이하선염, 파라 인플루엔자, 아데노 바이러스, 폴리오 바이러스 및 아르보 바이러스와 같은 수 가지 혈구 응집소 포함 바이러스에 적용되었다. 현재 HAI는 인체 및 동물에서 인플루엔자 항체의 적합판단 소위 골드 표준 혈청 검사로 알려져 있으며 인플루엔자 감시 및 백신 검사에 널리 사용된다.
독감 HAI는 독감 백신 조치의 전부는 아니지만 많은 것을 지원하는 중추적 혈청 검사이다. 현재 이 고전적 분석은 수동으로 수행되며 모든 규제 기대를 충족시킨다. 테스트 요구가 증가함에 따라 인플루엔자 또는 기타 혈구 응집소(hemagglutinin)를 함유한 바이러스에 관련하여 사용될 수 있는 독감 HAI 시스템 및 방법의 효율 및 처리량을 개선할 필요가 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 플레이트가 평평한 경우와 플레이트가 기울어진 경우의 HAI RBC(red blood cell) 패턴 간의 차이를 도시한다.
도 2a 내지 2c는 본 발명의 실시예에 따른 다양한 기울기의 각도에서 이미저(imager)를 도시한다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 이미저를 도시한다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 도 3에 도시된 이미저의 광학 부분의 추가 상세부를 도시한다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 다른 이미저를 도시한다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 96-웰 플레이트에 대해 위에서 아래로의 사다리꼴 효과를 갖는 에지 주변의 소형 렌즈 왜곡 및 음영을 도시한다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 텔레센트릭 렌즈가 플레이트 이미지의 왜곡 및 음영을 감소시키는 방법을 도시한다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 자동화된 HAI(HIVE) 자동화 이미저를 도시한다.
도 9a는 본 발명의 실시예에 따른 HIVE 자동화 이미저의 다양한 내부 컴포넌트를 도시한다.
도 9b는 본 발명의 실시예에 따른 HIVE 듀얼 모드 자동화 이미저를 도시한다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 이미지 분석 알고리즘과 관련된 흐름도를 도시한다.
도 11은 본 발명의 실시예에 따른 자동화된 HAI 이미저와 관련된 프로세스를 설명하는 흐름도이다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른 L * a * b * 컬러 공간 맵이다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따른 이미지 프로세싱 알고리즘 중 사용되는 RBC 제어 웰이다.
도 14는 본 발명의 실시예에 따른 최적 시점 알고리즘을 도시하는 흐름도이다.
도 15는 본 발명의 실시예에 따른 평균 표준 편차 대 이미지 획득 시간을 나타내는 차트를 도시한다.
도 16a 내지 도 16c는 본 발명의 실시예에 따른 상이한 응집도에 대한 이미지 획득 시간의 함수로서 표준화된 파라미터를 나타내는 차트이다.
도 17은 본 발명의 실시예에 따른 단일 플레이트에 대한 최적 판독 시간 변화를 도시하는 차트이다.
도 18은 본 발명의 실시예에 따른 단일 플레이트에 대한 표준 편차 변화를 도시하는 차트이다.
도 19a 및 도 19b는 본 발명의 실시예에 따른 시간 및 응집 상태의 함수로서의 파라미터 편차를 도시하는 차트이다.
도 20은 본 발명의 실시예에 따른 자동 웰 마스크 알고리즘을 나타내는 흐름도이다.
도 21은 본 발명의 실시예에 따른 응집 상태 분류 알고리즘을 나타내는 흐름도이다.
도 22는 본 발명의 실시예에 따른 풋 패턴에 대한 에지 검출을 도시한다.
도 23은 본 발명의 실시예에 따른 GUI에 대한 이미지 획득 탭을 도시한다.
도 24는 본 발명의 실시예에 따른 6개의 플레이트의 자동화 이미징 각각에 관한 시기선도이다.
도 25는 본 발명의 실시예에 따른 36개의 플레이트의 자동화 이미징에 관한 시기선도이다.
도 26은 본 발명의 실시예에 따른 GUI에 대한 이미지 분석 탭의 추가 도면이다.
도 27은 본 발명의 실시예에 따른 GUI에 대한 데이터 분석 탭을 도시한다.
도 28은 본 발명의 실시예에 따른 이미저의 일치 결과를 수동 테스트와 비교하여 나타낸 표이다.
도 29는 본 발명의 실시예에 따른 이미저의 추가 일치 결과를 수동 테스트와 비교하여 나타낸 표이다.
도 30은 본 발명의 HIVE T670 이미저 실시예에 대한 일치 결과를 수동 테스트와 비교하여 나타내는 표이다.
도 31은 본 발명의 HIVE T670 이미저 실시예에 대한 추가 일치 결과를 수동 테스트와 비교하여 나타내는 표이다.
도 32는 본 발명의 실시예에 따른 HAI 데이터에 적합한 곡선을 도시하는 차트이다.
도 33은 본 발명의 실시예에 따른 통상의 역가값과 IC50 값을 비교하는 차트이다.
도 34는 종래의 이미저 시스템을 도시한다.
도면 전체에 걸쳐, 동일한 참조 번호는 동일한 요소, 특징 및 구조를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
HAI는 일반적으로 96-웰 U-또는 V-하부 마이크로-역가 플레이트에서 수행되는 3일 분석이다. 1일째, 비특이적 억제제를 뉴라미니다아제 용액으로 처리 및 약 18시간 동안 수조에서 인큐베이팅함으로써 시험 항원에서 제거한다. 2일째, 혈청 샘플은 열 활성화되고 응집소는 적혈구(RBC)를 사용하여 혈청으로부터 흡수된다. 2°C 내지 8°C에서 2시간 인큐베이션 단계 후 원심 분리를 통해 적혈구를 제거한다. 3일째, HAI 분석에 사용하기 위한 4HAU/25μL의 목표 값을 확보하기 위해 해당 인플루엔자 항원의 적정이 수행된다. 일단 항원 역가가 확인되면, 처리된 혈청 샘플을 연속 희석하고 항원과 결합시킨다. 최적의 판독 시간을 위한 척도로서 나중에 사용하기 위해 이 시점에서 혈청 전용, 즉 항원이 존재하지 않는, 제어 웰 또한 확립된다. 바이러스 변형에 따라 37°C (± 2 °C) 또는 주변 온도에서 1시간 동안 인큐베이션 한 후 RBC 현탁액이 샘플군 및 대조군에 첨가된다.
RBC 현탁액을 첨가한 후, 샘플군은 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션 된다. 인큐베이션 후 샘플 플레이트를 60 °에서 70 °로 천천히 기울여서 RBC 제어 웰 스트림이 "풋" 패턴을 생성하면 각 샘플 희석액에 대해 응집 상태가 기록된다. 음성 결과는 RBC 대조군과 동일한 비율로 흐르고 즉, 완전한 스트리밍은 응집을 나타내지 않고 명확한 상청액을 갖는다. 이 상태는 도 1의 우측 상단 사분면(100)의 이미지에 의해 도시된다. 양성 결과는 혈구 응집 때문에 RBC 대조군과 동일한 비율로 흐르지 않는다. 이 상태는 도 1의 우측 하단 사분면(102)에 위치한 이미지에 의해 도시된다. HAI 역가는 혈구 응집의 완전한 억제를 보이는 가장 높은 혈청 희석의 역가로 지정된다.
