KR20170086052A - Il-12 조성물 및 조혈 회복에의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본원의 양태 및 구현예는 개체에서 조혈 회복 HSCT 이식을 개선시키는데 유용한 인터루킨 12(IL-12)를 포함하는 치료방법 및 조성물을 제공한다. 특히, 본원의 개시는 IL-12 촉진된 조혈 및 치명적으로 조사된 마우스에서 BMCT만큼 효과적으로 증가된 말초 혈구의 회복 및 생존을 포함하는 예시적인 방법 및 조성물을 제공하고, 이는 rHuIL-12 요법이 HSCT 후 HSC 생착을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들은 IL-12의 잠재적 표적인 조사된 마우스 골수에서 IL-12Rβ2 발현 세포를 확인하였다. rMuIL-12의 투여는 마우스 골수에서 IL-12Rβ2를 발현하는 Lin-세포의 수를 증가시켰고, 이는 골수 HSC 및 니치(niche) 세포가 rMuIL-12의 직접 표적이고, rMuIL-12의 조혈-촉진 활성은 HSC 상의 IL-12 수용체에 의해 매개됨을 나타낸다. 마지막으로, 본 발명자들은 인간의 골수 lin- 및 CD34+ 세포 상의 IL-12β2의 발현을 밝혔고, 이는 인간 이식에서 IL-12의 잠재적인 역할을 나타낸다.

Description

IL-12 조성물 및 조혈 회복에의 사용 방법 {IL-12 COMPOSITIONS AND METHDOS OF USE IN HEMATOPOIETIC RECOVERY}

연관 출원의 상호 참조

본 출원은 2014년 10월 31일자로 출원된 미국 예비출원 제 62/073,197호의 우선권 이익을 주장하며, 그 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다.

기술분야

본 발명은 일반적으로 이식을 위한 신규한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 줄기세포 이식 후 조혈 회복을 촉진하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것으로서, IL-12를 포함하는 약학적 조성물의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.

다음은 본원의 다양한 양상 및 구현예를 이해하는데 유용할 수 있는 정보를 포함한다. 본원에 제공된 정보가 본원에 기술된 또는 청구된 발명에 대해 선행 기술 또는 관련기술이거나, 특정 또는 암시적으로 언급된 모든 출판물 또는 문서가 선행기술임을 인정하는 것은 아니다.

줄기세포 이식은 혈액, 골수 또는 특정 암의 질병이 있는 사람들을 위해 수행될 수 있는 혈액학 및 종양학 분야의 의료 방법이다. 조혈모세포 이식은 많은 합병증이 있는 위험한 방법이며, 전통적으로 생명을 위협하는 질병을 가진 환자를 위해 마련되었다. 심각한 자가 면역 질환 및 심혈관 질환과 같은 비 악성 및 비-혈액학적 징후에서 때때로 실험적으로 사용되지만, 치명적인 합병증의 위험이 너무 높아서 더 많이 수용될 수 없었다.

조혈모세포이식을 위한 세계 네트워크(Worldwide Network for Blood and Marrow Transplantation)에서 실시한 71개국 1327개 센터에 대한 전 세계적인 조사에 따르면, 총 50,417건의 첫 번째 조혈 줄기세포 이식이 2006년 전 세계적으로 수행된 것으로 보고되었다. 이 중 28,901명(57%)이 자가 조직이었고, 21,516명(43%)은 동종이계(가족 기증자가 11,928명, 친족이 아닌 기증자가 9,588명)이었다. 이식의 주된 적응증은 림프 증식성 질환(54.5%)과 백혈병(33.8%)이었으며, 대다수는 유럽(48%) 또는 아메리카(36%)에서 발생했다. 2009년 세계 골수 기증자 협회에 따르면 전 세계적으로 친족이 아닌 이식에 제공된 줄기세포 제품은 15,399(골수 기증이 3,445건, 말초 혈액 줄기세포 기증이 8,162건, 제대혈 유닛 3,792건)로 증가했다.

과거에는 조혈 줄기세포를 골수에서 직접 수득하였으나, 현재 이 줄기세포는 환자들이 줄기세포를 골수에서 순환계로 이동시키는 성장 인자를 받은 후 환자의 혈류에서 직접 수집할 수 있다. 줄기세포를 수득하는 데 사용되는 도구를 애피레시스(apheresis) 장치라고 한다. 이 유형의 이식은 줄기세포가 고용량 요법이 주어지기 전에 환자로부터 실제로 수집되기 때문에 자가이식으로 불리운다. 다른 주요 형태의 이식은 조혈 줄기세포가 기증자(일반적으로 형제 또는 자매 또는 일치하는 기증자)로부터 수집되는 동종이식을 일컫는다. 환자가 근본적으로 새로운 면역계를 얻게됨에 따라 동종이식은 추가적인 이점을 가지고 있다. 과학자들은 이것이 고용량 요법을 받은 후에도 남아있는 종양 세포를 박멸할 수 있는 새로운 면역계임을 알게되었다. 이 현상은 이식편 대 종양(GVT) 효과로 알려져 있다.

널리 사용되긴 하지만, 조혈모세포 이식은 자가 또는 동종이든 간에 매우 위험한 방법으로 남아 있다. 따라서 조혈모세포 이식의 분야는 지난 5년에서 10년 동안 변화를 겪어왔다. 특히, 동종이식 후 재발한 환자가 이후 완전 관해로 되돌아가고 기증자의 면역 효과 세포(T-림프구)가 환자에게 다시 주입되었을 때 궁극적으로 그들의 질병을 완치한 현상이 주목되었다. 이 정보는 이식 분야의 패러다임 변화를 가져오고 따라서 "미니-알로(mini-allo)"이식, "트랜스플랜트 라이트(transplant lite)", "드라이브-스루(drive-thru)"이식, "감소된 강도(reduced intensity)"이식 또는 "혼합 키메라(mixed chimera)"이식과 같은 다른 이름으로도 알려져 있는 비-골수절제 동종 이식 줄기세포 이식의 탄생을 가져온다.

그러나 미니-이식 및 조혈모세포 이식을 위한 새로운 방법의 도입에도 불구하고 감염 및 기타 합병증의 위험은 여전히 높다. 주요 합병증은 정맥폐쇄병, 점막염, 감염(패혈증), 이식 편대-숙주 질환 및 새로운 악성 종양의 발병이다. 따라서, 조혈모세포 이식 방법을 진행중인 환자에 대한 결과를 개선하는 데 도움을 줄 수 있는 신규한 약제가 요구된다. 이러한 신규한 약제는 조혈세포 이식 후 심각한 합병증의 가능성을 줄이면서 조혈 회복 기회를 증가시킨다.

발명의 요지

따라서, 조혈 줄기세포 이식(HSCT) 후 조혈 회복에 유용한 신규 한 방법 및 조성물이 요구된다.

본원은 조혈 및 선천성 면역의 다중 경로를 표적으로 하고 조혈 줄기세포 이식(HSCT) 후 조혈 회복을 포함하는 광범위한 임상 장애에 대해 치료학적으로 사용될 수 있는 방법 및 치료제를 제공한다. 일부 양태에서, 본원은 HSCT후 조혈 회복을 개선시킬 수 있는 방법 및 치료제를 제공한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 재조합 인간 인터루킨-12(rHuIL-12) 및/또는 그의 마우스 상동체(homologue), IL-12 (rMuIL-12)를 포함하는 조성물 및 전신 방사선 조사(total body irradiation: TBI) 전후에 투여된 단일 저용량을 사용하여 골수를 재구성하기 위해 이들 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 놀랍게도 예를 들어, 재조합 인간 인터루킨-12(rHuIL-12) 및 그 마우스 상동체(homologue)인 IL-12(rMuIL-12)는 전신 방사선 조사(TBI) 전후 단일 저용량 투여를 사용하여 골수를 재구성하는 현저한 능력을 보였다.

다른 양태에서, 본 발명은 예를 들어, rHuIL-12와 HSC 및 니치 세포 상에 발현되는 IL-12 수용체의 상호 작용을 통해 작용할 수 있는 조혈을 자극하기 위해, rHuIL-12를 투여하는 방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 조혈모세포 이식의 보조제로서 rHuIL-12을 처리하는 방법 또는 이식 후 HSC 생착 및 골수 회복을 향상시키는 다른 방법에 관한 것이다.

하나의 양태에서, 골수절제(myoablation) 및 비-골수절제술(non-myoablation) 후 실질적으로 분리된 IL-12를 포함하는 치료학적으로 유효량의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 이온화 방사선에 개체를 노출시킨 후, 개체를 시스템, 기관, 조직 또는 세포 손상으로부터 보호하는 방법. 예시적인 골수절제 방법은 예를 들어, 방사선, 화학요법 및/또는 방사선 및 화학요법을 포함할 수 있다. 예시적인 비-골수절제 방법은 예를 들어, 미니-이식 또는 감소된 강도 컨디셔닝을 포함할 수 있다.

하나의 양태에서, 골수절제 방사선은 전신 방사선 조사로서 수용된다.

하나의 양태에서, 방사선은 둘 이상의 분할로 분할된 선량으로서 수용된다. 또 다른 구현예에서, 방사선은 과분할 조사 요법에서 분할된 선량으로서 수용된다. 또 다른 양태에서, 방사선은 가속된 분할 요법에서 분할된 선량으로서 수용된다.

하나의 양태에서, IL-12의 유효량은 50 내지 300ng/Kg의 하나 이상의 투여량으로 주어진다. IL-12의 다른 유효 투여량은 100-200ng/kg의 용량 범위에 있다.

하나의 양태에서, IL-12의 하나 이상의 유효량(들)은 HSCT 전에 주어진다. 다른 양태에서, IL-12의 하나 이상의 유효량(들)은 HSCT 전후에 주어진다. 또 다른 양태에서, 하나 이상의 IL-12의 유효량(들)은 HSCT 후에 주어진다.

하나의 양태에서, IL-12의 하나 이상의 유효 투여량은 국소, 피하, 피내, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 경막 외, 비경구, 비강 내 및/또는 두개 내로 투여된다.

하나의 양태에서, 예시적인 방법 및/또는 조성물로서, 본원에서는 생체 내 마우스에서의 rMuIL-12 및 골수 세포 이식(BMCT)의 조혈 촉진 작용을 비교하였고, rHuIL-12의 잠재적 세포 표적 및 시험관 내 인간 조혈에서 IL-12 수용체의 역할을 입증했다.

또 다른 양태에서, 예시적인 방법 및/또는 조성물로서, 본원은 치명적으로 마우스에 적어도 1회 저-용량(10ng/마우스) rMuIL-12의 투여는 BMCT만큼 효과적으로 증가된 생존 및 말초 혈구 회복을 입증하였다. 일 구현예에서, 방사선 12일 후, rMuIL-12로 처리된 마우스의 골수는 IL-12 수용체 β2 서브유닛(IL-12Rβ2)-발현 골수 전구세포, 거핵구 및 골아세포의 존재를 특징으로 하였다.

하나의 양태에서, 예시적인 방법 및/또는 조성물로서, rMuIL-12의 투여는 또한 마우스 골수 Lin- 세포에서 IL-12Rβ2 발현 세포의 수를 증가시켰다. 일 구현예에서, 인간 골수 세포의 분석은 다능성 Lin-세포 및 CD34+ 세포가 조혈모세포(HSC)의 다른 마커와 함께 IL-12Rβ2를 발현한다는 것을 나타내었다.

본 명세서에 기술되고 청구된 본 발명은 이 요약서에 개시, 기술되거나 참조된 것들을 포함하는 많은 속성들 및 구현예들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 모든 것을 포함하는 것은 아니고, 본 명세서에 기술되고 청구된 발명은 설명의 목적으로만 포함되고 제한되는 것이 아니며, 이 간략한 요약에 식별된 특징 또는 구현예에 의해 제한되지 않는다. 추가적인 구현예는 이하의 상세한 설명에 개시 될 수 있다.

도 1은 마우스의 생존(a)과 회복(b-d)을 골수 세포 이식 (BMCT)과 유사한 정도로 증가시키는 rMuIL-12의 효능을 나타낸 것이다. 동물들은 비히클, rMuIL-12(10ng/마우스) 또는 BMCT (1.1×10⁶ 세포)를 정맥 주사하여 35일 동안 생존과 혈구 수를 관찰하였다. TBI = 총 신체 방사선.
도 2. rMuIL-12는 마우스에서 조혈 재구성을 증가시켰다. IL-12Rβ2로 염색된 대퇴 골수 단면은 비-조사된 비 처리 마우스(a) 및 비히클 또는 rMuIL-12(20ng/마우스)로 피하 투여된 동물에 대해 TBI 후 12일째에 나타냈다. 비히클로 처리된 마우스는 IL-12Rβ2를 발현하는 세포 및 조혈 재생(b)의 징후가 보이지 않는 반면, rMuIL-12로 처리된 마우스는 조혈 재구성 및 IL-12Rβ2-발현 거핵구, 골수계 전구세포 및 골아세포(c-d)의 존재를 나타냈다. rMuIL-12 처리 후 조혈 및 IL-12Rβ2를 발현하는 줄기와 비 줄기세포를 참고. 배율 = 100×.
도 3. 소주골(Trabecular bone) 가까이에서 관찰된 거핵구 섬. 대퇴 골수 단면은 24시간 전 및 3일 후에 rMuIL-12(20ng/마우스)로 피하 투여한 마우스에 대해 TBI 후 12일째에 IL-12Rβ2(오렌지색)로 염색되었다. 배율 = 100×.
도 4. 마우스 골수 Lin-세포는 IL-12Rβ2를 발현하였다. Lin-세포를 마우스 골수 세포 중에서 면역 학적으로 선택하고 IL-12Rβ2에 대한 항체로 표지한 후 유동 세포계수 분석법으로 분석하였다. 게이티드 영역(Gated area)(R6)은 IL-12Rβ2를 발현하는 서브 세트를 나타내며, Lin-세포의 약 5%를 합계한다.
도 5. 인간 골수 Lin-세포 및 CD34+ 세포는 IL-12Rβ2를 발현하였다. 인간 Lin- 세포(a)와 CD34+ 세포(b,c)는 IL-12Rβ2와 CD34에 대한 항체로 표지하고 유동 세포계수 분석법(a 및 b) 또는 면역세포화학(c)로 분석하였다. 사분면은 염색되지 않은 대조군 및 아이소타입 대조군을 사용하여 설정되었다. R2: IL-12Rβ2+CD34-, R3: IL12Rβ2+CD34+, R5: IL-12Rβ2-CD34+.
도 6. 인간 Lin-IL-12Rβ2+ 세포 및 CD34+ IL-12Rβ2 세포는 다른 줄기세포 마커를 공동 발현하였다. Lin-세포(a)와 CD34+ 세포(b)를 IL-12Rβ2에 대한 항체와 줄기세포의 표시된 마커로 공동 표지하고 유동 세포계수 분석법으로 분석하였다. 참고: IL-12Rβ2는 Lin 세포의 1-4% 및 CD34+ 세포의 6-50%에서 발현됨.
도 7. TBI에 노출되고 TBI 24시간 후 비히클 또는 rHuIL-12로 처리된 리서스 원숭이(rhesus monkey)의 생존.
각 처리 그룹에 대한 연구 기간동안 생존의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 플롯이 표시된다. 각 투여 그룹은 18마리의 동물로 구성되었다. 로그 랭크 p-값은 비히클-처리된 대조군에 대해 50ng/kg, 100ng/kg, 250ng/kg 및 500ng/kg 투여 그룹 각각 0.0305, 0.0344, 0.0404 및 0.0265 이었다.
도 8. 치명적인 TBI에 노출되고 TBI 24시간 후 비히클 또는 rHuIL-12(평균±SEM)로 처리된 리서스 원숭이에서 시간 경과에 따른 혈구 수.
a) 혈소판; b) 평균 혈소판 부피; c) 호중구; d) 림프구; e) 망상적혈구. 정상 범위는 다음과 같다: 림프구, 1.85 내지 8.71×10⁹/L; 호중구, 1.21 내지 10.29×10⁹/L; 혈소판, 252 내지 612×10⁹/L; 평균 혈소판 부피, 6.3 내지 9.4×10⁹ / L; 망상적혈구, 29.9 내지 103.9×10⁹/L.
도 9. 골수 재생 섬의 동정.
(a) 재생 골수의 조직병리학적 동정. 절제된 골수에 나타나는 세포 집단을 하나의 재생 섬으로 기록하였다. 왼쪽 패널, 절제된 골수; 중간 패널, 재생 골수; 오른쪽 패널, 조사되지 않은 골수(Olympus BX41 복합현미경; Infinity Analyze software v5.0, 배율: 10×). (b) 비히클 처리된 대조군(오른쪽 패널, p <0.05)에 대한 개별 처리된 그룹(왼쪽 패널, 대조군에 대해 500ng/kg 그룹 p<0.01) 및 결합된 rHUIL-12-처리 그룹의 재생 섬 수의 정량화. (c) 비히클-처리된 대조군(오른쪽 패널, p <0.05)에 대한 개별 처리 그룹(왼쪽 패널, 대조군에 대해 50 및 500ng/kg 그룹 p<0.05) 및 결합된 rHUIL-12-처리된 그룹 재생 영역의 정량화. (d) 비히클-처리된 대조군(오른쪽 패널)에 대한 개별 처리 그룹(왼쪽 패널) 및 결합된 rHUIL-12-처리된 그룹의 거핵구 정량화.
도 10. rMuIL-12는 치명적으로 조사된 마우스에서 BMT만큼 효과적으로 생존율을 증가시켰다. 마우스를 비히클, rMuIL-12 x 1(TBI 24시간 전 10ng 투여), rMuIL-12 x 2(TBI 24시간 전 및 3일 후 10ng 투여), 또는 BMT(TBI 후 2시간에 1.1×10⁶ 세포 투여)로 정맥 내 처리하였다. Mantel-Cox test를 이용하여 각 그룹의 생존 곡선을 통계적으로 비교하였다.
도 11. rMuIL-12 및 BMT로 처리된, 치명적으로 조사된 마우스에서의 혈구 회복은 유사했다. 마우스를 rMuIL-12 x 1(TBI 24시간 전 10ng 투여), rMuIL-12 x 2(TBI 24시간 전 및 3일 후 10ng 투여) 또는 TBI 2시간 후에 투여한 BMT(1.1 × 10⁶ 세포)로 처리하였다. a) 호중구; b) 적혈구; c) 혈소판의 혈구 수치는 21일, 28일 및 35일에 결정하였다. 통계 분석은 스튜던트 T-검사(Student T-test)를 사용하여 수행하였다. 패널 a, b 및 c의 점선은 마우스의 정상 수준을 나타낸다. 오차 막대는 평균 ± 표준편차를 나타낸다.
도 12. 인간 골수 CD34+ 세포는 IL-12Rbeta2를 발현하였다. a) 인간 CD34+ 세포를 IL-12Rbeta2에 대한 항체로 표지하고 면역세포화학을 사용하여 분석하였다. 분석은 Olympus BX41 복합현미경, ×200(20× 대물렌즈 및 10× 접안렌즈)으로 수행하였다. b) 인간 골수 CD34+ 세포에서의 IL-12Rbeta2 발현은 유동 세포계수 분석법(표시된 도트 플롯)에 의해 분석되었다. 각 항체에 대한 아이소타입 매치된(matched) 대조군이 포함되었다. 세 가지 독립된 분석 중 하나의 대표 이미지를 나타내었다.
도 13. IL-12Rbeta2는 정상 인간 골수 유래 CD34+ 세포의 다른 줄기세포 마커와 함께 발현된다. CD34+ 세포를 IL-12Rβ2 및 표시된 줄기세포 마커에 대한 항체로 함께 표지하고 유동 세포계수 분석법으로 분석하였다. a) CD117(ckit); a) CD135(Flt3); c) CD133; d) CD318(CDCP1). 각 결과 세트에 대해, 왼쪽 패널에 아이소타입 대조군을 표시하였다. 세 가지 독립된 분석 중 하나의 대표 이미지를 나타내었다.

조혈 줄기세포 이식 (HSCT)을 포함하는, 이식 후 조혈 회복을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 조혈 줄기세포 이식 (HSCT)에는 골수, 말초 혈액 줄기세포 또는 제대혈에서 유래한 다분화 조혈 줄기세포의 이식이 포함된다. 본 명세서에서 HSCT 골수절제 방법은 방사선, 화학요법 및/또는 방사선 및 화학요법의 사용을 포함 할 수 있다. 상기 방법 및 조성물은 또한 미니-이식 또는 감소된 강도 컨디셔닝(reduced intensity conditioning)과 같은 비-골수절제 방법에 유용할 수 있다.

본 발명의 양태 및 구현예는 조혈 줄기세포 이식(HSCT)을 포함하는, 이식 후 조혈 회복을 위한 재조합 인간 인터루킨-12(IL-12) 제제를 포함하는 IL-12를 포함하는 치료 조성물 및 이의 사용 방법을 제공한다.

예시적인 조성물 및/또는 방법으로서, 재조합 인간 인터루킨-12(rHuIL-12) 및 그의 마우스 상동체(homologue)인 IL-12(rMuIL-12)는 전신 방사선 조사(TBI) 전 또는 후에 단일, 저 용량을 투여하여 골수를 재구성하는 현저한 능력을 나타낸다. 이러한 새로우며, 놀랍고 예상치 못한 발견은 rHuIL-12가 HSC 및 니치(niche) 세포에서 발현된 IL-12 수용체에 직접 작용하여 조혈을 자극한다는 증거를 제공하였다. 추가적인 임상 연구는 이식 후 HSC 생착 및 골수 회복을 향상시키기 위한 조혈세포 이식의 보조제로서 rHuIL-12 사용의 효능을 확인하였다.

본 발명은 또한 HSCT 후 조혈 회복을 개선할 수 있는 방법 및 치료제에 관한 것이다. 예를 들어, HSCT 전 IL-12 하나 이상의 유효량을 투여할 수 있다. 다른 예로, IL-12의 하나 이상의 유효은 HSCT 전후에 주어진다. 또 다른 예로서, 하나 이상의 IL-12의 유효량(들)은 HSCT 후에 주어진다.

또한, 본 발명은 근육절제 및 비-근육절제 방법 후 실질적으로 분리된 IL-12를 포함하는 약학적 조성물의 치료학적으로 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체를 이온화 방사선에 노출시킨 후 시스템, 기관, 조직 또는 세포 손상으로부터 개체를 보호하는 방법에 관한 것이다. 골수절제 방법은 예를 들어 방사선, 화학요법 및/또는 방사선 및 화학요법을 포함할 수 있다. 예시적인 비-골수절제 방법은 예를 들어, 미니-이식 또는 감소된 강도 컨디셔닝을 포함할 수 있다.

또한, 본원의 개시는 예를 들어 전신 방사선 조사로, 또는 신체 일부의 방사선 조사를 통해 수용될 수 있는 골수절제성 방사선에 관한 것이다. 방사선은 2 이상의 분획으로 분할된 선량으로서 또한 수용될 수 있다. 다른 구현예에서, 방사선은 과분할 조사 요법에서 분할된 선량으로서 수용된다. 또 다른 양태에서, 방사선은 가속 분할 요법에서 분획된 선량으로서 수용된다.

하나의 양태에서, IL-12의 유효량은 100 내지 300ng/Kg의 하나 이상의 투여량으로 주어진다.

하나의 양태에서, IL-12의 하나 이상의 유효 투여량은 국소적으로, 피하, 피내, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 경막 외, 비 경구, 비강 내 및/또는 두개 내로 투여된다.

본 발명은 또한 생체 내 조사된 개체에서의 재조합 IL-12 및 골수 세포 이식(BMCT)의 조혈-촉진 활성을 비교하고, rHuIL-12의 잠재적 세포 표적 및 시험관 내 인간 조혈에서 IL-12 수용체의 역할을 입증하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 치명적으로 조사된 마우스에 대해 저-용량(10ng/마우스) rMuIL-12의 적어도 하나의 투여는 BMCT만큼 효과적으로 생존 및 말초 혈구 회복을 증가시키는 것에 관한 것이다. 일 구현예에서, 방사선 12일 후, rMuIL-12로 처리된 마우스의 골수는 골수 전구세포, 거핵구 및 골아세포를 발현하는 IL-12 수용체 β2 서브유닛(IL-12Rβ2)의 존재를 특징으로 한다.

본 발명은 또한 마우스 골수 Lin-세포에서 IL-12Rβ2 발현 세포의 수를 증가시키는 rMuIL-12의 투여에 관한 것이다. 일 구현예에서, 인간 골수 세포의 분석은 다능성 Lin -포 및 CD34+ 세포가 또한 조혈모세포(HSC)의 다른 마커와 함께 IL-12Rβ2를 발현한다는 것을 나타내었다.

