KR20170098876A - Vegf 변이체 폴리펩타이드 조성물 - Google Patents

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KR20170098876A KR1020177019672A KR20177019672A KR20170098876A KR 20170098876 A KR20170098876 A KR 20170098876A KR 1020177019672 A KR1020177019672 A KR 1020177019672A KR 20177019672 A KR20177019672 A KR 20177019672A KR 20170098876 A KR20170098876 A KR 20170098876A
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제니퍼 알. 코크런
시븐 카푸르
마크 에스. 블루멘크란츠
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더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
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Abstract

본 명세서에서 펩타이드 링커 또는 이황화 브릿지에 의해 제2 VEGF 단량체에 결합된 제1 VEGF 단량체를 포함하는, VEGF 변이체 폴리펩타이드 및 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합이 제공된다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 하기 식을 포함한다: A-L-B, 식 중, A는 제1 VEGF 단량체 서브유닛이고; B는 제2 VEGF 단량체 서브유닛이며; L은 14 내지 20개의 아미노산을 갖는 펩타이드 링커이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 개체에게 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합을 투여하는 단계를 포함하는 혈관형성 장애의 치료가 필요한 개체에서 혈관형성 장애를 치료하는 방법이 개시된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에서 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 키트가 개시된다.

Description

VEGF 변이체 폴리펩타이드 조성물{VEGF VARIANT POLYPEPTIDE COMPOSITIONS}
상호 참조
본 출원은 2015년 1월 16일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/104,590호, 및 2015년 1월 16일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/104,588호, 및 2015년 1월 16일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/104,621호의 유익을 주장하며, 이들 각각은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 펩타이드 링커 또는 이황화 브릿지에 의해 제2 VEGF 단량체에 결합된 제1 VEGF 단량체를 포함하는 VEGF 변이체 폴리펩타이드가 개시된다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 하기 식을 포함한다:
A-L-B
식 중,
A는 제1 VEGF 단량체 서브유닛이고;
B는 제2 VEGF 단량체 서브유닛이며; 그리고
L은 14 내지 20개의 아미노산을 갖는 펩타이드 링커이다.
일부 실시형태에서, L은 하기로부터 선택된 식을 갖는 펩타이드 링커이다: (GS)n(여기서 n은 6 내지 15의 정수임); (G2S)n(여기서, n은 4 내지 10의 정수임); (G3S)n(여기서, n은 3 내지 8의 정수임); (G4S)n(여기서, n은 2 내지 6의 정수임); (G)n(여기서, n은 12 내지 30의 정수임); 및 (S)n(여기서, n은 12 내지 30의 정수임). 일부 실시형태에서, L은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: GSTSGSGKSSEGKGGGGGS(서열번호 42); GGGGSGGGGSGGGG(서열번호 43); 및 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44). 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 하기 식을 포함한다:
A-L1-B-(L2-A-L1-B)n-L2-A-L1-B
식 중,
A는 제1 VEGF 단량체 서브유닛이고,
B는 제2 VEGF 단량체 서브유닛이며,
L1은 14 내지 20개의 아미노산을 갖는 펩타이드 링커이고;
L2는 펩타이드 링커이며; 그리고
n은 0 내지 4의 정수이다.
일부 실시형태에서, L1은 하기로부터 선택된 식을 갖는 펩타이드 링커이다: (GS)n(여기서 n은 6 내지 15의 정수임); (G2S)n(여기서, n은 4 내지 10의 정수임); (G3S)n(여기서, n은 3 내지 8의 정수임); (G4S)n(여기서, n은 2 내지 6의 정수임); (G)n(여기서, n은 12 내지 30의 정수임); 및 (S)n(여기서, n은 12 내지 30의 정수임). 일부 실시형태에서, L1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: GSTSGSGKSSEGKGGGGGS(서열번호 42); GGGGSGGGGSGGGG(서열번호 43); 및 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44). 일부 실시형태에서, L2는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: (GS)n(여기서, n=10 내지 30); (G2S)n(여기서, n= 6 내지 20); (G3S)n(여기서, n= 5 내지 15); (G4S)n(여기서, n= 4 내지 12); (G)n(여기서, n= 20 내지 60); 및 (S)n(여기서, n =20 내지 60).
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 2작용성 길항제이다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 VEGFR, 인테그린 또는 이들의 조합물을 길항한다. 일부 실시형태에서, VEGFR은 VEGFR1이다. 일부 실시형태에서, VEGFR은 VEGFR2이다. 일부 실시형태에서, 인테그린은 αvβ3, αvβ5 또는 α5β1 인테그린, 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 적어도 하나는 VEGF-A 단량체이다. 일부 실시형태에서, VEGF-A 단량체는 VEGF165이다. 일부 실시형태에서, VEGF-A 단량체는 VEGF165b이다. 일부 실시형태에서, VEGF-A 단량체는 VEGF121이다. 일부 실시형태에서, VEGF-A 단량체는 VEGF145이다. 일부 실시형태에서, VEGF-A 단량체는 VEGF189이다. 일부 실시형태에서, VEGF-A 단량체는 VEGF206이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 적어도 하나는 VEGF-B 서브유닛이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 적어도 하나는 VEGF-C 서브유닛이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 적어도 하나는 VEGF-D 서브유닛이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 적어도 하나는 PlGF이다. 일부 실시형태에서, 제1 VEGF 단량체 서브유닛 및 제2 VEGF 단량체 서브유닛은 각각 독립적으로 VEGF-A 단량체이다.
일부 실시형태에서, 제1 VEGF 단량체 서브유닛은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다: V14A, V14I, V15A, K16R, F17L, M18R, D19G, Q22R, R23K, I29V, L32S, I35V, F36L, F36S, D41N, E42K, E44G, Y45H, F47S, K48E, P49L, S50P, P53S, G58S, C60Y, D63H, D63N, D63G, I76T, M78V, M81T, M81V, R82G, H86Y, Q87R, Q89H, H90R, I91T, I91V, N100D, 및 K101E. 일부 실시형태에서, 제1 VEGF 단량체 서브유닛은 F36L, E44G, D63G 및 Q87R로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 VEGF 단량체 서브유닛은 F36L, E44G 및 Q87R로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 VEGF 단량체 서브유닛은 V14A, V14I, V15A, K16R, F17L, M18R, D19G, Q22R, R23K, I29V, L32S, I35V, F36L, F36S, D41N, E42K, E44G, Y45H, F47S, K48E, P49L, S50P, P53S, G58S, C60Y, D63H, D63N, D63G, I76T, M78V, M81T, M81V, R82G, H86Y, Q87R, Q89H, H90R, I91T, I91V, N100D 및 K101E로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함한다. VEGF 단량체에 대해 전체적으로 "제1" 및 "제2"의 표기는 임의적인 차이이며, 사슬 중 하나는 "제1" 또는 "제2"일 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
일부 실시형태에서, 제2 VEGF 단량체 서브유닛은 K16R, D41N 및 D63N으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 VEGF 단량체 서브유닛은 D63N으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 VEGF 단량체 서브유닛 또는 제2 VEGF 단량체 서브유닛 또는 둘 다는 RGD 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, RGD 루프는 서열번호 1 내지 40, 66 내지 72로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, RGD 포함 루프는 제1 또는 제2 VEGF 단량체 서브유닛, 또는 이들의 임의의 조합의 루프 1, 루프 2, 또는 루프 3을 대체한다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 mE7I의 서열(서열번호 75)에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 mA7I의 서열(서열번호 76)에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 mJ7I의 서열(서열번호 77)에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 mE7I-R1null의 서열(서열번호 78)에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 추가로 독소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 독소는 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin: PE), 디프테리아 독소(Diphtheria toxin: DT), 리신 독소, 아브린 독소, 탄저 독소, 시가 독소, 보툴리눔 독소, 파상풍 독소, 콜레라 독소, 마이토톡신, 팔리독소, 시구아독소, 텍스틸로독소, 바트라코독소, 알파 코노톡신, 타이폭신, 테트로도톡신, 알파 티티우스독소, 삭시톡신, 아나톡신, 마이크로시스틴, 아코니틴, 엑스폴리아틴 독소 A, 엑스폴리아틴 B, 엔테로톡신, 독성 쇼크 증후군 독소(TSST-I), 예르시니아 페스티스(Y. pestis) 독소 및 가스괴저 독소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 독소는 VEGF 변이체의 N-말단에 부착된다. 일부 실시형태에서, 독소는 VEGF 변이체의 C-말단에 부착된다. 일부 실시형태에서, 독소는 제1 또는 제2 VEGF 단량체 서브유닛에 부착된다.
특정 실시형태에서, (a) 다음의 돌연변이: F36L, E44G, 및 Q87R 또는 F36L, E44G, D63G, 및 Q87R을 갖는 제1 VEGF-A 단량체 서브유닛 (b) 돌연변이: D63N을 갖는 제2 VEGF-A 단량체 서브유닛, 및 (c) 제1 및 제2 VEGF-A 단량체에 결합하는 펩타이드 링커 또는 이황화 브릿지를 포함하는, 상기 나타낸 바와 같은 식 A-L-B의 VEGF 변이체 폴리펩타이드가 본 명세서에서 개시된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 하기 식을 포함하는 VEGF 변이체 폴리펩타이드가 개시된다:
A-L1-B-(L2-A-L1-B)n-L2-A-L1-B
식 중, A는 다음의 돌연변이: F36L, E44G 및 Q87R을 갖는 제1 VEGF-A 단량체이고; B는 돌연변이 D63N을 갖는 제2 VEGF-A 단량체이며; L1은 펩타이드 링커이고; L2는 펩타이드 링커이며; 그리고 n은 0 내지 4의 정수이고, 각각의 A 및 B는 상기 나타낸 바와 같다. 일부 실시형태에서, L1의 길이는 14개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, L1의 길이는 15개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, L1의 길이는 16개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, L1의 길이는 17개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, L1의 길이는 18개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, L1의 길이는 19개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, L1의 길이는 20개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, L1은 GSTSGSGKSSEGKG(서열번호 41)에 대해 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 실시형태에서, L1은 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44)에 대해 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 실시형태에서, L1은 GSTSGSGKSSEGKGGGGGS(서열번호42)에 대해 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 실시형태에서, L1은 GGGGSGGGGSGGGG(서열번호43)에 대해 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 실시형태에서, L2는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: (GS)n(여기서, n=10 내지 30); (G2S)n(여기서, n= 6 내지 20); (G3S)n(여기서, n= 5 내지 15); (G4S)n(여기서, n= 4 내지 12); (G)n(여기서, n= 20 내지 60); 및 (S)n(여기서, n =20 내지 60). 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 mE7I의 서열(서열번호 75)에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다.
특정 실시형태에서, 상기 나타낸 바와 같은 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드를 생성하기 위해 면역글로불린 Fc 영역에 융합된다. Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합은 하기 식을 포함할 수 있다:
Fc-(A-L-B) 또는 (A-L-B)-Fc
식 중,
Fc는 면역글로불린 Fc 영역이고;
A 및 B는 각각 독립적으로 VEGF 단량체이며; 그리고
L은 펩타이드 링커 아미노산이고, 각각의 A, B 및 L은 상기 나타낸 바와 같다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 하기 식을 포함하는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합이 개시된다:
Fc-[A-L1-B-(L2-A-L1-B)n-L2-A-L1-B], 또는 Fc-[A-L1-B-(L2-A-L1-B)n-L2-A-L1-B]
식 중,
Fc는 면역글로불린 Fc 영역이고;
A는 제1 VEGF 단량체이며;
B는 제2 VEGF 단량체이고; 그리고
L1 및 L2는 각각 독립적으로 펩타이드 링커이며, 각각의 A, B, L1 및 L2는 상기 나타낸 바와 같고; 그리고
n은 0 내지 4의 정수이다.
조성물은 본 발명의 하나 이상의 변이체 VEGF 폴리펩타이드(들)를 포함하는 데, 이는 단일 종으로서 또는 보통 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 조합하여 2 이상의 폴리펩타이드의 칵테일로서 제공될 수 있다. 이러한 조성물은 선택적으로 1종 이상의 추가적인 치료제를 포함한다. 약학적 조성물은 본 발명의 1종 이상의 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 조성물은 국소 또는 전신 용도를 위해 제공될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 국소 조성물이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 피부, 안구 조직, 뇌척수액, 종양, 관절 열극 등으로 국소 주사되는 조성물이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 경구 또는 정맥내로 전달되는 전신 조성물이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 점안액이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 안과적으로 허용 가능한 용액, 크림 또는 연고로서 제형화된다. 본 발명의 안과 조성물은 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애의 치료가 필요한 대상체에서 각막 및 안구결막을 포함하는 눈 외면의 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애를 비수술적으로 치료하기 위해 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애의 치료가 필요한 대상체에서 각막 및 안구결막을 포함하는 눈의 외면의 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애의 재발을 예방하기 위해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 안구내 주사, 결막하 주사, 또는 안구주위 주사용으로 제형화된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 기능성 모이어티, 예를 들어 검출 가능한 표지, 예컨대 형광 표지, 검출 가능한 표지, 예컨대 동위원소 표지; 세포독성 모이어티 등에 컨쥬게이팅되는데, 이는 영상화, 정량화, 치료적 목적 등에서의 용도를 발견할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 혼성 폴리펩타이드는 독소를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 독소는 슈도모나스 외독소(PE), 디프테리아 독소(DT), 리신 독소, 아브린 독소, 탄저 독소, 시가 독소, 보툴리눔 독소, 파상풍 독소, 콜레라 독소, 마이토톡신, 팔리독소, 시구아독소, 텍스틸로독소, 바트라코독소, 알파 코노톡신, 타이폭신, 테트로도톡신, 알파 티티우스독소, 삭시톡신, 아나톡신, 마이크로시스틴, 아코니틴, 엑스폴리아틴 독소 A, 엑스폴리아틴 B, 엔테로톡신, 독성 쇼크 증후군 독소(TSST-I), 예르시니아 페스티스 독소 및 가스괴저 독소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 독소는 폴리펩타이드의 N-말단에 부착된다. 일부 실시형태에서, 독소는 폴리펩타이드의 C-말단에 부착된다. 일부 실시형태에서, 독소는 PDGF 사슬, VEGF 사슬 또는 둘 다에 부착된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 혈관형성 장애의 치료가 필요한 개체에서, 상기 개체에게 본 명세서에 개시된 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 본 명세서에 개시된 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합을 투여하는 단계를 포함하는 혈관형성 장애를 치료하는 방법이 개시된다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 익상편이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 각막 신혈관 형성이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 황반변성이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 망막 혈관 폐쇄이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 안구의 신혈관 형성, 맥락막 신혈관 형성, 홍채 신혈관 형성, 각막 신혈관 형성, 망막 신혈관 형성, 검열반, 판누스, 당뇨망막병증(DR), 당뇨성 황반부종(DME), 망막 박리, 뒤포도막염, 당뇨망막병증, 황반변성, 예를 들어, 노인성 황반변성(AMD), 특히 습성 황반변성, 켈로이드, 녹내장, 백내장, 부분 색맹, 완전 실명, 근시, 근시변성, 중심시의 악화, 변시증, 색 왜곡, 혈관 출혈, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 익상편을 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 섬유혈관 성장을 가진다.
일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 전립선암, 유방암, 폐암, 식도암, 결장암, 직장암, 간암, 요로암(예를 들어, 방광암), 신장암, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암), 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 위암, 갑상선암, 피부암(예를 들어, 흑색종), 림프구 또는 골수성 계열의 조혈암, 두경부암, 비인두암(NPC), 교모세포종, 기형암종, 신경아세포종, 선암종, 간엽 유래의 암, 예컨대 섬유육종 또는 횡문근육종, 연조직 육종 및 암종, 융모막 암종, 간아세포종, 카포시 육종 또는 윌름 종양이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 염증성 장애가다. 일부 실시형태에서, 염증성 장애는 염증성 관절염, 골관절염, 건선, 만성 염증, 과민성 장 질환, 폐 염증 또는 천식이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 자가면역 장애이다. 일부 실시형태에서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 또는 전신 홍반 루푸스이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 죽상동맥경화증, 후수정체 섬유 증식증, 갑상선 과형성(그레이브스병을 포함), 신증후군, 자간전증, 복수, 심낭수(예컨대, 심낭염과 관련) 및 흉수이다.
일부 실시형태에서, 대상체에게 본 발명의 혼성 폴리펩타이드를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애의 비수술적 치료를 필요로 하는 대상체의 각막 및 안구결막을 포함하는 눈의 외면의 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애를 비수술적으로 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 본 발명의 혼성 폴리펩타이드를 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 신혈관 형성 재발의 예방을 필요로 하는 대상체의 각막 및 안구결막을 포함하는 눈의 외면의 신혈관 형성 재발을 예방하는 방법이 제공된다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 추가적인 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 항체, 폴리펩타이드, 뉴클레오타이드, 소분자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 VEGF의 저해제, PDGF의 저해제, ANG의 저해제 또는 FGF의 저해제 또는 관련 수용체이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 인테그린의 저해제, 또는 MMP의 저해제 또는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 미토마이신 C(MMC), 5-플루오로유라실(5-FU), 로테프레드놀 에타보네이트(LE), 경구 독시사이클린, 다이피리다몰 및 도베실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 항염증 스테로이드이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 비스테로이드성 항염증제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 VEGF 신호전달의 항체 또는 소분자 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 이미 생성된 VEGF의 효과에 결합하거나, 가두거나, 스캐빈지하거나 또는 방해한다. 추가적인 치료제는 본 발명의 혼성 폴리펩타이드와 함께 안과 조성물을 포함하는 약제학적 조성물에서 제형화되거나, 또는 별개의 제형으로 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 눈의 외면의 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애는 익상편이다. 일부 실시형태에서, 익상편은 만성 익상편이다. 일부 실시형태에서, 익상편은 재발성 익상편이다. 일부 실시형태에서, 눈의 외면의 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애는 판누스이다. 일부 실시형태에서, 눈의 외면의 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애는 각막 신혈관 형성이다. 일부 실시형태에서, 눈의 외면의 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애는 검열반이다. 일부 실시형태에서, 각막 경계에서 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애는 콘택트렌즈의 낡음에 의해 야기된다. 일부 실시형태에서, 장애는 수술적 개입의 1개월 내에 치유되지 않았다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 혼성 폴리펩타이드는 수술적 개입 또는 좌멸 괴사 조직 제거술 동안 또는 후에 투여된다.
본 명세서에 기재된 신규한 특징은 특히 첨부된 청구범위에서 제시된다. 본 명세서에 기재된 특징 및 이점의 더 양호한 이해는 본 명세서에 기재된 특징의 원칙이 이해되는 예시적 실시예를 제시하는 다음의 상세한 설명, 및 수반하는 도면을 참고로 하여 얻을 수 있다:
도 1은 상이한 펩타이드 링커(L1A, L2A 및 L3A)를 지니는 작제물에 대한 단백질 수율을 나타내는 겔의 이미지를 도시한 도면.
도 2는 본래의 링커에 비해 펩타이드 링커 L3A를 포함하는 작제물의 표적 결합 친화도를 비교하기 위해 수행한 인간 내피 세포에 대한 세포 결합 분석 결과의 플롯을 도시한 도면.
도 3은 scVEGFMUT-E로부터 유래된 VEGF 변이체 폴리펩타이드의 라이브러리에 대한 발현 대 VEGFR 결합의 플롯을 도시한 도면.
도 4는 scVEGF 작제물의 Fc-융합 결합의 플롯을 도시한 도면.
도 5는 HUVEC에 대한 인산화 분석의 결과 플롯을 도시한 도면.
도 6은 각막 신혈관 형성의 실험 모델에서 혈관형성을 차단하는 단일 사슬 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 도시한 도면.
도 7은 인간 익상편에서 폰빌레브란트 인자(vWF) 및 VEGFR2의 면역조직화학적 염색을 예시한 도면.
도 8은 인간 익상편에서 vWF 및 VEGFR1의 면역조직화학적 염색을 예시한 도면.
도 9는 인간 익상편에서 αvβ3 및 VEGFR2의 면역조직화학적 염색을 예시한 도면.
도 10은 인간 익상편에서 CD31 및 α5β1 인테그린의 면역조직화학적 염색을 예시한 도면.