종래의 HAI 기술은 수동으로, 즉 적정 후에 플레이트를 관찰하고 플레이트의 각 웰의 결과를 결정하도록 특별히 훈련된 인간 실험실 기술자 또는 다른 인원에 의해 수행된다. 고전적인 HAI를 수동으로 수행하는 주된 단점 중 하나는 시각적 판독 값의 주관성이다. RBC 패턴을 해석하는 방법과 시기에 따라 분석가마다 역가 할당이 다를 수 있다. 스트리밍 RBC의 빠른 운동은 분석가가 최적의 시간에 플레이트의 모든 샘플을 읽는 것을 어렵게 한다. 게다가 분석가 서로 간의 변동 및 편향은 일관성 없는 결과와 샘플 재검사 필요성을 초래할 수 있다.
또한, HAI 플레이트는 전형적으로 현상 중에 영상화되지 않고 판독 후에 폐기된다. 역가값은 수동으로 기록되며 분석 과정에서 원시 데이터(RBC 패턴)가 파괴되고, 이에 따라 다른 분석가가 데이터 분석 후 결과를 검토할 가능성이 없어진다. 표준, 수동 판독 HAI 기술은 또한 할당된 시간 내에 많은 수의 플레이트를 처리하고 플레이트를 읽을 시기를 추적해야하는 고 처리량 분석에는 적합하지 않다. 예를 들어, 36개의 96-웰 HAI 플레이트의 전형적인 작동은 한시간 안에 단일 분석가에 의해 평가되어야 한다. 플레이트는 일반적으로 한 번에 3개가 기울여지고 시각적으로 모니터링되며 스톱워치도 사용된다. 일단 최적 판독 시간에 도달하면, 역가가 결정되고 기록되고, 플레이트는 폐기되고 분석가는 다음 3개의 플레이트로 이동한다. HAI 테스트의 증가된 양이 요구됨에 따라,이 상황은 문제가 되었다.
자동화된 HAI 이미저를 제공하려는 알려진 시도가 적어도 한 번 있었지만 이 시스템은 수동 테스트와 관련된 적어도 몇몇의 문제가 되는 사안에 의해 어려움을 겪고 있다. 도 34에 따른 이 알려진 시스템은 이스라엘의 Kfar Saba의 SciRobotics에서 제공하는 FluHemaTM 이미저 시스템이다. FluHemaTM 시스템은 한 번에 하나의 HAI 플레이트를 하향식으로 전개 및 이미지화한 다음 이미지 분석을 수행하여 양성 및 음성 웰을 식별한다. 이 시스템은 Tecan Freedom EVO® 실험 자동화 플랫폼과 함께 사용하도록 설계되었다. 결과적으로 FluHemaTM 시스템의 처리량은 현재의 요구 사항을 해결하기에는 여전히 만족스럽지 않다. 또한, FluHemaTM 에서 사용되는 고 왜곡 비 텔레센트릭 이미징 광학으로 인해 시스템의 효용성 또한 이상적이지 않다.
교시된 내용 전부가 본원의 참고로서 인용된 미국 특허 제 8,962,012 호는 이전에 공지된 것보다 상당히 더 민감한 버전의 HAI 분석법을 개시하고 있다. '705 출원에 개시된 HAI 분석은 용액이 아닌 특별히 옵소나이즈된 플레이트(opsonized pates) 및 ELISA 플레이트의 활성화된 표면에서의 응집을 관찰하는 것에 기초한다. 특히, '705 출원에 따르면, 표면-보조 혈구 응집/혈구 응집 억제 작용 분석, 즉 "SA-HAI"로 지칭되는 방법이 개시되어있다. SA-HAI는 바이러스 및 바이러스 특이적 항체 및 혈청의 기능적 특성 규명을 위한 것이다. 사용된 바이러스 및 적혈구의 유형에 따라 다양한 인플루엔자 바이러스에 대한 SA-HAI 분석의 민감도는 전통적인 HA 분석보다 7 ~ 200배 더 높은 것으로 밝혀졌으며 인플루엔자 특이적 항체에 대한 SA-HAI 분석의 민감도는 전통적인 HAI보다 7 ~ 50배 더 높았다. 비록 한 번에 하나의 웰만 이미지화 되더라도, SA-HAI는 일반적으로 이미징 기술을 사용하여 평가된다.
따라서, 종래의 방법론에 비해 증가된 처리량을 가지며 더욱 일관되고 신뢰성있는 결과를 제공하는 보다 견고한 HAI 테스트에 대한 방법론의 필요성이 있다.
수동 HAI 테스트 시스템 및 제한된 이용 가능한 자동화 시스템과 관련하여 전술한 문제점 및 가능하게는 다른 문제점 또한 해결하기 위해, 본 발명의 실시예는 고유한 하드웨어 및 소프트웨어 컴포넌트를 포함하는 HAI 테스트를 위한 이미징 솔루션을 제공한다. 본 발명의 특정 실시예는 한번에 복수의 플레이트를 이미지하고, 선택적으로 상향식이고, 저 왜곡의 텔레센트릭 이미징 광학을 사용한다.
본 명세서에 개시된 HAI 이미징 솔루션의 예시적인 실시예는 컴퓨터 비전 및 이미지 프로세싱을 사용하여 분석 판독을 자동화하고, 분석 대상 또는 RBC종과는 무관하게 임의의 샘플에 대해 역가 값을 자동으로 할당함으로써 분석가의 주관을 제거하는 독립형 시스템을 포함한다. 본 발명의 특정 실시예는 인플루엔자 및 풍진에서 천연두 및 뎅기 출혈열에 이르기까지 광범위한 인간 및 동물 질병을 유발하는 아데노 바이러스, 엔테로 바이러스, 레오 바이러스, 뮤소 바이러스, 폭스 바이러스 및 플라비 바이러스를 포함하는 다수의 상이한 병원성 바이러스와 함께 사용하도록 적합화될 수 있다. 유사하게, 본 발명의 실시예는 다양한 종의 적혈구와 함께 사용하도록 적합화될 수 있다. 예를 들어, WHO 권고에 따라 칠면조, 닭 및 말의 RBC는 이미징을 위해 기울어진 v-바닥 플레이트에서 검사될 수 있으며 기니 피그 및 사람의 O형 RBC는 u-바닥 플레이트에서 검사되고 평평할동안 이미지화될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 실시예와 일치하는 시스템은 수동 분석을 초과하는 처리량 능력을 갖는 포스트 - 분석으로 평가될 수 있는 미가공 데이터로서 작용하는 HAI 플레이트 이미지의 아카이브를 생성한다.
전술한 바와 같이, 본 명세서에 개시된 본 발명의 실시예는 하드웨어 및 소프트웨어 구성 요소 모두를 포함한다. 다음은 이러한 각 개별 구성 요소의 예에 대한 오버뷰를 제공한다.
다양한 실시예는 몇몇 상이한 이미저 및 시스템 구성을 포함한다. 이들 실시예들 중 하나 또는 그 이상에 따른 상이한 이미저는 초기에 개념 증명과 나중에 논의될 이미지 프로세싱 알고리즘을 튜닝하기 위한 초기 데이터를 획득하기 위해 개발되는 프로토타입으로 본 명세서에서 언급된다. 다양한 이미저에 중점을 둔 핵심 분야 중 일부는 광학 트레인 및 플레이트 핸들링 시스템을 포함하며 이보다 중요한 일반 특징 중 하나는 완전 자동화된 이미저이다. 본 발명의 바람직한 실시예와 일치하는 자동화 이미저의 일반적인, 그러나 제한되지 않는, 시스템 요구 사항은 (1) 시간당 최대 100 플레이트의 처리; (2) 분석 판을 70 °각도로 기울임; (3) 표준 플레이트 스태커와 통합; (4) 실제 운동 분석을 위한 풀 플레이트 이미징; (5) 즉각적인 분석 및 역가 결정을 위한 실시간 이미지 프로세싱; (6) 작은 설치 공간, 즉 이미저는 표준 실험 벤치에 적합하다.
