KR20170053035A

KR20170053035A - 천식 진단용 마커 조성물, 이를 포함하는 천식 진단용 키트 및 천식 진단을 위한 정보제공방법

Info

Publication number: KR20170053035A
Application number: KR1020150155287A
Authority: KR
Inventors: 장안수
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2015-11-05
Filing date: 2015-11-05
Publication date: 2017-05-15
Anticipated expiration: 2035-11-05
Also published as: KR101754490B1

Abstract

본 명세서는 클라우딘 4(Claudin-4: CLDN4)의 검출 시약을 포함하는 천식 진단용 마커 조성물, 이를 포함하는 천식 진단용 키트, 천식 진단을 위한 정보제공방법, 천식 치료 또는 예방 활성 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것으로 이는 천식을 진단하는 데 있어 유용하다.

Description

천식 진단용 마커 조성물, 이를 포함하는 천식 진단용 키트 및 천식 진단을 위한 정보제공방법{MARKER COMPOSITION FOR DIAGNOSING ASTHAMA, KIT FOR DIAGNOSING ASTHAMA AND METHOD OF PROVIDING DATA FOR DIAGNOSISING ASTHAMA}

본 명세서는 천식 진단용 마커 조성물에 관한 것이다.

천식은 전 세계 3억 명의 사람들에게 영향을 주는 만성 염증 질환이다. 천식의 증상은 만성 기도 염증과 기도 벽에 구조적 변화가 동반되는 것에 기인하여 간헐적인 기도 파괴, 기도 과민성(AHR), 폐기능 감소를 포함한다. 기도 상피는 공기를 흡입할 때 자동차 배기가스, 담배 연기, 꽃가루, 동물비듬 및 병원균으로부터 온 가스와 입자들과 같은 유독가스, 인위적이고 자연적인 입자들을 포함하는 넓은 범위의 환경 물질에 지속적으로 노출된다. 흡입된 입자를 잡는 접착력 있는 복합체와 관련 된 물리적 장벽과 점액의 분비와 관련된 화학적 장벽을 형성하는 것에 의해 이들로부터 폐의 내부 환경을 보호하는 완전히 차별화된 가성중층 점막 섬모 상피와 기관지 상피는 점막 섬모의 에스컬레이터에 의해 청소될 수 있다. 환경에 접촉한 초기 세포와 같은 기관지 상피는 병원균 또는 다른 위험한 신호들이 존재할 때 면역 감시에서 중요한 역할을 하고, 면역 이펙터 세포와 항원 제시 세포의 적절한 활성화를 하게 한다.

클라우딘은 상피와 내피의 부세포적 이온 투과성을 조절하는 접합(tight) 단백질이다. 클라우딘 4(CLDN4)는 부세포적 나트륨 배리어로서 기능을 하는 폐 폐포 상피 세포에서 발현하는 3대 주요 클라우딘 중의 하나라고 보고되어 있다. 그러나 기관지 천식과 관련하여 CLDN4의 가능한 역할은 아직 연구되지 않았다.

1. Harkness LM, Ashton AW, Burgess JK. Pharmacol Ther. 2014 Nov 20. pii: S0163-7258(14)00210-1. 2. Ebina, M., Yaegashi, H., Chiba, R., Takahashi, T., Motomiya, M., & Tanemura, M. (1990).

본 명세서가 해결하고자 하는 과제는 클라우딘 4(Claudin-4: CLDN4)의 검출 시약을 포함하는 천식 진단용 마커 조성물, 이를 포함하는 천식 진단용 키트 및 천식 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 명세서의 하나의 실시태양은 클라우딘 4(Claudin-4: CLDN4)의 검출 시약을 포함하는 천식 진단용 마커 조성물을 제공한다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 검출 시약은 상기 클라우딘 4의 발현을 핵산 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있는 것이다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 핵산 수준에서의 검출은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용하는 것일 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 단백질 수준에서 검출은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드, 보조인자 및 질량분광분석기 검출 시약으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

상기 천식 진단용 마커 조성물은, 천식 중증도 진단용 마커 조성물일 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양은 상기 조성물을 포함하는 천식 진단용 키트를 제공한다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 키트는 T-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, 바이오센서, DNA 칩, RNA 칩, 단백질 칩, 세포 칩, 면역 분석용 키트, 면역 크로마토그래피 키트, 루미넥스 어세이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트일 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양은 (a) 생물학적 시료로부터 클라우딘 4(Claudin-4: CLDN4)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 클라우딘 4의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 클라우딘 4 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 천식 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 클라우딘 4의 발현 수준을 측정하는 단계는 핵산 또는 단백질 수준에서 측정하는 것일 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 핵산 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법일 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 방법일 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 생물학적 시료는 검체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 또는 세포일 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 천식 치료 또는 예방 활성 물질의 스크리닝 방법은 폐포 상피 세포에서 클라우딘 4 단백질 발현을 조절하는지 여부를 확인하는 과정을 포함한다.

상기 천식 치료 또는 예방 활성 물질은 폐포 상피 세포에서 클라우딘 4 단백질 발현을 저해하거나 과발현을 억제하는 물질일 수 있다.

클라우딘 4는 천식 진단과 천식의 진행 정도를 나타내는 마커로 역할을 할 수 있으므로, 본 명세서의 마커 조성물, 진단용 키트 및 정보제공방법은 천식과 그 중증도를 진단하는 데 있어 유용하다. 또한, 천식 치료용 약물 스크리닝 타겟으로도 유용하다.

도 1은 천식환자의 안정 상태(STA)와 악화 상태(EXA) 사이의 혈장 클라우딘 4(CLDN4) 수준을 나타낸 것이다.
도 2는 천식 환자의 혈장 클라우딘 4(CLDN4) 수준과 폐 기능(FEV1 pred.)의 관계를 나타낸 것이다.
도 3은 천식 환자의 혈장 클라우딘 4(CLDN4) 수준과 폐 기능(FEV1/FVC)의 관계를 나타낸 것이다.
도 4는 천식 환자의 클라우딘 4(CLDN4) 수준과 호산구의 관계를 나타낸 것이다.
도 5는 천식 환자의 클라우딘 4(CLDN4) 수준과 총 IgE의 관계를 나타낸 것이다.
도 6은 오브알부민(OVA)로 민감화되고 도전 유도된 마우스에서 기도 과민성 반응(AHR)을 나타낸 것이다.
도 7은 오브알부민(OVA)로 민감화되고 도전 유도된 마우스에서 염증 반응을 나타낸 것이다.
도 8은 오브알부민(OVA)로 민감화되고 도전 유도된 마우스에서 사이토카인을 나타낸 것이다.
도 9는 폐가 오브알부민(OVA)로 민감화되고 도전받은 마우스에서 밀착 연접 단백질 클라우딘 4 (CLDN4) 의 통합이 파괴된 것을 나타낸 것이다.
도 10은 CLDN4의 발현을 나타낸 것이다.
도 11은 OVA 마우스의 폐에서 CLDN4 전사체가 증가하는 것을 나타낸 것이다.
도 12는 OVA 마우스의 폐에서 웨스턴 블롯으로 검출된 CLDN4 단백질 수준이 증가하는 것을 나타낸 것이다.
도 13은 대조군 또는 Der p1으로 처리된 NHBE에서 웨스턴 블롯에 의해 결정된 CLDN4 단백질을 나타낸 것이다.
도 14는 대조군에 비하여 NHBE에서 트랜스멤브레인 내피 전기 저항(TEER)이 감소된 Der p1을 나타낸 것이다.