도 11은 인간 익상편에서 CD31 및 αvβ5 인테그린의 면역조직화학적 염색을 예시한 도면.
도 12는 인간 익상편에서 MMP2, 프로-MMP2 및 CD31의 면역조직화학적 염색을 예시한 도면.
몇몇 실시형태는 예시를 위해 실시예 적용을 참고로 하여 이하에 기재된다. 수많은 구체적 상세한 설명, 관계 및 방법은 본 명세서에 기재된 특징의 완전한 이해를 제공하기 위해 제시된다는 것이 이해되어야 한다. 그러나, 관련 기술에서 당업자는 본 명세서에 기재된 특징이, 일부 실시형태에서 특정 상세한 설명 중 하나 이상 없이 또는 다른 방법에 의해 실행된다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 본 명세서에 기재된 특징은 작업 또는 사건의 예시된 순서로 제한되지 않는데, 일부 작업은 다른 작업 또는 사건과 상이한 순서로 및/또는 동시에 일어날 수 있다. 더 나아가, 본 명세서에 기재된 특징에 따른 방법을 실행하기 위해 모든 작업 또는 사건을 예시할 필요는 없다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정 경우를 설명하는 목적을 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에서 사용하는 바와 같은 단수 형태는 달리 내용에서 분명하게 표시되지 않는 한, 복수의 형태도 포함하는 것으로 의도된다. 더 나아가, 용어 "포함하는", "포함하다", "갖는", "가지다", "지니는", 또는 이들의 변형이 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 정도로, 이러한 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포함된다는 것이 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 값이 측정 또는 결정되는 방법, 예를 들어, 측정 시스템의 제한에 부분적으로 의존하는 당업자에 의해 결정되는 바와 같은 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미할 수 있다. 예를 들어, "약"은 당업계에서 실행마다 1 내의 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 20%까지, 10%까지, 5%까지 또는 1%까지의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 대해, 상기 용어는 값의 10배, 5배 내, 및 더 바람직하게는 2배 내를 의미할 수 있다. 특정 값이 적용 및 청구범위에서 기재되지 않는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"은 추정되어야 한다.
"아미노산"은 천연 유래 아미노산, 비천연 유래 아미노산, 및 아미노산 유사체, 및 각각의 D 또는 L 입체이성질체를 지칭한다.
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", 및 "아미노산 서열"은 아미노산의 사슬을 지칭한다. "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "아미노산 서열"은 상호 호환적으로 사용된다.
용어 "펩타이드 링커", "폴리펩타이드 링커" 또는 "아미노산"은 하나의 VEGF 단량체 서브유닛을 다른 VEGF 단량체 서브유닛에 연결하는 아미노산의 사슬을 지칭한다. 상기 용어는 상호 호환적으로 사용된다.
VEGF 또는 혈관 내피 성장 인자는 신생혈관생성, 혈관형성 및 림프관 신생을 자극하는 신호전달 단백질의 패밀리를 지칭한다. VEGF 패밀리의 구성원은 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 PlGF(태반 성장 인자)를 포함한다. VEGF의 특정 구성원이 구체화된다면, VEGF는 임의의 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 PlGF를 의미한다. 본 출원 내에서, 임의의 VEGF 단량체의 아미노산 잔기 넘버링은 성숙 인간 야생형 VEGF-A 서열에 대해 잔기 13에서 시작된다. 서열번호 73은 VEGF 121의 성숙 전장 서열이다. 서열번호 74는 처음 12개의 아미노산 잔기의 N-말단 절단(그 결과 13에서 넘버링을 시작함)과 마지막 12개의 아미노산 잔기의 C-말단 절단을 둘 다 포함하는 성숙 전장 VEGF 121의 단편이다. 본 명세서에서 언급할 때, VEGF-A의 루프 1은 (성숙 인간 야생형 VEGF-A 서열에 대해)아미노산 잔기 62 내지 67을 의미하고; 루프 2는 (성숙 인간 야생형 VEGF-A 서열에 대해) 아미노산 잔기 39 내지 46을 의미하며; 루프 3은 (성숙 인간 야생형 VEGF-A 서열에 대해) 아미노산 잔기 83 내지 89를 의미한다. 다른 VEGF 패밀리 구성원의 루프 1, 2 및 3은 유사하게 정의되거나 상동성에 의해 추론될 수 있다.
"VEGF 단량체 서브유닛"은 VEGF 단량체 아미노산 서열을 의미한다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛은 서열번호 73의 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛은 서열번호 74의 서열을 가진다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛은 서열번호 73의 서열을 갖되, 서열번호 73의 서열은 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 대체, 첨가, 삽입, 생략, 치환 또는 결실 또는 이들의 조합)에 의해 변형된다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛은 서열번호 74의 서열을 갖되, 서열번호 74의 서열은 돌연변이(예를 들어, 대체, 첨가, 삽입, 생략, 치환 또는 결실 또는 이들의 조합)에 의해 변형된다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛은 서열번호 73의 서열을 갖되, 서열번호 73의 루프 1, 루프 2 또는 루프 3, 또는 이들의 임의의 조합은 이종성 모티프(예를 들어, RGD 인식 모티프)로 대체되었다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛은 서열번호 74의 서열을 갖되, 서열번호 74의 루프 1, 루프 2 또는 루프 3, 또는 이들의 임의의 조합은 이종성 모티프(예를 들어, RGD 인식 모티프)로 대체되었다.
"VEGF 변이체 폴리펩타이드"는, 예를 들어 링커 또는 이황화 브릿지에 의해 함께 회합된 적어도 2개의 VEGF 단량체 서브유닛을 포함하는 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 하나 또는 둘 다 연결된 VEGF 단량체 서브유닛은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
"scVEGF 변이체"는 2개의 VEGF 단량체 서브유닛이, 예를 들어 펩타이드 링커에 의해 결합되는 VEGF 변이체 폴리펩타이드의 단일 사슬 형태, 즉, 단일 사슬 분자를 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단일 사슬 VEGF 변이체", 및 "scVEGF 변이체"는 상호 호환적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "극(pole)" 또는 "면(face)"은 VEGF 변이체 폴리펩타이드의 VEGFR 결합 계면을 지칭한다. "극" 또는 "면"은 제1 VEGF 단량체 서브유닛 및 제2 VEGF 단량체 서브유닛으로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. 각각의 극은 하나의 VEGFR 분자에 결합한다. "극" 또는 "면"은 상호 호환적으로 사용된다.
"돌연변이체"는 기준 야생형 폴리펩타이드와 어떤 점에서는 상이한 폴리펩타이드를 지칭한다. 폴리펩타이드는 기준 야생형(예를 들어, 천연 유래) 폴리펩타이드의 생물학적 특성을 보유한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 기준 야생형 폴리펩타이드와 상이한 생물학적 특성을 가진다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체는 폴리펩타이드 사슬이 아미노산 잔기의 대체, 첨가, 삽입, 생략, 치환 또는 결실 또는 이들의 조합을 갖는 돌연변이를 가진다.
"항-VEGF 제제"는 VEGF 신호전달의 저해제, 예를 들어 경쟁적 길항제, 비-경쟁적 길항제, 경쟁하지 않는 길항제, 침묵 길항제, 부분적 작용제 또는 역작용제를 의미한다.
"정제된" 또는 "실질적으로 정제된"은 표시된 분자가 다른 생물학적 거대분자, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 단백질 등의 실질적인 부재 하에 존재한다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 상기 분자는 존재하는 표시된 생물학적 거대분자의 적어도 95중량%, 예를 들어, 적어도 99중량%를 구성하도록 정제된다. 일부 실시형태에서, 물, 완충제 및 분자량이 1000달톤 미만인 기타 소분자는 임의의 양으로 존재한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "단리된"은 그의 천연 공급원에서 분자와 함께 존재하는 적어도 하나의 다른 성분으로부터 분리된 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 상기 분자는 존재하는 표시된 생물학적 거대분자의 50중량% 초과, 예를 들어, 적어도 75중량%를 구성하도록 단리된다.
용어 "개체", "환자" 또는 "대상체"는 상호 호환적으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 그들은 임의의 포유류(즉, 분류학적 분류 동물계 내의 목, 과 및 속의 임의의 종: 척삭동물문: 척추동물문: 포유류강)를 의미한다. 일부 실시형태에서, 포유류는 인간이다. 상기 용어 중 어떤 것도 의료계 종사자(예를 들어, 의사, 간호사, 전문 간호사, 의사 보조원, 도우미 또는 호스피스 노동자)의 감독(예를 들어, 지속적 또는 간헐적)을 특징으로 하는 상황을 요구하거나 또는 그런 상황으로 제한되지 않는다.
상태, 장애 또는 병태(예를 들어, 익상편)을 "치료하는" 또는 이의 "치료"는 하기를 포함한다: (1) 상태, 장애 또는 병태로 고통받거나 또는 성향을 갖지만, 아직 상태, 장애 또는 병태의 임상 또는 준임상 증상을 경험하거나 또는 나타내지 않는 포유류에서 상태, 장애 또는 병태의 임상 또는 준임상 증상의 출현을 예방 또는 지연시키는 것; 및/또는 (2) 질환 또는 이의 재발의 발생(유지 치료의 경우에) 또는 이의 적어도 하나의 임상 또는 준임상 증상을 저지, 감소 또는 지연시키는 것을 포함하는, 상태, 장애 또는 병태의 저해; 및/또는 (3) 질환의 완화, 예를 들어, 상태, 장애 또는 병태 또는 그의 임상 또는 준임상 증상 중 적어도 하나의 퇴행을 야기; 및/또는 (4) 질환의 하나 이상의 증상의 중증도의 감소를 야기. 치료될 대상체에 대한 이점은 환자 또는 의사에게 통계적으로 유의하거나 또는 적어도 지각할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "혈관형성 장애"는 병리적 신생혈관생성과 관련되거나 또는 이로부터 초래되거나, 또는 신혈관 형성에 의해 용이하게 되는 임의의 병태 또는 장애(예를 들어, 신혈관 형성에 따른 종양)을 의미한다.
VEGF 변이체 폴리펩타이드
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 VEGF 변이체 폴리펩타이드가 개시된다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 Fc 융합이다. 일부 실시형태에서, 이러한 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 혈관형성 장애, 예를 들어, 신생혈관생성 관련 눈 장애를 진단 및 치료하는 방법에서 사용된다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 익상편 치료에서 사용된다.
본 명세서에 개시되는 바와 같은 VEGF 변이체 폴리펩타이드는, 예를 들어 링커에 의해 함께 결합된 적어도 2개의 VEGF 단량체 서브유닛을 포함하는 분자이다. 일부 실시형태에서, 하나 또는 둘 다 연결된 VEGF 단량체 서브유닛은 아미노산 잔기의 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 대체, 첨가, 삽입, 생략, 치환 또는 결실 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 VEGF 수용체 길항제이다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 인테그린 수용체 길항제이다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 인테그린 수용체 길항제 및 VEGF 수용체 길항제이다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 비트로넥틴 수용체 길항제이다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 비트로넥틴 수용체 길항제 및 VEGF 수용체 길항제이다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드의 하나의 극이 VEGFR에 결합할 수 있도록 이 극은 무손상 VEGFR 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드의 적어도 하나의 극은 VEGFR에 결합할 수 없다. 일부 실시형태에서, VEGFR에 대한 VEGF 변이체 폴리펩타이드의 결합 시, VEGFR은 활성화되지 않는다. 이에 의해 이는 신생혈관생성의 저해를 초래하는 하류의 신호전달의 VEGF-자극 수용체 자가인산화 및 증식을 길항한다. 임의의 하나의 이론에 구속되는 일 없이, 본 명세서에 개시된 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 VEGFR 및 VEGFR 활성화에 의해 유도되는 후속적 신호전달을 길항할 수 있는데, VEGF 변이체 폴리펩타이드의 하나의 극이 무손상 VEGFR 결합 부위를 갖기 때문이다. VEGF 변이체 폴리펩타이드의 이 극은 VEGFR에 결합할 수 있는 반면, VEGF 변이체 폴리펩타이드의 다른 극은 그것이 제2 VEGFR에 결합할 수 없도록 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는데, 이는 VEGFR 이량체화 및 활성화를 방지한다.
일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛의 적어도 하나는 VEGF-A이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 적어도 하나는 VEGF-A 동형 단백질이다. 일부 실시형태에서, VEGF-A 동형 단백질은 121, 145, 148, 165, 183, 189 또는 206개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, VEGF-A 동형 단백질은 VEGF165b 동형 단백질이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 적어도 하나는 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 또는 PlGF이다. 임의의 적합한 VEGF 단량체 서브유닛은 본 명세서에 개시된 방법과 함께 사용하기 위해 상정된다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 단량체 VEGF-A121로부터 유래되지만, VEGF-A121의 97-아미노산 코어 영역만을 포함한다(서열번호 74 참조).
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 VEGF 단량체 서브유닛에 비해 절단된 N-말단, C-말단 또는 둘 다를 가진다.
VEGF 변이체 융합 폴리펩타이드
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 다른 시스테인 매듭 성장 인자 또는 당단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 적어도 하나의 다른 분자를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 융합 펩타이드는 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, PDGF 또는 PlGF 단량체에 융합된 VEGF-A 단량체를 포함하고; VEGF-B 단량체는 VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, PDGF 또는 PlGF 단량체에 융합되며; VEGF-C 단량체는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, PDGF 또는 PlGF 단량체에 융합되고; VEGF-D 단량체는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-E, VEGF-F, PDGF 또는 PlGF 단량체에 융합되며; 또는 PlGF 단량체는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F 또는 PDGF 단량체에 융합된다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는, 예를 들어 공유 또는 이온 결합에 의해 독소에 부착된다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 독소에 부착된다. 일부 실시형태에서, 독소는 VEGF 변이체 폴리펩타이드의 N 말단에 부착된다. 일부 실시형태에서, 독소는 VEGF 변이체 폴리펩타이드의 C-말단에 부착된다. 일부 실시형태에서, 독소는 제1 또는 제2 VEGF 단량체 서브유닛에 부착된다.
일부 실시형태에서, 독소는 슈도모나스 외독소(PE), 디프테리아 독소(DT), 리신 독소, 아브린 독소, 탄저 독소, 시가 독소, 보툴리눔 독소, 파상풍 독소, 콜레라 독소, 마이토톡신, 팔리독소, 시구아독소, 텍스틸로독소, 바트라코독소, 알파 코노톡신, 타이폭신, 테트로도톡신, 알파 티티우스독소, 삭시톡신, 아나톡신, 마이크로시스틴, 아코니틴, 엑스폴리아틴 독소 A, 엑스폴리아틴 B, 엔테로톡신, 독성 쇼크 증후군 독소(TSST-I), 예르시니아 페스티스 독소 및 가스괴저 독소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 Fc-융합을 포함한다. 일부 실시형태에서, scVEGF의 C-말단은 Fc의 N-말단에 결합된다. 일부 실시형태에서, Fc의 C-말단은 scVEGF의 N-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, Fc-융합은 천연 유래 또는 조작된다. 일부 실시형태에서, Fc-융합은 인간, 마우스, 래트 및 토끼로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, Fc-융합을 포함하는 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 면역 세포들의 관여를 유도한다. 일부 실시형태에서, Fc-융합을 포함하는 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 Fc 수용체에 결합한다. 일부 실시형태에서, Fc-융합을 포함하는 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 면역 세포의 관여를 유도한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 B 림프구, 여포성 수상돌기 세포, 자연 살해 세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 호염기구 및 비만 세포이다. 일부 실시형태에서, Fc-융합을 포함하는 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 Fc-융합 없이 VEGF 변이체 폴리펩타이드로부터 VEGFR 또는 인테그린에 대한 결합 친화도를 변경시키지 않는다. 일부 실시형태에서, Fc-융합을 포함하는 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 Fc 융합 없이 VEGF 변이체 폴리펩타이드로부터 VEGFR 또는 인테그린에 대한 길항 활성을 변경시키지 않는다. 일부 실시형태에서, Fc-융합을 포함하는 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 Fc-융합 없이 VEGF 변이체 폴리펩타이드로부터 VEGFR 또는 인테그린에 대한 결합 친화도를 향상시켰다. 일부 실시형태에서, Fc-융합을 포함하는 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 Fc 융합 없이 VEGF 변이체 폴리펩타이드로부터 VEGFR 또는 인테그린에 대한 길항 활성을 향상시켰다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 VEGF 변이체 폴리펩타이드 및 Fc-융합의 융합 접점에서 Gly4Ser 링커에 의한 Fc 융합에 연결된다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 Gly4Ser 링커 없이 Fc-융합에 연결된다. 일부 실시형태에서, Gly4Ser 링커는 하나의 Gly4Ser 반복부를 포함한다. 일부 실시형태에서, Gly4Ser 링커는 2개의 Gly4Ser 반복부를 포함한다. 일부 실시형태에서, Gly4Ser 링커는 3개의 Gly4Ser 반복부를 포함한다.
이종성 모티프를 지니는 VEGF 변이체 폴리펩타이드
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 비-VEGFR 단백질에 결합하는 이종성 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 VEGF 펩타이드 단량체 서브유닛 또는 제2 VEGF 펩타이드 단량체 서브유닛은 비-VEGFR 단백질에 결합하는 이종성 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 VEGF 펩타이드 단량체 서브유닛 및 제2 VEGF 펩타이드 단량체 서브유닛은 각각 독립적으로 비-VEGFR 단백질에 결합하는 이종성 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 이종성 모티프는 제1 VEGF 펩타이드 단량체 서브유닛과 제2 VEGF 펩타이드 단량체 서브유닛 사이에서 나누어진다. 일부 실시형태에서, 비-VEGFR 단백질은 수용체이다. 일부 실시형태에서, 비-VEGFR 단백질은 혈관 단백질이다. 일부 실시형태에서, 이종성 모티프를 포함하는 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 야생형 VEGF에 비해 VEGFR2에 대해 증가된 친화도를 가진다.
일부 실시형태에서, 비-VEGF 단백질은 인테그린이다. 인테그린은 세포외 기질 리간드에 대한 세포 접착에 수반된 다양한 부류의 이형이량체(α/β) 수용체이다. 특히, 인테그린 αvβ3은 종양 증식, 전이 및 신생혈관생성에 결정적으로 수반되기 때문에 연루되었고, 따라서 인테그린 αvβ3을 표적화하는 항암 치료를 개발하기 위한 다수의 노력이 있었다. 인간 익상편 조직 샘플은 αvβ3, αvβ5 및 α5β1에 대해 양성이다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 VEGFR2와 αvβ3 인테그린을 둘 다 표적화하는 이중특이성 단백질이다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 VEGFR1, VEGFR2 및 αvβ3 인테그린을 표적화하는 다중특이성 길항제이다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 돌연변이 수용체 결합 부위에서 αvβ3 인테그린의 결합을 위한 인테그린-인식 RGD 서열을 운반하는 루프를 포함함으로써, 내피 세포의 VEGF-자극 증식뿐만 아니라 αvβ3 인테그린의 활성화를 길항한다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 하나의 무손상 및 하나의 돌연변이된 VEGF 수용체 결합 극을 포함하되, 돌연변이된 결합 극은 인테그린, 예를 들어 αvβ3, αvβ5 또는 α5β1 인테그린의 결합을 위한 인테그린-인식 RGD 서열을 지니는 루프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인테그린-인식 RGD 서열은 VEGF 단량체 서브유닛의 루프 1, 루프 2 또는 루프 3을 대체한다. 일부 실시형태에서, 루프 1 서열은 RGD 모티프로 대체된다. 일부 실시형태에서, 루프 2 서열은 RGD 모티프로 대체된다. 일부 실시형태에서, 루프 3 서열은 RGD 모티프로 대체된다. 일부 실시형태에서, 루프 3 서열(서열번호 64) IKPHQGQ는 RGD 모티프로 대체된다. 표 1은 예시적인 인테그린-결합 루프 펩타이드의 서열을 나타낸다.
