KR20170056796A - HO-1 유전자 및 TNFR1-Fc 유전자를 동시에 발현하며 GGTA1 유전자가 넉아웃된 형질전환 돼지 및 이의 용도 - Google Patents

HO-1 유전자 및 TNFR1-Fc 유전자를 동시에 발현하며 GGTA1 유전자가 넉아웃된 형질전환 돼지 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HO-1 (Heme oxygenase-1) 유전자 및 TNFR1-Fc (Tumor necrosis factor receptor 1-Fc) 유전자를 동시에 발현하며 GGTA1 (α-1,3-galactosyltransferase) 유전자가 넉아웃 (knock-out)된, 이종 장기 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 형질전환 돼지, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 인간 HO-1과 TNFR1-Fc 융합 유전자를 동시 발현하며 GGTA1 유전자가 넉아웃된 형질전환 돼지는 HO-1 유전자의 항산화 작용 및 세포 보호 기능 등에 의해 장기 분리 및 체외 배양 시에 산화적 스트레스를 감소시킬 수 있고, TNFR1-Fc 발현에 의해 이식 초기에 일어나는 TNF-α 매개의 염증 반응도 감소시킬 수 있으며, 또한 수지상 세포의 성숙을 억제하고 T 세포의 증식과 활성화를 조절하여 급성 혈관계 거부 반응을 감소시켜 이식된 장기의 초기 생착을 촉진할 수 있다. 나아가, GGTA1에 의한 초급성 면역 거부반응을 억제함으로써 이식된 장기의 생존율을 증가시킬 수 있다. 이에, 상기 형질전환 돼지를 이용하여 이종 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 장기를 생산할 수 있다.

Description

HO-1 유전자 및 TNFR1-Fc 유전자를 동시에 발현하며 GGTA1 유전자가 넉아웃된 형질전환 돼지 및 이의 용도 {Transgenic pigs expressing both TNFRI-Fc and HO-1 without Gal epitope and the use of thereof}
본 발명은 HO-1 (Heme oxygenase-1) 유전자 및 TNFR1-Fc (Tumor necrosis factor receptor 1-Fc) 유전자를 동시에 발현하며 GGTA1 (α-1,3-galactosyltransferase) 유전자가 넉아웃 (knock-out)된, 이종 장기 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 형질전환 돼지, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
장기의 기능이 상실되어 더 이상 약물 치료 등과 같은 치료가 불가능할 때 타인의 장기 일부분이나 전부를 옮겨 심는 장기 이식의 경우, 대부분 살아 있는 사람으로부터 장기를 이식하는 방법을 많이 이용하고 있다. 그러나, 이식 장기의 공여자가 현저히 부족한 문제가 있어, 이를 해결하기 위한 여러 가지 시도가 이루어지고 있다. 그 예로 줄기세포를 이용한 방법과 이종 간에 장기를 이식하는 방법 등이 있다. 줄기세포는 필요한 수만큼 세포를 분화 증식시켜 손상된 세포를 대신하여 치료할 수 있는 방법이나, 여러 가지 세포로 구성된 장기로 발달시킬 수 없는 한계가 있다. 따라서 장기를 필요로 하는 경우는 직접적으로 장기를 교체시킬 수 있는 방법으로 이종 장기를 이용하는 방법을 고려해볼 수 있다.
충분한 공여 장기의 확보가 가능한 동물을 이용한 이종 간의 이식은 인간의 장기를 대체할 수 있는 여러 가지 방법 중 하나의 대안으로 떠오르고 있으며, 대체 장기를 공급하는 동물로서 원숭이, 돼지 등 여러 동물이 시도되었다. 그 중 돼지는 해부학적 및 생리학적으로 사람과 매우 유사하며 장기가 사람과 유사한 크기이고, 사육이 쉽고 임신기간 (112일)이 짧으면서도 한꺼번에 많은 수의 새끼 (6 내지 12마리)를 낳을 수 있는 장점이 있어서 돼지의 장기를 이용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
돼지 등을 이용한 이종간 장기 이식의 경우 면역 거부 반응이 심각한 문제가 된다. 이에, 본 발명자들은 인간 HO-1 (Heme oxygenase-1) 유전자 및 인간 TNFR1-Fc (Tumor necrosis factor receptor 1-Fc) 융합 유전자를 돼지 세포에 도입하여, 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하고 이식 후 나타나는 염증 반응을 억제할 수 있는 면역 거부 반응이 억제된 형질전환 돼지를 제조한 바 있다 (한국공개특허 제10-2011-0079485호). 그러나, 상기 형질전환 돼지의 이종 이식편 (xenograft)은 초급성 면역 거부 반응 (hyper-acute rejection, HAR)에는 저항할 수 없었다.
이에, 본 발명자들은 이종 장기 이식 시 산화적 스트레스 및 염증 반응이 감소되고, 초급성 면역 거부 반응이 없는 장기 이식용 형질전환 돼지를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 인간 HO-1 유전자 및 인간 TNFR1-Fc 융합 유전자가 도입되고 GGTA1 유전자가 넉아웃된 형질전환 돼지를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 인간 HO-1 (Heme oxygenase-1) 유전자 및 인간 TNFR1-Fc (Tumor necrosis factor receptor 1-Fc) 융합 유전자를 도입시키고 GGTA1 (α-1,3-galactosyltransferase) 유전자를 넉아웃 (knock-out)시킨, 이종 장기 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 형질전환 돼지, 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 돼지를 제조하기 위한 체세포 공여주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 돼지를 제조하는 단계; 및 상기 형질전환 돼지로부터 이식용 장기를 분리하는 단계를 포함하는 이종 장기 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 장기를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 a) 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계; b) 상기 체세포에 인간 HO-1 (Heme oxygenase-1) 유전자 및 인간 TNFR1-Fc (Tumor necrosis factor receptor 1-Fc) 융합 유전자를 도입시키고, GGTA1 (α-1,3-galactosyltransferase) 유전자를 넉아웃 (knock-out)시키는 단계; c) 인간 HO-1 유전자 및 인간 TNFR1-Fc 융합 유전자가 도입되고 GGTA1 유전자가 넉아웃된 체세포를 선별한 후 배양하는 단계; 및 d) 돼지 난자의 핵을 제거하고 상기 선별된 체세포와 융합하여 체세포 핵이 이식된 수정란을 제조하는 단계를 포함하는, 이종 장기 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 형질전환 돼지의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 이종 장기 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 장기를 생산하기 위하여 이러한 특징을 가지는 형질전환 돼지를 생산하는 것을 목적으로 한다. 이에, 본 발명에서는 분리된 돼지의 체세포에 인간 HO-1 유전자 및 인간 TNFR1-Fc 융합 유전자를 도입하여 발현시키고, GGTA1 유전자를 넉아웃 시킨 형질전환 돼지를 제조하였다. 이하 상기 제조 방법의 각 단계를 상세히 설명한다.
본 발명에서 용어, 형질전환 돼지란 외부에서 도입된 유전자를 재조합하여, 이를 돼지의 염색체 상에 인공적으로 삽입시키거나, 돼지가 내재적으로 가지고 있는 유전자를 결실시키는 등 그 형질의 일부가 변화된 돼지를 의미하며, 동물의 종류는 돼지가 바람직하지만 자연계의 포유류로써 인간에게 장기를 이식할 수 있는 동물에도 본 발명의 방법을 적용하여 면역 거부 반응이 억제된 형질전환 동물을 제조할 수 있다.
a) 단계는 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계로서, 상기 돼지는 핵치환 기술을 이용한 복제 돼지 생산에 있어서 세포 공여체 (또는 핵 공여체)가 된다. 이에 당업자는 그 목적에 따라 돼지를 선택하여 사용할 수 있으며, 돼지의 종류에 특별히 제한되지 않는다. 즉, 상기 돼지는 돼지의 태아 또는 성돈일 수 있고, 자연상태의 돼지 뿐만 아니라 인공적으로 형질전환된 돼지까지 모두 포함되는 개념이다.
