KR20170061802A

KR20170061802A - 생달나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR20170061802A
Application number: KR1020150166700A
Authority: KR
Inventors: 서민재; 조영철; 최봉석; 정보미; 오득실; 박화식; 조정희; 조현우; 정호경; 장지훈; 안병관; 정원석; 심미옥
Original assignee: 전라남도; 재단법인 전남생물산업진흥원; 한약진흥재단
Priority date: 2015-11-26
Filing date: 2015-11-26
Publication date: 2017-06-07

Abstract

본 발명은 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 상기 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물은 티로시나아제의 활성을 억제하고, 멜라닌의 생성을 억제하며, 멜라닌 합성관련 인자들의 발현을 억제하는 효과가 우수하므로, 피부 미백을 위한 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물은 세포에 대한 독성이 거의 없으므로 피부 미백을 위한 화장료 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

Description

구실잣밤나무 또는 생달나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물{Composition for skin whitening comprising extract of Castanopsis cuspidata var. sieboldii or Cinnamomum japonicum Siebold}

본 발명은 구실잣밤나무 또는 생달나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 티로시나아제 활성, 멜라닌 생성, 및 멜라닌 합성 관련 인자들의 발현을 억제시키는 효과를 나타내는 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 사람의 눈동자, 머리 및 피부색은 피부 내 멜라닌의 농도와 분포에 따라 결정되기도 하고, 멜라닌의 종류에 따라서도 달라지기도 하지만, 자외선이나 스트레스 등 다양한 환경 및 생리적인 요소들에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌세포(melanocyte)에서 아미노산의 일종인 티로신이 멜라닌 세포의 멜라노좀에서 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 도파로 산화되어 도파크롬으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 효소적 산화과정 및 비효소적 산화과정을 거쳐 생성된다. 이런 멜라닌의 생성과 합성에는 대표적인 영향인자로 자외선이 있고, 그 밖에도 유전적 요인과 환경적 요인, 호르몬, 식품, 의약품 등의 화학물질 등이 작용한다. 이러한 멜라닌은 일정량의 자외선을 흡수하여 피부를 보호하고 체온을 유지해주는 역할을 하지만, 심한 자극을 받게 될 경우 과생성된 멜라닌이 침착되어 주근깨, 노인성 반점, 기미, 갈색 또는 흑점, 일광 색소반, 상처 또는 피부염으로 인한 염증후 과색소침착, 광독성 반응 등이 일어날 수 있다.

최근 동양권 여성들은 하얗고 깨끗한 피부를 선호하며, 이를 미의 중요한 기준으로 삼고 있기 때문에 피부색소 이상침착의 치료 및 미용욕구 충족을 위한 미백제에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있다. 현재 피부미용을 위한 미백제의 개발에 있어서, 생성된 멜라닌 색소를 환원시켜 탈색하는 방법과 멜라닌 색소를 형성하는 효소인 티로시나제의 활성을 억제하는 방법이 알려져 있다. 그러나 멜라닌 색소를 환원시키기 위해 사용되는 토코페롤이나 비타민류 등을 사용한 미백제는 멜라닌 색소의 탈색효과가 미미한 것으로 알려져 있으므로 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 저해제에 관한 연구가 다수 진행되고 있다.

종래에는 피부 미백이나 피부 과색소 침착증을 개선하기 위하여, 히드로퀴논(hydroquinone), 아스콜빈산(ascorbic acid), 코직산(kojic acid), 글루타치온(glutathione) 및 시스테인(cysteine)과 같은 티로시나제에 대해 저해 활성을 갖는 물질을 사용하여 왔다. 그러나, 히드로퀴논은 소정의 미백효과를 발휘하지만 피부자극성이 심하여 배합량을 극소량으로 제한해야 하는 문제점이 있고, 아스콜빈산은 산화되기 쉬워 이를 배합한 화장료의 경우 변색, 변취되는 등의 문제가 발생하며, 코직산은 용액 내에서 불안전하여 화장료의 제조공정이 복잡해진다는 단점이 있다. 또한, 글루타치온 및 시스테인 등의 티올계 화합물은 특유의 불쾌한 냄새를 가질 뿐만 아니라 경피흡수에도 문제점이 있고, 이들의 배당체 및 유도체들도 극성이 높으므로 화장료의 배합 성분으로 사용하기는 어렵다. 그 외에 비타민 C의 경우 수용액 상태에서 쉽게 산화되어 지속적인 효과를 내지 못하는 문제점이 있다.

