KR20170100071A

KR20170100071A - 인자 Ｘａ 저해제에 대한 안티도트 및 그것을 사용하는 방법

Info

Publication number: KR20170100071A
Application number: KR1020177023761A
Authority: KR
Inventors: 건민 루; 데이비드 알 필립스; 파트릭 앙드레; 우마 신하
Original assignee: 포톨라 파마슈티컬스, 인코포레이티드
Priority date: 2007-09-28
Filing date: 2008-09-26
Publication date: 2017-09-01
Also published as: FR20C1045I2; NL301063I2; US20120269788A1; US20140079684A1; NO2020033I1; WO2009042962A2; NZ583944A; SI2915564T1; LT3078743T; SI2193196T1; JP2010539945A; AU2021218033A1; NO2019040I1; SG185263A1; IL255397A0; WO2009042962A3; AU2017200212A1; JP6300885B2; JP2014218521A; EP3078743B1

Abstract

본 발명은 인자 Xa 를 표적으로 하는 항응고제에 대한 안티도트에 관한 것이다. 상기 안티도트는 인자 Xa 저해제에 결합함으로써, 이들을 실질적으로 중화시키지만, 프로트롬비나아제 복합체으로는 조립되지 않는 인자 Xa 단백질 유도체이다. 본원에 기재된 유도체들은 고유한 응고 활성이 결핍되어 있거나 또는 감소되어 있다. 현재 인자 Xa 저해제를 이용하여 항응고 요법 중인 환자에서의 출혈 정지 또는 예방 방법이 본원에 개시된다.

Description

인자 Ｘａ 저해제에 대한 안티도트 및 그것을 사용하는 방법{ANTIDOTES FOR FACTOR Xa INHIBITORS AND METHODS OF USING THE SAME}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은, 35 U. S. C. § 119(e) 하에, 본원에 모두 참고문헌으로 포함되는, 2007 년 9 월 28 일에 출원된 U.S. 임시 출원 일련 번호 60/976,343 및 2008 년 8 월 20 일에 출원된 U.S. 임시 출원 일련 번호 61/090,574 의 권리를 주장한다.

본 출원은, 고유의 응고촉진 활성은 결핍되어 있거나 또는 감소되어 있지만, fXa 저해제에 결합 및/또는 중화할 수 있어 fXa 를 표적으로 하는 항응고제에 대한 안티도트로서 작용할 수 있는 인자 Xa (fXa) 유도체의 용도에 관한 것이다.

항응고제는 예를 들어, 혈액응고 장애가 있거나, 부동 기간에 제한되어 있거나 또는 의학적 수술 중인 환자와 같은, 혈병 형성의 경향이 있는 환자에서의 바람직하지 않은 혈전증의 치료 또는 예방에 있어서의 시장에서의 필요를 충족시킨다. 그러나, 항응고 요법의 주된 제한점들 중 하나는 치료와 연합된 출혈 위험 및 과다투여시 또는 위급한 수술 과정이 필요한 경우 항응고 활성을 재빨리 역전시킬 수 있는 능력에 있어서의 한계가 있다는 점이다. 따라서, 모든 형태의 항응고 요법에 대한 특이적이며 유효한 안티도트가 절실히 필요하다. 안전을 고려하면, 신규한 항응고 약물 개발에서는 항응고제-안티도트 쌍을 찾는 것이 또한 유리하다.

과도한 항응고에 대한 현재 이용가능한 항응고제-안티도트 쌍은 헤파린-프로타민 및 와파린-비타민 K 이다. 신선한 냉동 혈장 및 재조합 인자 VIIa (rfVIIa) 가 또한, 저분자량 헤파린 치료 하에 중대한 외상 또는 심각한 대출혈이 있는 환자에서 비특이적인 안티도트로서 이용된다 (Lauritzen, B. 등, Blood, 2005, 607A-608A). 프로타민 절편 (US 특허 6,624,141) 및 소형 합성 펩티드 (US 특허 6,200,955) 가 또한 헤파린 또는 저분자량 헤파린 안티도트로서 보고되었으며; 트롬빈 뮤테인 (US 특허 6,060,300) 은 트롬빈 저해제에 대한 안티도트로서 보고되었다. 프로트롬빈 중간체 및 유도체는 히루딘 및 합성 트롬빈 저해제에 대한 안티도트로서 보고된 바 있다 (US 특허 5,817,309 및 6,086,871).