이하, 본 명세서를 보다 상세하게 설명한다.

본 명세서에서 상기 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 천식 상태의 동정, 천식의 단계 결정)를 판정하는 것을 포함한다.

본 명세서에서 상기 "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커"란 천식이 발생한 개체, 조직 또는 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 검체에 비하여 질환이 발생한 조직이나 부위에서 증가 양상을 보이는 물질이다. 따라서, 정상 대조군에 비해 천식 군에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 천식을 진단하기 위한 마커는 정상 대조군의 조직에 비하여, 천식 군의 조직에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 클라우딘 4 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.

상기 "검출"은 정량적 검출 또는 존재여부 수준에서의 검출을 모두 포함하는 것으로, 천식의 발병 및 진행에 대한 지표가 될 수 있으며, 발병, 질환의 진행, 질환의 진단 또는 예후에 이용될 수 있다.

또한 상기 검출은 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지된 것으로서, 후술하는 바와 같이 검출시약을 이용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 조성물에 포함되는 검출 시약은 클라우딘 4를 핵산, 예를 들면 DNA 또는 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 정량적으로 또는 그 존재 여부의 판단을 검출할 수 있는 물질이다.

상기 용어 "핵산"은 단일쇄 또는 이중쇄 형태의 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 상기 용어는 천연 뉴클레오티드의 공지의 유사체를 함유한 핵산을 포괄한다. 상기 용어 핵산은 유전자, DNA, RNA, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드 프라이머, 프로브 및 증폭 생성물과 상호 교환적으로 사용된다. 이 용어는 또한 DNA 골격 유사체, 예를 들어, 포스포다이에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 알킬 포스포트라이에스테르, 설파메이트, 3'-티오아세탈, 메틸렌(메틸이미노), 3'-N-카르바메이트, 모르폴리노 카르바메이트, 및 펩티드 핵산(PNA)을 포괄한다. 올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 30개 미만의 뉴클레오티드를 갖는 핵산 분자를 말한다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 핵산 수준에서의 검출은 핵산의 발현양을 측정하여 천식을 진단하는 것으로 예를 들어, 생물학적 시료에서 클라우딘 4의 mRNA 발현정도를 확인하기 위해 mRNA에 대한 프라이머 또는 프로브를 이용하여 측정할 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 이용한 방식이 사용될 수 있다. 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다.

상기 mRNA의 존재 여부와 그 발현양 또는 패턴을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로, 예를 들면 클라우딘 4의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라미어 또는 프로브를 포함할 수 있다.

상기 용어 "프라이머"는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다.

본 명세서의 하나의 실시태양은 검출시약으로 본원에 따른 클라우딘 4 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적인 상보적 서열을 갖는 프라이머 세트를 포함할 수 있다. 상기 클라우딘 4 단백질 및 그 핵산 서열은 공지된 것이며, 이의 기능적 동등체를 포함하는 것으로 당업자라면 각 유전자의 검출을 위한 특이적인 프라이머, 프로브 등을 제작할 수 있을 것이다.

본 명세서의 하나의 실시태양에 따르면 클라우딘 4 유전자의 mRNA의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 천식을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.

상기 용어 "프로브"란 mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는, 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에 따르면 클라우딘 4의 폴리뉴클레오티드의 mRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현 양을 측정함으로써 천식 여부 및 정도를 측정할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.

상기 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서, 상기 단백질 수준에서 검출은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 수용체, 리간드, 보조인자 및 질량분광분석기 검출 시약으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 클라우딘 4와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)과 함께 사용될 수 있다. 또한 본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 형광물질과 같은 발색물질과 컨쥬게이션된 것일 수 있다.

상기 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 구체적으로, 항체는 클라우딘 4 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기 "특이적 결합"의 의미는 항체가 그것의 표적 단백질인 클라우딘 4와 항원-항체 결합체를 형성하고, 다른 단백질과는 실질적으로 그러한 결합체를 형성하지 않는 경우를 의미한다. 상기 "특이적 결합"의 의미는 달리 표현할 경우 그 결합이 단백질의 특정 구조 즉 항원의 결정 부위인 에피토프에 의해서 결정되는 결합이라고 표현될 수도 있다. 여기서 "실질적으로"란 정도는 낮지만 비특이적인 결합체는 형성될 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 비특이적인 결합은 특이적 결합의 분석, 정량을 위한 전처리 과정에서 제거될 수 있다.

상기 "에피토프"란, 클라우딘 4에서 항원성 또는 면역원성을 갖는 부분의 아미노산 영역(항원 결정기)을 가리킨다. 에피토프는 통상 적어도 적어도 10개 아미노산을 포함할 것이다. 이러한 에피토프는 당업계의 공지, 관용된 에피토프 해석법 예컨대, 파시 제시(phage display)법, 역면역유전학(reverse immunogenetics) 등에 의해서 동정할 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 단백질 수준에서의 검출은 천식을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 클라우딘 4 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 단백질의 양을 측정하여 이루어진다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 발광 면역 측정법, 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 또는 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 효소면역측정법에는 퍼옥시다제(POD), 알칼리포스파타제, ?-갈락토시다제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스옥시다제, 락트산 탈수소 효소, 아밀라제 또는 비오틴-아비딘 복합체 등의 효소가 사용될 수 있고, 형광면역 측정법의 경우에는 플루오레세인이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트, 치환 로다민 이소티오시아네이트, 디클로로트리아진이소티오시아네이트, 알렉사(Alexa) 또는 알렉사플루오로(AlexaFluoro) 등의 형광성 물질 또는 형광단이 사용될 수 있으며, 방사 면역 측정법에는 트리티움, 요오드(¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ¹²¹I), 인(³²P), 황(³⁵S), 금속류(예를 들면, ⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ge, ⁵⁴Mn, ⁹⁹Mo, ⁹⁹Tc, ¹³³Xe 등) 등의 방사성 동위원소가 사용될 수 있으며, 발광 면역 측정법에는 루시퍼라제 방법, 루미놀 퍼옥시다제 POD 방법 등이 디옥세탄 화합물 등의 발광성 물질 등과 함께 사용될 수 있다.

