KR20170054587A - 융합 항균펩타이드 ｐ9ｐ12 및 이를 합성하는 방법 - Google Patents

융합 항균펩타이드 ｐ9ｐ12 및 이를 합성하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 융합 항균펩타이드 P9P12 및 이를 합성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 융합 항균펩타이드 P9P12는 서열번호 3으로 표현되는 신규 물질로써, 상기 융합 항균펩타이드는 파필리오신(Papiliocin)의 N말단 부위 1-12 아미노산 영역의 앞쪽 N말단에, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에서 유래된 TAT 단백질의 단백질도입도메인(PDT) 3-11 아미노산 영역을 접합시켜 합성한다.

Description

융합 항균펩타이드 Ｐ9Ｐ12 및 이를 합성하는 방법{Convergence antibacterial peptide P9P12 and process to synthesize it}
본 발명은 융합 항균펩타이드 P9P12 및 이를 합성하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 파필리오신(Papiliocin)의 N말단 부위 1-12 아미노산 영역 앞쪽 N말단에, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus:HIV)에서 유래된 TAT 단백질의 단백질도입도메인(protein transduction domain:PDT) 3-11 아미노산 영역이 접합된 것을 특징으로 하는 융합 항균펩타이드 P9P12 및 이를 합성하는 방법에 관한 것이다.
페니실린 이후 수많은 종류의 항생제가 개발되어 생체에 외부침입의 세균 퇴치를 위하여 사용되어 왔다. 그러나 최근에 들어서 이들 항생제에 내성을 가지는 균주들이 등장하여 큰 문제로 여겨지고 있다.
곤충은 다양한 환경에서 생존하기 위해서 외부 미생물 및 바이러스의 침입에 효과적으로 대항할 수 있는 생체방어 시스템을 소유하고 있는데, 세포성 면역과 체액성 면역반응을 포함하는 선천적 면역인자를 분비함으로써 자신을 보호하는 면역체계를 가지고 있다. 선천적 면역은 곤충을 포함한 무척추동물에 있어서 초기감염에 대한 효과적인 방어인자로 중요한 역할을 한다. 곤충의 선천성 면역반응에서 세포성 면역은 세균, 곰팡이, 선충을 포함한 원생동물에 대한 식균작용, 결절형성과 캡슐형성을 포함한다. 체액성 면역반응에서는 병원체의 침입으로 인해 다양한 종류의 단백질 또는 펩타이드가 지방체 및 혈구세포에서 합성되어 혈액 또는 림프로 분비되는데 이들은 병원체에 대한 강력한 방어인자로 이용된다. 곤충의 체액성 면역반응의 일환으로 분비되는 항균성 단백질 또는 펩타이드는 인간을 포함한 가축 등의 질병 방제에 대한 천연항생제로서의 이용 가능성이 높다. 또한 이러한 항균성 단백질 또는 펩타이드는 인간 및 가축의 질병에 대한 치료 뿐만 아니라 각종 병원균의 감염에 의해 야기되는 농작물의 피해 방지에도 유용하게 사용될 수 있다.
현재까지 발견된 곤충의 항균성 단백질 및 펩타이드는 세크로피아나방에서 세크로핀(cecropin)이 최초로 보고된 이래 약 200여종이 곤충으로부터 분리되었는데 이들은 구조와 크기에 따라 크게 세크로핀류, 디펜신류, 플로린 및 글리신 아미노산을 많이 포함하고 있는 펩타이드로 나눌 수 있다. 이들 중 가장 흔한 것으로는 시스테인(cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파-나선형을 형성하는 구조를 갖는 멜리틴(melittin)이나 세크로핀과 같은 항균펩타이드가 있다.
본 발명자들은 파필리오신(Papiliocin)(대한민국등록특허 제10-1099558호) 및 이로부터 설계된 신규 항균펩타이드(대한민국등록특허 제10-1465098호)에 관한 연구를 수행한 바 있다. 상기 파필리오신은 호랑나비 유충에서 분리한 항균펩타이드로서, 상기 항균펩타이드 유전자의 cDNA 전체 크기는 503bp이며, 94번째 염기에서 개시되어 283번째 위치에서 종결되는 암호화 영역을 가지는 62개의 아미노산으로 구성되어 있다. 상기 항균펩타이드 파필리오신의 아미노산 구조는 알파-헬릭스-힌지-알파-헬릭스로 구성된 전형적인 세크로핀류의 염기성 단백질이다. 한편, 본 발명자들은 이에 대한 연구를 거듭하여 세균 침투성이 우수한 본 발명의 신규한 파필리오신 유래 항균펩타이드에 관한 기술을 완성하였다.
