KR20170061152A - 자극성 및 비자극성 골수성 세포의 조절 - Google Patents

자극성 및 비자극성 골수성 세포의 조절 Download PDF

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Abstract

항원 결합 단백질, 예컨대 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하여 비자극성 골수성 세포를 사멸, 불능 또는 고갈시키는 것을 포함하는 면역 반응을 증대시키고/시키거나 개체에서의 면역 관련 병태, 예를 들어 암의 치료를 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다.

Description

자극성 및 비자극성 골수성 세포의 조절{MODULATION OF STIMULATORY AND NON-STIMULATORY MYELOID CELLS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2014년 9월 28일에 출원된 미국 가출원 제62/056,569호 및 2015년 3월 8일에 출원된 미국 가출원 제62/129,883호(이들의 각각은 모든 목적을 위해 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)의 이익을 주장한다.
연방 지원 연구 또는 개발에 관한 성명
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)이 허여한 U01 CA141451 및 U54 CA163123 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 소정의 권한을 가진다.
면역력은 종양 생육을 방지하는 데 역할을 한다. 복잡한 미세환경은 병변 내에 발생할 수 있고, T 세포의 동원에도 불구하고, 덩어리의 발생의 효과적인 제어가 대개 없다. 종양 제거와 종양 도피 사이의 균형의 이해는 골수성 세포가 종양 미세환경에서 하는 차등적 역할의 이해에 의존할 수 있다.
종양 미세환경의 골수성 집단은 주로 단핵구 및 호중구(때때로 골수성 유래 억제자 세포로서 느슨하게 그룹화됨), 대식세포, 및 수지상 세포를 포함한다. 종양내 골수성 집단이 전체로서 오랜 기간 비자극성 또는 억제로 생각되어 왔지만, 모든 종양 침윤 골수성 세포가 동일하게 만들어지는 것은 아니라는 것이 가장 최근에 이해되었다.
정상 조직에서, 많은 이 골수성 세포는 선천성 및 후천성 면역력 둘 다의 적절한 작용 및 특히 상처 회복에 필수적이다. 그러나, 암의 환경에서, 상당한 과도한 대식세포 및 이들 및 다른 세포 유형의 기능이상 또는 왜곡 집단이 흔히 기재되어 있다. 단일 마커, 예컨대 CD68 또는 CD163에 의해 한정된 응집체 집단으로 생각될 때, "대식세포" 침윤은 다수의 종양 유형에 걸친 대상체에서의 더 나쁜 결과와 상관된다((de Visser, Cancer Immunol Immunother, 2008;57:1531-9); (Hanada et al., Int J Urol 2000;7:263-9); (Yao et al. Clin Cancer Res, 520, 2001;7:4021-6); (Ruffell et al., PNAS, 523 2012;109:2796-801)). 그러나, 종양 미세환경으로부터 대식세포의 표현형적 및 기능적 하위환경은 대식세포 및 수지상 세포의 유사성에 의해 복잡해지고, 종양 생물학에서 문제가 된다. 형태학적 기준은 대개 문제에 적용되고; 대식세포로부터 수지상 세포를 구별하기 위한 노력하는 하나의 접근법은 전자에 대한 더 뾰쪽한 또는 수지상 형태 및 후자에 대한 더 숨겨진 또는 둥글납작한 형태에 기초한다(Bell et al., J Exp Med 555, 1999;190:1417-26). 다른 그룹은 유전적 및 세포 표면 마커에 기초하여 구별하고자 노력하고 있다.
종양 내의 항원 제시 구획에 다양성이 존재하고, T 세포는 항원 제시 세포(APC)의 특징을 구별할 수 있다. T 세포가 종양 면역력의 주요 추진제이므로, 이의 동족 APC의 정확한 특징의 이해는 중요할 것이다. 골수성 세포는 T 세포에 종양 유래 항원을 제시하고 이로써 활성화 상태에서 이 항원을 유지시킬 수 있는 세포 중에서 두드러진다. 항원 제시는 종양 자체 내에 발생하고, 종양 세포독성 T 림프구(CTL)의 기능에 아마도 영향을 미친다. 항원 제시 세포(APC)에 의한 T 세포 활성화는 항원 특이적 면역 반응 및 종양 세포 사멸에서 중요한 성분이다. 이 골수성 집단이 들어오는 종양 반응성 세포독성 T 림프구에 대한 주요 T 세포 상호작용 파트너 및 항원 제시 세포를 나타내므로, 이 구별의 이해는 치료학적 방안을 안내할 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 공보, 문헌 및 논문은 그 전문이 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법이 본 명세서에 기재되어 있고, 상기 방법은 비자극성 골수성 세포를, 비자극성 골수성 세포에 결합하고 대상체의 암 조직에서 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키기에 효과적인 양으로 존재하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함한다. 몇몇 양태에서, 비자극성 골수성 세포는 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에 있다. 몇몇 양태에서, 비자극성 골수성 세포의 사멸, 불능 또는 고갈은 암 조직의 양 또는 용적을 감소시킴으로써 대상체를 치료한다. 몇몇 양태에서, 접촉 단계는 면역 세포의 집단에서 자극성 골수성 세포 대 비자극성 골수성 세포의 비율을 증가시킨다. 몇몇 양태에서, 접촉 단계는 면역 세포의 집단에서 비자극성 골수성 세포 대 자극성 골수성 세포의 비율을 감소시킨다. 몇몇 양태에서, 접촉 단계는 대상체에서 면역 반응을 증대시킨다. 몇몇 양태에서, 접촉 단계는 암 조직의 밖에 존재하는 골수성 세포 및/또는 암 조직에 존재하는 자극성 골수성 세포를 실질적으로 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키지 않는다.
대상체에서 암을 치료하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있고, 상기 방법은 암에 존재하는 비자극성 골수성 세포에 결합하고 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키기에 효과적인 양으로 존재하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함한다. 몇몇 양태에서, 비자극성 골수성 세포는 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에 있다. 몇몇 양태에서, 비자극성 골수성 세포의 사멸, 불능 또는 고갈은 암 조직의 양 또는 용적을 감소시킴으로써 대상체를 치료한다. 몇몇 양태에서, 접촉 단계는 면역 세포의 집단에서 자극성 골수성 세포 대 비자극성 골수성 세포의 비율을 증가시킨다. 몇몇 양태에서, 접촉 단계는 면역 세포의 집단에서 비자극성 골수성 세포 대 자극성 골수성 세포의 비율을 감소시킨다. 몇몇 양태에서, 접촉 단계는 암의 밖에 존재하는 골수성 세포 및/또는 암에 존재하는 자극성 골수성 세포를 실질적으로 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키지 않는다. 몇몇 양태에서, 대상체의 암은 암에 대한 면역 반응을 생성하거나 증대시킴으로써 치료된다.
몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및 TMEM119로 이루어진 군으로부터 선택된 비자극성 골수성 세포에서 발현된 표적 단백질의 세포외 도메인에 결합하고, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD11c+, CD14+ 및 BDCA3-이고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC) 또는 보체 의존적 세포독성(complement-dependent cytotoxicity; CDC)을 통해, 비자극성 골수성 세포와 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 접촉 전에 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포의 수준보다 낮은 수준으로, 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키고, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+, BDCA1- 및 BDCA3+인 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에 존재하고, 상기 접촉 또는 투여 단계는 암 조직의 밖에 존재하는 골수성 세포 및/또는 상기 암 조직에 존재하는 자극성 골수성 세포를 실질적으로 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키지 않고, 비자극성 골수성 세포의 사멸, 불능 또는 고갈은 암 조직에 대한 면역 반응을 증대시킴으로써 암을 치료한다.
몇몇 양태에서, 비자극성 골수성 세포는, 예를 들어 유세포계측법 또는 동등한 검정에 의해 결정될 수 있는 바대로, 종양 연관 대식세포; 종양 연관 수지상 세포; CD45+, HLA-DR+, CD11c+, CD14+ 및 BDCA3-; CD45+, HLA-DR+ 및 CD14+; CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+; CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+ 중 적어도 하나이거나; BDCA3+이 아니다. 몇몇 양태에서, 비자극성 골수성 세포는, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR), 유전자 어레이, 유세포계측법, RNAseq 또는 동등한 검정에 의해 측정될 수 있는 바대로, C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2, TLR7 및 LILRB4 중 적어도 하나에 대해 양성이고/이거나; KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1 중 적어도 하나에 대해 음성이다.
몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 활성, 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성 및 항체 매개 식균작용 활성 중 적어도 하나를 가진다. 몇몇 양태에서, 항체는 단일클론 항체, 길항제 항체, 다중클론 항체, IgG1 항체, IgG3 항체, 비푸코실화 항체, 이중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 전장 항체 및 항원 결합 단편 중 적어도 하나이다. 몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG2 항체가 아니거나, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG4 항체가 아니다. 몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 접합된다. 몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 방사성 핵종, 세포독소, 화학치료제, 약물, 프로드럭, 독소, 효소, 면역조절제, 혈관형성방지제, 세포사멸 촉진제(anti-angiogenic agent), 사이토카인, 호르몬, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 분자, siRNA, 제2 항체 및 제2 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치료제에 접합된다. 몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및 TMEM119 중 적어도 하나에 선택적으로 결합한다. 몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 LILRB4에 선택적으로 결합하지 않는다.
몇몇 양태에서, 상기 접촉 또는 투여 단계는 상기 비자극성 골수성 세포의 사멸, 상기 비자극성 골수성 세포의 세포사멸, 상기 비자극성 골수성 세포의 용해, 상기 비자극성 골수성 세포의 식균작용 및 상기 비자극성 골수성 세포의 성장 정지 중 적어도 하나를 유도한다.
몇몇 양태에서, 자극성 골수성 세포는, 예를 들어 유세포계측법 또는 동등한 검정에 의해 결정될 수 있는 바대로, CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+, BDCA1- 및 BDCA3+; CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+; CD45+, HLA-DR+ 및 BDCA3+; CD45+, HLA-DR+, CD14- 및 BDCA3+; 및 CD45+, HLA-DR+, CD11c+ 및 BDCA3+ 중 적어도 하나인 세포를 포함한다. 몇몇 양태에서, 자극성 골수성 세포는, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR), 유전자 어레이, 유세포계측법, RNAseq 또는 동등한 검정에 의해 측정될 수 있는 바대로, C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2, TLR7 및 LILRB4 중 적어도 하나에 대해 음성이고/이거나; KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1 중 적어도 하나에 대해 양성이다.
몇몇 양태에서, 비자극성 골수성 세포는 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에 있다.
몇몇 양태에서, 암 조직은 고형암 또는 액체 암이다. 몇몇 양태에서, 암은 흑색종, 신장, 간담즙성, 두경부 편평상피 암종(head-neck squamous carcinoma; HNSC), 췌장, 결장, 방광, 교모세포종, 전립선, 폐 및 유방으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 몇몇 양태에서, 대상체는 면역치료제를 이전에 받았거나, 동시에 받거나, 후속하여 받을 것이다. 몇몇 양태에서, 면역치료제는 관문 저해제를 저해하는 면역치료제; T 세포의 관문 저해제를 저해하는 면역치료제; 항-PD1; 항-PDL1; 항-CTLA4; 적응성 T 세포 치료제; CAR-T 세포 치료제; 수지상 세포 백신; 단핵구 백신; T 세포 및 항원 제시 세포 둘 다에 결합하는 항원 결합 단백질; BiTE 항원 결합 단백질; 톨 유사 수취 리간드; 및 사이토카인 중 적어도 하나이다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 대상체에서 면역 반응을 증대시킨다. 몇몇 양태에서, 면역 반응은 면역치료제 기반 면역 반응이다. 몇몇 양태에서, 면역치료제 기반 면역 반응은 암 조직에 대해 표적화된다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 자극성 골수성 세포의 활성을 증대시키거나 이의 수를 증가시키는 물질을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 물질은 FLT3L이다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 대상체에서 암을 치료한다.
몇몇 양태에서, 접촉 또는 투여 단계는 면역 세포의 집단에서 자극성 골수성 세포 대 비자극성 골수성 세포의 비율을 증가시킨다. 몇몇 양태에서, 접촉 또는 투여 단계는 종양에 존재하는 전체 CD45+, HLA-DR+ 세포의 종양에 존재하는 1-4% 초과, 1-2%, 1%, 1.37%, 1.6%, 2%, 3% 또는 4%의 자극성 골수성 세포를 가지는 대상체를 발생시킨다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 자극성 골수성 세포 및/또는 비자극성 골수성 세포의 수를 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서, 결정 단계는 대상체가 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여로부터 이익을 얻을지를 결정하도록 사용된다. 몇몇 양태에서, 결정 단계는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여의 유효성을 모니터링하도록 사용된다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2, TLR7 및 LILRB4 중 적어도 하나의 발현 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1 중 적어도 하나의 발현 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 있다. 몇몇 양태에서, 조성물은 무균이다.
몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및 TMEM119로 이루어진 군으로부터 선택된 비자극성 골수성 세포에서 발현된 표적 단백질의 세포외 도메인에 결합하고, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD11c+, CD14+ 및 BDCA3-이고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 통해, 비자극성 골수성 세포와 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 접촉 전에 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포의 수준보다 낮은 수준으로, 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키고, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+, BDCA1 및 BDCA3+인 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에 존재한다.
종양에 대한 대상체의 면역 반응을 증대시키는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있고, 상기 방법은 종양에서 자극성 골수성 세포의 존재비를 증대시키거나 종양에서 비자극성 골수성 세포의 존재비를 감소시키는 유효량의 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 치료제는 종양에 대한 면역 반응을 증대시키고, 임의로 면역 반응은 종양의 용적을 감소시킨다.
종양을 가지는 대상체에서 암 면역치료제 치료의 효능을 개선하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있고, 상기 방법은 종양에서 자극성 골수성 세포의 존재비를 증대시키거나 종양에서 비자극성 골수성 세포의 존재비를 감소시키는 유효량의 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 대상체는 암 면역치료제를 이전에 받았거나, 동시에 받거나, 후속하여 받을 것이다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 FLT3L의 전신 투여 또는 증대를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은, 자극성 골수성 세포를 선택적으로 할애하면서, 비자극성 골수성 세포의 제거 또는 감소를 발생시키는, 하나 이상의 항체의 전신 투여를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은, CSF1의 발현 또는 작용을 동시에 차단하면서, FLT3L에 의한 대상체의 자가유래 골수 또는 혈액 세포의 치료를 포함한다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 골수 또는 혈액 전구세포 집단에서의 IRF8, Mycl1, 또는 BATF3 또는 ZBTB46의 발현을 증대시키는 단계를 포함한다.
대상체로부터의 샘플에서 비자극성 골수성 세포의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있고, 상기 방법은 상기 비자극성 골수성 세포 및 자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단을 상기 비자극성 골수성 세포에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 비자극성 골수성 세포에 대한 항체의 결합을 나타내는 복합체의 존재를 결정하는 단계; 임의로 집단에서의 비자극성 골수성 세포의 수를 정량화하는 단계; 및 임의로 비자극성 골수성 세포에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
대상체로부터의 샘플에서 자극성 골수성 세포의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있고, 상기 방법은 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단을 자극성 골수성 세포에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; 자극성 골수성 세포에 대한 항체의 결합을 나타내는 복합체의 존재를 결정하는 단계; 임의로 집단에서의 자극성 골수성 세포의 수를 정량화하는 단계; 및 임의로 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
종양 샘플에서의 비자극성 골수성 세포를 정량화하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있고, 상기 방법은 종양 연관 대식세포; 종양 연관 수지상 세포; CD45+, HLA-DR+ 및 CD14+; CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+; CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+ 중 적어도 하나이거나; BDCA3+이 아닌, 세포의 수를 측정하는 단계를 포함한다.
종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포를 정량화하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있고, 상기 방법은 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+; CD45+, HLA-DR+ 및 BDCA3+; CD45+, HLA-DR+, CD14- 및 BDCA3+; 및 CD45+, HLA-DR+, CD11c+ 및 BDCA3+ 중 적어도 하나인, 세포의 수를 측정하는 단계를 포함한다.
몇몇 양태에서, 세포는 세포 분류 방법에 의해 정량화된다. 몇몇 양태에서, 세포 분류 방법은 형광 활성화된 세포 분류, 유세포계측법, 자기 활성화된 세포 분류, 마이크로래프트 분류 및 친화도 기반 세포 분리로 이루어진 군으로부터 선택된다.
종양 샘플에서 비자극성 골수성 세포를 정량화하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있고, 상기 방법은 C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2, TLR7 및 LILRB4의 비자극성 골수성 세포 마커 중 적어도 하나의 발현을 측정하는 단계를 포함한다.
종양 샘플에 존재하는 자극성 골수성 세포를 정량화하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있고, 상기 방법은 KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1의 자극성 골수성 세포 마커 중 적어도 하나의 발현을 측정하는 단계를 포함한다.
몇몇 양태에서, 마커의 발현은 정량적 PCR에 의해 측정된다. 몇몇 양태에서, 마커 유전자 발현의 정량화는 마커 유전자 서열에 대한 부동화 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 어레이를 사용하여 달성된다.
몇몇 양태에서, 종양 샘플은 종양의 침생검, 펀치 생검 또는 수술 절제에 의해 종양으로부터 얻어진다.
환자에서의 암 상태를 평가하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있고, 상기 방법은 대상체로부터 종양 샘플을 얻는 단계; 및 대상체로부터 유래한 종양 샘플에서 자극성 골수성 세포의 존재비를 측정하는 단계를 포함한다.
몇몇 양태에서, 평가된 암 상태는 암 재발의 가능성이고; 종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포의 상승된 존재비는 암 재발의 가능성의 감소를 나타낸다. 몇몇 양태에서, 평가된 암 상태는 면역치료제 치료에 대한 대상체의 순응성이고; 종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포의 상승된 존재비는 대상체가 면역치료제 치료에 양성으로 반응할 것이라는 가능성의 증가를 나타낸다. 몇몇 양태에서, 평가된 암 상태는 면역치료제 치료의 유효성이고; 종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포의 상승된 존재비는 효과적인 면역치료제 치료를 나타낸다. 몇몇 양태에서, 평가된 암 상태는 예상된 암 생존 시간이고; 종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포의 상승된 존재비는 예상된 암 생존 시간의 증가를 나타낸다.
몇몇 양태에서, 자극성 골수성 세포의 상승된 존재비는 대표적인 종양 샘플의 풀에서 관찰된 자극성 골수성 세포의 중앙값 또는 평균 존재비를 초과하는 존재비이다. 몇몇 양태에서, 자극성 골수성 세포의 존재비는 샘플에 존재하는 자극성 골수성 세포 대 비자극성 골수성 세포의 비율로서 측정된다. 몇몇 양태에서, 자극성 골수성 세포의 존재비는 샘플에 존재하는 자극성 골수성 세포 대 전체 골수성 세포의 비율로서 측정된다. 몇몇 양태에서, 자극성 골수성 세포의 존재비는 샘플에 존재하는 자극성 골수성 세포 대 전체 HLA-DR+ 세포의 비율로서 측정된다. 몇몇 양태에서, 자극성 골수성 세포의 상승된 존재비는 100개의 HLA-DR+ 세포당 1.37개 초과의 자극성 골수성 세포로서 정의된다. 몇몇 양태에서, 면역치료제 치료는 항-PD1 치료이다. 몇몇 양태에서, 항-PD1 치료는 니볼루맙 또는 펨브로미주랍의 투여이다. 몇몇 양태에서, 대상체는 흑색종을 가진다.
종양에서 자극성 골수성 세포의 존재비를 증가시키는 치료제의 유효성을 평가하는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있고, 상기 방법은 암을 가지는 하나 이상의 대상체에게 치료제를 투여하는 단계; 및 하나 이상의 대상체로부터 유래한 하나 이상의 종양 샘플에서 자극성 골수성 세포의 존재비를 측정하는 단계를 포함하고, 하나 이상의 종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포의 증가한 존재비는 물질이 효과적이라는 것을 나타낸다.
몇몇 양태에서, 자극성 골수성 세포의 증가한 존재비는 치료제의 투여 전에 하나 이상의 대상체로부터 얻은 하나 이상의 종양 샘플에서 관찰된 하나 이상의 종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포의 더 높은 존재비로 정의된다. 몇몇 양태에서, 자극성 골수성 세포의 증가한 존재비는 비치료된 대상체로부터의 대표적인 종양 샘플의 풀에서 관찰된 것보다 치료된 대상체로부터의 하나 이상의 종양 샘플에서의 골수성 세포의 더 높은 존재비로 정의된다.
표 BB에 기재된 하나 이상의 서열을 포함하는 항-LILRB4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 표 BB에 기재된 서열과 적어도 80%, 90% 또는 95%의 서열 동일성을 가지는 이의 변이체, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 BB에 기재된 CDR 서열의 CDR의 각각을 포함하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 BB에 기재된 가변 도메인의 각각을 포함하고, 임의로 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 BB에 기재된 전장 서열을 포함한다.
LILRB4 단백질에 결합하고, 비자극성 골수성 세포를 특이적으로 사멸시키거나 고갈시키거나 불능시킬 수 있는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 LILRB4의 세포외 도메인에 결합하고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 통해 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 고갈시키거나 불능시킨다.
몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 활성, 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성 및 항체 매개 식균작용 활성 중 적어도 하나를 가진다. 몇몇 양태에서, 항체는 단일클론 항체, 길항제 항체, 다중클론 항체, IgG1 항체, IgG3 항체, 비푸코실화 항체, 이중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 전장 항체 및 항원 결합 단편 중 적어도 하나이다. 몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG2 항체가 아니거나, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG4 항체가 아니다. 몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 접합된다. 몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 방사성 핵종, 세포독소, 화학치료제, 약물, 프로드럭, 독소, 효소, 면역조절제, 혈관형성방지제, 세포사멸 촉진제, 사이토카인, 호르몬, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 분자, siRNA, 제2 항체 및 제2 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치료제에 접합된다. 몇몇 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 표 BB에 기재된 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.
본 명세서에 개시된 항-LILBR4 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
몇몇 양태에서, 조성물은 무균이다.
몇몇 양태에서, 본 명세서에 개시된 항-LILBR4 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 본 명세서에 개시된 방법에서 사용된다.
도 1. 마우스 및 인간 종양에서의 희귀 DC 및 풍부한 대식세포. (도 1a) 분해되고 CD45 농후화 PyMTchOVA 종양으로부터의 종양 APC 집단의 유세포계측법 및 게이팅. a-c: 5개 초과의 독립 실험을 대표. (도 1b) 이소성 B78ChOVA 종양의 종양 APC 집단의 세포계측법. (도 1c) B78chOVA에서의 종양 침윤 면역 세포에 의한 종양 유래 mCherry 형광의 히스토그램. (도 1d) CD45+ Lin-(CD3e, CD56, CD19) HLA-DR+에 의해 한정되고 CD14, BDCA1 및 BDCA3에 의해 분할된, 필연적 DC 및 TAM 집단을 확인하는, 분해된 인간 흑색종 전이성 생검의 대표적인 세포계측법. 이중 음성 세포는 아마도 B 세포 도피 계통 게이트, 미성숙 단핵구 또는 pDC를 반영한다. (도 1e) PyMTchOVA 및 B78chOVA 모델에 대한 전체 CD45+ 세포의 %로서의 종양 침윤 골수성 세포의 상대 비율. (n=5) 마우스로부터의 평균 ± SEM으로서 제시된, 개별 종양으로부터의 풀링된 데이터. (도 1f) 전체 CD45+ 세포의 %로서 제시된, DC 및 TAM 집단 침윤 인간 전이성 흑색종의 빈도. (n=4) 생검으로부터 평균 ± SEM으로서 제시된, 다수의 환자로부터의 풀링된 데이터. 도 1c의 경우, 앞으로부터 뒤로의 각각의 세포 유형에 대한 히스토그램은 각각 T 세포, NΦ, DC2, DC1, 모노, TAM2, TAM1 및 종양이다.
도 2. 표면 및 이행 프로파일링은 종양 DC 및 대식세포의 구별되는 계통을 강조한다. 모든 데이터(도 2a-도 2g)는 이소성 B78chOVA 종양 모델로부터 얻는다. 세포 계통은 도 1에 따라 정의된다. (도 2a) 각각의 동형단백질(회색 음영)과 비교하여 일련의 DC 특이적 마커의 발현. 검정 박스는 CD103+ DC2 집단을 윤곽 표시하여, 독특한 발현을 나타낸다. (도 2b) 상응하는 동형단백질(회색 음영)을 가지는 대식세포 특이적 마커(색상)의 차등적 발현. 검정 박스는 CD11b+ DC1, TAM1 및 TAM2 집단을 윤곽 표시하여, 독특한 발현을 나타낸다. (도 2c) 각각의 동형단백질(회색 음영)과 비교하여 CD11b+ DC1 집단에 의한 DC-Th2 마커(색상)의 특이적 발현. 검정 박스는 CD11b+ DC1을 윤곽 표시하여, 독특한 발현을 나타낸다. (도 2d) 생물학적 3회 반복으로부터의 FACS 정제된 집단의 RNAseq에 의해 나타난 전체 이행 프로필. DC1, DC2, TAM1과 TAM2 사이의 최대 변량에 의해 상위 1000개의 유전자의 전체 평균에 대한 Log2 배수 변화의 열 지도로서 나타난데이터. (도 2e) RNAseq 전체 이행 프로필에 기초한 PCA of DC1, DC2, TAM1 및 TAM2 집단. (도 2f) 분류된 APC 집단으로부터의 Irf4 , Irf8 , Myb 및 Zbtb46(zDC)의 발현의 qRT-PCR 분석. 생물학적 3회 반복(n=3)으로부터 계산된 평균 ΔCt ± SEM으로 제시된 데이터(N.D. 검출되지 않음). (도 2g) 각각의 동형단백질(회색)과 비교하여 종양 APC 집단에서의 Irf4 및 Irf8에 대한 세포내 염색. 도 2e의 경우, 왼쪽으로부터 오른쪽의 3개의 점의 각각의 클러스터는 각각 CD103+DC2, CD11b+DC1, F4/80+ TAM1 및 F4/80+ TAM2이다.
도 3. 종양 침윤 APC 집단에 대한 차등적 Irf4 , Irf8 및 Batf3 요건. 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된 CD11b+DC1 및 CD103+DC2 집단(CD45+, Ly6C-, MHCII+ 및 CD24+에서 게이팅됨) 데이터의 대표적인 유세포계측 분석이다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; ns = 통계적으로 무의미로 표시된 통계 유의성. (도 3a) 대조군(WT)과 비교하여 Irf8 -/-(KO)로부터의 이소성 PyMT-VO 종양. 전체 MHCII+ 세포의 %로서의 상대 세포 비율. 2개의 독립 실험으로부터의 개별 마우스(n=6)로부터 풀링된 데이터. (도 3b) Cre 음성 한배 새끼와 비교하여 Irf4 f /f x CD11c-CRE+ 숙주에서의 이소성 B78chOVA 종양. 전체 MHCII+ 세포의 %로서의 상대 세포 비율. 2개의 독립 실험으로부터의 개별 마우스(n=7)로부터 풀링된 데이터. (도 3c) WT와 비교하여 Batf3 KO에서의 이소성 B78chOVA 종양. 전체 MHCII+의 %로서 그래프 표시된 상대 세포 비율. 개별 마우스(n=6)로부터 풀링된 데이터. (도 3d) DT 또는 PBS에 의해 급성 24시간 고갈을 받은, Zbtb46-DTR 마우스에서의 이소성 B78chOVA 종양. 전체 MHCII+ 세포의 %로서 그래프 표시된 상대 세포 비율. 2개의 독립 실험으로부터의 개별 마우스(n=6)로부터 풀링된 데이터.
도 4. 종양 침윤 APC 집단에 의한 M- CSF 및 GM- CSF 사이토카인에 대한 차등적 의존성. (도 4a) 분류된 APCf로부터의 CSF1R, CSF2Rb 및 CSF3R 발현의 qPCR. 개별 B78chOVA 종양의 생물학적 3회 반복(n=3)으로부터 계산된 평균 ΔCt ± SEM으로 제시된 데이터(N.D. 검출되지 않음). (도 4b) 동형단백질(채워짐) 처리된 종양 동물과 비교하여 αCSF-1 블록(점)의 3일 후 종양 APC의 세포계측법. 평균 ± SEM으로 표시된 2개의 독립 실험으로부터의 개별 마우스(n=6)로부터 풀링된 전체 종양 CD45+ 세포의 %로서 정량화됨. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; ns = 통계적으로 무의미로 표시된 통계 유의성. (도 4c) BM, 비장 및 종양에 대한 BM 전구세포 적응성 전달 및 기여의 도식. (도 4d) 동족 세포에 도달하는 종양의 대표적인 세포계측법. CD45.2에서 게이팅되고, 도 1a의 게이팅 전략 후. (도 4e) B78chOVA 종양 수혜자로의 GMCSFR KO GMP 전구세포에 대한 WT의 경쟁적 BM 적응성 전달. 전체 전달된 세포의 %로서 작도된 재증식 효율. GMP 세포, WT(BM, 비장 및 종양의 각각에 대한 왼쪽 막대), KO(BM, 비장 및 종양의 각각에 대한 오른쪽 막대)에 도달한 종양의 대표적인 게이팅. CD24+ CD11c+에 의해 한정된, DC에 도달한 종양의 정량화. 개별 종양(n=6)으로부터 평균 ± SEM으로 작도된, 2개의 독립 실험으로부터 풀링된 데이터. (도 4f) 이소성 B16-F10, B16-GMCSF와 B16-FLT3L 사이토카인 발현 종양 사이의 CD11b+DC1 및 CD103+DC2 집단(CD45+, Ly6C- MHCII+, CD24+에서 게이팅됨)의 세포계측법. 각각의 종양에 대한 전체 MHCII+ 세포의 %로서 제시된 집단. 데이터는, 개별 종양(n=6)으로부터 평균 ± SEM으로 작도된, 3개의 독립 실험으로부터 풀링된다. 도 4f(오른쪽 패널)에서의 각각의 군의 경우, 왼쪽으로부터 오른쪽으로 나타난 막대는 각각 DC2, DC1, TAM1 및 TAM2이다.
도 5. CD103 + DC2의 독특한 항원 처리 및 제시 능력. 모든 데이터(도 5a-도 5g)는 이소성 B78chOVA 종양 모델로부터 얻는다. (도 5a) 교차 제시, 사이토카인 및 케모카인 생성, 및 동시자극에 관여한 선택된 유전자에 대한 집단에 걸친 RNAseq로부터의 Log2 형질전환된 발현의 열 지도. 밝은 회색 = 하부 20번째 백분위, 어두운 회색 = 상부 80번째 백분위(20번째-80번째 백분위가 등급 매겨지고 집중됨(50번째 백분위))로서 정의된, 색상 스케일. 분류된 세포의 생물학적 3회 반복으로부터의 데이터. (도 5b) 각각의 동형단백질(회색 음영)과 비교하여 T 세포 조절 분자(어두운 선)에 대한 리간드의 표면 단백질 수준의 세포계측법. (도 5c) 각각의 동형단백질(음영; 뒤의 4개의 선)과 비교하여 MCHI 및 MHCII(어두운 선; 앞의 4개의 선) 발현의 세포계측법. 도 5c의 경우, 색상의 앞으로부터 뒤로의 각각의 선은 각각 CD103+ DC2, CD11b+ DC1, F4/80+ TAM1 및 F4/80+ TAM2이다. 도 5c의 경우, 음영의 앞으로부터 뒤로의 각각의 선은 각각 CD103+ DC2, CD11b+ DC1, F4/80+ TAM1 및 F4/80+ TAM2이다. (도 5d) 집단에 걸친 생체외 덱스트란 흡수의 세포계측법. 회색 = 덱스트란 무, 밝은 히스토그램 = 4℃에서의 덱스트란 결합 및 37℃에서의 덱스트란 흡수 = 어두운 히스토그램(3회 반복 표시됨). 평균 ± SEM으로서 작도된, 각각의 집단에 대한 델타 기하학적 평균 형광 강도(gMFI). 데이터는 2개의 독립 실험(n=6)을 대표한다. (도 5e) 집단에 걸친 식균작용 구획의 상대 pH의 세포계측법 분석. B78 종양 세포를 N1-mCherry-pHlourin인 비율 척도 pH 작제물에 의해 형질감염시켰다. pH 민감성 GFP 유도체인 pHluorin은 산성 pH에서 켄칭된다. 대표적인 히스토그램은 mCherry+ 세포에서의 pHluorin의 형광을 보여주고, 여기서 더 적은 pH-GFP가 더 산성인 환경을 나타낸다. 회색 히스토그램은 비-pHluorin 발현 대조군 종양(B78모)으로부터의 각각의 집단이다. GFP와 mCherry 형광 사이의 gMFI의 비율로서 요약된 데이터. 3개의 독립 실험으로부터 풀링된, 평균 비율 ± SEM으로서 제시된 데이터. (도 5f) 집단에서의 IL12의 세포내 사이토카인 염색. 각각의 집단에 걸쳐 정량화된 IL12+ 세포의 %, 평균 ± SEM으로서 작도된, 2개의 독립 실험(n=3)으로부터 풀링된 데이터. 통계 유의성은 *p<0.05로 표시된다. 도 5f의 경우, 앞으로부터 뒤로의 각각의 선은 각각 CD103+ DC2, CD11b+ DC1, F4/80+ TAM1 및 F4/80+ TAM2이다. (도 5g) 사이토카인 Il12b 및 Il10 전사체에 대해 qPCR에 의해 측정된, 전사체 수준. 개별 종양의 생물학적 3회 반복(n=3)으로부터 계산된 평균 ΔCt ± SEM으로서 제시된 데이터(N.D. 검출되지 않음).
도 6. CD103 + DC는 미경험 및 활성화된 CD8 + T 세포에 대한 우수한 T 세포 자극물질이다. 모든 데이터(도 6a-도 6g)는 이소성 B78chOVA 종양 모델로부터 얻어진다. T 세포+BMDC(음영 회색; 가장 뒤), T 세포+BMDC+ SL8(비음영 회색; 두 번째 가장 뒤), T 세포+종양 APC(각각의 색상의 히스토그램). 20,000 T 세포: 4,000 APC 비율로 플레이팅됨. 기재되지 않은 경우, 4개의 독립 실험으로부터의 대표적인 흐름 도면. (도 6a) 직접적으로 종양으로부터 분류된 APC 집단에서 배양된 미경험 또는 이전에 활성화된 OT-I CD8+ T 세포에서의 Nur77 및 CD69(12시간)인 조기 활성화 마커의 유세포계측법. 도 6a의 경우, 앞으로부터 뒤로의 각각의 선은 각각 F4/80+ TAM2, F4/80+ TAM1, CD11b+ DC1 및 CD103+ DC2이다. (도 6b) 종양 APC 집단에 의한 동시배양 후 72시간에 (TCR 촉발의 측정치로서) Nur77에 대해 작도된, eFluor670의 염료 희석에 의해 측정된, 미경험 OT-I CD8+ T 세포 증식의 대표적인 세포계측법. 전체 세포 수율 계수는 상기 그래프를 기재한다. (도 6c) 종양 APC 사이의 미경험 T 세포 증식의 히스토그램 오버레이. 도 6c의 경우, 앞으로부터 뒤로의 각각의 선은 각각 F4/80+ TAM1, F4/80+ TAM2, CD11b+ DC1 및 CD103+ DC2이다. (도 6d) 종양 APC 집단에서 배양된 이전에 활성화된 OT-I CD8+ T 세포 아구에 대한 72시간에 Nur77에 대해 작도된, eFluor670의 염료 희석에 의해 측정된, T 세포 증식의 대표적인 세포계측법. 전체 세포 수율 계수는 상기 그래프를 기재한다. (도 6e) 종양 APC에 걸쳐 이전에 활성화된 OT-I CD8+ T 세포 증식의 히스토그램 오버레이. 도 6e의 경우, 앞으로부터 뒤로의 각각의 선은 각각 F4/80+ TAM1, F4/80+ TAM2, CD11b+ DC1 및 CD103+ DC2이다. (도 6f) 종양 APC 집단에서 배양된 미경험 OT-II CD4+ T 세포에 대한 72시간에 eFluor670의 염료 희석에 의해 측정된, T 세포 증식의 대표적인 세포계측법. 2개의 독립 실험으로부터의 대표적인 흐름 도면. (도 6g) 종양 APC에 걸친 미경험 OT-II CD4+ T 세포 증식의 히스토그램 오버레이. 도 6g의 경우, 앞으로부터 뒤로의 각각의 선은 각각 F4/80+ TAM1, F4/80+ TAM2, CD11b+ DC1 및 CD103+ DC2이다.
도 7. 생존중 및 슬라이스 영상화는 CD11b+DC1 및 CD103+DC2가 종양 주변 근처에 희박하지만 거기에 존재할 때 T 세포와 상호작용할 수 있다는 것을 보여준다. (도 7a) 종양 내의 APC의 근위/원위 위치의 정량화. 평균 ± SEM으로서 제시된, 4개의 독립적인 영상화 실행으로부터 풀링된 데이터. 도 7a의 경우, 각각의 군에 대한 막대는 왼쪽으로부터 오른쪽으로 각각 TAM2, TAM1 및 DC1/2이다. (도 7b) 관찰된 전체 T 세포 커플의 %로서 생체내 APC-T 세포 접촉. 2개의 독립적인 생존중 2회 광자 영상화 실행에서 30분 동안 영상화된 4개의 상이한 위치의 축적 데이터. 접촉은 T 세포 및 적색, 황색 및 녹색 APC 사이에 만들어진 물리적 접촉을 계수함으로써 수동으로 스코어링된다. 막대의 위치는 접촉의 APC를 나타낸다(상부: CD103+, CD11b+ DC1, 하부: TAM1, 중간: TAM2). (도 7c) 이전에 활성화된 OT-I CD8+ T 세포에 의해 CD45+ 세포에 대해 양성으로 선택된 분해된 종양에 의한 생체외 T 세포 커플링 검정. 집단의 각각 내의 T 세포 커플의 %(왼쪽) 및 T 세포 커플의 전체 %(오른쪽)로서 계산된 데이터. 평균 ± SEM으로서 작도된, 2개의 독립 실험으로부터 풀링된 데이터. 도 7c의 경우, 왼쪽으로부터 오른쪽의 각각의 군의 각각의 막대는 각각 DC2, DC1, TAM1 및 TAM2이다.