본 명세서에 기술되고 청구된 본 발명은 요약서에 개시되거나 기술되거나 참조된 것들을 포함하는 많은 속성 및 구현예를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 모든 것을 포함하는 것은 아니고, 본 명세서에 기술되고 청구된 발명은 설명의 목적으로만 포함되고 제한되는 것이 아니며, 이 요약에 식별된 특징 또는 구현예에 의해 제한되지 않는다. 추가적인 구현예는 이하의 상세한 설명에 개시될 수 있다.

본원에 사용된 IL-12는 p40 및 p35 서브유닛을 모두 포함하는 이형이량체(heterodimeric) 사이토 카인이며, 면역에서의 그의 역할에 대해 잘 알려져 있다. 약 20년에 걸친 수많은 보고서에서 IL-12는 염증 반응, 감염에 대한 선천적 저항 및 적응 면역을 조절하여 면역의 선천적 및 적응적 암(arms) 간의 상호 작용에 필수적인 역할을 하는 것으로 나타났다. 내인성 IL-12는 많은 병원균 및 이식 가능하고 화학적으로 유도된 종양에 대한 저항성에 있어 요구된다. 면역계에서 IL-12의 특징적인 효과는 자연 살해세포(NK) 대식세포 및 T 세포로부터 인터페론-감마(IFN-gamma)의 생산을 자극하는 능력이다. 또한, 90년대 초반의 여러 시험관 내 연구는 IL-12가 다른 사이토 카인과 상승 작용으로 조혈을 자극할 수 있다고 보고하였다. IL-12의 조혈-촉진 활성은 골수 줄기세포에 대한 직접 작용 때문인 것으로 보이는데, 이들 연구에서 고도로 정제된 전구세포 또는 단일세포를 사용했기 때문이다. 여러 연구가 IFN-감마에 대한 조혈의 촉진과 억제를 관련짓고 있지만, IL-12의 조혈 활성에 있어서 IFN-감마의 역할은 명확하지 않다.

인터루킨-12(IL-12)는 전신 방사선에 노출되기 전이나 직후에 방사선 보호 기능이 있는 것으로 밝혀졌다[(Neta, et al. (1994)]. IL-12는 골수를 보호하고 장관을 이온화 방사선에 민감하게 만든다 [J Immunol 153: 4230-4237; Chen, et al. (2007)]. IL-12는 이온화 방사선 후 줄기세포의 내인성 조혈 및 생착의 회복을 촉진한다(Exp Hematol 35: 203-213; 및 US20110206635 및 US7939058의 전체 개시 내용은 본원에 참고로 포함됨). 연구에서, 마우스는 치명적인 전신 방사선의 해로운 영향으로부터 구조되었다. 방사선 보호 효과는 골수에서 알려지지 않은 세포 집단, 아마도 장기간 재증식 조혈 줄기세포 내에 존재하는 것으로 보고되었다. 또 다른 연구에서, IL-12는 종양 보유 마우스의 준치사 방사선 조사 후 조기 회복 말초 혈구 수치를 제공하는 것으로 나타났다(Basile, et al. (2008) Multilineage hematopoietic recovery with concomitant antitumor effects using low dose Interleukin-12 in myelosuppressed tumor-bearing mice. J Transl Med 6: 26). 이 나중의 연구에서, IL-12는 종양 부피를 줄이는데 방사선과 상승 작용을 하는 것으로 나타났다. 특히, IL-12는 방사선 노출 전이나 후에 투여했을 때 종양 부피를 증가시키지 않았다.

따라서 IL-12는 전신 방사선 조사 후 골수의 방사선 보호에 잠재력이 있다. 그러나 초기 연구에서는 IL-12가 골수에서 방사선 보호 효과를 나타내지만 위장관(GI) 시스템이 방사선 손상에 민감해 졌다고 보고하였다(Neta, et al.). 나중의 보고에서, IL-12의 GI 감작 효과는 투여된 IL-12의 투여량에 의존하는 것으로 밝혀졌다(Chen, et al.). 골수 이외의 다른 조직이나 장기에 대한 IL-12의 방사선 보호 효과에 대한 보고는 없었다.

본 발명은 특정 마우스 재조합 IL-12(예: m-HemaMax) 및 인간 재조합 IL-12(예: HemaMax)가 개체에서 HSCT 이식 후에 조혈 회복을 개선할 수 있는 능력을 가지고 있다는 놀랍고 예상치 못한 발견에 근거한다.

조혈 줄기세포 이식(HSCT)은 고용량의 화학요법 및/또는 방사선 요법으로 파괴된 줄기세포를 복구하는 과정이다. 줄기세포 이식을 위해 전신 방사선 조사(TBI)를 받은 환자는 혈소판 수가 적다. 이러한 낮은 혈소판 수치는 출혈과 감염을 일으킨다. 현재까지 혈소판의 회복을 촉진시키는 약은 없으므로 종종 수혈이 필요하다.

HSCT에 의해 치료될 수 있는 질병, 장애 및/또는 상태는 예를 들어, 다발성 골수종; 비-호지킨 림프종(NHL); 호지킨 림프종; 급성 골수성 백혈병; 신경 모세포종; 생식 세포 종양; 자가면역 질환; 아밀로이드증을 포함한다.

자가 HSCT: 급성 골수성 백혈병; 급성 림프구성 백혈병; 만성 골수성 백혈병; 만성 림프성 백혈병; 골수 증식성 질환; 골수이형성증후군; 다발성 골수종; 비-호지킨 림프종; 호지킨병; 재생불량성 빈혈;

동종 HSCT; 순 적혈구 무형성증; 발작성 야간 혈색소 요증; 판코니 빈혈; 종증성 지중해 빈혈; 겸상 적혈구 빈혈; 중증 복합형 면역 결핍증(SCID); 비스커트-알드리치 증후군; 혈구탐식성림프조직구증식증(HLH); 선천성 대사 이상

특정 구현예에서, 종래의 BMT에 대해 이전에는 적합하지 않다고 여겨지는 환자를 위해 특별히 개발된 BMT 방법은 감소된 강도 컨디셔닝("RIC")이다. RIC 이식의 개념은 환자가 기증자의 줄기세포를 받아들이도록 하기 위해 고-용량 요법이 필요하지 않을 수 있다는 것이다. 고-용량 요법의 회피는 고령 환자 또는 기존에 건강 문제가 있는 환자에 있어서 절차를 더 안전하게 만든다. 대신, 환자는 상대적으로 독성이 적은 컨디셔닝 요법을 받는다. 환원 정도에 따라 환자를 입원 환자 유닛에 입원시키기보다는 외래 환자 유닛에서 컨디셔닝 요법을 제공한다. 감소된 강도의 컨디셔닝은 환자의 면역 시스템을 충분히 억제하여 기증자 줄기세포를 수용하도록 설계되었다.

하나의 양태에서, 골수는 전신 방사선 조사 또는 고-용량 화학요법과 전신 방사선 조사의 조합에 의해 완전히 파괴된다. 이러한 극단적 치료법의 목적은 골수에 존재할 수 있는 모든 질병 세포(예: 백혈병 세포 또는 고형 종양에서 유래된 전이된 종양 세포)를 제거하는 것이다. 상기 절차는 골수 줄기/전구세포의 이식으로 이어진다.

하나의 양태에서, 비어있는 골 공강을 다시 채우는데 사용되는 성체 줄기/전구세포는 골수(예를 들어, 후부 장골능으로부터) 또는 말초 혈액으로부터 직접 수득될 수 있다. 후자의 경우, 기증자(예를 들어, 환자 그/그녀 자신 또는 가까운 친척)는 G-CSF 및/또는 GM-CSF로 미리 처리하여 골수 세포를 동원하고 말초 혈액 전구세포의 수율을 향상시킬 수 있다. 줄기/전구세포 집단은 다양한 방법, 예를 들어 단핵구 또는 T-림프구를 제거하기 위한 자성-활성화된 세포 분류 또는 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque) 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 농축될 수 있다. 이식에 앞서, 줄기/전구세포는 일반적으로 액체 질소의 기체 상에서 Iscove's modified Dulbecco's medium과 같은 5-20% 디메틸설폭사이드-함유 배지에 보관한다. 당 업계에 잘 공지 된 줄기/전구세포의 분리, 농축 및 저장을 위한 임의의 표준화된 절차가 사용될 수 있다.

선도적인 조혈모세포 치료법(EPO)은 종양 성장에 미치는 영향에 대해 블랙 박스 경고문(black box warnings)을 받았다. 조혈모세포에 대한 HemaMax의 직접 작용 메커니즘은 TPO 모방체 및 IL-11(Neumega로 알려진)뿐만 아니라 EPO(Procrit, Aranesp, 및 Epogen로 알려진), 및 G-CSF(Neulasta 및 Neupogen 로 알려진)와 같이 다른 잘 알려진 조혈 성장 인자와 대조 될 수 있다. EPO 유사 분자는 적혈구 전구세포의 수준에서 작용하여 적혈구의 증가를 가져온다. G-CSF 유사 분자는 호중구 전구세포의 수준에서 작용하여 호중구의 증가를 가져온다. TPO 모방체 및 IL-11은 거대구 수준에서 작용하여 혈소판 증가를 유도한다. 이들 조혈 성장 인자의 표적 세포 집단은 모두 HemaMax의 표적 세포인 조혈 줄기세포의 하류에 있다.

HemaMax의 작용 메커니즘과 잘 알려진 조혈 성장 인자의 작용 메커니즘 사이에는 겹치는 부분이 없다. HemaMax의 작용 메커니즘은 다른 조혈 인자 활성의 상류에서 조혈 줄기세포의 활성화를 포함한다, 결과적으로, HemaMax는 ablation 후 조혈 및 면역 시스템을 보충하고 재생할 수 있지만, 이러한 하류 작용 인자는 전구세포를 표적으로 하여 단일 혈구 유형을 산출할 수 없다. 이 초기-작용(상류) 메커니즘을 통해, HemaMax의 전구 조혈모세포의 활성화는 모든 주요 혈구 유형을 회복시킬 수 있다. 전-임상 연구에서, HemaMax는 면역요법의 작용 메커니즘(INF-γ의 증가 및 T 및 NK 세포의 상향 조절)으로 인한 항-종양 효과를 갖는다.

HemaMax(rMuIL-12)에 대한 마우스 카운터파트(counterpart)는 준치사 또는 치사의 전신 방사선 조사(TBI)에 노출된 정상 및 종양-보유 마우스 모두에서 백혈구와 적혈구 및 혈소판을 포함한 완전한-계통의 혈구 회복을 촉진한다. HemaMax의 활성은 골수 구획에 존재하는 전구세포(조혈 줄기세포 및 비-조혈 줄기세포)의 수준에서 시작된다. 이러한 전구세포의 활성화는 방사선 요법 또는 화학요법으로 인한 골수절제 또는 골수억제 후 골수 구획의 재생을 유도한다.

HemaMax는 HSCT 이전 줄기세포의 이식 전/후에 현재 방법을 재-정의하고 HSCT 후 보조제 조혈 줄기세포(HSC) 생착 촉진제로서 독특한 역할을 한다. HSCT는 백혈병 및 림프종(신경 모세포종 및 다발성 골수종)의 치료에 가장 일반적으로 사용되며, 완화에 있어서 가장 효과적이다. HemaMax는 초기 조혈 줄기세포의 재생과 분화를 자극하여 화학요법의 치료에 의해 파괴된 줄기세포/골수를 복원할 수 있었다(HSC는 이식 전에 동원되어 이식 후 HSC 생착을 돕는다).

본원 개시의 목적 상, 다음의 정의는 전체적으로 기술 용어를 정의하고 청구항에서 보호가 요구되는 물질 조성의 범위를 정의하는데 사용된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "개체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 의미한다. "동물"은 어류, 갑각류, 파충류 및 특히 포유동물과 같은 냉혈 및 온혈 척추 동물 및 무척추 동물을 포함한다. "포유동물"은 마우스; 래트(rat); 토끼; 기니피그; 개; 고양이; 양; 염소; 소; 말; 원숭이, 침팬지, 유인원, 태아, 소아 및 성인과 같은 영장류를 제한없이 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "예방하는" 또는 "보호하는"은 전체 또는 일부의 예방, 또는 개선 또는 조절을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 치료적 처리 및 예방적(prophylactic 또는 preventative) 방법 모두를 의미하거나 치료적 잠재력을 가진 것으로 여겨지는 제제를 투여하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "약학적 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 추구하는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의약적 반응을 유도하는 활성 조성물 또는 약학적 제제의 양을 의미하고, 치료되는 질병의 증상 경감 또는 완화를 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 본원의 약학적 조성물에 대한 "유효량"은 유용성을 가지며 원하는 치료적 종점을 제공하기에 충분한 양을 지칭한다.

본원에서 사용된, 전신 방사선 조사(TBI) 후 방사선-유도된 손상은 아래와 관련된 장기, 조직, 시스템에 영향을 줄 수 있다: 골수, 림프계, 면역계, 점막 조직, 점막 면역계, 위장 계통, 심혈관 계통, 신경계, 생식 기관, 전립선, 난소, 폐, 신장, 피부 및 뇌.

본 명세서에서 사용된, 방사선 노출은 방사선-유도된 급성, 만성 및 전신 손상 영향과 관련될 수 있다. 하나의 양태에서, 본원은 방사선 유도된 급성 손상 효과를 치료하기 위한 치료적 조성물 및 이의 사용 방법을 제공한다. 예시적인 손상 효과는 항상 조사 빔에서의 정상 조직으로 제한되지는 않는다. 예시적인 손상 효과는 치료된 영역을 넘어 확장될 수 있으며, 예를 들어, 식도염(연하 곤란); 폐렴(기침, 발열, 폐액 축적); 방사선 조사에 의해 유발된 장의 염증(설사, 경련, 복통); 메스꺼움 및 구토; 피로, 설사, 두통, 조직 부종, 피부 홍반, 기침, 호흡 곤란을 포함할 수 있다. 예시적인 손상 효과는 피부 영역에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 홍반, 박리; 구강 점막, 예를 들어, 점막염, 비인강; 구강 인두; 성대; 편도선; 피부, (편평 또는 상피성 암). 특정 구현예에서, 예시적인 효과는 모세 혈관 확장증, 섬유증, 척수염 및 연골 섬유증을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 예시적인 방사선 유도된 손상 효과는 가장 빠른 속도로 분열하는 세포(골수, 비장 및 림프 조직과 같은)에 대한 손상을 특징으로 하는 혈액-생성 기관(골수) 증후군을 또한 포함할 수 있다. 예시적인 증상으로는 내부 출혈, 피로, 세균 감염 및 발열을 포함한다.

특정 구현예에서, 예시적인 방사선 유도된 손상 효과는 덜 빠르게 분열하는 세포(위와 장의 내벽과 같은)에 대한 손상을 특징으로 하는 위장관 증후군을 또한 포함할 수 있다. 예시적인 증상으로는 메스꺼움, 구토, 설사, 탈수, 전해질 불균형, 소화 능력 상실, 출혈성 궤양 및 혈액-생성 기관 증후군을 포함한다.

특정 구현예에서, 예시적인 방사선-유도 손상 효과는 또한 점막염을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 방사선-유발된 점막염은 구강 점막염이다.

특정 구현예에서, 예시적인 방사선-유발 효과는 또한 신경 세포와 같이 재생산되지 않는 세포에 대한 손상을 특징으로 하는 중추 신경계 증후군을 포함할 수 있다. 예시적인 증상으로는 조정 능력 상실, 혼란, 혼수 상태, 경련, 쇼크, 혈액 생성 기관 및 위장관 증후군의 증상을 포함한다.

특정 구현예에서, 예시적인 방사선 유발된 손상 효과는 태아 방사선 노출로 인한 태아에 대한 영향도 포함할 수 있다. 배아/태아는 특히 방사선에 민감한데, 특히 임신의 첫 20주째에 그러하다(배아/태아 세포가 빠르게 분열 중).

특정 구현예에서, 예시적인 방사선 유발된 효과는 이온화 조사에 의해 유발된, 슈퍼옥사이드, 하이드록실 라디칼, 산화질소, 산소 및 물과 이온화 조사의 반응으로부터의 페록시니트리트를 포함하는 라디칼 산소 종(ROS)의 생산에 의한 손상을 또한 포함할 수 있다.

하나의 양태에서, 본 개시는 방사선 유발된 만성 손상 효과를 치료하기 위한 치료적 조성물 및 이의 사용 방법을 제공한다. 만성 방사선 조사 효과는 모든 환자에서 중요하지만, 특히 전신 방사선 조사(TBI)를 받는 환자에서 중요하다. 전신 방사선 조사는 특히 골수 이식이 필요한 환자에 대해 일부 암 치료에서 사용된다.

예시적인 방사선 유도된 만성 손상 효과는 예를 들어, 모발 노화, 피부 얇아짐 및 건조, 백내장 형성, 조기 심근 섬유증, 심근 경색, 신경 변성, 골감소증/골연화증 및 신경인지 장애와 같은 조기 노화에 공통적인 특징을 포함 할 수 있다.

특정 구현예에서, 예시적인 방사선 유발된 효과는 또한 섬유증(정상 조직을 흉터 조직으로 대체하여 영향을 받는 부위의 움직임이 제한됨); 설사와 출혈을 일으키는 장의 손상; 기억 상실; 불임 및/또는 발암/백혈병 발생.

특정 구현예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 줄기세포 이식 후에 조혈을 개선 시키는데 유용하다. 예시적인 골수절제 전달 양상/요법은 예를 들어, 통상적인 분할 요법, 과분할 조사, 소분할 조사 및 가속 분할 조사를 포함 할 수 있다.

일 구현예에서, 치료 방식/요법은 과분할 조사 요법이다. 과분할 조사에서, 목표는 임상적으로 수용 가능한 장기간 조직 손상의 수준을 유지하면서 더 높은 종양 선량을 제공하는 것이다. 일일 선량은 변하지 않거나 약간 증가하지만 분할 당 선량은 감소하고 전체 치료 시간은 일정하게 유지된다.

일 구현예에서, 치료 방식/요법은 가속 분할 조사 요법이다. 가속 분할 조사 요법에서, 분할 당 투여량은 변화하지 않지만 일일 투여량은 증가하고, 치료를 위한 총 시간은 감소된다.

일 구현예에서, 치료 방식/요법은 연속 과분할 가속 방사선 요법(CHART)이다. (CHART)요법에서, 강렬한 치료 일정의 여러 일별 분량이 단축된 기간 내에 투여된다.

일 구현예에서, 치료 방식/요법은 IMRT이다.

화학요법과의 병용

많은 화학 치료제가 방사선 요법의 효과를 향상시킬 수 있다. 하나의 양태에서, 본원의 양태 및 구현예는 기존의 화학 치료 방식과 병용 치료로서 이용될 수 있다. 상기 병용(순차적 또는 병행의) 요법은 병용-투여 또는 동시-처방일 수 있다.

"인터루킨-12(IL-12)"는 현재 알려지거나 미래에 개발될, 현재 당 업계에 공지된 임의의 방식으로 생산되거나 미래에 개발될, 천연 IL-12 분자, 변이체 11-12 분자 및 공유 결합으로 변형된 IL-12 분자를 포함하는, 본원에 개시된 조혈 성질 중 적어도 하나를 생성하는 IL-12 분자를 지칭한다.

IL-12 분자는 실질적으로 분리된 형태로 존재할 수 있다. 생성물은 생성물의 의도된 목적을 방하지 않고 실질적으로 분리된 것으로 간주되는 담체 또는 희석제와 혼합 될 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 생성물은 또한 실질적으로 정제된 형태일 수 있으며, 이 경우 일반적으로 약 80%, 85% 또는 90%를 포함하며, 예를 들어, 적어도 약 95%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%의 펩타이드 또는 제제의 건조 중량을 갖는다.

일반적으로, 본 발명의 구현예에서 사용되는 IL-12 분자의 아미노산 서열은 본 발명의 방법에 의해 치료되는 특정 포유동물로부터 유래된다. 따라서, 예시를 돕기 위해, 인간의 경우, 일반적으로 인간 IL-12 또는 재조합 인간 IL-12는 본 발명의 방법에서 인간에게 투여될 것이며, 유사하게, 고양이과에서, 예를 들어, 고양이 IL-12 또는 재조합 고양이 IL-12가 본 발명의 방법에서 고양이에게 투여될 것이다.

그러나, IL-12 분자가 그의 아미노산 서열을 본 발명의 치료 방법의 대상인 포유동물로부터 유래하지 않는 특정 구현예가 본 발명에 또한 포함된다. 예시를 돕기 위해, 인간 IL-12 또는 재조합 인간 IL-12는 고양이 포유동물에서 이용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구현예는 IL-12의 천연 아미노산 서열이 천연 서열로부터 변경되는 IL-12 분자를 포함하나, IL-12 분자는 본원에 개시된 IL-12의 조혈 특성을 산출하는 기능을 한다. 천연 서열로부터 변경, IL-12의 종-특이적 아미노산 서열은 IL-12 1차 서열에서 변화를 포함하고, IL-12 분자를 생성하기 위한 1차 아미노산 서열에 대한 결실 및 부가를 포함한다. 고도로 유도체화된 IL-12 분자의 예는 변이체 IL-12 분자가 DNA 셔플링 방법에 의해 생산되는, Maxygen, Inc.(Leong S R, et al., Proc Nati Acad Sci USA. 2003 Feb. 4; 100 (3): 1163-8.)에 의해 제조된 재설계된 IL-12 분자이다. 미국 특허 제 4,640,835호; 제 4,496,689호; 제 4,301,144호; 제 4,670,417호; 제 4,791,192호 or 제 4,179,337호에 기재된 방식으로 유통기한, 반감기, 효능, 용해도, 전달 등, 폴리에틸렌 글리콜 그룹, 폴리프로필렌 글리콜 등의 첨가를 증가시키는 IL-12 분자에 대한 공유 결합 변형과 같이 변형된 IL-12 분자도 본 발명의 방법에 포함된다. IL-12 분자의 공유 결합 변형의 한 유형은 IL-12 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 선택된 측쇄 또는 IL-12 폴리펩티드의 N- 또는 C- 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체와 반응시킴으로써 분자 내로 도입된다. 천연 서열 IL-12 및 IL-12의 아미노산 서열 변이체는 공유 결합으로 변형 될 수 있다. 또한 본원에서 언급된 바와 같이, IL-12 분자는 재조합 방법을 포함하여 당 업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 본원에 포함된 다른 IL-12 변이체는 표준 서열이 번역 후 변형된 것, 예를 들어, 글리코실화 된 것이다. 특정 구현예에서, IL-12는 포유동물 발현 시스템 또는 세포주에서 발현된다. 일 구현예에서, IL-12는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서의 발현에 의해 생산된다.

변이체 IL-12 폴리펩티드의 특성을 사전에 예측하는 것은 종종 어렵기 때문에, 최적의 변이체를 선택하기 위해 회수된 변이체의 스크리닝이 필요하다는 것을 알 수 있다. 변이체 IL-12 분자의 혈액학적 자극 또는 강화 특성의 변화를 평가하는 바람직한 방법은 하기 개시된 치명적인 방사선 조사 구조 프로토콜을 사용하는 것이다. 산화 환원 또는 열 안정성, 소수성, 단백질 분해에 대한 감수성, 또는 담체 또는 다량체와 응집하는 경향과 같은 단백질 또는 폴리펩티드 특성의 다른 잠재적 변형은 당 업계에 공지된 방법으로 분석된다.

IL-12에 관한 일반적인 설명은 미국 특허 제 5,573,764호, 제 5,648,072호, 제 5,648,467호, 제 5,744,132호, 제 5,756,085호, 제 5,853,714호 및 제 6,683,046호에 기재되어 있다. 인터루킨-12 (IL-12)는 일반적으로 면역 반응에 관여하는 세포의 활성을 조절하는 전 염증성 사이토카인으로 기술된 이형이량체 사이토카인이다(Fitz KM, et al., 1989, J. Exp. Med. 170 : 827-45). 일반적으로 IL-12는 자연 살해 세포(NK)와 T 세포로부터 인터페론-γ(INF-γ)의 생산을 자극하고 (Lertmemongkolchai G, Cai, et al., 2001, Journal of Immunology. 166:1097-105; Cui J, Shin T, et al., 1997, Science. 278:1623-6; Ohteki T, Fukao T, et al., 1999, J. Exp. Med. 189:1981-6; Airoldi I, Gri G, et al., 2000, Journal of Immunology. 165:6880-8), favors the differentiation of T helper 1 (TH1) cells (Hsieh C S, et al., 1993, Science. 260:547-9; Manetti R, et al., 1993, J. Exp. Med. 177:1199-1204), 선천적 저항과 적응 면역 사이의 연결 고리를 형성한다. IL-12는 또한 면역-조절 및 항-혈관 신생 효과를 통해 암 성장을 억제하는 것으로 나타났다(Brunda M J, et al., 1993, J. Exp. Med. 178:1223-1230; Noguchi Y, et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11798-11801; Giordano P N, et al., 2001, J. Exp. Med. 194:1195-1206; Colombo M P, et al, 2002, Cytokine Growth factor rev. 13:155-168; Yao L, et al., 2000, Blood 96:1900-1905). IL-12는 일단 병원성 박테리아, 곰팡이 또는 세포 내 기생충과 마주하여 활성화되면 수지상세포(DC) 및 식세포(대식세포 및 호중구)에 의해 주로 생산된다(Reis C, et al., 1997, J. Exp. Med. 186 : 1819-1829, Gazzinelli RT, et al., 1994, J. Immunol. 153 : 2533-2543; Dalod M, et al., 2002, J.Exp.Med.195 : 517-528). IL-12 수용체(IL-12R)는 주로 활성화된 T 세포 및 NK 세포에 의해 발현된다(Presky DH, 등, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 14002-14007; Wu CY, et. 등, 1996, Eur J. Immunol., 26 : 345-50] 참조).