대한민국등록특허 제10-1099558호(등록일: 2011년 12월 21일, 명칭: 호랑나비 유충에서 분리된 항균펩타이드 유전자 및 항균펩타이드) 대한민국등록특허 제10-1150281호(등록일: 2012년 05월 08일, 명칭: 파필리오신 하생 펩타이드로부터 설계된 신규한 항균, 항염활성을 가지는 펩타이드 및 그 용도) 대한민국등록특허 제10-1465098호(등록일:2014년11월19일, 명칭: 융합 항균펩타이드 ＰＡＪＥ 및 이를 합성하는 방법)
본 발명의 목적은 융합 항균펩타이드 P9P12 및 이를 합성하는 방법을 제공하는 데에 있다. 보다 상세하게는 파필리오신(Papiliocin)의 N말단 부위 1-12 아미노산 영역 앞쪽 N말단에, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus:HIV)에서 유래된 TAT 단백질의 단백질도입도메인(protein transduction domain:PDT) 4-12 아미노산 영역이 접합된 것을 특징으로 하는 융합 항균펩타이드 P9P12 및 이를 합성하는 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 서열번호 3으로 표현되는 융합 항균펩타이드 P9P12에 관한 것이다.
상기 항균펩타이드 P9P12는 그람음성균, 그람양성균, 캔디다를 유발하는 진균으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균에 대해, 항균 또는 살균 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기 융합 항균펩타이드 P9P12를 유효성분으로 포함하는 항균 또는 살균용 조성물을 제공한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기 융합 항균펩타이드 P9P12를 유효성분으로 포함하는 세균성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 세균성 질환은 세균성 장염, 세균성 식중독, 살모넬라병 및 캔디다증으로 이루어진 군에서 선택되는 질환일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 융합 항균펩타이드 P9P12를 유효성분으로 포함하는 사료용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에서는 서열번호 1로 표현되는 파필리오신(Papiliocin)의 N말단 부위 1-12 아미노산 영역 앞쪽 N말단에, 서열번호 2로 표현되는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에서 유래된 TAT 단백질의 단백질도입도메인(PDT) 3-11 아미노산 영역을 접합하여, 서열번호 3으로 표현되는 융합 항균펩타이드 P9P12의 합성방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 서열번호 3으로 표현되는 융합 항균펩타이드 P9P12는, 서열번호 1(RWKIFKKIEKVG)로 표현되는 파필리오신(Papiliocin)의 N말단 부위 1-12 아미노산 영역의 앞쪽 N말단에, 서열번호 2(RKKRRQRRR)로 표현되는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에서 유래된 TAT 단백질의 단백질도입도메인(PDT) 3-11 아미노산 영역이 접합된, 총 21개의 아미노산 잔기(RKKRRQRRRRWKIFKKIEKVG)로 구성되며, 상기 융합 항균펩타이드 P9P12는 분자량 2851.8 Da인 것을 특징으로 한다.
한편, 파필리오신의 전체 아마노산 서열과 HIV의 TAT 단백질의 단백질도입도메인의 핵심 아미노산 서열은 하기와 같다.
파필리오신 (서열번호 4): RWKIFKKIEKVGRNVRDGIIKAGPAVAVVGQAATVVKG
HIV의 TAT 단백질의 단백질도입도메인 (서열번호 5): YGRKKRRQRRR
본 발명의 항균펩타이드 P9P12는 그람음성균, 그람양성균, 캔디다를 유발하는 진균으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균에 대해, 항균 또는 살균활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 그람음성균은 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)으로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 그람양성균은 포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 고초균(Bacillus subtilis) 중 선택된다. 또한 상기 캔디다를 유발하는 진균은 캔디다 알비칸스(Candida albicans)일 수 있다.
이에, 상기 항균펩타이드 P9P12는 대장균(Escherichia coli), 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum), 포도상구균(Staphylococcus aureus), 고초균(Bacillus subtilis) 및 캔디다 알비칸스(Candida albicans)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균에 대해, 항균 또는 살균활성이 있을 수 있다.