표지 물질과 항체의 결합은 효소 면역 측정법에 있어서는 글루타르알데히드법, 말레이미드법, 피리딜디술피드법, 과요오드산법 등의 방법이 사용될 수 있으며, 방사 면역 측정법에 있어서는 클로라민T법, 볼턴-헌터법 등의 방법이 사용될 수 있다.

상기 폴리클로날 항체는, 조류(예를 들면, 닭 등), 포유 동물(예를 들면, 토끼, 염소, 말, 양, 쥐 등) 등의 동물에 클라우딘 4를 면역시킴으로써 제조할 수 있다. 항체는 면역된 동물의 혈액으로부터 당업계의 공지 또는 관용된 방법 예컨대 이온교환크로마토그래피, 친화도-크로마토그래피 등의 방법을 사용하여 정제할 수 있다.

상기 모노클로날 항체는 클라우딘 4에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에 의해서 얻어질 수 있다. 이러한 하이브리도마 세포주를 생산하기 위한 방법으로서, 예컨대 동물(예컨대, 마우스)을 클라우딘 4로 면역시키고, 그 면역시킨 동물로부터 비장 세포를 채취하고, 그 비장세포를 골수종 세포주에 융합시키고, 그에 따라 하이브리도마 세포를 생성하고, 그리고 목적으로 하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 동정하는 방법을 들 수 있다. 그러한 세포주로부터 모노클로날 항체의 분리, 회수는 당업계의 공지, 관용기술에 의해서 가능하다.

이러한 모노클로날 항체의 제조 방법에 대해서 보다 자세히 살펴보면, 먼저 모노클로날 항체를 얻기 위해서는 면역원인 클라우딘 4를 포유동물, 예를 들면 랫드, 마우스, 토끼, 원숭이, 염소 등에 투여할 필요가 있다.

면역원의 1회 투여량은 당업자가 면역 동물의 종류, 투여 경로 등을 고려하여 그의 통상의 능력 범위 내에서 적절하게 결정할 수 있다. 통상은 동물 1 마리당 약 50 내지 200 ㎍일 것이다. 투여는 통상 면역원을 PBS(phospate-buffered saline)나 생리 식염수 등으로 적당량 희석, 현탁시키고 통상의 어쥬번트를 혼합하고 유화한 후에 피하, 복강 내에 주입함으로써 행해질 수 있다. 이러한 투여는 처음의 투여 후 수일에서 수주 간격으로, 바람직하게는 1 내지 4주간 간격으로 2 내지 10회, 바람직하게는 3 내지 4회에 걸쳐 이루어질 것이다. 면역원의 투여를 계속하면서 ELISA 방법 등에 의해서 면역 동물의 혈청 중 항체가를 측정하여 항체가가 정점(plateau)에 도달했을 때는, 최종적으로 면역원을 정맥 내 또는 복강 내에 투여하고, 그 최종 투여일로부터 2 내지 5일 후에 항체 생산 세포를 채취한다. 항체 생산 세포로는 비장 세포, 림프절 세포, 말초혈 세포 등을 들 수 있지만, 비장 세포 또는 림프절 세포가 바람직하다. 항체 생산 세포를 채취한 후에는 투여된 면역원 즉 클라우딘 4에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제조한다. 이러한 하이브리도마는 당업계의 공지, 관용 기술에 의해서 생산하고 동정하는 것이 가능하다. 통상은 항체 생산 세포 바람직하게는, 비장 세포를 면역된 동물로부터 채취하고, 그 비장 세포를 골수종 세포주에 융합시켜 하이브리도마 세포를 제조하며, 면역원에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 동정하는 단계를 거치게 될 것이다. 항체 생산 세포와 융합되는데 사용되는 골수종 세포주는 마우스 등의 동물로부터 유래한 세포주를 사용할 수 있는데, 이러한 세포주는 상업적으로 입수 가능하다. 바람직한 골수종 세포주는 면역 동물과 동종계의 동물에서 유래하고, 항생제 등에 대한 약제 선택성을 지니며, 비장 세포와 융합되지 아니한 상태로는 히포크산틴, 아미노푸테린 및 티민을 포함하는 HAT 선택 배지에서 생존할 수 없고 비장 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 특성을 지니는 것이 바람직하다. 골수종 세포주의 구체적인 예로서는 BALB/c 마우스 유래의 HGPRT(hypoxantine guanine phosporibosyl-transferase) 결손 세포주인 P3X63(ATCC TIB9) 등을 들 수 있다.

항체 생산 세포인 비장 세포와 골수종 세포주의 융합은 혈청을 포함하지 않는 DMEM, RPMI-1640 배지 등의 동물 세포 배양용 배지 중에서 항체 생산 세포와 골수종 세포주를 적정한 비율(약 1:1 내지 20:1의 비율)로 혼합하고, 세포 융합 촉진제의 존재하에서 융합 반응을 수행함으로써 이루어지게 된다. 세포 융합 촉진제로서 평균 분자량 1500 내지 4000 달톤의 폴리에틸렌글리콜 등을 약 10 내지 80 %의 농도로 사용할 수 있다. 또한 경우에 따라서는 융합 효율을 높이기 위해서, 디메틸술폭시드 등의 보조제를 병용할 수도 있다. 또한 시판되고 있는 세포 융합 장치를 이용하여 융합시킬 수도 있다. 세포 융합 처리 후, 목적으로 하는 하이브리도마를 선별하여야 한다. 통상 세포 현탁액을 우태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등으로 적당히 희석한 후, 마이크로타이터 플레이트 상에 세포를 웰당 200만개 정도로 분주하고, 각 웰에 선택 배지를 첨가하고, 이후 동일한 선택 배지로 적절히 교환하여 줌으로써 신선한 배지를 공급하며 배양한다. 배양 온도는 통상 20 ℃ 내지 40 ℃이다. 골수종 세포주가 HGPRT 결손주 또는 티미딘 키나제 결손주인 경우에는 히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘을 포함하는 선택 배지(HAT 배지)를 이용함으로써, 항체 생산 세포와 골수종 세포주의 하이브리도마만을 선택적으로 배양하고 증식시킬 수 있다. 그러면 선택 배지에서 배양 개시 후 약 14일 전후에서 생육되는 세포를 하이브리도마로서 얻을 수 있다. 이어서, 증식된 하이브리도마의 상등 배양물에서 목적으로 하는 항체의 존재 여부를 스크리닝한다. 이러한 하이브리도마의 스크리닝은 당업계의 공지, 관용 기술에 따라 이루어질 수 있다. 그러한 기술로서 예컨대, 효소 면역 측정법(EIA: Enzyme Immuno Assay 및 ELISA), 방사 면역 측정법 등을 들 수 있다. 융합 세포의 클로닝은 한계 희석법(limiting dilution method) 등에 의해 이루어질 수 있다.