항응고 요법들 중 한가지 유망한 형태는 인자 Xa (fXa) 를 표적으로 하는데, 사실, 몇가지 직접적인 fXa 저해제는 항응고 요법에서의 이용을 위해 현재 임상 개발의 상이한 단계들에 있다. 이들 중 다수는 소형 분자이다. 이들 신규한 fXa 저해제가 치료에 유망성을 보이나, 특이적이며 유효한 안티도트가 여전히 필요하다. 과다-항응고 또는 상기 fXa 저해제로 치료한 환자에서 수술이 필요한 경우, 투여된 fXa 저해제 또는 저해제들을 실질적으로 중화하고 정상 지혈을 유지시켜줄 약제가 필요할 것이다.

재조합 인자 VIIa (rfVIIa) 와 같이 현재 이용가능한 약제는 fXa 저해제의 역전에 대해서 메커니즘적으로 제한적이며 특이적이지 못하므로, 임상의를 위한 개선된 선택사항들이 절실히 필요하다. 인간 연구에서, rfVIIa 는 간접적인 안티트롬빈 III 의존성 fXa 저해제, 예컨대 폰다파리눅스 (fondaparinux) 및 이드라파리눅스 (idraparinux) 의 효과를 역전시키기 위해 이용되었다 (Bijsterveld, NR 등, Circulation, 2002, 106:2550-2554; Bijsterveld, NR 등, British J. of Haematology, 2004(124): 653-658). 인자 VIIa (fVIIa) 의 작용 메커니즘은, 환자에서 정상적인 지혈을 유지하기 위해 fXa 에 대한 혈액 순환시 존재하는 인자 X (fX) 를 전환시키는 조직 인자와 작용하는 것이다. 이러한 양태의 작용은 필연적으로, 활성 부위 지정 fXa 저해제를 중화시키기 위해 획득하는 fXa 의 최고 잠재 농도가 fX 의 순환 혈장 농도에 의해 제한된다는 점을 야기한다. 따라서, 직접적인 fXa 저해제의 효과를 역전하기 위해 사용되는 rfVIIa 의 잠재력은 메커니즘적으로 제한된다. fX 의 순환 혈장 농도는 150 나노몰농도 ("nM") 이므로, 이러한 양태에 의해 제공되는 fXa 의 최대 양은 150 nM 이 될 것이다. 따라서, 직접적인 fXa 저해제의 효과를 역전하기 위해 사용되는 rfVIIa 의 잠재력은 메커니즘적으로 제한된다. 리바록사반과 같은 소형 분자 fXa 저해제의 보고된 치료 농도는, rfVIIa 에 의해 생성되는 fXa 의 잠재적인 양보다는 더 많다 (약 600 nM, Kubitza D, 등, Eur. J. Clin. Pharmacol., 2005, 61:873-880). 따라서, fXa 저해제에 의한 항응고의 치료 또는 과치료 (supratherapeutic) 수준의 역전을 위한 rfVIIa 의 이용은 부적합한 수준의 효능을 제공한다. 도 4 에 나타낸 바와 같이, rfVIIa 의 이용은 인자 Xa 저해제 베트릭사반의 항응고 활성의 중화에서 제한된 유효성을 갖는다 (하기에 기재되어 있음). 재조합성 fVIIa 는 50 nM 내지 100 nM 의 투여량 응답성 안티도트 활성을 나타내나, 100 nM 내지 200 nM 에서는 효과가 반감되어, 그의 안티도트 효과가 그의 농도 이외의 요인에 의해 제한된다는 점을 시사한다. 시험한 모든 rfVIIa 농도에서, 베트릭사반은, 250 nM 의 농도에서, 약 75% 저해까지는, fXa 의 투여량 응답성 저해를 나타낸다. 이러한 관찰사실은 fVIIa 의 작용에 대해 제안된 메커니즘과 일치한다. 이는, rfVIIa 가 트롬빈 생성 및 프로트롬빈 작용의 파라미터에 대한 폰다파리눅스 (fondaparinux) 의 저해 효과를 완전히 역전시키지는 않는다는 것을 보여준 연구들에 의해 뒷받침된다 (Gerotiafas, GT, 등, Thrombosis & Haemostasis 2204(91):531-537).

외인성 활성 fXa 는 rfVIIa 와 유사한 방식으로 대상체에 직접 투여될 수는 없다. 그의 보조 인자 조직 인자의 부재 하에서는 매우 낮은 응고촉진 활성을 갖는 rfVIIa 와는 달리, 네이티브 fXa 은 강력한 효소이며, 혈전증을 유발할 잠재적인 위험성을 안고 있다. 따라서, fXa 항응고 요법에 대한 안티도트로서 rfVIIa 또는 활성 fXa 를 이용하는 것은 불리하다.

