KR20170045986A - 암전이 억제효능을 보이는 지금초 추출물 및 그 추출물 유래 화합물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암전이 억제효능을 보이는 지금초 추출물 및 그 추출물 유래 화합물에 관한 것으로, 본 발명을 통하여 지금초 추출물이 효과적으로 암전이억제효능을 보임을 확인하였고, 그 추출물로부터 효능 성분을 분석하여 암전이 억제 효과를 확인하여 암전이 후보물질로 사용할 수 있다.

Description

암전이 억제효능을 보이는 지금초 추출물 및 그 추출물 유래 화합물{A Euphorbia humifusa Extract with anti-metastatic effect and a compound from the same}

본 발명은 암전이 억제효능을 보이는 지금초 추출물 및 그 추출물 유래 화합물에 관한 것이다.

암이 전이되기 이전 단계에서는 수술, 화학적요법, 방사선치료 등을 통하여 5년 생존률이 높으나, 일단 전이가 된 후에는 생존률이 급격하게 감소하는 것이 현실로서 암전이 억제가 암정복의 큰 과제이다. 정상적인 조직세포의 성장과 분화는 여러 성장인자들의 신호전달 경로에 의해 엄격히 조절되고 통제되고 있으나, 세포외부 신호전달에 의한 세포성장 조절이 여러 가지 원인에 의해 그 균형이 깨지게 되면 정상세포는 통제가 불가능한 종양세포로 변하게 된다. 신혈관 생성으로 인해 암발달이 진행되면 원발 병소의 암세포 집락이 급진적으로 성장하게 되고 암세포는 원발 병소에서 타 장기로의 전이 (metastasis)가 이뤄진다. 전이된 암세포는 genetic instability에 의한 heterogenicity 때문에 항암 요법에 대한 저항성과 숙주 면역계의 공격 등에 저항성이 생겨 결국 악성 종양으로 급격히 발전하게 된다. 따라서 효과적인 암치료를 위해서는 효과적으로 암세포의 전이 과정을 차단하는 방법의 개발이 절대적으로 필요하다. 항암효과를 보이는 식물 추출물은 다양하게 알려져 있으나 암전이를 억제하는 것으로 알려진 식물 추출물은 드문 실정이다.

지금초는 비단풀로도 알려져 있고 학명은 Euphorbia humifusa 로서, 대극과에 속하는 일년생풀이다. 탄닌성분이 10% 이상 들어 있는 것으로 알려져 있고 생약명은 지금 (地錦)이다. 우리나라에서는 염증, 천식, 당뇨, 심장병 등에 효능이 있는 것으로 알려져서 다려서 먹거나 나물같이 무쳐 먹는다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 암전이억제효능을 가지는 식물 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 식물 추출물 유래 화합물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 지금초 추출물을 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 지금초 추출물은 지금초 에틸아세테이트 추출물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 지금초 추출물을 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 식품 조성물을 제공한다.

또 본 발명은 캠페롤(Kaempferol)-3-O-6-OMe-글루코피라노사이드(glucopyranoside), 퀘세틴(Quercetin)-3-O-5-OMe-아라비노피라노사이드(arabinopyranoside) 및 퀘세틴(Quercetin)-3-O-6-OMe-글루코피라노사이드(glucopyranoside)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 화합물은 지금초 추출물 유래인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 캠페롤(Kaempferol)-3-O-6-OMe-글루코피라노사이드(glucopyranoside), 퀘세틴(Quercetin)-3-O-5-OMe-아라비노피라노사이드(arabinopyranoside) 및 퀘세틴(Quercetin)-3-O-6-OMe-글루코피라노사이드(glucopyranoside)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 추출물 및 화합물은 암세포 전이 억제 효능가 우수하여 암전이 억제제 또는 건강식품에 매우 유용하리라 기대된다.

또한, 본 발명의 화합물은 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 인산, 아세트산, 시트르산, 푸마르산, 락트산, 말레산, 숙신산 및 타르타르산 등의 유기 또는 무기산과 함께 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수 도 있고, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리금속 이온이나 암모늄 이온과 반응하여 약학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수도 있으며,

또한, 상기 추출물 및 화합물은 암전이 억제효과를 나타내는 유효성분이므로 위암, 폐암, 간암 및 혈액암 등 각종 암질환을 치료하는데 있어서 암의 재발 및 전이암을 억제하는데 유용하게 이용될 수 있다.

