KR20170096842A - 불가사리로부터 피부 재생 인자 및 세포 성장 인자의 추출 방법 및 이의 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 불가사리의 관족을 절단하는 등의 방법으로 불가사리의 관족을 손상시킴으로써, 불가사리 관족으로부터 다량의 생리 활성 인자를 효율적으로 추출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 불가사리에서 다량 추출된 불가사리 관족 유래의 생리 활성 성분은 인체 피부를 재생하고, 콜라겐 합성을 촉진하며, 피부 세포의 성장 인자 및/또는 인체 면역 인자의 합성을 촉진한다. 따라서 본 발명에 따라 불가사리로부터 추출된 생리 활성 성분은, 기능성 화장품, 예를 들어 피부 재생 촉진, 콜라겐 합성 촉진 및/또는 피부 주름 개선용의 화장품의 유효 성분으로 응용, 활용될 수 있다.

Description

불가사리로부터 피부 재생 인자 및 세포 성장 인자의 추출 방법 및 이의 응용{PROCESS OF EXTRACTING SKIN RENEWAL FACTORS AND CELL GROWTH FACTORS AND APPLICATION THEREOF}

본 발명은 생체에서 활성 성분을 추출하는 방법에 관한 것으로, 불가사리로부터 생리 활성 인자를 추출하는 방법 및 추출된 생리 활성 인자의 산업적 응용에 관한 것이다.

불가사리(starfish)는 극피동물문(Echinodermata), 불가사리강(Asteroidea)의 총칭으로 가시의 형태와 골격에 따라 현대목(Phanerozonia), 유극목(Spinulosa), 차극목(Forcipulata)의 3목으로 분류된다. 5개에서 20개 이상의 팔의 끝에는 안점이 있으며, 이동시에는 관족을 활용한다. 불가사리의 등 쪽(윗부분)은 석회질로 단단하며, 항문과 호흡기관인 피새(불가사리류의 배면 또는 배복 양면에 나타나는 얇은 막으로 이루어진 다수의 미소한 주머니 모양의 돌기로, 일종의 피부호흡기관)가 위치한다.

몸통 가운데에 입이 존재하며, 섭생은 주로 조개류를 먹으며 섭취 방식은 팔을 이용하여 조개류를 비틀어 연 뒤 입을 벌려 조개 틈새로 위액을 흘려 넣어 외부에서 소화시킨 다음 흡수한다. 즉, 몸 아래쪽 가운데에 있는 입에서 위를 꺼내 먹이를 뒤집고, 위액을 내보내어 외부에서 소화시킨 뒤 흡수한다.

불가사리의 일부 종은 유성생식과 무성생식이 모두 가능한 자웅동체도 있고 일부는 자웅이체이기도 하다. 수정은 외부에서 일어나기 때문에 방대한 수의 정자와 난자를 바다에 방출한다. 불가사리의 산란기는 보통 5~7월이며 한마리가 하루 200만개의 알을 뿌릴 정도의 놀라운 번식력을 가진다. 수정된 배아는 작고 투명하며 약 2개월 동안 조류를 따라 부유한다. 이들은 동물성 플랑크톤을 구성하며, 식물성 플랑크톤을 섭취하면서 성장한다. 성장한 불가사리는 동물성 플랑크톤 상태에서 벗어나면 방사성 대칭 구조를 가지게 된다.

기본적으로 불가사리는 유성 생식을 하지만, 몸의 일부를 잘라내면 잘린 부분이 재생하여 다른 개체의 불가사리로 성장하는 분열 생식하며, 원래의 불가사리도 다시 완전히 새로운 팔이 생성되어 성장한다. 이처럼 몸을 여러 조각으로 잘라도 죽지 않고 살아난다고 하여 불가사리란 이름이 붙었다. 오염에 매우 강하며, 지구상의 거의 모든 바다에 생존하고 있는 것으로 알려져 있다.

불가사리는 봄에는 수심이 낮은 곳에 많이 서식하며 여름에는 수심이 깊은 곳에서 서식한다고 한다. 즉 수온이 낮을 때는 수심이 낮은 곳에서도 서식하지만, 수온이 높으면 수심이 깊은 곳으로 이동해 서식을 하게 된다. 불가사리는 이와 같이 수심과 수온에 영향을 많이 받으며, 또한 감촉, 광도, 온도, 방향, 물의 조건에 민감하다.

불가사리 종류는 약 1,500종이 있으며, 우리나라에는 약 50여 종이 서식하고 있다. 우리나라에 주로 서식하는 불가사리는 거미 불가사리(Ophioplocus japonicus), 별 불가사리(Asterina pectinifera), 빨강불가사리(Certonardoa semiregularis), 아무르불가사리(Asterias amurensis)이다. 이 중에서 과다증식으로 문제를 일으키는 종은 아무르불가사리와 별 불가사리로 유해해양생물로 지정되어 있다.

불가사리는 주로 조개, 바지락, 전복, 피조개, 홍합, 진주담치 등 작은 고기나 조개류를 주로 먹는다. 불가사리 한마리가 하루의 평균 멍게 4마리, 전복 2마리, 홍합 10마리 정도를 먹는다고 한다. 이러한 불가사리의 대단한 식성 때문에 이들은 우리나라 바다 양식장을 황폐하게 만드는 주범으로 인식되고 있다. 현재 불가사리의 천적으로 알려진 것은 나팔고둥이 유일하므로, 바다 환경을 황폐화시키면서 대량 번식되는 불가사리를 채집하여 산업적으로 응용할 필요성이 있다.

현재, 불가사리류는 우리나라 전 연안에 분포, 식하며 바다에서 사는 생물의 천적으로서 해안자원의 활용인 양식업 등에 막대한 피해를 주는 쓸모없는 생물로 인식되어 왔다. 현재 우리나라에서는 불가사리의 포식 습성인, 종의 분포 등 기초적인 생태 연구가 주로 진행되었을 뿐이고, 불가사리를 산업적으로 활용하기 위한 방안에 대한 연구, 개발은 부족한 실정이다.