이에 따라 최근에는 천연 생약재 추출물들을 포함하는 피부 미백용 조성물들이 개발되고 있다. 이의 예로서, 한국특허등록 제1428873호에서는 파리풀 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 대하여 개시하고 있으며, 한국특허등록 제1415997호에서는 인삼열매 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 대하여 개시하고 있으며, 한국특허등록 제1408019호에서는 동백나무 열매 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 대하여 개시하고 있다.

한편, 구실잣밤나무(Castanopsis cuspidata var. sieboldii)는 참나무과에 속하는 상록활엽 교목으로, 열매는 날로 먹거나 구워서 먹고, 떡이나 묵에 넣어서 먹기도 한다고 보고되어 있다. 또한, 최근에는 열매의 영양성분 분석이나 식의약품 소재의 활용도에 연구들이 이루어지고 있다. 그러나, 구실잣밤나무의 열매 이외에 잎과 줄기 등에 대한 효능은 잘 알려져 있지 않으며, 특히 미백에 대해서는 전혀 알려져 있지 않은 실정이다.

생달나무(Cinnamomum japonicum Siebold)는 녹나무과에 속하는 상록활엽 교목으로, 맵고 단맛을 낸다. 한방에서는 나무껍질과 열매를 천축계라는 약재로 쓰는데, 상기 나무껍질과 열매에는 펠란드렌(phellandrene), 유게놀(eugenal), 메틸 유게놀(methyleugenal) 등의 성분이 함유되어 있어 주로 위의 소화력을 높이고, 구토, 이질, 신경통 등을 치료하는데 효과가 있다고 보고되어 있다. 또한 생달나무의 잎은 향기가 짙어 예로부터 차의 대용으로 사용되어 왔다. 그러나, 생달나무의 미백 용도에 대해서는 전혀 알려져 있지 않은 실정이다.

이에 본 발명자들은 자원식물로서 활용가치가 높은 구실잣밤나무의 잎과 생달나무를 이용하여 얻은 추출물이 세포 독성이 없으면서도 미백 효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 티로시나아제 활성, 멜라닌 생성, 및 멜라닌 합성 관련 인자들의 발현을 억제함으로써 우수한 피부 미백 효과를 갖는 구실잣밤나무 잎 추출물, 또는 생달나무 추출물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기와 같은 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 구실잣밤나무 또는 생달나무는 난대 상록 활엽 교목으로서 이의 천연, 잡종, 또는 변종을 포함한다.

본 발명에 있어서, 추출물은 구실잣밤나무 잎 또는 생달나무로부터 통상의 방법에 의하여 추출하거나 이로부터 분리된 티로시나아제 활성, 멜라닌 생성, 및/또는 멜라닌 합성관련 인자들의 발현을 억제하는 활성을 가지는 물질을 말한다.

본 발명에 있어서, 상기 생달나무 추출물은 생달나무의 잎, 가지, 꽃, 뿌리, 또는 껍질, 바람직하게는 잎 또는 가지를 통상의 방법을 사용하여 추출하거나 이로부터 분리된 물질을 말한다.

본 발명에서 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물은 당분야에 공지된 통상적인 추출용매를 사용하여 추출할 수 있으며, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 이때, 상기 추출용매는 예를 들어, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름 또는 (g) 1,3-부틸렌글리콜을 추출 용매로 하여 수득할 수 있다. 바람직하게는, 메탄올, 에탄올 또는 부탄을 이용하여 추출하는 것이 좋다. 추출용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 추출용매를 선택하여 사용하도록 한다. 상기 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.

또한, 상기 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물은 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물을 수득할 수 있다.

