KR20170075013A - Cart 세포에서 유전자 발현의 변경 및 그의 용도 - Google Patents

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양빙 자오
지앙타오 렌
샤오준 리우
칼 에이치. 준
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
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Abstract

본 발명은 TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, HLA 분자, CTLA-4, PD1, 및 FAS로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 내인성 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 갖고 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)을 암호화하는 핵산 또는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 전기천공된 핵산을 추가로 포함하는 변형된 T 세포의 생성을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 또한, 입양 요법 및 자가면역 질병과 같은 병증을 치료하기 위한 상기 변형된 T 세포를 포함하는 방법 및 약학 조성물을 포함한다.

Description

CART 세포에서 유전자 발현의 변경 및 그의 용도{ALTERING GENE EXPRESSION IN CART CELLS AND USES THEREOF}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에서 2014년 10월 31일자로 출원된 미국 가 특허 출원 제 62/073,651 호에 대한 우선권의 권리가 있으며, 상기는 내용 전체가 본 발명에서 참고로 인용된다.
연방 지원 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 국립 보건원에 의해 부여된 CA120409 하에서 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.
키메릭 항원 수용체(CAR) 변형된 T 세포를 사용하는 입양 세포 전달 요법(ACT)은 암 치료에 유망한 전략인 것으로 나타났다(Louis et al., 2011, Blood 118:6050-6056; Kochenderfer et al., 2010, Blood 116:3875-3886 and Porter et al., 2011, N Engl J Med 365:725-733).
렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하는 통합 관련된 안전성 우려는 ACT에 사용되는 세포의 변형에 주요 관심사이다. 표적-상 또는 표적-외 불필요한 부작용, 예를 들어 T 세포 수용체(TCR) 또는 CAR RNA 전기천공 (electroporation)에 의한 T 세포의 RNA 형질감염을 피하기 위한 일부 진보가 이루어졌다(Zhao, 2006, Mol Ther 13:151-159; Mitchell et al., Smits et al., 2004, Leukemia 18:1898-1902). 상기와 같은 방법은 RNA 및 T 세포 모두의 투여량을 최소화시킴으로써, 세포내로의 다수 유전자의 도입을 효율적으로 허용한다. 그러나, CAR의 일시 발현에 대한 주된 제약은 RNA 형질감염된 T 세포의 최적에 못 미치는 효과기 활성 및 기능성이다. 다수의 T 세포 주입 및/또는 저용량 화학요법의 유의수준의 사용이 CAR 기능을 개선시키기 위해 사용되어 왔다(Barrett et al., 2013, Hum Gene Ther 24(8):717-27).
복합 요법 및 추가적인 치료에 대한 요구를 피하기 위해서 CAR의 효과기 활성 및 기능성을 개선시키기 위한 다양한 시도들이 수행되었다. 형질감염 과정 동안 RNA의 증가는 특히 생체내 항-종양 활성에 있어서 T 세포 기능에 부정적인 영향을 제기한다(Barrett et al., 2011, Hum Gene Ther 22:1575-1586). 항-CD3 항원 항체 단편을 항-종양 항원 항체 단편에 융합시키는 대안의 구조물이 암 치료를 위한 임상 시험에서 또한 시험되었다(Bargou et al., 2008, Science 321:974-977; Klinger et al., 2012, Blood 119:6226-6233). 불행하게도, 상기 구조물은 짧은 반감기, 표적 세포 부위에의 불충분한 접근성, 및 적절한 장기적인 신호전달 기능의 결여로 인해 기능성이 심하게 제한되었다.
임상적 TCR 연구는 형질도입된 TCR의 낮은 발현 수준뿐만 아니라 α 및 β 쇄의 잘못 짝짓기에 의해 방해되었다. T 세포가 2개의 상이한 TCR의 쇄(고유 알파/베타, 외인성 알파/베타, 및 고유/외인성 "잘못 짝지은" 이종이량체)를 전사하는 경우 4개의 TCR이 세포 표면상에서 잠재적으로 발현될 수 있기 때문에, 상기 접근법의 사용에 대한 상당한 방해는 자명하다. 지금까지 수행된 연구에서, 전임상 연구는 TCR 잘못 짝짓기가 자기-항원의 해로운 인식을 유도할 가능성을 가짐을 명백히 입증하였다.
암 치료에서 수득된 초기 TCR 및 CAR T 세포 임상 데이터는 유망한 결과를 입증하였지만, 환자에 대한 위험성이 높고 일부 환자의 T 세포는, 동종이계 공여자-유래된 T 세포의 변형을 강제하는 TCR 또는 CAR 재지시후에조차, 유효 치료에 충분히 효능이 있지 않다. 그러나, 주입된 동종이계 T 세포상의 내인성 αβ T-세포 수용체는 수용자 중의 주 및 부 조직적합성 항원들을 인식하여, 이식편 대 숙주병(GVHD)을 유도할 수도 있다. 그 결과, 자기유래 CAR T 세포의 주입을 사용하는 대다수의 현행 임상 시험들은 입양 세포 전달 요법 후 정상 조직의 TCR-매개된 유해 인식을 예방하기 위해서 면역 관용에 의존한다. 이러한 접근법은 초기에 임상적 성공을 성취하였으나, 환자-특이성 T-세포 제품의 제조를 위한 시간 및 비용에 의해 제한된다.
따라서, 환자-특이성 T-세포 제품의 제조를 위한 시간 및 비용을 우회하면서, T 세포를 변형시키는 보다 안전한 방법이 필요하다.
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 본 발명은 TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, HLA 분자, CTLA-4, PD1, 및 FAS로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 내인성 유전자의 유전자 발현을 변경시킬 수 있는 핵산을 갖고 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 변형된 T 세포의 생성을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 하나의 태양은 TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, HLA 분자, CTLA-4, PD1, 및 FAS로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 내인성 유전자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산; 및 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 보조-자극 (co-stimulatory) 분자의 세포내 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, HLA 분자, CTLA-4, PD1, 및 FAS로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 내인성 유전자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 T 세포내에 도입시키고; 항원 결합 도메인, 막관통 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 도입시킴을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 증진된 면역 (enhanced immunity)과 관련된 질병 또는 병증의 치료가 필요한 피험자에게 유효량의 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자의 치료 방법을 포함한다.
여전히 또 다른 태양에서, 본 발명은 피험자에게 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 병증을 치료하는 방법을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 피험자에게 유효량의 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는 상기 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응 (immune response)을 자극하는 방법을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 입양 세포 전달 요법 (adoptive cell transfer therapy)이 필요한 피험자에게 유효량의 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 (adverse to) 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하는 입양 세포 전달 요법 치료 방법을 포함한다.
여전히 또 다른 태양에서, 본 발명은 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포의 용도를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 변형된 T 세포를 포함하는 조성물을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
본 명세서에 묘사된 발명의 상기 태양 또는 임의의 다른 태양의 다양한 실시태양에서, 상기 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산은 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, siRNA, shRNA, 및 CRISPR 시스템, 예를 들어 pAd5/F35-CRISPR 벡터로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서, 상기 CAR의 항원 결합 도메인은 단클론 항체, 다클론 항체, 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단일 도메인 항체, 단쇄 가변 단편, 및 그의 항원 결합 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 항체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 상기 CAR의 항원 결합 도메인은 표적 세포상의 항원에 특이적으로 결합한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 CAR의 세포내 도메인은 이중 신호전달 도메인을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포는 보조-자극 분자, 예를 들어 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L을 암호화하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포의 생성 방법은 보조-자극 분자를 암호화하는 RNA를 상기 T 세포내에 전기천공시킴을 추가로 포함한다. 상기 보조-자극 분자가 CD3인 일부 실시태양에서, 상기 CD3은 적어도 2개의 상이한 CD3 쇄, 예를 들어 CD3 제타 및 CD3 입실론 쇄를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 제대혈 세포, T 세포의 정제된 집단 (population) 및 T 세포주로 이루어지는 그룹으로부터 수득된다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포의 생성 방법은 상기 T 세포를 증대시킴 (expanding)을 또한 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 T 세포의 증대는 상기 T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함한다.
여전히 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포의 생성 방법은 상기 T 세포를 냉동보존함 (cryopreserving)을 또한 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 핵산을 상기 T 세포에 도입시키기 전에 상기 냉동보존된 T 세포를 해동시킴을 추가로 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 핵산의 도입은 증대된 T 세포의 형질도입 (transduction), 증대된 T 세포의 형질감염 (transfection), 및 증대된 T 세포의 전기천공으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 T 세포의 다능성을 유도하기 위해 상기 T 세포에서 Klf4, Oct3/4 및 Sox2를 발현시킴을 또한 포함한다.
본 명세서에 묘사된 발명의 상기 태양 또는 임의의 다른 태양의 다양한 실시태양에서, 본 발명은 상기 변형된 T 세포를 피험자에게 투여함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 피험자는 자가면역 질병과 같은 병증을 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 자가면역 질병은 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
또 다른 실시태양에서, 상기 병증은 암, 예를 들어 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암 (cervical cancer), 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 암이다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법은 상기 표적 세포 또는 조직의 용해, 예를 들어 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 유도함을 추가로 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시태양의 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독시 보다 양호하게 이해될 것이다. 본 발명을 예시하기 위해서, 현재 바람직한 도면 실시태양에 나타낸다. 그러나, 본 발명이 도면에 나타낸 실시태양들의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않음은 물론이다.
도 1(도 1A-1C 포함)은 CRISPR 설계 및 293T 세포에서 TCR αβ-CD3 복합체의 표적화를 예시한다. 도 1A는 TCR-α 및 β 불변 영역의 게놈 유전자좌내의 CRISPR gRNA 표적화 부위를 나타낸다. 각 엑손은 블록에 의해 나타낸다. 검은색 블록은 암호화 영역을 나타낸다. 회색 컬럼은 비-암호화 영역을 나타낸다. 13개의 gRNA가 TCRα 불변 영역(TRAC)의 엑손 1을 표적화하고, 10개의 gRNA는 TCR β 불변 영역 1(TRBC1) 및 2(TRBC2)의 엑손 1상의 보존된 서열을 표적화하며, 10개의 gRNA는 베타-2 마이크로글로빈 유전자의 엑손 1을 표적화하도록 설계되었다. 도 1B는 전형적인 gRNA 스캐폴드 서열을 나타내다. gRNA PCR 산물이 중첩 PCR에 의해 생성되었으며 T7 프로모터를 갖는 MSGV 벡터내에 클로닝되었다. 도 1C는 CAS9 mRNA 및 gRNA의 세포내로의 형질감염 후 다중 피크가 293T TCR TRAC 및 TRBC 게놈 PCR 산물 중에 존재함을 나타내는 상거 서열분석 결과를 나타낸다.
도 2(도 2A-2E 포함)는 1차 T 세포 중의 TCRαβ-CD3 복합체의 붕괴를 나타낸다. 도 2A는 CAS9 mRNA 및 gRNA의, BTX830에 의한 1차 T 세포내로의 전기천공에 사용되는 매개변수들을 나타내는 표이다. 2 ㎜ 큐벳과 360V 1ms는 3일 비드(beads) 자극된 1차 T 세포의 전기천공에 최고의 평균 형광 강도(MFI) 및 효율을 제공하였다. 도 2B는 통상적인 37 ℃ 5% CO2 조건보다 훨씬 더 높은 MFI를 갖는 32 ℃ 5% CO2에서 배양된 T 세포를 나타내는 그래프 패널이다. 도 2C는 1차 T 세포내로 전달된 CRISPR 시스템의 도식적 예시이다. CAS9 mRNA 및 gRNA를 1차 T 세포의 비드 자극 후 3일째에 T 세포내로 전기-전달하였다. 이어서 T 세포를 100 IU/㎖의 IL-2와 배양하고 일부 세포를 1일 동안 32 ℃ 5% CO2에서 배양하고 이어서 추가로 7 내지 9일 동안 배양하였다. CD3 발현을 유식 세포측정에 의해 전기천공 후 7 내지 9일째에 분석하였다. 도 2D는 37 ℃에서 표적화 효율이 32 ℃에서보다 약 2.5배 더 높음을 나타내는 그래프 패널이다. 도 2E는 TCR β를 표적화하는 다양한 양 및 비의 CAS9 및 gRNA의 전기-전달 후 6일째에 CD3의 하향 조절을 나타내는 그래프 패널이다. CD3 발현을 CD3에 대한 염색에 의해 분석하였다. 전기천공 후 6일째에 전형적인 흐름 데이터를 나타낸다. 사분면은 T-세포 집단 중 CD3 음성 세포의 비율을 나타낸다.
도 3(도 3A-3D 포함)은 T 세포에서 TCRneg 알파 또는 베타 녹아웃을 TCRpos T 세포의 고갈에 의해 농축시킬 수 있음을 나타낸다. 도 3A는 T 세포 중의 TCRneg 알파 또는 베타 녹아웃의 마이크로-비드 고갈 전후의 CD3 발현을 나타내는 그래프 패널이다. 유식 세포측정은 CD3의 발현을 예시한다. 하부 우측 사분면의 숫자는 T-세포 집단 중 CD3 음성 세포의 비율을 나타낸다. 도 3B는 CD3neg 농축된 T 세포 게놈 PCR 산물에서 다중 피크가 관찰되었음을 나타내는 서열분석 그래프 패널이다. 도 3C는 CRISPR로 변형된 단일 알파 쇄, 베타 쇄, 및 알파 베타 이중 녹아웃 T 세포에서 CD3 마이크로-비드 농축 후 CD4 및 CD8 T 세포 레퍼토리 분석을 나타내는 그래프 패널이다. 데이터는 CD8 T 세포 집단의 비가 CRISPR 변형에 의해 농축되었음을 나타내며, 이는 CD8 T 세포가 CD4 T 세포보다 더 용이하게 변형될 수 있음을 암시한다. 도 3D는 CRISPR 변형 후 TCR 알파 및 베타 유전자좌에 도입된 결실 및 삽입의 서열분석 결과를 나타낸다.
도 4(도 4A-4C 포함)는 gRNA의 수회의 전기-전달이 1차 T 세포에서 CRISPR 시스템의 표적화 효율을 크게 개선시켰음을 나타낸다. 도 4A는 gRNA의 수회의 전기천공이 상기 표적화 효율을 크게 개선시켰음을 나타내는 그래프 패널이다. 24시간 이내에 3회 이하의 T 세포의 전기천공은 거의 80%의, 최고의 표적화 효율을 제공하였다. 초기 실험에서, TCR 표적화 효율의 단지 15%만이 T 세포에서 성취되었다. CAS9의 지속된 발현이 상기 T 세포내로의 CAS9 mRNA의 전기-전달 후 관찰되었다. 낮은 절단 효율에 대한 있음직한 이유는 gRNA의 빠른 분해에 기인할 수 있다. 보다 높은 CD3 음성 집단이 수득되었다. 도 4B는 캡핑이 gRNA의 기능을 손상시키는 반면, 두 번째 라운드에서 gRNA의 조기 도입은 보다 높은 효율을 제공하였음을 나타내는 그래프 패널이다. 도 4C는 ND221에서 TRAC 및 TRBC를 표적화하는 gRNA의 수회의 전기-전달이 각각 대략 64.5% 및 57.5%의 절단률을 제공하였음을 나타내는 그래프 패널이다.
도 5(도 5A 및 5B 포함)는 TCRneg T 세포를 상이한 자극 조건하에서 증대시킬 수 있었음을 나타낸다. 도 5A는 TCRneg T 세포가 TCR 알파 및 베타 쇄의 TCRneg T 세포내로의 재-도입 후 CD3 발현을 복원하였음을 나타내는 그래프 패널이다. CD3 및 Vb13.1이 TCR 알파 및 베타 쇄의 TCRneg T 세포내로의 전기천공 후 검출되었다. CD3 발현 수준은 TCRpos T 세포에 필적하였다. 도 5B는 상이한 조건들을 TCRneg T 세포를 자극하는데 사용한 후 증대 배수를 나타내는 그래프 패널이다. PBMC REP는 대략 500배 증대를 제공한 반면, CD3/CD28 비드, 또는 K562 aAPC 재-자극은 약 25 내지 58배 증대를 제공하였다.
도 6(도 6A 및 6B 포함)은 상이한 조건하에서 증대 후 TCRneg T 세포 특징을 나타낸다. 도 6A는 상이한 조건하에서 증대 후 TCRneg T 세포 표현형 특징을 나타내는 그래프 패널이다. 도 6B는 상이한 조건하에서 증대 후 TCRneg T 세포 표현형 특징을 나타내는 그래프 패널이다.
도 7(도 7A-7C 포함)은 시험관내에서 재-지시 후 효능 있는 항-종양 활성을 갖는 증대된 TCRneg T 세포를 나타낸다. 도 7A는 TCRneg T 세포가 상기 세포에서 항 NY-ESO 1G4 TCR의 도입에 의해 재-지시될 수 있었음을 나타내는 그래프 패널이다. CAS9 MOCK 그룹에 비해, 1G4 TCR에 의해 재-지시될 때 TCRneg T 세포는 외인성 및 내인성 TCR 알파 및 베타 쇄의 적은 잘못 짝짓기로 인해 보다 높은 수준의 Vb13.1 발현을 나타내었다. 도 7B는 1G4 TCR에 의해 재-지시된 TCRneg T 세포가 종양(Nalm6-ESO) 세포주와 함께 배양시 높은 탈-과립 활성을 가졌음을 나타내는 그래프 패널이다. 도 7C는 1G4 TCR에 의해 재-지시된 TCRneg T 세포가 종양 세포주에 대해 높은 세포독성을 가졌음을 나타내는 그래프이다.
도 8은 지시된 TCRneg T 세포가 재-지시후 NSG 마우스에서 종양의 성장을 억제함을 나타내는 예시 패널이다.
도 9(도 9A-9D 포함)는 HLA-CLASS I 제거가 베타-2 마이크로글로빈의 붕괴에 의해 수득됨을 나타낸다. 도 9A는 HEK293 세포에서 베타-2 마이크로글로빈 유전자좌를 붕괴시킬 수 있는 CRISPR의 서열분석 데이터를 나타낸다. 도 9B는 HLA-CLASS I 음성 T 세포 집단이 베타-2 마이크로글로빈의 붕괴에 의해 생성되었음을 나타내는 그래프 패널이다. 도 9C는 cIFNg가 1차 T 세포에서 베타-2 마이크로글로빈의 표적화 효율을 개선시켰음을 나타내는 그래프 패널이다. 도 9D는 HLA-CLASS Ineg T 세포가 마이크로비드 고갈에 의해 농축되었음을 나타내는 그래프 패널이다.
도 10은 1차 T 세포에서 HLA-CLASS I 및 TCR의 동시 녹아웃을 나타내는 그래프 패널이다. CD4 및 CD8 T 세포를 CD3/CD28 다이나비드로 자극하였다. 자극 후 3일째에, 증대된 T 세포를 TCR β 불변 영역(TRBC) 및 베타-2 마이크로글로빈 표적화 gRNA와 함께 CAS9 mRNA로 전기천공시켰다. TCR 발현 및 베타-2 마이크로글로빈 발현을 모두, 전기천공 후 6일째에 항-CD3 단클론 항체(mAb) 및 항-베타-2 마이크로글로빈 mAb를 사용하여 평가하였다. 숫자는 각 사분면 중의 집단의 비율을 나타낸다.
도 11(도 11A-11D 포함)은 1차 T 세포에서 HLA-CLASS I 및 TCR 알파 및 베타 쇄의 삼중 녹아웃을 나타낸다. 도 11A는 CD4 및 CD8 T 세포를 CD3/CD28 다이나비드로 자극하였음을 나타내는 그래프 패널이다. 자극 후 3일째에, 증대된 T 세포를 TCR 알파, 베타 불변 영역(TRAC, TRBC) 및 베타-2 마이크로글로빈 표적화 gRNA와 함께 CAS9 mRNA로 전기천공시켰다. TCR 발현 및 HLA-CLASS I 발현을 모두, 전기천공 후 6일째에 항-CD3 단클론 항체(mAb) 및 항-베타-2 마이크로글로빈 mAb를 사용하여 평가하였다. 숫자는 각 사분면 중의 집단의 비율을 나타낸다. 도 11B는 HLA-CLASS I 및 TCR 알파 및 베타 쇄 삼중 녹아웃 T 세포의 단리를 도식적으로 예시한다. 도 11C는 GFP 발현에 의해 시험된 전기천공 효율을 나타내는 그래프 패널이다. 도 11D는 유식 세포측정에 의해 측정된 TCRneg T 세포내로의 TCR 알파 및 베타 쇄의 재-도입을 나타내는 그래프 패널이다. 약 64%의 알파 음성 및 약 14%의 베타 음성 집단이 전체 TCRneg T 세포에서 관찰되었다.
도 12(12A-12D 포함)는 293T 세포에서 FAS의 녹아웃을 나타낸다. 도 12A는 FAS가 293T 세포에서 녹아웃되었을 때 다중 피크의 상거 서열분석 결과를 나타내는 상이다. 도 12B는 FAS 단백질의 표면 발현이 CRISPR에 의해 붕괴된 것을 밝히는 FACS 데이터를 나타내는 그래프 패널이다. 도 12C는 CRISPR과의 상동성 재조합 후 FAS 단백질이 GFP에 의해 대체되었음을 나타내는 상들의 패널이다. 도 12D는 CRISPR과의 상동성 재조합의 비율을 나타내는 FACS 데이터의 그래프 패널이다.
도 13은 1차 T 세포에서 FAS의 녹아웃을 나타낸다. FACS 데이터는 표면 FAS 단백질 발현이 CRISPR에 의해 없어짐을 예시하였다.
도 14(도 14A 및 14B 포함)는 293T 및 1차 T 세포에서 PD1의 녹아웃을 나타낸다. 도 14A는 PD1이 293T 세포에서 표적화되었을 때 다중 피크의 상거 서열분석 결과를 나타내는 상이다. 도 14B는 CRISPR에 의해 붕괴된 PD1 단백질의 표면 발현의 FACS 데이터를 나타내는 그래프 패널이다.
도 15(도 15A 및 15B 포함)는 293T 및 1차 세포, 예를 들어 CCD1079-SK에서 CTLA4의 녹아웃을 나타낸다. 도 15A는 CTLA4가 293T 세포에서 표적화되었을 때 다중 피크의 상거 서열분석 결과를 나타내는 상이다. 도 15B는 제한 희석 및 단세포 증대 후 서열 데이터를 나타내는 상이다. 상거 서열분석 결과는 상기 CTLA4 게놈 유전자좌에서 결실 및 삽입을 나타내었다.
도 16은 293T에서 PPP2r2d의 녹아웃을 나타낸다. 상거 서열분석 데이터는 PPP2r2d가 CRISPR에 의해 293T 세포에서 표적화됨을 가리켰다.
도 17(도 17A 및 17B 포함)은 FAS 녹아웃 T 세포로부터 iPSC의 생성을 나타낸다. 도 17A는 FASneg T 세포의 iPSC로의 재프로그램화 과정 중 형태 변화를 나타내는 상들의 패널이다. 전형적인 배아 줄기세포 형태 형성은 FASneg T 세포가 다능성 상태로 유도될 수 있음을 가리킨다. 도 17B는 FASneg T 세포가 야생형 대응물의 약 5배의 효율로 iPSC로 재프로그램화되었음을 나타내는 그래프이다. p53 결함 세포주는 세포사멸 경로의 장애로 인해 보다 쉽게 재프로그램화되는 것으로 보고되었다. FAS 녹아웃은 유사한 기전에 의해 상기 재프로그램화 과정을 촉진할 수 있다.
도 18(도 18A 및 18B 포함)은 CD3neg T 세포로부터 iPSC의 생성을 나타낸다. 도 18A는 한정된 재프로그램화 조건하에서 CD3neg TCR 알파 또는 베타 쇄 녹아웃 T 세포에 의해 형성된 ES-형 형태를 나타내는 상들의 패널이다. 상기 형태는 수회의 계대 후 일정하게 남아있는다. 도 18B는 CD3neg T 세포의 재프로그램화가 야생형 대응물보다 약 5배 더 효율적임을 나타내는 일련의 그래프이며, 이는 TCR 녹아웃이 T 세포 재프로그램화 과정에서 한 역할을 하거나 또는 센다이 바이러스 감염 후 세포 생육력에 영향을 미칠 수 있음을 암시한다.
도 19는 siRNA를 갖고 제2 디설파이드 결합 및 탈-N-글리코실화가 베타 쇄에 부가된 내인성 T 세포 수용체(TCR)의 녹다운을 나타내는 그래프이다.
도 20(도 20A 및 20B 포함)은 CAS9 RNA 및 gRNA에 의한 TCR 녹아웃을 나타낸다. 전기천공 후 6일째에, 세포를 CD3의 평가에 의해 TCR 발현에 대해 분석하였다.
도 21은 CD3 마이크로비드 고갈 후 PCR 서열분석 결과를 나타내는 예시이다.
도 22는 NY-ESO-1 TCR RNA 전기천공 후 4시간째의 CD3의 재-발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 23(도 23A-23D 포함)은 내인성 TCR의 녹다운이 TCR RNA 전기천공된 T 세포의 트랜스유전자 발현 및 기능을 모두 증대시켰음을 나타내는 그래프 패널이다. 도 23A는 TCR siRNA(실선 개방 막대그래프), 대조군 siRNA(점선 개방 막대그래프)로 전기천공된 T 세포 및 어떠한 siRNA도 없는 T 세포(색칠 된 막대그래프)의 TCR 발현을 나타낸다. 도 23B는 야생형 NY-ESO-1 TCR(wt) 또는 TCR siRNA, 대조군 siRNA를 갖거나, 또는 siRNA가 없는, 변형된 TCR(SD) RNA 전기천공된 T 세포의 트랜스유전자(TCR vb13.1) 발현을 나타낸다. 도 23C는 야생형 NY-ESO-1 TCR(wt) 또는 TCR siRNA, 대조군 siRNA를 갖거나, 또는 siRNA가 없는, 변형된 TCR(SD) RNA 전기천공된 T 세포의 NY-ESO-1 사량체 염색을 나타낸다. 도 23D는 TCR siRNA 녹다운, 야생형 NY-ESO-1 TCR RNA 전기천공된 T 세포에 의한 HLA-A2/NY-ESO-1 양성 종양 세포주의 특이적 용해를 나타낸다.
도 24는 마우스 모델에서 T 세포의 주사 후 종양 세포의 형광을 나타내는 그래프이다. NY-ESO-1 및 GFP를 모두 발현하는 10x106개 Nalm6-CBG-ESO-GFP(녹색 방아벌레) 종양 세포를 NOD/SCID 마우스에게 정맥내 주사하였다. 종양 접종 후 5일째에, CBR 형질도입되고 RNA 전기천공된 T 세포를 상이한 그룹들에 지시된 대로 주사하고 종양 세포를 형광에 의해 검출하였다.
도 25는 시간에 따른 마우스 모델에서 주사된 종양 및 하이브리드 TCR T 세포의 형광을 나타내는 상들의 패널이다.
도 26은 보편적인 CAR19 T 세포의 생성을 나타내는 상들의 패널이다. 도면의 상부는 상기 보편적인 CAR19 T 세포의 생성을 위한 프로토콜의 예시이다. 좌측 그래프는 렌티바이러스-CAR19 유전자 형질도입 후 CAR19 양성 T 세포의 비율을 나타낸다. 우측 그래프 패널은 분류 전후의 TCR 단일 음성 및 TCR/HLA-A 이중 음성 T 세포의 비율을 나타낸다.
도 27은 조사된 CD19 제공 K562 세포로 자극 후 CD19 양성 세포의 증대 배수를 나타내는 그래프 및 표의 패널이다.
도 28A는 K562-CD19 증대된 세포의 내인성 및 트랜스제닉 유전자 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 28B는 내인성 TCR 발현이 TCR 단일 음성 세포에서 음성으로 남아있는 반면, TCR 및 HLA-A 발현은 K562-CD19 자극된 증대 후 TCR/HLA-A 이중 음성 T 세포에서 음성으로 남아있음을 나타내는 그래프 패널이다.
도 29A는 증대된 보편적인 CAR19 T 세포의 대부분이 CD45RO 양성이고 중간 수준의 CD28 발현을 발현하였음을 나타내는 그래프 패널이다.
도 29B는 증대된 보편적인 CAR19 T 세포의 대부분이 높은 수준의 CD62L 발현 및 낮은 수준의 CCR7 발현을 유지하였음을 나타내는 그래프 패널이다.
도 30A는 CRISPR 유전자 편집이 시험관내에서 보편적인 CAR19 T 세포의 항-종양 활성에 영향을 미치지 않았음을 나타내는 그래프이다.
도 30B는 TCR 단일 및 TCR/HLA-A 이중 음성 CAR19 T 세포가 Nalm6 종양 세포로 공격시 확고한 용해 능력을 나타내었음을 나타내는 그래프 패널이다.
도 30C는 세포의 효능 있는 항-종양 활성 부분으로서 사이토킨 분비를 나타내는 그래프 패널이다.
도 30D는 Nalm6 종양 세포로 공격 후 유사한 증식 동역학을 나타낸 CAR19 T 세포에서 TCR 단일 제거 또는 TCR 및 HLA-A 이중 제거를 나타내는 그래프 패널이다.
도 31은 CRISPR 유전자 편집이 생체내에서 보편적인 CAR19 T 세포의 항-종양 활성에 영향을 미치지 않았음을 나타내는 상들의 패널이다. 조작되지 않은 T 세포를 수용한 마우스 및 렌티바이러스 GFP 형질도입된 야생형 T 세포가 주입된 마우스는 모두 종양 세포 주입 후 3주 이내에 죽었다. 객관적인 종양 퇴화가 CAR19 T 세포를 수용한 마우스에서 관찰되었다. CRISPR 편집된 TCR 신호 또는 TCR/HLA-A 이중 음성 보편적인 CAR19 T 세포는 동일한 항-종양 활성을 나타내었다.
도 32A는 T 세포에서의 TCR 단일 또는 TCR 및 HLA-A 이중 제거가 동종이계 반응성을 급격하게 감소시켰음을 나타내는 그래프 패널이다.
도 32B는 HLA-A 분자의 제거가 장기간(5일) 함께 배양된 NK 세포를 활성화시켰음을 나타내는 그래프 패널이다.
도 32C는 세포를 IFNr 아이스폿(Eispot) 분석에서 24시간 동안 동종이계 전혈 PBMC에 의해 공격했을 때 표적-외 활성이 관찰되지 않았음을 나타내는 그래프이다.
도 33은 FAS 제거가 CAR19 T 세포의 항-종양 활성을 증대시켰음을 나타내는 그래프 패널이다. FAS 음성 CAR19 T 세포를 생성시켰다. FAS 제거는 유식 세포측정 분석에 의해 확인되었다. FASneg T 세포의 CAR19 유전자 발현은 야생형에 필적하였다. 4시간의 짧은 기간 동안 Nalm6 종양 세포와 배양후에조차, CD107a 발현은 야생형 대응물에 비해 FASneg CAR19 T 세포에서 크게 증대되었다.
도 34A는 CAR19 T 세포에서 FAS 제거가 시험관내 항원 조건하에서 CART 세포 생존 및 증식을 증대시켰음을 나타내는 그래프이다. FASneg CAR19 T 세포는, 상기 세포를 높은 수준의 CD19+ K562 세포로 자극시 야생형 CAR19 T 세포보다 더 빨리 증대되었다.
도 34B는 FASneg CAR19 T 세포가 애넥신(Annexin) V 염색에 의해 측정된 바와 같이 세포사멸 수준을 감소시켰음을 나타내는 그래프 패널이다.
도 35A는 CAR19 T 세포의 FAS 제거가 동물 모델에서 CART 세포 기능을 증대시켰음을 나타내는 그래프이다. 시험관내에서 관찰된 바와 같이, FASneg T 세포는 야생형 T 세포에 비해 증대된 증식을 나타내었다.
도 35B는 FASneg CAR19 그룹이 야생형 그룹과 비교시 우수한 항-종양 활성을 나타내었음을 나타내는 상들의 패널이다.
도 35C는 FASneg CAR19 그룹과 야생형 그룹간의 생물발광 데이터의 현저한 차이를 나타내는 그래프이다.
도 36은 PD1 음성 PSCA-CAR T 세포의 생성을 나타내는 그래프 패널이다. PD1 제거는 유식 세포측정 분석에 의해 확인되었다. PD1 음성 세포를 마이크로비드 고갈에 의해 농축시켰다. 야생형 또는 PD1 음성 PSCA-CAR T 세포를 조사된 PSCA 항원 제공 PC3 종양 세포에 의한 자극에 의해 증대시켰다. PSCA-CAR 양성 세포를 증대 후 농축시켰다.
도 37은 PSCA-CAR T 세포에서 PD1 제거 및 CD137 발현이 시험관내 항원 조건하에서 CART 세포 활성화를 증대시켰음을 나타내는 그래프 패널이다.
도 38A는 생체내 PC3-PSCA-PDL1 NSG 모델에서 PD1 제거를 나타내는 상들의 패널이다. 상기 PSCA-CAR T 세포는 야생형 그룹에 비해 증대된 CART 세포 생체내 항-종양 활성을 나타내었다.
도 38B는 PD1 음성 및 야생형 그룹간의 종양 크기의 차이를 나타내는 그래프이다.
도 39는 TCR 또는 TCR/HLA-I 제거된 T 세포가 이식편 대 숙주병(GVHD)을 유발하지 않았음을 나타내는 조직학적 상들의 패널이다. 이중 또는 삼중 녹아웃 CART 세포로 처리된 마우스는 GVHD의 어떠한 징후도 나타내지 않았다. 대조적으로, 야생형 CD19 CART 그룹으로부터의 4마리 마우스 중 3마리는 65일까지 GVHD를 발병하였으며, 이는 상이한 기관의 조직 검사에 의해 확인되었다.
도 40A는 TCR 또는 TCR/HLA-I 제거된 T 세포가 주사된 동물의 생존 퍼센트를 나타내는 그래프이다. 마우스를 준-치사량으로 조사하고 주사하였다. 야생형 T 세포를 수용한 5마리 마우스 중 4마리는 60일 연구 중에 GVHD로 인해 죽었다. PBS 처리된, TCR 단일 및 TCR/HLA-I 이중 제거된 T 세포 처리된 그룹은 GVHD의 어떠한 징후도 나타내지 않았다.
도 40B는 야생형 T 세포, PBS 처리된, TCR 단일 또는 TCR/HLA-I 이중-제거된 T 세포를 수용한 마우스의 체중을 나타내는 그래프 패널이다.
도 41A는 CRISPR/Cas9로 PD1 및 Fas 경로를 차단 후 보편적인 CART 세포의 개선된 항-종양 활성을 나타내는 상들의 패널이다. Nalm6-PDL1 함유 마우스에 주사시 우수한 항-종양 활성이 PD1 녹아웃 보편적인 CD19-CART 세포에서 검출되었다.
도 41B는 상이한 CRISPR/Cas9 편집된 T 세포를 수용한 마우스의 정량적인 생물발광 데이터를 나타내는 그래프이다.
도 42는 보편적인 CART 세포를 생성시키는 원-샷(one-shot) 시스템을 예시하는 패널이다. gRNA는 분해되기 쉽기 때문에, 단일 렌티바이러스 벡터 중에서 CAR과 함께 gRNA를 구성적으로 발현하는 단순화된 원-샷 방법이 개발되었다.
도 43은 원-샷 시스템에 의한 효율적인 유전자 제거를 나타내는 그래프 패널이다. Cas9 mRNA의 전기-전달 후 상이한 양의 CD3 제거가 관찰되었다.
도 44A는 Fas 녹아웃 T 세포로부터 iPSC의 재프로그램화 과정 중 형태적 변화를 나타내는 상들의 패널이다. 전형적인 배아 줄기 세포 형태 형성은 FASneg T 세포가 다능성 상태로 유도될 수 있음을 가리킨다.
도 44B는 FASneg T 세포가 야생형 대응물의 약 5배의 효율로 iPSC로 재프로그램화되었음을 나타내는 그래프이다. p53 결함 세포주는 세포사멸 경로의 장애로 인해 보다 쉽게 재프로그램화되는 것으로 보고되었다. FAS 녹아웃은 유사한 기전에 의해 상기 재프로그램화 과정을 촉진할 수 있다.