따라서, 상기 추출물 또는 화합물을 유효성분으로 포함하는 약제 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 및 건강식품의 형태로 사용될 수 있다.

상기 약제 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면, 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액,조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 항암 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.

본 발명에 따른 추출물 및/또는 화합물의 유효 용량은 일반적으로 성인 환자 체중 1kg 당 0.001 ∼ 3000 mg/일이고, 바람직하기로는 0.03 ∼ 200 mg/일이며, 의사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 하루 2 ∼ 3회 분할 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 추출물 또는 화합물을 유효성분으로 하는 건강식품을 포함한다.

건강식품이란, 상기 추출물 또는 화합물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화,분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명에서는 암전이억제효과를 보이는 식물 추출물을 도출하기 위하여 다양한 식물 추출물에 대한 암전이억제효능을 시험한 결과, 지금초 추출물이 효과적으로 암전이억제효능을 보임을 확인하였고, 그 추출물로부터 효능 성분을 분석하여 규명하였다.

도 1은 지금초 분획물에 의한 IKK 효소 활성 억제 효과를 면역블롯법으로 조사한 것,
도 2(A) TNFa에 의해 활성되는 NF-kB 전사능이 처리한 지금초 추출물의 농도 의존적으로 억제됨을 루시퍼라제 리포터 활성법으로 측정한 것이다. (B)는 TNFa에 의해 활성되는 NF-kB 활성이 지금초 추출물에 의해 억제된다는 사실을 면역블롯법으로 조사한 것,
도 3은 형광현미경을 이용하여 지금초 추출물의 NF-kB 활성 억제효과를 조사한 것,
도 4는 TNFa에 의해 증가되는 MMP9 mRNA 양이 지금초 추출물의 농도 의존적으로 감소된다는 사실을 RT-PCR법 (A)과 Real-Time PCR법 (B)을 이용하여 측정한 것,
도 5는 3차원배양 스페로이드 세포 배양법을 이용하여 TNFa에 의해 증가되는 암전이능이 지금초 추출물에 의해 억제된다는 사실을 확인한 것,
도 6은 실시예 1에서 확보한 ethyl acetate 분획이 다른 분획에 비하여 우수한 효능을 보임에 따라서 이 분획을 추가로 분석하기 위하여 분취액체크로마토그래피 (prep-HPLC)로 성분을 분석한 결과,
도 7은 Eu3의 수소핵자기공명분광 스펙트럼,
도 8은 Eu3의 탄소핵자기공명 스펙트럼,
도 9는 Eu3의 DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer) 실험을 수행한 결과,
도 10 내지 13은 Eu3의 COSY(Correlated Spectroscopy), TOCSY(Total Correlated Spectroscopy), HMQC(Heteronuclear Multiple Quantum Coherence ), HMBC(Heteronuclear Multiple Bonded Connetivities) 실험 결과,
도 14는 이차원 핵자기공명 실험들로부터 수소-수소, 또는 수소-탄소 사이의 관계를 규명하여 구조를 도출한 결과,
도 15는 Eu3의 고분해능질량분석시험 (high resolution mass spectrometry, HR/MS)을 수행한 결과,
도 16 내지 22는 Eu2의 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, TOCSY, HMQC, HMBC 스펙트럼 결과,
도 23은 Eu2의 고분해능질량분석시험 (high resolution mass spectrometry, HR/MS)을 수행한 결과,
도 24 내지 30은 Eu1의 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, TOCSY, HMQC, HMBC 스펙트럼,
도 31은 지금초로부터 분리한 세 종류 물질, 즉, Eu1, Eu2, Eu3에 대한 MMP-9 mRNA 발현 억제 효과를 분석한 사진.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1. 지금초 추출물의 확보 방법

지금초는 경동시장에서 구입하여 그늘에서 건조시킨 후 3Kg을 분쇄하여 메탄올에 침지시킨 후 3일간 shaker로 교반시켜 추출하였다. 감암증류기로 용매를 제거한 후 130g의 추출물을 확보하였다. n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol로 차례로 분획하여 수용액층을 포함한 5종의 분획을 확보하였다.