하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 구실잣밤나무 잎 추출물은 티로시나아제 활성, 멜라닌 생성, 및 멜라닌 합성관련 인자의 발현을 억제하는 효과를 나타낸다. 특히, 상기 구실잣밤나무 잎 추출물의 티로시나아제 활성 억제 효과는 구실잣밤나무 가지 추출물에 비하여 약 1.3배, 멜라닌 생성 억제 효과는 약 2.3배, 멜라닌 합성관련 인자의 발현 억제 효과는 약 1.3 내지 2배 향상된 효과를 나타낸다.

다른 하나의 구체적 양태로서, 본 발명의 생달나무 추출물은 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생성을 억제하는 효과를 나타낸다.

따라서, 본 발명의 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 미백을 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 피부 미백용 조성물에 포함되는 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물은 전체 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 15.0 중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 10 중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 5 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 하나의 구체적 용도로서, 본 발명의 상기 조성물은 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용되는 경우, 유효성분으로서 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 구체적 실시예에서 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물은 세포독성이 없는 물질임이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물은 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

본 발명의 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물은 티로시나아제의 활성을 억제하고, 멜라닌의 생성을 억제하며, 멜라닌 합성관련 인자들의 발현을 억제하는 효과가 우수하므로, 피부 미백을 위한 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물은 세포에 대한 독성이 거의 없으므로 피부 미백을 위한 화장료 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

도 1은 구실잣밤나무 잎 및 가지 추출물, 또는 생달나무 잎 및 가지 추출물이 B16F10 세포의 독성에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 2는 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 구실잣밤나무 가지 추출물에 의한 B16F10 세포에서 티로시나아제 활성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 생달나무 잎 추출물 또는 생달나무 가지 추출물에 의한 B16F10 세포에서 티로시나아제 활성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 구실잣밤나무 가지 추출물에 의한 B16F10 세포에서 멜라닌 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 생달나무 잎 추출물 또는 생달나무 가지 추출물에 의한 B16F10 세포에서 멜라닌 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 구실잣밤나무 가지 추출물에 의한 멜라닌 합성 관련 인자인 MITF, TRP-1 또는 TRP-2의 발현을 억제하는 효과를 보여주는 그래프이다.

이하, 제조예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 제조예 등은 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 제조예 등에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

제조예 1: 구실잣밤나무 추출물 제조

완도수목원에서 채취한 난대 상록활엽수인 구실잣밤나무의 잎과 가지를 200g씩 칭량하여 100℃가 유지되는 환류추출기를 이용하여 열 수추출하였다. 그 다음 상기 열수 추출물들을 회전 증발기(rotary evaporator)에 넣고 수조 온도 70℃로 감압 농축한 후 동결건조기(일신랩 Lyoph-Pride Series)를 이용하여 콜드트랩 온도 -70℃ 기본설정으로 동결건조를 실시하여 구실잣밤나무 잎 추출물(CCL)과 구실잣밤나무 가지 추출물(CCB)을 제조하였다.

제조예 2: 생달나무 추출물 제조

완도수목원에서 채취한 난대 상록활엽수인 생달나무의 잎과 가지를 200g씩 칭량하여 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 생달나무 잎 추출물(CJL)과 생달나무 가지 추출물(CJB)을 제조하였다.

