KR20170061499A - 미세유체 소자를 이용한 다공성 마이크로스피어 또는 나노 복합체 마이크로스피어의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미세유체 소자를 이용한 다공성 마이크로스피어 또는 나노 복합체 마이크로스피어의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세유체 소자(microfluidic device)를 사용함으로써 잘 형성된 구형 모양 및 평균 직경에 있어서 높은 단분산성을 보이는 채널형 기공을 갖는 다공성 마이크로스피어를 제조하는 방법, 및 상기 미세유체 제조과정 중에 자성 나노입자(magnetic nanoparticle, MNP)를 도입하여 마이크로스피어의 구조 및 크기의 단분산성에 영향을 주지 않으면서 자성 나노 복합체 마이크로스피어를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

미세유체 소자를 이용한 다공성 마이크로스피어 또는 나노 복합체 마이크로스피어의 제조방법{Preparation method of porous microspheres or nanocomposite microspheres using a microfluidic device}

본 발명은 미세유체 소자를 이용한 다공성 마이크로스피어 또는 나노 복합체 마이크로스피어의 제조방법에 관한 것이다.

마이크로스피어 시스템은 결함있는 조직의 필러 및 단백질, 약물 등 치료적 인자의 담체로 광범위하게 사용되고 있다. 또한, 마이크로스피어는 주입가능성 및 큰 표면적 때문에 줄기세포, 간세포 또는 조직특이적 세포 등 조직 세포의 유망한 담체로 여겨진다. 따라서, 시험관 내 세포 전달 능력 및 생체 내 조직 재생능력을 가지는 마이크로스피어 물질을 제조하기 위하여 많은 노력이 있었다.

마이크로스피어의 화학적 성질 및 형태는 세포 담체로의 효과적인 사용에 있어서 중요한 요소이다. 물질의 표면은 기본적으로 부착성 세포의 행동을 좌우하기 때문에, 표면 화학은 세포 유인성일 것을 요한다. 또한, 생분해성의 정도와 비독성 분해 생성물은 또다른 중요한 화학적 성질이다. 그러므로, 칼슘 포스페이트 시멘트, 생체활성 유리, 천연 및 합성 고분자, 합성물 등 생체적합한, 분해 가능한 다양한 물질들이 마이크로스피어 제조에 이용되었다. 화학적 성질과 더불어, 마이크로스피어 물질의 형태학 또한 고려되어야 한다. 마이크로스피어가 채널을 갖거나 다공성으로 제조된 경우, 이러한 구조가 신혈관형성 영양 공급(neo-vascularization nutrient supply)을 가능케 하므로, 세포 담체로서의 역할을 더 효과적으로 수행한다는 것은 잘 알려져 있다. 또한, 다공성 구조가 치밀질 구조보다 넓은 표면적 및 부피를 가지므로 세포가 더욱 많이 담지될 수 있다.

이러한 관점에서, 본 발명자들은 캄펜을 기공형성제(포로젠)로 하여 다공성 폴리(ε-카프로락톤)(PCL) 마이크로스피어를 제조하고, 이의 세포를 위한 미세 담체로서의 잠재성을 확인한 바 있다(H. W. Kim et al., Macromol . Biosci ., 2009, 9, 639-645; H. W. Kim et al., RSC Adv ., 2014, 4, 29062). PCL은 FDA 승인을 받은 생분해성 합성 고분자로서, 의료기기 및 조직공학 물질로 오랫동안 사용되어 왔다. 캄펜은 이중고리 모노터펜 중의 하나로서, 비독성이고 진공에서 쉽게 승화하며, 저온(< 40℃)에서 고화되는 동안 수지상 성장을 보인다. 이러한 이유로, 캄펜은 세라믹 및 금속성 다공성 지지체의 가공에 있어서 기공형성제로 사용되어 왔다. 상기와 같은 방법으로 본 발명자들은 매크로포어(> 50 ㎛)를 갖는 PCL 마이크로스피어를 제조하였고, 간엽 줄기 세포가 공극 채널 속으로 침투할 수 있음을 확인하였다. 담체 물질로서, 마이크로스피어의 크기는 생체 분자의 양 또는 세포의 수의 1차적 결정요인이다. 그러나, 상기 방법을 이용할 경우, 제조되는 마이크로스피어의 직경이 광범위하게 다양하며, 조직적으로 조절될 수 없음을 관찰하였다. 마이크로스피어가 보다 균일하고 조절된 크기 및 구조로 제조될 수 있는 경우, 생산 규모를 스케일 업하고 세포를 전달하는 특성 및 생물학적 활성이 향상될 것이고, 궁극적으로 재현가능하고 효과적인 마이크로담체 시스템이 될 수 있다.