도 45A는 한정된 재프로그램화 조건하에서 CD3neg TCR 알파 또는 베타 쇄 녹아웃 T 세포로부터의 iPSC의 ES-형 형태를 나타내는 상들의 패널이다. 상기 형태는 수회의 계대 후 일정하게 남아있었다.
도 45B는 CD3neg T 세포의 재프로그램화가 야생형 대응물보다 약 5배 덜 효율적임을 나타내는 일련의 그래프이며, 이는 TCR 녹아웃이 T 세포 재프로그램화 과정에서 한 역할을 하거나 또는 센다이 바이러스 감염 후 세포 생육력에 영향을 미칠 수 있음을 암시한다.
도 45C는 CD3neg iPSC 세포의 포스파타제 염색을 나타내는 상들의 패널이다.
도 46은 상이한 T-iPSC 세포주에서 내인성 다능성 줄기세포 유전자의 유도를 나타내는 그래프 패널이다.
도 47A는 Tra-1-60 및 SSEA4 발현에 대한 면역염색을 나타내는 상들의 패널이다.
도 47B는 상거 서열분석에 의한 T-iPSC의 Fas 녹아웃의 확인을 나타내는 상이다.
도 48A는 상이한 버전의 Cas9에 의한 나이브 T 세포에서의 유전자 제거를 나타내는 그래프 패널이다. CD3는 dCas9 및 FokI-Cas9로 녹아웃되었다.
도 48B는 dCas9 및 FokI-Cas9의 유전자 제거를 위해 2개의 gRNA가 필요함을 나타내는 그래프 패널이다.
도 48C는 CRISPR/cas9에 의한 유전자 변형된 T 세포에서 드문 표적-외 사건들을 나타내는 상이다.
도 49는 CRISPR/Cas9의 T 세포내로의 도입 전략을 나타내는 상들의 패널이다. T7 프로모터에 의해 구동된 gRNA의 도식적 표현을 좌측에 나타낸다. CRISPR 시스템을 사용하는 유전자-편집된 항원-특이성 T 세포의 생성에 대한 도식적 표현을 우측에 나타낸다. T 세포를 CD3/CD28 비드 자극 후 3일째에 특이적인 유전자를 표적화하는 Cas9 mRNA 및 gRNA로 전기천공시키고 이어서 IL2의 존재하에 32 ℃에서 24시간 동안 배양한 후에 통상적인 37 ℃ 배양 조건으로 복귀시켰다. 특이적인 유전자-붕괴된 T 세포를 8일째에 분류하고 렌티바이러스 형질도입 또는 mRNA 전기천공 유전자 전달에 의해 CAR 또는 TCR로 재지시하였다.
도 50A는 CRISPR/Cas9가 T 세포에서 효율적인 TCR 붕괴를 매개함을 나타내는 그래프 패널이다. 37 ℃ 또는 32 ℃에서 배양된 CRISPR/Cas9 편집된 T 세포의 CD3 발현.
도 50B는 연속적인 CRISPR RNA 전기천공 후 배양된 CRISPR/Cas9 편집된 T 세포의 CD3 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 51A는 T 세포에서 발생한 효율적인 CRISPR 유전자 붕괴를 나타내는 그래프 패널이다. T 세포의 CD3 발현은 상이한 Cas9:gRNA 비(상부 및 중간 패널) 및 양의 전체 CRISPR RNA(하부 패널)를 사용하여 CRISPR로 전달되었다.
도 51B는 유식 세포측정 및 클론 서열분석 모두에 의해 계산된 표적화 효율을 나타내는 표이다.
도 52는 세포로부터 증폭된 DNA상의 오합치-선택성 T7 측량자 뉴클레아제 분석에 의해 측정된 TCR-표적화된 유전자 붕괴의 양을 나타내는 상이다. TRAC 및 TRBC에서 표적화된 유전자 붕괴의 계산된 양을 기부에 나타낸다. 화살표는 예상된 밴드를 가리킨다.
도 53A는 TCR α 및 β 유전자좌의 CRISPR-매개된 재조합 후 PCR 앰플리콘의 클론 서열 분석에 의해 관찰된 삽입-결실(유전자 붕괴에서)의 상이다.
도 53B는 TCR α 및 β 불변 영역의 게놈 유전자좌내 TCR α 및 β CRISPR gRNA 표적화 부위를 암호화하는 인간 유전자좌의 도해의 상이다. 각각의 엑손을 블록으로 나타낸다. 화살표: 센스 가닥 gRNA 표적화 부위; 청색 화살표: 안티-센스 가닥 gRNA 표적화 부위. 상거 서열분석 결과 중 다중 피크는 TRAC 및 TRBC 게놈 유전자좌에서 NHEJ의 CRISPR-매개된 사건들을 나타낸다.
도 54는 정제된 TCRneg 세포에서 CD3 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 55는 1G4 TCR(α 및 β) 또는 CAR19 mRNA의 전기전달을 통한 TCR/CD3neg 세포의 재지시를 나타내는 그래프 패널이다.
도 56은 상이한 자극 조건을 사용하여 10일 후 TCR/CD3neg 세포 증대를 나타내는 그래프이다.
도 57은 CRISPR/Cas9 편집이 1차 T 세포의 항종양 효능을 손상시키지 않았음을 나타내는 그래프 패널이다. 4개의 상이한 증대 기법 후 TCR/CD3neg 세포의 표현형들을 나타낸다.
도 58은 CD19-CAR RNA의 Cas9 MOCK 및 TCR/CD3neg 세포로의 전기전달 후 상대적인 CD19-CAR 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 59A는 Nalm6 표적 세포와 배양 후 CD107 방출 분석에 의해 확인된 바와 같이 CD19-CAR 재지시된 Cas9 MOCK 및 TCR/CD3neg 세포간에 현저한 기능상 차이가 관찰되지 않았음을 나타내는 그래프 패널이다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 전형적인 데이터를 나타낸다. 막대, 표준 오차.
도 59B는 Nalm6 표적 세포와 배양 후 세포독성 분석에 의해 확인된 바와 같이 CD19-CAR 재지시된 Cas9 MOCK 및 TCR/CD3neg 세포간에 현저한 기능상 차이가 관찰되지 않았음을 나타내는 그래프이다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 전형적인 데이터를 나타낸다. 막대, SE = 표준 오차.
도 59C는 Nalm6 표적 세포와 배양 후 IL2 및 IFNγ 분비에 의해 확인된 바와 같이 CD19-CAR 재지시된 Cas9 MOCK 및 TCR/CD3neg 세포간에 현저한 기능상 차이가 관찰되지 않았음을 나타내는 그래프 패널이다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 전형적인 데이터를 나타낸다. 막대, SE = 표준 오차.
도 59D는 1x106 Nalm6 종양 세포 주사된(i.v.) NOD/scid/γc(-/-) 마우스(n=12)(상기 마우스는 3개의 그룹으로 무작위 분류되었다)의 상들의 패널이다. 전기천공 후 CD19-CAR을 발현하는 Cas9 MOCK 및 TCR/CD3neg T 세포(10x106)를 총 3회의 주사에 대해서 매 4일마다 i.v. 주사하였다(화살표). RNA로 전기천공되지 않은 T 세포로 처리된 마우스를 대조군으로서 제공하였다. 지시된 바와 같은 생존 동물로부터 상들을 수득하였다. T 세포 처리 시작 하루 전에 영상화를 개시하였다. 막대, SE = 표준 오차, EP = 전기천공; E:T = 효과기 대 종양 비; 화살표, T 세포 주입 시점; ns, 유의수준 아님. ****P<0.0001, ns 2-원 ANOVA + 본페로니 사후 검정에 의해.
도 59E는 형광 세포의 휘도를 나타내는 그래프이다.
도 60은 보편적인 효과기 세포를 생성시키기 위한 CRISPR/Cas9에 의한 이중 및 삼중 유전자 제거를 나타내는 그래프 패널이다. B2M을 표적화하는 gRNA에 의한 HLA-I 붕괴.
도 61은 본 명세서에 기재된 바와 같은 보편적인 효과기 세포를 생성시키기 위한 프로토콜의 흐름도이다.
도 62는 TCR 제거가 비-특이적인 살해 활성을 없앴음을 나타내는 그래프 패널이다. 624mel-CBG 및 PC3-CBG 종양 세포주를 24시간 동안 20:1의 효과기 대 표적 비로, PHA로 전-처리된 또는 상기로 전처리되지 않은 T 세포와 배양하였으며 루시페라제 분석을 근거로 세포독성을 계산하였다. 데이터는 평균±SD이다; n=3.
도 63은 유전자-제거된 T 세포를 조사된 동종이계 PBMC(좌측 패널)로 공격하거나 또는 동종이계 PBMC를 조사된 유전자-제거된 T 세포와 함께 배양함으로써 TCR 및 TCR/HLA 붕괴의 동종이계 반응성을 측정하는 IFNγ 엘리스폿(Elispot) 분석을 나타내는 그래프 패널이다. 특정한 점들을 y축상에, 자극제 존재하에서 생성된 점 - 효과기 단독에 의해 생성된 점으로서 나타낸다. **P<0.01 만-휘트니 검정에 의해서.
도 64는 CRISPR/Cas9에 의한 내인성 TCR의 붕괴가 TCR-재지시된 T 세포 기능을 개선시켰음을 나타내는 그래프 패널이다. Vb13.1 및 CD3 발현이, NY-ESO-1 TCRα(1G4 α, 2ug), β(1G4β, 2ug) 또는 α+β RNA(1G4α+β, 2+2ug) RNA로 전기천공된, 붕괴된 내인성 TCRα 단독(αKO), β 단독(βKO), α 및 β 이중(α+β KO)을 갖는 Cas9 mRNA 단독(Cas9 Mock) 또는 CD3neg T 세포로 형질감염된 T 세포에서 나타났다.
도 65A는 HLA-A2/NY-ESO-1-양성 세포주(Nalm6-ESO) 또는 대조군 세포주 Nalm6로 자극된 TCR(1G4) α/β RNA 전기천공된 TCR α 또는 β 단일 녹아웃 또는 α+β 이중 녹아웃 T 세포의 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다.
도 65B는 Nalm6-ESO에 대한 루시페라제-기재 CTL 분석에서 (a)에 나타낸 TCR α+β RNA(1G4 TCR) 전기천공된 TCR α 또는 β 단일-녹아웃 또는 α+β 이중-녹아웃 T 세포의 용해 능력을 나타내는 그래프이다.
도 66은 대조군 Cas9 Mock T 세포와 비교된, 2개의 상이한 NY-ESO-1 TCR RNA(1G4 TCR, 10ug 또는 8F TCR, 10ug)로 전기천공된 TCR α+β 이중-붕괴된 T 세포(TCRneg T 세포)에서 V베타 및 CD3 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 67A는 HLA-A2/NY-ESO-1-양성 세포주 Nalm6-ESO, 624-mel 또는 U266으로 자극된 NY-ESO-1 TCR(1G4 TCR 또는 8F TCR) RNA 전기천공된 TCR 이중-녹아웃 CD8+ T 세포에서 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다. Nalm6을 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 67B는 HLA-A2/NY-ESO-1-양성 세포주 Nalm6-ESO 또는 U266으로 자극 후 NY-ESO-1 TCR(1G4 TCR 또는 8F TCR) RNA 전기천공된 TCR 이중-녹아웃 T 세포의 사이토킨 생성(IL-2 및 TNF-α)을 나타내는 그래프 패널이다; 888mel 흑색종 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.0001, 2-원 ANOVA + 본페로니 사후 검정에 의해.
도 68은 렌티바이러스 유전자 전달 및 CRISPR/Cas9 전기천공의 조합에 의한 보편적인 CART 세포의 생성을 나타내는 상들의 패널이다. 보편적인 CD19-CART 세포의 생성에 대한 흐름도를 나타낸다. T 세포를 자극 후 1일째에 렌티바이러스 CD19-CAR로 형질도입시키고, TCR α 및 TCR β 쇄를 표적화하는 Cas9 mRNA 및 gRNA를 2일 후에 상기 T 세포에 전기천공시켰다. 증대를 위한 재자극 전에 상기 TCR 및 HLA-I 이중-음성 세포 집단을 농축시켰다.
도 69는 1G4 TCR 전기천공 후 CD3/CD28 비드 자극에 의해 증대된 유전자-변형된 렌티-CD19-CAR T 세포에서 CD19-CAR 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 70은 CD19-CAR T 세포의 표현형을 나타내는 그래프 패널이다.
도 71은 TCR-음성 및 TCR/HLA-I 이중-음성 CD19-CAR T 세포에서 CD107a 방출을 나타내는 그래프이다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 전형적인 데이터를 나타낸다. 막대, SE = 표준 오차.
도 72는 TCR-음성 및 TCR/HLA-I 이중-음성 CD19-CAR T 세포의 사이토킨 분비를 나타내는 그래프 패널이다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 전형적인 데이터를 나타낸다. 막대, SE = 표준 오차.
도 73은 TCR-음성 및 TCR/HLA-I 이중-음성 CD19-CAR T 세포의 종양 용해 능력을 나타내는 그래프이다. 3개의 독립적인 실험으로부터의 전형적인 데이터를 나타낸다. 막대, SE = 표준 오차.
도 74는 72시간 동안 1 내지 10의 비로 K562 및 표적 K562-CD19 종양 세포와 함께 배양된 CFSE-표지된 CD19-CAR 및 형질도입되지 않은 T 세포를 나타내는 그래프 패널이다.
도 75A는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 CD19-CAR 및 GFP를 발현하는 7일째 단일 주사로 처리된 마우스로부터의 BLI를 나타내는 그래프이다. ns, 2-원 ANOVA + 본페로니 사후 검정에 의해 차이 없음. 종양을 1x106 Nalm6 세포의 i.v. 주사에 의해 NSG 마우스(n=4/그룹)에서 확립시켰다. 7일째에 시작하여, 렌티바이러스(LV) 형질도입된 CD19-CAR을 발현하는 T 세포(1x107)를 단일 주사로 주입하였다. LV GFP 단백질을 발현하는 T 세포를 대조군으로서 주사하였다.
도 75B는 LV-GFP, LV-CD19-CAR, LV-CD19-CAR-TCR/CD3neg 및 LV-CD19-CAR-TCR/HLA-Ineg T 세포를 수용한 마우스의 전체적인 생존을 나타내는 그래프이다. ns, 로그-순위 만텔-콕스 검정에 의해 차이 없음.
도 76은 유전자-변형된 CAR T 세포가 항종양 효능을 유지하였으며 GVHD를 유도하지 않았음을 나타내는 상들의 패널이다. 종양을 1x106 Nalm6 세포의 i.v. 주사에 의해 NSG 마우스(n=4/그룹)에서 확립시켰다. 7일째에 시작하여, LV-CD19-CAR을 발현하는 T 세포(2x107)를 단일 주사로 주입하였다. LV GFP 단백질을 발현하는 T 세포를 대조군으로서 주사하였다. T 세포 처리 하루 전에 영상화를 개시하였다. 상이한 처리 그룹들로부터 무작위로 선택된 마우스의 기관을 65일째에 수집하고 CD3 면역조직화학 염색에 사용하였다. 도 77은 PD1, Fas 및 TCR 알파 쇄를 표적화하는 pAd5F35-CRISPR의 설계를 나타내는 벡터의 일련의 개략도이다.
도 78은 항-CD3 ScFv의 5개 단위의 변형된 pAd5F35-CRISPR의 설계, 및 시험관내 및 생체내에서 T 세포내로의 녹인/녹아웃 키메릭 항원 수용체에 대한 pAd5F35-CRISPR의 도식적 전달을 나타내는 삽화이다.
도 79A는 PD1-gRNA 표적화 부위에 인접한 PCR 산물의 상거 서열분석을 나타내는 그래프이다. 아데노바이러스-pAd5F35-CRISPR-PD1 바이러스를 MD231 세포내에 형질도입시켰다. 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고 PCR을 수행하였다.
도 79B는 아데노바이러스-CRISPR 조작 후 MDA231 세포에서 표적화 사건들의 서열을 나타낸다. PD1 PCR 산물을 TOPO 벡터내에 클로닝시키고 서열분석하였다.
도 80은 gRNA 사용의 감소가 T 세포 증대 배수를 개선시키고 녹아웃 효율을 단지 약간 감소시켰음을 나타내는 차트이다.
도 81은 개선된 T 세포 증대 배수와 함께 높은 CD3/B2M 녹아웃 효율을 수득하기 위해 전기천공 조건을 최적화하는데 사용되는 매개변수들을 나타내는 차트이다. 2 ㎜ 큐벳(EP#10-13) 또는 4 ㎜ 큐벳에서 표준 전기천공(EP) 조건들과 비교하였다. 높은 CD3/B2M 녹아웃 효율이 개선된 T 세포 증대 배수와 함께 관찰되었다(EP#1 및 5).
도 82는 허용 가능한 녹아웃 효율과 함께 최대의 증대 배수를 성취하기 위한 EP 조건의 최적화를 나타내는 차트이다.
도 83은 허용 가능한 녹아웃 효율과 함께 최대의 증대 배수를 성취하기 위한 추가적인 EP 조건의 최적화를 나타내는 차트이다.
도 84는 T 세포 자극, 렌티바이러스 형질도입 및 CRISPR 전기천공 과정에 대한 도표이다.
도 85는 전기천공 및 배양 과정 후 T 세포수(상부 차트) 및 증대 배수(하부 차트)를 나타내는 차트이다.
도 86은 T 세포의 평균 증대를 나타내는 그래프 패널이다. CD19 CAR 단독(TD 단독)이 형질도입된 또는 CD19 CAR이 형질도입되고 CRISPR로 편집된(TD/KO) T 세포의 증대 배수(좌측 그래프). 10일째에 상기 T 세포의 증대 배수를 우측 그래프에 나타낸다.
도 87은 증대된 T 세포의 8일째 CD3/B2M/CAR 발현을 나타내는 흐름 그래프 패널이다.
도 88은 CD3+ T 세포 고갈 후 CD3/B2M 발현을 나타내는 그래프 패널이다.
도 89는 CD19 CAR TD(형질도입된)/CRISPR 전기천공된, CD3 고갈된 T 세포; CD19 CAR TD/CRISPR 전기천공된 T 세포; 및 CD19 CAR TD T 세포에서 11일째에 CD3/B2M 발현을 나타내는 그래프 패널이다. 형질도입되지 않은 ND463(NOTD)을 음성 대조군으로서 사용하였다. 도 90은 CD19 CAR TD(형질도입된)/CRISPR 전기천공된, CD3 고갈된 T 세포; CD19 CAR TD/CRISPR 전기천공된 T 세포; 및 CD19 CAR TD T 세포에서 11일째에 CD19 CAR 발현을 나타내는 그래프 패널이다. 형질도입되지 않은 ND463(NOTD)을 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 91은 CD19 CAR TD(형질도입된)/CRISPR 전기천공된, CD3 고갈된 T 세포; CD19 CAR TD/CRISPR 전기천공된 T 세포; 및 CD19 CAR TD T 세포에서 11일째에 CD3/B2M/CAR 발현을 나타내는 그래프 패널이다. 형질도입되지 않은 ND463(NOTD)을 음성 대조군으로서 사용하였다.
도 92는 CD19 CAR TD(형질도입된)/CRISPR 전기천공된, CD3 고갈된 T 세포; CD19 CAR TD/CRISPR 전기천공된 T 세포; 및 CD19 CAR TD T 세포에서 CD3/B2M/CAR 발현을 요약하는 차트이다.
도 93은 CD19 CAR TD(형질도입된)/CRISPR 전기천공된, CD3 고갈된 T 세포; CD19 CAR TD/CRISPR 전기천공된 T 세포; 및 CD19 CAR TD T 세포에서 CD107a 상향-조절을 나타내는 그래프 패널이다.
도 94는 11일째에 T 세포의 용해 활성을 나타내는 그래프 패널이다.
도 95는 11일째에 T 세포의 사이토킨 생성을 나타내는 그래프 패널이다.
도 96은 T 세포 증대를 나타내는 그래프 패널이다. 비정상적인 T 세포 생육은 관찰되지 않았다.
정의
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에 사용되는 모든 기술과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 개시된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질을 본 발명의 시험을 위한 실시에 사용할 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법을 본 명세서에 기재한다. 본 발명의 기재 및 청구에서, 하기의 용어가 사용될 것이다.
본 명세서에 사용되는 용어는 단지 특정한 실시태양을 기재하기 위한 것이며, 제한을 의도하지 않음을 또한 알아야 한다.
"하나의"라는 관사는 본 명세서에서 상기 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나보다 많은(즉 적어도 하나)을 지칭하는데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나보다 많은 요소를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "약"은 양, 시간적 지속 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 명시된 값의 ±20% 또는 ±10%, 보다 바람직하게는 ±5%, 훨씬 더 바람직하게는 ±1%, 및 더욱 더 바람직하게는 ±0.1%의 변화를 포함함을 의미하며, 상기와 같은 변화는 개시된 방법을 수행하기에 적합하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "활성화"는 검출 가능한 세포 증식을 유도하기에 충분히 자극된 T 세포의 병증을 지칭한다. 활성화는 또한 유도된 사이토킨 생성, 및 검출 가능한 효과기 기능과 관련될 수 있다. "활성화된 T 세포"란 용어는 특히, 세포 분열을 겪고 있는 T 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항체"란 용어는 항원과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 지칭한다. 항체는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 완전한 면역글로불린일 수 있으며 완전한 면역글로불린의 면역반응성 부분들일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 본 발명에서 항체는 다양한 형태들, 예를 들어 다클론 항체, 단클론 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2뿐만 아니라 단쇄 항체(scFv) 및 인간화된 항체로 존재할 수 있다(Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
"항체 단편"이란 용어는 완전 항체의 일부를 지칭하며 완전 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항체 중쇄"는 천연 입체형태로 모든 항체 분자 중에 존재하는 폴리펩티드 쇄의 2가지 유형 중 보다 큰 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항체 경쇄"는 천연 입체형태로 모든 항체 분자 중에 존재하는 폴리펩티드 쇄의 2가지 유형 중 보다 작은 것을 지칭한다. α 및 β 경쇄는 2가지 주요 항체 경쇄 아이소타입들을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "합성 항체"란 용어는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성되는 항체, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 박테리오파지에 의해 발현된 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한, 항체를 암호화하고 항체 단백질을 발현하는 DNA 분자 또는 상기 항체를 명시하는 아미노산 서열의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 해석되어야 하며, 여기에서 상기 DNA 또는 아미노산 서열은 당해 분야에서 입수할 수 있고 주지되어 있는 합성 DNA 또는 아미노산 서열 기술을 사용하여 수득되었다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항원" 또는 "Ag"란 용어는 면역 반응을 일으키는 분자로서 정의된다. 상기 면역 반응은 항체 생성, 또는 특정한 면역학적으로-적격인 세포의 활성화, 또는 이 둘 모두를 포함할 수 있다. 숙련가는 실질적으로 모든 단백질 또는 펩티드를 포함한 임의의 거대분자가 항원으로서 작용할 수 있음을 알 것이다. 더욱 또한, 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 따라서 숙련가는 면역 반응을 이끌어내는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항원"을 암호화함을 알 것이다. 더욱 또한, 당해 분야의 숙련가는 항원이 오직 유전자의 전장 핵산 서열에 의해서만 암호화될 필요는 없음을 알 것이다. 본 발명이 비제한적으로 하나 초과의 유전자의 부분 뉴클레오티드 서열의 용도 및 이들 뉴클레오티드 서열을 목적하는 면역 반응을 이끌어내기 위해서 다양한 조합들로 배열함을 포함함은 쉽게 자명하다. 더욱이, 숙련가는 항원이 전혀 "유전자"에 의해 암호화될 필요가 없음을 알 것이다. 항원이 생물학적 샘플로부터 생성되거나, 합성되거나 유래할 수 있음은 쉽게 자명하다. 상기와 같은 생물학적 샘플은 비제한적으로 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "항-종양 효과"란 용어는 종양 부피의 감소, 종양 세포수의 감소, 전이수의 감소, 기대수명의 증가, 또는 암성 병증과 관련된 다양한 생리학적 증상들의 개선에 의해 나타날 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항-종양 효과"는 또한 애초에 종양 발생의 예방에서 본 발명의 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타날 수 있다.
"자가-항원"이란 용어는 본 발명에 따라, 외래의 것으로서 면역계에 의해 인식되는 임의의 자기-항원을 의미한다. 자가-항원은 비제한적으로 세포 단백질, 인단백질, 세포 표면 단백질, 세포 지질, 핵산, 당단백질(모든 표면 수용체 포함)을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "자가면역 질병"이란 용어는 자가면역 반응으로부터 생성되는 질환으로서 정의된다. 자가면역 질병은 자기-항원에 대한 부적합하고 과도한 반응의 결과이다. 자가면역 질병의 예는 특히, 비제한적으로 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 자가면역 간염, 자가면역 이하선염, 크론병, 당뇨병(I형), 수포성 표피 박리증, 부고환염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 전신 홍반성 루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 건선, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성 빈혈, 궤양성 대장염을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "자기유래 (autologous)"란 용어는 동일한 개체로부터 유래하여 나중에 다시 상기 개체로 재-도입되는 임의의 물질을 지칭하고자 한다.
"동종이계 (allogeneic)"는 동일한 종의 상이한 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
"이종발생성 (xenogeneic)"은 상이한 종의 동물로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "암"이란 용어는 빠르고 통제되지 않는 이상 세포의 성장을 특징으로 하는 질병으로서 정의된다. 암 세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 다양한 암의 예는 비제한적으로 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암 등을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 암은 갑상선 수질암이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "키메릭 항원 수용체" 또는 "CAR"이란 용어는 면역 효과기 세포상에서 발현되도록 조작되고 항원에 특이적으로 결합하는 인공 T 세포 수용체를 지칭한다. CAR은 입양 세포 전달 요법에 의한 요법으로서 사용될 수 있다. T 세포를 환자로부터 제거하고 특정한 형태의 항원에 특이적인 수용체를 발현하도록 변형시킨다. 일부 실시태양에서, 상기 CAR은 예를 들어 종양 관련 항원에 대해 특이적으로 발현되었다. CAR은 또한 세포내 활성화 도메인, 막관통 도메인 및 종양 관련 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 일부 태양에서, CAR은 CD3-제타 막관통 및 세포내 도메인에 융합된, 단쇄 가변 단편(scFv) 유래된 단클론 항체의 융합물을 포함한다. CAR 설계의 특이성은 수용체의 리간드(예를 들어 펩티드)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시태양에서, CAR은 종양 관련 항원에 특이적인 CAR을 발현하는 T 세포의 특이성을 재지시함으로써 암을 표적화할 수 있다.
"절단"이란 용어는 예를 들어 핵산 분자의 주쇄에서 공유 결합의 파괴를 지칭한다. 절단은 다양한 방법들, 예를 들어 비제한적으로 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해에 의해 개시될 수 있다. 단일-가닥 절단 및 이중-가닥 절단이 모두 가능하다. 이중-가닥 절단은 2개의 별개의 단일-가닥 절단 사건의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 절단은 평활 말단 또는 엇갈린 말단을 생성시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 융합 폴리펩티드가, 절단된 이중-가닥 DNA의 표적화에 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "보존적 서열 변형"이란 용어는 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특징에 현저하게 영향을 미치거나 상기 특징을 변경시키지 않는 아미노산 변형을 지칭하고자 한다. 상기와 같은 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형을 당해 분야에 공지된 표준 기법, 예를 들어 부위-지향된 변이도입 및 PCR-매개된 변이도입에 의해 본 발명의 항체에 도입시킬 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기들의 계열이 당해 분야에서 정의되었다. 이들 계열은 염기성 측쇄(예를 들어 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어 아스파트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 쓰레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄(예를 들어 쓰레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산들을 포함한다. 따라서, 항체의 CDR 영역내의 하나 이상의 아미노산 잔기들을 동일한 측쇄 계열로부터의 다른 아미노산 잔기들로 치환시킬 수 있으며 상기 변경된 항체를 본 명세서에 기재된 기능 분석을 사용하여 항원에 결합하는 능력에 대해 시험할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어로서 "보조-자극 리간드"는 T 세포상의 동족 보조-자극 분자에 특이적으로 결합하여, 예를 들어 TCR/CD3 복합체와 펩티드가 부하된 (loaded) MHC 분자와의 결합에 의해 제공된 1차 신호 외에, T 세포 반응, 예를 들어 비제한적으로 증식, 활성화, 분화 등을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포(예를 들어 APC, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 분자를 포함한다. 보조-자극 리간드는 비제한적으로 CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 보조-자극 리간드(ICOS-L), 세포내 부착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림프독소 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, 톨 리간드 수용체에 결합하는 작용물질 또는 항체 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있다. 보조-자극 리간드는 또한 특히, T 세포상에 존재하는 보조-자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어 비제한적으로 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
"보조-자극 분자"는 보조-자극 리간드와 특이적으로 결합하여, T 세포에 의한 보조-자극 반응, 예를 들어 비제한적으로 증식을 매개하는 T 세포상의 동족 결합 상대를 지칭한다. 보조-자극 분자는 비제한적으로 MHC I 부류 분자, BTLA 및 톨 리간드 수용체를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "보조-자극 신호"는 TCR/CD3 결찰과 같은 1차 신호와 함께, T 세포 증식 및/또는 핵심 분자의 상향조절 또는 하향조절을 유도하는 신호를 지칭한다.
"CRISPR/CAS", "주기적 간격으로 분포하는 짧은 회문 구조 반복 서열" 또는 "CRISPR"이란 용어는 염기 서열의 짧은 반복을 함유하는 DNA 유전자좌를 지칭한다. 각각의 반복에 이어서 바이러스에의 선행 노출로부터 이격자 DNA의 짧은 분절이 이어진다. 세균 및 고세균은 짧은 RNA를 사용하여 외래 핵산의 분해를 지시하는 CRISPR-CRISPR-관련(Cas) 시스템이라 칭하는 진화된 적응 면역 방어를 갖는다. 세균에서, 상기 CRISPR 시스템은 RNA-유도된 DNA 절단을 통해 침입하는 외래 DNA에 대한 수득 면역을 제공한다.
II형 CRISPR/Cas 시스템에서, "이격자"라 칭하는 외래 DNA의 짧은 분절이 CRISPR 게놈 유전자좌 내에 통합되고 전사되어 짧은 CRISPR RNA(crRNA)로 가공된다. 상기 crRNA는 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)에 어닐링되고 Cas 단백질에 의해 병원성 DNA의 서열-특이적인 절단 및 침묵화를 지시한다. 최근의 연구는 상기 Cas9 단백질에 의한 표적 인식이 상기 crRNA 내의 "시드" 서열 및 상기 crRNA-결합 영역 상류의 보존된 디뉴클레오티드-함유 원시이격자(protospacer) 인접 동기(PAM) 서열을 필요로 함을 입증하였다.
관심 서열을 절단하도록 Cas9를 지시하기 위해서, crRNA-tracrRNA 융합 전사물(이후부터 "안내 RNA" 또는 "gRNA"라 칭한다)을 인간 U6 폴리머라제 III 프로모터로부터 설계할 수 있다. CRISPR/CAS 매개된 게놈 편집 및 조절은 기초 과학, 세포 공학 및 치료학을 위한 그의 변형 잠재성을 강조하였다.
"CRISPRi"란 용어는 예를 들어 전사 수준에서 서열 특이적 유전자 억제 또는 유전자 발현의 억제를 위한 CRISPR 시스템을 지칭한다.
"질병"은, 동물이 항상성을 유지할 수 없고 상기 질병이 개선되지 않는다면 상기 동물의 건강이 계속해서 나빠지는 상기 동물의 건강 상태이다. 대조적으로, "질환"은 동물이 항성성을 유지할 수 있지만, 상기 질환이 없는 경우보다는 덜 유리한 상기 동물의 건강 상태이다. 치료되지 않고 방치되는 경우, 질환은 상기 동물의 건강 상태의 추가적인 감소를 반드시 야기하지는 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "하향조절"이란 용어는 하나 이상의 유전자의 유전자 발현의 감소 또는 제거를 지칭한다.
"유효량" 또는 "치료 유효량"은 본 명세서에서 호환적으로 사용되며, 특정한 생물학적 결과를 성취하거나 치료학적 또는 예방학적 이득을 제공하기에 유효한 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물, 제형, 물질 또는 조성물의 양을 지칭한다. 상기와 같은 결과는 비제한적으로 당해 분야에 적합한 임의의 수단에 의해 측정될 수 있는 항-종양 활성을 포함할 수 있다.
"암호화"는 뉴클레오티드(즉 rRNA, tRNA 및 mRNA)의 한정된 서열 또는 아미노산의 한정된 서열을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하기 위한, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 유전자, cDNA, 또는 mRNA 중의 뉴클레오티드의 특정 서열의 본래적인 성질 및 상기로부터 생성되는 생물학적 성질을 지칭한다. 따라서, 유전자는 상기 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물계에서 단백질을 생성시키는 경우 상기 단백질을 암호화한다. 암호화 가닥(그의 뉴클레오티드 서열은 mRNA 서열에 일치하고 대개는 서열 목록에 제공된다), 및 유전자 또는 cDNA의 전사에 대한 주형으로서 사용되는 비-암호화 가닥을 모두 상기 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하는 것으로서 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 계 내부로부터 또는 상기 내부에서 생성되는 임의의 물질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 계로부터 도입되거나 또는 상기 밖에서 생성되는 임의의 물질을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "증대"란 용어는 T 세포수의 증가에서와 같은 수의 증가를 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 생체외에서 증대되는 상기 T 세포는 배양물 중에 원래 존재하는 수에 비해 수가 증가한다. 또 다른 실시태양에서, 생체외에서 증대되는 상기 T 세포는 배양물 중의 다른 세포 유형에 비해 수가 증가한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "생체외"란 용어는 살아있는 유기체(예를 들어 인간)로부터 제거되고 상기 유기체 밖에서(예를 들어 배양 접시, 시험관 또는 생물반응기에서) 번식된 세포를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "발현"이란 용어는 그의 프로모터에 의해 구동된 특정 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 번역으로서 정의된다.
"발현 벡터"는 발현시키고자 하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용 요소를 포함하며; 다른 발현 요소들은 숙주 세포에 의해 또는 시험관내 발현 시스템에서 공급될 수 있다. 발현 벡터는 당해 분야에 공지된 모든 것들, 예를 들어 코스미드, 플라스미드(예를 들어 네이키드 또는 리포솜 중에 함유된) 및 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스(예를 들어 센다이 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "상동성"은 2개의 중합체성 분자, 예를 들어 2개의 핵산 분자, 예를 들어 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자, 또는 2개의 폴리펩티드 분자간의 서브유닛 서열 일치성을 지칭한다. 상기 2개 분자 모두 중의 서브유닛 위치가 동일한 단량체성 서브유닛에 의해 점유되는 경우; 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각 중 하나의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 이들은 상기 위치에서 상동성이다. 2개 서열간의 상동성은 합치 또는 상동성 위치 수의 직접적인 함수이다; 예를 들어 2개 서열 중 위치들의 절반(예를 들어 10 서브유닛 길이 중합체 중 5개 위치)이 상동성인 경우, 상기 두 서열은 50% 상동성이며; 상기 위치 중 90%(예를 들어 10 중 9)가 합치되거나 상동성인 경우, 상기 두 서열은 90% 상동성이다.
비-인간(예를 들어 쥐 (murine)) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 그의 면역글로불린 쇄 또는 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열들)이다. 대개, 인간화된 항체는 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부 예에서, 상기 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱 또한, 인간화된 항체는 상기 수용자 항체 중에서도 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열 중에서도 발견되지 않는 잔기들을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 수행성능을 더욱 다듬고 최적화하기 위해 수행된다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이며, 여기에서 상기 CDR 영역 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 영역에 상응하고 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 서열의 영역들이다. 상기 인간화된 항체는 또한 최적으로, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용에 대해서, 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986]; 문헌[Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988]; 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992]을 참조하시오.
