KR20170077600A - C형 간염 바이러스 항원 및 이에 대한 항체의 동시 진단을 위한 조성물, 키트 및 방법 - Google Patents

Abstract

HCV 코어 단백질의 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 HCV NS3의 C-말단 단편, 코어 단백질의 친수성 단편, NS4의 친수성 단편 및 NS5의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 이용하면 보다 간편하고 신속하게 개체의 HCV 항원 및 이에 대한 항체를 검출하여 C형 간염을 진단할 수 있다.

Description

C형 간염 바이러스 항원 및 이에 대한 항체의 동시 진단을 위한 조성물, 키트 및 방법{A composition, kit and method for concurrent detecting of Hepatitis C virus antigen and antibody thereto}

C형 간염 바이러스 항원 및 항체의 동시 진단을 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.

최근 의학에 연관된 여러 기초 학문들이 발전을 거듭하면서 인류에게 질병을 일으킬 수 있는 여러 전염성 병원균이 속속 밝혀지고 있다. 그 중 C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus: HCV)는 B형 간염바이러스와 더불어 국내뿐 아니라 세계적으로도 점점 문제가 되고 있다.

C형 간염 바이러스(HCV)에 감염되어 나타나는 C형 간염은 간에 염증이 발생하는 질환으로 C형 간염 바이러스에 감염된 환자의 혈액이 정상인의 상처 난 피부나 점막, 혈액을 통해 전염될 수 있다. C형 간염 바이러스의 감염은 대부분 감염 초기에 증상이 없으며 성인에게 감염된 경우 B형 간염 바이러스 감염과 달리 75% 이상에서 만성화된다. 국내 간경변증 환자의 약 12%, 간세포암 환자의 약 15%가 C형 간염 바이러스에 의해 질환이 발병되며 B형 간염 바이러스와 함께 만성간질환을 일으키는 주요 원인이다.

그러나 기존의 C형 간염 바이러스 진단 시약은 C형 간염 바이러스의 인체감염 후 검출하는데 상당한 시간이 소요되어 수혈을 위한 혈액 및 혈액 제재 등에 사용시 C형 간염 바이러스에 오염된 상태로 사용될 수 있다. 이에 대한 보완책으로 간염 분자 진단 등의 보조적 방법이 사용되고 있으나 이는 진단에 필요한 시약구입비 및 검색 시험자의 인건비, 기기 및 시설이 설치, 운영비 등의 제반 경비로 인하여 막대한 부담이 가중되고, 혈액 및 혈액 제재의 가격도 증가할 수밖에 없다.

따라서, 보다 간편하고 신속한 C형 간염 바이러스의 진단이 요구되고 있다.

일 양상은 HCV 코어 단백질의 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드 및 이에 대한 항체를 제공한다.

다른 양상은 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

다른 양상은 수탁번호 KCLRF-BP-00354 또는 KCLRF-BP-00355의 하이브리도마 세포 및 이에 의해 생산되는 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.

다른 양상은 HCV 코어 단백질의 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 HCV의 항원을 검출하기 위한 조성물 및 키트를 제공한다.

다른 양상은 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 HCV NS3의 C-말단 단편, 코어 단백질의 친수성 단편, NS4의 친수성 단편 및 NS5의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 HCV의 항원 및 항체를 동시에 검출하기 위한 조성물 및 키트를 제공한다.

다른 양상은 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 HCV NS3의 C-말단 단편, 코어 단백질의 친수성 단편, NS4의 친수성 단편 및 NS5의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 이용한 B형 및 C형 간염을 동시에 진단하기 위한 방법을 제공한다.

일 양상은 C형 간염 바이러스(hepatitis C virus: HCV) 코어 단백질로부터 선택된 아미노산 서열인 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.

상기 단편은 전체 단백질 또는 펩티드 아미노산 서열로부터 선택된 연속된 아미노산 서열일 수 있다.

"친수성"은 분자 또는 물질이 극성을 가져 물과의 친화력이 큰 것을 의미할 수 있으며 예를 들면, Kyte-Doolittle법(Kyte, J. and Doolittle, R. 1982,J. Mol. Bio. 157, 105-132)에 의해 결정될 수 있다. 친수성을 갖는 분자 또는 물질은 부분적으로 친수성을 갖고, 분자 또는 물질의 일부만이 물과 상호 작용할 수 있는 물질을 포함하는 것이며, 분자 또는 물질의 전체 부위가 친수성을 가질 필요는 없다. 예를 들면, 펩티드의 아미노산 서열에 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산, 세린, 트레오닌, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 글리신 및 프롤린을 포함하는 극성 아미노산이 포함되어 있는 경우 그 펩티드는 친수성을 가질 수 있으며, 펩티드의 아미노산 서열에 소수성 아미노산이 포함되어 있어도 친수성을 잃지 않을 수 있다. 펩티드의 일 영역이 소수성 아미노산으로 이루어진 영역이라 할지라도, 인접한 친수성 아미노산의 영향에 의해 친수성을 갖는 영역이 될 수 있다.

HCV의 유전자에는 구조 단백질인 코어, E1 및 E2, 비구조 단백질인 NS1, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B를 코딩하는 유전자가 포함되어 있다. 단백질 NS3는 두가지 구조 도메인, 즉, 바이러스성 폴리프로테인의 성숙에 속하는 활성화 세린 프로테아제 활성에 의해 부여된 N-말단 도메인, 및 바이러스성 게놈의 복제에서 역할을 하는 NTPase 활성과 관련된 헬리카제 활성을 포함하는 C-말단 도메인을 포함할 수 있다. 코어(Core) 단백질은 HCV ORF에 의해 암호화되는 최초의 구조 단백질로서 바이러스의 뉴클레오캡시드를 형성한다. 코어 단백질의 N-말단에는 염기성 아미노산이 풍부하여 친수성을 가질 수 있다. 단백질 NS4는 NS4A와 NS4B로 구분될 수 있다. NS4A는 NS3과 NS3-4A 세린 프로테아제를 형성할 수 있다. 단백질 NS5는 NS5A와 NS5B로 구분될 수 있으며, 인산화된 형태 또는 과인산화된 형태로 존재할 수 있다.

상기 단편은 코어 단백질의 N-말단으로부터 1번, 2번, 3번, 4번, 5번, 10번, 15번 또는 20번 아미노산부터 150번, 155번, 156번, 157번, 158번, 159번, 160번, 161번, 162번, 163번, 164번, 165번, 170번, 175번 또는 180번 아미노산까지의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면 상기 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCV 코어 단백질의 친수성 단편일 수 있다.

