KR20170081760A

KR20170081760A - 항-마이코플라즈마 에스피피. 아단위 백신

Info

Publication number: KR20170081760A
Application number: KR1020177018451A
Authority: KR
Inventors: 지운-홍 린; 지-펑 왕; 밍-웨이 시에; 젱-웽 첸; 치엔-유 팡; 수에-타오 리우; 핑-쳉 양
Original assignee: 애그리컬쳐럴 테크놀로지 리서치 인스티튜트
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2017-07-12
Anticipated expiration: 2033-02-05
Also published as: EP2955192B1; KR101831318B1; KR20170081759A; EP3733690A1; US9730990B2; WO2014121433A1; KR101758778B1; KR101764750B1; KR20170082657A; JP2016514086A; MX370715B; TW201431873A; ES2812552T3; US9561267B2; JP6113306B2; KR101838160B1; RU2636459C2; US20170182142A1; KR20150107767A; US20170182143A1

Abstract

본 발명은 마이코플라즈마 에스피피에 대항하는 아단위 백신에서 활성 성분으로서 사용되기에 적합한 단백질들을 제공한다. 본 발명은 또한 이로부터 제조된 아단위 백신을 제공한다. 상기 단백질은 돼지가 마이코플라즈마 에스피피 감염을 피하는데 충분한 면역 반응을 유도하는 능력을 가진 것으로 실험적으로 입증되었다. 상기 백신은 활성 성분으로서 상기 단백질들 중 하나를 가질 수 있고 또는 상기 단백질들 중 둘 이상을 가질 수 있고 칵테일 백신으로서 제제화될 수 있다. 본 발명의 백신은 통상적인 백신보다 더 안정할 뿐만 아니라 동일하거나 더 좋은 면역 효과를 가진다.

Description

항-마이코플라즈마 에스피피. 아단위 백신{Anti-Mycoplasma Spp. Subunit Vaccine}

본 발명은 마이코플라즈마 에스피피에 대항하는 백신; 특히 마이코플라즈마 에스피피에 대항하는 아단위 백신에 관한 것이다.

마이코플라즈마 에스피피는 숙주 세포 밖에서 자가 복제할 수 있는 가장 작은 박테리아로 현재 알려져 있다. 비록 돼지 유행성 폐렴이 돼지 사망을 일으키지는 않으나, 사육 효율을 감소시키고 성장 지연, 염증 및 면역억제를 일으킬 뿐만 아니라 돼지를 다른 병원균의 감염에 더욱 취약하게 하며, 따라서 산업의 경제적 손실이 된다.

지금까지, 돼지 유행성 폐렴은 의약 투여, 환경 관리, 및 백신접종을 포함하는 세 가지 주요 전략에 의해 예방되고 있다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae)에 대한 항상제의 나쁜 예방 효과를 생각하면, 의약 투여는 단지 치료 목적에만 사용될 수 있고 예방 필요성을 충족하기 어렵다. 또한, 약물 남용은 약물-저항 박테리아에 의해 유발되는 더 큰 감염을 일으킬 수 있다는 것을 고려하면, 의약 투여는 신중한 계획을 필요로 하며 많은 제약이 존재한다.

환경 관리는 마이코플라즈마 에스피피 감염의 예방의 기초를 형성한다. 우수한 돼지우리 위생 및 관리는 감염의 발생을 감소시키는데 효과적일 수 있다. 다른 한편으론, 예방은 백신접종을 통해서 더욱 포괄적일 수 있다.

기술분야에서 통상적인 백신은 활성 성분으로서 비활성/죽은 박테리아를 사용한다. 그러나, 통상적인 백신의 가격이 너무 높은데 이는 마이코플라즈마 에스피피가 세심한 주의가 필요한 박테리아이며 실험실에서 배양되기가 어렵다. 마이코플라즈마 에스피피 백신의 비용을 줄이기 위해서, 과학자들은 (1) 약독백신, (2) 벡터 백신, (3) 아단위 백신 및 (4) DNA 백신과 같은 다른 형태의 백신을 개발하도록 지속적으로 노력한다. 이들 중에서, 아단위 백신은 생산의 용이함 및 높은 안정성의 이점 때문에 최고의 가능성을 나타낸다.

지금까지, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 백신에 사용될 수 있는 여러 가능성 있는 후보 단백질이 있다; 그러나, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 백신에 적합한 단백질을 입증하는 추가 보고서가 없다.

상기의 관점에서, 본 발명의 목적들 중 하나는 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 백신에서 사용되고 새로운 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 백신을 생산하는데 적합한 항원을 제공하는 것이며 그 결과 예방의 비용이 감소될 수 있다.

본 발명의 다른 목적은 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 백신에 사용되기에 적합한 항원의 조합을 제공하여 더 좋은 성능을 가진 아단위 백신을 제공하며; 따라서, 예방 임무를 위한 더 많은 선택사항이 있을 수 있다.

상기 목적들을 성취하기 위해서, 본 발명은 SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 또는 이의 조합의 아미노산 서열을 포함하는, 마이코플라즈마 에스피피 감염을 예방하기 위한 재조합 단백질을 제공한다.

본 발명은 또한 PdhA, XylF, EutD, Mhp145, P78, P132, Mhp389 또는 이의 조합의 단백질을 포함하는 활성 성분; 및 약학적으로 허용가능한 항원보강제를 포함하는 마이코플라즈마 에스피피를 예방하기 위한 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 활성 성분은 상기 조성물의 전체 부피를 기초로 50 내지 3500㎍/mL의 농도이다.

바람직하게는, 상기 활성 성분은 PdhA, XylF, EutD, Mhp145, P78, P132 및 Mhp389로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 단백질을 포함한다.

바람직하게는, 상기 활성 성분은 PdhA 및 P78을 포함한다.

바람직하게는, 상기 활성 성분은 XylF 및 Mhp145를 포함한다.

바람직하게는, 상기 약학적으로 허용가능한 항원보강제는 완전 프로인트 항원보강제, 불완전 프로인트 항원보강제, 알루미나 겔, 계면활성제, 폴리음이온 항원보강제, 펩타이드, 오일 에멀젼 또는 이의 조합이다.

바람직하게는, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 약학적으로 허용가능한 첨가제는 용매, 안정화제, 희석제, 방부제, 항균제, 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 또는 이의 조합이다.

본 발명은 SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 또는 이의 조합의 아미노산 서열을 포함하는 활성 성분; 및 약학적으로 허용가능한 항원보강제를 포함하는 마이코플라즈마 에스피피 감염을 예방하기 위한 조성물을 더 제공한다.

바람직하게는, 상기 활성 성분은 SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 및 SEQ ID NO: 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 아미노산 서열을 포함한다.

바람직하게는, 상기 활성 성분은 SEQ ID NO: 08 및 SEQ ID NO: 12의 아미노산 서열을 포함한다.

바람직하게는, 상기 활성 성분은 SEQ ID NO: 09 및 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 플라스미드를 포함하는 마이코플라즈마 에스피피를 예방하기 위한 발현 벡터를 더 제공하며; 상기 플라스미드는 SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 06, 및 SEQ ID NO: 07로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열; 및 조절 요소를 포함한다.

바람직하게는, 상기 조절 요소는 프로모터 및 리보솜 결합 부위를 포함한다.

바람직하게는, 상기 플라스미드는 pET-MSY, pET-YjgD, pET-D 또는 pET-SUMO이다.

바람직하게는, 상기 플라스미드는 융합 파트너를 암호화하는 유전자를 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 융합 파트너는 대장균의 MysB, 대장균의 YjgD, 람다 박테리오파아지의 단백질 D 또는 에스. 세레비시에(S. cerevisiae)의 SUMO이다.

바람직하게는, 상기 발현 벡터는 대장균 유전자 발현 시스템에 사용된다.

요약하면, 본 발명은 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 아단위 백신의 활성 성분으로서 사용되기에 적절한 항원 및 이를 사용하여 제조된 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 아단위 백신/조성물에 관한 것이다. 본 발명의 아단위 백신은 이의 비용을 낮춤으로써 예방 임무에 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 적어도 2개의 항원을 사용하는 "칵테일" 아단위 백신(즉 활성 성분으로서 적어도 2개의 항원을 가짐)은 면역 반응의 개선된 유도를 가진다는 것을 나타낸다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.

도 1은 본 발명의 제 1 실시예에서 실행된 2차원 겔 단백질 전기영동의 결과를 도시한다.
도 2는 본 발명의 제 1 실시예에서 실행된 웨스턴 블럿의 색 반응의 결과를 도시한다.
도 3은 본 발명의 제 2 실시예에서 얻은 PCR 생성물의 전기영동의 결과를 도시한다.
도 4a-c는 본 발명의 제 3 실시예에서 실행된 면역성검사 실험의 기록을 도시한다.

본 발명의 주요 개념 중 하나는 면역학적 선별 기술과 함께 2차원 겔 단백질 전기영동을 사용함으로써 아단위 백신에 적합한 가능성 있는 후보 항원을 조사하고 질량 분석법에 의해 항원을 확인하는 것이다. 그런 후에, 본 발명의 아단위 백신의 성능은 동물 모델 실험에 의해 입증되었다.

간략하게는, 본 발명의 개발 과정은 다음이다:

(1) 통상적인 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 백신을 주사하고 항-마이코플라즈마 하이오뉴모니에 항체를 함유하는 혈청을 얻음으로써 실험 돼지의 면역 반응을 유도한다. (2) 2차원 겔 단백질 전기영동을 위해 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 총 단백질을 얻는다. (3) 제 1 항체로서 단계(1)의 혈청을 사용하여 단계(2)의 2차원 겔 단백질 전기영동의 결과의 혼성화를 실행한 후, 2차 항체에 의한 증폭 및 다음 개발 절차 이후 겔로부터 양성을 나타내는 단백질(즉, 후보 항원)을 수집한다. (4) 단계(3)에서 얻은 후보 항원을 확인한다. (5) 대장균 유전자 발현 시스템을 사용하여 다량으로 상기 후보 항원을 발현한다. (6) 돼지 면역성검사 실험에 의해 폐에서 병적인 특성을 감소시키는데 본 발명의 아단위 백신의 효과를 검사하여 아단위 백신의 활성 성분으로 사용되는데 상기 후보 항원의 가치를 입증한다.

마이코플라즈마 에스피피 감염을 예방하기 위한 본 발명의 조성물은 활성 성분 및 약학적으로 허용가능한 항원보강제를 포함한다.

본 발명의 한 실시태양에서, 상기 활성 성분은 PdhA, XylF, EutD, Mhp145, P78, P132, 또는 Mhp389일 수 있다. 대안적 실시태양에서, 상기 단백질의 임의의 것의 항원 결정자가 간섭되지 않는 한, 상기 활성 성분은 상기 단백질의 임의의 2개의 융합 단백질일 수 있다. 다른 대안적 실시태양에서, 상기 활성 성분은 상기 단백질의 적어도 2개; 즉, 소위 본 발명의 "칵테일" 백신을 포함한다.