일반적으로 IL-12의 생성은 INF-γ의 생산을 자극하여 차례로 IL-12 생산을 증가시켜 긍정적인 피드백 루프를 형성한다. 시험관 시스템에서 IL-12는 초기 조혈 전구세포의 증식 및 분화를 자극하기 위해 다른 사이토카인(예를 들어 IL-3 및 SCF)과 상승 작용할 수 있다고 보고되었다 (Jacobsen SE, et al., 1993, J. Exp Med 2 : 413-8, Ploemacher RE, et al., 1993, Leukemia 7 : 1381-8, Hirao A, et al., 1995, Stem Cells 13 : 47-53).

IL-12의 생체 내 투여는 말초 혈구 수 및 골수 조혈을 감소시키는 것으로 관찰되었다 (Robertson MJ 등, 1999, Clinical Cancer Research 5 : 9-16, Lenzi R 등, 2002, Clinical Cancer Research 8 : 3686-95, Ryffel B. 1997, Clin Immunol Immunopathol.83 : 18-20, Car BD, et al., 1999, The Toxicol Pathol.27 : 58-63). INF-γ 수용체 녹아웃 마우스를 사용하여, Eng, et al. 및 Car, et al. 등은 고용량 IL-12가 일반적으로 보이는 독성 효과를 유발하지 않았음을 입증하였다. 즉, 조혈의 억제는 없었다(Eng VM, et al., 1995 , J. Exp Med.181 : 1893-8, Car BD, et al., 1995, American Journal of Pathology 147 : 1693 ~ 707). 이러한 관찰은 이전에 보고된 바와 같이, IL-12가 분화된 조혈세포의 증진을 촉진하는 일반적인 현상이 INF-γ의 생산에 의해 생체 내에서 균형을 이루고 있음을 시사하고, INF-γ는 우세한 골수 억제 방식으로 작용한다.

현재의 증거는 예시적인 IL-12 제제, 재조합 인간 IL-12(예, HemaMax)가 체내에서 적어도 4단계의 반응을 유발한다는 것을 시사한다(도 14 참조). 단계 1 반응에서, HemaMax는 방사선 민감성 면역 세포, 즉 NK 세포, 대식세포 및 수지상세포의 현존하는 증식 및 활성화를 촉진한다. HemaMax에 의해 유도된 IL-15 및 IL-18의 혈장 상승은 NK 세포의 성숙을 촉진하여, IFN-γ의 방출을 유도하며, 이것은 차례로 대식세포 및 수지상세포 및 아마도 NK 세포로부터의 내인성 IL-12 생산에 긍정적인 영향을 미친다. 이러한 사건은 HemaMax 투여 이후 초기에 선천 면역 능력을 향상시킨다. 단계 2 반응에서 HemaMax는 생존하는 조혈 줄기세포, 골아세포 및 거핵구의 증식 및 분화를 촉진하여 최적의 조혈이 뒤따르는 특정한 세포 구성으로 유도한다. CD34+, IL-12Rβ2 양성 골수 세포로부터의 HemaMax-유도된 EPO 분비는 또한 골수 내 IFN-γ의 국소 과-발현을 억제하여, 조혈세포의 팽창을 촉진시키는 환경을 제공할 수 있다. 골수에서의 조혈 재생은 선천 및 적응 면역 능력을 향상시킨다. 단계 3 반응에서, HemaMax는 GI 줄기세포를 보존하여 병원균 유출량 감소, 음식 섭취 증가, 설사 감소를 가져온다. 단계 4 반응에서, HemaMax는 다양한 장기/조직 세트에서 세포 생존력을 향상시키는 세포보호 인자, EPO의 신장 방출을 직접적으로 증가시킬 가능성이 있다. 병원체 및/또는 EPO에 의해 활성화된 수지상세포로부터의 내인성 IL-12의 계속적인 생산은 양성 피드백 고리 역할을 하며 아마도 방사선 조사 후 몇 주 동안 외인성 HemaMax에 대한 초기 반응을 유지하는 데 중요한 역할을 한다.

IL-12의 투여 방법

본 발명은 요구되는 치료 효과를 달성하기 위한 기간 동안 IL-12의 하나 이상의 유효 투여량(들)을 개체에 투여함으로써 치료하는 방법을 제공한다. 개체는 바람직하게는 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등과 같은 동물을 포함하나, 이에 제한되지 않는 포유동물이며, 가장 바람직하게는 인간이다.

다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 본 발명의 방법에 따라 IL-12를 투여하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 리포솜 안에 캡슐화, 미립자, 마이크로캡슐, IL-12를 발현 할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개 엔도시토시스(예를 들어, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262 : 4429-4432 참조), 레트로 바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 IL-12에 대한 유전자를 포함하는 핵산의 조성 등이다. 도입 방법은 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비강 내, 경막 외 및 구강 경로를 포함 하나 이에 제한되지 않는다.

IL-12는 임의의 편리한 경로, 예를 들면, 주입 또는 볼루스 주사, 상피 또는 점막 내벽(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국지적 일 수 있다. 또한, 뇌실 내 및 척추 강내 주사를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 IL-12를 포함하는 약학적 조성물을 중추 신경계에 도입하는 것이 바람직할 수 있으며; 뇌실 내 주입은 예를 들어, 옴마야 저장소(Ommaya reservoir)와 같은 저장소에 부착된 뇌실 내 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 폐 투여는 또한 예를 들어 흡입기 또는 네뷸라이저의 사용 및 에어로졸화제의 제형에 의해 사용될 수 있다. 치료를 필요로 하는 영역에 국소적으로 IL-12를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는 예를 들어, 국소 적용, 주사, 카테터, 좌제 또는 임플란트에 의해 제한없이 달성될 수 있으며, 상기 임플란트는 시알라스틱 막(sialastic membrane) 같은 막 또는 섬유를 포함하는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질로 이루어진다.

IL-12 투여의 다른 방식은 소포, 특히 리포솜에서의 전달을 포함한다. (참조: Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat, et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; 일반적으로 ibid.)

IL-12의 다른 투여 방식은 제어 방출 시스템에서의 전달을 포함한다. 특정 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다 (참조: Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald, et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek, et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). 또한, 중합체 물질이 사용될 수 있거나(참조: Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres, Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, N.Y. (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983; 참조: Levy, et al., Science 228:190 (1985); During, et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard, et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)), 제어 방출 시스템이 치료 표적, 즉 뇌에 근접하여 배치될 수 있으므로 전신 투여량의 일부만을 필요로 한다 (예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). 다른 조절 방출 시스템은 Langer (Science 249 : 1527-1533 (1990))의 검토에서 논의된다.

IL-12의 형태 및 투여량

본 발명의 구현예에서 사용하기 위한 IL-12의 적합한 투여 형태은 본질적으로 비-독성이고 비-치료적인 생리학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 이러한 담체의 예는 이온 교환기, 알루미나, 스테아르산 알루미늄, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 인산염과 같은 완충 물질, 글리신, 소르빈산, 소르빈산 칼륨, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염, 또는 프로타민 황산염과 같은 전해질, 인산수소이나트륨, 인산 수소 칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트라이실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈계 물질 및 PEG, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 또는 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌- 블록 중합체, PEG 및 나무 왁스 알콜과 같은 다당류를 포함하는 국소용 담체 또는 겔-기초 형태의 IL-12 폴리 펩타이드를 포함하며, 모든 투여에 대해, 통상적 인 저장소 형태가 적절하게 사용된다. 이러한 형태는 예를 들어, 마이크로 캡슐, 나노-캡슐, 리포솜, 플라스터, 흡입 형태, 코 스프레이, 설하 정제 및 서방형 제제를 포함한다.

서방형 제제의 적합한 예는 폴리펩티드를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형된 제품의 형태로 존재한다, 예를 들어 필름 또는 마이크로 캡슐, 서방형 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 상기 Langer, et al.,에 기재된 하이드로겔(예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜), 폴리락타이드(미국 특허 제 3,773,919 호), L-글루탐산 및 감마의 공중합체, 에틸-L-글루타메이트(상기 Sidman, et al,), 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트(상기 Langer, et al.,), Lupron Depot^TM 젖산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 마이크로스피어와 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 및 폴리-D-(-)-3-하이드 록시 부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 폴리머가 100일 이상 동안 분자를 방출 할 수 있는 반면, 특정 하이드로겔은 보다 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 IL-12 폴리펩티드가 장시간 동안 체내에 남아있을 때, 37℃에서 수분에 노출되어 변성되거나 응집되어 생물학적 활성이 상실되고 면역원성이 변할 수 있다. 관련 메커니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-디설파이드 상호 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면 설프하이드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터 동결 건조, 수분 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용, 및 특정 폴리머 매트릭스 조성의 개발로써 안정화 될 수 있다

서방형 IL-12 함유 조성물은 또한 리포솜으로 포획된 폴리펩티드를 포함한다. IL-12 폴리펩티드를 포함하는 리보솜은 Eppstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692 (1985); 황(Hwang) et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 4030 (1980); 및 미국 특허 제 4,485,045호 및 제 4,544,545호에 기재된 것과 같은, 당 업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 통상적으로, 리포솜은 지질 함량이 약 30몰보다 높은, 작은(약 200-800 옹스트롬) 단일 라멜라형이다. % 콜레스테롤, 선택된 비율은 최적의 Wnt 폴리펩티드 치료를 위해 조정된다. 향상된 순환 시간을 갖는 리포솜은 미국 특허 제 5,002,302호에 개시되었다.

질병의 치료를 위해, IL-12 폴리펩티드의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같이 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 이전의 치료, 환자의 임상 병력과 본원에 개시된 IL-12 치료 방법에 대한 반응 및 주치의의 재량에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따르면, IL-12는 한 번 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다.

질병의 유형 및 중증도에 따라 약 10ng/kg 내지 2000ng/kg의 IL-12가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이며, 예를 들어, 하나 이상의 별개의 투여에 의해, 또는 연속 주입에 의해 투여될 수 있다. 인간은 약 500ng/kg의 반복 투여량을 안전하게 견딜 수 있지만, 약 200ng/kg까지의 단일 투여량은 독성 부작용을 일으키지 않아야 한다. 예를 들어, 투여량은 G-CSF, GM-CSF 및 EPO와 같은 다른 사이토카인의 투여량과 동일할 수 있다. 며칠 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라, 바람직한 질병 증상의 억제가 나타날 때까지 치료가 지속된다. 그러나 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석법으로 쉽게 관찰할 수 있다.

IL-12는 직접 공동-투여 또는 순차 투여에 의해 다른 사이토카인과 함께 투여될 수 있다. 하나 이상의 사이토카인이 IL-12와 함께 투여되는 경우, IL-12의 보다 적은 투여량이 사용될 수 있다. 다른 사이토카인, 즉 IL-12 이외의 다른 사이토카인의 적절한 투여량은 약 1㎍/kg 내지 약 15mg/kg의 사이토카인이다. 예를 들어, 투여량은 G-CSF, GM-CSF 및 EPO와 같은 다른 사이토카인의 투여량과 동일할 수 있다. 다른 사이토카인(들)은 IL-12의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여 될 수 있다. 사이토카인(들) 및 IL-12는 결합되어 포유동물에 동시 투여하기 위한 약학적 조성물을 형성할 수 있다. 특정 구현예에서, IL-12 및 사이토카인의 양은 IL-12 및 다른 사이토카인의 투여에 따라 포유동물에서 혈구의 상승적인 재증식(또는 조혈세포의 증식 및/또는 분화의 상승적인 증가)이 일어나는 정도이다. 즉, 혈구의 재증식(또는 조혈세포의 증식/분화)에 대한 둘 이상의 약물 (즉, IL-12 및 하나 이상의 사이토카인)의 조정된 작용은 이들 분자 각각의 효과의 합보다 크다.

IL-12의 치료적 제형은 원하는 정도의 순도를 갖는 IL-12를 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington 's Pharmaceutical Sciences, 제 16 판, Osol, A., Ed., (1980)) 와 동결 건조 케이크 또는 수용액의 형태로 혼합함으로써 저장을 위해 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 인산염, 시트르산 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저 분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 슈가 알코올; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온; 및/또는 Tween®, Pluronics^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함 할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "완충제"은 약학적 제제의 pH를 안정화시키는 약학적으로 허용 가능한 부형제를 의미한다. 적합한 완충제은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 문헌에서 찾을 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 완충제는 히스티딘-완충제, 시트르산-완충제, 숙시네이트-완충제, 아세테이트-완충제, 포스페이트-완충제, 아르기닌-완충제 또는 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 언급된 완충제는 일반적으로 약 1mM 내지 약 100mM, 약 5mM 내지 약 50mM 및 약 10 내지 20mM의 양으로 사용된다. 완충된 용액의 적어도 pH는 4.0, 적어도 4.5, 적어도 5.0, 적어도 5.5 또는 적어도 6.0일 수 있다. 완충된 용액의 pH는 7.5 미만, 7.0 미만 또는 6.5 미만일 수 있다. 완충된 용액의 pH는 당 업계에 공지된 산 또는 염기, 예를 들어 염산, 아세트산, 인산, 황산 및 시트르산, 수산화 나트륨 및 수산화 칼륨으로 약 4.0 내지 약 7.5, 약 5.5 내지 약 7.5, 약 5.0 내지 약 6.5 및 약 5.5 내지 약 6.5일 수 있다. 본원에서 pH를 기술할 때, "약"은 ± 0.2 pH 단위를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "계면활성제"는 교반 및 전단과 같은 기계적 응력으로부터 단백질 제형을 보호하기 위해 사용되는 약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 계면활성제의 예로는 폴리옥시에틸렌솔비탄 지방산 에스테르(Tween), 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르(Brij), 알킬페닐폴리옥시에틸렌 에테르(Triton-X), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(Poloxamer, Pluronic) 및 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 포함한다. 적합한 계면활성제는 폴리소르베이트 20(Tween 20® 상표로 판매됨) 및 폴리소르베이트 80(상표명 Tween 80®으로 판매됨)과 같은 폴리옥시에틸렌소르비탄-지방산 에스테르를 포함한다. 적합한 폴리에틸렌-폴리 프로필렌 공중합체는 Pluronic® F68 또는 Poloxamer 188®이라는 이름으로 판매되는 것이다. 적합한 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르는 Brij®라는 상표로 판매되는 것이다. 적합한 알킬페놀폴리옥시 에틸렌 에스테르는 Triton-X라는 상표로 판매된다. 폴리소르베이트 20 (Tween 20®) 및 폴리소르베이트 80 (Tween 80®)을 사용하는 경우, 이들은 일반적으로 약 0.001 내지 약 1%, 약 0.005 내지 약 0.2% 및 약 0.01% 내지 약 0.1% w/v (중량/부피)의 농도 범위로 사용된다.

본원에 사용된 용어 "안정화제"는 제조, 저장 및 적용 중에 화학적 및/또는 물리적 분해로부터 활성 약학적 성분 및/또는 제형을 보호하는 약학적으로 허용되는 부형제를 포함 할 수 있다. 단백질 약제의 화학적 및 물리적 분해 경로는 Cleland, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 70(4):307-77 (1993); Wang, Int. J. Pharm., 7S5(2): 129-88 (1999); Wang, Int. J. Pharm., 203(1-2): 1-60 (2000); and Chi, et al., Pharm. Res., 20(9): 1325-36 (2003)에 의해 검토되었다.

안정화제는 당류, 아미노산, 폴리올, 사이클로덱스트린, 예를 들어 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린, 설포부틸에틸-베타-사이클로덱스트린, 베타-사이클로덱스트린, 폴리에틸렌글리콜, 예를 들어 PEG3000, PEG3350, PEG 4000, PEG 6000, 알부민, 인간 혈청 알부민(HAS), 소 혈청 알부민(BSA) 염, 예를 들어 염화나트륨, 염화 마그네슘, 염화 칼슘, 킬레이터, 예를 들어 이하 정의되는 EDTA를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전술한 바와 같이, 안정화제는 약 10 내지 약 500mM, 약 10 내지 약 300mM의 양 또는 약 100mM 내지 약 300mM의 양으로 제형에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 예시적인 IL-12는 안정하고 적절한 약학적 제형에 용해될 수 있다.

IL-12는 또한 예를 들어 코아세르베이션법 또는 계면 중합에 의해(예를 들어, 각각 하이드록시 메틸셀룰로즈 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트)마이크로 캡슐), 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼으로 제조된 마이크로 캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 전술 한 Remington 's Pharmaceutical Sciences에 개시되었다.

생체 내 투여에 사용되는 IL-12는 무균이어야 한다. 이는 동결 건조 및 재구성 전 또는 후에 무균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. IL-12는 일반적으로 동결 건조된 형태 또는 용액으로 저장될 것이다. 치료적 IL-12 조성물은 일반적으로 무균 접근 포트를 갖는 용기에 놓여지며, 예를 들어, 피하 주사 바늘에 의해 관통 할 수 있는 마개를 갖는 정맥 내 용액 백(bag) 또는 바이알이다.

국소적으로 투여될 때, IL-12는 담체 및/또는 보조제와 같은 다른 성분과 적절히 혼합된다. 이러한 다른 성분의 성질에는 제한이 없지만, 이들은 의도된 투여를 위해 생리학적으로 허용 가능하고 효과적이어야 하며, 조성물의 활성 성분의 활성을 저하시킬 수 없다. 적합한 비히클의 예는 정제된 콜라겐이 있거나 없는 연고, 크림, 겔 또는 현탁액을 포함한다. 조성물은 또한 경피 패치, 플라스터 및 붕대에, 바람직하게는 액체 또는 반 액체 형태로 함침될 수 있다.

겔 제형을 얻기 위해, 액체 조성물로 제형화 된 IL-12는 유효량의 수용성 다당류 또는 PEG와 같은 합성 중합체와 혼합되어 국부적으로 도포되는 적절한 점도의 겔을 형성 할 수 있다. 사용될 수 있는 다당류는 예를 들어, 알킬 셀룰로오스, 하이드록시알킬 셀룰로오스를 포함하는 에테르화된 셀룰로오스 유도체와 같은 셀룰로오스 유도체 및 알킬하이드록시 셀룰로오스, 예를 들어, 메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스, 카르복시메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 및 하이드록시프로필 셀룰로오스; 전분 및 분획된 전분; 한천; 알긴산 및 알긴산 염; 검 경작(gum arable); 풀루란; 아가로오스; 카라지난; 덱스트란; 덱스트린; 프룩탄; 이눌린; 만난(mannan); 크실란; 아라비안; 키토산; 글리코겐; 글루칸; 및 합성 생체고분자; 크산탄검과 같은 검 뿐만 아니라; 구아검; 로커스트빈검; 아라비아 검; 트라가칸트 검; 카라야 검; 및 이들의 유도체 및 혼합물을 포함한다. 본원에서 바람직한 겔화제는 생물학적 시스템에 대해 비활성이고, 비독성이고, 제조가 간단하고, 너무 묽거나 끈적거리지 않으며, 그 안에 보유된 IL-12 분자를 불안정하게 하지 않을 것이다.

바람직하게는 다당류는 에테르화된 셀룰로오스 유도체, 보다 바람직하게는 USP에서 잘 정의되고 정제되고 목록화된 것, 예컨대 메틸셀룰로스 및 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시에틸 셀룰로오스 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스와 같은 하이드록시알킬 셀룰로오스 유도체이다.

겔화에 유용한 폴리에틸렌 글리콜은 전형적으로 적절한 점도를 얻기 위해 저 분자량 및 고 분자량 PEG의 혼합물이다. 예를 들어, 분자량 400 내지 600의 PEG와 분자량 1500의 PEG의 혼합물은 페이스트를 얻기 위해 적절한 비율로 혼합될 때 이러한 목적에 효과적이다.

다당류 및 PEG에 적용되는 용어 "수용성"은 콜로이드성 용액 및 분산액을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 셀룰로오스 유도체의 용해도는 에테르기의 치환 정도에 의해 결정되며, 본원에서 유용한 안정화 유도체는 유도체가 수용성이 되도록 셀룰로오스 사슬에서 안하이드로글루코스 단위 당 충분한 양의 그러한 에테르기를 가져야 한다. 안하이드로글루코스 단위당 적어도 0.35 에테르기의 에테르 치환 정도는 일반적으로 충분하다. 또한, 셀룰로오스 유도체는 알칼리 금속 염, 예를 들어 Li, Na, K 또는 Cs 염의 형태일 수 있다.

메틸셀룰로오스가 겔에서 사용되는 경우, 바람직하게는, 겔의 약 2 내지 5%, 보다 바람직하게는 약 3%를 구성하고 IL-12는 겔의 ml 당 약 300 내지 1000mg의 양으로 존재한다.

치료학적으로 사용되는 IL-12의 유효량은 예를 들어 치료 목적, 투여 경로 및 환자의 상태에 좌우 될 것이다. 따라서, 치료자에게 있어서 최적의 치료 효과를 얻기 위해 투여량을 적정하고 투여 경로를 수정하는 것이 필요하다. 전형적으로, 임상가는 원하는 효과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 IL-12를 투여할 것이다. 전신 치료를 위한 전형적인 투여량은 위에서 언급한 요인에 따라 약 10ng/kg에서 2000ng/kg 이상까지 다양하다. 일부 구현예에서, 투여량 범위는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19에서 약 20까지; 약 30까지; 내지 약 50까지; 약 100까지, 약 200까지, 약 300까지 또는 약 500ng/kg까지이다. 하나의 양태에서, 투여량은 500ng/kg 미만이고, 다른 양태에서, 투여량은 300ng/kg 미만이다. 다른 양태에서, 투여량은 약 200ng/kg 미만이다. 다른 양태에서, 투여량은 약 100ng/kg 미만이다. 다른 양태에서, 투여량은 약 50ng/kg 미만이다. 다른 양태에서, 투여량은 약 10 내지 300ng/kg, 20 내지 40ng/kg, 25 내지 35ng/kg, 50 내지 100ng/kg의 범위 일 수 있다.

하나의 양태에서, 본원에 기술된 예시적인 치료적 조성물은 분획 요법과 병행하여 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 치료학적으로 유효량은 각 분획 전에 투여된다. 일 구현예에서, 치료 유효량은 각 분획의 투여와 거의 동시에 투여된다. 일 구현예에서, 치료학적으로 유효량은 각각의 분획 전에 주어지며, 각 분획의 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 또는 60분 전; 또는 각 분획의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12시간 후; 또는 각 분획의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 전에 이른다. 일 구현예에서, 치료학적으로 유효량은 각각의 분획 이후에 제공되며, 각 분획 후 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50분 또는 60분; 또는 각 분획 후 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12시간; 또는 각 분획 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일; 또는 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회 주간, 격주 또는 격월로 방사선 처리 동안 또는 후에 이른다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 예시적인 IL-12의 투여량은 분획된 처방으로 각 방사선 조사 전후 약 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60분, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일에 1회 내지 10회/일 최대 30일 동안 TBI 또는 국지적으로 각각의 방사선원을 사용하여 투여된다.

대체의 일반적 명제로서, IL-12 수용체는 유효하지만 과도하게 독성이 없는 최대 투여량까지 약 0.1 ng/cc 이상의 IL-12 수준을 조직 내에 형성할 수 있는 투여량으로 제형화되어 표적 부위 또는 조직에 전달된다. 이 조직-내 농도는 가능한 경우 연속 주입, 서방출, 국소 도포 또는 경험적으로 결정된 빈도로 주입을 포함하여 투여 계획에 의해 유지되어야 한다. 이 요법의 진행은 통상적인 분석법으로 쉽게 관찰될 수 있다.

"치료제 투여 시간 근처"는 약 1개월, 약 3주, 약 2주, 약 1주, 수 일, 약 120시간, 약 96시간, 약 72시간, 약 48시간, 약 24시간, 약 20시간, 수 시간, 약 1 시간 또는 수 분과 같이, 치료의 투여 전 및/또는 치료의 투여 후에 적당한 시간에 IL-12를 투여하는 것을 의미한다.