불가사리는 식용으로서는 중국 이외의 지역에서는 거의 사용되고 있지 않은데, 우리나라에서는 불가사리의 체벽에 존재하는 회분 성분인 탄산칼슘을 이용하여 퇴비나 비료로 이용하고 있다. 이외에 불가사리에서 신경성 펩타이드를 분리하여(비특허문헌 1), 산업적으로 응용하고자 하는 시도가 있었다. 하지만, 불가사리로부터 생리적 활성 성분을 추출하기 위한 방법이나 공정의 비효율성의 문제나 원료의 안정적 공급 확보 등의 미비로 인하여 불가사리로부터 산업적으로 활용될 수 있는 생리 활성 인자를 확보하는데 어려운 문제점이 있었다.

조미정 외, 한국수산과학회지 47(2): 129-134 (2014)

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 불가사리로부터 생리적 활성 인자를 과량 추출할 수 있는 방법을 제공하고자 하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 불가사리로부터 추출된 생리 활성 인자를 활용한 산업적 응용을 제공하고자 하는 것이다.

전술한 목적을 가지는 본 발명은 손상된 불가사리의 관족을 준비하는 단계; 상기 손상된 불가사리의 관족을 분쇄하는 단계; 상기 분쇄된 불가사리의 관족 분말을 단백질 가수분해 저해제로 처리하는 단계; 및 상기 단백질 가수분해 저해제로 처리된 불가사리의 관족 분말을 원심분리하여 상층액을 추출하는 단계를 포함하는 불가사리의 관족으로부터 생리 활성 인자를 추출하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 불가사리의 관족으로부터 추출된 상기 생리 활성 인자는 콜라겐 합성, 인체 피부 세포의 재생(regeneration), 인체 세포의 성장 인자의 발현(expression) 중에서 적어도 하나의 생리 활성을 증진시킬 수 있다.

예를 들어, 상기 인체 세포의 성장 인자는 MAPK 1(mitogen-activated protein kinase 1) 및 IGF-1(insulin growth factor 1), IL-1β(interleukin 1β), TNF-α(tumor necrosis factor α), TGF-β(transformation growth factor β) 및 CXCL12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12) 중에서 적어도 하나의 성장 인자를 포함할 수 있다.

상기 불가사리는 아무르불가사리(Asterias amurensis)일 수 있다.

예를 들어, 상기 불가사리의 관족으로부터 얻어진 상기 생리 활성 인자를 포함하는 추출물은 피부 노화 방지, 피부 주름 개선 및 피부 재생 촉진 중에서 적어도 하나의 기능을 갖는다.

본 발명은 또한 전술한 공정에 의하여 얻어지는 손상된 불가사리 관족 유래의 추출물, 예를 들어 단백질 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 치료제와 같은 약품, 또는 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생 촉진 및 콜라겐 합성 촉진 중에서 적어도 하나의 기능을 가지는 기능성 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 불가사리의 관족에 외부적인 자극을 가하여 불가사리의 관족을 손상시킴으로써, 이에 대하여 불가사리의 면역 반응 등에 기인하여 생리적 활성 인자를 효율적으로 다량 추출할 수 있는 방법을 제안한다.

본 발명에 따라 불가사리로부터 다량 추출된 생리 활성 인자는 천연물질에서 유래하여 인체에 대하여 아무런 독성이 없으므로 안전성을 담보할 수 있다. 특히, 불가사리로부터 추출된 생리 활성 인자는 콜라겐 합성 촉진, 피부 세포 성장 인자 및/또는 면역 활성 인자의 합성 촉진 및/또는 피부 재생 활성을 가지고 있다.

따라서 본 발명에 따라 불가사리로부터 추출된 생리 활성 인자는 기능성 화장품, 예를 들어 피부 주름 개선, 콜라겐 합성 촉진이나 피부 재생을 위한 기능성 화장품이나 약품 등의 유효 성분으로 활용될 수 있다.

결과적으로, 손상된 불가사리 관족 유래의 추출물은 다량의 생리 활성 인자를 포함하고 있으므로, 예를 들어, 피부 상처를 치료하는 일반 연고제와 같은 의약품에 첨가하거나, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생 촉진, 콜라겐 합성 촉진 등의 기능성 화장품에 사용하는 등의 방법으로 불가사리를 활용함으로 우리나라에 문제시되는 불가사리의 생태계 파괴 방지와 그를 위한 불가사리의 새로운 활용 방안을 제시할 수 있게 될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 불가사리로부터 생리 활성 성분을 추출하는 과정을 개략적으로 도시한 플로 차트이다.
도 2는 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 불가사리에서 추출된 생리 활성 성분의 세포 독성 시험을 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 불가사리에서 추출된 생리 활성 성분에 의한 콜라겐 합성 촉진 정도를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 4a 내지 도 4f는 각각 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 불가사리에서 추출된 생리 활성 성분에 의한 세포 성장 인자의 발현 유도 정도를 측정한 결과를 도시한 그래프이다. 음성컨트롤(NC)을 1로 하여, 각각의 불가사리 추출무로 처리한 세포에서의 성장 인자의 상대적인 발현 비율을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 불가사리에서 추출된 생리 활성 성분에 의한 세포 재생 정도를 측정한 결과를 도시한 사진이다.

이하, 필요한 경우에 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

[불가사리 관족으로부터 생리 활성 인자 추출]

도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 불가사리로부터 생리 활성 성분을 추출하는 과정을 개략적으로 도시한 플로 차트이다. 도 1에 도시한 바와 같이, 본 발명에 따라 불가사리로부터 생리 활성 성분을 추출하는 방법은, 불가사리를 준비하는 단계(S110 단계), 외부의 물리적 충격에 의하여 불가사리 관족을 손상하는 단계(S120 단계), 손상된 불가사리의 관족을 분쇄하는 단계(S130 단계), 분쇄된 불가사리 관족 분말을 단백질 가수분해 저해제로 처리하는 단계(S140 단계), 단백질 가수분해 저해제로 처리된 불가사리 가수 분말을 원심분리하여 상층액을 추출하는 단계(S150 단계)를 포함한다.