본 발명의 다른 실시태양에서, 상기 활성 성분은 SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 또는 이의 조합의 아미노산 서열을 포함한다. 대안적 실시태양에서, 상기 아미노산 서열의 펩타이드의 접힘에 의해 형성된 항원 결정자가 간섭되지 않는 한, 상기 활성 성분은 적어도 2개의 상기 서열을 가진 융합 단백질일 수 있다. 다른 대안적 실시태양에서, 상기 활성 성분은 상기 아미노산 서열의 하나를 각각 포함하는 둘 이상의 단백질; 즉, 소위 본 발명의 "칵테일" 백신을 포함한다.

상기 약학적으로 허용가능한 항원보강제는 상기 활성 성분의 면역 효과를 개선하고, 상기 활성 성분을 안정화 및/또는 백신의 안정성을 증가시키는데 사용된다. 본 발명의 상기 약학적으로 허용가능한 항원보강제는 완전 프로인트 항원보강제, 불완전 프로인트 항원보강제, 알루미나 겔, 계면활성제, 폴리음이온 항원보강제, 펩타이드, 오일 에멀젼 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 조성물은 하나 또는 적어도 2개의 상기 활성 성분(즉, 칵테일 백신)을 가질 수 있다. 본 조성물의 한 예에서, 상기 활성 성분은 상기 조성물의 전체 부피를 기초로 50 내지 3500㎍/mL의 농도이다. 본 발명의 한 바람직한 실시태양에서, 상기 조성물이 단지 하나의 상기 활성 성분을 포함할 때, 상기 활성 성분은 상기 조성물의 전체 부피를 기초로 50 내지 500㎍/mL의 농도이다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 본 조성물은 적어도 하나의 상기 활성 성분을 포함하며; 상기 조성물에 함유된 상기 활성 성분(들)의 전체 농도는 상기 조성물의 전체 부피를 기초로 50 내지 1000㎍/mL, 50 내지 1500㎍/mL, 50 내지 2000㎍/mL, 50 내지 2500㎍/mL, 50 내지 3000㎍/mL 또는 50 내지 3500㎍/mL이다.

본 발명의 다른 양태는 마이코플라즈마 에스피피를 예방하기 위한 발현 벡터를 제공하는 것이다. 구체적으로, 상기 발현 벡터는 대장균 유전자 발현 시스템에 사용될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 취지와 분리함이 없이, 당업자는 본 발명의 상세한 설명을 기초로 상기 벡터를 변형시킬 수 있고 상기 벡터를 여전히 본 발명의 범위에 속하는 다른 유전자 발현에 적합하게 할 수 있다.

상기 발현 벡터는 플라스미드를 포함한다. 상기 플라스미드는 SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 06, 및 SEQ ID NO: 07로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열; 및 조절 요소를 포함한다.

상기 벡터는 대장균 유전자 발현 시스템에서 사용되며 대장균을 통해 본 발명의 항원을 생산하는데 사용된다. 다시 말하면, 상기 뉴클레오티드 서열은 대장균 유전자 발현 시스템을 통해 본 발명의 항원의 아미노 서열 속에 번역될 수 있고 그런 후에 아미노산 서열은 본 발명의 항원 속에 접힐 수 있다.

대안적 실시태양에서, 대장균 유전자 발현 시스템의 작동이 방해되지 않고 상기 뉴클레오티드 서열의 생산과 이의 필연적인 아미노산 서열의 접힘이 방해되지 않는 한, 상기 플라스미드는 둘 이상의 상기 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

상기 조절 요소는 발현 시스템에서 전사 및 번역을 개시하는데 필요한 요소로 불린다. 상기 조절 요소는 적어도 프로모터 및 리보솜 결합 부위를 포함할 것이다. 바람직하게는, 상기 조절 요소는 오퍼레이터, 인핸서 서열 또는 이의 조합을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 한 바람직한 실시태양에서, 상기 플라스미드는 융합 파트너를 암호화하는 유전자를 더 포함한다. 상기 융합 파트너는 대장균의 MsyB, 대장균의 YjgD, 람다 박테리오파아지의 단백질 D 또는 에스, 세레비시에(S. cerevisiae)의 SUMO를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 MsyB는 산성 아미노산에 풍부하며 생산될 단백질의 용해도를 개선하는데 유리할 수 있다.

다음 실시예는 본 발명의 특징과 이점을 추가로 설명하기 위해 본 발명의 시험과 실험을 설명한다. 다음 실시예는 예시적이며 본 발명의 청구항 범위를 제한하는데 사용되지 않아야 한다는 것을 알아야 한다.

실시예 1: 아단위 백신의 활성 성분으로 사용되기에 적합한 후보 항원의 선별.

항-돼지 마이코플라즈마 에스피피 항체를 함유하는 혈청의 제조.

연구에 따라, 돼지로부터 분리될 수 있는 7개: 마이코플라즈마 하이오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae), 마이코플라즈마 하이오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 마이코플라즈마 하이오시노비에(Mycoplasma hyosynoviae), 마이코플라즈마 플로쿨라레(Mycoplasma flocculare), 마이코플라즈마 하이오파린기스(Mycoplasma hyopharyngis), 마이코플라즈마 수알비(Mycoplasma sualvi), 마이코플라즈마 보비게니탈리움(Mycoplasma bovigenitalium)(Gourlay et al., 1978; Blank et al., 1996; Assuncao et al., 2005)가 존재한다. 이들 중에서, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에가 25 내지 93%의 감염률을 가진 돼지 유행성 폐렴의 주요 병원균이다. 따라서, 본 발명은 면역 프로테오믹스 연구를 위해 마이코플라즈마 하이오뉴모니에(PRIT-5 균주)를 사용하였고 항원을 암호화하는 유전자의 원료로서 사용하였다. 프리스 배지(Friis et al., 1975)가 마이코플라즈마 하이오뉴모니에를 배양하는데 사용되었다. 실험 설계에 따라, 적절한 양의 항생제 또는 1.5%의 한천을 첨가하여 고체 배지를 제제화하였다.

4주령의 세 마리 SPF 돼지를 농업 기술 연구소로부터 데려와서 동일한 사료를 먹이고 실험 전에 돼지우리에서 동일한 실험 및 성장 조건을 유지하였다. 돼지를 32일령, 46일령 및 60일령까지 먹인 후에, 근육내 주사를 통해 2mL의 Bayovac^®MH-PRIT-5 (마이코플라즈마 하이오뉴모니에 PRIT-5)를 돼지에 투여하였다. 그런 후에, 돼지를 지속적으로 74일령까지 먹이고 혈액을 경정맥으로부터 채취하였다. 채취한 혈액을 실온에서 1시간 동안 놓고 4℃로 저장하였다. 다음날, 채취한 혈액을 30분 동안 1,107xg로 원심분리하였고 상청액을 깨끗한 튜브로 제거하고 -20℃로 저장하였다.

마이코플라즈마 에스피피의 총 단백질의 2차원 겔 단백질 전기영동

ReadyPrep^TM 단백질 추출 키트(총 단백질)(Bio-Rad, CA, USA)를 사용하여 마이코플라즈마 에스피피의 총 단백질을 추출하였다. 그 후, 수집한 단백질의 농도를 Bio-Rad RC DC 단백질 분석 키트(CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 상세한 프로토콜은 제품 설명서로부터 볼 수 있거나 기술분야의 주지된 프로토콜로부터 변형될 수 있다.

2차원 겔 단백질 전기영동을 2 단계로 실행하였다: 등전 집중(IEF) 및 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미이드 겔 전기영동(SDS-PAGE). IEF는 등전점의 관점에서 샘플에서 단백질을 분리하는 것이었고; SDS-PAGE는 분자량에 따라 단백질을 분리하는 것이었다. 2차원 겔 단백질 전기영동의 결과를 나타내는 도 1을 참조하기 바란다.

잡종화.

단계(1)에서 얻은 혈청은 단계(2)에서 2차원 겔 단백질 전기영동의 결과와 잡종화하기 위한 제 1 항체로 사용하였다. 제 2 항체에 의해 증폭되고 다음 전개 절차에 의해 개발된 후, 양성을 나타내는 단백질을 수집하였다. 이런 단백질은 항-마이코플라즈마 에스피피 항체에 의해 인식되었고 따라서 아단위 백신의 활성 성분에 대한 후보 항원으로서 적절할 것이다.

잡종화는 웨스턴 블로팅에 의해 실행되었다. 간략하게, 전기영동 이후 2D 겔을 PVDF 막으로 전달하였다. 그런 후에, 막을 배양하고 제 1 항체(항-마이코플라즈마 에스피피 항체를 함유하는 혈청) 및 제 2 항체(AP-컨쥬게이트 항-pig IgG)로 연속적으로 잡종화하였다. 그 후, NBT/BCIP 용액을 사용함으로써 색 반응을 실행하였다.

웨스턴 블로팅의 색 반응 결과는 도 2에 도시되었다; 항-마이코플라즈마 에스피피 항체에 의한 면역-잡종화에 대해 양성인 10개 단백질을 아단위 백신의 활성 성분으로 사용하기 위한 후보 항원으로 표시하였다.

얻은 후보 항원의 확인.

웨스턴 블로팅의 색 반응에 따라, 막 상의 양성 위치에 해당하는 겔을 마이크로펩타이드로 절단하고 질량 분석법로 분석하였다. 질량 분석법의 얻은 데이터를 아미노산 서열 및 단백질 데이터베이스와 일치시켜 이런 단백질을 확인하였다.

다음 표 1을 참조하기 바라며, 항-마이코플라즈마 에스피피 항체에 의한 면역-잡종화에 대해 양성인 상기 10개 단백질을 나열하였다.

항-마이코플라즈마 에스피피 항체에 의한 면역-잡종화에 대해 양성인 10개 단백질 및 이의 아미노산 서열.

후보	이름	SEQ ID NO
1	XylF (자일로스-결합 당단백질)	SEQ ID NO: 09
2	XylF (자일로스-결합 당단백질)	SEQ ID NO: 09
3	XylF (자일로스-결합 당단백질)	SEQ ID NO: 09
4	PdhA (피루베이트 탈수소효소 E1-알파 아단위)	SEQ ID NO: 08
5	Mhp145 (주변세포질 당-결합 단백질)	SEQ ID NO: 11
6	EutD (포스포트랜스아세틸라아제)	SEQ ID NO: 10
7	EutD (포스포트랜스아세틸라아제)	SEQ ID NO: 10
8	Mhp389	SEQ ID NO: 14
9	P78 (당단백질)	SEQ ID NO: 12
10	P132	SEQ ID NO: 13

^*XylF 및 EutD는 세포에서 다른 전하 상태를 가지며 따라서 막 상에서 3 및 2 양성 위치가 된다.

실시예 2: 대장균 유전자 발현 시스템에 의한 다량의 상기 후보 항원의 발현.

대장균 JM109를 복제를 위한 숙주 세포로 사용하였고 대장균 BL21(DE3)를 단백질 발현을 위한 숙주 세포로 사용하였다. 대장균 세포를 LB 배지(Luria-Bertani; Difco, Michigan, USA)에서 배양하였다. 실험 설계에 따라, 적절한 양의 항생제 또는 1.5%의 한천을 첨가하여 고체 배지를 제제화하였다.

후보 항원을 암호화하는 유전자의 증폭.