따라서, 바람직하지 않은 혈전증을 유발하지 않고, fXa 저해제의 과다투여시 또는 출혈을 예방 또는 정지하기 위해 정상적인 지혈이 회복되어야 할 경우 fXa 저해제의 항응고 작용을 실질적으로 중화함에 있어서 유효한 개선된 안티도트제가 필요하다.

본원에 언급되는 임의의 모든 출판물, 특허, 특허 출원이 본원에 전부 참고문헌으로 포함된다.

발명의 개요

fXa 단백질의 개질된 유도체의 투여가 fXa 를 표적으로 하는 항응고제에 대한 안티도트로서 유용하다는 것을 발견했다. fXa 단백질의 개질된 유도체는 프로트롬비나아제 복합체로의 조립에서 fXa 와 경쟁하지 않으나, 그 대신에 fXa 저해제와 같은 항응고제에 결합 및/또는 실질적으로 중화한다. 안티도트로서 유용한 유도체들은, 저해제에 결합하는 능력은 유지하면서, 내재적인 응고촉진 (procoagulant) 및 항응고 활성을 감소 또는 제거하도록 개질된다. 본 발명의 유도체에는 활성 부위의 개질, 또는 fXa 유래의 온전한 Gla 도메인의 변경 또는 제거 및 이들의 각종 조합이 포함되는 것으로 생각된다. 추가로, 활성 부위 개질 전장 fXa 는 항응고제로서 공지되어 있기 때문에, Gla 도메인의 개질은 정상적인 지혈에 대한 fXa 유도체의 항응고 효과를 감소시키거나 또는 제거할 것으로 생각된다.

추가로, fXa 의 EGF 도메인을 (EGF1, EGF2, 또는 EGF1 및 EGF2 도메인의 두가지 모두의 결실 또는 치환에 의해) 개질하는 것이 본 발명의 방법에 유용한 유도체를 제공할 것으로 생각된다. EGF 도메인 개질은 단독으로 또는 Gla 도메인 개질에 추가하여 수행될 수 있다.

한 구현예에서, 유도체는 fXa 를 표적으로 하는 항응고제 (또는 fXa 저해제) 에 대한 결합에 필요한 구조적인 특징들을 유지한다. 직접적이든 간접적이든, 저해제에 대한 유도체 결합에 의해, 저해제가 실질적으로 중화된다.

한 국면에서, 본 발명은, 대상체에 인자 Xa 저해제에 결합하며, 프로트롬비나아제 복합체로 조립되지 않는 유효량의 인자 Xa 단백질 유도체를 투여하는 것을 포함하는, 인자 Xa 저해제를 이용하여 항응고 요법 중인 대상체에서 출혈을 예방 또는 감소시키는 방법을 제공한다. 한 국면에서, 유도체들은 하기의 특성들 중 하나 이상을 갖는다: 응고촉진 활성이 감소되거나 또는 없음; Gla 도메인이 개질되거나 또는 제거됨; 및 활성 부위가 개질됨. 본 발명의 유도체는 외부에서 투여된 인자 Xa 에 선택적으로 결합하고 저해함으로써, fXa 저해제의 항응고 활성을 실질적으로 중화한다. 상기 방법은 시험관내 및 생체내 방법의 두가지 모두를 고려한다. 본 발명에 의해 고려되는 인자 Xa 단백질에 대한 각종 추가적인 개질들은 발명의 상세한 설명을 통해 알게 될 것이다.

본 발명에 의해 고려되는 유도체들은 혈장 유도성 인자 VIIa, 재조합성 인자 VIIa, 신선한 냉동 혈장, 프로트롬빈 복합체 농축물 또는 전혈이 아니라는 점이 이해될 것이다.

본 발명의 한 국면은 인자 Xa 저해제를 이용한 과다한 항응고 요법을 수용한 적이 있거나 또는 수용중인 환자 또는 인자 Xa 저해제를 과거에 투여받은 것이 있고, 이후 예컨대 환자의 희망에 의한 수술 또는 긴급 수술로 인해 지혈이 필요한 환자를 치료하기 위한, 인자 Xa 유도체 및 그것을 함유하는 조성물의 용도이다. 한 국면에서, 개질된 fXa 단백질은, 고유한 응고촉진 활성이 감소되거나 또는 제거되고, 지혈에서의 생리학적 fXa 기능과는 상충하지 않으면서도, fXa 저해제에 결합하여 그것을 실질적으로 중화시킬 수 있다는 점에서 자연 발생적인 fXa 와 구분된다.

