KR20170055463A

KR20170055463A - 인터페론 접합체를 포함하는 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20170055463A
Application number: KR1020170058289A
Authority: KR
Inventors: 방규호; 정형무; 신오규; 김희정; 박호석; 박명옥
Original assignee: 한국코러스 주식회사
Priority date: 2017-05-10
Filing date: 2017-05-10
Publication date: 2017-05-19

Abstract

인터페론 접합체를 포함하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 종래의 PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 단점을 극복하여 높은 항바이러스 활성을 가지면서 낮은 가수분해에 민감성을 가진다.

Description

인터페론 접합체를 포함하는 조성물 및 이의 제조방법{A Composition comprising interferon conjugates and a method of producing the same}

인터페론 접합체를 포함하는 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

인터페론 알파와 같은 폴리펩타이드류는 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 좀 더 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 단백질과 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)를 접합시켜 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질 약물의 지속성 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.

1990년대 초부터 인터페론 투여 빈도를 줄이기 위해 반감기를 증가시키는 연구가 집중적으로 이루어졌다. 이들은 주로 인터페론 내에 존재하는 아민기와 반응할 수 있는 PEG를 사용하여 인터페론 알파의 혈액 내에서 반감기를 증대시킬 수 있음을 보여주었다. 아민 반응성 PEG의 사용은 인터페론 알파에 10~11개 (아형에 따라)의 라이신과 반응할 수 있으며, 또 N-말단의 아미노산에도 결합을 할 수 있다 (Monkarsh el al., Anal Biochem. 247 (1997) 434-440). 더욱이 이들 동종체들은 인터페론에 모노-, 다이-. 멀티플-PEG가 결합할 수도 있다. 호프만 라-로슈의 특허 US Pat 5,382,657에 따르면 결합한 PEG의 분자량이 클수록 생체내 순환 반감기가 길고, PEG가 인터페론에 1개 결합한 것이 2개 이상의 PEG가 결합한 것보다 항바이러스 활성이 높았다고 기술하고 있으며, 단백질에 결합한 PEG는 크기가 증가함에 따라 신장에서의 배출되는 양은 줄고, 간에서의 분해가 증가 되는 등의 신체 내에서의 분포가 변하게 되므로 (Yamaoka et al., J Pharm Sci. 83 (1994) 390-399), 인터페론의 활성을 유지하면서 반감기를 연장할 수 있는 방법이 필요한 실정이다.

본 발명은 인터페론 및 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드이 결합된 위치 이성질체 접합체를 포함하는 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