먼저, 불가사리를 준비한다(S110 단계). 본 발명에 따라 사용될 수 있는 불가사리는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 거미 불가사리(Ophioplocus japonicus), 별 불가사리(Asterina pectinifera), 빨강불가사리(Certonardoa semiregularis), 아무르불가사리(Asterias amurensis) 등을 사용할 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 특히 과다 증식으로 바다의 생태계를 훼손하는 주범인 아무르불가사리 또는 별 불가사리를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 아무르불가사리이다.

이어서, 불가사리의 관족을 손상시킨다(S120 단계). 하나의 예시적인 방법으로서 가위와 같은 절단 수단을 사용하여 불가사리 관족을 절단하여, 불가사리 관족을 손상시킨다. 불가사리는 수분 약 67%, 회분 약 18%, 조단백질 약 10%, 조지방 약 1.6% 탄수화물 4%, 고형물은 33.1%, 유기물 함량은 약 21.8%이다. 무기성분은 칼슘이 83.19% 마그네슘이 7.47%, 나트륨이 4.39%, 칼륨이 2.79%, 인이 1.97%로 이루어져 있고, 그 이외 철, 아연, 구리, 망가니즈 등도 소량 포함하고 있다. 특히, 본 발명에서는 의도적으로 불가사리 관족을 손상시킴으로써, 후술하는 것과 같이 생리 활성 성분이 다량 함유된 불가사리 추출물을 얻고자 하였다.

이어서, 손상된 불가사리 관족을 미세한 분말로 분쇄한다(S130 단계). 예를 들어, 저온(예를 들어 -150 ~ -130℃)의 액제질소를 이용하여 급속하게 동결건조된 손상된 불가사리 관족을 막자사발을 이용하여 미세한 분말 형태로 분쇄할 수 있다. 이렇게 얻어진 불가사리 관족 분말에 단백질 가수분해 저해제로 처리하여, 불가사리 관족 분말에서의 단백질의 분해를 방지한다(S140 단계). 이러한 공정에 의하여 본 발명의 실시형태에 따라, 손상된 불가사리 관족으로부터 단백질 조-추출물을 얻을 수 있다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 이 과정에서 적절한 버퍼 용액, 예를 들어 Tris 버퍼 용액에 단백질 가수분해 저해제로서 페닐 메탄 설포닐 플루오라이드(phenyl methane sulfonyl fluoride)를 사용할 수 있다. 페닐 메탄 설포닐 플루오라이드 외에도 다른 단백질 가수분해 저해제가 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 단백질 가수분해 저해제로 사용될 수 있는 물질은 예를 들어, bestatin이라는 상품명으로도 잘 알려져 있는 Ubenimex((2S)-2-[[(2S,3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoic acid, E-64로 알려져 있는 (1S,2S)-2-(((S)-1-((4-Guanidinobutyl)amino)-4-methyl-1-oxopentan-2-yl)carbamoyl)cyclopropanecarboxylic acid, Leupeptin으로 알려져 있는 N-Acetyl-leucyl-N-{(5-[(diaminomethylidene)amino]-1-oxopentan-2-yl}-leucinamide 등의 단백질 가수분해효소 저해제가 사용될 수 있음은 물론이다. 필요한 경우, 남겨진 잔여물에 Tris 버퍼 용액을 넣고, 초음파 처리(sonfication)를 진행하여, 손상된 불가사리 관족 분말로부터 조-단백질 추출물과 같은 생리 활성 인자를 포함하는 추출물을 더욱 추출할 수 있다.

계속해서, 단백질 가수분해 저해제로 처리된 불가사리 관족 분말을 원심분리하여, 상층액을 추출하여(S150 단계), 손상된 불가사리 관족으로부터의 조-추출물인 생리 활성 인자가 다량 함유된 추출물을 얻을 수 있다

본 발명의 예시적인 실시예에 따르면, 본 발명에 따라 손상된 불가사리 관족에서 유래한 추출물은 천연 성분이기 때문에, 인간 피부 세포에 투여하더라도 아무런 독성이나 부작용이 없다(도 2 참조).

또한, 본 발명에 따라 손상된 불가사리 관족 추출물은 다량의 생리 활성 성분이 포함되어 있다. 예시적인 실시형태에 따르면, 손상된 불가사리 관족 추출물은 손상되지 않은 정상 불가사리 관족 추출물이나 정상 불가사리 몸통 추출물과 비교해서, 생리 활성 성분이 훨씬 많이 포함되어 있다.

예를 들어, 본 발명의 예시적인 실시형태에 따르면, 동일한 양의 불가사리 유래의 추출물을 인간 피부 세포주에 적용하였을 경우에, 본 발명에 따라 손상된 불가사리 유래의 추출물은 피부 세포에서의 콜라겐 합성 촉진 능력이 매우 우수하다(도 3 참조). 뿐만 아니라, 피부 세포를 비롯한 다양한 인간 세포의 성장이나 분화에 관여하는 다양한 성장 인자 및/또는 면역 활성 인자의 발현을 촉진하고(도 4a 내지 도 4f 참조), 피부 재생이나 피부의 성장을 유도한다(도 5 참조).