본 발명에서 용어 체세포는 상기 돼지로부터 분리될 수 있는 세포로서 유전자 도입 및 넉아웃을 통해 형질전환이 가능한 세포라면 그 종류에 특별히 제한되지 않으며, 분화된 세포 및 미분화 세포를 모두 포함할 수 있다.
체세포를 분리하기 위한 방법으로는 종래의 공지된 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
b) 단계는 상기 분리된 돼지 체세포를 형질전환시키는 단계로서, 구체적으로 상기 체세포에 인간 HO-1 (Heme oxygenase-1) 유전자 및 인간 TNFR1-Fc (Tumor necrosis factor receptor 1-Fc) 융합 유전자를 도입시키고, GGTA1 (α-1,3-galactosyltransferase) 유전자를 넉아웃 (knock-out)시키는 단계이다.
c) 단계는 상기 형질전환된 세포를 선별하고, 선별된 세포를 배양하는 단계이다.
본 발명에서 용어 HO-1 (Heme oxygenase-1) 유전자란 중금속, 내독소 (endotoxin), 자외선, 열충격 (heat shock), 활성산소 및 저산소 상태 등과 같은 각종 스트레스원에 의해 세포 내에서 유도 발현되는 효소를 코딩하는 유전자를 의미한다. HO-1은 헴 (heme)을 최종적으로 빌리루빈 (bilirubin)과 Fe2 +으로 분해하는 효소이며, 또한 항산화 효소로서 라디칼 소거 (radical scavenging)나 세포사멸 억제를 통한 세포 보호 기능을 함으로써 이식된 장기의 기능을 향상시킨다. 본 발명에서 HO-1은 CD4+ T-세포 증식을 억제하고 동시에 내피세포 증식을 활성화하여 생체 내의 면역세포들을 정상화시킴으로써 이종 면역 거부 반응 억제 및 장기 분리 시 산화적 스트레스에 대한 저항성을 보이며 세포사멸 억제를 통해 장기를 구성하는 세포를 보호한다.
구체적으로 상기 인간 HO-1 유전자는 공지의 유전자 데이터베이스에서 그 서열을 얻을 수 있으며, 더욱 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것일 수 있으나, 돼지의 체세포에 도입되어 HO-1의 기능을 나타낼 수 있는 것이라면 본 발명의 범위에 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 TNFR1-Fc (Tumor necrosis factor receptor 1-Fc) 융합 유전자란 TNF-α와 결합할 수 있는 TNFR1의 세포외역 부위와 면역글로불린의 Fc 영역이 융합된 형태를 의미한다. 본 발명에서 용어 TNFR1-Fc 융합 유전자와 TNFR1-Fc 유전자는 구별 없이 사용된다. 본 발명에서 TNFR1-Fc 형태는 TNF-α에 결합하여 TNF-α를 억제할 수 있는 형태는 제한 없이 사용할 수 있으며, 특히 수용성 (soluble) 형태인 수용성 종양괴사인자 수용체1 (soluble TNFR1, sTNFR1) 및 면역글로불린의 Fc 영역이 융합된 형태일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "면역글로불린 Fc 영역"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1 (CH1)과 경쇄 불변영역 1 (CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2 (CH2) 및 중쇄 불변영역 3 (CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지 (hinge) 부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1 (CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1 (CL1)을 포함한 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다. 즉, 본 발명의 면역글 로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) 1 개 또는 2 개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역 (또는 힌지 영역의 일부)과 조합, 6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체 (mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331 번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체 결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다.
이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation), 아세틸화 (acetylation), 아밀화 (amidation) 등으로 수식 (modification)될 수도 있다. 상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합 (combination) 또는 이들의 혼성 (hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하 게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 용어,조합 (combination)이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2 개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 용어, "하이브리드 (hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2 개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1 개 내지 4 개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다. 한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다.
본 발명에서 사이토카인의 수용성 수용체와 면역 글로블린 (이하 'Ig'라 함)의 융합체는 원래 분자의 단일체 (monomer) 또는 Ig와 융합되지 않은 분자에 비해 다음과 같은 장점을 가질 수 있다:
1) 이량체 (dimer) 형태에서 융합 단백질은 이가화 (bivalency)가 되므로 리간드에 대한 총 친화력 (avidity)이 증가;
2) 혈청 내에서 파괴되지 않고 존재할 수 있는 기간의 증가, 즉 분자의 안정성 증가;
3) 면역 글로블린 중쇄의 Fc (Fragment crystallizable)를 통한 효과세포(effector cell)의 활성화; 및
4) 단백질 분리 정제의 편리성 (예를 들어, 프로테인 A를 이용한 분리 정제).
본 발명의 융합체는 중쇄부위의 CH1 도메인을 제외한 형태로 제작되며 그 결과 면역 글로블린의 경쇄 (light chain)와 결합하지 않은 이량체로 제조될 수 있다.
구체적으로 상기 인간 TNFR1 및 Fc 각각의 유전자에 관한 서열을 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있고, 더욱 구체적으로는 서열번호 8로 기재되는 TNFR1-Fc 융합 유전자를 사용할 수 있으나, 돼지의 체세포에 도입되어 TNFR1-Fc 융합 단백질의 기능을 나타낼 수 있는 서열이라면 제한 없이 사용될 수 있다.
상기 유전자 도입은 인간 HO-1 유전자 및 인간 TNFR1-Fc를 돼지 체세포에서 발현시킬 수 있는 공지된 방법을 통해 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터를 도입하거나, 유전체상에서 당해 유전자의 카피수를 증가시키거나, 당해 유전자의 프로모터 서열을 치환 또는 변형에 의해 도입 또는 과발현시킬 수 있다.
상기 유전자를 세포 내로 형질도입시키는 방법으로는 생화학적 방법, 물리적방법 또는 바이러스 매개로 한 형질도입 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 생화학적 방법으로 FuGene6 (Roche, USA), 리포펙타민 (Lipofectamine TM2000, Invitrogen, USA) 또는 ExGen 500 (MBI Fermentas International Inc. CANADA)를 이용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 리포펙타민을 이용한 지질 매개법을 사용할 수 있다. 또한, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터는 돼지 체세포 주에서 발현시킬 수 있는 모든 발현벡터를 사용할 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 인간 HO-1 유전자를 포함하는 발현벡터로서 pcDNA 3.1 벡터를 사용하였고 인간 TNFR1-Fc 융합 유전자를 포함하는 발현벡터로서 pcDNA6를 사용하였다.
이에 제한되는 것은 아니나 구체적인 일 실시태양으로 상기 b) 단계의 인간 HO-1 유전자를 포함하는 단일 벡터, 특히 도 1의 개열지도를 갖는 벡터, 및 인간 TNFR1-Fc 융합 유전자를 포함하는 단일 벡터, 특히 도 2의 개열지도를 갖는 벡터를 별도로 또는 동시에 체세포에 도입시키는 방법에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 네오마이신 저항성 유전자를 포함하는 발현 벡터인 pcDNA3.1 벡터에 인간 HO-1 유전자를 삽입하여 도 1의 개열지도를 갖는 벡터를 제작하였고, 삽입된 유전자의 발현 여부를 HEK293 세포주에서 확인하였다. 또한 블라스티사이딘 (blasticidine) 저항성 유전자를 포함하는 유전자 발현 벡터인 pcDNA6에 인간 TNFR1-Fc 융합 유전자를 삽입하여 도 2의 개열지도를 갖는 벡터를 제작하였고, 삽입된 유전자의 발현 여부를 HEK293 세포주에서 확인하였다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 상기 벡터가 도입된 세포에서 목적 유전자를 발 현할 수 있는 발현 벡터로서, 벡터 내에 도입된 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 말한다. 일례로 본 발명은 인간 HO-1 유전자 또는 인간 TNFR1-Fc 융합 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있으며, 상기 제조된 재조합 벡터를 이용하여 이를 체세포에 도입함으로써, 형질전환된 수정란을 제조하기 위한 공여 세포주를 제작할 수 있게 된다.