인터페론은 1957년 이삭스(Isaacs)와 린덴만(Lindenmann)이 닭을 인플루엔자 A 바이러스로 감염시키면 바이러스를 억제하는 인자가 있음을 발견하여 알려지게 되었다 (Isaacs, K. and Lindenmann, J., Proc. R. Soc. Lond.,B147(1957), 258-267). 인간 인터페론은 일종의 사이토카인으로 생체내 면역반응 또는 바이러스의 증식을 저해하는 단백질로서 이들은 생성되는 세포의 종류에 따라 인터페론 알파, 인터페론 베타 및 인터페론 감마로 나누어진다 (Kirchner, H., et al., Tex. Rep. Biol. Med., 41 (1981), 89-93 : Stanton, G. J., et al., Tex.Rep. Biol. Med., 41 (1981), 84-88). 인터페론은 항바이러스 기능, 항암기능, NK (Natural Killer) 세포의 활성화 및 골수세포의 억제 기능에 서로 상승작용을 갖고 있는 것으로 널리 알려져 있다 (Klimpel, et al., J. Immunol., 129 (1982), 76-78); Fleischmann, W. R., et al., J. Natl. Cancer Inst., 65 (1980), 863-966; Weigent., et al., Infec. Immun., 40 (1980), 35-38). 또한, 수많은 연구를 통해서 인터페론이 항바이러스 기능뿐만 아니라 세포내 유전자의 발현, 구조 그리고 기능의 조절인자로 작용함이 밝혀진 바 있으며, 직접적인 항증식효과 (Antiproliferative effect) 외에도, 여러 가지 바이러스성 질병 등에 효과적으로 작용하며, 여러 가지 암에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 최근에는 만성 B형과 C형 간염 치료제에서는 주요 의약품으로 사용되는 등 의약품 치료제로서의 적용 범위가 날로 확대되고 있다. 인터페론 알파는 B 세포 분열인자 (mitogen), 바이러스 또는 암세포 등에 의해 백혈구가 자극 받았을 때 생성되는 것으로 현재까지 20 여종 이상의 인터페론 유전자가 존재하며, 이들은 대부분 165 또는 166개의 아미노산으로 구성된 것으로 알려져 있다. 또한, 인터페론 알파에는 수용체와 결합하는데 중요한 부위에 일부 라이신이 포함되어 있으며, 하나 혹은 그 이상의 주요 라이신 위치에 PEG가 결합하게 되면 항바이러스 활성의 감소를 일으키게 되는데, 이러한 생물학적 활성의 감소는 인터페론 알파가 큰 분자량의 PEG로 수식될 때 보다 크게 나타난다 (Monkarsh el al., Anal Biochem. 247 (1997) 434-440). 40 kDa의 고분자량의 PEG 한 분자가 인터페론 알파 2a의 라이신 잔기에 결합된 접합체는 인간 종양세포의 항증식성 활성이 인터페론 및 다른 PEG 인터페론 접합체보다 높지만 항바이러스 활성은 인테페론 알파 2a가 갖는 원래 항바이러스 활성의 7% 수준으로 감소되는 단점을 가지고 있다. 또한, 저 분자량의 PEG 한 분자를 인터페론 알파 2b의 히스티딘에만 결합시킬 경우는 인터페론 알파 2b가 갖는 원래 항바이러스 활성을 유지하는 반면 가수분해에 대한 민감성이 가장 높아 안정성이 떨어지는 단점을 가지고 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 인터페론 알파 2b는 포유동물로부터 분리되고, 재조합 DNA 기술로 원핵세포 또는 진핵세포에서 생산된 재조합 인터페론 알파 2b를 포함한다. 또한, 상기 폴리알킬렌 옥사이드는 중합체의 하이드록실 말단 그룹 중 하나를 접합을 용이하게 하는 석신이미딜 카보네이트, N-석신이미드, N-프탈이미드, N-글루타르이미드와 같은 반응성 작용그룹으로 치환시킨 활성화된 중합체이며 가장 바람직하게는 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜- 석신이미딜 카보네이트 (mPEG-SC)이며, 분자량은 500 달톤 내지 45,000 달톤, 바람직하게는 12,000 달톤이 적합하다. 상기 히스티딘 잔기는 His34로서, PEG가 60중량% 이상, 또는 70중량% 이상 라이신과 타이로신 잔기에 접합되고 His34 잔기에는 14중량% 이하, 또는10중량% 이상으로 접합되기에 충분한 조건하에서 접촉시키고, 상기 조건이 pH 8.0 내지 pH 8.5에서 인테페론 알파 2b 분자를 몰 과량의 mPEG-SC와 저온에서 반응시키는 것을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 제조방법에서 mPEG-SC의 몰 과량이 1 내지 3배이며, 저온은 2°C 내지 8°C이며, 바람직하게는 3°C 내지 5°C이고, 인터페론 알파 2b의 농도가 1 ㎎/㎖ 내지 2 ㎎/㎖로 구성됨이 바람직하다. 상기 혼합물에서, PEG-인터페론 알파 2b 접합체는 PEG 분자가 접합되어 있는 아미노산 잔기에 따라서 위치 이성질체로 정의된다. PEG 한 분자가 인터페론 알파 2b 분자상의 약 13개 이하의 아미노산 잔기 (Lys31, Lys49, Lys83, Lys121, Lys131, Lys133, Lys134, Lys164 ,Tyr129, His7, His34, Cys1, Ser163)에 결합될 수 있다. 이 조성물은 포함된 mono-PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 항바이러스 활성을 높이기 위해 히스티딘 잔기에 PEG를 결합시킨 위치 이성질체가 14중량% 이하로 포함되고, 타이로신과 라이신 잔기에 PEG가 결합된 위치 이성질체가 60중량% 이상 포함된다는 점에서 종래 기술의 생성물들과 구별된다.