클로닝된 하이브리도마는 10% 우태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, DMEM 배지, 무혈청 배지 등 동물 세포 배양 배지에서 통상의 배양 조건(예를 들면, 37 ℃, 5 % CO₂ 농도)에서 배양하면 된다. 배양 기간은 2 내지 10일 정도이다. 모노클로날 항체는 그 상등 배양물로부터 수득할 수 있다. 모노클로날 항체는 당업계의 공지, 관용 기술을 사용하여 회수할 수 있다. 그러한 당업계의 공지, 관용 기술로서는 황산암모늄 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법 또는 이들을 조합한 방법 등을 들 수 있다.

상기 모노클로날 항체의 생산에는 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여 적당한 벡터에 삽입시키고 이를 적당한 숙주세포에 도입, 발현시켜 수득하는 유전자 재조합 기술을 이용할 수도 있다.

구체적으로 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 본 발명의 항체의 가변 영역을 암호화하는 mRNA을 수득한다. 그 mRNA의 수득은 당업계의 공지, 관용된 방법, 예를 들어 구아니딘 초원심분리법, AGPC법 등을 사용하여 전체 RNA를 수득하고 그 전체 mRNA로부터 mRNA Purification Kit(Pharmacia 사) 등을 사용하여 목적하는 mRNA를 수득함으로써 이루어진다. 대안적으로는 QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia사 제품)을 이용함으로써, mRNA를 직접 수득할 수도 있다. 수득된 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체 V 영역의 cDNA를 합성한다. 필요하다면 cDNA 합성, 증폭에 RACE PCR 방법 등을 적용할 수도 있다. 이렇게 얻어진 가변 영역을 암호화하는 cDNA를 항체의 불변 영역(C 영역)을 암호화하는 DNA를 함유하는 발현 벡터에 삽입한다. 이러한 발현 벡터는 클라우딘 4의 DNA 재조합 생산 방법과 관련하여 후술하는 바와 같이 프로모터, 인핸서, 복제 개시점, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜 결합 부위 등 조절서열을 포함할 수 있다. 이 발현벡터가 숙주 세포에 형질전환되면 항체의 생산이 가능하게 된다. 항체 유전자의 발현은 항체 중쇄(H쇄) 또는 경쇄(L쇄)를 암호화하는 DNA를 각각 발현벡터에 재조합하여 숙주세포를 동시 형질전환시켜도 무방하며, 또는 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA를 단일의 발현벡터에 삽입하여 숙주세포를 형질전환시켜도 무방하다.

한편, 상기 항체를 얻기 위하여 사용한 면역원으로서의 클라우딘 4는 당 업계의 공지, 관용된 DNA 재조합 기술에 의하여 얻을 수 있다. 통상적으로는, 클라우딘 4의 cDNA를 제작하고 그 cDNA를 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 형질전환시키고 그 형질전환된 숙주 세포를 적당한 배지에서 배양하고, 그 배양액 또는 세포로부터 얻게 될 것이다. 상기 cDNA는 GenBank, RefSeq, Entrez Gene, UniProtKB, Swiss-Prot 등의 유전자/단백질 테이터베이스가 제공하는 유전자 서열 또는 본 명세서가 제공하는 서열에 기초하여 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 제작 가능하다. 이러한 cDNA의 제조에는 포스포아미다이트법 등을 이용하는 DNA 합성 장치, RT-PCR 법, cDNA 라이브러리로부터 목적하는 cDNA를 얻기 위한 혼성화 방법 등이 사용될 수 있고, 필요에 따라서는 PCR 방법 등에 의해서 목적하는 cDNA를 증폭할 수도 있다.

상기에서 발현 백터는 생명공학 회사 예컨대 노바겐(Novagen) 사, 다까라슈죠 사, 키아겐(Qiagen)사, 스트라타진(Stratagene) 사, 프로메가(Promega) 사, 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnositics) 사, 인비트로겐(Invitrogen) 사, 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute)사 등으로부터 상업적으로 입수 가능하다.

이러한 발현 벡터에는 상기 클라우딘 4를 코딩하는 DNA 이외에 조절 엘리멘트, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜, 결합 부위, 복제 개시점, 터미네이터, 선택 마커, 단리, 정제를 용이하게 하기 위한 표지 펩티드 서열(예컨대 히스티딘 반복 서열을 암호화하는 염기서열) 등이 포함될 수 있다. 숙주 세포는 세균 등의 원핵 세포(예를 들면 대장균, 고초균), 및 효모(예를 들면 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)), 곤충 세포(예를 들면 Sf 세포), 포유 동물 세포(예를 들면 COS, CHO, BHK) 등의 진핵 세포를 사용할 수 있다. 숙주 세포 또는 그 배양물로부터 클라우딘 4의 정제에는 한외 여과, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피(표지 펩티드가 결합된 경우), HPLC, 소수성 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피 등의 방법이나 이들을 조합하는 방법이 사용될 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 항체를 생산하기 위한 면역원으로서의 클라우딘 4는 그 단편이 사용될 수도 있다. 단편을 사용하여 얻어지는 항체도 클라우딘 4에 특이적으로 결합하는 능력을 보유할 것이 때문이다.

상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, 바이오센서, DNA 칩, RNA 칩, 단백질 칩, 세포 칩, 면역 분석용 키트, 면역 크로마토그래피 키트, 루미넥스 어세이 키트, 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트일 수 있다.

상기 키트는 클라우딘 4의 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 천식의 진단을 할 수 있다. 상기 키트에는 천식 진단을 위한 프라이머, 프로브, 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치가 더 포함될 수 있다.

상기 "어레이" 또는 "마이크로어레이" 또는 "바이오칩" 또는 "칩"은 복수의 고정된 표적 요소를 포함하는 제조 물품 또는 장치를 말하며, 각각의 표적 요소는 고상 표면에 고정된 특정 조성물, 예를 들어, 핵산 분자 또는 폴리펩티드 등의 생물학적 분자를 포함하는 "클론(clone)", "특징부(feature)", "스팟(spot)" 또는 한정된 영역을 포함한다.

상기 키트는 클라우딘 4의 발현량을 정량적 또는 정성적으로 확인할 수 있는 면역학적 방법에 사용되는 2차 항체(예컨대 클라우딘 4의 발현량을 검출할 수 있는 형광 색소 등으로 표지된 클라우딘 4에 대한 항체), 담체, 세정 버퍼, 시료 희석액, 효소 기질, 반응 정지액 등을 포함할 수 있다. 상기 키트는 바람직하게는 정량적 또는 정성적으로 검출된 클라우딘 4의 발현 수준으로부터 천식의 유무, 천식의 진행 정도, 천식의 치료 경과 등의 판별을 교시하는 설명서를 포함할 수 있다.