또다른 국면에서, 개질된 인자 Xa 단백질은 인자 Xa 유도체의 혈장 반감기 (또는 순환 반감기) 를 연장시킬 수 있는 약제와 함께 투여된다. 또다른 국면에서, 안티도트는 그의 혈장 반감기를 연장시키는 부분과 콘쥬게이션된다.

인자 Xa 저해제에 결합 (하고/하거나 실질적으로 중화) 하나, 프로트롬비나아제 복합체로는 조립되지 않는 인자 Xa 유도체를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다. 약제학적 조성물은 임의로는 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다.

또다른 국면에서, 본 발명은 항응고 용도의 fXa 저해제 및 fXa 저해제의 항응고 활성의 실질적인 중화가 필요한 경우 사용하기 위한 fXa 저해제 안티도트 (또는 인자 Xa 유도체) 를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 한 구현예는 서열 식별 번호 12 의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호 12 와 80% 이상의 상동성을 가진 폴리펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드에 대한 것이다. 또다른 구현예는 서열 식별 번호 13 의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호 13 과 80% 이상의 상동성을 가진 폴리펩티드를 포함하는 단리된 2 쇄 폴리펩티드에 관한 것이다. 또다른 구현예는, 서열 식별 번호 15 의 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호 15 와 80% 이상의 상동성을 가진 폴리펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.

담체 및 상기 기재된 폴리펩티드를 함유하는 약제학적 조성물이 또한 제공된다.

상기 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다.

상기 기재된 폴리펩티드에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된 담체를 함유하는 펩티드 콘쥬게이트가 또한 본원에서 제공된다. 담체는 리포좀, 미셀, 약제학적으로 허용되는 중합체, 또는 약제학적으로 허용되는 담체일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 기재된 폴리펩티드에 결합하는 항체에 관한 것이다. 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라성 항체 또는 인간화된 항체이다. 상기 항체의 생물학적으로 활성인 절편이 또한 제공된다. 항체는 검출가능하게 표지될 수 있다. 항체 (또는 항체 절편) 은 또한 담체를 추가로 함유하는 조성물의 일부로서 제공된다.

한 구현예에서, 본 발명의 항체 및 상기 항체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 항체-펩티드 복합체가 제공된다. 상기 폴리펩티드는 항체가 발생하도록 하는 폴리펩티드이다. 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라성 항체 또는 인간화된 항체이다.

또다른 구현예에서, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포에서 발현시키는 것을 포함하는, 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법이 제공된다. 한 구현예에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 특히 중국 햄스터 난소 세포이다. 한 구현예에서, 중쇄 (서열 식별 번호 15) 는 대장균과 같은 원핵성 세포에서 발현된다. 또다른 구현예에서, 폴리펩티드가 단리된다.

또다른 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 단리된 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포를 제공한다. 한 구현예에서, 숙주 세포는 담체를 추가로 함유하는 조성물 중에 있다.

또다른 구현예에서, 대상체에 유효량의, 본 발명의 폴리펩티드 및 담체를 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인자 Xa 저해제를 이용하여 항응고 요법 중인 대상체에서의 외부에서 투여된 인자 Xa 에 선택적으로 결합하여 저해하는 방법이 제공된다. 추가로, 대상체에 유효량의, 상기 기재된 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 항응고 요법 중인 대상체에서의 외부에서 투여된 인자 Xa 저해제에 선택적으로 결합하고 저해하는 방법이 제공된다.