실험예 1: 구실잣밤나무 추출물 또는 생달나무 추출물의 세포독성 측정

본 발명의 구실잣밤나무 추출물 또는 생달나무 추출물에 의한 세포 독성 효과를 알아보기 위하여, B16F10 흑색종 세포(B16F10 melanoma cell)를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 마우스의 흑색종 세포(Mouse melanoma cell)부터 유래된 B16F10 세포는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받았으며, 페니실린/스트렙토마이신(Penicillin/streptomycin) 100 unit/mL과 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco BRL; Grand Island, NY, USA)가 함유된 DMEM 배지(Gibco BRL; Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃ 및 5% CO₂하에서 배양하였다. 그 다음, 상기 배양된 B16F10 세포를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 희석하여 96-웰 플레이트(well plate)에 웰당 5 × 10⁴cells/mL로 분주한 후, 상기 제조예 1의 구실잣밤나무 추출물 또는 제조예 2의 생달나무 추출물을 농도별로 처리하였다. 구실잣밤나무 추출물 또는 생달나무 추출물의 농도범위는 10~500 μg/mL로 결정하였다. 그 다음, 상기 각웰에 세포 배양액 용량의 1/10 배의 MTS 용해액을 첨가한 후 37℃에서 2시간 동안 배양한 후 ELISA microplate reader(Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보듯이, 구실잣밤나무 잎 추출물(CLL)은 100 μg/mL의 농도 이상에서 세포 독성이 나타났으며, 구실잣밤나무 가지 추출물(CCB)은 200 μg/mL 농도 이상에서 독성이 나타났다. 반면, 생달나무 잎 추출물(CJL)과 생달나무 가지 추출물(CJB)은 모두 500 μg/mL 농도에서만 독성이 나타났다.

따라서, 이하 실험에서는 세포독성을 나타내지 않는 농도인 5~50 μg/mL의 구실잣밤나무 잎 추출물, 10~100 μg/mL의 구실잣밤나무 가지 추출물, 10~100 μg/mL의 생달나무 잎 추출물 또는 생달나무 가지 추출물을 사용하였다.

실험예 2: 구실잣밤나무 추출물 또는 생달나무 추출물의 티로시나아제 활성 억제 효과 측정

본 발명의 구실잣밤나무 추출물 또는 생달나무 추출물의 미백활성을 평가하기 위하여, B16F10 세포를 이용하여 구실잣밤나무 추출물 또는 생달나무 추출물의 티로시나아제 활성을 알아보는 실험을 수행하였다.

2-1. 구실잣밤나무 추출물의 티로시나아제 활성 억제 효과

6-웰 플레이트에 웰당 1 × 10⁵cells/mL의 B16F10 세포 배양액을 가하여 이산화탄소 배양기(CO₂ incubator)에서 안정화시켰다. 그 후 상기 B16F10 세포에 상기 제조예 1의 구실잣밤나무 잎 추출물(CCL) 5, 10, 또는 50 μg/mL과 구실잣밤나무 가지 추출물(CCB) 10, 50, 또는 100 μg/mL을 처리하고 1시간 후에 100 nM의 α-msh를 각 세포에 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 그 다음, 상기 배양물의 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척한 후 세포 용해 용액(lysis buffer)을 이용하여 세포를 용해하였다. 용해된 세포는 4℃에서 15,000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상기 얻어진 상등액을 티로시나아제 활성 측정 시료 50 μL, 동량의 단백질, 및 10 mM L-DOPA 50 μL를 96-웰 플레이트에 분주하여 혼합한 후 37℃에서 30분 반응시킨 뒤 ELISA reader기로 490 nm의 파장으로 흡광도를 측정한 다음, 세포 일정수 당 티로시나아제 활성을 구하였다. 실험 대조군(K)으로는 코직산(kojic acid, K) 100 μg/mL를 처리한 B16F10 세포를 사용하였고, 음성 대조군(blank)으로는 구실잣밤나무 추출물과 코직산을 처리하지 않은 B16F10 세포를 사용하였으며, 양성 대조군(α-msh)으로는 구실잣밤나무 추출물 대신 α-msh를 처리한 B16F10 세포를 사용하였다. 측정 결과는 음성 대조군(blank) 대비 백분율로 나타내었다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보듯이, 구실잣밤나무 잎 추출물(CCL)과 구실잣밤나무 가지 추출물(CCB)은 티로시나아제 활성을 억제하였다.