"화학요법"은 현재 의학 분야에서 알려진 또는 개발된 천연 또는 합성 약제가 포함된 모든 요법을 말한다. 화학요법의 예는 현재 이용 가능한 수많은 항암제를 포함한다. 그러나 화학요법에는 질병 상태를 치료하기 위한 천연 또는 합성 약물도 포함된다. 본 발명의 특정 구현예에서, 화학요법은 질병 상태를 치료하기 위한 몇몇 최첨단 약물의 투여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 국소 진행된 머리 편평 상피 세포 암종 환자에서 도세탁셀, 시스플라틴 및 5-플루오로우라실과 병합 화학요법, 난치성 및 재발성 지연성 림프종에서 루다라빈(ludarabine) 및 벤다무스틴을 포함한다(Tsukuda, M., et al., Int J Clin Oncol. 2004 June; 9 (3): 161-6), and fludarabine and bendamustine in refractory and relapsed indolent lymphoma (Konigsmann M, et al,, Leuk Lymphoma. 2004; 45 (9): 1821-1827).

본원에서 사용된 바와 같이, 치료 또는 우연한 이온화 방사선의 예시적인 소스는 예를 들어, 알파, 베타, 감마, 엑스레이 및 중성자 소스를 포함 할 수 있다.

"방사선 요법"이란 어떤 형태의 방사선이 질병 상태를 치료하는 데 사용되는 모든 요법을 말한다.

"고용량 요법"은 높은 준-치사 또는 거의 치사의 치료를 말한다. 고용량 치료 방식은 치료적 종점을 달성할 수 있는 능력이 향상되었지만, 일반적으로 증가된 관련 독성을 가지고 있다. 또한, 일반적으로 고용량 투여 방식은 종래의 치료 방식과 비교하여 조혈 손상이 증가한다. 고용량 치료 방식에 대한 프로토콜은 현재 사용되고 있거나 향후 사용될 프로토콜이다.

본 명세서에서 사용된 방사선 요법 "치료 방식"은 이온화 및 비-이온화 방사선원 모두를 포함할 수 있다. 예시적인 이온화 방사선 치료 방식은, 예를 들어, 외부 빔 방사선 요법; 강도 변조 방사선 요법(IMRT); 영상 유도 방사선 치료(IGRT); X 조사(예 : 광자 빔 요법); 전자 빔(예를 들어, 베타 조사); 양성자 조사; 고 선형 에너지 전달(LET) 입자; 정위 방사선 수술; 감마 칼; 선형 가속기 매개 프레임리스 정위 방사선 수술; 로봇 팔 제어 x 조사 전달 시스템; 기관 특이적 또는 암세포 특이적 흡수를 위한 방사성 동위 원소 방사선 요법; 종양 표적 방사선 요법(또는 방사성 면역 요법, RIT)을 위한 단일 클론 항체에 결합된 방사성 동위 원소; 근접 방사선 치료 (간질 또는 공동 내) 고 선량률 방사선 소스 주입; 장기 특이적 선량 전달을 위한 영구 방사성 종자 주입을 포함한다.

"투여 고밀도 치료 요법(dose dense treatment regimen)"은 일반적으로 종래의 치료 요법과 비교하여 요구되는 치료 결과를 달성하기 위해 치료가 촉진된 방식으로 순차적으로 반복되는 치료 요법이다. 본 발명의 방법은 치료의 관련된 조혈 독성을 감소시키거나 개선시킴으로써 투여 고밀도 치료 요법의 사용을 용이하게 하여, 투여 고밀도 요법을 이용하고 특정 질병 상태의 치료 성공률을 증가시킨다. (참조: 일반적으로, Hudis C A, Schmits N, Semin Oncol. 2004 June; 31 (3 Suppl 8): 19-26; Keith B, et al., J Clin Oncol. 2004 Feb. 15; 22 (4): 749; author reply 751-3; Maurel J, et al., Cancer. 2004 Apr. 1; 100 (7): 1498-506; Atkins C D, J Clin Oncol. 2004 Feb. 15; 22 (4): 749-50.)

"화학보호 또는 방사선 보호"는 질병 상태를 표적으로 하는 관련된 조혈 독성으로부터 보호 또는 질병 상태를 표적으로 하는 관련된 조혈 독성의 명백한 감소를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "급성 방사선 증후군(ARS)"(방사선 독성 또는 방사선 질환으로도 알려짐)은 매우 짧은 시간 내(예: 몇 분만에)에 많은 양의 투과성 방사선에 의해 전신(또는 대부분의 신체)의 치명적인 또는 준치사 방사선 조사를 받음으로써 유발되는 급성 질환을 특징으로 한다. ARS로 고통받는 사람들의 예로 히로시마 및 나가사키 원자 폭탄의 생존자, 1986년의 체르노빌 원자력 발전소 사건 이후 처음으로 대응한 소방관 및 살균 방사선 조사기에 대한 의도하지 않은 노출이 있다. 특정 구현예에서, 급성 방사선 증후군과 관련된 방사선 투여량은 일반적으로 크다 (즉, 0.7 Gray(Gy) 또는 70rads 이상). 특정 구현예에서, 0.3Gy 또는 30rads만큼 낮은 투여량으로 경미한 증상이 관찰 될 수 있다.

본원에서 사용된 "급격한 손상 영향" 및 "손상 효과"에는 급성 치사 및 치명적인 방사선 조사량으로 인한 방사선 유도 손상이 포함될 수 있다.

"고형 종양"은 일반적으로 혈액, 골수 또는 림프계 이외의 신체 조직의 암의 존재를 나타낸다.

"조혈 장애(암)"는 일반적으로 조혈계에서 유래된 암세포의 존재를 의미한다.

"결핍의 개선"은 조혈 결핍의 감소, 즉 결핍의 개선, 또는 현재의 의학적 관행에 의해 정의된 바와 같이 정상 상태의 부분적 또는 완전 회복을 의미한다. 따라서, 조혈 결핍의 개선은 일반적으로 또는 구체적으로 조혈의 증가, 자극, 증진 또는 촉진을 의미한다. 조혈 결핍의 완화는 일반적으로, 즉, 2개 이상의 조혈세포 유형 또는 계통을 증가시키거나, 특이적으로, 즉, 하나의 조혈세포 유형 또는 계통을 증가시키는 것으로 관찰될 수 있다.

"골수 세포"는 일반적으로 포유동물의 골수 구획 내에 및/또는 홈(home)에 있는 세포를 지칭한다. "골수 세포"라는 용어에는 조혈 기원 세포뿐만 아니라 조혈 재증식세포, 조혈 줄기세포 및/또는 전구세포, 골수에서 유래 될 수 있는 어떠한 세포, 예를 들어 내피 세포, 간엽 세포, 골 세포, 신경 세포, 지지세포(기질 세포), 이들 및 기타 세포 유형 및 계통과 관련된 줄기 및/또는 전구세포를 포함 하나, 이에 한정되지 않는다.

"조혈세포 유형"은 일반적으로 다양한 유형의 분화된 조혈세포를 말하나, 줄기세포, 전구세포 및 골수 세포, 림프 세포 등과 같은 다양한 계통 세포를 포함하는, 혈구 생산과 관련된 모든 세포 유형을 나타내는 다양한 아세포와 같은 특정 조혈세포 유형 유래의 조혈 전구세포를 또한 포함 할 수 있다.

"조혈세포 계통"은 일반적으로 골수 또는 림프구와 같은 분화된 조혈세포의 특정 혈통을 지칭하지만, 수상 돌기의, 적혈구 등 보다 분화된 계통을 나타낼 수 있다.

세포의 "IL-12 촉진된 증식"은 조혈 전구세포 및/또는 줄기세포, 그러나 골수 니치(niche)의 미세 환경을 포함하는 다른 세포를 포함하는, 포유동물의 골수에 일반적으로 존재하거나 귀소(home)하는 세포에서 적어도 부분적으로 팽창 또는 증가에 기여하는 조혈의 증가, 자극 또는 증진을 의미한다.

"조혈의 자극 또는 증진"은 포유동물이 하나 이상의 조혈세포 유형 또는 혈통이 결핍된 경우에 일반적으로 하나 이상의 조혈세포 유형 또는 계통의 증가를 말하며, 특히 하나 이상의 조혈세포 유형 또는 계통의 자극 또는 증진에 관한 것이다.

"조혈 장기 재증식 세포"는 일반적으로 골수에서 가장 원시적인 혈구이다. 그들은 다양한 혈구 유형 및 혈통의 평생 생산을 제공하는 책임이 있는 혈액 줄기세포이다.

"조혈 줄기세포"는 일반적으로 혈액 줄기세포이고; 두 가지 유형이 있다. 위에 정의된 "장기 재증식" 및 짧은 기간동안 "전구세포"를 생산할 수 있는 "단기 재증식"이 있다(포유동물에 따라 몇 주, 몇 달 또는 심지어 수 년).

"조혈 전구세포"는 일반적으로 혈액 줄기세포로부터 분화(즉, 성숙된 형태)되는 첫 번째 세포이며; 그 후 그들은 다양한 혈구 유형과 혈통으로 분화(성숙)한다.

"조혈 지지 세포"는 골수의 비-혈구이며; 이 세포들은 혈구 생산을 위한 "지원"을 제공한다. 이러한 세포는 골수 간질 세포라고도 한다.

"골수 보전"은 방사선, 화학요법, 질병 또는 독소에 의해 손상된 골수가 정상 상태 또는 거의 정상 상태로 유지되는 과정을 의미한다; "골수 회복"은 방사선, 화학요법, 질병 또는 독소에 의해 손상된 골수가 정상, 거의 정상 상태로 회복되거나 골수 기능의 측정 가능한 개선이 얻어진 과정을 의미한다; 골수 기능은 조혈(혈액) 줄기세포에서 다양한 혈구 유형 또는 계통의 적절한 수준을 생산하는 과정이다.

"골수 부전"은 방사선, 화학요법, 질병 또는 독소에 의해 손상된 골수가 정상으로 회복될 수 없으므로, 포유동물에서 적절한 조혈을 유지하기에 충분한 혈액 세포를 생성하지 못하는 병리학적 과정이다.

실시예

본 발명을 하기 실시예를 참조하여 설명한다. 이들 실시예는 설명의 목적으로만 제공되며, 본 발명은 이들 실시예에 한정되지 않고, 본원에서 제공된 교시의 결과로서 명백한 모든 변형을 포함한다.

본원에 기재된 실험에 앞서, HSCT 후 조혈 회복을 개선하기 위한 재조합 인간 인터루킨 -12(IL-12) 제제를 포함하는, 조성물 및 방법을 허용하는 공개된 프로토콜이 없었다.

본원의 양태 및 실시예는 HSCT 이식 후 개체에 투여될 때 특정 IL-12 제형이 놀랍고 예상치 못한 유용성 및 효능을 갖는다는 예상치 못한 발견으로부터 유래한다.

예로서, 치료학적으로 효과적인 IL-12 제형를 제조하는 방법이 개발되었다.

실시예 1:

재료 및 방법

rMuIL-12, 마우스 BMCT 및 인간 골수 CD34+ 세포.

rMuIL-12(재조합 마우스 IL-12)는 Neumedicines에 배타적으로 Peprotech(Catalog# 210-12), (Rocky Hill, NJ, USA) 또는 SBH Sciences(LS#45(Q4))(Natick, MA, USA)로부터 획득하였다. 마우스 및 마우스 유래 골수 세포의 연구에 rMuIL-12를 이용하였다. BMCT를 25G5/8 바늘을 사용하여 PBS로 정상 C57/BL6 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 골수 세포를 플러싱함으로써 준비하였다. 세포를 40㎛ 세포 스트레이너로 여과하고, 10% FBS를 포함하는 RPM1로 세척하여 액체 질소 중에서 동결보존 하였다. CD34를 발현하는 인간 골수 세포는 Lonza Group, Ltd,(Walkersville, MD)로부터 구입하였다.

마우스

암컷(BMCT 연구) 또는 수컷(골수 연구) C57BL/6 마우스를 Jackson Laboratories(Sacramento, CA)에서 수득했다. 마우스 연구는 BATTS Laboratories(Northridge, CA)에서 수행되었다. 연구 시작 전에 적어도 일주일 동안 마우스를 격리보관 하였다. 연구에 사용된 마우스는 8 내지 10주령이었고 질병 징후가 없이 약 20g의 무게가 나갔다. 모든 절차는 국제실험동물관리평가인증협회(Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, AAALAC) 및 미국 실험동물관리협회(American Association of Laboratory Animal Care)에 의해 승인된, BATTS 연구소 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)에 의해 검토되고 승인되었다. 연구 기간 동안, 동물의 관리 및 사용은 미국 국립 보건원(US National Institutes of Health)에 의해 출판된 실험동물의 관리와 사용에 관한 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(출판 번호: 85-23, 1996년 개정)에 설명된 원칙에 따라 수행되었다.

실시예 2:

rMuIL-12 및 BMCT로 처리된 조사된 마우스에서 생존 연구

0일 째, 방사선의 균일한 분포를 위해 마우스를 방사선 조사 장치의 중앙에 두기 위해 특별 제작된 "파이-박스(pie-box)"에서 ¹³⁷Cs 공급원을 갖는 Gammacell® 40(Theratronics, Ontario, Canada)을 사용하여 암컷 C57BL/6 마우스(n=40)에 8.2Gy의 치사량으로 TBI를 수행하였다. 마우스에 TBI(n=10) 24시간 전 또는 TBI 24 시간 전 및 3일 후 (n=10)에 10ng/마우스 용량으로 비히클(n=10) 또는 rMuIL-12를 정맥 주사하였다. 네 번째 그룹의 마우스(n=10)는 방사선 조사 2시간 후 BMCT(1.1 × 10⁶ 세포)를 투여 받았다. 마우스가 생존하는지 35일까지 관찰하였다. 이 기간 동안 마우스는 멸균된 음식과 산성화 된 물을 자유롭게 섭취할 수 있었다. 생존에 대한 그룹 간 차이를 생존 시간에 대한 Mantel-Cox Test에 이어 Kaplan-Meier 생존 분석에 의해 평가하였고, 생존율에 대해 Pearson's chi-square test에 의해 평가하였다. 혈액 샘플을 28일째 각 그룹의 동물 절반에서, 21일과 35일째 나머지 절반에서 채취하고 자동 혈색 분석기(Hemavet; Drew Scientific Inc., Waterbury CT)로 분석하였다. 혈구 수의 그룹 간 차이를 분산 분석(ANOVA)에 의해 분석하였다.

실시예 3:

마우스 골수 면역조직화학

수컷 C57BL/6 마우스(그룹당 n=2)에 8.0Gy로 TBI를 수행하고, 이어서 방사선 조사 24시간 후 1회 용량 또는 방사선 조사 24시간 및 2일 후에 2회 용량의 비히클 또는 rMuIL-12(20ng/마우스)를 피하에 투여하였다. 방사선 조사 후 12일째에 마우스를 희생시키고, 대퇴골을 분리하고 포르말린에 고정시킨 후, Cyto-Pathology Diagnostic Center, Inc.(Duarte, CA, USA)에 의해 파라핀 매입된 조직 절편을 제조하였다.

조직 절편을 크실렌으로 탈 파라핀화하고, 에탄올의 농도를 감소시키며 다시 수화하고, 항원을 회복하기 위해 열-유도된 에피토프 회수(HIER)를 수행하였다. 내인성 페록시다아제는 30분 동안 0.3% H₂O₂(VWR, San Francisco, CA)로 저해하였고 Background Sniper(Biocare Medical, LLC, Concord, CA)로 배경 염색이 차단하였다. 조직 절편을 토끼 항-마우스 IL-12Rβ2(Sigma; St Louis, MO)와 함께 항온 처리하였다. 조직 절편을 세척하고 페록시다아제 결합된 항-토끼 IgG(ImmPRESS; Vector Laboratories; Burlingame, CA)와 함께 항온 처리하였다. AEC 기질(ImmPACT AEC, Vector Laboratories, Burlingame, CA)과 항온 처리한 후, 페록시다아제 표지된 세포의 주황색 착색이 발현되었다. 조직을 CAT 헤마톡실린(Biocare Medical, Concord, CA)으로 대조하였다. 조직 절편을 Vectamount(Vector Laboratories; Burlingame, CA)에 담그고, 커버 슬립으로 덮고, 깨끗한 매니큐어로 밀봉하였으며, Olympus 복합현미경(Olympus America, Inc., Center Valley, PA)을 사용하여 20배 내지 100배까지 확대하여 시각화 하였다.

실시예 4:

인간 CD34+ 세포상의 IL-12Rβ2의 면역세포화학 분석

Lanza Group, Ltd,(Walkersville, MD)에서 수득한 인간 골수 CD34+ 세포를 5㎍/mL 피브로넥틴으로 처리한 슬라이드에 접종하고, -20℃에서 10분간 차가운 메탄올로 고정시키고, Background Sniper로 처리한 후 IL-12Rβ2에 대한 토끼 다클론 항체로 표지한 다음 겨자무과산화효소 (ImmPRESS 시약, Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 결합된 항-토끼 IgG와 배양하였다. 슬라이드를 30분 동안 InimPACT AEC 페록시다아제 기질(Vector Laboratories; Burlingame, CA)과 함께 항온 처리하고 CAT Hematoxylin(Biocare Medical, LLC, Concord, CA)에서 대조 염색하였다. 음성 대조군은 고정되고 1차 토끼 다클론 항체없이 동일한 시약으로 처리된 세포를 포함하였다. Olympus 복합현미경을 사용하여 사진을 촬영하였다.

실시예 5:

마우스 조혈 Lin- 및 Lin-IL-12Rβ2+ 세포 및 인간 조혈 Lin-세포의 제조

마우스 골수는 Bioreclamation(Liverpool, NY) 또는 BATTS Laboratories에서 수득하였다. 세포를 MACS 완충제(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)으로 희석하고 70㎛ 세포 여과기(VWR, San Francisco, CA)를 통해 여과시켰다. 이어서 세포를 MACS 완충제에서 세척하고 CD3e, CD4, CD5, CD8b, CD8a, B220, CD11b, Gr1 및 Ter(80)(Miltenyi Biotec, Auburn, CA) 계통 마커에 특이적인 비오틴-결합된 단일 클론 항체와 배양하였다. 이어서 세포를 세척하고 항 비오틴 마이크로비즈와 함께 배양하였다. Lin+ 세포는 QuadroMACS 분리기(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)의 자기장에 놓인 MACS 칼럼을 통해 세포를 통과시킴으로써 고갈시켰다. 자기 표지된 Lin+ 세포는 칼럼에 남게되고, 비표지 Lin-세포는 용출액으로서 수집된다. 선택된 연구에서 마우스 IL-12 수용체 복합체의 독특한 β2 서브유닛(IL-12Rβ2)와 반응하는 HAM10B9 항체(BD Biosciences; San Jose, CA)를 사용하여 IL-12Rβ2+ 세포 집단을 얻기 위해 MoFlow 세포 분류기(Beckman Coulter, Indianapolis, IN)에서 유동 세포계수 분석을 통해 마우스 골수 Lin 세포를 분류 하였다.

인간 골수 세포는 Lonza Group, Ltd,(Walkersville, MD)로부터 수득하였다. 세포를 MACS 완충제(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)으로 희석하고 70㎛ 세포 여과기(VWR, San Francisco, CA)를 통해 여과시켰다. 골수 단핵 세포를 Ficoll-Paque(GE Lifesciences, Piscataway, NJ)를 사용하여 밀도 구배 원심분리(4℃에서 35분 동안 455g)에 의해 분리 하였다. 200g을 10분간 추가 원심분리한 후 단핵구 분획으로부터 혈소판을 제거 하였다. 생성된 세포 펠렛을 MACS 완충제에 재현탁하고 CD2, CD3, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123 및 CD235a(글리코포린 A)(Miltenyi Biotec, Auburn, CA) 계통 마커에 특이적인 비오틴-결합된 단일 클론 항체와 배양하였다. Lin-세포는 앞서 언급한 바와 같이 자성 비즈로 Lin+ 세포를 제거한 후 수집하였다.

실시예 6:

마우스 및 인간 조혈세포의 세포계수 분석 방법

마우스 및 인간 골수 Lin-세포를 알로피코시아닌-접합된 항 인간/마우스 IL-12Rβ2, 클론 #305719(APC-IL-12Rβ2) 항체(R & D systems; Minneapolis, MN)와 함께 30분 동안 실온에서 배양하였다. 염색되지 않은 대조군 및 아이소타입 대조군이 포함되었다. 선택된 연구에서, 인간 골수 Lin-세포 및 CD34+ 세포는 또한 APC-IL-12Rβ2 항체 및 접합된 단일 clone 피코에리트린(PE)-CD34 항체, clone #563(BD Biosciences, San Jose, CA), 플루오레세인 이소티오시안산염(FITC)-ckit, clone #104D2 (Abcam; Cambridge, MA), FITC-KDR, clone #89106 (R&D systems, Minneapolis, MN), PE-CD133, clone #EMK08 (eBioscience; San Diego, CA), PE-Flt-3, clone #4G8 (BD Biosciences; San Jose, CA), PE-CDI50, clone #A12 (BD Biosciences; San Jose, CA), PE-CDCP1 항체, clone #309121 (R&D systems; Minneapolis, MN)로 표지되었다. 인간 골수 CD34+ 세포를 유사하게 APC-IL-12Rβ2 및 PE-CD34 항체와 함께 배양하였다. 세포를 세척한 후 DPBS에 재현탁하고 MoFlow 유동 세포 계측기(Beckman Coulter; Brea, CA)로 분석하였다. 각 분석에 대해 적어도 세 명의 다른 기증자가 평가되었다.

실시예 7

결과

rMuIL-12는 치명적으로 조사된 마우스에서 BMCT만큼 효과적으로 생존율을 높이고 혈구 회복을 촉진한다.

임상 HSC 이식 셋팅에 사용할 rHuIL-12의 잠재력을 입증하기 위해, 1회(TBI 24시간 전) 또는 2회 (TBI 24시간 전 및 3일 후) 정맥 내 투여된 rMuIL-12(10ng/마우스)의 생존 및 조혈 촉진 효과를 35일 간 치명적으로 조사된 마우스에서 TBI 2시간 후에 투여한 BMCT(1.1×10⁶ 전체 골수 세포)의 그것과 비교하였다. BMCT와 rMuIL-12는 두 가지 투여 일정 모두에서 근본적으로 동일한 정도로 방사선 조사에 인한 사망을 감소시켰다(도 1A). 전체 생존율은 비히클 그룹에서 0%, BMCT 그룹에서 70%, 1회 rMuIL-12 그룹에서 60%, 2회 rMuIL-12 그룹에서 90%였다(도 1A). 생존율의 그룹 간 차이는 비히클 그룹과 비교했을 때 유의성이 있었다(P <0.005). BMCT 그룹과 rMuIL-12 그룹의 생존율 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.

조사된 마우스에서 혈구 수를 분석한 결과, BMCT 및 rMuIL-12를 1회 또는 2회 투여 한 경우 말초 혈구 수가 비슷한 정도까지 증가했다(도 1B-D). BMCT 그룹과 rMulL-12 그룹에서 그룹 간 혈구 수 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 그러나, BMCT, rMuIL-12 1회 투여 그룹, rMuIL-12는 2회 투여 그룹에서 회복에 약간의 차이가 있었다. 특히, 2회 투여된 rMuIL-12 그룹에 대한 혈소판 회복은 BMCT 그룹보다 먼저 정상 혈소판 수준에 도달했다(도 1d).

실시예 8:

rMuIL-12는 조사된 골수에서 조혈을 촉진한다.

