KR20170068029A - 칡 추출물을 유효성분으로 함유하는 악성흑색종 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

악성흑색종 치료용 약학적 조성물로서, 암세포를 직접적으로 사멸시키는 천연화합물을 이용한 악성흑색종 치료용 약학적 조성물이 개시된다. 본 발명은 칡 추출물을 유효성분으로 함유하는 악성흑색종 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

칡 추출물을 유효성분으로 함유하는 악성흑색종 치료용 약학적 조성물{A PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH TREATING MALIGNANT MELANOMA COMPRISING THE EXTRACT FROM PUERARIA THUNBERGIANA}
본 발명은 악성흑색종 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연화합물을 이용한 악성흑색종 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
피부를 구성하고 있는 표피의 대표적인 세포인 각질형성세포는 피부분화, 노화와 같은 내인성 요인에 대한 변화뿐만 아니라, 감염, 자외선 노출 등과 같은 외부적 환경에도 끊임없이 반응하고 적응해야만 한다. 이러한 적응 과정 중 발생하는 세포자멸(apoptosis) 및 자가포식현상(autophagy)은 세포의 방어수단의 일환으로 여겨지고 있다(비특허문헌 1 내지 3 참조).
인간의 평균수명이 늘어나면서 자외선 축적량이 많은 고령 인구가 증가하고 있고, 더불어 사람들의 야외활동 증가로 자외선에 대한 노출이 많아져 피부암 환자는 지속해서 증가하고 있다. 악성흑색종은 피부암 중에서도 가장 악성도가 높은 암으로서 지난 10년간 특히 백인에게서 악성흑색종 발병 비율이 매년 3~7% 정도 지속해서 증가해 왔다.
우리나라는 기후가 변해 가면서 유해 자외선에 노출되기 쉬운 여름이 매년 일찍 찾아오고 있고 따라서 여러 피부암에 노출될 확률이 높아지고 있다. 건강보험심사평가원에서 2010년에서 2014년까지 피부의 악성흑색종으로 진료받은 인원수를 조사한 바로는 2010년 2343명에서 2014년 3822명으로 5년간 1479명이 증가했고, 연평균 증가율은 13.0%로 나타났다. 그 중 50대 이상의 남성에게서 발병률이 가장 높은데 이는 고령인은 피부노화 때문에 진피층이 얇아지고, 면역반응이 저하되며, 보습기능이 떨어져 피부가 건조해지기 때문이다. 악성흑색종은 초기에 진단되면 수술의 방법으로 치료 가능하지만, 초기 이상 진행되거나 재발한 경우 현재까지 특별한 치료방법이 없는 난치성 질환이다. 악성흑색종은 림프관과 혈관을 통해 뼈, 간, 폐 등 기관에 전이가 가능하다. 또한 화학요법이나 면역요법 치료로부터 저항성을 가지기 때문에 흑색종 암세포의 완전한 소멸에 심각한 문제가 있다. 최근 과학적 발전에도 불구하고 악성흑색종 치료는 약물에 대한 저항성 때문에 완벽하지 못한 실정이다(비특허문헌 4 참조).
항암제와 같은 화합요법제들은 상대적으로 강한 독성효과와 약물에 대한 내성을 암세포로부터 갖게 하고 한번 항암제에 대한 내성이 생기면 동일 기전의 항암제에 대해서도 내성을 가지게 한다. 따라서 최근 항암제들은 동물이나 식물로부터 얻어낸 천연화합물을 사용하여 부작용은 줄이고 항암 효과는 높이는 방향으로 이동하고 있다(비특허문헌 5 참조). 악성흑색종 발병 시 환자 스스로 몸의 면역력을 강화시켜 질병에 대한 치유능력을 향상시키는 것이 중요한데 합성 항암제의 경우 환자의 면역력을 저하시킬 수 있기 때문에 악성흑색종 치료를 위한 천연화합물에 대한 연구가 더 많이 이루어져야 한다.
세포사멸에는 자가사멸, 괴사 외에도 자가포식이 중요하다고 알려져 있다. 영양 결핍 시 세포생존을 위해 자가포식이 유도되지만 이는 암세포의 사멸에도 중요한 기전의 하나이다(비특허문헌 6 및 7 참조).