구체적으로 본 발명에서 사용되는 프로모터는 당업계에서 통상적으로 사용되는 발현벡터를 제조하기 위한 프로모터 서열을 제한 없이 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 프로모터의 예로는 CMV 프로모터, SV40 프로모터 또는 CAG 프로모터 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 프로모터 서열이 제한되는 것은 아니다. 이러한 프로모터는 필요에 따라 조직 특이적으로 발현시키기 위하여 특정 프로모터를 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 폴리아데닐화 서열은 통상적으로 사용되는 폴리아데닐화 서열, 예를 들면 SV40 폴리아데닐화 서열, 인간 성장호르몬 폴리아데닐화 서열, 마우스 프로타민-1 유전자 폴리아데닐화 서열 (protamine-1 poly A signal), 라지 T 항원 폴리 A 영역 (large T antigen poly A region)으로 부터 유래된 폴리아데닐화 서열, 토끼 β-글로빈 (β-globin)으로부터 유래된 폴리아데닐화 서열 또는 소태아 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 등이 제한 없이 사용될 수 있다.
인간 HO-1 유전자 또는 인간 TNFR1-Fc 융합 유전자가 발현되었는지를 확인하기 위하여, 본 발명의 벡터 내에는 단백질 분리 정제 또는 확인용 태그 서열을 추 가적으로 포함할 수 있다. 태그 서열의 예로는 GFP, GST (Glutathione Stransferase)-tag, HA, His-tag, Myc-tag, T7-tag 등이 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 태그 서열이 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 HO-1 유전자를 pcDNA3.1 벡터에 도입하여 HO-1 유전자 발현 벡터를 제조하였고 (도 1), 서열번호 8의 염기서열을 가지는 sTNFR1-Fc 유전자를 pcDNA6 벡터에 도입하여 sTNFR1-Fc 유전자 발현 벡터를 제조하였다 (도 2). 본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 상기 두 종류의 발현 벡터를 돼지로부터 분리된 체세포에 도입하여, HO-1 유전자 및 sTNFR1-Fc 유전자를 동시에 발현하는 세포, 및 상기 세포를 이용하여 형질전환 돼지를 제조하였다.
본 발명에서 용어 GGTA1 (α-1,3-galactosyltransferase) 유전자란 당단백질에서 N-글라이칸의 생산에 관련되는 효소를 말하며, 상기 효소는 α-1,3 글라이코시드 결합을 통해 N-글라이칸에서 갈락토스에 갈락토스 잔기를 연결하여 말단 Gal-α-1,3-Gal (즉, α-Gal) 모이어티를 형성한다. 돼지의 장기를 다른 종에 이식하는 이종간 장기 이식의 경우, 돼지의 GGTA1 유전자에 의해 일어나는 초급성 면역 거부 반응이 이식한지 수 분 내지 수 시간 안에 일어나 이식받은 동물 또는 사람을 사망에 이르게 한다. 이는 장기 이식에 있어 매우 치명적이므로, 본 발명자들은 이를 해결하기 위해 HO-1 유전자 및 sTNFR1-Fc 유전자를 동시에 발현하면서, GGTA1 유전자를 완전히 넉아웃시킨 돼지를 제조하고자 하였다.
구체적으로 상기 GGTA1 유전자는 공지의 유전자 데이터베이스에서 그 서열을 얻을 수 있으며, 돼지에서 α-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 활성을 나타내는 단백질에 대응되는 유전자라면 본 발명의 범위에 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 유전자 넉아웃 (knock-out)은 유전자가 그 기능을 상실하는 것을 목적으로 하는 인위적 조작 의미하며, 이는 이에 제한되는 것은 아니나 유전자에 일부 뉴클레오티드가 삽입, 치환, 결손 등이 일어나 야기되는 것일 수 있고, 또는 유전자의 전부 또는 일부가 유전체에서 제거되는 것일 수 있다.
상기 유전자 넉아웃은 공지된 넉아웃 방법이라면 특별히 제한되지 않고 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자 넉아웃은 TALEN (transcription activator-like effector nuclease)을 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "TALEN"은 DNA의 타켓 영역을 인식 및 절단할 수 있는 뉴클레아제를 말하며, 구체적으로 TALE 도메인 및 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 가리킨다. 본 발명에서, "TAL 이펙터 뉴클레아제" 및 "TALEN"이라는 용어는 호환이 가능하다. TAL 이펙터는 크산토모나스 (Xanthomonas) 박테리아가 다양한 식물 종에 감염될 때 이들의 타입 Ⅲ 분비 시스템을 통해 분비되는 단백질로 알려져 있다. 상기 단백질은 숙주 식물 내의 프로모터 서열과 결합하여 박테리아 감염을 돕는 식물 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다. 상기 단백질은 34 개 이하의 다양한 수의 아미노산 반복으로 구성된 중심 반복 도메인을 통해 식물 DNA 서열을 인식한다. 따라서, TALE은 게놈 엔지니어링의 도구를 위한 신규 플랫폼이 될 수 있을 것으로 여겨진다. 다만 게놈-교정 활성을 갖는 기능 TALEN을 제작하기 위해서 다음과 같이 현재까지 알려지지 않았던 소수의 주요 매개변수가 정의되어야 한다. i) TALE의 최소 DNA-결합 도메인, ii) 하나의 타켓 영역을 구성하는 2 개의 절반-자리 사이의 스페이서의 길이, 및 iii) FokI 뉴클레아제 도메인을 dTALE에 연결하는 링커 또는 융합 접합 (fusion junction).
본 발명의 TALE 도메인은 하나 이상의 TALE-반복 모듈을 통해 서열-특이적 방식으로 뉴클레오티드에 결합하는 단백질 도메인을 가리킨다. 상기 TALE 도메인은 적어도 하나의 TALE-반복 모듈, 보다 구체적으로는 1 내지 30 개의 TALE-반복 모듈을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서, "TAL 이펙터 도메인" 및 "TALE 도메인"이라는 용어는 호환가능하다. 상기 TALE 도메인은 TALE-반복 모듈의 절반을 포함할 수 있다. 상기 TALEN과 관련하여 국제공개특허 WO/2012/093833호 또는 미국공개특허 2013-0217131호에 개시된 내용 전문이 본 명세서에 참고자료로서 포함된다.
본 발명에서 상기 TALEN은 GGTA1 유전자를 표적으로 하여 상기 유전자를 넉아웃시키기 위해 사용될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니나 특히, GGTA1 유전자의 엑손 9 번 부위를 표적으로 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 GGTA1 효소의 촉매작용을 실시하는 부위에 결정적인 역할을 하는 엑손 9 번 부위를 표적으로 하여, GGTA1 유전자를 넉아웃시키기 위한 TALEN을 제작하였다 (도 3). 본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 상기 제작한 TALEN을 인간 HO-1 유전자 및 인간 sTNFR1-Fc 융합 유전자를 동시에 발현하는 섬유아세포에 형질도입하여 GGTA1 유전자가 넉아웃된 세포를 제조하였고 (도 4), 이를 자성 비드를 이용하여 분리함으로써 GGTA1 유전자가 결손된 세포 집단을 획득하였다 (도 5).