[불가사리 관족 추출 생리 활성 인자의 산업적 응용]

전술한 공정에 따라 손상된 불가사리 관족 유래의 추출물은 특히 인간 피부에 대한 다양한 생리 활성을 촉진한다. 독성이 없기 때문에, 피부 치료를 위한 약품이나 외용제, 기능성 화장품 및/또는 기능성 식품의 유효 성분(활성 성분)으로 적용될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따라 손상된 불가사리 관족 유래의 추출물은 다량의 생리 활성 인자를 포함하고 있다. 이에 따라 손상된 불가사리 관족 유래의 추출물은 콜라겐 합성을 유도하고, 피부 세포를 비롯한 다양한 인체 세포의 성장 인자의 발현을 촉진시키며, 피부 재생 능력이 탁월하다. 따라서 본 발명에 따라 손상된 불가사리 관족 유래의 추출물은 예를 들어 피부 주름 개선, 노화 방지, 피부 재생 및/또는 콜라겐 합성 등의 생리적 활성을 유도하는 기능성 화장품의 유효성분으로 활용될 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따라 손상된 불가사리 관족 유래의 추출물에 의하여 합성이 증가하는 콜라겐에 대해서 설명한다. 콜라겐(collagen)은 인체를 비롯한 동물의 연결 조직을 구성하는 주요한 단백질로서, 특히 피부 조직에서 진피 성분의 약 90% 가량을 차지하는 섬유상 단백질이다. 콜라겐은 결합 조직의 주된 구조 블록으로서, 피부를 비롯한 결합 조직에 높은 장력 강도를 제공할 뿐만 아니라, 변형을 극복할 수 있는 능력을 제공한다. 예를 들어 콜라겐은 피부의 견고성을 유지하고, 피부 조직의 결합력에 관여하기도 하며, 세포 접착(cell adhesion) 지탱 등에 관여한다.

자연적인 피부 노화 및 자외선 조사에 의한 광노화로 인하여 피부의 두께가 얇아지고, 이로 인하여 피부의 주름이 형성되는 것으로 알려져 있다. 아울러, 콜라겐은 골 이식이나 조직 재생성을 위한 스캐폴드, 인공 피부 대체 물질과 같은 조직 재구성을 위한 소재나 상처 치유를 위한 물질과 같은 의학적 용도로 활용되고 있다. 특히 생체내에 존재하는 대부분의 콜라겐 형태인 타입 Ⅰ 콜라겐은 피부 조직에서 엘라스틴(elastin)과 함께 피부 장력과 피부의 탄력을 제공하는 물질로서, 자외선으로부터 피부를 보호하고 주름을 예방한다.

피부 세포인 섬유아세포(fibroblast)의 구성 단백질인 콜라겐에서는 프롤린(Pro)과 하이드록시프롤린(Hyp)이 반복 구조(Gly-Pro-X 또는 Gly-X-HyP; Gly은 글리신이고 X는 그 이외의 아미노산)를 이루고 있다. 이처럼 콜라겐은 프롤린과 하이드록시프롤린이 반복되는 구조를 가지는데, 섬유아세포는 이들 아미노산을 생합성하지 않고 세포 주변의 세포외기질(Extracellular Matrix, ECM)에서 제공받는 독특한 생리학적 특성을 보인다. 섬유아세포에서 프롤린과 하이드록시프롤린의 공급과 관련해서, 프롤리다아제(Prolidase)가 중요한 역할을 수행하는데, Xaa-Pro 디펩티다아제라고도 불리는 프롤리다아제는 펩타이드의 C-말단에 위치하는 프롤린 또는 하이드록시프롤린을 갖는 디펩타이드를 가수분해하는 세포질 내 효소이다. 콜라겐에는 프롤린 또는 하이드록시프롤린과 같은 이미노산(imino acid)의 함량이 높기 때문에, 프롤리다아제는 콜라겐의 대사에서 중요한 역할을 수행한다. 즉, 콜라겐의 분해 과정 중 최종 단계에 관여하는 프롤리다아제에 의해서 콜라겐의 주요 아미노산 또는 이미노산인 프롤린 또는 하이드록시프롤린으로 분해되고, 이에 따라 생성된 프롤린 또는 하이드록시프롤린은 70-90% 가량이 리사이클링되어 콜라겐의 합성에 사용된다. 따라서 프롤린의 리사이클링을 촉진하는 효소인 프롤리다아제의 활성을 촉진시키면, 콜라겐의 생합성이 증가되어 주름 개선의 효과를 거둘 수 있다.

어린 피부 세포에서 ECM의 분해, 프롤리다아제의 활성 등 모든 생리적 현상이 정상적으로 작동하지만, 피부 세포가 자연적 원인이든 또는 자외선에 의해서 노화되면 피부 세포가 합성해내는 콜라겐과 같은 ECM 분자의 양이 줄어들 뿐만 아니라, 프롤리다아제의 활성도 같이 저하되어 콜라겐의 재생률이 급격하게 저하되고, 이에 따라 피부의 탄력이 감소하여 주름이 생긴다.

따라서 본 발명에 따라 다량의 생리 활성 인자를 함유하는, 손상된 불가사리 관족 유래의 단백질 추출물은 기능성 화장품, 예를 들어 피부 재생 촉진, 콜라겐 합성 촉진 및/또는 피부 주름 개선용의 화장품의 유효 성분으로 응용, 활용될 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 본 발명에 따라 다량의 생리 활성 성분을 함유하는, 손상된 불가사리 관족 유래의 추출물은 이들 기능성 화장품 조성물 중에 대략 0.1 내지 1000 ㎍/㎖의 농도, 바람직하게는 1 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다.

상기 기능성 화장품 조성물은 화장 및/또는 피부과학적으로 허용가능한 매질, 즉 피부, 점막, 두발 및 두피에 적합한 매질을 함유한다. 이는 국소적용으로 적합한 모든 투여 형태로, 특히 수성, 수성/알코올성 또는 유성 용액, 또는 수성, 수성/알코올성 또는 유성 겔, 또는 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀션(O/W) 또는 그 반대(W/O), 서스펜션, 마이크로에멀션, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및/또는 비-이온형의 소낭 분산제의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 화장품 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로 사용될 수 있다.본 발명에 따른 조성물의 여러 성분의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이다.