IKK(IkB kinase) 효소는 암전이 활성에 중요한 NF-kB 활성을 억제하는 IkB를 인산화시켜 단백분해시킴으로써 결과적으로 NF-kB 활성을 유도시키는 인산화 효소이다. IKK는 serine 177 잔기와 serine 181 잔기가 인산화되면 활성되므로 (DiDonato, J.A. et al., Nature 1997;388:548-554), 지금초 분획에 의한 암전이 억제 효과를 알아보기 위하여 지금초 분획에 의한 IKK 인산화 억제 정도를 면역불롯법으로 조사하였다.

지금초 분획물에 의한 IKK 활성 억제 효과를 분석하기 위하여, HCT116 세포에 염증을 유도시키는 10 ng/ml 농도의 TNFa를 단독 처리하거나, TNFa 처리 30분전에 10 ppm 농도의 지금초 분획물을 처리하였다. TNFa를 처리하고 30분 경과 후에 세포를 수확하여, 20 mM HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 150 mM NaCl, 10 ㎍/㎕ Leupeptin, 1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 함유하는 완충용액으로 세포를 용해시킨 후, 고속원심분리하여 세포 용해액만을 수확하였다. 동량의 단백질이 포함하도록 제조된 시료를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-polyacrylamide gel) 전기영동을 실시하여 세포에 존재하는 단백질들을 분리하였다. 전기영동으로 분리된 단백질을 폴리스틸렌 막 (polystyrene membrane)으로 옮긴 후 IKK의 serine177과 serine 181 잔기의 인산화 형태만을 인지하는 일차 항체(Cell Signaling Technology 회사에서 구입)와 대조군으로서 단백질 발현이 변화되지 않는 GAPDH 단백질을 인지하는 일차항체 (Santa Cruz technology 회사에서 구입)를 각각 5시간 반응 시킨 후, 일차항체를 인자하는 이차항체 (Cell Signaling Technology 회사에서 구입)를 1시간동안 반응시켰다. 화학형광감지 시스템 (chemiluminescence) (Amersham Pharmacia Biotechnology에서 구입)을 이용하여 X-ray 필름상에서 IKK 효소의 인산화 변화를 분석하였다. 도 1에서 보는 바와 같이 TNFa만을 단독으로 처리하면 IKK 효소의 serine 171과 serine 181 잔기의 인산화가 증가하였다. 지금초 분획물 중 ethyl acetate (EA) 분획을 전처리하였을 경우 TNFa에 의해 증가되는 IKK의 인산화 정도가 현저하게 감소되었다. 따라서 가장 우수한 IKK 효소 활성 억제 효능을 보인 EA 분획을 이후의 추가 실험에 사용하였다.

실험예 2. 지금초 추출물의 전사인자 NF - kB 활성 억제 효과 분석

전사인자 NF-kB는 암세포의 성장을 촉진시키고, 세포사멸을 억제시키며, 암조직에서 다양한 염증성 싸이토카인과 케모카인 등의 염증성 매개인자 생성을 촉진시켜 염증 반응을 통한 암세포의 성장과 발달을 촉진시키는 암생성 촉진 단백질이다. 지금초 EA분획에 의한 IKK 효소 활성 억제 효과가 직접적으로 NF-kB 활성을 억제시키는지 알아보기 위하여, 전사인자 NFkB가 활성되면 루시퍼라제 (Luciferase) 유전자 발현 증가를 통하여 루시퍼라제 효소 활성이 증가되는 루시퍼라아제 리포터 실험법(luciferase reporter assay)을 이용하였다. HCT116 세포에 루시퍼라제 유전자 발현 조절 부위에 NFkB 결합 서열이 5회 포함되어있는 리포터 플라스미드 (5xNFkB-Luc; Staratagene에서 구입) 0.5 ㎍을 퓨진6 (Fugene6; Roche에서 구입) 시약을 이용하여 세포내로 주입시킨 후, 48 시간 후에 1 ㎍/㎖ 농도의 TNFa 단독 또는 TNFa와 10, 5ppm 농도의 지금초 화합물을 병행 처리하였다. 약물 처리한 후 세포를 12시간 더 배양한 후 수확하여 세포를 용해시킨 후, 세포 용액 단백질에 기질인 루시페린(luciferin)을 50㎕ 첨가하여 발광되는 루시페린 형광을 측정하였다. 루시페린 형광 측정은 Promega 회사에서 구입한 Dual-Glo Luciferase Assay System을 이용하여 Centro LB960 luminometer (Berthold Technologies)에서 측정하였다.