도 8. 종양에서의 희귀 CD103 DC2 집단은 효율적인 적응성 CTL 처리에 대해 필요하다. (도 8a) zDC-DTR 숙주에서 EG7.1에 대한 시간에 따른 종양 면적(㎟)으로서 작도된 종양 성장 곡선. 화살표는 각각 4일 및 5일에 i.p. D.T./PBS 투여의 시간, 및 5x106개의 이전에 활성화된 OT-I CD8+ T 세포의 i.v. 전달을 나타낸다. DT/PBS를 후속하여 매 3일째 날에 투여하고, FTY-720/식염수를 후속하여 시간 과정에 걸쳐 격일마다 투여하였다. 밝은 회색의 파선(상부)은 T 세포의 전달 없이 zDC-DTR 숙주에서의 EG7.1 성장을 보여준다. 활성화된 CD8+ T 세포의 전달 및 FTY-720 처리 시(검정 선; 하부) 또는 추가적인 DT 매개 DC 고갈에 의한(어두운 회색 선; 중간) EG7.1 퇴행. 2개의 독립 실험으로부터의 평균 종양 면적 ± SEM(n = 4)으로서 제시된 대표적인 데이터. 통계 유의성은 *p<0.05로 표시된다. (도 8b) 공변량으로서 암 유형에 대해 조정하는 다변량 COX 비례 위험 생존 분석에서의 TCGA 인간 샘플에 대한 개별 유전자(CD103+ 특이적 유전자, 녹색, 또는 TAM1/TAM2/Cd11b DC1 특이적 유전자, 적색)와 비교된 CD103+/CD103- 비율 유전자 신호의 예후 값의 비교. BH p-값<0.05로 유전자에 대해 95% 신뢰도 간격(여기서, 값 <1은 증가한 전체 생존(OS)을 의미하고; >1은 감소한 OS를 의미함)을 가지는 위험 비율(HR)로서 표시된 데이터. (도 8c) 공변량으로서 암 유형에 대해 조정하는 다변량 COX 비례 위험 생존 분석에서의 TCGA 인간 샘플에 대한 여러 공개된 예후 유전자 서명과 비교된 CD103+/CD103- 비율 유전자 신호의 예후 값의 비교. BH p-값<0.05로 유전자에 대해 95% 신뢰도 간격(여기서, 값 <1은 증가한 전체 생존(OS)을 의미하고; >1은 감소한 OS를 의미함)을 가지는 위험 비율(HR)로서 표시된 데이터. (도 8d) 암 유형에 대해 조정하는 인간 TCGA 데이터 세트에서 모든 12개의 암에 걸친 K-M 곡선. p-값 = 1.76e-07로 높은 CD103+/CD103- 유전자 비율(검정, n = 1801) 및 낮은 CD103+/CD103- 비율 발현자(회색, n = 1801)에서 분석된 데이터. (도 8e) TCGA 데이터 세트에서 유방 암 환자의 전체 생존에 대한 K-M 도면. p-값 = 0.0255로 높은 CD103+/CD103- 유전자 비율(검정, n = 422) 및 낮은 CD103+/CD103- 비율 발현자(회색, n = 423)에서 분석된 데이터. (도 8f) TCGA 데이터 세트에서 두경부 편평 세포 암종 환자의 전체 생존에 대한 K-M 도면. p-값 = 0.000207로 높은 CD103+/CD103- 유전자 비율(검정, n = 151) 및 낮은 CD103+/CD103- 비율 발현자(회색, n = 152)에서 분석된 데이터. (도 8g) TCGA 데이터 세트에서 폐 선암 환자의 전체 생존에 대한 K-M 도면. p-값 = 0.000874로 높은 CD103+/CD103- 유전자 비율(검정, n = 177) 및 낮은 CD103+/CD103- 비율 발현자(회색, n = 178)에서 분석된 데이터.
도 9. CD103+ 및 BDCA3+ 유전자의 전사 존재비는 전이성 흑색종에서 증가한 재발 후 생존과 연관된다. (도 9a) COX 비례 위험 생존 분석에서 전이성 흑색종 데이터 세트를 사용한 CD103+ 유전자, CD103+/- 비율, 및 개별 유전자의 예후 값의 비교. 데이터는 BH 조정된 p 값<0.05로 95% 신뢰도 간격(여기서, <1은 전이의 시간(재발 후 생존) 이후로 증가한 전체 생존(OS)을 의미하고, >1은 전이의 시간 이후로 감소한 OS를 의미함)으로 위험 비율(HR)로 표시된다. (도 9b) CD103+ 유전자 목록 발현에 대해 전이성 흑색종 환자의 재발 후 생존에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 도면. 데이터는 CD103+ 유전자의 발현의 수준에 대해 33%, 50% 및 66% 엄격도 한계치에서 "높은"(밝은 회색; 각각의 도면의 상부 선) 및 "낮은"(검정; 각각의 도면의 하부 선) 빈으로 분석된다. (도 9c) CD103+/- 비율 유전자 발현에 대해 전이성 흑색종 환자의 재발 후 생존에 대한 카플란-마이어 도면. 데이터는 CD103+/- 비율 유전자의 발현의 수준에 대해 33%, 50% 및 66% 엄격도 한계치에서 "높은"(밝은 회색; 각각의 도면의 상부 선) 및 "낮은"(검정; 각각의 도면의 하부 선) 빈으로 분석된다. 도 9d-도 9e. TIL 카테고리 및 도 9f-도 g의 종류 기반 측정치. {Bogunovic et al, 2009}로부터의 종양주변 CD3+ T 세포 수의 조직학적 측정치는 SDC 유전자 서명(도 9d, 도 9f) 및 SDC/NSM 비율(도 9e, 도 9g)에 대해 작도된다.
도 10. 인간 전이성 흑색종에서의 종양 침윤 APC 집단의 유세포계측 정량화. (도 10a) 인간 전이성 흑색종 생검 환자 표. 환자 신원, 연령, 성별 및 종양 생검의 위치, 및 각각의 환자에 대한 이전의 치료(알려진 경우)의 표. 기재된 모든 환자는 UCSF에서 항-PD-1 면역치료제를 받았다. 이전의 병력은 미경험, 0 또는 치료, 1로 코딩된다. **는 추가적인 스캔이 불가능하게 하는 신속한 진행을 나타낸다. (도 10b) 종양 침윤 골수성 하위세트를 한정하도록 인간 전이성 흑색종에 대한 대표적인 유세포계측 게이팅 전략. 데이터는 단일선 및 생 세포에서 게이팅된 주요 BDCA3+ 및 BDCA1+ DC 집단을 가지는 환자를 대표한다. (pDC, CD14+ TAM, BDCA1+ DC, BDCA3+, CD14-TAM). (도 10c) 종양 침윤 골수성 하위세트를 한정하도록 인간 전이성 흑색종에 대한 대표적인 유세포계측 게이팅 전략. 데이터는 단일선 및 생 세포에서 게이팅된 주요 BDCA3+ DC 집단이 없는 환자를 대표한다. (pDC, CD14+, BDCA1+ DC, BDCA3+ DC, CD14-T AM). (도 10d) 환자 생검에 걸쳐 전체 생 세포의 백분율로서 CD45+(검정; 각각의 군의 왼쪽 막대) 및 HLA-DR+(회색; 각각의 군의 오른쪽 막대) 세포의 빈도. (도 10e) 게이팅 전략에 의해 한정된 바와 같은 환자 생검에 걸친 종양 침윤 면역 집단의 빈도. 데이터는 환자에 걸쳐 전체 CD45+ 세포의 빈도(평균 ± S.E.M.)로서 제시된다. pDC, CD14+ TAM, BDCA1++ DC, BDCA3+ DC, CD14-TAM, 계통 마커(CD3e, CD56, CD19).
도 11. 인간 흑색종에서의 BDCA3 + DC의 세포 존재비는 항-PD1 반응성을 예측한다. 반응자(회색, 부분 또는 완전 반응 포함) 또는 비반응자(검정, 안정한 질환 및 진행성 질환 포함)로서 비닝된 환자. (도 11a) 반응자 및 비반응자에 의해 분리된, 개별 환자에서의 전체 생 세포의 CD45+ 세포의 백분율의 폭포 도면. (도 11b) 종양에서의 전체 생 세포의 CD45+ 세포의 백분율에 대한 반응자(회색) 및 비반응자(검정)의 정량화된 빈도. 데이터는 환자에 걸쳐 풀링되고 평균 ± S.E.M.으로서 제시된다, n.s. = 무의미함. (c) 반응자 및 비반응자에 의해 분리된, 개별 환자에서의 종양에서의 전체 CD45+ 세포의 BDCA3+ DC의 백분율의 폭포 도면. (도 11d) 종양에서의 전체 CD45+ 세포의 BDCA3+ DC의 백분율에 대한 반응자(회색) 및 비반응자(검정)의 정량화된 빈도. 데이터는 환자에 걸쳐 풀링되고 평균 ± S.E.M.으로서 제시된다, **p=0.0056. (도 11e) 종양에서의 전체 HLA-DR+ 세포의 비율로서 BDCA3+ DC 및 CD14+ TAM의 빈도의 산란 도면, 반응자는 열린 원으로 표시되고 비반응자는 닫힌 원으로 표시된다. (도 11f) 종양에서의 전체 HLA-DR+ 세포의 비율로서 BDCA3+ DC 및 BDCA1+ DC의 빈도의 산란 도면, 반응자는 열린 원으로 표시되고 비반응자는 닫힌 원으로 표시된다. (도 11g) 종양에서의 전체 HLA-DR+ 세포의 비율로서 BDCA3+ DC 및 CD14-TAM의 빈도의 산란 도면, 반응자는 열린 원으로 표시되고 비반응자는 닫힌 원으로 표시된다.
도 12. 흑색종의 마우스 모델에서의 항-PD1 효능에 대한 CD103 + DC의 요건. (도 12a) 조합된 면역치료제 치료 섭생을 가지는 마우스 및 종양 모델의 도식. (도 12b) 종양 성장의 5일, 8일 및 11일에 100㎍의 대조군 아르메니아(Armenian) 햄스터 IgG 및 100㎍의 대조군 랫트 IgG2a i.p.를 받은 B6 대조군 마우스(가장 왼쪽의 그래프)에서의 개별 B78chOVA 종양의 종양 면적(㎟). 데이터는 2개의 독립 실험(n = 8)으로부터 풀링된다. (도 12c) 4일, 7일 및 10일에 PBS의 주사와 함께 종양 성장의 5일, 8일 및 11일에 100㎍의 항-CTLA-4 및 100㎍의 항-PD-1을 받은 Zbtb46-DTR BM 키메라 마우스(중간 그래프)에서의 개별 B78chOVA 종양의 종양 면적(㎟). 데이터는 2개의 독립 실험(n = 8)으로부터 풀링된다. (도 12d) 4일, 7일 및 10일에 DT의 주사와 함께 종양 성장의 5일, 8일 및 11일에 100㎍의 항-CTLA-4 및 100㎍의 항-PD-1을 받은 Zbtb46-DTR BM 키메라 마우스(가장 오른쪽의 그래프)에서의 개별 B78chOVA 종양의 종양 면적(㎟). 데이터는 2개의 독립 실험(n = 8)으로부터 풀링된다.
도 13은 진행성 게이팅이, 유세포계측법에 의해 분석된 바대로, 모든 디스플레이된 인간 종양 유형(전이성 흑색종, 두경부 편평 세포 암종(HNSC) 및 결장 암종)에서의 NSM 집단 및 SDC 집단 둘 다를 확인하였다는 것을 보여준다.
도 14는 B16-F10 및 MC38 이소성 마우스 종양 모델에 걸쳐 TREM2를 포함하는 다양한 NSM 마커에 의한 종양 미세환경에서의 표시된 세포 하위세트의 표지, 및 유세포계측법에 의해 분석된 바와 같은 MS467, LILRB4 및 CD88 염색을 보여준다. 모든 NSM 마커에 대한 염색 패턴은 SDC(CD103+ DC)를 염색하지 않으면서 NSM 집단(TAM, Ly6C+ 단핵구, CD11b+ DC)에 대한 높은 특이성을 보여준다. 도 1a, 도 1b 게이팅 전략에서처럼 이전에 게이팅된 집단. 각각의 집단에 대한 2차 대조군은 음영 회색이지만, NSM 마커에 대한 염색은 각각의 집단에 대해 실선 검정 히스토그램에 의해 오버레잉된다.
도 15는 인간 SDC에서의 CCR7 발현을 보여준다. 도 13 게이팅 전략에서처럼 이전에 게이팅된 집단.
도 16은 마우스 이소성 B16-F10 종양의 종양 미세환경에서 SDC(CD103+ DC)에서의 CCR7 및 XCR1인 SDC 유전자 생성물의 특이적 발현 및 NSM(TAM, Ly6C+ 단핵구, CD11b+ DC)에서의 SDC 단백질 발현의 결여를 보여준다. 도 1a, 도 1b 게이팅 전략에서와 같이 이전에 게이팅된 집단. 각각의 집단에 대한 2차 대조군은 음영 회색이지만, SDC 마커에 대한 염색은 각각의 집단에 대해 실선 검정 히스토그램에 의해 오버레잉된다.
도 17은, 유세포계측법에 의해 분석된 바대로, 야생형 C57BL/6 수컷 마우스로부터의 건강한 BM 및 비장 조직에서의 MS4A7 및 TREM2인 NSM 마커에 대한 염색의 부재를 보여준다. 도 1a, 도 1b 게이팅 전략에서처럼 이전에 게이팅된 집단. 각각의 집단에 대한 2차 대조군은 음영 회색이지만, MS4A7 및 TREM2에 대한 염색은 각각의 집단(상부 도면)에 대해 실선 검정 히스토그램에 의해 오버레잉된다. 도면의 하부 절반은 면역 집단에 걸쳐 aTREM2 항체 클론 2, 5 및 7의 적정된 농도(0nM, 2nM, 20nM 및 200nM)를 가지는 건강한 BM 및 비장 마우스 조직에서의 염색의 특이적 결여를 보여준다.
도 18은 항-TREM2 및 항-LILRB4 항체가 각각 생체내 TREM2 및 LILRB4 보유 세포를 특이적으로 고갈시킨다는 것을 보여준다. 대조군 및 TREM2 또는 LILRB4 발현 EL4 형질전환체 세포를 1:1 비율로 혼합하고, WT B6 수컷 마우스에 IP 주사하였다. 3시간 후, 동물에 (항-TREM2 또는 항-LILRB4) 항체 또는 대조군 인간 IgG1 또는 PBS를 주사하였다. 36시간 후, 마우스를 희생시키고 복막으로부터 세포를 회수하고 복막 세척에 의해 수확하고 유세포계측법에 의해 열거되었다.
도 19는 항-NSM 항체가 항-PD-1 처리와 동일한 정도로 대조군에 대해 종양 성장을 감소시킨다는 것을 나타낸다. MC38 결장 암종을 B6 6주령 수컷 마우스에 주사하였다. 처리 군으로 무작위화된 마우스를 IP 주사에 의해 5일, 7일, 11일, 15일에 표시된 항체에 의해 처리하였다. 75% 랭크(상부 극단치에 떨어지고, 4마리 중 하부 3마리의 마우스가 작도됨)가 도시되어 있다. 투약: PD-1 및 Fc 대조군에 대해 200㎍/일, 40㎍, 20㎍, 20㎍ 및 40㎍ 주사를 5일, 7일, 11일 및 15일에 항-Pi1.2(aTREM2) 항체에 대해 만들었다. 종양을 캘리퍼에 의해 측정하고, 종양 용적이 도시되어 있다.
도 20은 인간 흑색종에서의 BDCA3+의 수용자 조작 특징(Receiver Operating Characteristic; ROC) 분석을 보여준다. %BDCA3 및 항-PD1 결과 데이터에 대한 염색 데이터는 (도 20a) 결과에 대한 BDCA3+ 대 CD45+ 비율의 ROC 분석; 및 (도 20b) 결과에 대한 BDCA3+ 대 HLA-DR+ 비율의 ROC 분석을 수행하기 위해 이용되었다.
도 21은 1차 인간 HNSC 종양 조직에서 SDC(BDCA3+ DC)를 포함하는 CD14 음성 CD11c 양성 세포에서 아주 적은 발현을 가지거나 가지지 않는 NSM 집단(CD14+ TAM)에 TREM2 단백질의 제한된 발현을 입증한다. TREM2 특이적 상업용 항체(RnD, 클론 237920) 염색을 2차 대조군 염색(항-랫트 IgG, 잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))과 비교하여 분해된 인간 HNSC 종양 조직에서 수행하고, 유세포계측법에 의해 분석하였다. 이 도면은 인간 종양 조직에서의 NSM 세포에서의 NSM 유전자 생성물의 특이적 발현 및 SDC 세포에서의 발현의 결여를 보여준다. 생, CD45+, 계통 음성, HLA-DR+, CD11c+에서 게이팅되고 CD14 발현에 의해 분할된 집단.
본 발명의 이들 및 다른 양태 및 이점은 후속하는 상세한 설명 및 청구항으로부터 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태의 특성 중 하나, 일부 또는 전부는 본 발명의 다른 실시형태를 형성하도록 조합될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서를 이해할 목적을 위해, 하기 정의가 적용될 것이고, 적절할 때마다, 단수로 사용된 용어는 또한 복수를 포함하고 그 반대일 것이다. 하기 기재된 임의의 정의가 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 임의의 문헌과 상충하는 경우, 기재된 정의가 지배해야 한다.
본 명세서에 기재된 본 발명의 양태 및 실시형태가 양태 및 실시형태를 "포함하는", "이들로 이루어지는" 및 "이들로 본질적으로 이루어지는" 것으로 이해된다.
본 명세서에 기재된 모든 조성물 및 본 명세서에 기재된 조성물을 사용한 모든 방법의 경우, 조성물은 기재된 성분 또는 단계를 포함할 수 있거나, 기재된 성분 또는 단계로 "본질적으로 이루어질" 수 있다. 조성물이 기재된 성분으로 "본질적으로 이루어진" 것으로 기재된 경우, 조성물은 기재된 성분을 함유하고, 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 성분을 함유할 수 있지만, 명확히 기재된 성분 이외에 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치는 임의의 다른 성분을 함유하지 않거나; 조성물이 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치는 기재된 성분 이외에 추가의 성분을 함유하는 경우, 조성물은 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치는 추가의 성분의 충분한 농도 또는 양을 함유하지 않는다. 방법이 기재된 단계로 "본질적으로 이루어진" 것으로 기재된 경우, 이 방법은 기재된 단계를 함유하고, 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 단계를 함유할 수 있지만, 이 방법은 명확히 기재된 단계 이외에 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치는 임의의 다른 단계를 함유하지 않는다. 비제한적인 구체적인 예로서, 조성물이 성분으로 "본질적으로 이루어진" 것으로 기재된 경우, 조성물은 임의의 양의 약제학적으로 허용되는 담체, 비히클 또는 희석제, 및 치료되는 병태에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 이러한 성분을 추가적으로 함유할 수 있다.
용어 "임의로"는, 순차적으로 사용될 때, 열거된 조합 중 하나 내지 전부를 포함하도록 의도되고, 모든 하위조합을 고려한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "유효량" 또는 "치료학적 유효량"은, 단독으로 또는 또 다른 치료학적 양상과 조합되어, 원하는 치료학적 효과를 생성하거나 이에 기여하는 데 효과적인, 단일 용량으로서 또는 일련의 용량의 일부로서, 개체에게 투여되는, 치료학적 화합물, 예컨대 항-NSM 항원 결합제 또는 항-NSM 항체의 양을 의미한다. 원하는 치료학적 효과의 예는 면역 반응의 증대, 종양 발생을 느리게 하거나 지연시키는 것; 질환의 안정화; 하나 이상의 증상의 완화이다. 유효량은 하나 이상의 투약량으로 제공될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "치료하는"은 병태, 예컨대 암의 진행의 억제 또는 역전을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "치료"는 병태, 예컨대 암의 치료의 작용을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "개체" 또는 "대상체"는 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 토기, 소, 돼지, 햄스터, 저빌, 마우스, 페럿, 랫트, 고양이 등을 포함하는 포유류로서 분류된 임의의 동물을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 개체는 인간이다. 몇몇 실시형태에서, 개체는 마우스이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "약"은 이 기술 분야의 당업자에게 용이하게 공지된 각각의 값에 대한 일반 오차 범위를 의미한다. 본 명세서에서 "약"의 값 또는 매개변수의 언급은 특히 그 값 또는 매개변수에 관한 실시형태를 포함한다(그리고 기재한다).
명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바대로, 단수 형태 "일", "하나" 및 "이"는 문맥이 명확히 달리 기재하지 않은 한 복수 지시어를 포함한다는 것에 주목해야 한다.
본 명세서에 기재된임의의 구조 및 기능 특징의 경우, 이 특징을 결정하는 방법이 당해 분야에 공지되어 있다.
비자극성 골수성 세포( NSM )
항-NSM 항체의 사용을 포함하는 비자극성 골수성 세포(NSM)를 불능시키고/시키거나 검출하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. NSM 단백질을 발현하는 비자극성 골수성 세포를 표적화하고/하거나 검출하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 또한 제공된다.
비인간 개체에서 인간 NSM 단백질의 비인간 동족체에 지향된 항체의 사용을 포함하는 비자극성 골수성 세포를 불능시키고/시키거나 검출하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 또한 제공된다.
본 명세서에 사용된 바대로, 비자극성 골수성 세포는 면역 반응을 자극하는 데 있어서 충분히 효과적이 아닌(예를 들어, 자극성 골수성 세포와 비교하여 종양 미세환경에서 항종양 반응을 자극하는 데 있어서 효과적이지 않은) 골수성 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 자극성 골수성 세포와 비교하여 T 세포에 항원(예를 들어, 종양 항원)을 제시하는 데 효과적이 아니거나, 종양 특이적 T 세포 반응을 자극하는 데 있어서 효과적이지 않다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 자극성 골수성 세포와 비교하여 종양 연관 항원을 흡수하고/하거나 처리하고/하거나 T 세포에 제시하는 능력의 감소를 나타낼 수 있다. 비자극성 골수성 세포는 세포독성 T 림프구를 다시 프라이밍하는 감소한 능력을 포함하거나 포함하지 않을 수 있거나 몇몇 경우에 효과적인 종양 세포 사멸을 자극할 수 없다. 비자극성 골수성 세포는 자극성 골수성 세포와 비교하여, 제한 없이, CD80, CD86, MHCI 및 MHCII를 포함하는, 항원 처리, 항원 제시 및/또는 항원 동시자극에 관여하는, 유전자 및 세포 표면 마커의 더 낮은 발현을 나타낼 수 있다.
비자극성 골수성 세포는, 자극성 골수성 세포와 비교할 때, 제한 없이, TAP1, TAP2, PSMB8, PSMB9, TAPBP, PSME2, CD24a, CD274, BTLA, CD40, CD244, ICOSL, ICAM1, TIM3, PDL2, RANK, FLT3, CSF2RB, CSF2RB2, CSF2RA, IL12b, XCR1, CCR7, CCR2, CCL22, CXCL9 및 CCL5 중 임의의 하나 이상을 포함하는, 교차 제시, 동시자극 및/또는 자극 사이토카인과 연관된 유전자의 더 낮은 발현, 및 소염 사이토카인 IL-10의 증가한 발현을 나타낼 수 있다. 몇몇 실시형태에서 비자극성 골수성 세포는 분화 및 생존에 대해 전사 인자 IRF4 및 사이토카인 GM-CSF 또는 CSF-1에 의존한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 맥관 내피 성장 인자(VEGF) 및 일산화질소 생성효소(NOS)를 분비함으로써 종양 혈관신생에 기여하고 상피 성장 인자(EGF)를 분비함으로써 종양 성장을 지지할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 종양 연관 대식세포(TAM) 또는 수지상 세포(DC)이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 수지상 세포(DC)가 아니다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 종양 연관 대식세포(TAM)이다. TAM은 암성 종양 근처 또는 내에 존재하는 대식세포이고, 순환하는 단핵구 또는 체류하는 조직 대식세포로부터 유래한다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포 및 자극성 골수성 세포는 이들이 발현하는 마커, 또는 이들이 선택적으로 발현하는 마커에 기초하여 구별된다. 세포 표면 마커의 발현은 '+' 또는 '양성'으로 기재될 수 있다. 세포 표면 마커의 부재는 '-' 또는 '음성'으로 기재될 수 있다. 세포 표면 마커의 발현은 'high'(마커의 높은 수준을 발현하는 세포) 또는 'low'(마커의 낮은 수준을 발현하는 세포)로 더 기재될 수 있고, 이것은 세포 표면에서의 각각의 마커의 상대 발현을 나타낸다. 마커의 수준은 당해 분야에 공지된 다양한 방법, 예를 들어 면역 염색 및 FACS 분석, 또는 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅에 의해 결정될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 수지상 세포(DC)이다. 몇몇 실시형태에서, 수지상 세포는 뾰족한 또는 수지상 형태의해 구별될 수 있다. 일 실시형태에서, 비자극 수지상 세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+(또한 DC1 세포라 칭함)이다. 일 실시형태에서, 비자극 수지상 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+(또한 DC2 세포)이 아니다. 일 실시형태에서, CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+인 수지상 세포는 자극 골수성 세포이다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 종양 연관 대식세포이다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 인간에서, 비자극 종양 연관 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극 종양 연관 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극 종양 연관 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11c+이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극 종양 연관 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극 종양 연관 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극 종양 연관 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11c+이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극 종양 연관 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+ 및 CD11c+이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극 종양 연관 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+이다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 다른 포유류, 예를 들어 마우스에서 TAM 및 DC를 표적화하는 데 유용하다. 이러한 실시형태에서, 마우스 TAM 및 DC는 NSM 항체와 접촉한다. 일 실시형태에서, 예를 들어 마우스에서, 종양 연관 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11bhigh 및 CD11clow(또한 TAM1이라 칭함)이다. 일 실시형태에서, 예를 들어 마우스에서, 종양 연관 대식세포는 적어도 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11blow 및 CD11chigh(또한 TAM2라 칭함)이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "CD11bhigh 대식세포"는 CD11b의 높은 수준을 발현하는 대식세포를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "CD11blow 대식세포"는 이의 표면에서 Cd11bhigh 대식세포보다 실질적으로 낮은 CD11b의 수준을 발현하는 대식세포를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "CD11chigh"는 CD11c의 높은 수준을 발현하는 대식세포를 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "CD11clow 대식세포"는 이의 표면에서 Cd11chigh 대식세포보다 실질적으로 낮은 CD11c의 수준을 발현하는 대식세포를 의미한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 비자극성 골수성 세포는 TAM 및 DC1 세포 중 하나 이상을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 예를 들어 마우스에서, 본 발명의 비자극성 골수성 세포는 TAM1, TAM2 및 DC1 세포 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 본 발명의 비자극성 골수성 세포는 NSM 항체와 접촉한다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 종양 병변의 주변 내에 또는 형질전환된 종양 관에서 국소화되고, 여기서 이것은 동족 T 세포와 접촉한다. 일 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 국소화는 변형되어서, 세포는 종양 주변부에 더 이상 국소화되지 않거나, T 세포와 더 이상 접촉하지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에 있다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 비자극성 골수성 세포를 오직 포함하는 면역 세포의 집단에 있다. 1차 세포 배양에서 유지되고/되거나, 불멸화 배양에서 유지되고/되거나, 생체외 배양에서 유지된, 다양한 공급원(예를 들어, 이환된 조직, 종양 조직, 건강한 조직, 세포 은행)으로부터 유래한, 본 발명의 면역 세포의 집단은 순수하고 균일하고 비균일할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 종양 연관 대식세포이다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 수지상 세포이다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+인 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+인 세포로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+인 세포로 본질적으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-인 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-인 세포로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-인 세포로 본질적으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+인 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+인 세포로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+인 세포로 본질적으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11c+이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11c+인 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11c+인 세포로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11c+인 세포로 본질적으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3- 및 CD11c+이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3- 및 CD11c+인 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3- 및 CD11c+인 세포로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3- 및 CD11c+인 세포로 본질적으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+인 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+인 세포로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+인 세포로 본질적으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+ 및 CD11c+이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+ 및 CD11c+인 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+ 및 CD11c+인 세포로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11b+ 및 CD11c+인 세포로 본질적으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+인 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+인 세포로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+인 세포로 본질적으로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+이 아니다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+이 아닌 세포를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 예를 들어 마우스에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11bhigh 및 CD11clow이다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 마우스에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11bhigh 및 CD11clow인 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 마우스에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11bhigh 및 CD11clow인 세포로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 마우스에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11bhigh 및 CD11clow인 세포로 본질적으로 이루어진다. 이러한 실시형태에서, 비자극 마우스 골수성 세포는 NSM 항체와 접촉한다.
몇몇 실시형태에서, 예를 들어 마우스에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14 +, CD11blow 및 CD11chigh이다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 마우스에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11blow 및 CD11chigh인 세포를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 마우스에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11blow 및 CD11chigh인 세포로 이루어진다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 마우스에서, 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14+, CD11blow 및 CD11chigh인 세포로 본질적으로 이루어진다. 이러한 실시형태에서, 비자극 마우스 골수성 세포는 NSM 항체와 접촉한다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 암 조직에 있다.
몇몇 실시형태에서, 면역 세포의 집단은 암 조직에 있다.
몇몇 실시형태에서, 비자극 세포 및 자극성 골수성 세포는 암 조직에 있다.
몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 비자극성 골수성 세포 및 자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단을 포함한다.
NSM 세포는 총체적으로 종양 조직에 존재하고 NSM 세포 마커의 이의 발현에 의해 다른 세포 유형으로부터 구별될 수 있는 DC1, TAM1, 및 TAM2 세포라 칭해질 수 있다. 예를 들어, SDC보다 NSM 세포에서 더 높은 존재비로 발현되고 번역되는 유전자 및 연관 단백질은 NSM 마커로서 작용할 수 있다. 예시적인 NSM 마커는 CD11b이다. 추가적인 예시적인 NSM 마커는 표 A에 기재되어 있다. NSM 세포는 이의 세포 표면에서 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및 TMEM119를 발현할 수 있다. 몇몇 양태에서, NSM 세포는 KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1 중 적어도 하나를 발현하지 않는다.
일 실시형태에서, NSM 세포는 표 A에 기재된 NSM 마커 유전자 중 하나 이상을 발현하는 종양 침윤 골수성 세포이다. 또 다른 실시형태에서, NSM 세포는 표 A에 기재된 NSM 마커 중 3개 이상을 발현하는 종양 골수성 세포이다. 또 다른 실시형태에서, NSM 세포는 표 A에 기재된 NSM 마커의 대부분 또는 전부를 발현하는 종양 골수성 세포이다. 또 다른 실시형태에서, NSM 세포는 MRC1, MS4A7, C1QC, APOE, C1QB, C1QA 및 C5AR1을 발현하는 종양 골수성 세포로서 확인될 수 있다.
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자극성 골수성 세포
본 명세서에 사용된 바대로, 자극성 골수성 세포(또한 소정의 양태에서 SDC라 칭함)는 면역 반응을 자극하는 데 있어서 효과적(예를 들어, 비자극성 골수성 세포와 비교하여 종양 미세환경에서 항종양 반응을 자극하는 데 있어서 더 효과적)인 골수성 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 자극성 골수성 세포는 비자극성 골수성 세포와 비교하여 T 세포에 항원(예를 들어, 종양 항원)을 제시하는 데 효과적이거나, 종양 특이적 T 세포 반응을 자극하는 데 있어서 효과적이다. 몇몇 실시형태에서, 자극성 골수성 세포는 비자극성 골수성 세포와 비교하여 종양 연관 항원을 흡수하고/하거나 처리하고/하거나 T 세포에 제시하는 능력의 증가를 나타낼 수 있다. 자극성 골수성 세포는 비자극성 골수성 세포와 비교하여 세포독성 T 림프구를 다시 프라이밍하거나 몇몇 경우에 효과적인 종양 세포 사멸을 자극하는 능력의 증가를 가질 수 있다. 자극성 골수성 세포는 비자극성 골수성 세포와 비교하여, 제한 없이, CD80, CD86, MHCI 및 MHCII를 포함하는, 항원 처리, 항원 제시 및/또는 항원 동시자극에 관여하는, 유전자 및 세포 표면 마커의 더 높은 발현을 나타낼 수 있다.
예시적인 자극성 골수성 세포 마커는 표 A에 기재되어 있다. 예를 들어, 인간 SDC에서, Xcr1, Clec9a 및 BDCA3(CD141)의 발현은 SDC 정체의 마커이다. 마우스에서, CD103이 SDC 정체의 강한 마커로서 또한 사용될 수 있지만, 인간 SDC에서 발현되지 않는다는 것이 주목될 것이다.
일 실시형태에서, SDC는 수지상 세포 정체를 가지고 표 A에 기재된 SDC 마커 중 하나 이상을 또한 발현하는 종양 침윤 골수성 세포이다. 또 다른 실시형태에서, SDC는 수지상 세포 정체를 가지고 표 A에 기재된 SDC 마커 중 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 전부를 또한 발현하는 종양 침윤 골수성 세포이다. 또 다른 실시형태에서, SDC는 BDCA3, KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, XCR1 및 CLEC9A를 발현하는 종양 침윤 골수성 수지상 세포로서 확인된다. SDC의 세포는 KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1 중 적어도 하나를 발현할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, SDC는 이의 세포 표면에서 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및/또는 TMEM119를 실질적으로 발현하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, SDC는 C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2, TLR7 및/또는 LILRB4를 실질적으로 발현하지 않는다. 유세포계측법 및 PCR은, 다른 분야 인정 검정 중에서, 본 명세서에 개시된 마커의 발현을 평가하도록 사용될 수 있다.
자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+일 수 있다. 자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+ 및 BDCA3+일 수 있다. 자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14- 및 BDCA3+일 수 있다. 자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD11c+ 및 BDCA3+일 수 있다.
항체
본원은 비자극성 골수성 세포를 불능시킨 항체를 포함하는 NSM 단백질에 결합하는 항체를 포함하는 항체 및 조성물을 제공한다.
본원은 비자극성 골수성 세포를 불능시킨 항체를 포함하는 NSM 단백질에 결합하는 항체를 포함하는 항체 및 조성물을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "항체" 또는 "면역글로불린"은 면역글로불린 유전자 또는 일련의 면역글로불린 유전자, 또는 분석물질(예를 들어, 항원)에 특이적으로 결합하고 이를 인식하는, 이의 분석물질 결합 단편에 의해 실질적으로 코딩된 폴리펩타이드를 의미한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자, 및 미리어드(myriad) 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 항체 또는 면역글로불린의 "종류"는 이의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 의미한다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 주요 항체 종류가 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위종류(동형단백질), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 종류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불린다.
예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 폴리펩타이드 사슬의 2개의 쌍으로 이루어지고, 각각의 쌍은 1개의 "경쇄"(약 25kD) 및 1개의 "중쇄"(약 50-70kD)를 가진다. 각각의 사슬의 N 말단 도메인은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개 또는 이것 초과의 아미노산의 가변 영역을 한정한다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 각각 이 경쇄 및 중쇄 도메인을 의미한다. IgG1 중쇄는 N으로부터 C 말단으로 각각 VH, CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 경쇄는 N으로부터 C 말단으로 VL 및 CL 도메인을 포함한다. IgG1 중쇄는 CH1 도메인과 CH2 도메인 사이에 힌지를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 면역글로불린 작제물은 치료학적 폴리펩타이드에 연결된 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE로부터 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체에서 발견된 면역글로불린 도메인은 면역글로불린 기반 작제물, 예컨대 다이아바디(diabody) 또는 나노바디로부터 이거나 이로부터 유래한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 면역글로불린 작제물은 중쇄 항체, 예컨대 낙타 항체로부터 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 면역글로불린 작제물은 포유류 항체, 예컨대 소 항체, 인간 항체, 낙타 항체, 마우스 항체 또는 임의의 키메라 항체로부터 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변이고/이거나, 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역의 각각을 의미한다. 일반적으로, 네이티브 4개 사슬 항체는 VH에서의 3개(H1, H2, H3) 및 VL에서의 3개(L1, L2, L3)의 6개의 HVR을 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변루프 및/또는 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 가장 높은 서열 가변성에 있고/있거나 항원 인식에 관여한다. VH에서의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 영역(hypervariable region; HVR)은 또한 "상보성 결정 영역"(CDR)이라 칭해지고, 이 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분과 관련하여 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 이 특정한 영역은 Kabat 등의 문헌[U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)] 및 Chothia 등의 문헌[J Mol Biol 196:901-917 (1987)]에 의해 기재되어 있고, 여기서 정의는 서로에 대해 비교될 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 하위세트를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체의 CDR 또는 이의 변이체에 관한 정의의 적용이 본 명세서에 정의되고 사용된 바대로 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 특정한 CDR을 포함하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 변할 것이다. 당해 분야의 당업자는 잔기가 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 특정한 CDR을 포함하는지를 일상적으로 결정할 수 있다.