"완전 인간"은 전체 분자가 인간 기원이거나 또는 항체의 인간형과 일치하는 아미노산 서열로 이루어지는 면역글로불린, 예를 들어 항체를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "일치성"은 2개의 중합체성 분자, 특히 2개의 아미노산 분자, 예를 들어 2개의 폴리펩티드 분자간의 서브유닛 서열 일치성을 지칭한다. 2개의 아미노산 서열이 동일한 위치에서 동일한 잔기를 갖는 경우; 예를 들어 2개의 폴리펩티드 분자 각각 중 하나의 위치가 아르기닌에 의해 점유되는 경우, 이들은 상기 위치에서 일치한다. 2개의 아미노산 서열이 하나의 정렬에서 동일한 위치에서 동일한 잔기를 갖는 일치성 또는 정도를 종종 비율로서 나타낸다. 2개 아미노산 서열간의 일치성은 합치 또는 일치하는 위치 수의 직접적인 함수이다; 예를 들어 2개 서열 중 위치들의 절반(예를 들어 10 아미노산 길이 중합체 중 5개 위치)이 일치하는 경우, 상기 두 서열은 50% 일치하며; 상기 위치 중 90%(예를 들어 10 중 9)가 합치되거나 일치하는 경우, 상기 두 아미노산 서열은 90% 일치한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "면역글로불린" 또는 "Ig"란 용어는 항체로서 기능하는 단백질 부류로서 정의된다. B 세포에 의해 발현된 항체를 때때로 BCR(B 세포 수용체) 또는 항원 수용체라 칭한다. 상기 단백질 부류에 포함되는 5개 구성원은 IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE이다. IgA는 체 분비물, 예를 들어 타액, 눈물, 젖, 위장 분비물 및 호흡 및 비뇨생식관의 점액 분비물 중에 존재하는 1차 항체이다. IgG는 가장 통상적인 순환 항체이다. IgM은 대부분의 피험자에서 1차 면역 반응으로 생성되는 주요 면역글로불린이다. 상기는 응집반응, 보체 결합, 및 다른 항체 반응에 가장 효율적인 면역글로불린이며, 세균 및 바이러스에 대한 방어에 중요하다. IgD는 공지된 항체 기능은 없지만, 항원 수용체로서 작용할 수 있는 면역글로불린이다. IgE는 알레르겐에 노출시 비만 세포 및 호염기성 세포로부터 매개체의 방출을 야기함으로써 즉각적인 과민증을 매개하는 면역글로불린이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "면역 반응"이란 용어는, 림프구가 항원 분자를 이물질로서 확인하고 항체의 형성을 유도하고/하거나 림프구를 활성화시켜 상기 항원을 제거하는 경우 발생하는 항원에 대한 세포 반응으로서 정의된다.
여기에 사용되는 바와 같이, "유도된 다능성 줄기 세포" 또는 "iPS 세포"는 T 세포와 같이, 성체 세포로부터 생성되는 다능성 줄기 세포를 지칭한다. 성체 세포에서 재프로그램화 인자, 예를 들어 Klf4, Oct3/4 및 Sox2의 발현은 상기 세포를, 다수의 세포 유형으로의 번식 및 분화가 가능한 다능성 세포로 전환시킨다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "교재"는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 연통하는데 사용될 수 있는 간행물, 기록물, 도해, 또는 임의의 다른 표현 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 교재를 예를 들어 본 발명의 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기에 부착시키거나 또는 상기 핵산, 펩티드 및/또는 조성물을 함유하는 용기와 함께 발송할 수 있다. 한편으로, 상기 교재를, 상기 교재 및 화합물을 수령자가 협력하여 사용하도록 상기 용기와 별도로 발송할 수도 있다.
"단리된"은 자연 상태로부터 변경되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물 중에 자연적으로 존재하는 핵산 또는 펩티드는 "단리된" 것이 아니고, 그의 자연 상태의 공존하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩티드가 "단리된" 것이다. 단리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재하거나, 또는 비-천연 환경, 예를 들어 숙주 세포 중에 존재할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "녹다운"이란 용어는 하나 이상의 유전자의 유전자 발현의 감소를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "녹아웃"이란 용어는 하나 이상의 유전자의 유전자 발현의 제거를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "렌티바이러스"는 레트로비리다에 과의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있음에 있어서 레트로바이러스 중 독특하며; 상당량의 유전 정보를 상기 숙주 세포의 DNA내로 전달할 수 있고, 따라서 이는 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV가 렌티바이러스의 모든 예이다. 렌티바이러스로부터 유래된 벡터는 생체내에서 상당한 수준의 유전자 전달을 성취하는 수단을 제공한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "변형된"이란 용어는 본 발명의 분자 또는 세포의 변화된 상태 또는 구조를 의미한다. 분자를 다수의 방식으로, 예를 들어 화학적으로, 구조적으로 및 기능적으로 변형시킬 수 있다. 세포를 핵산의 도입을 통해 변형시킬 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "조절"이란 용어는 치료 또는 화합물 부재하에서의 피험자의 반응 수준에 비해, 및/또는 달리 동일하지만 치료되지는 않은 피험자에서의 반응 수준에 비해, 상기 피험자에서 반응 수준의 검출 가능한 증가 또는 감소를 매개함을 의미한다. 상기 용어는 고유 신호 또는 반응을 동요시키고/시키거나 영향을 미침으로써 피험자, 바람직하게는 인간에서 이로운 치료 반응을 매개함을 포함한다.
본 발명과 관련하여, 하기의 통상적으로 존재하는 핵산 염기에 대한 약어들이 사용된다. "A"는 아데노신을 지칭하고, "C"는 시토신을 지칭하고, "G"는 구아노신을 지칭하고, "T"는 티미딘을 지칭하고, "U"는 유리딘을 지칭한다.
달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로 축퇴 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열들을 포함한다. 단백질 및 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이란 어구는 상기 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 일부 버전에서 인트론(들)을 함유할 수 있는 정도로 인트론을 또한 포함할 수 있다.
"작동적으로 연결된"이란 용어는 이종핵산 서열의 발현을 생성시키는 조절 서열과 상기 이종 핵산 서열간의 기능적 결합을 지칭한다. 예를 들어, 제1 핵산 서열은, 상기 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 놓일 때 상기 제2 핵산 서열과 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 프로모터는, 상기 프로모터가 암호화 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 상기 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, 작동적으로 연결된 DNA 서열은 연속적이며, 필요한 경우 동일한 판독 프레임 중의 2개의 단백질 암호화 영역에 결합된다.
"과발현된" 종양 항원 또는 종양 항원의 "과발현"이란 용어는 특정한 조직 또는 기관으로부터의 정상 세포에서의 발현에 비해 환자의 상기 조직 또는 기관내의 고형 종양과 같은 질병 영역으로부터의 세포에서의 종양 항원의 비정상적인 발현 수준을 가리키고자 한다. 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 고형 종양 또는 혈액암을 갖는 환자는 당해 분야에 공지된 표준 분석에 의해 판정될 수 있다.
면역원성 조성물의 "비경구" 투여는 예를 들어 피하(s.c.), 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.) 또는 흉골내 주사, 또는 주입 기법을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "폴리뉴클레오티드"란 용어는 뉴클레오티드의 쇄로서 정의된다. 더욱 또한, 핵산은 뉴클레오티드의 중합체이다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 핵산 및 폴리뉴클레오티드는 호환 가능하다. 당해 분야의 숙련가는 핵산이 폴리뉴클레오티드이고, 이는 단량체성 "뉴클레오티드"로 가수분해될 수 있다는 일반적인 지식을 갖는다. 상기 단량체성 뉴클레오티드는 뉴클레오시드로 가수분해될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 당해 분야에서 입수할 수 있는 임의의 수단, 예를 들어 비제한적으로 재조합 수단, 즉 통상적인 클로닝 기술 및 PCR(상표) 등을 사용하여 재조합 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터 핵산 서열의 클로닝에 의해, 및 합성 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"이란 용어들은 호환 가능하게 사용되며, 펩티드 결합에 의해 공유적으로 결합된 아미노산 잔기들로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대수에 대한 제한은 없다. 폴리펩티드는 서로 펩티드 결합에 의해 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 단쇄(또한 당해 분야에서 예를 들어 펩티드, 올리고펩티드 및 올리고머라 통상적으로 지칭된다) 및 보다 긴 쇄(일반적으로 당해 분야에서 단백질이라 지칭되며, 다수의 유형이 존재한다) 모두를 지칭한다. "폴리펩티드"는 특히 예를 들어 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 동종 폴리펩티드, 올리고펩티드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩티드의 변체, 변형된 폴리펩티드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 상기 폴리펩티드는 천연 펩티드, 재조합 펩티드, 합성 펩티드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "프로모터"란 용어는 폴리뉴클레오티드 서열의 특정한 전사를 개시시키는데 필요한 세포의 합성 기구, 또는 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열로서 정의된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프로모터/조절 서열"이란 용어는 상기 프로모터/조절 서열에 작동적으로 연결된 유전자 산물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 예에서, 상기 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있으며, 다른 예에서 상기 서열은 또한 인헨서 서열 및 상기 유전자 산물의 발현에 필요한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 상기 프로모터/조절 서열은 예를 들어 조직 특이적인 방식으로 상기 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.
"구성" 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 명시하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 상기 유전자 산물이 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건하에서 상기 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"유도성" 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 명시하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 상기 유전자 산물이, 실질적으로 오직 상기 프로모터에 상응하는 유도물질이 세포 중에 존재하는 경우에만 상기 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"조직-특이성" 프로모터는 유전자 산물을 암호화하거나 명시하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결될 때, 상기 유전자 산물이, 실질적으로 오직 세포가 상기 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 상기 세포에서 생성되도록 하는 뉴클레오티드 서열이다.
"센다이 바이러스"는 파라믹소비리다에 과의 속을 지칭한다. 센다이 바이러스는 숙주 게놈내에 통합되지 않거나 상기 숙주 세포의 유전 정보를 변경시키지 않는 음성, 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 센다이 바이러스는 대단히 넓은 숙주 범위를 가지며 인간에 병원성이 아니다. 재조합 바이러스 벡터로서 사용시, 센다이 바이러스는 일시적이지만 강한 유전자 발현이 가능하다.
"신호전달 경로"는 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로의 신호의 전달에 한 역할을 하는 다양한 신호전달 분자들간의 생화학적 관계를 지칭한다. "세포 표면 수용체"란 어구는 신호를 받아 세포의 원형질막을 가로질러 신호를 전달할 수 있는 분자 및 분자들의 복합체를 포함한다.
"단쇄 항체"는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 단편을 조작된 아미노산의 스팬을 통해 Fv 영역에 연결시키는 재조합 DNA 기법에 의해 형성되는 항체를 지칭한다. 단쇄 항체의 다양한 생성 방법은 공지되어 있다, 예를 들어 미국특허 제 4,694,778 호; 문헌[Bird (1988) Science 242:423-442]; 문헌[Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]; 문헌[Ward et al. (1989) Nature 334:54454]; 문헌[Skerra et al. (1988) Science 242:1038-1041]에 기재되어 있다.
항체에 관하여 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "특이적으로 결합하는"이란 용어는, 특정한 항원을 인식하지만 샘플 중 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들어, 하나의 종으로부터의 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 종으로부터의 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 상기와 같은 종간 반응성은 그 자체가 항체의 분류를 특이적인 것으로서 변경시키지 않는다. 또 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 상이한 대립유전자 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 상기와 같은 교차 반응성은 그 자체가 항체의 분류를 특이적인 것으로서 변경시키지 않는다. 일부 예에서, "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"이란 용어는 항체, 단백질 또는 펩티드의 제2 화학 종과의 상호작용과 관련하여, 상기 상호작용이 화학 종상의 특정한 구조(예를 들어 항원 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 따라 변함을 의미하는데 사용될 수 있다; 예를 들어 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정한 단백질 구조를 인식하고 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A(또는 유리, 표지되지 않은 A)를 함유하는 분자의 존재는 상기 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
"자극"이란 용어는 그의 동족 리간드와 자극 분자(예를 들어 TCR/CD3 복합체)의 결합(이에 의해 신호전달 사건, 예를 들어 비제한적으로 TCR/CD3 복합체를 통한 신호전달을 매개한다)에 의해 유도되는 1차 반응을 의미한다. 자극은 몇몇 분자의 변경된 발현, 예를 들어 TGF-베타의 하향조절, 및/또는 세포골격 구조의 재구성 등을 매개할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "자극 분자"란 용어는 항원 제시 세포상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포상의 분자를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "자극 리간드"는 항원 제시 세포(예를 들어 aAPC, 수지상 세포, B-세포 등)상에 존재할 때 T 세포상의 동족 결합 상대(본 명세서에서 "자극 분자"라 칭함)와 특이적으로 결합하여, 상기 T 세포에 의한 1차 반응, 예를 들어 비제한적으로 면역 반응의 활성화, 개시, 증식 등을 매개할 수 있는 리간드를 의미한다. 자극 리간드는 당해 분야에 주지되어 있으며, 특히 펩티드, 항-CD3 항체, 과작용물질 항-CD28 항체, 및 과작용물질 항-CD2 항체가 부하된 MHC I 부류 분자를 포함한다.
"피험자"란 용어는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체(예를 들어 포유동물)를 포함하고자 한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "피험자" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유동물일 수 있다. 비-인간 포유동물은 예를 들어 가축 및 애완동물, 예를 들어 양, 소, 돼지, 개, 고양이 및 쥐과 포유동물들을 포함한다. 바람직하게, 상기 피험자는 인간이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 정제된" 세포는 다른 세포 유형이 필수적으로 없는 세포이다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 자연 상태에서 통상적으로 관련되는 다른 세포 유형들로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 예에서, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 세포의 균일 집단을 지칭한다. 다른 예에서, 상기 용어는 단순히 자연 상태에서 자연적으로 관련되는 다른 세포 유형들로부터 분리된 세포를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 세포는 시험관내에서 배양된다. 다른 실시태양에서, 상기 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합이 발생하기에 충분한 조건하에서 결합 분자가 특이적으로 결합할 수 있는 핵산의 일부를 한정하는 게놈 핵산 서열을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "T 세포 수용체" 또는 "TCR"이란 용어는 항원의 제공에 반응하여 T 세포의 활성화에 관여하는 막 단백질의 복합체를 지칭한다. 상기 TCR은 주조직적합성 복합체 분자에 결합된 항원의 인식을 담당한다. TCR은 알파(α) 및 베타(β) 쇄의 이종이량체로 구성되지만, 일부 세포에서 상기 TCR은 감마 및 델타(γ/δ)쇄로 이루어진다. TCR은 알파/베타 및 감마/델타 형태로 존재할 수 있으며, 이들 형태는 구조적으로 유사하나 별개의 해부학적 위치 및 기능을 갖는다. 각각의 쇄는 2개의 세포외 도메인, 가변 및 불변 도메인으로 구성된다. 일부 실시태양에서, 상기 TCR은 TCR을 포함하는 임의의 세포, 예를 들어 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 천연 킬러 T 세포, 및 감마 델타 T 세포상에서 변형될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "치료학적"이란 용어는 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료 효과는 질병 병증의 억제, 경감, 또는 근절에 의해 수득된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"이란 용어는 외인성 핵산이 숙주 세포로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되거나, 형질전환되거나 또는 형질도입된 것이다. 상기 세포는 1차 피험자 세포 및 그의 자손을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 질병을 "치료하다"란 용어는 피험자가 겪는 질병 또는 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시킴을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "전사 조절하에서" 또는 "작동적으로 연결된"이란 어구는 프로모터가 폴리뉴클레오티드와 관련하여 정확한 위치 및 배향으로 RNA 폴리머라제에 의한 전사의 개시 및 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절함을 의미한다.
"벡터"는, 단리된 핵산을 포함하고 상기 단리된 핵산을 세포의 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 다수의 벡터들, 예를 들어 비제한적으로 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친성 화합물과 결합된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스가 당해 분야에 공지되어 있다. 따라서, "벡터"란 용어는 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 또한 핵산의 세포내로의 전달을 촉진하는 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예를 들어 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스 벡터의 예는 비제한적으로 센다이 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함한다.
범위: 본 명세서 전체를 통해, 본 발명의 다양한 태양들을 범위 포맷으로 제공할 수 있다. 범위 포맷의 기재는 단지 편의성 및 간략성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 완고한 제한으로서 해석해서는 안 됨은 물론이다. 상응하게, 범위에 대한 기재는 모든 가능한 하위범위뿐만 아니라 상기 범위내의 개별적인 수치들을 구체적으로 개시하는 것으로 간주해야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 구체적으로 개시된 하위범위뿐만 아니라 상기 범위내의 개별적인 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3, 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이를 상기 범위의 폭과 관계없이 적용한다.
설명
이식편 대 숙주병(GVHD)을 피하는 보편적인 T 세포가 임상 상황에서 대단히 요구된다. 그러나, 동종이계 T 세포의 사용은 HLA-A 분자의 인식을 통한 숙주의 면역계에 의한 거부로 인해 위험하다. 다중 유전자를 조작하기 위한 표적화 전략은 복잡하며 결과는 GVHD와 숙주대 이식편 반응을 동시에 예방하지 못하면서 T 세포에서 낮은 효율을 제공하였다.
FAS 수용체/FAS 리간드(FAS/FASL) 세포사멸 신호전달 경로는 T 세포 기능을 음으로 조절한다. PD1 및 CTLA4는 T 세포에서 중요한 2개의 억제성 신호전달 경로이다. CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1의 항체-매개된 봉쇄로부터 생성되는 증대된 항-종양 면역은 상기 경로를 억제시킴으로써 면역요법의 효율을 개선시키는 가능성을 제시한다. 본 발명은 감소된 면역원성을 갖는 변형된 T 세포를 생성시키는 수단으로서 TCR α 및 β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, HLA 분자, CTLA-4, PD-1 및/또는 FAS가 고갈된, 변형된 T 세포의 생성을 포함한다.
본 발명은 내인성 유전자 발현을 녹다운시키고 변형된 T 세포 수용체 또는 키메릭 항원 수용체를 발현시킴으로써 변형된 T 세포를 생성시키기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명은 상기 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함한다. 상기와 같은 변형된 T 세포를 치료학적 조성물에 포함시키고 상기가 필요한 환자에게 투여할 수 있다.
내인성 유전자 발현의 녹다운
본 발명은 T 세포에서 내인성 유전자 발현의 하향조절, 예를 들어 T 세포 수용체(TCR), 베타-2 마이크로글로불린, CTLA-4, FAS, PD1, 또는 주 조직적합성 복합체 단백질, 예를 들어 HLA 분자의 알파 및/또는 베타 쇄를 하향조절함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 하향조절된 유전자 발현을 갖는 T 세포는 동종이계 환경에서 감소된 면역원성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서, 감소된 면역원성을 갖는 T 세포는 표적화된 효과기 활성을 위해 변형된 TCR 또는 CAR을 발현한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 핵산을, 내인성 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 T 세포내로 도입시킴을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함하며, 이때 상기 유전자는 TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, HLA 분자, CTLA-4, PD1 및 FAS로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 세포에 대한 면역 반응을 생성시키는데 관련된 내인성 유전자, 예를 들어 TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, 또는 HLA 분자의 발현의 하향조절은 변형된 T 세포의 면역-매개된 거부를 감소시킨다. 예를 들어, 내인성 TCR, MHC 또는 베타-2 마이크로글로불린 유전자의 발현의 하향조절은 숙주 면역계에 의한 거부를 야기할 수 있는 T 세포상의 동종항원의 표면 제공을 제거한다. 또한, T 세포에서 억제성 신호전달 경로를 조절하는 내인성 유전자, 예를 들어 CTLA-4, PD1 및/또는 FAS의 하향조절은 면역억제성 미세환경에 노출시 상기 변형된 T 세포의 항-종양 효능을 증대시킨다.
하나의 태양에서, 내인성 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을, 예를 들어 전기천공, 형질감염, 또는 렌티- 또는 다른 바이러스 형질도입에 의해 상기 T 세포내로 도입시킨다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 내인성 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 전기천공된 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 포함한다. 더욱 또 다른 태양에서, 변형된 T 세포는 내인성 TCR 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 전기천공된 핵산을 포함한다. 또 다른 태양에서, 상기 변형된 T 세포를 포함하는 조성물을 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성시킨다. 더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 상기 변형된 T 세포 또는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성된 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 포함한다.
내인성 유전자 발현을 조절할 수 있는 핵산은 상기 내인성 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 내인성 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산은 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, siRNA, shRNA 및 CRISPR 시스템으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 내인성 유전자 발현을 예를 들어 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, siRNA, shRNA, CRISPR 시스템 등에 의해 하향조절, 녹다운, 감소 및/또는 억제할 수 있다.
CRISPR / Cas
CRISPR/Cas 시스템은 표적화된 유전자 변경을 유도하기에 용이하고 효율적인 시스템이다. 상기 Cas9 단백질에 의한 표적 인식은 안내 RNA(gRNA)내에 '시드' 서열 및 상기 gRNA-결합 영역 상류의 보존된 디-뉴클레오티드 함유 원시이격자 인접 동기(PAM) 서열을 필요로 한다. 상기 CRISPR/CAS 시스템은 상기에 의해 조작되어 세포주(예를 들어 293T 세포), 1차 세포, 및 CAR T 세포 중에 상기 gRNA를 재설계함으로써 실질적으로 어떠한 DNA 서열도 절단할 수 있다. 상기 CRISPR/CAS 시스템은 2개 이상의 gRNA를 갖는 단일 CAS9 단백질을 동시-발현함으로써 다수의 게놈 유전자좌를 동시에 표적화하여, 상기 시스템을 표적 유전자의 다수 유전자 편집 또는 상승적 활성화에 유일하게 적합하게 한다.
유전자 발현을 억제하는데 사용되는 CRISPR/Cas 시스템의 일례인 CRISPRi가 미국특허 공보 제 2014/0068797 호에 기재되어 있다. CRISPRi는 오류유발 수선 경로를 촉발하여 인프레임 이동 돌연변이를 생성시키는 DNA 이중 가닥 파괴를 도입하기 위해 상기 RNA-안내된 Cas9 엔도뉴클레아제를 사용하는 영구적인 유전자 붕괴를 유도한다. 촉매 활성이 없는 Cas9는 엔도뉴클레아제 활성이 없다. 안내 RNA와 동시 발현시, 전사 신장, RNA 폴리머라제 결합, 또는 전사 인자 결합을 특이적으로 방해하는 DNA 인식 복합체가 생성된다. 상기 CRISPRi 시스템은 표적화된 유전자의 발현을 효율적으로 억제한다.
CRISPR/Cas 유전자 붕괴는, 표적 유전자 및 Cas 엔도뉴클레아제에 특이적인 안내 핵산 서열이 세포내에 도입되고 상기 Cas 엔도뉴클레아제가 상기 표적 유전자에서 이중 가닥 파괴를 도입할 수 있게 하는 복합체를 형성할 때 발생한다. 하나의 실시태양에서, 상기 CRISPR 시스템은 발현 벡터, 예를 들어 비제한적으로 pAd5F35-CRISPR 벡터를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 변형된 T 세포를, Cas 발현 벡터 및 유전자에 특이적인 안내 핵산 서열을 T 세포내에 도입시킴으로써 생성시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 Cas 발현 벡터는 Cas9 엔도뉴클레아제의 발현을 유도한다. 다른 엔도뉴클레아제, 예를 들어 비제한적으로 T7, Cas3, Cas8a, Cas8b, Cas10d, Cse1, Csy1, Csn2, Cas4, Cas10, Csm2, Cmr5, Fok1, 당해 분야에 공지된 다른 뉴클레아제, 및 이들의 임의의 조합을 또한 사용할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 Cas 발현 벡터의 유도는 상기 T 세포를 상기 Cas 발현 벡터 중의 유도성 프로모터를 활성화시키는 작용제에 노출시킴을 포함한다. 상기와 같은 실시태양에서, 상기 Cas 발현 벡터는 유도성 프로모터, 예를 들어 항생제에의 노출에 의해(예를 들어 테트라사이클린 또는 테트라사이클린의 유도체, 예를 들어 독시사이클린에 의해) 유도성인 것을 포함한다. 그러나, 다른 유도성 프로모터들을 사용할 수 있음을 알아야 한다. 상기 유도제는 상기 유도성 프로모터의 유도를 생성시키는 선택성 조건(예를 들어 작용제, 예를 들어 항생제에의 노출)일 수 있다.
상기 안내 핵산 서열은 유전자에 특이적이며 Cas 엔도뉴클레아제-유도된 이중 가닥 파괴를 위해 상기 유전자를 표적화한다. 상기 안내 핵산 서열의 서열은 상기 유전자의 유전자좌내에 있을 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 안내 핵산 서열은 길이가 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 이상의 뉴클레오티드이다.
상기 안내 핵산 서열은 임의의 유전자, 예를 들어 면역원성을 감소시키거나 또는 면역억제성 미세환경에 대한 민감성을 감소시키는 유전자에 특이적일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 유전자는 T 세포 수용체(TCR) 쇄(예를 들어 알파, 베타, 감마 및/또는 델타 쇄), 베타-2 마이크로글로불린, FAS, PD1, 주 조직적합성 복합체 단백질(예를 들어 HLA I 부류 분자 및/또는 HLA II 부류 분자), CTLA-4, 또는 이들의 임의의 조합에 특이적인 서열을 포함할 수 있다.
상기 안내 핵산 서열은 RNA 서열, DNA 서열, 이들의 조합(RNA-DNA 조합 서열), 또는 합성 뉴클레오티드와의 서열을 포함한다. 상기 안내 핵산 서열은 단일 분자 또는 이중 분자일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 안내 핵산 서열은 단일 안내 RNA를 포함한다.
T 세포 수용체
항원-특이성 TCR을 갖는 T 세포에 의한 입양 면역요법은 암 및 몇몇 만성 바이러스 감염의 치료에 치료학적 가능성을 갖는다. 특이적인 TCR을 갖는 T 세포의 유전-공학은 상기 T 세포를 세포내 항원으로 재지시하는 이점을 갖는다. 대부분의 발암성 단백질이 세포내성이므로, 발암 구동 단백질에 특이적인 TCR 패널의 개발은 큰 매력을 갖는다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하향조절된 유전자 발현 및 외인성 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 변형된 T 세포를 포함한다. 하나의 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산 및 TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, PD1, 및 FAS로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 내인성 유전자 발현을 조절할 수 있는 핵산을 T 세포내에 도입시킴을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 상기 변형된 TCR을 발현할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 외인성 핵산 및 TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, PD1, 및 FAS로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 내인성 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 상기 변형된 TCR을 발현하고 상기 내인성 유전자 발현은 상기 T 세포에서 하향조절된다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 포함한다.
T 세포 수용체는 항원의 제공에 반응하여 T 세포의 활성화에 관여하는 막 단백질의 복합체이다. 상기 TCR의 자극은, 상기 T 세포에 항원 펩티드를 제공하고 상기 TCR 복합체에 결합하여 일련의 세포내 신호전달 캐스케이드를 유도하는 항원 제시 세포상의 주조직적합성 복합체 분자(MHC)에 의해 촉발된다.
상기 TCR은 일반적으로 리간드 인식을 맡고 있는 TCR 이종이량체를 형성하는 6개의 상이한 막 결합된 쇄들로 구성된다. TCR은 알파/베타 및 감마/델타형으로 존재하며, 이들은 구조적으로 유사하나 별개의 해부학적 위치 및 기능을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 TCR은 TCR 알파 및 TCR 베타쇄를 포함한다, 예를 들어 상기 TCR을 암호화하는 핵산은 TCR 알파 및 TCR 베타쇄를 암호화하는 핵산을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, TCR 알파쇄 또는 TCR 베타쇄 또는 이 두 쇄 모두는 적어도 하나의 N-탈글리코실화를 포함한다.
각각의 쇄는 2개의 세포외 도메인, 가변 및 불변 도메인으로 구성된다. 하나의 실시태양에서, 상기 TCR은 적어도 하나의 쥐 불변 영역을 포함한다. 상기 불변 도메인은 세포막에 이어서 막관통 도메인 및 짧은 세포질 꼬리에 인접한다. 하나의 실시태양에서, 상기 변형된 TCR은 보조-자극 신호전달 도메인, 예를 들어 4-1BB 보조-자극 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인을 포함한다. 상기 가변 도메인은 상기 TCR이 결합 특이성을 갖는 특정한 항원 및 MHC 분자의 결정에 기여한다. 차례로, 독특한 항원-MHC 복합체에 대한 T 세포의 특이성은 상기 T 세포에 의해 발현된 특정한 TCR 중에 존재한다.
상기 불변 및 가변 도메인은 각각 쇄-내 디설파이드 결합을 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, TCR은 적어도 하나의 디설파이드 결합을 포함한다. 상기 가변 도메인은 항체의 상보성 결정 영역(CDR)에 유사한 고도의 다형태성 루프를 포함한다. TCR 서열의 다양성은 연결된 가변(V), 다양성(D), 결합(J) 및 불변 유전자의 체세포 재배열을 통해 생성된다.
기능적 알파 및 감마쇄 폴리펩티드는 재배열된 V-J-C 영역에 의해 형성되는 반면, 베타 및 델타쇄는 V-D-J-C 영역으로 이루어진다. 상기 세포외 불변 도메인은 막 근위 영역 및 면역글로불린 영역을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 TCR은 야생형 TCR, 고 친화성 TCR, 및 키메릭 TCR을 포함한다. 상기 TCR이 변형되는 경우, 상기는 야생형 TCR보다 표적 세포 표면 항원에 대해 더 높은 친화성을 가질 수 있다. 상기 TCR이 키메릭 TCR인 실시태양에서, 상기 TCR은 키메릭 도메인을 포함할 수 있다, 예를 들어 상기 TCR은 상기 쇄들 중 적어도 하나의 C' 말단에서 보조-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 TCR은 변형된 쇄, 예를 들어 변형된 알파 또는 베타쇄를 포함할 수 있다. 상기와 같은 변형은 비제한적으로 N-탈글리코실화, 변경된 도메인(예를 들어 특정한 항원을 표적화하거나 친화성을 증가시키도록 조작된 가변 영역), 하나 이상의 디설파이드 결합의 부가, 상이한 종들로부터 유래된 쇄 전체 또는 그의 단편, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 TCR은 표적 세포 항원에 대한 특이성을 포함한다. 상기 표적 세포 표면 항원은 표적 세포의 표면을 한정하는 임의의 유형의 리간드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 세포 표면 항원은 특정한 질병 병증과 관련된 표적 세포상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서 상기 TCR의 항원 결합 도메인에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 세균 및 기생충 감염, 자가면역 질병 및 암 세포와 관련된 것들을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 표적 세포 표면 항원은 임의의 종양 관련 항원(TAA) 및 바이러스 항원, 질병 세포 관련 항원, 또는 이들의 임의의 단편을 포함한다.
상기 표적 세포 항원은 주조직적합성 복합체에 의해 가공되고 제공될 수 있는 임의의 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 표적 항원은 특정한 질병 병증과 관련될 수 있다. 따라서, 상기 TCR의 표적으로서 작용할 수 있는 세포 마커의 예는 바이러스, 세균 및 기생충 감염, 자가면역 질병 및 암 세포와 관련된 것들을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 표적 항원은 임의의 종양 관련 항원(TAA) 및 바이러스 항원, 또는 이들의 임의의 단편을 포함한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산 및 TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, HLA 분자, CTLA-4, PD1, 및 FAS로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 내인성 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포의 집단을 포함하며, 여기에서 상기 T 세포는 상기 변형된 TCR을 발현할 수 있다.
T 세포 수용체를 조작하고 발현시키기 위한 기법들은 비제한적으로, 각각의 서브유닛들을 연결하는 고유 디설파이드 가교를 포함하는 TCR 이종이량체의 생성을 포함한다(Garboczi, et al., (1996), Nature 384(6605): 134-41; Garboczi, et al., (1996), J Immunol 157(12): 5403-10; Chang et al., (1994), PNAS USA 91: 11408-11412; Davodeau et al., (1993), J. Biol. Chem. 268(21): 15455-15460; Golden et al., (1997), J. Imm. Meth. 206: 163-169; 미국특허 제 6,080,840 호).
키메릭 항원 수용체( CAR )
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 하향조절된 유전자 발현 및 CAR을 갖는 변형된 T 세포를 포함한다. 따라서, 본 발명은 CAR 또는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기에서 상기 CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다.
하나의 태양에서, 본 발명은 TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, HLA 분자, CTLA-4, PD1, 및 FAS로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 내인성 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 T 세포내에 도입시킴을 포함하는 변형된 T 세포의 생성 방법을 포함하며, 여기에서 상기 CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 보조-자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 내인성 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산 및 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는 변형된 T 세포를 포함하며, 여기에서 상기 하향조절된 유전자 발현은 TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, HLA 분자, CTLA-4, PD1, 및 FAS로 이루어지는 그룹 중에서 선택되고, 상기 CAR은 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 보조-자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포는 본 명세서의 다른 어딘가에 기재된 바와 같은 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 변형된 TCR을 암호화하는 외인성 핵산을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 세포의 집단을 포함한다.
하나 이상의 도메인 또는 상기 CAR의 도메인의 단편은 인간일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 완전인간 CAR을 포함한다. 목적하는 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 당해 분야에 공지된 재조합 방법을 사용하여, 예를 들어 표준 기법을 사용하여 유전자를 발현하는 세포로부터 라이브러리를 선별하거나, 상기를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 상기 유전자를 수득하거나, 또는 상기를 함유하는 세포 및 조직으로부터 직접 단리함으로써 수득할 수 있다. 한편으로, 관심 유전자를 클로닝된 분자로서라기 보다는 합성적으로 생성시킬 수 있다.
CAR의 예들이 미국특허 제 8,911,993 호, 미국특허 제 8,906,682 호, 미국특허 제 8,975,071 호, 미국특허 제 8,916,381 호, 미국특허 제 9,102,760 호, 미국특허 제 9,101,584 호, 및 미국특허 제 9,102,761 호(이들은 모두 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)에 기재되어 있다.
항원 결합 도메인
하나의 실시태양에서, 상기 CAR은 표적 세포상의 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 포함한다. 상기 CAR의 항원 결합 도메인에 결합하는 항원으로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 세균 및 기생충 감염, 자가면역 질병, 및 암 세포와 관련된 것들을 포함한다.
상기 항원 결합 도메인의 선택은 표적 세포의 표면상에 존재하는 항원의 유형 및 수에 따라 변한다. 예를 들어, 상기 항원 결합 도메인은 특정한 질병 병증과 관련된 표적 세포상의 세포 표면 마커로서 작용하는 항원을 인식하도록 선택될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 항원 결합 도메인은 종양 항원, 예를 들어 관심 종양 또는 암에 특이적인 항원에 결합한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 종양 항원은 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다.
상기 항원 결합 도메인은 항원에 결합하는 임의의 도메인을 포함할 수 있으며, 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 비-인간 항체, 및 이들의 임의의 단편을 포함할 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 상기 항원 결합 도메인 부분은 포유동물 항체 또는 그의 단편을 포함한다.