도 1 은 Leytus 등, Biochem., 1986, 25, 5098-5102 에서 보고되는 표 1 에 제시된 인간 인자 X (서열 식별 번호 1) 의 도메인 구조를 도식적으로 보여준다. 서열 식별 번호 1 은 선행기술에서 공지된 표 2 에 제시된 인간 fX 의 뉴클레오티드 서열 (서열 식별 번호 2) 에 의해 코딩되는 아미노산 서열이다. 예를 들어, 번역된 아미노산 서열은 Leytus 등, Biochem., 1986, 25, 5098-5102 에서 보고되었으며, 인터넷 사이트인 <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=89142731> 에서의 GenBank 에서 "NM 000504" 로 찾을 수 있다. 상기 서열에서의 아미노산 넘버링은 fX 서열을 기준으로 했다. 인간 fX 전구체 (서열 식별 번호 1) 는, 프리프로 (prepro)-리더 서열 (서열 식별 번호 1 의 아미노산 1 내지 40) 에 이어, fX 경쇄 (LC) 에 해당하는 서열 (서열 식별 번호 1 의 아미노산 41 내지 179), fX 분비 동안에 제거되는 RKR 트리플렛 (서열 식별 번호 1 의 아미노산 180 내지 182), 및 활성화 펩티드 (AP) (서열 식별 번호 1 의 아미노산 183 내지 234) 및 촉매 도메인 (서열 식별 번호 1 의 아미노산 235 내지 488) 을 포함하는 fX 중쇄 (서열 식별 번호 1 의 아미노산 183 내지 488) 를 포함한다.
도 2 (서열 식별 번호 3) 는 성숙형 (mature) 인간 인자 X 의 아미노산 서열을 보여준다. 본 도면에서의 아미노산 넘버링은 fX 경쇄의 N-말단으로부터 출발하는 성숙형 fX 서열을 기준으로 한 것이다. 인자 X 는 디설파이드 결합으로 연결된 2 쇄 분자로서 혈장 중에서 순환한다. 경쇄 (LC) 는 139 개의 아미노산 (서열 식별 번호 1 의 아미노산 41 내지 179) 잔기를 갖고 있으며, 짧은 아로마틱 스택 (AS) (서열 식별 번호 3 의 아미노산 40 내지 45) 를 포함하는 γ-카르복시글루탐산 (Gla)-풍부 도메인 (서열 식별 번호 3 의 아미노산 1 내지 45) 에 이어, 2 개의 상피 성장 인자 (EGF)-형 도메인 (EGF1: 서열 식별 번호 3 의 아미노산 46 내지 84, EGF2: 서열 식별 번호 3 의 아미노산 85 내지 128) 을 포함한다. 중쇄 (HC) 에는 306 개의 아미노산이 있으며, 52 개의 아미노산 활성화 펩티드 (AP: 서열 식별 번호 3 의 아미노산 143 내지 194) 에 이어 촉매 도메인 (서열 식별 번호 3 의 아미노산 195 내지 448) 을 포함한다. 키모트립신 넘버링에서 H57-D102-S195 와 동등한 촉매성 삼원 등가물은 fX 서열에서 His236, Asp282 및 Ser379 에 위치하며, 밑줄이 그어져 있다 (서열 식별 번호 3 의 아미노산 236, 282 및 379).
도 3 은 도 2 에서 보여준 성숙형 인간 인자 X 의 도메인 구조를 도식적으로 보여준다. 본 도면에서의 아미노산 넘버링은 성숙형 fX 서열을 기준으로 한 것이다. Gla-도메인 포함 절편 (서열 식별 번호 3 의 아미노산 1 내지 44) 을 제거하기 위한 키모트립신 소화 및 활성화 펩티드를 제거하기 위한 fX 활성화를 위한 절단 부위들은 강조해 놓았다. fXa 의 키모트립신 소화는 1 내지 44 아미노산 잔기가 없는 Gla-도메인이 없는 fXa 를 제공한다 (서열 식별 번호 4).
도 4 는 트롬빈 생성에서의 fXa 저해제 베트릭사반 (하기에 기재함) 의 항응고 활성에 대한 조직 인자 존재 하의 rfVIIa 의 다양한 농도의 효과를 보여준다 (상대적 형광 유닛 (RFU) 검정법 (실시예 2 에 기재함) 으로 나타냄). 데이터는 rfVIIa 및 조직 인자의 조합이 200 nM 까지의 농도에서는 fXa 저해제, 베트릭사반의 항응고 활성을 경쟁적으로 중화하지는 못한다는 것을 보여준다.
도 5 는 활성 fXa 및 베트릭사반을 포함하는 정제된 계에서의 베트릭사반에 의한 그의 Gla-도메인이 온전한 안히드로-fXa 가 fXa 저해를 역전시키며 (속이 빈 원), 안히드로-fXa 단독으로는 활성 fXa 와 비교하면 무시할 만한 응고촉진 활성 (속이 빈 삼각형) 을 갖는다는 것을 보여준다. FXa 발색 활성은 임의의 저해제의 부재 하에 활성 fXa 에 대해 정상화되었다 (속이 빈 사각형). 이는 실시예 2 에서 더욱 완전하게 기재된다. 데이터는, 안히드로-fXa 가 fXa 기질에 대해서는 비활성이나, fXa 저해제 결합 능력은 유지한다는 것을 보여준다.