명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "단쇄"는 펩타이드 결합에 의해 직선으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 의미한다. 특정한 이러한 실시형태에서, Fab 경쇄의 C 말단은 단쇄 Fab 분자에서 Fab 중쇄의 N 말단에 연결된다. 본 명세서에 더 자세히 기재된 바대로, scFv는 폴리펩타이드 사슬에 의해 중쇄(VH)의 가변 도메인의 이의 C 말단으로부터 N 말단 끝으로 연결된 경쇄(VL)의 가변 도메인을 가진다. 대안적으로, scFv는 VH의 C 말단 끝이 폴리펩타이드 사슬에 의해 VL의 N 말단 끝에 연결된 폴리펩타이드 사슬을 포함한다.
"Fab 단편"(또한 단편 항원 결합이라 칭함)은 각각 경쇄 및 중쇄에서 가변 도메인 VL 및 VH를 따라 경쇄의 불변 도메인(CL) 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. 가변 도메인은 항원 결합에 관여하는 상보성 결정 루프(CDR, 또한 초가변 영역이라 칭함)를 포함한다. Fab의 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 아주 약간의 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 다르다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일 실시형태에서, Fv 폴리펩타이드는, scFv가 항원 결합에 대해 원하는 구조를 형성하게 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 검토를 위해, 문헌[Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다. HER2 항체 scFv 단편은 WO93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호에 기재되어 있다.
"단일 도메인 항체" 또는 "sdAb" 포맷은 개별 면역글로불린 도메인이다. sdab는 꽤 안정하고 항체의 Fc 사슬과의 융합 파트너로서 발현하기 쉽다(Harmsen MM, De Haard HJ (2007). "Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments". Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22).
본 명세서에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 정의하도록 사용된다. 이 용어는 네이티브 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 본 명세서에 달리 기재되지 않은 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바대로 EU 인덱스라 또한 칭해지는 EU 넘버링 시스템에 따른다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 이합체 Fc의 "Fc 폴리펩타이드"는, 안정한 자기 회합을 형성할 수 있는, 이합체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩타이드, 즉 면역글로불린 중쇄의 C 말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩타이드 중 하나를 의미한다. 예를 들어, 이합체 IgG Fc의 Fc 폴리펩타이드는 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인 서열을 포함한다. Fc는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 종류일 수 있고, 이들 중 몇몇은 하위종류(동형단백질), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다.
용어 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하도록 사용된다. 예를 들어, FcR은 네이티브 서열 인간 FcR일 수 있다. 일반적으로, FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 것이고, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위종류의 수용체, 예컨대 이 수용체의 대립형질 변이체 및 대안적으로 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 이의 세포질 도메인이 주로 다른 유사한 아미노산 서열을 가지는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("저해 수용체")를 포함한다. 다른 동형단백질의 면역글로불린은 소정의 FcR(예를 들어, 문헌[Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999)] 참조)에 의해 또한 결합할 수 있다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 이의 세포질 도메인에서 면역수용체 타이로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 이의 세포질 도메인에서 면역수용체 타이로신 기반 저해 모티프(ITIM)를 함유한다(문헌[Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))]에서 검토됨). FcR은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 미래에 확인될 것을 포함하여 다른 FcR은 본 명세서에서 용어 "FcR"에 의해 포함된다. 이 용어는 또한 태아로의 모체 IgG의 전달을 담당하는 FcRn인 신생아 수용체를 포함한다(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976); 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).
CH2 도메인의 변형은 Fc에 대한 FcR의 결합에 영향을 미칠 수 있다. Fc 영역에서의 아미노산 변형의 수는 상이한 Fc감마 수용체에 대한 Fc의 친화도를 선택적으로 변경하기 위해 당해 분야에 공지되어 있다. 몇몇 양태에서, Fc는 Fc-감마 수용체의 선택적 결합을 촉진하도록 하나 이상의 변형을 포함한다.
Fc에 대한 FcR의 결합을 변경하는 예시적인 돌연변이는 하기 기재되어 있다:
S298A/E333A/K334A, S298A/E333A/K334A/K326A(Lu Y, Vernes JM, Chiang N, et al. J Immunol Methods. 2011 Feb 28;365(1-2):132-41);
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(Stavenhagen JB, Gorlatov S, Tuaillon N, et al. Cancer Res. 2007 Sep 15;67(18):8882-90; Nordstrom JL, Gorlatov S, Zhang W, et al. Breast Cancer Res. 2011 Nov 30;13(6):R123);
F243L(Stewart R, Thom G, Levens M, et al. Protein Eng Des Sel. 2011 Sep;24(9):671-8.), S298A/E333A/K334A(Shields RL, Namenuk AK, Hong K, et al. J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604);
S239D/I332E/A330L, S239D/I332E(Lazar GA, Dang W, Karki S, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-10);
S239D/S267E, S267E/L328F(Chu SY, Vostiar I, Karki S, et al. Mol Immunol. 2008 Sep;45(15):3926-33);
S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/S298A/K326A/A327H, G237F/S298A/A330L/I332E, S239D/I332E/S298A, S239D/K326E/A330L/I332E/S298A, G236A/S239D/D270L/I332E, S239E/S267E/H268D, L234F/S267E/N325L, G237F/V266L/S267D 및 WO2011/120134 및 WO2011/120135(본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 다른 돌연변이. 문헌[Therapeutic Antibody Engineering(William R. Strohl 및 Lila M 저서. Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9, Oct 2012)]은 283페이지에 돌연변이를 기재한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 이팩터 기능을 매개하는 이의 능력을 개선하는 변형을 포함한다. 이러한 변형은 당해 분야에 공지되어 있고, ADCC에 대한 활성화 수용체, 주로 FCGR3a, 및 CDC에 대한 C1q를 향한 Fc의 친화도의 조작 또는 비푸코실화를 포함한다. 하기 표 B는 이팩터 기능 조작에 대한 문헌에 보고된 다양한 설계를 요약한다.
아미노산 서열을 변경하지 않으면서 Fc 글라이코실화 부위(Asn 297 EU 넘버링)에서 푸코스를 아주 적게 가지거나 가지지 않는 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. GlymaX(등록상표) 기술(ProBioGen AG)은 항체 제조에 사용되는 세포로의 푸코스 생합성의 세포 경로를 바꾸는 효소에 대한 유전자의 도입에 기초한다. 이것은 항체 생성 세포에 의한 N 연결 항체 탄수화물 부분으로의 당 "푸코스"의 첨가를 막는다(von Horsten et al. (2010) Glycobiology. 2010 Dec; 20(12):1607-18). 낮아진 수준의 푸코실화를 가지는 항체를 얻는 또 다른 접근법은 미국 특허 제8,409,572호(항체에서 낮은 수준의 푸코실화를 생성하는 이의 능력에 대해 항체 제조를 위한 세포주를 선택하는 것을 교시함)에서 발견될 수 있다. 항체는 완전히 비푸코실화(이것이 검출 가능한 푸코스를 함유하지 않는다는 것을 의미)될 수 있거나, 이것은 부분적으로 비푸코실화(단리된 항체가 포유류 발현 시스템에 의해 제조된 유사한 항체에 대해 보통 검출되는 푸코스의 양의 95% 미만, 85% 미만, 75% 미만, 65% 미만, 55% 미만, 45% 미만, 35% 미만, 25% 미만, 15% 미만 또는 5% 미만을 함유한다는 것을 의미)될 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 개선된 이팩터 기능을 부여하는 표 B에 기재된 바와 같은 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이합체 Fc를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 항체는 이팩터 기능을 개선하도록 비푸코실화될 수 있다.
Figure pct00002
FcγR 및/또는 보체 결합 및/또는 이팩터 기능을 감소시키는 Fc 변형은 당해 분야에 공지되어 있다. 최근의 간행물은 감소한 또는 침묵 이팩터 활성을 가지는 항체를 조작하기 위해 이용되는 전략을 기재한다(문헌[Strohl, WR (2009), Curr Opin Biotech 20:685-691, 및 Strohl, WR and Strohl LM, "Antibody Fc engineering for optimal antibody performance" In Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 225-249] 참조). 이 전략은 글라이코실화의 변형, IgG2/IgG4 스캐폴드의 사용 또는 Fc의 힌지 또는 CH2 영역에서의 돌연변이의 도입을 통한 이팩터 기능의 감소를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공보 제2011/0212087호(Strohl), 국제 특허 공보 제WO 2006/105338호(Xencor), 미국 특허 공보 제2012/0225058호(Xencor), 미국 특허 공보 제2012/0251531호(Genentech) 및 문헌[Strop et al ((2012) J. Mol. Biol. 420: 204-219)]은 Fc에 대한 FcγR 또는 보체 결합을 감소시키는 특이적 변형을 기재한다.
Fc에 대한 FcγR 또는 보체 결합을 감소시키는 공지된 아미노산 변형의 구체적인, 비제한적인 예는 하기 표에서 확인된 것을 포함한다:
Figure pct00003
몇몇 실시형태에서, 항체는 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC) 활성을 가진다. 항체가 병원성 또는 종양형성성 표적 세포의 표면에서 항원에 결합할 때 ADCC가 발생할 수 있다. 세포독성 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 수지상 세포 또는 단핵구를 포함하는 세포 표면에서, Fc 감마 수용체(FcγR 또는 FCGR)를 보유하는 이팩터 세포는 표적 세포에 결합한 항체의 Fc 영역을 인식하고 이에 결합한다. 이러한 결합은 세포사를 발생시키는 세포내 신호전달 경로의 활성화를 촉발할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 항체의 면역글로불린 Fc 영역 하위유형(동형단백질)은 인간 IgG1 및 IgG3을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, ADCC는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포에서 결합한 항체를 인식하고 후속하여 표적 세포의 용해를 발생시키는 세포 매개 반응을 의미한다. NK 세포인 ADCC를 매개하기 위한 1차 세포는 오직 FcγRIII를 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현한다. 조혈 세포에서의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 464페이지의 표 3에 요약되어 있다. 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 것을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 대한 유용한 이팩터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성은 생체내, 예를 들어 동물 모델에서, 예컨대 문헌[Clynes et al., Proc . Natl . Acad . Sci . (USA) 95:652-656(1998)]에 개시된 것에서 평가될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성을 가진다. 항체 유도 CDC는 전통적인 보체 캐스케이드의 단백질을 통해 매개되고, 항체에 대한 보체 단백질 Clq의 결합에 의해 촉발된다. Clq에 대한 항체 Fc 영역 결합은 보체 캐스케이드의 활성화를 유도할 수 있다. 특정한 실시형태에서, 항체의 면역글로불린 Fc 영역 하위유형(동형단백질)은 인간 IgG1 및 IgG3을 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, CDC는 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체화된 분자(예를 들어, 폴리펩타이드(예를 들어, 항체))에 대한 보체 시스템(C1q)의 제1 성분의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996)]에 기재된 것과 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.
항-NSM 항체는 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 이상의 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및 TMEM119를 표적화할 수 있다. 항-NSM 항체는 TREM2를 표적화할 수 있다. 항-NSM 항체는 MS4A7을 표적화할 수 있다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및/또는 TMEM119 중 하나 이상을 표적화하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 LILRB4를 표적화하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 TREM2에 결합하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 MS4A7에 결합하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 C5AR1에 결합하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 LYVE1에 결합하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 ABCC3에 결합하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 LILRB4에 결합하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 MRC1/CD206에 결합하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 SIGLEC1에 결합하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 STAB1에 결합하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 TMEM37에 결합하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 MERTK에 결합하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 TMEM119에 결합하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 TLR7에 결합하지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 항체 의존적 세포내 식균작용(ADCP) 활성을 가진다. 항체가 병원성 또는 종양형성성 표적 세포의 표면에서 항원에 결합할 때 ADCP가 발생할 수 있다. 단핵구 및 대식세포를 포함하는 세포 표면에서, Fc 수용체를 보유하는 포식 세포는 표적 세포에 결합한 항체의 Fc 영역을 인식하고 이에 결합한다. 항체 결합 표적 세포에 대한 Fc 수용체의 결합 시, 표적 세포의 식균작용은 개시될 수 있다. ADCP는 ADCC의 형태로 생각될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 면역 복합체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 면역 복합체는 항체에 의해 덮인 종양 세포일 수 있다.
몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 암 조직의 밖에 존재하는 골수성 세포에 실질적으로 결합하지 않는다. 몇몇 양태에서, 항-NSM 항체는 암 조직에 존재하는 자극성 골수성 세포에 실질적으로 결합하지 않는다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 단일클론 항체이다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 다중클론 항체이다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 하이브리도마에 의해 생성된다. 다른 실시형태에서, 항체는 원하는 가변 및 불변 도메인을 발현하도록 조작된 재조합 세포에 의해 생성된다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 항원 특이성을 보유하는 단쇄 항체 또는 다른 항체 유도체 및 하부 힌지 영역 또는 이의 변이체일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 다기능 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 단편 또는 이의 변이체일 수 있다. 특정한 실시형태에서, 항체 단편 또는 이들의 유도체는 Fab 단편, Fab'2 단편, CDR 및 ScFv로부터 선택된다.
인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 및 불변 영역을 가지는 모든 항체를 포함한다. 일 실시형태에서, 가변 및 불변 도메인의 전부는 인간 면역글로불린 서열(완전히 인간 항체)로부터 유래한다. 이 항체는 인간 중쇄 및/또는 경쇄 코딩 유전자로부터 유래한 항체를 발현하도록 유전적으로 변형된 마우스의 관심 있는 항원에 의한 면역화를 통한 것을 포함하는 다양한 방식으로 제조될 수 있다.
인간화 항체는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 비인간 종으로부터 유래한 항체의 서열과 다른 서열을 가져서, 인간화 항체는, 인간 대상체에게 투여될 때, 비인간 종 항체와 비교하여, 면역 반응을 덜 유도하고/하거나, 덜 중증인 면역 반응을 유도한다. 일 실시형태에서, 비인간 종 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 프레임워크 및 불변 도메인에서의 소정의 아미노산은 인간화 항체를 제조하도록 돌연변이된다. 또 다른 실시형태에서, 인간 항체로부터의 불변 도메인(들)은 비인간 종의 가변 도메인(들)에 융합된다. 또 다른 실시형태에서, 비인간 항체의 하나 이상의 CDR 서열에서의 하나 이상의 아미노산 잔기는 인간 대상체에게 투여될 때 비인간 항체의 가능할 것 같은 면역원성을 감소시키도록 변경되거나(여기서, 변경된 아미노산 잔기는 이의 항원에 대한 항체의 면역특이적 결합에 중요하지 않음), 이루어진 아미노산 서열에 대한 변경은 보존적 변경이어서, 항원에 대한 인간화 항체의 결합은 항원에 대한 비인간 항체의 결합보다 유의미하게 나쁘지 않다. 인간화 항체를 제조하는 방법의 예는 미국 특허 제6,054,297호, 제5,886,152호 및 제5,877,293호에서 발견될 수 있다.
키메라 항체는 하나의 항체로부터의 하나 이상의 영역 및 하나 이상의 다른 구별되는 항체로부터의 하나 이상의 영역을 함유하는 항체를 의미한다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 표면 항원, 예컨대 NSM 단백질에 특이적이다. 몇몇 실시형태에서, 치료학적 항체는 종양 항원(예를 들어, 종양 세포에 의해 특이적으로 발현된 분자)에 특이적이다. 특정한 실시형태에서, 치료학적 항체는 인간 또는 비인간 영장류 IgG1 또는 IgG3 Fc 부분을 가질 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 이팩터 분자에 결합하거나 접합된다. 특정한 실시형태에서, 항체는 방사성 핵종, 세포독소, 화학치료제, 약물, 프로드럭, 독소, 효소, 면역조절제, 혈관형성방지제, 세포사멸 촉진제, 사이토카인, 호르몬, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 분자, siRNA, 제2 항체 및 제2 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치료제에 접합된다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 작동성 항체이다. 항체가 세포에서 발현된 NSM 단백질에 결합한 후 작동성 항체는 NSM의 하나 이상의 활성 또는 기능을 유도할 수 있다(예를 들어, 증가시킬 수 있다). 작동성 항체는 NSM에 결합하고 이를 활성화하여서, 세포의 증식을 변경시키거나 항원 제시 능력을 변형시킨다. 작동성 항체는 NSM에 결합하고 이를 활성화하여서, 변형된 세포 성장 또는 세포사멸를 발생시키는 세포내 신호전달 경로를 촉발할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 길항성 항체이다. 항체가 세포에서 발현된 NSM 단백질에 결합한 후 길항성 항체는 NSM의 하나 이상의 활성 또는 기능을 차단할 수 있다(예를 들어, 감소시킬 수 있다). 예를 들어, 길항성 항체는 하나 이상의 NSM 단백질에 결합하고 이에 대한 결합을 차단하여서, 세포의 분화 및 증식을 막거나 항원 제시 능력을 변형시킬 수 있다. 길항성 항체는 NSM 단백질에 결합하고 이의 리간드에 의해 이의 활성화를 막아서, 세포 성장 및 생존에 기여하는 세포내 신호전달 경로를 변형시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 결핍성 항체이다. 결핍성 항체는 분자의 다른 면역 세포와의 항체의 상호작용을 통해 접촉 시 비자극성 골수성 세포를 사멸하는 것이다. 예를 들어, 항체는, NSM 단백질을 보유하는 세포에 결합할 때, 보체 단백질과 맞물리고 보체 의존적 세포 용해를 유도할 수 있다. 항체는, NSM 단백질을 보유하는 세포에 결합할 때, Fc 수용체를 보유하는 이웃 세포가 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)에 의해 이를 사멸하도록 또한 촉발시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 중화 항체이고, 항체는 NSM의 하나 이상의 생물학적 활성을 중화시킨다. 몇몇 실시형태에서, NSM 단백질은 비자극성 골수성 세포의 표면에서 발현되고, 항체는 NSM 단백질의 세포외 도메인을 인식한다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 NSM에 선택적이다(NSM에 우선적으로 결합한다). 소정의 실시형태에서, NSM에 선택적으로 결합하는 항체는 0.0001nM 내지 1μM의 범위의 해리 상수(Kd)를 가진다. 소정의 실시형태에서, 항체는 상이한 종으로부터의 단백질 중에 보존된 NSM 단백질 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 선택적 결합은 배타적 결합을 포함하지만, 이것을 요하지는 않는다.
일 실시형태에서, 표적에 결합한 항-NSM 항체는 이것이 결합한 비자극성 골수성 세포의 생체내 고갈을 발생시키는 것을 책임진다. 몇몇 실시형태에서, 클러스터링된 항체에 의해 유도된 이팩터 단백질은 염증성 사이토카인의 방출, 항원 제조의 조절, 내포작용 또는 세포 사멸을 포함하는 다양한 반응을 촉발할 수 있다. 일 실시형태에서, 항체는 생체내 보체를 동원하고 활성화하거나 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)을 매개하거나, 또는 Fc 수용체를 결합시킴으로써 식균작용을 매개할 수 있다. 항체는 결합 시 비자극성 골수성 세포의 세포사멸 또는 괴사를 유도함으로써 비자극성 골수성 세포를 또한 고갈시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 IgG1 항체가 아니다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 IgG3 항체가 아니다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 IgG2 항체가 아니다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 IgG4 항체가 아니다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 불능은 시험관내이고, a) 비자극성 골수성 세포의 사멸; b) 비자극성 골수성 세포의 자기 비드 고갈; 또는 c) 비자극성 골수성 세포의 형광 활성화된 세포 분류(FACS)에 의해 달성된다.
소정의 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 항체는 0.0001nM 내지 1μM의 범위의 해리 상수(Kd)를 가진다. 예를 들어, 항체의 Kd는 약 1μM, 약 100nM, 약 50nM, 약 10nM, 약 1nM, 약 500pM, 약 100pM, 또는 약 50pM 내지 약 2pM, 약 5pM, 약 10pM, 약 15pM, 약 20pM, 또는 약 40pM 중 임의일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 항-NSM 항체의 생체내 투여를 위해, 일반 투약량 양은 투여 경로에 따라 매일 약 10ng/㎏ 내지 약 100㎎/㎏(개체의 체중) 이상, 바람직하게는 약 1㎎/㎏/일 내지 10㎎/㎏/일로 변할 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료되는 질환 또는 장애의 중증도에 따라, 치료는 증상의 원하는 억제가 달성될 때까지 지속한다. 예시적인 투약 섭생은 약 2㎎/㎏의 항-NSM 항체의 초기 용량, 이어서 격주마다 약 1㎎/㎏의 매주 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 다른 투약량 섭생은 의사가 달성하기를 바라는 약물동력학적 감퇴의 패턴에 따라 유용할 수 있다. 예를 들어, 주마다 1회 내지 21회 개체에 투약하는 것이 본 명세서에서 고려된다. 소정의 실시형태에서, 약 3㎍/㎏ 내지 약 2㎎/㎏(예컨대, 약 3㎍/㎏, 약 10㎍/㎏, 약 30㎍/㎏, 약 100㎍/㎏, 약 300㎍/㎏, 약 1㎎/㎏ 및 약 2/㎎/㎏)의 투약 범위가 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 투약 빈도는 매일 3회, 매일 2회, 매일 1회, 격일 1회, 주마다 1회, 2주마다 1회, 4주마다 1회, 5주마다 1회, 6주마다 1회, 7주마다 1회, 8주마다 1회, 9주마다 1회, 10주마다 1회, 또는 개월마다 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회이거나 이보다 길다. 치료의 진행은 종래의 기법 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다. 투여된 항-NSM 항체를 포함하는 투약 섭생은 사용된 용량과 독립적으로 시간에 따라 변할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 항체는 약물, 예를 들어 독소, 화학치료제, 면역 조절제, 또는 방사성 동위원소에 접합된다. ADC(항체 약물 접합체)를 제조하는 몇몇 방법이 당해 분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제8,624,003호(포트 방법), 제8,163,888호(1단계) 및 제5,208,020호(2단계 방법)에 기재되어 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 방사성 핵종, 세포독소, 화학치료제, 약물, 프로드럭, 독소, 효소, 면역조절제, 혈관형성방지제, 세포사멸 촉진제, 사이토카인, 호르몬, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 분자, siRNA, 제2 항체, 및 항원 결합인 제2 항체 단편을 포함하는 적어도 하나의 물질에 접합될 수 있다.
단백질, 뉴클레오타이드 및 동족체
NSM 단백질을 발현하는 비자극 인간 골수성 세포를 불능시키고/시키거나 검출하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 NSM 단백질 동족체를 발현하는 비인간 포유류 세포로부터 비자극성 골수성 세포를 불능시키고/시키거나 검출하는 것에 관한 것이다. 예를 들어, 마우스에서의 NSM 단백질은 이의 인간 동족체와 필적하는 제한된 발현 패턴을 발현할 수 있다. 따라서 일 실시형태에서, NSM 단백질을 발현하는 비자극 마우스 골수성 세포를 불능시키고/시키거나 검출하기 위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 제공된다. 세포가 NSM 단백질의 것과 필적하는 발현 패턴을 나타내는 유사한 발현 패턴으로, NSM 단백질의 동족체를 발현하는 임의의 개체로부터의 비자극 세포를 불능시키고/시키거나 검출하기 위한 유사한 방법 및 조성물이 본 명세서에 또한 제공된다.
NSM 단백질 또는 뉴클레오타이드는 C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2, TLR7 및 LILRB4, 및 이들의 동족체 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다. SDC 단백질 또는 뉴클레오타이드는 KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1, 및 이들의 동족체 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다. 세포 표면 NSM 단백질은 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및 TMEM119 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다. 세포 표면 NSM 단백질은 단독으로 또는 조합으로 하나 이상의 항-NSM 항체에 의해 표적화될 수 있다. 일반적으로, NSM은 NSM 단백질 또는 뉴클레오타이드에 양성이고, SDC 단백질 또는 뉴클레오타이드에 음성이고; 반대로 SDC는 일반적으로 SDC 단백질 또는 뉴클레오타이드에 양성이고, NSM 단백질 또는 뉴클레오타이드에 음성이다.
본 명세서에 기재된 항원 결합 작제물은 적어도 하나의 폴리펩타이드를 포함한다. 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 또한 기재되어 있다. 항원 결합 작제물은 통상적으로 단리된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "단리된"은 천연 세포 배양 환경의 성분으로부터 확인되고 분리되고/되거나 회수된 물질(예를 들어, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드)을 의미한다. 이의 천연 환경의 오염물질 성분은 항원 결합 작제물에 대한 진단학적 또는 치료학적 사용을 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 단리된은 예를 들어 인간 중재를 통해 합성으로 제조된 물질을 또한 의미한다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 의미하도록 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다. 즉, 폴리펩타이드에 관한 설명은 펩타이드의 설명 및 단백질의 설명 및 그 반대에 동등하게 적용된다. 이 용어는 천연 발생 아미노산 중합체, 및 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연으로 코팅된 아미노산인 아미노산 중합체에 적용된다. 본 명세서에 사용된 바대로, 이 용어는, 아미노산 잔기가 공유 펩타이드 결합에 의해 연결된, 전장 단백질을 포함하는, 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포함한다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 및 비천연 발생 아미노산, 및 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 천연으로 코팅된 아미노산은 20개의 공통 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글라이신, 히스티딘, 아이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신, 및 발린) 및 피로라이신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭사이드, 메티오닌 메틸 설포늄과 같은 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카복실기, 아미노기 및 R 기에 결합한 탄소를 가지는 화합물을 의미한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩타이드 골격을 가지지만, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산의 언급은 예를 들어 천연 발생 단백질생성 L-아미노산; D-아미노산, 화학적으로 변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 변이체 및 유도체; 천연 발생 비단백질생성 아미노산, 예컨대 β-알라닌, 오르니틴 등; 및 아미노산에 특징적인 당해 분야에 공지된 특성을 가지는 화학적으로 합성된 화합물을 포함한다. 비천연 발생 아미노산의 예는 α-메틸 아미노산(예를 들어, α-메틸 알라닌), D-아미노산, 히스티딘 유사 아미노산(예를 들어, 2-아미노-히스티딘, β-하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘), 부사슬에서 초과의 메틸렌을 가지는 아미노산("호모" 아미노산), 및 부사슬에서의 카복실산 작용기가 설폰산 기에 의해 대체된 아미노산(예를 들어, 시스테산)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 발명의 단백질로의 합성 비네이티브 아미노산, 치환된 아미노산, 또는 하나 이상의 D-아미노산을 포함하는 비천연 아미노산의 혼입은 다수의 상이한 방식으로 유리할 수 있다. D-아미노산 함유 펩타이드 등은 L-아미노산 함유 대응물과 비교하여 시험관내 또는 생체내 증가한 안정성을 나타낸다. 따라서, D-아미노산이 혼입한 펩타이드 등의 작제는 더 큰 세포내 안정성이 원해지거나 필요할 때 특히 유용할 수 있다. 더 구체적으로, D-펩타이드 등은 내인성 펩티다제 및 프로테아제에 내성이어서, 이러한 특성이 원해질 때 개선된 분자의 생체이용률 및 생체내 연장된 수명을 제공한다. 추가적으로, D-펩타이드 등은 T 헬퍼 세포에 대한 주요조직 적합 복합체 II종 제한된 제시에 대해 효율적으로 처리될 수 없고, 따라서 전체 유기체에서 체액 면역 반응을 덜 발생시킬 것이다.
아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회가 추천한 이의 흔히 공지된 3 철자 기호 또는 1 철자 기호에 의해 본 명세서에서 언급될 수 있다. 뉴클레오타이드는, 마찬가지로, 이의 흔히 인정된 단일 철자 코드에 의해 언급될 수 있다.
항원 결합 작제물의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 또한 포함된다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 서열"은 2개 이상의 뉴클레오타이드 분자의 연속적인 스트레치를 나타내도록 의도된다. 뉴클레오타이드 서열은 게놈, cDNA, RNA, 반합성 또는 합성 기원, 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다.
용어 "핵산"은 단일 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오사이드, 리보뉴클레오사이드, 또는 리보뉴클레오타이드 및 이들의 중합체를 의미한다. 구체적으로 제한되지 않은 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 가지고 천연 발생 뉴클레오타이드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 구체적으로 달리 제한되지 않은 한, 이 용어는 또한 PNA(펩티도핵산)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 유사체, 안티센스 기술에서 사용된 DNA의 유사체(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)를 의미한다. 달리 표시되지 않은 한, 특정한 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(축퇴성 코돈 치환을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않음) 및 상보성 서열, 및 명확히 표시된 서열을 전적으로 포함한다. 구체적으로, 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기에 의해 치환된 서열으르 생성함으로써 축퇴성 코돈 치환이 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정한 핵산 서열과 관련하여, "보존적으로 변형된 변이체"는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 의미한다. 유전적 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능상 동일한 핵산은 임의의 소정의 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 기재된 매 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩타이드를 변경하지 않으면서 기재된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 일 종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩타이드를 코딩하는 본 명세서에서의 모든 핵산 서열은 또한 모든 가능한 핵산의 침묵 변이를 기재한다. 당해 분야의 당업자는 핵산에서의 각각의 코돈(AUG(보통 메티오닌에 대한 유일한 코돈임) 및 TGG(보통 트립토판에 대한 유일한 코돈임)를 제외)이 기능상 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에서 암묵적이다.
아미노산 서열에 관해, 당해 분야의 당업자는 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 아미노산의 작은 백분율을 변경, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결식 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"(여기서, 변경은 아미노산의 결실, 아미노산의 부가 또는 화학적으로 유사한 아미노산에 의한 아미노산의 치환을 발생시킴)라는 것을 인식할 것이다. 기능상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 명세서에 기재된 다형 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자 이외이고 이를 배제하지 않는다.
기능상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 하기 8개의 그룹은 각각 서로에 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌(A), 글라이신(G); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W); 7) 세린(들), 트레오닌(T); 및 [0139] 8) 시스테인(C), 메티오닌(M)(예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993] 참조)
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 용어 "동일한" 또는 "동일성" 백분율은 동일한 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 의미한다. 서열은, 하기 서열 비교 알고리즘(또는 당해 분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 가시적인 검사에 의해 측정될 때, 비교 창 또는 지정된 영역에 대해 최대 관련성에 대해 비교되고 정렬될 때, 동일한(즉, 기재된 영역에 걸쳐 약 60%의 동일성, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%의 동일성), 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 백분율을 가지는 경우 "실질적으로 동일"하다. 이 정의는 또한 시험 서열의 보체를 의미한다. 동일성은 적어도 약 50개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 길이인 영역에 걸쳐, 또는 75-100개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 길이인 영역에 걸쳐, 또는 기재되지 않은 경우 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 인간 이외의 종으로부터의 동족체를 포함하는, 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는, 엄격한 하이브리드화 조건 하에 라이브러리를 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 가지는 표지된 프로브에 의해 스크리닝하는 단계, 및 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 전장 cDNA 및 게놈 클론을 단리시키는 단계를 포함하는, 공정에 의해 얻어질 수 있다. 이러한 하이브리드화 기법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 기준 서열은 컴퓨터로 입력되고, 필요한 경우 하위서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 디폴트 프로그램 매개변수가 이용될 수 있거나, 대안적인 매개변수가 지정될 수 있다. 서열 비교 알고리즘은 이후 프로그램 매개변수에 기초하여 기준 서열에 대해 시험 서열에 대한 서열 동일성 백분율을 계산한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "비교 창"은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치의 기준 서열과 서열이 비교될 수 있는, 20개 내지 600개, 보통 약 50개 내지 약 200개, 더 보통 약 100개 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 인접 위치의 수 중 임의의 하나의 분절에 대한 언급을 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬의 방법은 당해 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 문헌[Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법에 대한 조사, 이 알고리즘의 컴퓨터화 실행(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(위스콘신주 매디슨 575 사이언스 드라이브)에서의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), 또는 수동 정렬 및 가시적인 검사(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)] 검토)(이들을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않음)에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 백분율을 결정하기에 적합한 알고리즘의 일 예는 각각 문헌[Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 및 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 ncbi.nlm.nih.gov의 월드 와이드 웹에서 이용 가능한 국립 생물기술 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공중에게 이용 가능하다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T, 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. (뉴클레오타이드 서열에 대한) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 11의 워드 길이(W), 10의 예측(E), M=5, N=-4 및 가닥 둘 다의 비교를 이용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 워드 길이, 및 10의 예측(E), 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌[Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 참조), 50의 정렬(B), 10의 예측(E), M=5, N=-4, 및 가닥 둘 다의 비교를 이용한다. BLAST 알고리즘은 "낮은 복합성" 필터가 꺼진 채 통상적으로 수행된다.
BLAST 알고리즘은 2개의 서열 사이의 유사성의 통계 분석을 또한 수행한다(예를 들어, 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 일 측정은 가장 작은 합 확률(P(N))이고, 이것은 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생하는 확률의 표시를 제공한다. 예를 들어, 기준 핵산과의 시험 핵산의 비교 시 가장 작은 합 확률이 약 0.2 미만 또는 약 0.01 미만 또는 약 0.001 미만인 경우 핵산은 기준 서열과 유사한 것으로 생각된다.
구절 "에 선택적으로(또는 특이적으로) 하이브리드화한다"는, 특정한 뉴클레오타이드 서열이 복잡한 혼합물(전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않음)에 존재할 때, 엄격한 하이브리드화 조건 하에 오직 이 서열에 대한 분자의 결합, 이중화 또는 하이브리드화를 의미한다.
구절 "엄격한 하이브리드화 조건"은 당해 분야에 공지된 바대로 낮은 이온 농도 및 높은 온도의 조건 하에 DNA, RNA, 또는 다른 핵산의 서열, 또는 이들의 조합의 하이브리드화를 의미한다. 통상적으로, 엄격한 조건 하에 프로브는 핵산의 복잡한 혼합물(전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않음)에서 이의 표적 하위서열에 하이브리드화하지만, 복잡한 혼합물에서 다른 서열에 하이브리드화하지 않는다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고, 상이한 상이한 상황에 있을 것이다. 더 긴 서열은 구체적으로 더 높은 온도에서 하이브리드화한다. 핵산의 하이브리드화에 대한 광범위한 가이드는 문헌[Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 발견된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "조작한다, 조작된, 조작하는"은 펩타이드 골격의 임의의 조작 또는 천연 발생 또는 재조합 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 번역 후 변형을 포함하는 것으로 생각된다. 조작은 아미노산 서열, 글라이코실화 패턴, 또는 개별 아미노산의 부사슬 기의 변형, 및 이들 접근법의 조합을 포함한다. 조작된 단백질은 표준 분자 생물학 기법에 의해 발현되고 제조된다.
"단리된 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드"란 이의 네이티브 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의도한다. 예를 들어, 벡터에 함유된 폴리펩타이드를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드는 단리된 것으로 생각된다. 단리된 폴리뉴클레오타이드의 추가의 예는 용액 중의 비상동성 숙주 세포 또는 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 폴리뉴클레오타이드에 유지되는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 보통 폴리뉴클레오타이드 분자를 함유하는 세포에 함유된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하지만, 폴리뉴클레오타이드 분자는 염색체외 또는 이의 천연 염색체 위치와 다른 염색체 위치에서 존재한다. 단리된 RNA 분자는 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체, 및 양성 및 음성 가닥 형태, 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 본 명세서에 기재된 단리된 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 예를 들어 PCR 또는 화학 합성을 통해 합성으로 제조된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은, 소정의 실시형태에서, 조절 구성요소, 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결자를 포함한다.
용어 "중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 일반적으로 예를 들어 미국 특허 제4,683,195호에 기재된 바대로 시험관내 원하는 뉴클레오타이드 서열의 증폭을 위한 방법을 의미한다. 일반적으로, PCR 방법은 주형 핵산에 우선적으로 하이브리드화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 프라이머 연장 합성의 반복 사이클을 포함한다.
본 발명의 기준 뉴클레오타이드 서열과 적어도 예를 들어 95% "동일한" 뉴클레오타이드 서열을 가지는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드란, 폴리뉴클레오타이드 서열이 기준 뉴클레오타이드 서열의 각각의 100개의 뉴클레오타이드마다 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열이 기준 서열과 동일한 것으로 의도된다. 즉, 기준 뉴클레오타이드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드를 얻기 위해, 기준 서열에서의 뉴클레오타이드의 5% 이하는 결실되거나 또 다른 뉴클레오타이드에 의해 치환될 수 있거나, 기준 서열에서의 전체 뉴클레오타이드의 5%까지의 다수의 뉴클레오타이드는 기준 서열로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이 변경은 기준 뉴클레오타이드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에 또는, 개별적으로 기준 서열에서의 잔기 중에 또는 기준 서열 내의 하나 이상의 인접 기에서 배치된, 이 말단 위치 사이의 어디서든 발생할 수 있다. 실제적 문제로서, 임의의 특정한 폴리뉴클레오타이드 서열이 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지는 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 폴리펩타이드에 대해 상기 기재된 것(예를 들어, ALIGN-2)을 이용하여 종래대로 결정될 수 있다.
폴리펩타이드의 유도체 또는 변이체는, 유도체 또는 변이체의 아미노산 서열이 원래 펩타이드로부터 100개의 아미노산 서열과 적어도 50%의 동일성을 가지는 경우, 펩타이드와 "상동성"을 공유하거나 "상동성"이라고 말해진다. 소정의 실시형태에서, 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가지는 펩타이드 또는 펩타이드의 단편의 것과 적어도 75% 동일하다. 소정의 실시형태에서, 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가지는 펩타이드 또는 펩타이드의 단편의 것과 적어도 85% 동일하다. 소정의 실시형태에서, 유도체의 아미노산 서열은 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가지는 펩타이드 또는 펩타이드의 단편의 것과 적어도 90% 동일하다. 몇몇 실시형태에서, 유도체의 아미노산 서열은 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가지는 펩타이드 또는 펩타이드의 단편의 것과 적어도 95% 동일하다. 소정의 실시형태에서, 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 수의 아미노산 잔기를 가지는 펩타이드 또는 펩타이드의 단편의 것과 적어도 99% 동일하다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "변형된"은 소정의 폴리펩타이드에 이루어진 임의의 변화, 예컨대 폴리펩타이드의 길이, 아미노산 서열, 화학 구조, 폴리펩타이드의 동시번역 변형, 또는 번역 후 변형의 변화를 의미한다. 형태 "(변형된)" 용어는 기재된 폴리펩타이드가 임의로 변형된다는 것, 즉 기재된 폴리펩타이드가 변형되거나 변형되지 않을 수 있다는 것을 의미하다.