IL-12 기능은 그것의 수용체인 IL-12R, 수용체의 독특한 구성 요소인 베타 2 서브유닛(IL-12Rβ2)과의 상호 작용에 의해 유도된다. 본 발명자들은 치명적으로 조사된 마우스에서 rMuIL-12의 재생 능력이 조혈모세포(HSC)에 대한 수용체 mIL-12R의 발현에 의해 좌우된다는 가설을 세웠다. 본 발명자들은 나아가 rMuIL-12 처리된 치사량의 방사선을 조사시킨 마우스의 대퇴골 골수 절편의 표현형 분석을 통해 rMuIL-12의 조혈-촉진 활성을 평가했다. TBI 후 24시간 및 3일 후에 rMuIL-12(20ng/마우스) 또는 비히클을 피하 투여한 마우스 유래의 IL-12Rβ2에 대해 치사 방사선 조사 후 12일 및 30일 후에 대퇴골 골수를 염색하였다. 조사된, rMuIL-12로 처리된 마우스의 골수는 IL-12Rβ2-발현 골아세포, 전구세포, 세포질의 좁은 테두리로 둘러싸인 소엽 핵이 있는 미성숙 거핵구, 소엽 핵이 있는 성숙한 거핵구 및 부피가 큰 세포질의 존재를 특징으로 한다(도 2a). 반면, 방사선 조사 후 12 일째에, 조사된, 비히클-처리된 마우스 유래의 골수는 조 l혈 재생의 징후가 최소이고 IL-12Rβ2-발현 세포의 완전한 결핍을 특징으로 한다(도 2b). 골수 전구세포와 골아세포 유형은 Sca-1 및 오스테오칼신(Osteocalcin) 마커를 이용하여 면역조직화학 분석을 통해 분석하였다(데이터가 표시되지 않음). 골아세포는 동종이식 환경(EI-Badri NS 등, "Osteoblasts Promote Engraftment Of Allogeneic Hematopoietic Stem Cells", Exp Hematol 1998; 26: 110-116.)에서 마우스의 조혈모세포 생착을 촉진시키고 거핵구의 호밍(homing) 및 확장에 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. (Ahmed N 등, "Cytokine-Induced Expansion of Human CD34+ Stem/Progenitor and CD34+CD41+ Early Megakaryocytic Marrow Cells Cultured on Normal Osteoblasts," Stem Cells 1999;17: 92-99; Dominici M 등, "Restoration and Reversible Expansion of the Osteoblastic Hematopoietic Stem Cell Niche after Marrow Radioablation," Blood 2009;I 14:2333-2343.) 이것과 일치하게, 본 발명자들은 방사선 조사 후 24시간 및 3일 후, 2회 투여한, rMuIL-12 처리된 마우스의 골수 내 골내막 표면에 가까운 거핵구 섬을 발현하는 IL-12Rβ2를 관찰하였다(도 3). 이것은 거핵구가 parasinusoidal sites를 차지하는 정상적인 미처리 마우스와는 대조적이다. (Dominici M, et al., supra.) 형태학적으로 동정된 HSC에서 IL-12Rβ2의 발현을 확인하여 우리의 결과를 뒷받침하기 위해, Lin-세포를 마우스 골수 세포 중에서 면역-자기적으로 선택하였다. 계통이 고갈된 세포(Lineage depleted cells)(Lin-)은 원시 줄기세포 및 성숙한 계통 세포 마커가 없는 다능성 전구세포로 구성된 세포 집단을 나타낸다. 유동 세포계수 분석을 통해 마우스 Lin-세포의 약 0.5 내지 7%가 IL-12Rβ2를 발현한다는 것을 입증하였다(도 4).

실시예 9:

rMuIL-12로의 마우스 생체 내 처리는 직접적으로 방사선 부재하에서 골수 lin-세포에서 분리된 IL-12Rβ2+ 세포 수를 증가시킨다.

마우스 HSC, 거핵구 및 골아세포에서 mIL-12Rβ2의 발현 및 치명적으로 조사된 마우스에서 BMCT에 버금가는 생존 및 조혈 회복 능력을 나타내는 rMuIL-12의 재생 능력은 IL-12 매개 조혈 회복 및 재생이 mIL-12Rβ2 발현 세포에 대한 직접적인 작용에 의해 유발된다는 것을 시사한다. 다음으로 생체 내 마우스 골수에서 IL12Rβ2 발현 세포에 대한 rMuIL-12의 영향을 평가했다. C57BL/6 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 rMuIL-12(10ng/마우스)를 처리하거나 처리하지 않았다. 첫 번째 실험에서는 rMuIL-12로 처리한지 21시간 후, 두 번째 실험에서는 IL-12로 처리한지 25시간 후 골수를 수득했다. 계통 음성 세포를 각 그룹으로부터 분리하고, 유동 세포계수 분석을 통해 분획하여 Lin-IL-12Rβ2+ 를 수득하였다. 처리된 또는 처리되지 않은 그룹에 존재하는 Lin-IL-12Rβ2+ 세포의 상대 백분율을 표 1에 나타내었다. rMuIL-12의 처리는 골수 구획의 계통 음성 세포 중 Lin-IL-12Rβ2+ 세포 수가 상대적으로 증가하고, 21시간 후 IL-12Rβ2+ 세포가 3.5배 증가하고, 25시간 후 IL-12Rβ2+ 세포가 5.4 배 증가한다.

실시예 10:

인간 골수 Lin-세포 및 CD34+ 세포는 알려진 HSC 마커와 함께 IL-12Rβ2를 발현한다.

rMuIL-12의 조혈 재생 기능, 마우스 Lin-세포에서 IL-12Rβ2의 발현 및 마우스 IL-12Rβ2+ 세포에 대한 rMuIL-12의 증식 효과는 rHuIL-12가 인간의 골수 재생에 미치는 잠재적 영향을 나타낸다. 인간 이식에서 rHuIL-12의 잠재적인 역할을 평가하기 위해 본 발명자들은 인간 골수 조혈 모/전구세포에서 IL-12Rβ2의 발현을 밝혀냈다. 본 발명자들은 IL-12Rβ2와 CD34에 대해 항체로 표지된 Lin-세포 및 CD34+ 세포의 유동 세포계수 분석을 통해 인간 골수 세포에서 IL-12Rβ2의 발현을 평가하였다. CD34 세포는 임상 환경에서 이식을 위해 조혈 줄기세포를 정제하는데 오랫동안 받아들여져 왔기 때문에 선택되었다. Lin-세포 중 CD34 발현 상태에 관계없이, IL-12Rβ2+(평균± SD: 1.89±1.21)를 발현한 세포는 약 0.5 내지 4% 정도였다(도 5a). 그러나, CD34+ 세포 중, IL-12Rβ2의 발현은 기증자 의존성이 높았고 세포의 6%에서 57%(평균± SD: 19.59±17.52)에서 나타났다(도 5b). 유동 세포계수 분석에 의해 검출된 CD34+ 세포상의 IL-12Rβ2의 존재를 IL-12Rβ2에 대해 상이한 항체를 사용하여 인간 골수 CD34+ 세포의 면역세포화학적 염색에 의해 입증하였다 (도 5c). 동일한 시약으로 제조하였지만 IL-12Rβ2에 대한 1차 항체와 함께 배양하지 않은 음성 대조군은 염색을 나타내지 않았다(데이터는 나타내지 않음).

HSC의 다른 세포 표면 마커와 IL-12Rβ2의 공동 발현은 또한 인간 골수에서의 유동 세포계수 분석에 의해 평가되었다. Lin-세포 및 CD34+ 세포는 원시 골수 세포의 개별 진단에서 발현되는 것으로 알려진 IL-12Rβ2와 CD34, c-kit, KDR, CD 133, Flt-3, CD 150 또는 CDCPI에 대한 항체로 표지되었다. 이러한 분석 결과는 약 50%의 Lin-IL-12Rβ2+ 세포가 CD34 (평균 ± SD: 53±5) 또는 c-Kit (평균 ± SD: 51±7), 35% KDR (평균 ± SD: 35±6) 및 25% CD 150 (평균 ± SD: 23±21) 를 공동 발현하고(도 6a), Lin-세포와 유사하게 약 70%의 CD34+IL-12Rβ2+ 세포가 c-kit (평균 ± SD: 68±0.2), 80% CDCP I, 및 15% KDR (평균 ± SD: 13±9)를 공동 발현함을 나타낸다(도 6b).

본원에서 제공된 실시예는 예시적인 IL-12 제제, HemaMax IL-12가 HSCT 이식 후 조혈 회복을 효과적으로 개선함을 명백히 입증하였다.

고찰

HSCT는 다양한 혈액학적 악성 종양에 대한 골수절제 화학요법 및/또는 방사선 요법 후 암 환자를 치료하는 데 사용된다. HSCT 생착의 성공에 영향을 미치는 주요 요인은 암의 유형 및 단계, 이식을 위한 예비 요법, CD34 + 세포의 품질 및 양, 이식 후 성장 인자의 사용이다(Ninan MJ, et al., "Posttransplant Thrombopoiesis Predicts Survival in Patients Undergoing Autologous Hematopoietic Progenitor Cell Transplantation," Biol Blood Marrow Transplant 2007;13:895-904; Bensinger WI, et al. "Peripheral Blood Stem Cells (PBSCs) Collected After Recombinant Granulocyte Colony Stimulating Factor (rhG-CSF): an Analysis of Factors Correlating with the Tempo of Engraftment After Transplantation," Br J Haematol 1994; 87:825-831; Klumpp TR, et al. "Phase II Study of High-Dose Cyclophosphamide, Etoposide, and Carboplatin (CEC) Followed by Autologous Hematopoietic Stem Cell Rescue In Women With Metastatic or High-Risk Non-Metastatic Breast Cancer: Multivariate Analysis of Factors Affecting Survival and Engraftment," Bone Marrow Transplant 1997; 20:273-281). 골수 및 적혈구 성장 인자의 투여는 이식 후 호중구 감소증 및 빈혈증을 치료하는 데 사용된다(Held TK, et al. "Pharmacodynamic Effects of Haematopoietic Cytokines: the View of a Clinical Oncologist," Basic Clin Pharmacol Toxicol 2010; 106:210- 214). 그러나, 그러한 약제는 혈소판 재생에 영향을 미치지 않는다. 혈소판 감소증을 극복하기 위해 환자는 초기 이식 후 혈소판 수혈에 의존한다(Wandt H, et al., "New Strategies for Prophylactic Platelet Transfusion in Patients with Hematologic Diseases," Oncologist 2001; 6:446-450). 초기 회복 후 암 환자의 17% 정도가 이차 이식 후 혈소판 감소증을 경험할 수 있으며 이는 사망률이 더 높다는 것과 관련이 있다(Ninan, MJ, et al., supra. at 895-904). 특발성의 이식 후 혈소판 감소증과 낮은 혈소판 수치는 단시간 및 장기간의 재증식 CD34 + 세포와의 좋지 않은 생착과 관련이 있으며 질환 재발로 인한 사망 위험이 증가의 전조이다.(Id.) 따라서, 생착을 위한 CD34 + 세포의 수를 향상시키고 이식 후 조혈 회복을 증가시킬 수 있는 약물에 대한 필요가 있다. 현재, 전반적인 생존 감소를 예측하는, 이식 후 혈소판 감소증을 완화시킬 수 있는 약제가 없다.

비-인간 영장류에서의 rHuIL-12, 또는 마우스에서의 rMuIL-12는 TBI 모델에서 생존을 증가시키는 것으로 나타났다(Basile LA, and Ellefson D, et al. "HemaMaxTM, a Recombinant Human Interleukin-12, is a Potent Mitigator of Acute Radiation Injury in Mice and Non-Human Primates, PLoS ONE," Submitted 2011; Basile LA, and Gallaher TK, et al. "Multilineage Hematopoietic Recovery with Concomitant Antitumor Effects Using Low Dose Interleukin-12 in Myelosuppressed Tumor-Bearing Mice," J Transl Med 2008; 6:26; Chen T, et al., "IL-12 Facilitates Both the Recovery of Endogenous Hematopoiesis and the Engraftment of Stem Cells after Ionizing Radiation," Exp Hematol 2007; 35:203-213). 몇 가지 증거에 따르면 골수 조혈의 자극은 rHuIL-12의 프로-생존 활성에 핵심적인 역할을 할 수 있다(Basile LA, and Ellefson D, et al., supra.). 생체 내에서 시험했을 때, rMuIL-12는 BMCT와 마찬가지로 치명적으로 조사된 마우스에서 말초 혈구의 회복과 생존을 증가시켰다. 흥미롭게도, 혈소판의 회복은 BMCT를 투여한 마우스보다 IL-12 처리된 마우스의 초기에 나타났다. 이러한 결과는 마우스 및 리서스 원숭이에서 각각 rMuIL-12 및 rHuIL-12의 조혈-촉진 및 프로-생존 활성을 입증한 이전 보고서와 일치한다. (Basile LA and Ellefson D, et al., supra. ; Basile LA and Gallaher TK, et al. supra., Chen T., et al., supra.) 이러한 조혈 회복 효과는 종양-보유 마우스에서도 관찰되었다. 루이스 폐 및 EL4 림프종 모델 모두에서, rMuIL-12는 준치사 TBI 후 조기 호중구, 적혈구 및 혈소판 회복을 제공하였다. 또한, IL-12는 림프종 및 폐암 마우스 모델 모두에서 방사선 또는 화학요법과 상승적으로 종양 부담을 감소시켰다. (Basile LA and Gallaher TK, et al. supra) 본 발명자들의 연구 결과와 일치하여, rHuIL-12의 면역 요법으로서 투여는 혈액학적 악성종양 환자에서 말초 혈액 줄기세포 이식 후 주요 림프구 서브 세트의 생체 내 확장을 유도한다(Pelloso D, et al. "Immunological Consequences of Interleukin 12 Administration After Autologous Stem Cell Transplantation," Clin Cancer Res 2004;10:1935-1942).

현재 연구에서, 치명적인 조사된 동물에서 혈구 회복 및 생존을 증가시키는 rMuIL-12 및 BMCT의 유사한 효능이 있음을 주목해야 한다. 나아가, 치료법 하나만으로는 치명적으로 조사된 동물을 구제할 수 없었던 반면, 차선의 rMuIL-12 용량과 저용량 BMCT의 조합이 상승작용으로 생존을 증가시킨 바, rMu IL-12의 조혈-증진 활성은 BMCT의 그것을 보완하는 것으로 보인다(Chen T., et al., supra). 현재 연구에서, 혈소판 회복은 BMCT에 비해 rMuIL-12 처리 마우스에서 더 강력했다. rMuIL-12와 BMCT의 비슷한 효능 및 보완적인 활성은 rHuIL-12가 HSC의 생착 가능성 및 조혈 회복, 특히 혈소판 수의 회복을 위해 HSCT에 부속 옵션이 될 수 있음을 시사한다.

rMuIL-12가 마우스의 골수 조혈을 증가시키는 능력은 IL-12에 의해 결합될 때 골수 재생을 시작하는 사건을 유발하는, 초기의, 현존하는 조혈세포에 대한 기능성 IL-12 수용체(IL-12R)의 존재를 나타낸다. 이 가설을 뒷받침하기 위해 본 발명자들은 rMuIL-12-처리된 마우스 골수가 IL-12Rβ2- 발현 줄기/전구세포, 거핵구 및 골아세포의 존재에 의해 특징지어지는 것을 입증하였으며, 이는 HSC 및 니치 세포 모두 rHuIL-12의 직접 표적일 수 있음을 시사한다. 조골 세포의 활성화는 조혈 줄기세포와 거핵구의 생존, 확장 및 호밍에 매우 중요하다(Ahmed N, et al., supra, de Barros AP, et al., "Osteoblasts and Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells Control Hematopoietic Stem Cell Migration and Proliferation in 3D in vitro Model," PLoS One 2010; 5:e9093; Hamada T, Mohle R, Hesselgesser J, et al. "Transendothelial Migration of Megakaryocytes in Response to Stromal Cell-Derived Factor 1 (SDF-1) Enhances Platelet Formation," J Exp Med 1998; 188:539-548; Hodohara K, et al. "Stromal Cell-Derived Factor-1 (SDF-1) Acts Together with Thrombopoietin to Enhance the Development of Megakaryocytic Progenitor Cells," (CFU-MK). Blood 2000; 95:769-775; Kiel MJ, et al., "Maintaining Hematopoietic Stem Cells in the Vascular Niche," Immunity 2006; 25:862-864; Wang JF, et al., "The Alpha-chemokine Receptor CXCR4 is Expressed on the Megakaryocytic Lineage from Progenitor to Platelets and Modulates Migration and Adhesion," Blood 1998; 92:756-764). 치사량의 방사선에 노출되면 골아세포성 니치 확장으로 이어져 방사선 저항성 골전구세포(osteoprogenitors)가 골내막의 뼈 영역 근처에서 증식하는 것으로 나타났다(Dominici M, Rasini V, et al., supra). 이 연구에서, 생존한 거핵구는 정상 parasinusoidal 부위가 아닌 소주골 골내막 표면 근처에서도 관찰되었다. 거핵구는 골아세포 니치의 팽창을 자극하는 인자를 방출한다.(Id.) 이 연구 결과와 일치하여, 본 연구에서의 면역조직화학검사는 뼈 근처에서 골 형성 니치, 거핵구 및 조혈 줄기세포로 구성된 세포 섬을 보여주어, 마우스 골수에서의 세포 배열을 밝혔다. 총체적으로, 이러한 결과는 rHuIL-12가 HSC 및 니치 세포의 활성을 조율하고 조혈을 자극하기 위해 IL-12 수용체를 통해 직접 작용할 수 있음을 시사한다. (Id.) 이러한 개념과 일치하여, IL-12는 부속 인간 CD34- 세포의 존재 하에 5-플루오로우라실-처리된 사람 말초 혈액 CD34 + 세포의 콜로니 형성을 향상시키는 것으로 보고되었다(Grafte S, et al. IL-12 "Indirectly Enhances Proliferation of 5-FU-Treated Human Hematopoietic Peripheral Blood CD34+ Cells" Am J Hematol 1998; 58:183-188).

조사된, 미처리된 마우스 골수에서의 부재와 달리, rMuIL-12로 처리된 조사된 마우스의 골수에서 IL-12β2 발현의 존재는 rMuIL-12가 골수에서 IL-12 수용체 발현을 증가시키고 HSC 및 니치 세포 상의 IL-12 수용체를 통해 조혈 촉진 활성을 직접 발휘할 수 있음을 시사한다. 이 가설과 일치하여, 방사선이 없는 외인성 rMuIL-12로 처리는 골수 구획의 계통 음성 세포 중 Lin-IL-12Rβ2 + 세포의 상대적 수를 증가시키고, 골수가 수확된 두 가지 상이한 시점에 대해 IL-12Rβ2+ 세포의 평균 4.5 배 향상을 가져왔다. 이러한 데이터는 또한 방사선의 부재 하에 BrdU 혼입 분석과 일치하는데, 이는 처리 21시간 후에 처리되지 않은 마우스(7.5%)와 비교하여 IL-12- 처리된 마우스의 전체 골수에서 BrdU 양성 세포의 증가(16.5%)를 나타냈다. (데이터는 나타내지 않음). 이러한 데이터로부터, 본 발명자들은 IL-12 리간드/IL-12 수용체 시스템을 통한 직접적인 HSC 확장으로부터 rMuIL-12 리간드로 생체 내 처리한 후 골수로부터 분리되고 선택된 lin-IL-12Rβ2+ 세포의 관찰된 증가가 IL-12 수용체를 가진 딸 HSC의 수 증가로 이어진다고 결론내렸다.

본 개시는 IL-12Rβ2가 마우스 및 인간 Lin-세포 및 인간 CD34+ 세포, 조혈 줄기세포 및 전구세포를 포함하는 골수 세포의 2개의 풀에서 발현된다는 것을 입증하는 최초의 보고이다. 인간 CD34+ 세포에서 IL-12Rβ2의 발현은 또한 면역세포화학적 염색에 의해 확인되었다. 전반적으로,이 연구는 인간 Lin-세포의 1 내지 4%와 인간 CD34+ 세포의 6 내지 50%가 IL-12Rβ2를 발현한다는 것을 입증하였다. 상당수의 Lin-IL-12Rβ2+ 세포 (20% 내지 50%)와 CD34+ IL-12Rβ2+ 세포 (15% 내지 80%)는 또한 주로 c-kit, KDR, CD150 또는 CDCP1의 HSC의 다른 잠재적 마커를 공동 발현했다(Hawley RG, et al., "Hematopoietic Stem Cells," Methods Enzymol 2006; 419:149-179; Conze T, et al. "CDCP1 is a Novel Marker for Hematopoietic Stem Cells," Ann N Y Acad Sci 2003; 996:222-226; Drake AC, et al. "Human CD34+ CD133+ Hematopoietic Stem Cells Cultured with Growth Factors Including Angpt15 Efficiently Engraft Adult NOD-SCID I12rgamma-/- (NSG) Mice," PLoS One 2011; 6:e18382; Ziegler BL, et al. "KDR Receptor: a Key Marker Defining Hematopoietic Stem Cells," Science 1999; 285:1553-1558) 주목할만한 것은 체외에서 마우스의 rMuIL-12에 의해 조혈-자극 활성이 극적으로(7배) 증가한 줄기세포 인자(SCF) 수용체인 c-Kit이었다. (Jacobsen SE, et al., "Cytotoxic Lymphocyte Maturation Factor (Interleukin 12) is a Synergistic Growth Factor for Hematopoietic Stem Cells," J Exp Med 1993; 178:413-418). 수용체 c-kit은 생체 내 HSC의 자가-재생 및 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다(Porrata LF, et al., "Early Lymphocyte Recovery Predicts Superior Survival After Autologous Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Multiple Myeloma or Non-Hodgkin Lymphoma," Blood 2001; 98:579-585). c-kit/SCF 복합체는 골수 및 HSC 호밍에서 그 미세환경에 줄기세포가 접착하는 데 중요한 역할을 한다. IL-12 및 SCF는 생체 외에서 림프성 원시 조혈 전구세포의 증식을 상승적으로 지지하는 것으로 나타났다(Hirayama F, et al., "Synergistic Interaction Between Interleukin-12 and Steel Factor in Support of Proliferation of Murine Lymphohematopoietic Progenitors in Culture," Blood 1994; 83:92-98). 이러한 예상치 못한 놀랄만한 상승 효과 및 IL-12Rβ2와 c-kit의 동시 발현은 조혈 재생 및 회복에서 IL-12의 역할을 입증했다. 이전의 보고와 일치하여, CD150 발현은 주로 Lin-세포로 제한되었지만 CDCP1 발현은 주로 CD34+ 세포로 제한되었다(Conze T, Lammers, et al. supra; Sintes J, et al., "Differential Expression of CD150 (SLAM) Family Receptors by Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells," Exp Hematol 2008; 36:1199-1204). CD150을 발현하는 Lin-세포는 장기간 재구성 HSC의 서브세트를 나타내는 것으로 나타났다(Buhring HJ, et al., "CDCP1 Identifies a Broad Spectrum of Normal and Malignant Stem/Progenitor Cell subsets of Hematopoietic and Nonhematopoietic Origin," Stem Cells 2004; 22:334-343). CDCP1 반응성 단일 클론 항체로 CD34+ 세포의 자극은 적혈구 콜로니 형성 단위를 증가시킨다. CDCP1 발현은 간엽 세포와 유사한 세포 유형에서도 관찰되었다. (Id.) Lin-세포와 CD34+ 세포 모두 KDR을 나타내었으며, 이는 이전의 보고와 일치한다(Ziegler BL, et al., supra). HSC 니치는 조직 재생 역할을 하는 것으로 알려진 CD34-KDR+ 표현형을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포로 구성되며, KDR+ 세포는 재구성 기능을 보유한 것으로 나타났다. IL-12Rβ2와 KDR의 동시 발현은 HSC 또는 골수 니치 세포에서 발현되는 IL-12Rβ2가 조혈 회복에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다. 총체적으로, 이러한 발견은 IL-12/IL-12 수용체 경로가 인간 골수 조혈에 관련되어 있고 IL-12Rβ2가 rHuIL-12에 의해 외인성으로 자극되어 골수절제 후 조혈 조직을 확장시키고 재구성하는, 조혈 줄기세포와 전구세포 및 골수 니치 세포의 새로운 풀을 묘사하는 마커를 나타내는 것임을 시사한다.

