KR20170060787A

KR20170060787A - 유중 수적형 에멀젼을 이용한 나노-마이크로 전분 젤 입자 제조 방법

Info

Publication number: KR20170060787A
Application number: KR1020150165393A
Authority: KR
Inventors: 김용노; 김영림; 문세훈
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2017-06-02
Anticipated expiration: 2035-11-25
Also published as: KR101849928B1

Abstract

본 발명은 단단한 효소변형 전분 젤을 포함한 유중 수적형 에멀젼을 제조하고 에탄올 및 아세톤 용액을 이용하여 젤 입자를 침전시킨 후, 건조하는 방법을 통하여 수십 나노에서 수 마이크로 사이즈의 젤 입자를 제조할 수 있는 방법에 관한 것으로, 물리화학적 처리를 하지 않은 효소변형전분을 이용하여 유중 수적형 에멀젼을 제조하였고, 기능성 물질을 '캡슐화'할 수 있는 나노-마이크로 전분 젤 입자를 비교적 간단한 공정으로 제조할 수 있어, 산업적으로 대량생산 시 시간적, 경제적 감소 효과를 나타낼 수 있다.

Description

유중 수적형 에멀젼을 이용한 나노-마이크로 전분 젤 입자 제조 방법{Method for preparing nano-micro starch gel particles by using W/O emulsion}

본 발명은 나노사이즈에서 마이크로 사이즈 단위의 전분 젤을 형성하는 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 단단한 효소변형 전분 젤을 포함한 유중 수적형 에멀젼을 제조하고 수십 나노에서 수 마이크로 사이즈를 가진 수상 젤 입자를 에탄올 및 아세톤 용액을 이용해 침전시킨 후 건조하는 단계를 통해 젤 입자를 가시화하여 보여줄 수 있는 제조방법에 관한 것이다.

최근 높은 세포내 흡수율을 위한 나노-마이크로 입자의 캡슐공법에 대한 관심이 증가하고 있다. 특히, 나노입자는 엄청나게 작은 부피 때문에 가장 얇은 모세혈관을 통과할 수 있으며 식세포에 의해 급격하게 제거되지 않으므로, 혈액 내 체류시간이 연장되고 방출이 조절가능하다는 특성을 보여 약물전달 시스템에서의 연구개발이 증가하고 있다.

약물전달 시스템의 연구개발에 있어서, 균질화(homogenization)와 침전(precipitation) 방법이 상호보완적인 과정을 통해 표면적을 늘리고 기능성 물질들을 캡슐화 하는 방법으로 개발되어져 왔다. 또한, 고분자를 이용한 나노-마이크로 입자 제조법으로는 에멀젼/용매증발법, 역마이셀 법, 코아세르베이션/탈용매법 등 다양한 방법이 제시되어져 왔다.

제약 산업에서 나노-마이크로 입자 제조에 사용되는 고분자로는 젤라틴, 키토산, 한천(Agar), PLGA(Poly Lactic Glycolic Acid) 또는 PLA(Poly Lactic Acid) 등이 있다.

지금까지 사용된 고분자 젤 입자의 제조방법은 분무건조법(spray drying), 상분리법(phase separation), 에멀젼법(Emulsion) 등에 의한 제조방법이 일반적이었다.

하지만, 상기 방법들은 최종 건조입자를 획득하기 위해 동결건조, 분무건조 등의 과정을 거치는데 이 건조방법은 비교적 가격이 비싸 제조원가 상승이라는 단점이 발생할 수 있다. 또한, 고분자로 사용되는 젤라틴, 키토산 등은 돼지, 갑각류에서 분리되기 때문에 알러지 반응이 유발될 위험성이 있다. 하지만 본 연구에 사용된 전분 젤 입자는 고농도에서도 저점도를 나타내어 제조과정 중 핸들링이 용이하고 천연 전분에서 유래하였기 때문에 알러지 유발 가능성이 거의 없을 뿐 아니라, 상온에서 건조가 가능하다는 장점 때문에 여러 산업분야에서 폭 넓게 이용될 수 있다.