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추가로, 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 2개 이상의 특이적 인테그린에 대한 결합 및 저해를 가능하게 하기 위해 2개 이상의 RGD-포함 루프를 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 비-VEGFR 단백질에 결합하는 이종성 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 혈관 단백질에 결합하는 이종성 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, 혈관 단백질은 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 기질 메탈로프로테이나제(MMP), 혈소판-유래 성장 인자 수용체(PDGFR), 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 섬유아세포 성장인자 수용체(FGFR), 섬유아세포 성장인자(FGF) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 (i) MMP-2 및 MMP-9의 활성을 저해하고, (ii) 시험관내 종양 세포와 내피 세포 둘 다의 이동을 억제하며, (iii) 생체내 종양 혈관 구조로 귀소하고, 그리고 (iv) 마우스에서 종양의 성장 및 침범을 방지하는 환식 데카펩타이드 CTTHWGFTLC(서열번호 65)를 포함한다. 서열번호 65 CTTHWGFTLC-디스플레이 파지는 또한 생체내 혈관형성 혈관을 특이적으로 표적화할 수 있었다.
아미노산 치환
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드의 제1 VEGF 단량체 서브유닛은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드의 제2 VEGF 단량체 서브유닛은 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드의 제1 VEGF 단량체 서브유닛 및 제2 VEGF 단량체 서브유닛은 각각 독립적으로 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 적어도 하나의 VEGF 단량체 서브유닛에서 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 VEGF 단량체 서브유닛 중 적어도 하나 또는 둘 다에서 적어도 2개의 아미노산 치환, 적어도 3개의 아미노산 치환, 적어도 4개의 아미노산 치환 또는 적어도 5개의 아미노산 치환을 포함한다. 천연 유래 아미노산에 추가로, 비-천연 유래 아미노산 또는 변형된 아미노산이 또한 상정되고, 범주 내에 있다.
일부 실시형태에서, 치환은, 치환된 아미노산이 기준 서열에서 대응하는 아미노산과 유사한 구조적 또는 화학적 특성을 갖는 보존적 아미노산 치환이다. 일부 실시형태에서, 치환은 비-보존적이다. 예를 들어, 보존적 아미노산 치환은 하나의 지방족 또는 소수성 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신의 다른 아미노산으로의 치환; 하나의 하이드록실-포함 아미노산, 예를 들어, 세린 및 트레오닌의 다른 아미노산으로의 치환; 하나의 산성 잔기, 예를 들어, 글루탐산 또는 아스파르트산의 다른 아미노산으로의 치환; 하나의 아마이드-포함 잔기의, 예를 들어, 아스파라긴 및 글루타민의 다른 아미노산으로의 대체; 하나의 방향족 잔기, 예를 들어, 페닐알라닌 및 타이로신의 다른 아미노산으로의 대체; 하나의 염기성 잔기, 예를 들어, 라이신, 아르기닌 및 히스티딘의 다른 아미노산으로의 대체; 및 하나의 작은 아미노산, 예를 들어, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌 및 글리신의 다른 아미노산으로의 대체를 수반한다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 전장 활성 단량체의 일부, 예를 들어, 전장 단백질이 아닌 펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 전장 활성 단량체의 일부는 이들 아미노산 서열의 아미노산의 치환, 대체, 첨가, 삽입, 생략 및/또는 결실에 의해 얻어진다. 일부 실시형태에서, 전장 활성 단량체의 일부는 다른 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 또는 추가적인 화학기, 예컨대 글리코실기, 지질, 아세틸기 등과 연결된다.
일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 하나 또는 둘 다는 포유류 VEGF 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 하나 또는 둘 다는 조류 VEGF 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 하나 또는 둘 다는 영장류 VEGF 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 하나 또는 둘 다는 개 VEGF 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 하나 또는 둘 다는 고양이 VEGF 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 하나 또는 둘 다는 소 VEGF 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 하나 또는 둘 다는 말 VEGF 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 하나 또는 둘 다는 돼지 VEGF 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 하나 또는 둘 다는 양 VEGF 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 하나 또는 둘 다는 뮤린 VEGF 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 하나 또는 둘 다는 래트 VEGF 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 하나 또는 둘 다는 토끼 VEGF 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, VEGF 단량체 서브유닛 중 하나 또는 둘 다는 인간 VEGF 펩타이드이다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 제1 VEGF-A 단량체 및 제2 VEGF-A 단량체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 VEGF-A 단량체는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다: V14A, V14I, V15A, K16R, F17L, M18R, D19G, Q22R, R23K, I29V, L32S, I35V, F36L, F36S, D41N, E42K, E44G, Y45H, F47S, K48E, P49L, S50P, P53S, G58S, C60Y, D63H, D63N, D63G, I76T, M78V, M81T, M81V, R82G, H86Y, Q87R, Q89H, H90R, I91T, I91V, N100D, 및 K101E. 일부 실시형태에서, 제1 VEGF-A 단량체는 F36L, E44G, D63G 및 Q87R로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 VEGF-A 단량체는 F36L, E44G 및 Q87R의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 VEGF-A 단량체는 V14A, V14I, V15A, K16R, F17L, M18R, D19G, Q22R, R23K, I29V, L32S, I35V, F36L, F36S, D41N, E42K, E44G, Y45H, F47S, K48E, P49L, S50P, P53S, G58S, C60Y, D63H, D63N, D63G, I76T, M78V, M81T, M81V, R82G, H86Y, Q87R, Q89H, H90R, I91T, I91V, N100D 및 K101E로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 VEGF-A 단량체는 K16R, D41N 및 D63N으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 VEGF-A 단량체는 돌연변이 D63N을 포함한다.
펩타이드 링커
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 펩타이드 링커에 의해 분리되는 2개 이상의 VEGF 단량체 서브유닛을 포함한다. 단일 사슬 입체배좌에서 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 형성하기 위해 펩타이드 링커가 사용된다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 VEGF 수용체에 결합하는 단일 사슬 분자의 능력을 방해하지 않는다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 인테그린 수용체에 결합하는 단일 사슬 분자의 능력을 방해하지 않는다.
일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 약 2 내지 약 50개 이상의 아미노산의 길이의 범위이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10 내지 15 또는 15 내지 20개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 14 내지 20개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 14개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 15개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 16개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 17개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 18개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 19개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 20개의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 Gly-Ser이거나 또는 Gly-Ser을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 글리신-풍부 폴리펩타이드 사슬이다.
일부 실시형태에서, 펩타이드 링커 서열은 GSTSGSGKSSEGKG(서열번호 41)이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커 서열은 GSTSGSGKSSEGKGGGGGS(서열번호 42)이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커 서열은 GGGGSGGGGSGGGG(서열번호 43)이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커 서열은 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44)이다.
일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 하기 군으로부터 선택된 식을 갖는 펩타이드를 포함한다: (GS)n(여기서 n은 6 내지 15의 정수임); (G2S)n(여기서, n은 4 내지 10의 정수임); (G3S)n(여기서, n은 3 내지 8의 정수임); (G4S)n(여기서, n은 2 내지 6의 정수임); (G)n(여기서, n은 12 내지 30의 정수임); 및 (S)n(여기서, n은 12 내지 30의 정수임).
일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 (Gly4-Ser)3(서열번호 45)이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(서열번호 46)이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(서열번호 47)이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys(서열번호 48)이다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 링커는 Gly9-Pro-Ser-Cys-Val-Pro-Leu-Met-Arg-Cys-Gly-Gly-Cys-Cys-Asn(서열번호 49)이다.
사슬
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 식 A-L-B로 나타내되, A 및 B는 각각 독립적으로 VEGF 단량체 서브유닛이고, L은 펩타이드 링커이다. 일부 실시형태에서, L은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: GSTSGSGKSSEGKG(서열번호 41); GSTSGSGKSSEGKGGGGGS(서열번호 42); GGGGSGGGGSGGGG(서열번호 43); 및 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44).
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 식 A-L1-B-(L2-A-L1-B)n-L2-A-L1-B로 나타내되, A 및 B는 각각 독립적으로 VEGF 단량체 서브유닛이고, L1 및 L2는 각각 독립적으로 펩타이드 링커이며; n은 0 내지 4의 정수이다. 일부 실시형태에서, L1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: GSTSGSGKSSEGKG(서열번호 41); GSTSGSGKSSEGKGGGGGS(서열번호 42); GGGGSGGGGSGGGG(서열번호 43); 및 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44). 일부 실시형태에서, L2는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: (GS)n(여기서, n=10 내지 30); (G2S)n(여기서, n= 6 내지 20); (G3S)n(여기서, n= 5 내지 15); (G4S)n(여기서, n= 4 내지 12); (G)n(여기서, n= 20 내지 60); 및 (S)n(여기서, n =20 내지 60).
증가된 반감기
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 야생형 VEGF 동종이량체에 비해 증가된 혈장 및/또는 안구 반감기를 가진다. 단백질의 반감기는 단백질 안정성 및 그의 클리어런스 속도의 측정이며, 단백질 농도에서 절반의 감소에 필요한 시간을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 VEGF 분자의 혈청 반감기는 시간에 따라 대상체로부터의 샘플에서 VEGF 수준을 측정하기 위한 임의의 적합한 방법, 예컨대 변형된 VEGF의 투여 후 시간 기간에 걸쳐 취한 혈청 샘플 내 VEGF 수준을 측정하기 위해 항-VEGF 항체를 이용하는 면역 분석에 의해, 또는 표지된 VEGF의 투여 후 대상체로부터 취한 샘플에서 표지된 VEGF 분자, 예를 들어, 방사성 표지 분자의 검출에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 개시된 VEGF 변이체 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키기 위해 임의의 적합한 변형이 사용된다. 일부 실시형태에서, 증가된 반감기는 Fc-융합의 사용에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, 증가된 반감기는 알부민 융합의 사용에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, 증가된 반감기는, 예컨대 인간 융모성 성선 자극 호르몬(hCG)의 카복시 말단 연장 펩타이드(CTEP)의 사용에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체의 단량체는 CTEP에 공유 결합되고, 예를 들어, 펩타이드 결합에 의해 또는 헤테로2작용성 시약에 의해 펩타이드 링커를 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는 아미노 말단과 카복시 말단 사이의 공유결합을 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체는 하나 이상의 단백질 분해 절단 부위를 제거함으로써 안정성을 향상시키고 혈청 반감기를 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환과 결합된 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 첨가적 아미노산 치환은 단백질 분해를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 첨가적 아미노산 치환은 단백질 절단을 방지한다. 일부 실시형태에서, 증가된 반감기는 다른 적절한 화학기의 페길화(pegylation) 또는 컨쥬게이션을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 가교에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, 반감기는 분자 내에서 음으로 하전된 잔기의 수, 예를 들어, 글루탐산염 및 아스파르트산염 잔기의 수를 증가시킴으로써 증가된다. 일부 실시형태에서, 이러한 변경은 부위 지정 돌연변이유발에 의해 또는 하나 이상의 음으로 하전된 잔기를 포함하는 아미노산 서열의 삽입에 의해 달성된다.
예시적인 VEGF 변이체 폴리펩타이드
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 링커, 예를 들어 펩타이드 링커에 의해 함꼐 연결된 2개의 VEGF 단량체 서브유닛을 포함하는 VEGF 변이체 폴리펩타이드가 개시된다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 링커에 의해 결합된 제1 및 제2 VEGF-A 단량체 서브유닛을 포함한다: GSTSGSGKSSEGKGGGGGS(서열번호 42), GGGGSGGGGSGGGG(서열번호 43), 및 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44), 여기서, (a) 제1 및 제2 VEGF-A 단량체 서브유닛은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 돌연변이를 포함한다: V14A, V14I, V15A, K16R, F17L, M18R, D19G, Q22R, R23K, I29V, L32S, I35V, F36L, F36S, D41N, E42K, E44G, Y45H, F47S, K48E, P49L, S50P, P53S, G58S, C60Y, D63H, D63N, D63G, I76T, M78V, M81T, M81V, R82G, H86Y, Q87R, Q89H, H90R, I91T, I91V, N100D, 및 K101E, 및 (b) 제1 및/또는 제2 VEGF-A 단량체 서브유닛의 루프 1, 루프 2 또는 루프 3, 또는 이들의 임의의 조합은 표 1의 임의의 RGD 서열로 대체된다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 VEGFR 둘 다(예를 들어, VEGFR1 및 VEGFR2) 및 인테그린(예를 들어, αvβ3 인테그린)의 2작용성 길항제이다. 예시적인 2작용성 길항제 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 mE7I(서열번호 75),(서열번호 76), mJ7I(서열번호 77), mE7I-R1null(서열번호 78)을 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 mE7I의 단백질 서열(서열번호 75)에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 mA7I의 단백질 서열(서열번호 76)에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 mJ7I의 단백질 서열(서열번호 77)에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 mE7I-R1null의 단백질 서열(서열번호 78)에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일하다.
VEGF 변이체 폴리펩타이드의 생성
VEGF 변이체 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 재조합 방법 또는 화학적 합성 방법을 통해 생성될 수 있다. 추가로, 기능적으로 동등한 폴리펩타이드는 동등한 폴리펩타이드가 침묵 변화를 초래하는 아미노산 잔기의 결실, 첨가 또는 치환을 포함할 수 있고, 따라서 경로 유전자 산물 상에서 상이하게 발현되는 기능적 등가물을 생성할 수 있는 용도를 찾을 수 있다. 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 수반된 잔기의 양친매성 특성에 기반하여 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "기능적으로 동등한"은 실질적으로 유사한 생체내 활성을 나타낼 수 있는 단백질을 지칭한다.
VEGF 변이체 폴리펩타이드는 당업계에 잘 공지된 기법을 이용하여 재조합 DNA 기법에 의해 생성될 수 있다. 당업자에게 잘 공지된 방법은 암호 서열 및 적절한 전사/번역 제어 신호를 포함하는 발현 벡터를 구성하기 위해 사용될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전자 재조합을 포함한다. 대안적으로, 관심 대상의 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 RNA는 화학적으로 합성될 수 있다.
재조합 방법에 대한 선택사항으로서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 방법은 전형적으로 고체 상태 접근을 포함할 뿐만 아니라 용액-기반 화학 및 조합 또는 고체 상태 및 용액 접근의 조합을 이용할 수 있다. 단백질을 합성하기 위한 고체 상태 방법의 예는 문헌[Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149; 및 Houghten (1985) Proc. Natl. Acad. Sci., 82:5131]에 의해 기재되어 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 단편은 합성될 수 있고, 이어서, 함께 결합된다. 이러한 반응을 수행하기 위한 방법은 문헌[Grant (1992) Synthetic Peptides: A User Guide, W.H. Freeman 및 Co., N.Y.; 및 "Principles of Peptide Synthesis," (Bodansky and Trost, ed.), Springer-Verlag, Inc. N.Y., (1993)]에 기재되어 있다. 본 발명의 단백질 또는 펩타이드는 하나 이상의 비-천연 유래 또는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. "비-천연 유래 아미노산 잔기"는 폴리펩타이드 사슬 내 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유 결합할 수 있는 상기 열거한 천연 유래 아미노산 잔기 이외의 잔기를 지칭한다. 비천연 아미노산은 호모-라이신, 호모-알기닌, 호모-세린, 아제티딘카복실산, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 아미노프로피온산, 2-아미노뷰티르산, 4-아미노뷰티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노아이소뷰티르산, 3-아미노아이소뷰티르산, 2-아미노피멜산, 3차-뷰틸글리신, 2,4-다이아미노아이소뷰티르산, 데스모신, 2,2'-다이아미노피멜산, 2,3-다이아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 호모프롤린, 하이드록시라이신, 알로-하이드록시라이신, 3-하이드록시프롤린, 4-하이드록시프롤린, 아이소데스모신, 알로-아이소류신, N-메틸알라닌, N-메틸글리신, N-메틸아이소류신, N-메틸펜틸글리신, N-메틸발린, 나프트알라닌, 노르발린, 노르류신, 오르니틴, 시트룰린, 펜틸글리신, 피페콜산 및 티오프롤린을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 변형된 아미노산은, 예를 들어, 다른 작용기에 대해 화학적으로 변형된 N-메틸화된 D 및 L 아미노산, 측사슬 작용기로서 그들의 N-말단 아미노기 또는 그들의 측사슬기에 대해 화학적으로 차단되거나, 가역적 또는 비가역적으로 변형된 천연 또는 비천연 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 변형된 아미노산 메티오닌 설폭사이드; 메티오닌 설폰; 아스파르트산-(베타-메틸 에스터), 아스파르트산의 변형된 아미노산; N-에틸글리신, 글리신의 변형된 아미노산; 또는 알라닌 카복스아마이드 및 알라닌의 변형된 아미노산을 포함한다. 추가적인 비천연 및 변형된 아미노산, 및 그들을 단백질 및 펩타이드 내로 혼입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sandberg et al., (1998) J. Med. Chem. 41: 2481-91; Xie and Schultz (2005) Curr. Opin. Chem. Biol. 9: 548-554; Hodgson and Sanderson (2004) Chem. Soc. Rev. 33: 422-430] 참조).
전형적으로, VEGF 변이체 폴리펩타이드에 대한 암호 서열은 상대적으로 다량의 유전자 산물을 생성하기 위해 목적으로 하는 숙주 세포에서 기능성인 프로모터의 제어 하에 놓인다. 매우 다양한 프로모터가 잘 공지되어 있으며, 특정 용도에 따라서 본 발명의 발현 벡터에서 사용될 수 있다. 보통, 선택된 프로모터는 프로모터가 활성이 되는 세포에 의존한다. 다른 발현 제어 서열, 예컨대 리보솜 결합 부위, 전사 종결 부위 등이 또한 선택적으로 유도된다. 이들 제어 서열 중 하나 이상을 포함하는 작제물은 "발현 카세트"로 칭해진다. 발현은 프로모터 및 특정 숙주 세포에 적절한 다른 조절제를 이용하여 원핵 및 진핵 세포에서 달성된다. 예시적인 숙주 세포는 이콜라이(E. coli), 기타 박테리아 숙주, 효모 및 다양한 고등 진핵 세포, 예컨대 COS, CHO 및 HeLa 세포주 및 골수종 세포주를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
VEGF 변이체 폴리펩타이드는 통상적으로 공지된 방법, 예컨대 면역친화도 또는 이온 교환 칼럼 상의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상의 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스(Sephadex) G-75를 이용하는 겔 여과; 소수성 친화도 수지, 기질 상에 고정된 적합한 결합 상대를 이용하는 리간드 친화도, 원심분리, ELISA, BIACore, 웨스턴 블롯 분석, 아미노산 및 핵산 시퀀싱 및 생물학적 활성을 이용하여 정제 및 동정될 수 있다.
용도
특정 실시형태에서, 본 명세서에 VEGF 변이체 폴리펩타이드가 개시된다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 Fc-융합이다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 혈관형성 장애의 진단 및 치료 방법에서 사용된다.
일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 신생혈관생성 관련 눈 장애이다. 일부 실시형태에서, 이러한 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 익상편 치료에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 안구 신혈관 형성, 맥락막 신혈관 형성, 홍채 신혈관 형성, 각막 신혈관 형성, 망막 신혈관 형성, 검열반 또는 판누스이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 각막 신혈관 형성이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 검열반이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 판누스이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 당뇨망막병증(DR), 당뇨성 황반부종(DME), 망막 박리, 뒤포도막염, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 당뇨망막병증이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 황반변성, 예를 들어, 노인성 황반변성(AMD), 특히 습성 황반변성이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 켈로이드이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 망막 혈관 폐쇄이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 녹내장, 백내장, 부분 색맹, 완전 실명, 근시, 근시변성, 중심시의 악화, 변시증, 색 왜곡, 혈관 출혈, 또는 이들의 조합이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 혈관형성-관련 병태의 치료가 필요한 대상체에서 혈관형성-관련 병태를 치료하는 방법이 개시된다. 일부 실시형태에서, 혈관형성-관련 병태는 익상편이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성-관련 병태는 각막 신혈관 형성이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성-관련 병태는 판누스이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성-관련 병태는, 예를 들어, 콘택트렌즈 낡음으로부터 초래되는 각막 윤부 신혈관 형성이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성-관련 병태는 검열반이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에 대한 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 투여를 포함한다.