IL-12의 효능은 암 환자에서의 항-종양 활성의 맥락에서 여러 연구의 주제가 되어왔다. 집중적인 관심에도 불구하고, IL-12는 결코 약물로 발전하지 못했고, 그다지 좋지 않은 임상 활성과 높은, 반복 투여 요법(반복 요법에서 매주5 회 투여)에서 중대한 독성으로 인해 식품 의약품국(FDA) 승인을 받지 못했다(Atkins MB, et al., "Phase I Evaluation of Intravenous Recombinant Human Interleukin 12 in Patients with Advanced Malignancies," Clin Cancer Res 1997; 3:409-417; Bajetta E, Del VM, Mortarini R, et al., Pilot Study of Subcutaneous Recombinant Human Interleukin 12 in Metastatic Melanoma," Clin Cancer Res 1998;4:75-85; Gollob JA, et al., "Phase I Trial of Twice-Weekly Intravenous Interleukin 12 in Patients with Metastatic Renal Cell Cancer or Malignant Melanoma: Ability to Maintain IFN-Gamma Induction Is Associated With Clinical Response," Clin Cancer Res 2000; 6:1678-1692; Gollob JA, et al., "Phase I Trial of Concurrent Twice-Weekly Recombinant Human Interleukin-12 Plus Low-Dose IL-2 in Patients with Melanoma or Renal Cell Carcinoma," J Clin Oncol 2003; 21:2564-2573; Lenzi R, et al., "Phase I Study of Intraperitoneal Recombinant Human Interleukin 12 in Patients with Mullerian Carcinoma, Gastrointestinal Primary Malignancies, and Mesothelioma," Clin Cancer Res 2002; 8:3686-3695; Little RF, et al., "Phase 2 Study of Pegylated Liposomal Doxorubicin in Combination with Interleukin-12 for AIDS-Related Kaposi Sarcoma," Blood 2007; 110:4165-4171; Motzer RJ, et al., "Phase I Trial of Subcutaneous Recombinant Human Interleukin-12 in Patients with Advanced Renal Cell Carcinoma," Clin Cancer Res 1998; 4:1183-1191; Ohno R, et al., "A Dose-Escalation and Pharmacokinetic Study of Subcutaneously Administered Recombinant Human Interleukin 12 and its Biological Effects in Japanese Patients with Advanced Malignancies," Clin Cancer Res 2000; 6:2661-2669; Portielje JE, et al., "Phase I Study of Subcutaneously Administered Recombinant HumanIinterleukin 12 in Patients with Advanced Renal Cell Cancer," Clin Cancer Res 1999; 5:3983-3989; Robertson MJ, et al., "Interleukin 12 immunotherapy After Autologous Stem Cell Transplantation for Hematological Malignancies," Clin Cancer Res 2002; 8:3383- 3393; van Herpen CM, et al., "Intratumoral Administration of Recombinant Human Interleukin 12 in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Patients Elicits a T-Helper 1 Profile in the Locoregional Lymph Nodes," Clin Cancer Res 2004;10:2626-2635.). 상대적으로 저용량의 경우, 혈액학적 악성 종양 환자에서 30ng/Kg 내지 250ng/Kg의 범위의 용량으로 말초 혈액 줄기세포 이식 후 약 2개월에 한번 2주 후 반복 요법으로 5일간 투여한 경우 외인성 IL-12를 이용한 치료가 잘 받아들여졌다 (Robertson MJ, et al., supra).

대조적으로, 본 발명자들은 rHuIL-12가 마우스 및 리서스 원숭이 연구 모두에서 오직 1회 또는 2회 주어진, 인간 투여량으로 100ng/Kg 미만에 상응하는 동물에서, 킬로그램 당 낮은 나노그램 용량에서 조혈-촉진 활성을 발휘한다는 것을 발견하였다. 또한 독성학 연구에서 본 발명자들 고유의 rHuIL-12는 리서스 원숭이에서 1,000ng/Kg의 7회 투여 후까지 잘 받아들여졌고(데이터는 표시되지 않음), 이는 독성에 대한 명백한 징후없이, 인간 투여량 약 300ng/kg에 상응한다. 이러한 결과는 조혈 재생을 위한 rHuIL-12 용량이 이전에 암 환자에서 사용된 IL-12 용량보다 실질적으로 낮을 것을 나타내어, HSC 이식 환자에서 rHuIL-12에 대한 보다 바람직한 안전성 프로파일을 제안한다.

본 발명자들의 연구 결과는 rHuIL-12가 말초 혈구 수, 특히 혈소판의 다중계통 회복을 자극함으로써 추가적인 치료적 가치를 제공할 수 있음을 보여준다. IL-12의 항-종양 및 면역 자극 효과는 암 환자의 치료적 가치를 한층 더 높인다. 따라서 IL-12/IL-12R은 HSC 이식을 받는 환자의 관해를 증가시키기 위해 외인성 IL-12의 투여를 통해 도입될 수 있는 실행 가능한 경로를 나타낸다.

결론

rMuIL-12를 포함하는 예시적인 방법 및 조성물은 조혈을 촉진시키고, BMCT만큼 효과적으로 치명적으로 조사된 마우스에서 말초 혈구의 회복 및 생존을 증가시켜 rHuIL-12 치료가 HSCT 후 HSC 생착을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. 본 발명자들은 IL-12의 잠재적 표적인 조사된 마우스 골수에서 IL-12Rβ2 발현 세포를 확인했다. rMuIL-12의 투여는 마우스 골수에서 IL-12Rβ2를 발현하는 Lin-세포의 수를 증가시켜, 골수 HSC 및 니치 세포가 rMuIL-12의 직접 표적이고 rMuIL-12의 조혈 촉진 촉진 활성이 HSC 상의 IL-12 수용체에 의해 매개된다는 것을 나타내었다. 마지막으로, 인간의 골수 lin- 및 CD34+ 세포에 IL-12Rβ2의 발현을 보여, 인간 이식에서 IL-12의 잠재적인 역할을 나타내었다.

실시예

표 1. 비히클 또는 rMuIL-12로 처리된 마우스에서 골수 Lin-IL-12Rβ2+ 세포의 백분율. 외인성 IL-12는 골수 구획의 계통 음성 세포 중 IL-12Rβ2+ 세포의 상대적 수를 증가시키며, IL-12Rβ2+ 세포를 평균 4.5배 향상시켰다.

실시예 11:

효능 입증: 단일, 저용량 rHuIL-12가 치명적인 방사선에 노출된 리서스 원숭이에서 조혈을 복원하고 및 생존을 증가시킨다.

단일, 저용량의 rHUIL-12는 단일 약제로서 치명적인 방사선에 노출된 비-인간 영장류에서 위약에 비해 생존을 유의하게 증가 시켰으며, 보조치료 없이 rHUIL-12는 패혈증 및 중증의 호중구 감소증/혈소판 감소증의 비율을 감소시키고, 위약에 비해 골수 재생을 증가시켰다.

급성 방사선 증후군(HSARS)의 조혈 증후군은 치명적인 전신 방사선 조사(TBI)에 노출된 사람에서 사망으로 이어진다. 적절한 동물 모델 (예: 사람이 아닌 영장류)에서 효능이 입증되고 인간에서 안전성이 증명된 FDA 동물 규칙에 따라, HSARS를 완화하기 위해 재조합 인간 인터루킨-12 (rHuIL-12)가 개발되고 있다. 리서스 원숭이(9마리 동물/성/투여군)는 항생제, 수액 또는 수혈이 없이, TBI(700 cGy) 24-25시간 후, rHuIL-12(0[위약], 50, 100, 250 또는 500 ng/kg)의 단일 피하 주사를 받기 위해 무작위 추출되었다. 60일째의 생존율은 위약, 50, 100, 250 및 500 ng/kg rHuIL-12 용량 그룹에서 각각 11%, 33%, 39%, 39% 및 50%였다(로그 순위 p <0.05 각 용량 대 위약). rHuIL 12는 또한 중증 호중구 감소증, 중증 혈소판 감소증 및 패혈증의 발생률을 유의하게 감소시켰다. 또한, TBI 후 골수 재생은 rHuIL-12로 처리한 원숭이에서 대조군보다 유의하게 더 컸다. 이 데이터는 TBI 후 하루에 투여된 rHuIL-12의 단일 주사가 생존을 현저하게 증가시키고 방사선-유발된 조혈 독성 및 감염을 현저히 감소시킬 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, rHuIL-12는 방사선 노출의 치명적인 영향에 대한 효과적인 독립형의 의료 대책으로 효과적이다.

급성 방사선 증후군(ARS)은 원자력 사고나 핵 공격 발생시와 같이 단기간에 1Gy를 초과하는 방사선량에 전신 또는 부분적인-신체 노출로 인한 생명을 위협하는 질병이다. ARS의 병태 생리학은 잘 알려져 있으며 조혈, 위장의, 중추 신경계 및 피부 계통에 해로운 영향을 미치는 것으로, 모든 포유동물에서 유사하다. ARS(HSARS)의 조혈 하위증후군에서 독성은 빠른 골수 제거로 인한 범혈구감소증을 유발한다. HSARS는 궁극적으로 방사선 노출 수준에 따라 2주에서 2개월 범위의 감염 및/또는 출혈로 사망한다.

대규모 방사선 비상사태 시 방사선 의학적 대책(R-MCM)의 유용성은 생명을 구하기 위해 중요하지만, 어떤 치료법도 현재 미국 식품의약국(FDA) 의 승인을 받지 못했다. HSARS에 대한 일반적인 치료 지침에는 노출 수준에 따라 단기 또는 장기 사이토카인 투여가 포함된다. 이용 가능한 사이토카인 산물이 일부 개별 세포 유형(예: 호중구의 경우 G-CSF)의 성장을 뒷받침하나, 이들의 사용에 대한 검토는 TBI 후 전반적인 사망률의 지속적인 감소를 나타내지 않았으며, FDA는 HSARS 표시를 위해 사이토카인을 승인하지 않았다. 원자력 재해 또는 사고로 인한 HSARS에 대한 최적의 R-MCM은 골수 구획의 모든 계통을 재생성할 수 있으며, 예상되는 물류 장애를 고려할 때, 노출 후 몇 시간에서 며칠 동안, 바람직하게는 단일 투여로, 집중적인 지지 치료가 없는 경우에 효과적이어야 한다. 이러한 요건은 과립구형성 계통에만 영향을 미치고, 여러 차례의 일일 투여가 필요한 G-CSF에 의해 충족되지 않고, 집중적인 지지 치료를 병행하는 경우에만 생존율을 향상시키는 것으로 나타났다. 또한 G-CSF는 장기간의 고립성 혈소판 감소증과 연관이 있으며, 심지어 폐 독성 및 섬유증과 관련된 지연성 부작용과 관련되어 보고되었다(아이올로스 참조).

본 발명자들은 이전에 재조합 인간 IL-12(방사선 조사 후 24-25시간 rHuIL-12를 투여 한 결과, 항생제, 체액 또는 혈액 제제의 부재 하에 마우스 HSARS 모델 및 개념-증명(proof-of-concept), 오픈-라벨, 비-인간 영장류(NHP)의 수컷-만의 연구에서 모두 생존이 향상되었음을 보고하였다. 이러한 결과는 적절한 동물 모델(예: 사람이 아닌 영장류)에서 효능이 입증되고 인간에서 안전성이 입증된 FDA 동물 규칙에 따라, HSARS를위한 R-MCM으로 rHuIL-12의 추가 개발을 뒷받침하였다. 여기에서 본 발명자들은 rheu-12의 방사선 대책 효과에 대한 무작위, 맹검, 중추적인 단계 효능 연구의 결과를 많은 수의 수컷 및 암컷 리서스 원숭이 그룹에서 설명한다. 이 2단계 연구는 rHuIL-12를 동물 규칙에 따른 승인으로 발전시킨다.

방법

동물

리서스 원숭이(Macaca mulatta)는 중국의 Yongfu County Xingui Wild Animals Raising Ltd.에서 획득하였다. 원숭이(3~5 세, 치료 시작 시 3.0 ~ 5.7 kg)를 개별적으로 수용하고 방사선 조사 전 5주 이상 순응시켰다. Harlan Teklad 인증 Hi-Fiber Primate Diet # 7195C (Harlan Laboratories, Indianapolis, Indiana)는 하루 2 회 제공되었다.

무작위 추출 및 맹검

주요 연구에서, 수컷과 암컷 동물(각각 45마리, 투여군 당 성별 당 9마리)을 체중별로, rHuIL-12의 다음 용량으로 무작위 추출하였다: 비히클; SC 주사에 의해 투여된 50ng/kg, 100ng/kg, 250ng/kg 또는 500ng/kg (그룹 1-5). 연구 팀장이 아닌 병리학자와 연구원 및 방사선 조사와 관련된 사람들은 맹검하였다. 12일째 골수의 평가는 rHuIL-12의 동일 용량(그룹 당 성별 당 2)으로 무작위 추출된 별개의 동물을 사용하여 맹검 방식으로 실시되었다.

전신 방사선 조사

Theatron 1000 Co60 소스[Best Theratronics, Canada, Ontario, Ottawa]로부터의 700cGy (60 cGy/분)의 선량은 CiToxLAB North America의 이용 가능한 과거 데이터를 기반으로 하였다. TBI는 이전에 설명한 것처럼 수직 위치에서 동물과 함께 수행되었다. 동질한 선량 분포의 경우, 첫 번째 반 선량은 앞뒤 방향으로 전달되었고 두 번째 반 선량은 뒤앞 방향으로 전달되었다. 선량 측정은 각 동물의 앞과 뒤에 위치한 나노도트 칩(Landauer, Inc., Glenwood, Illinois, USA)을 사용하여 처방된 선량의 10% 이내로 확인되었다.

rHuIL-12 투여

임상 등급 rHuIL-12 또는 비히클은 TBI 후 약 24-25 시간에 견갑골 사이 SC 주사에 의해 투여되었다. Quantikine® Human IL-12 ELISA 키트(R & D Systems Inc., Minneapolis, USA)를 사용하여 intertek Pharmaceutical Services(San Diego, CA)에서 각 투여 시료의 검사 항목 농도를 확인하였다.

평가

임상 증상은 1일 2회 기록되었다. 식욕 감퇴(음식물 섭취량 기준)와 신체 활동을 매일 기록하고 다음으로 점수를 매겼다: 1 = 약간; 2 = 보통의; 3 = 심각한. 자세한 신체 검사는 rHuIL-12 투약 전에 실시되었으며 그 후 매주 두 번 실시되었다. 체온(귀의)은 방사선 조사 전에 3-10, 12, 14, 16, 18, 30, 45, 60일 또는 임상적으로 타당한 시점에 측정했다. 방사선 조사 전에 5일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 30일, 45일 및 60일에 혈액 샘플링(말초 혈구 수에 대해 0.5 mL)을 수행했다. 열성 호중구 감소증 (직장 체온이 104°F/40.0℃ 이상이며 절대 호중구 수가 0.059/L 미만인 경우) 및 부검시 혈액 배양을 위해 혈액을 채취했다.

마지막 절차

다음 기준 중 하나가 관찰되면 동물을 60일 이전에 안락사시켰다: 호흡 곤란; 3일 동안 완전 식욕 부진; 3일간 초기 체중의 20% 초과 감소; 심한 활동 수준 감소(전체 관찰 기간 동안 누워있거나 접촉에 대한 무반응); 예상 혈액량의 20% 초과 급격한 감소; 일반 발작 활동; 비정상적인 생체 신호와 관련된 비정상적인 모습(자세, 거친 털, 머리가 아래로, 눈과 코 주위의 삼출물, 창백함, 접어 넣은 복부 및 임상 증상): 저체온증으로 심한 탈수 (직장 온도가 34.6℃ 미만에 도달하고 심각하게 감소된 활동 수준) 또는 고열(온도> 40.1℃ 및 심각하게 감소된 활동 수준). 안락사 결정은 기술자와 수의사 팀이 동물 그룹 과제에 대해 맹목적으로 결정하였다. TBI 후 60 일째에 생존 동물을 안락사 시켰다.

부검은 외부의 거시적 검사, 상세한 내부 검사, 장기 무게 및 육안 병리학 평가 및 조직 병리학을위한 조직 수집으로 구성되었다. 주요 장기에 대한 출혈의 유무는 다음과 같이 점수를 매겼다: 0 = 없음; 1 = 최소; 2 = 약간; 3 = 보통; 4 = 뚜렷한; 5 = 심각한. 조직학적 검사를 위해 조직을 파라핀에 끼우고, 절편을 만들어 헤마톡실린 및 에오신-플록신(H & E)으로 염색하였다.

미생물학적 분석은 뇌, 심장, 신장, 간, 양쪽 폐 및 비장에 대해 수행되었다. 세균의 성장은 각 장기에 대해 (0 내지 4) 점수를 매겼다. 총 점수는 각 동물에 대해 합산되었다; 평균 점수는 각 치료 그룹에 대해 계산된 점수였다.

골수 조직병리학

골수 검사 그룹의 동물들은 TBI 후 12일째 안락사시켰다. 1마리의 동물은 11일째에 예정 외 안락사를 받았다; 모든 동물이 분석에 포함되었다. Olympus BX41 복합현미경으로 각 동물에 대한 2개의 H & E 섹션을 스캔하였다. 각 대퇴골 부분을 전체적으로 포함하는 약 40개의 시야의 이미지를 무한 분석(Infinity Analyze) 소프트웨어 v5.0에서 10x 배율로 획득하였다. 골수 재생 섬의 수는 각 섹션의 각 시야에서 육안으로 정량화하여 결정하였다. 골수 재생의 총 면적은 ImageJ 소프트웨어 버전 1.46을 사용하여 결정하였다. 동물 당 2개의 절편으로부터 얻은 재생 섬의 평균 수와 재생 영역의 평균을 통계적 분석에 사용하였다. 거핵구의 수는 각 대퇴골 부분에서 시각적으로 결정되었다.

통계적 분석

모든 통계학적 비교는 성별 및 전체 연구 집단에 따라 수행되었다. 생존 기능은 Kaplan-Meier 누적-한계 방법을 사용하여 매일 측정하였다. Mantel 로그 순위 검정을 사용하여 대조군을 다른 치료군과 비교하였다. GLT 분석은 CiToxLAB에서 수행되었다.

Fisher 정확 검정을 이용하여 중증 호중구 감소증(호중구 수 <0.05 x 10⁹/L로 정의됨), 중증 혈소판 감소증(혈소판 수 <10 x 10⁹/L로 정의됨) 및 혈액배양 양성 반응에 대한 그룹 비교를 수행하였다. 전반적인 비교가 유의적이면(p≤0.05), Fisher 정확 검정을 사용하여 대조군과 각 투약 군 사이의 쌍으로 된 비교가 이루어졌다.

통계 소프트웨어 프로그램 Prism version 6(GraphPad, San Diego, CA)을 사용하여 골수 재생 데이터의 그룹 평균(재생 섬의 수 및 면적)을 단측 t- 검정으로 비교하였다. p<0.05 인 차이는 유의한 것으로 간주되었다.

결과

생존

생존 데이터는 도 1에 나타내었다. 투여된 방사선량은 이 실험의 조건 하에서(항생제, 수액 또는 수혈 없음) 약 LD90/60(처리되지 않은 그룹에서 생존한 동물 2/18 마리)에 해당한다. 59마리 중 58마리의 사망이 9일에서 24일 사이에 발생했으며, 이는 리서스 원숭이에서 HSARS로 인해 이전에 관찰된 사망률 및 시점과 일치하며, 33일째에 한 번의 사망이 발생했다. 가장 많은 사망이 11일에서 21일 사이에 발생했으며, 14일은 대조군과 rHuIL-12로 처리된 그룹 모두에서 가장 많이 사망이 발생했다. 사망 빈도는 수컷 및 암컷이 비슷했다. 원인에 관계없이, 모든 사망은 효능의 통계적 분석에 포함되었다. 각 rHuIL-12 처리군은 비히클에 비해 생존이 통계적으로 유의하게 증가했다(로그 순위 검정 p <0.05). rHuIL-12 처리군에서 각각 33% (수컷 3마리, 암컷 3마리), 39% (수컷 4마리, 암컷3 마리), 39% (수컷 4마리, 암컷 3마리) 및 50마리(수컷 5마리, 암컷 4마리)가 생존한 반면, 비히클 그룹에서는 18마리 중 2마리(11%, 모두 수컷)가 생존하였다. rHuIL-12로 치료 한 그룹 간의 쌍 비교는 유의한 차이가 없었다.

60일 이전에 예정외로 사망한 원인은 주로 감염이었다. 또한 출혈의 거시적 및 미세한 증거가 다양한 기관에서 관찰되었다.

혈액학

혈소판, 평균 혈소판 부피, 호중구, 림프구 및 망상적혈구의 혈구 수를 각각 도 2A-E에 나타내었다. 혈액학적 측정은 기저 수준에 상응하는 방사선 조사 전 시점에서 이루어졌고, 그 후 5, 10, 12, 14, 16 및 18 일의 방사선 조사 전 시점에서 이루어졌으며, 이는 HSARS 모델에서 보여지는 중증 혈구 감소증의 기간과 상응하는 것이고, 30, 45 및 60일에 생존한 동물에서 기저 수준으로의 복귀를 평가하였다.

혈소판

혈소판 최저치은 투여 그룹에 따라 12일 또는 14일에 발생하였다. 10-15일 간격으로 유의한 혈소판 감소증(<50 x 10⁹/L)이 나타났다. 대조군의 최저치 평균은 10.1 × 10⁹ 혈소판/L이었으며, 이는 각 처리군의 최저치보다 낮은 것으로, rHuIL-12로 처리된 그룹 2-5에서는 각각 12.1, 15.5, 12.7 및 18.6 × 10⁹ 혈소판/L이었다. 18일까지, 모든 그룹의 생존자에서 초기 회복이 관찰되었고, 30일째에는 완전 회복되었다. 10일에서 18일 사이에 심한 혈소판 감소증(혈소판 <10 × 10⁹/L)를 보인 혈액 시료의 비율은 대조군에서 33%, rHuIL-12로 처리한 그룹 2-5에서 각각 34%, 20%, 22% 및 12%이었다. 대조군과의 쌍 비교는 500 ng/kg 그룹에서 유의미했다 (Fisher 정확 검정 p = 0.0073). 평균 혈소판 부피는 14일에서 18일 사이에 증가하였으며, 이는 골수 회복에서 어린 혈소판의 방출에 해당한다. 평균 피크 값은 rHuIL-12로 치료한 그룹에서는 2-5에서 각각 9.21, 9.13, 9.56 및 9.17fL인 것과 비교하여 대조군에서 8.64 fL이었다.

호중구

호중구의 최저치는 투여 그룹에 따라 10일에서 14일 사이에 발생하였다. 대조군에서는 100% 동물에서 중증 호중구 감소증(<50 × 10⁶/L)이 나타났고 rHuIL-12 처리한 2-5 그룹에서는 88.9%, 77.8%, 83.3% 및 72.2%의 동물에서 중증 호중구 감소증(50 × 10⁶/L 미만)이 나타났다. 대조군의 최저치는 26 x 10⁶/L이었고, 이는 각각 50, 100, 250 및 500 ng/kg의 rHuIL-12로 처리한 군에서 각 34, 54, 39 및 78 × 10⁶/L의 치료군의 최저치보다 낮았다. 호중구 회복은 18일째에 시작되었고 30일째에 완료되었다. 각각 50, 100, 250 및 500ng/kg의 투여량에서 46%, 35%, 46% 및 31%와 비교하여(p = 0.0196, 0.0005, 0.0278 및 <.0001, Fisher 정확 검정) 대조군에서 10일에서 18일 사이에 중증 호중구 감소증을 보이는 혈액 시료의 비율은 67%이었다.

림프구

림프구 최저치는 투여 그룹에 따라 10일에서 16일 사이에 발생했다. 모든 그룹에서 방사선 조사 전 수준의 7-10 %까지 심각한 림프구 감소를 보였다. 대조군에서 림프구의 최저치는 0.143 × 10⁹/L로 각 처리군(50, 100, 250 및 500ng/kg의 투여량에서 0.163, 0.213, 0.220, 0.239 × 10⁹/L) 의 최저치보다 낮았다. 18일째에 최저치로부터 초기 회복이 모든 군에서 관찰되었다. 30일까지 그룹 평균 수준은 여전히 방사선 조사 전 수준의 30%에서 60%에 이르는 반면, 45일과 60일에는 림프구 수치가 정상 범위였지만 여전히 기준선 수준보다 약간 낮았다. 수컷과 암컷 모두에 통계적으로 유의하지 않았지만, rHuIL-12로 처리한 동물과 대조군 사이의 림프구 최저치 차이는 50, 250 및 500 ng/kg 용량으로 처리된 암컷에서 통계적으로 유의했다(Sidak adjusted t-test p = 0.0443, 0.0103 및 0.0211).

적혈구 및 망상적혈구

모든 그룹에서 18일째에 적혈구 최저치가 나타났으며, 이는 기준치에서 37% 감소한 수치이다. 적혈구 최저치는 모든 그룹에서 비교 가능했다(데이터는 표시되지 않음). 망상적혈구 최저치는 대조군에서 7.1 × 10⁹/L이었고, 50, 100, 250 및 500ng/kg rHuIL-12 그룹에서는 각각 8.7 × 10⁹/L, 12.1 × 10⁹/L, 9.1 × 10⁹/L 및 9.8 × 10⁹/L이었으며, 이는 적혈구 생성에 rHuIL-12의 자극 효과가 있음을 시사한다. 그러나 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.

열성 호중구감소증

총 15 마리의 동물(수컷 8마리, 암컷 7마리)은 열성 호중구 감소증이 보고되었으며, 대부분(10/15)은 rHuIL-12의 두 최고 복용량 수준으로 처리되었다. 15마리 동물 중 10마리는 양성 혈액배양이 있었고 가장 흔한 박테리아는 대장균과 황색 포도상구균이었다. 열성 호중구 감소증의 지속기간은 모든 동물에서 1일이었고 12마리의 동물에서 같은 날 또는 다음날 사망을 유발했다. 15마리의 동물 중 3마리는 60일째까지 생존했다(250ng/kg 그룹에서는 1마리, 500ng/kg 그룹에서는 2마리). 특히 생존한 3마리 중 2마리는 음성 혈액배양이 있었다.