본 발명에 따른 화장품 조성물을 제조하기 위한 용매로서 에탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세레스-26, 메틸글루세스-20, 이소세틸미리스테이트, 이소세틸옥타노에이트, 옥틸도데실미리스테이트, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴이소스테아레이트, 세틸옥타노에이트 및 네오펜틸글리콜디카프레이트 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 이러한 용매를 사용하여 본 발명의 화장품 조성물을 제조하는 경우 화합물의 종류에 따라, 용매의 혼합비에 따라 용매에 대한 화합물의 용해도가 조금씩 상이하나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자라면 제품의 특성에 따라 용매의 종류 및 사용량을 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물은 화장품에 배합 가능한 ⅰ) 비타민B1, 비타민B2, 비타민B6, 피리독신, 니코틴산, 엽산, 비타민C 및 이들의 염이나 유도체와 같은 수용성 비타민; ⅱ) 비타민A, 카로틴, 비타민D2, 비타민D3, 비타민E(토코페롤), 이들의 유도체(지방산 아스코르빈이나 아세트산알파토코페롤)와 같은 지용성 비타민; ⅲ) 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 케라틴 등의 고분자 펩타이드; ⅳ) 히드록시에틸셀룰로오스, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴황산 또는 그 염과 같은 고분자 다당; ⅴ) 세라미드, 피토스핑고신 등의 스핑고 지질; 및/또는 ⅵ) 갈조/홍조/농조 엑기스 또는 이들로부터 정제된 칼라기탄, 아르긴산, 아르긴산나트륨/칼륨 등의 해초 엑기스로 구성되는 군에서 선택되는 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에는 상기 성분과 더불어 필요에 따라 통상적으로 화장품에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있다. 첨가될 수 있는 배합 성분으로는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 유기 및 무기 안료, 유기분체, 자외선흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, 항산화제, 식물추출물, pH 조정제, 알코올, 발포제, 충전제, 자외선 흡수제, 안료, 착색제, 겔화제 또는 농축제, 향료, 혈행촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로는 ⅰ) 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 지방산알코올과 같은 에스테르계 유지; ⅱ) 스쿠알렌, 유동파라핀, 이소파라핀, 알파-올레핀올리고머, 바세린 등의 탄화수소계 유지; ⅲ) 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 디메틸실록산-메틸세틸옥시실록산 공중합체, 알킬변성 실리콘유 등과 같은 실리콘계 유지; ⅳ) 퍼플루오로폴리에테르와 같은 불소계 유지; 및/또는 ⅴ) 아보카도유, 올리브유, 유채유, 피마자유, 해바라기유, 야자유, 호호바유, 난황유, 우지(牛脂), 캔데리러왁스, 액상 라놀린 등과 같은 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 ⅰ) 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복시산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리글리세린, 락트산과 같은 수용성 저분자 보습제; ⅱ) 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르와 같은 지용성 저분자 보습제; ⅲ) 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트란과 같은 수용성 고분자; 및/또는 ⅳ) 폴리비닐피롤리돈-에이코센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트란지방산 에스테르, 고분자 실리콘과 같은 지용성 고분자를 들 수 있다.

에몰리엔트제(연화제)로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면활성제로는 ⅰ) 자기유화형 모노스테아르산 글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 솔비탄지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리세린지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르, 라우린산알카놀아마이드 등과 같은 비이온성 계면활성제; ⅱ) 지방산 비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, 폴리옥시에틸렌 알킬에테르황산염, 알킬인산염, N-아실아미노산염, 알킬술포숙신산염, 퍼플루오로알킬인산에스테르와 같은 음이온성 계면활성제; ⅲ) 염화알킬트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 스테아르산에틸아미노에틸아미드, 리놀린유도체 제4급 암모늄염과 같은 양이오선 계면활성제; 및/또는 ⅳ) 카르복시베타인계, 아미드베타인계, 술포베타인계, 아미노카르복시산염계, 이미다졸린계 유도체와 같은 양성 계면활성제를 들 수 있다. 이들 계면활성제는 유화제 또는 보습제로도 사용될 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 탤크, 세리사이트, 카올린, 클레이, 벤토나이트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체 등의 무기안료; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 셀룰로오스, 실크파우더, CI 피그먼트 옐로우 등의 유기안료 및 전술한 무기안료와 유기안료의 복합안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서 스테아르산칼슘 등의 금속비누; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산 금속염; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘등의아실아미노산다가금속염; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지 지방산 아실아르기닌 등의N-아실염기성아미노산; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의알파-아미노지방산; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산등을 들 수 있다.

항산화제의 예로는 비타민, 예컨대, 비타민C 및 그 유도체, 예를 들면, 아스코르빈산초산염, 인산염 및 팔미트산염; 비타민A 및 그 유도체; 엽산 및 그 유도체; 비타민E 및 그 유도체, 예컨대, 토코페릴아세테이트; 플라본또는플라보노이드; 아미노산, 예컨대, 히스티딘, 글리신, 티로신, 트립토판 및 이들 유도체; 이미다졸, 예컨대, 시스-또는 트란스-유로카닌산 및 이들 유도체; 펩티드, 예컨대, D,L-카르노신, D-카르노신, L-카르노신 및 이들유도체; 카로티노이드 및 카로틴, 예컨대, α-카로틴, β-카로틴; 리코핀; 요산 및 그 유도체; α-히드록시산, 예컨대, 시트르산, 젖산, 말산; α-히드록시지방산, 예컨대, 팔미트산, 피틴산, 락토페린; 스틸벤및그유도체; 만노스 및 그 유도체; 리포닌산 및 그 유도체, 예컨대, 디히드로리포닌산; 페룰라산및 그 유도체; 티올, 예컨대, 글루타치온, 시스테인 및 시스틴이 있다. 비타민A 또는 비타민A-팔미테이트(레티놀) 및 비타민E를 첨가하는 것이 특히 바람직하다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다. 알코올로서는 세틸알코올 등의 고급알코올을 들 수 있다.