대한민국 특허등록번호 제10-0956276호 (등록일자 2010년 04월 28일)에는, 수용성 실크 피브로인 용액을 이용하여 실크 피브로인 나노 입자 및 형광 실크 피브로인 나노 입자를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 대한민국 특허등록번호 제10-1095992호 (등록일자 2011년 12월 13일)에는, 자외선 차단효과를 가지는 풀러렌-실리카 나노복합체의 제조방법이 기재되어 있다. 대한민국 특허출원번호 제10-20130093438호 (출원일자 2013년 08월 07일), 나노입자를 포함하는 액상 마이크로 캡슐의 제조방법.

"Studies on smart drug carryiing nano/micro system using polysaccharides 2014 Feb Master’thesis"에는, W1/O/W2 다중유화 방법을 이용하여 다공성 PLGA 미세입자 내 전분을 포함시킨 후 티오트로피움의 방출을 감소시켜 약물 잔존시간을 연장했다는 결과가 기재되어 있다. "Suspensions of vacuum-freeze dried starch nanoparticles: Influence of NaCl on their rheological properties 2013 May 15;(94). doi:10.1016/j.carbpol"에는, 가교 결합(cross-linked)된 전분입자를 사용하여 나노입자(nanoparticles)을 획득한 프로토콜이 기재되어 있다. "Preparation of starch-based nanoparticles through high-pressure homogenization and miniemulsion cross-linking:Influence of various process parameters on particle size and stability 2011 Feb 1;(83). doi:10.1016/j.carbpol"에는, 고압균질기를 사용하여 전분 나노입자(starch nanoparticles)을 제조하고 유화제 종류와 물/기름의 비율에 따른 입자의 물리화학적 특성이 기재되어 있다.

본 발명은 기능성 물질을 안정적으로 캡슐화할 수 있는 나노-마이크로 전분 젤 입자를 간단히 제조할 수 있는 방법의 확립을 목표로 하였으며, 그 방법 중의 하나로 유중 수적형 에멀젼 (W/O emulsion)을 사용하여 입자를 얻는 방법을 개발하고자 하였다.

본 발명은 기능성 물질을 안정적으로 캡슐화할 수 있는 나노-마이크로 전분 입자를 제조할 수 있는 간단한 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 내열성 균주인 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)를 이용해 변성시킨 옥수수전분을 수용액 부분에 포함하고 PGPR 유화제를 사용하여 나노-마이크로 유중 수적형 (O/W) 에멀젼을 제조하는 단계

(a); 상기 에멀젼 제조 후, 에탄올과 아세톤으로부터 나노-마이크로 전분 젤 입자를 회수함으로써 구형 수용성 전분입자를 관찰하는 단계 (b); 를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.

본 발명에서와 같이 고압 균질기를 이용하여 기능성 물질을 안정적으로 캡슐화할 수 있는 옥수수 변형전분을 내부에 첨가한 유중 수적형 에멀젼 제조 시, 단단한 전분 젤 형성으로 균일한 크기의 나노-마이크로 수용성 젤 물방울 입자(gel-water droplets)를 현미경으로 확인할 수 있다. 즉, 새롭게 발굴된 전분분해효소나 새롭게 개발된 전분 소재를 이용하기 위해서 종래에는 전분소재의 특성을 분석하거나 에멀젼 제조에 사용하여 캡슐화 효율과 안정성을 높이는데 그쳤지만, 본 발명에 의할 경우, 이를 이용하여 '안정화된 나노-마이크로 젤 입자'를 비교적 간단히 제조할 수 있는 것이다.

본 발명에서는 유중 수적형 에멀젼 제조에 있어서 내부 수용액 부분에 효소적으로 변형된 옥수수전분을 사용하는데, 에멀젼 제조는 다양한 방법에 의해 형성될 수 있고, 일 예로 고압균질기(high pressure homogenizer)를 사용해 제조할 수 있다.