익상편(또한 "파도타기 눈(Surfer's Eye)"으로서 알려짐)은 눈의 결막 및 각막 표면을 가로지르는 양성 혈관 성장이다. 익상편은 결막 상에서 유래되고, 일부 경우에, 각막 경계를 넘어서 퍼지는 쐐기모양의, 혈관의 크고, 새로운 성장을 특징으로 한다. 익상편은 통상적으로 공막의 비강측으로부터 성장하고, 보통 눈꺼풀틈새에 존재한다. 이는 자외선 노출(예를 들어, 태양광), 저습도, 바람 및 먼지와 관련되고, 이들에 의해 야기되는 것으로 생각된다. 일부 예에서, 익상편은 눈꺼풀 횡연합 주위의 공막 외상이 선행한다. 일부 예에서, 비강측에 대한 익상편의 우세는 태양광이 각막을 측면으로 통과한 결과이며, 이는 굴절을 겪고, 둘레 영역에 집중되게 된다. 태양광은 눈의 측면부로부터 방해받지 않고 통과하여 각막을 통과한 후에 안쪽 경계 상에 집중된다. 그러나, 대측성(안쪽) 측면 상에서, 코의 그림자는 측면의/일시적 경계 상에 집중된 태양광의 강도를 안쪽으로 감소시킨다.
결막 내 익상편은 콜라겐(일광탄력섬유증) 및 섬유혈관 증식의 탄성 변성을 특징으로 한다. 익상편은 일반적으로 신혈관 형성, 세포외 기질(ECM)의 리모델링, 및 섬유아세포(FB) 증식을 나타낸다. 이는 익상편의 두부로 불리는 돌출된 부분을 갖는데, 이는 목에 의해 익상편의 주몸체와 연결된다. 일부 예에서, 철 침착 선은 스토커 라인(Stocker's line)으로 불리는 익상편의 두부에 인접하여 보인다. 일부 예에서, 선의 위치는 성장 패턴의 표시를 제공한다.
익상편은 몇몇 세그먼트로 구성된다: 훅스 패치(Fuchs' Patch)(익상편 두부 가까이에서 분산되는 작은 회색 결점), 스토커 라인(철 침착물로 구성된 갈색선), 후드(Hood)(익상편의 섬유성 비혈관 부분), 두부(전형적으로 상승되고 고도로 혈관성인 익상편의 정점), 몸체(뒤틀린 혈관에 의해 정체된 새로 상승된 부분), 상부 에지(익상편의 삼각형 또는 날개형 부분의 위쪽 에지), 내부 에지(익상편의 삼각형 또는 날개형 부분의 아래쪽 에지).
일부 예에서, 익상편은 과도한 태양 또는 바람 노출에 의해 야기되기 때문에, 측면 차폐 또는 바람막이 모자와 함께 보호용 선글라스 및 눈에 대한 인공 눈물의 적용은 익상편 형성을 예방하는 데 도움을 주거나 또는 추가 성장을 예방한다.
본 명세서에 개시된 폴리펩타이드에 의한 치료를 위한 추가적인 혈관형성-관련 병태는 검열반, 판누스 및 각막 신혈관 형성을 포함한다. 검열반은 눈의 결막 변성이다. 검열반을 지니는 개체는 경계에 인접한 결막 상에 황색 내지 백색의 침착물이 존재한다. 조직학적으로, 장애는 가로놓인 상피의 박화 및 때때로 석회화와 함께 결막 간질의 콜라겐 섬유의 변성을 특징으로 한다. 판누스는 말초 각막 내로의 혈관의 비정상적 층이다. 각막 신혈관 형성은 각막에 대한 염증 또는 외상과 종종 관련되는 윤부혈관총으로부터 각막 내로의 혈관의 과도한 성장이다.
본 발명의 폴리펩타이드에 의한 치료는 익상편에 대한 통상적인 치료와 조합될 수 있는데, 이 치료는 수술적 제거 및/또는 방사선조사, 결막 자가이식, 양막 세포막 이식 또는 치료제의 투여를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 익상편이 수술 후에 재발되거나, 또는 시력을 위협하는 것으로 생각된다면, 스트론튬(90Sr) 경화반 요법이 사용될 수 있다. 결막 자가 이식은 익상편 성장 제거를 위한 침습적 수술 기법이다. 익상편 성장 제거를 위해 양막 이식이 또한 사용된다. 익상편의 치료를 위한 다른 치료제는 미토마이신 C(MMC), 5-플루오로유라실(5-FU), 로테프레드놀 에타보네이트(LE), 경구 독시사이클린, 다이피리다몰 및 도베실레이트를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 전립선암, 유방암, 폐암, 식도암, 결장암, 직장암, 간암, 요로암(예를 들어, 방광암), 신장암, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암), 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 위암, 갑상선암, 피부암(예를 들어, 흑색종), 림프구 또는 골수성 계열의 조혈암, 두경부암, 비인두암(NPC), 교모세포종, 기형암종, 신경아세포종, 선암종, 간엽 유래의 암, 예컨대 섬유육종 또는 횡문근육종, 연조직 육종 및 암종, 융모막 암종, 간아세포종, 카포시 육종 또는 윌름 종양이다.
일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 염증성 장애이다. 일부 실시형태에서, 염증성 장애는 염증성 관절염, 골관절염, 건선, 만성 염증, 과민성 장 질환, 폐 염증 또는 천식이다.
일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 자가면역 장애이다. 일부 실시형태에서, 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 또는 전신 홍반 루푸스이다.
다른 혈관형성 장애는 죽상동맥경화증, 후수정체 섬유 증식증, 갑상선 과형성(그레이브스병을 포함), 신증후군, 자간전증, 복수, 심낭수(예컨대 심낭염과 관련) 및 흉수를 포함한다.
병용 요법
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 추가적인 치료제와 병용하여 개체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 혈관 내피 성장인자(VEGF), 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 앤지오텐신(ANG), 또는 섬유아세포 성장인자(FGF), 및 관련 수용체의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 기질 메탈로프로테이나제(MMP), 전립선-특이적 막 항원(PSMA)이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 항체, 폴리펩타이드, 뉴클레오타이드, 소분자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 미토마이신 C(MMC), 5-플루오로유라실(5-FU), 로테프레드놀 에타보네이트(LE), 경구 독시사이클린, 다이피리다몰 및 도베실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 항염증 스테로이드이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 비스테로이드성 항염증제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 VEGF 신호전달의 항체 또는 소분자 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 이미 생성된 VEGF의 효과에 결합하거나, 가두거나, 스캐빈지(scavenge)하거나 또는 방해한다.
일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 화학치료제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 알킬화제, 예를 들어, 시스플라틴, 사이클로포스파마이드, 알트레타민; DNA 가닥-파손제, 예컨대 블레오마이신; DNA 토포아이소머라제 II 저해제(삽입제, 예컨대 암사크린, 닥티노마이신, 아우노루비신, 독소루비신, 이다루비신 및 미톡산트론을 포함); 비개재(nonintercalating) 토포아이소머라제 II 저해제, 예컨대, 에토포사이드 및 테니포사이드; DNA 소홈 결합제 플리카마이신; 알킬화제(질소 머스터드, 예컨대 클로람부실, 사이클로포스파마이드, 아이소파마이드, 메클로르에타민, 멜팔란, 유라실 머스터드를 포함); 아지리딘, 예컨대 티오테파; 메탄설포네이트 에스터, 예컨대 부설판; 니트로소 유레아, 예컨대 카무스틴, 로무스틴, 스트렙토조신; 백금 착물, 예컨대 시스플라틴, 카보플라틴; 생환원성 알킬화제, 예컨대 미토마이신 및 프로카바진, 다카바진 및 알트레타민; 엽산염 길항제, 예컨대 메토트렉세이트 및 트라이메트렉세이트를 포함하는 대사길항물질; 피리미딘 길항제, 예컨대 플루오로유라실, 플루오로데옥시유리딘, CB3717, 아자사이티딘, 사이타라빈; 머캅토퓨린을 포함하는 플록수리딘 퓨린 길항제, 6-티오구아닌, 플루다라빈, 펜토스타틴으로부터 선택되고; 당 변형된 유사체는 사이타라빈, 플루다라빈; 하이드록시유레아를 포함하는 리보뉴클레오타이드 환원효소 저해제; 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 파클리탁셀을 포함하는 튜불린 상호작용제; 부신 피질 스테로이드, 예컨대 프레드니손, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론 및 프로드니솔론; 에스트로겐, 컨쥬게이팅된 에스트로겐 및 에틴일 에스트라다이올 및 다이에틸스틸베스테롤, 클로로트라이아니센 및 이데네스트롤을 포함하는 호르몬 차단제; 프로게스틴, 예컨대 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 및 메게스트롤; 안드로겐, 예컨대 테스토스테론, 테스토스테론 프로피오네이트; 플루옥시메스테론, 메틸테스토스테론 에스트로겐, 컨쥬게이팅된 에스트로겐 및 에틴일 에스트라다이올 및 다이에틸스틸베스테롤, 클로로트라이아니센 및 이덴스트롤을 포함한다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드 및 추가적인 치료제는 일원화된 투약 형태로 또는 별개의 투약 형태로 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 치료 절차와 조합하여 본 명세서에 개시된 VEGF 변이체 폴리펩타이드의 투여를 포함한다. 상가적 또는 상승적 이점을 제공하는 절차는 방사선조사(예를 들어, 90Sr 요법), 결막 자가이식 또는 양막 이식 또는 수술을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
단지 예로서, 본 명세서에 기재된 VEGF 변이체 폴리펩타이드 중 하나를 받을 때 개체에 의해 경험되는 부작용 중 하나가 구역이라면, 초기 치료제와 병용하여 항구역제를 투여하는 것이 적절하다. 또는, 단지 예로서, 본 명세서에 기재된 치료제 중 하나의 치료적 유효성은 애주번트의 투여에 의해 향상된다(즉, 애주번트 단독으로 최소의 치료적 이점을 갖지만, 다른 치료제와 병용하여, 환자에 대한 전반적인 치료적 이점이 향상된다). 또는, 단지 예로서, 개체에 의해 경험되는 이점은 또한 치료적 이점을 갖는 다른 치료제와 함께(또는 치료적 요법을 포함함) 본 명세서에 기재된 치료제 중 하나를 투여함으로써 증가된다. 임의의 경우에, 치료될 질환 또는 장애와 관계없이, 환자에 의해 경험되는 전반적인 이점은 단순이 두 치료제에 상가적이거나, 또는 다른 실시형태에서, 환자는 상승적 이점을 경험한다.
사용되는 제제의 특정 선택은 담당 의사의 진단 및 환자 병태의 그들의 판단 및 적절한 치료 프로토콜에 의존할 것이다. 제제는 선택적으로 장애의 특성, 환자의 병태 및 사용되는 제제의 실제 선택에 따라서 일제히(예를 들어, 동시에, 본질적으로 동시에 또는 동일한 치료 프로토콜 내에) 또는 순차적으로 투여된다. 투여 순서의 결정, 및 치료 프로토콜 동안 각각의 치료제 투여의 반복 수는 치료 중인 질환의 평가 및 환자의 병태에 기반한다.
일부 실시형태에서, 약물이 치료 조합에서 사용될 때 치료적으로 유효한 투약량은 다르다. 치료 요법과 병용하여 사용하기 위한 약물 및 다른 제제의 치료적으로 유효한 투약량을 실험적으로 결정하는 방법은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 메트로노믹(metronomic) 투약의 사용, 즉, 독성 부작용을 최소화하기 위해 더 빈번하고, 더 낮은 용량을 제공하는 것은 문헌에 광대하게 기재되었다. 병용 요법은 추가로 환자의 임상 관리를 보조하기 위해 다양한 시간에 시작 및 중단되는 주기적 치료를 포함한다.
약제학적 제형
일부 실시형태에서, 요법을 위해 본 명세서에 개시된 제제를 있는 그대로 사용할 수 있지만, 약제학적 제형으로서, 예를 들어, 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 실행과 관련하여 선택된 약제학적 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합하여 제제를 투여하는 것이 바람직하다. 약제학적 제형은 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체와 함께 적어도 1종의 활성 화합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량 및 투여 빈도는, 예를 들어 본 방법으로 치료되는 병태의 질환의 임상 징후, 병리학적 징후 및 임상 및 준임상 증상뿐만 아니라 환자의 임상 이력을 고려하여 치료하는 의사의 판단에 기반하여 조절된다. 예를 들어, 환자가 익상편 또는 켈로이드 재발(예를 들어, 혈관 성장) 증상을 나타낼 때, 또는 환자가 이전의 익상편 또는 켈로이드 재발의 이력이 있다면, 더 고용량, 증가된 투여 빈도 또는 더 긴 치료의 지속기간이 표시된다.
폴리펩타이드의 제형은 진단 및 요법에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, 제형은 1, 2개 이상의 폴리펩타이드 또는 제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료적 제형은 치료, 예를 들어, 화학요법, 방사선 요법, 수술 등의 다른 방법과 병용하여 투여된다.
일부 실시형태에서, 제형은 표적화된 부위에서 체류 및 안정화를 위해 최적화된다. 안정화 기법은 분자량 증가를 달성하기 위해 가교, 다량체화 또는 기에 대한 연결, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴아마이드, 중성 단백질 담체, Fc-융합 등에 의해 폴리펩타이드의 크기를 향상시키는 것을 포함한다. 체류를 증가시키기 위한 다른 전략은 생분해성 또는 생부식성 이식물 또는 바이오겔에서 또는 비생부식성 중합체 저장소에 의한 폴리펩타이드의 포착(entrapment)을 포함한다. 체류를 증가시키기 위한 또 다른 전략은 생분해성 또는 생부식성 이식물 또는 바이오겔에서, 또는 비생부식성 중합체 저장소에 의해, 저장소에 대한 화학적 결합의 분해에 의한 폴리펩타이드의 서방출에 의한 폴리펩타이드의 화학적 포착을 포함한다. 치료적 활성제의 방출 속도는 중합체 기질을 통한 운반 속도 및 이식물의 생분해에 의해 제어된다. 중합체 장벽을 통한 폴리펩타이드의 운반은 또한 약물에 대해 더 침투 가능한 중합체 장벽, 이식물의 기하학적 구조 등을 생성하기 위해 화합물 용해도, 중합체 친수성, 중합체 가교 정도, 물 흡수 시 중합체의 팽창에 의해 영향 받을 것이다. 이식물은 이식물의 부위로서 선택된 영역의 크기 및 형상에 비례한 치수를 가진다. 일부 실시형태에서, 이식물은, 예를 들어, 입자, 시트, 패치, 플라크, 섬유 또는 마이크로캡슐을 포함하며, 선택된 삽입 부위에 적합한 임의의 크기 또는 형상이다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 목적으로 하는 제형에 따라서, 동물 또는 인간 투여를 위한 약제학적 조성물을 제형화하기 위해 통상적으로 사용되는 비히클로서 정의되는, 약제학적으로 허용 가능한, 비독성 담체 또는 희석제를 포함한다. 희석제는 조합물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않도록 선택된다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 완충수, 생리 식염수, PBS, 링거 용액, 덱스트로스 용액 및 행크스 용액이다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물 또는 제형은 다른 담체, 애주번트, 또는 비독성, 비치료적, 비면역원성 안정제, 부형제 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 또한 생리적 조건에 근사하게 하는 추가적인 물질, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 독성 조절제, 습윤제 및 세정제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 다양한 안정제, 예를 들어 항산화제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드는 펩타이드의 생체내 안정성을 향상시키거나, 또는 다르게는 약학적 특성을 향상시키는(예를 들어, 폴리펩타이드 반감기를 증가시키거나, 그의 독성을 감소시키거나, 용해도 또는 흡수를 향상시키는) 다양한 잘 공지된 화합물에 의해 착물화된다. 이러한 변형 또는 착화제의 예는 황산염, 글루콘산염, 시트르산염 및 인산염을 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물의 펩타이드는 그들의 생체내 속성을 향상시키는 분자에 의해 착물화된다. 이러한 분자는, 예를 들어, 탄수화물, 폴리아민, 아미노산, 다른 펩타이드, 이온(예를 들어, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 망간) 및 지질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처치를 위해 투여된다. 일부 실시형태에서, 활성 성분의 독성 및 치료적 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 대해 치사성인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 결정하는 것을 포함하여 세포 배양물 및/또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 따라 결정된다. 독성 효과와 치료적 효과 사이의 용량비는 치료 지수이며, 이는 비 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
일부 실시형태에서, 세포 배양물 및/또는 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에 대한 투약량의 범위를 제형화하는 데 사용된다. 활성 성분의 투약량은 전형적으로 낮은 독성의 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 놓인다. 일부 실시형태에서, 투약량은 사용되는 투약 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라서 이 범위 내에서 다르다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 다양한 상이한 방법으로 투여된다. 예는 경구, 비강내, 직장, 국소, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 진피하, 경피, 척추강내 및 두개내 방법을 통해 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
예를 들어, 정맥내, 병변내, 근육내, 진피내, 복강내, 및 피하 경로에 의한 비경구 투여에 적합한 제형은 수성 및 비-수성, 등장성 멸균 주사 용액을 포함하는데, 이는 일부 실시형태에서 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제, 및 의도된 수용인의 혈액과 등장성인 제형을 제공하는 용질, 및 일부 실시형태에서 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정제 및 보존제를 포함하는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 함유한다.
약제학적 조성물을 제형화하기 위해 사용되는 성분은 바람직하게는 고순도이며, 잠재적으로 해로운 오염물질(예를 들어, 적어도 국가 식량(National Food: NF) 등급, 일반적으로 적어도 분석 등급, 및 더 전형적으로는 적어도 약제학적 등급)이 실질적으로 없다. 게다가, 생체내 용도를 위해 의도되는 조성물은 보통 멸균이다. 주어진 화합물이 사용 전 합성되어야 하는 정도로, 일부 실시형태에서, 얻어진 제품은 전형적으로 합성 또는 정제 공정 동안 존재하는 임의의 잠재적 독성 제제, 특히 임의의 내독서가 실질적으로 없다. 비경구 투여용 조성물은 또한 멸균, 실질적으로 등장성이며, GMP 조건 하에 제조된다.
일부 실시형태에서, 익상편 치료를 위한 안과 제형이다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드는 익상편을 치료하기 위한 안과 제형으로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 안과 제형은 결막 점막에 도포될 결막 국소 용도를 위한 임의의 제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 안과 제형은 안질환(예를 들어, 익상편)의 치료를 위한 액체 제제(예를 들어, 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액) 또는 고체 제제(예를 들어, 연고, 분말)이다. 일부 실시형태에서, 안과 제형은 연고이다. 일부 실시형태에서, 안과 제형은 크림이다. 일부 실시형태에서, 다른 물질은 항-산화제 및 점탄성 화합물 또는 비히클, 보존제, 완충제 용액, 삼투성 및 유화 물질(또는 장력활성)을 포함하는 제형 내 부형제로서 존재한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 부형제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 바셀린 및 더 양호한 내약성을 위해 사용될 수 있는 비이온성 유화 물질(또는 장력활성)(예컨대, 폴리솔베이트)을 포함한다. 일반적으로 6.4 내지 7.8 범위의 견딜 수 있는 pH, 멸균이며, 외인성 입자가 없고 대략 300 mOsm/ℓ 또는 약 200 내지 약 350mO sm/ℓ 정도의 눈물 등장성 삼투압을 갖는 국소 용도를 위한 안과 제형이 바람직하게 제조된다.
익상편을 치료하기 위한 수술 작업은 익상편 두부의 탈착 및 제거, 다음에 공막노출법의 앰플 부분을 남기거나 또는 각공막 가장자리까지 조직을 부착시키는 결막 봉합으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 결막 복원은 조직의 미끄러짐 또는 심지어 결막의 자가 이식을 통하는 것이 필수적이다. 이런 유형의 절차 후에, 가장 통상적인 수술후 합병증은 감염, 결막 낭종 또는 안구 움직임을 제한하는 유착 흉터를 포함한다. 수술 치료 후에, 증식 지수가 더 높고, 유병률은 사례의 10 내지 80% 범위인 더 공격적 형태의 재발이 발생할 수 있게 남아있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 점안액의 이용은 유리하다. 일부 실시형태에서, 이는 익상편 성장을 방지 또는 지연시키고, 수술 개입 및 수술 후 합병증에 대한 필연성을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 안과 화합물은 수성 또는 수용성 용매(예를 들어, 알코올) 중의 점안액, 겔, 크림 또는 연고로서 제형화된다. 예시적인 수성 용매는 인산염 또는 시트르산염 인산염 또는 TRIS 완충제 또는 히스티딘, 트라이신, 라이신, 글리신, 및/또는 세린을 함유하는 완충제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용매는 산성 또는 염기성 성분을 이용하여 정확한 생리적 pH로 조절된다. 일부 실시형태에서, 용해도 증가시키는 제제, 보존제, 점탄성 물질(바람직하게는 0.1 내지 10% v/v 범위에서)(예컨대, 히알루론산, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 지방산의 혼합물), 또는 셀룰로스(하이드록실-프로필-메틸 셀룰로스와 유사)이 존재한다. 잠재적으로는, 또한 1 내지 15% v/v 범위의 아스코르브산과 같은 항산화제 물질 및 EDTA와 같은 킬레이트제가 제형 중에 함유된다.