본 발명의 일구체예에서, PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 제조 방법 및 이러한 방법에 의해 제조된 조성물을 포함한다. PEG-인터페론 알파 2b 접합체는 PEG를 인터페론 알파 2b의 Lys 잔기와 His 잔기에 공유 결합시키기에 적합한 조건하에서 인터페론 알파 2b를 함유하는 용액을 충분한 양의 mPEG-SC와 반응시켜서 제조한다. 이러한 조건은 PEG의 일정 부분이 인터페론 알파 2b의 Lys과 His 잔기에 공유 결합하기에 충분히 용이한 반응조건 (pH, 온도, 인터페론 알파 2b 농도, 인터페론 알파 2b와 PEG의 몰비)의 범위 내에서 수행함을 포함한다. 공유 결합을 수행하기 위한 조건은 인터페론 알파 2b에 대해 약 2배 내지 3배의 비교적 적은 몰의 mPEG-SC를 사용하여 접합 반응을 수행함을 포함한다. 이 조건은 또한 8.0 내지 8.5 pH에서 반응을 수행함을 포함한다. 이 조건은 또한 2°C 내지 8°C, 바람직하게는 3°C 내지 5°C의 온도에서 반응을 수행함을 포함한다.

본 발명의 일구체예에서, 조성물이란 고분자 화합물 또는 접합체등이 다양한 유사한 구조로 존재하는 것으로, 이에 한정하지는 않지만, 동일한 구조 화합물이지만 이성질체이거나, 동일한 분자량의 화합물이 인터페론과 같은 단백질의 서로 다른 특정 위치에 결합한 위치 이성질체를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 포유동물, 바람직하게는 사람에서 각종 의학 질환의 치료 방법을 제공한다. 이 방법은 이러한 치료가 필요한 포유동물에게 본원에 기술된 바와 같이 제조한 IFN 알파 접합체 함유 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 이 접합체는 다른 것들 중에서, 인터페론 민감성 질환 또는 이들 용어에 대해 의학 분야에 공지되어 있는 바, 인터페론 기준한 치료요법에 대해 양성적으로 또는 긍정적으로 반응하는 상태를 치료하는데 유용하다. 본 발명에 따라 치료할 수 있는 상태는 일반적으로 인터페론 알파를 사용한 치료에 민감한 질환이다. 예를 들어, 민감한 질환은 이들 용어가 의학 분야에 공지되어 있는 바, 인터페론 알파 기준한 치료요법에 대해 양성적으로 또는 긍정적으로 반응하는 질환을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 인터페론 알파 치료요법을 사용하여 치료할 수 있는 질환은 인터페론 알파를 사용한 치료가 일부 효능을 나타내지만 부작용이 이러한 치료의 잇점을 능가하므로 인터페론 알파를 사용하여 치료할 수 없는 질환을 포함한다. 예를 들어, 알파 치료요법에 수반되는 부작용은 인터페론 알파를 사용하여 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr virus)의 치료를 실질적으로 배제시켰다. 본 발명의 실행으로 통상의 인터페론 알파 치료와 비교하여 부작용을 실질적으로 감소시키거나 제거한다.