본 발명의 'PGPR'은 식품 및 화장품 공전에 친유성 유화제로 사용할 수 있는 것으로 언급된 유화제는 어느 것이든 사용할 수 있다. 일 예로는 폴리소르베이트(Polysorbate), 글리세린 지방산 에스테르(Glycerin fatty acid ester), 솔비탄 지방산 에스테르(Sorbitan fatty acid ester), 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르(Propylene glycol fatty acid ester), 글리세릴스테아레이트(Glyceryl stearate), 솔비탄 올레이트(Sorbitan oleiate) 등이 있다. 더욱 바람직하게는 레시틴(Lecithin)을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 효소변형전분의 경우, 단단한 젤을 형성할 수 있는 변형전분은 모두 사용 가능하다. 일 예로, 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로 변형시킨 쌀변형전분을 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 모든 효소변형전분을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 전분 젤 입자의 시각적 관찰방법에 있어서, 단계 (b)의 시각적 확인은, 일 예로 전계방출형 주사전자현미경(FE-SEM)을 통해 확인할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 나노-마이크로 전분 젤 입자 제조방법은, 물리화학적 처리를 하지 않은 효소변형전분을 이용하여 유중 수적형 에멀젼을 제조하였고, 단단한 전분 젤을 포함한 안정한 에멀젼으로 기능성 물질을 '캡슐화'할 수 있는 나노-마이크로 전분 젤 입자를 간단한 공정으로 제조할 수 있어, 산업적으로 대량생산시 시간적, 경제적 감소 효과를 나타낼 수 있다.

도 1는 '광학현미경으로 관찰한 효소변형 전분 젤을 포함한 유중 수적형 에멀젼'의 이미지이다.
도 2에서 control wo는 효소변형전분을 포함하지 않은 유중 수적형 에멀젼을 나타낸다. 도 2에서 MCS 20 wo는 효소변형전분 젤을 수상부분의 중량대비 20% 포함한 유중 수적형 에멀젼을 나타낸다. 도 1에서 MCS gel은 효소변형전분 젤을 나타낸다.
도 3은 전계방출형 주사전자현미경(FE-SEM)으로 관찰한 '유중 수적형 젤 내부에서 분리, 건조된 효소변형 전분 젤 입자'의 이미지이다.
도 4는 건조된 효소변형 전분 젤 입자를 X선 분광분석기(EDS)로 성분분석한 결과 그래프이다.

이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 옥수수변형전분 제조 및 젤을 포함한 유중 수적형 (W/O) 에멀젼 제조]

내열성 균주인 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)에서 직접 분리, 정제한 4-α-글루카노트란스페라아제(4-α-glucanotransferase)를 옥수수 전분 페이스트 (5 wt. %)에 5 U/g 의 농도로 처리한 후 70도씨의 수욕조에서 72시간 이상 반응시켜 최종 옥수수변형전분을 제조하였다. 반응이 끝난 후 95% 에탄올을 이용하여 전분을 침전시켰고, 6,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 분리된 전분은 상온에서 건조시켜 100 mesh 체에 내린 후 사용하였다.

유중 수적형(W/O) 에멀젼을 제조하기 위해 하기와 같은 과정을 수행하였다. 먼저, 효소처리한 옥수수 변형전분을 중량대비 20 %의 농도로 5mM 나트륨 인산 완충제(sodium phosphate buffer (pH 7.0))에 분산, 가열시켜 총 수상부분의 중량대비 40 %의 농도로 제조한 후, 이를 중량대비 8 %의 농도로 PGPR(Polyglycerol polyricinoleate, hydrophobic emulsifier)을 분산시켜 놓은 중량대비 60 % 오일에 투입하고 실험실용 균질기(laboratory homogenizer) (T25 digital Ultra-Turrax, IKA)로 14,000 rpm에서 2분 동안 균질화하였다.

1차로 균질화된 에멀젼을 고압균질기(MN250A,PICOMAX, MICRONOX)에 10,000 psi의 압력을 가해 3번 통과시켜 오일 연속상에 존재하는 균일한 입자의 수상입자를 얻었다.

내부 수상부분에 포함된 효소변형전분 페이스트를 젤화시키기 위하여 고압균질기에 최종 통과시킨 유중 수적형 에멀젼을 냉장고 또는 4도씨의 온도조건에서 2시간 이상 냉각시켜 효소변형전분 젤을 포함한 안정한 에멀젼으로 만들었다.