상기 클라우딘 4의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

상기 키트는 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 마이크로어레이 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있으며, 클라우딘 4를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이를 제작하기 위해서, 상기 탐색된 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

상기 프로브는 고체 지지체(기질)에 고정될 수 있는데, 여기서, "기질"은 물질, 구조, 표면 또는 재료, 비생물학적이고, 합성되고, 무생물, 평면, 구형 또는 특이적 결합, 평편한 표면의 물질을 포함하는 혼합물 수단으로, 하이브리다이제이션 또는 효소 인식 부위 또는 대다수의 다른 인식 부위 또는 표면, 구조 또는 재료로 구성된 수많은 다른 분자 종을 넘어서는 수많은 다른 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 기질은 예를 들면, 반도체, (유기)합성 메탈, 합성 반도체, 인슐레이터 및 도판트; 금속, 합금, 원소, 화합물 및 미네랄; 합성되고, 분해되며, 에칭되고, 리소그라프되며, 프린트되고 마이크로패브리케이트된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 산업적, 폴리머, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속 및 세라믹; 나무, 종이, 카드 보드, 면, 울, 천, 직조 및 비직조 섬유, 재료 및 패브릭일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서의 하나의 실시태양은 (a)생물학적 시료로부터 클라우딘 4(Claudin-4: CLDN4)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b)상기 클라우딘 4의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 클라우딘 4 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 천식 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 핵산 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법일 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 방법일 수 있다.

본 명세서의 하나의 실시태양에서 상기 생물학적 시료는 검체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 또는 세포일 수 있고, 구체적으로는 혈장, 혈청, 전혈일 수 있다.

상기 검체는, 비교 분석을 위해, 진단이 필요한 대상체의 검체는 물론, 정상 대조군, 특정 질환을 갖는 대조군 유래의 검체가 사용될 수 있다.

상기 스크리닝 방법을 이용하면 클라우딘 4 단백 발현 여부를 확인하는 방법으로 효과적으로 천식의 치료 또는 예방에 활성을 가지는 물질을 탐색할 수 있다.

이하, 본 명세서를 하기 제조예 및 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예 및 실험예는 본 명세서를 예시하는 것일 뿐, 본 명세서의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니라, 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 명세서의 개시가 완전하도록 하고, 본 명세서가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명세서의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

<실험예>

1. 천식 환자의 모집

50명의 천식환자들을 모집하였고, 6.6±3.6년 동안 앓았고, 혈장 클라우딘 4 수준을 안정 상태와 악화 상태에서 결정하였다. 8마리의 BALB/c 마우스를 염분(대조군) 또는 OVA 에 노출시켰다. 폐 CLDN4 mRNA와 단백질, 폐 히스토리, 브론코알베올라(bronchoalveolar) 세척(BAL)의 측정을 포함하여 상세히 분석하였다. 정상 인간의 기관지 상피 (NHBE) 세포에서 나온 세포 라인으로 추가 테스트를 수행하였다. 환자에 대한 연구는 순천향 대학교의 제도적 검토 위원회에 의해 승인되었다. 동물 연구는 순천향 대학교의 제도적 동물 치료와 사용 위원회에 의해 승인되었다.

우리는 한국에서 알레르기 및 호흡기 질환을 위한 게놈 연구 센터의 천식 코호트(cohort)에 등록된 50명의 천식 환자의 임상 데이터를 연구하였다. 모든 환자들은 순천향 대학교 부천 병원에서 모집하였다. 천식 진단은 GINA 지침을 기초로 하였다. 천식의 임상 진단을 가진 모든 피검자들은 아래 기준 중 하나 이상에 의해 지지되었다.

1) 14일간을 넘어서 20% 초과하는 매일의 최대 피크 호흡 흐름의 가변성

2) 알부테롤(albuterol) 200-400μg을 흡입한 후에 15% 초과의 FEV1 증가

3) 밀리리터당 10mg 이하의 흡입된 메타콜린(PC20 methacholine) 자극 농도에 반응한 FEV1에서의 20% 감소

모든 피검자들은 유도된 타액 시료의 분석, 차등계수와 함께 전혈구 세포 계수 측정, IgE 측정, 가슴 전후 자기방사기록법(posteroanterior radiography), 알레르기 피부 따가움 테스트, 폐활량측정법을 포함하여 정규화된 측정이 수행되었다. 모든 데이터는 천식 약물치료의 처방이전 진단의 시기에 수집되었다. 병원의 천식 코호트 중에서, 나이, 성별, BMI로 정상 대조군과 매칭된 천식환자 연구를 위해 선택되었다. 정상 대조군 피검자는 환자의 배우자 또는 호흡기 증상과, 80%가 넘는 FEV1 값, 10 mg/mL 넘는 PC20 메타콜린, 단순 가슴 방사선 사진 중 정상 결과를 갖는 다른 알러지 질환에 관한 스크리닝 질문에 부정적으로 대답한 일반 집단에서 모집하였다. 2년 이상 기간의 정기적인 팔로우업을 거친 피검자들 중에 50명의 환자들이 GINA 지침으로 진단되었다.

천식 악화(Asthma exacerbation)는 호흡 곤란, 기침, 헐떡임, 흉부 압박 또는 이들의 복합 증상의 점진적 증가 상황 및 호흡 흐름의 감소가 동반되며, 천식으로 병원이나 응급대원 방문시에 체계적인 코르티코이드가 요구될 때 정제, 현탁액 또는 주사의 형태로 체계적으로 코르티코이드를 사용하거나, 적어도 3일 이상 안정적인 함량 유지로 증가시키는 경우로 지나(GINA: 천식에 대한 글로벌 지침)에 의해 정의되었다. 본 연구는 순천향 대학교의 제도 검토 위원회에 의해 승인되었다.

2. 세포 배양

초기 NHBE 세포(Lonza, 바젤, 스위스)(시딩(seeding) 밀도:3000cells/cm²)를 BEGM™ BulletKit™(Lonza)를 사용한 T-flasks에서 37^oC; 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포가 90% 융합에 도달할 때까지 48시간마다 배지를 교체하였다. 그 세포를 6웰 플레이트에서 시딩(seeding)하였다. 실험 24시간 전에 4, 8, 또는 24시간 동안 10μg/ml의 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronyssinus) 제품 1(Der p1)로 처리하여 둔 0.1% 우혈청 세럼(FBS)로 EBM-2 기본 배지로 교체하였다.