몇몇 양태에서, 본 명세서에 개시된 항체 또는 단백질은 본 명세서에 개시된 표(들) 또는 수탁 번호(들)에 기재된 관련 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, 본 명세서에 개시된 단리된 항체 또는 단백질은 본 명세서에 개시된 표(들) 또는 수탁 번호(들)에 기재된 관련 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편과 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 아미노산 서열을 포함한다.
약제학적 조성물
본원은, 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 본 명세서에 기재된 항체 중 임의의 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는, 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 무균이다. 약제학적 조성물은 일반적으로 유효량의 항체를 포함한다.
이 조성물은, 본 명세서에 개시된 항체 중 하나 이상 이외에, 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비독성이어야 하고 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로, 예를 들어 경구, 정맥내, 피부 또는 피하, 비강, 근육내, 복강내 경로에 따라 달라질 수 있다.
경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체, 예컨대 젤라틴 또는 아쥬번트를 포함할 수 있다. 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예컨대 물, 석유, 동물 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일을 포함한다. 생리학적 식염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 사카라이드 용액 또는 글라이콜, 예컨대 에틸렌 글라이콜, 프로필렌 글라이콜 또는 폴리에틸렌 글라이콜이 포함될 수 있다.
정맥내, 피부 또는 피하 주사, 또는 통증의 부위에서의 주사를 위해, 활성 성분은 발열원 비함유이고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 가지는 비경구로 허용되는 수성 용액의 형태일 것이다. 당해 분야의 당업자는 예를 들어 등장성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사, 링거 주사, 락트산염 링거 주사를 사용하여 적합한 용액을 훌륭히 제조할 수 있다. 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요한 경우 포함될 수 있다.
이것이 폴리펩타이드, 항체, 핵산, 소분자 또는 개체에게 투여되는 다른 약제학적으로 유용한 화합물이든지, 투여는 바람직하게는 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"에 있다(예방이 치료로 생각될 수 있을지라도, 그 경우일 수 있음), 이것은 개체에게 이익을 보여주기에 충분하다. 투여된 실제 양, 및 투여의 속도 및 시간 과정은 치료되는 단백질 응집 질환의 성질 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 치료의 처방, 예를 들어 투약량의 결정 등은 일반적인 실행자 및 다른 의학 의사의 책임 내에 있고, 통상적으로 치료되는 장애, 개별 대상체의 병태, 전달의 부위, 투여의 방법 및 실행자에게 공지된 다른 인자를 고려한다. 상기 언급된 기법 및 프로토콜의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980]에서 발견될 수 있다.
이 조성물은 단독으로 또는 다른 치료와 조합되어, 치료되는 병태에 따라 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
방법
사용 방법
일 양태에서, 본원은 비자극성 골수성 세포의 불능을 발생시키는 비자극성 골수성 세포와 항-NSM 항체, 예컨대 인간 항체를 접촉시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본원은 비자극성 골수성 세포의 불능을 발생시키는 비자극성 골수성 세포와 항-NSM 마우스 항체를 접촉시키는 방법을 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 비자극 세포는 DC1 세포 및 TAM 세포 중 하나 이상이다.
몇몇 실시형태에서, 본원은 비자극성 골수성 세포를 NSM 항체와 접촉시켜, 비자극성 골수성 세포를 사멸시키는 비자극성 골수성 세포를 불능시키는 방법을 제공한다. 불능은 세포가 부분적으로 또는 완전히 비기능성이 되게 하는 것을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 불능은 세포에서 성장 정지를 유도한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 불능은 세포에서 세포사멸를 발생시킨다. 몇몇 실시형태에서, 비자극 세포의 불능은 예를 들어 보체 의존적 세포독성(CDC) 또는 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC)에 의해 세포의 용해를 발생시킨다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 불능은 세포에서 괴사를 발생시킨다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 불능은 세포에서 성장 정지를 유도한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 불능은 세포를 불활성화시킨다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 불능은 세포에서 NSM 단백질의 활성을 중화시킨다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 불능은 세포의 증식을 감소시킨다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 불능은 세포의 분화를 발생시킨다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 불능은 저해 항원 제시 세포로서 작용하는 세포의 능력의 감소시키거나, 활성화 항원 제시 세포로서 작용하는 세포의 능력을 증가시킨다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 불능은 종양 조직 또는 종양 미세환경(TME) 내에 세포의 불국소화를 발생시킨다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 불능은 종양 조직 또는 종양 미세환경 내에 세포의 공간적 구조를 변경시킨다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 불능은 종양 조직 또는 TME 내에 세포의 시간적 발현을 변경시킨다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 비자극성 골수성 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 비자극성 골수성 세포를 불능시키는 것의 임의의 및 모든 양태에서, 특징(들) 또는 기능(들)의 양태의 임의의 증가 또는 감소 또는 변경은 항-NSM 항체와 접촉하지 않은 세포와 비교된다.
또 다른 양태에서, 본원은 비자극성 골수성 세포의 기능을 조절하는 비자극성 골수성 세포를 항-NSM 항체와 접촉시키는 방법을 제공한다. 조절은 하기 중 임의의 하나 이상일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 비자극 세포는 DC1 세포, TAM1 세포 및 TAM2 세포 중 하나 이상이다. 몇몇 실시형태에서, 기능의 조절은 비자극성 골수성 세포의 불능을 발생시킨다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 기능의 조절은, 예를 들어 미경험 CD8+ T 세포에 MHCI 분자 상의 종양 항원을 교차 제시하는 비자극 세포의 능력을 증가시킴으로써, 네이티브 및 활성화 CD8+ T 세포 둘 다를 자극시키는 세포의 능력을 증가시킨다. 몇몇 실시형태에서, 조절은 예를 들어 T 세포 수용체(TCR) 신호전달, T 세포 증식 또는 T 세포 사이토카인 제조를 촉발하는 세포의 능력을 포함하여 비자극성 골수성 세포의 T 세포 자극 기능을 증가시킨다. 일 실시형태에서, 비자극 세포의 생존은 감소하거나, 비자극 세포의 증식은 감소한다. 일 실시형태에서, 자극성 골수성 세포 대 비자극성 골수성 세포의 비율은 증가한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 비자극성 골수성 세포의 기능을 감소시키는 것의 임의의 및 모든 양태에서, 특징(들) 또는 기능(들)의 양태의 임의의 증가 또는 감소 또는 변경은 항-NSM 항체와 접촉하지 않은 세포와 비교된다.
몇몇 실시형태에서, 본원은 비자극성 골수성 세포를 항-NSM 항체와 접촉시켜, 비자극성 골수성 세포를 사멸시키는 단계를 포함하는 비자극성 골수성 세포의 사멸(또한 세포사의 유도라 칭함)의 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 사멸은 항-NSM 항체와 접촉하지 않은 비자극성 골수성 세포에 비해 증가한다. 몇몇 실시형태에서, 접촉은 비자극성 골수성 세포에서 세포사멸를 유도한다. 몇몇 실시형태에서, 접촉은 비자극성 골수성 세포에서 세포사멸를 유도한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 비자극성 골수성 세포 및 자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에 있다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 추가로 비자극성 골수성 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 세포의 10%-80%는 사멸된다. 몇몇 실시형태에서, 세포의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%는 사멸된다.
몇몇 실시형태에서, 본원은 면역 세포의 집단을 항-NSM 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에서 자극성 골수성 세포 대 비자극성 골수성 세포의 비율을 증가시키는 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 비율은 항-NSM 항체와 접촉하지 않은 세포의 집단에 비해 증가한다. 몇몇 실시형태에서, DC2 세포 대 DC1 세포의 비율은 증가한다. 몇몇 실시형태에서, DC2 세포 대 TAM1 세포의 비율은 증가한다. 몇몇 실시형태에서, DC2 세포 대 TAM2 세포의 비율은 증가한다. 몇몇 실시형태에서, DC2 세포 대 TAM1 + TAM2 세포의 비율은 증가한다. 몇몇 실시형태에서, DC2 세포 대 TAM1 + DC1 세포의 비율은 증가한다. 몇몇 실시형태에서, DC2 세포 대 DC1 + TAM2 세포의 비율은 증가한다. 몇몇 실시형태에서, DC2 세포 대 DC1 + TAM1 + TAM2 세포의 비율은 증가한다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 비율은 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%만큼 증가한다.
몇몇 실시형태에서, 접촉 전에 자극성 골수성 세포 대 비자극성 골수성 세포의 비율은 0.001:1 내지 0.1:1의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 접촉 후에 자극성 골수성 세포 대 비자극성 골수성 세포의 비율은 0.1:1-100:1의 범위이다.
몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 수가 감소한다. 몇몇 실시형태에서, 자극성 골수성 세포는 DC2 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 예를 들어 괴사 또는 세포사멸에 의해 사멸된다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 성장 정지를 겪도록 유도된다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포는 더 이상 급증하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 공간적 국소화는 변경되고, 비율은 TME의 특정한 영역에서 증가한다. 몇몇 실시형태에서, 비자극성 골수성 세포의 시간적 발현은 변경되고, 비율은 종양의 발생 동안 특정한 시간 동안 증가한다.
몇몇 실시형태에서, 접촉은 시험관내이다. 몇몇 실시형태에서, 접촉은 생체내이다. 몇몇 특정한 실시형태에서, 접촉은 인간에서 생체내이다. 몇몇 실시형태에서, 접촉은 항-NSM 항체를 투여함으로써 실행된다. 몇몇 실시형태에서, 항체(예컨대, 인간)를 받는 개체는 암을 가진다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-NSM 항체를 포함하는 유효량의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 면역 관련 병태(예를 들어, 암)를 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 항-NSM 항체를 포함하는 유효량의 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 면역 반응을 증대시키는 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 이 방법은 다른 동시치료제, 예컨대 PDL 봉쇄 치료제, CTLA4 봉쇄 치료제, T 세포 상의 저해 분자가 차단되는 일반화 관문 봉쇄 치료제, 적응성 T 세포 치료제, CAR T 세포 치료제, 수지상 세포 또는 다른 세포 치료제, 및 종래의 화학치료제와 조합되어 추가로 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 개체로부터의 생물학적 샘플에서 NSM 단백질의 발현 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 체액, 조직 샘플, 기관 샘플, 뇨, 대변, 혈액, 타액, CSF 및 임의의 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 종양 조직으로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 발현 수준은 NSM 단백질을 코딩하는 mRNA의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, NSM 단백질의 발현 수준은 NSM의 단백질 발현 수준을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, NSM 단백질의 발현 수준은 FACS, 웨스턴 블롯, ELISA, 면역침강, 면역조직화학, 면역형광, 방사성 면역검정, 도트 블로팅, 면역검출 방법, HPLC, 표면 플라스몬 공명, 광학 분광학, 질량 ?좁?법, HPLC, qPCR, RT-qPCR, 멀티플렉스 qPCR 또는 RT-qPCR, RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, MassARRAY 기법, 및 FISH, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 샘플에서 검출된다.
또 다른 양태에서, 본원은 비자극성 골수성 세포를 포함하는 세포의 집단 항-NSM 항체와 접촉시키는 단계; 및 비자극성 골수성 세포의 수를 정량화하는 단계를 포함하는 일반적으로 비자극성 골수성 세포의 존재 또는 부재, 또는 특정한 비자극성 골수성 세포(예를 들어, DC1 세포, TAM1세포 및/또는 TAM2 세포)의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본원은 비자극성 골수성 세포 및 자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단을 항-NSM 항체와 접촉시키는 단계; 세포에 대한 항체의 결합을 표시하는 복합체 또는 모이어티를 검출하는 단계 및 임의로 집단에서 비자극성 골수성 세포의 수를 정량화하는 단계를 포함하는 비자극성 골수성 세포의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 비자극성 골수성 세포 및 자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단을 항-NSM 항체와 접촉시키는 단계; 자극성 골수성 세포의 수 및 비자극성 골수성 세포를 정량화하는 단계; 및 자극성 골수성 세포에 대한 비자극성 골수성 세포의 상대 비율을 결정하는 단계를 포함하는 자극성 골수성 세포에 대한 비자극성 골수성 세포의 상대 비율을 결정하는 방법이 제공된다.
검출 및/또는 정량화에 대해 본 명세서에 기재된 실시형태에서, 항-NSM 항체는 NSM 단백질에 결합하지만, 이것이 생물학적 반응에 영향을 가질 수 있더라도, 생물학적 반응, 예컨대 ADCC에 반드시 영향을 미칠 필요는 없다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 개체로부터의 생물학적 샘플에서 NSM 단백질의 발현 수준을 검출하는 단계; 및 NSM 단백질의 발현 수준에 기초하여 개체가 면역치료에 반응할 수 있는지 결정하는 단계(여기서, 건강한 개체에 비해 개체에서의 NSM 단백질의 상승한 수준은 개체가 면역치료에 반응할 수 있다는 것을 나타냄)를 포함하는 면역 관련 병태(예를 들어, 암)의 치료에 대한 (예를 들어, 항-NSM 항체에 의한) 면역치료에 반응할 수 있는 개체를 확인하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 이 방법은 개체에서의 면역 관련 병태(예를 들어, 암)를 진단하기 위해 또한 사용될 수 있고, NSM 단백질의 발현 수준에 기초하고, 여기서 건강한 개체에 비해 개체에서의 NSM 단백질의 상승한 수준은 암을 겪는 개체를 나타낸다. 몇몇 실시형태에서, 발현 수준은 NSM 단백질을 코딩하는 mRNA의 mRNA 발현 수준을 포함한다. 다른 실시형태에서, NSM 단백질의 발현 수준은 NSM 단백질의 단백질 발현 수준을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, NSM 단백질의 발현 수준은 FACS, 웨스턴 블롯, ELISA, 면역침강, 면역조직화학, 면역형광, 방사성 면역검정, 도트 블로팅, 면역검출 방법, HPLC, 표면 플라스몬 공명, 광학 분광학, 질량 ?좁?법, HPLC, qPCR, RT-qPCR, 멀티플렉스 qPCR 또는 RT-qPCR, RNA-seq, 마이크로어레이 분석, SAGE, MassARRAY 기법, 및 FISH, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 이용하여 샘플에서 검출된다. 이 실시형태에서, 항-NSM 항체는 NSM 단백질에 결합하지만, 생물학적 반응, 예컨대 ADCC에 반드시 영향을 미칠 필요는 없다. 몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 종양 조직으로부터 유래한다. 몇몇 실시형태에서, 생물학적 샘플은 체액, 조직 샘플, 기관 샘플, 뇨, 대변, 혈액, 타액, CSF 및 임의의 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
종양에 대한 대상체 면역 반응을 증대시키거나 면역치료제 치료의 효능을 증대시키는 방법이 본 명세서에 또한 개시되어 있다. 일반적으로, SDC의 존재비를 증가시키는 치료는 대상체 결과, 예컨대 재발 무 생존 시간을 개선할 것이고, 암 면역치료제 치료의 효능을 증대시킬 것이다. 치료는 대상체의 종양에서의 SDC 세포의 상대 또는 절대 존재비를 증가시킬 수 있다. 치료는 대상체의 종양에서의 NSM 세포의 상대 또는 절대 존재비를 감소시킬 수 있다.
일반적인 치료 전략의 예시적인 방법은 Flt3L의 전신 도입에 의해 SDC의 수를 증가시키는 것을 포함한다. 또 다른 방법은 CSF1을 동시에 차단하면서 Flt3L에 의한 대상체의 자가유래 골수 또는 혈액 세포의 치료이다. 예를 들어, 골수 또는 혈액 전구세포 집단에서의 IRF8, Mycl1 또는 BATF3 또는 ZBTB46과 같은 SDC 전사 인자의 레트로바이러스에 의한 발현은 SDC 발생을 추진시키도록 또한 사용될 수 있다. 치료의 또 다른 전략은 SDC를 선택적으로 할애하면서 NSM 세포의 전신 제거를 포함한다. 이것은 이 집단의 비율의 양호한 전체 변화를 생성시킬 수 있다. NSM 세포의 제거는 NSM 표면 단백질에 대한 항체의 투여(전신 또는 종양에 국소화)를 포함하는 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, SDC 증대 치료는 암을 제어하거나 근절하는 데 있어서 대상체의 네이티브 면역계가 훌륭히 가능하게 하는 치료학적 치료로서 적용된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 SDC 증대 치료는 치료학적 치료, 예컨대 면역치료제 치료(이러한 적용은 면역치료제 치료 전, 이와 동시 또는 이의 후임)와 조합되어 적용되고, 여기서 SDC 증대 치료는 치료학적 치료의 효능을 증가시키기 위해 보조적 또는 보강 치료로서 작용한다.
투여 방법
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법은 개체에서 면역 관련 병태의 치료에 유용하다. 일 실시형태에서, 개체는 인간이고, 항체는 NSM 항체이다. 또 다른 실시형태에서, 개체는 마우스이고, 항체는 NSM 항체이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법(예컨대, 면역 반응을 증대시키거나 비자극성 골수성 세포의 불능을 실행하는 방법)은 암의 치료에 유용하고, 그러므로 항-NSM 항체 또는 항-NSM 항체를 받는 개체는 암을 가진다. 몇몇 실시형태에서, 암은 고형암이다. 몇몇 실시형태에서, 암은 액체 암이다. 몇몇 실시형태에서, 암은 면역회피성이다. 몇몇 실시형태에서, 암은 면역반응성이다. 특정한 실시형태에서, 암은 흑색종, 신장, 간담즙성, 두경부 편평상피 암종(HNSC), 췌장, 결장, 방광, 전립선, 폐, 교모세포종 및 유방으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, 면역 관련 병태는 (인간에서의) 비자극성 골수성 세포에서의 NSM 단백질의 발현 또는 비인간 종에서의 NSM 단백질의 동족체의 발현과 연관된 면역 관련 병태이다. 몇몇 실시형태에서, 면역 관련 병태는 자극성 골수성 세포와 비교하여 비자극성 골수성 세포에서의 NSM 단백질의 과발현과 연관된 면역 관련 병태이다. 몇몇 실시형태에서, NSM mRNA 또는 NSM 단백질의 과발현은 자극성 골수성 세포와 비교하여 약 적어도 2배, 5배, 10배, 25배, 50배 또는 100배 더 높다.
몇몇 실시형태에서, 항체는 정맥내로, 근육내로, 피하로, 국소로, 경구로, 경피로, 복강내로, 안와내로, 이식에 의해, 흡입에 의해, 척수강내로, 심실내로 또는 비강내로 투여된다. 항-NSM 항체의 유효량은 암의 치료를 위해 투여될 수 있다. 항-NSM 항체의 적절한 투약량은 치료되는 암의 유형, 항-NSM 항체의 유형, 암의 중증도 및 과정, 개체의 임상 병태, 개체의 임상 병력 및 치료에 대한 반응, 및 주치의의 결정에 기초하여 결정될 수 있다.
SDC 및 NSM 세포의 검출 및 정량화
본 발명은 SDC 및/또는 NSM 세포의 정량화를 위한 임의의 방법론을 포함한다. 다양한 실시형태는 예를 들어 종양 샘플에서의 SDC 및/또는 NSM 세포의 확인 및 정량화에 관한 것이다. 종양 샘플은 당해 분야에 공지된 바와 같은 환자로부터 얻어진 종양 세포, 예를 들어 생검(예를 들어, 침생검 또는 펀치 생검, 예를 들어 4㎜ 펀치 생검)을 위해 제거된 종양의 일부 또는 1차 또는 전이성 세포를 포함하는, 수술로 절제되는, 실질적으로 전체 종양을 포함하는 임의의 조직일 수 있다. SDC의 존재비가 주변 영역보다 종양의 원위 영역에서 크다는 것이 주목될 것이다. 통상적인 샘플에서, 이 차이는 평균이 내질 것이고 결과에 영향을 미치지 않아야 한다. 그러나, 과도한 양의 주변 물질이 샘플에 포함되는 경우, 이것은 SDC 존재비의 언더컷을 향해 결과를 좌우할 수 있다.
실시형태에서, 샘플에서의 SDC 및 NSM 세포의 수는 형광 활성화된 세포 분류(FACS), 유사한 유세포계측법 방법론, 자기 활성화된 세포 분류, 마이크로래프트 분류, 친화도 기반 세포 분리 방법, 및 세포의 혼합 집단으로부터 특이적 세포 유형을 단리하는 다른 수단에 의해 직접적으로 정량화된다. 예를 들어, 종양 샘플은 당해 분야에 공지된 바와 같은 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 효소에 의해 분해될 수 있다. 이후, 세포는 단백질에 특이적인 항체 또는 각각의 세포 유형에 독특한 탄수화물 마커에 의해 표지될 수 있다. 다음에, 다양한 라벨에 기초한 다양한 게이팅 프로토콜은 FACS, 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 유사한 방법론에 의해 세포 분획을 분리시키도록 이용될 수 있다. 예를 들어, 실시예에 기재된 바대로, 형광으로 태그화된 항체에 의한 분해된 종양으로부터의 단일 세포 현탁액의 표지는 샘플 내의 다른 세포 유형으로부터의 수지상 세포 분획의 FACS 단리 및 SDC 및 NSM 세포 풀의 분리를 허용한다. 당해 분야에 공지된 바대로, 세포외 또는 세포내 마커 단백질의 표지는 이러한 방법론에서 사용될 수 있다.
예를 들어, 하나의 FACS 프로토콜에서, 종양 골수성 구획의 다양한 세포 유형은 하기에 따라 분류될 수 있다. CD11b 및 Ly6C를 발현하는 이 세포는 단핵구 및 호중구를 나타내고, 이러한 발현에 의해 제거될 수 있다. 높은 CD24 발현 및 낮은 F4/80 발현은 종양 대식세포 세포(TAM1 및 TAM2)로부터 수지상 세포(SDC 및 DC1 세포)를 구별하도록 이용될 수 있다. 2개의 종양 대식세포 집단은 CD11b 및 CD11c의 이의 차등적 발현에 의해 서로로부터 분리될 수 있고, TAM1 세포는 "CD11b 높음", "MHC II종 낮음" 및 "CD11c 낮음"이지만, TAM2 세포는 "CD11b 낮음", "MHC II종 높음" 및 "CD11c 높음"이다. 인간에서의 종양 대식세포는 특징적으로 CD14를 발현하지만, DC는 통상적으로 그렇지 않다. 서로로부터 및 대식세포로부터 2개의 수지상 집단을 구별하는 것을 보조하는 구별되는 표면 마커의 예는 마우스에서의 CD103, XCR1, Clec9a 및 CD11b 또는 인간에서의 CD14, BDCA3, XCR1 및 Clec9a를 포함한다. 예를 들어, 2개의 수지상 세포 집단은 CD11b(SDC에 부재, NSM 세포에 존재) 및 CD103(NSM 세포에 부재, SDC에 존재)의 이의 차등적 발현에 의해 마우스 종양에서 분리될 수 있다. 유사하게, 인간에서의 SDC는 BDCA3, XCR1 및 Clec9a를 발현하지만, 비자극 DC는 BDCA1을 발현하고, 대식세포는 CD14를 발현한다.
또 다른 실시형태에서, 조직 샘플의 직접적인 조직학적 분석은 다른 세포 유형과 비교하여 SDC의 존재, 출현율 및 상대 존재비를 결정하기 위해 이용된다. 예를 들어, 조직 절편은 SDC 마커에 대항하고 항원을 포함하는 표지된 항체, 및 NSM 마커에 대항하고 항원을 포함하는 표지된 항체에 의해 염색될 수 있다. 정량적 형광 현미경검사법에 의한 표지된 조직 절편의 분석은 이후 샘플에서의 SDC 및 NSM 세포의 정량화, 및 상대 신체 분포의 가시화 및 샘플에서의 이러한 세포의 국소화에 적용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 샘플에서의 SDC의 존재비 및/또는 NSM 세포의 존재비는 벌크 종양 샘플에서 유전자 발현 패턴을 관찰함으로써 간접적으로 결정되어서, 세포 분획으로 샘플을 분리시킬 필요를 없앤다. 벌크 종양 조직에서의 SDC 및 NSM 유전적 마커의 정량적 분석은 종양에 존재하는 SDC 대 NSM 세포의 비율의 대리 측정치로서 이용된다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 종양 샘플 내의 세포의 전체 전사체는 SDC 마커 유전자의 발현 대 NSM 마커 유전자의 발현의 비율을 결정하기 위해 평가된다. 마커 유전자 발현의 이러한 정량화는 유전자 발현의 분석을 위해 당해 분야에 공지된 임의의 수의 도구를 이용하여 달성될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
일 실시형태에서, 종양 샘플에서의 마커 유전자 발현의 평가는 당해 분야에 공지된 바대로 정량적 PCR 방법론을 이용하여 수행된다. 이러한 방법론은 당해 분야에 공지된 바와 같은 전체 종양-전사체 프로토콜, 및 마커 유전자 서열을 독특하게 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 수행될 수 있다. 마커 유전자의 공지된 서열을 고려하여, 이에 대한 프라이머를 생성하는 것이 용이하게 당업자의 기술 내에 있다. 당해 분야에 공지된 바대로, 특정한 유전자의 "유전자 서열"의 언급이, 발현의 정량화의 맥락에서, 발현될 때 그 유전자에 의해 제조된 mRNA(또는 이로부터 생성된 cDNA)에 상응하거나 상보성인 전체 또는 부분 핵산 서열을 의미하느 것으로 이해될 것이다.
또 다른 실시형태에서, 마커 유전자의 발현은 당해 분야에 공지된 바와 같은 DNA 어레이 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 마커 유전자 전사체에 결합하는 프로브는 마커 유전자의 공지된 서열을 이용하여 당해 분야의 당업자에 의해 용이하게 생성될 수 있고, 임의의 수의 유전자 발현 칩 및 분석 플랫폼에서 이용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, SDC 및 NSM 세포 정량화는, 마커 유전자 또는 이의 번역 생성물에 의해 조절되고, 활성이 마커 유전자 발현에 반응하여 예상대로 변하는, 유전자 및 단백질로서 한정된, 다운스트림 유전자 및 단백질의 존재 또는 활성을 모니터링함으로써 달성된다. 또 다른 실시형태에서, 기능적 검정은 예를 들어 차등적 면역학적 활성에 의해 SDC 및 NSM 세포를 확인하거나 정량화하기 위해 이용된다. 예를 들어, SDC는 종양 항원을 교차 제시하는 데 있어서 효율적이고, CD8 T 세포의 강력한 활성자이지만, NSM 세포는 그렇지 않다. 유사하게, 비교하면 NSM 세포가 매우 포식세포 거동을 나타내지만, SDC는 덜 건장한 포식세포이다.
존재비 및 스크리닝
본 발명의 다양한 실시형태는 종양에서의 SDC의 존재비를 결정하는 것에 관한 것이다. 이러한 세포의 존재비는 다양한 측정치에 의해 평가될 수 있다. 이러한 측정은 상대 측정 또는 절대 측정을 포함할 수 있고, 직접 또는 간접 측정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상대 존재비는 샘플에서의 SDC 대 NSM 세포의 비율; 샘플에서의 SDC 대 DC1 세포의 수의 비율; 또는 샘플 내의 SDC 대 모든 세포 유형의 비율, 샘플에서의 SDC 대 전체 골수성 세포의 비율, 또는 샘플에서의 SDC 대 HLA-DR+ 세포의 비율을 측정함으로써 결정될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, SDC의 절대 존재비는 예를 들어 종양 조직의 1㎖당 또는 종양 조직의 1마이크로그램당 SDC의 전체 수의 측정치로서 결정된다. 간접 측정은 단독으로 또는 다른 세포 유형, 예컨대 NSM 세포에 대한 마커의 발현 수준과 비교하여 SDC 마커 유전자의 유전자 발현의 수준을 평가하는 것을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 대상체의 종양에서의 SDC의 존재비는 예후 표시자, 진단학적 표시자 또는 치료 선택 표시자를 포함한다.
다양한 실시형태는 비교적 측정치, 예컨대 SDC의 "상승한" 또는 "증가한" 존재비에 관한 것이다. 이러한 비교적 측정치는 대상체로부터의 샘플을 대표적인 샘플과 비교함으로써 이루어질 수 있다. 대표적인 샘플은 예를 들어 이른 시점에서의 동일한 대상체로부터 유래한 샘플, 유사한 대상체(예를 들어, 연령, 성별, 건강 표시자, 암 진행, 암 유형 등에서 일치)로부터 유래한 샘플, 또는 유사한 종양(예를 들어, 종양 유형, 종양 단계 및 종양 진행의 다른 측정치에 관해 일치)으로부터 유래한 샘플을 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료의 효능이 평가되는, 몇몇 실시형태에서, 상승한 존재비는 치료되지 않은 대상체로부터의 대표적인 샘플에서 관찰된 것보다 높은 존재비로 정의된다. 몇몇 실시형태에서, 통상적인 또는 평균 SDC 존재비의 측정치는 무엇이 상승한 또는 증가한 존재비를 구성하는지를 결정하기 위한 기준치로서 사용되고, 예를 들어 대표적인 샘플에서의 SDC의 평균, 중앙값 또는 유사한 통계 측정치가 사용될 수 있다. 당해 분야에 공지된 다양한 통계 방법론은 유의미하게 상승한 또는 증가한 분량을 한정하기 위해 이용될 수 있다.
일 실시형태에서, 대상체의 종양에서의 SDC의 존재비는 예후 표시자를 포함하고, 여기서 대상체의 결과는 대상체의 종양에서의 SDC의 존재비에 기초하여 예측되고, 상승한 존재비는 양성 결과의 더 높은 가능성을 나타낸다. 결과의 예시적인 측정치는 재발 무 생존의 가능성, 예측된 재발 무 생존 시간, 예측된 전체 생존 시간, 재발 위험, 삶 표시자의 품질 등을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 직접적으로 또는 간접적으로 측정된, 종양 샘플에서의 SDC 대 NSM 세포의 비율은 SDC 존재비의 측정치로서 이용되고, 예측된 재발 무 생존 시간은 대상체 결과의 측정치이다. 예를 들어, 유사한 종양 샘플의 풀에서 관찰된 평균 또는 중앙값 SDC 마커 유전자 발현 대 NSM 마커 유전자 발현 비율은 한계치 값으로 작용할 수 있고, 개별 대상체의 측정된 비율이 상기 한계치를 초과하는 경우, 대상체는 재발 무 생존의 증가한 가능성을 가지는 것으로 발견되었다.
또 다른 실시형태에서, 대상체의 종양에서의 SDC의 존재비는 면역치료제 치료에 양성으로 반응하는 대상체의 가능성의 표시자이고, 대상체로부터 유래한 종양 샘플에서의 SDC의 상승한 존재비는 면역치료에 대한 양성 반응의 더 높은 가능성을 표시한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 직접적으로 또는 간접적으로 측정된, 종양 샘플에서의 SDC 대 NSM 세포의 비율은 SDC 존재비의 측정치로서 이용된다. 예를 들어, 유사한 종양 샘플의 풀에서 관찰된 평균 또는 중앙값 SDC 마커 유전자 발현 대 NSM 마커 유전자 발현 비율은 한계치 값으로서 작용할 수 있고, 개별 대상체의 측정된 비율이 상기 한계치보다 낮은 경우, 대상체는 면역치료에 양성으로 반응하는 감소한 가능성을 가지는 것으로 발견되었다.
대상체가 면역치료 방법에 의한 치료에 더욱 아마도 수정될 것인지를 예측하는 것은 유리하게는 적절한 치료학적 중재의 선택을 허용한다. 면역치료제 치료에 덜 반응할 것으로 발견된 대상체는 다른 치료 양상에 관할 수 있지만, 면역치료에 더 반응할 것인 대상체는 이렇게 치료될 수 있다. 본 발명의 치료 선택 표시자는 당해 분야에 공지된 임의의 암 면역치료에 대한 반응성 또는 비반응성을 예측하는 것에 적용 가능하다. 예를 들어, 일 종류의 암 면역치료제는 "관문 봉쇄" 치료제로서 공지되어 있다. 포유류 면역계는 면역 반응을 약화시키고 자가면역 반응을 막도록 보통 작용하는 자기 제한 저해 경로인 다양한 "관문"을 포함한다. 종양은 이 경로를 장악하여서 항종양 면역 반응이 억제되는 것으로 나타났다. 관문 봉쇄로서 공지된 다양한 치료학적 전략은, 이 기준점을 차단하고 면역 반응의 종양 억제를 제어하고 항종양 면역 반응을 구조하도록, 리간드, 예컨대 항체의 사용을 포함한다. 또 다른 종류의 면역치료제는 세포 기반 전략, 예를 들어 대상체로부터의 세포, 예컨대 수지상 세포의 제거 및 종양 항원에 대한 이러한 세포의 생체외 증식 및 활성화를 포함한다. 활성화된 세포는 이후 종양에 대한 대상체의 면역 반응을 증대시키기 위해 신체로 재도입된다.
본 명세서에 함유된 개시내용은 SDC의 존재비와 대상체 결과 및/또는 면역체료제 치료에 대한 대상체 적용 사이의 신규한 관계식을 가지는 기술을 제공한다. 본 발명은 광범위하게 이 개념의 임의의 적용을 포함한다. 암의 임의의 특정한 유형 또는 하위유형에 대한 SDC 존재비의 특정한 측정치와 대상체 결과의 특정한 측정치 또는 면역치료제 치료에 특정한 수정 사이의 예측 관계식을 개발함으로써 본 발명의 개념을 실행하는 것이 당업자의 기술 내에 있다. 이러한 예측 관계식은 증가한 SDC 존재비가 개선된 대상체 결과 또는 면역치료제 치료에 대한 증가한 수정을 나타내는 현상을 구현하는 임의의 통계 섭생을 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 SDC 마커 유전자 발현 대 NSM 마커 유전자 발현의 비율이 NSM 면역 세포 존재비에 대한 SDC 존재비의 측정치로서 사용되고, SDC의 상승한 비율이 대상체 생존의 더 높은 가능성을 예측하는 예측 관계식을 포함한다. 예를 들어, 실시예에 기재된 바대로, 12개의 상이한 암 유형을 나타내는 3602 종양 샘플로부터의 유전자 발현 데이터(TCGA 팬-암 프로젝트(pan-cancer project)로부터의 데이터)의 큰 풀이 분석되고, 여기서 연관 대상체 생존 데이터는 각각의 종양 샘플에 이용 가능하다. 각각의 샘플에 대해, 표 A에서의 모든 SDC 마커 유전자의 평균 관찰된 발현 수준(정규화 데이터세트에서 강도의 상대 단위로 측정됨)은 SDC 수지상 면역 세포 존재비의 측정치로서 계산되고 취해진다. 마찬가지로, 표 A에서의 모든 NSM 마커 유전자의 관찰된 평균 발현 수준은 각각의 샘플에 대해 계산되고, NSM 면역 세포 존재비의 측정치로부터 취해진다. 각각의 샘플에 대한 SDC 대 NSM 세포 존재비 신호의 비율이 이후 계산되고, 대수적으로 형질전환되고, Z 점수는 전체 데이터세트에 걸쳐 0의 중앙값 및 1의 표준 편차가 되도록 정규화된다. 각각의 암 유형의 경우, 중앙값 SDC 대 NSM 유전자 마커 유전자 발현 비율 값이 계산된다. 각각의 암 유형의 경우, 샘플의 풀은 "높은" SDC 대 NSM 비율 또는 "낮은" SDC 대 NSM 비율로 분할되고, 높은 풀은 유사한 샘플(암 유형에 기초하여 일치)의 전체 집단에 대해 중앙값보다 높은 정규화 비율을 가지는 모든 샘플을 포함하고, 낮은 풀은 중앙값보다 낮은 정규화 비율을 가지는 모든 샘플을 포함한다. 카플란-마이어 방법은 양분된 변수(암마다 중앙값에 걸쳐 갈라짐)로서 전체 생존과 SDC/NSM 서명 비율 사이의 연관을 평가하도록 이용된다. 도면에 도시된 바대로, 데이터는 전체 생존율이 낮은 풀과 비교하여 높은 풀에서 실질적으로 증가한다는 것을 명확히 보여준다.
따라서, 샘플에서의 SDC 마커 유전자 발현 대 NSM 유전자 발현의 비율은 샘플이 유래한 대상체에 대한 전체 생존 시간을 예측하고, 상승한 비율은 증가한 전체 생존을 나타낸다. 이 경우에, "상승한" 비율은 그 유형의 암에 대한 중앙값 비율 값을 초과하는 비율로서 정의된다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 (1) 대상체로부터 유래한 종양 샘플에서의 평균 SDC 마커 유전자 발현 대 평균 NSM 유전자 발현의 z 점수화 로그 변환된 비율을 계산하고; 이후 대상체의 관찰된 비율을 종양 샘플의 암의 유형에 대한 중앙값 SDC 마커 유전자 발현 대 NSM 유전자 발현 비율 값을 나타내는 한계치 값과 비교함으로써(여기서, 더 높은 평균 전체 생존 시간은 샘플 비율 값이 한계치 값을 초과하는지를 나타냄), 대상체(낮은 SDC/NSM 서명 비율을 가지는 대상체)에 대한 더 높은 전체 생존 시간을 예측하는 방법을 포함한다.