도 6 은 도 5 에서의 온전한 Gla 도메인이 있는 안히드로-fXa 가 혈장 트롬빈 생성에서 강력한 저해제라는 것을 보여준다 (상대값 형광 유닛 (RFU) 검정법 (실시예 2 에 기재함) 으로 나타냄). 약 115 nM 에서 트롬빈 생성을 거의 완전히 저해했다. 데이터는, Gla-도메인의 개질이 없는 안히드로-fXa 가 fXa 저해제 안티도트로서 사용하기에는 적합하지 않다는 것을 보여준다.
도 7 은 키모트립신 소화 이전, 키모트립신 소화 15 분 후 및 30 분 후, 96-웰 플레이트 포맷에서의 활성 fXa 의 혈병형성 활성 비교를 보여준다. 도면에 나타낸 바와 같이, 혈병형성 시간 (OD405 의 변화) 은, fXa 를 키모트립신으로 소화시키고 15 분 후에 현저히 지연되었으며, fXa 를 30 분 동안 소화했을 때에는 20 분까지 혈병이 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 또한 안히드로-fXa 의 키모트립신 소화에 대한 조건 확립에 이용했는데, 이는 소화 동안 모니터링될 수 있는 활성이 없었기 때문이다. 이는 실시예 3 에서 더욱 완전하게 기재된다.
도 8 은 실시예 4 에 기재된 바와 같이 인자 Xa 저해제 베트릭사반에 대한 des-Gla 안히드로-fXa 의 결합 친화성을 보여준다. 데이터는, Gla-도메인 포함 절편 (잔기 1 내지 44) 를 제거하기 위해 안히드로-fXa 을 키모트립신으로 소화시켜 제조된 des-Gla 안히드로-fXa 가 네이티브 fXa 와 유사한 친화성으로 베트릭사반에 결합할 수 있다는 것을 보여준다 (fXa: Ki=O.12 nM, des-Gla 안히드로-fXa: Kd=0.32 nM).
도 9 는 실시예 2 의 트롬빈 생성 검정에서 680 nM 농도의 안티도트 (des-Gla 안히드로-fXa) 의 첨가로 베트릭사반의 농도를 달리하는 항응고제 활성의 역전을 보여준다. 680 nM 의 농도에서는, des-Gla 안히드로-fXa 가 fXa 활성의 실질적으로 완전한 복구를 제공할 수 있다.
도 10 은, 96-웰 플레이트 포맷에서의 aPTT 시약을 이용한 혈병형성 연장 검정에서 다양한 농도의 안티도트 (des-Gla 안히드로-fXa) 에 의한 250 nM 의 베트릭사반의 항응고 활성의 역전을 보여준다 (실시예 3 에 기재된 바와 같음). 데이터는, 약 608 nM 의 안티도트를 250 nM 의 fXa 저해제 베트릭사반의 중화에 이용되했을 때 혈병형성 시간이 대조군 혈소판 부족 혈장의 것과 필적한다는 것을 보여준다.
도 11 은, 정상화 후 배수 변화로 나타낸, 96-웰 플레이트 포맷에서 aPTT 시약을 이용한 혈병형성 연장 검정에서의 563 nM 의 안티도트 (des-Gla 안히드로-fXa) 에 의한 에녹사파린 (0.3125 내지 1.25 U/mL) 의 항응고 활성에 대한 효과를 보여준다. 검정 프로토콜은 실시예 3 에 기재되어 있다. 데이터는 563 nM 의 안티도트 첨가가 저분자량 헤파린 에녹사파린의 활성을 현저하게 중화시킨다는 것을 보여준다.
도 12 는, 발색 검정에서의, 트롬빈 (5 nM) 의 활성에 대한 안티도트, des-Gla 안히드로-fXa 의 영향, 및 50 nM 의 특이적인 트롬빈 저해제인 아르가트로반의 첨가에 의한 그의 저해를 보여준다. 예상한 바와 같이, fXa 저해제의 안티도트는 538 nM 까지의 농도에서는, 트롬빈의 활성 또는 특이적 저해제 아르가트로반에 의한 그의 저해에 검출가능하게 영향을 주지 않았다. 이는 실시예 14 에서 더욱 완전하게 기재된다.
도 13 은 표준 응고 타이머를 이용하여, aPTT 검정에서 안티도트, des-Gla 안히드로-fXa 의 농도를 달리함으로써 400 nM 베트릭사반의 항응고 활성에 대한 영향을 보여준다. 검정 프로토콜은 실시예 3 에 기재되어 있다. 데이터는 fXa 저해제의 안티도트가 400 nM 의 베트릭사반에 의한 fXa 의 저해를 실질적으로 역전시킨다는 것을 보여준다. 안티도트의 EC₅₀ 는 400 nM 베트릭사반을 사용할 때 약 656 nM 인 것으로 추정되었다.
도 14 는 CHO 세포에서의 fXa 삼중 돌연변이의 발현을 위한 DNA 구축의 맵을 보여준다 (서열 식별 번호 12). 플라스미드 DNA 를 선형화하고, CHO dhfr(-) 세포에 트랜스펙션했다. 세포를 테트라히드로 폴레이트 (HT) 결핍 배지 및 메토트렉세이트 (MTX) 를 이용하여 선별했다. 안정한 클론을 ELISA 에 의해 높은 단백질 발현에 대해 스크리닝했다. fXa 삼중 돌연변이는 무혈청 배지에서 생산하고, 이온 교환 및 친화성 컬럼의 조합으로 정제했다. 맵에서의 넘버링은 인간 fX 을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 식별 번호 1) 을 기준으로 했다. 예를 들어, 활성 부위 S419 에서의 알라닌 돌연변이 (서열 식별 번호 1) 는 본 출원 및 더 구체적으로는 실시예 7 을 통해 논의될 성숙형 인간 fX 의 S379 에서의 돌연변이 (서열 식별 번호 3) 와 동등하다.