상기 b) 단계에 있어서, 인간 HO-1 유전자를 포함하는 단일 벡터 및 인간 TNFR1-Fc 융합 유전자를 포함하는 단일 벡터를 도입하는 것과 GGTA1 유전자를 넉아웃시키는 것은 동시에 수행되거나 또는 별도로 수행되는 것일 수 있으며, 동일한 유전자형의 세포를 제조할 수 있는 한 그 순서에 특별히 제한되지 않는다.
상기 c) 단계에 있어서, 일례로 상기 b) 단계의 발현벡터가 도입된 체세포는 선별마커가 도입된 발현벡터를 사용함으로써 용이하게 선별할 수 있다. 선별마커로는 항생제 내성 유전자가 사용될 수 있다. 상기 항생제 내성 유전자에는 bsdr, neor, pacr, bsrr, hphr 등이 사용될 수 있으나, 반드시 여기에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 neor를 사용하여 세포 배양액에 네오마이신을 처리해서 인간 HO-1 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 체세포를 선별하였고, bsdr를 사용하여 세포 배양액에 블라스티사이딘을 처리해서 인간 TNFR1-Fc 융합 유전자를 포함하는 발현 벡터가 도입된 체세포를 선별하였다.
다른 일례로 TALEN을 이용하여 GGTA1 유전자가 넉아웃 된 체세포를 선별하는 것은, 이에 제한되는 것은 아니나 리포터 시스템을 포함하는 TALEN 플라스미드를 이용하는 것일 수 있다. 상기 리포터 시스템은 예컨대, H2KK 막단백질 유전자를 이용할 수 있으며, 이 경우 마그네틱 비드를 이용하여 상기 유전자를 발현하는 세포를 선별할 수 있다. 선별된 세포로부터 콜로니를 형성시킨 뒤, 각각의 콜로니에 대하여, T7E1 분석, 타겟화 딥시퀀싱 (targeted deep sequencing) 등을 수행하여 GGTA1 유전자가 넉아웃되었는지 여부를 추가적으로 확인할 수 있다.
d) 단계는 상기 선별된 체세포를 이용하여 상기 체세포와 유전 형질이 동일한 수정란을 제조하는 단계로, 상기 체세포에 대한 복제 돼지를 생산하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로, d) 단계는 돼지 난자의 핵을 제거하고 상기 선별된 체세포와 융합하여 체세포 핵이 이식된 수정란을 제조하는 단계이며, 체세포 핵 이식 기술 (somatic cell nuclear transfer)을 이용하는 단계이다.
상기 d) 단계에 있어서, 본 발명의 난자는 미경산돈의 난소에서 채취된 미성숙 난자를 배양하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "핵 이식 (nuclear transfer)"이란 세포의 핵을 이미 핵을 제거한 난자에 넣어 이식시키는 것을 의미한다. 이런 핵이식된 수정란을 착상시켜서 태어난 개체는 핵공여 세포의 유전적 물질이 핵수여 세포질로 그대로 전달되었기 때문에 핵공여 개체와 유전적으로 완전히 동일한 복제 개체이다.
난자의 유전 물질을 제거하는 방법에는, 물리적인 방법, 화학적인 방법, Cytochalasin B 를 사용한 원심분리법 등이 있다 (Tatham et al., Hum Reprod., 11(7);1499-1503, 1996). 본 발명에서는, 미세조작기를 이용하여, 물리적인 핵 제거 방법을 사용하였다. 형질전환된 체세포는 세포막융합법, 세포질내미세주입법 등을 이용하여 핵이 제거된 난자 내로 도입된다. 세포막융합법은 간단하며 대규모 수정란 생산에 적합하다는 장점이 있으며, 세포질내 미세주입법은 핵과 난자 내 물질들과의 접촉을 극대화시킨다는 장점이 있다. 체세포와 핵이 제거된 난자와의 융합은 전기자극을 통하여 세포막의 점도를 변화시켜 융합시키는 방법을 통하여 재조합한다. 이때, 미세전류ㆍ전압을 자유롭게 조정할 수 있는 전기융합기를 이용하면 편리하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 미세조작에 의해 물리적으로 상기 난자의 핵을 제거하고, 핵이 제거된 난자와 상기 선별된 체세포인 공여 세포주를 전기적 자극으로 융합시켜 수정란을 제조하였다.
본 발명의 형질전환 돼지의 제조 방법은, 상기 d) 단계의 수정란을 돼지 자궁에 착상시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이를 위해, 체세포 핵이 이식된 수정란의 이식을 위한 대리 모돈은 발정이 시작된 개체를 선별하는 것이 바람직하다.
핵이식된 수정란은 활성화시켜 이식 가능한 단계까지 발생시킨 후 대리모로 착상된다. 복제 수정란의 활성화는 수정란이 분열할 수 있도록 성숙과정에서 일시적으로 정지되어진 세포주기를 다시 가동시키는 것을 의미한다. 복제수정란 활성화를 위하여서는 세포주기 정지요소인 MPF, MAP 키나제 등의 세포신호전달물질의 활성을 저하시켜야만 하는데, 이를 위하여서는 복제 수정란 내 칼슘 이온 증가가 필수적이다. 크게 전기적 자극에 의하여 세포막 투과도를 변형하여, 세포 외로부터 칼슘유입을 급격히 증가시키는 방법과 이노마이신(ionomycin) 및 6-DMAP 등의 화학적 물질을 이용하여 세포주기 정지요소의 활성을 직접적으로 저해시키는 방법 등이 단독 또는 병용되어지고 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 상기 방법을 통해 생산된 모든 형질전환 돼지에서 HO-1 및 sTNFR1-Fc 유전자가 삽입되어 발현됨을 PCR (도 6) 및 웨스턴블랏 (도 7 및 도 8)으로 확인하였다. 또한, 염기서열 분석 (도 9) 및 FACS 분석 (도 10)을 통해 GGTA1 유전자가 넉아웃되었음을 확인하였다.
본 발명의 다른 구체적인 일 실시예에서는 상기 형질전환 돼지로부터 분리한 섬유아세포를 이용하여 세포사멸 자극 및 산화적 스트레스 자극에 대한 세포 생존능을 분석한 결과, 야생형 섬유아세포에 비해 세포 생존능이 유의하게 증가하였음을 확인하였다 (도 11). 또한, 상기 섬유아세포는 인간 혈청과 보체에 대하여 저항성을 가지고 있으며 (도 12), GGTA1 넉아웃에도 불구하고 non-Gal 항원의 발현수준이 감소된 것을 확인하였다 (도 13).
이로써, 본 발명의 형질전환 돼지의 제조 방법을 이용하면 안정적으로 인간 HO-1 유전자 및 TNFR1-Fc 융합 유전자를 발현하고 GGTA1 유전자가 넉아웃된 형질전환 돼지를 제조할 수 있으며, 상기 돼지로부터 분리되는 장기는 산화적 스트레스에 생존능이 높고, 인간 혈청과 보체에 저항성을 가질 뿐만 아니라, non-Gal 항원 발현수준이 낮다는 것을 확인하였다. 이에 상기 돼지로부터 분리된 장기 이식시 산화적 스트레스로부터 세포 또는 조직이 보호되며, 면역 거부 반응이 억제될 것임을 알 수 있다.