특히 구실잣밤나무 잎 추출물(CCL)은 코직산(K)에 비해 더 낮은 농도에서 높은 티로시나아제 억제 활성을 나타내었으며, 구실잣밤나무 가지 추출물(CCB)에 비해 약 1.3배 높은 티로시나아제 억제 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

2-2. 생달나무 추출물의 티로시나아제 활성 억제 효과

상기 2-1에서 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 구실잣밤나무 가지 추출물 대신 제조예 2의 생달나무 잎 추출물 10, 50, 100 또는 200 μg/mL과 생달나무 가지 추출물 10, 50, 100 또는 200 μg/mL을 사용한 것을 제외하고 상기 2-1과 동일한 방법으로 생달나무 추출물의 티로시나아제 활성 억제 효과를 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보듯이, 생달나무 잎 추출물(CJL)과 생달나무 가지 추출물(CJB)은 티로시나아제의 활성을 억제하였으며, 처리농도가 증가할수록 티로시나아제의 억제 활성이 증가하여 농도 의존적인 경향을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, 생달나무 가지 추출물(CJB)은 코직산(K)에 비해 더 높은 티로시나아제 억제 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 구실잣밤나무 추출물 또는 생달나무 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과 측정

본 발명의 구실잣밤나무 추출물 또는 생달나무 추출물의 미백활성을 평가하기 위하여, B16F10 세포를 이용하여 구실잣밤나무 추출물 또는 생달나무 추출물의 멜라닌 생성량을 알아보는 실험을 수행하였다.

3-1. 구실잣밤나무 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과

6-웰 플레이트에 웰당 1 × 10⁵cells/mL의 B16F10 세포 배양액을 가하여 이산화탄소 배양기(CO₂ incubator)에서 안정화 시켰다. 그 후 상기 B16F10 세포에 상기 제조예 1의 구실잣밤나무 잎 추출물(CCL) 5, 10, 또는 50 μg/mL과 구실잣밤나무 가지 추출물(CCB) 10, 50, 또는 100 μg/mL을 각각 처리하고 1시간 후에 100 nM의 α-msh 를 각 세포에 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 그 다음, 상기 배양물의 배지를 제거하고 PBS로 2번 세척한 후 세포 용해 용액(lysis buffer)을 이용하여 세포를 용해하였다. 용해된 세포는 4℃에서 15,000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 세포 침전물을 얻었다. 얻어진 세포 침전물에 10% DMSO가 함유된 1N 수산화나트륨(NaOH) 용액을 첨가하여 80℃에서 1시간 동안 반응시켜 세포 내 멜라닌을 얻었다. 상기 얻은 멜라닌 액을 가지고 ELISA reader기로 475 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 일정수당 멜라닌 양을 구하였다. 실험 대조군(K)으로는 코직산(kojic acid, K) 100 μg/mL를 처리한 B16F10 세포를 사용하였고, 음성 대조군(blank)으로는 구실잣밤나무 추출물과 코직산을 처리하지 않은 B16F10 세포를 사용하였으며, 양성 대조군(α-msh)으로는 구실잣밤나무 추출물 대신 α-msh를 처리한 B16F10 세포를 사용하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보듯이, 구실잣밤나무 잎 추출물(CCL)과 구실잣밤나무 가지 추출물(CCB)은 B16F10 세포에서 멜라닌 생성을 억제하였다.

특히 구실잣밤나무 잎 추출물(CCL)은 코직산(K)에 비해 더 낮은 농도에서 높은 멜라닌의 생성을 억제하는 효과를 나타내었으며, 구실잣밤나무 가지 추출물(CCB)에 비해 약 2.3배 높은 멜라닌 생성 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

3-2. 생달나무 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과

상기 3-1에서 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 구실잣밤나무 가지 추출물 대신 제조예 2의 생달나무 잎 추출물 10, 50, 100 또는 200 μg/mL과 생달나무 가지 추출물 10, 50, 100 또는 200 μg/mL을 사용한 것을 제외하고 상기 3-1과 동일한 방법으로 생달나무 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보듯이, 생달나무 잎 추출물(CJL)과 생달나무 가지 추출물(CJB)은 멜라닌의 생성을 억제하였으며, 처리농도가 증가할수록 멜라닌 생성량이 감소하여 농도 의존적인 경향을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히, 생달나무 가지 추출물(CJB)은 코직산(K)에 비해 더 높은 멜라닌 생성 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 구실잣밤나무 추출물의 멜라닌 합성 관련 인자 발현 억제 효과 측정

멜라닌 생합성 신호전달 체계에는 매우 다양한 신호전달 물질이 관여하고 있다. 그 중 MITF는 멜라닌 합성 과정에 중요한 전사 조절 인자로, TRP-1과 TRP-2의 전사를 촉진한다. 이에 본 실험예에서는 구실잣밤나무 추출물의 미백효과 검증을 위하여 멜라닌 합성 관련 인자들의 발현 정도를 측정하였다.