3. 트랜스멤브레인 -내피 전기 저항( TEER ) 측정

8 x 10³ cells/ml로 처음 시딩된 HLMVE 세포에서 융합막(tight junction)형성을 TEER을 사용하여 측정하였다. 이들은 4, 8, 또는 24시간 동안 Der p1으로 처리하였다. TEER는 EVOM 미터(World Precision Instruments, FL)를 사용하여 매주 측정하였다.

4. 실험 동물

수산화 알루미늄 10mg에 Delbecco의 인산염 완충 식염수(D-PBS) 100μl을 더하여 유화시킨 V등급 치킨 에그 OVA(Sigma-Aldrich, St Louis, MO) 50μg을 0일과 14일에 복강내 주사(IP)로 6주된 암컷 BALB/c 마우스를 민감하게 만들었다. 21일부터 23일까지 모든 마우스는 D-PBS 50 μl에서 grade III OVA (Sigma-Aldrich) 150μg으로 비강내 어려움(I.N)을 겪었다. 대조군 마우스는 민감화되어 염분으로 어려움을 겪었다. 24일에 기도과민성이 측정되었고 기관지폐포세척액(BALF)가 수집되었고, 폐 조직은 단백질, RNA, 헤마톡실린과 이오신 염색(H&E stain) 및 공초점 영상으로 처리되었다.수산화 알루미늄 10mg에 Delbecco의 인산염 완충 식염수(D-PBS) 100μl을 더하여 유화시킨 V등급 치킨 에그 OVA(Sigma-Aldrich, St Louis, MO) 50μg을 0일과 14일에 복강내 주사(IP)로 6주된 암컷 BALB/c 마우스를 민감하게 만들었다. 21일부터 23일까지 모든 마우스는 D-PBS 50 μl에서 grade III OVA (Sigma-Aldrich) 150μg으로 비강내 어려움(I.N)을 겪었다. 대조군 마우스는 민감화되어 염분으로 어려움을 겪었다. 24일에 기도과민성이 측정되었고 기관지폐포세척액(BALF)가 수집되었고, 폐 조직은 단백질, RNA, 헤마톡실린과 이오신 염색(H&E stain) 및 공초점 영상으로 처리되었다.

5. AHR, BALF, 형태분석법

2.5 mg/kg 틸레타민(tiletamine)과 자이라진(xylazine) Zoletil and lumpum; Bayer Korea Co., Seoul, Korea)로 마우스를 마취시켜서 메타콜린 0, 5, 20, 또는 100 mg/ml로 처리하여 AHR을 측정하였다. 다음날 BALF가 얻어졌고, 원심분리하여 상층액을 저장하였다. 세포 펠렛은 세포 카운트동안 재현탁되었고, 세포미분(500 cells/mouse, Diff-Quick-staining)하는 동안 세포원심분리기 슬라이드를 만들었다. 폐조직은 4% 인산완충된 파라포름알데히드에 고정되었고, 파라핀으로 포매되어 4μm으로 섹션화되고 H&E 염색법으로 염색되었다.

6. RNA 추출 및 정량적 실시간 PCR ( qRT - PCR )

RNA는 TRI REAGENT (Molecular Research Center, Cincinnati, OH) 을 사용하여 동정하였다. 마우스 폐 RNA에 대하여, Superscript III을 가진 3 μg RNA와 제1가닥 합성 superMix (Invitrogen)로부터 cDNA가 준비되었다. qRT-PCR System (StepOne, Life Technologies)으로 Power SYBR Green PCR Master Mix를 사용하여 qRT-PCR이 수행되었다. 다음과 같이 확장을 위해 프라이머가 사용되었다. 마우스 CLDN4 (포워드: GGAGGGCCTCTGGATGAACT, 리버스 GATGCTGATGACCATAAGGGC), 마우스 베타-액틴(포워드: ACGTTGACATCCGTAAAGA, 리버스: GCCACGTTGACATCCGTAAAGA). 관련 CLDN4 전사 수준은 베타-액틴으로 정규화된 2-ΔΔCt 방법에 따라 계산되었다.

	정방향 프라이머	역방향 프라이머
마우스 CLDN4	GGAGGGCCTCTGGATGAACT	GATGCTGATGACCATAAGGGC
마우스 베타-액틴	ACGTTGACATCCGTAAAGA	GCCACGTTGACATCCGTAAAGA

7. 면역형광법 염색

마우스 폐 섹션을 파라핀을 제거하고 에탄올 시리즈에서 다시 수화하였다. 섹션을 1.5% 정상 혈청으로 비특이적 바인딩시켜 블록시키고, Alexa Fluor 488-conjugated Donkey polyclonal anti-Rabbit IgG (1:1000 Abcam Inc., Cambridge, MA)로 CLDN4 (1:400, Abcam Inc., Cambridge, MA)로 배양하였고, 핵을 DAPI (1:1000, Invitrogen)으로 대비 염색시켰다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 카메라를 사용하는 ×40 대물렌즈를 가진 LSM 510 META과 ×20을 가진 6400 (Carl Zeiss Microsystems, Thornwood, NY)에서 형광 현미경을 사용하여 공초점 레이저 현미경을 수행하였다. 섹션을 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 관찰하고 제이스 LSM 이미지 브라우저를 사용하여 이미지를 생성시켰다.

8. 면역조직화학

마우스 폐 섹션에서 파라핀을 제거하고 에탄올 시리즈로 다시 수화하였다. 엔도제너스 퍼옥시다체를 블록하기 위해 30분 동안 메탄올에서 1.4% 과산화수소로 섹션을 처리한 후에 1.5% 말혈청으로 비특이적 결합으로 블록킹하고 항-토끼 CLDN4 (1:200, Abcam Inc.)로 배양하였다. 다음날, ABC 키트(Vector Laboratories, Burlingame, CA)에서 섹션을 배양하였다. 리퀴드 DAB+ 기질 키트(Golden Bridge International Inc, Mukilteo, WA)로 염색하여 컬러반응을 하게 하였다. 면역조직화학 염색 후에 1분 동안 Herris’s 헤마톡실린으로 슬라이드를 대비 염색시켰다.

9. 웨스턴 블랏

증류수에 50 mM Tris-HCL (pH 7.4), 50mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 0.5 mM EDTA, 및 100mM PMSF을 포함하는 단백질 용해 용액에서 추출된 폐 조직을 균질화하고, 4°C에서 30분 동안 14000 rpm으로 원심분리하고, 불용성 물질을 수집하였다. 각 샘플에서 얻은 30 ug 단백질을 15% 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 젤에서 로딩시켰다. 분리된 단백질을 80V 에서 2시간 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전이시켰다. 1시간 동안 실온에서 멤브레인을 블로킹하고 나서, 4°C에서 밤새 적절한 희석액에서 CLDN4 (1:100, abcam, UK)에 1차 특이적 항체로 배양하였다. 1시간 동안 염소 항-토끼 항체로 실온에서 멤브레인을 배양하고 나서 ECL 플러스 케미루미네슨스 시약 (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ, USA)로 블롯을 검출하였다. 정량적 농도계 데이터로 결정된 단백질의 상대적 양을 베타-액틴(Sigma-Aldrich)로 표준화하였다.