세포 자가 사멸 경로는 죽음 신호를 전달하는 리간드(ligand)와 막수용체가 결합하면서 개시되는데, FasL 및 TRAIL은 대표적인 리간드이며 Fas, DR4 및 DR5는 잘 알려진 막수용체이다. 일단 리간드가 수용체와 결합하면 세포질 내의 Fas-연관 사멸 영역(Fas-associated death domain; FADD)과 같은 어댑터 단백질(adapter protein)이 결합하여 사멸 유도 신호 복합체(death inducing signaling complex ; DISC)를 형성하고 프로카스파제-8(procaspase-8)을 자가분해시켜 활성화시킨다(비특허문헌 8 참조).
다음으로 내인성 경로라고 불리는 미토콘드리아 경로를 구성하는 단백질들의 발현 변화가 조사된 바 있다. 성장인자나 산소의 결핍, 방사선 혹은 자유 라디칼(free radicals) 등이 미토콘드리아 경로를 유발시키는 자극원으로서, 이러한 자극이 미토콘드리아 막전위(mitochondria membrane potential, MMP)를 저하시키면서 미토콘드리아 내부에 존재하는 세포자멸(apoptosis) 전구 단백질들을 세포질로 방출시키게 된다(비특허문헌 9 참조). 이때 방출된 시토크롬 c(cytochrome c)는 프로카스파제-9(procaspase-9)과 결합하여 카스파제-9(caspase-9)을 활성화시켜 세포자멸(apoptosis)을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 세포자멸 단백질 억제제 패밀리(inhibitors of apoptosis proteins(IAP) family) 단백질들은 이 과정을 억제하여 세포자멸(apoptosis)을 막는 역할을 한다(비특허문헌 10 참조).
미토콘드리아 막전위를 유지하는 데 중요한 역할을 하는 단백질로서 Bcl-2 패밀리가 있는데(비특허문헌 11 참조), Bcl-2 및 Bcl-xL과 같은 전-세포자멸(pro-apoptosis) 단백질은 미토콘드리아 막의 안정화에 기여하며, Bax와 같은 항-세포자멸(anti-apoptosis) 단백질은 이합체를 형성하여 미토콘드리아 막전위를 감소시키는 역할을 한다. 또 다른 Bcl-2 패밀리인 Bid는 카스파제-8(caspase-8)이 활성화되면서 절단되어 tBid(truncated Bid)의 형태로 미토콘드리아 막에 삽입되어 미토콘드리아 막의 투과성을 증가시키는 등 죽음수용체 경로와 미토콘드리아 경로를 연결시키는 핵심적인 역할을 한다(비특허문헌 12 참조).
세포자멸(apoptosis)은 준비된 프로그램에 따라 세포가 능동적으로 죽는 과정으로서 유형 Ⅰ의 세포예정사(type Ⅰ programmed cell death; PCD)로 분류되며, 세포막의 블레빙(blebbing) 현상, 세포질의 응축, DNA의 절편화 등을 특징으로 한다(비특허문헌 13 참조). 예기치 않은 외부의 자극으로 인해 세포가 급팽창해 파괴되면서 주변 조직에 염증을 일으키는 괴사(necrosis)와 달리 세포자멸(apoptosis)은 정해진 프로그램을 따라 질서정연하게 세포질 및 염색질이 수축하여 식세포의 식작용에 의해 제거되므로 주위에 염증 반응을 일으키지 않는다. 따라서 암세포에 효율적으로 세포자멸(apoptosis)을 일으키는 물질을 탐색하고 그 기전을 밝히는 것이 새로운 암 치료제를 개발하는 데 기본적인 과정이 되어 왔다.
자가포식(autophagy)은 세포 내에서 기본적으로 일어나는 생리적 과정으로 항상성 유지, 발달 과정, 면역 기능, 노화 및 다른 병리적인 기능에도 영향을 미치고 있어 자가포식(autophagy)의 조절 장애가 암을 비롯한 방대한 질병 발생 및 치료에 영향을 미칠 것으로 생각되고 있다(비특허문헌 14 및 15 참조).