다양한 실시예들에 따라 몇몇 프로토타입 이미저는 개발되었다. 이 프로토타입 중 일부는 아래에 설명되어있다.
도 2a 내지 도 2c에 도시된 프로토타입 1 이미저는 SA-HAI에 대해 이전에 개발된 이미저와 유사하지만 여러 중요한 변경이 이루어졌다. 특히, 이 이미저는 포커싱을 위해 Z 스테이지에 부착된 1.3 메가픽셀 카메라와 관련하여 플레이트 위치 결정을 위한 X-Y 스테이지를 구비한다. 또한 0 °에서 70 °까지 자동 기울이기를 허용하기 위해 이미저에 회전 스테이지가 추가되었다. 도 2a는 이미저가 0 °기울어진 것을 도시하고, 도 2b는 이미저가 45 °기울어진 것을 도시하고, 도 2c는 이미저가 70 °기울어진 것을 도시한다. 이 이미저는 또한 바람직하게는 자동화 라인에 통합되어있고 로봇 암으로 접근이 가능하다.
프로토타입 1 이미저에는 HAI 플레이트를 이미징 할 때 두 가지 문제가 있었다. 첫째로, 카메라는 단일 웰 이미징만을 수행할 수 있었고, 전체 96-웰 플레이트를 이미지화하는데 약 1.5분이 걸렸다. 빠른 RBC 패턴 현상 역학으로 인해, 이 상대적으로 느린 이미징은 이미지에서 역가 결정에 이상적인 것으로 간주되지 않았다. 둘째, HAI 플레이트는 이미지 분석을 복잡하게 하는 플레이트 바닥에서의 반사로 눈부심이 크게 발생하는 에피 조명(epi-illumination) 구성으로 조명되었다.
도 3 및 도 4에서 볼 수 있듯이, 프로토타입 2 이미저는 이미징 옵틱을 개선하고 전체 플레이트 이미징을 구현함으로써 프로토타입 1의 단점을 개선한다. 프로토타입 2 이미저는 왜곡을 최소화하면서 단일 스냅 샷에서 전체 플레이트를 이미지화하기 위해 고 F-값 렌즈를 사용한다. 카메라는 이미지 프로세싱을 위한 더 높은 해상도를 제공하기 위해 최소 5메가픽셀 CMOS센서이다. 플레이트는 반사를 피하기 위해 에피 조명보다는 트랜스-조명 구성에서 LED 백라이트를 통해 조명된다. 이미저는 플레이트를 슬라이드 어셈블리에 잠그고 70 °에서 이미징 평면으로 어셈블리를 회전함으로써 수동으로 로드된다. 역학 이미징은 맞춤 이미지 수집 소프트웨어를 실행하는 PC에서 동시에 유발된다.
도 3에 도시된 바와 같이, 프로토타입 2 이미저(300)는 이미징 어셈블리(302) 및 슬라이드 어셈블리(303)가 장착되는 프레임(301)을 구비한다. 슬라이드 어셈블리(303)는 96 웰 플레이트를 홀딩하기 위한 플레이트 홀더(304)를 포함한다. 이미저(300)는 자기 잠금장치(305) 및 백 라이트(306)를 포함한다. 온/오프 스위치(307)는 이미저(300)의 전원을 켜고 끄기 위해 제공된다. 이미저는 백 라이트(306)에 대한 슬라이드 위치를 유지하는 어셈블리 가이드(308)를 포함한다. 이미저(300)는 또한 이미징 어셈블리(302)의 각도를 조정하는 각도 조절기구(309)를 포함한다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 이미저(300) 이미징 어셈블리(302)는 고해상도 이미징 CCD(310), 16mm HR 렌즈(311) 및 반사 거울(312)을 구비한다. 광로(optical path)를 위한 기울기 조정부(313)도 제공된다. 이미징 어셈블리(302)는 플레이트 미디어와 관련된 음영 및 렌즈 효과를 감소시키기 위해 가변 축 이미징을 제공한다.
도 5에 도시된 프로토타입 3(500)에 대하여, 이미지의 품질을 향상시키기 위해 프로토타입 2의 이미징 옵틱을 대형 텔레센트릭 렌즈 및 5메가픽셀 CCD 센서로 대체하였다. 예를 들어, 도 6은 모서리 주위의 컴팩트 렌즈 왜곡 및 그림자를 도시하며, 사다리꼴 효과를 위에서 아래로 초래한다. 도 7에서, 텔레센트릭 렌즈의 추가는 왜곡 및 음영을 감소시키고 플레이트를 가로 질러 비율이 유지되는 것을 볼 수 있다. HAI 데이터는 서로 다른 인플루엔자 유형 및 하위 유형을 다루는 4가지 인플루엔자 항원에 대한 수동 및 자동 판독 방법/알고리즘을 사용하여 생성되었으며 결과는 일치를 보여주었다.
각각의 종래의 프로토타입을 기초로 한 바람직한 실시예는 HIVE T670 또는 단순히 HIVE이다. "HIVE"는 High-Throughput Imaging and Visualization Equipment를 나타내고 "T670"은 70도에서 6개의 플레이트를 동시에 기울일 수 있는 기능을 나타낸다. 도 8에서, HIVE(800)는 HAI 플레이트의 완전 자동, 고처리 동적 이미징이 가능한 장비이다. HIVE는 고해상도, 저 왜곡의 텔레센트릭 이미징과 원하는 각도로 기울이는 것을 포함하는 완전 자동화된 플레이트 핸들링을 결합한다. RBC 현상 및 이미징 형성은 실질적으로 0 ° 및/또는 70 °에 가까운 기울기 각도로 수행되는 것이 바람직하다. 또한, HIVE는 로봇 팔, 스태커 및 크레인과 같은 다양한 유형의 산업 표준 자동 플레이트 핸들러와 호환된다.
다음으로, 시스템 하드웨어의 광학이 논의될 것이다. 보다 구체적으로, 도 9a에서 볼 수 있듯이, HIVE 이미저(800)는 최소 시차 오차 및 전체 플레이트를 포함하는 충분한 시야를 갖는 저 왜곡 이미지를 제공하는 텔레센트릭 렌즈(802)에 부착된 바람직하게는 5 또는 11메가픽셀 해상도인 고해상도 CCD 카메라(801)를 사용하여 HAI 플레이트를 이미지화한다. 하나 또는 그 이상의 실시예에 따르면 플레이트는 플레이트가 예를 들어 70 °로 기울어진 상태로 하부로부터 이미징되며, 고도로 균일한 LED 백 라이트(803)에 의해 트랜스-조명된다. 조정 가능한 회전 거울(804)은 광로를 접음으로써 전체 풋 프린트를 감소시키기 위해 렌즈와 HAI 플레이트 사이에 위치된다.