본 명세서에 제시된 SDC 존재비를 계산하는 예시적인 방법은 예시적이고 다양한 방식으로 변형될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 표 A로부터의 유전자의 하위세트가 이용될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, SDC 마커 BDCA3, KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, 및 CLEC9A, 및 NSM 마커 MRC1, MS4A7, C1QC, APOE, C1QB, C1QA 및 C5AR1을 사용한다. 마찬가지로, 유전자 발현 비율을 계산하기 위해 이용된 특정한 수학 연산은 변경될 수 있고, 예를 들어 로그 변환된 값은 합계되고 로그 변환된 평균된 값보다는 평균될 수 있고, 기타 등등이다. 특정한 방법론이 샘플에서의 SDC 마커 유전자 발현 수준 대 NSM 마커 유전자 발현 수준의 비율을 대표하는 한, 비율을 계산하기 위해 이용된 수학 연산의 정확한 성질 및 순서는 필수적이 아니다.
대안적인 실시형태에서, NSM 존재비는 전체 생 종양 세포마다 NSM 세포의 수, 전체 종양 면역 세포마다 NSM 세포의 수, 종양 샘플의 단위 용적마다 NSM 세포의 수, 또는 종양 샘플의 단위 질량(예를 들어, ㎎)마다 NSM 세포의 수로서 측정될 수 있다. 마찬가지로, SDC 존재비는 전체 생 종양 세포마다 SDC 세포의 수, 전체 종양 면역 세포마다 SDC 세포의 수, 종양 샘플의 단위 용적마다 SDC 세포의 수, 또는 종양 샘플의 단위 질량(예를 들어, ㎎)마다 SDC 세포의 수로서 측정될 수 있다.
샘플에서의 전체 골수성 세포는 샘플에서의 전체 CD11b+ 세포로서 평가될 수 있다. 샘플에서의 전체 골수성 세포는 CD14를 발현한 전체 세포와 CD16을 발현한 전체 세포와 HLA를 발현한 전체 세포로서 정의될 수 있다.
일 실시형태에서, SDC 세포의 존재비는 유세포계측 방법에 의해 SDC 마커를 발현한 샘플에서의 HLA-DR 양성 골수성 세포의 백분율로서 평가된다. 예를 들어, SDC 마커는 BDCA3 또는 XCR1 또는 Clec9a일 수 있다.
CD14 발현(CD14+) 대식세포 및 단핵구의 존재비가 암 결과를 더 정확하게 예지하거나 치료 효능을 평가할 목적을 위해 비자극 세포 존재비의 측정치로서 또는 대상체 풀을 계측화하도록 이용될 수 있다는 것이 본 개시내용의 발명자들에 의해 유리하게 발견되었다. CD14+ 대식세포는 자극 수지상 세포와 경쟁할 수 있고, 따라서 골수성 풀에서의 CD14+ 세포 대 SDC 세포의 균형은 암 결과의 중요한 결정인자일 수 있다. CD14+ 세포의 비율은 SDC 존재비의 효과를 조절할 수 있다. 일 실행에서, NSM 존재비의 대안적인 측정치는 샘플에서의 CD14+ 골수성 세포의 존재비로서 정의된다. 일 실시형태에서, CD14+ 골수성 세포 존재비는 CD14를 발현한 전체 CD11b+ 골수성 세포의 백분율로서 측정된다. 또 다른 실시형태에서, CD14를 발현한 HLA-DR 양성 세포의 백분율은 CD14+ 세포 존재비의 측정치로서 사용된다. 또 다른 실시형태에서, CD14+ 골수성 세포 존재비는 CD45를 발현한 전체 면역 세포의 백분율로서 측정된다. 또 다른 실시형태에서, CD14+ 골수성 세포 존재비는 샘플 조직의 그램당 CD14+ 세포의 수 또는 유사한 측정치로서 측정된다.
본 발명의 일 실행에서, SDC 존재비는 SDC 마커, 예를 들어 BDCA3 또는 XCR1을 또한 발현하는 HLA-DR+ 발현 골수성 세포의 백분율로서 측정된다. 일 실시형태에서, 이렇게 측정된 SDC 존재비는 예후 표시자, 치료 효능의 표시자 또는 특정한 치료에 대한 대상체의 수정의 표시자로서 이용되고, 여기서 SDC의 상승한 존재비는 양성 예후, 치료에 대한 양성 반응, 또는 특정한 치료에 대한 적용의 더 높은 가능성을 나타내고, SDC의 더 낮은 존재비는 불량한 예후, 비효과적인 치료, 또는 특정한 치료에 대한 수정의 더 낮은 가능성을 나타낸다. 예를 들어, HLA-DR+ 세포의 1-4, 1-2, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 1.37% 또는 이것 초과의 SDC(예를 들어, BDCA3+ 세포) 존재비는 SDC의 상승한 존재비인 것으로 생각될 수 있다. 예를 들어, 1-5, 1-4, 1-2, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 1.37% 또는 이것 초과의 HLA-DR+ 포함 SDC 세포를 가지는 종양을 가지는 대상체는 면역치료제 치료, 예컨대 항-PD1에 양성으로 반응할 50% 초과의 확률, 예를 들어 양성으로 반응할 85% 초과의 확률을 가진다.
일 실시형태에서, 평가되는 치료는 면역자극 또는 면역치료제 치료이다. 예를 들어, 치료는 프로그래밍된 세포사 단백질 1(PD1) 또는 프로그래밍된 세포사 리간드 1(PD-L1)을 표적화하는 치료를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-PD1 치료는 니볼루맙(Opdivo(상표명)), 펨브로미주랍(Keytruda(상표명))을 포함한다. 또 다른 유사한 치료는 예를 들어 이필리무맙(Yervoy(상표명))에 의한 CTLA-4의 표적화이다. 일 실시형태에서, 대상체가 항-PD1 치료에 반응하는 가능성은 대상체의 종양에서의 SDC 세포의 존재비를 측정함으로써 평가되고, 예를 들어 SDC 세포의 존재비는 SDC 마커(예를 들어, BDCA3)를 발현하는 HLA-DR+ 골수성 세포의 백분율로서 평가되고, SDC 세포의 상승한 존재비는 대상체가 항-PD1 치료에 양호하게 반응할지를 나타내고, 종양에서의 SDC 세포의 더 낮은 존재비는 대상체가 항-PD1 치료에 불량하게 반응할지를 나타낸다. 일 예에서, SDC 세포의 상승한 존재비는 4% 이상의 HLA-DR+ 골수성 세포로 정의되고, SDC 세포의 더 낮은 존재비는 종양 샘플에서의 4% 미만의 HLA-DR+ 골수성 세포로서 정의된다. 일 실시형태에서, 대상체는 흑색종 대상체이다. 상기 방법론은 항-PD1 치료의 효능을 평가하기 위해 유사하게 이용될 수 있고, 치료 이후 SDC 세포의 존재비의 관찰된 증가는 효과적인 치료를 나타낸다. 마찬가지로, PD1의 추정적인 저해제는, 예를 들어 BDCA3+ 세포인 HLA-DR+ 세포의 백분율로서 측정된, SDC 세포의 존재비를 증가시키는 물질로서 확인될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 SDC의 존재비를 증대시키는 조성물(또는 다른 유형의 치료 양상)을 확인하기 위한 스크리닝 방법을 포함한다. 예를 들어, 종양을 가지는 동물은 SDC 존재비의 추정적인 증대제에 노출될 수 있고, 이후 본 발명의 도구 및 방법을 이용하여, SDC의 존재비가 평가될 수 있고, 예를 들어 비치료 대조군 또는 치료 전에 동일한 대상체로부터 유래한 샘플과 비교된, SDC 존재비의 증대는 SDC 존재비의 효과적인 증대제인 치료를 나타내다. 이러한 SDC 존재비는 SDC의 상대 및 절대 측정치를 포함하는 SDC 존재비의 임의의 측정치, 예를 들어 SDC 대 NSM 세포의 비율, 또는 이의 간접 측정을 포함할 수 있다.
키트 및 제조 물품
본원은 본 명세서에 기재된 임의의 하나 이상의 항체 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 키트는 임의의 2차 항체, 면역조직화학 분석을 위한 시약, 약제학적으로 허용되는 부형제 및 설명서 매뉴얼 및 임의의 이들의 조합으로부터 선택된 구성성분을 추가로 함유한다. 특정한 일 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 하나 이상의 항체 조성물을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
일 양태에서, 키트는 시약, 생물학적 물질, 및 SDC 및 NSM 세포의 측정을 수월하게 하는 다른 구성성분으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 키트는, FACS 또는 다른 세포 분류 또는 샘플 내의 SDC 및/또는 NSM 세포의 정량화를 위한 유세포계측 방법론을 수월하게 하도록, 골수성 세포, 일반 수지상 세포 마커, SDC 세포 마커 및 NSM 세포 마커에 관한, 형광 표지된 항체를 포함하는 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 마우스에서의 CD45, CD11c, Ly6C, MHCII, CD24, F4/80, CD11b 및 CD103에 대한 다르게 표지된 항체를 포함하는 키트를 사용할 수 있지만, 인간에서의 CD45, CD11c, CD14, HLA-DR, BDCA1 및 BDCA3에 대한 항체는 SDC 및 NSM 분획의 FACS 단리를 수월하게 하도록 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 일련의 PCR 프라이머는 하나 이상의 SDC 유전자 마커 또는 하나 이상의 NSM 유전자 마커의 증폭을 위해 키트에 포함될 수 있다. 일 실시형태에서, PCR 프라이머 키트는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 모든 표 A에 기재된 SDC 마커 및 표 A에 기재된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 9개 초과의 NSM 마커를 독특하게 증폭시킬 수 있는 일련의 프라이머를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, PCR 프라이머 키트는 BDCA3, KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, MRC1, MS4A7, C1QC, APOE, C1QB, C1QA, 및 C5AR1을 독특하게 증폭시킬 수 있는 일련의 프라이머를 포함한다.
키트는, SDC 또는 NSM 전사체 또는 cDNA의 결합 및/또는 표지를 위한 SDC 또는 NSM 유전자 마커 하위서열을 포함하는, 2개 이상의 프로브를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 키트는 종양 침윤 SDC 또는 NSM 전사체 또는 이로부터 유래한 cDNA의 결합 및 정량화를 위한 하나 이상의 SDC 또는 NSM 마커 유전자 서열을 포함하는 부동화 프로브를 위에 가지는 마이크로어레이 또는 다른 고체 기판을 포함한다. 일 실시형태에서, 어레이는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 모든 표 A에 기재된 SDC 마커; 및/또는 표 A에 기재된 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 9개 초과의 NSM 마커에 상응하는 일련의 프로브를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 어레이는 BDCA3, KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, MRC1, MS4A7, C1QC, APOE, C1QB, C1QA 및 C5AR1에 상응하는 일련의 프로브를 포함한다.
키트는 샘플에서 KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1 및 CLEC9A 유전자 서열을 독특하게 증폭할 수 있는 일련의 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 키트는 샘플에서 C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2 및 TLR7 유전자 서열을 독특하게 증폭할 수 있는 일련의 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 키트는 샘플에서 MRC1, MS4A7, C1QC, APOE, C1QB, C1QA 및 C5AR1 유전자 서열을 독특하게 증폭할 수 있는 일련의 PCR 프라이머를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 어레이는 KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, BDC3A, XRC1 및 CLEC9A 유전자 서열에 결합할 수 있는 부동화 프로브를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 어레이는 C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2 및 TLR7 유전자 서열에 결합할 수 있는 부동화 프로브를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 어레이는 MRC1, MS4A7, C1QC, APOE, C1QB, C1QA 및 C5AR1 유전자 서열에 결합할 수 있는 부동화 프로브를 포함할 수 있다.
본원은 또한 본 명세서에 기재된 항체 조성물 또는 키트 중 임의의 하나를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 제조 물품의 예는 바이알(밀봉 바이알 포함)을 포함한다.
실시예
본 발명을 수행하기 위한 특정한 실시형태의 예가 하기 있다. 예는 오직 예시적인 목적을 위해 제공되고, 본 발명의 범위를 임의의 방식으로 제한하도록 의도되지 않는다. 사용된 수(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하도록 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차 및 편차가 물론 허용되어야 한다.
본 발명의 실행은, 달리 표시되지 않은 한, 당해 분야의 기술 내의 단백질 화학, 생물화학, 재조합 DNA 기법 및 약리학의 종래의 방법을 이용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 완전히 설명된다. 예를 들어, 문헌[T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3 rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)]을 참조한다.
실시예 1: 실시예 1-9의 재료 및 방법.
마우스 종양
PyMT - ChOVA 형질전환 C57BL/6 파운더(founder) 마우스는 기재된 바와 같고(Engelhardt et al., 2012), 자손을 PCR에 의해 PyMT - ChOVA 전이유전자에 대해 스크리닝하고 종양에 대해 모니터링하고 20-30주령에 사용하였다. B78ChOVA는 보충 방법에 기재된 바대로 생성되고 사용된 B78의 변이체(Graf et al., 1984)이다. 모든 추가적인 균주 정보는 보충 방법에서 발견될 수 있다. 모든 마우스를 SPF 조건 하에 유지시키고, NIH 및 미국 실험 동물 관리 표준 협회(Association of Laboratory Animal Care standards)에 따라 처리하고, UCSF의 관리 규제에 부합하였다.
유세포계측법
모든 항체를 비디 파르민젠(BD Pharmingen), 이바이오사이언스(eBioscience), 인비트로겐(Invitrogen), 바이오레전드(Biolegend), UCSF 하이브리도마 코어(UCSF hybridoma core)로부터 구입하거나, 크루멜 랩(Krummel Lab)에서 제조하였다. 표면 염색을 위해 세포를 항-Fc 수용체 항체(클론 2.4G2)와 항온처리하고 얼음에서 30분 동안 PBS + 2% FCS 중의 항체에 의해 염색하였다. 고정 가능한 생/죽은 좀비(Zombie)(바이오레전드) 또는 DAPI에 의해 염색함으로써 생존능력을 평가하였다. 세포내 염색을 위해, 마우스에 수확 전 6시간에 브레펠딘(Brefeldin) A(카이만(Cayman))에 의해 10㎍/그램(체중)으로 주사하고, 세포를 표면 마커에 대해 항체에 의해 염색하고, 이후 25℃에서 10분 동안 2% PFA에 의해 고정하고, 0.2% 사포닌에 의해 투과되게 하고, 이후 표적 항체에 의해 염색하였다. 비디 포르테사(BD Fortessa) 유세포분석기에서 모든 유세포계측법을 수행하였다. 플루조(Flowjo)(트리스타(Treestar))를 사용하여 유세포계측법 데이터의 분석을 수행하였다. BD FACS Aria II를 사용하여 세포 분류를 수행하였다.
TCGA 생물정보학 분석
임상 발현 분석은 12개의 암 유형(845개의 유방, 265개의 난소, 303개의 두경부 편평, 122개의 방광, 168개의 교모세포종, 190개의 결장, 173개의 AML, 72개의 직장, 355개의 폐 선암, 259개의 폐 편평, 480개의 신장 및 370개의 자궁암)을 대표하는 3602명의 환자 종양 샘플로부터 게놈-와이드 mRNA 수치(Illumina mRNA-seq)를 이용하고, 공개된 바대로 TCGA PanCancer 작업 그룹에 의해 단일 데이터세트로 정규화되고 조합되었다(Cancer Genome Atlas Research et al., 2013; Hoadley et al., 2014)(데이터는 TCGA 데이터 포탈 https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/에 있고, https://www.synapse.org/에서 syn1715755로서 이용 가능함). CD103+/CD103- 비율 서명은 CD103-DC 유전자의 평균 발현으로 나눈 CD103+DC 유전자의 평균 발현의 로그로서 계산되고, 이어서 z 점수 표준화(평균 = 0, sd = 1; 도 8c에서의 유전자 목록)된다. 본 발명자들은 또한 CD8/CD68 발현 비율(DeNardo et al., 2011)에 따라 공개된 바대로 공개된 T 세포(Palmer et al., 2006), 증식(Wolf et al., 2014), CSR/상처(Chang et al., 2005) 및 감마 인터페론(Viigimaa et al., 2010) 서명을 평가하였다. 전체 생존 데이터를 TCGA 포탈(6/2013 다운로드)(Cancer Genome Atlas Research et al., 2013)로부터 얻었고, 암 유형에 대해 조정하는 다변량 모델에서 Cox 비례 위험 모델링을 이용하여 생존 분석을 수행하였다. 로그 랭크 p-값은 벤자미니-호흐베르크(Benjamini-Hochberg) 방법(Bejamini and Hochberg, 1995)을 이용하여 다중 비교에 대해 조정한 후 유의성을 평가하도록 이용된다. R에서 생존 패키지를 이용하여 카플란-마이어 생존 곡선을 생성하였다. 모든 데이터 KM 도면(도 8e)에서, 본 발명자들은 CD103+/CD103- 비율 서명의 암 유형의 중앙값을 이용하여 '높음' 또는 '낮음'으로서 각각의 샘플을 분류함으로써 암 유형에 대해 '조정'하였다.
마우스 균주 정보
H-2Kb(Hoquist et al., 1994)의 상황에서 난알부민 펩타이드 SIINFEKL(SL8)에 특이적인 OT-I 마우스를 CD45.1, Nur77-eGFP 마우스(Moran et al., 2011) 및 Cd2-RFP 마우스(Veiga-Fernandes et al., 2007) 또는 액틴 -CFP 마우스(Hadjantonakis et al., 2002)와 상호교배하여 적응성 전달, 영상화 및 활성화 실험에 대해 게놈으로 코딩된, 형광 또는 동족으로 표지된 T 세포를 생성하였다.
종양에서의 골수성 세포의 집단을 조절하기 위해, 하기 마우스 균주를 사용하였다: 시몬센(Simonsen)사로부터 구입된 C57BL/6, Irf4 f /f x CD11c-Cre(Klein et al., 2006), (Williams et al., 2013)(시카고 대학교의 Anne Sperling이 선뜻 본 발명자들에게 기증), Irf8 -/- FVBN(Ouyang et al., 2011)(UCSF의 Scott Kogan이 선뜻 본 발명자들에게 기증), Zbtb46-DTR(Meredith et al., 2012), Csf2rb -/-(Robb et al., 1995) 및 Csf3r -/-(Liu et al., 1996).
종양 내의 APC의 가시화를 위해, PyMT - ChOVA 형질전환 마우스를 Cx 3 cr1-eGFP(Jung et al., 2000) 및 Cd11c-mCherry 마우스(Khanna et al., 2010)와 상호교배하고, 영상화 실험에 전이유전자 둘 다를 보유하는 생성된 F1 자손을 사용하였다.
세포주, 세포 배양, 플라스미드 및 형질감염
하기 종양 세포주를 마우스로의 주사 전에 표준 조건 하에 배양하였다. B16-F10(Fidler, 1975), B16-GMCSF(Dranoff et al., 1993), Larry Fong가 선뜻 제공한 B16-FLT3L(Curran and Allison, 2009), B78-모(Graf et al., 1984), 표준 방법을 이용하여 PyMTChOVA에서 사용된 것과 동일한 Ch-OVA 융합 작제물에 의해 형질감염된 B78 모인 B78chOVA(Engelhardt et al), EL4(Hyman et al., 1972), EG7(Moore et al., 1988), UCSF의 Zena Werb가 선뜻 본 발명자들에게 기증한 Vo-PyMT-루시퍼라제-FVB인 EG7-chOVA(Halpern et al., 2006), 및 UCSF의 Lewis Lanier가 선뜻 본 발명자들에게 기증한 LLC(Bertram and Janik, 1980). N1-mCherry-pHlourin 작제물의 제조사의 설명서에 따라 리포펙타민에 의한 B78-모 세포의 형질감염에 의해 B78p-mCherry-pHlourin을 생성하였다(Koivusalo et al., 2010; Webb et al., 2011; Choi et al., 2013).
간단히 말하면, 부착 세포를 조직 배양 처리된 플라스틱 플레이트에서 DMEM와 10% FCS와 Pen/Strep/Glut 중에 37℃/%5 CO2에서 배양하고 격일마다 나눴다. 현탁액 세포를 플라스크에서 RPMI-1640과 10% FCS 및 Pen/Strep/Glut 중에 배양하고 격일마다 나눴다.
이소성 종양 주사
종양 세포주를 수확하고 PBS에 의해 3회 세척하고, 이후 50㎕의 최종 주사 용적을 위해 성장 인자 감소한 마트리겔 매트릭스(BD Biosciences)와 1:1 비율로 혼합하였다. 100,000개의 종양 세포(달리 기재되지 않은 한)를 면도된 마우스의 오른쪽 옆구리에서 피하로 주사하고, 사용 전에 14-21일 동안 성장하게 하였다.
종양 분해
PyMT - chOVA 및 이소성 B78chOVA 종양을 마우스로부터 해부하고, 제거된 종양 조직의 전체 중량을 결정하였다. 이후, 종양을 메스를 사용하여 갈고, 교반 막대를 가지는 25㎖의 엘렌마이어(Erlenmeyer)에서 3x 30분 간격 동안 0.3그램의 종양 중량마다 500U/㎖의 콜라게나제(Collagenase) IV(Sigma), 100U/㎖의 콜라게나제 I(Worthington) 및 200㎎/㎖의 DNAse I(Roche)에 의해 분해하고, 교반 플레이트에서 5% CO2를 가지는 37℃ 항온처리기에 배치하였다. 각각의 30분 간격 후, 종양을 70㎛ 세포 스트레이너를 통해 통과시켜 큰 조각의 분해되지 않은 종양을 제거하고, 남은 덩어리를 재도입하여 분해시키고, 단리된 단일 세포를 얼음에 유지시켰다. 이후, CD45-Biotin 자기 양성 선택(StemSep)을 4℃에서 수행하여 전체 종양 면역 침윤액이 농루하게 하였다.
인간 샘플
조직을 수술 가위로 힘차게 갈고, 일정한 교반에 의해 37℃/5% CO2에서 1시간 동안 0.3g의 조직마다 3㎎/㎖의 콜라게나제 A(Roche) 및 50U/㎖의 DNase I(Roche)를 가지는 자기 교반 막대를 가지는 25㎖의 엘렌마이어로 옮겼다. 이후, 샘플을 70㎛ 필터를 통해 여과시키고 스핀 다운하고 염색을 위해 재현탁시켰다(Ruffell et al., 2012). 모든 인간 샘플에 대해, 모든 대상체로부터 동의서를 얻고, IRB 승인(IRB 번호 13-12246, 12/06/2013-12/05/2014)에 따라 작업을 수행하였다.
세포 단리
OT-I 미경험 CD8+ T 세포를 6주령 to 12주령의 마우스의 림프절 및 비장으로부터 단리하였다. 제조사의 설명서에 따라 음성 CD8 단리 키트(스템셀 테크놀로지스)에 의해 선택을 수행하였다. IMDM와 10% FCS와 GM-CSF(과립구-대식세포 콜로니 자극 인자) 중의 1-2x10^6 세포/㎖로 플레이팅된 8-11일 동안 골수 세포의 배양에 의해 BMDC를 생성하였다. IL-4를 배양의 최종 2일 동안 첨가하고, LPS를 사용 전 12시간에 첨가하여 BMDC를 완전히 성숙시켰다.
T 세포의 eFlour670 표지
OT-I CD8+ T 세포를 37℃에서 15분 동안 2μM efluor670(이바이오사이언스)과 FCS 없이 RPMI 중에 항온처리하였다. 이후, eFluor670을 2ml의 FCS에 의해 켄칭하고, 사용 전 3시간에 RPMI 10% FCS 중에 세척하였다.
T 세포의 벌크 활성화(CTL 생성)
OT-I TCR 형질전환 림프절 세포를 30분 동안 100ng/㎖의 SL8 펩타이드에 의해 펄스화된 B6 비장세포에 의해 자극하고, 이후 3회 세척하였다. 자극 후 2일에 및 자극 후 다시 4일에, 세포를 2U/㎖의 재조합 인간 IL-2의 존재 하에 증식시키고 2-3일 후에 실험에 사용하였다.
T 세포 증식 검정
OT-I TCR 형질전환 마우스로부터의 림프절 세포를 단리하고, StemSep CD8 농후화(스템셀 테크놀로지스(Stemcell technologies))에 의해 미경험 CD8+ T 세포에 의해 농후화시키고/시키거나, CTL의 벌크 활성화 배양물을 사용하였다. OT-II TCR 형질전환 마우스로부터의 림프절 세포를 단리하고, StemSep CD4 농후화(스템셀 테크놀로지스)에 의해 미경험 CD4+ T 세포에 대해 농후화하였다. 20,000개의 농후화된 미경험 CD8 세포 또는 5일 이전에 활성화된 OT-1 T 세포 또는 2μM eFluor670에 의해 표지된 미경험 CD4 세포를 37℃/5% CO2에서 12, 48 또는 72시간 동안 96웰 V-하부 플레이트에서 25ng/㎖의 SL8 펩타이드(OT-I) 또는 1㎍/㎖의 pOVA 323-339 펩타이드(OT-II)에 의해 또는 이것 없이 펄스화된 4,000개의 BMDC 또는 4,000개의 펄스화되지 않은 종양 APC(달리 기재되지 않은 한)와 혼합하고, 이때 활성화를 유세포계측법을 통해 CD69/Nur77 상향조절 및 efluor670 희석에 의해 측정하였다.
커플링 검정
기재된 바대로 커플링 검정을 수행하였다(Friedman et al., 2006). 간단히 말하면, 표지된 T 세포를 30분-1시간 동안 종양 분해물로부터의 염색된 단일 세포 현탁액과 혼합하고, 이후 유세포계측법을 위해 2%의 PFA에 의해 고정하였다. T 세포의 전체 수에 대한 T 세포 커플의 수로서 커플링 백분율을 계산하였다.
생체내 다광자 현미경검사법 영상화 및 수술
동물을 가열된 현미경검사법 단계에서 아이소플루오란을 사용하여 마취 하에 유지시키고, 마취의 깊이를 기관 가이드라인에 따라 규칙적인 간격으로 모니터링하였다. 수술 전에, 동물을 PBS 중의 100㎍의 Evans Blue에 의해 i.v. 주사하고, 1㎖의 링거 락트산염에 의해 i.p 주사하였다. 유선을 수술로 절제하고, 종양을 본 발명자들이 이전에 기재한 변형된 버전의 흡입을 통해 영상화하였다(Thornton et al.). 생존중 영상화를 2개의 적외선 레이저가 구비된 주문 제작된 2개의 광자 기구를 사용하여 수행하였다(MaiTai: Spectra Physics, Chameleon: Coherent). MaiTai 레이저를 각각 CFP 및 GFP, 또는 GFP 단독의 동시 여기를 위해 870㎚ 또는 910㎚로 동조시켰다. 카멜레온 레이저 여기를 mCherry의 여기를 위해 1030㎚로 동조시켰다. 6 색상 검출기 어레이(custom; Hamamatsu H9433MOD 검출기 사용)에 커플링된 25x 1.2NA 물 렌즈(Zeiss)를 사용하여 방출된 광을 검출하고, 교류하는 레이저 여기를 이용하여 12개 검출 채널을 생성하였다. 사용된 방출 필터는 바이올렛 417/50, 청색 475/23, 녹색 510/42, 황색 542/27, 적색 607/70, 근적외선 675/67이다. 현미경을 MicroManager 소프트웨어 스위트에 의해 제어하고, z 스택 이미지를 4회 평균화 및 3㎛의 z 폭에 의해 얻었다. Imaris 소프트웨어 스위트(Bitplane)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다.
생체외 종양 슬라이스 염색 및 다광자 영상화
동물을 안락사시키고 종양을 수확하였다. 폐색성 지방을 제거하고, 종양을 PBS 중의 2% 저융점 아가로스(SeaPlaque, Lonza) 중에 포매시켰다. 300㎛ 두께의 절편을 Compresstome VF-200, Precisionary Instruments Inc. 조직 슬라이서를 사용하여 제조하였다. 슬라이스를 Vetbond(3M)를 사용하여 플라스틱 커버슬립에 부착시키고, 37℃/5% CO2에서 2시간 동안 5% 랫트 혈청이 보충된 RPMI 중에 Alexa647 표지된 랫트 항-CD11b 항체에 의해 염색하였다. 슬라이스를 RPMI 중에 세척하고, Nikon A1R 공초점 현미경을 사용하여 영상화하였다.
RNA 추출, 플루이다임 및 RNA 서열분석
4,000-20,000개의 세포를 300㎕의 트리졸(Trizol) LS로 직접적으로 분류하고, 급속 동결시키고, 추출까지 -80℃에서 즉시 저장하였다. RNA를 페놀-클로로폼 방법 및 에탄올 침강에 의해 추출하였다. 이후, 샘플을 DNase I 처리하고, cDNA를 Superscript III(인비트로겐)를 사용하여 합성하였다. 나노리터 qPCR 플루이다임(Fluidigm) 분석을 위해, cDNA를 2X Taqman PreAmp Master Mix(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))에 의해 표적 특이적 증폭을 통해 예비 증폭시키고(12회 사이클), 이후 엑소뉴클레아제(Exonuclease) I에 의해 처리하여 비혼입된 프라이머를 제거하였다. 이후, 샘플 및 프라이머(표적 프라이머를 하버드(Harvard) 프라이머 은행: http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/을 이용하여 설계함)를 2X SsoFast EvaGreen Super Mix(Bio-Rad)를 가지는 48.48 동역학 어레이에 로딩하고, BioMark HD에서 실행하였다. RNA 서열분석을 위해, 샘플을 Arcturus Picopure RNA 단리 키트(라이프 테크놀로지스(Life Technologies))를 사용하여 추출하고 생물분석하고 UCSF Genomics Core에 제출하였다. 라이브러리를 Nugen Ovation 키트를 사용하여 제조하고, 후속하여 Illumina HiSeq 2500 기계에서 서열분석하였다. 싱글 엔드(Single-end), 50개 염기 쌍 판독을 생성하여 약 40500만개의 판독 및 3370만개 판독/샘플의 평균 폭을 생성하였다. 판독을 마우스 게놈(USCS mm10)과 일치시키고, 공지된 mRNA에 독특하게 맵핑된 것을 이용하여 차등적 발현을 평가하였다. 차등적 발현의 분석 및 평가를 위해, Tophat(Trapnell et al., 2009)를 이용하여 정렬을 수행하고 DESeq(Anders and Huber, 2010)를 이용하여 차등적 발현 분석을 수행하였다.
종양 성장
종양 성장 곡선에 대해, 표시된 시간 기간에 걸쳐 종양 면적(㎟)을 종양 폭 x 종양 높이로서 캘리퍼에 의해 측정하였다.
디프테리아 독소, FTY-720 및 aCSF-1 처리
D.T.를 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구입하였다. 일시적인 D.T. 절제를 위해, DTR 마우스에 체중 1그램당 20ng의 D.T.에 의해 i.p. 주사하고, 분석을 위해 D.T. 주사 후 24시간에 마우스를 안락사시켰다. 장기간 절제를 위해, 마우스를 초기에 20ng/그램의 DT에 의해 i.p. 주사하고, 이후 이로부터 3일마다 4ng/그램에서 유지시켰다.
FTY720을 카이만으로부터 구입하고 식염수 중에 재구성하고 -20℃에서 1㎎/㎖의 분취량에서 저장하였다. 200㎕의 FTY를 표지된 시간 기간에 걸쳐 격일마다 식염수 중의 100㎍/㎖의 최종 농도로 i.p. 주사하였다.
중화 aCSF-1 항체, 클론 5A1 및 동형단백질 랫트 IgG2a를 UCSF Antibody Core로부터 구입하고 정제하였다. 동물을 초기에 i.p. 주사에 의해 1㎎의 항체에 의해 처리하고 이후 3일에 분석하였다. 시간에 걸친 고갈을 유지시키기 위해, 마우스에 후속하여 이후로부터 5일마다 0.5㎎ i.p. 용량을 주었다.
GMP 전구세포 제조 및 적응성 전달
모든 골(대퇴골, 경골, 상완골, 척골, 요골 및 골반 포함)을 분류 완충제(PBS + 2% FCS)로 수확하고, 막자사발 및 막자에 의해 분쇄하고 HBSS에 의해 반복하여 세척하고, 이후 70㎛의 필터를 통해 통과시켰다. 이후, 세포를 37℃에서 5분 동안 175mM 염화암모늄에 의해 RBC 용해시키고, 이후 세척하고 Histopaque-1110의 3㎖의 언더레이(Sigma)에 의해 피콜화하여 생 세포를 선택하고 남은 골 부스러기를 제거하였다. 골수 세포를 CD117 마이크로비드(Miltenyi Biotec)를 사용하여 CD117 양성 세포에 대해 농후화시키고 AutoMACS에서 양성 선택하였다. 이후, 세포를 얼음에서 30분 동안 비접합 랫트 항체(CD4, CD8, Mac1, Gr-1, CD5, Ter119 및 CD3)의 계통 칵테일에 의해 염색한 후, 세척하고 얼음에서 30분 동안 항-랫트 형광 접합된 2차에 의해 염색하였다. 이후, 세포를 세척하고 얼음에서 30분 동안 전구세포 마스터 믹스(Ckit-APC-cy7, Sca1-PB, CD34-FITC 및 FCgR-PerCPCy5.5)에 의해 염색하고, 세척하고 BD FACs AriaII을 사용하여 Live, cKit+ Sca1-, CD34+ FcgR+에서 분류하였다.
덱스트란 흡수 검정
종양을 분해하고 상기 기재된 바대로 CD45 양성 선택하고, 이후 96웰 둥근 바닥 플레이트에서 웰마다 1x106개의 세포로 플레이팅하고, 3회 반복으로 30분 동안 4℃ 또는 37℃에서 1㎎/㎖의 덱스트란-퍼시픽 블루(Dextran-Pacific Blue)(10,000 MW)와 함께 또는 이것 없이 항온처리하였다. 플레이트를 5분마다 두들겼다. 이후, 플레이트를 3회 세척하고 표면 항체에 의해 염색하고 유세포계측법에 의해 즉시 분석하였다. 37℃에서의 덱스트란 흡수의 기하학적 평균 형광 강도로부터 공제된 4℃에서의 덱스트란 결합의 기하학적 평균 형광 강도로서 덱스트란 흡수를 측정하였다.
세포 추적 및 영상화 분석
데이터를 Imaris 소프트웨어(Bitplane)를 사용하여 가시화하고 분석하였다. 개별 T 세포를 Imaris에 의해 확인하고 추적하였다. MATLAB 분절화로부터 마스킹된 DC의 아이소-표면을 사용하여 CD11c mcherry DC를 계산하였다. Imaris를 사용하여 추적된 마스킹된 T 세포-DC 커플의 계산된 추적 기간에 의해 접촉 기간을 결정하였다.
항체 클론
마우스 Ab 클론: CD45 클론 30-F11, CD45.1 클론 A20, CD45.2 클론 104, CD11b 클론 M1/70, CD11c 클론 N418, CD103 클론 2E7, CD24 클론 M1/69, CD90.2 클론 30-H12, Ly6C 클론 HK1.4, MHCII 클론 N22, F4/80 클론 BM8, CD69 클론 H1.2F3, CD135 cone A2F10, CD117 클론 2B8, CD26 클론 H194-112, CD206 클론 C068C2, CD64 클론 X54-5/7.1, MerTK 클론 Y323, CD301b 클론 11A10-B7-2(예일 대학교의 Akiko Iwasaki가 선뜻 본 발명자들에게 기증), PDL2 클론 TY25, IRF4 클론 M17 및 IRF8 클론 T14(시카고 대학교의 Roger Sciammas가 선뜻 본 발명자들에게 기증), IL12 클론 C17.8, CD80 클론 16-10A1, CD86 클론 GL1, 2B4 클론 m2B4 및 PDL1 클론 10F.9G2.
인간 Ab 클론: CD45 클론 Hl30, CD3e 클론 OKT3, HLADR 클론 L243, CD56 클론 CMSSB, CD19 클론 H1B19, CD14 클론 61D3, CD16 클론 CB16, CD11c 클론 3.9, BDCA1 클론 L161 및 BDCA3 클론 AD5-14H12.
통계 분석
그래프패드 프리즘 소프트웨어(GraphPad Prism software)를 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 구체적으로 기재되지 않은 한, 모든 데이터가 3회 초과의 별개의 실험을 대표한다. 오류 막대는 프리즘을 이용하여 계산된 SEM을 나타내고, 3회 반복 실험 조건으로부터 추론된다. 이용된 특정한 통계 시험은 쌍 지어지고, 비대칭적 T 시험 및 0.05 미만의 모든 p 값은 통계적으로 유의미한 것으로 생각된다.
실시예 2: 표면 마커는 풍부한 대식세포로부터 희귀한 종양 DC 하위세트를 기술한다.