상기 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본래 단백질의 목적 기능 또는 특성, 예를 들면, 항원성을 실질적으로 변화시키지 않는 범위에서 적절하게 변형시킬 수 있다. 아미노산의 변형은 아미노산 잔기 치환체의 유사성, 예를 들면 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어지며, 이를 위해 아미노산의 소수성 인덱스(hodrophobic index)가 고려될 수 있다. 상기 변형은 예를 들면, 일부 아미노산의 치환, 결실, 부가 등일 수 있으며, 치환은 특히 보존적 치환일 수 있다. 용어 "보존적 치환"은 결과적인 분자의 생물학적 활성이 유의하게 변경시키지 않는 치환으로서, 치환되는 아미노산이 단백질의 3차 구조 또는 국부 전하 상태에 유의한 영향을 야기하지 않는 경우를 지칭한다. 분자 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환을 포함할 수 있다.

상기 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 각각 서열번호 1의 아미노산 서열에서 활성 부위 또는 항체 결합 부위의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 염기가 상이한 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 그 단편의 활성을 변화시키지 않는 범위 내에서 각각 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.

상기 폴리펩티드는 검출 가능한 표지가 부착된 것일 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 광학적 표지, 전기적 표지, 방사능 표지, 효소 표지, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 광학적 표지는 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오로레신 (fluorescein), 로다민, 시아닌, 금속 포르피린 복합체, Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다. 플루오레세인 염료의 예에는, 6-카르복실플루오레세인 (6-FAM), 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (TET), 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (HEX), 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시로다민 (JOE), 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인, 및 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인이 포함될 수 있다. 상기 효소 표지는 기질을 발색 물질로 전환하는 것일 수 있다.

다른 양상은 HCV 코어 단백질로부터 선택된 연속된 아미노산 서열을 갖는 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 용어, "항원 결합 단편(antigen binding fragment)"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 상기 항체 및 이의 항원 결합 단편은 HCV의 코어 단백질을 인식할 수 있어 HCV를 검출하는 데 이용할 수 있다.

용어, "특이적으로 결합(specifically binding)" 또는 "특이적으로 인식(specifically recognizing)"은 당업자에게 통상적으로 알려진 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 항원-항체 복합체를 형성할 수 있으며, 또한 면역학적 반응을 하는 것을 의미할 수 있다.

상기 항체에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 상기 폴리펩티드에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은 상기한 바와 같다.

다른 양상은 수탁번호 KCLRF-BP-00354 또는 KCLRF-BP-00355인 하이브리도마 세포를 제공한다.

일 구체예에서, 상기 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00354 또는 KCLRF-BP-00355인 하이브리도마 세포에서 생성되는 것일 수 있다. 상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이브리도마 세포는 면역원인 상기 폴리펩티드를 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.

상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 내지 300 ㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 1-5주마다 2-6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다. 피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3-10일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라서, 융합 촉진제의 존재하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다. 상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있다. 또한 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B 세포와 골수종세포를 1:1-20:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000-6,000의 PEG를 10-80%의 농도로 첨가하여, 30-37℃에서 1-10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있다. 최종적으로, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마에 대하여, 한계 희석 등의 방법에 의해 클로닝을 반복함으로써 선별될 수 있다. 한편, 상기 단일클론 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgE, IgA1, IgA5, 또는 IgD 타입일 수 있다.

상기 하이브리도마 세포에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 폴리펩티드 또는 항체에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은 상기한 바와 같다.

다른 양상은 HCV 코어 단백질로부터 선택된 아미노산 서열인 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체를 의미할 수 있다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 자연의 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라 당 또는 염기 부위가 변형된 그의 유사체(analogue)도 포함할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질 복합체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함할 수 있다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent condition) 하에서, 예를 들어, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미할 수 있다.

또한, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 부가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 80% 이상의 상동성, 90% 이상의 상동성 또는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 폴리펩티드의 제조는 상기 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 당해 기술분야에 공지된 유전자 조작 기술 및 화학적 합성을 통해 수행될 수 있다. 상기 유전자 조작 기술은 복제가능한 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 구축하여 상기 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키고, 숙주 세포를 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 방법을 포함할 수 있다.

따라서, 일 양상은 전술한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입시킨 재조합 발현 벡터를 구축하는 단계, 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계, 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포에서 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, HCV 코어 단백질로부터 선택된 연속된 아미노산 서열을 갖는 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로서, 숙주 세포 내에 도입되면 독립적으로 복제되어 벡터 및 내부에 삽입된 외래 DNA 등의 카피를 생산한다. 용어 "재조합 발현 벡터(recombinant expression vector)"는 특정 단백질의 증폭을 목적으로 내부에 외래 DNA 단편을 삽입시킨 벡터로서, 상기 외래 DNA 단편은 전술된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 발현 또는 클로닝을 목적으로 한 벡터 시스템의 구축 방법은 공지되어 있다.

상기 벡터는 본원에 정의된 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된(operably linked) 조절 서열을 포함할 수 있다. 용어 "조절 서열"은 코딩 서열의 발현을 수행하는데 필요한 핵산 서열을 지칭하며, 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르다. 용어 "작동가능하게 연결된(operatively linked)"은 상기 구성요소들이 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 기능적 결합 관계에 의한 병치(juxtaposition)를 의미할 수 있다.

상기 재조합 발현 벡터는 조절 서열 외에, 제한 효소 절단 부위, 약물 저항성 유전자와 같은 마커 유전자, 분비 신호 서열 또는 리더(leader) 서열 등을 추가적으로 포함할 수 있다. 제한효소 절단 부위는 제한효소에 의해 특이적으로 인식되어 절단되는 특정한 염기 서열을 지칭한다. 상기 절단 부위는 예를 들면, EcoRI, BamHI, HindⅢ, kpnⅠ, SalI, NotⅠ, PstⅠ, SmaⅠ, Xho I과 같은 제한효소에 의해 특이적으로 인식되는 서열일 수 있다. 상기 마커 유전자는 선택 표지로서 기능하며, 암피실린, 게나마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 및 테트라사이클린과 같은 약물의 내성 유전자일 수 있다. 상기 분비 신호 서열 또는 리더 서열은, 합성된 단백질을 세포 구획 (예를 들면, 주변 세포질 공간(periplasmic space))으로 향하게 하거나 세포외 배지로 분비하도록 유도하는 서열로, 전술된 폴리뉴클레오티드 서열의 코딩 서열에 첨가될 수 있다. 이와 같은 서열들은 도입되는 DNA, 숙주 세포의 종류, 배양 배지의 조건 등에 따라, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

상기 숙주 세포는 전술된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는 형질감염시켜 생성될 수 있다.