후보 항원을 확인한 후, 이런 항원을 암호화하는 유전자를 NCBI 데이터베이스(National Center for Biotechnology Information)에서 찾았다. 항원 유전자를 표적으로 하는 특정 프라이머를 적절하게 설계하였다. 그런 후에, 항원 유전자를 특정 프라이머 및 주형으로서 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 PRIT-5의 염색체를 사용하여 증폭하였다. 사용된 특정 프라이머를 다음 표 2에 나열하였다.

프라이머 세트.

후보	프라이머 세트의 서열
PdhA	PdhAF (SEQ ID NO: 15) 5'-GATATAGGATCCATGGACAAATTTCGCTATGTAAAGCCT G-3' PdhAR (SEQ ID NO: 16) 5'-CAATATGTCGACTTATTTTACTCCTTTAAAAAATTCAAGCG CTTC-3'
XylF	XylFF (SEQ ID NO: 17) 5'-GATATAGGATCCATGAATGGAATAAATTTCTTGGCTTAGGC TTAGTTTTTC-3' XylFR (SEQ ID NO: 18) 5'-CAATATGTCGACTTAATTTTTATTAATATCGGTAATTAGTT TGTCTAAGC-3'
EutD	EUTDF (SEQ ID NO: 19) 5'-GATATAGGATCCATGACATACCAAGAATATCTTCAAGCAA G-3') EUTDR (SEQ ID NO: 20) 5'-CAATATGTCGACCTATTTACCTTCTTCAAC TTGTAGAGCGCT-3')
Mhp145	Mhp145F (SEQ ID NO: 21) 5'-GATATAGGATCCATAGCTTCAAGGTCGAA TACAACTGC-3' Mhp145R (SEQ ID NO: 22) 5'-CAATATGTCGACTTAATTTACCTTTTGGAG TATCCCATTTTC-3'
P78	P78F (SEQ ID NO: 23) 5'-GATATAGGATCCTTATCCTATAAATTTAGG CGTTTTTTCC-3' P78R (SEQ ID NO: 24) 5'-CAATATGTCGACTTATTTTGATTTAAAAGCAGGACCTAA AT-3'
P132	P132F (SEQ ID NO: 25) 5'-GATATAGGATCCATTGGACTAACAATTTTTGAGAAATCATT TAG-3' P132R (SEQ ID NO: 26) 5'-CAATATGTCGACTTATTCCTAAATAGCCCC ATAAAGTG-3'
Mhp389	Mhp389F (SEQ ID NO: 27) 5'-GATATAGGATCCATGGACAAATTTTCACGA ACTGTTCT-3' Mhp389R (SEQ ID NO: 28) 5'-CAATATGTCGACCTAGATTTTAAAGGATTTTTTTAATTCAA TAATATAATC-3'

중합효소 연쇄 반응(PCR)을 표 2에 나열된 프라이머 세트로 실행하여 후보 항원의 유전자를 증폭하였다. 그런 후에 증폭된 유전자를 대장균 발현 시스템에 사용하였다. PCR 조건은 98℃에서 5분(1 라운드); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 X초(35 라운드); 68℃에서 5분(1 라운드)이었다. 상기 X는 DNA 중합효소를 위한 신장시간이었고 증폭될 단편의 크기에 따라 설정하였다. PCR 반응 이후, 전기영동을 실시하여 PCR 생성물이 예상된 크기의 DNA 단편을 함유하였는지를 입증하였다. PCR 생성물의 전기영동 결과를 나타내는 도 3을 참조하기 바란다; 레인 1은 eutD 유전자이었고; 레인 2는 pdhA이었고; 레인 3은 xylF이었고; 레인 4는 P78 유전자이었고; 레인 5는 P132 유전자이었고; 레인 6은 mhp145이었고; 레인 7은 mhp389이었다.

PCR 생성물의 복제.

CloneJET PCR 클로닝 키트를 사용하여 복제를 실시하였고 결찰 혼합물을 대장균 ECOS^TM 9-5 (Yeastern, Taipei, Taiwan)로 변형시켰다. 상세한 프로토콜은 제품 설명서로부터 볼 수 있거나 기술분야의 주지된 프로토콜로부터 변형될 수 있다.

변형 이후, 박테리아를 이의 콜로니가 형성될 때까지 앰피실린(100㎍/mL)를 함유하는 고체 LB 배지 상에서 배양하였다. 그런 후에, 콜로니 PCR를 실시하여 변형에서 균주 성공을 선별하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분(1 라운드); 95℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 X초(25 라운드); 72℃에서 7분(1 라운드)이었다. 상기 X는 DNA 중합효소를 위한 신장시간이었고 증폭될 단편의 크기에 따라 설정하였다. Taq DNA 중합효소(Genomics, Taipei, Taiwan)의 신장 속도는 1kb/min이며; 따라서, Taq DNA 중합효소가 1kb DNA 단편을 증폭하는데 사용된 경우, 상기 X는 1분으로 설정되어야 한다.

재조합 플라스미드가 인서트 DNA를 가진 것으로 확인된 균주의 플라스미드를 DNA 시퀀싱(Total Solution Provider of Systems Biology and Chemoinformatics Ltd.)으로 진행시켰다. eutD, pdhA, xylF, P78 유전자, P132 유전자, mhp145, 및 mhp389를 함유하는 플라스미드를 각각 pJET-eutD, pJET-pdhA, pJET-xylF, pJET-P78, pJET-P132, pJET-mhp145, pJET-mhp389로 명명하였다.

마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 항원 유전자의 점 돌연변이 및 복제.

대장균 유전자 발현 시스템에서 후보 항원을 증폭하기 전에, 다른 유기체에서 코돈 사용이 고려되어야 한다. 즉, 유전자가 최초 유기체 및 대장균 사이에서 모호하게 암호화될 수 있는 코돈을 함유하는 경우, 유전자는 점 돌연변이에 의해 변형되어야 한다.

마이코플라즈마 하이오뉴모니에 항원 유전자, pdhA, xylF, P78 유전자, P132 유전자, mhp145, 및 mhp389는 TGA 코돈을 함유한다(eutD는 다른 것과 같이 코돈 사용에 이해관계를 갖지 않는다). TGA 코돈은 마이코플라즈마 에스피피에서 트립토판으로 번역되었으나 대장균에서는 정지 코돈으로 번역되었다. 대장균 유전자 발현 시스템에서 총 단백질을 생산할 수 없게 되는 것을 예방하기 위해서, TGA 위치를 표적으로 하는 프라이머를 설계하고 TGA를 TGG로 대체하는 점 돌연변이를 겹치는 연장 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 실행하였다. 그 결과, 대장균 유전자 발현 시스템에서 발현될 유전자는 본 발명의 후보 항원으로 충실하게 번역될 수 있다. 게다가, P78 유전자, P132 유전자 및 mhp389의 BamHI의 절단 위치는 복제의 편리함을 위해 침묵 돌연변이가 진행되었다.

점 돌연변이에 사용된 프라이머는 프라이머의 중앙부에서 점 돌연변이의 위치를 파악하고 78℃보다 높은 Tm 값을 갖도록 설계되었다. 점 돌연변이를 위한 프라이머의 Tm 값은 인비트로진 사에 의해 제공된 식을 사용하여 계산하였다: Tm = 81.5 + 0.41(%GC) - 675/N - %불일치; 여기서 %GC는 당해 프라이머에 함유된 전체 뉴클레오티드의 관점에서 GC의 백분율로 불리며; N은 당해 프라이머의 길이로 불리며; %불일치는 당해 프라이머에 함유된 전체 뉴클레오티드의 관점에서 돌연변이 될 염기의 백분율로 불린다. 상기 유전자에 대해 사용된 프라이머 세트는 다음 표 3 내지 표 8에 나열하였다.

pdhA의 점 돌연변이에 대한 프라이머 세트

프라이머	DNA 서열 (5' to 3')
PdhAF SEQ ID NO: 29	GATATAGGATCCATGGACAAATTTCGCTATGTAAAGCCTG
PdhAM1 SEQ ID NO: 30	GCTAACAAAAGATGACTGGTTTGTCCCAGCTTTTCG
PdhAM2 SEQ ID NO: 31	CGAAAAGCTGGGACAAACCAGTCATCTTTTGTTAGC
PdhAM3 SEQ ID NO: 32	CTTGCAAATGCAATATTGGAATGGTAGCGAAAAAGG
PdhAM4 SEQ ID NO: 33	CCTTTTTCGCTACCATTCCAATATTGCATTTGCAAG
PdhAM5 SEQ ID NO: 34	CGAGGCGCTAAATATTGCAAGTATTTGGAAATGGCCAGTTGTTTTTTGCGTAAATAAC
PdhAM6 SEQ ID NO: 35	GTTATTTACGCAAAAAACAACTGGCCATTTCCAAATACTTGCAATATTTAGCGCCTCG
PdhAM7 SEQ ID NO: 36	GTTTTTTGCGTAAATAACAATCAATGGGCAATTTCAACCCCAAATAAATATG
PdhAM8 SEQ ID NO: 37	CATATTTATTTGGGGTTGAAATTGCCCATTGATTGTTATTTACGCAAAAAAC
PdhAM9 SEQ ID NO: 38	GTTGAGTTTGTAACTTGGCGTCAAGGTGTTCATACC
PdhAM10 SEQ ID NO: 39	GGTATGAACACCTTGACGCCAAGTTACAAACTCAAC
PdhAM11 SEQ ID NO: 40	GAGAACACGAAAAATGGGAACCAATGCACCGG
PdhAM12 SEQ ID NO: 41	CCGGTGCATTGGTTCCCATTTTTCGTGTTCTC
PdhAM13 SEQ ID NO: 42	CCGAAAAACAAAAAATTTGGGATGAAGCGCTTGCGATTG
PdhAM14 SEQ ID NO: 43	CAATCGCAAGCGCTTCATCCCAAATTTTTTGTTTTTCGG
PdhAR SEQ ID NO: 44	CAATATGTCGACTTATTTTACTCCTTTAAAAAATTCAAGCGCTTC

xylF의 점 돌연변이에 대한 프라이머 세트

프라이머	DNA 서열 (5' to 3')
XylFF SEQ ID NO: 45	GATATAGGATCCATGAAATGGAATAAATTTCTTGGCTTAGGCTTAGTTTTTC
XylFM1 SEQ ID NO: 46	CATTTAACCAATCAAGTTGGGAGGCAATTCAACAACTTGG
XylFM2 SEQ ID NO: 47	CCAAGTTGTTGAATTGCCTCCCAACTTGATTGGTTAAATG
XylFM3 SEQ ID NO: 48	CTAATACCAACAAAAATGTTTGGGTACTTTCTGGTTTTCAACACG
XylFM4 SEQ ID NO: 49	CGTGTTGAAAACCAGAAAGTACCCAAACATTTTTGTTGGTATTAG
XylFM5 SEQ ID NO: 50	CGGTGATGCGATCACAAAATGGTTAAAAATCCCTGAAAATAAGC
XylFM6 SEQ ID NO: 51	GCTTATTTTCAGGGATTTTTAACCATTTTGTGATCGCATCACCG
XylFM7 SEQ ID NO: 52	TTATCATACTCGGAATTGACTGGACTGATACTGAAAATGTAATTC
XylFM8 SEQ ID NO: 53	GAATTACATTTTCAGTATCAGTCCAGTCAATTCCGAGTATGATAA
XylFM9 SEQ ID NO: 54	GAAGAAGCCGGATGGCTTGCAGGATATGC
XylFM10 SEQ ID NO: 55	GCATATCCTGCAAGCCATCCGGCTTCTTC
XylFM11 SEQ ID NO: 56	GGTTATCTAGCCGGAATTAAAGCTTGGAATCTAAAAAATTCTGATAAAAAAAC
XylFM12 SEQ ID NO: 57	GTTTTTTTATCAGAATTTTTTAGATTCCAAGCTTTAATTCCGGCTAGATAACC
XylFR SEQ ID NO: 58	CAATATGTCGACTTAATTTTTATTAATATCGGTAATTAGTTTGTCTAAGC