폴리펩타이드의 유효량을 결정함에 있어서, 최소 유해 부작용을 갖는 목적으로 하는 효과를 달성하기 위해 투여 경로, 방출 시스템의 동역학(예를 들어, 알약, 겔 또는 기타 기질), 및 제제의 효능이 고려된다. 본 발명의 폴리펩타이드의 투약량은 VEGF 또는 PDGF 길항제에 대해 효력 및/또는 효능에 따라 조절된다. 일부 실시형태에서, 용량은 약 0.001㎍ 내지 100㎎의 범위로 1일에 1 내지 20회로 주어지며, 총 1일 용량이 약 0.01㎍ 내지 100㎎까지이다. 일부 실시형태에서, 국소로 적용될 때, 전신 효과의 목적을 위해, 패치 또는 크림은 약 0.01㎍ 내지 100㎎ 범위로 용량의 전신 전달을 제공하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 전신 효과의 목적을 위해 주사된다면, 폴리펩타이드가 투여되는 기질은 약 0.001㎍ 내지 1㎎ 범위 용량의 전신 전달을 제공하도록 설계된다. 국소 효과 목적을 위해 주사된다면, 기질은 약 0.001㎍ 내지 100㎎ 범위의 VEGF 변이체 폴리펩타이드의 양을 국소로 방출하도록 설계된다.
일부 실시형태에서, 요법을 위해 본 명세서에 개시된 제제를 있는 그대로 사용할 수 있지만, 약제학적 제형으로서, 예를 들어, 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 실행과 관련하여 선택된 약제학적 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합하여 제제를 투여하는 것이 바람직하다. 약제학적 제형은 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체와 함께 적어도 1종의 활성 화합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용량 및 투여 빈도는, 예를 들어 본 방법으로 치료되는 병태의 질환의 임상 징후, 병리학적 징후 및 임상 및 준임상 증상뿐만 아니라 환자의 임상 이력을 고려하여 치료하는 의사의 판단에 기반하여 조절된다. 예를 들어, 환자가 익상편 또는 켈로이드 재발(예를 들어, 혈관 성장) 증상을 나타낼 때, 또는 환자가 이전의 익상편 또는 켈로이드 재발의 이력이 있다면, 더 고용량, 증가된 투여 빈도 또는 더 긴 치료의 지속기간이 표시된다.
폴리펩타이드의 제형은 진단 및 요법에서의 용도를 발견한다. 일부 실시형태에서, 제형은 1, 2개 이상의 폴리펩타이드 또는 제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료적 제형은 치료, 예를 들어, 화학요법, 방사선 요법, 수술 등의 다른 방법과 병용하여 투여된다.
일부 실시형태에서, 제형은 표적화된 부위에서 체류 및 안정화를 위해 최적화된다. 안정화 기법은 분자량 증가를 달성하기 위해 가교, 다량체화 또는 기에 대한 연결, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴아마이드, 중성 단백질 담체, Fc-융합 등에 의해 폴리펩타이드의 크기를 향상시키는 것을 포함한다. 체류를 증가시키기 위한 다른 전략은 생분해성 또는 생부식성 이식물 또는 바이오겔에서 또는 비생부식성 중합체 저장소에 의한 폴리펩타이드의 포착을 포함한다. 치료적 활성제의 방출 속도는 중합체 기질을 통한 운반 속도 및 이식물의 생분해에 의해 제어된다. 중합체 장벽을 통한 폴리펩타이드의 운반은 또한 약물에 대해 더 침투 가능한 중합체 장벽, 이식물의 기하학적 구조 등을 생성하기 위해 화합물 용해도, 중합체 친수성, 중합체 가교 정도, 물 흡수 시 중합체의 팽창에 의해 영향 받을 것이다. 이식물은 이식물의 부위로서 선택된 영역의 크기 및 형상에 비례한 치수를 가진다. 일부 실시형태에서, 이식물은, 예를 들어, 입자, 시트, 패치, 플라크, 섬유 또는 마이크로캡슐을 포함하며, 선택된 삽입 부위에 적합한 임의의 크기 또는 형상이다.
일부 실시형태에서, 안과 조성물은 익상편 치료를 위해 제형화된다. 일부 실시형태에서, 안과 제형은 결막 점막에 도포될 결막 국소 용도를 위한 임의의 제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 안과 제형은 안질환(예를 들어, 익상편)의 치료를 위한 액체 제제(예를 들어, 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액) 또는 고체 제제(예를 들어, 연고, 분말)이다. 일부 실시형태에서, 안과 제형은 연고이다. 일부 실시형태에서, 안과 제형은 크림이다. 일부 실시형태에서, 다른 물질은 항-산화제 및 점탄성 화합물 또는 비히클, 보존제, 완충제 용액, 삼투성 및 유화 물질(또는 장력활성)을 포함하는 제형 내 부형제로서 존재한다.
일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 부형제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 바셀린 및 더 양호한 내약성을 위해 사용될 수 있는 비이온성 유화 물질(또는 장력활성)(예컨대, 폴리솔베이트)을 포함한다. 일반적으로 6.4 내지 7.8 범위의 견딜 수 있는 pH, 멸균이며, 외인성 입자가 없고 대략 300 mOsm/ℓ 또는 약 200 내지 약 350 mOsm/ℓ 정도의 눈물 등장성 삼투압을 갖는 국소 용도를 위한 안과 제형이 바람직하게 제조된다. 일부 실시형태에서, 안과 화합물은 수성 또는 수용성 용매(예를 들어, 알코올) 중의 점안액, 겔, 크림 또는 연고로서 제형화된다. 예시적인 수성 용매는 인산염 또는 시트르산염 인산염 또는 TRIS 완충제 또는 히스티딘, 트라이신, 라이신, 글리신, 및/또는 세린을 함유하는 완충제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용매는 산성 또는 염기성 성분을 이용하여 정확한 생리적 pH로 조절된다. 일부 실시형태에서, 용해도 증가시키는 제제, 보존제, 점탄성 물질(바람직하게는 0.1 내지 10% v/v 범위에서)(예컨대, 히알루론산, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 지방산의 혼합물), 또는 셀룰로스(하이드록실-프로필-메틸 셀룰로스와 유사)이 존재한다. 잠재적으로는, 또한 1 내지 15% v/v 범위의 아스코르브산과 같은 항산화제 물질 및 EDTA와 같은 킬레이트제가 제형 중에 함유된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 안장애의 치료가 필요한 대상체에서 안장애, 예를 들어 익상편을 치료하는 방법이 개시된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 대상체에게 본 발명의 폴리펩타이드 및 추가적인 치료제의 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 혈관 내피 성장인자(VEGF), 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 또는 앤지오텐신(ANG), 및 관련 수용체의 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 인테그린의 저해제, 또는 기질 메탈로프로테이나제(MMP)의 저해제 또는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 항체, 폴리펩타이드, 뉴클레오타이드, 소분자 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 미토마이신 C(MMC), 5-플루오로유라실(5-FU), 로테프레드놀 에타보네이트(LE), 경구 독시사이클린, 다이피리다몰 및 도베실레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 항염증 스테로이드이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 비스테로이드성 항염증제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 VEGF 신호전달의 항체 또는 소분자 저해제이다. 일부 실시형태에서, 추가적인 치료제는 이미 생성된 VEGF의 효과에 결합하거나, 가두거나, 스캐빈지하거나 또는 방해한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 및 추가적인 치료제는 일원화된 투약 형태로 또는 별개의 투약 형태로 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 치료 절차와 병용하여 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 투여를 포함한다. 상가적 또는 상승적 이점을 제공하는 절차는 방사선조사(예를 들어, 90Sr 요법), 결막 자가이식 또는 양막 이식 또는 수술을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
단지 예로서, 본 명세서에 기재된 치료제 중 하나의 치료적 유효성은 애주번트의 투여에 의해 향상된다(즉, 애주번트 단독으로 최소의 치료적 이점을 갖지만, 다른 치료제와 병용하여, 환자에 대한 전반적인 치료적 이점이 향상된다). 또는, 단지 예로서, 개체에 의해 경험되는 이점은 또한 치료적 이점을 갖는 다른 치료제와 함께(또는 치료적 요법을 포함함) 본 명세서에 기재된 치료제 중 하나를 투여함으로써 증가된다. 임의의 경우에, 치료될 질환 또는 장애와 관계없이, 환자에 의해 경험되는 전반적인 이점은 단순히 두 치료제에 상가적이거나, 또는 다른 실시형태에서, 환자는 상승적 이점을 경험한다.
사용되는 제제의 특정 선택은 담당 의사의 진단 및 환자 병태의 그들의 판단 및 적절한 치료 프로토콜에 의존할 것이다. 제제는 선택적으로 장애의 특성, 환자의 병태 및 사용되는 제제의 실제 선택에 따라서 일제히(예를 들어, 동시에, 본질적으로 동시에 또는 동일한 치료 프로토콜 내에) 또는 순차적으로 투여된다. 투여 순서의 결정, 및 치료 프로토콜 동안 각각의 치료제 투여의 반복 수는 치료 중인 질환의 평가 및 환자의 병태에 기반한다.
일부 실시형태에서, 약물이 치료 조합에서 사용될 때 치료적으로 유효한 투약량은 다르다. 치료 요법과 병용하여 사용하기 위한 약물 및 다른 제제의 치료적으로 유효한 투약량을 실험적으로 결정하는 방법은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 메트로노믹(metronomic) 투약의 사용, 즉, 독성 부작용을 최소화하기 위해 더 빈번하고, 더 낮은 용량을 제공하는 것은 문헌에 광대하게 기재되었다. 병용 요법은 추가로 환자의 임상 관리를 보조하기 위해 다양한 시간에 시작 및 중단되는 주기적 치료를 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 생분해성 물질을 포함하는 안과 장치 내로 혼입되며, 상기 장치는 안구 병태, 예컨대 익상편의 장기간(예를 들어, 약 1주 이상, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 이상) 치료를 제공하기 위해 대상체에게 이식된다. 이러한 장치는 대상체의 안구 또는 안구 주위 조직에서 이식된다.
본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 이용하여 병태를 치료하는 방법은 수술적 치료 방법 이상으로 그리고 기존의 생물학적 제제 이상으로 이점을 제공한다. 초기 또는 진행된 익상편에 대해 비수술적 개입은 존재하지 않는다. 더 나아가, 혈관 및 섬유성 조직 성분의 제거에서 완전히 성공적이라고 하더라도, 수술은 익상편의 재발을 예방할 수 없다. 익상편의 절단을 위한 반복적인 침습적 수술은 상당한 위험을 운반한다. 따라서, 존재하는 익상편의 성장을 제어하고/하거나 수술적 절단 후 익상편의 재발을 방지하는 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물이 유리하다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 수술 동안 및/또는 수술 직후에, 예컨대 병변내 주사, 결막하 주사, 또는 익상편 부위에 또는 근처에 대한 다른 직접적 적용에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료 과정은 상기 요소, 예컨대 주사 또는 다른 기법에 의한 수술 동안 및/또는 수술 후 투여 + 수술 후 며칠, 몇 주 및/또는 몇 개월에 가정(병원 밖)에서 투여되는 점안액 또는 다른 국소 투여 수단을 조합한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 수술 대신 병태를 치료하기 위해, 병태의 진행을 멈추거나 또는 퇴행을 유도하기 위해 사용된다. 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물이 특히 유효한 것으로 나타났다면, 다르게는 익상편 수술을 택한 환자 및 의사는 비용, 시간, 통증 및 수술 위험을 피하기 위해 수술 대신에 약제학적 조성물 단독을 이용하는 치료를 선택할 수 있다. 수술 없이 약제학적 조성물로부터 유익을 얻는 다른 환자 부류는 수술의 자격을 얻지 못한 환자, 수술을 감당할 수 없는 환자 및 수술의 자격은 있지만 받지 않는 것으로 선택한 환자를 포함한다. 둘째로, 약제학적 조성물은 특히, 과거 및 현재 기법에서 허용 가능하지 않게 높은 재발률, 또는 안구 조직 이식 또는 전달을 포함하는 매우 복잡한 형태의 수술에 대한 필요 때문에 재발을 예방하기 위해 수술 동안 및/또는 후에 사용될 수 있었다.
일부 실시형태에서, 치료 방법은 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 투여와 조합된 전문적 개입을 수반한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 치료 방법은 처음에 익상편 표면층, 예컨대 상피 또는 표피 섬유아세포층의 좌멸 괴사 조직 제거술, 다음에 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 투여를 수반한다. 투여는 국소 또는 병변내일 수 있다. 일부 실시형태에서, 좌멸 괴사 조직 제거술은 내피 세포, 섬유아세포 또는 다른 세포를 폴리펩타이드의 항-혈관형성, 항-성장 및/또는 항-이동 효과에 노출시킴으로써 또는 병변 내로 그들의 침투를 다르게 향상시킴으로써 약제학적 조성물의 효과를 가능하게 하거나 또는 향상시키는 더 단순하고, 덜 비싸며, 더 짧고, 더 저위험의 개입이다.
기존의 생물제제는 그들의 효능을 선천적으로 제한하는 신생혈관생성을 매개하는 리간드-수용체 상호작용의 서브세트만을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드는 다중 수용체를 표적화하며, 더 소수의 단일 표적을 표적화하는 제제에 비해 우수한 효능을 나타낸다. 더 나아가, 폴리펩타이드 조성물은 가용성 성장인자 스캐폴드를 이용하며, 항체, 항체 단편 또는 항체 Fc 도메인에 융합된 수용체 세포외 도메인인 기존의 생물제제(50 내지 150kDa)에 비교할 때 크기가 상당히 더 작다(25kDa). 따라서, 기존의 생물제제의 큰 크기가 주사(결막하)를 통한 전달을 필요로 하는 반면, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 국소로 투여된다. 이는 환자에서 순응도 부하 및 치료 비용의 상당한 감소를 나타낸다.
이상적으로는, 수술후이든, 재발률을 감소시키든, 또는 수술 대신이든, 진행을 중단시키거나 퇴행을 유도하든, 익상편에 대한 치료는 점성겔 또는 연고와 같은 국소 점안액 또는 다른 유사한 제형과 같이 용이하고 안전하게 투여될 것이다. 바람직한 치료 방법은 치료 과정 당 1회 또는 1개월 당 1회만큼 빈번하지 않게 자가 투여되는 국소 점안액이다. 더 빈번한 자가 투여 국소 제형은 덜 바람직하지만 여전히 매우 만족스러운데, 그것이 주사 시간, 통증 및 위험을 여전히 회피하기 때문이다. 예를 들어, 점안액, 겔 또는 연고는 병원 밖에서 1주 1회, 1주 2회, 1일 1회 또는 1일 2회 또는 1일 3회 또는 1일 4회 적용된다.
투여 경로
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 국소로 또는 비경구로, 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 적합한 방법에 의해 투여된다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 안과용 국소 제형; 안과용 주사용 제형; 또는 안과용 이식물과 함께 사용을 위해 제형화된다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 결막하 주사 또는 병변내 주사를 통해 투여된다. 일부 실시형태에서 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 눈에 국소로 투여된다.
용어 "비경구"는 비히클 또는 장치(예를 들어, 정맥내, 결막하, 테논낭하, 공막외, 공막내, 공막하, 복강내, 경막외, 척추 강내, 근육내, 내강내, 기관내, 상피, 진피내, 진피하 또는 피하)를 통해 주사 또는 침착을 포함하거나 또는 지속 방출된다. 게다가, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 병용 요법으로 투여되는 상이한 제제는 상이한 경로로 투여된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 눈 또는 피부에 주사되거나 또는 국소로 적용된다. 항염증성 스테로이드 및/또는 NSAID는 전신으로(예를 들어, 주사에 의해), 경구로 및/또는 국소로, 예를 들어, 눈 또는 피부에 투여된다. 투여 방법의 비제한적 예는 주사, 정맥내 주사, 및 주입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여는 피하 투여이다. 일부 실시형태에서, 투여는, 예를 들어, 정맥내 주사, 볼루스 주사, 5분 내지 약 5시간에 걸쳐 주입, 알약, 캡슐, 경피 패치, 협측 전달 등 또는 이들의 조합과 같은 임의의 경로 실행을 통한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 국소 투여, 전신 투여, 안구주위 주사, 또는 유리체내 주사를 통해 제형에 혼입된다. 일부 실시형태에서, 주사용 유리체내 제형은 활성 성분의 지속 방출, 예컨대 약 1주 이상(또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 이상) 동안 활성 성분의 지속 방출을 제공하는 담체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지속 방출 제형은 바람직하게는 유리체에서 불용성이거나 또는 단지 드물게 가용성인 담체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 담체는 오일계 액체, 에멀전, 겔 또는 반고체이다. 오일계 액체의 비제한적 예는 피마자유, 땅콩유, 올리브유, 코코넛유, 참깨유, 면실유, 옥수수유, 해바라기유, 어간유, 낙화생유 및 액체 파라핀을 포함한다.
일 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 미세-게이지 바늘, 예컨대 25 내지 34 게이지를 이용하여 익상편 또는 이의 진행을 치료 또는 예방하기 위해 유리체내로, 예를 들어 모양체의 편평부를 통해 주사된다.
다른 양상에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 생분해성 물질을 포함하는 안과 장치 내로 혼입되며, 상기 장치는 안구 병태의 장기간(예를 들어, 약 1주 이상, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개월 이상) 치료를 제공하기 위해 대상체에게 이식된다. 이러한 장치는 대상체의 안구 또는 안구 주위 조직에서 이식된다.
일부 실시형태에서, 치료 방법은 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 투여와 조합된 전문적 개입을 수반한다.
본 명세서에 기재된 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 이용하여 병태를 치료하는 방법은 통상적인 요법 이상으로 이점을 제공한다. 예를 들어, 익상편에 대해, 초기 또는 진행된 익상편에 대해 비-수술 개입은 존재하지 않는다. 더 나아가, 혈관 및 섬유성 조직 성분의 제거에서 완전히 성공적이라고 하더라도, 수술은 익상편의 재발을 예방할 수 없다. 익상편의 절단을 위한 반복적인 침습적 수술은 상당한 위험을 운반한다. 따라서, 존재하는 익상편의 성장을 제어하고/하거나 수술적 절단 후 익상편의 재발을 방지하는 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물이 유리하다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합을 포함하는 약제학적 조성물 혈관형성 장애를 치료하기 위해 수술 동안 및/또는 수술 직후에, 예컨대 병변내 주사, 결막하 주사, 또는 수술 부위에 또는 근처에 대한 다른 직접적 적용에 의해 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료 과정은 상기 요소, 예컨대 주사 또는 다른 기법에 의한 수술 동안 및/또는 수술 후 투여 + 수술 후 며칠, 몇 주 및/또는 몇 개월에 가정(병원 밖)에서 투여되는 점안액 또는 다른 국소 투여 수단을 조합한다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합을 포함하는 약제학적 조성물 수술 대신 병태를 치료하기 위해, 병태의 진행을 멈추거나 또는 퇴행을 유도하기 위해 사용된다. VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합을 포함하는 약제학적 조성물이 특히 유효한 것으로 나타났다면, 다르게는 익상편 수술을 택한 환자 및 의사는 비용, 시간, 통증 및 수술 위험을 피하기 위해 수술 대신에 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합을 포함하는 약제학적 조성물 단독을 이용하는 치료를 선택할 수 있다. 수술 없이 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합을 포함하는 약제학적 조성물이 유리한 다른 환자 부류는 수술의 자격을 얻지 못한 환자, 수술을 감당할 수 없는 환자 및 수술의 자격은 있지만 받지 않는 것으로 선택한 환자를 포함한다. 둘째로, VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합을 포함하는 약제학적 조성물은 특히, 과거 및 현재 기법에서 허용 가능하지 않게 높은 재발률, 또는 안구 조직 이식 또는 전달을 포함하는 매우 복잡한 형태의 수술에 대한 필요 때문에 재발을 예방하기 위해 수술 동안 및/또는 후에 사용될 수 있었다.