도 2a에 나타난 바와 같이 TNFa는 루시퍼라제 효소 활성을 약 4.5배 증가시켰다. 이와 같은 결과는 TNFa가 NFkB 활성을 유도하여 유전자 프로모터에 존재하는 NFkB 조절 부위 (NF-kB-regulatory element)를 활성화시킴으로써 표적 유전자 리포터 효소인 루시퍼라제 효소 유전자 발현을 증가시켜 루시퍼라제 효소 활성이 증가되었다는 것을 의미하는 것이다. 이때, 본 발명의 지금초 화합물을 TNFa와 병행 처리한 실험군에서는 TNFa에 의해 증가되는 루시페라제 효소 활성이 지금초 화합물 처리 농도 의존적적으로 억제 되는 것이 관찰되었다. 따라서 본 발명의 지금초 추출물은 HCT116 대장암세포에 작용하여 암조직의 염증반응을 유도시키는 TNFa에 의해 활성되는 NFkB 활성을 억제시킨다는 사실을 확인하였다.

지금초 추출물에 의한 NF-kB 활성 억제 효과를 분석하기 위하여, HCT116 세포에 염증을 유도시키는 10 ng/ml 농도의 TNFa를 단독 처리하거나, TNFa 처리 30분전에 10, 5ppm 농도의 지금초 추출물을 처리하였다. TNFa를 처리하고 30분 경과 후에 세포를 수확하여, 20 mM HEPES(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid), 1% Triton X-100, 10% 글리세롤, 150 mM NaCl, 10 ㎍/㎕ Leupeptin, 1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 함유하는 완충용액으로 세포를 용해시킨 후, 고속원심분리하여 세포 용해액만을 수확하였다. 동량의 단백질이 포함하도록 제조된 시료를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-polyacrylamide gel) 전기영동을 실시하여 세포에 존재하는 단백질들을 분리하였다. 전기영동으로 분리된 단백질을 폴리스틸렌 막 (polystyrene membrane)으로 옮긴 후 인산화 형태의 NF-kB와 IkB 만을 인지하는 일차 항체(Cell Signaling Technology 회사에서 구입)와 대조군으로서 단백질 발현이 변화되지 않는 GAPDH 단백질을 인지하는 일차항체 (Santa Cruz technology 회사에서 구입)를 각각 5시간 반응 시킨 후, 일차항체를 인자하는 이차항체 (Cell Signaling Technology 회사에서 구입)를 1시간동안 반응시켰다. 화학형광감지 시스템 (chemiluminescence) (Amersham Pharmacia Biotechnology에서 구입)을 이용하여 X-ray 필름상에서 단백질 변화양을 분석하였다.

도 2b에 나타난 바와 같이 TNFa를 HCT116 세포에 처리하면 대조단백질인 GAPDH의 양은 변하지 않았지만, IkB와 p65/NFkB 단백질의 인산화 형태가 증가하였다. 이와 같은 결과는 TNFa가 IKK (IκB kinase) 활성을 유도하고, IKK는 NFkB 억제단백질인 IkB를 인산화시킴으로써, IkB가 단백분해됨으로써, NFkB 활성이 증가된 것을 의미한다. 이때, 본 발명의 지금초 추출물을 3, 5, 10ppm 농도로 처리해주면 TNFa에 의한 IkB와 NFkB의 인산화 증가가 나타나지 않았다. 이러한 결과를 통하여, 본 발명의 지금초 추출물은 염증반응에 의해 활성되는 NFkB를 억제시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 형광현미경을 이용한 지금초 추출물의 NF - kB 활성억제효과 분석