플레이트 핸들링과 관련하여, HIVE는 로드/언로드 위치로부터 이미징 위치 및 후방으로 플레이트를 순환시키는 전동 회전 캐로셀(808)에 장착된 틸팅 플레이트 홀더(805)를 갖는 모터(809)에 의해 제어되는 6개의 개별적으로 어드레스 가능한 회전 스테이지(806)를 갖는다. 슬립 링(807)은 회전 캐로셀(808)과 하이브의 정적 베이스 사이의 전기적 연결을 제공한다. 도 9a에 도시된 실시예에 따르면, HIVE (800)는 커스텀 플레이트 홀더(805) 위에 장착된 고해상도, 예를 들어 5메가픽셀, CCD 카메라(801)를 포함하고, HIVE는 텔레센트릭렌즈(802)를 갖추고 있다. 모든 동작 및 카메라 동작은 나중에 자세히 설명될 그래픽 유저 인터페이스(graphic user interface), 즉 GUI의 이미지 수집 소프트웨어 구성 요소를 통해 제어된다. HIVE는 최대 6개의 플레이트를 동시에 처리하며 자동화된 이미저의 처리량은 시간당 약 100개의 플레이트 또는 예를 들어 BioTek BioStackTM NEO 마이크로 플레이트 핸들러에 결합되고 약 120초의 전형적 플레이트의 현상 시간 및 대략 30초의 이미징 윈도우를 가정했을 때 단일 무인 실행에서 50개의 플레이트이다.
도 9b에서, HIVE 듀얼 모드 이미저(900)는 기울기 없이(즉, 실질적으로 0 °에서) 이미징 플레이트를 위한 제 2 광학 트레인(901)의 추가로 HIVE T670의 성능을 확장시킨다. 광학 장치는 70 ° 이미징 위치 이전의 캐로셀 회전 위치에서의 0 ° 전체 플레이트 이미징을 위한 고해상도 CCD 카메라(902) 및 텔레센트릭 렌즈(903)를 포함한다. 플레이트 아래의 제 2 LED 백라이트는 70 °이미징과 유사한 트랜스-조명을 제공한다. 카메라(902) 및 텔레센트릭 렌즈(903)는 광로를 접기 위한 선회 거울의 추가로 0 °이미징 위치 수직 상 또는 이미징 면에 수직으로 장착될 수 있다. HIVE 듀얼 모드 이미저(900)는 평평한(0 °) 이미징 모드에서 시간당 최대 300개의 플레이트를 처리하거나, 예를 들어 BioTek BioStackTM NEO 마이크로 플레이트 핸들러에 결합되면 단일 무인 실행에서 50개의 플레이트를 처리한다. 기울어진 이미징 모드의 처리량은 HIVE T670의 처리량, 즉 정상 분석 조건에서 시간당 100플레이트의 처리량과 동일하다. HIVE DM을 위한 응용에는 기니피그 또는 인체 O형 RBC를 사용하는 것과 같이 일반적으로 기울임 없이 읽히는 HAI 분석뿐만 아니라 표면 보조 HAI(SA-HAI)도 포함한다. HIVE DM은 또한 SBS 역가 플레이트에서 시각적 읽음을 사용하여 평가되는 다양한 웰 포멧(6-, 12-, 24-, 48-, 96-, 384-, 1536- 및 3456- 웰을 포함하지만 이에 제한되지는 않음)으로 수행되는 플라크 분석 및 다른 것들을 영상화하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 0 °이미징 광학 트레인은 넓은 범위의 가능한 분석 유형을 수용하기 위해 70 °광학 트레인보다 높은 예를 들어 11메가픽셀과 같은 해상도 CCD 카메라를 갖는다. 본 발명의 장치 및 방법에 사용될 수 있는 적혈구들(RBCs)의 신원은 세포의 공급원에 의해 제한되지 않는다는 것을 이해되어야 한다. 예를 들어, 인간, 고양이, 개, 생쥐, 쥐, 기니피그, 말, 양, 돼지 등을 포함하는 포유류 종으로부터의 적혈구가 사용될 수 있다. 유사하게, 칠면조, 닭 등을 포함하는 조류 종으로부터의 세포가 사용될 수 있다. 본 발명의 장치 및 방법에서 사용된 적혈구에 상응하는 혈액형 타입 또한 제한되지 않는다. 예를 들어, 인간 혈액형 A, B, AB 및 O로부터의 RBCs가 사용될 수 있다.
본 발명의 다양한 전형적인 실시예의 소프트웨어 컴포넌트가 이제 설명될 것이다. 특히, 소프트웨어 컴포넌트는 2개의 주 하부 컴포넌트인 이미지 프로세싱 알고리즘과 그래픽 유저 인터페이스로 구성된다. 이미지 프로세싱 알고리즘은 샘플 역가값을 자동으로 결정하며 그래픽 유저 인터페이스는 이미지 프로세싱 알고리즘을 이미징, 모션 및 데이터 관리 제어와 통합한다.
이미지 프로세싱 알고리즘에 관해서, 모든 적혈구 웰 패턴의 상태를 동시에 포착하기 위해 HAI 역가 플레이트는 웰을 하향식으로 보거나 웰을 통해 상향식으로 보면서 전체적으로 이미지화된다. 또한, 소프트웨어에 의해 제어됨에 따라, 기울어진 HAI 플레이트는 RBC 스트리밍 동역학을 포착하기 위해, 예를 들어 90초부터 시작하여 기울임 후 120초까지의 매 10초 같은 현상주기 동안의 여러 시점에서 종종 이미지화된다. 이미지 프로세싱 알고리즘은 전체 플레이트 이미지에서 각 개별 웰을 찾아 평가해야 하며 응집 상태를 결정해야 한다. 일단 플레이트상의 각 웰에 대해 응집 상태가 결정되면, 대응하는 샘플에 대해 역가값이 평가된다. 도 10은 본 발명의 실시예에 따른 이미지 분석 알고리즘에서의 다양한 프로세스 단계에 대한 순차적 타임 라인(1000)을 도시한다. 제 1 단계(1001)는 이미지를 불러오고, 이미지가 하부 이미지화되면 이미지를 뒤집는 것이다. 그 다음 단계(1002)는 자동 삼각 측량 또는 저장된 측정치를 사용하여 웰 마스크를 정의하는 것이다. 그 다음 단계(1003)는 세계적 L * a * b 분할을 적용하는 것이다. 그 다음 단계(1004)에서, 이미지 분석 알고리즘은 각각의 웰을 통해 반복하고, ROI, 분할을 정의하고 측정을 한다. 다음 단계(1005)에서, 알고리즘은 측정들에 기초하여 웰들을 분류한다. 상기 분류는 바람직하게는 응집된, 응집되지 않은, 역가 및 특이값을 포함한다. 단계(1006)에서, 이미지 분석 알고리즘은 웰 분류를 나타내는 플레이트 이미지 오버레이를 생성하고, SQL 데이터베이스와 같은 데이터를 저장한다.
예시적인 실시예에 따른 HAI 이미지 프로세싱에 관한 보다 상세한 정보가 도 11의 흐름도(1100)에 도시되어있다. 도시된 바와 같이, 제 1 단계(1101)는 처리를 위해 이미지, 즉 플레이트를 선택하는 것이다. 전형적으로, HAI 플레이트는 RBC 스트리밍 동역학을 포획하기 위해, 기울임 이후와 같은 그들의 현상 주기 동안 다수의 시점에서 이미징된다. 분석할 이미지는 수동으로 또는 최적의 판독 시간에 가장 가깝게 획득한 이미지를 선택하는 알고리즘을 사용하여 동적 이미지의 집합에서 선택되어야 한다. 수동 선택은 데이터베이스의 이미지 표에서 원하는 플레이트 이미지를 강조 표시하여 수행된다. 아래에서보다 상세히 논의될 바와 같이, 최적 시점 알고리즘은 제어 웰 패턴을 분석하여 기준 패턴과 비교하기 위한 이미지 프로세싱을 사용하여 최적의 이미지를 자동으로 결정한다. 일단 이미지가 선택되면, 이미지는 단계(1102)에서 이미지 프로세싱 알고리즘에 로드된다. 이것이 전체-플레이트 이미지이기 때문에, 다음 단계(1103)는 이미지화될 필요가 있는 모든 웰을 찾아내는 웰 마스크를 정의하는 것이다.