일부 실시형태에서, 치료 방법은 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합을 포함하는 약제학적 조성물의 투여와 조합된 전문적 개입을 수반한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 치료 방법은 처음에 수술 개입, 예컨대 익상편에 대한 괴사 조직 제거 후에 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합을 포함하는 약제학적 조성물의 투여를 수반한다. 일부 실시형태에서, 수술 개입은, 예컨대 내피 세포, 섬유아세포, 또는 다른 세포를 내피 세포, 섬유아세포 또는 다른 세포를 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합의 항-혈관형성, 항-성장 및/또는 항-이동 효과에 노출시킴으로써 또는 그들의 침투를 다르게 향상시킴으로써, 예컨대 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합을 포함하는 약제학적 조성물의 효과를 가능하게 하거나 또는 향상시킨다.
기존의 항-VEGF 치료는 그들의 투여 방법에 기인하여 비이상적이다. 기존의 생물제제는 그들의 효능을 선천적으로 제한하는 신생혈관생성을 매개하는 리간드-수용체 상호작용의 서브세트만을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 VEGF 변이체 폴리펩타이드 및 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합은 다중 수용체를 표적화하며, 더 소수의 단일 표적을 표적화하는 제제에 비해 우수한 효능을 나타낸다. 더 나아가, VEGF 변이체 폴리펩타이드 및 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합 조성물은 가용성 성장인자 스캐폴드, (VEGF 그 자체)를 이용하며, 항체, 항체 단편 또는 항체 Fc 도메인에 융합된 수용체 세포외 도메인인 기존의 생물제제(50 내지 150kDa)에 비교할 때 크기가 상당히 더 작다(25kDa). 따라서, 기존의 생물제제의 큰 크기가 주사(결막하)를 통한 전달을 필요로 하는 반면, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합을 포함하는 약제학적 조성물은 국소로 투여된다. 이는 환자에서 순응도 부하 및 치료 비용의 상당한 감소를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 국소 점안액 또는 점성 겔 또는 연고와 같은 다른 유사한 제형으로서 투여된다. 일부 실시형태에서, 국소 점안액은 경구는 치료 과정 당 1회 또는 1개월 당 1회만큼 빈번하지 않게 자가 투여되는 국소 점안액이다. 일부 실시형태에서, 국소 점안액은 1주 1회, 1주 2회, 1일 1회 또는 1일 2회 또는 1일 3회 또는 1일 4회 적용된다.
투약 및 치료 요법
일부 실시형태에서, 대상체, 특히 인간에게 투여되는 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 용량은 합리적인 시간에 걸쳐 대상체에서 신생혈관생성의 치료적 감소를 달성하는 데 충분하다. 일부 실시형태에서, 용량은 사용되는 특정 펩타이드의 효능 및 대상체의 병태뿐만 아니라 치료될 대상체의 체중에 의해 결정된다. 용량의 크기는 또한 특정 화합물의 투여를 수반하는 임의의 유해한 부작용의 존재, 특성 및 정도에 의해 결정될 것이다.
치료에서 사용하는 데 필요한 본 명세서에 개시된 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 양은 투여 경로, 치료가 필요한 병태의 특성, 및 환자의 연령, 체중 및 병태에 따라 다를 것이며, 궁극적으로 담당의사 또는 수의사의 재량에 의한다는 것이 인식될 것이다. 조성물은 전형적으로 유효량의 활성제(들)를 단독으로 또는 조합하여 함유할 것이다. 일부 실시형태에서, 예비 용량은 동물 시험에 따라 결정되며, 인간 투여를 위한 투약량의 조정은 당업계에서 허용되는 관행에 따라 수행된다.
VEGF 변이체 폴리펩타이드의 유효량을 결정함에 있어서, 최소 유해 부작용을 갖는 목적으로 하는 효과를 달성하기 위해 투여 경로, 방출 시스템의 동역학(예를 들어, 알약, 겔 또는 기타 기질), 및 길항제의 효능이 고려된다.
VEGF 변이체 폴리펩타이드의 투약량은 VEGF 길항제에 대해 효력 및/또는 효능에 따라 조절된다. 일부 실시형태에서, 용량은 약 0.001㎍ 내지 100㎎의 범위로 1일에 1 내지 20회로 주어지며, 총 1일 용량이 약 0.01㎍ 내지 100㎎까지이다. 일부 실시형태에서, 국소로 적용될 때, 전신 효과의 목적을 위해, 패치 또는 크림은 약 0.01㎍ 내지 100㎎ 범위로 용량의 전신 전달을 제공하도록 설계된다. 일부 실시형태에서, 전신 효과의 목적을 위해 주사된다면, VEGF 변이체 폴리펩타이드가 투여되는 기질은 약 0.001㎍ 내지 1㎎ 범위 용량의 전신 전달을 제공하도록 설계된다. 국소 효과 목적을 위해 주사된다면, 기질은 약 0.001㎍ 내지 100㎎ 범위의 VEGF 변이체 폴리펩타이드의 양을 국소로 방출하도록 설계된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 대한 투약량 범위는 당업자에 의해 결정되고, 예를 들어, 당업계에 공지된 표준 방법에 따라 투약량, 안전성 및 효능을 결정하기 위해 동물 모델에서 처음 결정된다.
일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체 체중(㎏) 당 VEGF 변이체 폴리펩타이드(㎎)로서 표현된다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 1 내지 1,000㎎/㎏, 1 내지 500㎎/㎏, 1 내지 250㎎/㎏, 1 내지 100㎎/㎏, 1 내지 50㎎/㎏, 1 내지 25㎎/㎏, 또는 1 내지 10㎎/㎏이다. 일부 실시형태에서, 유효량은 5㎎/㎏, 10㎎/㎏, 25㎎/㎏, 50㎎/㎏, 75㎎/㎏, 100㎎/㎏, 150㎎/㎏, 200㎎/㎏, 250㎎/㎏, 300㎎/㎏, 400㎎/㎏, 500㎎/㎏, 600㎎/㎏, 700㎎/㎏, 800㎎/㎏, 900㎎/㎏, 1,000㎎/㎏, 약 5㎎/㎏, 약 10㎎/㎏, 약 25㎎/㎏, 약 50㎎/㎏, 약 75㎎/㎏, 약 100㎎/㎏, 약 150㎎/㎏, 약 200㎎/㎏, 약 250㎎/㎏, 약 300㎎/㎏, 약 400㎎/㎏, 약 500㎎/㎏, 약 600㎎/㎏, 약 700㎎/㎏, 약 800㎎/㎏, 약 900㎎/㎏, 또는 약 1,000㎎/㎏이다.
일부 실시형태에서, 치료적 유효량은 대상체 신체 면적의 평방 미터 당 화합물(㎎)로서 표현된다. 일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은, 예를 들어 1 내지 1500㎎(0.6 내지 938㎎/㎡), 또는 2 내지 800㎎(1.25 내지 500㎎/㎡), 또는 5 내지 500㎎(3.1 내지 312㎎/㎡), 또는 2 내지 200㎎(1.25 내지 125㎎/㎡) 또는 10 내지 1000㎎(6.25 내지 625㎎/㎡), 구체적 예는 하기를 포함하여, 10㎎(6.25㎎/㎡), 20㎎(12.5㎎/㎡), 50㎎(31.3㎎/㎡), 80㎎(50㎎/㎡), 100㎎(62.5㎎/㎡), 200㎎(125㎎/㎡), 300㎎(187.5㎎/㎡), 400㎎(250㎎/㎡), 500㎎(312.5㎎/㎡), 600㎎(375㎎/㎡), 700㎎(437.5㎎/㎡), 800㎎(500㎎/㎡), 900㎎(562.5㎎/㎡) 및 1000㎎(625㎎/㎡)의 용량 범위에서 피하로 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 예방적 및/또는 치료적 처치를 위해 투여된다. 치료적 적용에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 적어도 장애 증상을 치료 또는 적어도 부분적으로 저지하는 데 충분한 양으로 장애로 이미 고통 받는 개체에게 투여된다. 이 용도에 유효한 양은 장애의 중증도 및 과정, 이전의 요법, 환자의 건강 상태, 체중 및 약물에 대한 반응, 및 치료하는 의사의 판단에 의존할 것이다.
예방적 적용에서, 본 명세서에 기재된 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 특정 질환 또는 장애에 걸리기 쉽거나 또는 다르게는 위험에 있는 개체에게 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효량 또는 용량"인 것으로 정의된다. 이 용도에서, 정확한 양은 또한 환자의 건강 상태, 체중 등에 의존한다. 개체에서 사용될 때, 이런 용도에 대한 유효량은 질환, 장애의 중증도 및 과정, 이전의 요법, 환자의 건강 상태 및 약물에 대한 반응, 및 치료하는 의사의 판단에 의존할 것이다.
일부 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 환자에게 정기적 기준, 예를 들어, 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 격일 또는 3일마다 투여된다. 다른 실시형태에서, VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 간헐적 기준, 예를 들어, 1일 2회 다음에 1일 1회, 이어서 1일 3회; 또는 매주 처음 2일; 또는 1주의 첫날, 둘째 날 및 셋째 날에 환자에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 간헐적 투약은 주기적 투약만큼 유효하다. 환자의 병태가 개선되지 않는 경우에, 의상의 재량으로, VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 투여는 환자 장애의 증상을 개선 또는 다르게 제어 또는 제한하기 위해 만성으로, 즉, 환자 수명의 지속기간 내내를 포함하는 장기간의 시간 동안 투여된다.
환자의 상태가 개선된 경우에, 의사의 재량으로, VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 투여는 연속적으로 주어지며; 대안적으로, 투여될 약물의 용량은 특정 시간 길이(즉, "휴약기") 동안 일시적으로 감소되거나 또는 일시적으로 연기된다. 일부 실시형태에서, 휴약기의 길이는 단지 예로서, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 35일, 50일, 70일, 100일, 120일, 150일, 180일, 200일, 250일, 280일, 300일, 320일, 350일, 또는 365일을 포함하는, 2일 내지 1년으로 다르다. 휴약기 동안의 용량 감소는 10% 내지 100%이며, 단지 예로서, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 포함한다.
일단 환자 병태의 개선이 일어난다면, 필요한 경우 유지 용량이 투여된다. 후속적으로, 투약량 및 투여 빈도 또는 둘 다는 증상의 함수로서, 개선된 질환, 장애가 보유되는 수준까지 감소될 수 있다. 일부 실시형태에서, 환자는 증상의 임의의 재발 시 장기간 기준으로 간헐적 치료가 필요하다.
이러한 양에 대응할 주어진 제제의 양은 인자, 예컨대, 치료가 필요한 대상체의 장애 및 그의 중증도, 동일성(예를 들어, 체중)에 따라 다를 것이며, 예를 들어, 투여 중인 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 특정 약제학적 조성물, 투여 경로, 치료 중인 병태 및 치료 중인 대상체 또는 숙주를 포함하는 경우 주변의 특정 상황에 따라 결정된다. 목적으로 하는 용량은 단일 용량으로 또는 동시에 투여되는 분할된 용량으로(단기간의 시간에 걸쳐) 또는 적절한 간격으로, 예를 들어 1일 당 2, 3, 4회 이상의 부분 용량으로 편리하게 제공된다.
영상화
특정 실시형태에서, 본 명세서에 하기 단계들을 포함하는 혈관형성 장애의 진단이 필요한 대상체에서 혈관형성 장애를 진단하는 방법이 개시된다: (a) 대상체로부터의 생물학적 샘플을 바이오마커에 결합하는 본 발명의 표지된 혼성 폴리펩타이드와 접촉시키는 단계; (b) 바이오마커에 결합된 표지된 VEGF 변이체 폴리펩타이드의 양을 측정함으로써 생물학적 샘플 내 바이오마커의 양을 결정하는 단계; (c) 생물학적 샘플 내 바이오마커의 결정된 양을 대조군 내 바이오마커의 양과 비교하는 단계; 및 (d) 비교에 기반하여 대상체를 혈관형성 장애를 갖는 것으로 진단하는 단계.
일부 실시형태에서, 표지 제제는 표지, 염료, 광가교제, 세포독성 화합물, 약물, 친화도 표지, 광친화도 표지, 반응성 화합물, 항체 또는 항체 단편, 생체물질, 나노입자, 스핀표지, 형광단, 금속-함유 모이어티, 방사성 모이어티, 신규 작용기, 다른 분자와 공유적 또는 비공유적으로 상호작용하는 기, 포토케이지된(photocaged) 모이어티, 화학선 방사선 여기성 모이어티, 리간드, 광이성질체화 가능한 모이어티, 바이오틴, 바이오틴 유사체, 중원자를 혼입하는 모이어티, 화학적으로 절단 가능한 기, 광절단성 기, 산화환원-활성제, 동위원소 표지된 모이어티, 생물리적 프로브, 인광성기, 화학발광기, 전자밀집기, 자기기, 개재기, 발색단, 에너지 전이제, 생물학적 활성제, 검출 가능한 표지, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 형광단은 보디피(BODIPY) 493/503, 보디피 FL, 보디피 R6G, 보디피 530/550, 보디피 TMR, 보디피 558/568, 보디피 564/570, 보디피 576/589, 보디피 581/591, 보디피 TR, 플루오레세인, 5(6)-카복시플루오레세인, 2,7 -다이클로로플루오레세인, N,N-비스(2,4,6-트라이메틸페닐)-3,4:9,10-페릴렌비스(다이카복스이미드, HPTS, 에틸 에오신, DY-490XL, DY-485XL 메가스토케스(MegaStokes), 아디론닥 그린(Adirondack 그린) 520, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 495, YOYO-1, 5-FAM, BCECF, BCECF, 다이클로로플루오레세인, 로다민 110, 로다민 123, 로다민 그린, YO-PRO-1, SYTOX 그린, 나트륨 그린, SYBR 그린 I, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 500, FITC, 플루오-3, 플루오-4, 플루오로-에메랄드, 요요(YoYo)-1 ssDNA, 요요-1 dsDNA, 요요-1, SYTO RNA셀렉트(RNASelect), 다이버사 그린-FP, 그래곤 그린, 에바그린, Surf 그린 EX, 스펙트럼 그린, 오리건(Oregon) 그린 488, 뉴로트레이스(NeuroTrace) 500525, NBD-X, 미토트랙커(MitoTracker) 그린 FM, 라이소트랙커(LysoTracker) 그린 DND-26, CBQCA, PA-GFP(활성화 후), WEGFP(활성화 후), FlASH-CCXXCC, 아자미(Azami) 그린 단량체, 아자미 그린, EGFP(Campbell Tsien 2003), EGFP(Patterson 2001), 플루오레세인, 카에데(Kaede) 그린, 7-벤질아미노-4-나이트로벤즈-2-옥사-1,3-다이아졸, Bex1, 독소루비신, 루미오 그린, IRDye 메가스토케스 800, IRDye 750, IRDye 700, DyLight 680, DyLight 755, DyLight 800 및 수퍼글로(SuperGlo) GFP로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 표지 제제는 양전자-방출 동위원소(예컨대, 18F), 감마선 동위원소(예컨대, 99mTc), 상자성 분자 또는 나노입자(예컨대, 코팅된 자기 나노입자), 가돌리늄 킬레이트(예컨대, 다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(DTPA), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA) 및 1,4,7-트라이아자사이클로노난-N,N',N''-트라이아세트산(NOTA)), 산화철 입자, 초상자성 산화철 입자, 극소형 상자성 입자, 망간 킬레이트, 갈륨 함유제, 테크네튬 킬레이트(예컨대, HYNIC, DTPA, 및 DOTA), 구리 킬레이트, 방사성 플루오린, 방사성 요오드, 인듐 킬레이트 또는 방사성 모이어티(예컨대, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 64Cu, Lu의 방사성 동위원소)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 연결 모이어티는 VEGF 변이체 폴리펩타이드에 표지 제제를 연결한다. 일부 실시형태에서, 연결 모이어티는 결합, 펩타이드, 중합체, 수용성 중합체, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬알켄일, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬알켄일알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 연결 모이어티는 4'-포스포판테테인이다.
일부 실시형태에서, 형광단은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 보디피 493/503, 보디피 FL, 보디피 R6G, 보디피 530/550, 보디피 TMR, 보디피 558/568, 보디피 564/570, 보디피 576/589, 보디피 581/591 및 보디피 TR. 일부 실시형태에서, 형광단은 보디피 FL이다. 일부 실시형태에서, 형광단은 보디피 530이 아니다. 일부 실시형태에서, 형광단은 여기 최대값이 약 500 내지 약 600㎚이다. 일부 실시형태에서, 형광단은 여기 최대값이 약 500 내지 약 550㎚이다. 일부 실시형태에서, 형광단은 여기 최대값이 약 550 내지 약 600㎚이다. 일부 실시형태에서, 형광단은 여기 최대값이 약 525 내지 약 575㎚이다. 일부 실시형태에서, 형광단은 방출 최대값이 약 510 내지 약 670㎚이다. 일부 실시형태에서, 형광단은 방출 최대값이 약 510 내지 약 600㎚이다. 일부 실시형태에서, 형광단은 방출 최대값이 약 600 내지 약 670㎚이다. 일부 실시형태에서, 형광단은 방출 최대값이 약 575 내지 약 625㎚이다.
일부 실시형태에서, 형광단은 플루오레세인 또는 인도사이아닌 그린이다.
일부 실시형태에서, 형광단은 ATTO 488, DY-547 또는 DY-747이다.
일부 실시형태에서, 표지 제제는 양전자 단층 촬영(PET)을 위한 양성자-방출 동위원소(예를 들어, 18F), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)을 위한 감마선 동위원소(예를 들어, 99mTc), 또는 자기공명영상(MRI)을 위한 상자성 분자 또는 나노입자(예를 들어, Gd3+ 킬레이트 또는 코팅된 자철석 나노입자)이다.
일부 실시형태에서, 표지 제제는 가돌리늄 킬레이트, 산화철 입자, 초상자성 산화철 입자, 극소형 상자성 입자, 망간 킬레이트 또는 갈륨 함유제이다. 가돌리늄 킬레이트의 예는 다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(DTPA), 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA), 및 1,4,7-트라이아자사이클로노난-N,N',N''-트라이아세트산(NOTA)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 표지 제제는 근적외선(near-IR) 영상화를 위한 근적외선 형광단, 루시퍼라제(반딧불이, 박테리아 또는 강장동물) 또는 생발광 이미징을 위한 다른 발광 분자, 또는 초음파를 위한 퍼플루오로탄소-충전 소수포이다.
일부 실시형태에서, 표지 제제는 핵 프로브이다. 일부 실시형태에서, 조영제는 SPECT 또는 PET 방사성핵종 프로브이다. 일부 실시형태에서, 방사성핵종 프로브는 테크네튬 킬레이트, 구리 킬레이트, 방사성 플루오린, 방사성 요오드, 인듐 킬레이트로부터 선택된다. Tc 킬레이트의 예는 HYNIC, DTPA 및 DOTA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 표지 제제는 방사성 모이어티, 예를 들어 방사성 동위원소, 예컨대 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 64Cu, Lu의 방사성 동위원소 및 기타이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 펩타이드 서열 DSLEFIASKLA에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 Sfp 태그를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 표지된 혼성체 폴리펩타이드는 혼성 폴리펩타이드, 연결 모이어티 및 표지 제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 연결 모이어티는 폴리펩타이드에 표지 제제를 연결한다. 일부 실시형태에서, 연결 모이어티는 결합, 펩타이드, 중합체, 수용성 중합체, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 헤테로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬, 선택적으로 치환된 사이클로알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬알킬, 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬알켄일, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 및 선택적으로 치환된 헤테로사이클로알킬알켄일알킬로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 연결 모이어티는 선택적으로 치환된 헤테로사이클이다. 일부 실시형태에서, 헤테로사이클은 아지리딘, 옥시란, 에피설파이드, 아제티딘, 옥세탄, 피롤린, 테트라하이드로퓨란, 테트라하이드로티오펜, 피롤리딘, 피라졸, 피롤, 이미다졸, 트라이아졸, 테트라졸, 옥사졸, 아이소옥사졸, 옥시렌, 티아졸, 아이소티아졸, 다이티올란, 퓨란, 티오펜, 피페리딘, 테트라하이드로피란, 티안, 피리딘, 피란, 티아피란, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 피페라진, 옥사진, 티아진, 다이티안 및 다이옥산으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 헤테로사이클은 피페라진이다. 추가 실시형태에서, 연결 모이어티는 할로겐, CN, OH, NO2, 알킬, S(O) 및 S(O)2로 선택적으로 치환된다. 다른 실시형태에서, 수용성 중합체는 PEG기이다.