상기 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항원, 예를 들어 비제한적으로 CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1(또한 CD2 부분집합 1로서 지칭된다, CRACC, SLAMF7, CD319, 및 19A24); C-유형 렉틴-유사 분자-1(CLL-1 또는 CLECL1); CD33;　표피 성장인자 수용체 변체 III(EGFRvIII); 강글리오시드 G2 (GD2); 강글리오시드 GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer);　TNF 수용체 과 구성원 B 세포 성숙화(BCMA); Tn 항원((Tn Ag) 또는 (GalNAcα-Ser/Thr)); 전립선-특이성 막 항원(PSMA); 수용체 티로신 키나제-유사 희귀 수용체 1 (ROR1); Fms-유사 티로신 키나제 3(FLT3); 종양-관련 당단백질 72(TAG72); CD38; CD44v6; 발암배아성 항원(CEA); 상피세포 부착 분자(EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2 또는 CD213A2); 메소텔린; 인터류킨 11 수용체 알파(IL-11Ra); 전립선 줄기세포 항원(PSCA); 프로테아제 세린 21(테스티신 또는 PRSS21); 혈관 내피성장 인자 수용체 2(VEGFR2); 루이스(Y) 항원; CD24; 혈소판-유래된 성장인자 수용체 베타(PDGFR-beta); 단계-특이적 배아 항원-4(SSEA-4); CD20; 폴레이트 수용체 알파; 수용체 티로신-단백질 키나제 ERBB2(Her2/neu); 뮤신 1, 세포 표면 관련된(MUC1); 표피 성장인자 수용체(EGFR); 신경세포 부착 분자(NCAM); 프로스타제; 전립선 산성 포스파타제(PAP); 신장 인자 2 돌연변이된(ELF2M); 에프린 B2; 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAP); 인슐린-유사 성장인자 1 수용체 (IGF-I 수용체), 카본산 안하이드라제 IX (CAIX); 프로테오솜(프로솜, 마크로파인) 서브유닛, 베타 유형 9(LMP2); 당단백질 100(gp100); 절단점 군 영역(BCR) 및 아벨슨(Abelson) 쥐 백혈병 바이러스 발암유전자 동족체 1(Ab1)(bcr-ab1)로 이루어지는 발암유전자 융합 단백질; 티로시나제; 에프린 유형-A 수용체 2(EphA2); 퓨코실 GM1; 시알릴 루이스 부착 분자(sLe); 강글리오시드 GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer); 트랜스글루타미나제 5(TGS5); 고분자량-흑색종-관련 항원(HMWMAA); o-아세틸-GD2 강글리오시드(OAcGD2); 폴레이트 수용체 베타; 종양 내피세포 마커 1(TEM1/CD248); 종양 내피세포 마커 7-관련된(TEM7R); 클라우딘 6(CLDN6); 갑상선 자극 호르몬 수용체(TSHR); G 단백질-결합된 수용체 부류 C 그룹 5, 구성원 D(GPRC5D); 염색체 X 개방 판독 프레임 61(CXORF61); CD97; CD179a; 역형성 림프종 키나제(ALK); 폴리시알산; 태반-특이성 1(PLAC1); 글로보H 글리코세라미드의 헥사사카라이드 부분(GloboH); 유선 분화 항원(NY-BR-1); 유로플라킨 2(UPK2); A형 간염 바이러스 세포 수용체 1(HAVCR1); 아드레날린 수용체 베타 3(ADRB3); 파넥신 3(PANX3); G 단백질-결합된 수용체 20(GPR20); 림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K 9(LY6K); 후각 수용체 51E2(OR51E2); TCR 감마 교번 판독 프레임 단백질(TARP); 빌름 종양 단백질(WT1); 암/고환 항원 1(NY-ESO-1); 암/고환 항원 2(LAGE-1a); 흑색종-관련 항원 1(MAGE-A1); ETS 전좌-변체 유전자 6, 염색체 12p상에 위치(ETV6-AML); 정액 단백질 17(SPA17); X 항원 과, 구성원 1A(XAGE1); 안지오포이에틴-결합 세포 표면 수용체 2(Tie 2); 흑색종 암 고환 항원-1 (MAD-CT-1); 흑색종 암 고환 항원-2(MAD-CT-2); Fos-관련 항원 1; 종양 단백질 p53(p53); p53 돌연변이체; 프로스테인; 생존; 텔로머라제; 전립선 암종 종양 항원-1(PCTA-1 또는 갈렉틴 8), T 세포 1에 의해 인식된 흑색종 항원(MelanA or MART1); 래트 육종(Ras) 돌연변이체; 인간 텔로머라제 역 전사효소(hTERT); 육종 전좌 절단점; 세포사멸의 흑색종 억제제(ML-IAP); ERG(막관통 프로테아제, 세린 2(TMPRSS2) ETS 융합 유전자); N-아세틸 글루코스아미닐-트랜스퍼라제 V(NA17); 쌍 상자 단백질 Pax-3(PAX3); 안드로겐 수용체; 사이클린 B1; v-myc 조류 골수세포종 바이러스 발암유전자 신경모세포종 유래된 동족체(MYCN); 라스 동족체 과 구성원 C(RhoC); 티로시나제-관련된 단백질 2(TRP-2); 시토크롬 P450 1B1(CYP1B1); CCCTC-결합 인자(아연 집게 단백질)-유사(BORIS 또는 날인된 부위의 조절제의 형제), T 세포 3에 의해 인식된 편평 세포 암종 항원(SART3); 쌍 상자 단백질 Pax-5(PAX5); 프로아크로신 결합 단백질 sp32(OY-TES1); 림프구-특이성 단백질 티로신 키나제(LCK); A 키나제 앵커 단백질 4(AKAP-4); 활액 육종, X 절단점 2(SSX2); 진행된 당화 최종생성물에 대한 수용체(RAGE-1); 신장 편재 1(RU1); 신장 편재 2(RU2); 레구메인; 인간 유두종 바이러스 E6(HPV E6); 인간 유두종 바이러스 E7(HPV E7); 장 카복실 에스테라제; 열충격 단백질 70-2 돌연변이된(mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; 백혈구-관련 면역글로불린-유사 수용체 1(LAIR1); IgA 수용체의 Fc 단편(FCAR 또는 CD89); 백혈구 면역글로불린-유사 수용체 아과 A 구성원 2(LILRA2); CD300 분자-유사 과 구성원 f(CD300LF); C-유형 렉틴 도메인 과 12 구성원 A(CLEC12A); 골수 간질 세포 항원 2(BST2); EGF-유사 모듈-함유 뮤신-유사 호르몬 수용체-유사 2(EMR2); 림프구 항원 75(LY75); 글리피칸-3(GPC3); Fc 수용체-유사 5 (FCRL5); 및 면역글로불린 람다-유사 폴리펩티드 1(IGLL1)에 결합할 수 있다.
일부 예에서, 상기 항원 결합 도메인은 상기 CAR이 최종적으로 사용될 동일한 종으로부터 유래되는 것이 이롭다. 예를 들어 인간에서 사용하기 위해, 상기 CAR의 항원 결합 도메인은 인간 항체, 본 명세서의 달리 어딘가에 기재된 바와 같은 인간화된 항체, 또는 그의 단편을 포함하는 것이 이로울 수 있다.
또한, 상기 항원 결합 도메인은 세포에서의 발현을 위해 상기 CAR의 또 다른 도메인, 예를 들어 막관통 도메인 또는 세포내 도메인(둘 다 본 명세서의 어딘가에 기재되어 있다)에 작동적으로 연결되는 것이 이롭다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원 결합 도메인을 암호화하는 핵산은 막관통 도메인을 암호화하는 핵산 및 세포내 도메인을 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결된다.
막관통 도메인
막관통 도메인에 관하여, 상기 CAR은 상기 CAR의 항원 결합 도메인을 세포내 도메인에 연결하는 막관통 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 상기 CAR 중의 도메인 중 하나 이상과 자연적으로 결합된다. 일부 예에서, 상기 막관통 도메인은, 상기와 같은 도메인이 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 결합하여 수용체 복합체의 다른 구성원들과의 상호작용을 최소화하는 것을 피하기 위해서 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형될 수 있다.
상기 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 상기 공급원이 천연인 경우, 상기 도메인은 임의의 막-결합된 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 본 발명에 특히 유용한 막관통 영역은 T 세포 수용체, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 알파, 베타 또는 제타쇄로부터 유래될 수 있다(즉 적어도 이들의 막관통 영역(들)을 포함할 수 있다). 일부 예에서, 인간 Ig(면역글로불린) 힌지를 포함하여 다양한 인간 힌지가 또한 사용될 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 막관통 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우 상기는 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기들을 우세하게 포함할 것이다. 바람직하게 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 3개 한 쌍은 합성 막관통 도메인의 각 단부에서 발견될 것이다.
세포내 도메인
상기 CAR의 세포내 도메인 또는 달리 세포질 도메인은 상기 CAR이 발현되는 세포의 활성화를 담당한다. 따라서 "세포내 도메인"이란 용어는 상기 활성화 신호를 전달하기에 충분한 세포내 도메인의 임의의 부분을 포함함을 의미한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포내 도메인은 효과기 기능에 책임이 있는 도메인을 포함한다. "효과기 기능"이란 용어는 세포의 특수 기능을 지칭한다. T 세포의 효과기 기능은 예를 들어 세포용해 활성 또는 사이토킨의 분비를 포함한 헬퍼 활성일 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 CAR의 세포내 도메인은 신호 활성화 및/또는 전달에 책임이 있는 도메인을 포함한다. 상기 세포내 도메인은 신호 활성화를 단백질-단백질 상호작용, 생화학적 변화, 또는 상기 세포의 대사, 모양, 유전자 발현의 변경에 대한 다른 반응, 또는 키메릭 세포내 신호전달 분자의 활성화에 대한 다른 세포 반응을 통해 전송할 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 세포내 도메인의 예는 비제한적으로 상기 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 부분, 및 항원 수용체 연동에 따른 신호 전달을 개시하기 위해 협력하여 작용하는 임의의 보조-자극 분자뿐만 아니라 이들 요소의 임의의 유도체 또는 변체 및 동일한 기능 능력을 갖는 임의의 합성 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 CAR의 세포내 도메인은 이중 신호전달 도메인을 포함한다. 상기 이중 신호전달 도메인은 본 명세서에 기재된 분자들 중 어느 하나로부터의 단편 또는 도메인을 포함할 수 있다.
상기 세포내 도메인의 예는 하나 이상의 분자 또는 수용체, 예를 들어 비제한적으로 TCR, CD3 제타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 입실론, CD86, 통상적인 FcR 감마, FcR 베타(Fc 입실론 R1b), CD79a, CD79b, Fc감마 RIIa, DAP10, DAP12, T 세포 수용체(TCR), CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, CDS, ICAM-1, GITR, BAFFR, HVEM(LIGHTR), SLAMF7, NKp80(KLRF1), CD127, CD160, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1(CD226), SLAMF4(CD244, 2B4), CD84, CD96(Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9(CD229), CD160(BY55), PSGL1, CD100(SEMA4D), CD69, SLAMF6(NTB-A, Ly108), SLAM(SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME(SLAMF8), SELPLG(CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, NKp44, NKp30, NKp46, NKG2D, 본 명세서에 기재된 다른 보조-자극 분자, 이들의 임의의 유도체, 변체 또는 단편, 동일한 기능 능력을 갖는 보조-자극 분자의 임의의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합으로부터의 단편 또는 도메인을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 CAR의 세포내 도메인은 CD3, CD27, CD28, ICOS, 4-1BB, PD-1, T 세포 수용체(TCR), 이들의 임의의 유도체 또는 변체, 동일한 기능 능력을 갖는 이들의 임의의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합으로부터의 적어도 하나의 신호전달 도메인과 같은 보조-자극 분자의 임의의 부분을 포함한다.
상기 CAR의 항원 결합 도메인과 막관통 도메인간에, 또는 상기 CAR의 세포내 도메인과 막관통 도메인간에 이격자 도메인이 통합될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "이격자 도메인"이란 용어는 일반적으로 상기 막관통 도메인을 폴리펩티드 쇄 중의 항원 결합 도메인 또는 세포내 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 의미한다. 하나의 실시태양에서, 상기 이격자 도메인은 300 아미노산 이하, 바람직하게는 10 내지 100 아미노산, 및 가장 바람직하게는 25 내지 50 아미노산을 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 길이가 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 바람직하게는 2 내지 10 아미노산이 상기 CAR의 막관통 도메인과 세포내 도메인간에 결합을 형성할 수 있다. 링커의 일례는 글리신-세린 한 쌍을 포함한다.
인간 항체
CAR의 이중특이성 항체 또는 항원 결합 도메인을 사용하는 경우 인간 항체 또는 그의 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 완전 인간 항체는 인간 피험자의 치료학적 치료에 특히 바람직하다. 인간 항체를 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 항체 라이브러리를 사용하는 파지 디스플레이 방법을 포함하여 당해 분야에 공지된 다양한 방법들(이들 기법에 대한 개선 포함)에 의해 제조할 수 있다. 또한, 미국특허 제 4,444,887 호 및 미국특허 제 4,716,111 호; 및 PCT 공보 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, 및 WO 91/10741을 참조하시오; 이들은 각각 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다. 상기 이중특이성 항체는 또한, 중쇄 및 경쇄가 인간 DNA의 하나 이상의 공급원으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 항체를 포함할 수 있다.
인간 항체를 또한, 기능성 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만 인간 면역글로불린 유전자를 발현할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 복합체를 마우스 배아 줄기 세포내에 무작위로 또는 상동성 재조합에 의해 도입시킬 수 있다. 한편으로, 상기 인간 가변 영역, 불변 영역 및 다양성 영역을 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 외에 마우스 배아 줄기 세포내에 도입시킬 수 있다. 상기 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동성 재조합에 의해 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과 별도로 또는 상기 도입과 동시에 비-기능성으로 될 수 있다. 예를 들어, 키메릭 및 생식세포 계열 돌연변이 마우스 중의 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동종접합 결실은 내인성 항체 생성의 완전한 억제를 발생시킴이 개시되었다. 상기 변형된 배아 줄기 세포를 증대시키고 배반포에 미세주입하여 키메릭 마우스를 생성시킨다. 이어서 상기 키메릭 마우스를 번식시켜 인간 항체를 발현하는 동종접합 새끼를 생성시킨다. 상기 트랜스제닉 마우스를 선택된 항원, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 전부 또는 일부로 통상적인 방식으로 면역시킨다. 선택 표적에 대한 항체를 통상적인 하이브리도마 기술을 하용하여 면역된, 트랜스제닉 마우스로부터 수득할 수 있다. 상기 트랜스제닉 마우스가 갖는 인간 면역글로불린 트랜스유전자는 B 세포 분화 중에 재배열하고, 후속으로 부류 변환 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 상기와 같은 기법을 사용하여, 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체(비제한적으로 IgG1(감마1) 및 IgG3을 포함한다)를 생성시킬 수 있다. 인간 항체의 상기 생성 기법에 대한 개관에 대해서, 문헌[Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)]을 참조하시오. 인간 항체 및 인간 단클론 항체의 상기 생성 기법 및 상기와 같은 항체의 생성 프로토콜에 대한 상세한 논의에 대해서, 예를 들어 PCT 공보 WO 98/24893, WO 96/34096, 및 WO 96/33735; 및 미국특허 제 5,413,923 호; 미국특허 제 5,625,126 호; 미국특허 제 5,633,425 호; 미국특허 제 5,569,825 호; 미국특허 제 5,661,016 호; 미국특허 제 5,545,806 호; 미국특허 제 5,814,318 호; 및 미국특허 제 5,939,598 호(이들은 각각 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)를 참조하시오. 또한, 아브제닉스 인코포레이티드(Abgenix, Inc.)(미국 캘리포니아주 프리몬트 소재) 및 젠팜(Genpharm)(미국 캘리포니아 산호세 소재)과 같은 회사들이 상술한 바와 유사한 기술을 사용하여 선택된 항원에 대한 인간 항체를 제공하는데 참여할 수 있다. 항원 공격시 인간 항체를 생성시키는 생식세포 계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식세포 계열 면역글로불린 유전자 배열의 전달에 대한 구체적인 논의에 대해서, 예를 들어 하기 문헌들을 참조하시오: Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993); 및 Duchosal et al., Nature, 355:258 (1992).
인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유래될 수 있다(Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech., 14:309 (1996)). 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., Nature, 348:552-553 (1990))을 사용하여 시험관내에서 면역되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼터리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 생성시킬 수 있다. 상기 기법에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 섬유성 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주 또는 부 외피 단백질 유전자내로 인-프레임 클로닝시키며, 상기 유전자는 파지 입자의 표면상에 기능성 항체 단편으로서 나타난다. 상기 섬유성 입자는 상기 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 사본을 함유하기 때문에, 상기 항체의 기능성 성질에 근거한 선택은 또한 상기 성질을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자를 선택하게 한다. 따라서, 상기 파지는 상기 B 세포의 성질들 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이를 다양한 포맷으로 수행할 수 있다; 그의 재고찰을 위해서 예를 들어 문헌[Johnson, Kevin S, and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조하시오. V-유전자 분절의 다수의 공급원들을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 클락슨(Clackson) 등(Nature, 352:624-628 (1991))은 면역되지 않은 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 단리하였다. 면역되지 않은 인간 공여자로부터 V 유전자의 레퍼토리를 구성하고 항원(자기-항원 포함)의 다양한 배열에 대한 항체들을 필수적으로 하기 문헌에 기재된 기법에 따라 단리할 수 있다: Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993). 또한 미국특허 제 5,565,332 호 및 미국특허 제 5,573,905 호(이들은 각각 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)를 참조하시오.
인간 항체를 또한 시험관내 활성화된 B 세포에 의해 생성시킬 수 있다(미국특허 제 5,567,610 호 및 미국특허 제 5,229,275 호(이들은 각각 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)를 참조하시오). 인간 항체를 또한 하이브리도마 기법, 예를 들어 비제한적으로 문헌[Roder et al., Methods Enzymol., 121:140-167 (1986)]에 기재된 기법을 사용하여 시험관내에서 생성시킬 수 있다.
인간화된 항체
한편으로, 일부 실시태양에서, 비-인간 항체를 인간화시킬 수 있으며, 이때 상기 항체의 특정한 서열 또는 영역들을, 인간에서 자연적으로 생성된 항체에 대한 유사성을 증가시키기 위해 변형시킨다. 예를 들어, 본 발명에서, 상기 항체 또는 그의 단편은 비-인간 포유동물 scFv를 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원 결합 도메인 부분을 인간화시킨다.
인간화된 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 CDR-이식(예를 들어 유럽 특허 EP 239,400; 국제 공보 WO 91/09967; 및 미국특허 제 5,225,539 호; 미국특허 제 5,530,101 호; 미국특허 제 5,585,089 호(이들은 각각 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)를 참조하시오), 베니어링(veneering) 또는 리설피싱(resurfacing)(예를 들어 유럽 특허 EP 592,106 및 EP 519,596; 문헌[Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498]; 문헌[Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814]; 및 문헌[Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973](이들은 각각 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)을 참조하시오), 쇄 셔플링(예를 들어 미국특허 제 5,565,332 호(상기는 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)를 참조하시오), 및 예를 들어 미국특허 출원 공보 US2005/0042664, 미국특허 출원 공보 US2005/0048617, 미국특허 제 6,407,213 호, 미국특허 제 5,766,886 호, 국제 공보 WO 9317105, 문헌[Tan et al., J. Immunol., 169:1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000)], 문헌[Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000)], 문헌[Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16):10678-84 (1997)], 문헌[Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996)], 문헌[Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995)], 문헌[Couto et al., Cancer Res., 55(8):1717-22 (1995)], 문헌[Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994)], 및 문헌[Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994)](이들은 각각 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)에 개시된 기법들을 사용하여 생성시킬 수 있다. 종종, 프레임워크 영역 중의 프레임워크 잔기는 CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 치환되어 항원 결합을 변경, 바람직하게는 개선시킬 것이다. 이러한 프레임워크 치환은 당해 분야에 주지된 방법에 의해, 예를 들어 특정 위치들에서 특이한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 항원 결합 및 서열 비교에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위해서 상기 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용을 모델링함으로써 확인된다(예를 들어 미국특허 제 5,585,089 호(Queen et al.); 및 문헌[Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323](이들은 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)을 참조하시오).
인간화된 항체는 비인간 공급원으로부터 상기 내로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기를 종종 "수입" 잔기라 칭하며, 전형적으로는 "수입" 가변 도메인으로부터 취한다. 따라서, 인간화된 항체는 비인간 면역글로불린 분자로부터의 하나 이상의 CDR 및 인간으로부터의 프레임워크 영역을 포함한다. 항체의 인간화는 당해 분야에 주지되어 있으며 필수적으로, 윈터(Winter)와 동료의 방법에 따라(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), 인간 항체의 상응하는 서열 대신 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 치환시킴으로써, 즉 CDR-이식에 의해(EP 239,400; PCT 공보 WO 91/09967; 및 미국특허 제 4,816,567 호; 미국특허 제 6,331,415 호; 미국특허 제 5,225,539 호; 미국특허 제 5,530,101 호; 미국특허 제 5,585,089 호; 미국특허 제 6,548,640 호(내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)) 수행될 수 있다. 상기와 같은 인간화된 키메릭 항체에서, 실질적으로 완전 미만의 인간 가변 도메인을 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환시켰다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크(FR) 잔기가 설치류 항체 중의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다. 항체의 인간화를 또한 베니어링(veneering) 또는 리설피싱(resurfacing)(EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., Protein Engineering, 7(6):805-814 (1994); 및 Roguska et al., PNAS, 91:969-973 (1994)) 또는 쇄 셔플링(미국특허 제 5,565,332 호)(이들 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)에 의해 성취할 수 있다.
인간화된 항체의 제조에 사용되는 인간 가변 도메인(경쇄 및 중쇄 모두)의 선택은 항원성을 감소시키기 위한 것이다. 소위 "최적합" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 선별한다. 이어서 상기 설치류의 서열에 가장 가까운 인간 서열을 상기 인간화된 항체의 인간 프레임워크(FR)로서 수용한다(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987))(내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정한 프레임워크를 사용한다. 같은 프레임워크를 다수의 상이한 인간화된 항체에 사용할 수도 있다(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993))(내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다).
항체를 표적 항원의 높은 친화성 및 다른 유리한 생물학적 성질의 유지와 함께 인간화시킬 수 있다. 본 발명의 하나의 태양에 따라, 인간화된 항체를, 모 서열 및 인간화된 서열의 3-차원 모델을 사용하여 상기 모 서열 및 다양한 개념상의 인간화된 생성물의 분석 과정에 의해 제조한다. 3-차원 면역글로불린 모델을 통상적으로 입수할 수 있으며 이는 당해 분야의 숙련가들에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 있음직한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 나타내는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이들 디스플레이의 검사는 상기 후보 면역글로불린 서열의 기능화에서 잔기들의 있음직한 역할의 분석, 즉 후보 항원에 결합하는 상기 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기들의 분석을 허용한다. 이렇게 하여, FR 잔기를 선택하고 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원에 대한 증가된 친화성이 성취되도록 수용 및 수입 서열로부터 조합할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
인간화된 항체는 원래 항체와 유사한 항원 특이성을 유지한다. 그러나, 몇몇 인간화 방법을 사용하는 경우, 표적 항원에 대한 항체의 결합 친화성 및/또는 특이성을 문헌[Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151 (1999)](이의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)에 기재된 바와 같이, "방향 진화" 방법을 사용하여 증가시킬 수 있다.
다른 분자
본 발명은 또한 보조-자극 분자 또는 상기 보조-자극 분자를 암호화하는 핵산을 추가로 포함하는 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 변형된 T 세포는 보조-자극 분자를 암호화하는 외인성 핵산을 추가로 포함하며, 따라서 상기 변형된 T 세포는 상기 보조-자극 분자를 발현한다. 상기 핵산을, 상기 T 세포의 형질도입, 상기 T 세포의 형질감염, 또는 상기 T 세포의 전기천공에 의해 상기 T 세포내에 도입시킬 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 보조-자극 분자는 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L 중에서 선택된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 보조-자극 분자는 CD3을 포함하고 적어도 2개의 상이한 CD3 쇄, 예를 들어 CD3 제타 및 CD3 입실론쇄를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포는 상기 T 세포의 다능성을 유도하기 위해서 Klf4, Oct3/4 및/또는 Sox2, 또는 Klf4, Oct3/4 및/또는 Sox2를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 상기 T 세포를 Klf4, Oct3/4 및/또는 Sox2를 발현시킴으로써 다능성으로 유도할 수 있다. Klf4, Oct3/4 및/또는 Sox2는 핵산, 바이러스 벡터(들) 또는 RNA 분자(들)로부터 발현될 수 있다. 하나의 실시태양에서, Klf4, Oct3/4 및/또는 Sox2를 암호화하는 바이러스 벡터를 상기 T 세포에 도입시켜 다능성을 유도한다. 또 다른 실시태양에서, 센다이 바이러스 벡터를 상기 T 세포에 도입시켜 다능성을 유도하며, 여기에서 상기 센다이 바이러스 벡터는 Klf4, Oct3/4 및 Sox2를 암호화한다.
핵산의 도입
핵산을 세포내에 도입시키는 방법은 물리적, 생물학적 및 화학적 방법을 포함한다. 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 RNA를 숙주 세포내에 도입시키는 물리적 방법은 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙션, 유전자총, 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. RNA를 전기천공(아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector)-II(아막사 바이오시스템스(Amaxa Biosystems), 독일 쾰른 소재)), (ECM 830 (BTX) (하바드 인스트루먼츠(Harvard Instruments) 미국 매사추세츠주 보스톤 소재) 또는 진 펄서(Gene Pulser) II(바이오래드(BioRad), 미국 콜로라도주 덴버 소재), 멀티포레이터(Multiporator)(에펜도르프(Eppendort), 독일 함부르크 소재)을 포함하는 상업적으로 입수할 수 있는 방법들을 사용하여 표적 세포내에 도입시킬 수 있다. RNA를 또한 리포펙션을 사용하는 양이온성 리포솜 매개된 형질감염을 사용하거나, 중합체 캡슐화를 사용하거나, 펩티드 매개된 형질감염을 사용하거나, 또는 유전자총법 입자 전달 시스템, 예를 들어 "유전자 총"을 사용하여 세포에 도입시킬 수 있다(예를 들어 문헌[Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)]을 참조하시오).
관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포내에 도입시키기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터가 유전자를 포유동물, 예를 들어 인간 세포에 삽입하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되고 있다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스 단순 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,350,674 호 및 미국특허 제 5,585,362 호를 참조하시오.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포내에 도입시키기 위한 화학적 수단은 콜로이드성 분산 시스템, 예를 들어 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드, 및 수중 유적형 유화액, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함한 지질-기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포솜(예를 들어 인공 멤브레인 소낭)이다.
사용에 적합한 지질을 상업적인 출처로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")을 시그마(Sigma)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 수득할 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")를 K&K 레보라토리즈(미국 뉴욕주 플레인뷰 소재)로부터 수득할 수 있고; 콜레스테롤("Choi")을 칼바이오켐-베링(Calbiochem-Behring)으로부터 수득할 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질들을 아반티 폴라 리피즈 인코포레이티드(Avanti Polar Lipids, Inc.)(미국 알라바마주 버밍햄 소재)로부터 수득할 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중의 지질의 모액을 약 -20 ℃에서 보관할 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 쉽게 증발되기 때문에 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 둘러싸고 있는 지질 2층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단층 및 다층 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어이다. 리포솜은 인지질 2층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소낭 구조를 가짐을 특징으로 할 수 있다. 다층 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다수의 지질층을 갖는다. 상기는 인지질이 과잉의 수용액 중에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 상기 지질 성분은 폐쇄된 구조의 형성 전에 자기-재배열을 겪고 상기 지질 2층 사이에 물 및 용해된 용질을 포집한다(Ghosh et al, 1991 Glycobiology 5:505-10). 그러나, 통상적인 소낭 구조보다 용액 중에 상이한 구조를 갖는 조성이 또한 포함된다. 예를 들어, 상기 지질은 미셀 구조를 띠거나 또는 단지 지질 분자의 불균일 응집체로서 존재한다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
외인성 핵산의 숙주 세포내로의 도입 또는 달리 본 발명의 억제제에의 세포의 노출에 사용되는 방법과 관계없이, 상기 숙주 세포 중의 핵산의 존재를 확인하기 위해서, 다양한 분석들을 수행할 수 있다. 상기와 같은 분석은 예를 들어 당해 분야의 숙련가들에게 주지된 "분자 생물학적" 분석, 예를 들어 서던 및 노던 블럿팅, RT-PCR 및 PCR; "생화학적" 분석, 예를 들어 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블럿)에 의한 또는 본 발명의 범위내에 속하는 작용제들을 확인하기 위해 본 명세서에 기재된 분석들에 의한 특정 펩티드의 존재 또는 부재의 검출을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 표적 세포상의 항원에 대한 친화성을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산을 상기 증대된 T 세포내에 도입시킨다. 상기 TCR을 암호화하는 핵산은 내인성 TCR 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 동일한 또는 별도의 핵산일 수 있다. 상기 TCR을 암호화하는 핵산을, 내인성 TCR 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산과 동시에 또는 순차적으로 상기 T 세포에 도입시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 TCR을 암호화하는 핵산을, 내인성 TCR 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산에 앞서 도입한다.
더욱이, 상기 핵산을 임의의 수단, 예를 들어 상기 증대된 T 세포의 형질도입, 상기 증대된 T 세포의 형질감염, 및 상기 증대된 T 세포의 전기천공에 의해 도입시킬 수 있다. 하나의 핵산을 하나의 방법에 의해 도입시킬 수 있으며 또 다른 핵산을 상이한 방법에 의해 상기 T 세포내에 도입시킬 수 있다.
RNA
하나의 실시태양에서, 상기 T 세포내에 도입된 핵산은 RNA이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 RNA는 시험관내 전사된 RNA 또는 합성 RNA를 포함하는 mRNA이다. 상기 RNA를, 폴리머라제 쇄 반응(PCR)-생성된 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성시킨다. 임의의 공급원으로부터의 관심 DNA를 적합한 프라이머 및 RNA 폴리머라제를 사용하여 PCR에 의해 시험관내 mRNA 합성을 위한 주형으로 직접 전환시킬 수 있다. 상기 DNA의 공급원은 예를 들어 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 파지 DNA, cDNA, 합성 DNA 서열 또는 DNA의 임의의 다른 적합한 공급원일 수 있다. 시험관내 전사에 바람직한 주형은 키메릭 막 단백질이다. 예로서, 상기 주형은 항체, 항체의 단편 또는 항체의 일부를 암호화한다. 또 다른 예로서, 상기 주형은 항체의 단쇄 가변 도메인, 예를 들어 항-CD3을 포함하는 세포외 도메인, 및 보조-자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 RNA 키메릭 막 단백질에 대한 주형은 보조-자극 분자에 대한 항체로부터 유래된 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 일부로부터 유래된 세포내 도메인을 포함하는 키메릭 막 단백질을 암호화한다.
PCR을 사용하여 mRNA의 시험관내 전사를 위한 주형을 생성시키고, 이어서 상기를 세포내에 도입시킨다. PCR을 수행하는 방법은 당해 분야에 주지되어 있다. PCR에 사용하기 위한 프라이머를, 상기 PCR을 위한 주형으로서 사용되는 상기 DNA의 영역들에 실질적으로 상보성인 영역들을 갖도록 설계한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "실질적으로 상보성"은 상기 프라이머 서열 중 염기의 대부분 또는 전부가 상보성이거나, 또는 하나 이상의 염기가 비-상보성이거나, 또는 오합치되는 경우의 뉴클레오티드의 서열을 지칭한다. 실질적으로 상보성인 서열은 PCR에 사용되는 어닐링 조건하에서 의도된 DNA 표적과 어닐링하거나 하이브리드화할 수 있다. 상기 프라이머를, 상기 DNA 주형의 임의의 부분에 실질적으로 상보성이도록 설계할 수 있다. 예를 들어, 상기 프라이머를 5' 및 3' UTR을 포함하여, 세포에서 통상적으로 전사되는 유전자 부분(개방 판독 프레임)을 증폭시키도록 설계할 수 있다. 상기 프라이머를 또한 특정한 관심 도메인을 암호화하는 유전자의 일부를 증폭시키도록 설계할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 프라이머는 5' 및 3' UTR의 전부 또는 일부를 포함하여, 인간 cDNA의 암호화 영역을 증폭시키도록 설계된다. PCR에 유용한 프라이머는 당해 분야에 주지된 합성 방법에 의해 생성된다. "순방향 프라이머"는 증폭시키고자 하는 DNA 서열의 상류인 상기 DNA 주형상의 뉴클레오티드에 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "상류"는 본 명세서에서 암호화 가닥에 비해 증폭되는 DNA 서열에 대한 5 위치를 지칭하는데 사용된다. "역방향 프라이머"는 증폭시키고자 하는 DNA 서열의 하류인 이중-가닥 DNA 주형에 실질적으로 상보성인 뉴클레오티드의 영역을 함유하는 프라이머이다. "하류"는 본 명세서에서 암호화 가닥에 비해 증폭되는 DNA 서열에 대한 3' 위치를 지칭하는데 사용된다.
상기 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 증진시키는 능력을 갖는 화학적 구조들을 또한 사용할 수 있다. 상기 RNA는 바람직하게는 5' 및 3' UTR을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 5' UTR은 길이가 0 내지 3000 뉴클레오티드이다. 상기 암호화 영역에 부가되는 5' 및 3' UTR 서열의 길이를 상이한 방법들, 예를 들어 비제한적으로 상기 UTR의 상이한 영역들에 어닐링하는 PCR용 프라이머의 설계에 의해 변경시킬 수 있다. 상기 접근법을 사용하여, 당해 분야의 통상적인 숙련가는 상기 전사된 RNA의 형질감염에 따른 최적의 번역 효율을 성취하는데 필요한 5' 및 3' UTR 길이를 변형시킬 수 있다.
상기 5' 및 3' UTR은 관심 유전자에 대한 천연의 내인성 5' 및 3' UTR일 수 있다. 한편으로, 상기 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열을 상기 순방향 및 역방향 프라이머내에 통합시키거나 또는 상기 주형의 임의의 다른 변형에 의해 부가할 수 있다. 관심 유전자에 내인성이 아닌 UTR 서열의 사용이 상기 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 변형시키기에 유용할 수 있다. 예를 들어, 3' UTR 서열 중의 AU-풍부 요소는 mRNA의 안정성을 감소시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 3' UTR을 당해 분야에 주지된 UTR의 성질에 기반하여 전사된 RNA의 안정성을 증가시키도록 선택하거나 설계할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 5' UTR은 상기 내인성 유전자의 코작 서열을 함유할 수 있다. 한편으로, 관심 유전자에 내인성이 아닌 5' UTR을 상술한 바와 같이 PCR에 의해 부가하는 경우, 공통 코작 서열을 상기 5' UTR 서열의 부가에 의해 재설계할 수 있다. 코작 서열은 일부 RNA 전사물의 번역 효율을 증가시킬 수 있지만, 효율적인 번역을 가능하게 하기 위해 모든 RNA가 필요한 것 같지는 않다. 다수 mRNA에 대한 코작 서열의 요구는 당해 분야에 공지되어 있다. 다른 실시태양에서 상기 5' UTR은 세포에서 안정한 RNA 게놈을 갖는 RNA 바이러스로부터 유래될 수 있다. 다른 실시태양에서 다양한 뉴클레오티드 유사체들을 상기 mRNA의 엑소뉴클레아제 분해를 방해하기 위해서 상기 3' 또는 5' UTR에 사용할 수 있다.
유전자 클로닝의 필요 없이 DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 가능하게 하기 위해서, 전사 프로모터를 전사시킬 서열의 DNA 주형 상류에 부착시켜야 한다. RNA 폴리머라제에 대한 프로모터로서 기능하는 서열을 순방향 프라이머의 5' 단부에 부가하는 경우, 상기 RNA 폴리머라제 프로모터는 전사시키고자 하는 개방 판독 프레임의 PCR 산물 상류에 통합되게 된다. 하나의 실시태양에서, 상기 프로모터는 본 명세서의 달리 어딘가에 기재된 바와 같은 T7 폴리머라제 프로모터이다. 다른 유용한 프로모터는 비제한적으로 T3 및 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함한다. T7, T3 및 SP6 프로모터에 대한 공통 뉴클레오티드 서열들이 당해 분야에 공지되어 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 mRNA는 리보솜 결합, 번역의 개시 및 세포에서 mRNA 안정성을 결정하는 5' 단부 및 3' 폴리(A) 꼬리상의 캡을 모두 갖는다. 환상 DNA 주형, 예를 들어 플라스미드 DNA상에서, RNA 폴리머라제는 진핵생물 세포에서의 발현에 적합하지 않은 긴 연쇄체성 생성물을 생성시킨다. 상기 3' UTR의 단부에서 선형화된 플라스미드 DNA의 전사는 통상적인 크기의 mRNA를 생성시키며, 이는 전사후 폴리아데닐화된다 하더라도 진핵생물 형질감염에 유효하지 않다.
선형 DNA 주형상에서, 파지 T7 RNA 폴리머라제는 전사물의 3' 단부를 상기 주형의 마지막 염기 이상으로 연장시킬 수 있다(Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).
DNA 주형내로 폴리A/T 신장부의 통상적인 통합 방법은 분자 클로닝이다. 그러나, 플라스미드 DNA에 통합된 폴리A/T 서열은 플라스미드 불안정성을 야기할 수 있으며, 이는 세균 세포로부터 수득된 플라스미드 DNA 주형이 종종 결실 및 다른 이상으로 매우 오염되는 이유이다. 이는 클로닝 과정을 힘들고 시간 소모적이게 할 뿐만 아니라 종종 신뢰할 수 없게 한다. 이것이 클로닝 없이 폴리A/T 3' 신장부를 갖는 DNA 주형의 구성을 허용하는 방법이 매우 바람직한 이유이다.