10. ELISA(효소 결합 면역 침강 분석법)

CLDN4(USCN)과 BALF에서 인터류킨 4(IL-4), 인터류킨 5(IL-5), 인터류킨 13(IL-13)와 같은 염증성 매개자들, 환자들의 혈장을 ELISA(R&D System, Minneapolis, MN)에 의해 측정하였다. 다른 플레이트로부터 얻은 결과를 비교하기 위해, 테스트 샘플 OD들은 각 키트에서 공급된 포지티브와 네거티브 대조군 샘플에 비교하여 조정하였다. 중복되는 웰의 평균 OD를 계산하였다. 각 테스트된 혈청의 인덱스 값은 다음 공식(인덱스 = (테스트된 혈청의 OD-네거티브 대조군의 OD)/(포지티브 대조군의 OD-네거티브 대조군의 OD) ×100)으로 한정되었다. 낮은 검출 한계는 2 또는 7 pg/ml, 제조자의 권고를 기준으로 각각 IL-4 또는 IL-5 또는 IL-13 또는 CLDN4에 대하여 0.066 ng/ml에서 세팅되었다.

11. 통계적 분석

데이터는 평균±평균의 표준 오차(SEM)으로 표현되고, 그룹 간 중요한 차이를 결정하기 위해 만 휘트니(Mann-Whitney ) U 테스트를 사용하였다. p< 0.05의 값은 통계적 중요성을 나타내는 것으로 간주되었다.

< 실시예 1> 천식 환자에서의 클라우딘 4의 변경(alteration)

50명의 천식 환자 (평균 나이 ± SD, 54.9 ± 14.1 yr)와 25명의 대조군 피검자(평균 나이 ± SD, 58.3 ± 6.2 yr)는 표 1에서 모집되었다. 천식 환자들의 초기 FEV1 % pred., FVC % pred., 및 FEV1/FVC는 대조군 피검자들에 비해 훨씬 낮았다. 천식 환자들 중 총 IgE 및 앳포이(atpoy), 혈액 호산구 비율은 대조군 피검자들에 비해 훨씬 높았다. 체질량 인덱스(Body mass index)는 천식 환자와 대조군 피검자 사이에 다르지 않았다. 천식 기간은 6.63 ± 3.60 yr이었고, 팔로우 업 동안 매년 악화율은 3.38 ± 3.24 (rate/yr)이었다.

악화된 천식환자들의 FEV1 % pred., FVC % pred., 및 FEV1/FVC는 대조군 천식환자보다 낮았다. 악화된 천식환자들의 혈액 호중구 비율이 대조군 천식환자보다 훨씬 높았다.

기관지 천식 환자들의 평균 혈장 CLDN4 수준은 건강한 대조군에서 0.041±0.005ng/ml과 0.022±0.003 ng/ml이었다(도 1). 악화된 천식환자들의 평균 플라즈마 CLDN4 수준은 0.057 ± 0.007 ng/ml이었고, 기관지 천식을 가진 대조군 환자들에서는 0.041 ± 0.005 ng/ml이었다(도 1). 기관지 천식의 대조군 환자들(도 1, P< 0.001) 에 비해 악화된 환자들의 혈장 CLDN4 수준이 훨씬 높았다. 건강한 대조군(도 1, P< 0?001) 에 비해 기관지 천식을 가진 대조군 환자들의 혈장 CLDN4 수준이 훨씬 높았다. 도 1은 천식환자의 안정 상태와 악화 상태 사이의 혈장 클라우딘 4(CLDN4) 수준을 나타낸 것이다. (*p<0.001, control vs. stable, # p<0.001 Stable vs. exacerbated state.)

도 2와 도 3은 천식 환자의 혈장 클라우딘 4(CLDN4) 수준과 폐 기능 (FEV1 pred. and FEV1/FVC)의 관계를 나타낸 것이다.(*p<0.001, control vs. stable, # p<0.001 Stable vs. exacerbated state.)혈장 CLDN4 수준은 FEV1 % pred.(r=-0.245, P=0.006, 도 2) 및 FEV1/FVC (r=-0.251, P=0.005, 도 3)과 관련이 있었다.

도 4와 도 5는 천식 환자의 클라우딘 4(CLDN4) 수준, 호산구, 총 IgE 의 관계를 나타낸 것이다. 혈장 CLDN4 수준은 호산구(r=0.213, P=0.035, 도 4) 및 총 IgE (r=0.284, P=0.001, 도 5)와 관련이 있었다.

< 실시예 2> 마우스에서 OVA로 유도된 염증, 사이토카인, AHR

OVA로 민감화되고 도전받은 마우스들은 대조군 마우스에 비하여 AHR이 증가하였다(도 6). OVA로 민감화되고 도전받은 마우스들은 대조군 마우스에 비하여 BALF에서 염증세포가 증가하였다(도 7). OVA로 민감화되고 도전받은 마우스들의 BALF에서 IL-4과 IL-13는 대조군 마우스들에 비하여 증가하였다(도 8). 도 6, 도 7, 도 8은 오브알부민(OVA)로 민감화되고 도전 유도된 마우스에서 기도 과민성(AHR), 염증, 사이토카인을 나타낸 것이다.

도 6은 OVA 유도된 마우스의 AHR을 나타낸 것이다. 메타콜린의 양이 증가함에 따라 기류 폐쇄(Penh)가 증가하는 것으로 측정되었고, 메타콜린 양이 더 낮을수록 OVA 유도된 마우스의 기류 폐쇄가 증가하였다. 값은 평균±SEM이다. (n = 8 mice/group)

도 7은 OVA 유도된 마우스의 염증 세포를 나타낸 것이다. 25일에 BALF가 수집되었고, 세포 격차가 결정되었다. OVA 유도된 마우스가 총 세포 수, 대식세포(macrophage), 호산구(eosinophil), 중성구(neutrophils), 림프구(lymphocytes)가 증가하였다.

도 8은 브론코아라베오라(bronchoalaveolar) 세척액에서 OVA 유도된 마우스의 사이토카인을 나타낸 것이다.(* p <0.05 OVA vs., Sham.)