본 발명의 항균펩타이드 P9P12는 그람음성 및 그람양성 세균, 캔디다 진균 모두에서 매우 높은 항균력 및 우수한 살균 속도를 나타낸다. 이에, 본 발명의 항균펩타이드 P9P12는 항균 또는 살균용 조성물, 인체 또는 식물체에 발생하는 세균성 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 사료용 조성물 등으로 유용하게 이용가능하다. 상기 항균 또는 살균용 조성물, 인체 또는 식물체에 발생하는 세균성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물로서 이용될 수 있다.
이때, 상기 약학적 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체가 추가로 함유될 수도 있는데, 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 피하 주입 또는 피부를 통한 국소 투여(경피 투여)가 바람직하며, 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 항균펩타이드 P9P12는 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 등의 동물, 바람직하게는 포유류에 대한 사료용 조성물로 사용될 수 있다. 이러한 사료용 조성물은 사료 원료에 적절하게 배합하여 사료로 제공되는데, 상기 사료 원료로는 곡물류, 조강류, 식물성 유박류, 동물성 사료 원료, 기타 사료 원료, 정제품 등을 들 수 있다. 본 발명의 항균펩타이드 P9P12가 함유된 사료 조성물을 동물에게 일상적으로 섭취시킬 경우 병원성 미생물에 대한 감염 등을 예방할 수 있다.
본 발명의 항균활성이 우수한 융합 항균펩타이드 P9P12 및 이를 합성하는 방법을 통해, 각종 세균성 질환의 예방, 동물 성장촉진용 천연항생제의 제공, 항균기능이 있는 사료 첨가제의 개발이 가능할 것으로 기대된다. 대한민국등록특허 제10-1099558호에 항균펩타이드 파필리오신(Papiliocin)에 관한 기술이 개시되어 있고, 대한민국등록특허 제10-1150281호 및 대한민국등록특허 제10-1465098호에 상기 파필리오신 유래의 융합 항균펩타이드에 관한 기술이 개시되어 있기는 하지만, 이들 선행기술의 펩타이드는 본 발명의 항균펩타이드 P9P12와는 아미노산 서열이 다를 뿐만 아니라, 항균효과 또한 본 발명의 항균펩타이드 P9P12이 상기 선행기술의 펩타이드들보다 우수하다. 이러한 효과의 차이는 본 발명의 항균펩타이드 P9P12를 구성하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에서 유래된 TAT 단백질의 단백질도입도메인(PDT) 3-11 아미노산 영역(RKKRRQRRR)에서 기인된 것으로서, 상기 영역은 펩타이드가 세포막 손실 없이 세균 내로 빠른 속도로 침투하는 역할을 부여한다. 이와 같은 빠른 침투작용은 특히 진균의 항균활성에 효과가 있는 것으로도 보고된 바 있다.
도 1은 본 발명의 융합 항균펩타이드 P9P12의 디자인 및 아미노산 구성을 나타낸 도면이다.
도 2는 역상 HPLC 이용한 본 발명의 융합 항균펩타이드 P9P12의 정제 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 MALDI 질량 분석법을 이용한 본 발명의 융합 항균펩타이드 P9P12의 분자량 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 대장균에 대한 본 발명의 융합 항균펩타이드 P9P12의 항세균 활성 검정 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 융합 항균펩타이드 P9P12(32㎍/㎖)의 처리시간에 따른 대장균에 대한 살균력 검정 결과를 나타낸 도면이다(control:항균펩타이드 무처리군).
도 6은 본 발명의 융합 항균펩타이드 P9P12(32㎍/㎖)의 처리시간에 따른 포도상 구균에 대한 살균력 검정 결과를 나타낸 도면이다(control은:항균펩타이드 무처리군).
도 7은 대장균(E.coli) 및 포도상 구균(S.aureus) 배양물에 본 발명의 융합 항균펩타이드 P9P12를 농도별로 처리하고 1시간이 지난 후에, LB 고체배지에 도말하여 생존한 대장균 및 포도상 구균의 살균력 검정 결과를 나타내는 도면이다(control: 항균펩타이드 무처리군).
도 8은 P9P12 처리에 따른 대장균 세포막의 카탈라아제(catalase) 활성 검정 결과를 나타낸 도면이다(control : 무처리군).
이하, 본 발명에 대하여 실시예를 통하여 상세히 설명하나, 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1. 펩타이드의 합성 및 분리정제>
기존에 개발된 파필리오신(Papiliocin)의 N말단 부위 1-12 아미노산 영역(RWKIFKKIEKVG)의 앞쪽 N말단에, 기존 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에서 유래된 TAT 단백질의 단백질도입도메인(PDT) 3-11 아미노산 영역(RKKRRQRRR)을 접합시켜, 총 21개의 아미노산 잔기를 가지며, 세균의 세포막 손실 없이 침투하여 항균활성을 나타내는 새로운 형태의 항균펩타이드 P9P12(RKKRRQRRRRWKIFKKIEKVG)를 디자인하였다(도 1).