골수

30일 이전에 사망한 모든 동물에서 TBI 관련 골수 저세포 상태가 관찰되었다. 이 동물들의 골수 스미어는 모든 처리군에서 유사한 골수억제 효과를 보였다. 생존한 동물의 경우, 상완골 골수에서 잔여의 뚜렷한 조혈 저세포 상태를 가지나, 다른 골수 부위에서는 정상인 한 동물(500ng/kg 군)을 제외하고 저세포 상태는 모두 60일까지 완전히 뒤집혔다.

동반 연구에서, 별도의 동물 집단(성별 당 그룹 당 2마리)이 생존 연구에서와 동일한 방사선 수준에 노출되었고 rHuIL-12의 동일한 투여 수준으로 처리되었다. 12일째에 모든 동물을 희생시켰는데, 이것은 혈구 수치의 최저치 시점을 기준으로 추정된 최대 골수 억제의 날을 나타낸다. 골수의 조직학적 분석은 재생 포켓(도 3A)과 함께 심각한 저세포 상태를 보여 주었다. 각 동물의 거핵구 수뿐만 아니라, 재생 섬의 수, 재생 섬의 전체 면적의 정량을 맹검 분석으로 수행하였다. 재생 섬의 수와 면적 모두는 대조군에 비해 rHuIL-12- 처리군에서 더 높았고, 모든 치료군은 비슷한 범위의 증가된 값을 보였다(도 3B-C). 두 파라미터의 차이는 500 ng/kg 그룹뿐만 아니라 풀 비교(모든 처리군 대 대조군)에서 통계적으로 유의미했다(p = 0.0272 및 p = 0.0311, 재생 섬의 수 및 면적, 각각). 중요하게, 거핵구 수는 대조군에 비해 모든 rHuIL-12-처리군에서 더 높았지만, 그 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(도 3D).

미생물학 및 병리학

감염

rHuIL-12로 처치한 2-5 그룹에서 각각 65%, 65%, 47%, 44%인데 비해, 대조군에서 혈액배양 양성은 86%였다. 그 차이는 가장 높은 두 투여량에서 통계적으로 유의했다(각 군에서 p = 0.0072). 감염 유병률의 감소는 그람-음성균과 그람-양성균 모두에서 나타났다. 심장, 신장, 간, 양쪽 폐, 뇌 및 비장에 대한 세균학적 분석을 모든 동물에 대한 부검에서 수행하였다. rHuIL-12로 처리된 동물의 평균 박테리아 성장 점수는 대조군에 비해 감소했다(표 1).

대장균과 황색 포도상구균이 장기와 혈액배양에서 가장 빈번한 분리물이었다. 계획되지 않은 안락사를 한 16마리의 대조군 동물 중 12마리(75%)는 rHuIL-12 처리군 2-5에서 각각 66.7%, 63.6%, 72.7% 및 55.6%와 비교하여 장기 배양에서 대장균에 양성이었다. 계획되지 않은 안락사 된 16마리의 대조 동물 중 10마리는 rHuIL-12로 처리군 2-5에서 50.0%, 54.5%, 54.5% 및 44.4%와 비교하여 장기 배양에서 화액 포도상구균에 양성이었다.

출혈

모든 기관의 전반적인 평균 출혈 점수와 위장 시스템에 대한 별도 점수는 표 1에 나타나있다. 평균 점수는 모든 rHuIL-12로 처리군 보다 대조군에서 높았지만, 기관과 기관에서 및 동물과 동물에서 상당한 차이가 있었는 바, 차이는 통계적 유의성이 없었다. 특히, 적어도 한 기관에서 출혈 점수가 4 이상인 동물의 비율은 대조군에서 rHuIL-12로 처리된 군보다 높았고, 뇌출혈은 대조군(2마리 동물)에서만 발견되었다.

고찰

본 연구에서 사용된 리서스 원숭이 모델은 TBI의 혈액학적 효과 및 이 모델에서 감염 및 출혈의 발생이 사람에게 보고된 것과 유사하기 때문에 인간 HSARS의 확립된 모델이다. 이 무작위 추출된, 맹검의, 위약-대조 연구의 데이터는 HSARS의 리서스 원숭이 모델에서 치명적인 TBI 후 생존에 10배 투여량 범위 이상의 rHuIL-12의 단일, 피하 주사의 긍정적이고 중요한 효과를 입증한다. 특히, 이 효과는 지지 치료의 사용없이 달성되었다. 이러한 결과는 rHuIL-12가 NHP 8의 개념-증명 연구에서 발견된 생존에 대한 유익한 효과와 일치한다.

현재 연구에서 TBI로 인한 임상 증상(구토, 설사 및 체중)은 일반적으로 모든 처리군과 성별 간에 유사했다(보충 참조). 혈구 수치 최저치 및 감염, 출혈 및 사망률이 가장 높은 기간 동안 발생한 활성 및 식욕 감소는 대조군에서 가장 높았으며 rHuIL-12로 처리한 그룹에서는 보다 작았다.

방사선-유발된 골수 억제는 rHuIL-12에 의해 완화되었다: rHuIL-12로 처리한 동물 그룹은 중증 호중구 감소증 및 중증 혈소판 감소증뿐만 아니라 림프구, 호중구, 혈소판 및 망상적혈구에 대한 약화된 최저치의 통계적으로 유의한 감소를 보였다. 대조군에 비해 rHuIL-12로 처리된 동물에서 평균 혈소판 부피가 증가하여 골수에서 새로 형성된 혈소판이 방출되는 것으로 나타났다. 동반된 연구에서 골수 재생 포켓의 정량 분석은 rHuIL-12 단독으로 골수 재생 및 주요 혈구 구성 요소의 재생을 허용하는 조혈에 자극 효과가 있다는 결론을 뒷받침하였다. 특히, 거핵구 수는 대조군에 비해 rHuIL-12-처리군에서 더 높았다. 본 연구에서 보여진 바와 같이, rHuIL-12에 의한 생체 내 다중 조혈 계통의 자극은 IL-12가 시험관 내에서 조혈 줄기세포 및 전구세포의 성장을 자극한 이전의 보고(4-6) 및 종양-보유 마우스에서의 본 발명자들의 이전 연구와 일치한다.

중증 호중구 감소증의 감소와 일치하여, 감염에 대한 혈액 배양 양성 발생률은 대조군에서 86%에서 47%로 현저히 감소하였고, 각각 250 또는 500 ng/kg의 투여량으로 rHuIL-12를 처리한 그룹에서 rHuIL-12 44%였다. 이 데이터는 TBI 후 24 시간 후 투여된 rHuIL-12가 항생제가 없는 경우 광범위한-스펙트럼 박테리아의 감염성을 감소시킨다는 것을 입증한다.

중증 호중구 감소증의 감소와 감염 및 패혈증의 감소를 지지하여, IL-12는 선천 및 적응 면역에 대해 여러 자극 효과를 나타내는 것으로 알려져, 감염의 발병률 감소에 기여했을 것으로 보인다. 방사선 조사 후 초기 단계에서 Th1 기능은 항원 제시 세포로부터의 내인성 IL-12 분비의 억제로 인해 감소된다. 방사선 조사 후 투여된 IL-12는 생존하는 NK 세포, 대식세포 및 수지상세포의 증식 및 활성화를 촉진한다. NK, 대식세포 및 수지상세포 사이의 세 방향 크로스-토크는 성숙을 촉진하여, Th1 기능의 회복과 TBI 후 초기 면역 능력의 확립을 유도한다. 또한, 병원체-활성화된 수지상세포로부터의 내인성 IL-12의 연속적인 생산은 양성 피드백 루프로서 작용하며, 외인성 IL-12에 대한 초기 반응을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 종합하면, IL-12 생성된 면역-매개 효과는 이 연구에서 관찰된 긍정적인 생존 이득을 상당 부분 차지할 수 있는데, 이것은 IL-12의 항-감염 특성으로부터 유도된 것일 수 있다.

중증 혈소판 감소증의 감소와 일치하여, 본 연구에서 rHuIL-12 치료는 사망하거나 예정된 종료 전에 안락사시킨 동물에 대한 출혈의 중증도와 관련이 있다. 감소된 중증 혈소판 감소증 및 출혈에 대한 발견을 뒷받침하기 위해, 본 발명자들은 최근 골수 내에서 IL-12 신호전달의 가장 특이적인, IL-12 수용체(IL-12Rβ2)의 β2 서브유닛의 발현을 보고하였고, 이는 조혈 줄기세포, 거핵구 및 골아세포에서 발견되었다. 이러한 핵심 골수 세포에서 IL-12Rβ2 수용체의 존재는 그 수용체를 통해, rHuIL-12가 방사선 노출 후 생존한 줄기세포 및 거핵구의 증식과 분화를 촉진하고, 혈소판 재생을 촉진하며 중증 혈소판 감소증을 감소시킬 수 있음을 시사한다. 암 환자에서 골수 억제 치료 후 혈소판 회복을 촉진할 수 있는 약물이 현재 없기 때문에, 혈소판 재생을 촉진하기 위한 rHuIL-12의 능력은 HSARS 완화 이외의 적응증에서 임상적으로 중요할 수 있다.

백혈구 성장 인자는 방사선의 희생자에게 사용하는 것이 권고되나, FDA는 이 적응증을 승인하지 않았다. 집중적인, 트리거-기반(trigger-based) 의료 관리(항생제, 정맥 내 혈액 제제 수혈, 정맥 내 수액 보충)와 함께 대조군 NHP 9에 대해 rHuG-CSF-에서 생존이 향상되었음을 입증한 오직 한 건의 연구 결과가 있다. 본 발명자들은 최근 rHuIL-12의 단일 주사 또는 비히클을 지지 치료없는 NHP 모델에서의 rHuG-CSF 18회 주사와 비교한 무작위적 맹검 연구를 완료하였다. 예비 분석 결과, 비히클, G-CSF 처리군에 대해 rHuIL-12 처리군에서 우수한 생존을 보였으나, G-CSF는 비히클과 비교하여 생존이 증가하지 않았다(원고 준비 중). 동물 효능 연구와 병행하여, rHuIL-12의 안전성과 내약성은 동물실험갈음규칙(Animal Rule)에 따라 정상인 건강한 개체에서 결정되었다. 첫번째 인간(FIH) 연구는 투여량 증가(2 내지 20㎍ 범위의 투여량에서)를 통해 rHuIL-12의 안전하고 잘-견딜 수 있는 투여량을 결정하기 위해 실시되었으며, 이어서 FIH 연구로부터 12㎍의 가장 안전하고 잘-견딜 수 있는 용량에서 단계 1b 확장(phase 1b expansion) 연구를 실시하였다(Gokhale et al., in preparation). 성인 70kg에 대한 12ug 단위의 인간 투여량은 체중 기준 변환을 사용하여 171ng/kg의 리서스 원숭이 투여량으로 전환될 수 있으며 이 투여량은 리서스 원숭이 연구에서 결정된 바와 같이 유효 투여량 범위 내에 있다.

요약하면, 이 무작위의, 위약-대조된, 맹검 연구는 생존을 증가시키고 조혈 시스템을 재생시키는 능력으로 인해 지지 항생제, 체액 또는 혈액 제제 없이 단일, 저용량으로 방사선 노출 24시간 후에 투여했을 때. rHuIL-12가 이상적이고 우수한 방사선 완화제임을 입증하였다. 동물 모델에서 인간으로의 효과적이고 안전한 투여량의 변환은 동물실험갈음규칙에 따른 모든 약물 개발 프로그램에 대한 중요한 도전 과제이다. 따라서, NHP 모델에서 rHuIL-12의 10배 효과적인 투여량 범위에 걸쳐 통계적으로 유의한 생존 증가가 달성된다는 본 발명자들의 발견은 최적의 사람 투여량 선택을 위한 뚜렷한 이점을 제공할 것이다.

표

표 1. 거시적 기관 출혈 점수 및 동물 당 장기 감염 점수(평균 ± SEM)

^a 다음의 조직들은 표에 나타난 평균 출혈 점수를 계산할 때 포함되었다: 위, 회장, 공장, 십이지장, 대장, 맹장, 직장, 심장, 뇌, 신장, 간, 폐, 방광. 출혈 점수는 다음과 같이 정의하였다: 0 = 출혈 없음; 1 = 최소 출혈(들); 2 = 경미한 출혈(들); 3 = 보통 출혈(들); 4 = 현저한 출혈 (들); 5 = 중증 출혈. 각 동물에서 모든 기관의 점수를 합한 다음 각 처리군의 평균 점수를 계산하였다.

^b 다음의 조직들은 위장관 출혈 점수를 계산할 때 포함되었다: 위, 회장, 공장, 십이지장, 대장, 맹장

^c 감염 점수 결정을 위해 뇌, 심장, 신장, 간, 양쪽 폐 및 비장을 포함하여, 부검 및 배양된(죽은 동물은 분석에서 제외되었다), 장기 샘플을 수집하였다. 각 장기에 대해 박테리아 성장을 점수매겼다(0 내지 4). 각 동물에서 모든 기관의 점수를 합한 다음, 각 처리군의 평균 점수를 계산하였다.

실시예 12:

마우스에서 치명적 방사선 조사 후 조혈 회복을 위한 재조합 인터루킨-12 대 골수 이식 및 잠재적 세포 표적의 평가

Interleukin-12 (IL-12)는 잘 특징지어진 면역 조절 효과 외에도, 방사선 조사로 손상된 골수에서 조혈 복원에 중요한 역할을 한다. 본 발명자들은 이전에 재조합 마우스의 IL-12(rMuIL-12)만이 치명적으로 조사된 마우스에서 생존을 증가시켰다고 보고하였다. 여기에서, 본 발명자들은 치명적인 방사선에 노출된 마우스를 구하기 위해 rMuIL-12 투여의 두 가지 스케줄을 골수 이식 (BMT)과 비교하였다. 그룹당 10마리의 동물은 다음 중 하나를 투여받았다: 비히클; 전신 방사선 조사(TBI) 24시간 전 10ng rMuIL-12; TBI 24시간 전 및 3일 후 10ng rMuIL-12; 또는 TBI 2시간 후 주입된 기증자 골수(1.1 × 10⁶ 세포). 결과는 rMuIL-12로 처리한 동물의 생존율이 BMT와 유사함을 보여주었다. 또한, 두 치료법 모두에 대한 호중구, 적혈구 및 혈소판의 조혈 회복도 유사했다. 마우스에서의 생체 내 실험은 비히클에 비해 rMuIL-12가 조혈 줄기/전구세포로 구성되는 세포의 서브유닛, 골수 유래 계통-음성(Lin-) 세포에서 IL-12 수용체 β2 서브유닛(IL-12β2)의 발현을 증가시킨다는 것을 나타내었다. 본 발명자들은 인간 조혈 줄기/전구세포 (HSC)의 서브유닛에서 IL-12Rβ2의 발현을 조사했다. 인간 골수-유래 CD34+ HSC는 IL-12Rβ2를 발현 하였고 IL-12Rβ2는 인간 HSC의 다른 마커와 함께 발현된다. 이러한 결과는 조혈 회복에서 IL-12 기능이 골수 내 IL-12Rβ2 발현 줄기세포와의 상호 작용에 의해 유도될 수 있음을 시사한다. 이러한 데이터는 다양한 임상 환경에서 골수 제거 후 조혈 회복을 촉진하기 위한 보조적인 재조합 인간 IL-12의 연구에 동기를 부여한다.

방사선-유발된 조혈 증후군의 완화를 위한 이상적인 약물은 방사선 노출 희생자들 사이에서 HSC 이식(여러 골수 세포 계통의 성장 촉진, 이환율 감소, 생존율 개선)의 효과를 모방하고, 건강한 개체에게 투여될 때 안전할 것이며 모든 희생자에게 단일 투여량 수준으로 투여될 수 있다. 본 발명자들은 이전에 염증 전 사이토카인 인터루킨 12(IL-12)를 그러한 후보 물질로 제안하였다. [1] 잘-정립된 면역 역할[2] 외에도, IL-12는 손상된 골수에서 조혈 능력을 보존하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 초기의 생체 외 연구는 IL-12가 콜로니-자극 인자(CSFs) [3] 또는 IL-3 및 SI 인자(SF; 줄기세포 인자 [SCF]라고도 함) [4,5,6]와 함께 골수 줄기세포 및 전구세포 [6], Lin-/Sca-1+ 세포 [3], 림프 조혈 전구세포 [5], 또는 혼합된, 적혈구 및 골수 콜로니 [4]의 증식을 유도할 수 있음을 입증하였다. Neta et al. 에 의한 생체 내 연구는 IL-12 단독 (1㎍/마우스)이 마우스의 골수를 치명적인 방사선의 영향으로부터 보호하지만, 위장 계의 방사선 민감도를 증가시킨다는 것을 입증했다. 그 후, Chen et al. [8]은 100 ng/마우스의 IL-12 투여량이 위장 계의 방사선 민감도를 증가시키지 않으면서 치명적인 방사선 조사로부터 골수를 보호하는데 효과적이라고 보고하였다. 본 발명자들은 최근 위약에 비해, 골수 세포에서 IL-12 수용체 β2 서브유닛 발현 유도에 의해 나타난 바와 같이, 치명적인 방사선 24시간 후 마우스에 투여된 재조합 마우스의 IL-12(rMuIL-12) 10 내지 40ng의 투여량이 생존을 증가시키고 조혈을 촉진한다고 보고하였다 [1]. 또한, 치명적인 TBI에 노출된 비-인간 영장류에서 재조합 인간 IL-12(rHuIL-12)로 처리한 결과, 위약으로 처리한 동물에 비해 생존이 유의하게 증가했으며 백혈구 및 혈소판의 최저치는 감소했다.

현재 연구에서, 본 발명자들은 조혈 회복을 유도하고 생존을 촉진시키는 rMuIL-12의 능력을 치명적으로 조사된 마우스에서 통상적인 BMT의 능력과 비교하였다. 또한, IL-12의 잠재적 세포 표적을 더 설명하기 위해, 본 발명자들은 인간 골수-유래 FISC에서 IL-12 수용체(IL-12Rβ2)의 β2 서브유닛의 발현을 평가했다.

재료 및 방법

재조합 IL-12

rMuIL-12는 Peprotech(Catalog# 210-12)에서 수득하였다; Rocky Hill, NJ, USA) 또는 SBH Sciences(LS # 45 [Q4]; Natick, MA, USA) 각 동물 실험에 대해 보고된 투여량은 ELISA(마우스 IL-12 (p70) ELISA MAXTM Deluxe 키트(Biolegend, San Diego, CA))에 의해 결정된 투여량이다.

생체 내 동물 연구

C57BL/6 마우스는 Jackson Laboratories(Sacramento, CA) 또는 Harlan Laboratories (Indianapolis, IN)로부터 얻었다. 연구 개시 시점에 마우스는 8 내지 10주령이었고, 무게는 약 20g이었으며, 질병의 징후는 없었다. 모든 절차는 BALI'S(Northridge CA) 동물실험윤리위원회 (국제실험동물관리평가인증협회 및 미국 실험동물관리협회의 인가를 받은)에 의해 검토되고 승인되었으며, 국립 보건원의 지침에 따라 수행되었다 [9].

치명적인 방사선에 노출된 마우스에서 생존에 대한 rMuIL-12 및 BMT의 영향 비교

치명적인 TBI에 노출된 40 마리의 암컷 마우스에서 rMuIL-12 및 BMT가 생존에 미치는 영향을 비교하였다. 10마리의 마우스 각각을 하기 정맥 치료 중 하나에 배정하였다: TBI 24시간 전에 투여된 비히클(인산염 완충 식염수[PBS]; 100㎕); TBI 24시간 전에 투여된 rMuIL-12 10ng(이하 단일 용량 rMuIL-12); TBI 전 24 시간 및 3일 후 투여된 10ng rMuIL-12(이하, 반복-투여 rMuIL-12); 또는 TBI 2시간 후에 투여된 기증자 골수(1.1 × 10⁶ 세포). 이식을 위한 기증자 골수 세포를 25 게이지 5/8-인치 바늘을 사용하여 PBS로 대퇴골과 경골을 플러싱(flushing)하여 정상 암컷 C57BL/6 마우스로부터 분리하였다. 세포를 40㎛ 세포 스트레이너로 여과하고, 10% 소 태아 혈청을 포함하는 RPMI 배지로 세척하고, 액체 질소 중에서 저온 보존하였다. 0일째에, Gammacell® 40 (137Cs)(Theratronics, Ontario, Canada)를 사용하여 8.2Gy(LD90 [1]을 타겟으로한)의 용량으로 TBI에 노출시켰다. 마우스는 방사선 분배를 위한 "파이 박스(pie-box)"를 사용하여 방사선 조사 장치에 집중되었다. TBI 후, 마우스는 멸균된 음식과 산성화된 물을 자유롭게 섭취하고 35일째까지 생존을 관찰하였다. 각 그룹에서 5마리로부터 21일, 28일, 35일에 혈액을 채취하였다. 혈구 수는 Hemavet® 850 (Drew Scientific Inc.; Waterbury, CT)에 의해 측정되었다.

건강한 암컷 C57BL/6 마우스의 Lin-세포에서 IL-12Rβ2 수용체 베타-2 서브유닛(IL-12Rβ2) 발현에 대한 rMuIL-12의 생체 내 영향의 유동 세포계수 분석

마우스(처리 그룹 당 6마리)는 꼬리 정맥 주사 또는 비히클(PBS)을 통해 rMuIL-12(10ng)를 투여받았다. rMuIL12 처리 21시간 후 골수를 수득했다. 대퇴골에서 골수가 빠져나갔고 경골을 MACS 완충액(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)으로 희석하고 70㎛ 세포 스트레이너(VWR, San Francisco, CA)로 여과하였다. 세포를 세척하고 다음의 마우스 계통 마커(Lin +): CD3e, CD4, CD5, CD8b, CD8a, B220, CD11b, Gr1 및 Ter(80) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)에 대한 바이오틴-접합된 단일 클론 항체로 배양하였다. 세포를 항-바이오틴 표지된 자성 비드와 함께 배양하고 QuadroMACS 분리기(Miltenyi Biotec; Auburn, CA)의 자기장에 놓인 MACS 칼럼을 통과시켰다. 표지되지 않은 Lin-세포를 유출액으로 수집하고 실온에서 30분동안 항-마우스 IL-12Rβ2 항체(HAM 10B9, BD Biosciences, San Jose, CA)와 함께 배양하였다. 세포를 염색되지 않고 아이소타입 대조군을 갖는 MoFlow 세포 계측기(Beckman Coulter; Indianapolis, IN)에서 분석 하였다. 상기 실험은 앞서 언급 한 바와 같이 rMuIL-12 및 IL-12 세포가 IL-12Rβ2 발현에 대해 분석된 후 25시간에 수득 된 골수로 반복하였다.

인간 골수 CD34+ 세포에서 IL-12Rβ2의 면역세포화학적 검출

인간 골수 유래 CD34 + 세포는 All Cells (Emeryville, CA)로부터 상업적으로 수득하였다. 5㎍/mL 피브로넥틴 슬라이드에 세포를 접종하고 20℃에서 10분간 차가운 메탄올로 고정시켰다. 고정된 세포를 내인성 페록시다아제 염색을 제거하기 위해 0.3% H₂O₂로 30분간 처리한 후 비-특이적인 염색을 제거하기 위해 Background Sniper(Biocare Medical, Concord, CA)로 20분간 처리 하였다. 처리된 세포를 인간 IL-12Rβ2(Sigma; St Louis, MO)에 대한 토끼 다클론 항체로 표지하고, 겨자무과산화효소(ImmPRESS 시약, Vector Laboratories, Burlingame, CA)에 커플링된 항-토끼 IgG와 배양하였다. 슬라이드를 30분 동안 ImmPACT AEC 퍼옥시다아제 기질(Vector Laboratories; Burlingame, CA)과 함께 배양하고 CAT 헤마톡실린(Biocare Medical, LLC, Concord, CA)에서 대조 염색 하였다. 음성 대조군에는 1차 항체가 없는 겨자무과산화효소에 결합 된 항-토끼 IgG로 표지된 세포가 포함되었다. Olympus BX41 복합현미경(Olympus, America, Inc, Centre Valley, CA) 및 Infinity Analyze Software v5.0을 사용하여 이미지를 획득하였다. 분석은 3 명의 개별 기증자의 CD34+ 세포를 사용하여 3회 실시 하였다.