P78 유전자의 점 돌연변이에 대한 프라이머 세트

프라이머	DNA 서열 (5' to 3')
P78F SEQ ID NO: 59	GATATAGGATCCTTATCCTATAAATTTAGGCGTTTTTTCC
P78M1 SEQ ID NO: 60	CAATTAATAAAGTTTTGTTTGGTTGGATGATTAATAAAGCACTTGCTGATCC
P78M2 SEQ ID NO: 61	GGATCAGCAAGTGCTTTATTAATCATCCAACCAAACAAAACTTTATTAATTG
P78M3 SEQ ID NO: 62	GATATTAAAGAAATTGAAAGAATCTGGAAAAAATATGTCTCCGATGATCAAGG
P78M4 SEQ ID NO: 63	CCTTGATCATCGGAGACATATTTTTTCCAGATTCTTTCAATTTCTTTAATATC
P78M5 SEQ ID NO: 64	GCCCTTTCAGGAGGCTCCACTGATTCGGCA
P78M6 SEQ ID NO: 65	TGCCGAATCAGTGGAGCCTCCTGAAAGGGC
P78M7 SEQ ID NO: 66	GCCGCAAAAGCTTTTGTTAAATGGCTTTTGACAGAAAAAATAGTCT
P78M8 SEQ ID NO: 67	AGACTATTTTTTCTGTCAAAAGCCATTTAACAAAAGCTTTTGCGGC
P78R SEQ ID NO: 68	CAATATGTCGACTTATTTTGATTTAAAAGCAGGACCTAAAT

P132 유전자의 점 돌연변이에 대한 프라이머 세트

프라이머	DNA 서열 (5' to 3')
P132F SEQ ID NO: 69	GATATAGGATCCATTGGACTAACAATTTTTGAGAAATCATTTAG
P132M1 SEQ ID NO: 70	CTAACTTCTCTAAAAGGTTGGAAAGAAGAAGATGATTTTG
P132M2 SEQ ID NO: 71	CAAAATCATCTTCTTCTTTCCAACCTTTTAGAGAAGTTAG
P132M3 SEQ ID NO: 72	CTTTCTATTACTTTTGAACTCTGGGACCCAAATGGTAAATTAGTATC
P132M4 SEQ ID NO: 73	GATACTAATTTACCATTTGGGTCCCAGAGTTCAAAAGTAATAGAAAG
P132M5 SEQ ID NO: 74	CCCTGAAGGAGATTGGATAACTTTAGGGAG
P132M6 SEQ ID NO: 75	CTCCCTAAAGTTATCCAATCTCCTTCAGGG
P132M7 SEQ ID NO: 76	CTACCAGGAACTACCTGGGATTTCCATGTTGAAC
P132M8 SEQ ID NO: 77	GTTCAACATGGAAATCCCAGGTAGTTCCTGGTAG
P132M9 SEQ ID NO: 78	GGACAACTAATTTGGAGCCAGTTAGCTTCC
P132M10 SEQ ID NO: 79	GGAAGCTAACTGGCTCCAAATTAGTTGTCC
P132M11 SEQ ID NO: 80	GGAACAAAAAAGGAATGGATTCTTGTAGGATCTGG
P132M12 SEQ ID NO: 81	CCAGATCCTACAAGAATCCATTCCTTTTTTGTTCC
P132M13 SEQ ID NO: 82	CCAATACGCAAATATGGATAACCCGTCTAGGAAC
P132M14 SEQ ID NO: 83	GTTCCTAGACGGGTTATCCATATTTGCGTATTGG
P132M15 SEQ ID NO: 84	CCAAGGGGAAGTTCTCTGGACTACTATTAAATCCAAAC
P132M16 SEQ ID NO: 85	GTTTGGATTTAATAGTAGTCCAGAGAACTTCCCCTTGG
P132M17 SEQ ID NO: 86	CAAAAAACTTCACCTTTGGTGGATTGCTAATGATAGC
P132M18 SEQ ID NO: 87	GCTATCATTAGCAATCCACCAAAGGTGAAGTTTTTTG
P132R SEQ ID NO: 88	CAATATGTCGACT TATTCCTAAATAGCCCCATAAAGTG

mhp145의 점 돌연변이에 대한 프라이머 세트

프라이머	DNA 서열 (5' to 3')
Mhp145F SEQ ID NO: 89	GATATAGG ATCCAT AGCTTCAAGGTCGAATACAACTGC
Mhp145M1 SEQ ID NO: 90	AATAATTGCAGAAAAAATTCTTAAAGATCAATGGAAAACAAGTAAATATTCTGATTTTTATTCACAAT
Mhp145M2 SEQ ID NO: 91	ATTGTGAATAAAAATCAGAATATTTACTTGTTTTCCATTGATCTTTAAGAATTTTTTCTGCAATTATT
Mhp145R SEQ ID NO: 92	CAATATGTCGACTTA ATTTACCTTTTGGAGTATCCCATTTTC

mhp389의 점 돌연변이에 대한 프라이머 세트

프라이머	DNA 서열 (5' to 3')
Mhp389F SEQ ID NO: 93	GATATAGGATCCATGGACAAATTTTCACGAACTGTTCT
Mhp389M1 SEQ ID NO: 94	CAATAGTGACAATGGACCCCCCAAATGTTGGTCG
Mhp389M2 SEQ ID NO: 95	CGACCAACATTTGGGGGGTCCATTGTCACTATTG
Mhp389M3 SEQ ID NO: 96	GATAAAGGCGCATCATGGCTTGCGCTTGCACCAAC
Mhp389M4 SEQ ID NO: 97	GTTGGTGCAAGCGCAAGCCATGATGCGCCTTTATC
Mhp389M5 SEQ ID NO: 98	GGAAAACTTAAAGGTAAATGGACTTTTGGACTAACCTATTT
Mhp389M6 SEQ ID NO: 99	AAATAGGTTAGTCCAAAAGTCCATTTACCTTTAAGTTTTCC
Mhp389R SEQ ID NO: 100	CAATATGTCGACCTAGATTTTAAAGGATTTTTTTAATTCAATAATATAATC

점 돌연변이에 대한 방법은 다음과 같이 간략하게 설명하였다. 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 PRIT-5의 염색체를 주형으로 사용하였고 DNA 단편은 상기 표 3 내지 8에 설명한 프라이머 세트를 사용함으로써 증폭하였다.

50μL PCR 반응 혼합물은 1xGDP-HiFi PCR 버퍼, 200μM의 dATP, dTTP, dGTP, 및 dCTP의 혼합물, 1μM의 프라이머, 100ng의 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 PRIT-5의 염색체 및 1U의 GDP-HiFi DNA 중합효소로 구성되었다. PCR 조건은 98℃에서 5분(1 라운드); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 X초(35 라운드); 68℃에서 5분(1 라운드)이었다. 상기 X는 DNA 중합효소를 위한 신장시간이었고 증폭될 단편의 크기에 따라 설정하였다. GDP-HIFI DNA 중합효소(GeneDirex, Las Vegas, USA)의 신장 속도는 1kb/15초이며; 따라서, GDP-HIFI DNA 중합효소가 1kb DNA 단편을 증폭하는데 사용된 경우, 상기 X는 15초로 설정되어야 한다. PCR 반응 이후, 전기영동을 실시하여 PCR 생성물이 예상된 크기의 DNA 단편을 함유하였는지를 입증하였다. 그런 후에, PCR 생성물을 Gel-M^TM 겔 추출 시스템 키트를 사용하여 재생하였다.

그 후, PCR 생성물을 주형으로 사용하였고 상기 표 2에 설명한 프라이머 세트를 사용하여 증폭하였다. PCR 조건은 98℃에서 2분(1 라운드); 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 68℃에서 X초(35 라운드); 68℃에서 5분(1 라운드)이었다. 상기 X는 DNA 중합효소를 위한 신장시간이었고 증폭될 단편의 크기에 따라 설정하였다. GDP-HIFI DNA 중합효소(GeneDirex, Las Vegas, USA)의 신장 속도는 1kb/15초이며; 따라서, GDP-HIFI DNA 중합효소가 1kb DNA 단편을 증폭하는데 사용된 경우, 상기 X는 15초로 설정되어야 한다. 상기 증폭 단계 이후, 점 돌연변이 없는 후보 항원 유전자의 전장 서열을 얻을 수 있다.

PCR 생성물을 PCR-M^TM 클린업 시스템 키트(GeneMark, Taichung, Taiwan)를 사용하여 재생하였고 CloneJET PCR 클로닝 키트를 사용하여 이의 복제를 실시하였다. 콜로니 PCR을 실시하여 인서트 DNA를 가진 플라스미드를 함유하는 돌연변이 이후 균주를 확인하였고 그런 후에 그 안의 플라스미드를 DNA 시퀀싱(Total Solution Provider of Systems Biology and Chemoinformatics Ltd.)을 위해 분리하였다. 돌연변이 후보 항원 유전자를 함유하는 플라스미드를 각각 pJET-pdhAM, pJET-xylFM, pJET-P78M, pJET-P132M, pJET-mhp145M, pJET-mhp389M으로 명명하였다.

시퀀싱의 결과에 따라, 점 돌연변이 이후 후보 항원 유전자의 DNA 서열은 SEQ ID NO:01 (pdhA), SEQ ID NO:02 (xylF), SEQ ID NO:03 (eutD, 는 점 돌연변이 되지 않았다), SEQ ID NO:04 (mhp145), SEQ ID NO:05 (P78 유전자), SEQ ID NO:06 (P132 유전자), SEQ ID NO:07 (mhp389)로 도시하였다.

마이코플라즈마 하이오뉴모니에 항원을 발현하기 위한 발현 벡터의 제조

실험의 이 부분에서, 플라스미드 pET-MSY를 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 항원을 발현하기 위한 발현 벡터를 제조하기 위한 주쇄로 사용하였다. pET-MSY는 pET29a의 유도체이며 대장균 msyB를 가진다. 따라서, 발현된 재조합 항원은 융합 파트너 MsyB를 가질 수 있다. MsyB는 산성 아미노산에 풍부하며 발현된 단백질의 d용해도를 증가시킬 수 있다.

pJET-eutD, pJET-pdhA, pJET-xylF, pJET-P78, pJET-P132, pJET-mhp145 및 pJET-mhp389가 BamHI 및 SalI에 의해 절단된 후, 얻은 DNA 단편을 리가아제에 의해 동일한 제한 효소로 미리 절단된 pET-Msy 속에 삽입하였다. 그런 후에, DNA 단편을 가진 pET-Msy를 대장균 ECOS 9-5로 변형시켰다. 콜로니 PCR을 실시하여 인서트 DNA를 가진 플라스미드를 함유하는 돌연변이 이후 균주를 확인하였고 그런 후에 그 안의 플라스미드를 DNA 시퀀싱(Total Solution Provider of Systems Biology and Chemoinformatics Ltd.)을 위해 분리하였다. 정확한 DNA 서열로 입증된 플라스미드를 각각 pET-MSYEutD, pET-MSYPdhA, pET-MSYXylF, pET-MSYP78, pET-MSYP132, pET-MSYMhp145, 및 pET-MSYMhp389로 명명하였다. 얻은 이런 플라스미드들은 본 발명의 마이코플라즈마 에스피피 감염을 예방하기 위한 발현 벡터의 예들이었다.