웰 위치를 정의하는 두개의 모드, 즉 사용자가 웰 위치를 정의하는 수동 모드와, 예를 들어 삼각 측량 기술을 사용하여 추가 알고리즘이 사용되는 자동 모드가 있다. 수동 모드는 플레이트 원을 원의 윤곽선과 플레이트 상에서 정렬하여 예를 들어 웰 A1, A12 및 H12 웰 같은 96-웰 플레이트의 특정 웰의 중심과 반경을 상호적으로 정의하는 사용자에 따라 좌우된다. 다른 모든 웰의 중심은 이 세 점으로부터 계산된다.
단계(1104)에서, 웰 번호는 1로 설정된다. 단계(1105)에서, 알고리즘은 플레이트 내의 모든 96-웰이 처리되었는지를 검사한다. 모든 웰이 처리된 경우, 방법은 단계(1106)으로 계속된다. 처리될 웰이 있다면, 방법은 이미지가 웰 관심 영역(ROI)로 잘리는 단계(1107)으로 진행한다. 단계(1108)에서, L * a * b 컬러 분할이 적용된다. 단계(1109)에서, RBC 패턴의 몇몇 특징들이 측정된다. 이러한 특징은 바람직하게는 응집 상태의 함수로서 변화한다. 단계(1110)에서 혈구 응집 파라미터가 계산된다. 단계(1111)에서 웰은 응집 상태에 따라 분류된다. 단계(1112)에서, 웰 번호가 증가되고, 그 다음에 방법은 단계(1105)로 되돌아 간다.
단계(1106)에서, 방법은 역가를 할당하고 특이값을 정의한다. 단계(1113)에서, 방법은 웰 분류를 나타내는 플레이트 이미지 오버레이를 생성한다. 단계(1114)에서, 데이터는 SQL 데이터베이스 같은 곳에 저장된다.
자동 웰 정의 알고리즘은 동일한 원칙을 적용하지만 이미지 분석을 사용하여 중심을 찾는다. 웰 정의 알고리즘에 관한 추가적 상세한 설명은 이하에 제공된다. 웰의 위치가 결정된 후, 다음 단계는 웰 RBC 패턴 각각을 반복적으로 처리하고 그들의 응집 상태를 결정하는 것이다. 본 발명의 실시예에 따른 웰 패턴을 처리하기위한 일반적인 단계는 (1) RBC 패턴을 포함하는 관심 영역으로 이미지를 자르고, (2) RGB 이미지를 L * a * b * (Lab) 컬러 공간으로 변환하고, 예를 들어 CIELAB에 의해 정의된 바와 같이, 치수 L은 밝기를 나타내고 a 및 b는 비선형으로 압축된 CIE XYZ 컬러 공간을 기준으로 컬러-상대 치수를 나타내며 나머지 이미지로 부터 RBC 패턴을 분할하는 미리 정의된 게이트를 적용하고, (3) 응집 상태의 함수로서 변화하는 RBC 패턴의 몇몇 특징을 측정한다. 이들은 이미지 모멘트로부터 유도되며 RBC 스트림의 길이(L), 최하위 픽셀(B)의 위치 및 Y 축(Y)의 가중치 중심을 포함한다. 이러한 측정이 이루어진 후에, 헤마글루티닌 파라미터는 식. 1에 따라 계산된다.
Figure pct00001
(식. 1)
헤마글루티닌 파라미터(HAp)는 이후에 상세히 논의될 바와 같이, 웰이 응집되거나 응집되지 않은 것으로 분류하는데 사용된다. 응집 상태가 플레이트상의 각 웰에 대해 결정된 후에, 적정되지 않은 가장 높은 희석물의 역가로서 각각의 샘플 희석 시리즈에 대하여 역가값이 할당된다. 샘플 희석 시리즈가 비연속적 응집 상태 또는 유효하지 않은 제어 웰과 같은 특이값을 피펫팅 에러로 인해 나타내는 경우, 샘플은 알고리즘에 의해 표시되고 역가값은 할당되지 않는다. 역가 할당 및 특이값 검출에 이어, 웰 분류를 시각적으로 묘사하기 위해 잘못된-컬러 플레이트 이미지 오버레이가 알고리즘에 의해 적용된다. 모든 계산된 값은 이후의 검색을 위해 하나 이상의 관계형 데이터베이스 프로그램이 인식할 수 있는 형식으로 메모리 장치에 저장된다.
전술 한 L * a * b 색 공간에서의 RBC 패턴 관련하여, 컬러 분할은 RBC 패턴을 플레이트 이미지로부터 분리하는데 사용된다. 최최의 RGB 이미지는 먼저 L * a * b 컬러 공간으로 변환된 다음 미리 정의된 "게이트"와 비교된다. 이 컬러 게이트는 다수의 웰, 예를 들어 수천개의 웰로부터 복합 L * a * b 컬러 공간 게이트를 만들고 RBCs에 해당하는 픽셀의 위치를 기록하여 수동으로 정의된다. 도 12는 본 발명의 하나 이상의 실시예에 따른 예시적인 L * a * b 컬러 공간 맵을 설명한다. 일단 게이트가 정의되면, RBC 패턴을 분할하는 것은 게이트 내에 있지 않은 픽셀을 폐기함으로써 달성된다.
최적 시점 알고리즘
최적 시점 알고리즘의 목적은 플레이트 현상 동안 획득된 동적 이미지들의 집합으로부터 최적의 플레이트 이미지를 결정하는 것이다. 적어도 하나의 실시예에 따르면, 도 13에서 볼 수 있듯 RBC 제어 패턴이 웰의 바닥으로 흘러 "풋"이 형성되는 시점으로 정의되는 최적 판독 시간 동안 RBC 제어 웰을 관찰하는 분석가를 모방함으로써 이를 달성한다.
적어도 하나의 실시예에 따른 예시적인 시점의 알고리즘의 프로세스(1400)가 도 14에 도시된다. 도시된 바와 같이, 알고리즘은 RBC 스트림의 길이(L), 최하위 픽셀(B)의 위치, 웰의 면적(A), 둘레(P), 등가 직경(D), Y 축의 무게 중심(Y) 및 각 RBC 제어의 원형도(C)를 결정하기 위해 선택된 플레이트에 대한 동적 이미지의 수집과 RBC 제어 웰에 대한 프로세스를 반복한다. 이들 파라미터 각각에 대한 측정된 값은 최적으로 수동으로 선택된 예를 들어 수천 개의 RBC 제어 웰로부터 유도된 평균 기준 레퍼런스 파라미터로 표준화된다. 이 특정 표준화 체계에 대한 이론적 근거는 측정된 파라미터가 레퍼런스 파라미터에 접근할 때 표준화된 파라미터의 값 또는 더 구체적으로는 그 비율이 단일로, 즉 1에 접근한다는 것이다.