본 발명의 일 구체예에서, 인터페론 민감성 질환이란, 인터페론으로 치료될 수 있는 질환으로, 이에 한정되지는 않지만, 세포 증식 질환, 특히 암(예: 모발 세포 백혈병, 카포시 육종, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 기저 세포암 및 악성 흑색종, 난소 암 및 피부 T 세포 임파종) 및 바이러스 감염을 포함한다. 이때, 인터페론을 사용한 치료를 사용하여 인터페론-민감성 바이러스의 복제를 억제함으로써 혜택을 입을 수 있는 질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 본 발명에 따라 치료할 수 있는 바이러스 감염은 A형 간염, B형 간염, C형 간염, 기타 비A형/비B형 간염, 헤르페스 바이러스, 엡스타인 바르 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 헤르페스 심플렉스, 사람 헤르페스 바이러스 제6형(HHV-6), 파필로마, 폭스바이러스, 피코르나바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, 사람 T 임파 추향성 바이러스 제1 및 제2형(HTLV-1/-2), 사람 로타바이러스, 라비스, 사람 면역결핍성 바이러스(HIV)를 포함하는 레트로바이러스, 뇌염 및 호흡기 바이러스 감염을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서 투여란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 치료 방법은 상기 약제학적 조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 유전자의 발현 억제제 또는 단백질의 활성 억제제를 1일 1회 내지 수회 투여시, siRNA일 경우 0.01ng/kg-10㎎/kg, 상기 유전자의 mRNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드인 경우 0.01ng/kg-10㎎/kg, 화합물일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg, 상기 단백질에 대한 모노클로날 항체일 경우 0.1ng/kg-10㎎/kg의 용량으로 투여될 수 있다.

상기 조성물은 총 중량에 대하여 유효성분을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 본 발명의 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화학식 1의 고분자 다당체 또는 토란추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에서, 인터페론 및 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드가 결합된 위치 이성질체 접합체를 포함하는 조성물에 있어서, 상기 조성물은 전체 인터페론 접합체 중 인터페론의 히스티딘 잔기에 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드가 결합된 접합체가 14중량% 이하인 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 전체 인터페론 접합체 중 60중량% 이상이 인터페론 알파의 라이신 및 타이로신 잔기에 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드가 결합된 접합체인 조성물을 제공하며, 상기 인터페론 접합체는 인터페론 알파의 라이신과 타이로신의 ε-아미노그룹에 공유 결합된 접합체인 조성물을 제공하며, 상기 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드는 폴리에틸렌 글리콜인 조성물을 제공하며, 상기 폴리에틸렌 글리콜은 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜-석신이미딜 카보네이트 (mPEG-SC)인 조성물을 제공하며, 상기 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드의 분자량은 0.5 내지 40 KDa인 조성물을 제공하며, 상기 인터페론은 인터페론 알파인 조성물을 제공하며, 상기 인터페론 알파는 인터페론 알파 2b인 조성물을 제공하며, 상기 히스티딘 잔기는 His34인 조성물을 제공하며, 상기 위치 이성질체 접합체는 3개 이상의 위치 이성질체를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 위치 이성질체 접합체는 5개 이상의 위치 이성질체를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 위치 이성질체 접합체는 15개 이하의 위치 이성질체를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 위치 이성질체는 His34, Tyr129, Lys131, Lys121, 및 Lys83로 구성된 군으로부터 선택된 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 인터페론 및 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드를 1:1 내지 1:5의 몰비로 결합반응을 시키는 단계; 및 2℃ 내지 8℃에서 교반시키는 단계를 포함하되, 상기 교반 후 제조된 전체 인터페론 접합체 중 인터페론의 히스티딘 잔기에 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드가 결합된 접합체가 14중량% 이하인, 인터페론 및 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드이 결합된 위치 이성질체 접합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 상기 교반은 1 시간 내지 3시간 동안 수행하는, 인터페론 및 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드이 결합된 위치 이성질체 접합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 교반 후에 반응물을 pH 4 내지 5 맞추어 반응을 중지시키는 단계를 추가로 포함하는, 인터페론 및 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드이 결합된 위치 이성질체 접합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 교반 후에 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 인터페론 및 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드이 결합된 위치 이성질체 접합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명의 조성물은 종래의 PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 단점을 극복하여 높은 항바이러스 활성을 가지면서 낮은 가수분해에 민감성을 가진다.