상기 숙주 세포는 상기 재조합 벡터를 안정화하고 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는, 당업계에 공지된 임의의 원핵 생물 또는 진핵 세포일 수 있다. 상기 원핵 생물은 단백질의 발현을 위해 DNA 또는 RNA 분자로 형질전환될 수 있는 박테리아를 지칭한다.

재조합 발현 벡터의 숙주 세포로의 형질전환은 예를 들면, DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAE-dextran mediated transfection), 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 칼슘 포스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 스크래프 로딩(scrape loading) 및 감염(infection) 등에 의해 수행될 수 있다.

숙주 세포의 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지 및 배양조건을 사용하여 수행될 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들면 LB 배지, Ham's F10 (Sigma), MEM (Minimal Essential Medium, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma)등이 이용될 수 있다. 필요한 경우, 호르몬 또는 기타 성장 인자, 염, 완충제, 뉴클레오티드, 항생제, 미량 원소 및 글루코오스 등이 공지된 적합한 농도로 보충될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 선택된 숙주 세포에 따라 당업자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

숙주 세포에 의해 발현된 폴리펩티드는 분비 신호 펩티드에 의해 세포 외로 분비될 수 있으며, 이 경우 배양액 또는 배지로부터 이를 회수함으로써 수득될 수 있다. 예를 들면, 배양 상청액을 시판되는 단백질 필터를 사용하여 농축시켜 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 그러나, 분비 신호 서열이 없이 발현된 경우, 상기 폴리펩티드는 세포 내 페리플라즘 공간에 존재하므로 세포 용해물(cell lysate)로부터 직접 수득될 수 있다. 페리플라즘 공간으로 분비되는 폴리펩티드를 단리시키는 공정은 공지되어 있으며, 일반적으로 미립자 파편(숙주 세포 또는 분해된 단편)을 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거할 수 있다.

선택적으로, 이러한 배양물로부터 수득된 폴리펩티드를 당업계에 공지된 방법에 의해 추가적으로 정제할 수 있다. 예를 들면, 회수되는 폴리펩티드에 따라, 상기 폴리펩티드는 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제), 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 분별 용해(예를 들면, 암모늄 술페이트 침전)와 같은, 통상의 단백질 정제 기술을 사용할 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 폴리펩티드, 항체 또는 하이브리도마 세포에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은 상기한 바와 같다.

다른 양상은 HCV 코어 단백질로부터 선택된 연속된 아미노산 서열을 갖는 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 개체의 HCV 항원을 검출 또는 C형 간염을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.

C형 간염은 HCV에 감염되었을 때 발생하는 간의 염증성 질환 및 이로 인한 급성 간염, 만성 간염, 간경변증 및 간암 등 다양한 양상의 질환을 포함한다. 또한 임상적 증상이 나타나지 않은 경우에도 HCV에 감염이 되어 있다면 C형 간염에 걸린 것으로 판단할 수 있다. C형 간염의 진단은 개체가 현재 또는 이전에 HCV에 감염이 되었는지를 결정하거나, 개체 중 HCV의 항원 또는 항 HCV 항체를 검출하거나, 개체 중 HCV가 존재하는지 결정하거나, 개체 중 HCV를 검출하는 것을 포함하는 의미일 수 있다.

상기 조성물은 항체를 액체 중에서 포함하는 액체 조성물일 수 있다. 상기 액체는 상기 항체를 용해시킬 수 있고 유지시킬 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 물, 또는 PBS와 같은 버퍼 용액일 수 있다. 상기 조성물은 상기 항체를 안정하게 유지하는 물질을 더 포함할 수 있다.

상기 진단의 대상이 되는 개체는 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 사람, 영장류, 마우스, 랫, 소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이 또는 그 조합일 수 있다.

다른 양상은, HCV 코어 단백질로부터 선택된 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체 및 비구조 단백질 3(non-structural protein 3: NS3)로부터 선택된 연속된 아미노산 서열이고 헬리카제 활성을 포함하는 NS3의 C 말단 단편, 코어 단백질로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편, NS4로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편 및 NS5로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 HCV의 항원 및 이에 대한 항체의 동시 검출용 조성물을 제공한다.

상기 단편은 전체 단백질 또는 펩티드 아미노산 서열로부터 선택된 연속된 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

C-말단 도메인은 NS3의 N-말단으로부터 150번 아미노산부터 C-말단 아미노산까지의 아미노산 서열, 160번 아미노산부터 C-말단 아미노산까지의 아미노산 서열, 170번 아미노산부터 C-말단 아미노산까지의 아미노산 서열, 180번 아미노산부터 C-말단 아미노산까지의 아미노산 서열, 185번 아미노산부터 C-말단 아미노산까지의 아미노산 서열, 160번 아미노산부터 620번 아미노산까지의 아미노산 서열, 또는 170번 아미노산부터 600번 아미노산까지의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 HCV NS3는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 HCV NS3의 헬리카제(helicase) 활성을 포함하는 C-말단 도메인일 수 있다.

상기 융합 폴리펩티드는 상기 HCV NS3의 C 말단 단편, 코어 단백질의 친수성 단편, NS4의 친수성 단편 및 NS5의 친수성 단편이 브릿지 아미노산 서열 또는 링커 아미노산 서열로 연결된 것일 수 있다. 상기 브릿지 아미노산 서열 또는 링커 아미노산 서열은 융합 파트너의 연결시 융합체에 유연성 또는 강직성을 제공할 수 있고, 따라서 융합 폴리펩티드 내의 각 단백질 단편들이 폴딩될 시, 또는 폴딩된 후에 서로의 단백질 구조에 미치는 영향을 줄이기 위해 삽입되는 서열일 수 있다. 또한 상기 브릿지 아미노산 서열 또는 링커 아미노산 서열은 각 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 연결을 용이하게 하기 위한 제한요소 인식 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 브릿지 또는 링커 아미노산 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 융합 폴리펩티드의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 상기 브릿지 아미노산 서열 또는 링커 아미노산 서열은 양쪽 말단에 세린, 및 중간에 글리신이 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 이상 삽입된 세린 및 글리신 서열일 수 있다.