발포제로는, 예로 디소듐 N-카르복시에톡시에틸-N-(코코일아미도에틸)아미노아세테이트, 소듐 라우릴 에테르 술페이트, 소듐 라우로일 사르코시네이트(sarcosinate), 트리에탄올아민 라우릴 술페이트 및 소듐코코일 이세티오네이트(isethionate) 및 코코넛 지방산의 혼합물을 언급할 수 있다.

충전제로는, 특히 다우 코닝(Dow Corning)사에서 폴리트랩(Polytrap)의 이름으로 시판중인 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트/라우릴 메타크릴레이트 공중합체와 같은 아크릴 공중합체를 언급할 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디이소프로필-디이소프로필계피산 에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산및그염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 등을 들 수 있다.

안료 및 안료 유사 효과가 있는 분말로는 철산화물, 알루미늄실리케이트, 예컨대, 황토(ochre), 티탄산화물, 운모, 카올린, 망간 함유 점토, 칼슘카보네이트, 프렌치초크, 운모-티탄산화물, 운모-티탄산화물-철산화물, 비스무스옥시클로라이드, 나일론비드, 세라믹비드, 분말성 천연 유기 화합물, 예컨대, 분쇄된고형조류(algae), 분쇄된 식물 부분 등을 들 수 있다.

통상의 착색제로는 처리되거나 미처리된 염료를 사용할 수 있다. 겔화제 또는 농축제로서 천연 고무(크산탄 고무), 폴리사카라이드(히드록시프로필메틸셀룰로오스 또는 카르복시메틸셀룰로오스), 카르복시비닐 중합체(카르보머), 아크릴 공중합체를 언급할 수 있다.

특히 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 - 5 %, 보다 바람직하게는 0.01 - 3 %의 비율로 배합될 수 있다.

본 발명의 화장품은 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다. 본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 화합물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 화장품 조성물은 피부 노화 방지 효과를 갖는 화장품, 세안제 및 샴푸 등에 다양하게 적용될 수 있다. 본 발명의 화장품 조성물은 화장품 업계에서 통상적으로 제조되는 임의의 제형으로 조제될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료 등을 들 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 각종 크림, 로션, 스킨 등과 같은 화장품류와 샴푸, 린스, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다. 구체적으로, 본 발명의 화장품 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 바디로션 및 바디클렌저와 같은 다양한 제형으로 조제될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 수산화물, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상희석제, 에톡시화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 솔비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 예시적인 실시예를 참조하면서 본 발명을 설명한다.

실시예 1: 손상된 불가사리 관족에서 생리 활성 인자 추출

샘플로 사용된 아무르불가사리는 강원도 양양의 양식장에서 채취하였으며, 한국해양생물연구소의 18℃ 저온 수조로 이송하고, 서로 싸우는 것을 방지하기 위하여 양파 망에 1마리씩 넣어 하룻밤 사육하였다. 이송된 다음 날 불가사리의 상태를 확인한 뒤, 건강한 불가사리만 선별한 뒤에 가위로 불가사리의 관족을 몸통에서 1 ㎝ 위쪽 부분을 절단하고, 다시 양파 망에 넣어 2일 동안 사육하였다. 관족을 절단하고 2일이 경과한 뒤, 불가사리를 수조에서 꺼내어, 불가사리를 정상 몸통(normal body), 정상 관족(normal leg, 절단하지 않은 관족) 및 손상 관족(damaged leg, 절단한 관족)으로 구분하여 각각 -80℃의 냉동실에 보관하였다.

다음 날 보관된 샘플 중에서 손상 관족 샘플(17 g)을 -140℃ 액체 질소를 이용하여 급속하게 동결한 뒤, 막자사발을 이용하여 미세하게 분쇄하였다. 이어서, 트리스 버퍼 용액(10 mM Tris)과, 단백질 가수분해 저해제(PMSF, phenyl methyl sulfonyl fluoride) 1 mM를 이용하여 손상 불가사리 관족을 곱게 분쇄한 막자사발 안에 불가사리 관족 샘플 분말의 3~10배를 넣고, 4℃에서 1시간 동안 교반하여 불가사리 관족 유래의 단백질 성분을 추출하였다. 4℃에서 원심분리기를 이용하여 13,000 rpm으로 15분 원심분리하여 상층액을 분리하고, 0.45 ㎛ syringe filter로 여과하여 얻은 조-추출물(crude extract)을 -80℃에 보관한 후, 이를 후술하는 실시예에서 사용하였다. 손상된 불가사리 관족에서 추출한 생리 활성 인자인 총 단백질의 양은 5897 ㎍/㎖이었다.

비교예 1 : 정상 불가사리 몸통에서 생리 활성 인자 추출

실시예 1에서 손상된 불가사리 관족을 대신하여 손상되지 않은 정상 불가사리 몸통(17 g)을 추출 샘플로 사용한 것을 제외하고 실시예 1의 절차를 반복하였다. 정상 불가사리 몸통에서 추출한 총 단백질의 양은 7817 ㎍/㎖이었다.

비교예 2: 정상 불가사리 관족에서 생리 활성 인자 추출

실시예 1에서 손상된 불가사리 관족을 대신하여 손상되지 않은 정상 불가사리 관족(17 g)을 추출 샘플로 사용한 것을 제외하고 실시예 1의 절차를 반복하였다. 정상 불가사리 관족에서 추출한 총 단백질의 양은 5550 ㎍/㎖이었다.

실시예 2 : 불가사리 추출 생리 활성 인자의 세포 독성 측정

실시예 1과 비교예 1-2에서 각각 얻어진 불가사리 유래의 단백질 조-추출물의 세포 독성 여부를 측정하였다. 세포 독성 유무를 알아보기 위하여 CCK-8 kit를 이용하였다. 원래 살아 있는 세포에서는 포마잔(formazan)이 분비되는데, CCK-8 kit는 이를 염색할 수 있는 물질인 WST-8 (2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium)를 세포 배양 상층액에 넣어주면, 살아 있는 세포에서 포마잔이 진하게 염색되는 것을 이용하여 염색되는 색의 세기를 이용하여 살아 있는 세포를 측정한다.