도 1은 본 발명의 일 실시예의 조성물을 크기배제 크로마토그래피 (Size Exclusion HPLC)로 분석한 순도 (di-PEG, mono-PEG 및 Native IFN의 함량)에 관한 크로마토그램이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예의 조성물을 양이온 교환 크로마토그래피 방법으로 분리·정제한 PEG-인터페론 알파 2b 접합체 조성물을 크기배제 크로마토그래피로 분석한 모노-PEG의 함량을 표시하는 크로마토그램이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예의 조성물을 질량분석기 (MALDI-MS)로 분석한 결과이다. 그 결과, 인터페론 질량은 약 19 kDa이고 페그인터페론 질량은 약 31 kDa이므로 PEG 질량은 12kDa임을 알 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예의 조성물을 양이온교환 크로마토그래피 (Ion Exchange HPLC)로 분석하여 위치 이성질체를 확인한 크로마토그램이다.
도 5는 도 4의 위치 이성질체에 대한 결과를 종래 기술(Wang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002), 547-570)과 비교한 크로마토그램이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예의 조성물의 포뮬레이션의 안정성을 비교하기 위해서 유리된 종래의 인터페론 알파 2b의 함량(US Pat No. 5,951,974)과 본 발명의 일 실시예를 비교 확인하는 HPLC 크로마토그램이이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1.

실시예 1-1. PEG -인터페론 알파 2b 접합체의 제조

인터페론 알파 2b 약 5 ㎎에 50 mM의 인산나트륨 pH 8.0 완충 용액을 첨가하여 최종 농도가 2 ㎎/㎖가 되도록 제조하였다. 이 용액에 분자량이 약 12KDa인 활성화시킨 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜-석신이미딜 카보네이트 (mPEG-SC) 약 9 mg을 가하여 인터페론 알파 2b 1 몰당 mPEG-SC 3 몰이 반응하도록 하였다. 이 PEG-인터페론 알파 2b 접합체 혼합물 용액을 4℃에서 1.5 시간 동안 교반하면서 반응시킨 후 즉시 반응 혼합물을 pH 4.4로 ??추어 반응을 중지시켰다.

실시예 1-2. PEG -인터페론 알파 2b 접합체의 분리 및 정제

상기 PEG-인터페론 알파 2b 접합체 혼합물을 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.4 완충액으로 10배 희석한 후 양이온교환 크로마토그래피로 PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 분리 및 정제를 수행하였다. 반응 혼합물을 크기배제 크로마토그래피 (Size Exclusion HPLC)로 분석하였다(도 1 참조).

추가로, 상기 PEG-인터페론 알파 2b 접합체 혼합물을 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 양이온 교환 크로마토그래피로 분리 및 정제를 수행하였다.

단계	완충용액	액량(CV)	유속(CV/min)
컬럼 평형화	10 mM 아세트산나트륨, pH 4.4	5	1
샘플 로딩	반응 혼합물	-	0.5
컬럼 세척	10 mM 아세트산나트륨, pH 4.4	5	1
용출 1	140 mM 염화나트륨, 10 mM 아세트산나트륨, pH4.4	7	1
용출 2	2000 mM 염화나트륨, 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.4	7	1
용출 3	220 mM 염화나트륨, 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.4	5	1
용출 4	1000 mM 염화나트륨, 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.4	5	1