지금초 화합물에 의한 NF-kB 활성 억제 효과를 세포 수준에서 좀 더 알아보기 위하여, 형광 현미경을 이용하여 세포내에서 활성되어 인산화된 NF-kB 단백질 존재를 조사하였다. HCT116 세포를 커버 글라스 (cover glasss)에서 배양한 후 10 ng/ml 농도의 TNFa를 단독 처리하거나, TNFa 처리 30분전에 10ppm 농도의 지금초 추출물을 전처리 하였다. TNFa를 처리하고 10분 경과 후에 4% 포름알데하이드(formaldehyde)를 첨가하여 세포를 고정시킨 후. 2% 우혈청알부민(bovine serum albumin)이 포함된 0.1% Triton X-100 용액을 첨가하여 세포막으로 항체가 통과할 수 있도록 하였다. a-tubulin과 p65/NFkB 단백질의 인산화된 serine 468 잔기와 결합하는 일차 항체를 2시간 동안 반응한 후, a-tubulin 항체를 인지하는 녹색 형광체인 Alexa-Fluor 488가 결합된 이차항체 (Invitrogen 회사에서 구입)와 인산화된 p65/NFkB 단백질을 인지하는 적색 형광체 Alexa-Fluor 555가 결합된 이차항체 (Invitrogen 회사에서 구입) 혼합액를 30분 동안 반응시켰다. 커버글라스를 PBS 완충 용액으로 10분간 세척하고 청색 형광으로 DNA를 선택적으로 염색하는 시약 Hoechst 33258 시약 (Invitrogen 회사에서 구입)을 10분간 첨가한 후 EVOSf1 형광 현미경 (Advanced Microscopy Group 회사에서 구입)을 이용하여 관찰하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이 TNFa를 세포에 처리하면 세포질에서 a-tubulin을 표시하는 녹색 형광에는 변화가 없었지만 인산화된 p65/NFkB 단백질을 표시하는 적색 형광이 핵안에서 강하게 증가되었다. 이때, 본 발명의 지금초 추출물이 존재하면 TNFa에 의해 유도되는 적색 형광이 나타나지 않았다. 이러한 결과는 지금초 추출물은 TNFa 에 의해 활성되는 NF-kB 활성을 억제시킨다는 사실을 의미하는 것이다.

실시예 4. 역전사 - 중합효소연쇄반응 (Reverse transcription-Polymerase Chanin Reaction; RT- PCR )을 이용한 지금초 추출물의 MMP -9 mRNA 발현 억제 효과 분석

지금초 추출물의 NF-kB 활성 억제를 통하여 암전이에 중요한 NF-kB 표적 유전자 중에 하나인 MMP9 유전자의 발현이 지금초 추출물에 의해 억제되는지 확인하기 위하여 역전사-중합효소연쇄반응 (RT-PCR)을 이용하여 MMP9 유전자의 mRNA 발현양을 측정하였다. HCT116 세포에 10 ng/ml 농도의 TNFa를 단독 처리하거나, TNFa 처리 30분전에 지금초 추출물을 처리하였다. TNFa처리하고 12시간 경과 후에 세포를 수확하여 Trizol RNA extraction kit (QIAGEN 회사에서 구입)를 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 총 RNA 0.5 ㎍을 역전사반응에 의해 1차 가닥(first strand) cDNA를 합성하고 iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-RAD회사에서 구입)를 이용하여 이중나선 cDNA를 합성하였다. 이중나선 cDNA 0.0125 ㎍을 주형으로 PCR을 이용하여 MMP9 mRNA를 증폭하였다. PCR 반응은 최초 cDNA를 94℃ 5분간 가열하여 초기 변성을 시키고, 이후에는 94℃ 30 초, 55℃ 30초, 72℃ 1분간 반응을 30회 증폭하였다. PCR 반응에 사용한 프라이머 서열은 이미 알려진 염기 서열에 근거하여 다음과 같이 제작하였다. 각 실험군의 상대적양을 비교하기 위한 대조군으로 항존유전자(housekeeping gene)로 알려져 있는 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자 mRNA 양을 측정하였다. 이때 사용한 프라이머 염기 서열은 다음과 같았다.