본 발명의 목적은 잘 형성된 구형 모양 및 평균 직경에 있어서 높은 단분산성을 보이는 채널형 기공을 갖는 다공성 마이크로스피어를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 제1양태는 하나의 샘플유로, 상기 샘플유로를 기준으로 대칭으로 위치하는 2개의 시스유로, 및 상기 샘플유로와 시스유로가 만나는 유로접합부를 포함하는 미세유체채널 소자를 준비하는 제1단계; 폴리에스테르계 고분자; 유기용매; 및 기공형성제를 포함하는 유상을 제조하는 제2단계; 친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조하는 제3단계; 미세유체 채널의 시스유로로는 상기 수상을, 샘플유로로는 상기 유상을 흘려주는 제4단계; 및 기공형성제를 제거하는 제5단계를 포함하는 구형의 몸체 표면 및 내부에 기공이 형성된 다공성 마이크로스피어의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제2양태는 하나의 샘플유로, 상기 샘플유로를 기준으로 대칭으로 위치하는 2개의 시스유로, 및 상기 샘플유로와 시스유로가 만나는 유로접합부를 포함하는 미세유체채널 소자를 준비하는 제a단계; 폴리에스테르계 고분자; 자성 나노입자; 유기용매; 및 기공형성제를 포함하는 유상을 제조하는 제b단계; 친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조하는 제c단계; 미세유체 채널의 시스유로로는 상기 수상을, 샘플유로로는 상기 유상을 흘려주는 제d단계; 및 기공형성제를 제거하는 제e단계를 포함하는 구형의 몸체 표면 및 내부에 기공이 형성된 다공성의 자성 나노 복합체 마이크로스피어의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 미세유체 소자(microfluidic device)를 사용함으로써 잘 형성된 구형 모양 및 평균 직경에 있어서 높은 단분산성을 보이는 채널형 기공을 갖는 다공성 마이크로스피어를 제조할 수 있음을 발견하였다. 이때 마이크로스피어의 평균 크기는 시스 유속 및 기공형성제의 함량을 조절함으로써 조절할 수 있으며, 마이크로스피어의 기공 채널 구조, 예를 들어 기공 채널의 평균 크기는 고화 온도 및 기공형성제의 함량으로 조절함으로써 조절할 수 있음을 발견하였다. 또한, 자성 나노입자(magnetic nanoparticle, MNP)를 미세유체 제조과정 중에 도입하여 마이크로스피어의 구조 및 크기의 단분산성에 영향을 주지 않으면서 자성 나노 복합체 마이크로스피어를 제조할 수 있음을 발견하였다. 본 발명은 이에 기초한다.

본 발명에서 사용하는 용어, "미세유체 소자(microfluidic device)"는 수십 내지 수백 마이크로미터 영역의 크기를 가진 미세유로를 사용하여 매우 적은 양의 유체를 생산하는 소자를 의미하며, 미세유체 시스템 또는 마이크로플루이딕 시스템(microfluidic system)이라고도 불린다.

본 발명에서는 특히 액적기반 미세유체시스템을 사용할 수 있다. 액적기반 미세유체시스템은 서로 섞이지 않는 두 유체를 이용하며, 미세유로 내에서 다양한 조성을 함유한 여러 액적을 형성하고 상호간 분리된 구역을 가지도록 하는 시스템이다. 액적 형성원리는 미세유로의 구조에 따라 T-접합(T-junction), 유체-집속(flow-focusing), 시스 흐름(sheath flow)으로 구분된다. 본 발명에서는 이들 원리 중 바람직하기로 유체-집속에 의해 마이크로스피어를 형성시키는 방식을 사용할 수 있다.

유체-집속 방법은 분산상이 주입되는 유로, 즉 샘플유로를 기준으로 두 개의 연속상이 대칭으로 시스 유로를 통해 주입되는 형태로서 유로접합부에서 연속상, 즉 시스 흐름의 지연응력(dragging stress)에 의해 액적이 형성된다. 유체-집속 방법은 연속상에 의해 대칭적인 지연응력이 발생하므로 T-접합 방법보다 정확하고 안정적인 액적 형성이 가능하다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 구형의 몸체 표면 및 내부에 기공이 형성된 다공성 마이크로스피어의 제조방법은

하나의 샘플유로, 상기 샘플유로를 기준으로 대칭으로 위치하는 2개의 시스유로, 및 상기 샘플유로와 시스유로가 만나는 유로접합부를 포함하는 미세유체채널 소자를 준비하는 제1단계;

폴리에스테르계 고분자; 유기용매; 및 기공형성제를 포함하는 유상을 제조하는 제2단계;

친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조하는 제3단계;

미세유체 채널의 시스유로로는 상기 수상을, 샘플유로로는 상기 유상을 흘려주는 제4단계; 및

기공형성제를 제거하는 제5단계를 포함한다.

상기 제1단계는, 샘플유로, 시스유로 및 유로접합부를 포함하는 미세유체채널 소자를 준비하는 단계이다.

상기 미세유체채널 소자는 통상의 방법으로 직접 제작되거나 또는 시판되는 것을 입수하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 미세유체채널 소자는 폴리디메틸실록산(PDMS)을 이용하여 소프트 리소그래피법(soft lithography)으로 제작된 것을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 미세유체채널 소자의 일 실시 양태는 도 1에 나타낸 바와 같다. 도 1을 보면, 기판 상에 하나의 샘플유로, 2개의 시스유로 및 상기 샘플유로와 시스유로가 만나는 유로접합부가 형성되어 있다. 또한, 상기 샘플유로로 PCL 등의 폴리에스테르계 고분자 함유 유상을 주입하기 위한 주입구가 기판 내부에 형성되어 있고, 상기 2개의 시스유로 각각에 PVA 등의 계면활성제 함유 수상을 주입하기 위한 주입구가 기판 외부 측면에 형성되어 있다. 상기 2개의 시스유로는 샘플유로를 기준으로 대칭으로 위치하며 샘플유로의 외부 측면에서 도입되어 유로접합부에서 샘플유로와 만난다. 상기 유로접합부는 샘플 수집부(sample collecting part)와 연결되며 상기 샘플 수집부 말단에 마이크로스피어가 배출되는 배출구가 위치한다. 상기 유로접합부에서 액적이 형성되며 형성된 액적은 샘플 수집부에서 수상에 의해 유기용매가 추출되면서 일정 수준으로 고화되어 입자, 즉 마이크로스피어를 형성하고, 상기와 같이 형성된 마이크로스피어가 배출구를 통해 배출된다. 상기와 같이 미세유체채널 소자로부터 배출된 마이크로스피어는 수상 배쓰 내에서 완전히 고화된 다음 기공형성제를 승화시켜 다공성 마이크로스피어를 형성할 수 있다.