자가포식(autophagy)에 의해 유도된 세포사를 자가포식 세포사(autophagic cell death) 또는 유형 Ⅱ의 세포예정사(programmed cell death type Ⅱ)라고도 하며, 자가포식(autophagy)은 자가포식체(autophagosome)라는 특이한 형태의 소낭을 형성하여 오래된 세포내 기관들을 둘러싸게 되고, 이 자가포식체(autophagosome)가 리소좀(lysosome)과 결합하면서 내부의 가수분해효소에 의해 세포내 기관들이 분해된다.
자가포식(autophagy)은 세포가 스트레스 상황 속에서 자가포식체(autophagosome)를 형성한 후 리소좀(lysosome)과 결합하여 자가리소좀(autolysosome)을 만드는 과정에서 에너지를 발생시켜 주변 소기관들에 에너지를 공급함으로써 스트레스 상황을 극복하는 것으로 알려져 있으며, 흑색종의 전이과정 및 바이러스 감염세포의 자멸과 같은 여러 피부질환과 관련이 있음이 보고되고 있다(비특허문헌 16 및 17 참조).
자가포식(autophagy) 시 발현이 증가하는 단백질로서 Beclin-1과 LC3가 있는데, Beclin-1은 자가포식체(autophagosome)를 형성하는 데 중요한 역할을 하며, LC3는 autophagy가 일어나면 LC3의 두 가지 형태 중에서 LC3Ⅰ 형태(form)가 LC3Ⅱ 형태로 전환되면서 자가포식체(autophagosome)의 막에 결합하기 때문에 자가포식체(autophagosome)의 직접적인 지표가 된다(비특허문헌 18 및 19 참조).
자가포식현상은 일반적으로 영양결손, 허혈 등의 외부, 내부적인 자극에 의해 발생되는데, 세포자멸 및 암발생의 억제 혹은 암전이 촉진 등에 다양하게 관여하는 것으로 알려져 있다. 자가포식현상이 유도될 때, 자가포식체가 형성되는데, 자가포식체의 이중막 형성에 관여하는 LC3라는 단백질은 자가포식(autophagy)이 일어나면 LC3의 두 가지 형태 중에서 LC3Ⅰ 형태가 LC3Ⅱ 형태로 전환되면서 자가포식체(autophagosome)의 막에 결합하기 때문에 자가포식현상의 특이적 마커로 사용되고 있다.
최근에는 자가포식(autophagy)과 세포자멸(apoptosis)의 복잡한 상호 작용에 관한 연구가 주목을 받고 있는데, 몇몇의 세포자멸(apoptosis)의 경우 자가포식(autophagy)의 억제제나 유도제로 작용하여 많은 항암제에 대해 저항성의 변화를 일으키거나 임상적 적용을 가능하게 하는 작용을 하는 것으로 알려져 있으므로 다양한 상황에서 자가포식(autophagy)과 세포자멸(apoptosis)에 관한 연구가 더 필요한 실정이다(비특허문헌 20 참조).