상기 전사 DNA 주형의 폴리A/T 분절을, 폴리T 꼬리, 예를 들어 100T 꼬리(크기는 50-5000 T일 수 있다)를 함유하는 역 프라이머를 사용함으로써 PCR 도중에, 또는 임의의 다른 방법, 예를 들어 비제한적으로 DNA 결찰 또는 시험관내 재조합에 의해 PCR 후에 생성시킬 수 있다. 폴리(A) 꼬리는 또한 RNA에 안정성을 제공하며 그의 분해를 감소시킨다. 일반적으로, 폴리(A) 꼬리의 길이는 전사된 RNA의 안정성과 양의 상관성을 갖는다. 하나의 실시태양에서, 상기 폴리(A) 꼬리는 100 내지 5000 아데노신이다.
RNA의 폴리(A) 꼬리를 폴리(A) 폴리머라제, 예를 들어 이 콜라이 폴리A 폴리머라제(E-PAP)의 사용으로 시험관내 전사에 따라 추가로 연장시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 폴리(A) 꼬리의 길이를 100 뉴클레오티드에서 300 내지 400 뉴클레오티드로 증가시키는 것은 상기 RNA의 번역 효율을 약 2배 증가시킨다. 추가로, 상기 3' 단부에 대한 상이한 화학 그룹들의 부착은 mRNA 안정성을 증가시킬 수 있다. 상기와 같은 부착은 변형된/인공 뉴클레오티드, 앱타머 및 다른 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, ATP 유사체를 폴리(A) 폴리머라제를 사용하여 상기 폴리(A) 꼬리에 통합시킬 수 있다. APT 유사체가 상기 RNA의 안정성을 추가로 증가시킬 수 있다.
5' 캡은 또한 RNA 분자에 안정성을 제공한다. 바람직한 실시태양에서, 본 명세서 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 5' 캡을 포함한다. 상기 5' 캡은 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 기법들을 사용하여 제공된다(Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).
본 명세서에 개시된 방법에 의해 생성된 RNA는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 함유할 수 있다. 상기 IRES 서열은 mRNA에 대한 캡-독립적인 리보솜 결합을 개시시키고 번역의 개시를 촉진하는 임의의 바이러스, 염색체 또는 인공 설계된 서열일 수 있다. 세포 전기천공에 적합한 임의의 용질(세포 투과성 및 생육성을 촉진하는 인자들을 함유할 수 있다), 예를 들어 당, 펩티드, 지질, 단백질, 산화방지제, 및 계면활성제를 포함시킬 수 있다.
RNA 형질감염
일부 실시태양에서, TCR을 암호화하는 RNA를 세포에 전기천공시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 TCR을 암호화하는 RNA는 시험관내 전사된 RNA이다.
상기 개시된 방법들을 표적 암세포를 살해하는 유전자 변형된 T 세포의 능력의 평가를 포함하여, 기본적인 연구 및 치료법, 암, 줄기세포, 급성 및 만성 감염, 및 자가면역 질병의 분야에서 T 세포 활성의 조절에 적용할 수 있다.
상기 방법들은 또한 예를 들어 프로모터 또는 투입 RNA의 양을 변화시켜 발현 수준을 개별적으로 조절할 수 있게 함으로써 상기 발현 수준을 광범위하게 조절하는 능력을 제공한다. 더욱 또한, PCR-기반 mRNA 생성 기법은 상이한 구조 및 도메인들의 조합을 갖는 mRNA의 설계를 매우 용이하게 한다.
본 발명의 RNA 전사 방법의 한 가지 장점은 RNA 형질감염이 필수적으로 일시적이고 무-벡터라는 것이다. RNA 트랜스유전자는 림프구로 전달되어 거기에서 임의의 추가적인 바이러스 서열의 필요 없이 최소 발현 카세트로서 간단한 시험관내 세포 활성화에 따라 발현될 수 있다. 이러한 조건하에서, 상기 트랜스유전자의 숙주세포 게놈내로의 통합은 일어나지 않을 듯하다. 세포의 클로닝은, 상기 RNA의 형질감염 효율 및 전체 림프구 집단을 균일하게 변형시키는 그의 능력으로 인해 필요하지 않다.
시험관내-전사된 RNA(IVT-RNA)에 의한 T 세포의 유전자 변형은 2가지 상이한 전략을 사용할 수 있게 하는데, 이들 전략은 모두 다양한 동물 모델에서 성공적으로 시험되었다. 세포를 리포펙션 또는 전기천공에 의해 시험관내-전사된 RNA로 형질감염시킨다. 전달된 IVT-RNA의 연장된 발현을 성취하기 위해서 IVT-RNA를 다양한 변형을 사용하여 안정화시키는 것이 바람직할 수 있다.
시험관내 전사를 위한 주형으로서 표준화된 방식으로 사용되고 안정화된 RNA 전사물을 생성시키는 방식으로 유전자 변형된 일부 IVT 벡터들이 문헌에 공지되어 있다. 당해 분야에 사용되는 현행 프로토콜들은 하기의 구조를 갖는 플라스미드 벡터를 기본으로 한다: RNA 전사를 가능하게 하는 5' RNA 폴리머라제 프로모터에 이어서, 번역되지 않은 영역(UTR)이 3' 및/또는 5'에 인접한 관심 유전자, 및 50-70 A 뉴클레오티드를 함유하는 3' 폴리아데닐 카세트. 시험관내 전사에 앞서, 상기 환상 플라스미드는 II형 제한 효소(인식 서열은 절단 부위에 상응한다)에 의해 상기 폴리아데닐 카세트의 하류에서 선형화된다. 따라서 상기 폴리아데닐 카세트는 상기 전사물 중의 나중의 폴리(A) 서열에 상응한다. 상기 과정의 결과로서, 일부 뉴클레오티드는 선형화 후 상기 효소 절단 부위의 부분으로서 남아있고 상기 3' 단부에서 폴리(A) 서열을 연장시키거나 가린다. 상기 비생리학적 오버행이 상기와 같은 구조물로부터 세포내적으로 생성되는 단백질의 양에 영향을 미치는지의 여부는 명확하지 않다.
RNA는 보다 전통적인 플라스미드 또는 바이러스 접근법보다 다수의 장점들을 갖는다. mRNA 공급원으로부터의 유전자 발현은 전사를 필요로하지 않으며 단백질 생성물이 형질감염 후 빠르게 생성된다. 더욱이, 상기 RNA는 핵보다는 단지 세포질에 대한 통로를 수득해야 하기 때문에, 전형적인 형질감염 방법들은 매우 높은 형질감염 속도를 생성시킨다. 또한, 플라스미드 기반 접근법은 관심 유전자의 발현을 구동하는 프로모터가 연구 중인 세포에서 활성일 것을 요한다.
또 다른 태양에서, 상기 RNA 구조물을 전기천공에 의해 세포내로 전달한다. 예를 들어 US 2004/0014645, US 2005/0052630A1, US 2005/0070841A1, US 2004/0059285A1, US 2004/0092907A1에 교시된 바와 같이 포유동물 세포내로의 핵산 구조물의 전기천공 제형 및 방법을 참조하시오. 임의의 공지된 세포 유형의 전기천공에 필요한 전장 강도를 포함한 다양한 매개변수들이 관련 연구 문헌뿐만 아니라 당해 분야의 다수의 특허 및 출원들에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어 미국특허 제 6,678,556 호, 미국특허 제 7,171,264 호, 및 미국특허 제 7,173,116 호를 참조하시오. 전기천공의 치료학적 적용을 위한 기구들은 상업적으로 입수할 수 있으며(예를 들어 MedPulser(상표) DNA 전기천공 쎄라피 시스템(Electroporation Therapy System)(이노비오/제네트로닉스(Inovio/Genetronics), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), 미국특허 제 6,567,694 호; 미국특허 제 6,516,223 호, 미국특허 제 5,993,434 호, 미국특허 제 6,181,964 호, 미국특허 제 6,241,701 호, 및 미국특허 제 6,233,482 호와 같은 특허들에 기재되어 있고; 전기천공을 또한 US20070128708A1에 기재된 바와 같이 시험관내에서 세포의 형질감염에 사용할 수 있다. 전기천공을 또한 시험관내에서 세포내에 핵산을 전달하는데 사용할 수 있다. 상응하게, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 다수의 이용 가능한 장치 및 전기천공 시스템 중 어느 하나를 사용하는, 발현 구조물을 포함하는 핵산의 세포내로의 전기천공-매개된 투여는 관심 RNA의 표적 세포로의 전달에 흥분되는 새로운 수단을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 TCR 알파 및 베타쇄를 암호화하는 RNA를 전기천공시킴을 포함한다. 상기 TCR 알파 및 베타쇄는 동일한 또는 별도의 RNA상에서 암호화될 수 있다. 상기 알파 및 베타가 별도의 RNA에 의해 암호화되는 경우, 상기 RNA는 동시-전기천공될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 보조-자극 분자를 암호화하는 핵산을 전기천공시킴을 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조-자극 분자 핵산을 상기 TCR RNA와 동시-전기천공시킬 수 있다.
T 세포의 공급원
증대에 앞서, T 세포의 공급원을 피험자로부터 수득한다. 피험자의 비제한적인 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 및 그들의 트랜스제닉 종을 포함한다. 바람직하게, 상기 피험자는 인간이다. T 세포를 다수의 공급원, 예를 들어 말초 혈액 단핵세포, 골수, 림프절 조직, 비장 조직, 탯줄, 및 종양으로부터 수득할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 당해 분야에서 입수할 수 있는 임의의 수의 T 세포를 사용할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, T 세포를 숙련가에게 공지된 임의의 수의 기법, 예를 들어 피콜 분리를 사용하여 피험자로부터 수집된 혈액의 단위로부터 수득할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 개인의 순환 혈액으로부터의 세포를 성분채집술 또는 백혈구성분채집술에 의해 수득한다. 상기 성분채집술 생성물은 전형적으로 T 세포를 포함한 림프구, 단핵세포, 과립구, B 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구, 및 혈소판을 함유한다. 상기 성분채집술에 의해 수집된 세포를 후속 가공 단계를 위해서, 세척하여 혈장 분획을 제거하고 상기 세포를 적합한 완충제 또는 매질, 예를 들어 포스페이트 완충 염수(PBS), 또는 칼슘이 없고 마그네슘이 없거나 다수(전부는 아니더라도)의 2가 양이온이 없을 수도 있는 세척액 중에 넣을 수 있다. 세척 후에, 상기 세포를 다양한 생체적합성 완충제, 예를 들어 무-Ca, 무-Mg PBS 중에 재현탁시킬 수 있다. 한편으로, 상기 성분채집 샘플의 바람직하지 못한 성분들을 제거하고 상기 세포를 직접 배양 배지에 재현탁시킬 수 있다.
또 다른 실시태양에서, T 세포를, 적혈구를 용해시키고 단핵세포를 고갈시킴으로써, 예를 들어 PERCOLL(상표) 구배를 통한 원심분리에 의해 말초 혈액으로부터 단리시킨다. 한편으로, T 세포를 탯줄로부터 단리할 수 있다. 어쨌든, T 세포의 특정한 하위집단을 양성 또는 음성 선택 기법에 의해 추가로 단리할 수 있다.
그렇게 단리된 제대혈 단핵세포에서 몇몇 항원, 예를 들어 비제한적으로 CD34, CD8, CD14, CD19 및 CD56을 발현하는 세포를 고갈시킬 수 있다. 상기 세포의 고갈은 단리된 항체, 항체를 포함하는 생물학적 샘플, 예를 들어 복수, 물리적 지지체에 결합된 항체, 및 세포 결합된 항체를 사용하여 수행될 수 있다.
음성 선택에 의한 T 세포 집단의 농축을 상기 음성적으로 선택된 세포 특유의 표면 마커에 대한 항체들의 조합을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직한 방법은 상기 음성적으로 선택된 세포상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단클론 항체들의 칵테일을 사용하는 유식 세포측정 또는 음성 자기 면역부착을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축시키기 위해서, 단클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다.
양성 또는 음성 선택에 의한 목적하는 세포 집단의 단리를 위해서, 세포 및 표면(예를 들어 비드와 같은 입자)의 농도를 변화시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 비드 및 세포를 함께 혼합시키는 부피를 현저하게 감소시켜(즉 세포의 농도를 증가시켜) 세포 및 비드의 최대 접촉을 보장하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서 20억 세포/㎖의 농도가 사용된다. 하나의 농도에서 10억 세포/㎖의 농도가 사용된다. 추가의 실시태양에서, 100x106 세포/㎖ 초과가 사용된다. 추가의 실시태양에서, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50x106 세포/㎖의 세포 농도가 사용된다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100x106 세포/㎖의 농도가 사용된다. 추가의 실시태양에서, 125 또는 150x106 세포/㎖의 농도가 사용될 수 있다. 고농도의 사용은 세포 수율, 세포 활성화 및 세포 증대를 증가시킬 수 있다.
T 세포를 또한 상기 세척 단계 후에 동결시킬 수 있으며, 이는 단핵세포-제거 단계를 필요로 하지 않는다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 동결 및 후속의 해동 단계는 과립구 및 어느 정도는 단핵구를 상기 세포 집단에서 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 상기 세척 단계 후에, 상기 세포를 동결 용액 중에 현탁시킬 수 있다. 다수의 동결 용액 및 매개변수들이 당해 분야에 공지되어 있으며 상기 상황에 유용할 것이지만, 비-제한적인 예에서 하나의 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 동결 매질을 수반한다. 이어서 상기 세포를 -80 ℃까지 분당 1°의 속도로 동결시키고 액체 질소 저장 탱크의 증기상 중에 보관한다. 다른 조절된 동결 방법뿐만 아니라 -20 ℃ 또는 액체 질소 중에서 즉각적인 조절되지 않은 동결을 사용할 수도 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 T 세포의 집단은 말초혈액 단핵세포, 제대혈 세포, 정제된 T 세포 집단, 및 T 세포주와 같은 세포내에 포함된다. 또 다른 실시태양에서, 말초 혈액 단핵 세포는 상기 T 세포의 집단을 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 정제된 T 세포는 상기 T 세포의 집단을 포함한다.
키메릭 막 단백질
일반적으로, T 세포를 상기에 부착된 표면과, CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 작용제 및 상기 T 세포의 표면상의 보조-자극 분자를 자극하는 리간드를 접촉시킴으로써 증대시킨다. 본 발명은 상기 T 세포를 키메릭 막 단백질을 암호화하는 RNA로 전기천공시키고 상기 전기천공된 T 세포를 배양시킴을 포함하는 상기 T 세포 집단을 증대시키는 신규의 방법을 포함하며, 여기에서 상기 집단내 전기천공된 T 세포는 적어도 10배 증대된다. 본 발명의 키메릭 막 단백질은 세포외 및 세포내 도메인을 포함한다. 상기 세포외 도메인은 표적-특이성 결합 요소, 예를 들어 항체를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 키메릭 막 단백질은 CD3에 대한 단쇄 가변 단편(scFv) 및 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 일부로부터 유래된 세포내 도메인을 포함한다.
상기 키메릭 막 단백질의 발현은 상기 집단 중의 다른 세포, 예를 들어 CD3을 발현하는 세포와의 상호작용을 허용하여 상기 전기천공된 T 세포의 증대를 자극하고 활성화시킨다. 임의의 특정한 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, CD3을 발현하는 세포를 상기 전기천공된 T 세포의 표면상에서 발현되는 키메릭 막 단백질과 접촉시키고 결합시킬 수 있다. 상기 키메릭 막 단백질을 발현하는 적어도 하나의 T 세포는 CD3을 발현하는 또 다른 세포와 상호작용한다. 이러한 상호작용은 상기 전기천공된 T 세포의 증대를 자극할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 T 세포를 내인성 유전자의 하향조절 전에 증대시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 변형된 T 세포를 증대시킨다.
세포외 도메인
본 발명은 보조-자극 분자에 대한 항체로부터 유래된 항원 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 상기 보조-자극 분자는 T 세포를 보조-자극하는 임의의 분자, 예를 들어 비제한적으로 CD3, CD28 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포외 도메인은 항-CD3, 항-CD28, 또는 이들의 조합으로부터 유래된 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 상기 세포외 도메인은 CD3에 대한 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 세포외 도메인은 비제한적으로 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단일 도메인 항체, 단쇄 가변 단편, 및 이들의 단편의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원에 결합하는 항체의 임의의 부분을 포함할 수 있다. 일부의 예에서, 상기 세포외 도메인은 상기 키메릭 막 단백질이 최종적으로 사용되는 동일한 종으로부터 유래되는 것이 이롭다. 예를 들어 인간에서의 사용을 위해, 상기 키메릭 막 단백질의 세포외 도메인은 인간 항체 또는 그의 단편을 포함하는 것이 이로울 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에서, 상기 세포외 도메인 부분은 본 명세서의 다른 어딘가에 기재된 바와 같은 인간 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 한편으로, 일부 실시태양에서, 상기 세포외 도메인 부분은 본 명세서의 다른 어딘가에 기재된 바와 같은 인간화된 비-인간 항체를 포함한다.
세포내 도메인
상기 세포내 도메인 또는 세포질 도메인은 보조-자극 신호전달 영역을 포함한다. 상기 보조-자극 신호전달 영역은 보조-자극 분자의 세포내 도메인을 지칭한다. 보조-자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그의 리간드 외의 세포 표면 분자이다.
상기 키메릭 막 단백질의 세포질 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인은 상기 T 세포의 효과기 기능 중 적어도 하나의 활성화를 담당한다. 대개는 전체 세포내 신호전달 도메인을 사용할 수 있지만, 다수의 경우 상기 전체 쇄를 사용할 필요는 없다. 상기 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분을 사용하는 한, 상기와 같은 절두된 부분은 상기가 효과기 기능 신호를 전달하는 한 완전한 쇄 대신에 사용될 수 있다. 세포내 신호전달 도메인은 상기 효과기 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절두된 부분을 포함한다.
상기 키메릭 막 단백질에 사용하기 위한 세포내 신호전달 도메인의 비제한적인 예는 CD28, 4-1BB, T 세포 수용체(TCR), 보조-자극 분자, 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변체, 동일한 기능상 능력을 갖는 임의의 합성 서열, 및 이들의 임의의 조합의 세포내 도메인의 임의의 부분을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 세포내 도메인은 CD28 및 4-1BB의 세포내 도메인의 일부를 포함한다.
키메릭 막 단백질의 다른 도메인
상기 키메릭 막 단백질의 세포외 도메인과 막관통 도메인 사이, 또는 상기 키메릭 막 단백질의 세포질 도메인과 막관통 도메인 사이에 이격자 도메인, 예를 들어 폴리펩티드 쇄 중의 세포외 도메인 또는 세포질 도메인에 막관통 도메인을 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩티드를 통합시킬 수 있다. 상기 이격자 도메인은 300 아미노산 이하, 바람직하게는 10 내지 100 아미노산 및 가장 바람직하게는 25 내지 50 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 키메릭 막 단백질은 막관통 도메인을 또한 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 키메릭 막 단백질은 힌지 도메인을 또한 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 키메릭 막 단백질을 암호화하는 RNA는 막관통 및 힌지 도메인, 예를 들어 CD28 막관통 도메인 및 CD8-알파 힌지 도메인을 또한 포함한다.
T 세포의 증대
본 명세서에 개시된 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 방법들에 의한 상기 전기천공된 T 세포의 증대는 약 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배, 2000 배, 3000 배, 4000 배, 5000 배, 6000 배, 7000 배, 8000 배, 9000 배, 10,000 배, 100,000 배, 1,000,000 배, 10,000,000 배, 또는 그 이상 및 이들 사이의 모든 전체 또는 부분 정수배까지 크게 증가될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 T 세포는 약 20배 내지 약 50배의 범위로 증대된다.
배양에 이어서, 상기 T 세포를 일정 기간 동안 또는 상기 세포가, 상기 세포를 또 다른 배양 기구로 옮기기 전에 최적의 계대 배양을 위해 융합 또는 높은 세포 밀도에 도달할 때까지 배양 기구 중의 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 상기 배양 기구는 시험관내에서 세포의 배양에 통상적으로 사용되는 임의의 배양 기구일 수 있다. 바람직하게, 융합 수준은 상기 세포를 또 다른 배양 기구로 옮기기 전에 70% 이상이다. 보다 바람직하게, 상기 융합 수준은 90% 이상이다. 배양 기간은 시험관내에서 세포의 배양에 적합한 임의의 시간일 수 있다. 상기 T 세포 매질을 상기 T 세포의 배양 기간 중 언제라도 교체할 수 있다. 바람직하게, 상기 T 세포 배지를 대략 2 내지 3일마다 교체한다. 이어서 상기 T 세포를 상기 배양 기구로부터 수확하며, 그 결과 상기 T 세포를 즉시 사용하거나 또는 나중의 사용을 위해 보관하기 위해 냉동보존할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 상기 증대된 T 세포를 냉동보존함을 포함한다. 상기 냉동보존된 T 세포를, 핵산을 상기 T 세포내에 도입시키기 전에 해동시킨다.
또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 상기 T 세포를 단리하고 상기 T 세포를 증대시킴을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 T 세포를 증대 전에 냉동보존함을 추가로 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 냉동보존된 T 세포를, 상기 키메릭 막 단백질을 암호화하는 RNA로 전기천공하기 위해 해동시킨다.
세포의 생체외 증대를 위한 또 다른 과정은 미국특허 제 5,199,942 호(본 명세서에 참고로 인용된다)에 기재되어 있다. 미국특허 제 5,199,942 호에 기재된 바와 같은 증대는 본 명세서에 기재된 다른 증대 방법들에 대한 대안이거나 추가일 수 있다. 간단히, T 세포의 생체외 배양 및 증대는 세포 성장 인자, 예를 들어 미국특허 제 5,199,942 호에 기재된 것들, 또는 다른 인자, 예를 들어 flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드의 부가를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 T 세포 증대는 상기 T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 배양 단계(본 명세서에 기재된 바와 같은 작용제와의 접촉 또는 전기천공 후)는 매우 짧을 수 있다, 예를 들어 24시간 미만, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23시간일 수 있다. 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같은 배양 단계(본 명세서에 기재된 바와 같은 작용제와의 접촉)는 보다 길 수 있다, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상일 수 있다.
다양한 용어들이 배양물 중의 세포를 기재하는데 사용된다. 세포 배양물은 일반적으로 살아있는 유기체로부터 채취하고 조절된 조건하에서 생육시킨 세포를 지칭한다. 1차 세포 배양물은 유기체로부터 직접 채취하고 1차 계대배양 전인 세포, 조직 또는 기관의 배양물이다. 세포는 상기가 세포 생육 및/또는 분열을 촉진하여 보다 큰 상기 세포의 집단을 생성시키는 조건하에서 생육 배지에 놓일 때 배양물 중에서 증대된다. 세포를 배양물 중에서 증대시킬 때, 세포 증식 속도는 전형적으로는 상기 세포의 수가 2배로 되는데 필요한 시간의 양(달리 배가시간으로서 공지됨)에 의해 측정된다.
각 계대배양의 라운드를 계대라 칭한다. 세포를 계대배양시킬 때, 이를 계대되었다라고 한다. 특정한 세포 집단 또는 세포주는 때때로 상기가 계대된 횟수로 지칭되거나 또는 상기를 특징으로 한다. 예를 들어, 10회 계대된 배양된 세포 집단을 P10 배양물이라 칭할 수 있다. 1차 배양물, 즉 조직으로부터 세포의 단리에 따른 1차 배양물은 P0으로 표시한다. 상기 1차 계대배양 다음에, 상기 세포를 2차 배양물(P1 또는 계대 1)로서 기재한다. 상기 2차 계대배양 후에, 상기 세포는 3차 배양물(P2 또는 계대 2) 등으로 된다. 당해 분야의 숙련가들은 계대 기간 동안 다수의 집단 배가가 있을 수 있음을 알 것이다; 따라서 배양물의 집단 배가 수는 계대수보다 크다. 계대 사이의 기간 동안 세포의 증대(즉 집단 배가의 수)는 다수의 인자들, 예를 들어 비제한적으로 시딩 밀도, 기질, 배지, 및 계대 사이의 시간에 따라 변한다.
하나의 실시태양에서, 상기 세포를 수시간(약 3시간) 내지 약 14일 또는 그 사이의 임의의 정수값의 시간 동안 배양할 수 있다. T 세포 배양에 적합한 조건은 증식 및 생육성에 필요한 인자들, 예를 들어 혈청(예를 들어 소태아 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-감마, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGF-베타, 및 TNF-α, 또는 숙련가에게 공지된 세포 생육을 위한 임의의 다른 첨가제를 함유할 수 있는 적합한 배지(예를 들어 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는 X-비보(vivo) 15, 론자(Lonza))를 포함한다. 상기 세포 생육을 위한 다른 첨가제는 비제한적으로 계면활성제, 플라스마네이트, 및 환원제, 예를 들어 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올을 포함한다. 배지는 아미노산, 나트륨 피루베이트, 및 비타민이 첨가되고, 무혈청이거나 또는 적합한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 한정된 호르몬 세트, 및/또는 T 세포의 생육 및 증대에 충분한 양의 사이토킨(들)이 보충된 RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-비보 15, 및 X-비보 20, 옵티마이저(Optimizer)를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어 페니실린 및 스트렙토마이신을, 피험자에게 주입해야 하는 세포의 배양물이 아닌, 실험 배양물에만 포함시킨다. 상기 표적 세포를 생육을 지지하는데 필요하는 조건, 예를 들어 적합한 온도(예를 들어 37 ℃) 및 분위기(예를 들어 공기+5% CO2)하에서 유지시킨다.
상기 T 세포를 배양하는데 필요한 배지는 상기 T 세포를 보조-자극할 수 있는 작용제를 포함할 수 있다. 예를 들어, CD3을 자극할 수 이는 작용제는 CD3에 대한 항체이고, CD28을 자극할 수 있는 작용제는 CD28에 대한 항체이다. 이는, 본 명세서에 개시된 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, 본 명세서에 개시된 방법에 의해 단리된 세포가 대략적으로 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배, 2000 배, 3000 배, 4000 배, 5000 배, 6000 배, 7000 배, 8000 배, 9000 배, 10,000 배, 100,000 배, 1,000,000 배, 10,000,000 배 이상 증대될 수 있기 때문이다. 하나의 실시태양에서, 상기 T 세포는 상기 전기천공된 집단을 배양시킴으로써 약 20 배 내지 약 50 배 이상의 범위로 증대된다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 표적 세포상의 표면 항원에 대한 친화성을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산을 증대된 T 세포내에 도입시키고, 보조-자극 분자를 암호화하는 RNA를 상기 T 세포내로 전기천공시킴을 포함하며, 여기에서 상기 전기천공된 T 세포는 상기 TCR 및 보조-자극 분자를 발현할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 상기 증대된 T 세포를 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 보조-자극 분자로 자극함을 또한 포함한다. 상기 자극은 상기 보조-자극 분자를 암호화하는 RNA에 의한 동시-전기천공을 포함할 수 있다. 상기와 같은 실시태양에서, 상기 증대된 T 세포를 CD3을 암호화하는 RNA로 추가로 전기천공시키거나 또는 동시-전기천공시킨다. 상기 CD3은 적어도 2개의 상이한 CD3 쇄, 예를 들어 CD3 제타 및 CD3 입실론쇄를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 T 세포의 증대 방법은 추가의 용도를 위해 상기 증대된 T 세포를 단리함을 또한 포함할 수 있다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 증대 방법은 상기 증대된 T 세포의 후속적인 전기천공에 이은 배양을 또한 포함한다. 상기 후속적인 전기천공은 작용제를 암호화하는 핵산을 상기 증대된 T 세포 집단에 도입시킴, 예를 들어 상기 증대된 T 세포를 형질도입시키거나, 상기 증대된 T 세포를 형질감염시키거나, 또는 상기 증대된 T 세포를 TCR을 암호화하는 핵산으로 전기천공시킴을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 작용제는 상기 T 세포를 또한 자극한다. 상기 작용제는 상기 T 세포를, 예를 들어 추가적인 증대, 효과기 기능 또는 또 다른 T 세포 기능을 자극함으로써 자극할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 작용제 핵산을 상기 키메릭 막 단백질 RNA와 동시-전기천공시킨다. 또 다른 실시태양에서, 상기 작용제 핵산, 예를 들어 TCR RNA를 상기 전기천공된 집단의 배양 후에 전기천공시킨다. 추가의 실시태양에서, 상기 작용제 핵산, 예를 들어 TCR RNA를 상기 냉동보존된, 증대된 T 세포내에 전기천공시킨다.
치료법
본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 치료용 조성물에 포함시킬 수 있다. 상기 조성물은 약학 조성물을 포함할 수 있으며 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 치료 유효량의 상기 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여할 수 있다.
하나의 태양에서, 본 발명은 피험자에게 유효량의 변형된 T 세포를 투여함을 포함하는 상기 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 자극하는 방법을 포함한다. 상기 실시태양에서, 상기 T 세포를 본 명세서의 다른 어딘가에 기재된 바와 같이 변형시킨다. 상기 변형된 T 세포를 투여하여 상기 표적 세포 또는 조직의 용해를 유도할 수 있으며, 이때 상기 유도된 용해는 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)이다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 유효량의 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하는, 상기 입양 세포 전달 요법 치료 방법을 포함한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 증진된 면역과 관련된 질병 또는 병증의 치료가 필요한 피험자에게 유효량의 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는 상기 피험자의 치료 방법을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 변형된 T 세포는 균일할 수 있으며 T 세포 기능을 갖는다. 더욱이, 상기 변형된 T 세포를 동물, 바람직하게는 포유동물, 훨씬 더 바람직하게는 인간에게 투여하여 면역 반응, 예를 들어 자가면역 질병, 예를 들어 당뇨병, 건선, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, GVHD, 증대성 동종이식편 내성 유도, 이식편 거부 등을 억제할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포를, 감소되거나 또는 달리 억제된 면역 반응, 특히 세포-매개된 면역 반응이 질병의 치료 또는 경감에 바람직할 수 있는 임의의 병증의 치료에 사용할 수 있다. 하나의 태양에서, 본 발명은 피험자에게 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 자가면역 질병과 같은 병증을 치료함을 포함한다.
자가면역 질병의 예는 비제한적으로 후천성 면역결핍 증후군(AIDS, 이는 자가면역 성분을 갖는 바이러스성 질병이다), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 및 베게너 육아종증을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이 생성된 T 세포를 또한 염증 질환의 치료를 위해 변형시켜 사용할 수 있다. 염증 질환의 예는 비제한적으로 만성 및 급성 염증 질환을 포함한다. 염증 질환의 예는 알쯔하이머병, 천식, 아토피성 알러지, 알러지, 죽상동맥경화증, 기관지 천식, 습진, 사구체신염, 이식편 대 숙주병, 용혈성 빈혈, 골관절염, 패혈증, 뇌졸중, 조직 및 기관 이식, 혈관염, 당뇨성 망막병증 및 인공호흡기 유발된 폐 손상을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 상기 면역 반응의 치료를 위한 약제의 제조에 사용할 수 있다.
본 발명의 세포를 적합한 전-임상 및 임상 실험 및 시험에서 측정하고자 하는 투여량 및 경로 및 시간에 투여할 수 있다. 세포 조성물을 이들 범위내의 투여량으로 수회 투여할 수 있다. 본 발명의 세포의 투여를 당해 분야의 숙련가들에 의해 결정되는 바와 같은 목적하는 질병 또는 병증의 치료에 유용한 다른 방법들과 병행할 수 있다.
투여하고자 하는 본 발명의 세포는 치료 중인 피험자에 대해서 자기유래, 동종이계 또는 이종발생성일 수 있다.
본 발명의 세포의 투여를 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 통상적인 방식으로 수행할 수 있다. 본 발명의 세포를 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 주입 및 이식에 의해 피험자에게 투여할 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물을 환자에게 경동맥, 피하, 피내, 종양내, 결절내, 척수내, 근육내, 정맥(i.v.) 주사에 의해 또는 복강내로 투여할 수 있다. 다른 경우에, 본 발명의 세포를 상기 피험자의 염증 부위, 상기 피험자의 국소 질병 부위, 림프절, 기관, 종양 등에 직접 주사한다.
본 명세서에 기재된 세포를 또한 임의의 수의 매트릭스를 사용하여 투여할 수 있다. 본 발명은 전형적으로 T 세포의 조절을 통해, 면역계를 지지하거나, 유지하거나 조절하기 위해 인공 림프 기관으로서 작용하는 새로운 환경내에서 상기와 같은 매트릭스를 사용한다. 상응하게, 본 발명은 조직 공학에 유용성이 입증된 상기 매트릭스 조성물 및 제형을 사용할 수 있다. 상응하게, 본 발명의 조성물, 장치 및 방법에 사용될 수 있는 매트릭스의 유형은 실질적으로 제한이 없으며 생물학적 및 합성 매트릭스를 모두 포함할 수 있다. 하나의 특정한 예에서, 미국특허 제 5,980,889 호; 미국특허 제 5,913,998 호; 미국특허 제 5,902,745 호; 미국특허 제 5,843,069 호; 미국특허 제 5,787,900 호; 또는 미국특허 제 5,626,561 호(이들 특허는 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다)에 제시된 조성물 및 장치가 사용된다. 매트릭스는 포유동물 숙주에 투여시 생체적합성임과 통상적으로 관련되는 특징들을 포함한다. 매트릭스는 천연 및/또는 합성 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 매트릭스는 동물의 체내에서 영구적인 구조물 또는 제거 가능한 구조물을 남기는 것이 바람직한 경우에 비-생분해성, 예를 들어 임플란트; 또는 생분해성일 수 있다. 상기 매트릭스는 스펀지, 임플란트, 튜브, 텔파 패드, 섬유, 중공 섬유, 동결건조된 성분, 젤, 분말, 다공성 조성물 또는 나노입자의 형태를 취할 수 있다. 또한, 매트릭스를 시딩된 세포 또는 생성된 사이토킨 또는 다른 활성 작용제의 지속적인 방출을 허용하도록 설계할 수도 있다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 매트릭스는 가요성이고 탄성이며, 무기염, 수성 유체 및 산소를 포함한 용해된 기체상 작용제와 같은 물질에 투과성인 반고체 스캐폴드로서 기재될 수 있다.
매트릭스를 본 명세서에서는 생체적합성 물질의 일례로서 사용한다. 그러나, 본 발명은 매트릭스로 제한되지 않으며, 따라서 매트릭스 또는 매트릭스들이란 용어가 존재하는 어디에서나 이들 용어를, 세포 유지 또는 세포 순회를 허용하고, 생체적합성이며, 자체가 반-투과성이거나 또는 특정한 반-투과성 물질과 함께 사용되는 물질을 통해서 직접 거대분자의 순회를 허용할 수 있는 다른 물질 및 장치를 포함하는 것으로 판독해야 한다.
약학 조성물
본 발명의 약학 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 T 세포를 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함할 수 있다. 상기와 같은 조성물은 완충제, 예를 들어 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 슈크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들어 글리신; 산화방지제; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA 또는 글루타치온; 항원보강제(예를 들어 수산화 알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물을 바람직하게는 정맥내 투여용으로 제형화한다.
본 발명의 약학 조성물을 치료하고자 하는(또는 예방하고자 하는) 질병에 적합한 방식으로 투여할 수 있다. 상기 투여량 및 투여 빈도는 환자의 조건, 및 환자의 질병의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이지만, 적합한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수도 있다.