강산성 양이온교환수지(SP Sepharose Fast Flow; GE Healthcare)를 컬럼에 충진하고 컬럼 부피 (CV)의 10배에 해당하는 10 mM 아세트산나트륨 완충액 (pH 4.4)을 1 CV/min 유속으로 통과시켜서 컬럼을 평형화시켰다. 평형화가 끝나고 유속을 0.5 CV/min로 조정하여 반응 혼합물을 컬럼에 로딩하였다. 로딩이 끝나고 유속을 1 CV/min으로 조정하여 10 mM 아세트산나트륨 완충용액 (pH 4.4)을 컬럼 부피의 5배만큼 흘려 세척하였다. 각각 염화나트륨 140 mM, 200 mM, 220 mM, 1,000 mM이 포함된 10 mM 아세트산나트륨 완충용액 (pH 4.4)을 1 CV/min 유속으로 흘려 단계적으로 염 농도를 증가시키면서 PEG-인터페론 알파 2b 접합체를 용출시키고, 각각의 분획을 모아서 크기배제 크로마토그래피로 확인하였다(도 2 참조).

PEG-인터페론 알파 2b 접합체는 인터페론 알파 2b에 PEG를 접합시킴으로써 PEG의 분자량만큼 분자량이 증가하였다. 따라서, 질량분석기 (MALDI-MS)를 사용하여 정제된 PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 분자량을 확인하였다(도 3 참조).

실시예 2.

실시예 2-1. PEG 접합 위치에 따른 위치 이성질체의 분포 분석

상기 실시예 1에서 정제된 PEG-인터페론 알파 2b 접합체 혼합물의 PEG 접합 위치에 따른 위치 이성질체 조성비를 이온교환 크로마토그래피 (Ion Exchange HPLC)를 사용하여 측정하였다. 양이온교환 크로마토그래피에 사용되는 컬럼은 TSKgel SP-5PW (Tosoh)이고 이동상은 10 mM 인산나트륨 완충용액 (pH 5.8)과 80 mM 인산나트륨 완충용액 (pH 5.8)으로 선형 농도 구배를 사용하였다. 유속을 1 ㎖/min으로 설정하고 약 1 ㎎/㎖ 농도의 검액을 100 ㎕ 주입한 후 용출된 단백질을 214 nm 파장에서 검출하였다. 이동상은 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 선형 구배를 사용하였다.

시간 (분)	이동상 A (%)	이동상 B (%)
0	100	0
40	0	100
100	0	100

양이온교환 크로마토그래피의 결과는 PEG-인터페론 알파 2b 접합체 혼합물에 약 15개의 상이한 피크가 포함되어 있음을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

또한, 이러한 결과를 종래 결과와 비교하였다( 도 5 참조, 인용 참조 (Wang et al, Advanced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 547-570). 이 결과는 실시예 1의 PEG-인터페론 알파 2b 접합체는 인터페론 알파 2b 분자상의 약 13개 이하의 상이한 부위에서의 공유결합을 포함하며, 접합체의 약 70중량% 이상은 PEG가 라이신(K)과 타이로신(Y)의 ε-아미노그룹에 결합되고, 약 14중량% 이하가 히스티딘(H) 아미노그룹에 결합함을 알수 있었다.

실시예 2-2. PEG 접합 위치 확인

상기 실시예 1의 방법으로 PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 위치 이성질체를 분리하여 각각의 피크를 분취하였다. 분취한 각각의 PEG-인터페론 알파 2b 접합체에 단백질분해 효소 (트립신, V8-프로테아제, 키모드립신 또는 서브틸리신)을 처리하여 분해한 후 PEG 접합 단편을 크기배제 크로마토그래피로 분리하고 N-말단 아미노산 서열분석을 수행하여 PEG 접합 위치를 확인하였다(Grace et al., J. Biol. Chem. 280 (2005), 6327-6336 참조).

도 4에 나타난 각 피크의 PEG 접합 위치는 다음 표 3과 같이 확인되었다.