상기 브릿지 아미노산 서열 또는 링커 아미노산 서열은 어느 한 단편의 C 말단 및 그 이후 연결되는 다른 한 단편의 N 말단 사이에 삽입될 수 있다. 또한 상기 브릿지 아미노산 서열 또는 링커 아미노산 서열은 NS3의 C 말단 단편의 C 말단 및 코어 단백질의 친수성 단편의 N 말단 사이에 삽입될 수 있다. 또한 상기 브릿지 아미노산 서열 또는 링커 아미노산 서열은 코어 단백질의 친수성 단편의 C 말단 및 NS4의 친수성 단편의 N 말단 사이에 삽입될 수 있다. 또한 상기 브릿지 아미노산 서열 또는 링커 아미노산 서열은 NS4의 친수성 단편의 C 말단 및 NS5의 친수성 단편의 N 말단 사이에 삽입될 수 있다.

상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCV NS3의 C 말단 단편, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 코어 단백질의 친수성 단편, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 NS4의 친수성 단편, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 NS5의 친수성 단편 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 브릿지 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한 상기 융합 폴리펩티드는 HCV NS3의 C 말단 단편, 코어 단백질의 친수성 단편, NS4의 친수성 단편, NS5의 친수성 단편 및 브릿지 아미노산 서열을 모두 포함하는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 2 내지 7의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열은 각각 서열번호 9 내지 서열번호 18의 염기 서열일 수 있다.

상기 융합 폴리펩티드는 HCV 항원 단백질에 대한 항 HCV 항체에 특이적으로 결합할 수 있으므로, 항 HCV 항체를 검출하여 C형 간염을 진단하는데 이용될 수 있다.

상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 폴리펩티드, 항체, 하이브리도마 세포 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은 상기한 바와 같다.

다른 양상은 HCV 코어 단백질로부터 선택된 연속된 아미노산 서열을 갖는 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 개체의 HCV 항원을 검출하기 위한 키트를 제공한다.

상기 HCV 항원을 검출하기 위한 키트는 C형 간염 진단 마커인 HCV 항원의 양을 측정함으로써 C형 간염을 진단할 수 있다. 상기 키트는 앞서 설명한 HCV 항원의 양을 측정할 수 있는 물질, 즉 HCV 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 뿐만 아니라, 그 키트가 이용하는 HCV 항원의 양을 측정하는 분석방법에 적합한 하나 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.

상기 키트는 HCV 항원에 대해 특이적으로 결합하는 항원, 항체, 항원 결합 단편, 폴리펩티드, 단백질, 또는 발색 효소 또는 형광 물질로 표지된 2차 항체 및 항체의 면역학적 검출을 위한 기질, 적합한 완충 용액을 포함할 수 있다. 상기 키트는 ELISA 법으로 HCV 항원의 양을 측정할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원과 항체의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원과 항체의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함할 수 있다.

상기 키트는 분석물을 포함하는 액체 시료가 적용되는 부위인 검체 패드, 상기 검체 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고, 골드 입자의 접합체가 이동가능하게 지지되어 있는 저장 패드로서, 상기 골드 입자의 접합체는 단백질 A와 골드 입자의 접합체이고, 상기 저장 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고 모세관 이동에 의하여 상기 액체 시료가 이동하는 크로마토그래피 막(membrane) 물질로서, 상기 저장 패드의 하류에 상기 융합 단백질이 비확산적으로 고정화되어 있는 검출 영역을 포함하는 크로마토그래피 막 물질; 상기 크로마토그래피 막 물질과 유체 소통가능하게 연결되어 있는 흡습 패드 및 상기 검체 패드, 저장 패드, 크로마토그래피 막 물질 및 흡습 패드를 지지하는 고체 지지체를 포함하는, HCV 검출용 키트일 수 있다. 본 발명의 키트에 사용되는 단백질 A와 골드 접합체는 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들면, 골드 콜로이드 용액을 만들고, 상기 용액 중의 골드를 단백질 A와 결합시킴으로써 제조될 수 있다.

다른 양상은, HCV 코어 단백질로부터 선택된 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체 및 NS3으로부터 선택된 연속된 아미노산 서열이고 헬리카제 활성을 포함하는 NS3의 C 말단 단편, 코어 단백질로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편, NS4로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편 및 NS5로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 HCV의 항원 및 이에 대한 항체의 동시 검출용 키트를 제공한다.

상기 키트에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 폴리펩티드, 항체, 하이브리도마 세포, 폴리뉴클레오티드 또는 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은 상기한 바와 같다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 시료와 HCV 코어 단백질로부터 선택된 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜 시료 중 포함된 HCV 항원과 상기 항체의 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 형성된 복합체의 수준을 측정하여 상기 시료 중 HCV 항원의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 시료 중 HCV 항원을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 항체는 HCV 항원과 결합하여 복합체를 형성할 수 있다. 상기 형성된 복합체의 수준을 측정하면 상기 시료 중 HCV 항원의 수준을 측정할 수 있다.

상기 복합체의 수준을 측정하는 것은 상기 항체 또는 HCV 항원에 특이적으로 결합하는 물질에 부착된 검출 가능한 표지로부터 나오는 신호를 검출함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 복합체의 수준을 측정하는 것은 복합체를 다시 분리하여 상기 항체 또는 HCV 항원의 수준을 측정하는 것, 항체 또는 HCV 항원에 특이적으로 결합하는 물질의 수준을 측정하는 것 또는 상기 복합체를 분리하지 않고 상기 항체 또는 HCV 항원의 수준을 측정하는 것일 수 있다.

상기 방법은 또한 상기 측정된 HCV 항원의 수준이 정상 대조군 또는 음성 대조군에서 측정된 동일한 항원의 수준보다 높은 경우, 개체가 HCV에 감염된 것으로 C형 간염에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 결정하는 단계는 상기 측정된 HCV 항원의 양이 정상 대조군 또는 음성 대조군에서 측정된 동일한 항원의 수준보다 같거나 낮은 경우 상기 개체는 C형 간염에 걸리지 않은 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 방법은 개체의 HCV 항원 수준이 정상 대조군 또는 음성 대조군에 비하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 또는 1000% 이상, 또는 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 이상 증가한 경우 상기 개체는 C형 간염에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

다른 양상은 개체로부터 분리된 시료와 HCV 코어 단백질로부터 선택된 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체 및 NS3으로부터 선택된 연속된 아미노산 서열이고 헬리카제 활성을 포함하는 NS3의 C 말단 단편, 코어 단백질로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편, NS4로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편 및 NS5로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 접촉시켜 시료 내 포함된 HCV 항원과 상기 항체의 제1 복합체 및 시료 내 포함된 항 HCV 항체와 상기 융합 폴리펩티드의 제2 복합체를 형성시키는 단계; 및 상기 형성된 제1 복합체 및 제2 복합체의 수준을 각각 측정하여 상기 시료 중 HCV 항원의 수준 및 상기 항 HCV 항체 HBV 항체의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 시료 중 HCV 항원 및 항 HCV 항체를 검출하는 방법을 제공한다.