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본 발명은 악성흑색종 치료용 약학적 조성물로서, 암세포를 직접적으로 사멸시키는 천연화합물을 이용한 악성흑색종 치료용 약학적 조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 칡 추출물을 유효성분으로 함유하는 악성흑색종 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 상기 추출물은 100㎍/㎖ 이상의 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 악성흑색종 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 상기 추출물은 B16F10 세포에 대한 세포자멸(apoptosis) 및 자가포식(autophagy) 유발 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 악성흑색종 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 악성흑색종인 B16F10 세포에서 칡 추출물 처리에 의해 세포자멸(apoptosis) 뿐만 아니라 자가포식(autophagy)이 동시에 유발되는 것을 확인함으로써 부작용 없이 악성흑색종을 직접적으로 사멸시키는 능력을 보유한 칡 추출물을 이용한 악성흑색종 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 3에서 B16F10 세포에서의 세포독성 결과를 나타낸 그래프,
도 2 및 도 3은 본 발명의 실시예 4에서 형광활성화 세포분류(Fluorescence-Activated Cell Sorting; FACS)를 통해 세포자멸(apoptosis)을 확인한 결과를 나타낸 그래프,
도 4 및 도 5는 본 발명의 실시예 4에서 형광활성화 세포분류(Fluorescence-Activated Cell Sorting; FACS)를 통해 자가포식(autophagy)을 확인한 결과를 나타낸 그래프,
도 6은 본 발명의 실시예 5에서 B16F10 세포에서 단백질의 발현 조절에 관한 단백질 발현 결과를 나타낸 사진.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명자들은 천연물로부터 악성흑색종을 직접적으로 사멸시키는 능력을 갖는 물질을 객관적인 암세포 사멸 활성지표를 이용하여 검색하던 중, 놀랍게도 악성흑색종인 B16F10 세포에 칡 뿌리(갈근), 칡 지상부(갈만) 등 칡 추출물을 처리 시 시간이 길어질수록, 농도가 높아질수록 더 높은 세포독성을 보이고, 세포자멸(apoptosis)과 자가포식(autophagy)을 유도하는지 확인하기 위해 형광활성화 세포분류(Fluorescence-Activated Cell Sorting; FACS)와 단백질 발현(western blot)을 실시한 결과 세포자멸(apoptosis) 뿐만 아니라 자가포식(autophagy)이 동시에 유발됨을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명은 칡 추출물을 유효성분으로 함유하는 악성흑색종 치료용 약학적 조성물을 개시한다.
본 발명에서 칡 추출물은 고순도 저급 알코올 또는 물로 추출하여 얻을 수 있다. 예컨대, 칡 뿌리(갈근), 칡 지상부(갈만) 등 칡을 저급 알코올로 추출하여 알코올 추출물을 얻고, 이 알코올 추출물을 다시 증류수로 희석시켜 유기 용매로 반복 분획함으로써 다양한 용매 분획 추출물을 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
실시예 1: 칡 추출물의 제조
칡 뿌리 및 칡 지상부 각 2,000g에 30% 에탄올을 10배수 가하여 80~100℃로 3시간 가열한 후, 여과하여 그 여과액을 진공 건조하여 건조물을 수득하였다. 상기 진공 건조하여 얻은 추출물을 증류수 3,600㎖에 녹이고 동량의 에틸아세테이트(EtOAc)를 넣어 분획하는 과정을 2회 반복하여 칡 추출물을 제조하였다.
실시예 2: B16F10 악성흑색종 세포의 배양
B16F10 세포주(한국세포주은행)의 배양은 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco, Grand Island, NY, USA)에 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco, Grand Island, NY, USA), 100U/㎖ 페니실린(penicillin) 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin, Gibco, Grand Island, NY, U.S.A.)을 혼합한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 수행되었다.
실시예 3: 칡 추출물이 B16F10 악성흑색종 세포주에 미치는 세포독성 조사
칡 뿌리 추출물과 칡 지상부 추출물의 B16F10 악성흑색종 세포주에 대한 세포독성이 있는지를 MTT 세포 생존능력 분석방법으로 조사하였다. 이를 위해 B16F10 세포주를 96 웰 플레이트(well plate)에 5×103cells/well이 되도록 분주한 후 24시간 배양하였다. 배지는 제거 후 칡 추출물의 농도를 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 150㎍/㎖ 및 200㎍/㎖로 처리하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24, 48 및 72시간 배양한 후 상층액은 제거하고 MTT(3-(4,5-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide, Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, USA)를 1mg/㎖ 만들어 100㎕/well 넣고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 3시간 배양한 후 상층액을 제거하고 DMSO(Sigma-Aldrich Co., St. Louis,MO, USA) 100㎕/well를 가하여 540nm에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader, TECAN, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. B16F10 세포에서의 세포독성 결과를 도 1에 나타내었고, IC50 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure pat00001