MMP9 PCR 프라이머: sense, 5’-AGA TTC CAA ACC TTT GAG-3’; antisense, 5’-CAT TCA TCT TCC AAG GCG-3

GAPDH PCR 프라이머: sense, 5’- ACC CAC TCC TCC ACC TTT G-3’; antisense, 5’- CCC AGC AAG AGC ACA AGA G-3’

PCR 산물은 1% 한천겔(agarose gel)에 전기영동한 후 에티디움 브로마이드(ethithium bromide)로 DNA 염색을 하였다. 그 결과 도 4a에 나타난 바와 같이, TNFa에 의해 유도되는 NF-kB 표적 유전자인 MMP9 mRNA 발현양이 지금초 추출물 처리 농도 의존적으로 감소하였다. 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time polymerase chain reaction; Real-Time PCR) 은 중합효소 연쇄 반응을 기반으로 한 정량적 실험방법이다. 즉, 타겟 유전자의 증폭 정도와 발현양을 동시에 측정함으로써 정확한 mRNA 양을 측정 할 수 있는 방법이다. TaqMan-iQ supermix kit (Bio-Rad에서 구입)를 이용하여 Real-Time PCR을 수행하였다. 이 때 사용한 프라이머 염기 서열은 다음과 같았다.

GAPDH 프라이머: sense, 5’-TCGACAGTCAGCCGCATCTTC-3’; antisense, 5’-CGCCCAATACGACCAAATCCG-3’; Probe, 5’-Yakima Yellow TM-CGTCGCCAGCCGAGCCAGCCGAGCCACATCGC-BHQ-1-3’

MMP9 프라이머: sense,5’-CTTCCAGTACCGAGAGAAA-3’; antisense, 5’-GAGTGAGTTGAACCAGGT-3’; Probe, Probe 5’-Fam-CTATTTCTGCCAGGACCGCTTCTACT-BHQ-1-3’

이 결과, RT-PCR 및 Real-time PCR 두 실험 모두에서 지금초 추출물 EA분획은 TNFa로 처리한 MMP9의 발현을 현저하게 저해한 결과를 얻었다.

실시예 5. 삼차원 스페로이드 세포 배양법 (Three-dimensional spheroid cell culture)을 이용한 지금초 추출물의 암전이 억제 효과 분석

스페로이드(spheroid) 형태의 3차원 세포배양법은 생체내 암덩어리와 가장 유사하게 암전이능을 측정할 수 있는 새로운 세포배양법이다 (Santini MT and Rainaldi G, Pathobiology 1999;67:148-157). HCT116 대장암세포를 BME Cell Invasion Assay kit (Trevigen Inc., Gaithersburg, MD, USA)를 이용하여 96-well 세포배양 플레이트에서 7일간 스페로이드 형태로 3차원 배양하였다. 스페로이드 형태의 3차원 배양세포를 세포외간질 단백질 (extracellular matrix protein) 성분을 함유하는 배양액 (ECM medium)을 첨가하여 고정시킨 후, 10 ng/ml 농도의 TNFa를 단독 처리하거나, TNFa 처리 30분 전에 지금초 추출물을 처리한 실험군에서 암세포가 고정상(solid phase)의 스페로이드에서 침습(invasion)되는 정도를 디지털카메라가 장착되어있는 Eclipse TS100 microscope (Nikon Inc, NY)을 이용하여 분석하였다.

도 5에서 보는 바와 같이 아무 처리도 하지 않은 세포는 스페로이드 형태로 존재하지만 TNFa를 처리한 대장암세포는 3일 후부터 스페로이드에서 스핀들 모양으로 주변의 ECM을 뚫고 뻗어나가는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 TNFa가 3차원 스페로이드 상태로 배양된 암세포의 invasion을 촉진시키고 있음을 의미하는 것이다. 지금초 추출물은 TNFa에 의한 암세포 전이를 현저하게 감소시킨다는 사실을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 지금초 함유 효능 물질의 분리

실시예 1에서 확보한 ethyl acetate 분획이 다른 분획에 비하여 우수한 효능을 보임에 따라서 이 분획을 추가로 분석하기 위하여 분취액체크로마토그래피 (prep-HPLC)로 성분을 분석하였다. 이 때 사용한 분석장비로는 Agilent 1100 series였고, Column은 Luna C18 (10 X 250mm Ø=5㎛)이었으며 30℃에서 분석하였다. 이동상은 1% Formic acid가 첨가된 18% MeCN 수용액이었고 유속 3.0mL/min, 주입부피는 70uL였다. 분리된 성분은 UV/Vis 검출기를 사용하였고 254nm에서 검출하였다. EA 추출물은 메탄올에 녹여서 100g/L의 농도로 실험하였다. 도 6의 크로마토그램과 같은 결과를 얻었고 세 분획으로 나누어서 모은 시료를 건조하여 생물학적 효능을 시험한 결과 두 번째, 세 번째 분획이 효능을 보였기 때문에 두 번째, 세 번째 분획에서 상대적으로 양이 많은 분획을 확보하여 Eu1, Eu2, Eu3이라고 명명하였다. 이들은 각각 15mg, 20mg, 30mg을 건중량으로 얻었다.