설계된 융합 항균펩타이드 P9P12는 자동화된 고체상 펩타이드 합성기(Pioneer Apploed Biosystems, Foster, Caclif.)를 이용하여 메리필드(Merrifield) 액상 고상법으로 합성하였다. 제조된 펩타이드들은 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배(acetonitrile gradient)에서 역상(reverse phase)-HPLC 칼럼을 이용하여 정제하고 그 순도를 확인하였으며, 그 결과 95% 이상의 순도를 나타냄을 확인하였다(도 2).
또한 MALDI 질량 분석 결과, 도 3에서와 같이 P9P12 분자량은 2851.8로 측정되었으며 이는 아미노산 서열로 계산하여 얻은 분자량과 일치함을 확인하였다. 이에 정확한 융합 항균펩타이드 P9P12가 합성되었음을 확인하였다.
<실시예 2. 융합 항균펩타이드 P9P12의 항균활성 확인>
실시예 2-1. 항균실험을 위한 각종 균주의 배양
항세균 활성분석(antibacterial assays)에 사용한 그람음성 세균(Escherichia coli, Salmonella pullorum, Salmonella typhimurium, Salmonella gallinarum) 및 그람양성 세균(Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis)은 3%(w/v) TSB(Tryptic Soy Broth) 액체 배지에서 37℃, 200rpm 조건으로 18시간 진탕배양한 후, 다시 동일한 조건에서 2×106 CFU/㎖이 되도록 2시간 30분 동안 2차 배양하였다.
진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans)는 YPD 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose)에서 30℃, 200rpm 조건으로 24시간 진탕배양한 후. 상기와 동일한 방법으로 2차 배양하여 사용하였다.
실시예 2-2. 항균활성 측정
그람음성 세균인 병원성 대장균(Escherichia coli)을 LB 액체 배지(Difco LB Broth: typtone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g/ disilled water 1ℓ)에 접종하고, 동시에 상기 실시예 1에서 합성된 융합 항균펩타이드 P9P12를, 최종농도가 1, 2, 4, 8, 16, 32 및 64㎍/㎖이 되도록 첨가한 후(무처리구-control), 18시간 동안 진탕배양을 하여 항세균 활성을 검정하였다. 그 결과, 도 4와 같이 P9P12의 농도가 16㎍/㎖ 이상인 것에서 대장균이 자라지 못함을 확인하였다.
다음으로는 P9P12 융합 항균펩타이드의 항균 활성을 다양한 병원균을 대상으로 하여 측정하였다. 이를 위해 각 항균활성을 최소성장저해농도(MIC, minimal inhibitory concentration) 및 세균을 완전히 치사시키는 최소살균농도(MBC, minimal bactericide concentration) 측정법으로 검정하였고 이에 대한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
최소성장저해농도(MIC)를 측정하기 위해서는 마이크로플레이트 웰(microplate well)에 90㎕의 세균 배양액(2×106 CFU/㎖)을 넣고 융합 항균펩타이드 P9P12를 농도별로 10㎕씩 첨가하였다. 이를 18시간 배양한 후 분광광도계를 사용하여 O.D.(optical density) 600nm에서 흡광도를 측정하였고 펩타이드 무처리구와 비교하여 MIC50 값을 측정하였다.
최소살균농도(MBC)는 상기 최소성장저해농도 측정 방법과 동일하게 세균 배양액에 융합 항균펩타이드를 첨가하여 18시간 배양한 다음 배양액을 LB 고체배지(Difco LB agar:LB 액체배지 성분에 15g agar/ℓ 포함되어 있음)에 도말하여 다시 18시간 동안 37℃ 배양기에서 배양한 후, 생존한 콜로니(colony) 숫자를 파악하여 콜로니가 전혀 형성되지 않는 농도를 계측하여 측정하였다.