마이코플라즈마 하이오뉴모니에 항원의 발현 및 분리

항원 발현을 위한 벡터를 대장균 BL21(DE3)로 변형시켰다. 돌연변이 이후 결과로 얻은 균주의 단일 콜로니를 카나마이신(작업 농도: 30㎍/mL)을 함유하는 LB 액체 배지에 주입시켰다. 37℃, 180rpm에서 밤새 배양 이후, 박테리아의 현탁액을 1:100의 비율로 희석하였고 카나마이신(작업 농도: 30㎍/mL)을 함유하는 다른 LB 액체 배지에 다시 주입시켰다. 박테리아를 OD₆₀₀까지 37℃, 180rpm에서 배양하여 약 .06 내지 0.8을 얻었다. 그런 후에, 0.1mM의 IPTG를 첨가하여 발현을 유도하였다. 4시간 동안 유도 후, 펠렛을 원심분리(10000xg, 10분, 4℃)로 수집하였고 발현을 단백질 전기영동을 통해 검사하였다.

그 후, 고정-금속 친화력 크로마토그래피(IMAC)를 재조합 단백질의 N-말단의 His 태그 및 니켈 이온 또는 코발트 이온 사이의 공유 결합을 통한 단백질 분리에 사용하였다. 단백질 분리의 프로토콜은 QIAexpressionist^TM(fourth edition, Qiagen)의 제품 설명서에 따랐다. 펠렛을 세포용해 버퍼(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 8.0)에 현탁하고 초음파 처리기로 교란시켰다. 원심분리(8,000xg, 15분) 이후, 상청액을 수집하여 1mL Ni-NTA 수지의 컬럼 속에 주입하였다. 재조합 항원은 상기 수지에 부착할 것이다. 그런 후에, 15mL 세척 버퍼(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 8.0)를 수지를 세척하도록 컬럼 속에 주입하여 수지에 부착된 비특이적 단백질이 제거될 수 있다. 마지막으로, 20mL 용출 버퍼(50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 8.0)를 첨가하여 수지상의 재조합 항원을 세척하였다; 여기서 고농도의 이미다졸은 재조합 단백질과 수지상의 결합 부위를 경쟁할 수 있어서 재조합 단백질이 세척되게 한다. 분리의 결과는 단백질 전기영동에 의해 검사하였다.

분리에 의해 수집된 본 발명의 후보 항원은 항-마이코플라즈마 에스피피 아단위 백신의 활성 성분으로서 사용될 능력을 확인하도록 다음 면역 시험에 사용될 수 있다.

실시예 3: 본 발명의 후보 항원의 돼지 면역성검사 실험.

이 실시예에서, 본 발명의 후보 항원을 아단위 백신을 제조하기 위한 활성 성분으로 사용하였고 살아있는 돼지에서 이의 면역 효과를 테스트하였다.

백신 제조

하나의 분리된 재조합 항원 또는 여러 분리된 재조합 항원을 항원보강제로서 알루미나 겔과 혼합하여 아단위 백신 또는 칵테일 아단위 백신을 제조하였다. 제조된 백신의 매 복용량은 2mL이었고 그 안에 함유된 각 종류의 항원은 100㎍이었다.

다음 표 9는 돼지 면역성 검사 실험을 위해 이 실시예에서 제조한 샘플을 나열한다.

실시예 3에서 제조된 백신의 샘플

샘플	활성 성분(항원)
1	PdhA
2	XylF
3	EutD
4	Mhp145
5	P78
6	P132
7	Mhp389
8	PdhA + P78
9	XylF + Mhp145

돼지 면역성 실험을 Bayovac^®MH-PRIT-5(양성 대조군으로서, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 PRIT-5를 사용하여 제조), 아단위 백신(본 발명의 샘플 1-7) 및 칵테일 백신(본 발명의 샘플 8 및 9)을 사용하여 실시하였다.

4주령의 33마리 SPF 돼지를 농업 기술 연구소로부터 데려와서 동일한 사료를 먹이고 실험 전에 돼지우리에서 동일한 실험 및 성장 조건을 유지하였다.

돼지를 35일령 및 49일령까지 먹인 후에, 근육내 주사를 통해 2mL의 백신을 투여하였다.

면역성검사 실험

면역 반응이 유도된 상기 돼지들을 109일령까지 마이코플라즈마 에스피피로 면역성검사하여 상기 백신의 면역 효과를 확인하였다.

먼저, 마이코플라즈마 에스피피에 감염된 돼지로부터 수집한 폐를 20mL의 프리스 배지에서 분쇄하고 10분 동안 148.8xg에서 원심분리하였다. 상청액을 깨끗한 튜브에 제거하고 다시 40분 동안 7,870xg에서 원심분리하였다. 그런 후에, 상청액을 버리고 침전물을 6mL의 프리스 배지에 현탁하여 현탁액을 얻었다. 그 후, 현탁액을 5㎛ 및 0.45㎛의 막으로 연속적으로 여과하여 면역성검사 실험에 필요한 박테리아 용액을 얻었다.

박테리아 용액(5mL)을 기관을 통해 마취된 돼지에게 투여하였다. 투여 28일 후, 돼지를 희생시키고 해부하여 폐를 채취하였다. 면역 효과는 폐를 관찰하여 검사하고 다음 기준에 따라 기록하였다: 병적인 특성이 관찰된 폐의 어느 쪽의 중간 상부 엽 및 상부 엽의 임의의 것은 10점으로 기록하였고; 병적인 특성이 관찰된 폐의 어느 쪽의 중간 상부 엽 및 횡경막 엽의 임의의 것은 5점으로 기록하였다. 전체 점수는 55점이었다. 관찰 기록은 도 4a-c에 도시되었다.

주사를 맞지 않은 돼지의 결과와 비교하여, 본 발명의 7개 후보 항원은 통상적인 백신(Bayovac^®MH-PRIT-5)과 동일한 면역 효과를 제공할 수 있었다. 아단위 백신의 더 높은 안정성을 고려하는 경우, 본 발명의 후보 항원을 함유하는 백신이 더 높게 평가되어야 한다.

다른 한편으론, 한 백신에서 면역 효과를 일으킬 수 있는 둘 이상의 항원을 사용하는 것은 일반적이지 않은데 이는 둘 이상의 항원이 2배의 면역 효과를 제공하지 않을 수 있기 때문이다. 사실, 둘 이상의 항원이 서로 방해하거나 대항할 수 있고 결과적으로 백신의 면역 효과를 감소시킬 수 있다는 가능성이 더 크다. 이 실시예의 결과에 따라, 본 발명의 샘플 8 및 샘플 9(즉, 칵테일 백신)는 면역 효과에 현저한 증가를 예상치못하게 제공한다. 즉, 본 발명의 아단위 백신은 본 발명의 후보 항원들이 조합으로 사용될 때 높은 안정성을 가질 뿐만 아니라 더 좋은 면역 효과를 제공한다.

당업자는 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 본 발명의 상세한 설명을 기초로 임의의 가능한 변화를 쉽게 이해할 수 있다. 따라서, 상기 실시예들은 본 발명을 제한하는데 사용되지 않아야 하며 이하에 인용된 청구항에 따라 본 발명의 취지 및 범위 하에서 임의의 가능한 변화를 포함한다.