상기 제2단계는, 샘플유로를 통해 주입시키기 위한 분산상으로서, 폴리에스테르계 고분자; 유기용매; 및 기공형성제를 포함하는 유상을 제조하는 단계이다.

상기 폴리에스테르계 고분자는 생분해성 고분자의 일종으로 생체 내에서 일정 기간 후 자발적으로 서서히 분해되는 것으로, 혈액 친화성, 세포 친화성 및 조직 친화성 중에서 하나 이상의 특성을 갖춘 고분자를 말한다. 상기 폴리에스테르계 고분자는 본 발명에서 특별히 그 종류를 한정하지는 않으며, 대표적으로 폴리(ε-카프로락톤)(PCL), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 이들의 공중합체 및 이들의 블렌드로 이루어진 군에서 선택되는 1종이 가능하다. 상기 폴리에스테르계 고분자는 중량평균 분자량이 5,000 내지 2,000,000 달톤, 보다 바람직하게는 10,000 내지 100,000 달톤 범위인 것을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 이때 폴리에스테르계 고분자의 함량은 다공성 마이크로스피어가 용이하게 형성될 수 있도록 고분자 용액 중 1 내지 20 중량%인 것이 바람직하다.

상기 유상에 사용되는 유기용매는 폴리에스테르계 고분자와 기공형성제를 용해시킬 수 있는 것이면 제한없이 사용 가능하며, 바람직한 유기 용매로 소수성 및 휘발성이 강한 것을 사용할 수 있다. 예를 들어 클로로포름, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 테트라하이드로퓨란, 디메틸설폭사이드 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 1종을 사용할 수 있다. 이때 유기 용매의 함량은 전체 유상의 중량 기준으로 3 내지 85 중량%인 것이 바람직하다.

본 발명의 기공형성제는 최종 제조되는 다공성 마이크로스피어에 열린 기공 구조를 부여하기 위해 첨가되는 것으로, 대기 조건에서 승화에 의해 제거될 수 있는 것이면 특별히 한정하지 않는다. 바람직하게는 20 내지 60℃의 융점을 가진 것을 사용한다. 대표적으로 캄펜, 캠포르, 나프탈렌, 멘톨, 티몰, 쿠마린, 바닐린, 살리실아미드, 2-아미노피리딘, t-부탄올, 트리클로로-t-부탄올, 이미다졸, 디메틸설폰, 우레아, 2-아미도피리딘 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종이 가능하다, 바람직하기로는 캄펜을 사용한다.

본 발명에서는 기공형성제의 함량을 조절함으로써 마이크로스피어의 평균 크기 및 기공 구조를 조절할 수 있다. 상기 기공형성제의 함량은 전체 유상의 중량 기준으로 10 내지 30 중량%로 조절할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실험예에서는 기공형성제로서 캄펜의 함량을 0 내지 40%(w/v)로 달리하여 마이크로스피어를 제조한 결과, 기공형성제의 함량을 전체 유상의 중량 기준으로 10 내지 30 중량%로 조절한 경우 230 내지 320㎛ 수준의 단분산성 마이크로스피어를 제조할 수 있으며, 균일하고 작은 채널형 기공을 형성시킬 수 있음을 확인하였다(실험예 3, 표 2). 반면에, 기공형성제를 사용하지 않은 경우에는 채널형 기공이 없는 밀집한 마이크로스피어가 형성되고, 기공형성제의 함량이 40%(w/v)에 도달한 경우에는 고르지 못한 구조의 기공이 형성되는 것을 확인하였다(실험예 3, 도 5).

상기 제3단계는, 시스유로를 통해 주입시키기 위한 연속상으로서, 친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조하는 단계이다.

상기 친수성 용매는 물, C_{1 -4} 알코올 또는 이의 혼합용매일 수 있으며, 바람직하기로 물을 사용할 수 있다.

본 발명의 수상은 유상인 고분자 용액과 친수성 용매 사이의 계면을 조정하기 위해 계면활성제를 포함할 수 있다. 상기 계면활성제는 HLB(hydrophilic-lipophilic balance) 값이 10 이상인 것이면 어떠한 것이든 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 계면활성제는 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐부티럴, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐에테르 및 이들의 혼합물 등이 가능하다. 계면활성제의 사용량은 제조되는 다공성 마이크로스피어의 입경을 고려하여 수상 중 0.1 내지 10 중량%가 바람직하다.

상기 제4단계는, 미세유체 채널의 시스유로로는 상기 수상을, 샘플유로로는 상기 유상을 흘려주어 마이크로스피어를 형성시키는 단계이다.

본 발명에서는 상기 수상의 유속, 즉 시스 유로의 유속을 조절함으로써 마이크로스피어의 평균 크기를 조절할 수 있다. 바람직하기로, 상기 수상의 유속은 10 내지 25 ml/h 으로 조절할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 수상의 유속 범위에서 마이크로스피어의 평균 크기를 384 내지 607 ㎛ 수준으로 조절할 수 있음을 확인하였다(실험예 1, 도 2).