상기 융합 폴리펩티드는 시료 중 포함된 이와 특이적으로 결합할 수 있는 물질과 결합하여 복합체를 형성할 수 있다. 상기 융합 폴리펩티드는 HCV 항원을 포함하므로 시료 중 항 HCV 항체가 포함되어 있다면, 이는 상기 융합 폴리펩티드과 특이적으로 결합하여 복합체를 형성할 수 있다.

상기 복합체의 수준을 측정하는 것은 상기 융합 폴리펩티드 또는 항 HCV 항체에 특이적으로 결합하는 물질에 부착된 검출 가능한 표지로부터 나오는 신호를 검출함으로써 이루어지는 것일 수 있다. 상기 복합체의 수준을 측정하는 것은 복합체를 다시 분리하여 상기 융합 폴리펩티드 또는 항 HCV 항체의 수준을 측정하는 것, 또는 융합 폴리펩티드 또는 항 HCV 항체에 특이적으로 결합하는 물질의 수준을 측정하는 것 또는 상기 복합체를 분리하지 않고 상기 융합 폴리펩티드 또는 항 HCV 항체의 수준을 측정하는 것일 수 있다.

상기 방법은 또한 상기 측정된 항 HCV 항체의 수준이 정상 대조군 또는 음성 대조군에서 측정된 동일한 항체의 수준보다 높은 경우, 개체가 C형 간염에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 결정하는 단계는 상기 측정된 항 HCV 항체의 양이 정상 대조군 또는 음성 대조군에서 측정된 동일한 항체의 수준보다 같거나 낮은 경우 상기 개체는 C형 간염에 걸리지 않은 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 방법은 개체의 항 HCV 항체 수준이 정상 대조군 또는 음성 대조군에 비하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 또는 1000% 이상, 또는 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 50배, 100배 이상 증가한 경우 상기 개체는 C형 간염에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩 (protein chip), 또는 그 조합으로 수행할 수 있다. 상기 형성된 복합체의 수준을 직간접적으로 측정함으로써, 시료 중 포함된 HCV 항원 또는 항 HCV 항체를 검출하여 개체의 C형 간염 유무를 진단할 수 있다.

상기 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 시료일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료는 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 림프액, 소변, 분변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 그들의 조합일 수 있다.

상기 HCV 항원을 검출하는 방법 및 항 HCV 항체를 검출하는 방법은 병렬적으로, 또는 순차적으로 수행할 수 있다.

상기 방법에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 폴리펩티드, 항체, 하이브리도마 세포, 폴리뉴클레오티드, 조성물 또는 키트에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은 상기한 바와 같다.

일 양상에 따른 HCV 코어 단백질의 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 HCV NS3의 C-말단 단편, 코어 단백질의 친수성 단편, NS4의 친수성 단편 및 NS5의 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 이용하면 보다 간편하고 신속하게 개체의 HCV 항원 및 이에 대한 항체를 검출하여 C형 간염을 진단할 수 있다.

도 1은 HCV 항원 항체 동시 진단 키트로 HCV 항원 및 항체 양성 15 검체를 검사한 결과를 나타낸다.
도 2는 HCV 항원 항체 동시 진단 키트로 HCV 항원 및 항체 음성 20 검체를 검사한 결과를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. HCV 코어 친수성 단편을 포함하는 재조합 HCV 항원을 이용한 HCV 코어 항체의 제조

1. HCV 코어 친수성 단편을 포함하는 재조합 HCV 항원의 제조

(1) HCV c160 항원 발현 플라스미드의 제조

표 1의 정방향 프라이머(서열번호 19) 및 역방향 프라이머(서열번호 20)와 Taq 폴리머라제 및 HCV 유전자를 가진 플라스미드를 이용하여, HCV 코어 단백질 중 친수성 단편 부분의 유전자를 합성하였다. 구체적으로, HCV 코어 유전자의 2 아미노산부터 161 아미노산에 해당되는 부위(서열번호 1)의 DNA 염기서열(서열번호 8)의 PCR 합성을 실시하였다. PCR은 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 결합 및 72℃에서 2분 을 1cycle 반응을 30회 반복하였으며, 사용한 올리고 프라이머들의 농도는 각각 50 pmole이었다. 각 합성 과정을 통해 증폭된 DNA들을 저융점 아가로즈(Low melting Agarose) 겔 전기영동으로 분리하고, 제한효소 BamHI(NEB R0136S, USA) 및 SalI(NEB, #R0138S, USA)으로 절단하였다. 이후, BamHI, SalI 처리한 pGEX-4t 발현 플라스미드를 상기 DNA들과 연결하여 재조합 발현 플라스미드 pHCV c160를 제작하였다.

[표 1]

(2) HCV c160 항원 발현 플라스미드로부터의 항원의 발현 및 정제

단백질 발현 플라스미드 pHCV c160를 대장균 BL21 균주에 형질전환 하였다. 상기 형질 전환된 균주를 암피실린 50 mg/㎖를 함유하는 LB배지(1% 펩톤 C, 0.5% 효모 추출물, 1% NaC1)에서 37℃로 배양하고, 흡광도(A600)가 0.5로 될 때 IPTG(isopropyl-thio-D-galactoside)를 1 mM농도로 첨가하여 다시 16시간 배양하였다. 각 시간별로 배양액 중 세포를 얻어 그 파쇄액으로 SDS 폴라이크릴 아미드 겔 전기 영동 및 웨스턴 블로팅을 실시하였고, HCV c160항원 단백질의 발현을 확인하였다. 이후 2L 배양 배지를 사용하여 상기 균주를 37℃의 발효기에서 2시간 정도 배양시키고 흡광도(A600)가 0.5일 때 IPTG를 3 mM농도로 첨가하였다. IPTG를 첨가한 후 6시간 동안 배양을 계속하여 HCV c160 단백질 발현을 유도하였고, 배양이 끝난 후에 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 인산염 완충액(pH 7.4)으로 2회 세척 후 초음파 분쇄기로 파쇄하였다. 파쇄된 균체 용액을 10,000g에서 30분간 원심분리 후 상층액의 가용성 단백질 부위만을 분리하였다. 항원이 함유된 상청은 0.45 ㎛ 필터(Sartorius stedim, Ministart)로 여과시킨 후 그 여과액을 평형액과 1:1 비율로 혼합하였다. 상기 혼합액을 글루타티온-레진 칼럼에 전량 로드하여 O.D₂₈₀=0.05 이하가 될 때까지 평형액으로 세척하였다. 이후 용출액으로 재조합 HCV c160 항원을 회수하였다.