이에, 본 발명의 형질전환 돼지는 기존의 인간 HO-1 유전자 및 TNFR1-Fc 융합 유전자를 동시에 발현하는 돼지에 비하여, GGTA1이 넉아웃된 특성을 추가로 가지므로, GGTA1 넉아웃에 의한 인간 혈청과 보체에 대해 저항성을 가진다. 뿐만 아니라 상기 유전형질의 조합에 의해 GGTA1 넉아웃에서 단점으로 나타날 수 있는 non-Gal 항원의 발현수준이 낮은 것으로 확인되었으므로, 면역 거부 반응 없이 이종 장기 이식 용도로 매우 유용하게 이용될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 인간 HO-1 (Heme oxygenase-1) 유전자 및 인간 TNFR1-Fc (Tumor necrosis factor receptor 1-Fc) 융합 유전자가 도입되고, GGTA1 (α-1,3-galactosyltransferase) 유전자가 넉아웃 (knock-out)된, 이종 장기 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 장기 이식용 형질전환 돼지를 제공한다. 상기 장기는 구체적으로 췌도, 췌장, 심장, 신장, 간장, 폐장 또는 각막일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 인간에게 이식할 수 있는 돼지의 모든 장기를 제한 없이 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환 돼지를 제조하기 위한 체세포 공여 세포주를 제공한다.
상기 체세포 공여 세포주는 인간 HO-1 유전자 및 인간 TNFR1-Fc 유전자를 안정적으로 발현하고, GGTA1 유전자가 넉아웃된 세포주를 제한 없이 사용할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환 돼지를 제조하는 방법에 의해 형질전환 돼지를 제조하는 단계; 및 상기 형질전환 돼지로부터 이식용 장기를 분리하는 단계를 포함하는, 이종 장기 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 장기를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 장기는 구체적으로 췌도 및 췌장, 심장, 신장, 간장, 폐장, 각막 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 인간에게 이식할 수 있는 돼지의 모든 장기를 제한 없이 포함할 수 있다. 또한, 상기 장기를 인간에게 이식했을 때 면역 거부 반응이 일어나지 않음으로써, 목적하는 장기의 종류에 따른 질환을 치료할 수 있다.
본 발명의 인간 HO-1과 TNFR1-Fc 융합 유전자를 동시 발현하며 GGTA1 유전자가 넉아웃된 형질전환 돼지는 HO-1 유전자의 항산화 작용 및 세포 보호 기능 등에 의해 장기 분리 및 체외 배양 시에 산화적 스트레스를 감소시킬 수 있고, TNFR1-Fc 발현에 의해 이식 초기에 일어나는 TNF-α 매개의 염증 반응도 감소시킬 수 있으며, 또한 수지상 세포의 성숙을 억제하고 T 세포의 증식과 활성화를 조절하여 급성 혈관계 거부 반응을 감소시켜 이식된 장기의 초기 생착을 촉진할 수 있다. 나아가, GGTA1에 의한 초급성 면역 거부반응을 억제함으로써 이식된 장기의 생존율을 증가시킬 수 있다. 이에, 상기 형질전환 돼지를 이용하여 이종 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 장기를 생산할 수 있다.
도 1은 인간 HO-1 유전자가 삽입된 발현 벡터의 개열지도를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 인간 sTNFR1-Fc 융합 유전자가 삽입된 발현 벡터의 개열지도를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 GGTA1 유전자를 타겟으로하는 TALEN의 모식도 이다.
도 4는 TALEN을 이용하여 GGGT1 유전자를 형질전환시키고 선별된 세포의 유전자 결실 여부를 클로닝 및 시퀀싱을 통해 확인한 결과이다.
도 5는 TALEN 매개 돌연변이 돼지세포들의 자기활성세포분리법 결과이다.
도 6은 형질전환된 돼지에서의 HO-1 유전자 및 sTNFR1-Fc 유전자의 발현을 PCR로 확인한 결과이다.
도 7은 형질전환된 돼지에서의 HO-1 유전자 및 sTNFR1-Fc 유전자의 단백질 발현을 웨스턴블랏 방법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 형질전환된 돼지의 장기에서의 HO-1 유전자 및 sTNFR1-Fc 유전자의 단백질 발현을 웨스턴블랏 방법을 이용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 체세포 복제를 통해 생산된 TALEN 매개 GGTA1 유전자 돌연변이의 결과를 염기 서열상에서 나타낸다.
도 10은 형질전환 돼지의 꼬리 유래 섬유아세포에서 유세포 분석 방법을 이용하여 a-1,3-Gal epitopes의 제거를 확인한 결과이다.
도 11은 세포사멸자극인 hTNF-α 와 CHX로 15 분, 산화적 스트레스 자극인 H2O2로 1 시간 처리 후 CCK-8을 이용한 형질전환 돼지의 섬유아세포에서 세포 생존능을 확인한 결과이다.
도 12는 40%의 사람 혈청 처리 후 7-AAD 염색에 의한 형광활성세포분리법을 이용한 형질전환 돼지의 섬유아세포에서 항체/보체 매개성 용해를 확인한 결과이다.
도 13은 야생형, shRNFR1-Fc-hHAHO-1, GGTA1 넉아웃, 및 GGTA1 넉아웃/shTNFR1-Fc-hHAHO-1 돼지 유래 피부 섬유아세포에서의 시알릴트랜스퍼라제 (sialyltransferase)의 발현을 확인한 것이다. (a) ST3Gal2, (b) ST3Gal3, (c) ST3Gal4, (d) ST6GalNac1, (e) ST6GalNac2 및 (f) ST6GalNac6.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: HO-1 유전자 및 sTNFR1 - Fc 유전자 발현 벡터 제작
HO-1 유전자 및 sTNFR1-Fc 유전자 각각을 클로닝하여 발현 벡터를 제작하고, 이를 세포에 도입하여 상기 유전자를 동시에 발현하는 세포주를 제조하였다. 상기 클로닝 및 형질전환은 한국공개특허 제10-2011-0079485호에 기술된 것과 같은 방식으로 수행하였으며, 구체적으로 다음과 같다.
1-1. HO-1 유전자 발현 벡터 제작 및 유전자 발현 확인
NCBI 웹사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)와 ExPASy 웹사이트 (http://expasy.org/)를 이용하여 인간의 HO-1 (Heme oxygenase-1) 유전자의 서열을 분석하고 이를 이용하여 HO-1의 정방향 프라이머 (서열번호 2) 및 역방향 프라이머 (서열번호 3)를 제작하였다. 상기 프라이머 세트를 이용하여 중합효소 연쇄반응법 (PCR)으로 HO-1 유전자 (서열번호 1)를 확보하였다. 유전자를 발현시키기 위하여 네오마이신 (neomycin) 저항성 유전자를 포함하는 유전자 발현 벡터인 pcDNA3.1 벡터 (Invitrogen, CA, USA)를 NheI과 EcoRI 제한 효소로 처리한 뒤, 절단된 부위에 상기 확보된 HO-1 유전자를 삽입하여 HO-1 유전자 발현 벡터를 제작하였다 (도 1).