종양 침윤 골수성 집단을 해부하기 위해, 11 색상 유세포계측법 패널, 및 형광 mCherry 단백질 및 난알부민을 독립적으로 동시발현하도록 개시 암유전자와 함께 조작된, PyMTChOVA(Engelhardt et al., 2012)인, 자발적인 유방 종양 모델을 이용한 진행성 게이팅 전략을 고안하였다. 본 발명자들은 종양 CD45+ 구획을 프로파일링하였고, 이들 대부분은 식균된 종양 항원을 가지고 따라서 mCherry 형광을 나타낸다(도 1a). 골수성 특이적 마커 CD11b 및 단핵구-마커 Ly6C에 의한 모든 조혈 세포의 하위게이팅은 호중구 및 단핵구의 제거를 허용하였다(데이터 비도시). MHCII+ 세포 내에, DC는 CD24hi 및 F4/80lo 발현에 기초하여 대식세포로부터 구별되었고, 이들 중 어느 것도 단독으로 이 구별을 만들기에 통상적으로 충분하지 않다. 후속하여, DC는 건강한 말초 조직에서 관찰되는 것처럼(Hashimoto et al., 2011) CD11b 및 CD103의 차등적 발현에 기초하여 2개의 집단으로 분석되는 것으로 발견되었다. 본 발명자들은 흑색종의 2개의 마우스 모델(B78ChOVA(mCherry 및 OVA를 발현하는 B16의 변이체), 도 1b 및 BRAF V600E, 데이터 비도시), 마우스 균주(예를 들어, FVB PyMT; 데이터 비도시)에 걸쳐, 및 이소성 종양(루이스 폐 암종; 데이터 비도시)에서 이 집단을 발견하였다. 본 발명자들은 차별 및 토의의 용이를 위해 이후 이 DC 집단을 "CD11b+DC1" 및 "CD103+DC2"라 칭한다.
F4/80hi CD24lo 구획의 분석은 또한 CD11c 및 CD11b의 차등적 발현에 의해 확인된 대식세포의 2개의 유형을 밝혀냈다. CD11clo CD11bhi(이하 "TAM1") 및 CD11chi CD11blo 세포("TAM2")는 유사하게 기술된 MHCIIhi 및 MHCIIlo 집단에 대략 상응하는 것으로 보인다(Movahedi et al., 2010)(또한 도 5c 참조). 달리 '원형' DC 마커인 CD11c가 DC에서 가장 높지만, 이것은 TAM2에서 고도로 발현되고 적은 정도로 TAM1에서 발현된다(데이터 비도시). 이 집단이 조사된 모든 모델에 걸쳐 존재하지만, 분명하게 구별되는 각각의 및 이들의 능력의 출현은 약간 변했다(도 1a-도 1b, 및 데이터 비도시). 따라서, 본 발명자들은 표시된 경우를 제외하고 본 발명자들의 계통 및 기능 연구를 자발적(PyMTChOVA) 및 이소성 종양 모델(B78ChOVA) 중 일 예에 적용하였다.
이 집단의 각각에 대해, 종양으로부터 유래한, mCherry 로딩 및 보유를 평가하였다. 이것은 본 발명자들의 이전의 보고에서 종양 주변에 국소화되고 이후 오직 CD11c에 의해 확인된 흡수hi 세포(Engelhardt et al., 2012)가 TAM1 및 TAM2 게이트에서 최고로 포획된다는 것을 밝혀냈다(도 1c 및 데이터 비도시). 비교하여, CD11b+DC1 및 CD103+DC2는 mCherry를 덜 흡수하거나 보유하지만, 일부 단핵구, 그러나 아주 적은 호중구는 보통의 항원 로딩의 증거를 나타냈다.
CD11b+ 및 CD103+DC 하위세트는 많은 말초 마우스 조직에서 발견되고, 이의 대응물은 각각 BDCA1 및 BDCA3의 발현에 의해 한정된 말초 인간 조직에서 확인되었다(Dzionek et al., 2000; Haniffa et al., 2012). 본 발명자들은 이 마커를 사용하여 동등한 TAM/DC 구별이 인간 전이성 흑색종 샘플에서 또한 가능하다는 것을 발견하였다(도 1d). 모든 TAM을 나타낸 CD16-HLADR+ CD11c+CD14+ 세포는 CD16-HLADR+ CD11c+CD14- DC 집단으로부터 구별되고, 이것은 결국 BDCA1("DC1") 및 BDCA3("DC2")의 차등적 발현에 의해 분석되었다. 마우스 모델(도 1e) 및 인간 흑색종 생검(도 1f)에 걸친 일반은 CD11b+/BDCA1 DC1 및 CD103+/BDCA3 DC2 집단의 존재 및 희귀성이고, DC2가 특히 드물다.
실시예 3: 종양 DC 및 대식세포의 단백질 및 전사 기술.
본 발명자들의 게이팅 전략을 검증하기 위해, 본 발명자들은 ImmGen 컨소시엄에 의해 한정된 항체의 패널을 적용하였다(Gautier et al., 2012; Miller et al., 2012). 본 발명자들의 "DC"의 배정과 일치하게, CD103+DC2는 CD135(Flt3), CD117(cKit) 및 CD26을 발현하지만, TAM 집단 둘 다는 B78chOVA 및 PyMTchOVA 모델에 있지 않았다. (도 2a 및 데이터 비도시). 놀랍게도, CD11b+DC1은 검출 가능한 수준의 DC 마커를 발현하지 않았고, 실제로 CD206, CD64 및 MerTK를 포함하는 몇몇 "대식세포" 마커의 발현에 의해 TAM1 및 TAM2에 의해 더 분리되었다(도 2b 및 데이터 비도시). 그러나, CD11b+DC1은 CD301b 및 PDL2를 약간 발현하였고, 이들 둘 다 피부에서 발견된 IRF4 의존적 "DCTh2" 집단을 한정하도록 사용되었다(도 2c 및 데이터 비도시)(Gao et al., 2013; Kumamoto et al., 2013).
이 APC를 추가로 기술하기 위해, 본 발명자들은 RNAseq를 이용하여 B78chOVA 종양으로부터 분류된 세포의 유전자 발현 프로필을 분석하였다. 도 2d에 도시된 바대로, 유전자의 블록은 4개의 집단을 명확히 분리하고, TAM1, TAM2 및 CD11b+DC1은 PCA 분석에 의해 가장 유사하고(도 2e), CD103+DC2는 가장 구별된다. 유전자 중에서 가장 차등적으로 발현된 DC 계통-한정 전사 인자 Irf8(Tamura et al., 2005) 및 Zbtb46(zDC)(Meredith et al., 2012)은 각각 CD103+DC2 단독에 대해, 또는 DC 둘 다에 특이적이지만, Irf4는 CD11b+DC1에서 보통으로 농후하고, 이들 모두 RT-qPCR에 의해 검증되었다(도 2f). 이것은 IRF4/8에 대해 세포내 유세포계측법에 의해 단백질 수준에서 또한 확인되었다(도 2g 및 데이터 비도시). 모든 집단은 Myb를 발현하였고, 이것은, 난황낭으로부터 시딩된 조직 전구체로부터 유래하는 것과 반대로, 조혈 줄기 세포 기원을 나타낸다(Schulz et al., 2012). 중요한 전사 인자의 독특한 표면 표현형 및 발현은 PyMTchOVA 모델에서 반복검증되었다(데이터 비도시).
이 종양내 집단이 구별되는 종양 특이적 기전을 통해 유래하고 이것이 몇몇 종래의 조직에 있으면서 이 전사 인자에 의존하지 않으므로, 본 발명자들은 넉아웃 또는 전사 인자 추진 디프테리아 독소 수용체(DTR) 마우스를 사용하여 Irf8, Irf4 , Batf3 및 zDC 의존성을 조사하였다. 본 발명자들은 자발적 모델에 대해 이 대립유전자를 번식시키는 것의 예상 밖의 변화 및 길이로 인해 다양한 이소성 종양의 이점을 취했다. 이소성 PyMT 유방 종양 모델을 이용하여, 본 발명자들은 Irf8의 소실이 CD103+DC2를 특이적으로 절제하지만, TAM1 또는 TAM2에 영향을 미치지 않았고, 아마도 보상의 결과로서 CD11b+DC1의 백분율을 가볍게 농후화시킨다는 것을 발견하였다(도 3a). 반대로, CD11c-Cre에 의해 추진된 Irf4의 조건적 결실(Williams et al., 2013)은 B78chOVA 모델에서 기타에서 아주 적은 변화와 함께 CD11b+DC1의 특정한 감소를 발생시켰다(도 3b). RNAseq 데이터와 일치하게, Batf3 결핍 동물은 CD11b+DC1, TAM1 또는 TAM2 비율에 대한 영향 없이 B78chOVA 모델에서 또한 종양 CD103+DC2 집단이 부족하게 하였다(도 3c). 마지막으로, zDC 추진 DTR 대립유전자가 사용될 때, 본 발명자들은 B78chOVA 종양에서 CD11b+DC1 또는 TAM1/TAM2 집단의 아주 적은 변화와 함께 또는 변화 없이 CD103+DC2에서 특정한 및 유의미한 감소를 다소 예상치 못하게 발견하였다(도 3d). 이것은 DTR 대립유전자의 예상 밖의 변화 또는 zDC 발현의 미묘하지만 유의미한 변동을 나타낼 수 있다. 종합하면, 본 발명자들은 CD103+DC2가 종양에서 CD11b+DC1 및 고도로 풍부한 TAM1/TAM2와 비교하여 APC의 구별되는 계통을 나타낸다는 것을 결론을 내렸다.
실시예 4: CD103 + DC2는 구별되는 사이토카인에 의해 프로그래밍된다 .
APC는 골수(BM) 전구체로부터 유래하고, DC/대식세포 하위세트로의 이의 분화는 특정한 사이토카인에 따라 달라진다. 이 집단으로 분화를 추진시키는 사이토카인을 결정하기 위해, 본 발명자들은 qPCR에 의해 모델에 걸쳐 콜로니 자극 인자(CSF) 수용체 발현을 질의하였다. Csf1r(M-CSFR)이 TAM1, TAM2 및 CD11b+ DC1에서 배타적으로 발견되지만, Csf2rb(GM-CSFR)가 DC1 및 DC2 하위세트에서 독특하게 발현되고, Csf3r(G-CSF)이 모두에서 부재하였다(도 4a). 이소성 종양을 가지는 중화 항체 처리 또는 사이토카인 수용체 결핍 마우스를 사용하여, 본 발명자들은 종양에서 APC의 CSF 사이토카인 의존성을 기능상 시험하였다.
TAM1 및 TAM2 세포는 이전에 기재된 바대로 이의 유지를 위해 CSF-1에 심하게 의존하지만(Wyckoff et al., 2004), CD11b+DC1 및 CD103+DC2 집단은 CSF1에 독특하게 독립적이었다(도 4b). 사이토카인 수용체 결핍 마우스의 사용을 위해, 본 발명자들은 유사유전자형 적응성 전달 모델을 개발하였고, 이로써 과립구 대식세포 전구세포(GMP)를 이소성 종양 보유 숙주로 전달하고 재증식을 BM, 비장 및 종양에서 추적하였다(도 4c). 종양에서 GMP 유래 세포는 모든 골수성 구획을 증식시켜서, CD11b+DC1, CD103+DC2, TAM1 및 TAM2의 GMP 기원을 확인시켜주었다(도 4d). 경쟁적 전달을 가지는 GMP 적응성 시스템의 사용에 의해, 본 발명자들은 CD24+ CD11c+ 게이팅을 사용하여 DC1/DC2의 합으로 여기서 정의된 종양에서 DC를 재구성하는 Csf2rb -/- 세포의 선택적 불능을 발견하였다. 본 발명자들은 종양 DC 발생에 대한 CSF2(GM-CSF)의 독특한 요건을 제시하는 TAM1 및 TAM2 재증식에 대한 영향이 없음을 발견하였지만(도 4e), CSF-3에 대한 요건은 임의의 4개의 APC에서 발견되지 않았다(데이터 비도시).
DC가 GM-CSF 또는 FLT3-리간드(FLT3L)에 의해 원형으로 추진되면서, 본 발명자들은 GMCSF 또는 FLT3L을 발현하도록 조작된 B16 흑색종 종양 모델을 이용하여 종양에서 DC 집단을 추진시키기에 충분히 사이토카인을 평가하였다. 종양에 의한 GMCSF 발현이 CD11b+ DC1의 비율을 극적으로 왜곡하지만, FLT3L 발현 종양이 종양에서 희귀 CD103+ DC2의 독특한 증식을 추진시켰다(도 4f).
실시예 5: CD103 + DC2의 독특한 항원 처리 및 제시 능력.
상이한 APC의 계통 요건을 확립하면서, 본 발명자들은 이후 T 세포 반응을 개시시키고 고용하고 지속시키는 이의 능력을 평가하였다. 항원 처리, 제시 및 동시자극에 관해 세포를 분석하기 위해, 본 발명자들은 도 2로부터의 RNASeq 데이터를 이용하여 이 경로에 관여한 유전자의 전사체 및 단백질 수준을 분석하였다. 가능한 APC 기능의 광범위한 자취에 걸쳐 차이가 상당하였다(도 5a). 특히, CD80, CD86 및 2B4를 포함하는 T 세포 반응을 조절하는 데 관여하는 분자의 표면 수준이 집단 사이에 필적하지만, CD103+ DC2는 T 세포 상호작용을 증대시키는 것으로 예상된 케모카인의 강조된 교차 제시, 증대된 동시자극 및 증가한 발현과 일치하는 구별되는 전사 서명을 나타냈다(도 5a, 도 5b 및 데이터 비도시). CD103+DC2의 약간 감소한 MHCI를 제외하고 APC 사이의 MHCI 및 MHCII 발현의 주요 차이가 없었다(도 5c). 그러나, 포식세포 능력의 유의미한 차이가, 이소성 종양으로부터 생체외 덱스트란 흡수에 의해 외인성으로 측정된, TAM1/TAM2와 비교하여 CD103+DC2에서 관찰되었다(도 5d).
DC 성숙 및 포식세포 능력이 대개 역상관관계이므로, 본 발명자들은 CD103+ DC2의 감소한 포식세포 능력이 항원의 증가한 교차 제시에 의해 더 성숙한 DC에 상응한다고 가정하였다(Guermonprez et al., 2002). DC에서의 항원의 효율적인 교차 제시는 Nox2에 의존하여 파가솜 pH를 조절하고, 이것은 이로써 T 세포 펩타이드의 파괴를 방지한다. 이 작업 전에, 식균작용 후 pH 민감성 및 pH 비민감성 형광단의 세포내 형광 강도를 비교하는 비율 척도 검정을 이용하여 이것을 이전에 결정하였다(Savina et al., 2006). 본 발명자들은 따라서 pH 민감성 GFP(pHluorin, pH 6.5 아래서 켄칭됨) 및 pH 비민감성 형광단(mCherry)의 융합을 발현하는 B78(흑색종) 종양 세포주를 생성하였다. 각각의 집단의 mCherry+ 구획 내의 pHluorin 강도를 단독으로 분석함으로써, 본 발명자들은 오직 'DC' 집단이 알칼리(형광) 환경에서 pHluorin을 유지시켰다는 것을 발견하였고; pHluorin 및 mCherry 신호의 비율의 비교는 CD103+ DC2가 가장 기본적인 식균작용 구획을 유지시키지만, TAM1 및 TAM2 집단이 고도로 산성이고 따라서 분해성인 포식세포 경로를 나타낸다는 것을 보여준다(도 5e). CD103+DC2의 증가한 알칼리 파고솜 루멘 이외에, 이 세포는 염증촉진성 사이토카인 IL-12의 차등적 발현 및 소염 IL-10의 부재를 입증하였다(도 5f, 도 5g 및 데이터 비도시). 종합하면, 이들 특징은 모두 CD103+DC2가 CD8+ T 세포에 대한 효율적인 항원 교차 제시에 매우 대비된다는 것을 제시한다.
실시예 6: CD103 + DC2는 미경험 및 활성화된 CD8 + T 세포의 우수한 자극제이다.
이전에, 본 발명자들은 응집체 항원 흡수 골수성 구획이 종양으로부터 직접적으로 취해질 때 미경험이지만 이전에 활성화되지 않은 CD8+ T 세포를 자극할 수 있다는 것을 발견하였다(Engelhardt et al., 2012). 그러나, CD103+ DC2의 독특한 교차 제시 표현형에 기초하여, 본 발명자들은 종양으로부터 새로 단리된 각각의 집단의 T 세포 자극 능력을 시험하도록 추구하였다. 난알부민 특이적 OT-I CD8+ T 세포의 동시배양의 12시간 후, CD103+ DC2 집단은 미경험 및 이전에 활성화된 OT-I CD8+ T 세포 둘 다에서 조기 T 세포 활성화 마커 Nur77 및 CD69의 상향조절에 의해 입증된 바대로 TCR 신호전달을 건장하게 유도할 수 있는 유일한 집단이었다. 중요하게는, 이것은 이소성 및 자발적 마우스 모델 둘 다에서 일치하였다(도 6a 및 데이터 비도시). 염료 표지된 OT-I CD8+ T 세포의 연장된 동시배양은 CD11b+DC1 및 CD103+DC2 집단이 미경험 CD8+ T 세포 증식의 가장 건장한 자극제라는 것을 밝혀냈고, 종양 골수성 세포를 식균작용하는 데 있어서 이전에 확인된 거의 전체 자극 능력이 특이적으로 이 DC 내에 있다는 것을 입증한다(도 6b-도 6c, 및 데이터 비도시). 흥미롭게도, CD103+ DC2는 확립된 CTL의 강한 증식을 독특하게 유도할 수 있고, 이것은 다른 집단에 의해 자극되지 않아서, CD103+ DC2가 종양에서 CTL의 자극제를 우수하게 교차 제시한다는 것을 나타낸다(각각 도 6d-도 6e 및 데이터 비도시).
궁극적으로, 전체 종양 단리물에서의 이의 보통의 낮은 빈도에서, CD103+DC2는 CTL의 증식을 추진할 수 없게 있었다(데이터 비도시(Engelhardt et al., 2012)). 추가적으로, APC 하위세트는 종양으로부터 직접적으로 CD4+ T 세포 증식을 유도하지 않았다. (도 6f-도 6g 및 데이터 비도시). 그러나 외인성 펩타이드는 증식을 자극하는 DC1 및 DC2 능력을 회복시키지 않아서, 이 DC가 CD4 T 세포 자극을 본래 할 수 없을 수 있다는 것을 제시한다(데이터 비도시). 중요하게는, 이것은 CTL을 건장하게 자극하기 위해 종양 항원을 흡수하고 처리하고 교차 제시하는 종양 내의 CD103+ DC2의 독특한 능력을 확인한다. 이것은 종양이 오직 약한 또는 억제성인 골수성 집단을 함유한다는 간단한 개념에 도전한다.
실시예 7: 생존중 영상화에 의해 밝혀진 CD103 + DC2 국소화 및 T 세포 상호작용.
T 세포를 자극하는 희귀 CD103+DC2의 독특한 능력을 고려하여, 본 발명자들은 종양 내의 이 세포의 공간적 구조 및 생체내 및 시험관내 둘 다 T 세포과의 이의 상호작용 동역학을 이해하도록 추구하였다. PyMTchOVA 대립유전자를 Cx 3 cr1-eGFP 및 Cd11c-mCherry 대립유전자에 교차시켜서, 골수성 구획에서 3개의 독특하게 형광인 집단을 생성하였다(데이터 비도시). DC 하위세트(DC1/DC2) 둘 다는 적색으로 특이적으로 마킹되지만(오직 CD11c-mCherry), TAM1 및 TAM2 집단은 각각 녹색(오직 Cx 3 cr1-eGFP) 및 황색(CD11c-mCherry 및 Cx 3 cr1-eGFP)이었다. 이 형광 접근법을 이용하여, 2-광자 생존중 영상화에 의해, 본 발명자들은 TAM1 및 TAM2 집단이 종양 병변에서 치밀하게 우선적으로 가장자리에 있다는 것을 관찰하였다. 이 구역은 본 발명자들이 우선적으로 포획되는 T 세포를 이전에 발견한 곳이다(Engelhardt et al., 2012). 반대로, 적색 DC 하위세트는 통상적으로 종양 병변에 원위인 별개의 콜라겐 농후 구역에서 발견되어서, 모든 원위로 국소화된 APC의 거의 70%를 구성한다(도 7a 및 데이터 비도시).
이 접근법이 종양 병소의 주변에서 이들 중에 CD11b+DC1과 CD103+DC2 세포 사이를 완전히 구별하지 않으므로, 본 발명자들은 아주 적은 적색 DC가 하나 또는 다른 하위세트를 우선적으로 배타적으로 나타내는지를 결정하도록 추구하였다. 인시츄로 하위세트를 기술하기 위해, 본 발명자들은 항-CD11b 항체 염색에 의해 생 종양 슬라이스 영상화를 이용하였다. 이것을 이용하여, 본 발명자들은 인시츄로 적색/녹색 형광 리포터의 존재 하에 CD103+DC2 하위세트로부터 CD11b+DC1을 구별할 수 있었고, CD11b+ 및 CD11b- DC 둘 다가 이 위치에 존재한다는 것을 발견하였다(데이터 비도시). 본 발명자들은 TAM이 일반적으로 종양 주변에서 우세한 세포 유형을 나타내지만, 프로-CTL 자극 APC가 그럼에도 불구하고 매우 낮은 수이긴 하지만 여기서 발견될 수 있다고 결론지었다.
본 발명자들의 이전의 데이터는 유입되는 CTL이 종양 주변에서의 정지 거동에 관여한다는 것을 입증하였고, 본 발명자들은 이것이 DC 또는 TAM 또는 둘 다에 의해 일어날 수 있는지를 결정하도록 추구하였다. 생존중 또는 생 슬라이스 영상화에 대해 자발적 유방 종양 보유 마우스로의 액틴-CFP 표지된 OT-I CD8+ T 세포의 적응성 전달에 의해 적색/녹색 리포터 시스템에서 생체내 T 세포 동역학을 분석하였다. 본 발명자들은 이전에 기재된 바대로 주로 종양 주변으로 국한된 안정한 T 세포 상호작용을 관찰하였다(Boissonnas et al., 2013; Engelhardt et al., 2012)(도 7b 및 데이터 비도시). TAM1 상호작용이 기록된 모든 상호작용을 지배하지만, DC 및 TAM2는 T 세포 정지에서 또한 잘 표현된다. 이것은 종양 근위 영역에서의 DC1/2가 종양 내에 T 세포를 관여시키는 것으로부터 물리적으로 배제되지 않고, 본질적으로 T 세포를 더 관여시킬 수 있는지의 기본적인 질문을 제기한다는 것을 입증한다.
이를 해결하기 위해, 본 발명자들은 단일 세포 현탁액을 만들기 위해 조직 및 분해된 종양의 물리적 구속으로부터 APC 선택을 단절시키고 시험관내 활성화된 OT-I CTL를 도입하고 이들이 항원 특이적 커플을 형성하게 하였다. 이후, 본 발명자들은 유세포계측법에 의해 T 세포로 채워진 각각의 APC 집단의 백분율을 정량화하였다. 이것은 OT-I T 세포가 CD103+DC2 및 TAM1/2 하위세트와 우선적으로 커플이 된다는 것을 밝혀냈다(도 7c 왼쪽 패널). 그러나, TAM1/2의 높은 빈도로 인해, 대부분의 T 세포-APC 커플은 TAM1/2 세포와 형성된다(도 7c 오른쪽 패널). 본 발명자들은 DC2가 종양에서 T 세포 상호작용에 기여하고, 주변 근처에 존재할 때, T 세포 점유와 경쟁할 수 있다고 결론지었다.
실시예 8: 희귀 종양 CD103 + DC2는 효율적인 적응성 T 세포 처리를 허용한다.
본 발명자들은 CD11b+DC1 및 CD103+DC2의 비율이 완전히 공격적이고 너무 커진 세포주 EG7.1과 비교하여 이후 EG7.2라 칭해지는 자발적으로 퇴행하는 EG7 종양 세포주에서 거의 뒤바뀐다는 것을 발견하고 놀랐다. 공격적으로 성장하는 세포주가 DC의 상대 비율을 유지시켰지만, 본 발명자들은 모든 다른 공격적인 종양에서 관찰하여서(데이터 비도시), 자발적으로 퇴행하는 모델은 대단히 높은 수의 CD103+DC2를 함유하였다(데이터 비도시). 본 발명자들은 Irf4 조건적 KO 모델에서가 아니라 CD103+ DC2가 결여된 Irf8 KO 종양 모델에서 증가한 종양 성장을 또한 관찰하였다(데이터 비도시). 종합하면, DC2 종양 존재비가 종양 제어에서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 제안하지만, 생육의 차이는 골수성 세포의 이의 집단 및 CTL을 자극하는 이의 능력을 넘어 이 세포주에서 많은 변화를 나타낼 수 있다. 따라서, CD103+DC2가 효율적인 CTL 매개 종양 퇴행에 필수적인지를 이전에 시험하기 위해, 본 발명자들은 생육하는 EG7.1 종양 모델에 의지하고, 퇴행을 분석하기 위해 활성화된 종양 특이적 T 세포의 적응성 T 세포 처리를 수행하였다(Helmich and Dutton, 2001). 본 발명자들은 종양에서 CD103+DC2를 특이적으로 절제하기 위해 본 발명자들에게 허용된 zDC-DTR 마우스에서 이 실험을 수행하였다(도 3d). 종양의 부위로 CD103+DC2의 영향을 단리시키고 LN 프라이밍의 임의의 영향을 제거하기 위해, 본 발명자들은 (1) LN에서의 프라이밍을 요하지 않고 통상적으로 여기서 통행하지 않는 활성화된 OT-I CD8+ CTL 블라스트의 사용, 및 (2) LN로 통행한 희귀 전달된 CTL T 세포의 LN 퇴장을 막는, FTY-720인 SIP1R 길항제에 의한 동물의 처리인, 2개의 전략을 포함하도록 실험을 구체적으로 설계하였다. FTY-720의 영향은 종양 퇴행을 매개하는 데 있어서 전달된 CTL에 단독으로 최소 영향을 가졌다(데이터 비도시). 그러나, 본 발명자들은 FTY-720의 환경에서 CD103+ DC2의 절제가 T 세포 매개 종양 퇴행을 단단하게 보여주는 효율적인 종양 퇴행을 매개하는 CTL의 능력에 유의미한 영향을 가진다는 것을 발견하였다(도 8a).
실시예 9: 종양내 CD103 + DC2 존재비의 서명은 인간 암에 걸친 결과를 예측한다.
CD103+DC2 존재비에 대한 중요한 역할이 인간 종양으로 번역되는지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 일치된 결과 데이터를 가지는 수많은 인간 암 유형으로부터 상대 유전자 발현을 정량화하는 TCGA 어레이 데이터(Cancer Genome Atlas Research et al., 2013; Hoadley et al., 2014)의 이익을 취했다. 본 발명자들은 CD103+DC2를 특징으로 하는 높은 수준 전사체를 선택하도록 본 발명자들의 RNAseq 데이터를 사용하고, 또한 TAM1/TAM2/CD11b+DC1 세포를 특징으로 하지만 CD103+DC2에서 결핍된 유전자의 하위세트를 선택하였다(각각 도 8b 상부 및 하부 유전자). 본 발명자들은 이 마우스 유전자의 인간 동족체를 확인하고 예후 연관을 평가하기 위해 모든 암 유형으로부터 환자 TCGA 데이터에서 이 '서명'의 발현을 평가하였다. 비례 위험 생존 분석에서, 공변량으로서 암 유형에 대한 모델을 조정하여, 본 발명자들은 이 집단으로부터의 개별 유전자가 오직 보통의 예후 이익을 가진다는 것을 관찰하였다(위험 비율(HR)로 표현됨). 그러나, 본 발명자들이 CD103+ 및 CD103- 유전자 발현 데이터의 비율을 정의하고 Cox 분석 내에 연속 변수로서 이것을 사용할 때 증가한 생존과의 매우 유의미한 연관(BH p=0.00019)이 관찰되었다(도 8b).
이 분석은 이의 기능적 반대에 의해 비율이 될 때 본 발명자들이 확인한 세포 유형이 인간 암에 걸쳐 결과에 대한 매우 강한 예후 값을 생성한다는 것을 보여준다. 이 '서명'과 다른 이전에 기재된 '면역 점수'와의 비교는 CD103+/CD103- 유전자의 비율이 전체 T 세포 존재비에 기초한 것(Palmer et al., 2006) 및 CD8 T 세포 대 대식세포의 벌크 비율에 의해 만들어진 것을 포함하는 TCGA 데이터의 다른 현재의 분석과 비교하여 가장 강한 면역촉진 생존 신호를 제공한다는 것을 보여준다(CD8/CD68 DeNardo et al., 2011)(도 8c). 본 발명자들의 점수는 또한 불량한 결과와 연관된 이 면역 점수에 대해 예후의 반대이긴 하지만 양호하게 비교한다. 이 환자에서의 종양에서의 CSF-1 발현이 또한 CD103/BDCA3 유전자 비율 측정치와 역상관관계이지만, 이것이 마찬가지로 전체 종양 Flt3L 수준과 역상관관계라는 것이 또한 주목할만하다(데이터 비도시).
마지막으로, 본 발명자들은 개별 암 유형 내에 TCGA 데이터를 분석하도록 추구하였다. 암 유형을 조정하여, 이 데이터세트에서의 모든 12개의 암에 대한 카플란-마이어(K-M) 도면은 높은 CD103+/CD103- 유전자-발현 프로필을 가지는 종양에서 전체 이익을 보여준다(도 8d; 및 데이터 비도시). 이 연관의 정도는 유방암, 두경부 편평 세포 암종 및 폐 선암에서 특히 심오하다(도 8e-도 8g). 종합하면, 이것은 전부 마우스 종양 모델에서의 경험적 면역프로파일링으로부터 유래하면서 예상치 못하게 강한 면역 서명을 나타낸다.
실시예 10: 실시예 11에 대한 재료 및 방법.
흑색종 생물정보학 분석
서명을 평가하고 생존과의 연관(Cox 비례 위험 위험)을 평가하기 전에 흑색종 데이터세트 GSE19234(n = 44)를 R 환경에서의 변위치 정규화함으로써 전처리하였다. Bogunovic, D., et al . 전이성 흑색종 병변의 면역 프로파일 및 분열 지수는 환자 생존을 예측하는 데 있어서 임상 스테이징을 증대시킨다. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 20429-20434 (2009). SDC/NSM 비율 서명은 NSM 유전자의 평균 발현으로 나눈 SDC 유전자의 평균 발현의 로그로서 계산되고, 이어서 z 점수 표준화(평균 = 0, sd = 1; 도 1a에서의 유전자 목록)된다. Cox 비례 위험 모델링을 이용하여 생존 분석을 수행하였다. 로그 랭크 p-값은 벤자미니-호흐베르크 방법을 이용하여 다중 비교에 대해 조정한 후 유의성을 평가하도록 이용된다. 20 R에서의 생존 패키지를 사용하여 카플란-마이어 생존 도면을 생성하고, 본 발명자들은 SDC 또는 SDC/NSM 비율 서명의 33%, 50%(중앙값) 또는 66% 값을 이용하여 각각의 샘플을 '높음' 또는 '낮음'으로 분류하였다.
환자 및 샘플
환자는 조직학적으로 확인된 IV 또는 III 절제 불가능 전이성 흑색종을 가지는 경우 이 연구에 등록하였다. 환자는 UCSF IRB 승인 프로토콜(UCSF CHR #13-12246) 하에 조직 수집에 동의하였다. 연구 등록 기간은 2012년 12월부터 시작하여 2015년 2월이었다. 환자를 하기 PD-1/PDL-1 축 차단 단일클론 항체에 의해 처리하였다: 펨브롤리주맙(Keynote 001, 002, 006 또는 프로그램 또는 상업용 공급체에 걸쳐 증식함) 또는 니볼루맙(상업용 공급처). 피부/피하 종양을 펀치(4㎜ 또는 6㎜), 수술 절제(샘플 K10)에 의해 생검하고, 모든 다른 종양 생검을 배타적으로 코어 생검(16g 또는 18g)에 의했다. 추가적인 샘플을 병리학 평가를 위해 보냈다. 항-PD1의 점적주사 전에 생검(n = 21)을 수집하였다. 새로운 생검 샘플을 식염수를 적신 가제에서 무균 용기에 즉시 배치하고 웨트 아이스의 용기에 배치하고 평가를 위해 실험실로 수송하였다. 모든 반응 평가는 고형 종양 버전 1.1에서의 반응 평가 기준(RECIST)을 이용하여 방사선학 영상화에 의했다. 완전한 반응은 모든 표적 및 비표적 병변의 완전한 퇴행으로 정의되고, 부분 반응은 새로운 병변 발생 없이 30% 초과의 표적 병변의 퇴행으로 정의되고, 안정한 질환은 표적 병변의 30% 이하 감소 또는 20% 이하 증가로 정의된다. 진행성 질환은 20% 이상의 표적 병변의 증가 또는 1㎝ 초과의 크기의 새로운 병변의 출현으로 정의된다. 완전한 또는 부분 반응을 가지는 환자는 "반응자"로 분류되지만, 안정한 질환 또는 진행성 질환을 가진 환자는 "비반응자"로 분류된다. 진행이 추적 관찰 스캔의 이익 없이 임상적으로 확인되는 경우(예를 들어, 새로운 병변), 환자는 반응자로서 분류되고, RECIST는 'x'로 표시된다.
인간 조직 분해
조직을 수술 가위로 힘차게 갈고, 일정한 교반에 의해 5% CO2에 의해 37℃에서 1시간 동안 0.3g의 조직마다 3㎎/㎖의 콜라게나제 A(Roche) 및 50U/㎖의 DNase I(Roche)를 가지는 자기 교반 막대를 가지는 25㎖의 엘렌마이어로 옮겼다. 이후, 샘플을 70㎛ 필터를 통해 여과시키고 스핀 다운하고 염색을 위해 재현탁시켰다. Ruffell, B., et al . Leukocyte composition of human breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 109, 2796-2801 (2012).
유세포계측법 및 Ab 클론
모든 항체를 비디 파르민젠, 이바이오사이언스, 인비트로겐, 바이오레전드, UCSF 하이브리도마 코어로부터 구입하거나, 크루멜 랩에서 제조하였다. 표면 염색을 위해 세포를 인간 항-Fc 수용체 항체 칵테일(클론 3G8, FUN-2, 및 10.1, 바이오레전드)과 항온처리하고 얼음에서 30분 동안 PBS + 2% FCS + 2 mM EDTA 중의 항체에 의해 염색하였다. 고정 가능한 생/죽은 좀비 NIR 또는 Aqua(바이오레전드)에 의해 염색함으로써 생존능력을 평가하였다. 비디 포르테사 유세포분석기에서 모든 유세포계측법을 수행하였다. 플루조(트리스타) 소프트웨어를 사용하여 유세포계측법 데이터의 분석을 수행하였다. BD FACS Aria II를 사용하여 세포 분류를 수행하였다.
인간 항원에 대한 마우스 항체: CD45 클론 Hl30, CD3e 클론 OKT3, HLA-DR 클론 L243, CD56 클론 CMSSB, CD19 클론 H1B19, CD14 클론 61D3, CD16 클론 CB16, CD11c 클론 3.9, BDCA1 클론 L161, 및 BDCA3 클론 AD5-14H12.
세포주 및 세포 배양
B78ChOVA는, PyMTchOVA 세포주를 생성하기 위해 사용된 것과 동일한 Ch-OVA 융합 작제물에 의한 표준 형질감염 절차에 의해 생성된, B78의 변이체 세포주이다. Graf, L.H., Jr., Kaplan, P. & Silagi, S. Efficient DNA-mediated transfer of selectable genes and unselected sequences into differentiated and undifferentiated mouse melanoma clones. Somatic cell and molecular genetics 10, 139-151 (1984) and Engelhardt, J.J., et al . Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell 21, 402-417 (2012). 간단히 말하면, 부착 세포를 조직 배양 처리된 플라스틱 플레이트에서 페니실린, 스트렙토마이신, 및 글루타민을 가지는 10% FCS와 DMEM 중의 5% CO2에 의해 37℃에서 배양하고 격일로 분할하였다. 현탁액 세포를 조직 배양 T25 및 T75 플라스크에서 RPMI-1640와 10% FCS 및 Pen/Strep/Glut 중에 배양하고 격일로 분할하였다.
마우스 종양
모든 마우스를 SPF 조건 하에 유지시키고, NIH 및 미국 실험 동물 관리 표준 협회에 따라 처리하고, UCSF의 관리 규제에 부합하였다.
종양 세포주를 수확하고 PBS에 의해 3회 세척하고, 이후 50㎕의 최종 용적을 위해 성장 인자 감소한 마트리겔 매트릭스(BD Biosciences)와 1:1 비율로 혼합하였다. 150,000개의 종양 세포를 오른쪽 면도된 옆구리에서 피하로 주사하고, 14-21일 동안 성장하게 하였다.
마우스 균주
종양에서의 골수성 세포의 집단을 조절하기 위해, 야생형 C57BL/6을 시몬센으로부터 구입하고, Zbtb46 -DTR C57BL/6 마우스를 시몬센사로부터 얻었다. Meredith, M.M., et al . 아연 핑거 전사 인자 zDC(Zbtb46, Btbd4)의 발현은 전통적인 수지상 세포 계통을 한정한다. J Exp Med 209, 1153-1165(2012). 치사 조사(5.5 Gy의 2 용량)를 받은 8주령 C57BL/6 수컷 수혜자 및 2-5X106 Zbtb46-DTR BM 세포를 사용하여 표준 절차에 따라 Zbtb46-DTR BM 키메라를 생성하였다. 마우스를 4주 동안 항생제 물 중에 유지시키고, 재구성 후 8주에 실험에 사용하였다.
종양 성장
종양 성장 곡선을 위해, 종양 면적(㎟)을 표시된 시간 기간에 걸쳐 종양 폭 x 종양 높이로서 전자 캘리퍼에 의해 측정하였다.
독소, 항-PD-1, 및 항-CTLA-4 처리
DT를 시그마-알드리치로부터 구입하였다. DTR에서의 일시적인 DT 절제를 위해, 마우스에 체중 1그램당 20ng의 DT에 의해 i.p. 주사하고, 분석을 위해 DT 주사 후 24시간에 마우스를 안락사시켰다. 장기간 절제를 위해, 마우스를 초기에 20ng/그램의 DT에 의해 i.p. 주사하고, 이후 15일까지 동안 이로부터 3일마다 4ng/그램에서 유지시켰다.