상기 수상은, 샘플유로를 통해 주입되는 분산상인 유상과 상의 차이를 가져, 마이크로스피어의 구형 모양을 유지하면서 유상으로부터 유기용매를 추출함으로써 마이크로스피어를 어느 정도 고화시킬 수 있다. 이러한 미세유체 소자 내에서의 수상에 의한 고화는 유기용매의 추출로 인한 것으로 완전한 고화를 위하여 상기 제4단계 이후에 바람직하기로 상기 제4단계에서 형성된 마이크로스피어를 수상을 담고 있는 배쓰 내에서 교반하여 고화시키는 제4-1단계를 추가로 수행할 수 있다.

상기 제4-1단계에서 수상은 대기 조건에서 승화하는 기공형성제를 승화를 방지하고, 고화를 유도하기 위해서 기공형성제의 융점 이하로 냉각되며, 사용하는 기공형성제가 갖는 융점에 따라 달라지는데, 바람직하게는 60 ℃ 미만으로 냉각할 수 있다.

본 발명에서는 상기 고화 온도를 조절함으로써 기공 채널의 평균 크기를 조절할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 고화 온도를 4, 25 및 35℃로 달리하여 다공성 마이크로스피어를 제조한 결과, 4℃에서 기공 채널의 평균 크기가 가장 작았고 온도가 높아질수록 기공 채널의 평균 크기가 점차 증가하는 것을 확인하였다(실험예 2, 도 4).

상기 제5단계는, 기공형성제를 제거하여 구형의 몸체 표면 및 내부에 기공을 형성시키는 단계이다.

본 발명에서 사용되는 기공형성제는 제조공정에서 사용되는 용액의 융점 이상의 온도로 가열하지 않아도 동결건조 또는 대기조건에서 승화에 의해 쉽게 제거된다. 기공형성제의 융점 이하로 냉각된 수상에서 유기 용매의 증발에 의해 폴리에스테르계 고분자와 함께 고화되었던 기공 형성제는 동결건조 온도 또는 상온에서 승화하여 마이크로스피어에 서로 연결된 열린 기공 구조를 형성한다.

상기 제5단계의 기공형성제 제거 시간은 10분 내지 100 시간 동안 수행할 수 있다. 이때 기공 형성 시간이 상기 범위 미만이면 충분한 기공을 형성할 수 없고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하더라도 더 이상의 효과가 없어 비경제적이다.

또한, 본 발명은 자성 나노입자를 미세유체 제조과정 중에 도입하여 마이크로스피어의 구조 및 크기의 단분산성에 영향을 주지 않으면서 자성 나노 복합체 마이크로스피어를 제조할 수 있어 크기 조절가능하고 단분산성인 채널형 기공을 갖는 나노복합소재를 제공할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 자성 나노입자를 유상에 추가로 첨가하여 미세유체채널 소자를 이용하여 자성 나노입자가 결합된 다공성 마이크로스피어를 제조하는 경우에도 채널형 기공 구조를 가지며 단분산성, 즉 크기 균일성을 갖는 자성 나노입자가 결합된 다공성 마이크로스피어를 용이하게 제조할 수 있음을 확인하였다(실시예 2).

전술한 바와 같이 본 발명에 따른 구형의 몸체 표면 및 내부에 기공이 형성된 다공성의 자성 나노 복합체 마이크로스피어의 제조방법은

하나의 샘플유로, 상기 샘플유로를 기준으로 대칭으로 위치하는 2개의 시스유로, 및 상기 샘플유로와 시스유로가 만나는 유로접합부를 포함하는 미세유체채널 소자를 준비하는 제a단계;

폴리에스테르계 고분자; 자성 나노입자; 유기용매; 및 기공형성제를 포함하는 유상을 제조하는 제b단계;

친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조하는 제c단계;

미세유체 채널의 시스유로로는 상기 수상을, 샘플유로로는 상기 유상을 흘려주는 제d단계; 및

기공형성제를 제거하는 제e단계를 포함한다.

상기 제b단계는 자성 나노입자를 유상에 추가로 첨가하는 것을 제외하고는 상기 본 발명에 따른 구형의 몸체 표면 및 내부에 기공이 형성된 다공성 마이크로스피어의 제조방법의 제2단계와 동일하다.

상기 자성 나노입자는 통상의 제조방법으로 제조되거나 시판 제품을 입수하여 사용할 수 있다.

상기 제a단계 및 제c단계 내지 제e단계는 각각 상기 본 발명에 따른 구형의 몸체 표면 및 내부에 기공이 형성된 다공성 마이크로스피어의 제조방법의 제1단계 및 제3단계 내지 제5단계와 동일하다.

본 발명에 따른 구형의 몸체 표면 및 내부에 기공이 형성된 다공성 마이크로스피어의 제조방법은 미세유체 소자(microfluidic device)를 사용함으로써 잘 형성된 구형 모양 및 평균 직경에 있어서 높은 단분산성을 보이는 채널형 기공을 갖는 다공성 마이크로스피어를 제조할 수 있다. 또한, 상기 미세유체 제조과정 중에 자성 나노입자(magnetic nanoparticle, MNP)를 도입하여 마이크로스피어의 구조 및 크기의 단분산성에 영향을 주지 않으면서 자성 나노 복합체 마이크로스피어를 제조할 수 있다.