RBC 제어 웰에 대한 모든 표준화된 파라미터가 1에 가장 가까울 때, 해당 웰의 패턴은 레퍼런스에 가장 가깝고 따라서 최적의 판독 시간에 가장 가까운 것으로 결정된다. 모든 표준화된 파라미터의 값은 거의 동일하며, 예를 들어 최적 시점에서 1에 가까워지므로, 그 값의 표준 편차는 주어진 RBC 패턴이 얼마나 근접하는지에 대한 단일 수치 표시를 제공한다. 일반적으로, 플레이트 내의 RBC 제어 웰은 정상적인 실험적 변화로 인해 약간 다른 비율로 발생한다. 예를 들어, 도 17 및 18은 동일한 플레이트 상의 8개의 RBC 제어 웰에 대한 최적 판독 시간 및 표준 편차의 변화를 각각 나타낸다. 특정 실시예에서, 최적 판독 시간은 플레이트를 0 °에서 70 °까지 기울인 후 약 100 내지 125초이다. 플레이트의 전반적인 상태를 평가하기 위해 모든 표준 편차값의 평균이 고려된다. 따라서 RBC 제어 웰의 표준화된 파라미터의 평균 표준 편차가 가장 낮은 이미지가 최적 시점에 가장 가깝다. RBC 제어 웰에 대한 전형적인 평균 표준 편차 대 시간 플롯을 도 15에서 볼 수 있다.
이미징 시점에 대한 함수로서의 표준화된 파라미터의 거동을 도 16a 내지 도 16c에 세 가지 각각의 상이한 경우로 나타낸다: 비-응집(도 16a), 응집 개시(도 16b) 및 응집 완료(도 16C). 도 16a에 도시된 바와 같이, 표준화된 파라미터는 100 초의 영상화 시점에서 비-응집된 경우 1의 값으로 잘 수렴한다. 이는 레퍼런스와의 긴밀한 일치 때문이다. 응집이 일어나기 시작하는 도 16b에서는 표준화된 파라미터들의 수렴은 덜 두드러지고, 비-응집된 경우의 도 16c에서는 어떠한 수렴도 관찰되지 않는다. 또한, 도 19a 및 19b는 HA 파라미터(상기 식.1에 의해 계산된 바와 같은) 및 평균 표준 편차가 시간 및 응집 상태의 함수로서 어떻게 변화하는지를 보여준다.
자동 웰 정의 알고리즘
본 발명의 실시예들에 따른 자동 웰 검출 알고리즘이 도 20에 도시되어있다. 이 알고리즘은 웰을 포함하는 영역에 원형 허프(Hough) 변환을 적용함으로써 이미지 분석을 통해 96-웰 플레이트와 같은 A1, A12 및 H12 웰의 중심 및 반지름을 반복적으로 계산한다. 발견된 중심과 반경은 판에 남아있는 웰의 위치를 계산하는 데 사용된다.
응집 상태 분류 알고리즘
본 발명의 실시예에 따르면, 응집 상태는 도 21의 흐름도(2100)에 도시된 알고리즘을 사용하여 분류된다. 도시된 구체적 실시예에 따른 웰은 응집된 것 또는 비-응집된 것으로 분류된다. HA-파라미터를 계산한 후, 분류 알고리즘은 HA-파라미터가 사전 설정된 한계와 관련하여 어디에 있는지를 결정한다. 이러한 사전 설정된 한계는 숫자 결과를 많은 샘플의 수동 분석과 일치시키는 것을 전제로 결정된다. HA-파라미터가 하한보다 작으면, 웰은 응집된 것으로 분류된다. HA-파라미터가 상한을 초과하여 결정되면 웰은 응집되지 않은 것으로 분류된다. HA-파라미터의 값이 상한 및 하한 사이에 있으면, 웰 패턴에 대해 추가 분석을 수행하여 그 상태를 결정한다.
특히, RBC 스트림이 웰 벽에 닿거나 오버랩되는지를 결정하기 위해 부가적인 이미지 프로세싱이 초기에 수행된다. 이 결정은, 예를 들어, 도 22에 도시된 바와 같은 에지 검출 알고리즘을 사용함으로써 이루어진다. 벽과 스트림의 오버랩이 감지되면 웰은 응집되지 않은 것으로 분류된다. 그렇지 않으면 웰은 응집된 것으로 분류된다. 이어서, 2차 중앙 이미지 모멘트가 RBC 패턴이 다이아몬드 형상을 나타내는지를 결정하기 위해 사전 설정된 임계치와 비교된다. 임계값을 초과하면 웰은 응집된 것으로 분류된다. 마지막으로, RBC 패턴 풋 근처의 픽셀을 조사하여 발의 강도가 충분한지를 결정한다. 풋의 강도가 낮은 패턴은 응집된 것으로 분류된다.
그래픽 유저 인터페이스(GUI)
자동화된 이미징 및 분석의 많은 부분이 전부는 아니지만, 그래픽 유저 인터페이스(GUI)에 의해 통합된다. 본 명세서에 명시적으로 개시된 예시적인 실시예에 따른 GUI는 3가지 주요 영역 : 이미지 획득, 이미지 분석 및 데이터 관리로 나누어지며, 이들 각각은 이하에서 상세히 설명된다.
이미지 획득
하나 이상의 실시예에 따른 GUI의 이미지 획득 컴포넌트는 유저 지정 시점에서 전체-플레이트 이미지를 획득하고 이미지를 메타 데이터와 함께 관계형 데이터베이스에 저장하는 역할을 한다.
실행 스케줄러는 이미지 획득 컴포넌트와 함께 동작한다. 스케줄러는 현상 시간, 이미징 윈도우, 이미징 간격 및 플레이트 수와 같은 원하는 플레이트 이미징 동역학에 대한 유저 입력을 취하고 주어진 플레이트 수에 대한 유저 요청을 달성하기 위한 최적 모션 제어 작업을 결정한다. 스케쥴러에 의해 생성된 스케쥴은 이미지 획득 실행 동안 모션 및 이미징 하드웨어를 제어하는데 사용된다.
전형적인 타이밍도가 도 24 및 도 25에 도시된다. 도 24 및 도 25에 도시된 다이어그램은 6 및 36 플레이트 각각에 대한 정상적인 동적 입력 파라미터를 고려한다. 전술한 HIVE 이미저는 예시적인 실시예에 따라 정상 동작 조건에서 1시간 내에 약 100개의 플레이트를 처리한다.
실행 중에, 실행 완료 백분율, 현재 플레이트 각도 및 현상 시간, 및 동적 이미징 상태와 같은 관련 정보가 이미지 획득 인터페이스에 의해 디스플레이된다. 도 23은 이미지 획득 동안 사용자에게 디스플레이되는 GUI상의 예시적인 탭을 도시한다. 이 실시예에 따르면, 사용자가 컴퓨터 모니터상에서 실시간으로 현상 프로세스를 관찰 할 수 있도록 이미지화되는 현재 플레이트의 비디오 데이터가 디스플레이된다. 또 다른 실시예에 따르면, 섬네일 이미지는 플레이트 이미지가 획득될 때 표시된다. 예를 들어, 섬네일 이미지를 클릭하면 GUI의 비디오 창에 큰 이미지가 로드되고 특정 플레이트 및 실행 정보가 표시된다.
도 24 및 도 25는 본 발명의 실시예에따라 각각 6 플레이트 및 36 플레이트의 자동화된 이미징에 대한 예시적인 타이밍도를 도시한다.
이미지 분석
이 실시예 및 다른 실시예에 따른 GUI의 이미지 분석 컴포넌트는 획득된 전체 플레이트 이미지에 이미지 프로세싱 알고리즘을 적용하고 오버레이된 플레이트 마스크의 형태로 결과의 시각적 표현을 제공한다. 도 26은 이 실시예에 따른 이미지 분석동안 디스플레이될 예시적인 스크린 샷을 도시한다. 도시된 바와 같이, 플레이트 마스크는 응집 상태, 역가값, 특이값, 샘플 수, 희석을 나타내고, 또한 항원 및 이미지 획득 시간과 같은 메타 데이터를 포함한다. 수동 모드는 사용자가 플레이트를 수동으로 분석하고 역가값과 특이값을 표시하고 플레이트 마스크에 노트를 추가 할 수 있게 한다. 분석 결과는 수치값이 있는 열 맵 또는 강도 맵으로 볼 수도 있다. 플레이트 이미지 데이터베이스는 사용자가 항원, 분석가, 타임 스탬프 및/또는 실험과 같은 여러 메타 데이터 카테고리를 기반으로 관심 있는 플레이트 이미지에 신속히 접근할 수 있게 해주는 상호 작용 및 필터링 가능한 표를 사용하여 획득될 수도 있다.