BioXcell로부터 정제된 항-PD-1(클론 RMPI-14) 및 항-CTLA-4(클론 9H10)를 구입하고, 종양 성장의 5일, 8일 및 11일에 3의 치료에 의해 조합 치료로서 100㎍의 각각의 항체에 의해 i.p. 주사하였다.
통계 분석
그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 구체적으로 기재되지 않은 한, 모든 데이터가 3회 초과의 독립 실험을 대표한다. 오류 막대는 프리즘을 이용하여 계산된 S.E.M.을 나타내고, 3회 반복 실험 조건으로부터 추론된다. 이용된 특정한 통계 시험은 쌍 지어지고, 비대칭적 T 시험 및 0.05 미만의 모든 p 값은 통계적으로 유의미한 것으로 생각된다.
실시예 11: 종양내 BDCA3 + DC는 인간 흑색종에서 항-PD1 관문 치료제에 대한 결과를 예측한다.
종양내 APC가 이의 표현형에서 매우 다양하고, 골수성 시스템이 대식세포 및 수지상 세포 둘 다를 닮은 다수의 집단에 기여한다. 그러나, '대식세포'가 종양 진행에 저해이지만(DeNardo et al., and Hanada et al.), 아마도 종양내 수지상 세포가 자극인 것으로 오랫동안 의심되었다(Sandel et al.). 분명히 자세히 이를 이해하는 노력은 이 세포 유형 사이의 명확한 구별의 부족으로 인해 유의미하게 방해되었다. 최근에, 본 발명자들은 종양내 골수성 세포를 구별하기 위해 RNAseq와 함께 고차원 유세포계측법을 수행하였다. 본 발명자들은 실제로 교차 제시하는 수지상 세포의 적은 집단이 CTL에 매우 자극이지만 다른 선량한(bona-fide) "수지상 세포") 하위세트, 및 매우 풍부한 대식세포 집단이 종양-항원 반응성 CD8 T 세포를 자극하지 못했다는 것을 발견하였다. 희귀 자극 수지상 세포(SDC)는 인테그린 CD103의 발현에 의해 마우스에서 및 CD141/BDCA3의 발현에 의해 인간에서 정의되었다(Broz et al.).
인간 흑색종에서 이 희귀 면역-자극 DC 집단의 역할을 구체적으로 해결하기 위해, 본 발명자들은 초기에 모든 남은 비자극성 골수성(NSM; 대식세포 및 비자극 DC를 포함) 항원 제시 세포 하위세트와 비교하여 마우스 SDC에서 RNA가 극적으로 농후화된 2개의 '서명' 유전자 세트 또는 반대로 NSM에서 우선적으로 발현된 유전자 세트의 이익을 취했다(도 9a). 이후, 본 발명자들은 전이성 흑색종 환자에서의 RNA 발현 분석, 종양 분열 지수, 질환의 임상 병기 및 생존 둘 다를 포함한 44명의 전이성 흑색종 환자의 잘 설명된 데이터세트를 문의하였다(Bogunovic et al). 본 발명자들은 RNA 존재비의 분석을 수행하여, 개별 SDC 유전자, 모든 SDC 유전자의 평균 또는 SDC/NSM 유전자의 비율에 대해 분석하였다. 이 후자의 2개는 각각 전체 SDC 존재비 및 상대 SDC/NSM 세포 존재비의 측정치로서 고려될 수 있었다(Broz et al.).
9개의 SDC 서명 유전자 중에, 7개는 위험 비율(HR)로서 표현된 유의미한 예후 이익을 가졌고(표 1, 하기), SDC 서명 및 SDC/NSM 비율 서명 둘 다는 매우 유의미한 예측 값을 가졌다.
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이 예후 연관을 훌륭히 가시화하기 위해, SDC 유전자 또는 SDC/NSM 비율(여기서, 환자는 발현의 33%, 50% 또는 66% 비닝된 한계치에서 증가하는 엄격성 기준점으로 '높은' 또는 '낮은' 서명 발현으로 비닝됨)에 대해 카플란-마이어(K-M) 도면을 생성하였다(도 9b, 도 9c). 이 분석은 가장 높은 발현 수준을 선택할 때 증가하는 생존율을 입증하였고; SDC 또는 SDC/NSM 종양의 상부 33%는 전이의 시간 이후로 가장 통계적으로 유의미한 생존 증가를 가진다. 이것은 종양에서의 자극 BDCA3+ DC의 증가한 존재비가 심지어 치료의 부재 하에 생존을 훌륭히 지지한다는 가설을 지지한다.
이 관계식과 T 세포 면역력 사이의 관계식을 고려하여, 본 발명자들은 TIL 침윤에 대한 데이터를 분석하기 위해 SDC 및 SDC/NSM 서명을 관계시키도록 프로파일링된 종양에서의 TIL의 존재비에 대한 생성된 정보의 이익을 추가로 취했다. 이 분석은 TIL 카테고리의 종류 기반 측정치 및 종양주변 CD3+ T 세포 수의 측정치가 둘 다 SDC 유전자 서명 및, 그보다 적게 그러나 여전히 매우 유의미한 정도로, SDC/NSM 비율과 매우 연관된다는 것을 밝혀냈다(도 9d-도 9g).
이 관계식은 SDC 존재비, T 세포 기능과 전체 생존 사이의 상호관계를 제안하였다. 본 발명자들은 관문 봉쇄에 관련시키면서 이 관계식을 질의하도록 추구하였다. 그러나, SDC 및 SDC/NSM 서명이 집단 자체에 대한 유일한 대리물이므로, 본 발명자들은 어떻게 이것이 관련하는지를 보기 위해 관문 치료제의 임상 실험의 맥락에서 흑색종 생검으로부터 이 집단을 직접적으로 측정하도록 추구하였다.
이 결과를 시험하기 위해, 본 발명자들은 유세포계측법을 이용하여 21개의 전이성 흑색종 환자의 생검 샘플로부터의 종양 생검을 분석하고, 이후 항-PD-1 처리에 반응한 이의 진행을 추적하였다. 21명의 환자 중에, 평균 연령이 61.6년으로 5명은 여성이고, 16명은 남성이고, 생검은 다양한 위치 및 조직으로부터 취해졌다(도 10a). 이들 환자의 각각에 대해, 생검을 효소로 분해하고, 유세포계측법에 의해 분석하여 종양에서의 면역 세포 침윤물의 비율을 정량화하였다. 본 발명자들은 마커 CD45, HLA-DR, CD3, CD19, CD56, CD11c, CD11b, CD85g, CD14, BDCA1 및 BDCA3을 사용하여 인간 골수성 침윤물을 해부하도록 포괄적인 흐름 패널을 설계하였다. 이 마커를 사용하여, 본 발명자들은 BDCA3+ DC, BDCA1+ DC, CD14+ TAM 및 CD14- TAM 하위세트를 확인하기 위해 이 종양의 면역 구획을 진행성으로 게이팅할 수 있다(도 10b, 도 10c). 그리고, 본 발명자들은 BDCA3+ SDC의 유의미한 집단을 가지는 환자(도 10b), 및 유의미하게 더 적은 것을 가지는 환자(도 10c)를 발견하였다. 종양은 또한 CD45+ 세포 침윤의 전체 분량 및 HLA-DR을 발현하는 세포의 비율이 유의미하게 변했다(도 10d). 대부분의 흑색종은 림프구('계통')의 전체 존재비에 대해 매우 농후화되었다(도 10e). 그리고, 골수성 하위집단으로, 도 10c/도 10d에서처럼, HLA-DR+ 세포가 분석될 때, 이것은 또한 환자 생검에 걸쳐 쾌 유의미한 이종성을 입증하였다(도 10e).
이 면역 골수성 침윤물과 환자 반응의 연관을 조사하기 위해, 본 발명자들은 안정한 또는 진행성 질환으로 정의된 '비반응자', 또는 항-PD-1 처리에 대한 부분 또는 완전한 반응으로 정의된 '반응자'로서 환자를 군으로 분석하였다(도 10a 및 방법 참조). 이 접근법에 의해, 반응 환자와 비반응 환자 사이에 전체 CD45+ 면역 세포 침윤물의 백분율의 유의미한 차이가 없었고, 군 둘 다 사실 평균 주위에 유사한 가변성으로 CD45+ 세포의 유사한 평균 백분율을 가졌다(도 11a, 도 11b 및 데이터 비도시). 유사하게, 림프구 세포의 전체 빈도와 결과 사이에 명확한 관계식이 없었다(데이터 비도시). 비교하여, BDCA3+ DC가 전체 면역 세포(CD45+ 세포에서 게이팅, 도 11c-도 11d) 또는 전체 APC(HLA-DR+ 세포에서 게이팅, 데이터 비도시)의 비율로서 반응 군에 걸쳐 정량화될 때, 항-PD-1 반응 환자는 이의 종양에서 BDCA3+ DC의 통계적으로 유의미한 더 높은 빈도를 가졌다. 종합하면, 이 발견은 종양의 전체 면역 세포 침윤이 면역치료 반응성을 예측하지 않지만, 가능하게는 전체 CD45+ 집단이 TME에서 항종양에 대한 종양촉진 플레이어 둘 다를 함유하므로, 자극 BDCA3+ DC의 비율이 사실 항-PD-1에 대한 면역치료 효능을 예측할 수 있다는 것을 제안한다. 비교적 낮은 수의 BDCA3을 가지는 반응자의 명확한 예가 있지만, HLA-DR+의 2% 초과의 절대 컷오프는 이 샘플 크기를 사용하여 반응자 상태에 대한 95% 신뢰도를 제공한다.
본 발명자들은 이 양의 관계식이 남은 골수성 집단의 정확한 동일성을 고려함으로써 추가로 개선될 수 있는지를 이해하기 위해 이 데이터를 추가로 조사하도록 추구하였다; 구체적으로 존재비 또는 CD14+ TAM 또는 BDCA1 또는 CD14- TAM에 의해 마킹된 대안적인 DC 집단. 본 발명자들은 이들 각각에 대한 BDCA3+ 세포의 백분율에 의해 개별 환자를 작도하고, 각각을 반응자 상태에 따라 코딩하였다. 반응자가 여전히 이 도면의 BDCA3+높은 영역으로 분석되지만, 본 발명자들은 다른 집단에 의해 명확하지 않은 경향을 발견하였다(도 11e-도 11g). 다시, 이 발견은 BDCA3의 존재가 고형 항종양 반응을 높일 수 있는 강한 표시자이지만, 다른 인자가 더 낮은 수준을 가짐에도 불구하고 적은 환자가 반응하도록 허용하는 데 역할을 할 수 있다는 것을 표시한다. 추가의 연구는 가능한 설명으로서 BDCA3+ 세포의 종양내 국소화에 초점을 두어야 하고; 현재, 이에 대한 항체는 수중에서 불량하게 수행되고, 따라서 미래의 연구에 대해 개발될 필요가 있을 것이다.
BDCA3+ DC 존재비와 면역치료제에 대한 반응성 사이의 강한 연관을 확립하면서, 본 발명자들은 이 연관이 관문 봉쇄 치료제에 대한 이 자극 DC 집단의 기능성 요건을 나타내는지, 또는 단순히 반응성의 '서명'을 나타내는지를 해결하였다. 이를 시험하기 위해, 본 발명자들은 mCherry 형광 단백질 및 난알부민을 발현한 B16 흑색종의 변형된 변이체인, B78chOVA 세포주7인, 흑색종의 추적 가능한 마우스 모델에 의존하였다. 이 종양 모델과 함께, 본 발명자들은 (CD103+) SDC를 우선적으로 절제하는 것으로 이전에 밝혀낸 Zbtb46-DTR BM 키메라 마우스를 사용하였다(Broz et al.). 수중에 있는 마우스 모델에서, 단지 항-PD1에 의한 단일치료제는 흑색종에서 비효과적이었다. 본 발명자들은 따라서 CD103+ SDC의 고갈이 항-PD-1 및 항-CTLA-4의 조합된 면역치료제 섭생의 효능을 방해하는지를 조사하기 위해 절제 모델을 이용하였다(도 12a). Zbtb46-DTR BM 키메라 마우스를 5일, 8일 및 11일에 3개의 투약 치료 섭생을 이용하여 항-PD-1 및 항-CLTA-4 또는 동형단백질 일치 대조군 항체에 의해 그리고 일에 시작하는 DT 또는 PBS 주사에 의해 처리하였고, 본 발명자들은 DT 처리가 단독으로 이 모델에서 종양 성장에서 영향을 가지지 않는다는 것을 확인시켜주었다(데이터 비도시). 본 발명자들은 비처리된 흑색종 종양이 진행성으로 생육하지만, 조합된 면역치료제에 의해 치료된 것이 7-8일 후 신속히 퇴행하고, 15일에 거의 완전히 근절된다는 것을 발견하였다(도 12b, 도 12c). 비교하여, 마우스가 이 강력한 면역치료제의 상황에서 CD103+ DC가 고갈될 때, 신속한 종양 퇴행이 소실되고, 이중 치료의 효능이 폐지되어서, 면역치료 효과에 대한 CD103+ DC의 기능적 요건을 제안한다(도 12d).
따라서, 본 발명자들은 마우스 및 인간 종양 조직 둘 다에서 특이적 SDC(CD103+ 또는 BDCA3+) 집단의 강력한 예측 및 예후 이익을 확립하였다. 일반적으로, 이 발견은 이전의 연구(DeNardo et al and Fridman et al)에서 밝혀진 바대로 종양 조직의 면역 랜드스케이프를 완전히 이해하는 것의 중요성을 추가로 강조한다. '면역-스코어링'(Ascierto et al)은 몇몇 암에 대해 새로운 진단학적 마커로서 인정되고 있지만; 이것 뒤로 진행하면서, 본 발명자들의 연구는 미세환경에서 T 세포를 조절할 수 있는 면역 세포의 희귀 집단을 확인하기 위한 인간 종양의 증가하게 상세하게 된 면역프로파일링의 필요성을 밝혀냈다. 계층화는 1차 연구, 이어서 생검에 수정 가능한 시험의 개발에서 밝혀진 서명의 연속 개선을 이용할 필요가 있고, 본 발명자들의 연구는 예를 들어 질량-이온 빔 기법에 의한 미래의 고차원 영상화에서 이러한 하나의 방법을 나타낼 수 있다는 것을 강조한다(Angelo et al).
실시예 12: 하기 실시예에 대한 재료 및 방법.
종양 분해
종양을 마우스로부터 해부하고, 제거된 종양 조직의 전체 중량을 결정하였다. 이후, 종양을 메스를 사용하여 갈고 50㎖의 원뿔에서 30분 동안 0.3그램의 종양 중량당 5㎎/㎖의 스톡 용액 및 200㎎/㎖의 DNAse I(Roche)로부터 20㎕/㎖의 Liberase TL(Roche)에 의해 분해하고, 5% CO2를 가지는 37℃ 진탕기에 배치하였다. 30분 후, 종양을 이후 70㎛ 세포 스트레이너를 통해 통과시키고, 생 세포를 Ficoll Paque Plus(GE) 밀도 구배에 의해 농후화시켰다. 생 세포를 계면으로부터 수집하고, 염색 완충제(PBS + 2% FCS + 2mM EDTA)로 세척하였다.
마우스 골수 및 비장 단리
대퇴골 및 경골을 제거하고, 골수를 PBS/2% FCS/2㎜ EDTA 및 25G 침/주사기를 사용하여 추출하였다. 비장을 마우스로부터 해부하고, 메스를 사용하여 갈았다. 조직 단편을 37℃ 진탕기에서 50㎖의 원뿔에서 500U/㎖의 콜라게나제 IV(Worthington), 100U/㎖의 콜라게나제 I(Worthington) 및 200㎎/㎖의 DNAse I(Roche)에 의해 분해하였다. 이후, 분해된 조직을 70㎛ 세포 스트레이너를 통해 여과시켰다. 적혈구를 5분 동안 0.8% NHCl4에 의해 골수 및 비장 둘 다에서 용해시키고, 이후 염색 완충제(PBS + 2% FCS + 2㎜ EDTA)로 세척하였다.
인간 종양 샘플
조직을 수술 가위로 힘차게 갈고, 일정한 교반에 의해 37℃/5% CO2에서 30분 동안 0.3g의 종양 중량마다 5㎎/㎖의 스톡 용액 및 200㎎/㎖의 DNAse I(Roche)로부터 20㎕/㎖의 Liberase TL(Roche)를 가지는 50㎖의 원뿔로 옮겼다. 이후, 샘플을 70㎛ 필터를 통해 여과시키고 스핀 다운하고 염색을 위해 재현탁시켰다(Ruffell et al., 2012). 모든 인간 샘플에 대해, 모든 대상체로부터 동의서를 얻고, IRB 승인(IRB 번호 13-12246, 12/06/2013-12/05/2014)에 따라 작업을 수행하였다.
유세포계측법 및 Ab 클론
모든 항체를 비디 파르민젠, 이바이오사이언스, 인비트로겐, 바이오레전드, 휴먼 프로테인 알타스(Human Protein Atlas)로부터 구입하거나, 크루멜 랩 또는 프리시즌 이뮨 인크.(Precision Immune Inc.)에서 제조하였다. 표면 염색을 위해 세포를 항-Fc 수용체 항체(클론 2.4G2), 및 500nm 인간 IgG1 Fc와 항온처리하고 얼음에서 30분 동안 PBS + 2% FCS + 2nM EDTA 중의 1차 항체에 의해 염색하였다. 이어서, PBS + 2% FCS + 2mM EDTA 중에 2회 세척하고, 얼음에서 30분 동안 적절히 2차 항체 염색하였다. 고정 가능한 생/죽은 좀비 아쿠아(바이오레전드) 또는 좀비 NIR 또는 DAPI에 의해 염색함으로써 생존능력을 평가하였다. 비디 포르테사 유세포분석기에서 모든 유세포계측법을 수행하였다. 플루조(트리스타) 소프트웨어를 사용하여 유세포계측법 데이터의 분석을 수행하였다.
항-마우스 Ab 클론: CD45 클론 30-F11, CD11b 클론 M1/70, CD11c 클론 N418, CD103 클론 2E7, CD24 클론 M1/69, CD90.2 클론 30-H12, Ly6C 클론 HK1.4, MHCII 클론 M5/114.15.2, F4/80 클론 BM8, CD64 클론 X54-5/7.1.
NSM 마커: MS4A7(휴먼 프로테인 알타스사제의 다중클론, 제품 번호: HPA017418), MS4A6A(휴먼 프로테인 알타스사제의 다중클론, 제품 번호 HPA011391). 랫트 항-마우스 CD88(C5aR) 클론 20/70, 항-LILRB4 클론(Pi1.5 클론 1), 항-Trem2(Pi1.2 클론 2, 5 또는 7), CD206 클론 C068C2, MerTK 클론 Y323.
SDC: 항-CCR7 클론 4B12(마우스), 항-CCR7 클론 3D12(인간), 항-XCR1 클론 ZET(마우스), CD135 cone A2F10(마우스), CD117 클론 2B8(마우스).
항-인간 Ab 클론: CD45 클론 Hl30, CD3e 클론 OKT3, HLADR 클론 L243, CD56 클론 CMSSB, CD19 클론 H1B19, CD14 클론 61D3, CD16 클론 CB16, CD11c 클론 3.9, BDCA1 클론 L161, 및 BDCA3 클론 AD5-14H12. TREM2(클론 237920).
2차 항체: 항-인간-Fab-A488, 항-래트-A488 및 항-염소-A488(모두 잭슨 이뮤노리서치사로부터 구입).
항-TREM2 항체를 제조하기 위해, 인간 및 마우스 TREM2의 세포외 도메인에 상응하는 정제된 단백질 항원을 Fc 융합으로서 제조하고 알앤디 시스템즈(R&D Systems)(미네소타주 미니아폴리스)로부터 구입하였다. 이 항원을 pH 7.4에서 인산염 완충 식염수(PBS) 중에 희석시키고, 4℃에서 밤샘 흡착에 의해 96웰 면역플레이트에서 부동화하였다. 이후, 면역플레이트를 소 혈청 알부민(BSA)에 의해 차단하고 실온에서 적어도 2시간 동안 미경험 합성 Fab-파지미드 라이브러리와 항온처리하였다. 비결합 파지를 PBS + 0.05% Tween-20에 의한 광범위한 세척에 의해 제거하였다. 0.1N HCl을 사용하여 결합 파지를 용리시켰다. 용리된 파지를 1M 트리스-Cl(pH 8.0)에 의해 중화시키고, 헬퍼 파지 M13KO7과의 상호 보완에 의해 박테리아 숙주를 통한 계대배양에 의해 증폭시켰다. PEG-8000, 2.5M NaCl의 1/5 용적의 첨가에 의한 침강, 20분 동안 얼음에서의 항온처리 및 20분 동안 17,600 x g 초과에서의 원심분리에 의해 박테리아 상청액으로부터 증폭된 파지를 농축시켰다. 침강한 파지를 0.5% BSA 및 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS 중에 재현탁시키고 흡착된 마우스, 인간 또는 항원 둘 다에서 후속하는 선택 회차에 사용하였다. 3회 내지 5회의 선택 회차 후, 파지를 96웰 포맷에서 성장한 개별 클론으로부터 제조하고, 배양 상청액을 파지 ELISA에서 사용하여 특이적 결합 클론을 검출하였다. 소 혈청 알부민 또는 인간 Fc 대조군이 아니라 항원에 결합한 클론을 DNA 서열 분석으로 처리하였다. Pi1.2 클론 2, 5 및 7을 선택하고 시험하였다. 이 클론은 마우스 및 인간 세포외 TREM2에 결합하고 마우스 및 인간 세포외 TREM1에 결합하지 않는 것으로 발견되었다(데이터 비도시). TREM1(골수성 세포 1에서 발현된 촉발 수용체)은 NCBI 웹사이트를 통해 2015년 9월 25일에 이용 가능한 것처럼 수탁 번호 NM_018643.3을 가진다.
항체 라이브러리를 토론토 대학교로부터 얻었다. 문헌[Persson et al., CDR-H3 Diversity is Not Required for Antigen Recognition by Synthetic Antibodies. J Mol Biol . 2013 February 22; 425(4): 803-811](이 표현 목적 및 모든 목적을 위해 본 명세서에서 참고문헌으로 포함됨)을 참조한다. 다양한 합성 항체 라이브러리가 USPN 7985840 B2(본 명세서에서 참고문헌으로 포함됨); 및 다양한 문헌 챕터(Fellouse and Sidhu, Making and Using Antibodies, Howard and Kaser, eds. Taylor and Francis, 2007에서 "Making antibodies in bacteria"(본 명세서에서 참고문헌으로 포함됨))에 또한 기재되어 있다.
상기 기재된 것 또는 WO2013080055(본 명세서에서 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 LILRB4 항체를 제조하였다. 클론 1 서열은 표 BB에 기재되어 있다.
세포주 및 세포 배양
MC38 세포를 표준 세포 배양 실행에 의해 배양하였다. 간단히 말하면, 부착 세포를 조직 배양 처리된 플라스틱 플레이트에서 페니실린, 스트렙토마이신, 및 글루타민을 가지는 10% FCS와 DMEM 중의 5% CO2에 의해 37℃에서 배양하고 격일로 분할하였다. EL4 현탁액 세포를 조직 배양 플라스크에서 페니실린, 스트렙토마이신, 및 글루타민을 가지는 RPMI-1640과 10% FCS 중의 5% CO2에 의해 37℃에서 배양하고 격일로 분할하였다.
마우스 종양
모든 마우스를 SPF 조건 하에 유지시키고, NIH 및 미국 실험 동물 관리 표준 협회에 따라 처리하고, IACUC UCSF 프로토콜에 부합하였다.
종양 세포주를 수확하고 PBS에 의해 3회 세척하고, 50㎕의 최종 주사 용적에서 주사하였다. 150000개의 종양 세포를 오른쪽 면도된 옆구리에 피하로 주사하고, 6-8주령 C57BL/6 수컷 마우스에서 14-21일 동안 성장하게 하였다.
종양 성장
종양 성장 곡선을 위해, 표시된 시간 기간에 걸쳐 종양 폭 x 종양 높이로서 전자 캘리퍼에 의해 종양을 측정하고, 종양 용적(㎣)을 V=(LxWxW)/2로서 계산하였다.
항체 처리
BioXcell사로부터 구입한 정제된 항-PD-1(클론 RMPI-14), 인간 IgG1 Fc(BioXcell사로부터 구입), 또는 인하우스 제조된 항체 클론을 각각의 일에 40, 20, 20 및 40㎍로 주사된 항-TREM2(Pi1.2)(클론 2)를 제외하고 종양 성장의 5일, 8일 및 11일 및 14일에 4개의 처리에 걸쳐 200㎍로 IP 주사하였다.
형질전환체 생성
젠코포에이아(GeneCopoeia) 렌티바이러스 벡터 및 LentiPack HIV 패키징 시스템을 사용하여 렌티바이러스 형질전환에 의해 세포주를 생성하였다. 제조 설명서에 따라, 감염된 세포주를 선택 가능한 항생제(퓨로마이신) 중에 배양하고, FACS에 의해 표적 단백질의 발현에 대해 분류하였다.
세포의 염료 표지
세포를 37℃에서 15분 동안 0.5μM eFluor670(이바이오사이언스) 또는 0.5μM CMTMR(Thermo)과 FCS 없이 RPMI 중에 항온처리하였다. 이후, 염료를 2㎖의 FCS에 의해 켄칭하고, 사용 전에 3회 RPMI 10% FCS 중에 세척하였다.
복강내 고갈 검정
모 및 표적 발현 형질전환체 세포주의 2x10^6개의 염료 표지된 세포의 각각을 WT B6 수컷 마우스로 IP 주사하였다. 4시간 후, 동물에 500㎍의 고갈 또는 대조군 항체를 주사하였다. 24시간 내지 36시간 후, 전달된 세포를 복막 세척에 의해 회수하고, 유세포계측법에 의해 열거되었다.
통계 분석
그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 통계 분석을 수행하였다. 구체적으로 기재되지 않은 한, 모든 데이터가 3회 초과의 독립 실험을 대표한다. 오류 막대는 프리즘을 이용하여 계산된 S.E.M.을 나타내고, 3회 반복 실험 조건으로부터 추론된다. 이용된 특정한 통계 시험은 쌍 지어지고, 비대칭적 T 시험 및 0.05 미만의 모든 p 값은 통계적으로 유의미한 것으로 생각된다.
실시예 13: 다수의 인간 종양에서의 NSM 및 SDC의 존재.
다수의 상이한 인간 종양 유형에 걸쳐 NSM 및 SDC이 존재하는지를 다음에 결정하였다. SDC 및 NSM 집단의 존재에 대해 유세포계측법에 의해 전이성 흑색종, 두경부 편평 세포 암종(HNSC), 및 결장 암종으로부터의 인간 종양 조직 생검을 분석하였다. 대표적인 흐름 도면은 진행성 게이팅이 모든 디스플레이된 인간 종양 유형(전이성 흑색종, 두경부 편평 세포 암종(HNSC) 및 결장 암종)에서 NSM 집단 및 SDC 집단 둘 다를 확인하였다는 것을 보여준다. 도 13을 참조한다.
실시예 14: 마우스 종양에서의 NSM 단백질 발현 및 결합.
소정의 NSM 단백질이 NSM의 세포 표면에서 발현되는지 및 이 NSM 단백질이 항-NSM 항체에 의해 결합할 수 있는지를 다음에 결정하였다. 소정의 NSM 단백질이 SDC에서 발현되는지를 또한 결정하였다.
마우스 종양을 NSM 마커에 의해 염색하여 SDC 또는 다른 세포 유형 또는 하위세트가 아니라 NSM에 대한 이 마커의 특이성을 입증한다. 도 14는 다양한 NSM 마커에 의한 표시된 세포 하위세트의 표지를 보여주어서, 표시된 세포 하위세트 내에 게이팅된다. 표시된 마커에 대한 염색은 검정 히스토그램으로 보여지고, 염색 대조군 동형단백질은 회색 음영 히스토그램에 의해 보여진다. 상부 열: 항-TREM2(Pi1.2 클론 2)에 의해 염색된 B16 흑색종; 제3 열: 항-TREM2(Pi1.2 클론 2)에 의해 염색된 MC38; 제3 열: MC38 stained with 항-MS4A7(휴먼 프로테인 알타스사로부터 구입한 상업용 다중클론 항체, 제품 코드: HPA017418); 제4 열: 항-LILRB4(Pi1.5 클론 1)에 의해 염색된 B16; 제5 열: 항-C5AR1에 의해 염색된 MC38. 데이터는 염증성 DC, Ly6c+ 단핵구 및 TAM에 대한 강한 결합, 및 CD11b+ DC에 대한 유의미한 결합을 보여준다. CD103+ DC, T 세포, B 세포, 및 종양 세포에서 염색이 거의 관찰되지 않거나 관찰되지 않았다.
소정의 NSM 단백질에 대한 항-NSM 항체에 의한 소정의 NSM 단백질의 결합은 NSM이 예를 들어 ADCC를 허용하는 적절한 Fc 도메인을 선택함으로써 공지된 항체 기반 고갈 기전을 통해 고갈되는지 사멸되는지를 나타낸다.
실시예 15: 인간 SDC 및 NSM 세포에서의 CCR7 발현.
유세포계측법에 의해 분해된 종양 조직에서의 각각 SDC 및 NSM 집단에 대한 CCR7의 특이적 발현을 분석하였다. 모든 데이터는 인간 전이성 흑색종 세포로부터 얻는다. 도 15는 NSM 및 다른 면역 세포에 비해 CCR7의 인간 SDC에서의 특이적 발현을 보여준다.
실시예 16: 종양에서의 SDC 단백질 발현 및 결합.
소정의 SDC 단백질이 SDC의 세포 표면에서 발현되는지 및 이 SDC 단백질이 항-SDC 항체에 의해 결합할 수 있는지를 다음에 결정하였다. 소정의 SDC 단백질이 NSM에서 발현되는지를 또한 결정하였다.
유세포계측법에 의해 분해된 종양 조직에서의 각각 SDC 및 NSM 집단에 대한 SDC 및 NSM 유전자 생성물의 특이적 발현을 분석하였다. 모든 데이터는 이소성 B78chOVA 종양 모델로부터 얻는다. 종양에서의 세포의 집단에 걸쳐 각각의 동형단백질(회색 음영)과 비교된 SDC 마커(CCR7 및 XCR1; 검정 선)의 발현. 도 16은 SDC에서의 SDC 유전자 생성물의 특이적 발현 및 NSM에서의 SDC 단백질 발현의 결여를 보여준다.
실시예 17: 종양의 밖의 NSM 결합의 부재.
TREM2(클론 237920, RnD) 및 MS4A7(상업용 다중클론, 휴먼 프로테인 알타스)의 발현에 대해 유세포계측법에 의해 건강한 야생형 B6 마우스 골수(BM) 및 비장을 분석하였다.
대표적인 히스토그램은 몇몇 건강한 조직 집단에 걸쳐 TREM2 및 MS4A7 염색의 수준을 보여준다. 각각의 집단에 대한 2차 대조군(각각 잭슨 이뮤노리서치사제의 항-랫트-A488 및 항-토끼-A488)은 음영 회색이지만, 표적 단백질에 대한 염색은 각각의 집단에 대해 검정 실선 히스토그램에 의해 오버레잉된다.
면역 집단에 걸쳐 대조군(인간 IgG1 Fc, 0nM으로 표지됨)과 비교하여 염색 농도의 범위(2, 20, 200nM)에 걸쳐 항체 염색함으로써 TREM2(Pi1.2 클론 2, 클론 5 및 클론 7)의 발현에 대해 유세포계측법에 의해 건강한 야생형 B6 마우스 골수(BM) 및 비장을 분석하였다.
도 17은 건강한 BM 및 비장 조직에서의 다수의 NSM 마커에 대한 실질적인 염색의 부재를 보여준다. 이것은 항-NSM 항체의 사용이 예를 들어 종양 처리 동안 유의미한 오프 타겟 효과를 가지지 않을 것이라는 것을 제안한다.
실시예 18: 항- TREM2 또는 항- LILRB4 항체를 사용한 종양에서의 NSM 고갈.
항-NSM 항체가 생체내 NSM 보유 세포를 특이적으로 고갈시킬 수 있는지를 다음에 결정하였다.
TREM2: 대조군 및 TREM2(TREM2는 또한 Pi1.2라 칭해질 수 있음) 발현 EL4 형질전환체 세포를 각각 CMTMR 및 Elfour670에 의해 염료 표지하고, 1:1 비율로 혼합하였다. 4x10^6개의 전체 세포 혼합물을 WT B6 수컷 마우스로 IP 주사하였다. 4시간 후, 동물에 500㎍의 항-Pi1.2(항-TREM2) 항체 또는 대조군 인간 IgG1을 주사하였다. 36시간 후, 마우스를 희생시키고 복막으로부터 세포를 회수하고 복막 세척에 의해 수확하고 유세포계측법에 의해 열거되었다. 도 18은 항-TREM2 항체가 생체내 TREM2 보유 세포를 특이적으로 고갈시키지만, 대조군 항체는 그렇지 않다는 것을 보여준다.
LILRB4(ILT3): 대조군 및 각각 TdTomato 및 GFP를 발현하는 LILRB4 발현 EL4 형질전환체 세포를 5x10^5개의 각각의 세포 유형과 1:1 비율로 혼합하고, WT B6 수컷 마우스에 IP 주사하였다. 2시간 후에 동물에 100㎍의 항-LILRB4 클론 1 또는 PBS 대조군을 주사하였다. 24시간 후, 마우스를 희생시키고 복막으로부터 세포를 회수하고, 복막 세척에 의해 수확하고 유세포계측법에 의해 수를 열거하였다. 도 18은 항-LILRB4 항체가 생체내 LILRB4 보유 세포를 특이적으로 고갈시킨다는 것을 보여준다.
소정의 NSM 단백질에 대한 NSM의 항-NSM 항체의 고갈은 항-NSM 항체가 종양을 가지는 대상체에 대한 투여 시 종양 성장을 감소시킬 것이라는 것을 표시한다.
실시예 19: 항- TREM2 항체의 투여 후 감소한 종양 성장.
항-NSM 항체가 생체내 종양 성장을 감소시킬 수 있는지를 다음에 결정하였다.
MC38 결장 암종을 T0에서 B6 6주령 수컷 마우스로 주사하였다. 종양 이식 후 IP 주사에 의해 5일, 7일, 11일, 15일에 표시된 항체에 의해 처리 군으로 무작위화된 마우스를 처리하였다. 투약: 항-PD-1 및 Fc 대조군에 대해 200㎍/일, 40㎍, 20㎍, 20㎍ 및 40㎍ 주사를 5일, 7일, 11일 및 15일에 항-TREM2(Pi1.2 클론 2) 항체에 대해 만들었다. 종양을 캘리퍼에 의해 측정하고, 종양 용적이 도시되어 있다. 데이터 분석을 위해 각각의 TREM2 및 PD-1 군으로부터 상부 극단치를 제거하였다. 도 19는 항-NSM 항체가 항-PD-1 처리와 동일한 정도로 대조군에 비해 종양 성장을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
실시예 20: 항- NSM 항체를 사용한 종양에서의 NSM 고갈.
대조군 및 각각 TdTomato 및 GFP를 발현하는 NSM 단백질 발현 EL4 형질전환체 세포를 예를 들어 5x10^5개의 각각의 세포 유형과 1:1 비율로 혼합하고, WT B6 수컷 마우스에 IP 주사하였다. 2시간 후에 동물에 항-NSM 항체(예를 들어, 100㎍), Fc 대조군 또는 PBS 대조군을 주사하였다. 24시간 후, 마우스를 희생시키고 복막으로부터 세포를 회수하고, 복막 세척에 의해 수확하고 유세포계측법에 의해 수를 열거하였다. 항-NSM 항체는 생체내 NSM 단백질 보유 세포를 특이적으로 고갈시킨다. 항-NSM 항체는 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및/또는 TMEM119에 결합한다. NSM 단백질은 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및 TMEM119로부터 선택된다.
실시예 21: 항- NSM 항체의 투여 후 감소한 종양 성장.
암 세포(예를 들어, MC38 결장 암종)를 T0에서 B6 6주령 수컷 마우스로 주사하였다. 종양 이식 후 IP 주사에 의해 복수 일(예를 들어, 5일, 7일, 11일, 15일)에 Fc 대조군 또는 항-NSM 항체의 주사에 의해 처리 군으로 무작위화된 마우스를 처리하였다. 예를 들어, Fc 대조군에 대해 200㎍/일; 매일(예를 들어, 5일, 7일, 11일 및 15일) 항-NSM 항체에 대해 40㎍, 20㎍, 20㎍ 및 40㎍와 같이 투약을 결정하였다. 종양을 캘리퍼에 의해 측정하고, 종양 용적을 결정하였다. 항-NSM 항체는 대조군에 비해 종양 성장을 감소시킨다. 항-NSM 항체는 대조군에 비해 실험 마우스에서 종양에 대한 면역 반응을 증대시킨다. 항-NSM 항체는 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및/또는 TMEM119에 결합한다.
실시예 22: 항- NSM 항체와의 동시투여를 통한 면역치료의 증대.