실시예 7. 분획 물질 Eu3 의 구조규명

분취액체크로마토그래피로부터 확보한 세 분획 Eu1, Eu2, Eu3을 각각 중수소디메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide, DMSO-d6) 150 uL에 녹여서 2.5-mm NMR tube에 옮겼다. 핵자기공명분광법 (nuclear magnetic resonance spectroscopy)을 사용하여 구조를 규명하기 위하여 사용한 핵자기공명분광기 (NMR)는 Bruker 사의 Avance 400이었고 실온에서 분석하였다.

먼저 Eu3의 수소핵자기공명분광 스펙트럼은 아래 그림과 같은데 3ppm부터 4ppm 사이의 peak들로부터 당이 포함된 구조임을 알 수 있고, 5ppm 8ppm 사이의 peak들로부터 benzene ring이 포함된 것을 알 수 있다.

탄소핵자기공명 스펙트럼은 총 20개의 peak을 보여주고 있는데 115.3ppm과 131.0ppm의 두 peak은 주변의 다른 peak들에 비해서 intensity가 두배에 해당되므로 이들 두 peak은 각각 두 개의 탄소가 중첩된 epak임을 알 수 있어서 Eu3은 총 22개의 탄소로 구성된 화합물임이 확인되었다.

탄소들의 종류를 확인하기 위하여 Distortionless Enhancement by Polarization Transfer (DEPT) 실험을 수행하였고, 그 결과로부터 1개의 quartet, 1개의 triplet, 9개의 doublet, 9개의 singlet으로 구성된 것을 확인하였다.

수소핵자기공명 스펙트럼과 탄소핵자기공명 스펙트럼과 DEPT 실험 결과로부터 Eu3은 플라보노이드의 일종으로 당을 포함하는 배당체 화합물임이 예측되었다. 이를 확인하기 위하여 이차원 핵자기공명 실험들을 수행하였다. 즉, Correlated Spectroscopy (COSY), Total Correlated Spectroscopy (TOCSY), Heteronuclear Multiple Quantum Coherence (HMQC), Heteronuclear Multiple Bonded Connetivities (HMBC) 실험들을 도 10 내지 13과 같이 수행하였다.

이차원 핵자기공명 실험들로부터 도 14와 같이 수소-수소, 또는 수소-탄소 사이의 관계를 규명하여 아래 화학식 1의 구조를 도출하게 되었다.

여기서 당은 탄소핵자기공명 스펙트럼에서 얻은 chemical shift를 근거로 glucopyranoside임이 밝혀졌다. 이상의 핵자기공명분광 실험 결과들은 아래와 같이 표 1로 요약될 수 있다.

[화학식 1]

NO.	13C	DEPT	HMQC	COSY	TOCSY	HMBC	Assign
1	177.6	S	-	-	-	-	C4
2	164.3	S	-	-	-	-	C7
3	161.4	S	-	-	-	-	C5
4	160.1	S	-	-	-	-	C4'
5	156.5	S	-	-	-	-	C9
6	156.4	S	-	-	-	-	C2
7	133.3	S	-	-	-	-	C3
8	131.0 (∫=2)	D	8.04(d)	6.89	6.89	156.4/160.1	C2'/C6'
9	121.0	S	-	-	-	-	C1'
10	115.3 (∫=2)	D	6.89(d)	8.04	8.04	121.0/160.1	C3'/C5'
11	104.2	S	-	-	-	-	C10
12	101.0	D	5.46(d)	3.20	3.57/3.34/3.21/3.09	133.3	C1''
13	98.9	D	6.21(s)	6.44	6.44	93.8/104.2/161.4/164.3/177.6	C6
14	93.8	D	6.44(s)	6.21	6.21	98.9/104.2/156.5/164.3/177.6	C8
15	77.6	D	3.11(s)				C3''
16	76.5	D	3.21(s)		3.57/3.34	70.0	C4''
17	74.4	D	3.20(d)	5.46		76.5/101.0	C2''
18	70.0	D	3.09(s)	3.34	3.57	77.6	C5''
19	61.0	T	3.34(d) 3.57(d)	3.34-3.09/3.57	3.34-3.21/3.573.57-5.46/3.34/3.21/3.09	48.7/77.6	C6''
20	48.7	Q	3.17(s,3H)				6''-OCH3
21			12.61(s)			98.9/104.2/161.4	4'-OH