세포 독성을 측정하기 위한 인간 세포주로서 인간 포피 섬유아세포인 Hs68 세포주(ATCC CRL-1635; aspartoacylase deficiency; possible Canavan disease)를 사용하였다. 구체적으로, 96-well 플레이트에 Hs68 세포(5 x 10³ cells/well)를 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 분위기에서 24시간 배양하였다. 실시예 1 및 비교예 1-2에서 각각 추출한 불가사리 추출물 1 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖을 세포에 처리하였다(n=5/group). 이어서, 불가사리 추출물을 처리한 세포 배양 플레이트를 16시간 동안 37℃, 5% CO₂ 분위기에서 다시 16시간 배양하고, CCK-8 용액 10 ㎕을 거품이 생기지 않도록 유의하면서 플레이트의 각 well에 처리하였다. CCK-8 용액을 처리한 플레이트를 1시간 동안 더 배양하고, 배양한 플레이트를 450 nm에서 흡광도를 측정하여 살아 있는 세포의 수를 측정하였다. 측정 결과는 도 2에 도시되어 있다. 불가사리 추출물로 처리한 세포에서 생존율이 음성컨트롤(NC)과 다르지 않아 불가사리 추출물은 세포 독성이 없는 것을 확인하였다.

실시예 3 : 불가사리 추출 생리 활성 인자의 콜라겐 합성양 측정

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 추출한 손상된 불가사리에서 추출한 생리 활성 인자에 의한 콜라겐 합성 정도를 측정하였다. 프로콜라겐(Pro-collagen)은 양단의 C-propeptides가 분리되어 콜라겐으로 변환되는데, 본 실시예에서는 콜라겐 합성 과정에서 제거되는 C-propeptide의 양을 효소면역분석법(EIA, enzyme immuno-assay)을 이용하여 측정하여, 간접적으로 합성되는 콜라겐의 양을 측정하였다. EIA 측정을 위하여, Procollagen Type-I C-Peptide (PIP) EIA Kit(TaKaRa, Cat.#MK101)를 이용하였다.

표준(standard)을 준비하기 위하여, 프로콜라겐 항체로 코팅된 96-well 플레이트에 Hs68 세포(1 x 10³ cells/well)를 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 분위기에서 24시간 동안 배양하였다. 실시예 1, 비교예 1-2에서 각각 얻어진 불가사리 추출물 100 ㎍/㎖을 세포에 처리하고(n=5/group), 37℃, 5% CO₂ 분위기에서 16시간 동안 더 배양한 뒤, 세포 배양 상층액을 procollagen type-I C-peptide를 확인할 때, 사용하였다.

EIA 분석과 관련한 C-propeptide의 양을 표준을 아래에 맞춰 만들었다.

고정 항체(1차 항체)로서 C-propeptide에 대한 항체인 프로콜라겐 항체로 코팅된 96-well 플레이트에 위에, 2차 항체(결합 항체)인 POD 항체 용액(solution 1) 100 ㎕과, 불가사리 추출물에 의한 세포 배양 상층액 20 ㎕을 넣고 37℃에서 2시간 배양하였다. 비교를 위하여 세포 배양 상층액을 대신하여 표준 혼합액 20 ㎕을 또한 혼합하였다. 각 well의 내용물을 제거한 뒤 PBS 400 ㎕로 4회 세척하고, 기질 용액(substrate solution, solution 2) 100 ㎕를 각각의 well에 처리한 뒤, 상온에서 15분 동안 배양하였다. 정지 용액(stop solution, solution 3) 100 ㎕를 각각의 well에 처리한 뒤, 450 nm에서 흡광도를 측정하여, 용액의 색의 세기를 비교하였다. 측정 결과는 도 3에 표시되어 있다. 도 3에 도시한 바와 같이, 손상된 불가사리 관족에서 추출된 생리 활성 인자로 처리한 인체 피부 세포에서 콜라겐 합성이 크게 증가한 것을 확인하였다. 따라서 손상된 불가사리 관족에서 얻어진 추출물에는 인간 피부 세포 내의 콜라겐을 합성하는 생리 활성 인자가 많이 포함되었으며, 이로 인하여 사람의 피부 노화를 억제할 가능성이 있다는 것을 확인하였다.

실시예 4 : 불가사리 추출 생리 활성 인자의 성장 인자 및 면역 활성 인자의 합성

본 실시예에서는 손상된 불가사리 관족 추출물이 인체 피부 세포의 성장 인자와 면역 활성 인자의 합성을 어느 정도 촉진시키는지 확인하였다. 세포 성장 인자 및 면역 활성 인자의 발현을 위해서, 이들 인자의 mRNA 발현 정도를 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)을 이용하여 측정하였다.

세포 성장 인자 및/또는 면역 활성 인자로서는 모든 세포의 성장 및 분화에 모두 관여하는 조절 인자인 MAPK 1(mitogen-activated protein kinase 1) 및 성장 호르몬에 의해 간에서 발현 및 분비가 촉진되는 인슐린 성장 인자인 IGF-1(insulin growth factor 1), 사이토카인 단백질의 하나로서, 염증 반응, 세포 증식 및 분화에 관여하는 IL-1β(Interleukin 1β), 세포 증식 및 분화 촉진에 중요한 역할을 수행하는 종양괴사인자인 TNF-α(tumor necrosis factor α), 섬유아세포 증식을 촉진하는 형질전환 성장인자인 TGF-β(transformation growth factor β), 케모카인의 일종으로서 염증반응 및 혈관생성(angiogenesis)에 관여하는 CXCL12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12)를 선정하였다.