삽입된 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여 HEK293 세포주에 HO-1 유전자 발현 벡터를 리포펙타민 TM2000 (Lipofectamine TM2000, Invitrogen, CA, USA)을 이용하여 트랜스펙션하였다. 35 mm 플라스틱 배양용 접시 (Becton Dickinson, NJ, USA)에 3 X 105 개의 HEK293 세포를 접종 (seeding)하였다. 다음 날 오전에 1 ㎍ HO-1 발현 벡터를 50 ㎕ Opti-MEM I Reduced Serum Medium (Invitrogen, CA, USA)으로 희석하고 또한 HO-1 발현 벡터와 동일한 부피의 리포펙타민 TM2000을 50 ㎕ Opti-MEM I 배지로 희석한 후 이들을 상온에서 5 분간 배양하였다. 배양 후 희석된 HO-1 발현 벡터와 희석된 리포펙타민 TM2000을 혼합하고 상온에서 20 분간 배양하였다. 상기 배양 후 혼합액을 세포가 접종된 35 mm 세포 배양 접시에 첨가하고 37 ℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 4 시간 후 10 % FBS와 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM (Invitrogen, CA, USA)으로 배양액을 교체하고 37 ℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
48 시간 후 세포를 용출 완충용액 (lysis buffer: 1 % Triton X-100, 50 mM TrisHCl, 20 mM NaF, 150 mM NaCl, protease inhibitors)으로 수확하여, 30 ㎍의 세포 추출물을 전기영동한 후 PVDF 막으로 전기이동시켰다. PVDF 막을 블로킹 완충용액 (blocking buffer: TBST 내 5 % skim milk)으로 1 시간 블로킹하였고 항-HO-1 항체 (래빗 단클론 항체, Abcam, Cambridge, UK)를 1 : 2000으로 희석하여 상온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후 TBST 완충용액으로 30 분간 3 회 세척한 후 HRP가 연결된 항-래빗 IgG 항체 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 1 : 5000으로 희석하여 상온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후 TBST 완충용액으로 30 분간 3 회 세척한 후 화학발광기질 (Chemiluminescent substrates, WestSaveUp™, Abfrontier, Seoul, Korea)을 처리하여 반응시켰다. 이를 X-ray 필름에 노출시켜서 현상하여 인간 HO-1 유전자가 벡터 내에 삽입되어 발현되는 것을 확인하였다.
1-2. sTNFR1 - Fc 융합 유전자 발현 벡터 제작 및 유전자 발현 확인
NCBI 웹사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 와 ExPASy 웹사이트(http://expasy.org/)를 이용하여 인간의 종양괴사인자 수용체 1 (TNFR1) 유전자의 서열을 분석하고, 이를 이용하여 종양괴사인자 수용체 1의 외역부위 (extracellular domain)의 정방향 프라이머 (서열번호 4) 및 역방향 프라이머 (서열번호 5)를 제작하였다. 또한, 인간의 면역 글로불린 G1의 유전자 서열 분석을 통하여 Fc 부위의 정방향 프라이머 (서열번호 6) 및 역방향 프라이머 (서열번호 7)를 제작하였다. 제작된 각각의 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄반응법 (PCR)을 수행하여 수용성 종양괴사인자 수용체 1 (soluble TNFR1) 및 면역 글로불린 G1-Fc (IgG1-Fc) 융합 유전자를 확보하였다 (sTNFR1-Fc, 서열번호 8). 상기 확보된 유전자를 발현시키기 위하여 블라스티사이딘 (blasticidine) 저항성 유전자를 포함하는 유전자 발현 벡터인 pcDNA6 (Invitrogen, CA, USA)를 HindIII와 XhoI 제한 효소로 처리하여 절단하고 절단된 부위에 확보된 sTNFR1 및 IgG1-Fc 융합 유전자를 삽입하여 sTNFR1-Fc 유전자 발현 벡터를 제작하였다 (도 2).
삽입된 유전자의 발현 여부를 확인하기 위하여 HEK293 세포주에 sTNFR1-Fc 유전자 발현 벡터를 리포펙타민 TM2000 (Invitrogen, CA, USA)을 이용하여 트렌스펙션하였다. 35 mm 플라스틱 배양용 접시 (Becton Dickinson, NJ, USA)에 3 X 105 개의 HEK293 세포를 접종하였다. 다음 날 오전에 1 ㎍ sTNFR1-Fc 발현 벡터를 50 ㎕ Opti-MEM I Reduced Serum Medium (Invitrogen, CA, USA)으로 희석하고 또한 sTNFR1-Fc 발현 벡터와 동일한 부피의 리포펙타민 TM2000을 50 ㎕ Opti-MEM I 배지로 희석한 후 이들을 상온에서 5 분간 배양하였다. 배양 후 희석된 sTNFR1-Fc 발현 벡터와 희석된 리포펙타민 TM2000을 혼합하고 상온에서 20 분간 배양하였다. 배양 후 혼합액을 상기 세포가 접종된 35 mm 세포 배양 접시에 첨가하고 37 ℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 4 시간 후 혈청이 없는 DMEM (페니실린/스트렙토마이신이 포함) (Invitrogen, CA, USA)으로 배양액을 교체하고 37 ℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
48 시간 후 배양액과 세포 용해물 (lysate)로 항-hIgG 항체 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 이용하여 웨스턴블랏을 수행하였다. 세포 용해물과 배양액으로 전기영동을 수행하고. 전기영동 후 PVDF 막으로 전기이동시켰다. 전기이동 후 PVDF 막을 블로킹 완충용액 (TBST 내 5 % 스킴 밀크)으로 1 시간 블로킹하였다. 블로킹 후 HRP가 연결된 항-인간 IgG 항체 (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)를 1 : 5000으로 희석하여 상온에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후 TBST 완충용액으로 3 회 세척한 후 화학발광기질 (WestSaveUp™, Abfrontier, Seoul, Korea)을 처리하여 반응 시켰다. 이를 X-ray 필름에 노출시켜서 현상하여 수용성 TNFR1-Fc의 단백질 발현을 확인하였다.
실시예 2: GGTA1 넉아웃 (knock-out) 세포의 생산을 위한 TALEN (transcription activator-like effector nuclease)의 처리 및 콜로니 회수
GGTA1 (α-1,3-galactosyltransferase) 유전자를 넉아웃시키기 위한 TALEN을 제작하였다 (도 3).
상기 TALEN의 목적 부위는 GGTA1 효소의 촉매작용을 실시하는 부위에 결정적인 역할을 하는 엑손 9 번 부위이다. 상기 유전자의 특정서열을 인식하고 결합할 수 있는 TALEN을 제작하여 플라스미드 내로 삽입하였다. TALEN의 목적 유전자 서열과 GFP 그리고 H2KK와 같은 리포터 유전자를 삽입하고 있는 리포터 시스템을 이용하여 TANEN으로 형질전환된 세포주를 확인하고 이를 회수 하였다.
구체적으로, 이전에 생산했던 shTNFRI-Fc-F2A-HA-HO-1(TNF/HAHO, #013) 형질전환 돼지의 신생돼지 (한국공개특허 제10-2011-0079485호)로부터 섬유아세포를 분리한 뒤, 이를 10 % FBS가 첨가된 DMEM 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 배양하였다. GGTA1에 대한 TALEN 플라스미드 및 리포터 시스템을 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 섬유아세포에 형질도입 시켰다. 48 시간 후, 세포를 IB4-FITC (isolectin B4-conjugated fluorescein isothiocyanate, Sigma)와 함께 30 분간 인큐베이션시키고, PBS로 세정하였다. IB4-음성 세포들은 FACS를 이용하여 분리하였다. 세포 배양을 통해 세포 수를 늘리고 유전체 DNA 분리 및 체세포 핵이식에 사용하였다.
분리된 DNA를 이용하여 swine α-gal 특이적 프라이머로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 생산물을 pGEM T-easy vector (Promega Inc.)에 삽입하여, 염색체 내 TALEN에 의한 뉴클레오티드 제거 효율을 분석하였다. 대안 방법으로, H2KK 막 발현 단백질의 유전자를 포함하는 TALEN 플라스미드 및 리포터 플라스미드를 48 시간 동안 형질도입 후, MACSelect H2KK microBeads (Miltenyi Biotec.)를 이용한 MACS 분리 시스템을 이용하여 세포를 선별하였다. 선별된 세포들은 IB4-biotin 및 streptavidin-conjugated microbeads를 이용하여 음성 분리하였다. 분리된 세포들은 100 mm 디쉬에 낮은 밀도 (200 개/디쉬)로 배양하여 각각의 콜로니를 형성하였다. 각각의 콜로니를 48 웰 플레이트로 옮겨 세포 수를 늘리고, T7E1 분석으로 돌연변이를 스크리닝하였다.