인간 골수-유래 줄기/전구세포 상의 IL-12Rβ2의 발현에 대한 유동 세포계수 분석

인간 골수-유래 CD34+ 세포를 상기 기술한 바와 같이 상업적으로 수득하였다. CD34+ 세포를 세척하고 생존능력 마커인 LIVE/DEAD Fixable 죽은 세포 염색(Invitrogen; Grand Island, NY)으로 실온에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 세척하고 다음의 조혈 줄기세포 마커 각각에 대한 항체와 함께 배양하였다: 플루오레세인 이소티오시안산염(fluorescein isothiocyanate, FITC)-접합된 cKit/CD117 (clone # YB5.B8; BD Biosciences; San Jose, CA), 피코에리트린(PE)-conjugated CD133 (clone #293C3; BD Biosciences), PE-Flt-3/CD135 (clone #4G8; BD Biosciences), PE-Slam/CD150 (clone #Al2; BD Biosciences), PE-VegfR2/KDR (clone#89106; R&D systems; Minneapolis, MN), PE-CDCP1/CD318 (clone #309121; R&D systems), FITC-CD34 (clone #AC136; Miltenyi Biotec; Auburn, CA). 상기 나열된 각 항체에 대한 아이소타입-매치된 대조군을 배경 형광을 결정하는 것과 병행하여 분석하였다. BD Cytofix/Cytoperm 고정/투과성 키트(BD Biosciences, San Hose, CA)를 사용하여 세포를 세척하고 고정시키고 투과성으로 만들었다. 세포 내 IL-12Rβ2는 인간 IL-12Rβ2(Clone # 305719; R & D systems; Minneapolis, MN)에 대한 알로피코시아닌-접합된(APC) 항체를 사용하여 측정하였다. IL-12Rβ2 항체에 대한 아이소타입-매치된 대조군을 동시에 분석하였다. 세포는 Southern California-Health Science Campus의 Broad CIRM Center에 위치한 고-출력, 고체 상태 레이저(488nm, 635nm 및 근 UV의 파장) 3개가 장착된 특별 주문 연구 제품 (SORP) BD^TM LSRII 디지털 유동 세포계측기(BD BioScience; San Jose, CA; License# H47300022)를 사용하여 분석되었다. 이 세포계측기는 최대 10개의 형광 파라미터로 데이터를 수집하는데 특화되어 있다. Flow.Jo 버전 9.5.2(TreeStar, Ashland, USA)를 사용하여 데이터를 분석하였다. 게이팅(Gating) 전략은 다음과 같다: CD34 세포를 선택하기 위한 전방 대 측방 산란 플롯, 죽은 세포 배제에 대한 측방 산란 대 생존/사멸 세포 염색, 줄기세포 마커 대 더블릿(데이터 나타내지 않음) 및 IL-12Rβ2을 배제하는 높이 대 면적 산란. 사분면 게이트는 아이소타입 매치된 항체 대조군에 기초하여 설정되었다. 분석은 3명의 개별 기증자의 CD34+ 세포를 사용하여 3회 실시하였다.

통계적 분석

Cox-Mantel test를 이용하여 모든 처리군의 생존 곡선을 통계적으로 비교 하였다. Student T-test를 이용하여 모든 군의 혈액 세포 회복 정도를 분석하였다. 적용가능한 경우 표준 편차가 있는 평균이 보고되었다.

결과

rMuIL-12는 치명적인 방사선에 노출된 건강한 마우스에서 생존을 높이고 BMT만큼 효과적으로 혈구 회복을 촉진한다.

BMT와 rMuIL-12의 단일 또는 반복 투여량 중 하나는 치명적인 TBI에 노출된 C57BL/6 마우스(도 1)에서 비히클과 비교하여 생존을 증가시키는 유사한 능력을 나타내었고, 35일째 전체 생존율(OS)는 비히클 그룹에서 0%, BMT 그룹에서 70%, 단일 용량 rMuIL-12 그룹에서 60%, 반복-투여 rMuIL-12 그룹에서 90%이다. rMuIL-12를 갖는 OS는 BMT와 유사한 수치였다. 각 rMuIL-12 그룹과 BMT 그룹의 OS는 Cox-Mantel 테스트를 사용하여 비히클 그룹보다 유의하게 높았다(각 비교에 대해 P <0.005). 21일째, BMT 그룹의 호중구 수치는 단일 용량 rMuIL-12보다 유의하게 높았다(p <0.05) (도 2A). 반복 투여 rMuIL-12 그룹의 호중구 수치는 BMT 그룹과 통계적으로 차이가 없었다. 28일째와 35일째에 모든 처리군에서 호중구 수치가 통계적으로 유사했다. BMT 그룹의 적혈구 수치는 21일째 rMuIL-12 그룹보다 유의하게 높았다(p <0.005) (도 2B). 모든 처리군에 대한 적혈구 수치는 28일째와 35일째에 유사했다. 혈소판 수치는 반복 투여 rMuIL-12 그룹에서 21일째 단일 투여 rMuIL-12(p <0.005)와 BMT(p <0.05)에 비해 유의하게 높았다(도 2C). 28일째와 35일째, 모든 처리군의 혈소판 수치를 통계적으로 비교하였다. 오차 막대는 평균 ± SD를 나타낸다. 전반적으로 rMuIL-12와 함께 35일째에 호중구, 혈소판 및 적혈구(RBC)를 회수하는 것이 BMT와 유사했다.

rMuIL-12로의 생체 내 치료는 골수-유래 계통이 고갈된 (Lin-) 세포에서 IL-12 수용체, 베타-2 서브유닛(IL-12Rbeta2)의 발현을 증가시킨다.

마우스의 골수에서 IL-12Rβ 2의 발현을 밝히기 위해, 본 발명자들은 꼬리 정맥 주사를 통해 rMuIL-12(n = 6) 또는 비히클(n = 6)의 단일, 정맥 내, 10-ng 용량으로 건강한 암컷 C57BL/6 마우스를 처리하고, 골수에서 분리된 Lin-세포에서 IL12Rbeta2의 발현을 조사하였다. 두 실험의 결과는 rMuIL-12가 처리 후 21시간에서 25시간에 Lin-세포의 IL-12Rb2의 발현에서(표 1) 3.5 배에서 5.4 배 증가(평균 (± SD) - 4.45±1.3) 를 유도한다는 것을 보여주었다. Lin-세포는 조혈 줄기/전구세포로 구성된 세포 집단을 나타내며 성숙한 조혈세포와 헌신적인 전구 간세포(committed precursor progenitors)를 고갈시켰다. 데이터는 IL-12가 마우스 골수의 Lin-세포에서 IL-12Rbeta2 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다. IL-12의 조혈 복구 기능에 대한 이 데이터는 IL-12Rbeta2가 HSCs에서 발현될 수 있음을 시사한다.

인간 골수 CD34+ 세포는 IL-12Rβ2를 발현한다.

본 발명자들은 다음으로 인간 골수 CD34를 발현하는 HSC에서 IL-12Rbeta2 발현을 밝혀냈다. 첫째, 면역세포화학 염색을 사용하여, 상업적으로 이용 가능한 인간 골수 CD34+ 세포(도 3A)에서 IL-12R β2의 존재를 입증했다. 둘째, 유동 세포계수 분석을 통해 인간 CD34+ 세포에서 IL-12Rβ2의 발현을 정량화했다. 검사한 3명의 개별 기증자의 CD34+ 세포 중 IL-12Rβ2를 발현한 평균(± SD) 백분율은 89±2였다(도 3B).

인간 골수 CD34+ 세포는 IL-12Rβ2와 다른 알려진 조혈 줄기/전구세포(USC) 마커를 공동 발현한다.

다음으로 본 발명자들은 CD34+ 세포에서 IL-12Rβ2 발현에 대한 관찰을 뒷받침하기 위해 HSC 마커 CD117, CDI33, CD135 및 CD318과 함께 IL-12Rβ2 동시발현을 조사하고자 했다. 이들 마커는 생착 가능성이 있는 HSC 집단을 대표하는 것으로 나타났기 때문에 선택되었다 [18,23,24,25,26,27]. IL-12Rβ2는 인간 골수 CD34 + 세포에서 CD 117, CD133, CD135 및 CD318과 함께 발현된다. IL-12β2와 CD117, CD133, CD135, CD318을 동시에 발현한 CD34+ 세포의 평균 백분율은 각각 70 ± 11%, 63 ± 7%, 57 ± 4%, 61 ± 9% 였다 (표 2 및 도 4A 내지 도 4D). 특히, CD113, CD133, CD135 및 CD318를 발현하는 CD34 하위 집단의 대다수는 IL-12Rβ2 발현을 나타내었다. 이러한 결과는 골수에서 HSC 집단을 통한 IL-12 매개된 조혈 복구에서 IL-12Rβ2의 잠재적인 역할을 나타낸다.

고찰

현재 연구는 치명적으로 조사된 마우스에서 rMuIL-12 또는 BMT로 처리한 결과 생체 내 조혈 활성 및 생존 이득을 비교했다. 결과는 BMT 또는 rMuIL-12의 1 또는 2 회 10ng 용량으로 처리된 조사된 마우스가 비히클 대조군에 비해 유의하게 생존을 증가시켰다는 것을 입증했다. 세 가지 활성 처리군 간의 생존 곡선은 유의한 차이가 없었다. 호중구, 적혈구 및 혈소판의 유사한 회복이 세 활성 처리군 모두에서 관찰되었다. 반복 투여 rMuIL-12의 혈소판 수치는 혈소판 회복에서 IL-12/IL-12R의 역할을 뒷받침하는 BMT에 비해 초기 21일 시점에서 유의하게 높았다. 이 데이터는 본 발명자들의 실험실과 다른 연구자의 이전 데이터를 확인하고 확장한다 [7,8]. 본 발명자들은 또한 Lewis 폐와 EL4 림프종 종양이 있는 피하 조사된 마우스에서 rMuIL-12가 혈구 회복에 미치는 유사한 효과를 관찰했다 [10].

조사된 마우스의 골수에서 rMuIL-12가 생존과 혈액 세포 재생을 촉진시키는 능력은 기능성 IL-12 수용체(IL-12R)가 골수 세포에 존재함을 시사한다. IL-12 수용체는 IL-23 수용체 복합체 [11]와 IL-12 수용체-특이적 β2 서브유닛(IL-12Rβ2)[2] 에 공통적인 β1 서브유닛(IL-12Rβ1)로 구성된 이형이량체 막관통 단백질이다. 면역조직화학적 분석을 이용하여 본 발명자들은 IL-12Rbeta2가 마우스의 골수 세포에서 발현된다는 것을 이전에 보고하였다. 마우스 골수 면역조직화학 데이터가 IL-12 처리가 조혈 골수 세포의 증식과 분화를 촉진한다는 것을 시사하였는 바, 본 연구에서 정상 마우스에서의 rMuIL-12 처리가 조혈 줄기/전구세포의 집단을 나타내는 Lin-집단에서, IL-12Rbeta2 발현에 영향을 줄 것인지를 조사하였다. 결과는 대조군 마우스에 비해 rMuIL-12로 처리한 마우스는 골수 유래 Lin-세포에서 IL-12Rbeta2의 발현이 3배에서 5배 증가 함을 보였다.

본 발명자들은 IL-12Rbeta2가 사람의 골수에서 발현되었는지 여부를 결정하고자 했다. 면역세포화학은 인간 골수 유래 CD34+ 세포에서 IL-12Rbeta2의 존재를 나타내었고, 유동 세포계수 분석은 CD34+ 세포가 12Rbeta2를 발현한다는 것을 밝혀냈다. 현재 연구는 IL-12Rbeta2가 골수 내 조혈 줄기 및 전구세포의 혼합된 집단을 대표하는 인간 CD34+ 세포에서 발현된다는 것을 최초로 보여준다. 본발명자들은 장기적인 재구성 가능성을 가지고 있으며 임상 환경에서 골수 이식에 사용되는 세포 집단을 대표하는 정상 인간 골수-유래 CD34+ 세포의 87-90%에서 IL-12Rβ2 발현을 확인했다[12, 13, 14]. 또한, HSC 집단을 확인하는 데 사용된 CD117 (c-Kit), CD133, CD135 (Flt3) 및 CD318 (CDCP1) 마커를 발현하는 CD34 세포의 일부 집단이 IL-12Rβ2를 공동 발현했다. CD 117은 SCF의 수용체로서 HSC의 확장에 관여하는 조혈 성장 인자로 기능하는 것으로 알려져 있으며[15] HSC의 동원에 관련되어있다[5,15]. 흥미롭게도, IL-12와 SCF는 림프구 조혈 전구세포의 증식을 상승적으로 지지하는 것으로 나타났다[5]. CD133은 신경 및 조혈 줄기/전구세포에서 발현되는 것으로 보고되었으며[16], CD34+/CD133+ 세포는 NOD/SCID 마우스에에 생착 할 수 있다. 수용체 티로신 키나아제 패밀리의 일원인 CD135는 조혈 항상성의 유지에 결정적인 역할을 하며, 조혈 모세포의 확장에 관여한다[18]. Flt3-리간드는 골수 HSC의 확장에서 IL-12 및 다른 사이토카인 및 성장 인자와 함께 시너지 효과를 나타내는 것으로 나타났다[19]. CD318+ 세포는 NOD/SCID 마우스에 생착할 때 다중계통 분화능을 갖는 것으로 나타났다[20]. 종합해보면, 마우스 및 인간 골수로부터의 IL-12Rβ2 발현 데이터는 IL-12Rβ2 발현하는 HSC가 IL-12의 조혈 활성의 잠재적 표적이 될 수 있음을 시사한다.

IL-12가 조혈을 자극하고 치명적인 손상을 입은 골수가 있는 동물의 생존을 촉진시키는 명백한 능력은 IL-12가 임상적으로, 이식 전 요법으로, 방사능 사고 또는 재난의 결과로 유발된, 골수가 손상된 상황에서 유용한 치료법일 수 있음을 시사한다. FDA 동물실험갈음규칙에 따라 급성 방사선 증후군(HSARS)의 조혈 증후군을 치료하기 위해 재조합 인간 인터루킨-12 제제(rHuIL-12)인 HemaMax^TM(Neumedicines Inc., Pasadena, CA)가 개발 중이다. 본 발명자들은 치명적인 방사선에 노출된 24시간 후 투여된 단일, 저용량(100ng/kg 또는 250ng/kg)의 HemaMax ™가 비인간 영장류(NHP)에서 골수를 재구성하고 생존을 증가시킬 수 있다고 최근 보고하였다. 또한, rHuIL-12는 치명적으로 조사된 NHP에서 백혈구 및 혈소판의 최저치를 감소시켰다[1].

종양학 환경에서 BMT와 관련하여, IL-12의 조혈 특성은 보조 치료제로서 적용 가능할 수 있다. 골수 줄기세포 동원의 기술을 향상시키고, 채집을 위한 분리반출법 접근을 개발하고, 독성을 줄이기 위한 새로운 전략을 사용하여 HSC 이식의 결과를 향상시키고 암 환자의 더 넓은 집단에 치료 가치를 확대시켰다[21,22,23]. 그럼에도 불구하고 HSC 이식의 성공은 조혈계의 장기 재구성에 필요한 세포의 수에 의해 크게 제한된다. 기존의 이식은 G-CSF와 같은 성장 인자로 동원되어 분리된 CD34+ 세포를 사용하지만, 충분한 양의 CD34+ 세포를 분리하기 위한 G-CSF 치료의 다중 라운드(round)에 대한 요구는 면역억제일 수 있다[24,25]. 골수 및 적혈구 성장 인자는 이식 후 호중구 감소증과 빈혈을 치료하는데 사용되지만[26], 혈소판 재생에는 영향을 미치지 않는다. 따라서 암 환자의 17%에서 생길 수 있으며 사망 위험이 유의하게 높이는[27], 이식 후 혈소판 감소증을 극복하기 위해서는, 환자는 초기 이식 후 혈소판 수혈에 의존해야 한다[28]. 이전 연구에서와 마찬가지로[1, 10], 현재 연구에서 관찰된 것과 같이, 치사 방사선에 노출된 마우스에서 IL-12 치료 후에 관찰된 혈소판 수치의 증가는 IL-12가 사람에서 이식 후 혈소판 회복을 촉진하는데 도움이 될 수 있음을 시사한다.

수많은 임상 시험에서 암 환자에서 항-종양 제제로 IL-12를 평가했지만, 반복적인 고용량(300ng/kg 내지 600ng/kg) 요법(일주일에 5회)으로 투여했을 때, 그다지 좋지 않은 임상 활성과 유의한 독성으로 인해 치료제로 발전하지 못하였다[29,30,31,32,33,34,35,36,37]. 대조적으로, 말초 혈액 줄기세포 이식 후 약 2개월 후, 그리고 2주 후 5일 연속으로 단일 투여된 IL-12 투여량은 30-250 ng/kg으로 고-위험의 혈액학적 악성 종양 환자에서 허용할만한 내약성을 보였다[37]. 위에서 언급했듯이, rHuIL-12는 치명적인 TBI에 노출된 리서스 원숭이에게 100-250 ng/kg의 용량으로 1 내지 2 회만 투여했을 때 조혈 촉진-활성을 나타냈다[1]. 이 투여량은 100 ng/kg 미만의 인간 투여량과 동일하다. 현재 진행중인 1 단계 인간 안전 연구에서, rHuIL-12는 잘 견뎌지며 안전 문제는 확인되지 않았다(Neumedicines, Inc., 미공개 자료). 이러한 결과는 조혈 재생에 필요한 rHuIL-12 용량이 이전에 암 환자에서 사용된 IL-12 용량보다 상당히 낮을 것이고 암에 대한 ARS와 HSC 이식의 환경 모두에서 rHuIL-12에 대한 보다 바람직한 안전성 프로파일을 가져야 함을 시사한다.

결론

본 발명자들은 rMuIL-12가 치명적인 방사선에 노출된 마우스에서 조혈 회복과 생존을 촉진함에 있어서 BMT와 동등하다는 것을 입증했으며, rMuIL-12 치료는 정상 마우스에서 분리된 Lin-세포에서 IL-12Rβ2 발현 수준을 증가시킴을 입증하였다. 또한, 정상 인간 골수의 CD34+ 세포는 IL-12Rβ2를 발현하는 것으로 밝혀졌다. IL-12Rβ2는 또한 다른 공지된 HSC 마커와 함께 발현되는 것이 밝혀졌다. 이러한 연구 결과는 줄기세포 생물학 및 재생 의학에 IL-12/IL-12R 시스템의 중요성을 밝히고 이 경로가 HSC 이식을 받는 환자 또는 원자력 재해에서 치명적인 방사선 노출의 영향을 겪은 환자의 관해 및 생존을 높이기 위한 치료 목표임을 나타낸다. 따라서 이러한 환경에서 보조 rHuIL-12 요법의 안전성과 효능을 평가하기 위한 임상 연구가 필요하다.

표 1. 마우스 골수에서 분리된 Lin-세포에서 IL-12Rβ2의 발현에 대한 rMu11-12의 효과

주: 유동 세포계수 분석은 각각 실험 1 및 2에서 rMuIL-12로 처리한 후 21시간 또는 25시간 후에 수집한 골수 Lin 세포로 수행하였다.

* 데이터는 실험 당 처리 그룹 당 6마리의 마우스의 평균을 나타낸다.

표 2. IL-12Rβ2 및 다른 조혈 줄기세포 마커를 공동 발현하는 인간 골수 CD34+ 세포의 백분율

주: 데이터는 세 가지 다른 건강한 생물학적 기증자의 세포를 기반으로한 요약 통계를 나타낸다.

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사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로서 사용되는 것으로서, 이러한 용어 및 표현의 사용은 설명되거나 보여준 특징 또는 그 일부의 어떤 등가물을 배제하는 의도는 없으며, 청구된 본 발명의 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다는 것이 인정된다. 따라서, 본 발명이 바람직한 구현예들 및 선택적 특징들에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 개념들의 변경 및 변화가 당업자에 의해 의지될 수 있고, 그러한 변경들 및 변화들이 첨부된 청구 범위에 의해 정의된 본 발명의 범위 내에서 고려된다.

본 발명은 본원에서 광범위하고 일반적으로 기술되었다. 일반적인 개시 내용에 속하는 좁은 종 및 하위 그룹도 각각 본 발명의 일부를 형성한다. 삭제된 자료가 본원에서 구체적으로 인용되는지를 불문하고, 여기에는 속으로부터 임의의 대상을 제거하는 단서 또는 부정적 제한을 갖는 본 발명의 일반적인 설명을 포함한다.

다른 구현예들은 다음의 청구 범위 내에 있다. 또한, 본 발명의 특징 또는 양태가 마쿠시 군으로 설명되는 경우, 당업자는 또한 본 발명이 마쿠시 군의 개별 구성 또는 하위 군 구성의 관해서 기술됨을 인식할 것이다

참조문헌

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Claims (28)

1. 조혈 회복 및 감염 합병증 경감용 약학적 조성물로서,
   (a) 상기 약학적 조성물은 IL-12를 포함하고,
   (b) 상기 약학적 조성물을 사용하는 조혈 회복 및 감염 합병증 경감을 위한 방법은 골수절제 요법 후, 골수절제 요법 전, 또는 골수절제 요법 전후에 상기 약학적 조성물의 하나 또는 그 이상의 유효 용량(들)을 투여하는 단계를 포함하는 것인, 조혈 회복 및 감염 합병증 경감용 약학적 조성물.
   
2. 조혈 회복용 약학적 조성물로서,
   (a) 상기 약학적 조성물은 IL-12를 포함하고,
   (b) 상기 약학적 조성물을 사용하는 조혈 회복을 위한 방법은 골수절제 요법 전, 후 또는 전후에 상기 약학적 조성물의 하나 또는 그 이상의 유효 용량(들)을 투여하는 단계를 포함하고,
   조혈은 골수 내 조혈세포 상의 IL-12 수용체의 활성화를 통해 회복되는 것인, 조혈 회복용 약학적 조성물.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 골수절제 요법에 방사선 요법이 사용되는 것인, 약학적 조성물.
   
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 골수절제 요법에 화학요법이 사용되는 것인, 약학적 조성물.
   
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 골수절제 요법은 방사선 요법과 화학요법의 조합인, 약학적 조성물.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈은 골수 내 전구세포 수의 증가를 통해 회복되는 것인, 약학적 조성물.
   
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈은 말초 혈액에서 회복되는 것인, 약학적 조성물.
   
8. 제7항에 있어서, 말초 혈구 수치가 증가되는 것인, 약학적 조성물.
   
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 혈소판이 증가되는 것인, 약학적 조성물.
   
10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 백혈구가 증가되는 것인, 약학적 조성물.
    
11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 망상적혈구가 증가되는 것인, 약학적 조성물.
    
12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 적혈구가 증가되는 것인, 약학적 조성물.
    
13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈세포는 니치(niche) 세포 및 줄기세포를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
    
14. 제13항에 있어서, 니치 세포는 골아세포를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
    
15. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈은 거핵구 상의 IL-12 수용체의 활성화에 따라 회복되는 것인, 약학적 조성물.
    
16. 제15항에 있어서, 거핵구는 미성숙한 것인, 약학적 조성물.
    
17. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈은 골수 내 조골 세포, 거핵구 세포 및 조혈모세포 상의 IL-12 수용체의 활성화에 따라 회복되는 것인, 약학적 조성물.
    
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 골수절제 요법 후 자가이식이 수반되는 것인, 약학적 조성물.
    
    
19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 골수절제 요법 후 동종이식이 수반되는 것인, 약학적 조성물.
    
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈모세포의 동원 및 수집은 골수절제 요법 전에 수행되는 것인, 약학적 조성물.
    
21. 제20항에 있어서, 조혈모세포의 동원 및 수집은 낮은 수치의 CD34+ 세포를 산출하는 것인, 약학적 조성물.
    
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 골수절제 요법은 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 저등급 비-호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 중등급 림프종, 다발성 골수증, 골수이형성증후군 및 호지킨병으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 조혈성 악성종양을 치료하기 위해 제공되는 것인, 약학적 조성물.
    
23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 요법은 비-골수절제성인 것인, 약학적 조성물.
    
24. 제23항에 있어서, 비-골수절제 요법은 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 맨틀 세포 림프종, 저등도 비호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병, 중등급 림프종, 다발성 골수증 및 호지킨병으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 조혈성 악성종양을 치료하기 위해 제공되는 것인, 약학적 조성물.
    
25. 제23항에 있어서, 비-골수절제 요법은 고형 악성종양을 치료하기 위해 제공되는 것인, 약학적 조성물.
    
26. 제23항에 있어서, 비-골수절제 요법은 미니-이식을 포함하는 것인, 약학적 조성물.
    
27. 제23항에 있어서, 비-골수절제 요법은 감소된 강도 컨디셔닝(reduced intensity conditioning: RIC)를 포함하는 것인, 약학적 조성물.
    
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, IL-12는 재조합 인간 IL-12인, 약학적 조성물.
    

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