일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 안구 신혈관 형성, 맥락막 신혈관 형성, 홍채 신혈관 형성, 각막 신혈관 형성, 망막 신혈관 형성, 익상편, 판누스, 검열반, 당뇨망막병증, 당뇨성 황반부종, 망막 박리, 뒤포도막염, 황반변성, 켈로이드, 녹내장, 백내장, 부분 색맹, 완전 실명, 근시, 근시변성, 중심시의 악화, 변시증, 색 왜곡, 혈관 출혈 또는 망막 혈관 폐쇄이다.
일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 전립선암, 유방암, 폐암, 식도암, 결장암, 직장암, 간암, 요로암(예를 들어, 방광암), 신장암, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암), 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 위암, 갑상선암, 피부암(예를 들어, 흑색종), 림프구 또는 골수성 계열의 조혈암, 두경부암, 비인두암(NPC), 교모세포종, 기형암종, 신경아세포종, 선암종, 간엽 유래의 암, 예컨대 섬유육종 또는 횡문근육종, 연조직 육종 및 암종, 융모막 암종, 간아세포종, 카포시 육종 또는 윌름 종양이다.
일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 염증성 장애이다. 일부 실시형태에서, 염증성 장애는 염증성 관절염, 골관절염, 건선, 만성 염증, 과민성 장 질환, 폐 염증 또는 천식이다. 일부 실시형태에서, 혈관형성 장애는 자가면역 장애이다. 일부 실시형태에서, 자가면역 장애는 류마티스 관절염, 다발성 경화증 또는 전신 홍반 루푸스이다.
일부 실시형태에서, 바이오마커는 혈관형성 장애의 바이오마커이다. 일부 실시형태에서, 성장인자 수용체는 혈관 내피 성장인자 수용체(VEGFR)이다. 일부 실시형태에서, VEGFR은 VEGFR1 또는 VEGFR2이다. 일부 실시형태에서, 성장인자 수용체는 PDGFR-α 또는 PDGFR-β이다.
일부 실시형태에서, 바이오마커는 바이오마커의 조합물이다. 일부 실시형태에서, 바이오마커의 조합물은 VEGFR1, VEGFR2, PDGFR-α 및 PDGFR-β를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이오마커에 결합된 표지 혼성 폴리펩타이드의 양을 측정하는 것은 검출 방법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출 방법은 웨스턴 블롯, 면역침강법, 효소결합 면역흡착 분석(ELISA), 면역조직화학 및 방사면역측정법으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 검출 방법은 스펙트럼 분석, 광화학, 생화학, 방사선학적, 면역화학적, 화학적, 전기적 및 광학적 검출 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 검출 방법은 표지 제제의 농도 또는 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 조직을 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 익상편 조직을 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플은 생체내 또는 생체밖이다.
본 발명은 또한 (a) 대상체로부터의 제1 생물학적 샘플을 바이오마커에 결합하는 본 발명의 표지된 혼성 폴리펩타이드와 접촉시키고, 바이오마커에 결합된 표지 폴리펩타이드의 양을 측정함으로써, 제1 생물학적 샘플 내 바이오마커의 양을 결정하는 단계; (b) 대상체에게 치료제를 투여한 후에 대상체로부터의 제2 생물학적 샘플을 표지된 폴리펩타이드와 접촉시키고, 바이오마커에 결합된 표지된 폴리펩타이드의 양을 측정함으로써, 제2 생물학적 샘플 내 바이오마커의 양을 결정하는 단계; 및 (c) 제1 및 제2 생물학적 샘플 내 바이오마커 양의 비교에 기반하여 요법에 대해 대상체가 양성, 음성 또는 중성 반응을 갖는지의 여부를 결정하는 단계를 포함하는 혈관형성 장애의 치료를 위한 요법에 대해 대상체의 반응을 평가하는 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 제1 생물학적 샘플 내 바이오마커의 양은 치료제, 예를 들어 본 발명의 치료적 혼성 폴리펩타이드에 의한 치료 전에 결정된다. 일부 실시형태에서, 제2 생물학적 샘플 내 바이오마커의 양은 치료제에 의한 치료 요법의 완료 후, 예를 들어 치료 요법의 완료 후 1주, 2주, 1개월, 2개월 또는 6개월에 결정된다.
일부 실시형태에서, 샘플 또는 대조군 내 바이오마커의 양을 결정하는 것은 생체내 영상화, 비침습적 또는 침습적을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플 또는 대조군 내 바이오마커의 양을 결정하는 것은 생체밖 영상화를 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 샘플을 생검 샘플 또는 흡인 샘플이다.
진단 대조군의 선택은 대조군의 유형(양성 또는 음성), 생물학적 샘플의 유형 및 영상화가 생체내 또는 생체밖인지 여부에 의존한다. 예를 들어, 생물학적 샘플이 눈인 경우(신생혈관생성-관련 안장애의 생체내 선별에 대해), 일부 실시형태에서, 음성 대조군은 대상체의 건강하고, 병에 걸리지 않은 눈이다. 일부 실시형태에서, 음성 대조군은 건강한, 비관련 눈의 집단 중에 존재하는 바이오마커의 평균 농도이며, 대상체는 신생혈관생성을 수반하는 임의의 질환 또는 병태로 고통받지 않는다는 것이 알려져 있다. 바이오마커 농도의 생체밖 결정, 예컨대 생검 샘플 내 바이오마커 양의 결정을 위해, 일부 실시형태에서, 대조군은 시작일에 취한 생검 샘플이다. 일부 실시형태에서, 대조군은 생물학적 샘플로서 치료가 실시된다.
일부 실시형태에서, 진단 부재, 진단 존재 또는 혈관형성 장애, 예를 들어, 신생혈관생성 관련 장애의 바이오마커의 양 변화는 요법이 유효할지의 여부, 또는 요법이 효과를 갖는지의 여부의 예측이다. 개체는 진단에 따라 본 발명의 혼성 폴리펩타이드에 의해 치료될 수 있다.
키트
특정 실시형태에서, 본 명세서에서 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 키트가 개시된다.
키트는, 유형과 상관없이, 일반적으로 생물학적 제제가 놓이고, 바람직하게는 분취된 하나 이상의 용기를 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, 키트의 부품은 수성 매질 중에 또는 동결건조 형태로 패키징된다.
추가 실시형태에서, 본 발명은, 예를 들어, 치료적 또는 비치료적 적용을 위해 사용되는 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드를 함유하는 키트를 제공한다. 키트는 라벨이 있는 용기를 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어, 보틀, 바이알 및 시험관을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성된다. 용기는 상기 기재한 바와 같이 치료적 또는 비치료적 용도에 효과적인 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 보유한다. 용기 상의 라벨은 조성물이 특정 요법 또는 비치료적 용도를 위해 사용된다는 것을 나타내며, 또한 생체내 또는 시험관내 용도를 위한 방향, 예컨대 상기 기재한 것을 나타낸다.
키트는 전형적으로 상기 기재한 용기 및 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기 및 사용을 위한 설명서와 함께 포장 삽입물을 포함하는, 상업적 및 사용자 견지로부터 바람직한 물질을 포함하는 하나 이상의 다른 용기를 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, 키트는 또한 야생형 VEGF로 이루어진 대조군을 포함한다.
실시예
실시예 1　- 단일 사슬 VEGF 변이체의 생성
2개의 단량체 VEGF 사슬이 가요성 링커를 통해 물리적으로 테터링된 VEGF의 단일 사슬 변이체(scVEGF로 칭해짐)를 생성하였다. scVEGF 내로 점 돌연변이를 도입하여(사슬 1: F17A, E64G; 사슬 2: I46A, I83A) 이 극에 대한 결합으로부터 VEGFR2의 제2 분자를 차단함으로써 이 변이체에 길항제 활성을 부여한 scVEGFMUT를 생성하였다. 일단 단일 사슬 VEGF 변이체가 확립되면, 9 내지 11개 아미노산 인테그린 결합 루프를 잔기 83 내지 89(즉, 루프 3) 대신에 scVEGF 내로 도입하였는데, 이는 상기 기재한 점 돌연변이와 동일한 극 상에서 VEGFR2 대신 인테그린 수용체에 대한 결합을 (잠재적으로) 허용하기 위해 이 극 상에 있다.
실시예 2 - 단일 사슬 VEGF 길항제의 조작된 최적 링커
단백질 발현 수율 및 내피 세포에 대한 결합 친화도를 개선시키기 위해 scVEGF-mE7I(서열번호 75) 작제물 상에서 단량체 A의 C-말단을 단량체 B의 N-말단에 연결하는 링커 모이어티를 최적화하였다. 상이한 길이 및 조성의 3개 링커를 설계하였고, 본래의 링커 서열에 따라 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타낸 링커는 임의의 2차 구조를 형성하는 것으로 예상되지 않은 글리신 및 세린 잔기를 이용하고, 또한 더 낮은 면역원성을 갖는 것으로 알려져 있다.
Figure pct00002
L1A, L2A 또는 L3A 중 하나를 포함하는 작제물의 소규모 발현을 생성하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 더 긴 링커 L1A 및 L3A는 고수율의 목적으로 하는 단백질을 얻었다(대략 30kDa으로 나타냄). L3A는 글리신 및 세린 잔기만을 포함하고, 따라서 (L1A에 비해) 면역원성에 대해 더 낮은 잠재력을 갖기 때문에, 최적화된 링커로서 선택하였다. 본래의 링커를 지니는 작제물에 비해 L3A을 지니는 최종 수율의 총 개선은 대략 2 내지 3배였다.
L3A을 포함하는 작제물의 표적 결합 친화도를 본래의 링커를 지니는 작제물(scVEGFmE7I, 서열번호 75)에 비교하기 위해 인간 내피 세포에 대한 세포 결합 분석을 수행하였다. 도 2에 나타내는 바와 같이, 본래의 링커를 포함하는 scVEGF-mE 작제물은 KD가 0.32 ± 0.07 nM인 반면, L3A 링커를 포함하는 scVEGF-mE 작제물은 KD가 0.16 ± 0.06 nM이었는데, 이는 대략 2-배 개선을 나타낸다.
실시예 3 - 고친화도 결합을 위한 최소 세트 돌연변이의 동정
scVEGFmutE 작제물은 7개의 돌연변이를 포함하고; 사슬 1은 F36L, E44G, D63G 및 Q87R에서 돌연변이를 포함하며, 사슬 2는 K16R, D41N 및 D63N에서 돌연변이를 포함한다. 고친화도 결합에 최소 세트의 돌연변이가 필요하다는 것을 동정하기 위해, 27개 돌연변이체의 라이브러리를 생성하였고(각각 7개 위치에서 잔기가 독립적으로 scVEGFmutE 또는 야생형 scVEGF에서 발견된 잔기 중 하나가 되도록 허용되는 경우), 프로브로서 적절한 양의 가용성 VEGFR2-Fc를 이용하여 효모 상의 VEGFR2 결합에 대해 시험하였다. VEGFR2에 대해 고친화도 결합을 보유한 효모 집단의 분석(도 3)은 돌연변이 사슬 1 F36L, 사슬 1E44G, 사슬 1Q87R, 및 사슬 2 D63N이 풍부한 반면, 사슬 1 D63G, 사슬 2 K16R 및 사슬 2 D41N은 그렇지 않다는 것을 나타내었다. 사슬 1 E44G 및 사슬 2 D63N이 보편적으로 풍부한 한편, 사슬 1 F36L 및 사슬 1 Q87R은 강하게 풍부하였다. 이들 결과는 돌연변이의 다음의 세트를 나타낸다: 사슬 1 F36L, 사슬 1E44G, 사슬 1Q87R 및 사슬 2 D63N은, 고친화도 VEGFR2 결합을 부여하기 위해 필수적이며 충분하다.
실시예 4 - scVEGF 작제물의 Fc-융합
1) 전신 투여에 의해 순환 반감기를 개선시키는 신장 컷오프 이상으로 크기를 증가시킴으로써 치료제의 덜 빈번한 투약을 허용하기 위해, 그리고 2) 더 강력한 활성을 위한 면역계 상보체 및 효과기 기능에 영향을 미치기 위해 scVEGF 작제물을 Fc 융합에 의해 변형시켰다. 모 scVEGF에서와 같이 보유된 결합 친화도에 대해, 그리고 모 scVEGF의 보유된 길항제 활성에 대해 scVEGF-Fc 융합을 시험하였다.
첫째로, 인간 내피 세포(HUVEC)에 대한 세포 결합 분석에서 scVEGF 작제물을 평가하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, scVEGF-Fc 융합의 결합 친화도는 모 scVEGF에 비해(돌연변이 0 곡선 및 돌연변이 곡선과 비교) 변하지 않는다. 추가로, scVEGF는 2개의 상이한 세포 표면 수용체(VEGFR 및 인테그린)에 결합하기 때문에, 이량체인 대응하는 Fc-융합은 총 4개의 수용체에 결합할 것이다. 얻어진 입체 무리가 결합에 영향을 미치는지의 여부를 시험하기 위해, scVEGF 및 Fc 도메인의 융합 접점에서 다양한 길이의 Gly4Ser 링커를 시험하였다. 0, 1 또는 3개의 Gly4Ser 반복부(도 4에서 71.0 대 71.1 대 71.3으로서 나타냄)를 갖는 3가지 상이한 링커 길이를 시험하고, 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 따라서, 일부 실시형태에서, scVEGF를 Fc 영역에 직접 융합한다.
다음에, scVEGF-Fc 융합 작제물을 HUVEC에 대한 인산화 분석에서의 길항제 활성에 대해 평가하였다(도 5). 칼럼 4 및 5는 양성 및 음성 대조군(각각 칼럼 1 및 2)에 비교할 때 Fc-융합이 작용제가 아니라는 것을 입증한다. 칼럼 6 및 7의 양성 및 음성 대조군(각각 칼럼 1 및 2)과의 비교는 Fc-융합이 scVEGF 등가물(칼럼 6 및 7을 칼럼 5에 비교)과 유사한 길항제 활성을 보유한다는 것을 입증하였다.
실시예 5 - VEGFR1에 대한 scVEGF 작제물 결합의 특성규명
모 작제물 scVEGFMUT(mut)의 결합 및 길항제 특성을 친화도 성숙 변이체 scVEGFMUT-E(mE, 서열번호 55)의 결합 및 길항제 특성과 비교하였다. 이하의 표 3에 나타내는 바와 같이, mut로부터 mE에 이르기까지 R1/R2 선택성의 12배 변화를 관찰하였다. 그럼에도 불구하고, 친화도 성숙 변이체 scVEGFMUT - E는 550 pM의 친화도로 VEGFR1에 대한 결합을 보유하였다.
Figure pct00003
실시예 2 - scVEGF에 의한 bFGF-신혈관 형성의 치료
bFGF-유도 각막 신혈관 형성 모델을 문헌[Kenyon et. al (1996) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:1625]에 의해 앞서 기재한 바와 같이, 100ng의 bFGF/펠렛을 이용하고, 시험할 제제에 의해 펠렛을 제형화하고, 펠렛 이식 후 6일에 신혈관 형성 정도를 측정하는 것을 포함하여, 약간 변형해서 수행하였다. 결과를 도 6에 제시한다. 서열번호 75의 scVEGF 변이체 폴리펩타이드는 모든 시험 용량에서 신혈관 형성을 저해할 수 있었다. 특히, 이는 모든 시험 용량에서 임상적으로 승인된 신생혈관생성 저해제만큼 강력하거나 또는 더 강력하였다. 더 나아가, scVEGF 변이체 폴리펩타이드는 또한, VEGFR1 결합이 VEGFR2 결합을 동시에 보유하는 것으로 알려진 돌연변이의 유도를 통해 제거된 대응하는 변이체(서열번호 78)보다 더 강력하였다.
실시예 3
안구 질환에서 항신생혈관 치료적 개입을 위한 바이오마커의 동정
임상적으로 나타난 익상편 제거 수술을 겪은 동의 환자로부터 얻은 조직 표본을 후속적으로 혈관형성 혈관구조의 마커에 대해 시험하였다.
파라핀 가공, 포매 전에 조직을 포말린 중에서 고정시키고, 수퍼프로스트 플러스(Superfrost Plus) 슬라이드 상에서 5㎛로 절편화하였다. 익상편 조직 절편을 자일렌 중에서 탈파라핀화하고 나서, 물에 대해 등급화된 알코올 시리즈를 통해 재수화시켰다. 슬라이드에 시트르산나트륨 완충제 중의 열-매개 항원 회수를 실시하였다. 슬라이드를 PBS 중에서 3 x 5분 세척하고, 이어서, 차단을 위해 실온에서 3시간 동안 1% BSA와 함께 PBS 중의 10% 정상 염소 혈청 중에서 인큐베이션시켰다. 이어서, 염색 오버레이를 달성하기 위해 종을 달리하여 두 항체의 칵테일을 상승시키면서 각각의 절편을 4℃에서 12시간 동안 인큐베이션시켰다. 폰빌레브란트 인자(vWF)에 대한 항체, CD31, VEGFR1, VEGFR2, β3 인테그린(αvβ3 인테그린에 대한 프로브에 대해), β5 인테그린(αvβ5 인테그린에 대한 프로브에 대해), α5 인테그린(α5β1 인테그린에 대한 프로브에 대해), 프로-MMP2 및 MMP2를 사용하였다. 모든 항체 희석을 위해 1% BSA와 함께 PBS를 사용하였다. 이어서, 슬라이드를 PBS 중에서 3 x 5분 동안 세척하고 나서, 각각 마우스 및 토끼에 비해 염소에서 상승된 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488 및 알렉사 플루오르 594 컨쥬게이팅된 항체 중에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 슬라이드를 PBS 중에서 3 x 5분 동안 세척하고 나서, 4'-6-다이아미디노-2-페닐인돌(DAPI)-함유 벡타쉴드(Vectashield) 장착 배지를 이용하여 장착하였다.
적절한 필터 세트를 지니는 악시오이미저(AxioImager) Z1 형광현미경 상에서 10x 플라나포크로마트(Plan Apochromat) 대물렌즈를 이용하여 형광 이미지를 캡처하였다. 각각의 항원에 대한 노출 시간은 샘플을 거쳐서 일정하였다. 젠 블루 소프트웨어(Zen Blue software)를 이용하여, 항원의 모든 이미지는 동일한 선형 밝기 및 콘트라스트 조절을 수용하였다.
형광 이미지는 도 7 내지 12에 나타낸 바와 같다. 도 7은 인간 익상편에서 폰빌레브란트 인자(vWF) 및 VEGFR2의 면역조직화학적 염색을 예시한다. 도 8은 인간 익상편에서 vWF 및 VEGFR1의 면역조직화학적 염색을 예시한다. 도 9는 인간 익상편에서 αvβ3 및 VEGFR2의 면역조직화학적 염색을 예시한다. 도 10은 인간 익상편에서 CD31 및 α5β1 인테그린의 면역조직화학적 염색을 예시한다. 도 11은 인간 익상편에서 CD31 및 αvβ5 인테그린의 면역조직화학적 염색을 예시한다. 도 12는 인간 익상편에서 MMP2, 프로-MMP2 및 CD31의 면역조직화학적 염색을 예시한다. 모든 경우에, 시험한 모든 마커에 의한 우세한 염색을 관찰하였다. 상당하게는, 모든 경우에 이 염색은 내피 세포(vWF 또는 CD31)의 알려진 마커에 의해 공동 국소화되었는데, 이들 마커의 발현은 내피 세포와 관련된다는 것을 확인한다. 더 나아가, MMP2에 대한 상보적 특이성을 지니는 항체를 이용함으로써, 본 발명자들은 MMP2의 활성 형태만이 내피 세포에 대한 마커와 함께 공동국소화한다는 것을 나타낼 수 있었다. 특히, 활성 MMP2와 프로-MMP2를 둘 다 검출할 수 있는 항체는 우세한 혈관 염색을 나타내었다(도 7 상부 좌측 패널). 대조적으로, 프로-MMP2 형태를 배타적으로 인식하는 항체는 대응하는 혈관에 대해 임의의 시각적 염색을 나타내지 않았다(도 7 상부 우측 패널).