도 1A는 단분산성 마이크로스피어를 제조하기 위한 PDMS 마이크로플루이딕 칩의 광학 이미지, 도 1B는 상기 마이크로플루이딕 칩을 사용한 마이크로스피어 제조 과정을 도식적으로 나타낸 개념도, 도 1C는 상기 PDMS 칩에서 수집된 PCL 마이크로스피어의 광학 이미지, 도 1D는 기공 형성 메커니즘을 도식적으로 나타낸 개념도이다.
도 2는 시스 유속에 따른 마이크로스피어의 크기를 보여주는 광학 현미경 이미지이다.
도 3은 본 발명에 따라 미세유체법으로 제조된 마이크로스피어의 SEM 이미지로서, 기공 구조에 대한 고화 조건의 영향을 보여주는 것이다.
도 4는 고화 온도에 따른 마이크로스피어의 SEM 모폴로지를 보여주는 것이다.
도 5는 마이크로스피어의 다공 구조에 대한 캄펜 함량의 영향을 보여주는 SEM 이미지이다.
도 6은 자성 나노입자가 도입된 나노 복합체 마이크로스피어의 광학 이미지(A, B) 및 SEM 이미지(C, D)(스케일 바 = 10㎛)이다. 이때 화살표는 자성 나노입자를 가리킨다.

이하，본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐，실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 미세유체법을 이용한 채널형 PCL 마이크로스피어의 제조

미세유체 소자의 제작

폴리디메틸실록산(PDMS) 미세유체칩(Microfludic chip)은 폴리디메틸실록산(PDMS) 칩을 통상의 소프트 리소그래피(Soft lithography)를 이용하여 준비하였다. 상기 미세유체칩은 샘플 흐름을 위한 한 개의 내부 주입구, 시스 흐름을 위한 두 개의 외부 주입구, 샘플 및 시스 흐름을 위한 유로 접합부, 즉 유체-집속 접합부(flow-focusing junction), 샘플 수집부(collection part) 및 배출구로 구성되었다(도 1B). 미세유체칩은 컴퓨터 지원 설계(CAD) 프로그램으로 디자인하였고, 고해상도 포토-마스크 시트 상에 프린트하였다. 스핀 코팅에 의해 300 ㎛의 포토레지스트(SU-8, 13020117, 마이크로켐, 미국)가 코팅된 실리콘 웨이퍼에 포토-마스크 시트를 올리고 자외선(UV)을 20초간 조사하였다. UV 조사 후에, 반응하지 않은 포토레지스트는 현상액(1-메톡시-2-프로판올 아세테이트)으로 헹구어 제거하였다. 패턴화된 실리콘 몰드에 PDMS 프리폴리머 및 가교제(실가드 184 실리콘 엘라스토머 키트, 다우 코닝, 미들랜드, 미시건)의 혼합물(중량비 10:1)을 붓고 진공 데시케이터 내에서 1시간 동안 탈기시켰다. 70℃에서 2시간 동안 처리 후, PDMS칩을 실리콘 마스터 몰드에서 떼고, 세 개의 용액 주입구를 바늘(ground needle)로 뚫었다. PDMS칩을 70 W에서 30초간 산소 플라즈마 처리(큐트, 펨토 사이언스, 대한민국)한 후에 슬라이드 글라스 기판에 올리고 70℃에서 2시간 동안 고화하였다. 미세유체공정을 위한 PDMS칩의 광학 이미지는 도 1A에 나타내었다.

미세유체소자를 이용한 채널형 PCL 마이크로스피어의 제조

채널형 PCL 마이크로스피어를 수중 유형(oil-in-water) 방법으로 제조하였다. 샘플 용액으로서, 유상 PCL/캄펜 용액을 준비하였다. 간략히 설명하면, 먼저 PCL(폴리(ε-카프로락톤); 시그마, 80000, 미국)을 3% w/v 농도로 클로로포름(대정, 119.38, 대한민국)에 녹였다. PCL 마이크로스피어의 미세기공을 얻기 위하여 기공형성제로서 올리고머릭 폴리에스테르의 한 종류인 캄펜(C₁₀H₁₆, 시그마, 미국)을 클로로포름에 다양한 농도(0 - 40% w/v)로 녹였다. 균질 용액이 형성될 때까지 교반한 후, 캄펜 및 PCL 용액을 부피비 1:1로 섞고, 혼합물을 4시간 동안 더 교반하였다. 동시에, 증류수에 2% w/v 농도로 녹이면서 24시간 동안 80℃에서 교반하여 시스 용액으로 사용하기 위한 수상인 폴리비닐알코올 수용액(PVA; 시그마, 85000-124000, 미국)을 준비하였다.

소수성 PCL 마이크로스피어를 수중 유형(O/W) 에멀전에 기반하여 제조하였다. 여기서 샘플 흐름인 클로로포름 중의 PCL/캄펜, 시스 흐름인 PVA 수용액은 각각 유상 및 수상으로 준비하였고, PDMS칩의 각 주입구로 동시에 주입하였다.

시스 액체는 마이크로스피어의 미세유체제조에 있어 몇 가지 역할을 한다. 첫째로, 시스 흐름은 윤활 막을 제공함으로써 샘플 흐름을 칩 벽으로부터 분리시킨다. 둘째로, PVA 용액은 상의 차이로 인해 마이크로스피어의 구형 모양을 유지하면서 PCL/캄펜 용액으로부터 클로로포름을 추출함으로써 마이크로스피어를 고화시킨다.