<110> AGRICULTURAL TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE <120> Anti-Mycoplasma Spp. Subunit Vaccine <160> 100 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated pdhA gene <400> 1 atggacaaat ttcgctatgt aaagcctggt caaattatgg caaaagatga agaaatgatt 60 cgctttcttg atattgatgg taatctttta tcttcaactg tttttggacc aatcgacgaa 120 acaaatgata ttcgcttatc aaaacaggaa atcaaaaaag cttatgaatt tatggtttta 180 tctcgccaac aagatacgta tatgacacaa ctacagcgac aaggtagaat gttgactttt 240 gcccctaact ttggtgaaga agctcttcaa gtagcctcag ggatggcgct aacaaaagat 300 gactggtttg tcccagcttt tcgttcaaat gcaacaatgt tatatcttgg cgtgccaatg 360 atcttgcaaa tgcaatattg gaatggtagc gaaaaaggta atgtaattcc cgaaaatgtt 420 aatgttttac ctattaacat tcccatcgga acgcagtttt cccatgctgc cggaattgct 480 tatgcagcaa aactaacagg taaaaaaata gtttcaatga gttttattgg aaacggggga 540 actgccgaag gcgagtttta cgaggcgcta aatattgcaa gtatttggaa atgaccagtt 600 gttttttgcg taaataacaa tcaatgggca atttcaaccc caaataaata tgaaaacggt 660 gcctcaacaa ttgctgcaaa agcaatggca gccggaattc ctggaattcg tgtagacgga 720 aatgaccttt tagcttctta tgaagtaatc aaggaagctg ttgattatgc tcgttctgga 780 aacggtcctg ttcttgttga gtttgtaact tggcgtcaag gtgttcatac ctcttctgat 840 aatccacgaa tttatcgtac tgttgaagag gaaagagaac acgaaaaatg ggaaccaatg 900 caccggattg aaaaatatat gtttgaccgc ggaattcttg attctgccga aaaacaaaaa 960 atttgggatg aagcgcttgc gattgtcaaa gaaacttatg aaaaatctct tgttgggctt 1020 gagtcaacaa ttgatgaaat tttcgatcat acctacaagg ttttaccacc agaacttgaa 1080 gaacaaaaac aagaagcgct tgaatttttt aaaggagtaa aataa 1125 <210> 2 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated xylF gene <400> 2 atgaaatgga ataaatttct tggcttaggc ttagtttttc cgctttcagc aatcgcgaca 60 atctctgccg gatgttggga taaagaaaca actaaagaag aaaaatcagc cgataatcaa 120 aataaacaaa tcactgatgt ctcaaaaatt tcaggactag ttaatgagcg aaaatccgaa 180 attatggccg caaaagctga tgcaaacaaa cattttgggc taaatatggc aattgtaacc 240 gctgatggaa cggtaaatga taattcattt aaccaatcaa gttgggaggc aattcaacaa 300 cttggcgctc ttactggagg tgagattact tcagtagata gttcaactgc tgaacttgaa 360 ggaaaatata gctcacttgc taataccaac aaaaatgttt gggtactttc tggttttcaa 420 cacggtgatg cgatcacaaa atggttaaaa atccctgaaa ataagcaatt atttactgaa 480 aaaaatatta tcatactcgg aattgactgg actgatactg aaaatgtaat tccaacaggt 540 cgatatatta atttaaccta taaaactgaa gaagccggat ggcttgcagg atatgcgaat 600 gcttcctttt tggcaaaaaa attcccaagt gatccaacta aaagatcagc aattgttatc 660 ggtggtggga ttttcccagc tgtaactgat tttatcgctg gttatctagc cggaattaaa 720 gcttggaatc taaaaaattc tgataaaaaa acaaagataa caactgataa aatcgaaata 780 aatcttgggt ttgattttca aaatacttca acaaaagaaa gacttgaaca aattgcttca 840 aaagataaac cttcaacact attagcagtc gctggaccac ttactgaaat tttctcggat 900 ataatcgcaa accaaaatga tcgttatctc attggtgttg acaccgacca atcacttgtt 960 tatacaaaaa ctaaaaataa atttttcacc tcaattttga aaaatttagg ttactccgtt 1020 ttcagtgttc ttagtgattt atataccaaa aaatcaaatt caagaaattt agccggcttt 1080 gaatttggta aaaaaagtgc aaccgtttat cttggaatta aagacaagtt tgtcgatatt 1140 gctgatactt ctttagaagg aaatgataaa aaactcgcaa ctgaagccat ttctgaagct 1200 aaaaaagaat ttgaagaaaa aactaagaca actcctgccg aagaagttcg taaaacttta 1260 gaaattccgg aaatgactga taaacaacct gataaacaac aggaaagctt agacaaacta 1320 attaccgata ttaataaaaa ttaa 1344 <210> 3 <211> 1122 <212> DNA <213> Mycoplasma hyopneumoniae <400> 3 atagcttcaa ggtcgaatac aactgccaaa gttgccccag ttgctgttgt tttctcaaca 60 agaaataatc cttttttcca aaatgttgaa aaagggattg aaacagcggc aaaagaatta 120 ggagttgact atgaagtcta tgactctgaa aatgactcgg ataaagaagc aagaaatatt 180 tcaaatatta ttgcaaaaca acaaaaagtt gtaattttta acgatgttaa tgaagattca 240 ggaatctcag ctgttaaaaa attaaatcaa gctggaattc cggtaattgc cactgatcat 300 ttactaaatt cgccaaaagc cttagaagca aaaattaaag ttgaagccaa tattgcttct 360 gataataaac aagcaggagt aattcttgcc cagtttatgg cccaaaaaat cggacttcct 420 caagattcac ttacttattc agtctatgga attcccggaa ctgaatcagg ggaatcccga 480 gctcaagggt ttattgaaac agttaaaaat ctaaataatc aagcaataaa atacaacctt 540 ttttcttatg gaaaatacgg aaaagaaaat gcaaatggaa aaacttacat cggaagacaa 600 gctgatgata atcgcgatct agcaaatcaa agagttgcaa atgatgcaac gcaagtattc 660 caagatgctc aaaaaaggcc acttttggtt tttgggacta atgatgaagc tgccttaggt 720 tcaatttctg cccttgaaag tgcccagatt ccattaggag gtggagataa attccttcca 780 ggttcaggaa aagtttatat taccggagtt gattatacaa atgatgctca aaaagcggta 840 ttaaataata aattatcagc aactgttgaa caagatactg atcttttagg aagactttct 900 ttaataattg cagaaaaaat tcttaaagat caatggaaaa caagtaaata ttctgatttt 960 tattcacaat ttcctcagct tgataaagac aaaaatcctg atgatcaagt tgagcaagga 1020 tattatttta aagtaggaac aaaacttttc tggaaaggac cagatggaaa aggtgaaaaa 1080 cttcaagccg atgaaaatgg gatactccaa aaggtaaatt aa 1122 <210> 4 <211> 1122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated mhp145 gene <400> 4 atagcttcaa ggtcgaatac aactgccaaa gttgccccag ttgctgttgt tttctcaaca 60 agaaataatc cttttttcca aaatgttgaa aaagggattg aaacagcggc aaaagaatta 120 ggagttgact atgaagtcta tgactctgaa aatgactcgg ataaagaagc aagaaatatt 180 tcaaatatta ttgcaaaaca acaaaaagtt gtaattttta acgatgttaa tgaagattca 240 ggaatctcag ctgttaaaaa attaaatcaa gctggaattc cggtaattgc cactgatcat 300 ttactaaatt cgccaaaagc cttagaagca aaaattaaag ttgaagccaa tattgcttct 360 gataataaac aagcaggagt aattcttgcc cagtttatgg cccaaaaaat cggacttcct 420 caagattcac ttacttattc agtctatgga attcccggaa ctgaatcagg ggaatcccga 480 gctcaagggt ttattgaaac agttaaaaat ctaaataatc aagcaataaa atacaacctt 540 ttttcttatg gaaaatacgg aaaagaaaat gcaaatggaa aaacttacat cggaagacaa 600 gctgatgata atcgcgatct agcaaatcaa agagttgcaa atgatgcaac gcaagtattc 660 caagatgctc aaaaaaggcc acttttggtt tttgggacta atgatgaagc tgccttaggt 720 tcaatttctg cccttgaaag tgcccagatt ccattaggag gtggagataa attccttcca 780 ggttcaggaa aagtttatat taccggagtt gattatacaa atgatgctca aaaagcggta 840 ttaaataata aattatcagc aactgttgaa caagatactg atcttttagg aagactttct 900 ttaataattg cagaaaaaat tcttaaagat caatggaaaa caagtaaata ttctgatttt 960 tattcacaat ttcctcagct tgataaagac aaaaatcctg atgatcaagt tgagcaagga 1020 tattatttta aagtaggaac aaaacttttc tggaaaggac cagatggaaa aggtgaaaaa 1080 cttcaagccg atgaaaatgg gatactccaa aaggtaaatt aa 1122 <210> 5 <211> 2076 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated P78 gene <400> 5 ttatcctata aatttaggcg ttttttccta accagcgcac ttagttttgc tcccttggct 60 ttagttgcaa gttgtgttaa taattcccga tttgattcaa atgaggataa taaattagtt 120 tttggtcata ctttttcatc ttcaggaaaa gaggcaaaag cacttgagaa aattattgaa 180 gtctggaata aaactgcaac taatcaaaaa gattttatca aaatggaagc acaatatttc 240 cagaatggct ataatggatc agcggcttca attacaaact ttttacagac aaaagatcgg 300 ataaaactgc caaatattgt cacaaattat ccttcacttc tggcaatagt taataaatat 360 tcaatgactt ttccgcttgt taaagatttt agttctaatc aagaaccaca agatgaaaat 420 gaaaaagcaa taaaaaagtt cctaaaagag caaggaattt ctgatttcct tgagattaat 480 aaagaagttc ctttccttga tacaaaggga gtttataccc ttccatttgg aaaatcaact 540 gaagttctta caattaataa agttttgttt ggttggatga ttaataaagc acttgctgat 600 ccaaaaaagc cagcaaaaat taaagaagaa gataaacctt attttgccga atttcaaaaa 660 ttaggcaagg aaaaaactgg tgatattaaa gaaattgaaa gaatctggaa aaaatatgtc 720 tccgatgatc aaggacttgc aggctatgaa tttcgccgat ccgatcttga aaattttact 780 gacctacaga aattatcatc acgaattctt cgttcttttc cagaggccct ttcaggaggc 840 tccactgatt cggcaaaatc agttttagga attgataatc aagcaacgct agtttttgct 900 cttgccagat cagtttcaga aggtaatcga tcccaggaag ttactgttct tgataggcaa 960 aagaatttaa ttgattatat atcttttata gataaacctg attcaattag atataaaaat 1020 ttagaaaaaa tttttaattt attaagccaa gggataaaag atcgctcaat ttattataca 1080 tctgcagggg agtataattc aacttttttc cggaatcatc agcaggtttt ctcaattggt 1140 tcaacttcag gctatttcca taattttgtc aaaccaacag cgacaaatta tcaaatcgga 1200 tttaagaaaa atgatggtct taagtcagtt tatagcgtta gctatcccaa atttagcgca 1260 attgtatcac ttgaagatct caaggatata accaaagatc tagaaataac agcaaccgat 1320 ggtagctcta aattaaaaat tgatgctaaa tttttaggaa aactcaaaga atatgcacag 1380 caaaatccag ttaaaaaagt gttttatttt actgatcgat cagaaaaacc ttcaggtatc 1440 ttcgaaaaag attatattgt tttaggcaaa tacaaaaatg ataaaaatga agaatttaat 1500 ggccttgtaa ttccaactta tacagaactc tataaaaatt ctggatcaaa tgcccttaat 1560 gatgatgaac ttgcacttga agccccaccg cataaattcg atgcaaatag taaaatcacc 1620 cccattgtcg cccaaggtcc tgatctaatt tttattcatt caactgaaaa agaagataaa 1680 gccgcaaaag cttttgttaa atggcttttg acagaaaaaa tagtctttga ggaaaatagt 1740 caggaaaaaa tgactccgct tgagtatttt gccagagcaa cctcatattt attgccaata 1800 aaatcaacgc ttgataaaac ccattttagt ccaaaaaata gatctcagaa attcatactt 1860 gaccaattta gtaaatttct taatgctgat tcaaaaggaa aatattcgct tgtctatgat 1920 aatgccgatg caaatgcttc atccttccgt gaatcactag attcttcagt tgcccagatg 1980 caatcattaa aagccagcga tggaaaacta cgtagtttta aagagttttt agaaaaacta 2040 gagggaaatt taggtcctgc ttttaaatca aaataa 2076 <210> 6 <211> 3549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated P132 gene <400> 6 attggactaa caatttttga gaaatcattt agttcccaag tttcaggagg ggtcgataag 60 aacaaagttg tggatttaaa atcagattca gatcaaatct tctcagaaga agattttata 120 agagcagttg agaatcttaa actttttgat aaatataaac atctaacagc aagaatggca 180 ttaggacttg ctagggaagc agctaatgcc tttaactttt tagatactta tgactacacc 240 ccaattacaa aacattcatt taagatttct ttggatattt ccgatgcctt tgcggctaat 300 aaagaagtaa aagcggtagt ggttagtgca tattcccaaa aatatcaagt tacctattca 360 agactaactt ctctaaaagg ttggaaagaa gaagatgatt ttggcgatga tattatagat 420 tatcaaatta atcaagagct ttcaggtcta tcactttctt ccttagcccc tgaaagcgcg 480 catcttttag cctcagaaat ggcttttcgg cttgataatg actttcaagt tgcatataaa 540 aaaacaggat caagagccga ggcttttcgt caggccttga taaagaatta tcttggttat 600 aacttagtta accgccaagg tttgcccact atgctccaaa agggttatgt gctagccccc 660 aaaacaattg aaaataaaaa tgcaagcgaa gaaaaattag taaatataaa tgaaaatgac 720 cgtgcaaggg ttaataaact acaaaaagta gaaaatctag cctttaaaaa cttaagtgat 780 ccaaatggaa cgctttctat tacttttgaa ctctgggacc caaatggtaa attagtatcc 840 gaatacgatt ttaaaattaa gggaatcaaa aaacttgatt ttgatcttaa aaaacaagag 900 gaaaaagtac ttcaaaaagt aactgaattt gttgagatta aaccttatgt tcaattaggt 960 ttaatccgtg ataatttatc attgtctgaa attatctata aaaatgataa taatccggag 1020 tatcttagga aaatattagc taaactaaaa gaacacaata acaacaaaag ggtggataat 1080 aatacatcca ctactaaatt tcaagaagag gatcttaaaa acgaaccaaa ttctaatgga 1140 tcagaacaag attctttcga gaaagcaaag gaaaatttcc ttagtttttt tgatctaagg 1200 tcgagactaa ttcctattcc cgatcttcct ttatattatc ttaaagttaa ttcaattaat 1260 tttgatagaa atattgaaga aaatgaaaaa gaaaaattat taaaaaatga acaagtagta 1320 ctcaaagtag attttagtct taaaaaagtt gttagcgata ttagagctcc ttacctagtt 1380 tctagtcagg ttagatcaaa ttatcccccg gttttaaaag cttcgctagc aaaaataggt 1440 aaggggtcaa attcaaaagt tgtcctttta gatcttggaa atttatcttc aagatttaaa 1500 gttcaacttg attatagtgc aaaacaaaga gaaataatta atactttatt aaaggaaaat 1560 ccagaaagag aaaaagaatt acaagctaaa attgaaagta agacgtttag tccaatagat 1620 cttaacaatg atgatctatt agcaatcgaa tttcaatatg aggataaccc tgaaggagat 1680 tggataactt tagggagaat ggaaaagtta gtcaaagagg ttatccaata taaaaaagaa 1740 ggtaaaacct tcttagatga tgaagtcgcg aaaacacttt attatttaga tttccatcat 1800 ctacctcaaa gtaaaaaaga cctcgaagaa tataaagaaa aacacaaaaa caagtttatc 1860 agcgaaataa aacctgctac accagcaagt caagcaaaaa caagtcaagc aaaaaatgaa 1920 aaagaagtaa aacctgaatc agcccaagca gaagcttcat cttcaaattc taatgattct 1980 agtagtaaaa ccacttcttc ttcaagtatg gcgggtacaa cccaaaataa atctacagaa 2040 actccaaatt caagttcaaa ttcaacacca acaagttcag caacaacttc agcaacaact 2100 tcaacaacaa gttcaaattc aagttcaaca acaagttcaa caacaacaac aacttcaaca 2160 caagcagcaa caacttcagc ctcttcggct aaagtaaaaa caactaaatt ccaagaacaa 2220 gtaaaagaac aagaacaaaa acaagaaaaa gcaaaagaaa ctaaccaatt attagatact 2280 aaaagaaata aagaagactc agggcttgga ttaattcttt gggatttcct agtaaattca 2340 aaatataaaa ctctaccagg aactacctgg gatttccatg ttgaaccaga taatttcaat 2400 gatcgtctaa aaataacagc gattctaaaa gaaaatacat cccaggcaaa gtcaaaccca 2460 gatagtaaaa acctaacttc cctatcacga aaccttataa taaaaggggt tatggctaat 2520 aaatacattg actacttagt ccaagaagat ccagtacttc ttgtagatta tacaagaaga 2580 aaccagatta aaaccgaaag agaaggacaa ctaatttgga gccagttagc ttcccctcaa 2640 atggcatctc ctgaatctag tcccgaaaag gctaagctcg agatcaccga ggaaggactc 2700 cgtgttaaaa aaggtggcac taagataaaa gagacaagaa aaagcacaac cagcaatgct 2760 aaaagcaata ctaactccaa accaaataaa aagttagtcc tactaaaagg gtctataaaa 2820 aacccgggaa caaaaaagga atggattctt gtaggatctg ggaataaggc caccaaaaac 2880 ggaagctcca gcaacaactc caatacgcaa atatggataa cccgtctagg aacatctgtt 2940 ggttcattaa aaaccgaagg tgagacagtc cttggaattt cgaataataa ttcccaaggg 3000 gaagttctct ggactactat taaatccaaa ctcgaaaacg aaaataactc agataacaat 3060 caaatccaat actccccaag tacgcatagt ttaacaacca attctcgatc aaatacccaa 3120 caatcagggc gaaatcaaat taaaattaca aacacgcaaa ggaaaacaac aacttcgcca 3180 agccaaaatc taagtcaaaa tcctgatctc aaccaaattg atgtaagact tggtctacta 3240 gtacaagaca aaaaacttca cctttggtgg attgctaatg atagctctga tgagcctgag 3300 catataacaa ttgatttcgc tgaagggaca aaatttaatt atgatgattt aaattatgtc 3360 ggagggcttt taaaaaatac tacaaataat aacaatatgc aaacccaaga cgatgaaggt 3420 gatggatatc ttgccctaaa aggattaggt atctatgaat ttcctgatga tgaaagtatt 3480 gatcaacccg ctactgttga aaaggcagag agattatata aacactttat ggggctattt 3540 agggaataa 3549 <210> 7 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated mhp389 gene <400> 7 atggacaaat tttcacgaac tgttctcggt gatattcacc catcggaatt aggtgttgtt 60 gactgtcatg atcatttaat taaaaattat ggaccaaaag ctcacgaaca tccggatttt 120 gtaatgttat caaatgaggc tgcaattgct gaatcacttg aatatgcttc ccggggtgga 180 aaaacaatag tgacaatgga ccccccaaat gttggtcggg atgtctatcg aatgttaaag 240 attgccaaag ctcttgaagg aaaagtgcat attattatgg caactggatt tcataaagcg 300 gctttctatg ataaaggcgc atcatggctt gcgcttgcac caacagatga aattgtaaaa 360 atggttgttg ctgaaattac acagggaatg gatgaatata