"면역학적 유효량", "면역-억제 반응 유효량", "면역 반응-억제 유효량" 또는 "치료량"이 지시되는 경우, 본 발명의 조성물의 정확한 투여량을 환자(피험자)의 연령, 체중, 면역 반응, 및 조건의 개별적인 차이를 고려하여 의사가 결정할 수 있다. 일반적으로 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 104 내지 109 세포/㎏ 체중, 바람직하게는 105 내지 106 세포/㎏ 체중(이들 범위내의 모든 정수 값 포함)의 투여량으로 투여할 수 있는 것으로 서술될 수 있다. T 세포 조성물을 또한 상기 투여량에서 수회 투여할 수 있다. 상기 세포를 면역요법에 통상적으로 공지된 주입 기법을 사용하여 투여할 수 있다(예를 들어 문헌[Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988]을 참조하시오). 특정 환자에 최적인 투여량 및 치료 섭생을, 상기 환자를 질병의 징후에 대해 모니터하고 치료를 상응하게 조절함으로써 의학 분야의 숙련가에 의해 쉽게 결정할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 활성화된 T 세포를 피험자에게 투여하고 이어서 후속으로 혈액을 다시채혈하고(또는 성분채집술을 수행하고), 본 발명에 따라 상기로부터 T 세포를 활성화시키고, 상기 환자에게 상기 활성화되고 증대된 T 세포를 재주입하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 과정을 수주마다 수회 수행할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, T 세포를 10 ㎖ 내지 400 ㎖의 채혈된 혈액으로부터 활성화시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, T 세포를 20 ㎖, 30 ㎖, 40 ㎖, 50 ㎖, 60 ㎖, 70 ㎖, 80 ㎖, 90 ㎖ 또는 100 ㎖의 채혈된 혈액으로부터 활성화시킨다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 수회의 채혈/수회의 재주입 프로토콜을 사용하여 T 세포의 일정한 집단을 선택할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시태양에서, 본 명세서에 기재된 방법 또는 T 세포를 치료 수준으로 증대시키는 당해 분야에 공지된 다른 방법들을 사용하여 증대되고 변형된 세포를 환자에게 임의의 수의 관련 치료 양상, 예를 들어 비제한적으로 항바이러스 요법, 시도포비어 및 인터류킨-2, 시타라빈(또한 ARA-C로서 공지됨)과 같은 작용제에 의한 치료 또는 MS 환자용 나탈리주맵 치료 또는 건선 환자용 에팔리주맵 치료 또는 PML 환자용 다른 치료와 함께(예를 들어 상기 치료 전, 상기 치료와 동시에, 또는 상기 치료에 이어서) 투여한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명의 T 세포를 화학요법, 방사선, 면역억제제, 예를 들어 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트 및 FK506, 항체, 또는 다른 면역제거제, 예를 들어 CAM PATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다리빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토킨, 및 조사와 함께 사용할 수 있다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시뉴린(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장 인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제(라파마이신)를 억제한다. (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). 추가의 실시태양에서, 본 발명의 세포 조성물을 환자에게 골수 이식, 화학요법제, 예를 들어 플루다라빈, 외부-광선 조사 요법(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 항체, 예를 들어 OKT3 또는 CAMPATH를 사용하는 T 세포 제거 요법과 함께(예를 들어 상기 전에, 상기와 동시에 또는 상기에 이어서) 투여한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 세포 조성물을 B-세포 제거 요법, 예를 들어 CD20과 반응하는 작용제, 예를 들어 리툭산에 이어서 투여한다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 피험자는 고용량 화학요법에 의한 표준 치료에 이어서, 말초 혈액 줄기세포 이식을 겪을 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 이식에 이어서, 피험자는 본 발명의 증진된 면역 세포의 주입을 받는다. 추가의 실시태양에서, 증대된 세포를 수술 전 또는 수술에 이어서 투여한다.
환자에게 투여하고자 하는 상기 치료의 투여량은 치료되는 병증의 정확한 성질 및 치료 수용자에 따라 변할 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 크기조정을 당해 분야-승인된 실행에 따라 수행할 수 있다. 예를 들어 CAMPATH에 대한 용량은 일반적으로 성인 환자의 경우 1 내지 약 100 ㎎의 범위로, 대개는 1 내지 30일의 기간 동안 매일 투여될 것이다. 바람직한 1일 용량은 하루에 1 내지 10 ㎎이나, 일부의 경우 하루에 40 ㎎ 이하의 보다 큰 용량이 사용될 수도 있다(미국특허 제 6,120,766 호에 기재됨).
본 발명에 유용할 수 있는 방법 및 조성물은 실시예들에 제시된 특정한 제형들로 제한되지 않음은 물론이다. 하기의 실시예들을, 본 발명의 세포, 증대 및 배양 방법 및 치료 방법의 제조 및 사용에 대한 완전한 개시 및 기재와 함께 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 제공하기 위해 제시하며, 이는 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 범위를 제한하고자 하지 않는다.
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법들을 사용하며, 이들은 충분히 숙련가의 이해 범위내에 있다. 상기와 같은 기법들은 예를 들어 하기 문헌에 충분히 설명되어 있다: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", fourth edition (Sambrook, 2012); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Culture of Animal Cells" (Freshney, 2010); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1997); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Short Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 2002); "Polymerase Chain Reaction: Principles, Applications and Troubleshooting", (Babar, 2011); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 2002). 이들 기법을 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 생성에 적용할 수 있으며, 그 자체가 본 발명의 수행 및 실시에 고려될 수 있다. 특정한 실시태양들에 특히 유용한 기법들은 하기 섹션에서 논의될 것이다.
실험 실시예
본 발명을 하기의 실험 실시예를 참조하여 상세히 추가로 기재한다. 이들 실시예는 단지 예시를 목적으로 제공되며 달리 명시되지 않는 한 제한을 의도하지 않는다. 따라서, 본 발명을 결코 하기의 실시예들로 제한되는 것으로서 해석해서는 안 되며, 오히려 여기에 제공된 교시의 결과로서 자명해지는 모든 변화들을 포함하는 것으로 해석해야 한다.
추가의 기재 없이, 당해 분야의 통상적인 숙련가는 선행 기재 및 하기의 예시적인 실시예들을 사용하여 본 발명의 화합물을 제조 및 사용하고 특허청구된 방법을 실시할 수 있을 것으로 여긴다. 따라서 하기의 실행 실시예는 본 발명의 바람직한 실시태양들을 구체적으로 지적하며 나머지 개시를 어떠한 제한으로서도 해석하지 않는다.
이제 상기 실험에 사용되는 물질 및 방법을 기재한다.
1차 인간 림프구.
1차 림프구를 기재된 바와 같이(Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586) CD3 및 CD28 자극 항체(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재, 카탈로그)로 코팅된 마이크로비드로 자극하였다. T 세포를 10일째에 90% 송아지 태아 혈청 및 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)의 용액 중에서 1 x 108 세포/바이알로 냉동보존하였다.
NALM-6을 독일 DSMZ 셀 콜렉션(DSMZ 카탈로그 코드: ACC 128)으로부터 구입하였다. K562 및 PC3을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션으로부터 구입하였다. 624mel 흑색종 세포주를 서저리 브랜치(Surgery Branch)(NCI/NIH)로부터 수득하였다. 상기 모든 세포주들을 지시된 대로 배양하고 마이코플라스마 오염에 대해 통상적으로 시험하고 음성인 것으로 확인하였다.
mRNA 전기천공 및 렌티바이러스 형질도입을 위한 TCR 구조물의 생성.
상이한 돌연변이들(1G4 및 8F) 및 CAR(PSCA 또는 CD19)을 갖는 1G4 NY-ESO-1 TCR을 관련 간행물(The Journal of experimental medicine 2005, 201(8):1243-1255; J Immunol 2008, 180(9):6116-6131)에 의해 제공된 서열분석 정보를 근거로 합성하고/하거나, PCR에 의해 증폭시키고, pGEM.64A RNA 기재 벡터 또는 pTRPE 렌티바이러스 벡터내에 서브클로닝하였다.
인간 1차 T 세포 제조.
1차 인간 CD4 및 CD8 T 세포를 RosetteSep 키트(스템 셀 테크놀로지스(Stem Cell Technologies), 캐나다 BC 밴쿠버 소재)를 사용하여 음성 선택에 의해 백혈구성분채집술에 따라 건강한 자원 공여자로부터 단리하였다. 모든 시편을 대학 임상연구심의위원회-승인 프로토콜하에서 채취하고, 각 공여자로부터 서면 동의를 얻었다.
CRISPR의 설계 및 구성.
Cas9 DNA를 PCR에 의해 합성하고 이어서 PGEM 벡터에 삽입하였다. gRNA를 NGG PAM 부위를 갖는 GN19에 의해 선택하였으며, 일부는 NGG PAM 부위를 갖는 N20으로부터 선택되었다. 모든 gRNA는 13개 초과의 잘못된 염기쌍으로 구성된 상보성 서열을 함유하였으며, 잠재적인 표적-외 mRNA 부위는 제외하였다(표 1). GRNA를 도 1A에 나타낸 바와 같이 설계하였으며, 중첩 PCR에 의해 합성하였다. 모든 gRNA PCR 산물들을 MSGV 벡터내에 결찰하였다. 시험관내 전사된 CAS9 및 gRNA는 TCR α,β 쇄 및 베타-2 마이크로글로빈의 불변 영역을 표적화하였다. gRNA는 상기 TCR α 불변 영역의 엑손 1내의 서열, TCR β 불변 영역 1 및 2 모두의 엑손 1에 공통적인 공통 서열, 베타-2 마이크로글로불린 또는 PD1을 표적화하도록 설계되었다. 상기 gRNA를 암호화하는 서열들을 중첩 PCR을 사용하여 조립하고 T7 프로모터를 함유하는 MSGV 벡터내에 클로닝하였다. 상기 플라스미드를 EcoRI로 선형화하였다. gRNA를 시험관내 전사시켰다. Cas9 mRNA를 mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA 키트(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 시험관내 전사시켰다. 상기 mRNA를 1회용 무-뉴클레아제 바이알에서 -80 ℃에서 보관하였다. 동물 연구에 사용된 gRNA 표적화 서열은 하기와 같았다:
TRAC-gRNA: TGTGCTAGACATGAGGTCTA, 서열번호 1
TRBC-gRNA: GCAGTATCTGGAGTCATTGA, 서열번호 2
B2M-gRNA: CGCGAGCACAGCTAAGGCCA, 서열번호 3
PD1-gRNA: GGCGCCCTGGCCAGTCGTCT, 서열번호 4
FAS-gRNA: GAGGGTCCAGATGCCCAGCA, 서열번호 5
유식 세포측정.
하기의 단클론 항체 및 시약들을 지시된 특이성 및 적합한 아이소타입 대조군과 함께 사용하였다. BD 바이오사이언시즈(Biosciences) (미국 캘리포니아주 산호세 소재)로부터: APC-접합된 항-CD3 (555335), FITC-항-CD8(555366), PE-항-CD8(555635), FITC-항-CD27 (555440), PE-항-CD107(555801), PE-항-베타-2 마이크로글로빈 (551337), FITC-항-HLA(555552); 바이오레전드(Biolegend) (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재): FITC-항-CD45RO(304204), APC-항-CD62L(304814), APC-항-CCR7(353214); 및 벡크만 쿨터(Beckman Coulter) (미국 캘리포니아주 패서디나 소재): PE-항-Vb13.1(IM2021U). 데이터를 셀퀘스트(CellQuest) 버전 3.3 (BD 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산호세 소재)을 사용하여 FACS 애큐리(Accuri) (BD 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 산호세 소재)상에서 수득하고 FCS 발현 버전 3.00 (드 노보 소프트웨어(De Novo Software), 미국 캘리포니아주 로스앤젤레스 소재) 또는 플로우조(FlowJo) 버전 7.6.1 (트리스타 인코포레이티드(Tree Star, Inc.), 미국 오리건주 애쉬랜드 소재)에 의해 분석하였다.
1차 T 세포의 번식.
1차 인간 T 세포를 10% FCS, 100-U/㎖ 페니실린, 100-g/㎖ 스트렙토마이신 설페이트, 10-mM Hepes가 보충된 RPMI 1640에서 배양하고, 1:3 세포 대 비드 비로 항-CD3/항-CD28로 코팅된 자기 비드로 자극하였다. 세포를 카운트하고 2일마다 먹이를 공급하였으며, 감소된 성장 동역학 및 세포 크기에 의해 측정된 바와 같이, 일단 T 세포가 휴지된 것으로 보이면, 상기 T 세포를 기능 분석에 사용하거나 냉동보존하였다.
CD3neg T 세포의 생성.
DNA 초나선 플라스미드를 각각 SpeI 및 EcoRI에 의해 선형화였다. gRNA를 T7 mScript(상표) 표준 mRNA 생성 시스템(캠바이오(Cambio), C-MSC100625, 영국 캠브리지 소재)에 의해 시험관내 전사시켰다. 모든 mRNA(Cas9, TCR α, TCR β 및 CAR)를 mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA 키트(라이프 테크놀로지스, AM1345, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 시험관내 전사시켰다. T 세포를 전기천공 전에 3일 동안 CD3/CD28 다이나비드에 의해 자극하였다. 10x106개의 1차 T 세포를 BTX830에 의해 360V, 1 ms 매개변수로 20 ㎍ Cas9, 10 ㎍ gRNA 종을 전기-전달하기에 앞서 비드-제거한 다음 10 ㎍ gRNA의 제2 및/또는 제3 전기-전달을 수행하였다. 또한, T 세포를 OPTI-MEM으로 3회 세척하고 1-3x108 세포/㎖의 최종 농도로 OPTI-MEM(인비트로젠)에 재-현탁하였다. 후속으로, 0.1 ㎖의 상기 세포를 10 ㎍의 IVT RNA(또는 지시된 대로)와 혼합하고 2 ㎜ 큐벳에서 전기천공시켰다. 10x106개의 1차 T 세포를 BTX830(하바드 어패러투스 BTX)을 사용하여 360V 및 1 ms에서 20 ㎍ Cas9 및 10 ㎍ gRNA 종을 세포내로 전기-전달하기에 앞서 비드-제거하였으며; 상기 과정에 이어서 5 ㎍ gRNA의 제2 및/또는 제3 전기-전달을 12 내지 24시간 후에 수행하였다.
전기천공에 이어서, 세포를 바로 2 ㎖의 예온된 배양 배지에 넣고 1일 동안 37 ℃, 5% CO2 또는 32 ℃, 5% CO2에서 배양하고 이어서 37 ℃, 5% CO2로 복귀시켰다.
TCR α 및 β 이중 붕괴 또는 TRAC, TRBC 및 B2M 삼중 붕괴.
TCR α 및 β 이중-녹아웃 T 세포를 생성시키기 위해서, Cas9 mRNA를, TCR α 쇄(TRAC) 및 TCR β 쇄(TRBC)를 표적화하는 2개의 상이한 gRNA로 동시-전기천공시켰다. 상기 TCR α 및 β 이중-녹아웃 T 세포를 2 단계로 정제할 수 있었다: 1) TCR-양성 및 α 쇄 단일-녹아웃 세포를 상기 1G4 TCR α 쇄 RNA의 전기천공 후에 항-CD3 마이크로비드로 고갈시키고, 2) TCR-β 쇄 단일-녹아웃 세포를 상기 TCR β 쇄 RNA의 전기천공 후에 항-CD3 마이크로비드로 고갈시켰다. TRAC, TRBC 및 B2M 삼중 붕괴를 위해서, T 세포를 항-CD3/CD28 비드 자극 후 3일째에 상기 TCR α 및 β 쇄 및 베타-2 마이크로글로불린을 표적화하는 gRNA 및 Cas9 mRNA로 전기천공시켰다. HLA-I-음성 세포 집단을 9일째에 농축시키고 TCR α 쇄 RNA로 전기천공시켰다. 상기 TCR-음성 집단을 10일째에 농축시켰다. 5일 후에, 상기 세포를 TCR β 쇄 RNA로 전기천공시키고, 상기 TCR-음성 세포 집단을 다음날 분류하여 보편적인 T 세포를 수득하였다. 18일째에, TCR 또는 CAR RNA를 상기 보편적인 T 세포내에 전기천공시켜 보편적인 효과기 세포를 생성시켰다. TCR 및 HLA-I 분자 발현을 각 단계에서 확인하였다.
보편적인 CART 세포의 생성.
보편적인 CART 세포를, CD19 또는 PSCA CAR의 렌티바이러스 형질도입과 CRISPR/gRNA의 RNA 전기천공의 병행에 의해 생성시켰다. 항-CD3/CD28 비드 자극 1일 후에, T 세포를 렌티바이러스-CD19 또는 PSCA CAR로 형질도입시켰다. 2일 후에, Cas9 및 TCR α, β 쇄, B2M, PD1을 표적화하는 gRNA를 전기천공에 의해 T 세포로 옮겼다. CRISPR 전달 후 6일째에, CD3, HLA-I, PD1에 대해 음성인 T 세포를 마이크로비드 고갈에 의해 분류하였다.
CD3neg T 세포의 농축.
자동 MACS 완충제로 세척한 세포를 4 ℃에서 30분 동안 CD3 마이크로비드(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec), 130-050-101, 미국 캘리포니아주 오번 소재)와 함께 배양하였다. 2회 세척 후에, 세포를 LD 컬럼(밀테니바이오텍, 130-042-901, 미국 캘리포니아주 오번 소재)에 통과시키고, 통과 분액을 추후의 사용을 위해 수집하였다. CD3neg T 세포의 CD3 발현을 1G4TCR α 및 β mRNA의 동시-전기천공에 의해 복원시키고, 상기 세포를 단일 고속 증대 프로토콜(REP), CD3/CD28 다이나비드 또는 K562-기재 aAPC를 사용하여 증대시켰다.
CD3neg T 세포의 생성 및 번식.
CD3neg T 세포는 외인성 1G4TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄 시험관내 전사된 mRNA(각 쇄에 대해 5 ㎍)의 전기-전달에 의해 복원된 CD3 발현을 가졌다. 상기 세포를 단일 고속 증대 프로토콜(REP)에 의해 증대시켰다. 3명의 상이한 공여자로부터의 PBMC: ND052 105x106, ND405 83x106, ND410 136x106을 조사하고, 이어서 함께 혼합하여 총 324x106 PBMC를 수득하였다. 상기 PBMC를 90 ㎖의 최종 부피로 재-현탁시키고, 이어서 R10을 300 ㎖로 가하고, 혼합하고 2개의 T150 ㎖ 플라스크에 나누었다. OKT를 30 ng/㎖의 최종 농도로 가하였다. 2일째에, IL-2를 50 CU/㎖로 가하였다. 5일째로부터, 세포를 카운트하고 2일마다 먹이를 공급하였으며, 감소된 성장 동역학 및 세포 크기에 의해 측정된 바와 같이, 일단 T 세포가 휴지된 것으로 보이면, 상기 세포를 기능 분석에 사용하거나 냉동보존하였다.
상거 서열분석.
T 세포 중의 TCR α 쇄(TRAC), TCR β 쇄 1(TRBC1) 및 TCR β 쇄 2(TRBC2)의 게놈 붕괴 수준을 서베이어(Surveyor) 뉴클레아제 분석(트랜스게노믹스(Transgenomics), 미국 네브래스카주 오마하 소재)에 의해 측정하였다. 표적 붕괴 퍼센트를 밀도측정에 의해 정량분석하였다. 표적 유전자좌의 증폭에 사용되는 PCR 프라이머들은 하기와 같았다:
TRAC 순방향, 5'-TCATGTCCTAACCCTGATCCTCTT-3' 서열번호 6
TRAC 역방향, 5'-TTGGACTTTTCCCAGCTGACAGA-3' 서열번호 7
TRBC 전체 순방향, 5'- TACCAGGACCAGACAGCTCTTAGA-3' 서열번호 8
TRBC 전체 역방향, 5'- TCTCACCTAATCTCCTCCAGGCAT-3' 서열번호 9
PCR 산물을 정제하여 TOPO 클로닝 벡터(인비트로젠)에 결찰시키고, 이어서 이 콜라이에 형질전환시켰다. 단일 클론을 채취하고 서열분석하여 삽입-결실을 계산하였다.
전기천공을 위한 siRNA 및 CRISPRi의 생성.
알파 (5'-rArGrGrArGrGrArUrUrCrGrGrArArCrCrCrArArUrCrArCrUrGrArC-3' 서열번호 10 및 5'-rCrArGrUrGrArUrUrGrGrGrUrUrCrCrGrArArUrCrCrUrCCT-3' 서열번호 11) 또는 베타 (5'-rArCrCrUrCrCrUrUrCrCrCrArUrUrCrArCrCrCrArCrCrArGrCrUrC-3' 서열번호 12 및 5'-rGrCrUrGrGrUrGrGrGrUrGrArArUrGrGrGrArArGrGrArGGT-3' 서열번호 13)의 TCR 불변 영역을 표적화하는 RNA 듀플렉스를 커스텀(Custom) RNAi 설계 툴(인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies), 미국 아이오와주 코럴빌 소재)을 사용하여 설계하고 siRNA를 합성하였다(인티그레이티드 DNA 테크놀로지스, 미국 아이오와주 코럴빌 소재). 상기 TCR 알파 및 베타 모두에 대한 siRNA를 혼합하고 내인성 TCR 녹다운을 위해 자극된 T 세포내로 전기천공시켰다.
mRNA 시험관내 전사 및 T 세포 전기천공.
T7 mscript 시스템 키트(셀스크립트(CellScript))를 사용하여 시험관내 전사된(IVT) RNA를 생성시켰다. CD3/CD28 비드 자극된 T 세포를 앞서 기재된 바와 같이(Cancer research 2010, 70(22):9053-9061) BTX EM830(하바드 어패러투스(Harvard Apparatus) BTX)을 사용하여 IVT RNA로 전기천공시켰다. 간단히, T 세포를 3회 세척하고 OPTI-MEM(인비트로젠(Invitrogen))에 1-3x108 세포/㎖의 최종 농도로 재현탁시켰다. 후속으로, 0.1 ㎖의 세포를 10 ug IVT RNA(또는 지시된 대로)와 혼합하고 2 ㎜ 큐벳에서 전기천공시켰다.
ELISA 분석.
CD19를 발현하는 상이한 종양 세포주들인 표적 세포들을 세척하고 R10 배지(10% 송아지 태아 혈청이 보충된 RPMI 1640; 인비트로젠)에 1x106 세포/㎖로 현탁시켰다. 100 ul의 각 표적 세포 유형을 96 웰 환저 플레이트(코닝(Corning))에 중복해서 가하였다. 효과기 T 세포를 세척하고, R10 배지에 1x106 세포/㎖로 재현탁시키고, 이어서 100 ul의 T 세포를 상기 지시된 웰에서 상기 표적 세포와 합하였다. 또한, T 세포만을 함유하는 웰을 대조군으로서 제조하였다. 상기 플레이트들을 37 ℃에서 18 내지 20시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후에, 상등액을 수확하고 ELISA 분석을 수행하였다(eBioscience).
CD107a 염색
세포를 96 웰 플레이트 중의 160 ㎕의 완전 RPMI 배지에 1:1의 효과기 세포:T 세포 비(1x105 효과기 대 1x105 표적)로 도말하였다. 20 ㎕의 피코에리쓰린-표지된 항-CD107a 항체(BD 바이오사이언시즈(Biosciences), 555801)를 가하고 상기 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 배양한 후에 골지 스탑(Golgi Stop)(3 ㎖ RPMI 배지 중의 2 ul 골지 스탑, 20 ul/웰; BD 바이오사이언시즈, 51-2092KZ)을 가하고 상기 플레이트를 추가로 2.5시간 동안 배양하였다. 이어서 5 ㎕ FITC-항-CD8 및 5 ul APC-항-CD3을 가하고 37 ℃에서 30분 동안 배양하였다. 배양 후에, 상기 샘플을 FACS 완충제로 세척하고 유식 세포측정에 의해 분석하였다.
루시페라제 기재 CTL 분석.
Naml6-CBG 종양 세포를 생성시키고 루시페라제 기재 세포독성 T 림프구 분석의 변형된 버전에 사용하였다. 간단히, 녹색 방아벌레 루시페라제(CBG)를 pELNS 벡터에 클로닝시키고, 렌티바이러스내에 패키지하고, Naml6 종양 세포에 형질도입시키고 CBG 발현에 대해서 분류하였다. 생성되는 Naml6-CBG 세포를 세척하고 R10 배지에 1x105 세포/㎖로 재현탁시키고, 100 ul의 CBG-표지된 세포를 37 ℃에서 밤새 상이한 비의 T 세포(예를 들어 30:1, 15:1 등)와 배양하였다. 100 ul의 상기 혼합물을 96 웰 백색 광도계 플레이트로 옮겼다. 100 ul의 기질을 상기 세포에 가하고 발광을 즉시 측정하였다. 상기 결과를, 종양 세포를 갖는(그러나 T 세포는 없는) 웰 중의 루시페라제 활성에 근거한 살해 퍼센트(% 살해 = 100 - ((효과기 및 표적 세포 공배양물이 있는 웰로부터의 RLU)/(표적 세포가 있는 웰로부터의 RLU) x 100))로서 보고한다.
마우스 이종이식 연구
연구를 몇몇 변형과 함께 앞서 개시된 바와 같이 수행하였다(Human gene therapy 2011, 22(12):1575-1586; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009, 106(9):3360-3365). 간단히, 6 내지 10주된 NOD/SCID 감마(NSG) 마우스에, 0일째에 우측 옆구리에 1x106 PC3-CBG 종양 세포를 피하 주사하고 같은 마우스에, 5일째에 좌측 옆구리에 SK-OV3-CBG 종양 세포(5x106 세포/마우스, 피하)를 제공하였다. 상기 마우스를 PC3-CBG 종양 접종 후 23일째에 꼬리 정맥을 통해 T 세포로 처리하였으며, 따라서 상기 두 종양은 부피가 대략 200 ㎣이었다. 렌티바이러스에 의해 형질도입된 T 세포를 1x107 세포/마우스(10M) 또는 3x106 세포/마우스(3M)로 제공하였다. 간단히, Nalm6 종양 모델을 위해서, 6- 내지 10-주된 NOD/SCID 감마(NSG) 마우스에게 0일째에 꼬리 정맥을 통해 1x106 녹색 방아벌레(CBG) 형질도입된 Nalm6(Nalm6-CBG) 세포를 주사하였다. 상기 T 세포 처리를 종양 접종 후 7일째에 시작하였다. PC3-PDL1 고형 종양 모델을 위해서, 6- 내지 10-주된 NOD/SCID 감마(NSG) 마우스에게 0일째에 우측 옆구리에서 1x106 PSCA, PD-L1 및 CBG 형질도입된 PC3(PC3-PSCA-PDL1-CBG) 종양 세포를 피하 주사하였다. 상기 마우스를 PC3-PDL1-CBG 종양 접종 후 22일째에 꼬리 정맥을 통해 T 세포로 처리하였으며, 따라서 종양 부피가 대략 200 ㎣이었다. T 세포를 2x106 세포/마우스(2M)로 제공하였다. 동물들을 기준선 종양 크기를 기준으로 무작위 분류하였다. 모든 동물을 실험에 포함시켰으며 맹검 종양 평가를 상기 수행된 모든 동물 실험에 수행하였다.
T 세포 자극, 렌티바이러스 형질도입 및 CRISPR 전기천공 과정.
도 84는 T 세포의 자극, 렌티바이러스 형질도입 및 CRISPR 전기천공에 사용되는 과정을 나타낸다. 0일째에, T 세포를 3명의 공여자로부터 수득하였다(100x106 세포/공여자). 상기 세포를 1:3의 T 세포:비드 비로 항-CD3/항-CD28 비드로 자극하였다. 상기 세포의 농도를 100 ㎖/플라스크로 0.5x106/㎖로 조절하였다. 1일째에, 자극된 T 세포를 CD19 CAR 렌티바이러스로 2의 감염배수(MOI)로 형질도입시켰다. 50 ㎖(25x106 세포)의 T 세포를 변형되지 않은 T 세포(그룹 9)로서 확보하였다. 3일째에, 상기 비드를 제거하고, 상기 세포를 Opti-MEM 배지에서 2x 세척하고, 각각의 공여자로부터의 형질도입된 T 세포를 2개의 그룹, CART/mock EP(10 ㎖, 50x106/㎖) 및 CART/CRISPR(10 ㎖, 50x106/㎖)으로 분리하였다. 이어서 상기 세포를 CAS9 RNA(1차 EP)로, 500V/1ms에서 120 ㎍의 CAS9 RNA/400 ㎕의 T 세포로 전기천공시켰다. 전기천공 후, 그룹 1, 3, 5 및 7을, 절반은 새로운 배지 및 절반은 배양된 배지 중에서 T 세포를 배양시킴으로써 분할하였다. 4일째에, 상기 세포를 2회 세척하고 Opti-MEM 중에 50x106/㎖로 재현탁시켰다. 20 ㎍ TRBC4 및 B2M gRNA를 400 ㎕의 T 세포내에 전기천공시켰다. 전기천공 후, 상기 세포를, 절반은 신선한 배지 및 절반은 배양된 배지 중에서 1x106 세포/㎖로 배양하였다. 5일 및 7일째에, 상기 세포를 분할하고 절반은 신선한 배지 및 절반은 배양된 배지 중에 재현탁시켰다. 8일째에, CD3+ 세포를 저밀도 컬럼을 통해 그룹 2, 4 및 6으로부터 제거하였다. 상기 CD3-T 세포를 절반은 신선한 배지 및 절반은 배양된 배지 중에 0.5-1x106 세포/㎖로 재현탁시키고 배양하여 증대시켰다. 11일째에, 상기 T 세포를 수확하고 상기 3명의 공여자로부터의 25x105 세포를 염색체분석을 위해 발송하였다. 남은 세포를 분액하고 동결시켰다.
이제 실험 결과를 기재한다.
실시예 1: CRISPR을 사용하는 T 세포상의 TCR-CD3 복합체의 붕괴.
TCR α 쇄의 불변 영역을 표적화하는 13개의 gRNA, TCR β 쇄의 불변 영역을 암호화하는 10개의 gRNA, 및 베타-2 마이크로글로빈 유전자를 표적화하는 10개의 RNA(도 1A-1C 및 도 9A-9D)를 개발하고 293T 세포에서 시험하였다. 1차 인간 T 세포를 3일동안 항-CD3/CD28 다이나비드로 생체외에서 번식시켰다. CRISPR의 일시 발현이면 유전자 녹아웃을 매개하기에 충분하기 때문에, CAS9 및 gRNA를 암호화하는 시험관내 전사된 RNA의 전기-전달을 사용함으로써 CRISPR을 일시적으로 발현시키는 "치고 달리기" 전달 전략이 개발되었다(도 2C).
TCR 발현을 측정하기 위해서, 오직 TCR 항체 발현시 세포 표면상에 제공되는 CD3에 특이적인 mAb를 사용하였다. 전기-전달 후 6일째에, 유식 세포측정 분석은 TRBC를 표적화하는 CRISPR이 공여자 ND147에서 1차 T 세포상의 CD3 발현을 13.7의 수준으로(도 2D) 제거함을 밝혀내었다. 상기 TCR 녹아웃의 효율을 전기-전달된 mRNA의 양과 상관시켰다(도 2D). 1차 T 세포에서의 RNA의 전기-전달은 충분히-허용되었지만, 증가하는 양의 도입된 RNA와 상관있는 세포 생육력의 약간의 감소가 관찰되었다. ZFN 및 TALEN 매개된 유전자 붕괴가, 세포를 순한 저체온에 일시적으로 노출시킬 때 보다 효율적인 것으로 보고되었다. 같은 현상이 상기 CRISPR 시스템에서 관찰되었다.
상기 T 세포를 전기-전달 후 32 ℃에서 1일 동안 배양하였다. CD3의 CRISPR-매개된 붕괴는 전기천공된 T 세포를 37 ℃에 비해 32 ℃에서 배양시켰을 때 2.5배까지 양호하였다. 상기 접근법을 사용하는 경우, TRAC 및 TRBC를 표적화하는 CRISPR을 사용하여, 각각 전기천공된 T-세포의 5.43% 및 16.7%가 CD3의 발현을 상실하였다(도 2D, 하부 패널). 상기 CAS9 MOCK 샘플에서 CD3 음성 세포의 수준은 변화가 없으며 생육력의 인지 가능한 감소도 없는 것으로(트립판 블루에 의해 측정됨) 관찰되었다.
gRNA를 두 번째 및 세 번째 전기-전달했을 때, 1차 T 세포상에서의 CD3 발현의 제거 효율은 그 수준이 크게 개선되었다.
·TRAC의 표적화: gRNA의 3회 전기-전달 후 77%에 달하는 수준(도 4A),
·TRAC 또는 TRBC의 표적화, 약간의 생육력 감소와 함께 gRNA의 두 번째 전기-전달 후 각각 64.5% 또는 57.5%에 달하는 수준(도 4C).
전기천공된 T 세포가 의도된 gRNA 표적 부위(TCR α 또는 β 유전자좌)에서 유전자 변형되었음을 확인하기 위해서, TRAC, TRBC1 또는 TRBC2 내의 표적 부위에 인접하는 특정한 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 사용하여 상거 서열분석을 수행하였다. 상기 표적 부위들로부터 출발하는 지시된 PCR 산물에서의 다중 피크들은 오직 CRISPR의 전기-전달 및 붕괴 퍼센트가 세포 표면 CD3 발현의 상실과 관련되었을 때만 나타났다(도 1C 및 3B). 1차 T 세포에서의 상기 실험은 TRAC 또는 TRBC를 표적화하도록 설계된 CRISPR이, 상거 서열분석에 의해 평가되고 CD3의 유식 세포측정 분석에 의해 확인된 바와 같이, αβ TCR 발현의 영구적인 붕괴를 도출함을 확인하였다.
실시예 2: TCR αβ 음성 T 세포의 농축.
장래의 임상 용도를 위해서, TCR 붕괴된 집단의 공급원을 단리하기 위한 신속하고 확고한 방법들을 사용할 수 있다. 상기 문제를 다루는 시작으로, TCR/CD3neg 집단을, 임상적으로-승인된 상자성 비드 및 고갈 컬럼을 사용하여 음성 선택에 의해 농축시켰다. 단일 고갈 단계에 의해, 상기 CD3neg 집단을 99% 이상까지 증대시켰다(도 3A). CD3neg 집단을, 감염되지 않은 대조군 세포로부터는 농축시킬 수 없었다. 연이은 고갈 단계는 CD4 또는 CD8 T 세포 부분집합의 왜곡 없이 >99% 농축을 생성시켰다(도 3C). 서열분석 결과는 또한 결실 및 삽입이 CRISPR 변형 후 TCR 알파 및 베타 유전자좌에 도입됨을 보였다(도 3D).
실시예 3: CRISPR에 의한 HLA-CLASS Ineg T 세포의 생성.
CRISPR이 동종이계 T 세포로부터 HLA-CLASS I 발현을 녹아웃시키는 능력을 시험하기 위해서, 베타-2 마이크로글로빈을 표적화하는 gRNA를 설계하였다. 상기 베타-2 마이크로글로빈 유전자좌를 293 T 세포에서 CRISPR에 의해 조작할 수 있었다(도 9A). 증거는 베타-2 마이크로글로빈의 붕괴가 T 세포 표면 HLA-CLASS I 발현을 없앰을 보였다(도 9B).
IFN-감마는 T 세포에서 베타-2 마이크로글로빈의 표적화 효율을 대략 10배 개선시켰다(도 9C). 베타-2 마이크로글로빈 gRNA의 수회의 전기-전달은 66% 베타-2 마이크로글로빈 음성 집단을 제공하였다(도 11A).
장래의 동종이식편 이식 임상 용도를 위해서, HLA-CLASS I 삭제 집단의 공급원을 단리하기 위한 신속하고 확고한 방법이 필요할 것이다. 이 문제를 다루는 시작으로, 상기 세포를 PE-항-베타-2 마이크로글로빈 항체로 표지하고, 임상적으로-승인된 상자성 항-PE 마이크로비드 및 고갈 컬럼을 사용하여 음성 선택에 의해 HLA-CLASS Ineg 집단에 대해 농축시켰다. 단일 고갈 단계에 의해, 상기 HLA-CLASS Ineg 집단을 99% 이상까지 증대시켰다. HLA-CLASS Ineg 집단을, 감염되지 않은 대조군 세포로부터는 농축시킬 수 없었다. 유식 세포측정을 통한 농축된 HLA-CLASS Ineg T 세포 중의 HLA-CLASS I 레퍼토리의 분석으로 상기 세포 표면으로부터 HLA-CLASS I 발현의 제거를 확인하였다(도 9D).
실시예 4: CD3neg T 세포를 상이한 방법들에 의해 번식시킬 수 있다.