생성된 PCL 마이크로스피어는 구형이었고, PDMS칩에 수집되었을 때 균일한 크기를 보였다(도 1C). 고체 마이크로스피어의 형태를 보존하기 위하여 이후의 고화 단계가 필수적이므로, 수집부를 갖춘 PVA 배쓰(bath)에 모은 다음 교반하여 완전히 고화하였다. 고화된 PCL 마이크로스피어는 얼음으로 냉각된 증류수로 씻어내고, 정량 여과지(quantitative filter paper)(어드밴텍, 일본)로 거른 후, 동결건조 하였다. 고화된 캄펜은 동결건조 중에 승화하여, 미세기공 채널을 형성하였다. 다공성 PCL 마이크로스피어는 계속해서 사용하기 위해 -20 ℃에서 보관하였다. 기공 생성을 위한 간단한 메커니즘을 도 1D에 나타내었다.

제조된 마이크로스피어의 분석

순수한 PCL의 고화 전후의 평균 크기 및 크기 분포를 각각 광학 현미경(Ix71, 올림푸스, 일본) 및 주사전자현미경(SEM; JSM-6510, JEOL, 일본) 이미지로 분석하였다. 각각의 광학 및 SEM 이미지의 임의로 선택된 영역에서 100개의 마이크로스피어를 임의로 선택하였고, 마이크로스피어의 평균크기 및 분포를 계산하였다. 다공성 PCL 마이크로포어에 대하여 다양한 캄펜 함량 또는 고화 파라미터에 따른 마이크로스피어의 기공 구조 또한 조사하였다.

실험예 1: 마이크로스피어 크기에 미치는 유속의 영향

미세유체에 의하여 제조되는 마이크로스피어의 크기는 미세유체채널에서의 샘플 및 시스 유속을 조절함으로써 조절하였다. 20% 캄펜을 대표 조성으로 하여 마이크로스피어 크기에 미치는 유속의 영향을 시험하였다.

상온에서 샘플 및 시스 용액 모두를 PDMS칩의 하나의 내부 주입구 및 두 개의 외부 주입구에 주입하였다. 샘플 및 시스 흐름을 각각 조절하기 위하여, 두 개의 주사기펌프(KDS-100, KD 사이언티픽, 미국)를 사용하였다. 과정 중에 샘플 유속은 1 ml/h로 고정하고, 시스 유속은 10 내지 25 ml/h로 변화시켰다. 클로로포름에 의한 화학적 손상을 방지하기 위하여, PDMS칩 및 주사기를 폴리(테트라플루오로에틸렌) (PTFE) 튜브와 연결하였다. 미세유체법으로 제조된 후 PDMS 칩의 샘플 수집부를 통과한 PCL 마이크로스피어(도 1C)를 PVA 용액 배쓰에 모아 고화하기 위하여 300 rpm으로 3시간 동안 교반하였다.

도 2는 고정된 샘플 유속(1ml/h) 및 다양한 시스 유속; (A) 10, (B) 15, (C) 20, 및 (D) 25 ml/h 에 의해 생성된 PCL/캄펜 마이크로스피어 (20% 캄펜) 광학 현미경 이미지이다. 미세유체제조된 PCL/캄펜 마이크로스피어는 완벽히 구형이며, 우수한 크기 균일성을 보였다. 평균 크기는 시스 유속이 10 ml/h 에서 25 ml/h 로 증가함에 따라 607 ㎛에서 384 ㎛로 감소하였다.

마이크로스피어의 크기는 샘플 및 시스 유속간의 비율에 의해 크게 영향을 받았다. 미세유체를 이용한 제조과정 중, 샘플 용액의 액적이 유체-집속 접합부(flow-focusing junction)에 형성되었고, 시스 흐름이 유속에 비례하는 지연응력(dragging stress)을 액적에 가하는 동안 샘플 용액이 흐르면서 자라났다. 견인력(dragging force)은 지연응력과 액적 크기의 곱에 비례한다. 액적은 견인력이 샘플 흐름의 장력(tension)을 초과할 때 샘플 흐름으로부터 떨어진다. 그러므로, 시스 유속이 증가할 때, 충분한 견인력을 위해 필요한 액적 크기는 감소하였다.

생성된 마이크로스피어의 평균 크기 및 표준편차 값을 하기 표 1에 나타내었다. 평균 크기에 대한 표준편차의 비율인 변동계수(coefficient of variance, CV)는 시스템의 '단분산성'을 결정하는 데 있어 중요한 파라미터 중 하나이다. 본 발명에서, 25 ml/h 의 높은 시스 유속을 가지는 고화된 마이크로스피어를 제외한 모든 샘플에 대하여, CV 값은 5% 이하였으며, 이는 미국 국립표준기술연구소(NIST)의 단분산의 정의에 따르면 단분산성이 있다고 여겨지는 것이다. 이러한 발견은 크기 조절 가능한 단분산 마이크로스피어가 미세유체시스템에 의해 쉽게 형성될 수 있다는 것을 시사한다.

실험예 2: 마이크로스피어의 기공 구조에 미치는 고화 파라미터의 영향

채널 형성은 고화 과정에서 일어나기 때문에, 마이크로스피어의 기공 구조 및 고화 파라미터 간의 관계를 조사하였다.

본 실험예에서, 캄펜 함량, 샘플 유속 및 시스 유속은 20%(w/v), 1 ml/h, 및 15 ml/h 로 각각 고정하였다. 생성된 마이크로스피어는 고화를 위하여 PVA 용액에 모았다. 마이크로스피어의 고화는 PVA 배쓰의 교반 속도(0 및 300 rpm) 및 온도(4, 25 및 35℃)를 포함하여 다양한 조건에서 수행하였다.