< 실시예 3>마우스 폐에서 OVA로 유도된 염증 침투 및 CLDN4 발현

조직 검사에서, OVA로 민감화되고 도전받은 마우스들은 염증 세포 침투를 가지는 수많은 집중 지역과 삼출되는 주변 기관지 및 체강내 지역을 가졌다(도 5A). OVA로 민감화되고 도전받은 마우스에서 H&E-염색된 이미지로부터 나온 염증 인텍스의 세미 정량값이 증가되었다. OVA로 민감화되고 도전받은 마우스에서 CLDN4 면역조직화학 염색이 단핵 염증 세포와 내피 세포, 상피 세포에서 증가하였다. OVA로 민감화되고 도전받은 마우스의 상피세포에서 CLDN4의 염색 패턴이 변경되었다(도 9 및 10).

도 9는 폐가 오브알부민(OVA)로 민감화되고 도전받은 마우스에서 밀착 연접 단백질 클라우딘 4 (CLDN4) 의 통합이 파괴된 것을 나타낸 것이다. 도 10은 CLDN4의 발현을 나타낸 것이다. 도 9에서 왼쪽 칼럼은 폐내 혈관과 주변 폐 조직을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 사용하여 푸른 형광색으로 염색된 핵 dsDNA를 나타낸 것이다. 중간 칼럼은 Alexa Flour® 488을 사용하여 항-CLDN4 항체를 초록 형광색으로 대비 염색한 CLDN4를 나타낸 것이다. 오른쪽 칼럼은 왼쪽과 중간 칼럼에서 조직이 통합된 것을 나타낸 것이다. CLDN4의 염색 패턴은 모의(sham) 대조군 처리된 마우스에 비하여 OVA로 민감화되고 도전받은 마우스의 NBEC에서 변경되었다. 밀착 연접은 각 세포를 둘러싸는 연속적인 링을 더 분명하게 형성하지만, OVA로 민감화되고 도전받은 마우스의 혈관에서는 파괴되는 것으로 나타났다.

< 실시예 4>마우스 폐에서 OVA로 유도된 CLDN4 전사체 및 단백질

정상적으로 밀착연접(tight junctions)은 각각의 세포를 둘러싸는 연속적인 링을 형성한다. 밀착연접 링은 OVA로 민감화되고 도전받은 마우스에서 파괴되었다. 공초점 이미지 분석은 TJ 단백질의 통합의 붕괴를 보여주면서, 밀착연접 깨짐에서 중요한 증가와 CLDN4 염색의 밀도에서 중요한 증가를 보여주었다(도 11). 폐 CLDN4 전사체(도 11) 및 단백질(도 12)는 염분 처리된 마우스에 비하여 OVA로 민감화되고 도전받은 마우스에서 증가하였다.

도 11과 도 12는 오브알부민(OVA)으로 민감화되고 도전받은 마우스에서 폐 클라우딘 4 (CLDN4) 전사체와 단백질 수준이 증가한 것을 나타낸 것이다. 덴시토메트리(Densitometry)는 3개의 면역 블롯으로 결정되었고, 베타-액틴으로 정규화되었다. 베타-액틴으로 정규화된 값은 평균±SEM이다. (* p<0.05 OVA vs Sham.) 도 11은 OVA 마우스의 폐에서 CLDN4 전사체가 증가하는 것을 나타낸 것이다. qRT-PCR로 결정된 전사체는 베타-액틴으로 정규화되었다. 도 12는 OVA 마우스의 폐에서 웨스턴 블롯으로 검출된 CLDN4 단백질 수준이 증가하는 것을 나타낸 것이다.

< 실시예 5> Der p1과 TEER

Der p1는 CLDN4 전사체를 증가시키고 인간 폐 상피 세포에서 TEER을 증가시킨다. 집먼지 진드기(Dermatophagoides pteronissinus) 는 단백질 활성을 가지는 공기 알러젠인 Der p1를 생성시킨다. Der p1가 정상 기도 세포를 바꿀 수 있는지 여부를 검사하기 위해, NHBE 세포를 4, 8, 또는 24시간동안 10g/ml Der p1 로 처리하고, CLDN4 전사체 수준을 측정하였다. Der p1에 노출된지 4, 8, 24시간 후에 NHBE 세포에서 CLDN4 전사체가 증가하였다(도 13). 이러한 증가는 Der p1이 상피의 밀착 연접 CLDN4에 영향을 줄 수 있음을 보여주면서, TEER에서 완만한 증가를 동반하였다(도 14).

도 13과 도 14는 집먼지 진드기 펩티다제 Der p1에 노출된 정상 인간 기관지 상피(NHBE) 세포에서의 CLDN4 전사체를 나타낸 것이다. (*p<0.05, derp1 vs. control.) 도 13은 웨스턴 블롯에 의해 결정된 대로 대조군 또는 Der p1으로 처리된 NHBE에서 CLDN4 단백질을 나타낸 것이다. 도 14는 대조군에 비하여 NHBE에서 트랜스멤브레인 내피 전기 저항(TEER)이 감소된 Der p1을 나타낸 것이다.

천식의 발병에서 CLDN4의 역할은 아직 알려지지 않았다. 상피 밀착연접 CLDN4는 밀착 연접의 구조 분자중 하나로 대조군 피검자에 비해 천식을 가진 환자에서 증가되었으므로, 본 명세서의 데이터는 CLDN4가 천식 발병의 역할을 할 수 있음을 보여준다. 클라우딘 4는 폐포액 제거를 증진시킬 수 있고, 인간 폐에서 발현된 클라우딘-4의 양이 조직학적 변화와 생리적인 장애 사이의 링크를 강화시키는 폐포상피 장벽 기능에 관한 특이적 정보를 공급할 수 있다. 게다가 우리 데이터는 클라우딘 4가 IgE와 호산구, 폐 기능과 관련 있음을 보여주고 있으며, 천식 염증과 천식의 중증도 진단을 위한 정보 제공에 활용되는 마커가 될 수 있음을 보여준다. 따라서, 천식에서 증가된 클라우딘-4 발현은 천식 발병 한계에 대한 매커니즘을 나타내고, 폐포 상피 클라우딘 4 발현의 조절이 천식에 대한 신규한 타겟이 될 수 있다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

클라우딘 4(Claudin-4:CLDN4)의 검출 시약을 포함하는 천식 진단용 마커 조성물.
제1항에 있어서,
상기 검출 시약은 상기 클라우딘 4의 발현을 핵산 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는 천식 진단용 마커 조성물.
(a) 생물학적 시료로부터 클라우딘 4(Claudin-4:CLDN4)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 클라우딘 4의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 클라우딘 4 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 천식 진단을 위한 정보 제공 방법.
폐포 상피 세포에서 클라우딘 4 단백질 발현을 조절하는지 여부를 확인하는 과정을 포함하는, 천식 치료 또는 예방 활성 물질의 스크리닝 방법.