CD3neg T 세포는 외인성 1G4-TCR 알파 및 베타 쇄 시험관내 전사된 mRNA(각각 5 ㎍)의 전기-전달 후 CD3 발현을 복원시켰다. 상기 세포를 (1) 단일 고속 증대 프로토콜(REP)에 의해 증대시키고, 이어서 활성 및 특이성에 대해 시험하였다. PBMC를 3명의 상이한 공여자로부터 수득하였다: ND052 105x106, ND405 83x106, ND410 136x106. 세포를 조사한 후에, 이어서 함께 혼합하여 총 324x106 PBMC를 수득하였다. 2x106 세포를 RNA로 전기-전달하였다. CD3neg T를 90 ㎖의 최종 부피로 재-현탁시키고, R10 배지를 총 300 ㎖로 가하였다. 상기 세포를 2개의 T150 ㎖ 플라스크에 나누었다. OKT를 30 ng/㎖의 최종 농도로 가하였다. 2일째에, IL-2를 50 CU/㎖로 가하였다. 5일째로부터, 세포를 카운트하고 2일마다 먹이를 공급하였으며, 감소된 성장 동역학 및 세포 크기 모두에 의해 측정된 바와 같이, 일단 T 세포가 휴지된 것으로 보이면, 상기 세포를 기능 분석에 사용하거나 냉동보존하였다.
단일 REP 후에, CD3neg T 세포를 500배 세포수 증가로 증대시켰다. 상기 세포를 (2) 1:3 세포 대 비드 비의 항-CD3/항-CD28로 코팅된 자기 비드로 자극함으로써 증대시켰다.
단일 REP 후에, CD3neg T 세포를 500배 세포수 증가로 증대시켰다. 상기 세포를 (3) 1x106/㎖의 농도로 같은 혼합물 중에서 조사된 K562-CD19 및 K562/86/64/A2(2D11)와의 동시-배양에 의해 증대시켰다.
단일 REP 후에, CD3neg T 세포를 500배 세포수 증가로 증대시켰다. 상기 세포를 (4) 30 ng/㎖ OKT와 함께 1x106/㎖의 농도로 같은 혼합물 중에서 조사된 K562-CD19 및 K562/86/64/A2(2D11)와의 동시-배양에 의해 증대시켰다.
단일 REP 후에, CD3neg T 세포를 500배 세포수 증가로 증대시켰다. 상기 세포를 (5) 1 ㎎/㎖ NY-ESO 펩티드와 함께 1x106/㎖의 농도로 같은 혼합물 중에서 조사된 K562-CD19 및 K562/86/64/A2(2D11)와의 동시-배양에 의해 증대시켰다.
실시예 5: TCR의 전기-전달에 의한 TCRneg T 세포의 재-지시.
TCRneg T 세포의 기능을 시험하기 위해서, 상기 세포를 TCR의 전기-전달에 의해 재-지시하였다. TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 도입시킴으로써, 상기 세포는 높은 수준의 TCR을 발현시켰다. Vb13.1의 발현은 CAS9 MOCK 대조군에 비해 전기-전달된 TCRneg T 세포에서 훨씬 더 높았다(도 7A). 상기 세포를 HLA-A2 및 NY-ESO 모두에 대해 양성인 Nalm-6 NY-ESO 백혈병 세포주와 함께 배양시, 상기 세포는 높은 수준의 107a를 나타내었으며, 이는 상승된 탈-과립화 활성을 가리킨다(도 7B). 살해 분석이 또한 상기 세포주에 대한 효능 있는 독성을 나타내었다(도 7C). 이는 상기 세포가 GVHD를 촉발하지 않고 TCR 처리에 의해 정상 T 세포보다 적은 잘못 짝짓기 독성을 가질 것이기 때문에, CAR 및 TCR을 발현하는 T 세포에 의한 전통적인 임상시험보다 잠재적으로 더 안정함을 암시하였다.
일부 보고서는 T 세포가 내인성 αβ TCR의 발현을 제거하도록 ZFN 또는 TALEN에 의해 유전자 편집될 수 있음을 입증하였다. 바람직하지 못한 αβ TCR을 발현하는 T 세포를 선택적으로 고갈시키는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 또한 GVHD를 치료하고 내인성 TCR이 CAR 기능에 불리한 영향을 미치는(예를 들어 전사 인자들에 대한 경쟁을 통해서) 것을 억제하는 상기 내인성 TCR의 불완전한 녹아웃을 포함한다. 따라서, 유전적 접근법은 디자이너 ZFN을 사용하여 T 세포에서 α 및 β 불변 영역 서열을 영구적으로 붕괴시키고, 이에 의해 TCR 발현을 제거하도록 설계되었다.
ZFN 및 TALEN은 DNA 결합 도메인을 DNA 절단 도메인에 융합시킴으로써 생성되는 인공 제한 효소들이다. ZFN 및 TALEN이 효율적으로 작동하지 못하는 경우, 원인을 판정하는 것이 종종 어렵다. 실패는 표적 서열의 접근성, 또는 전달 문제와 함께 설계의 문제점을 반영할 수 있다. 동시에, ZFN 표적화 효율이 T 세포에서 대체로 낮으며, 이는 다수 유전자를 한 번에 조작하기 어렵게 한다.
독특한 ZFN 및 TALEN인 CRISPR/Cas 시스템이, 최근에 표적화된 유전자 변경을 유도하기 위한 ZFN 및 TALEN에 대한 잠재적으로 용이하고 효율적인 대안으로서 대두되었다. 최근의 연구는 상기 Cas9 단백질에 의한 표적 인식이 crRNA내에 '시드' 서열 및 상기 crRNA-결합 영역 상류의 보존된 디-뉴클레오티드 함유 원시이격자 인접 동기(PAM) 서열을 필요로 함을 입증하였다. 상기 CRISPR/CAS 시스템은 상기에 의해 재표적화되어 상기 crRNA를 재설계함으로써 실질적으로 어떠한 DNA 서열도 절단할 수 있다. 본 명세서에 개시된 데이터는 293T 세포 및 1차 T 세포에서 CRISPR/CAS에 의한 유전자 편집 가능성을 나타낸다. 상기 CRISPR/CAS 시스템은 2개 이상의 gRNA를 갖는 단일 CAS9 단백질을 동시-발현함으로써 다수의 게놈 유전자좌를 동시에 표적화하여, 상기 시스템을 표적 유전자의 다중 유전자 편집 또는 상승적 활성화에 유일하게 적합하게 한다. 상이한 gRNA를 CAS9와 함께 투여함으로써, 다수 유전자를 T 세포에서 동시에 붕괴시킬 수 있다.
실시예 6: CRISPR에 의한 HLA CLASS I 및 TCR α,β 쇄 삼중 녹아웃.
암 및 감염성 질병에 대한 "기성품" 동종이계 t-세포 요법에 대해 연구하기 위해서, T 세포의 주입에 의한 세포 요법을 병원체 및 암에 대한 면역을 재구성하도록 설계하였다. 목적하는 성질을 가지며 생체외에서 충분한 수의 T 세포를 제조하는데 필요한 시간의 양이 종종 환자의 치료창에 부적합하다. 더욱 또한, 진행된 질병을 갖는 환자로부터의 자기유래 T 세포는 손상된 기능을 가질 수도 있으며 목적하는 항원에 내성일 수도 있다.
이를 다루기 위해서, 환자에게 동종이계 T 세포를 주입하여, 상기 주입된 세포상의 이질적인 주 또는 부 조직적합성 항원을 인식하는 숙주 T 세포에 의해 야기되는 면역-매개된 거부를 피할 수 있다. T 세포 요법의 적용을 확장시키고 장래의 동종이식편 이식을 위해서, TCR 및 HLA-CLASS I 붕괴된 집단의 공급원을 단리하기 위한 신속하고 확고한 방법을 생성시킬 수 있다.
ZFN 및 TALEN은 Fokl 엔도뉴클레아제의 절단 도메인에 융합된 특정한 DNA 서열에 결합하도록 설계된 아연 집게 DNA-결합 도메인을 포함한다. 상기 ZFN 및 TALEN의 설계 및 구성은, 조작해야 할 유전자가 하나보다 많은 경우 상기 유전자를 개별적으로 표적화해야 하기 때문에, 매우 복잡하며 시간 소모적이다. 본 명세서에 기재된 CRISPR 시스템을 사용하면, 상기 유전자 붕괴의 효율성 및 시간 과정의 단축을 수득할 수 있다.
상기 문제를 다루기 위해서, CAS9를 TRAC, TRBC 및 베타-2 마이크로글로빈을 표적화하는 3개의 상이한 gRNA와 전기-전달하였다. 세포를 PE-항-베타-2 마이크로글로빈 항체로 표지화하고 임상적으로 승인된 상자성 항-PE 마이크로비드 및 고갈 컬럼을 사용하여 음성 선택에 의해 HLA-CLASS Ineg 집단에 대해 농축시켰다. 단일 고갈 단계에 의해, 상기 HLA-CLASS Ineg 집단을 99% 이상까지 증대시켰다(도 9D). 이어서 상기 세포를 TCR 알파 쇄와 함께 재-도입시키고, HLA-CLASS Ineg CD3neg 집단을 마이크로비드에 의해 농축시켰다(도 11). 5일 후에, 상기 TCR 베타 쇄를 상기 세포에 재-도입시키고, HLA-CLASS Ineg CD3neg 집단을 다시 마이크로비드에 의해 농축시켰다. 2일 후에, TCR을 상기 삼중 녹아웃 세포내에 전기-전달하였다. 전기-형질전환 후 당일에, 상기 세포를 CD3/CD28 다이나비드로 자극하였다. 이어서, 상기 세포는 다음날 항원 특이적 TCR의 렌티바이러스 전달 및 배양 증대를 겪었다.
실시예 7: CRISPR에 의한 FAS, PD1, CTLA4, PPP2R2D 녹아웃.
상기 FAS 수용체/FAS 리간드(FAS/FASL) 세포사멸 신호전달 경로는 광범위하게 연구되었으며 T 세포에서 충분히 특성화되어 있다. PD1 및 CTLA4는 또한 광범위하게 연구된 T 세포에서의 2개의 주요 억제성 신호전달 경로이다. 이들 경로를 표적화하는 잠재적인 치료학적 영향에 대한 직접적인 증거는 CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1의 항체-매개된 봉쇄 후 증대된 항-종양 면역을 나타내는 전임상 쥐 종양 모델에서의 연구로부터 왔다. 인간에 사용하기 위한 유사한 항체들이 개발되었으며, 조기 임상 데이터는 유망한 결과를 입증하였다. Ppp2r2d 녹다운이 또한 T-세포 세포사멸을 억제하고 T-세포 증식뿐만 아니라 사이토킨 생성을 증대시킬 수 있다. Ppp2r2d는 인간 T 세포의 기능을 개선시키기 위한 표적으로서 가능성을 갖는다.
상기 문제를 다루기 위해서, CAS9 및 FAS, PD1, CTLA4, PPP2r2d를 표적화하는 3개의 상이한 gRNA를 T 세포내에 전기-전달하였다. 상거 서열분석 데이터는 FAS, PD1, CTLA4, PPP2r2d의 지시된 유전자좌가 CRISPR에 의해 변형되었음을 나타냈다. FAS가 또한 CRISPR에 의해 촉발된 상동성 재조합에 의해 GFP에 의해 교체되었다. FACS 데이터는 FAS 및 PD1의 표면 발현이 없어짐을 보였다.
실시예 8: 유전자 변형된 1차 및 T 세포를 갖는 IPS 세포의 생성.
암 및 감염성 질병에 대한 입양 T-세포 요법의 진보는, 쉽게 입수할 수 있고 항원-특이성인 인간 T 림프구의 결여에 의해 방해된다. 다능성 줄기 세포는 T 림프구의 무제한 공급원을 제공할 수 있었다. 상기 문제를 다루기 위해서, FAS, PD1, CTLA4, PPP2r2d의 발현을 1차 세포 및 T 세포에서 붕괴시켰다.
센다이 바이러스를 사용하여 1차 세포 및 T 세포를 재프로그램화하였다. 바이러스-매개된 유전자 형질도입 및 화학적 유도를 포함한, iPSC의 다수의 생성 방법들이 존재한다. 렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터는 재프로그램화 유전자의 발현을 위해 숙주 염색체내로의 통합을 요하지만, DNA-기재 벡터, 예를 들어 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 및 플라스미드 벡터는 에피솜에 의해 존재하고 통합을 필요로 하지 않는다. 그러나, 상기는 여전히 일정한 빈도로 숙주 염색체내에 통합될 수 있으며, 재프로그램화 효율은 비교적 낮다. 마찬가지로, mRNA 기재 재프로그램화는 복잡하며 매우 비효율적인 것으로 나타났다.
상기 방법들과 달리, 센다이 바이러스는 숙주 게놈내로 통합되지 않거나 숙주 세포의 유전 정보를 변경시키지 않는다. 센다이 바이러스는 또한 렌티바이러스- 및 레트로바이러스-기재 유전자 형질도입에 필적하는 재프로그램화 가능성을 갖는다.
24 웰 플레이트 중의 각 웰에 0.1x106의 야생형, FASneg, CD3neg TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄 녹아웃 T 세포를 시딩하였다. 상기 세포를 CD3/CD28 비드로 자극하였다. 자극 후 3일째에, 상기 비드를 제거하고, 상기 세포를 1 ㎖의 예온된 T 세포 완전 배지에 재현탁시키고, 이어서 상기 세포에서 hKlf4, hOct3/4 및 hSox2의 발현을 위한 폴리시스트론 벡터를 포함하는 계산된 부피의 사이토튠(CytoTune) 센다이 바이러스와 배양하였다(라이프테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재). 처리된 T 세포를 24 웰 플레이트에 시딩하고, 실온에서 90분 동안 2250 rpm에서 원심분리시켰다. 추가로 1 ㎖의 완전 T 세포 배지를 각 웰에 가하고 상기 플레이트를 5% CO2의 가습 분위기하에 37 ℃에서 밤새 배양하였다.
형질도입 후 당일에, 센다이 바이러스를, 상기 T 세포를 신선한 완전 배지로 세척하고 상기 세포를 2일 동안 배양함으로써 제거하였다. 배지는 매일 절반 교환하였다. 감염 후 3일째에, 세포를 MEF 피더 플레이트로 옮기고 어떠한 사이토킨도 없이 T 세포 배지에서 배양하였다. 감염 후 4일째에, 상기 세포를 표준 hES 배지에서 배양하였다. 배지를 매일 교환하였다. ES-형 콜로니가 7일째 부근에서 관찰되었다. 상기 세포를 15일째부터 hES 순화 배지에서 배양하고 추가로 10일 동안 배양을 계속하였다. 콜로니를 형질도입 후 약 25 내지 30일째에 채취하였다.
대략 4일째에, 세포 덩어리가 피더 세포상에 형성되었으며, 이는 상기 재프로그램화 과정의 개시를 암시하였다. T 세포는 iPSC로의 재프로그램화 과정 동안 극적인 형태 변화를 겪었다. 대략 12일째에, 느슨한 테두리를 갖는 큰 세포 덩어리가 나타나기 시작하였다. 대략 18일째에, 세포는 충분히 한정된 테두리를 갖는 전형적인 ES-형 콜로니들로 형질전환되었다. 전형적인 배아 줄기 세포 형태가 관찰되었으며, 이는 FASneg, CD3neg TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄 녹아웃 T 세포가 한정된 재프로그램화 조건하에서 다능성 상태로 유도됨을 암시하였다(도 17A 및 18A).
FASneg T 세포는 그의 야생형 대응물의 약 5배의 효율로 더 용이하게 iPSC로 재프로그램화되었다(도 17B). 마찬가지로, CD3neg T 세포의 재프로그램화는 상기 야생형 대응물보다 약 5배 더 효율적이었다(도 18B). p53 결핍 세포주는 세포사멸 경로가 방해되기 때문에 더 용이하게 재프로그램화되는 것으로 보고되었다. FAS 녹아웃은 세포사멸 내성을 추가로 유도한다. TCR 발현의 상실은 T 세포를 덜 건강하게 하는 반면, 세포사멸이 재프로그램화 과정에 중요한 역할을 함을 가리킨다.
실시예 9: siRNA에 의한 T 세포에서 TCR의 녹다운.
도 19는 제2 디설파이드 결합 및 베타 쇄에 대한 탈-N-글리코실화를 갖는(S/SD) 변형된 NY-ESO-1 TCR 또는 야생형 NY-ESO-1 TCR(wt)의 IFN-감마 생성을 나타내는 그래프이다. RNA를 siRNA로 녹다운된 내인성 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 T 세포내로 전기천공시켰다. T 세포를 NY-ESO-1 특이성 펩티드, p156-165로 18h 동안 펄스화시킨 HLA-A2 양성 세포주로 자극한 후에 ELISA에 의해 IFN-감마가 검출되었다.
도 20(도 20A 및 20B 포함)은 CAS9 RNA 및 gRNA 동시-전기천공에 의한 TCR 알파 녹다운을 나타낸다. 전기천공 후 6일째에, 세포를 CD3의 평가에 의해 TCR 발현에 대해 분석하였다.
도 21은 상거 서열분석을 나타낸다. 결과는 CAS9 mRNA 및 gRNA 전기천공되어 TCR 알파(TRAC-5) 또는 TCR 베타(TRBC-7)를 녹다운시킨, CD3 음성 농축된 T 세포에서의 다중 피크를 나타낸다.
도 22는 NY-ESO-1 TCR 알파 및 베타(1G4LY95 TCR) RNA 전기천공 후 4시간째에 내인성 TCR 베타(TRB-7) 녹다운을 갖는 CD3 음성 T 세포가 CD3을 재-발현하였음을 나타내는 그래프 패널이다. 정상적인 T 세포(ND424 Beads)를 대조군으로서 사용하였으며, 상기는 5.25% 내인성 TCR vb13.1 발현과 함께 거의 100% CD3 양성을 나타내었다.
도 23(도 23A-23D 포함)은 내인성 TCR의 녹다운이 TCR RNA 전기천공된 T 세포의 트랜스유전자 발현 및 기능을 모두 증대시켰음을 나타내는 그래프 패널이다. 도 23A는 TCR siRNA(실선 개방 막대그래프), 대조군 siRNA(점선 개방 막대그래프)로 전기천공된 T 세포 및 어떠한 siRNA도 없는 T 세포(색칠 된 막대그래프)의 TCR 발현을 나타낸다. 도 23B는 야생형 NY-ESO-1 TCR(wt) 또는 TCR siRNA, 대조군 siRNA를 갖거나, 또는 siRNA가 없는, 변형된 TCR(SD) RNA 전기천공된 T 세포의 트랜스유전자(TCR vb13.1) 발현을 나타낸다. 도 23C는 야생형 NY-ESO-1 TCR(wt) 또는 TCR siRNA, 대조군 siRNA를 갖거나, 또는 siRNA가 없는, 변형된 TCR(SD) RNA 전기천공된 T 세포의 NY-ESO-1 사량체 염색을 나타낸다. 도 23D는 TCR siRNA 녹다운, 야생형 NY-ESO-1 TCR RNA 전기천공된 T 세포에 의한 HLA-A2/NY-ESO-1 양성 종양 세포주의 특이적 용해를 나타낸다.
도 24는 마우스 모델에서 T 세포의 주사 후 종양 세포의 형광을 나타내는 그래프이다. NY-ESO-1 및 GFP를 모두 발현하는 10x106개 Nalm6-CBG-ESO-GFP(녹색 방아벌레) 종양 세포를 NOD/SCID 마우스에게 정맥내 주사하였다. 종양 접종 후 5일째에, CBR(적색 방아벌레) 형질도입되고 RNA 전기천공된 T 세포를 상이한 그룹들에 지시된 대로 주사하고 종양 성장을 생물발광 상(BLI)에 의해 모니터하였다.
도 25는 상이한 시점들에서 CD19BBZ CAR RNA T 세포 또는 변형된 NY-ESO-1 TCR RNA에 의해 처리된 2개 그룹으로부터의 마우스의 생물발광 상을 나타낸다.
실시예 10: CRISPR을 사용하는 T 세포상의 TCR-CD3 복합체의 렌티바이러스 형질도입 및 붕괴의 조합에 의해 생성된 보편적인 CAR19 T 세포.
도 26에 나타낸 바와 같이, 1차 T 세포를 0일째에 항-CD3/항-CD28 비드로 자극하고, 이어서 렌티-CAR19로 형질도입시켰다. 상기 세포의 70% 이상이 유식 세포측정에 의해 검출된 바와 같이 CAR19 양성이었다. CRISPR의 일시 발현이면 유전자 녹아웃을 매개하기에 충분하기 때문에, 3일째에 CAS9 및 TCR α 쇄, TCR β 쇄 및 베타-2 마이크로글로불린 유전자의 불변 영역을 표적화하는 gRNA를 암호화하는 시험관내 전사된 RNA의 전기-전달을 사용함으로써 CRISPR을 일시적으로 발현시키는 "치고 달리기" 전달 전략이 개발되었다. T 세포를 전기전달 후에 32 ℃에서 24시간 동안 배양하였으며, 이어서 정상 조건으로 복귀시켰다.
TCR 발현을 측정하기 위해서, CD3에 특이적인 단클론 항체를 사용하였다. CD3은, TCR이 발현될 때 CD3이 세포 표면상에서 유일하게 존재하기 때문에 선택되었다. CRISPR 구조물을 1차 T 세포로 전기천공시켰다(도 26). TCR 단일 음성 및 TCR/HLA-A 이중 음성 세포를 CD19 제공 K562 세포에의 노출에 의해 증대시켰으며, >100배의 증대가 생성되었다(도 27).
증대 후에, 상기 세포는 TCR 단일 음성 또는 TCR/HLA-A 이중 음성으로 남았으며, CAR19 양성 집단은 농축되었다. 내인성 TCR 발현은 TCR 단일 음성 세포에서 음성으로 남은 반면, TCR 및 HLA-A 발현은 K562-CD19 자극된 증대 후 TCR/HLA-A 이중 음성 T 세포에서 음성으로 남았다(도 28A). CAR19 양성 세포는 K562-CD19 자극된 증대에 의해 농축되었다(도 28B).
상기 증대된 보편적인 T 세포의 대부분은 CD45RO 양성이었으며(도 29A) 높은 수준의 CD62L 발현(도 29B), 중간 수준의 CD28 발현(도 29A) 및 낮은 수준의 CCR7 발현(도 29B)을 유지하였다.
CRISPR 유전자 편집은 시험관내에서 보편적인 CAR19 T 세포의 항-종양 활성에 영향을 미치지 않았다(도 30A). TCR 또는 TCR/HLA-A의 고갈은 CAR19 발현 및 항-종양 활성에 최소의 영향을 미쳤다(도 30B 및 30C). TCR 단일 및 TCR/HLA-A 이중 음성 CAR19 T는 Nalm6 종양 세포로 공격시 확고한 용해 능력을 나타내었다(도 30B). CD107a 방출 및 사이토킨 분비가 또한 상기 보편적인 세포에서 효능 있는 항-종양 활성을 나타내었다(도 30C). TCR 단일 제거 또는 TCR 및 HLA-A 이중 제거 CAR19 T 세포는 CD19 발현 세포 공격 후에 유사한 증식 동역학을 나타내었다(도 30D).
CRISPR/CAS9 편집된 CAR19 T 세포의 항-종양 활성을 시험하기 위해서, TCR 단일 음성, TCR 및 HLA-A 이중 음성 CAR19 T를 Nalm6 종양 세포를 갖는 NSG 마우스내에 주입하였다. 조작되지 않은 T 세포를 수용한 마우스 및 렌티바이러스 GFP 형질도입된 야생형 T 세포가 주입된 마우스는 모두 종양 세포 주입 후 3주 이내에 죽었다. 객관적인 종양 퇴화가 CAR19 T 세포를 수용한 마우스에서 관찰되었다(도 6). CRISPR/CAS9는 CAR19 T 세포의 생체내 종양 살해 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 이는 T 세포 요법에 대한 렌티바이러스 유전자 전달 및 CRISPR/CAS9의 병용 이점을 입증한다.
T 세포상의 TCR α 및 β 쇄 및 HLA-A 분자의 전체 제거는 상기 세포를 HLA 불합치된 종양 세포주로 공격시 비특이적인 살해를 완전히 없앴다(도 32A). HLA-A 분자의 제거는 장기간(5일) 공-배양 후 NK 세포를 활성화시켰다. 상기 세포를 IFNr 엘리스폿 분석에서 24시간 후 동종이계 전혈 PBMC에 의해 공격시 표적-외 활성은 관찰되지 않았다. 상기 표적-외 활성의 결여는 T 세포가 동종이계 세포와 조우 후에 급성 면역 반응에서 우세한 역할을 할 수 있음을 암시한다. 상기 결과는 모두 CRISPR/CAS9 편집된 TCR α 및 β 쇄 및 HLA-A 분자(삼중 음성) T 세포가 보편적인 효과기 공여자 세포의 공급원으로서 작용할 수 있음을 암시한다.
CAS9 및 FAS를 표적화하는 상이한 gRNA를 T 세포내에 전기-전달하였다. FASneg 세포를 분류하고 이어서 렌티바이러스 CAR19로 형질도입시켰다. 유식 세포측정 및 상거 서열분석 데이터는 FAS가 CRISPR에 의해 변형되었음을 나타내었다(도 33). FASneg T 세포의 CAR19 유전자 발현은 야생형에 필적하였다. Nalm6 종양 세포와 단기간 배양후에조차, CD107a 발현은 심지어 공-배양 4시간이내에 야생형 대응물 세포에 비해 FASneg CAR19 T 세포에서 크게 증대되었다.
일부 보고서는 심지어 약한 항원 자극조차 FAS 활성화를 촉발하여 T 세포 증식을 촉진할 수 있음을 나타내었다(Rethi, et al, Blood, vol. 112(4):1195-1204, 2008). 흥미롭게, FASneg CAR9 T 세포는 상기가 높은 수준의 CD19+ K562 세포에 의해 자극시 야생형 CAR19 T 세포보다 훨씬 더 빠르게 증대되었다. 이는 FAS/FASL이 높은 수준의 항원 조건하에서 활성화 대신 세포사멸을 촉발하였음을 암시한다(도 34A). FASneg CAR19 T 세포는 애넥신 V 염색에 의해 측정된 바와 같이 세포사멸 수준의 감소를 추가로 나타내었다(도 34B).
시험관내에서 관찰된 바와 같이, FASneg T 세포는 야생형 T 세포에 비해 증대된 증식을 나타내었다. 유사한 증식 결과가, CAR19 T 세포의 트루 카운트(True Count) 분석을 Nalm6 함유 마우스에서 상기 세포의 주입 후 수행하였을 때 관찰되었다. 상기 FASneg CAR19 그룹은 야생형 그룹에 비해 우수한 항-종양 활성을 나타내었다(도 35B). 상기 차이는 상기 두 그룹간의 생물발광 데이터를 나타내는 도 35C의 그래프에서 예시된다. 상기 데이터는 CART 세포에서 FAS 제거가 그의 항-종양 활성을 증대시켰음을 가리킨다.
CAS9 및 PD1을 표적화하는 상이한 gRNA를 PSCA-CAR의 렌티바이러스 형질도입 후 T 세포내로 전기-전달하였다. PD1 녹아웃 세포는 CD3/CD28 비드 자극 후 표면 PD1 발현에 의해 확인되었다(도 36). PD1 음성 세포를 마이크로비드 고갈에 의해 농축시키고 이어서 PSCA 항원 제공 PC3 종양 세포로 자극하였다. PSCA-CAR 양성 세포를 야생형 및 PD1 음성 그룹 모두에서 농축시켰다. PC3-PSCA-PDL1 종양 세포와 배양 후에, PD1 발현은 야생형 PSCA-CAR T 세포의 표면상에서 급속히 상향조절되었으며, 이때 매우 낮은 수준의 PD1 발현이 음성 PSCA-CAR T 세포상에서 검출되었다(도 37). PD1 음성 PSCA-CAR T 세포는 또한, 크게 증대되고 지속된 높은 수준의 CD137 발현(도 37)(T 세포 활성화의 마커)을 나타내었으며, 이는 상기 PD1/PDL1 억제 신호전달 경로가 차단되었음을 가리킨다.
생체내 PC3-PSCA-PDL1 NSG 모델에서 시험시, 야생형 그룹에 비해 PD1 음성 PSCA-CAR T 세포 그룹에서 상당히 증대된 항-종양 활성이 검출되었으며(도 38A 및 38B), 이는 CART 세포 요법에 대한 PD1 제거의 치료학적 가치를 암시한다.
CRISPR 조작된 보편적인 CART 세포의 이식편 대 숙주병(GVHD) 효과를 시험하기 위해서, 높은 T 세포 용량을 Nalm6 백혈병이 있는 NSG 마우스에게 제공하였다. 상기 마우스를 이중 또는 삼중 녹아웃 CART 세포로 처리하였으며 상기 마우스는 어떠한 GVHD의 발병 징후도 나타내지 않았다. 대조적으로, 야생형 CD19 CART 그룹으로부터의 마우스 4 마리 중 3마리는 65일까지 GVHD를 나타내었으며, 이는 상이한 기관의 조직 검사에 의해 확인되었다(도 39).
또 다른 실험에서, 상기 세포를 FBS에 재현탁시키고 준-치사 조사 후에 마우스내에 정맥내 주입하였다. 임상적 GVHD를 주당 2 내지 3회 모니터하였다. 야생형 T 세포를 수용한 5마리 마우스 중 4마리는 상기 60일 연구 동안 죽은 반면, PBS 처리된, TCR 단일 및 TCR/HLA-I 이중 제거된 T 세포 처리된 그룹은 GVHD의 어떠한 징후도 나타내지 않았다. 야생형 T 세포를 수용한 마우스는 체중 손실을 경험하였다. 그러나, PBS 처리된, TCR 단일 및 TCR/HLA-I 이중 제거된 T 세포 처리된 그룹은 상기 연구 동안 체중이 약간 증가하였다(도 40A 및 40B).
T 세포를 렌티바이러스 CD19-CAR 형질도입 후에 Cas9 및 CD3, B2M 및 PD1 또는 Fas를 표적화하는 gRNA로 처리하였다. 삼중 녹아웃 보편적인 CART 세포를 Nalm6-PDL1 종양을 갖는 마우스에게 주사하였다. 우수한 항-종양 활성이, CD3/HLA-I 이중 녹 아웃 세포에 비해 PD1/CD3/HLA-I 삼중 녹아웃 세포를 수용한 마우스에서 관찰되었으며, 이는 상기 PD1 신호전달 경로 차단의 치료학적 가치를 추가로 가리킨다(도 41A 및 41B). 상기 데이터는 보편적인 CART 세포의 CRISPR/Cas9에 의한 치료를 증대시키는 방식을 공급한다.
gRNA는 분해되기 쉬우므로, 보편적인 CART 세포를 생성시키기 위해 단순화된 원-샷 방법이 개발되었다. gRNA를 단일 렌티바이러스 벡터에서 CAR과 함께 구성적으로 발현시켰다. 나이브 T 세포를 CD3/CD28 다이나비드로 자극 후 1일째에 렌티바이러스 암호화 gRNA 및 CAR에 의해 형질도입시켰다. 상기 세포를 3일째에 Cas9 mRNA로 전기천공시켰다(도 42). 상기 시스템은 하나의 벡터에 의한 다수 유전자의 조작을 허용한다(도 42). CD3 발현은 6일째에 유식 세포측정에 의해 확인되었다. 상기 원-샷 시스템에 의해 처리된 T 세포는 상이한 Cas9 mRNA 그룹들 각각에서 90% 정도로 높은 일관적인 유전자 제거를 나타내었다(도 43).
암 및 감염성 질병에 대한 입양 T-세포 요법의 진보는 쉽게 입수할 수 있는 항원-특이성 인간 T 림프구에 의해 방해되었다. 다능성 줄기 세포는 T 림프구의 무제한 공급원을 제공할 수 있었다. 상기 문제를 다루기 위해서, FAS, PD1, CTLA4, PPP2r2d의 발현을 1차 세포 및 T 세포에서 붕괴시켰다.
센다이 바이러스를 사용하여 1차 세포 및 T 세포를 재프로그램화하였다. 바이러스-매개된 유전자 형질도입 및 화학적 유도를 포함한, iPSC의 생성에 이용할 수 있는 다수의 방법들이 존재한다. 렌티바이러스 및 레트로바이러스 벡터는 재프로그램화 유전자의 발현을 위해 숙주 염색체내로의 통합을 요하지만, DNA-기재 벡터, 예를 들어 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 및 플라스미드 벡터는 에피솜에 의해 존재하고 통합을 필요로 하지 않는다, 그러나 상기는 여전히 일정한 빈도로 숙주 염색체내에 통합될 수 있으며, 재프로그램화 효율은 비교적 낮다. 마찬가지로, mRNA 기재 재프로그램화는 복잡하며 매우 비효율적인 것으로 나타났다.
대조적으로, 센다이 바이러스는 숙주 게놈내로 통합되지 않거나 숙주 세포의 유전 정보를 변경시키지 않는다. 센다이 바이러스는 또한 렌티바이러스- 및 레트로바이러스-기재 유전자 형질도입에 필적하는 재프로그램화 가능성을 갖는다.
24 웰 플레이트 중의 각 웰에 0.1x106의 야생형, FASneg, CD3neg TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄 녹아웃 T 세포를 시딩하였다. 상기 세포를 CD3/CD28 비드로 자극하였다. 자극 후 3일째에, 상기 비드를 제거하고, 상기 세포를 1 ㎖의 예온된 T 세포 완전 배지에 재현탁시키고, 이어서 상기 세포에서 hKlf4, hOct3/4 및 hSox2의 발현을 위한 폴리시스트론 벡터를 포함하는 계산된 부피의 사이토튠 센다이 바이러스와 배양하였다(라이프테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재). 처리된 T 세포를 24 웰 플레이트에 시딩하고, 실온에서 90분 동안 2250 rpm에서 원심분리시켰다. 추가로 1 ㎖의 완전 T 세포 배지를 각 웰에 가하고 상기 플레이트를 5% CO2의 가습 분위기하에 37 ℃에서 밤새 배양하였다.
형질도입 후 당일에, 센다이 바이러스를, 상기 T 세포를 신선한 완전 배지로 세척하고 상기 세포를 2일 동안 배양함으로써 제거하였다. 배지는 매일 절반 교환하였다. 감염 후 3일째에, 세포를 MEF 피더 플레이트로 옮기고 어떠한 사이토킨도 없이 T 세포 배지에서 배양하였다. 감염 후 4일째에, 상기 세포를 표준 hES 배지에서 배양하였다. 배지를 매일 교환하였다. ES-형 콜로니가 7일째 부근에서 관찰되었다. 상기 세포를 15일째부터 hES 순화 배지에서 배양하고 추가로 10일 동안 배양을 계속하였다. 콜로니를 형질도입 후 약 25 내지 30일째에 채취하였다.
대략 4일째에, 세포 덩어리가 피더 세포상에 형성되었으며, 이는 상기 재프로그램화 과정의 개시를 암시하였다. T 세포는 iPSC로의 재프로그램화 과정 동안 극적인 형태 변화를 겪었다(도 44A). 대략 12일째에, 느슨한 테두리를 갖는 큰 세포 덩어리가 나타나기 시작하였다. 대략 18일째에, 세포는 충분히 한정된 테두리를 갖는 전형적인 ES-형 콜로니들로 형질전환되었다. FASneg T 세포는 그의 야생형 대응물의 약 5배의 효율로 iPSC로 재프로그램화되었다(도 44B). p53 결함 세포주는 세포사멸 경로의 장애로 인해 더 용이하게 재프로그램화되는 것으로 보고되었다. FAS 녹아웃은 유사한 기전을 사용하여 상기 재프로그램화 과정을 촉진할 수 있다.
CD3neg TCR 알파 또는 베타 쇄 녹아웃 T 세포로부터 재프로그램화된 iPSC의 ES-형 형태가 관찰되었다(도 45A). 상기 형태는 수회 계대 후에 일정하게 남아있었다. CD3neg T 세포의 재프로그램화는 야생형 대응물보다 약 5 배 덜 효율적었으며(도 45B), 이는 TCR 녹아웃이 T 세포 재프로그램화의 과정에 한 역할을 하거나 또는 센다이 바이러스 감염 후 세포 생육력에 영향을 미칠 수 있음을 암시한다. 도 45C는 CD3neg iPSC 세포의 포스파타제 염색을 나타내는 상들의 패널이다.