attattcagg tcctgtggtt 420 agacgttcaa aagccaaagc aggaattatc aaagccggaa ctggatatgg agcaattgat 480 cgacttgaat taaaatcact tgaggttgca gcaagagcct caattgaaac cggggcaccg 540 attttggttc atacccaatt aggaacaatg gcctatgaag cggcaaaata tttaattgat 600 tttggtgcaa atccacggaa aattcagatc tcacatctta ataaaaaccc tgataaatat 660 tattatgcaa aaataattaa agaacttggg gtatctttat gttttgatgg tcctgatcgg 720 gttaagtatt ttcctgatac aactcttgct gaaaatatta aatatcttgt cgatttagga 780 ctagaaaaac atattacctt atcacttgat gccggtcgtg ttttatatca gcgaaattat 840 ggaaaactta aaggtaaatg gacttttgga ctaacctatt tattcgatcg gtttattccg 900 cttttagaac aagttggaat tagcaaggaa acaattaata atattcttgt taataatcca 960 gctgaaattc ttgcctttga tcagccaaga aaatttgatc catcaattct tccagattat 1020 attattgaat taaaaaaatc ctttaaaatc tag 1053 <210> 8 <211> 374 <212> PRT <213> Mycoplasma hyopneumoniae <400> 8 Met Asp Lys Phe Arg Tyr Val Lys Pro Gly Gln Ile Met Ala Lys Asp 1 5 10 15 Glu Glu Met Ile Arg Phe Leu Asp Ile Asp Gly Asn Leu Leu Ser Ser 20 25 30 Thr Val Phe Gly Pro Ile Asp Glu Thr Asn Asp Ile Arg Leu Ser Lys 35 40 45 Gln Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Glu Phe Met Val Leu Ser Arg Gln Gln 50 55 60 Asp Thr Tyr Met Thr Gln Leu Gln Arg Gln Gly Arg Met Leu Thr Phe 65 70 75 80 Ala Pro Asn Phe Gly Glu Glu Ala Leu Gln Val Ala Ser Gly Met Ala 85 90 95 Leu Thr Lys Asp Asp Trp Phe Val Pro Ala Phe Arg Ser Asn Ala Thr 100 105 110 Met Leu Tyr Leu Gly Val Pro Met Ile Leu Gln Met Gln Tyr Trp Asn 115 120 125 Gly Ser Glu Lys Gly Asn Val Ile Pro Glu Asn Val Asn Val Leu Pro 130 135 140 Ile Asn Ile Pro Ile Gly Thr Gln Phe Ser His Ala Ala Gly Ile Ala 145 150 155 160 Tyr Ala Ala Lys Leu Thr Gly Lys Lys Ile Val Ser Met Ser Phe Ile 165 170 175 Gly Asn Gly Gly Thr Ala Glu Gly Glu Phe Tyr Glu Ala Leu Asn Ile 180 185 190 Ala Ser Ile Trp Lys Trp Pro Val Val Phe Cys Val Asn Asn Asn Gln 195 200 205 Trp Ala Ile Ser Thr Pro Asn Lys Tyr Glu Asn Gly Ala Ser Thr Ile 210 215 220 Ala Ala Lys Ala Met Ala Ala Gly Ile Pro Gly Ile Arg Val Asp Gly 225 230 235 240 Asn Asp Leu Leu Ala Ser Tyr Glu Val Ile Lys Glu Ala Val Asp Tyr 245 250 255 Ala Arg Ser Gly Asn Gly Pro Val Leu Val Glu Phe Val Thr Trp Arg 260 265 270 Gln Gly Val His Thr Ser Ser Asp Asn Pro Arg Ile Tyr Arg Thr Val 275 280 285 Glu Glu Glu Arg Glu His Glu Lys Trp Glu Pro Met His Arg Ile Glu 290 295 300 Lys Tyr Met Phe Asp Arg Gly Ile Leu Asp Ser Ala Glu Lys Gln Lys 305 310 315 320 Ile Trp Asp Glu Ala Leu Ala Ile Val Lys Glu Thr Tyr Glu Lys Ser 325 330 335 Leu Val Gly Leu Glu Ser Thr Ile Asp Glu Ile Phe Asp His Thr Tyr 340 345 350 Lys Val Leu Pro Pro Glu Leu Glu Glu Gln Lys Gln Glu Ala Leu Glu 355 360 365 Phe Phe Lys Gly Val Lys 370 <210> 9 <211> 447 <212> PRT <213> Mycoplasma hyopneumoniae <400> 9 Met Lys Trp Asn Lys Phe Leu Gly Leu Gly Leu Val Phe Pro Leu Ser 1 5 10 15 Ala Ile Ala Thr Ile Ser Ala Gly Cys Trp Asp Lys Glu Thr Thr Lys 20 25 30 Glu Glu Lys Ser Ala Asp Asn Gln Asn Lys Gln Ile Thr Asp Val Ser 35 40 45 Lys Ile Ser Gly Leu Val Asn Glu Arg Lys Ser Glu Ile Met Ala Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Ala Asn Lys His Phe Gly Leu Asn Met Ala Ile Val Thr 65 70 75 80 Ala Asp Gly Thr Val Asn Asp Asn Ser Phe Asn Gln Ser Ser Trp Glu 85 90 95 Ala Ile Gln Gln Leu Gly Ala Leu Thr Gly Gly Glu Ile Thr Ser Val 100 105 110 Asp Ser Ser Thr Ala Glu Leu Glu Gly Lys Tyr Ser Ser Leu Ala Asn 115 120 125 Thr Asn Lys Asn Val Trp Val Leu Ser Gly Phe Gln His Gly Asp Ala 130 135 140 Ile Thr Lys Trp Leu Lys Ile Pro Glu Asn Lys Gln Leu Phe Thr Glu 145 150 155 160 Lys Asn Ile Ile Ile Leu Gly Ile Asp Trp Thr Asp Thr Glu Asn Val 165 170 175 Ile Pro Thr Gly Arg Tyr Ile Asn Leu Thr Tyr Lys Thr Glu Glu Ala 180 185 190 Gly Trp Leu Ala Gly Tyr Ala Asn Ala Ser Phe Leu Ala Lys Lys Phe 195 200 205 Pro Ser Asp Pro Thr Lys Arg Ser Ala Ile Val Ile Gly Gly Gly Ile 210 215 220 Phe Pro Ala Val Thr Asp Phe Ile Ala Gly Tyr Leu Ala Gly Ile Lys 225 230 235 240 Ala Trp Asn Leu Lys Asn Ser Asp Lys Lys Thr Lys Ile Thr Thr Asp 245 250 255 Lys Ile Glu Ile Asn Leu Gly Phe Asp Phe Gln Asn Thr Ser Thr Lys 260 265 270 Glu Arg Leu Glu Gln Ile Ala Ser Lys Asp Lys Pro Ser Thr Leu Leu 275 280 285 Ala Val Ala Gly Pro Leu Thr Glu Ile Phe Ser Asp Ile Ile Ala Asn 290 295 300 Gln Asn Asp Arg Tyr Leu Ile Gly Val Asp Thr Asp Gln Ser Leu Val 305 310 315 320 Tyr Thr Lys Thr Lys Asn Lys Phe Phe Thr Ser Ile Leu Lys Asn Leu 325 330 335 Gly Tyr Ser Val Phe Ser Val Leu Ser Asp Leu Tyr Thr Lys Lys Ser 340 345 350 Asn Ser Arg Asn Leu Ala Gly Phe Glu Phe Gly Lys Lys Ser Ala Thr 355 360 365 Val Tyr Leu Gly Ile Lys Asp Lys Phe Val Asp Ile Ala Asp Thr Ser 370 375 380 Leu Glu Gly Asn Asp Lys Lys Leu Ala Thr Glu Ala Ile Ser Glu Ala 385 390 395 400 Lys 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Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 caatatgtcg acttattttg atttaaaagc aggacctaaa t 41 <210> 25 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gatataggat ccattggact aacaattttt gagaaatcat ttag 44 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 caatatgtcg acttattcct aaatagcccc ataaagtg 38 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gatataggat ccatggacaa attttcacga actgttct 38 <210> 28 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 caatatgtcg acctagattt taaaggattt ttttaattca ataatataat c 51 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gatataggat ccatggacaa atttcgctat gtaaagcctg 40 <210> 30 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gctaacaaaa gatgactggt ttgtcccagc ttttcg 36 <210> 31 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 cgaaaagctg ggacaaacca gtcatctttt gttagc 36 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 cttgcaaatg caatattgga atggtagcga aaaagg 36 <210> 33 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 cctttttcgc taccattcca atattgcatt tgcaag 36 <210> 34 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cgaggcgcta aatattgcaa gtatttggaa atggccagtt gttttttgcg taaataac 58 <210> 35 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gttatttacg caaaaaacaa ctggccattt ccaaatactt gcaatattta gcgcctcg 58 <210> 36 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 gttttttgcg taaataacaa tcaatgggca atttcaaccc caaataaata tg 52 <210> 37 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 catatttatt tggggttgaa attgcccatt gattgttatt tacgcaaaaa ac 52 <210> 38 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gttgagtttg taacttggcg tcaaggtgtt catacc 36 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 ggtatgaaca ccttgacgcc aagttacaaa ctcaac 36 <210> 40 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 gagaacacga aaaatgggaa ccaatgcacc gg 32 <210> 41 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 ccggtgcatt ggttcccatt tttcgtgttc tc 32 <210> 42 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 ccgaaaaaca aaaaatttgg gatgaagcgc ttgcgattg 39 <210> 43 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 caatcgcaag cgcttcatcc caaatttttt gtttttcgg 39 <210> 44 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 caatatgtcg acttatttta ctcctttaaa aaattcaagc gcttc 45 <210> 45 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gatataggat ccatgaaatg gaataaattt cttggcttag gcttagtttt tc 52 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 catttaacca atcaagttgg gaggcaattc aacaacttgg 40 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 ccaagttgtt gaattgcctc ccaacttgat tggttaaatg 40 <210> 48 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 ctaataccaa caaaaatgtt tgggtacttt ctggttttca acacg 45 <210> 49 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 cgtgttgaaa accagaaagt acccaaacat ttttgttggt attag 45 <210> 50 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 cggtgatgcg atcacaaaat ggttaaaaat ccctgaaaat aagc 44 <210> 51 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 gcttattttc agggattttt aaccattttg tgatcgcatc accg 44 <210> 52 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 ttatcatact cggaattgac tggactgata ctgaaaatgt aattc 45 <210> 53 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 gaattacatt ttcagtatca gtccagtcaa ttccgagtat gataa 45 <210> 54 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 gaagaagccg gatggcttgc aggatatgc 29 <210> 55 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 gcatatcctg caagccatcc ggcttcttc 29 <210> 56 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 ggttatctag ccggaattaa agcttggaat ctaaaaaatt ctgataaaaa aac 53 <210> 57 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 gtttttttat cagaattttt tagattccaa gctttaattc cggctagata acc 53 <210> 58 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 caatatgtcg acttaatttt tattaatatc ggtaattagt ttgtctaagc 50 <210> 59 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 59 gatataggat ccttatccta taaatttagg cgttttttcc 40 <210> 60 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 caattaataa agttttgttt ggttggatga ttaataaagc acttgctgat cc 52 <210> 61 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 ggatcagcaa gtgctttatt aatcatccaa ccaaacaaaa ctttattaat tg 52 <210> 62 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 62 gatattaaag aaattgaaag aatctggaaa aaatatgtct ccgatgatca agg 53 <210> 63 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 63 ccttgatcat cggagacata ttttttccag attctttcaa tttctttaat atc 53 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 64 gccctttcag gaggctccac tgattcggca 30 <210> 65 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 65 tgccgaatca gtggagcctc ctgaaagggc 30 <210> 66 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 66 gccgcaaaag cttttgttaa atggcttttg acagaaaaaa tagtct 46 <210> 67 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 67 agactatttt ttctgtcaaa agccatttaa caaaagcttt tgcggc 46 <210> 68 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 68 caatatgtcg acttattttg atttaaaagc aggacctaaa t 41 <210> 69 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 69 gatataggat ccattggact aacaattttt gagaaatcat ttag 44 <210> 70 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 70 ctaacttctc taaaaggttg gaaagaagaa gatgattttg 40 <210> 71 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 71 caaaatcatc ttcttctttc caacctttta gagaagttag 40 <210> 72 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 72 ctttctatta cttttgaact ctgggaccca aatggtaaat tagtatc 47 <210> 73 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 73 gatactaatt taccatttgg gtcccagagt tcaaaagtaa tagaaag 47 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 74 ccctgaagga gattggataa ctttagggag 30 <210> 75 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 75 ctccctaaag ttatccaatc tccttcaggg 30 <210> 76 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 76 ctaccaggaa ctacctggga tttccatgtt gaac 34 <210> 77 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 77 gttcaacatg gaaatcccag gtagttcctg gtag 34 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 78 ggacaactaa tttggagcca gttagcttcc 30 <210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 79 ggaagctaac tggctccaaa ttagttgtcc 30 <210> 80 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 80 ggaacaaaaa aggaatggat tcttgtagga tctgg 35 <210> 81 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 81 ccagatccta caagaatcca ttcctttttt gttcc 35 <210> 82 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 82 ccaatacgca aatatggata acccgtctag gaac 34 <210> 83 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 83 gttcctagac gggttatcca tatttgcgta ttgg 34 <210> 84 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 84 ccaaggggaa gttctctgga ctactattaa atccaaac 38 <210> 85 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 85 gtttggattt aatagtagtc cagagaactt ccccttgg 38 <210> 86 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 86 caaaaaactt cacctttggt ggattgctaa tgatagc 37 <210> 87 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 87 gctatcatta gcaatccacc aaaggtgaag ttttttg 37 <210> 88 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 88 caatatgtcg acttattcct aaatagcccc ataaagtg 38 <210> 89 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 89 gatataggat ccatagcttc aaggtcgaat acaactgc 38 <210> 90 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 90 aataattgca gaaaaaattc ttaaagatca atggaaaaca agtaaatatt ctgattttta 60 ttcacaat 68 <210> 91 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 91 attgtgaata aaaatcagaa tatttacttg ttttccattg atctttaaga attttttctg 60 caattatt 68 <210> 92 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 92 caatatgtcg acttaattta ccttttggag tatcccattt tc 42 <210> 93 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 93 gatataggat ccatggacaa attttcacga actgttct 38 <210> 94 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 94 caatagtgac aatggacccc ccaaatgttg gtcg 34 <210> 95 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 95 cgaccaacat ttggggggtc cattgtcact attg 34 <210> 96 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 96 gataaaggcg catcatggct tgcgcttgca ccaac 35 <210> 97 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 97 gttggtgcaa gcgcaagcca tgatgcgcct ttatc 35 <210> 98 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 98 ggaaaactta aaggtaaatg gacttttgga ctaacctatt t 41 <210> 99 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 99 aaataggtta gtccaaaagt ccatttacct ttaagttttc c 41 <210> 100 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 100 caatatgtcg acctagattt taaaggattt ttttaattca ataatataat c 51