실시예 4- 익상편에 의해 VEGF 변이체 폴리펩타이드를 이용하는 임상 시험
이 연구의 목적은 본 명세서에 개시된 VEGF 변이체 폴리펩타이드가 익상편 성장을 중단시키거나 또는 퇴행을 야기할 수 있는지의 여부를 조사하는 것이다. VEGF 변이체 폴리펩타이드는 6개월 동안 1일 1회 익상편 성장에 대해 직접적으로 국소로 적용한다.
연구 유형: 중재
연구 설계: 중재 모델: 단일 그룹 배정
마스킹: 개방 표지
1차적 목적: 치료
1차 결과 측정: VEGF 변이체 폴리펩타이드 투여; 시간: 기준 및 3개월 전에 그리고 후에 경계로부터 측정하여 익상편 면적은 확대 또는 퇴행되었다.
익상편의 성장은 시각적 축에 대해 경계로부터 측정하여 익상편 면적의 증가로서 나타낸다.
익상편의 퇴행은 시간축에 대해 경계로부터 측정하여 익상편 길이의 감소로서 나타낸다.
2차 결과 측정: 익상편을 수술적으로 제거한 환자의 수; 시간: 12개월
적격성: 연구에 적격인 연령: 19세 이상; 연구에 적격인 성별: 양성 모두; 건강한 지원자의 수용: 없음
포함 기준: 19세 이상; 익상편의 진단; 계획된 후속 방문을 하기에 충분히 건강함
제외 기준 임신가능성이 있는 여성 및 연구 참여 동안 아이를 계획 중인 남성을 연구로부터 제외할 것이다.
서열번호
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
SEQUENCE LISTING <110> THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY <120> VEGF Variant Polypeptide Compositions <130> WO/2016/115511 <140> US2016/013688 <141> 2016-01-15 <150> US 62/104,590 <151> 2015-01-16 <150> US 62/104,588 <151> 2015-01-16 <150> US 62/104,621 <151> 2015-01-16 <160> 78 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 1 Pro Phe Gly Thr Arg Gly Asp Ser Ser 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 2 Ser Gly Glu Arg Gly Asp Gly Pro Thr 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 3 Ser Asp Gly Arg Gly Asp Gly Ser Val 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 4 Pro Ile Gly Arg Gly Asp Gly Ser Thr 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 5 Leu Ala Glu Arg Gly Asp Ser Ser Ser 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55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro Tyr Gln Gly Gln His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly Glu 100 105 110 Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile 115 120 125 Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Lys Ile Glu Tyr 130 135 140 Ala Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys 145 150 155 160 Asn Asn Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr 165 170 175 Met Gln Ile Thr Arg Ala Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu 180 185 190 Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp 195 200 205 <210> 55 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 55 Glu Val Val Lys Ala Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Leu Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Gly 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Gly Ala Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Arg Gly Gln His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly Glu 100 105 110 Val Val Arg Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile 115 120 125 Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asn Glu Ile Glu Tyr 130 135 140 Ala Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys 145 150 155 160 Asn Asn Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr 165 170 175 Met Gln Ile Met Arg Ala Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu 180 185 190 Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp 195 200 205 <210> 56 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 56 Glu Ala Val Lys Ala Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Asp Ala Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Arg Gly Gln His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Glu 100 105 110 Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile 115 120 125 Glu Thr Leu Val Asp Val Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr 130 135 140 Ala Ser Glu Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys 145 150 155 160 Asn His Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr 165 170 175 Met Gln Ile Met Arg Ala Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu 180 185 190 Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp 195 200 205 <210> 57 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 57 Glu Val Val Lys Ala Met Gly Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Ser Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Asp Ala Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly His Arg Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asp Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly Glu 100 105 110 Val Val Arg Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile 115 120 125 Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr 130 135 140 Ala Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys 145 150 155 160 Asn Asn Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr 165 170 175 Met Gln Ile Val Arg Ala Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu 180 185 190 Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp 195 200 205 <210> 58 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 58 Glu Val Val Lys Ala Met Asp Val Tyr Arg Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Val Glu Thr Ser Val Asp Ile Leu Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Asp Ala Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Thr 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro Tyr Arg Gly Gln His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly Glu 100 105 110 Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile 115 120 125 Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr 130 135 140 Ala Phe Lys Pro Ser Cys Val Ser Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys 145 150 155 160 Asn Asn Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr 165 170 175 Val Gln Ile Met Gly Ala Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu 180 185 190 Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp 195 200 205 <210> 59 <211> 208 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 59 Glu Val Ala Lys Ala Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Leu Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Gly 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Asp Ala Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly His Arg Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asp Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly Glu 100 105 110 Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile 115 120 125 Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr 130 135 140 Ala Phe Lys Leu Pro Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Ser Gly Tyr Cys 145 150 155 160 Asn Asn Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr 165 170 175 Met Gln Ile Met Arg Ala Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu 180 185 190 Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp 195 200 205 <210> 60 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 60 Glu Val Val Lys Ala Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Asp Ala Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly Glu 100 105 110 Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile 115 120 125 Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr 130 135 140 Ala Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys 145 150 155 160 Asn Glu Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr 165 170 175 Met Gln Ile Met Arg Pro His Asp Arg Gly Asp Ala Gly Val His Ile 180 185 190 Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys 195 200 205 Lys Asp 210 <210> 61 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 61 Glu Val Val Lys Ala Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Asp Ala Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly Glu 100 105 110 Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile 115 120 125 Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr 130 135 140 Ala Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys 145 150 155 160 Asn Glu Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr 165 170 175 Met Gln Ile Met Arg Pro Gly Gly Arg Gly Asp Ser Ala Tyr His Ile 180 185 190 Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys 195 200 205 Lys Asp 210 <210> 62 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 62 Glu Val Val Lys Ala Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Asp Ala Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly Glu 100 105 110 Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile 115 120 125 Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr 130 135 140 Ala Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys 145 150 155 160 Asn Glu Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr 165 170 175 Met Gln Ile Met Arg Pro Ser Val Arg Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser 180 185 190 His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg 195 200 205 Pro Lys Lys Asp 210 <210> 63 <211> 210 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 63 Glu Val Val Lys Ala Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Asp Ala Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Ser Ser Glu Gly Lys Gly Glu 100 105 110 Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile 115 120 125 Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr 130 135 140 Ala Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys 145 150 155 160 Asn Glu Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr 165 170 175 Met Gln Ile Met Arg Pro Ala Ser Arg Gly Asp Ser Pro Pro His Ile 180 185 190 Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys 195 200 205 Lys Asp 210 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 64 Ile Lys Pro His Gln Gly Gln 1 5 <210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 65 Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys 1 5 10 <210> 66 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 66 Pro Ser Val Arg Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser 1 5 10 <210> 67 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 67 Pro Thr Thr Arg Gly Asp Cys Pro Asp 1 5 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 68 Pro Gly Gly Arg Gly Asp Ser Ala Tyr 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 69 Pro His Asp Arg Gly Asp Ala Gly Val 1 5 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 70 Ser Thr Asp Arg Gly Asp Ala Ser Ala 1 5 <210> 71 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 71 Ala Ser Gly Arg Gly Asp Gly Gly Val 1 5 <210> 72 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 72 Pro Ala Ser Arg Gly Asp Ser Pro Pro 1 5 <210> 73 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 73 Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu 20 25 30 Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys 35 40 45 Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu 50 55 60 Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile 65 70 75 80 Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe 85 90 95 Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg 100 105 110 Gln Glu Lys Cys Asp Lys Pro Arg Arg 115 120 <210> 74 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 74 Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp <210> 75 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 75 Glu Val Val Lys Ala Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Leu Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Gly 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Gly Ala Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Arg Gly Gln His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Arg Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg 115 120 125 Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr 130 135 140 Pro Asn Glu Ile Glu Tyr Ala Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met 145 150 155 160 Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asn Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr 165 170 175 Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Pro Ser Val Arg Arg 180 185 190 Gly Asp Ser Pro Ala Ser His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His 195 200 205 Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp 210 215 <210> 76 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 76 Glu Val Ala Lys Ala Met Asp Val Tyr Gln Lys Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Leu Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Gly 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Asp Ala Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro Tyr Gln Gly Gln His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg 115 120 125 Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr 130 135 140 Pro Asp Lys Ile Glu Tyr Ala Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met 145 150 155 160 Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asn Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr 165 170 175 Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Thr Arg Pro Ser Val Arg Arg 180 185 190 Gly Asp Ser Pro Ala Ser His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His 195 200 205 Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp 210 215 <210> 77 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 77 Glu Ile Val Lys Ala Arg Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Leu Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Asp Ala Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro Tyr Gln Gly His His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg 115 120 125 Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr 130 135 140 Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ala Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met 145 150 155 160 Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asn Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr 165 170 175 Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Pro Ser Val Arg Arg 180 185 190 Gly Asp Ser Pro Ala Ser His Thr Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His 195 200 205 Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp 210 215 <210> 78 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 78 Glu Val Val Lys Ala Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro 1 5 10 15 Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Leu Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Gly 20 25 30 Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys 35 40 45 Cys Asn Gly Ala Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile 50 55 60 Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His Arg Gly Gln His Ile Gly 65 70 75 80 Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys 85 90 95 Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Val Arg Phe Glu Asp Val Leu Arg Arg 115 120 125 Ser Ser Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr 130 135 140 Pro Asn Glu Ile Glu Tyr Ala Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu Met 145 150 155 160 Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asn Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr 165 170 175 Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Pro Ser Val Arg Arg 180 185 190 Gly Asp Ser Pro Ala Ser His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His 195 200 205 Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp 210 215

Claims (45)

  1. 하기 식을 포함하는 VEGF 변이체 폴리펩타이드:
    A-L-B
    식 중,
    A는 제1 VEGF 단량체 서브유닛이고;
    B는 제2 VEGF 단량체 서브유닛이며; 그리고
    L은 하기로부터 선택된 식을 갖는 펩타이드 링커이다: (GS)n(n은 6 내지 15의 정수임); (G2S)n(n은 4 내지 10의 정수임); (G3S)n(n은 3 내지 8의 정수임); (G4S)n(n은 2 내지 6의 정수임); (G)n(n은 12 내지 30의 정수임); 및 (S)n(n은 12 내지 30의 정수임).
  2. 제1항에 있어서, 하기 식을 포함하는, VEGF 변이체 폴리펩타이드:
    A-L1-B-(L2-A-L1-B)n-L2-A-L1-B
    식 중,
    A는 제1 VEGF 단량체 서브유닛이고,
    B는 제2 VEGF 단량체 서브유닛이며,
    L1은 14 내지 20개의 아미노산을 갖는 펩타이드 링커이고;
    L2는 펩타이드 링커이며; 그리고
    n은 0 내지 4의 정수이다.
  3. 제2항에 있어서, L1은 하기로부터 선택된 식을 갖는 펩타이드 링커인, VEGF 변이체 폴리펩타이드: (GS)n(n은 6 내지 15의 정수임); (G2S)n(n은 4 내지 10의 정수임); (G3S)n(n은 3 내지 8의 정수임); (G4S)n(n은 2 내지 6의 정수임); (G)n(n은 12 내지 30의 정수임); 및 (S)n(n은 12 내지 30의 정수임).
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, L 또는 L1은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된, VEGF 변이체 폴리펩타이드: GSTSGSGKSSEGKGGGGGS(서열번호 42); GGGGSGGGGSGGGG(서열번호 43); 및 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44).
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, L2는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된, VEGF 변이체 폴리펩타이드: (GS)n(n=10 내지 30); (G2S)n(n= 6 내지 20); (G3S)n(n= 5 내지 15); (G4S)n(n= 4 내지 12); (G)n(n= 20 내지 60); 및 (S)n(n =20 내지 60).
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 2작용성 길항제인, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 VEGFR, 인테그린 또는 이들의 조합물을 길항하는, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 VEGFR은 VEGFR1 또는 VEGFR2인, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  9. 제7항에 있어서, 상기 인테그린은 αvβ3, αvβ5 또는 α5β1 인테그린, 또는 이들의 임의의 조합인, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF 단량체 서브유닛 중 적어도 하나는 VEGF-A 단량체인, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 VEGF-A 단량체는 VEGF165; VEGF165b; VEGF121; VEGF145; VEGF189; VEGF206 중 하나인, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF 단량체 서브유닛 중 적어도 하나는 VEGF-B 서브유닛; VEGF-C 서브유닛; VEGF-D 서브유닛; PlGF인, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VEGF 단량체 서브유닛 및 상기 제2 VEGF 단량체 서브유닛은 각각 독립적으로 VEGF-A 단량체인, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  14. 제13항에 있어서, 하나의 VEGF 단량체 서브유닛은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, VEGF 변이체 폴리펩타이드: V14A, V14I, V15A, K16R, F17L, M18R, D19G, Q22R, R23K, I29V, L32S, I35V, F36L, F36S, D41N, E42K, E44G, Y45H, F47S, K48E, P49L, S50P, P53S, G58S, C60Y, D63H, D63N, D63G, I76T, M78V, M81T, M81V, R82G, H86Y, Q87R, Q89H, H90R, I91T, I91V, N100D, 및 K101E.
  15. 제14항에 있어서, 하나의 VEGF 단량체 서브유닛은 F36L, E44G, D63G 및 Q87R로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  16. 제14항에 있어서, 하나의 VEGF 단량체 서브유닛은 F36L, E44G 및 Q87R로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  17. 제14항에 있어서, 하나의 VEGF 단량체 서브유닛은 V14A, V14I, V15A, K16R, F17L, M18R, D19G, Q22R, R23K, I29V, L32S, I35V, F36L, F36S, D41N, E42K, E44G, Y45H, F47S, K48E, P49L, S50P, P53S, G58S, C60Y, D63H, D63N, D63G, I76T, M78V, M81T, M81V, R82G, H86Y, Q87R, Q89H, H90R, I91T, I91V, N100D 및 K101E로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  18. 제14항에 있어서, 상기 VEGF 단량체 서브유닛은 K16R, D41N 및 D63N으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  19. 제14항에 있어서, 상기 VEGF 단량체 서브유닛은 D63N 돌연변이를 포함하는, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VEGF 단량체 서브유닛 또는 상기 제2 VEGF 단량체 서브유닛 또는 둘 다는 RGD 루프를 포함하는, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  21. 제20항에 있어서, 상기 RGD 루프는 서열번호 1 내지 40, 66 내지 72로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일한, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 RGD 포함 루프는 상기 제1 VEGF 단량체 서브유닛 또는 상기 제2 VEGF 단량체 서브유닛, 또는 이들의 임의의 조합의 루프 1, 루프 2, 또는 루프 3을 대체하는, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 mE7I(서열번호 75); mA7I(서열번호 76); mJ7I(서열번호 77); 또는 mE7I-R1null(서열번호 78)의 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 동일한, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VEGF 변이체 폴리펩타이드는 독소를 더 포함하는, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  25. (a) 다음의 돌연변이를 갖는 제1 VEGF-A 단량체 서브유닛: F36L, E44G 및 Q87R, (b) 다음의 돌연변이를 갖는 제2 VEGF-A 단량체 서브유닛: D63N, 및 (c) 상기 제1 VEGF-A 단량체 및 상기 제2 VEGF-A 단량체에 결합하는 펩타이드 링커 또는 이황화 브릿지를 포함하는, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, L 또는 L1의 길이가 약 14 내지 20개의 아미노산인, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  27. 제26항에 있어서, L 또는 L1은 GSTSGSGKSSEGKG(서열번호 41); GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 44); GSTSGSGKSSEGKGGGGGS(서열번호 42); GGGGSGGGGSGGGG(서열번호 43)에 대해 적어도 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는, VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  28. 제2항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, L2는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된, VEGF 변이체 폴리펩타이드: (GS)n(여기서, n=10 내지 30); (G2S)n(여기서, n= 6 내지 20); (G3S)n(여기서, n= 5 내지 15); (G4S)n(여기서, n= 4 내지 12); (G)n(여기서, n= 20 내지 60); 및 (S)n(여기서, n =20 내지 60).
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 폴리펩타이드는 면역글로불린 Fc 영역에 융합되는, Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드.
  30. 혈관형성 장애의 치료가 필요한 개체에서 혈관형성 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 개체에게 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 VEGF 변이체 폴리펩타이드 또는 제29항에 따른 Fc-VEGF 변이체 폴리펩타이드 융합을 투여하는 단계를 포함하는, 혈관형성 장애를 치료하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 혈관형성 장애는 익상편인, 혈관형성 장애를 치료하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 혈관형성 장애는 안구의 신혈관 형성, 맥락막 신혈관 형성, 홍채 신혈관 형성, 각막 신혈관 형성, 망막 신혈관 형성, 검열반, 판누스, 당뇨망막병증(DR), 당뇨성 황반부종(DME), 망막 박리, 뒤포도막염, 당뇨망막병증, 황반변성, 예를 들어, 노인성 황반변성(AMD), 특히 습성 황반변성, 켈로이드, 녹내장, 백내장, 부분 색맹, 완전 실명, 근시, 근시변성, 중심시의 악화, 변시증, 색 왜곡, 혈관 출혈, 또는 이들의 조합인, 혈관형성 장애를 치료하는 방법.
  33. 제30항에 있어서, 상기 혈관형성 장애는 암인, 혈관형성 장애를 치료하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 암은 전립선암, 유방암, 폐암, 식도암, 결장암, 직장암, 간암, 요로암(예를 들어, 방광암), 신장암, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암), 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 췌장암, 위암, 갑상선암, 피부암(예를 들어, 흑색종), 림프구 또는 골수성 계열의 조혈암, 두경부암, 비인두암(NPC), 교모세포종, 기형암종, 신경아세포종, 선암종, 간엽 유래의 암, 예컨대 섬유육종 또는 횡문근육종, 연조직 육종 및 암종, 융모막 암종, 간아세포종, 카포시 육종 또는 윌름 종양인, 혈관형성 장애를 치료하는 방법.
  35. 제30항에 있어서, 상기 혈관형성 장애는 염증성 장애인, 혈관형성 장애를 치료하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 염증성 장애는 염증성 관절염, 골관절염, 건선, 만성 염증, 과민성 장 질환, 폐 염증 또는 천식인, 혈관형성 장애를 치료하는 방법.
  37. 제30항에 있어서, 상기 혈관형성 장애는 자가면역 장애인, 혈관형성 장애를 치료하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 또는 전신 홍반 루푸스인, 혈관형성 장애를 치료하는 방법.
  39. 제30항에 있어서, 상기 혈관형성 장애는 죽상동맥경화증, 후수정체 섬유 증식증, 갑상선 과형성(그레이브스병을 포함), 신증후군, 자간전증, 복수, 심낭수(예컨대, 심낭염과 관련) 및 흉수인, 혈관형성 장애를 치료하는 방법.
  40. 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애의 비수술적 치료를 필요로 하는 대상체의 각막 및 안구결막을 포함하는 눈의 외면의 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애를 비수술적으로 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 눈의 외면의 신혈관 형성을 특징으로 하는 장애를 비수술적으로 치료하는 방법.
  41. 신혈관 형성의 재발 예방이 필요한 대상체의 각막 및 안구결막을 포함하는 눈의 외면의 신혈관 형성 재발을 예방하는 방법으로서, 상기 대상체에게 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 눈의 외면의 신 혈관 형성의 재발을 예방하는 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 안과적으로 허용 가능한 용액, 겔, 크림 또는 연고로서 제형화되는, 방법.
  43. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 눈의 상기 외면의 신혈관형성을 특징으로 하는 상기 장애는 익상편인, 방법.
  44. 검출 가능한 모이어티를 더 포함하는 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물.
  45. 조직을 제44항의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 조직의 영상화 방법.
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