구체적으로, 100 mm 세포배양 접시에 5 × 10⁶ cells/mL 세포로 분주한 다음, 하루밤 동안 안정화시켰다. 그 다음 상기 세포에 제조예 1의 구실잣밤나무 잎 추출물(CCL) 5, 10, 또는 50 μg/mL과 구실잣밤나무 가지 추출물(CCB) 10, 50, 또는 100 μg/mL, 및α-msh를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 상기 배양된 세포를 모아 PBS로 세척한 후 TRIzol 1 mL를 가하여 실온에서 교반하였다. 그 다음 클로로포름 200 ㎕를 넣고 다시 교반하여 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 후, 상등액 500 ㎕에 이소프로판올을 가하여 동일한 조건에서 원심분리하여 RNA 펠렛을 얻었다. 상기 얻은 RNA 5 ug를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied biosystem 4368814)를 이용하여 cDNA로 합성 하였다. 합성된 cDNA 1μL, taqman primer 1μL, Taqman Universal Master Mix II (Appiled biosystem) 10μL, 3차 증류수 8μL를 넣고 real-time PCR을 수행하였다. 상기 real-time PCR 반응 조건은 50℃에서 2분 95℃에서 10분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 15초, 어닐링 온도 60℃에서 15초인 사이클을 40회 반복 수행하였다. 정량 중합 효소 반응에 쓰인 TaqMan gene은 Life technologies에서 구입하여 사용하였다. 상기 구입한 유전자는 하기 표 1과 같다. 실험 대조군(K)으로는 코직산(kojic acid, K) 100 μg/mL를 처리한 B16F10 세포를 사용하였고, 음성 대조군(blank)으로는 구실잣밤나무 추출물과 코직산을 처리하지 않은 B16F10 세포를 사용하였으며, 양성 대조군(α-msh)으로는 구실잣밤나무 추출물 대신 α-msh를 처리한 B16F10 세포를 사용하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

Gene symbol	Gene description	TaqMan gene expression assay number	Reference sequence
TRP-1	Tyrosinase-related protein 1	Mm00453201_m1	NM_031202.3
TRP-2	Tyrosinase-related protein 2	Mm01225584_m1	NM_010024.3
MITF	Microphthalmia-associated transcription factor	Mm00434954_m1	NM_008601.3

도 6에서 보듯이, 구실잣밤나무 잎 추출물(CCL)은 MITF의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰으며, 구실잣밤나무 가지 추출물(CCB)의 경우에는 50 μg/mL의 농도이상에서 MITF의 발현을 감소시켰다.

이에 따라 구실잣밤나무 잎 추출물(CCL)과 구실잣밤나무 가지 추출물(CCB)을 처리한 세포에서 TRP-1과 TRP-2의 발현 역시 모두 억제되었으며, 특히 구실잣밤나무 잎 추출물(CCL)과 구실잣밤나무 가지 추출물(CCB) 모두 고농도에서 코직산(K)에 비해 TRP-1의 발현을 보다 더 많이 억제함을 확인할 수 있었다.

또한, 구실잣밤나무 잎 추출물(CCL)은 구실잣밤나무 가지 추출물(CCB)에 비해 약 1.3 내지 2배 높은 MITF, TRP-1 및 TRP-2의 발현 억제 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

Claims

구실잣밤나무(Castanopsis cuspidata var. sieboldii) 잎 추출물 또는 생달나무(Cinnamomum japonicum Siebold) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 생달나무 추출물은 생달나무의 잎 또는 가지로부터 추출되거나 분리된 물질인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 구실잣밤나무 잎 추출물 또는 생달나무 추출물은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 15.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.