Claims

P132의 단백질을 포함하는 활성 성분; 및
약학적으로 허용가능한 항원보강제를 포함하며,
상기 P132는 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함하는 것인 마이코플라즈마 하이오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae) 감염을 예방하기 위한 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 활성 성분은 상기 조성물의 전체 부피를 기초로 50 내지 3500㎍/mL의 농도인 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 약학적으로 허용가능한 항원보강제는 완전 프로인트 항원보강제, 불완전 프로인트 항원보강제, 알루미나 겔, 계면활성제, 폴리음이온 항원보강제, 펩타이드, 오일 에멀젼 또는 이들의 조합인 조성물.
제 1 항에 있어서,
약학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함하는 것인 조성물.
제 4 항에 있어서,
상기 약학적으로 허용가능한 첨가제는 용매, 안정화제, 희석제, 방부제, 항균제, 항진균제, 등장제, 흡수 지연제 또는 이들의 조합인 조성물.
플라스미드를 포함하는 마이코플라즈마 하이오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae) 감염을 예방하기 위한 발현 벡터로서; 상기 플라스미드는
SEQ ID NO: 06으로 이루어진 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열; 및
조절 요소;를 포함하며,
상기 플라스미드는 융합 파트너를 암호화하는 유전자를 더 포함하며, 상기 융합 파트너는 대장균의 MsyB, 대장균의 YjgD, 람다 박테리오파아지의 단백질 D, 또는 에스. 세레비시에(S. cerevisiae)의 SUMO인 발현 벡터.
제 6 항에 있어서,
상기 조절 요소는 프로모터 및 리보솜 결합 부위를 포함하는 것인 발현 벡터.
제 6 항에 있어서,
상기 플라스미드는 pET-MSY, pET-YjgD, pET-D, 또는 pET-SUMO인 발현 벡터.
제 6 항에 있어서,
대장균 유전자 발현 시스템에 사용되는 것인 발현 벡터.