언급된 이미지 분석의 다양한 실시예와의 일치하여, 플레이트 이미지는 수 개의 상이한 선택 가능한 분석 모드, 즉 수동 분석, 자동 단일 플레이트 분석, 배치(batch) 분석 및 완전 자동 분석을 사용하여 분석된다.
분석 모드는 유저가 예를 들어 관심 있는 특정 웰을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 웰 이미지의 역가 포인트를 수동으로 표시할 수 있게 한다. 특이값 웰은 예를 들어 웰을 오른쪽 클릭하여 지정된다. 지정되거나 표식된 웰은, 예를 들어, 둘레 주위의 착색 및/또는 파선 원에 의해 구별된다. 그런 다음 결과가 데이터베이스에 저장되며 원하는 대로 나중에 세션에서 검색될 수 있다. 본 실시예 및 다른 실시예에 따른 자동 단일 플레이트 분석 모드는 단일 선택된 플레이트의 분석을 제공하고 역가값 및 응집 상태를 반환한다. 배치(batch) 분석 모드에 따라 정의된 배치 내에 포함된 모든 플레이트 이미지가 연속적으로 분석된다. 분석 진행 상태는 진행 막대 및 분석중인 플레이트 및 남아있는 플레이트를 나타내는 상태 메시지에 의해 사용자에게 표시된다. 완전 자동 분석 모드는 최적의 시간 지점 알고리즘을 사용하여 플레이트를 처리한다. 이 모드가 사용되는 경우 처리는 단일 플레이트 또는 실행되는 전체 플레이트의 이미지로부터 수행될 수 있다.
다른 실시예에 따르면, 분석 결과를 보기 위한 분석 탭(도 26에 도시된 예시) 상에 몇 가지 다른 뷰 모드가 구현된다 : 플레이트 마스크, 강도 맵, 열 맵 및 차트
플레이트 마스크는 웰의 응집 상태, 역가값, RBC 대조군의 유효성 및 불연속 응집 상태로 인한 특이값을 표시하는 폴스 컬러 오버레이이다. 플레이트 마스크는 또한 각 컬럼에 대한 희석 계수, 각 행에 대한 샘플 번호 및 예를 들어, 분석가 이름, 플레이트 시간 스탬프, 사용된 항원 및 사용자 정의 노트 영역을 포함하는 노트 섹션을 오버레이한다. 강도 맵은 모든 웰로부터의 구획화된 RBC 패턴의 폴스 컬러 이미지이며, 픽셀 강도의 함수로서 음영 처리된다. 강도맵은 예를 들어, 알고리즘이 패턴을 분할하는 방법을 검토하고 알고리즘이 역가값을 할당하는 방법을 파악하는 것에 유용하다. 열 맵은 대응되는 웰의 HA-파라미터 값으로 정의된 각 섹션의 색상을 가진 HAI 판의 8 x 12 격자 표현이다. 비-응집에서 응집으로 전환하는 동안 색 변화가 관찰됨에 따라 샘플의 응집 개시를 시각화하는 데 유용하다. 마지막으로, 선택된 플레이트에 대한 데이터, RBC 제어 웰 표준 편차값, 샘플 역가값 및 도즈(dose) 응답 곡선과 같은 데이터를 디스플레이하기 위해 차트 섹션이 실시예에 따른 분석 탭에 포함된다.
데이터 처리
본 발명의 실시예에 따르면, 데이터 관리 GUI 컴포넌트는 이미지 분석 컴포넌트에 의해 생성된 데이터를 생성하고 반출하기 위한 제어를 제공한다. 도 27은 이 실시예와 일치하는 사용자에게 제시된 예시적인 데이터 분석 탭의 스크린샷이다. 예를 들어, 도시된 바와 같이 상호 작용 및 필터링 가능한 표는 실행 - 플레이트 - 샘플 - 역가의 계층구조 내의 메타 데이터에 기초하여 데이터 서브 세트를 생성 및 반출하는 능력을 제공한다. 이 실시예 및 다른 실시예에 따라 제공되는 반출 제어는 미리 포맷된 맞춤형 마이크로소프트 엑셀 또는 일부 다른 형식의 보고서를 관계형 데이터베이스로부터 직접 생성한다. 또 다른 실시예에 따르면, 데이터는 커스텀 포맷된 PDF 보고서로 보내진다.
구성
데이터 분석 설정, 기기 설정 및 유저 역할의 구성은 GUI 내에서 생성된 탭-기반 메뉴를 통해 처리된다. 예를 들어, 하나 이상의 실시예에 따르면, 앞서 논의된 이미지 프로세싱 알고리즘에서 사용되는 모든 파라미터는 분석 설정 메뉴에서 정의된다. 스테이지 오프셋, 카메라 설정 및 통신 포트와 같은 하드웨어 설정은 설정 메뉴의 하드웨어 탭을 통해 제어 및 정의된다. 또한, 적어도 하나의 실시예에 따르면, 소프트웨어는 3 개의 상이한 사용자 역할, 즉 일반(general), 매니저(manager) 및 관리자(administrator)를 지원한다. 이러한 각 역할에 대한 허가와 특정 사용자에 대한 설정은 설정 메뉴의 사용자 탭을 통해 제어 및 정의된다.
테스트 동안, 몇몇 상이한 인플루엔자 항원에 대한 상당한 양의 동적 이미지 데이터가 본원에 개시된 다양한 실시예에 따른 프로토타입 및 HIVE 이미저를 사용하여 수집되었다. 이 데이터는 공개된 이미지 프로세싱 알고리즘을 개발 및 개선하고 하드웨어에 대한 계측기 설계 요구 사항을 추가로 정의하기 위해 사용되었다. 일치 검사는 프로토타입 3 및 HIVE 이미징 시스템을 사용하는 실시예로 수행되었으며, 각기 다른 자격을 갖춘 분석가 및 칠면조 적혈구의 상이한 로트(lots)로 2회의 독립적인 분석이 시행되었다. 항원에 대한 샘플 당 총 2개의 결과가 각 판독 방법, 수동 및 자동화로 생성되었다. 자동 역가 할당은 개시된 최적 시점 알고리즘에 의해 정의된 최적의 정적 이미지를 사용하여 개시된 알고리즘에 의해 정의되었다. 샘플 패널은 2012 내지 2013년 인플루엔자 백신 접종 전후의 30개의 혈청 샘플을 포함하는 60개의 인간 혈청 샘플로 구성되었다. 검사된 항원은 H1N1, H3N2, B 및 에테르 처리된 B가 포함한다. 결과의 통계 분석은 개별 분석 실행의 표준 일치도 분석과 두 가지 분석 실행의 기하 평균 역가(GMT), 혈청 항원 양성율, 혈청 전환율 및 GMT 비율(GMTR, post/pre)을 포함하는 인간 사용을 위한 의약품위원회(Committee for Medicinal Products for Human Use(CHMP)) 평가 및 개별 분석 방법을 사용한 정밀도 분석을 구비한다. 스트리밍 RBC의 수동 판독 방법과 본 발명의 구현 예에 따른 이미저를 이용한 자동화된 분석 방법 간의 일치 분석(concordance analysis)은 광범위한 인플루엔자 균주에 대해 우수한 일치를 보였다. 도 28 및 도 29의 표에 제공된 데이터는 프로토타입3 이미징 시스템을 사용하는 실시예가 사용되었을 때 다양한 인플루엔자 균주에 대한 수동 분석과 자동화 분석 사이의 높은 일치도를 나타낸다. 도 30 및 도 31의 표에 제공된 데이터는 HIVE 이미징 시스템을 사용하는 실시예가 사용될 때 수동 분석과 자동화 분석 사이의 더 높은 일치도를 나타낸다. 본 발명의 실시예에 따른 이미저를 사용하는 수동 판독 방법과 자동화된 판독 방법 사이의 일치는 B/Hubei-Wujiagang/158/2009(전체 및 에테르 처리) 및 B/Florida/04 /2006 (데이터 미도시)을 포함하는 기타 균주에 대해 또한 입증되었다. 본 발명에 개시된 다양한 알고리즘은 제한, 임계치 및 컬러 게이팅과 같은 알고리즘 파라미터가 각각의 이미저에서 테스트된 모든 균주에 대해 고정되어 있기 때문에 균주 독립성을 나타낸다.