결과적으로 Eu3은 C22H22O11의 분자식을 가지며 예상 분자량은 462.1162 인 Kaempferol-3-O-6-OMe-glucopyranoside로 밝혀졌다. 이를 확인하기 위하여 고분해능질량분석시험 (high resolution mass spectrometry, HR/MS)을 수행하였다. HR/MS 실험은 ultraperformance liquid chromatography-hybrid quadrupole-time-of-flight MS Waters Acquity UPLC system (Waters Corp., Milford, MA)을 사용하여 수행하였다. HR/MS 실험 결과는 methoxy 기의 메틸기가 빠진 peak이 447.0961에서 관찰되었다.

실시예 8. 분획 물질 Eu2 의 구조규명

Eu2의 구조를 확인하기 위한 실험은 Eu3과 모두 동일하게 수행하였다. 도 16 내지 22는 순서대로 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, TOCSY, HMQC, HMBC 스펙트럼들이다.

이들 스펙트럼을 해석한 결과, Eu2는 Quercetin-3-O-5-OMe-arabinopyranoside로 확인되었다. Eu2의 분자식은 C21H20O11이고 분자량은 448인 화합물로 HR/MS 스펙트럼은 도 23과 같다.

실시예 9. 분획 물질 Eu1 의 구조규명

Eu1의 구조를 확인하기 위한 실험은 Eu3과 모두 동일하게 수행하였다. 도 24 내지 30은 순서대로 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, COSY, TOCSY, HMQC, HMBC 스펙트럼들이다.

이들 스펙트럼을 해석한 결과, Eu1은 Quercetin-3-O-6-OMe-glucopyranoside로 확인되었다. Eu1의 분자식은 C22H22O12이고 분자량은 478인 화합물이다.

실시예 10. 지금초 함유 물질의 효능시험

실시예 4에서 수행한 실험과 동인한 역전사-중합효소연쇄반응 (Reverse transcription-Polymerase Chanin Reaction; RT-PCR)을 이용하여 지금초로부터 분리한 세 종류 물질, 즉, Eu1, Eu2, Eu3에 대한 MMP-9 mRNA 발현 억제 효과를 분석하였다. 도 31(왼쪽은 RT-PCR 시험 결과, 오른쪽은 Real-time PCR 시험 결과)에서 보듯이 지금초 ethyl acetate (EA) 분획보다는 미약하나 TNFa를 처리한 대조군에 비해서 Eu1, Eu2, Eu3 모두 MMP9의 발현을 저해한 결과를 얻었다.

Claims (8)

1. 지금초 추출물을 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 지금초 추출물은 지금초 에틸아세테이트 추출물인 것을 특징으로 하는 암전이 억제용 약학 조성물.
3. 지금초 추출물을 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 식품 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 지금초 추출물은 지금초 에틸아세테이트 추출물인 것을 특징으로 하는 암전이 억제용 식품 조성물.
5. 캠페롤(Kaempferol)-3-O-6-OMe-글루코피라노사이드(glucopyranoside), 퀘세틴(Quercetin)-3-O-5-OMe-아라비노피라노사이드(arabinopyranoside) 및 퀘세틴(Quercetin)-3-O-6-OMe-글루코피라노사이드(glucopyranoside)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 약학 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 화합물은 지금초 추출물 유래인 것을 특징으로 하는 암전이 억제용 약학 조성물.
7. 캠페롤(Kaempferol)-3-O-6-OMe-글루코피라노사이드(glucopyranoside), 퀘세틴(Quercetin)-3-O-5-OMe-아라비노피라노사이드(arabinopyranoside) 및 퀘세틴(Quercetin)-3-O-6-OMe-글루코피라노사이드(glucopyranoside)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 암전이 억제용 식품 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 화합물은 지금초 추출물 유래인 것을 특징으로 하는 암전이 억제용 식품 조성물.
   

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