효소변형 전분 젤을 포함한 유중 수적형(W/O) 에멀젼(emulsion)의 이미지를 광학현미경으로 관찰하여 도 1에 나타내었다.

도 1에서 오일에 분산된 수상입자의 사이즈는 5마이크로 이하이며 에멀젼 입자의 크기와 고압균질기 통과횟수의 관계는 그 횟수가 증가할수록 분산되어있는 에멀젼 입자의 크기가 감소한다고 알려져 있다.

한편, 오일상에 분산되어 있는 수상 입자가 완벽히 젤이 되었는지의 여부를 비파괴적으로 확인하기 위하여 FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy, TENSOR27, Bruker)을 측정하였다. 측정 파장 범위는 4,000 ~ 900 cm-1 이었으며, 스캔 횟수 20, 분해능(resolution) 4의 조건으로 측정한 결과, 도 2와 같이 나타났다. 도 2에서 control wo는 효소변형전분을 포함하지 않은 유중 수적형 에멀젼을 MCS 20 wo는 효소변형전분 젤을 수상부분의 중량대비 20% 포함한 유중 수적형 에멀젼을 각각 의미한다.또한, MCS gel은 중량대비 20 % 농도의 효소변형전분 젤을 의미한다. 측정결과를 살펴보면, 1022 cm-1 파장부근에서 C-O-H 화합물의 피크를 얻을 수 있었다. 이것은 전분 젤의 무정형 부분에서 나타나는 피크로, MCS gel과 거의 같은 범위에서 나타났으며, control wo에서는 나타나지 않아 MCS 20 wo에서 내부 수상부분에 젤이 완벽히 형성되었다는 것을 알 수 있었다.

[ 실시예 2: 유중 수적형 에멀젼을 이용한 나노-마이크로 젤 제조 및 성분분석]

PGPR을 유화제로 사용하여, 안정한 유중 수적형(W/O) 에멀젼(emulsion)을 제조하고, 95 % 에탄올을 이용하여 젤 입자를 침전시킨 후, 상온건조하여 수 나노에서 수 마이크로 사이즈의 젤 입자를 회수하고자 하였다. 이때, 전계방출형 주사전자현미경 (Field Emission Scanning Electron Microscope; FE-SEM)을 사용하여 최종 젤 입자를 관찰하였다.

유중 수적형 에멀젼 (oil-in water emulsion)은 실시예 1과 같은 방법으로 제조하였다.

최종 젤화된 유중 수적형 에멀젼 5 g을 700 rpm 이상으로 교반하면서 5배 분량의 95 % 에탄올을 소량씩 가해준다. 이때, 오일은 뭉치고, 내부에 형성되었던 젤 입자들은 알콜에 의해 가라앉게 된다. 이를 약 5분 동안 교반 후 10겹의 거즈에 여과하고, 다시 한번 5겹의 거즈에 여과하여 뭉친 오일이 제거된 깨끗한 알콜부분을 얻을 수 있었다. 알콜 부분에는 젤 입자들이 포함되어 있기 때문에 1,000 rpm의 속도로 2분 동안 원심분리하여 알콜과 분리시켰다. 순수한 젤 입자를 회수하기 위하여 알콜 수세과정과 원심분리 과정을 3회 이상 반복하였다.

분리된 알콜 상등액을 제거하고 남은 전분 젤 입자에 3배 분량의 99 % 아세톤을 가하여 강하게 볼텍싱(vortexing)하고 2,000 rpm의 속도로 5분 동안 원심분리하여 아세톤을 제거하고 탈수하였다.

탈수는 상온에서 건조하는 방법을 사용하였으며, 건조 시 입자들끼리 뭉치는 것을 방지하기 위하여 최대한 얇게 펴서 건조하였다.