도 1 및 표 1을 참조하면, 칡 뿌리 추출물과 칡 지상부 추출물의 농도가 증가할수록 생존하는 세포의 수가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 시간 경과에 따른 세포생존율 결과는 저농도인 50㎍/㎖ 농도에서 칡 뿌리 추출물 24시간 배양조건에서 세포생존율이 84.8%, 48시간 배양조건에서 68.91%이며, 칡 지상부 추출물 24시간 배양조건에서 세포생존율이 95.53%, 48시간 배양조건에서 61.3%이다. IC50값을 계산한 결과 칡 뿌리 추출물 24시간 배양조건에서 146.53㎍/㎖, 48시간 배양조건에서 77.9㎍/㎖이며, 칡 지상부 추출물 24시간 배양 조건에서 147.83㎍/㎖, 48시간 배양조건에서 91.41㎍/㎖로 시간 경과에 따라 세포독성이 증가함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 형광활성화 세포분류(Fluorescence-Activated Cell Sorting; FACS)에 의한 세포자멸(apoptosis) 및 자가포식(autophagy) 관찰
세포자멸(apoptosis)은 FITC-Annexin V apoptosis detection kit(BD PharmingenTM, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였고, 자가포식(autophagy)은 아크리딘 오렌지(Acridine Orange, Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. B16F10세포에 칡 지상부 추출물을 농도별(50, 100, 150 및 200㎍/㎖)로 처리하였고, 양성대조군(positive control)으로는 독소루비신(doxorubicin) 0.5μM로 처리하여 24시간 배양한 세포를 PBS로 세척 후 trypsin-EDTA로 모은 다음, 1×106cells/㎖의 농도에서 결합 완충액(binding buffer)으로 현탁(suspension)하였다. 그 후 B16F10 세포를 Annexin V-FITC와 요오드화 프로피디움(propidium iodide; PI), 1㎍/㎖의 아크리딘 오렌지(Acridine Orange)로 15분간 염색하고 흐름세포분석기(Flow cytometry) - FACS Canto(Becton-Dickinson Biosciences, Drive Frankline Lages, NJ, USA)로 분석하여 결과를 관찰하였다. 형광활성화 세포분류(Fluorescence-Activated Cell Sorting; FACS)를 통해 세포자멸(apoptosis)을 확인한 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었고, 형광활성화 세포분류(Fluorescence-Activated Cell Sorting; FACS)를 통해 자가포식(autophagy)을 확인한 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.
세포사멸의 초기단계에 세포막은 인지질의 구축에 혼란이 생겨서 포스파티딜세린이 세포막의 외측에 노출이 되며, 아넥신 V는 칼슘(Ca) 의존성 인지질 결합 단백질로서 특히 포스파티딜세린에 특이적으로 결합 친화도가 높기 때문에, 현재 사멸세포 표면의 포스파티딜세린을 검출하는데 주로 사용되고 있다. 또한 요오드화 프로피디움(propidium iodide)을 이용해서 손상을 입은 DNA를 염색할 수 있다. 따라서 아넥신 V의 포스파티딜세린에 대한 결합정도와 동시에 요오드화 프로피디움(propidium iodide)의 염색을 통해서 확실한 세포사멸을 확인하고자 하였다.
도 2 및 도 3을 참조하면, 독소루비신(doxorubicin) 0.5㎍/㎖(Dox 0.5)와 칡 뿌리 추출물 및 칡 지상부 추출물을 각각 50, 100, 150 및 200㎍/㎖로 처리한 세포를 아넥신 V와 요오드화 프로피디움(propidium iodide)으로 염색한 경우 대조군(control) 대비 모든 샘플에서 세포자멸(apoptosis)이 일어남을 확인할 수 있다. 칡 뿌리 추출물의 독소루비신(doxorubicin) 0.5㎍/㎖의 전체 세포사멸율은 1489.56%이며 칡 뿌리 추출물 50, 100, 150 및 200㎍/㎖로 처리 시 전체 세포사멸율은 각각 194.7%, 376.55%, 547.05% 및 952.19%로 농도 의존적으로 증가함을 보였다. 칡 지상부 추출물의 독소루비신(doxorubicin) 0.5㎍/㎖의 전체 세포사멸율은 423.77%이며 칡 지상부 50, 100, 150 및 200㎍/㎖로 처리 시 전체 세포사멸율은 각각 297.01%, 368.98%, 379.37% 및 683.62%로 농도 의존적으로 증가함을 보였다. 칡 지상부 100㎍/㎖ 농도부터 독소루비신(doxorubicin) 0.5㎍/㎖와 비슷한 수준의 세포사멸율을 보였으며 200㎍/㎖에서는 약 1.6배의 세포사멸율을 보였다.