병원균(Microorgaism) 최소성장억제농도
(MIC50, ㎍/㎖)		 최소살균농도
(MBC, ㎍/㎖)
그람음성세균
(Gram negative bacteria)		 대장균(Escherichia coli) 13 32
살모넬라균(Salmonella pullorum) 48 64
살모넬라균(Salmonella typhimurium) 24 32
살모넬라균(Salmonella gallinarum) 20 32
그람양성세균
(Gram positive bacteria)		 포도상 구균(Staphylococcus aureus) 21 32
고초균(Bacillus subtilis) 11 16
효모 곰팡이균(Yeast fungi)
캔디다균(Candida albicans)
2
4
상기 표 1을 참고하면, 그람음성 장내세균인 대장균(Escherichia coli) 및 3종의 살모넬라균에 대하여 P9P12의 최소생장억제농도(MIC50)를 측정한 결과, 대장균(Escherichia coli)에서는 13㎍/㎖에서, 살모넬라 풀로룸(Salmonella pullorum), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 갈리나룸(Salmonella gallinarum)에서는 각각 48, 24, 20㎍/㎖, 그람양성 세균인 포도상 구균(Staphylococcus aureus) 및 고초균(Bacillus subtilis)에서는 최소생장억제농도(MIC50)가 각각 21 및 11㎍/㎖인 것으로 확인되어, P9P12 융합 항균펩타이드의 항세균 활성이 우수함을 알 수 있다. 캔디다증을 유발하는 진균인 캔디다균(Candida albicans)에 대해서도 최소생장억제농도(MIC50)가 2㎍/㎖로서, 항진균 효과 또한 우수함을 확인할 수 있다.
최소살균농도(MBC)을 측정한 결과에서도, 융합 항균펩타이드 P9P12가 대장균, 살모넬라균, 포도상 구균 등 병원균에서 그 농도가 16~64㎍/㎖, 캔디다증을 유발하는 진균(Candida albicans)에서는 4㎍/㎖로서 강한 살균효과가 있음을 알 수 있다.
<실시예 3. 융합 항균펩타이드 P9P12의 처리시간 및 농도에 따른 살균력 측정>
시간-살균 곡선 분석(Time-kill curve assay)을 통하여 융합 항균펩타이드의 대장균 및 포도상 구균에 대한 살균속도 및 펩타이드 농도에 따른 살균 활성을 측정하였다. 구체적으로, 대장균(Escherichia coli) 및 포도상 구균(Staphylococcus aureus)을 3%(w/v) TSB(Tryptic Soy Broth)(Bacto Tryptic Soy Broth - pancreatic digest of casein 17g, papaic digest of soybean 3g, dextrose 2.5g, NaCl 5g, dipotassium phosphate 2.5g/distilled water 1ℓ)에서 37℃, 200rpm 조건으로 18시간 진탕 배양한 후, 다시 동일한 조건에서 최종농도가 1×106 CFU/㎖이 되도록 2차 배양한 다음, 마이크로플레이트 웰(microplate well)에 90㎕의 세균 배양액을 넣고 융합 항균펩타이드 P9P12를 각 농도별로 10㎕를 첨가하였다. 이 후, 일정한 시간이 지날 때마다 배양액을 희석한 다음 LB 고체배지에 도말하고, 37℃에서 배양기에 18 ~ 24시간 배양시킨 후 생존된 콜로니(colony) 숫자를 파악하여 펩타이드 처리 시간별 CFU(Colony Forming Unit)를 측정하였다. 그 결과, P9P12의 최소살균농도(MBC)인 32㎍/㎖에서 그람 음성균 및 그람 양성균 모두에서 살균 속도가 매우 빠름을 확인할 수 있다(도 5 - 대장균 실험결과, 도 6 - 포도상구균 실험결과).
또한, 항균펩타이드 P9P12 농도에 따른 살균 활성을 측정하기 위해서 여러 농도로 희석된 항균펩타이드 P9P12를 대장균(Escherichia coli) 및 포도상 구균(Staphylococcus aureus)의 세균 배양액(1×106 CFU/㎖)에 첨가하여 1시간이 지난 후, 상기와 동일한 방법으로 LB 고체배지에 도말하여 생존한 세균 수를 측정하였다. 그 결과, 도 7에서와 같이 대장균(Escherichia coli:E.coli) 및 포도상 구균(Staphylococcus aureus:S.aureus)에 대해 32㎍/㎖ 이상의 농도에서 매우 높은 살균 효과가 있음을 확인할 수 있다. 일반적인 항균제의 항균활성 기작은 크게 직접적인 세포막 파괴 기작을 이용하거나, 세포막 파괴 없이 침투하여 생육 억제하는 것으로 나뉘는데, 본 발명의 항균펩타이드는 빠른 속도로 세포막 파괴 없이 각종 균들의 생육을 억제하기 때문에 이전에 합성된 파필리오신 유래 펩타이드들보다 살균 속도가 더 우수함을 알 수 있다.