암 세포(예를 들어, MC38 결장 암종)를 T0에서 B6 6주령 수컷 마우스로 주사하였다. 종양 이식 후 IP 주사에 의해 복수 일(예를 들어, 5일, 7일, 11일, 15일)에 Fc 대조군 또는 항-NSM 항체의 주사에 의해 처리 군으로 무작위화된 마우스를 처리하였다. 마우스는 면역치료제를 이전에 받았거나, 동시에 받거나, 후속하여 받을 것이다. 면역치료제는 관문 저해제를 저해하는 면역치료제; T 세포의 관문 저해제를 저해하는 면역치료제; 항-PD1; 항-PDL1; 항-CTLA4; 적응성 T 세포 치료; CAR-T 세포 치료; 수지상 세포 백신; 단핵구 백신; T 세포 및 항원 제시 세포 둘 다에 결합하는 항원 결합 단백질; BiTE 항원 결합 단백질; 톨 유사 수취 리간드; 및/또는 사이토카인을 포함할 수 있다. 매일(예를 들어, 5일, 7일, 11일 및 15일) Fc 대조군에 대해 200㎍/일; 항-NSM 항체에 대해 40㎍, 20㎍, 20㎍ 및 40㎍와 같이 당해 분야에서 이용 가능한 정보 및 통상적인 기술을 이용하여 투약을 결정하였다. 종양을 캘리퍼에 의해 측정하고, 종양 용적을 결정하였다. 면역치료제와의 항-NSM 항체의 동시투여는 비동시투여 대조군(예를 들어, 단일치료)에 비해 종양 성장의 감소를 증대시킨다. 면역치료제와의 항-NSM 항체의 동시투여는 비동시투여 대조군(예를 들어, 단일치료)에 비해 종양에 대한 면역 반응을 증대시킨다. 항-NSM 항체는 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및/또는 TMEM119에 결합한다.
실시예 23: 면역치료제 반응자 대 비반응자에서의 SDC 한계치 분석.
어떤 SDC 백분율 한계치 값이 ROC 곡선을 통해 암을 가지는 대상체에서 면역치료의 개시 전에 반응자 대 비반응자 상태를 통계적으로 표시한다는 것을 다음에 결정하였다.
ROC 곡선은 항-PD-1에 의한 처리 전에 인간 흑색종 환자로부터 취해진 HLA-DR+의 분획으로서 CD45+ 또는 %BDCA3의 분획으로서 %BDCA3에 대한 데이터를 이용하였다. 이것은 % BDCA3+ 값이 변하면서 반응자/비반응자 2진 시스템의 성능을 작도한다. 곡선은 최적 한계치 설정에서 위양성율(FPR)에 대한 진양성율(TPR)을 작도함으로써 생성된다. 진양성율은 신호 검출에서 민감도로 또한 공지되어 있다. 위양성율은 탈락으로 또한 공지되어 있고 (1-특이성)으로 계산될 수 있다. 넓은 곡선 하 면적은 특이성에 대한 높은 감수성으로 한계치 값 및 이에 따른 높은 예측 값을 나타낸다.
R에서 pROC 소프트웨어 패키지에 의해 실행된 바대로 DeLong 방법을 이용하여 예측자로서의 BDCA3의 추가의 검증을 얻었다. 백분율 DC/HLA+를 위해, AUC의 95% CI가 [0.76-1](AUC=0.905 [0.76-1])인 것으로 예상된다. 2000개의 계층화된 부트스트랩된 반복검증에 의해, 부트스트랩 방법을 이용하여, CI=[0.73-1](AUC=0.905 [0.73-1]). pct/CD45+를 위해, DeLong 예상치는 95% CI:[0.59-0.98](AUC=0.786 [0.59-0.98]), 및 부트스트랩 [0.57-0.95](AUC=0.786 [0.57-0.95])이다. 도 20은 (A) 결과에 대한 BDCA3+ 대 CD45+ 비율의 ROC 분석; 및 (B) 결과에 대한 BDCA3+ 대 HLA-DR+ 비율의 ROC 분석을 보여준다.
이것은 1.347%의 한계치 BDCA3+/HLADR+ 백분율을 사용하는 것은 환자가 반응자라는 것을 고려하여 BDCA3+ 높은 결과의 확률이 89%(소위 민감도)이고, 환자가 비반응자라는 것을 고려하여 BDCA3+ 낮은 결과의 확률이 86%인(소위 민감도) 것이라는 것을 보여준다. 이것은 종양에서의 HLA-DR+ 세포 중에 약 1.347% 이상으로 종양에서의 SDC의 백분율을 증가시키는 것이 이전에 투여되거나, 진행 중이거나, 다가올, 또는 그 외 암 면역치료제에 반응하여 아마도 증가할 것이다는 것을 나타낸다. 예를 들어, (예를 들어, FLT3L의 사용을 통해) SDC 수를 증가시키고/시키거나, (예를 들어, 항-NSM 항체의 사용을 통해) NSM 수를 감소시킴으로써 이러한 증가가 달성될 수 있다.
실시예 24: FLT3 -L 처리에 의한 종양에서의 SDC 집단의 증대.
암 세포(예를 들어, MC38 결장 암종)를 T0에서 B6 6주령 수컷 마우스로 주사하였다. 종양 이식 후 I.P., I.V. 및/또는 S.C. 주사에 의해 복수 일(예를 들어, 5일, 7일, 11일, 15일)에 FLT3-L 또는 PBS 대조군의 주사에 의해 처리 군으로 무작위화된 마우스를 처리하였다. 당해 분야에서 이용 가능한 정보 및 통상적인 기술(예를 들어, 100㎕의 PBS 중의 10㎍)을 이용하여 투약을 결정하였다. 종양 성장에 걸쳐 복수의 시점에, 동물을 희생시키고, SDC 및 NSM 존재비를 유세포계측법에 의해 분석한다. 종양 발생을 통한 FLT3-L 처리는 종양에서의 SDC 존재비를 증대시킨다.
실시예 25: 증가한 SDC 집단으로 인한 FLT3 -L에 의한 처리 후 감소한 종양 성장.
암 세포(예를 들어, MC38 결장 암종)를 T0에서 B6 6주령 수컷 마우스로 주사하였다. 종양 이식 후 I.P., I.V. 및/또는 S.C. 주사에 의해 복수 일(예를 들어, 5일, 7일, 11일, 15일)에 FLT3-L 또는 PBS 대조군의 주사에 의해 처리 군으로 무작위화된 마우스를 처리하였다. 당해 분야에서 이용 가능한 정보 및 통상적인 기술(예를 들어, 100㎕의 PBS 중의 10㎍)을 이용하여 투약을 결정하였다. 종양을 캘리퍼에 의해 측정하고, 종양 용적을 결정하였다. FLT3-L 처리는 대조군에 비해 종양 성장을 감소시킨다. FLT3-L 처리는 종양에서의 SDC 존재비, 및 dLN, 비장 및 골수(BM)에서의 SDC 집단을 증대시킨다. FLT3-L은 대조군에 비해 실험 마우스에서 종양에 대한 면역 반응을 증대시킨다.
실시예 26: FLT3 -L과의 동시투여를 통한 면역치료의 증대.
암 세포(예를 들어, MC38 결장 암종)를 T0에서 B6 6주령 수컷 마우스로 주사하였다. 종양 이식 후 I.P., I.V. 및 또는 S.C. 주사에 의해 복수 일(예를 들어, 5일, 7일, 11일, 15일)에 FLT3-L 또는 PBS 대조군의 주사에 의해 처리 군으로 무작위화된 마우스를 처리하였다. 마우스는 면역치료제를 이전에 받았거나, 동시에 받거나, 후속하여 받을 것이다. 면역치료제는 관문 저해제를 저해하는 면역치료제; T 세포의 관문 저해제를 저해하는 면역치료제; 항-PD1; 항-PDL1; 항-CTLA4; 적응성 T 세포 치료; CAR-T 세포 치료; 수지상 세포 백신; 단핵구 백신; T 세포 및 항원 제시 세포 둘 다에 결합하는 항원 결합 단백질; BiTE 항원 결합 단백질; 톨 유사 수취 리간드; 및/또는 사이토카인을 포함할 수 있다. 당해 분야에서 이용 가능한 정보 및 통상적인 기술(예를 들어, 100㎕의 PBS 중의 10㎍)을 이용하여 투약을 결정하였다. 종양을 캘리퍼에 의해 측정하고, 종양 용적을 결정하였다. 면역치료제와의 FLT3-L의 동시투여는 비동시투여 대조군(예를 들어, 단일치료)에 비해 종양 성장의 감소를 증대시킨다. 면역치료제와의 FLT3-L의 동시투여는 비동시투여 대조군(예를 들어, 단일치료)에 비해 종양에 대한 면역 반응을 증대시킨다. 또한, Curran 등, Lynch 등, Chen 등, Peron 등 및 Shurin 등의 문헌을 참조한다.
실시예 27: SDC는 작동제 항- FLT3 항체를 통해 자극을 표적화한다 .
암 세포(예를 들어, MC38 결장 암종)를 T0에서 B6 6주령 수컷 마우스로 주사하였다. 종양 이식 후 I.P. 주사에 의해 복수 일(예를 들어, 5일, 7일, 11일, 15일)에 항-FLT3 항체 또는 Fc 대조군의 주사에 의해 처리 군으로 무작위화된 마우스를 처리하였다. 당해 분야에서 이용 가능한 정보 및 통상적인 기술(예를 들어, Fc 대조군에 대해 200㎍/일; 항-FLT3 항체에 대해 40㎍, 20㎍, 20㎍ 및 40㎍)을 이용하여 투약을 결정하였다. 종양 성장에 걸쳐 복수의 시점에, 동물을 희생시키고, SDC 및 NSM 존재비를 유세포계측법에 의해 분석한다. 종양 발생을 통한 항-FLT3 작동제 항체 처리는 종양에서의 SDC 존재비, 및 dLN, 비장 및 BM에서의 SDC 집단을 증대시킨다.
실시예 28: 증가한 SDC 집단으로 인해 작동제 항- FLT3 항체에 의한 처리 후 감소한 종양 성장.
암 세포(예를 들어, MC38 결장 암종)를 T0에서 B6 6주령 수컷 마우스로 주사하였다. 종양 이식 후 I.P. 주사에 의해 복수 일(예를 들어, 5일, 7일, 11일, 15일)에 작동제 항-FLT3 항체 또는 Fc 대조군의 주사에 의해 처리 군으로 무작위화된 마우스를 처리하였다. 당해 분야에서 이용 가능한 정보 및 통상적인 기술(예를 들어, Fc 대조군에 대해 200㎍/일; 항-FLT3 항체에 대해 40㎍, 20㎍, 20㎍ 및 40㎍)을 이용하여 투약을 결정하였다. 종양을 캘리퍼에 의해 측정하고, 종양 용적을 결정하였다. 항-FLT3 항체 처리는 대조군에 비해 종양 성장을 감소시킨다. 항-FLT3 항체 처리는 종양에서 SDC 존재비, 및 dLN, 비장 및 BM에서 SDC 집단을 증대시킨다. 항-FLT3L 작동제 항체는 대조군에 비해 실험 마우스에서 종양에 대한 면역 반응을 증대시킨다.
실시예 29: 작동제 항- FLT3 항체와의 동시투여를 통한 면역치료의 증대.
암 세포(예를 들어, MC38 결장 암종)를 T0에서 B6 6주령 수컷 마우스로 주사하였다. 종양 이식 후 I.P., I.V. 및 또는 S.C. 주사에 의해 복수 일(예를 들어, 5일, 7일, 11일, 15일)에 항-FLT3 항체 또는 PBS 대조군의 주사에 의해 처리 군으로 무작위화된 마우스를 처리하였다. 마우스는 면역치료제를 이전에 받았거나, 동시에 받거나, 후속하여 받을 것이다. 면역치료제는 관문 저해제를 저해하는 면역치료제; T 세포의 관문 저해제를 저해하는 면역치료제; 항-PD1; 항-PDL1; 항-CTLA4; 적응성 T 세포 치료; CAR-T 세포 치료; 수지상 세포 백신; 단핵구 백신; T 세포 및 항원 제시 세포 둘 다에 결합하는 항원 결합 단백질; BiTE 항원 결합 단백질; 톨 유사 수취 리간드; 및/또는 사이토카인을 포함할 수 있다. 당해 분야에서 이용 가능한 정보 및 통상적인 기술(예를 들어, 100㎕의 PBS 중의 10㎍)을 이용하여 투약을 결정하였다. 종양을 캘리퍼에 의해 측정하고, 종양 용적을 결정하였다. 면역치료제와의 항-FLT3 항체의 동시투여는 비동시투여 대조군(예를 들어, 단일치료)에 비해 종양 성장의 감소를 증대시킨다. 면역치료제와의 항-FLT3 항체의 동시투여는 비동시투여 대조군(예를 들어, 단일치료)에 비해 종양에 대한 면역 반응을 증대시킨다.
실시예 30: 인간 세포에서의 NSM 단백질의 발현.
도 21은, 1차 인간 HNSC 종양 조직에서 SDC(BDCA3+ DC)를 포함하는 CD14 음성 CD11c 양성 세포에서 아주 적은 발현을 가지거나 발현이 없는, NSM 집단(CD14+ TAM)에 대한 TREM2 단백질의 제한된 발현을 입증한다. TREM2 특이적 상업용 항체(RnD, 클론 237920) 염색을 2차 대조군 염색(항-랫트 IgG, 잭슨 이뮤노리서치)과 비교하여 분해된 인간 HNSC 종양 조직에서 수행하고, 유세포계측법에 의해 분석하였다. 이 도면은 NSM 세포에서의 NSM 유전자 생성물의 특이적 발현 및 인간 종양 조직에서의 SDC 세포에서 발현의 결여를 보여준다. 생, CD45+, 계통 음성, HLA-DR+, CD11c+에서 게이팅되고 CD14 발현에 의해 분할된 집단.
본 발명이 바람직한 실시형태 및 다양한 대안적인 실시형태를 참조하여 특히 도시되고 기재되어 있지만, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 상세내용의 다양한 변화가 이루어질 수 있다는 것이 관련 분야의 당업자에 의해 이해될 것이다.
본 명세서의 실체 내에 인용된 모든 참고문헌, 발행 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.
서열
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참고문헌
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<110> THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA <120> MODULATION OF STIMULATORY AND NON-STIMULATORY MYELOID CELLS <130> IF17P055/US <150> US 62/056,569 <151> 2014-09-28 <150> US 62/129,883 <151> 2015-03-08 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 1 Gly Phe Asn Leu Ser Ser Ser Tyr 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 2 Ile Ser Ser Ser Tyr Gly Ser Thr 1 5 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Ala Arg Ala His Tyr Val Trp Tyr Gly Ser Val Tyr Ala His Ser Tyr 1 5 10 15 Gly Gly Met Asp Tyr 20 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 4 Gln Ser Val Ser Ser Ala 1 5 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Ser Ala Ser 1 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Gln Gln Trp Ser Gly Gly Tyr Ser Gly Leu Ile Thr 1 5 10 <210> 7 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Gly Tyr Ser 85 90 95 Gly Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Leu Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Ser Ser Tyr Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala His Tyr Val Trp Tyr Gly Ser Val Tyr Ala His Ser Tyr 100 105 110 Gly Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 9 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Ser Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Gly Tyr Ser 85 90 95 Gly Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 115 120 125 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 130 135 140 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 165 170 175 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 180 185 190 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 195 200 205 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 10 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 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Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 355 360 365 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 11 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5

Claims (88)

  1. 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법으로서, 상기 비자극성 골수성 세포를, 상기 비자극성 골수성 세포에 결합하고 상기 대상체의 암 조직에서 상기 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키기에 효과적인 양으로 존재하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하고, 임의로 상기 비자극성 골수성 세포는 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에 있고, 임의로 상기 비자극성 골수성 세포의 사멸, 불능 또는 고갈은 상기 암 조직의 양 또는 용적을 감소시킴으로써 상기 대상체를 치료하고, 임의로 상기 접촉 단계는 상기 면역 세포의 집단에서 자극성 골수성 세포 대 비자극성 골수성 세포의 비율을 증가시키고, 임의로 상기 접촉 단계는 상기 면역 세포의 집단에서 비자극성 골수성 세포 대 자극성 골수성 세포의 비율을 감소시키고, 임의로 상기 접촉 단계는 상기 대상체에서 면역 반응을 증대시키고, 임의로 상기 접촉 단계는 상기 암 조직의 밖에 존재하는 골수성 세포 및/또는 상기 암 조직에 존재하는 자극성 골수성 세포를 실질적으로 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키지 않는, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및 TMEM119로 이루어진 군으로부터 선택된 비자극성 골수성 세포에서 발현된 표적 단백질의 세포외 도메인에 결합하고, 상기 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD11c+, CD14+ 및 BDCA3-이고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC) 또는 보체 의존적 세포독성(complement-dependent cytotoxicity; CDC)을 통해, 상기 비자극성 골수성 세포와 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 접촉 전에 상기 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포의 수준보다 낮은 수준으로, 상기 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키고, 상기 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+, BDCA1- 및 BDCA3+인 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에 존재하고, 상기 접촉 단계는 상기 암 조직의 밖에 존재하는 골수성 세포 및/또는 상기 암 조직에 존재하는 자극성 골수성 세포를 실질적으로 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키지 않고, 상기 비자극성 골수성 세포의 사멸, 불능 또는 고갈은 상기 암 조직에 대한 면역 반응을 증대시킴으로써 상기 암을 치료하는, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 비자극성 골수성 세포는, 유세포계측법 또는 동등한 검정에 의해 결정된 바대로, 종양 연관 대식세포; 종양 연관 수지상 세포; CD45+, HLA-DR+, CD11c+, CD14+ 및 BDCA3-; CD45+, HLA-DR+ 및 CD14+; CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+; CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+ 중 적어도 하나이거나; BDCA3+이 아닌, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비자극성 골수성 세포는, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 유전자 어레이, 유세포계측법, RNAseq 또는 동등한 검정에 의해 측정된 바대로, C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2, TLR7 및 LILRB4 중 적어도 하나에 대해 양성이고/이거나; KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1 중 적어도 하나에 대해 음성인, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 활성, 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성 및 항체 매개 식균작용 활성 중 적어도 하나를 가지는, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체, 길항제 항체, 다중클론 항체, IgG1 항체, IgG3 항체, 비푸코실화 항체, 이중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 전장 항체 및 항원 결합 단편 중 적어도 하나인, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG2 항체가 아니거나, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG4 항체가 아닌, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 접합된, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 방사성 핵종, 세포독소, 화학치료제, 약물, 프로드럭, 독소, 효소, 면역조절제, 혈관형성방지제, 세포사멸 촉진제(pro-apoptotic agent), 사이토카인, 호르몬, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 분자, siRNA, 제2 항체 및 제2 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치료제에 접합된, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및 TMEM119 중 적어도 하나에 선택적으로 결합하고, 임의로 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 LILRB4에 선택적으로 결합하지 않는, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 비자극성 골수성 세포의 사멸, 상기 비자극성 골수성 세포의 세포사멸, 상기 비자극성 골수성 세포의 용해, 상기 비자극성 골수성 세포의 식균작용 및 상기 비자극성 골수성 세포의 성장 정지 중 적어도 하나를 유도하는, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극성 골수성 세포는, 유세포계측법 또는 동등한 검정에 의해 결정된 바대로, CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+, BDCA1- 및 BDCA3+; CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+; CD45+, HLA-DR+ 및 BDCA3+; CD45+, HLA-DR+, CD14- 및 BDCA3+; 및 CD45+, HLA-DR+, CD11c+ 및 BDCA3+ 중 적어도 하나인 세포를 포함하는, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극성 골수성 세포는, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 유전자 어레이, 유세포계측법, RNAseq 또는 동등한 검정에 의해 측정된 바대로, C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2, TLR7 및 LILRB4 중 적어도 하나에 대해 음성이고/이거나; KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1 중 적어도 하나에 대해 양성인, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비자극성 골수성 세포는 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에 있는, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 조직은 고형암 또는 액체 암인, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 신장, 간담즙성, 두경부 편평상피 암종(head-neck squamous carcinoma; HNSC), 췌장, 결장, 방광, 교모세포종, 전립선, 폐 및 유방으로 이루어진 군으로부터 선택된, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 면역치료제를 이전에 받았거나, 동시에 받거나, 후속하여 받을 것인, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 면역치료제는 관문 저해제를 저해하는 면역치료제; T 세포의 관문 저해제를 저해하는 면역치료제; 항-PD1; 항-PDL1; 항-CTLA4; 적응성 T 세포 치료제; CAR-T 세포 치료제; 수지상 세포 백신; 단핵구 백신; T 세포 및 항원 제시 세포 둘 다에 결합하는 항원 결합 단백질; BiTE 항원 결합 단백질; 톨 유사(toll 유사) 수취 리간드; 및 사이토카인 중 적어도 하나인, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에서 면역 반응을 증대시키고, 임의로 상기 면역 반응은 면역치료제 기반 면역 반응이고, 임의로 상기 면역치료제 기반 면역 반응은 상기 암에 대해 표적화된, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 자극성 골수성 세포의 활성을 증대시키거나 이의 수를 증가시키는 물질을 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로 상기 물질은 FLT3L인, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에서 암을 치료하는, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 면역 세포의 집단에서 자극성 골수성 세포 대 비자극성 골수성 세포의 비율을 증가시키는, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 종양에 존재하는 전체 CD45+, HLA-DR+ 세포의 종양에 존재하는 1-4% 초과, 1-2%, 1%, 1.37%, 1.6%, 2%, 3% 또는 4%의 자극성 골수성 세포를 가지는 대상체를 발생시키는, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 자극성 골수성 세포 및/또는 비자극성 골수성 세포의 수를 결정하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로 상기 결정 단계는 상기 대상체가 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여로부터 이익을 얻을지를 결정하도록 사용되고, 임의로 상기 결정 단계는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여의 유효성을 모니터링하도록 사용되는, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2, TLR7, LILRB4, KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1 중 적어도 하나의 발현 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 있는, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 조성물은 무균인, 대상체의 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키는 방법.
  29. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 암에 존재하는 비자극성 골수성 세포에 결합하고 상기 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키기에 효과적인 양으로 존재하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 단계를 포함하고, 임의로 상기 비자극성 골수성 세포는 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에 있고, 임의로 상기 비자극성 골수성 세포의 사멸, 불능 또는 고갈은 상기 암 조직의 양 또는 용적을 감소시킴으로써 상기 대상체를 치료하고, 임의로 상기 접촉 단계는 상기 면역 세포의 집단에서 자극성 골수성 세포 대 비자극성 골수성 세포의 비율을 증가시키고, 임의로 상기 접촉 단계는 상기 면역 세포의 집단에서 비자극성 골수성 세포 대 자극성 골수성 세포의 비율을 감소시키고, 임의로 상기 접촉 단계는 상기 암의 밖에 존재하는 골수성 세포 및/또는 상기 암에 존재하는 자극성 골수성 세포를 실질적으로 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키지 않고, 임의로 상기 대상체의 암은 상기 암에 대한 면역 반응을 생성하거나 증대시킴으로써 치료되는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및 TMEM119로 이루어진 군으로부터 선택된 비자극성 골수성 세포에서 발현된 표적 단백질의 세포외 도메인에 결합하고, 상기 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD11c+, CD14+ 및 BDCA3-이고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 통해, 상기 비자극성 골수성 세포와 항체 또는 이의 항원 결합 단편과의 접촉 전에 상기 암 조직에 존재하는 비자극성 골수성 세포의 수준보다 낮은 수준으로, 상기 비자극성 골수성 세포를 사멸시키거나 불능시키거나 고갈시키고, 상기 비자극성 골수성 세포는 CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+, BDCA1- 및 BDCA3+인 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에 존재하고, 상기 비자극성 골수성 세포의 사멸, 불능 또는 고갈은 상기 암을 치료하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 비자극성 골수성 세포는, 유세포계측법 또는 동등한 검정에 의해 결정된 바대로, 종양 연관 대식세포; 종양 연관 수지상 세포; CD45+, HLA-DR+, CD11c+, CD14+ 및 BDCA3-; CD45+, HLA-DR+ 및 CD14+; CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+; CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+ 중 적어도 하나이거나; BDCA3+이 아닌, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비자극성 골수성 세포는, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 유전자 어레이, 유세포계측법, RNAseq 또는 동등한 검정에 의해 측정된 바대로, C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2, TLR7 및 LILRB4 중 적어도 하나에 대해 양성이고/이거나; KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1 중 적어도 하나에 대해 음성인, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC) 활성, 보체 의존적 세포독성(CDC) 활성 및 항체 매개 식균작용 활성 중 적어도 하나를 가지는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체, 길항제 항체, 다중클론 항체, IgG1 항체, IgG3 항체, 비푸코실화 항체, 이중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 전장 항체 및 항원 결합 단편 중 적어도 하나인, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG2 항체가 아니거나, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG4 항체가 아닌, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 접합된, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 방사성 핵종, 세포독소, 화학치료제, 약물, 프로드럭, 독소, 효소, 면역조절제, 혈관형성방지제, 세포사멸 촉진제, 사이토카인, 호르몬, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 분자, siRNA, 제2 항체 및 제2 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치료제에 접합된, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 TREM2, MS4A7, C5AR1, LYVE1, ABCC3, LILRB4, MRC1/CD206, SIGLEC1, STAB1, TMEM37, MERTK 및 TMEM119 중 적어도 하나에 선택적으로 결합하고, 임의로 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 LILRB4에 선택적으로 결합하지 않는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  39. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 비자극성 골수성 세포의 사멸, 상기 비자극성 골수성 세포의 세포사멸, 상기 비자극성 골수성 세포의 용해, 상기 비자극성 골수성 세포의 식균작용 및 상기 비자극성 골수성 세포의 성장 정지 중 적어도 하나를 유도하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  40. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극성 골수성 세포는, 유세포계측법 또는 동등한 검정에 의해 결정된 바대로, CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+, BDCA1- 및 BDCA3+; CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+; CD45+, HLA-DR+ 및 BDCA3+; CD45+, HLA-DR+, CD14- 및 BDCA3+; 및 CD45+, HLA-DR+, CD11c+ 및 BDCA3+ 중 적어도 하나인 세포를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  41. 제29항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극성 골수성 세포는, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 유전자 어레이, 유세포계측법, RNAseq, 또는 동등한 검정에 의해 측정된 바대로, C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2, TLR7 및 LILRB4 중 적어도 하나에 대해 음성이고/이거나; KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1 중 적어도 하나에 대해 양성인, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  42. 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비자극성 골수성 세포는 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단에 있는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  43. 제29항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 고형암 또는 액체 암인, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 신장, 간담즙성, 두경부 편평상피 암종(HNSC), 췌장, 결장, 방광, 교모세포종, 전립선, 폐 및 유방으로 이루어진 군으로부터 선택된, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  45. 제29항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  46. 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 면역치료제를 이전에 받았거나, 동시에 받거나, 후속하여 받을 것인, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 면역치료제는 관문 저해제를 저해하는 면역치료제; T 세포의 관문 저해제를 저해하는 면역치료제; 항-PD1; 항-PDL1; 항-CTLA4; 적응성 T 세포 치료제; CAR-T 세포 치료제; 수지상 세포 백신; 단핵구 백신; T 세포 및 항원 제시 세포 둘 다에 결합하는 항원 결합 단백질; BiTE 항원 결합 단백질; 톨 유사 수취 리간드; 및 사이토카인 중 적어도 하나인, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  48. 제29항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에서 면역 반응을 증대시키고, 임의로 상기 면역 반응은 면역치료제 기반 면역 반응이고, 임의로 상기 면역치료제 기반 면역 반응은 상기 암에 대해 표적화된, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  49. 제29항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 자극성 골수성 세포의 활성을 증대시키거나 이의 수를 증가시키는 물질을 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로 상기 물질은 FLT3L인, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  50. 제29항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 면역 세포의 집단에서 자극성 골수성 세포 대 비자극성 골수성 세포의 비율을 증가시키는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  51. 제29항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 단계는 상기 종양에 존재하는 전체 CD45+, HLA-DR+ 세포의 종양에 존재하는 1-4% 초과, 1-2%, 1%, 1.37%, 1.6%, 2%, 3% 또는 4%의 자극성 골수성 세포를 가지는 대상체를 발생시키는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  52. 제29항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 자극성 골수성 세포 및/또는 비자극성 골수성 세포의 수를 결정하는 단계를 추가로 포함하고, 임의로 상기 결정 단계는 상기 대상체가 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여로부터 이익을 얻을지를 결정하도록 사용되고, 임의로 상기 결정 단계는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여의 유효성을 모니터링하도록 사용되는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  53. 제29항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2, TLR7, LILRB4, KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1 중 적어도 하나의 발현 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  54. 제29항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 있는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 조성물은 무균인, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  56. 종양에 대한 대상체의 면역 반응을 증대시키는 방법으로서, 상기 종양에서 자극성 골수성 세포의 존재비를 증대시키거나 상기 종양에서 비자극성 골수성 세포의 존재비를 감소시키는 유효량의 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 치료제는 상기 종양에 대한 면역 반응을 증대시키고, 임의로 상기 면역 반응은 상기 종양의 용적을 감소시키는, 종양에 대한 대상체의 면역 반응을 증대시키는 방법.
  57. 종양을 가지는 대상체에서 암 면역치료제 치료의 효능을 개선하는 방법으로서, 상기 종양에서 자극성 골수성 세포의 존재비를 증대시키거나 상기 종양에서 비자극성 골수성 세포의 존재비를 감소시키는 유효량의 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 대상체는 상기 암 면역치료제를 이전에 받았거나, 동시에 받거나, 후속하여 받을 것인, 종양을 가지는 대상체에서 암 면역치료제 치료의 효능을 개선하는 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 방법은 FLT3L의 전신 투여 또는 증대를 포함하는, 방법.
  59. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 방법은, 자극성 골수성 세포를 선택적으로 할애하면서, 비자극성 골수성 세포의 제거 또는 감소를 발생시키는, 하나 이상의 항체의 전신 투여를 포함하는, 방법.
  60. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 방법은, CSF1의 발현 또는 작용을 동시에 차단하면서, FLT3L에 의한 대상체의 자가유래 골수 또는 혈액 세포의 치료를 포함하는, 방법.
  61. 제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 방법은 골수 또는 혈액 전구세포 집단에서의 IRF8, Mycl1, 또는 BATF3 또는 ZBTB46의 발현을 증대시키는 단계를 포함하는, 방법.
  62. 대상체로부터의 샘플에서 비자극성 골수성 세포의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서,
    a. 상기 비자극성 골수성 세포 및 자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단을 상기 비자극성 골수성 세포에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계;
    b. 비자극성 골수성 세포에 대한 상기 항체의 결합을 나타내는 복합체의 존재를 결정하는 단계;
    c. 임의로 상기 집단에서의 비자극성 골수성 세포의 수를 정량화하는 단계; 및
    d. 임의로 상기 비자극성 골수성 세포에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 의해 상기 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 대상체로부터의 샘플에서 비자극성 골수성 세포의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
  63. 대상체로부터의 샘플에서 자극성 골수성 세포의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서,
    a. 상기 자극성 골수성 세포 및 비자극성 골수성 세포를 포함하는 면역 세포의 집단을 상기 자극성 골수성 세포에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계;
    b. 자극성 골수성 세포에 대한 상기 항체의 결합을 나타내는 복합체의 존재를 결정하는 단계;
    c. 임의로 상기 집단에서의 자극성 골수성 세포의 수를 정량화하는 단계; 및
    d. 임의로 상기 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 대상체로부터의 샘플에서 자극성 골수성 세포의 존재 또는 부재를 결정하는 방법.
  64. 종양 샘플에서의 비자극성 골수성 세포를 정량화하는 방법으로서, 종양 연관 대식세포; 종양 연관 수지상 세포; CD45+, HLA-DR+ 및 CD14+; CD45+, HLA-DR+, CD14+, BDCA3-, CD11b+ 및 CD11c+; CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA1+ 중 적어도 하나이거나; BDCA3+이 아닌, 세포의 수를 측정하는 단계를 포함하는, 종양 샘플에서의 비자극성 골수성 세포를 정량화하는 방법.
  65. 종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포를 정량화하는 방법으로서, CD45+, HLA-DR+, CD14-, CD11c+ 및 BDCA3+; CD45+, HLA-DR+ 및 BDCA3+; CD45+, HLA-DR+, CD14- 및 BDCA3+; 및 CD45+, HLA-DR+, CD11c+ 및 BDCA3+ 중 적어도 하나인, 세포의 수를 측정하는 단계를 포함하는, 종양 샘플에서의 비자극성 골수성 세포를 정량화하는 방법.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 상기 세포는 세포 분류 방법에 의해 정량화된, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 세포 분류 방법은 형광 활성화된 세포 분류, 유세포계측법, 자기 활성화된 세포 분류, 마이크로래프트 분류 및 친화도 기반 세포 분리로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.
  68. 종양 샘플에서의 비자극성 골수성 세포를 정량화하는 방법으로서, C5AR1, LYVE1, ABCC3, MRC1, SIGLEC1, STAB1, C1QB, C1QA, TMEM37, MERTK, C1QC, TMEM119, MS4A7, APOE, CYP4F18, TREM2, TLR7 및 LILRB4의 비자극성 골수성 세포 마커 중 적어도 하나의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 종양 샘플에서의 비자극성 골수성 세포를 정량화하는 방법.
  69. 종양 샘플에 존재하는 자극성 골수성 세포를 정량화하는 방법으로서, KIT, CCR7, BATF3, FLT3, ZBTB46, IRF8, BTLA, MYCL1, CLEC9A, BDCA3 및 XCR1의 자극성 골수성 세포 마커 중 적어도 하나의 발현을 측정하는 단계를 포함하는, 종양 샘플에 존재하는 자극성 골수성 세포를 정량화하는 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 상기 마커의 발현은 정량적 PCR에 의해 측정된, 방법.
  71. 제68항 또는 제69항에 있어서, 마커 유전자 발현의 정량화는 마커 유전자 서열에 대한 부동화 프로브를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 어레이를 사용하여 달성되는, 방법.
  72. 제64항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 샘플은 종양의 침생검, 펀치 생검 또는 수술 절제에 의해 종양으로부터 얻어진, 방법.
  73. 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법으로서, 상기 대상체로부터 종양 샘플을 얻는 단계; 및 상기 대상체로부터 유래한 종양 샘플에서 상기 자극성 골수성 세포의 존재비를 측정하는 단계를 포함하는, 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 평가된 암 상태는 암 재발의 가능성이고; 상기 종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포의 상승된 존재비는 암 재발의 가능성의 감소를 나타내는, 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 평가된 암 상태는 면역치료제 치료에 대한 상기 대상체의 순응성이고; 상기 종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포의 상승된 존재비는 상기 대상체가 면역치료제 치료에 양성으로 반응할 것이라는 가능성의 증가를 나타내는, 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법.
  76. 제73항에 있어서, 상기 평가된 암 상태는 면역치료제 치료의 유효성이고; 상기 종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포의 상승된 존재비는 효과적인 면역치료제 치료를 나타내는, 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법.
  77. 제73항에 있어서, 상기 평가된 암 상태는 예상된 암 생존 시간이고; 상기 종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포의 상승된 존재비는 예상된 암 생존 시간의 증가를 나타내는, 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법.
  78. 제74항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 자극성 골수성 세포의 상승된 존재비는 대표적인 종양 샘플의 풀에서 관찰된 자극성 골수성 세포의 중앙값 또는 평균 존재비를 초과하는 존재비인, 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법.
  79. 제73항에 있어서, 상기 자극성 골수성 세포의 존재비는 상기 샘플에 존재하는 자극성 골수성 세포 대 비자극성 골수성 세포의 비율로서 측정되는, 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법.
  80. 제73항에 있어서, 상기 자극성 골수성 세포의 존재비는 상기 샘플에 존재하는 자극성 골수성 세포 대 전체 골수성 세포의 비율로서 측정되는, 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법.
  81. 제73항에 있어서, 상기 자극성 골수성 세포의 존재비는 상기 샘플에 존재하는 자극성 골수성 세포 대 전체 HLA-DR+ 세포의 비율로서 측정되는, 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 자극성 골수성 세포의 상승된 존재비는 100개의 HLA-DR+ 세포당 1.37개 초과의 자극성 골수성 세포로서 정의된, 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법.
  83. 제75항 또는 제76항에 있어서, 상기 면역치료제 치료는 항-PD1 치료인, 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 항-PD1 치료는 니볼루맙 또는 펨브로미주랍의 투여인, 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법.
  85. 제83항에 있어서, 상기 대상체는 흑색종을 가지는, 환자에서의 암 상태를 평가하는 방법.
  86. 종양에서 자극성 골수성 세포의 존재비를 증가시키는 치료제의 유효성을 평가하는 방법으로서, 암을 가지는 하나 이상의 대상체에게 치료제를 투여하는 단계; 및 상기 하나 이상의 대상체로부터 유래한 하나 이상의 종양 샘플에서 상기 자극성 골수성 세포의 존재비를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 하나 이상의 종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포의 증가한 존재비는 상기 물질이 효과적이라는 것을 나타내는, 종양에서 자극성 골수성 세포의 존재비를 증가시키는 치료의 유효성을 평가하는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 자극성 골수성 세포의 증가한 존재비는 상기 치료제의 투여 전에 상기 하나 이상의 대상체로부터 얻은 하나 이상의 종양 샘플에서 관찰된 상기 하나 이상의 종양 샘플에서의 자극성 골수성 세포의 더 높은 존재비로 정의되는, 종양에서 자극성 골수성 세포의 존재비를 증가시키는 치료의 유효성을 평가하는 방법.
  88. 제86항에 있어서, 자극성 골수성 세포의 증가한 존재비는 비치료된 대상체로부터의 대표적인 종양 샘플의 풀에서 관찰된 것보다 치료된 대상체로부터의 하나 이상의 종양 샘플에서의 골수성 세포의 더 높은 존재비로 정의되는, 종양에서 자극성 골수성 세포의 존재비를 증가시키는 치료의 유효성을 평가하는 방법.
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