전형적인 배아 줄기세포 형태가 관찰되었으며, 이는 상기 FASneg, CD3neg TCR 알파 및 베타 쇄 녹아웃 T 세포가 한정된 재프로그램화 조건하에서 다능성 상태로 유도됨을 가리켰다. TCR 발현의 상실이 T 세포를 덜 건강하게 만들지만, 본 명세서에 기재된 데이터는 세포사멸이 재프로그램화 과정에 중요한 역할을 함을 암시한다.
내인성 다능성 줄기세포 유전자의 유도가 또한 상이한 T-iPSC 세포주에서 검출되었다(도 46). Tra-1-60 및 SSEA4 발현에 대한 면역염색이 상기 T-iPSC 세포의 줄기세포 표현형을 추가로 가리켰다(도 47A). Fas 녹아웃이 상거 서열분석에 의해 상기 T-iPSC에서 확인되었다(도 47B).
dCas9 및 FokI-Cas9가 적은 표적-외 활성을 갖는 것으로 보고되었다. T 세포를, 상기가 CRISPR/dCAS9 및 CRISPR/FokI-CAS9 시스템의 변형된 버전에 의해 편집될 수 있는지를 평가하였다(도 48A). 유식 세포측정 데이터는 1차 T 세포가 CRISPR/dCAS9 및 CRISPR/FokI-CAS9 모두에 의해 편집됨을 나타내었다(도 48B). 상기 CRISPR/dCAS9 유전자 녹아웃 시스템은 적어도 한 쌍의 gRNA와 함께 증대된 특이성을 나타내었으며, 이는 상기 녹아웃 사건을 보다 정확하고 보다 특이적으로 만든다.
T 세포에서 CRISPR/CAS9의 표적-외 사건을 시험하기 위해서, 측량자 분석을 표적-외 부위에서 수행하였다. 상기 시험된 유전자의 경우, 게놈 유전자좌에서 명백한 절단은 관찰되지 않았다(도 48C).
실시예 11: 복합 게놈 편집.
CART 세포를, 다수의 게놈 유전자좌를 동시에 붕괴시키는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용함으로써 생성시켰다. 상기 CART 세포는 동종이계 보편적인 CART 세포로서 사용하기 위한 내인성 TCR 및 HLA 부류 I(HLA-I) 분자의 발현에 결함이 있었다. T 세포 수용체(TCR) α 쇄, TCR β 쇄 및 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자를, 이들 유전자를 표적화하는 gRNA와 Cas9를 암호화하는 mRNA를 동시 전기천공시킴으로써 높은 효율로 붕괴시켰다. 보편적인 TCR 또는 CART 세포를, CAR의 렌티바이러스(LV) 전달 및 CRISPR RNA 전기천공을 병행함으로써 생성시켜 내인성 TCR 및 B2M 유전자를 동시에 붕괴시켰다. 또한, 내인성 PD1의 붕괴는 고형 종양 모델에서 CAR 요법의 효능을 증대시켰다.
gRNA의 수회 전달은 효과기 기능의 손상 없이 높은 효율로 인간 1차 T 세포에서 유전자를 붕괴시킨다.
효율적인 복합 게놈 편집이, TCR, HLA 및 다른 유전자 결핍된 보편적인 T 세포의 생성에 필요하다. CRISPR/gRNA PNA 전기천공을 최적화하여 T 세포에서 효율적인 유전자 붕괴를 성취하였다. 먼저, Cas9 및 gRNA를 시험관내 전사 시스템을 사용하여 생성된 RNA와 동시-전기천공시켰으며(도 49, 좌측), 전기천공에 의해 T 세포로 Cas9 mRNA 및 gRNA를 일시적으로 전달하기 위한 "치고 달리기" 전달 전략이 개발되었다(도 49, 우측).
단일 전기천공과 함께 TCR α 불변 영역(TRAC) 또는 β 불변 영역(TRBC)을 표적화하는 초기 실험은 각각 1% 내지 3% CD3-음성(CD3neg) T 세포를 생성시켰다(도 50A, 상부 그래프). 순한 저체온에의 일시적인 노출이 보다 효율적인 유전자 붕괴를 허용하는지의 여부를 판정하기 위해서, 세포를 37 ℃ 또는 32 ℃에서 편집하였다. TRAC 및 TRB의 CRISPR-매개된 붕괴는, T 세포를 Cas9/gRNA 동시-전기천공 후 32 ℃에서 24h 동안 배양시 4-배까지 증가하였다(도 50A, 하부 그래프). 최대의 붕괴 효율을 위한 Cas9:gRNA의 최적의 분자비는 1:1 내지 2:1이었으며, 유전자 붕괴 효율은 전기-전달된 RNA의 양과 상관되었다(도 51A).
mRNA와 비교시, gRNA는 보다 더 신속히 분해되기 쉬우며, 이는 상기 표적화 효율을 잠재적으로 제한한다. 따라서, gRNA의 수회, 연속적인 전기천공을 초기 Cas9/gRNA 전기천공 후에 시험하였다. 세 번째 gRNA 전기천공 후 세포의 82.4%가 CD3neg이었으므로, 단백질 수준에서 붕괴 빈도의 현저한 증가가 존재하였다(도 50B). 클론 서열분석은 상기 게놈 표적화 효율이 상기 세 번째 gRNA 전기천공 후 89.4%에 도달함을 나타내었다(도 51B). 측량자 분석은 gRNA의 세 번째 전기천공 후에(도 52), TRAC 및 TRBC의 게놈 유전자좌에서 각각 81.7% 및 49.3%의 절단율을 입증하였다.
상기 TRAC 및 TRBC 표적 부위에 인접한 상거 서열분석 데이터 중의 다중 피크는 상기 게놈 판독 프레임이 상기 표적 부위의 하류로 이동함을 입증하였다(도 53A). CRISPR/Cas9에 의해 매개된 NHEJ에 의해 야기된 삽입 또는 결실(인델)의 존재는 클론 서열분석에 의해 확인되었다(도 53B). 상기 TCR 붕괴된 TCR/CD3neg 집단을 CD3 음성 선택의 단일 단계에 의해 99% 이상(99.70±0.20%)까지 농축시켰다(도 54).
상기 TCR/CD3neg T 세포를 증대시키기 위한 방법을 개발하기 위해서, TCR/CD3neg T 세포를 HLA-A2 제한된 1G4 NY-ESO-1 TCR(α+β) RNA로 동시-전기천공시켜 CD3 발현을 복원시켰다(도 55, 좌측 패널). T 세포 자극/증대 방법에 이어서, 하기를 비교하였다: 1) 피더 세포로서 PBMC를 사용하여 빠른 T 세포 증대 프로토콜(REP), 2) 항-CD3/CD28 다이나비드(Beads), 또는 3) CD28 및 4-1BB(K562 aAPC)에 대한 리간드를 발현하는 OKT3 부하된 K562-기재 인공 항원-제공 세포. TCR/CD3neg T 세포를 또한 CD19 CAR RNA로 전기천공시키고(도 55, 우측 패널), 이어서 CD19를 발현하는 조사된 K562 aAPC(RK562-CD19)에 의해 자극하였다. 751.0±217.1, 35.7±9.3, 46.3±8.5 및 57.5±5.0의 증대 배수 값이 10일 동안 단일 자극 후에 각각 REP, Beads, K562 aAPC 및 K562-CD19에 대해 성취되었다(도 56).
CRISPR/Cas9 유전자 편집이 상기 T 세포의 표현형 및 기능에 영향을 미치는지를 시험하기 위해서, 상이한 방법들에 의해 증대된 TCR/CD3neg T 세포의 표현형을 조사하였으며, 상기 증대된 세포가 전부 CD3 음성으로 남아있고 대부분이 중심 기억 세포 표현형과 일관되게 높은 수준의 CD27(79.8% 내지 93.4%)을 유지함을 보였다(도 57). 상기 증대된 TCR/CD3neg T 세포를 두 번째로 CD19 CCAR mRNA로 전기천공시켜 그의 항-종양 활성을 시험하였다. 상기 TCR/CD3neg T 세포의 표면 CAR 발현은 대조군 그룹의 경우와 동등하였다(도 58). 상기 TCR/CD3neg CD19 CAR T 세포가 CD19+ Nalm6 백혈병 세포로 자극되었을 때, CD19 CAR+ TCR/CD3neg T 세포의 CD107a 상향-조절(도 59A), 사이토킨 분비(도 59C) 및 살해 활성(도 59B)은 야생형 대조군 세포의 경우와 동등하였다. 상기 CD19 CAR TCR/CD3neg T 세포를 Nalm6-함유 NSG 마우스에게 주입하여 그의 생체내 항-종양 활성을 시험하였다. 종양 퇴화는 상기 CART19 야생형 대응물 세포의 경우와 동등한 효능으로 자명하였다(도 59D 및 59E). 상기 결과는 내인성 TCR의 CRISPR/Cas9 편집이 입양 면역요법을 위한 1차 T 세포의 기능에 불리한 영향을 미치지 않았음을 암시한다.
TCRα,β 및 B2M 삼중-붕괴된 T 세포의 감소된 동종이계 반응성
TCR α 및 β 쇄 모두의 붕괴는 TCR-재지시된 T 세포 입양 면역요법을 위한 TCR 잘못 짝짓기-관련된 독성을 방지할 것을 요하며 B2M은 HLA-I 복합체의 조립 및 발현에 필수적이다. 이에 비추어, TCR α 및 β 쇄 및 B2M 삼중 붕괴가 보편적인 T 세포의 생성을 위해 개발되었다. 먼저, B2M을 붕괴시킴으로써 상기 T 세포상의 HLA-I 발현을 제거하는 능력을 시험하였다. T 세포를 B2M-표적화 Cas9/gRNA RNA로 전기천공시켰다. 이는 79.9%의 B2M 및 HLA-I 이중-음성 집단을 생성시켰다. 상기 HLA-Ineg 집단을 음성 선택에 의해 추가로 농축시킬 수 있었다(도 60).
TCR α, β 쇄 및 B2M이 없는 삼중-녹아웃 T 세포를 생성시키기 위해서, Cas9 mRNA를 TRAC, TRBC 및 B2M을 표적화하는 3개의 상이한 gRNA와 동시-전기천공시켰다. 그 결과, CD3 및 HLA-I 이중-음성 세포 집단은 65.4%였다(도 61). 상기 이중 및 삼중 녹아웃 세포의 농축 후에, 상기 TCR α 및 β 쇄 및 B2M 삼중-녹아웃 T 세포는 HLA 불합치된 종양 세포주의 비-특이적인 살해를 없앴다(도 62). 이들 세포를 IFNγ 엘리스폿 분석에서 동종이계 전혈 조사된 PBMC에 의해 공격했을 때 반응이 관찰되지 않았다(도 63, 좌측 패널). HLA-I 분자의 제거가 또한 조사된 B2M-붕괴된 세포와 동종이계 PBMC와의 공-배양에 의해 확인된 바와 같이 상기 동종-반응성을 급격히 감소시켰다(도 63, 우측 패널). 상기 결과는 TCR α 및 β 쇄 및 B2M이 없는 삼중-음성 T 세포가 입양 면역요법을 위한 보편적인 T 세포의 공급원으로서 잠재적으로 작용할 수 있고, 이는 이식편 대 숙주 병을 야기할 수 없으면서 숙주 면역계에 의한 거부에 저항함을 암시한다.
TCR 재지시된, 내인성 TCR-붕괴된 T 세포의 개선된 항-종양 활성.
TCR α 및 β 쇄의 CRISPR/Cas9-붕괴를 갖는 T 세포는 NY-ESO-1 TCR(1G4)로 재지시된 후에 세포 표면상에서 상승된 트랜스제닉 TCR 발현을 나타내었다. 트랜스제닉 TCR 발현은 야생형 T 세포의 46.8%에 비해, TCR α 또는 β 쇄 단일 녹아웃 또는 α/β 이중 녹아웃에 대해서 각각 67.6%, 78.8% 또는 94.3%였다. 상기 개선된 트랜스제닉 TCR 발현은 증가된 항원-특이성 CD107a 발현(도 65A), 및 특히 α/β 이중-녹아웃 T 세포에 대해 증대된 세포독성(도 65B)에 의해 입증된 바와 같이, 증대된 T 세포 기능을 유도하였다.
별도의 실험에서, α/β 이중-녹아웃 T 세포를 상이한 NY-ESO-1 TCR(8F)로 형질감염시켰다. 1G4 TCR에 비해, 상기 8F TCR은 트랜스제닉 TCR 발현(도 66; TCR/CD3neg에 대해 60.1% 대 야생형 T 세포(Cas9 Mock T 세포)에 대해 44.7%(∼5% 내인성 TCR Vβ8 배경)) 및 기능(도 67A에서 CD107a 발현, 및 도 67B에서 사이토킨 생성) 모두에서 보다 큰 현저한 개선을 나타내었다. 이들 결과는 트랜스제닉 TCR 발현 및 기능에 대한 내인성 TCR의 차별적인 영향을 강조한다.
보편적인 CART 세포는 항종양 효능을 유지하며 GVHD를 야기하지 않는다.
보편적인 CD19 CART 세포를, Cas9/gRNA의 RNA 전기천공과 CD19 CAR의 LV 형질도입의 병행에 의해 생성시켰다(도 68). 상기 세포를 증대시켰으며 남은 CD3neg 세포는 높은 수준의 CD19 CAR 발현을 가졌다(도 69). 상기 증대된 T 세포의 대부분은 CD45RO 양성이었으며, 중심 기억 세포 병증과 일관되게 높은 수준의 CD62L 발현 및 중간 수준의 CD28 발현을 유지하였다(도 70). 상기 증대된 TCR/HLA-I 이중-음성 CD19 CART는 확고한 시험관내 항-종양 활성, 예를 들어 CD107a 방출(도 71), 사이토킨 분비(도 72), 용해 능력(도 73) 및 증식(도 74)(야생형 CD19 CART 세포의 경우만큼 효능이 있었다)을 나타내었다.
상기 T 세포를 전이된 Nalm6 백혈병을 갖는 NSG 마우스내에 주입하였다. 붕괴된 내인성 TCR(LV-CD19 CAR TCRneg) 또는 TCR 및 HLA-I(LV-CD19 CAR TCR/HLA-Ineg)의 동시 붕괴를 갖는 CART 세포로 처리된 마우스는 야생형 CD19 CART 세포(LV-CD19 CAR)로 처리된 마우스의 경우와 유사한 종양 퇴화를 나타내었으며(도 75A 및 75B), 이는 TCR 단독 또는 B2M과의 붕괴가 CART 세포 항-종양 활성에 영향을 미치지 않았음을 암시한다.
상기 조작된 T 세포의 GVHD 효과를 시험하기 위해서, 고 T 세포 용량(20x106/마우스)을 Nalm6 백혈병을 갖는 NSG 마우스에게 제공하였다. 도 76에 나타낸 바와 같이, TCR 붕괴 단독(LV-CD19 CAR TCR/CD3neg) 또는 TCR 및 B2M의 동시 붕괴(LV-CD19 CAR TCR/HLA-Ineg)를 갖는 CD19 CART 세포로 처리된 마우스는 야생형 CD19 CAR T 세포(LV-CD19 CAR)의 경우에 비해 유사한 종양 퇴화를 나타내었다. 이중 또는 삼중 녹아웃 CAR T 세포로 처리된 마우스는 GVHD의 어떠한 징후도 나타내지 않았다. 대조적으로, 야생형 CD19 CART(LV-CD19 CAR) 그룹으로부터의 4마리 마우스 중 3마리는 65일째에 GVHD를 나타내었으며, 이는 상이한 기관의 조직 검사에 의해 확인되었다. 따라서, TCR 단독 또는 HLA-I와의 붕괴는 동종이계 반응성을 제거하면서 CART 세포의 생체내 항-종양 활성에 영향을 미치지 않았다.
1차 T 세포내로의 아데노바이러스 CRISPR 전달.
CRISPR/Cas9 시스템은 모델 유기체 및 세포주에서 유전자 조절 및 유전자 편집 목적에 빠르게 견인되고 있는 중이다. 바이러스 벡터가 CRISPR의 다른 세포 유형, 예를 들어 분열 및 침묵 1차 세포에의 적용성을 확장시키기에 특히 적합할 수 있다. Cas9 및 단일 안내 RNA(gRNA) 분자를 암호화하는 아데노바이러스, 즉 2-세대 섬유-변형된 아데노바이러스가 Cas9 뉴클레아제를 PD1, Fas 및 TRAC 유전자좌로 가져가는데 사용되었다(도 77). CRISPR의 종양 세포내로의 아데노바이러스-매개된 형질도입(도 78)은 약 71% 이하의 높은 비율의 표적화된 변이도입을 제공하였다(도 79A 및 79B). 아데노바이러스는 그의 침묵 상태과 관계없이 CRISPR의 인간 T 세포내로의 도입에 귀중한 플랫폼을 구성하는 듯하다. 이러한 접근법은 다수의 실험 상황에서 CRISPR 유전자 조절 및 편집에 대한 가능성을 조사하는데 일조할 것이다.
전기천공 최적화.
CD3 및 B2M 녹아웃 효율 및 T 세포 증대를 4 ㎜ 큐벳 및 2 ㎜ 큐벳에서 Cas9 및 gRNA 전기천공(EP) 후에 평가하였다. 2 ㎜ 큐벳을 사용하는 표준 EP 조건(360 v/1ms, 1차 EP - 20 ㎍ Cas9 RNA + 10 ㎍ gRNA/100 ㎕ T 세포, 2차 EP 5 ㎍ gRNA/100 ㎕ T 세포)은 약 18.8 배 증대의 대조군 EP T 세포(EP#12)에 비해, 약 2.7 배(EP#1)의 T 세포 증대와 함께, 각각 81.8% 및 88.6%의 최고의 CD3 및 B2M 녹아웃 비율을 나타내었다. 상기 gRNA 용량(EP#2-5)의 감소는 T 세포 증대를 대단히 증가시켰지만, CD3 및 B2M 녹아웃 효율은 단지 약간 영향을 미쳤다. 도 80을 참조하시오. 4 ㎜ 큐벳을 사용하는 표준 EP 조건은 CD3 및 B2M 녹아웃 효율(EP#8)을 대단히 감소시켰으며, 이는 상기 EP 조건(전압 및/또는 펄스 길이)이 4 ㎜ 큐벳의 사용을 위해 추가로 최적화될 필요가 있음을 암시한다.
2 ㎜ 큐벳(EP#10-13) 또는 4 ㎜ 큐벳에서의 표준 전기천공(EP) 조건들을 비교하였다. 높은 CD3/B2M 녹아웃 효율이 개선된 T 세포 증대 배수(EP#1 및 5)와 함께 관찰되었다. 도 81을 참조하시오.
60% 이상의 CD3/B2M 녹아웃 효율과 함께 최대의 T 세포 증대 배수를 성취하기 위해 EP 조건을 추가로 최적화하기 위해서, 상이한 EP 조건 및 RNA 양을 시험하였다. 상기 결과는 증대 배수가 EP#4에 대해서, EP#1의 경우(400v/2ms/120㎍ CAS9 RNA) 및 EP#2의 경우(500v/1ms/20㎍ gRNA) 비교적 높은 CD3/B2M 녹아웃 효율(CD3의 경우 63.5% 및 B2M의 경우 84.8%)로 개선됨을 나타내었다.
추가적인 실험을 수행하여 EP 조건들을 최적화하였다. 결과는 시험된 가장 유리한 조건에 비해(도 82에서 EP#1), 생성된 500v/1ms/120㎍ CAS9 RNA(EP#1) 및 500v/1ms/20㎍ gRNA(EP#2)의 사용이 CD3/B2M 녹아웃 효율 및 T 세포 증대(EP#3)를 증가시킴을 보였다. 도 83을 참조하시오.
대규모 전기천공 및 증대
대규모 전기천공이 높은 녹아웃 및 증대 효율을 제공할 수 있는지를 판정하기 위해서 실험을 수행하였다. 0일째에, 항-CD3/항-CD28 비드를 사용하여 3명의 공여자로부터 수득된 T 세포(100x106 세포/공여자, 0.5x106/㎖로 농축됨)를 자극하였다. 1일째에, 자극된 T 세포를 CD19 CAR 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 50 ㎖(25x106 세포)의 T 세포를 변형되지 않은 T 세포(그룹 9)로서 확보하였다. 3일째에, 상기 비드를 제거하고, 각각의 공여자로부터의 형질도입된 T 세포를 2개의 그룹, CART/mock EP(10 ㎖, 50x106) 및 CART/CRISPR(10 ㎖, 50x106)으로 분리하였다. 이어서 상기 세포를 CAS9 RNA(1차 EP)로 전기천공시키고, 그룹 1, 3, 5 및 7 세포를 분할하였다. 4일째에, 상기 gRNA를 T 세포내에 전기천공시키고 상기 세포를 1x106 세포/㎖로 배양하였다. 5일 및 7일째에, 상기 세포를 분할하였다. 8일째에, CD3+ 세포를 그룹 2, 4 및 6으로부터 제거하였다. 11일째에, 상기 T 세포를 수확하고 상기 3명의 공여자로부터의 25x105 세포를 염색체분석을 위해 발송하였다.
실험그룹
그룹# 공여자 T 세포
1 ND391 CART/MOCK EP
2 ND391 CART/CRISPR
3 ND463 CART/MOCK EP
4 ND463 CART/CRISPR
5 ND463 UNMOD
6 ND469 CART/MOCK EP
7 ND469 CART/CRISPR
T 세포 수(도 85의 상부 차트) 및 증대 배수(도 85의 하부 차트)를 전기천공 및 배양 과정 후에 평가하였다. CD19 CAR 단독(TD 단독)으로 형질도입되었거나 또는 CD19 CAR로 형질도입되고 CRISPR로 편집된(TD/KO) T 세포의 증대 배수를 도 86의 좌측 그래프에 나타내고 10일째의 상기 T 세포의 증대 배수를 도 86의 우측 그래프에 나타낸다. 전기천공 조건 및 CAS9/gRNA 용량을 최적화함으로써, 대략 60 내지 70% CD3/B2M 녹다운 효율 및 대략 30배의 T 세포 증대가 10일 후에 관찰되었다(도 87은 10일째에 CD3/B2M/CAR 발현을 나타낸다).
CD3/CD28 비드 자극 및 CRISPR RNA 전기천공 후 8일째에, CD3 양성 T 세포를 제거하였다. 도 88은 8일째에 3명의 공여자 집단에서 CD3/B2M 발현을 나타낸다. 11일째에, T 세포에 FACS 염색을 가하여 CD3, B2M 및 CAR 발현을 검출하였다. 형질도입되지 않은(NOTD) ND463을 음성 대조군으로서 사용하였다. 도 89는 CD19 CAR TD(형질도입된)/CRISPR 전기천공된, CD3 고갈된 T 세포; CD19 CAR TD/CRISPR 전기천공된 T 세포; 및 CD19 CAR TD T 세포에서 CD3/B2M 발현을 나타낸다. 도 90은 CD19 CAR TD/CRISPR 전기천공된, CD3 고갈된 T 세포; CD19 CAR TD/CRISPR 전기천공된 T 세포; 및 CD19 CAR TD T 세포에서 CAR 발현을 나타낸다. 도 91은 CD19 CAR TD(형질도입된)/CRISPR 전기천공된, CD3 고갈된 T 세포; CD19 CAR TD/CRISPR 전기천공된 T 세포; 및 CD19 CAR TD T 세포에서 11일째에 CD3/B2M/CAR 발현을 나타낸다. 도 92는 상이한 T 세포 그룹들에서 CD3/B2M/CAR 발현을 요약한다.
11일째에 도 93에 나타낸 바와 같이, 상이한 T 세포 그룹들을 CD19 양성 세포주, 라지 또는 Nalm6에 의해 자극하였다. K562를 CD19 음성 대조군으로서 사용하였다. 공배양 4시간 후에, CD107a 상향-조절이, 음성 대조군을 제외하고, 상기 각각의 T 세포 그룹에서 검출되었다.
11일째에, 도 94에 나타낸 바와 같이, 상기 T 세포의 살해 능력을, 상기 T 세포를 CD19 양성 표적 세포, Nalm6-CBG와 공배양 후에 발광 세포독성 림프구(CTL) 분석을 사용하여 시험하였다. 또한 11일째에, 상기 T 세포의 사이토킨 생성을 Nalm6 표적 세포로 상기 T 세포 그룹을 자극함으로써 분석하였다. 도 95를 참조하시오.
상기 T 세포를 26일까지 100 U/㎖의 IL-2를 함유하는 배지에서 배양하였다. 도 96에 나타낸 결과들은 비정상적인 T 세포 성장이 상기 3명의 공여자로부터의 CRISPR 편집된 T 세포에 대해 관찰되지 않았음을 가리킨다.
상기 CRISPR/Cas9 시스템의 가장 매력적인 용도 중 하나로서, 복합 게놈 편집은 T 세포-기재 입양 면역요법의 진보에 큰 가능성을 갖는다. 그러나, DNA 형질감염의 낮은 표적화 효율은 1차 T 세포에서 복합 게놈 조작의 사용을 제한한다. "치고 달리기" 전달 전략이 Cas9 mRNA 및 gRNA의 동시-전기천공을 통해 CRISPR을 T 세포에 도입시키기 위해 개발되었다. 순한 저체온에의 일시적인 노출과 함께 3 라운드 이하의 gRNA 전기천공의 병행을 통해, 단백질 수준에서 >80%의 표적화 효율이 단일 유전자 붕괴에 대해서 통상적으로 성취되었다. 보다 고무적으로, TRAC, TRBC 및 B2M의 삼중 유전자 붕괴는 어떠한 정제 및 선택 없이 이중 음성 CD3 및 HLA-I를 약 65%로 제공하였다. 상기 결과는 또한 유전자-붕괴된 T 세포의 >99% 순도로의 농축이 임상적으로 승인된 상자성 비드를 사용하여 쉽게 성취되었으며 상기 정제된 T 세포가 10일 동안 500배까지 증대되었음을 입증한다. 상기 증대된 T 세포는 그의 유전자 붕괴 표현형을 유지하였으며 중심 기억 T 세포와 일관되는 특징들을 나타내었다. 상기 붕괴된 T 세포는 GVHD를 유발하지 않았으며, 이는 상기가 동종이계 CAR T 세포로서 사용될 수 있음을 암시한다. 중요하게, 상기 유전자-편집된 T 세포는 시험관내 및 상이한 종양 마우스 모델 모두에서 효능 있거나 또는 비-유전자 편집된 T 세포보다 더 효능 있는 항-종양 활성을 나타내었다. 따라서, 합성 세포를 생성시키기 위한 본 명세서에 기재된 방법을 현행 GMP-순응 제조 과정으로 쉽게 이행할 수 있었다.
본 명세서에 기재된 데이터는 CRISPR/Cas9가 1차 인간 T 세포에서 강력한 복합 게놈 편집 도구임을 입증한다. 선행의 보고서들은 T 세포가 ZFN 또는 TALEN에 의해 유전적으로 편집되어 내인성 TCR α 및 β 쇄의 발현을 제거하여 GVHD를 피할 수 있음을 입증하였다. T 세포에서 아연 집게 뉴클레아제(ZFN) 및 TAL 효과기 뉴클레아제 TALEN에 의한 다수 유전자의 조작을 위한 표적화 전략의 복잡성으로 인해, 선행의 연구들은 GVHD 및 이식편 대 숙주 반응을 전임상 동물 모델에서 동시에 예방할 수 없었다. NK 세포 활성화는 또한 CRISPR/Cas9에 의한 자극성 NK 리간드의 제거에 의해서 또는 비표준적인 HLA 부류 I 분자, 예를 들어 HLA-E(NK-세포-매개된 거부로부터 보편적인 T 세포를 잠재적으로 보호할 수 있었다)의 발현에 의해 저지될 수 있다.
요약하면 효능 있는 항-종양 활성 및 감소된 동종이계 반응성을 갖는 임상 규모의 보편적인 CART 세포는 복합 CRISPR 기술을 사용하여 효율적으로 생성될 수 있다. 상기 접근법을 현행 GMP-순응성 제조 과정에 통합시킬 수 있으며 이는 높은 이행 가능성을 가져, HIV/AIDS에 대한 ZFN에 의한 입양 이식 요법의 성공적인 이행을 제공한다. 보편적인 CAR 및 TCR T 세포는 자기유래 T 세포에 대한 대안을 제공하는 것이 가능하다. 실제로, 무능력한 검사점 분자를 갖는 보편적인 CAR 및 TCR T 세포가 암 및 감염성 질병에 대해 자기유래 T 세포를 사용하는 현행 CART 요법보다 더 유효하고 더 널리 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
다른 실시태양들
본 명세서의 변수의 임의의 정의에서 요소들의 목록의 인용은 임의의 단일 요소 또는 나열된 요소들의 임의의 조합(또는 하위조합)으로서의 상기 변수의 정의를 포함한다. 본 명세서의 실시태양의 인용은 상기 실시태양을 임의의 단일 실시태양으로서 또는 임의의 다른 실시태양들 또는 그의 일부와의 조합으로서 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원, 및 공보의 명세는 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다. 본 발명을 특정한 실시태양들을 참조하여 개시하였지만, 본 발명의 다른 실시태양 및 변화들이 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 당해 분야의 숙련가들에 의해 고안될 수 있음은 자명하다. 첨부된 특허청구범위를, 모든 상기와 같은 실시태양 및 동등한 변화를 포함하는 것으로 해석하고자 한다.
SEQUENCE LISTING <110> The trustees of the university of pennsylvania <120> ALTERING GENE EXPRESSION IN CART CELLS AND USES THEREOF <130> IPA170382-CN <150> 62/073,651 <151> 2014-10-31 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 1 tgtgctagac atgaggtcta 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 2 gcagtatctg gagtcattga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 3 cgcgagcaca gctaaggcca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 4 ggcgccctgg ccagtcgtct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 5 gagggtccag atgcccagca 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 6 tcatgtccta accctgatcc tctt 24 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 7 ttggactttt cccagctgac aga 23 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 8 taccaggacc agacagctct taga 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 9 tctcacctaa tctcctccag gcat 24 <210> 10 <211> 54 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 10 rargrgrarg rgrarururc rgrgrararc rcrcrararu rcrarcrurg rarc 54 <210> 11 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 11 rcrargrurg rarururgrg rgrururcrc rgrararurc rcrurcct 48 <210> 12 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 12 rarcrcrurc rcrururcrc rcrarururc rarcrcrcra rcrcrargrc rurc 54 <210> 13 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 13 rgrcrurgrg rurgrgrgru rgrararurg rgrgrararg rgrarggt 48

Claims (38)

  1. TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, HLA 분자, CTLA-4, PD1, 및 FAS로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 내인성 유전자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산; 및
    항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 보조-자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산
    을 포함하는 변형된 T 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산이 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, siRNA, shRNA, 및 CRISPR 시스템으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  3. 제2항에 있어서,
    CRISPR 시스템이 pAd5/F35-CRISPR 벡터를 포함하는 변형된 T 세포.
  4. 제1항에 있어서,
    CAR의 항원 결합 도메인이 단클론 항체, 다클론 항체, 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단일 도메인 항체, 단쇄 가변 단편, 및 그의 항원 결합 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 항체를 포함하는 변형된 T 세포.
  5. 제1항에 있어서,
    CAR의 항원 결합 도메인이 표적 세포상의 항원에 특이적으로 결합하는 변형된 T 세포.
  6. 제1항에 있어서,
    CAR의 세포내 도메인이 이중 신호전달 도메인을 포함하는 변형된 T 세포.
  7. 제1항에 있어서,
    보조-자극 분자를 암호화하는 외인성 핵산을 추가로 포함하는 변형된 T 세포.
  8. 제7항에 있어서,
    보조-자극 분자가 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 변형된 T 세포.
  9. 제8항에 있어서,
    CD3이 적어도 2개의 상이한 CD3 쇄를 포함하는 변형된 T 세포.
  10. 제9항에 있어서,
    상이한 CD3 쇄가 CD3 제타 및 CD3 입실론 쇄인 변형된 T 세포.
  11. 변형된 T 세포의 생성 방법으로서,
    TCR α 쇄, TCR β 쇄, 베타-2 마이크로글로불린, HLA 분자, CTLA-4, PD1, 및 FAS로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 내인성 유전자의 유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산을 T 세포내에 도입시키고;
    항원 결합 도메인, 막관통 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 도입시킴
    을 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    유전자 발현을 하향조절할 수 있는 핵산이 안티센스 RNA, 안티고머 RNA, siRNA, shRNA, 및 CRISPR 시스템으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    CRISPR 시스템이 pAd5/F35-CRISPR 벡터를 포함하는 방법.
  14. 제11항에 있어서,
    CAR의 항원 결합 도메인이 단클론 항체, 다클론 항체, 합성 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 단일 도메인 항체, 단쇄 가변 단편, 및 그의 항원 결합 단편으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 항체를 포함하는 방법.
  15. 제11항에 있어서,
    CAR의 항원 결합 도메인이 표적 세포상의 항원에 특이적으로 결합하는 방법.
  16. 제11항에 있어서,
    CAR의 세포내 도메인이 이중 신호전달 도메인을 포함하는 방법.
  17. 제11항에 있어서,
    T 세포를 말초 혈액 단핵세포, 제대혈 세포, T 세포의 정제된 집단, 및 T 세포주로 이루어지는 그룹으로부터 수득하는 방법.
  18. 제11항에 있어서,
    T 세포를 증대시킴을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    T 세포의 증대 단계가, T 세포를 flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 인자와 배양시킴을 포함하는 방법.
  20. 제11항에 있어서,
    T 세포를 냉동보존함을 추가로 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    핵산을 T 세포에 도입시키기 전에 냉동보존된 T 세포를 해동시킴을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제11항에 있어서,
    핵산의 도입을, 증대된 T 세포의 형질도입 (transduction), 증대된 T 세포의 형질감염 (transfection), 및 증대된 T 세포의 전기천공으로 이루어지는 그룹 중에서 선택하는 방법.
  23. 제11항에 있어서,
    보조-자극 분자를 암호화하는 RNA를 T 세포내에 전기천공시킴을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    보조-자극 분자가 CD3, CD27, CD28, CD83, CD86, CD127, 4-1BB, 4-1BBL, PD1 및 PD1L로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  25. 제11항에 있어서,
    T 세포에서 Klf4, Oct3/4 및 Sox2를 발현시켜 상기 T 세포의 다능성을 유도함을 추가로 포함하는 방법.
  26. 증진된 면역과 관련된 질병 또는 병증의 치료가 필요한 피험자에게 유효량의 제1항의 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자의 치료 방법.
  27. 피험자에게 치료 유효량의 제1항의 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 병증을 치료하는 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    병증이 자가면역 질병인 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    자가면역 질병이 후천성 면역결핍 증후군(AIDS), 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 애디슨병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 내이병(AIED), 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 베체트병, 심근병증, 셀리악 스프루-포진형 피부염; 만성 피로 면역 기능장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 말초신경병증(CIPD), 반흔성 유천포창, 한랭응집소증, 크레스트 증후군, 크론병, 디고스병, 소아-피부근염, 원판성 루푸스, 본태성 혼합 저온글로불린혈증, 섬유근육통-섬유근염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신장병증, 인슐린-의존성 당뇨병, 소아 만성 관절염(스틸병), 소아 류마티스성 관절염, 메니에르병, 혼합 결합조직병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발성 근염 및 피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스성 발열, 류마티스성 관절염, 유육종증, 피부경화증(진행성 전신 경화증(PSS), 또한 전신 경화증(SS)으로서 공지됨), 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 타카야수 동맥염, 측두동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증, 베게너 육아종증, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  30. 제27항에 있어서,
    병증이 암인 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    암이 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 폐암, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법.
  32. 피험자에게 유효량의 제1항의 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 피험자에서 표적 세포 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 자극하는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    표적 세포 또는 조직의 용해를 유도함을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    유도된 용해가 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)인 방법.
  35. 입양 세포 전달 요법이 필요한 피험자에게 유효량의 제1항의 변형된 T 세포를 포함하는 약학 조성물을 투여하여 상기 피험자에게 불리한 면역 반응을 예방하거나 치료함을 포함하는, 입양 세포 전달 요법을 위한 방법.
  36. 면역 반응의 치료가 필요한 피험자에서 면역 반응의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 제1항의 변형된 T 세포의 용도.
  37. 제11항의 방법에 따라 생성된 변형된 T 세포를 포함하는 조성물.
  38. 제11항의 방법에 따라 생성된 변형된 T 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
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