먼저, 인체 피부 세포에서 다음과 같은 방법으로 RNA를 추출하였다. 인체 세포를 채집하기 전에 세포 상층액 추출한 후 PBS를 투입하였다. 스크래퍼(scraper)로 6-well에 있는 세포를 pipette로 수집하고, 1 ㎖ 튜브에 세포를 담고 원심분리기로 세포를 침전(RPM 회전수 1200/5분)한 뒤, 1 ㎖l 튜브에 남은 PBS를 제거하였다. TRIZOL 시약을 투입하여 세포벽을 파괴한 뒤, 클로로포름을 처리하여 게놈과 잔여물로 분리하였다. 1 ㎖ 튜브의 상층부를 옮기고 유전자를 청색으로 염색시키는 글라일코블루(glycoblue)와, 유전자를 침전시키는 이소프로필알코올을 순차적으로 투입하였다. 1 ㎖ 튜브를 흔들어서 이들 시약과 샘플을 섞고, 원심분리기를 사용하여 유전자를 침전시켰다. 나머지 알코올을 pipette로 제거하고, 에탄올 세척 후에 pipette로 다시 제거하여, 추출물이 투명하게 굳어지도록 하였다. 자연 건조 후에 침전된 RNA를 핵산 분해를 억제하는 DEPC(Diethylpyrocarbonate) 용액에 투입하여 용해시켰다. 각각의 RNA를 5 ㎕씩 옮기고 실시간 PCR을 위한 샘플로 사용하였다.

실시간 PCR을 수행하기 위하여 6-well 플레이트에 Hs68 세포(1 x 10⁵ cells/well)를 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 분위기에서 24시간 동안 배양하였다. 실시예 1, 비교예 1-2에서 얻은 불가사리 추출물 100 ㎍/㎖을 세포 배양물에 처리하고(n=3/group), 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 위에서 얻은 mRNA를 추출한 뒤에, cDNA를 합성하여 qPCR(quantitative real time PCR)을 이용하여 표적 성장 인자의 RNA 양을 측정하였다. 측정 결과는 도 4a 내지 도 4f에 각각 도시되어 있다. 손상된 불가사리 관족에서 얻은 추출물에 생리 활성 성분이 다량 포함되어, 인간 세포의 성장 및/또는 면역 세포의 증식 및 분화에 관여하는 인자들의 발현이 크게 증가한 것을 확인하였다.

실시예 5 : 불가사리 추출 생리 활성 인자의 세포 재생/세포 성장 측정

본 실시예에서는 상기 실시예 1의 손상된 불가사리 관족에서 추출한 생리 활성 인자에 의한 인체 피부 세포 재생 촉진 정도를 측정하였다.

6-well 플레이트에 인체 피부 세포 Hs68 세포(1 x 10⁵ cells/well)를 접종하고, 37℃, 5% CO₂ 분위기에서 24시간 배양하였다. 1 ㎖ pipet tip을 사용하여 well 중앙 부분을 상하좌우(십자가 모양)로 긁어내고, 바닥을 제외한 배양액을 제거한 뒤, PBS로 1회 세척하였다. 실시예 1, 비교예 1-2의 불가사리 유래의 생리 활성 인자를 각각 100 ㎍/㎖의 농도로 처리하였다(n=1/group). 37℃에서 16시간 동안 더 배양한 뒤에, tip으로 긁어 낸 부분에서 세포가 얼마나 채워졌는지를 현미경을 사용하여 관찰하였다. 측정 결과는 도 5에 도시되어 있다. 도 5에 도시한 바와 같이, 손상된 불가사리 관족에서 추출된 생리 활성 인자를 첨가한 인체 피부 세포에서 16시간 경과 후에 세포를 제거한 부분이 채워졌으며, 정상 불가사리 몸통이나 관족에서는 추출한 성분을 첨가한 인체 피부 세포의 재생은 훨씬 적은 것을 확인하였다.

상기에서는 본 발명의 예시적인 실시형태 및 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 전술한 실시형태 및 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되지 않는다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시형태 및 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 사실은 첨부하는 청구의 범위를 통하여 더욱 분명해질 것이다.

Claims (5)

1. 손상된 불가사리의 관족을 준비하는 단계;
   상기 손상된 불가사리의 관족을 분쇄하는 단계;
   상기 분쇄된 불가사리의 관족 분말을 단백질 가수분해 저해제로 처리하는 단계; 및
   상기 단백질 가수분해 저해제로 처리된 불가사리의 관족 분말을 원심분리하여 상층액을 추출하는 단계를 포함하는 불가사리의 관족으로부터 생리 활성 인자를 추출하는 방법.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 불가사리의 관족으로부터 추출된 상기 생리 활성 인자는 콜라겐 합성, 인체 피부 세포의 재생(regeneration), 인체 세포의 성장 인자의 발현(expression) 중에서 적어도 하나의 생리 활성을 증진시키는 불가사리 관족으로부터 생리 활성 인자를 추출하는 방법.
   
3. 제 2항에 있어서,
   상기 인체 세포의 성장 인자는 MAPK 1(mitogen-activated protein kinase 1) 및 IGF-1(insulin growth factor 1), IL-1β(interleukin 1β), TNF-α(tumor necrosis factor α), TGF-β(transformation growth factor β) 및 CXCL12 (chemokine (C-X-C motif) ligand 12) 중에서 적어도 하나의 성장 인자를 포함하는 불가사리 관족으로부터 생리 활성 인자를 추출하는 방법.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 불가사리는 아무르불가사리(Asterias amurensis)인 불가사리 관족으로부터 생리 활성 인자를 추출하는 방법.
   
5. 제 1항에 있어서,
   상기 불가사리의 관족으로부터 얻어진 상기 생리 활성 인자를 포함하는 추출물은 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 콜라겐 합성 촉진 및 피부 재생 촉진 중에서 적어도 하나의 기능을 가지는 불가사리 관족으로부터 생리 활성 인자를 추출하는 방법.

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