T7E1 분석을 위해, 표적 부위인 GGTA1 유전자의 부위를 PCR 방법을 이용하여 증폭시켰다. 증폭된 서열은 가열하여 변성시켜주고 이형의 복합체를 형성시키기 위해 T7 엔도뉴클레아제 I을 20 분간 37 ℃에서 처리하여 합성한 뒤, 2 %의 아가로스 겔 상에서 확인하였다. 두 양성 세포 콜로니들을 통합하여 체세포 핵이식을 위한 공여세포로 사용하였다. 세포로부터 생산된 형질전환 돼지들을 대상으로 다시 한번 T7E1 분석을 수행하여 넉아웃을 확증하였다.
실시예 3: FACS 분석
FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorter)를 이용한 세포주를 검증하고자 하였다. 먼저, 배양한 섬유아세포를 트립신 처리하고 PBS로 세정한 뒤, Gal-α-1,3-Gal 에피토프 발현을 분석하기 위해 30 분간 얼음에서 IB4-FITC 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 그 다음, 상기 세포를 PBS로 세정 및 부유시키고, FACS Caliber (Becton-Dickinson, CA)를 사용하여 CELLQUEST 소프트웨어 (Becton Dickinson)로 분석하였다.
실시예 4: 체세포 핵이식
체외 성숙된 난자의 난구세포를 모두 제거한 뒤 5 ㎍/mL hoechst 33342로 난자의 핵과 극핵을 염색하였다. 염색된 난자를 홀딩 마이크로피펫으로 고정하고 5 ㎍/mL 사이토칼라신 B (cytochalasin B)가 첨가된 TALP 배지 내에서 흡입 피펫을 사용하여 탈핵을 실시하였다. 탈핵된 난자는 TALP 배지에 두고 계속하여 체세포 핵이식에 사용하였다. 넉아웃된 형질전환 체세포 하나를 탈핵된 난자의 위란강으로 주입한 후, 0.26 M 만니톨 (mannitol), 0.1 mM MgSO4, 0.5 mM HEPES를 포함하는 융합 배지에 4 분간 침전시켰다. 그 다음, BTX Electro-Cell Manipulator로 1.2 Kv/cm 직류전압, 1 회 30 ㎲ 지속시간의 전기 자극을 주어 탈핵된 난자의 세포질과 주입한 체세포간의 세포질 융합을 유도하였다. 융합 20 - 30 분 후 재구축된 수정란을 0.26 M 만니톨, 0.5 mM HEPES, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgSO4가 첨가된 활성배지에서 BTX electro-cell Manipulator로 1.5 kv/cm 직류전압, 1 회 60 ㎲ 지속시간의 전기 자극을 주어 재구축된 수정란을 활성화시켰다. 활성화된 복제수정란은 5 % 이산화탄소, 5 % 산소, 90 % 질소가 유지되는 배양기에서 PZM-5 (porcine zygote medium-5; IFP0410P, Funakoshi, Tokyo, Japan)에 1 - 2 일 배양 하고, 형태적으로 정상적인 수정란들 (1 일째 1 세포기; 2 일째 2 - 8 세포기)을 수정란 이식을 위해 선별하였다. 그 다음, 90 내지 120 개의 수정란들을 동기화된 대리모에 개복술을 통해 이식하였다. 동물 사용을 위한 프로토콜은 서울대학교의 실험동물 관리 및 사용을 위한 가이드에 따라 서울대학교 동물실험윤리위원회에 의해 허가 받았다 (SNU-141120-8).
실시예 5: 형질전환 돼지 섬유아세포의 세포 생존능 평가
야생형, GGTA1 넉아웃 돼지, TNF/HAHO 형질전환 돼지, 및 3 마리의 GGTA1 KO/TNF/HAHO 형질전환 돼지로부터 각각 분리된 섬유아세포 (1 × 105 세포/웰)를 24 웰 플레이트에 준비하여 15 시간 동안 TNF-α (20 ng/mL)와 CHX (cycloheximide, 10 ㎍/mL)로 처리하고, 1 시간 동안 H2O2를 처리하였다. 세포 생존능은 제조사 매뉴얼 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)에 따라 CCK-8 용액을 사용하여 측정하였다. 본 평가에서는 야생형 Yucatan 돼지로부터 유래된 섬유아세포를 대조군으로 사용하였다. 흡광도는 microplate reader (Tecan Sunrise, Hayward, CA, USA)로 측정하였다.
실시예 6: 웨스턴블랏 분석
꼬리 유래 섬유아세포와 다양한 종류의 장기들을 분리하여 PRO-PREP 단백질 추출 용액 (iNtRON Biotechnology, Inc.)에 용해하고, SDS 완충 용액 (GeneDepot)에 희석하여 100 ℃ 에서 5 분간 인큐베이션하였다. 동량의 단백질을 10 % SDS-PAGE에 로딩하였다. 단백질은 전기영동 후 PVDF (polyvinylidene difluoride) 막으로 옮겼다. 전기이동 후 PVDF 막을 5 % 스킴 밀크로 블로킹한 다음, HRP가 결합된 항 인간 IgG (1 : 2,000, Binding Site, Birmingham, UK), 항 hHO-1 (Abcam, MA, USA) 또는 1 : 4,000으로 희석한 항 HA (Abcam, MA, USA) 항체로 4 ℃ 에서 24 시간 인큐베이션하였다. 블랏은 Pierce SuperSignal West Pico Chemiluminescent System (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 현상하였다.
실시예 7: 돼지 섬유아세포의 보체 매개 용해 평가
α-Gal 항원에 대한 자연 항체를 평가하기 위해 보체 매개 세포독성을 측정하였다. 야생형, GGTA1 넉아웃 돼지, shTNFRI-Fc-F2A-HA-hHO-1 형질전환 돼지, shTNFRI-Fc-F2A-HA-hHO-1/GGTA1 넉아웃 형질전환 돼지로부터 유래된 섬유아세포 (1 x 105 개)를 떼어내어 1.5 mL 튜브에 옮겨 담고, 인간 혈청 (Sigma Aldrich, MO, USA)으로 처리하여 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존능은 FACS Canto (BD Bioscience, CA, USA)에서 7-AAD (BD Bioscience, CA, USA)를 사용하여 측정하였다.
시험예 1: GGTA1 유전자 넉아웃 세포주 확립
GGTA1을 표적으로 하는 TALEN을 이용하여 GGTA1 유전자를 넉아웃시키고, MACS 방법을 이용하여 선별된 세포의 GGTA1 유전자의 결실 여부 및 정성적 분석을 클로닝 및 시퀀싱을 통해 확인하였다 (도 4). 그 결과, 선별된 세포의 GGTA1 유전자의 표적위치에서 일부 뉴클레오티드가 결손된 것을 확인하여, GGTA1 유전자가 넉아웃된 것을 확인하였다.
GGTA1 유전자가 넉아웃된 세포의 선별 방법은 자성 비드 (magnetic bead)를 이용한 방법으로, H2KK에 대한 자성 비드가 결합된 항체를 세포와 배양한 다음 컬럼을 이용하여 세포를 분리하는 방법이다 (도 5). 상기 방법을 통해 GGTA1 유전자가 결손된 세포 집단을 획득하였다.