이미지 프로세싱은 응집 상태에 정량적 측정을 할당함으로써 종래의 분석과 비교하여 HAI를 분석하기 위한 확장된 능력을 제공한다. HAI 샘플 희석 시리즈는 이러한 수치 값(HA-파라미터)을 사용하여 도즈(dose) 응답 곡선에 맞춰질 수 있다. 도시된 바와 같이, 예를 들어, 도 32에서, 도즈 응답 곡선은 연속적인 역가값을 할당할 수 있게 하고, 종래 보고된 불연속 값을 본질적으로 보충한다. 결과는 응집이 시작되는 때의 실제 역가의 더 정밀하고 더 상세한 묘사이다.
결과 곡선은 억제제 또는 길항제라 불리는 물질의 농도를 결정하는데 유용한 억제 반응 곡선과 유사하며, 작용제 활성을 보통 최대 억제 농도의 절반 또는 IC50으로 보고되는 특정 양만큼 억제하는데 필요하다. HAI의 경우 IC50 값은 HA-파라미터를 반으로 줄이기 위해 필요한 샘플 희석 계수를 나타낸다. HA-파라미터가 응집 상태와 관련되어 있으므로 IC50 값은 응집 또는 비-응집의 별개의 분류보다는 응집도에 따라 샘플을 분류하는 수단을 제공한다. 예를 들어, 도 32의 도즈 반응 곡선은 각각 상이한 혈청 샘플에 대한 희석 시리즈를 나타낸다. 각 곡선에 상응하는 IC50 값은 샘플에 대한 종래의 개별 역가값과 함께 도 33에 도시되어 있다. 이들 샘플에 대한 도즈 반응 곡선 간의 차이는, 샘플 3의 곡선이 샘플 2의 곡선과 비교하여 우측으로 시프트되어 이들이 서로 다른 응집 활성을 나타내는, 도 32에서 증명될 수 있다. 그러나 기존의 역가값은 이산값을 할당하기 위한 기준에 따라 동일하다. 이 경우, 도즈 반응 곡선 및 IC50 값은 샘플 응집 상태의 더욱 완전한 표현을 제공한다.

Claims (17)

  1. 항체의 기능적 결합 활성의 측정 방법으로서,
    응집 인자 및 상기 항체로 이루어지는 샘플을 준비하는 단계;
    표적물을 상기 샘플에, 상기 응집 인자로 인한 상기 표적물의 응집을 허용하는 조건하에서 추가하는 단계;
    상기 표적물이 추가된 상기 샘플의 이미지를 준비하는 단계; 및
    상기 표적물의 응집을 결정하기 위해 프로그램된 프로세싱 장치에서 상기 이미지를 프로세싱하는 단계를 구비하는, 항체의 기능적 결합 활성의 측정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 샘플 및 상기 표적물은 복수의 웰을 갖는 배양 플레이트 내에 함께 배치되고, 각 웰은 각각의 샘플 및 상기 표적물의 양을 포함하는, 항체의 기능적 결합 활성의 측정 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 이미지는 각 웰에 대한 이미지 데이터를 포함하는, 항체의 기능적 결합 활성의 측정 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 배양 플레이트를 일정 각도로 기울이는 단계; 및
    상기 플레이트를 광원으로 조명하는 단계를 추가로 구비하는, 항체의 기능적 결합 활성의 측정 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 각도는 약 0도 또는 약 70도인, 항체의 기능적 결합 활성의 측정 방법.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    복수의 플레이트들 각각은 복수의 웰을 가지고, 독립적으로 이미지화되고 자동적으로 프로세스되는, 항체의 기능적 결합 활성의 측정 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    최대 6개의 플레이트들이 동시에 기울어지는, 항체의 기능적 결합 활성의 측정 방법.
  8. 제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 플레이트들은 상향식(bottom-up)으로 이미지화되는, 항체의 기능적 결합 활성의 측정 방법.
  9. 제 2 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적물을 가지는 상기 샘플의 이미지를 준비하는 단계는 상기 배양 플레이트 또는 플레이트들을 텔레센트릭 렌즈로 이미징하는 단계를 구비하는, 항체의 기능적 결합 활성의 측정 방법.
  10. 항체의 결합 활성을 측정하기 위한 시스템으로서,
    카메라, 렌즈, 및 거울을 구비하는 광로부;
    복수의 플레이트 홀딩 스테이션을 구비하는 회전 테이블, 및 임의의 상기 플레이트 홀딩 스테이션들을 상기 광로부와 정렬되게 이동시키도록 상기 회전 테이블을 회전시키도록 구성된 테이블 모터; 및
    적어도 하나의 플레이트의 적어도 하나의 이미지를 획득하기 위해 상기 테이블 모터, 상기 회전 모터, 및 상기 카메라를 제어하기 위해 구성된 제어기를 구비하고,
    상기 플레이트 홀딩 스테이션은 테스트 웰들의 배열을 구비하는 플레이트를 홀드하도록 구성된 플레이트 홀더, 및 상기 플레이트 홀더의 경사 각도를 조절하도록 구성된 틸트 모터를 구비하는, 시스템.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 플레이트 홀딩 스테이션은 상기 플레이트를 조명하기 위해 구성된 백라이트를 추가로 구비하는, 시스템
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 제어기는 상기 플레이트 홀더를 실질적으로 70 °로 기울이고 상기 플레이트 홀더가 기울어진 후 예정된 시간 동안 상기 플레이트의 이미지를 획득하게 상기 카메라를 제어하도록 상기 틸트 모터를 제어하는, 시스템.
  13. 제 10 항에 있어서,
    카메라, 렌즈, 및 거울을 구비하는 제 2 광로부를 추가로 구비하고, 상기 제 2 광로부는 기울어지지 않은 플레이트의 이미지를 획득하기 위해 위치되는, 시스템
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 카메라는 CCD 카메라인, 시스템
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 CCD 카메라는 적어도 5 메가픽셀의 이미지 센서를 갖는, 시스템
  16. 제 10 항에 있어서,
    상기 렌즈는 텔레센트릭 렌즈인, 시스템
  17. 제 10 항에 있어서,
    상기 카메라로부터 획득된 이미지들을 수신하고, 플레이트의 실질적으로 모든 테스트 웰에 대한 응집 상태를 결정하기 위해 상기 이미지들을 분석하도록 구성된 컴퓨팅 요소를 추가로 구비하는, 시스템.
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