2. HCV 코어 160 항체의 제조

(1) HCV 코어 160 항원 면역 마우스 제조

정제된 HCV c160 항원을 면역원으로 하여 6주령 암컷 BALB/c 마우스를 면역시켰다. 구체적으로, 200 μL/마리의 양으로 1주 간격으로 4회 복강 주사하였다. 마지막 복강주사 일주일 후 동일 항원을 인산염 완충용액(Phosphate buffered saline: PBS)에 20% 농도(v/v)로 희석하여 1일 간격으로 3회(20 ㎕/회) 꼬리 정맥에 주사하였다. 3회차 정맥 주사 후에는 꼬리 정맥에서 얻어낸 혈청으로 중간 역가 검사를 실시하였다. 역가 검사 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하였다.

(2) HCV 코어 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 제작

상기 선별된 마우스의 비장 세포를 떼어 70 μm 구멍크기의 세포 스트레이너(BD falcon사)를 통해 걸러내었다. 걸러진 비장 세포를 원심분리 하여 침전물을 획득하고, 적혈구 용해 버퍼(Red blood cell lysis buffer, Sigma)를 5 ml 섞어준 뒤 1분간 방치하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 비장 세포는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco)을 넣어 3회 세척하고 세포 계수를 실시하였다. 상기 비장 세포를 마우스 유래 골수종 세포인 SP2/0-Ag 14(ATCC CRL-1581) 세포주와 혼합비율 10:1(비장세포: SP2/0)이 되도록 섞어주었다. 혼합된 세포는 DMEM으로 2회 세척 후 PEG1500(Roche)를 사용하여 융합시켰다. 세포 융합은 PEG1500을 점적하여 시행하였고, 융합이 완료된 후 원심분리하여 침전물을 획득하였다. HAT(Gibco)와 항생제(Gibco), 소태아혈청(Fetal bovine serum, Hyclone)이 10% 첨가된 DMEM(이하, HAT 배지)과 잘 섞어준 뒤 200 ㎕/웰의 용량으로 96웰 조직 배양 플레이트에 분주한 뒤 3일간 배양기에서 성장시켰다.

(3) 하이브리도마 세포주 배양 및 융합 세포주 선별

융합이 완료된 세포주는 37℃, 5% 탄산가스 및 가습 조건이 유지되는 세포 배양기에서 성장시켰으며, 2일 간격으로 일주일 동안 HAT 배지를 교체하여 융합된 세포주를 선별하였다. HAT 배지로 선별이 완료된 세포주는 효소 연결 면역 흡광도 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 양성 클론을 선별하였다. 먼저 96 웰 조직 배양플레이트 각각의 웰에서 자라고 있는 융합된 세포주 배양액을 HCV 코어 항원이 2.5 μg/ml의 농도로 코팅된 96 웰 흡착 플레이트(Costar)에 100 ㎕/웰의 용량으로 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후 5회 세척하고 항 마우스 IgG HRP 콘주게이트와 항 마우스 IgM HRP 콘주게이트를 100㎕/웰의 용량으로 분주하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 30분 반응 후 5회 세척하고 기질액을 100 ㎕/웰의 용량으로 분주하여 15분간 발색반응을 시켰다. 마지막으로 반응정지액을 100 ㎕/웰의 용량으로 첨가하였다. 반응을 정지시킨 후 판독기에서 450nm 파장으로 흡광도를 측정하여 높은 수치를 나타내는 양성클론 mAb 항-HCV c160 #11, mAb 항-HCV c160 #75를 선별하였다. 선별된 양성 클론은 24 웰 조직 배양 플레이트로 옮긴 뒤 3일간 배양하고 상기와 동일한 방법으로 2차 선별을 하였다. 2차 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 최종 단일 양성 클론 후보군 HCV c160 #11, HCV c160 #75를 선별하였다. 최종 선별된 단일클론 항체 생산 하이브리도마를 mAb 항-HCV c160 (#11), mAb 항-HCV c160 (#75)으로 명명하고, 이를 한국 세포주 연구 재단(KCLRF)에 기탁하여 수탁 번호를 부여받았다. 상기 실시예에 따라 제조된 상기 하이브리도마 세포는 2015년 12월 10일자로 부다페스트 조약 하의 국제 기탁기관인 한국 세포주 연구 재단에 기탁하였다(수탁번호: #11 KCLRF-BP-00354 및 # 75 KCLRF-BP-00355). 한편, 기탁된 하이브라도마 세포는 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약의 규정에 따라 보관되고 상기 수탁 번호를 참조하여 일반인들에게 분양이 가능하다.

(4) 항- HCV c160 항체의 생산 및 정제

최종 선별된 양성 클론은 T75(SPL) 배양접시로 옮긴 뒤 3일간 배양하여 1 X 10⁶ 세포/ml 세포 밀도로 0.5 ml씩 마우스의 복강에 주사한 뒤, 일주일 뒤 복수를 채취하였다. 마우스 복수액은 원심분리(3000rpm, 10분, 4℃)하여 부유물을 침전시키고, 그 상층액을 결합 버퍼(Binding buffer, Thermo scientific)와 1:1 비율로 섞어준 뒤 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후 다시 원심분리(3000rpm, 10분, 4℃)하여 부유물을 침전시키고, 1.2 μm 구멍크기의 필터를 사용하여 침전되지 않은 부유물을 재차 걸러내었다. 부유물이 완전히 제거된 복수액은 단백질 G 레진 (Pierce)이 들어있는 칼럼에 넣어, 항체와 단백질 G 간의 결합을 유도하였다. 복수액이 컬럼을 모두 통과한 후 인산염 완충 용액으로 3회 세척한 뒤 용출 버퍼(Elution buffer, Thermo scientific)를 이용하여 용출시켰다. 용출된 항체는 다시 PD-10 컬럼(GE heathcare)에 적용하고 인산염 완충 용액으로 용출시켜 최종 정제하였다.

실시예 2. HCV 항체 검출을 위한 HCV NS3 코어 45 융합 항원의 제조 및 역가 검정

1. HCV NS3 코어 45 융합 유전자 재조합 항원의 제조

(1) HCV NS3 코어 45 융합 항원 발현 플라스미드의 제조

HCV NS3의 헬리카제 활성을 갖는 C 말단 단편(서열번호 9), 코어 단백질의 친수성 단편(서열번호 10), NS4의 친수성 단편(서열번호 11) 및 NS5의 친수성 단편(서열번호 12)의 DNA를 합성 PCR을 이용하여 융합하고, HCV NS3 코어 45 플라스미드 DNA(서열번호 18)을 제조하였다. 각각의 영역 사이에는 세린 + 글리신 브릿지 서열(서열번호 13, 14, 15, 16 또는 17)을 추가하여 정제 후 폴딩(folding)될 시에 각 항원부위가 엉키지 않게끔 조치하였다.