도 15 는 fX 중쇄 및 경쇄를 각각 인식하는 모노클로날 항체를 이용하는 정제된 r-안티도트의 웨스턴 블롯을 보여준다. 경쇄 및 중쇄를 연결하는 디설파이드 결합의 환원시, r-안티도트 중쇄는 혈장 유도성 fXa 의 것과 유사한, 예상한 분자량으로 이동한다. fXa 돌연변이의 Gla-도메인에서의 6 내지 39 의 결실은 정상 FXa 에 비해 더 낮은 분자량 밴드의 r-안티도트 경쇄를 제공한다.
도 16 은 베트릭사반 (15 mg/kg) 만의 경구 투여 후, 또는 베트릭사반 (15mg/kg) 에 이은 실시예 1 에 따라 제조한 혈장 유도성 안티도트 (pd-안티도트) 의 정맥내 주사 (300 ㎍, IV) 후 마우스 (군 당 n = 7 내지 10 마리) 에서의 베트릭사반 혈장 수준을 보여준다. pd-안티도트는 1.5 시간의 시점 5 분 전에 투여했고, 마우스 혈액 시료 (0.5 mL) 를 베트릭사반의 경구 투여 후 1.5, 2.0, 및 4.0 시간 째에 채취했다. 전혈 INR, 베트릭사반 및 안티도트 혈장 수준을 분석했다. 마우스 혈장 중의 베트릭사반 수준 (평균±SEM) 을, 15 mg/kg 주사 (속이 빈 사각형) 및 15 mg/kg 에 이은 안티도트 주사 (속이 빈 원) 후 마우스에 대해서 시간의 함수로서 그래프를 그렸다. 1.5 시간 시점 (안티도트 주사 후 5 분) 에서 안티도트 처리군의 PK-PD 보정은 표 13 에 요약했다. 안티도트의 단독적인 주사는 INR 측정을 근거로 하는 기능성 베트릭사반의 50% 초과 감소를 초래했다. 이는 실시예 8 에서 더욱 철저하게 기재한다.
도 17 은 정제된 r-안티도트를 이용한 마우스 실험의 결과를 보여준다 (군 당 n = 4 내지 10 마리). 마우스 혈장 (도 17A) 및 전혈 INR (도 17B) 에서의 베트릭사반 수준은, 베트릭사반 단독으로 (15 mg/kg) 경구 투여 후 또는 베트릭사반 (15mg/kg) 의 경구 투여에 이은 r-안티도트의 정맥 주사 (300 ㎍) 투여 후 비교했다. 각 처리군의 평균값을 표시했다. 표 14 에 요약한 바와 같이, r-안티도트의 단독적인 IV 주사는 생체외 전혈 INR 의 50% 초과 보정을 제공했으며, 이는 다중 주사 또는 기타 요법을 통한 안티도트에 의한 fXa 저해제의 유효한 중화를 입증해 준다. 상기 결과는 본 발명의 fXa 변이체가, 출혈 또는 기타 의학적 응급상황에 처한 환자에서의 fXa 저해제의 항응고 효과를 역전시키는 범용 안티도트로서 작용하는 잠재성을 갖는다는 것을 증명한다. 이는 실시예 8 에서 더욱 철저하게 기재한다.
도 18 은 96-웰 탁도 변화 혈병형성 검정에서의 에녹사파린의 저해 효과의 r-안티도트 역전을 보여준다. 결과는 pd-안티도트와 본질적으로 유사해 (도 11), 두 fXa 유도체가 그에 필적할만한 기능성 안티도트 활성을 갖는다는 것을 나타냈다. 50 nM r-안티도트는 1.25 U/mL 에녹사파린의 저해 효과를 실질적으로 보정했다 (>75%). 검정 프로토콜은 실시예 11 에 제시한다.
도 19 는 인간 혈장 혈병형성 검정에서 시험한 바와 같이 저분자량 헤파린 (LMWH) 의 저해 효과의 r-안티도트 역전을 보여준다. 도 18 및 19 의 두가지 모두는 실시예 11 에서 논의된다.
도 20 는 리바록사반의 항응고 효과의 r-안티도트 역전을 보여준다. 이는 실시예 12 에서 더욱 완전하게 논의된다.
도 21 은 r-안티도트의 폴리뉴클레오티드 서열 및 번역된 폴리펩티드 서열의 정렬을 보여준다.
도 22 는 r-안티도트의 단일 IV 주사 (1 회 주사) 또는 2 회 주사 (2 회 주사) 를 이용한 마우스 실험의 결과를 보여준다 (군 당 n = 5,312 ㎍/200 ul r-안티도트). 혈장에서의 베트릭사반 수준 (도 22A) 을, 베트릭사반 (15 mg/kg) 의 투여에 이은 비히클 또는 r-안티도트의 정맥내 주사 후 비교했다 (상세한 사항은 실시예 8 참조). 도 22A 에 나타낸 바와 같이, r-안티도트의 단일 IV 주사는 비히클 대조군 (대조군_1) 에 비해 혈장 중 베트릭사반 수준을 8 배 넘게 증가시켜, 생체내에서 베트릭사반을 유효하게 포획하는 안티도트의 능력을 나타냈다. 안티도트의 두번째 주사는 단일 주사에 비해 베트릭사반 수준을 2 배가 안되게 증가시켜, 마우스 혈액내 베트릭사반의 양 제한 및 안티도트에 의한 그의 항응고 효과 역전이 가능하다는 것을 나타냈다. 도 22B 는, 안티도트의 1 회 또는 2 회 주사 후 마우스 혈장에서 안티도트/베트릭사반 비율이 증가함에 따라 측정된 INR 가 감소한다는 것을 증명한다.