<실시예 4. P9P12 처리에 따른 세포막의 카탈라아제 활성 검정>
세균의 세포막 손상시 분비되는 카탈라아제(catalase)의 활성 검정을 통하여 P9P12의 항균활성 작용기작을 확인하였다.
이를 위해 대장균(Escherichia coli)을 3%(w/v) TSB(Tryptic Soy Broth) 액체 배지에서 37℃, 200rpm 조건으로 18시간 진탕 배양한 다음, 다시 동일한 조건에서 최종농도가 1×106 CFU/㎖이 되도록 2차 배양하였다. 대장균 배양액 2㎖에 100㎍/㎖ 농도가 되도록 P9P12, 암피실린 및 카나마이신을 첨가한 후, 2시간 동안 37℃ 180rpm 조건으로 다시 배양한 다음, 5000rpm 조건에서 10분간 원심 분리하여 그 상등액을 수거한 후, 시그마 알드리치 사의 카탈라아제 측정 키트(CAT-100-1KT)를 사용하여 카탈라아제 활성을 측정하였다.
대장균을 대상으로 P9P12, 암피실린(Ampicillin), 카나마이신(Kanamycin) 및 초음파(Sonication) 처리에 의한 카탈라아제 활성 검정 결과, P9P12 항균펩타이드 처리시 직접적으로 세포막을 파괴하는 초음파 처리에 비해 기존 항생제인 암피실린 및 카나마이신과 유사하게 매우 낮은 카탈라아제 활성을 나타냈었다(도 8). 따라서 P9P12 항균펩타이드의 N말단 영역에 위치하는 단백질도입도메인(PTD)에 의해서 세포막 파괴 작용 없이 세포질내로 침투하여 항균 효과를 나타냄을 확인하였다.
이와 같이 본 발명에 의해, 인체 및 동물에 발생하는 세균성 질환 예방 및 동물 성장촉진용 천연항생제 개발이 가능해짐으로써, 항세균제, 항진균제 등의 항균용 조성물, 동물 성장촉진용 천연항생제 등의 제조, 세균성 장염, 세균성 식중독, 살모넬라병, 캔디다증 등의 세균성 질환 예방에 P9P12를 유용하게 이용할 수 있으며, P9P12를 함유한 사료 첨가제의 제조가 가능하다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Convergence antibacterial peptide P9P12 and process to synthesize it <130> P2015-0214 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> 1-12 amino acids of Papiliocin, Papilio xuthus <400> 1 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> 3-11 amino acids of TAT core domain <400> 2 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion peptide P9P12 <400> 3 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys 1 5 10 15 Ile Glu Lys Val Gly 20 <210> 4 <211> 38 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Papiliocin, Papilio xuthus <400> 4 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg 1 5 10 15 Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala 20 25 30 Ala Thr Val Val Lys Gly 35 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> TAT core domain, Human immunodeficiency virus <400> 5 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10

Claims (7)

  1. 서열번호 3으로 표현되는 융합 항균펩타이드 P9P12.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 항균펩타이드 P9P12는 그람음성균, 그람양성균, 캔디다를 유발하는 진균으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병원균에 대해 항균 또는 살균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 융합 항균펩타이드 P9P12.
  3. 청구항 1의 융합 항균펩타이드 P9P12를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항균 또는 살균용 조성물.
  4. 청구항 1의 융합 항균펩타이드 P9P12를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 세균성 질환은 세균성 장염, 세균성 식중독, 살모넬라병 및 캔디다증으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 세균성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 청구항 1의 융합 항균펩타이드 P9P12를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 사료용 조성물.
  7. 서열번호 1로 표현되는 파필리오신(Papiliocin)의 N말단 부위 1-12 아미노산 영역 앞쪽 N말단에, 서열번호 2로 표현되는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에서 유래된 TAT 단백질의 단백질도입도메인(PDT) 3-11 아미노산 영역을 접합하여, 서열번호 3으로 표현되는 펩타이드를 제조하는 것을 특징으로 하는 융합 항균펩타이드 P9P12의 합성방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110692651A (zh) * 2019-10-24 2020-01-17 常州大学 一种抗菌纳米探针BSA@AuNc-AMP-Ce6及其制备方法和应用

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