피크	중량 비율 (%)	위치	피크	중량 비율 (%)	위치
1	3.91	Dipeg	9	13.06	K¹²¹
2	0.11	K³¹	10	28.45	K⁸³
3	8.31	K¹²¹/K¹³⁴	11	2.32	H⁷
4	1.31	K¹³³	12	1.77	K⁴⁹
5	1.66	Unknown	13	2.40	S¹⁶³, K¹¹²
6	6.83	H³⁴	14	0.45	C¹
7	20.74	Y¹²⁹	15	2.66	N/A*
8	6.01	K¹³¹/K¹⁶⁴	-	-	-

*접합이 일어나지 않음

이들 결과는 PEG가 대부분 라이신 아미노기 중 하나에서 접합되고 히스티딘에서의 PEG 접합은 14중량% 이하임을 나타내었다.

실시예 3.

실시예 3-1. PEG -인터페론 알파 2b 접합체의 포뮬레이션

상기 실시예 1의 방법으로 제조한 PEG-인터페론 알파 2b 접합체 150 ㎍, 나트륨-아세테이트(Na-acetate) 6.07 ㎎, 아세트산 0.09 ㎎, NaCl 8.0 ㎎, 폴리소르베이트(polysorbate) 80 0.05 ㎎의 비율로 전체 0.5 ㎖가 되도록 혼합하되, NaOH를 이용하여 pH 6.0으로 조정하였다. 상기 포뮬레이션으로 하기 실험을 수행하였다.

실시예 3-2. PEG -인터페론 알파 2b 접합체의 항바이러스 활성

상기 실시예 1의 정제된 PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 생체외 항바이러스성 활성을 수포성 구내염 바이러스(ATCC NO. VR-129B)로 포화시킨 A549 사람 폐암 세포를 사용하는 세포병변효과(CPE)로 측정하였다. 항바이러스성 활성을 상응하는 잔류 활성과 함께 출발 인터페론 알파 2b의 %로 하기 표 4에 나타내었다.

시료	비활성 (IU/)	잔류 활성 (%)
대조군 (인터페론 알파 2b만)	2.21 x 10⁸	100
PEG-인터페론 알파 2b 접합체 (실시예 1)	0.71 x 10⁸	32

실시예 3-3. PEG -인터페론 알파 2b 접합체의 항증식성 활성

상기 실시예 1의 정제된 PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 생체외 항증식성 활성을 인간의 다우디 (Daudi; Burkitt 림프종)에서 효력 검정하였다(Borden et al., Canc. Res. 42 (1982), 4948-4953 참조). PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 항증식성 활성 (IC₅₀)를 하기 표 5에 나타내었다.

시료	항증식성 IC₅₀(ng/)	활성 증가
대조군(인터페론 알파 2b만)	0.52	1
PEG-인터페론 알파 2b 접합체 (실시예 1)	0.02	26

실험 결과, 인터페론 알파 2b의 항증식성 활성과 비교할 때 실시예 2의 PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 항증식성 활성이 증가됨을 알 수 있었다.

실시예 3-4. 약물 동태

상기 실시예 1의 정제된 PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 시간에 따른 혈중 농도를 조사하였다. 평균 체중이 220g 내지 240g 범위 내에 있는 7주된 랫트 (Sprague-Dawely rat)를 격리시켜 사육하고, 1주일간 매일 50g의 사료만을 공급하였다. 인터페론 알파 2b와 상기 포뮬레이션된 PEG-인터페론 알파 2b 접합체를 1 ㎍/kg씩 랫트에 정맥 주사한 후 0분, 5분, 15분, 30분, 1시간, 3시간, 5시간, 12시간, 24시간 후에 채혈하였다. 혈청 시료를 적당히 희석시키고, 각 시간점에서의 항바이러스성 활성을 상기 표 4에서와 같은 방법으로 측정하였다. 이때, 분석조건의 검증은 평행선검정을 이용한 통계방법으로 역가를 계산하였으며, 4회 연속으로 시험한 결과를 적용하였다. 인터페론 알파 2b와 상기 포뮬레이션된 PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 혈장중 농도 추이를 표 6에 제시하였다.