시험예 2: 형질전환 복제 돼지의 유전자 삽입 검증
형질전환 돼지의 산자 및 공여세포에서 DNA를 추출하여 각 유전자에 특이적인 프라이머를 이용, PCR로 검증한 결과, 생산된 모든 형질전환 돼지에서 HO-1 및 sTNFR1-Fc 유전자가 삽입되어 있음을 확인하였다 (도 6). 형질전환 돼지 유래 섬유아세포 (도 7) 및 장기 (도 8)에서 HO-1 및 sTNFR1-Fc 단백질에 대한 웨스턴블랏 방법을 수행한 결과, 각 유전자의 단백질 형에 맞는 사이즈의 밴드를 각각 뚜렷이 관찰하였다.
시험예 3: 형질전환 복제 돼지의 GGTA1 유전자 제거 검증
형질전환 복제돼지의 유전자 변이 검증을 실시하였다. 생산된 각 개체에서 DNA를 추출하여 TALEN의 표적에 해당되는 GGTA1 유전자 엑손 9 번 위치의 염기서열을 분석하였다. 분석 결과, 형질전환 복제돼지에서 GGTA1 유전자 염기 서열이 각각 18 개, 6 개, 29 개 등이 결실되었음을 확인하였다 (도 9). 각각 염기서열의 결실로 인해 아미노산 서열 또한, 6 개, 2 개, 9 개 등의 순서로 결실되어 GGTA1 유전자의 기능 상실 또한 예상되었다. 항체를 이용한 FACS 분석 결과를 통해서 GGTA1 유전자가 결실되었음을 검증하였다 (도 10). 이는 상기 형질전환 복제돼지에서 유래된 장기의 이종 이식 적용 시 초급성 거부반응의 극복이 가능하다는 것을 시사하는 것이다.
시험예 4: 세포 생존능 분석을 통한 기능 검증
각 개체 유래 섬유아세포를 이용하여 세포사멸 자극 (hTNFα 및 CHX)과 산화적 스트레스 자극 (H2O2)에 대한 세포 생존능을 CCK-8 분석법으로 확인한 결과, GGTA1 KO/shTNFRI-Fc-HA-hHO-1 형질전환 복제돼지 3 마리 유래 섬유아세포 모두에서 야생형 섬유아세포에 비해 세포 생존능이 유의하게 증가하였다 (도 11). 이는 상기 형질전환 복제돼지에서 유래된 장기의 이종 이식 적용 시 이식된 세포의 생존능이 증가될 것임을 시사하는 것이다.
시험예 5: 유전자 제거의 항체/ 보체 매개성 용해 반응을 통한 기능 검증
각 개체 유래 섬유아세포를 이용하여 7-AAD 염색을 수행하였고, 이로부터 인간 혈청에 의한 항체/보체 매개성 용해를 확인하였다. 그 결과, GGTA1 KO/shTNFRI-Fc-HA-hHO-1 형질전환 돼지 유래 섬유아세포가 shTNFRI-Fc-HA-hHO-1 형질전환 돼지 유래 섬유아세포에 비하여 인간 혈청과 보체에 대하여 저항성을 보였다 (도 12). 이는 이러한 형질전환 복제돼지에서 유래된 장기의 이종 이식 적용 시 항체/보체 매개성 용해반응이 감소될 것임을 시사하는 것이다.
시험예 6: 시알릴 유전자 ( sialyl gene) 발현 확인
시알릴 유전자는 대표적인 non-Gal 항원의 하나로, GGTA1 단일 유전자 넉아웃의 경우 이러한 non-Gal 항원의 과발현이 문제될 수 있다. 따라서, HO-1 및 TNFR1-Fc 유전자를 동시에 발현하고 GGTA1 유전자가 결손된 돼지와 야생형 돼지, HO-1 및 TNFR1-Fc 유전자 동시 발현 돼지 및 GGTA1 단일 유전자 넉아웃 돼지 유래의 세포에서 non-Gal 항원의 발현 수준을 확인하였다 (도 13).
그 결과, HO-1 및 TNFR1-Fc 유전자를 동시에 발현하고 GGTA1 유전자가 결손된 돼지 3 두의 ST3Gal2 및 ST3Gal3의 발현은 HO-1 및 TNFR1-Fc 유전자 동시 발현 돼지 및 야생형 돼지에서의 발현 수준에 비해서는 높으나 GGTA1 단일유전자 넉아웃 돼지에 비해서는 유의하게 낮은 것을 확인할 수 있었다. 또한, ST3Gal4, ST6GalNac1, ST6GalNac2 및 ST6GalNac6의 경우 HO-1 및 TNFR1-Fc 유전자를 동시에 발현하고 GGTA1 유전자가 결손된 돼지에서 발현 수준은 야생형 돼지, 및 HO-1 및 TNFR1-Fc 유전자 동시 발현 돼지와 유사한 수준인 것을 확인하였다.
상기 결과를 종합하면, GGTA1 유전자만을 결손시킴으로써 non-Gal 항원의 발현이 증가될 수 있어 이식 시 면역 거부 반응의 문제가 야기될 수 있으나, HO-1 및 TNFR1-Fc 유전자를 동시에 발현함으로써 non-Gal 항원의 발현 수준이 감소되었음을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 형질전환 돼지는 HO-1 및 TNFR1-Fc 유전자를 동시 발현하는 돼지에 비해 항체/보체 매개성 용해반응이 현저히 감소되어 장기 이식 시 초급성 면역반응이 억제되며, GGTA1 유전자를 결손시킨 돼지에 비하여 non-Gal 항원의 발현이 감소된 것이다.
따라서, 본 발명의 형질전환 돼지는 이종 장기 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 장기를 생산할 수 있어, 장기 이식 목적으로 매우 유용하게 이용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (11)

  1. a) 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계;
    b) 상기 체세포에 인간 HO-1 (Heme oxygenase-1) 유전자 및 인간 TNFR1-Fc (Tumor necrosis factor receptor 1-Fc) 융합 유전자를 도입시키고, GGTA1 (α-1,3-galactosyltransferase) 유전자를 넉아웃 (knock-out)시키는 단계;
    c) 인간 HO-1 유전자 및 인간 TNFR1-Fc 융합 유전자가 도입되고 GGTA1 유전자가 넉아웃된 체세포를 선별한 후 배양하는 단계; 및
    d) 돼지 난자의 핵을 제거하고 상기 선별된 체세포와 융합하여 체세포 핵이 이식된 수정란을 제조하는 단계를 포함하는, 이종 장기 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 형질전환 돼지의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 인간 HO-1 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 인간 TNFR1-Fc 융합 유전자는 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계는 인간 HO-1 유전자를 포함하는 단일 벡터 및 인간 TNFR1-Fc 융합 유전자를 포함하는 단일 벡터를 별도로 또는 동시에 체세포에 도입시키는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유전자 넉아웃은 TALEN (transcription activator-like effector nuclease)을 이용하여 수행되는 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 TALEN은 GGTA1 유전자의 엑손 9 번 부위를 표적으로 하는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 d) 단계의 수정란을 돼지 자궁에 착상시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  8. 인간 HO-1 (Heme oxygenase-1) 유전자 및 인간 TNFR1-Fc (Tumor necrosis factor receptor 1-Fc) 융합 유전자가 도입되고, GGTA1 (α-1,3-galactosyltransferase) 유전자가 넉아웃 (knock-out)된, 이종 장기 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 장기 이식용 형질전환 돼지.
  9. 제8항의 형질전환 돼지를 제조하기 위한 체세포 공여 세포주.
  10. 제1항의 방법에 의해 형질전환 돼지를 제조하는 단계; 및
    상기 형질전환 돼지로부터 이식용 장기를 분리하는 단계를 포함하는, 이종 장기 이식 시 면역 거부 반응이 억제된 장기를 제조하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 장기는 췌도, 췌장, 심장, 신장, 간장, 폐장 및 각막으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상인 것인, 방법.
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