자가포식(autophagy) 관찰은 아크리딘 오렌지로 세포를 염색하여 수행되었다. 도 4 및 도 5를 참조하면, 독소루비신(doxorubicin)과 칡 추출물을 처리한 세포를 아크리딘 오렌지로 염색한 경우 칡 뿌리 추출물은 50㎍/㎖, 100㎍/㎖ 및 150㎍/㎖ 농도에서 농도 의존적으로 자식작용율을 보였고, 100㎍/㎖로 처리 시 양성대조군(positive control)인 독소루비신(doxorubicin) 0.5㎍/㎖과 비슷한 수준의 자식작용율을 보였으며, 150㎍/㎖로 처리시에는 더 높은 자식작용율을 보였다. 칡 지상부 추출물은 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖로 처리 시 양성대조군(positive control)인 독소루비신(doxorubicin) 0.5㎍/㎖과 비슷한 수준의 자식작용현상을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 칡 지상부 추출물의 단백질 발현(western blot)을 이용한 세포자멸(apoptosis) 및 자가포식(autophagy) 관찰
B16F10 세포를 각각 5×104cell/well이 되도록 6-웰 플레이트(well plate)에 분주하고 칡 뿌리 추출물 및 칡 지상부 추출물을 각각 50㎍/㎖, 100㎍/㎖, 150㎍/㎖ 및 200㎍/㎖ 농도별로 24시간 처리하고 RIPA(Radio Immuno Precipitation Assay) 완충액(buffer)(pH 7.4, 50mM Tris-Hcl, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% NP40, 10% glycerol)을 이용하여 4℃에서 30분 동안 용해시켰다. 세포 분해산물(cell lysates)을 4℃, 13,000rpm에서 25분 동안 원심분리한 후 동량의 단백질(30~50㎍)을 SDS-PAGE에 전기 영동한 후 PVDF 막(membrane)에 이동시켜, PVDF 막을 5% 탈지 분유(skim milk)로 상온에서 1시간 블로킹(blocking)하였다. 다음에는 카스파제-9(caspase-9), 카스파제-3(caspase-3), PARP(poly(ADP-ribose)polymerase), p-mTOR, LC3BI/II, Becline, SQSTM1/p62 항체(Antibody), GAPDH(Cell Signaling Technology, Inc.USA)에 대한 1차 항체를 4℃에서 하룻밤(overnight) 반응시키고, 4분 간격으로 4번 세척(washing)하였다. 항-래빗(anti-rabbit, Cell Signaling Technology, Inc. USA), 항-마우스(anti-mouse, Santa Cruz Biotechnology, Inc. USA) 2차 항체를 상온에서 2시간 반응시킨 다음 4분 간격으로 6번 세척(washing)하였다. 그리고 단백질 발현 시스템(ECL Western blotting detection system)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였다. B16F10 세포에서 단백질의 발현 조절에 관한 단백질 발현 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 칡 추출물들의 세포자멸(apoptosis)의 관찰을 위해 Bcl-2, BID, PARP(poly(ADP-ribose) polymerase), 카스파제-3(caspase-3) 및 카스파제-9(caspase-9)을 확인하였다. 세포자멸(apoptosis)의 경로는 크게 두 가지로 나누어지는데, DISC(death inducing signaling complex)를 형성하여 카스파제-8(capase-8)을 활성화시키는 죽음수용체 경로와 미토콘드리아 막전위가 감소하면서 시토크롬 c(cytochrome c)가 세포질로 방출되어 카스파제-9(caspase-9)과 복합체를 형성하는 미토콘드리아 경로는 Bcl-2를 포함한 항-세포사멸(anti-apoptotic) 단백질과 Bax, BID를 포함한 전-세포사멸(pro-apoptotic) 단백질의 상대적인 비율에 의해 조절받으며, 활성화된 카스파제-8(capase-8) 및 카스파제-9(caspase-9)에 의해 최종적으로 카스파제-3(caspase-3)이 활성화되고 카스파제-3(caspase-3) 기질 단백질로 알려져 있는 PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)는 세포자멸(apoptosis) 유발 시 활성화된 카스파제-3(caspase-3)에 의해 분해되어 정상세포의 DNA 수복이나 유전자 안정성을 유지하는 본래의 기능을 상실하게 되어 세포자멸(apoptosis)이 일어난다. 