2-1. 교반 속도

마이크로스피어의 고화가 PVA 용액에서 클로로포름의 추출에 의해 일어나기 때문에, PVA 배쓰를 300rpm으로 교반시킴으로써 고화 시간은 24시간에서 3시간으로 줄어들 수 있었다. 도 3은 다양한 교반 속도에 의해 채널형 PCL 마이크로스피어의 SEM 이미지를 보여준다. 마이크로스피어의 크기는 여전히 단분산성을 가지며(도 3A), 마이크로채널은 균일하게 마이크로스피어에 형성되는 것(도 3B, C)을 확인하였다. 또한 마이크로스피어의 평균 크기는 45% 정도까지 감소된 것을 확인하였다. 비록 마이크로스피어의 표면 층은 이미 PDMS칩에서 고화되었지만, 여전히 마이크로스피어에 클로로포름이 존재하였다. PVA 배쓰에서의 고화 과정 중에, 클로로포름은 제거되었고, PCL은 밀집되었다. 그러므로, 고화된 마이크로스피어의 평균 크기는 처음 생성된 마이크로스피어에 비해 작았다. 다양한 시스 유속에 의한 고화된 마이크로스피어의 평균 직경 및 표준편차를 상기 표 1에 요약하였다.

2-2. 고화 온도

도 4A-C는 각각 4, 25 및 35 ℃에서 고화된 채널형 PCL 마이크로스피어의 SEM이미지이다. 채널 크기는 고화 온도가 4 ℃ 일 때 가장 작았고, 온도가 높아질수록 점차 증가하였다. 각 고화 온도에서의 평균 기공 크기를 측정하였다(도 4D).

실험예 3: 마이크로스피어의 크기 및 기공 구조에 미치는 캄펜 함량의 영향

캄펜 함량이 마이크로스피어의 크기 및 미세구조에 미치는 영향에 대하여 시험하였다. 본 실험예에서, 샘플 및 시스 유속 및 고화 과정 파라미터는 각각 1 ml/h, 15 ml/h, 300 rpm, 및 25 ℃로 고정하였으며, 반면 캄펜 함량은 0 내지 40%(w/v)로 달리하였다.

도 5는 서로 다른 캄펜 함량을 가지는 마이크로스피어의 SEM 이미지를 나타낸 것이다; (A, F) 0%, (B, G) 10%, (C, H) 20%, (D, I) 30% 및 (E, J) 40%. 그 결과, 캄펜이 없을 때는 밀집한 PCL 마이크로스피어가 생성되었다. 반면에, 캄펜 함량이 10%인 경우는 균일하고 작은 채널형 기공이 관찰되었다. 기공 크기는 캄펜 함량이 30%까지 증가함에 따라 증가하였다. 기공 벽의 크기 역시 캄펜 함량 증가에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 캄펜 함량이 40%에 도달하였을 때, 고르지 못한 구조의 기공이 형성되었다. 또한 기공 벽은 다른 조건에 비하여 훨씬 두꺼웠으며, 많은 작은 크기의 기공들이 기공 벽에 형성되었다. 기공 구조는 캄펜 결정의 수지상 성장과 밀접한 관련이 있다. 일반적으로, 고체 내용물들은 캄펜의 수지상 성장을 저해하여, 기공 구조의 틀인 캄펜 수지상 조직을 좁아지게 만든다. 벽에 형성되는 작은 기공들은 캄펜 수지상 조직의 2차 가지 때문에 생성된다. 다양한 캄펜 함량에 의해 처음 생성된, 그리고 고화된 마이크로스피어의 평균 직경 및 평균 기공 크기를 하기 표 2에 나타내었다.

처음 생성된 마이크로스피어는 캄펜 함량에 관계없이 비슷한 평균 직경을 보였다(이미지 미도시). 그러나, 고화 이후 평균 직경의 감소가 캄펜 함량에 크게 의존하는 것을 쉽게 관찰하였다. 다시 말해서, 고화된 마이크로스피어의 평균 직경은 캄펜 함량이 증가함에 따라 증가하였다. 캄펜의 부피가 무시할 수 있을 정도가 아니기 때문에, 만일 제조된 마이크로스피어의 부피가 동일하다면, 클로로포름의 부피는 캄펜 함량이 증가함에 따라 현저하게 줄어든다. 그러므로, 고화 후 마이크로스피어의 최종 부피는 캄펜 함량이 증가함에 따라 증가한다. 마이크로스피어 지름의 감소율이 캄펜 부존재시 가장 높았다는 점은 주목할 점이었다.

캄펜 함량을 다양하게 하여 제조된 모든 마이크로스피어의 크기 분포는 매우 단분산성이었다. 심지어 본 발명에서 기록된 최대 CV값(~6%)은 PCL 마이크로스피어를 종래 교반 방법(stirring method)으로 성장시킨 본 발명자의 선행 연구의 최소 CV값(~22.5%)보다 훨씬 작았다(Hae-Won Kim et al., Macromol. Biosci., 2009, 9(7), 639-645). 이 결과는 미세유체시스템을 마이크로스피어 제조에 사용하는 주된 이점을 뒷받침 한다.