구체적으로, 하기 표 2에 나타나 있는 프라이머들과 Taq 폴리머라제를 이용하여 합성 PCR을 실시하였다. 이 때의 PCR은 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 1분간 결합과 72℃에서 2분의 1 사이클 반응을 30회 반복하였으며, 사용한 올리고 프라이머들의 농도는 각각 50 pmole이었다. 각 합성 과정을 통해 증폭된 DNA들을 저융점 아가로즈(Low melting Agarose) 겔 전기영동으로 분리하고, 제한효소 BamHI(NEB R0136S, USA) 및 SalI(NEB, #R0138S, USA)으로 절단하였다. 이후, BamHI, SalI 처리한 pGEX-4t 발현 플라스미드를 상기 DNA들과 연결하여 재조합 발현 플라스미드 pHCV NS3 코어 45 DNA를 제조하였다. 상기 pHCV NS3 코어 45 DNA으로부터는 NS3 헬리카제의 친수성 단편으로서 서열번호 2, 코어 단백질의 친수성 단편으로서 서열번호 3, NS4의 친수성 단편으로서 서열번호 4, NS5의 친수성 단편으로서 서열번호 5 및 브릿지 아미노산 서열로서 서열번호 6의 아미노산 서열을 모두 포함하는 서열번호 7의 융합 펩티드가 발현된다.

[표 2]

(2) HCV NS3 코어 45 융합 항원 발현 플라스미드로부터 항원의 발현 및 정제

단백질 발현 플라스미드 pHCV NS3 코어 45를 대장균 BL21 균주에 형질전환 하였다. 상기 형질전환된 균주를 암피실린 5 ug/㎖를 함유하는 LB배지(1% 펩톤C, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl)에서 37℃로 배양하고, 흡광도(A600)가 0.5로 될 때 IPTG(isopropyl-thio-D-galactoside)를 1 mM 농도로 첨가하여 다시 16시간 배양하였다. 각 시간별로 배양액 중 세포를 얻어 그 파쇄액으로 SDS 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블로팅을 실시하였고, HCV NS3 코어 45 융합 항원 단백질의 발현을 확인하였다. 이후 2L 배양 배지를 사용하여 상기 균주를 37℃의 발효기에서 2시간 정도 배양시키고 흡광도(A600)가 0.5일 때 IPTG를 3 mM농도로 첨가하였다. IPTG를 첨가 후 6시간 동안 배양을 계속하여 HCV NS3 코어 45 융합항원 단백질 발현을 유도하였고, 배양이 끝난 후에 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 인산염 완충액(pH 7.4)으로 2회 세척 후 초음파 분쇄기로 파쇄하였다. 파쇄된 균체 용액을 10,000 g에서 30분간 원심분리 후 상층액의 가용성 단백질 부위만을 분리하였다. 항원이 함유된 상청은 0.45 ㎛ 필터(Sartorius stedim, Ministart)로 여과시킨 후 그 여과액을 평형액과 1:1 비율로 혼합하였다. 상기 혼합액을 글루타티온-레진 칼럼에 전량 로드하여 O.D₂₈₀=0.05 이하가 될 때까지 평형액으로 세척하였다. 이후 용출액으로 재조합 HCV NS3 코어 45 융합 항원을 회수하였다.

2. HCV NS3 코어 45 항원 역가 검정

상기 정제된 HCV NS3 코어 45 융합 항원은 HBsAg Mixed titer Accuset Performance Panel(0805-0217, Seracure) 검체를 이용하여 그 역가를 효소 연결 면역 흡광도 분석법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 확인하였다.

상기 항원을 2.5 μg/ml의 농도로 96 웰 흡착 플레이트(Costar사)에 코팅하였다. 검체는 10㎕/웰의 용량으로 분주하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 반응 후 5회 세척하고 항 휴먼 IgG HRP 콘주게이트를 100㎕/웰의 용량으로 분주한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 30분 반응 후 5회 세척하고 기질액을 100㎕/웰의 용량으로 분주하여 15분간 발색반응을 시켰다. 마지막으로 반응정지액을 100㎕/웰의 용량으로 첨가하였다. 반응을 정지시킨 후 판독기에서 450nm 파장으로 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 3 와 같다.

[표 3] HCV NS3 코어 45 항원 역가 검정 결과

실시예 3. HCV 항원 및 이에 대한 항체의 동시 진단 키트 제조 및 효과 확인

1. 키트 제조

(1) 검사선 제조

검사선 2개를 사용하여 본 제제의 HCV 항원 및 항체 검출 키트를 제조하였다. 제1 검사선에는 mAB 항-HCV c160(#11)을 흡광도 및 BCA법으로 단백 농도를 정량한 후, 2 mg/mL의 농도로 희석하였다. 희석된 mAB 항-HCV c160(#11)은 제1 검사선에 분주하여 코팅하였다.

제2 검사선에는 상기 실시예 1과 같이 정제된 HCV NS3 코어 45 융합 항원을 흡광도 및 BCA법으로 단백 농도를 정량한 후, 2 mg/mL의 농도로 희석하였다. 희석된 HCV NS3 코어 45 융합 항원은 제2 검사선에 분주하여 코팅하였다. 제조된 검사선들은 건조 후 밀폐 보관하였고, 실험시 사용하였다.

(2) 검사선 표지 제조

제1 검사선용 표지로는 단일클론 항 HCV c160 (#75)에 골드를 접합시킨 것을 이용하였다. 구체적으로, 골드 클로리드를 0.01%로 증류수에 용해한 뒤, 0.1% 소듐 시트레이트 용액을 첨가하면서 약 10분간 가열한 후 냉각하였다. 제조된 콜로이드 골드 용액은 냉장 보관했다. 이후 단일클론 항 HCV c160(#75)을 최종 20 ㎍/㎖의 농도가 되도록 생리식염액에 용해하고 상기 상기 콜로이드 골드용액에 10분간 반응시켜 접합반응을 유도하였다. 골드 입자를 안정화시킨 후 10,000g에서 30분간 원심 분리하여 침전을 만들었다. 생성된 침전을 다시 생리식염액에 용해하고 0.45 ㎛ 여과기로 여과한 뒤, 540nm에서 흡광도를 측정하여 최종 20이 되도록 희석하여 사용했다. 제2 검사선용 표지로는 상기 제1 검사선용 표지 제조 방법과 동일하한 방법으로 HCV NS3 코어 45 융합 항원에 골드를 접합시킨 것을 이용하였다.