칡 뿌리 추출물 및 칡 지상부 추출물의 항-세포사멸(anti-apoptotic) 단백질인 Bcl-2에 미치는 영향은 농도 의존적으로 증가하였으며, 전-세포사멸(pro-apoptotic) 단백질인 BID에 미치는 영향은 농도 의존적으로 감소하였다. PARP의 단편화가 칡 뿌리 추출물 및 칡 지상부 추출물 처리 농도 의존적으로 증가한 것으로 보아 칡 뿌리 추출물 및 칡 지상부 추출물이 B16F10 세포에 유발한 세포자멸(apoptosis)은 카스파제(caspase)의 활성화와 그 기질 단백질의 단편화에 의한 것임을 알 수 있었다. 칡 뿌리 추출물 및 칡 지상부 추출물의 카스파제-3 활성(caspase-3 activity)에 미치는 영향은 pro form인 32kDa가 농도 의존적으로 감소하였고, cleaved form인 17kDa는 농도 의존적으로 증가하였으며 양성대조군(positive control)인 독소루비신(doxorubicin) 역시 증가하였다. 칡 뿌리 추출물 및 칡 지상부 추출물은 미토콘드리아 경로를 경유하는 카스파제-9(caspase-9)의 pro form이 농도 의존적으로 감소함을 보였다.
또한 칡 지상부 추출물의 자가포식(autophagy)의 관찰을 위해 p-mTOR, LC3, p62/SQSTM1을 확인하였다. 자가포식의 조절에는 mTOR를 통한 신호전달 경로가 중요하므로 따라서 이를 조절함으로써 자가포식이 조절될 수 있는데, mTOR는 자가포식의 음성조절자로서 알려져 있다. LC3는 자가포식(autophagy) 시 발현이 증가하는 단백질로서 자가포식(autophagy)이 일어나면 LC3의 두 가지 형태 중에서 LC3Ⅰ 형(form)이 LC3Ⅱ 형(form)으로 전환되면서 자가포식체(autophagosome)의 막에 결합하기 때문에 자가포식체(autophagosome)의 직접적인 지표가 된다. p-mTOR의 발현 변화를 관찰한 결과 농도 의존적으로 발현이 감소하였고, 양성대조군(positive control)인 독소루비신(doxorubicin) 역시 감소하였다. LC3의 발현 변화를 관찰한 결과 LC3Ⅱ 형(form) 모두 농도 의존적으로 발현이 증가하였다. p62/SQSTM1 단백질은 유비퀴틴 결합부위(ubiquitin-associated domain; UBA)를 가지고 있으며 이를 통해 유비퀴틴화된 단백질과 결합할 수 있다. 이후 자가 올리고머화를 통해 결합된 단백질을 기능적으로 격리시키고 이 유비퀴틴화 단백질-p62 올리고머 복합체는 자가포식소포체에 결합되어 있는 LC3와 결합하여 최종적으로 p62를 포함하는 자가포식소포체 내의 단백질과 세포기관은 리소좀 내에서 분해된다. p62/SQSTM1 발현 변화를 관찰한 결과 모두 농도 의존적으로 발현이 감소하였다.
이러한 결과는 B16F10 세포에서 칡 뿌리 추출물 및 칡 지상부 추출물 처리에 의해 세포자멸(apoptosis) 뿐만 아니라 자가포식(autophagy)이 동시에 유발됨을 보여준다.
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.

Claims (3)

  1. 칡 추출물을 유효성분으로 함유하는 악성흑색종 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 100㎍/㎖ 이상의 농도로 처리되는 것을 특징으로 하는 악성흑색종 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 B16F10 세포에 대한 세포자멸(apoptosis) 및 자가포식(autophagy) 유발 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 악성흑색종 치료용 약학적 조성물.
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