실시예 2: 미세유체법으로 제조된 채널형 PCL 마이크로스피어를 이용한 나노복합체 마이크로스피어의 제조

채널형 마이크로스피어의 미세유체제조는 나노복합체 구성의 제조에도 적용될 수 있다. 대표적인 나노입자로서, 자성 세포 배양 장치 등 미래의 생체의학적 적용가능성을 시험하기 위하여 자성 나노입자(magnetic nanoparticles, MNPs)를 사용하였다.

이를 위해, MNPs는 졸-겔 법을 이용하여 준비하였다(K. Dashnyam, R. A. Perez, R. K. Singh, E.-J. Lee and H.-W. Kim, RSC Adv., 2014, 4, 40841-40851)_. 간략히 설명하면, 1 M HCl 중의 아이언(II) 클로라이드 테트라하이드레이트(FeCl₂·4H₂O) 및 아이언(III) 클로라이드 헥사하이드레이트(FeCl₃·6H₂O) 혼합물을 30분 동안 격렬하게 교반하면서 1.5 M NaOH용액에 적가하였다. 반응 후, 침전물을 원심분리로 고립하고, 40 ℃에서 건조하였다.

준비한 MNPs를 PCL 용액에 PCL 대비 1 및 5 중량% 농도로 혼합하고, 다공성을 얻기 위하여 20% 캄펜 용액을 PCL/MNP용액과 섞었다. 샘플 및 시스 유속은 각각 1 ml/h 및 15 ml/h 이었으며, 생성된 마이크로스피어는 25 ℃에서 교반(300 rpm, 3시간)하여 고화하였다. MNP-결합 다공성 PCL 마이크로스피어의 미세구조는 SEM으로 관찰하였다.

광학 이미지는 순수한 PCL 마이크로스피어와는 다른, 박혀있는 MNP로 인한 위상차가 있는(phase-contrasted) 다공성 구조를 보여준다(도 6A-B). 나노복합체 마이크로스피어는 거의 같은 크기의 잘 형성된 구형을 나타냈다. 1 및 5 wt% MNP와 함께 최초 생성된 마이크로스피어의 평균 직경은 각각 415.5 ± 13.6 및 444.3 ± 10.5 μm 이었다. 고화 후, 마이크로스피어의 평균 크기는 처음 크기의 45% 정도인 225.9 ± 15.8 및 245.7 ± 17.8 μm로 줄어들었으며, 크기 균일성은 유지되었다. 나노복합체 마이크로스피어는 또한 모든 조성에서 기공 채널 형성을 보였다(도 6C-D). 자세히 살펴보면(삽입된 이미지), MNP의 존재가 드러난다. 이 결과는 MNP 결합이 생체고분자 PCL의 채널형 마이크로스피어 생성을 위한 미세유체장치의 능력을 제한하지 않음을 나타낸다. 또한, 이 결과는 미세유체제조된 채널형 마이크로스피어를 자성 나노 복합체 마이크로스피어의 제조에 활용할 수 있음을 보여준다. 상기 제조된 자성 나노복합체 채널형 마이크로스피어는 세포 배양 및 조직 공학에서 적용을 위하여 고려될 수 있다.

Claims (9)

1. 하나의 샘플유로, 상기 샘플유로를 기준으로 대칭으로 위치하는 2개의 시스유로, 및 상기 샘플유로와 시스유로가 만나는 유로접합부를 포함하는 미세유체채널 소자를 준비하는 제1단계;
   폴리에스테르계 고분자; 유기용매; 및 기공형성제를 포함하는 유상을 제조하는 제2단계;
   친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조하는 제3단계;
   미세유체 채널의 시스유로로는 상기 수상을, 샘플유로로는 상기 유상을 흘려주는 제4단계; 및
   기공형성제를 제거하는 제5단계를 포함하는 구형의 몸체 표면 및 내부에 기공이 형성된 다공성 마이크로스피어의 제조방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 폴리에스테르계 고분자는 폴리(ε-카프로락톤)(PCL), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 이들의 공중합체 및 이들의 블렌드로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 유기용매는 클로로포름, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트, 아세토니트릴, 테트라하이드로퓨란, 디메틸설폭사이드 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 기공형성제는 캄펜, 캠포르, 나프탈렌, 멘톨, 티몰, 쿠마린, 바닐린, 살리실아미드, 2-아미노피리딘, t-부탄올, 트리클로로-t-부탄올, 이미다졸, 디메틸설폰, 우레아, 2-아미도피리딘 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 기공형성제의 함량은 전체 유상의 중량 기준으로 10 내지 30 중량%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 친수성 용매는 물, C_{1 -4} 알코올 또는 이의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐부티럴, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐에테르 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
8. 제1항에 있어서, 상기 수상의 유속은 10 내지 25 ml/h 인 것을 특징으로 하는 제조방법.
   
9. 하나의 샘플유로, 상기 샘플유로를 기준으로 대칭으로 위치하는 2개의 시스유로, 및 상기 샘플유로와 시스유로가 만나는 유로접합부를 포함하는 미세유체채널 소자를 준비하는 제a단계;
   폴리에스테르계 고분자; 자성 나노입자; 유기용매; 및 기공형성제를 포함하는 유상을 제조하는 제b단계;
   친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조하는 제c단계;
   미세유체 채널의 시스유로로는 상기 수상을, 샘플유로로는 상기 유상을 흘려주는 제d단계; 및
   기공형성제를 제거하는 제e단계를 포함하는 구형의 몸체 표면 및 내부에 기공이 형성된 다공성의 자성 나노 복합체 마이크로스피어의 제조방법.

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