2. HCV 항원 및 항체 동시 진단 키트의 효과 확인

상기 제조된 HCV 항원 및 항체 동시 진단용 키트는 하기와 같이 시험하였다.

(1) 사용 검체

① C형 간염 항체 양성 검체 : HCV mixed titer Accuset Performance Panel(0810-0175, Seracure) 16 검체를 구입하여 사용하였다. 16개 검체 중 양성으로 판별된 15 검체를 사용하였다.

② C형 간염 항원 양성 검체 : 분당차병원에서 입수한 HBV, HCV, HIV 항체 음성이며, HBV, HCV 항원 음성인 혈청 검체 20개 중 15 검체에 유전자 재조합 항원 c160을 1 ~ 10 μL 사이의 농도로 첨가하여 C형 간염 항원 양성 검체를 제조하였다.

③ C형 간염 항원/항체 음성 검체 : 분당차병원에서 입수한 HBV, HCV, HIV 항체음성이며, HBV, HCV 항원 음성인 혈청 검체 20개를 사용하였다.

(2) 검사 방법

검체(혈액 혹은 혈청) 10 μL를 검체투입구에 점적 후, 검사용 희석액을 90 ~100 μL를 첨가하였다. 15분 후 검사창에 나타나는 붉은 보라색 밴드를 읽어 대조선만 발색시 음성, 대조선과 검사선 1 발색시 C형 간염 항원 양성, 대조선과 검사선 2 발색시에는 C형 간염 항체 양성, 및 대조선, 검사선 1 및 검사선 2 모두 발생시에는 C형 간염 항원 및 항체 양성으로 판정하였다.

(3) 결과

도 1과 같이, C형 간염 항원/항체 동시 양성 15 검체 모두에서 검사선 1 및 2 모두의 발색이 관찰되었다. 또한 도 2와 같이, C형 간염 항원/항체 음성 20 검체 모두 대조선의 발색만이 관찰되었다.

[수탁 기관]

기탁기관명 : 한국세포주연구재단

수탁번호 : KCLRFBP00354

수탁일자 : 20151210

기탁기관명 : 한국세포주연구재단

수탁번호 : KCLRFBP00355

수탁일자 : 20151210

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Sequence <220> <223> core reverse primer <400> 24 gtcctgtggg cggcggttgg tgttacgttt ggtttttctt tgaggtttag gattcgtgct 60 ggaaccccct ccaga 75 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS4 forward primer <400> 25 ggatcctcgc ggggtaacca cgtc 24 <210> 26 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS4 reverse primer <400> 26 tgctgcgtcg ctctcaggca catagtgcgt gggggagacg tggttacccc gcgaggaacc 60 ccctccaga 69 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS5 forward primer <400> 27 ggatccccca tatgggcacg cccg 24 <210> 28 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS5 reverse primer <400> 28 gtccggatcc ttccaggact ctagcagggg aggattgtaa tccgggcgtg cccatatggg 60 ggaaccccct ccaga 75

Claims (15)

1. C형 간염 바이러스(hepatitis C virus: HCV) 코어 단백질로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편을 포함하는 폴리펩티드.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 HCV 코어 단백질로부터 선택된 연속된 아미노산 서열을 갖는 친수성 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드.
3. 수탁번호 KCLRF-BP-00354 또는 KCLRF-BP-00355인 하이브리도마 세포에서 생산되는 것이고, 청구항 1의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
4. 수탁번호 KCLRF-BP-00354 또는 KCLRF-BP-00355인 것인 하이브리도마 세포.
5. 청구항 1의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
6. 청구항 1의 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 HCV의 항원을 검출하기 위한 조성물.
7. 청구항 1의 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 HCV의 항원을 검출하기 위한 키트.
8. 청구항 1의 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체 및 비구조 단백질 3(non-structural protein 3: NS3)로부터 선택된 연속된 아미노산 서열이고 헬리카제 활성을 포함하는 NS3의 C 말단 단편, 코어 단백질로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편, NS4로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편 및 NS5로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 HCV의 항원 및 이에 대한 항체의 동시 검출용 조성물.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
10. 청구항 8에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드는 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 모두 포함하는 것인 조성물.
11. 청구항 1의 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체 및 비구조 단백질 3(non-structural protein 3: NS3)로부터 선택된 연속된 아미노산 서열이고 헬리카제 활성을 포함하는 NS3의 C 말단 단편, 코어 단백질로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편, NS4로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편 및 NS5로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함하는 HCV의 항원 및 항 HCV 항체의 동시 검출용 키트.
12. 개체의 C형 간염의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
    개체로부터 분리된 시료와 청구항 1의 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜 시료 중 포함된 HCV 항원과 상기 항체의 복합체를 형성시키는 단계; 및
    상기 형성된 복합체의 수준을 측정하여 상기 시료 중 HCV 항원의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 시료 중 HCV 항원을 검출하는 방법.
13. 청구항 12에 있어서, 상기 측정된 HCV 항원의 수준이 정상 대조군에서 측정된 동일한 항원의 수준보다 높은 경우, 개체가 C형 간염에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
14. 개체의 C형 간염의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
    개체로부터 분리된 시료와 청구항 1의 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체 및 비구조 단백질 3으로부터 선택된 연속된 아미노산 서열이고 헬리카제 활성을 포함하는 NS3의 C 말단 단편, 코어 단백질로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편, NS4로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편 및 NS5로부터 선택된 연속된 아미노산 서열인 친수성 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 접촉시켜 시료 내 포함된 HCV 항원과 상기 항체의 제1 복합체 및 시료 내 포함된 항 HCV 항체와 상기 융합 폴리펩티드의 제2 복합체를 형성시키는 단계; 및
    상기 형성된 제1 복합체 및 제2 복합체의 수준을 각각 측정하여 상기 시료 중 HCV 항원의 수준 및 상기 항 HCV 항체 HBV 항체의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 시료 중 HCV 항원 및 항 HCV 항체를 검출하는 방법.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 측정된 HCV 항원의 수준이 정상 대조군에서 측정된 동일한 항원의 수준보다 높고, 상기 측정된 항 HCV 항체의 수준이 정상 대조군에서 측정된 동일한 항체의 수준보다 높은 경우, 개체가 C형 간염에 걸린 것으로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
    

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