시료	농도 (ng/, n=6)
시간	0	0.083	0.25	0.5	1	3	5	12	24
대조군 (인터페론 알파 2b만)	0.25	30.50	3.25	0.65	0.25	-	-	-	-
PEG-인터페론 알파 2b 접합체 (실시예 1)	0.27	125	65	26.75	15.50	4.05	1.05	0.48	0.28

실시예 3-5. 안정성 실험

상기 포뮬레이션된 PEG-인터페론 알파 2b 접합체와 종래의 PEG-인터페론 알파 2b의 안정성을 비교하기 위해서 동일한 조건에서 PEG-인터페론 알파 2b 접합체로부터 유리된 인터페론 알파 2b (depegylated interferon alpha 2b)의 함량을 12주 동안 측정하였다. PEG-인터페론 알파 2b로부터 유리된 인터페론 알파 2b의 함량은 크기배제 크로마토그래피 (size exclusion HPLC)로 측정하여 피크의 면적비 (%)로 하기 표 7에 나타내었으며, HPLC 크로마토그램을 도 6에 나타내었다. 실험 결과 상기 포뮬레이션된 PEG-인터페론 알파 2b 접합체의 안정성이 종래의 인터페론 알파 2b와 비교하여 약 1.5배 증가됨을 알 수 있었다.

시료	포뮬레이션된 PEG-인터페론 알파 2b 접합체 (실시예 1)	종래의 PEG-인터페론 알파 2b)
유리된 인터페론 알파 2b (depegylated IFN alpha 2b)	5.15%	7.65%

Claims

인터페론 및 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드가 결합된 위치 이성질체 접합체를 포함하는 조성물에 있어서,
상기 조성물은 전체 위치 이성질체 접합체 중 인터페론의 히스티딘 잔기에 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드가 결합된 접합체가 14중량% 이하인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 전체 위치 이성질체 접합체 중 60중량% 이상이 인터페론 알파의 라이신 및 타이로신 잔기에 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드가 결합된 접합체인, 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 위치 이성질체 접합체는 인터페론 알파의 라이신과 타이로신의 ε-아미노 그룹에 공유 결합된 접합체인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드는 폴리에틸렌 글리콜인, 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 폴리에틸렌 글리콜은 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜-석신이미딜 카보네이트 (mPEG-SC)인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드의 분자량은 0.5 내지 40 KDa인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 인터페론은 인터페론 알파인, 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 인터페론 알파는 인터페론 알파 2b인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 히스티딘 잔기는 His³⁴인, 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 위치 이성질체 접합체는 3개 이상의 위치 이성질체를 포함하는, 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 위치 이성질체 접합체는 5개 이상의 위치 이성질체를 포함하는, 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 위치 이성질체 접합체는 15개 이하의 위치 이성질체를 포함하는, 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 위치 이성질체는 His³⁴, Tyr¹²⁹, Lys¹³¹, Lys¹²¹, 및 Lys⁸³로 구성된 군으로부터 선택된, 조성물.
인터페론 및 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드를 1:1 내지 1:5의 몰비로 결합반응을 시키는 단계; 및
2℃ 내지 8℃에서 교반시키는 단계를 포함하되,
상기 교반 후 제조된 전체 위치 이성질체 접합체 중 인터페론의 히스티딘 잔기에 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드가 결합된 접합체가 14중량% 이하인, 인터페론 및 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드이 결합된 위치 이성질체 접합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법.
제 14항에 있어서,
상기 교반은 1 시간 내지 3시간 동안 수행하는, 인터페론 및 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드이 결합된 위치 이성질체 접합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법.
제 15항에 있어서,
상기 교반 후에 반응물을 pH 4 내지 5 맞추어 반응을 중지시키는 단계를 추가로 포함하는, 인터페론 및 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드이 결합된 위치 이성질체 접합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법.
제 16항에 있어서,
상기 교반 후에 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 인터페론 및 알콕시-말단화 폴리알킬렌 옥사이드이 결합된 위치 이성질체 접합체를 포함하는 조성물을 제조하는 방법.