최종 건조한 전분 젤 입자를 전계방출형 주사전자현미경 (Field Emission Scanning Electron Microscope; FE-SEM)을 사용하여 관찰한 결과 도 3과 같은 입자들을 볼 수 있었다. 각 입자의 크기는 1 ~ 3 마이크로미터 였으며, 구 형태의 하얀 돌기를 가진 입자 형태를 유지하고 있었다.

한편, 젤 입자의 성분을 확인하기 위하여 EDS로 분석한 결과, 도 4와 같이 C,O를 주성분으로 이루고 있는 탄수화물임을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 실험에서 옥수수변형전분 젤이 첨가된 유중 수적형 에멀젼을 이용하여 나노-마이크로 전분 젤을 제조할 수 있었다.

Claims

옥수수전분 페이스트에 4-α-글루카노트랜스퍼레이즈 (4-α-glucanotransferase)를 처리하여 옥수수변형전분을 제조하는 단계 (A);
상기 단계 (A)로부터 제조된 옥수수변형전분을 침전시키고, 침전물을 수득한 후, 건조시켜 건조된 옥수수변형전분을 수득하는 단계 (B);
상기 단계 (B)에서 수득된 건조 옥수수변형전분을 완충액에 현탁시킨 후, 오일 및 유화제를 첨가하여 균질화시킴으로써 유중 수적형 에멀젼을 제조하는 단계 (C); 및
상기 단계 (C) 후, 오일 연속상에 존재하는 수상입자인 옥수수변형전분을 젤화시키기 위하여, 상기 유중 수적형 에멀젼을 냉각시키는 단계 (D)를 포함하는 것을 특징으로 하는 나노-마이크로 옥수수전분 젤 입자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (A) 단계는,
고형분 함량 1~10 wt.%의 옥수수전분 페이스트에 4-α-글루카노트랜스퍼레이즈 (4-α-glucanotransferase)를 1~10 U/g의 농도로 처리한 후, 60~80℃에서 60~80시간 반응시키는 것을 특징으로 하는 나노-마이크로 전분 젤 입자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 4-α-글루카노트랜스퍼레이즈 (4-α-glucanotransferase)는,
터머스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 나노-마이크로 전분 젤 입자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (B) 단계는,
옥수수변형전분에 92~98 중량% 에탄올 수용액을 가해 침전시키고, 5,000~7,000 rpm에서 10~30분 동안 원심분리하여 침전물을 분리해 낸 후, 이를 상온에서 건조시키고, 50~150 mesh 체에 내려 옥수수변형전분을 수득하는 것을 특징으로 하는 나노-마이크로 전분 젤 입자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (C) 단계는,
pH 6.0~8.0인 1~10mM 나트륨 인산 완충제 (sodium phosphate buffer)에 옥수수변형전분을 10~30 중량% 농도로 현탁하여 수상부분을 제조하고, 이를 유화제가 5~10 중량%로 분산된 오일에 투입한 후, 10,000~18,000 rpm에서 1~3분 동안 균질화함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 나노-마이크로 전분 젤 입자의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 수상부분 및 오일은,
수상부분 : 오일의 비율이 3~5 : 7~3인 것을 특징으로 하는 나노-마이크로 전분 젤 입자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 나노-마이크로 전분 젤 입자의 제조방법은,
상기 단계 (C)와 (D)의 사이에, 상기 단계 (C)에서 제조한 에멀젼에 5,000~15,000 psi의 압력을 가하여 균일한 크기를 갖도록 제조하는 과정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 나노-마이크로 전분 젤 입자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (D) 단계의 냉각은,
0~10℃에서 1~3시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 나노-마이크로 전분 젤 입자의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 (D) 단계 후,
유중 수적형 에멀젼에 에탄올 수용액을 가해 젤 입자를 침전시킨 후, 여과하여 나노-마이크로 전분 젤 입자를 수득하는 것을 특징으로 하는 나노-마이크로 전분 젤 입자의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 전분 젤 입자는,
유중 수적형 에멀젼 2~8 g에 유중 수적형 에멀젼 중량 대비 3~7배의 92~98 중량% 에탄올 수용액을 소량씩 가하여 젤 입자를 침전시키는 것을 특징으로 하는 나노-마이크로 전분 젤 입자의 제조방법.