발명의 상세한 설명

I. 정의

본 발명의 수행은, 달리 언급되지 않는 한, 당업자에게 공지된 통상적인 조직 배양 기법, 면역학, 분자생물학, 미생물학, 세포 생물학 및 재조합 DNA 기술을 채용한다. 참고문헌은, 예를 들어, Sambrook 및 Russell 편저 (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제 3 판; 시리즈물인 Ausubel 등 편저의 (2007) Current Protocols in Molecular Biology; 시리즈물인, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); MacPherson 등 (1991) PCR 1: A Practical Approach (Oxford University Press 의 IRL Press); MacPherson 등, (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow 및 Lane 편저 (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 제 5 판; Gait 편저 (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S. 특허 4,683,195; Hames 및 Higgins 편저 (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames 및 Higgins 편저 (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller 및 Calos 편저 (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides 편저 (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer 및 Walker 편저 (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); Herzenberg 등 편저 (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 제 3 판 (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)).

모든 숫자 표시, 예를 들어 pH, 온도, 시간, 농도 및 분자량은 그의 범위들을 포함하여 0.1 의 증분만큼 (+) 또는 (-) 로 가변적인 대략적인 것이다. 언제나 명쾌하게 언급되는 것이 아닐지라도, 모든 숫자 표시는 용어 "약" 이 앞에 있는 것으로 이해되어야 한다. 언제나 명쾌하게 언급되는 것이 아닐지라도, 본원에 기재된 시약들이 단지 예시일 뿐이고, 당업자에게는 그의 등가물이 공지되어 있음이 이해되어야 한다.

상세한 설명 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 대표 단수는 문맥에서 달리 명확하게 언급하지 않더라도 복수 표현을 포함한다. 예를 들어, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체" 에는, 그의 혼합물을 포함하여, 복수의 약제학적으로 허용되는 담체들이 포함된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 은 조성물 및 방법이 언급한 구성요소들을 포함하지만, 나머지 것들을 배제하지는 않음을 의미하려는 것이다. 조성물 및 방법을 정의함에 있어서 "로 본질적으로 이루어지는" 은 의도하는 용도에 대한 조합에 임의의 핵심적인 유의한 것들 외의 구성요소들이 배제되지 않음을 의미한다. 따라서, 본원에서 정의된 구성요소들로 본질적으로 이루어지는 조성물은 분리 및 정제 방법으로부터의 미량의 불순물 및 약제학적으로 허용되는 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수, 보존제 등을 배제하지 않는다. "로 이루어진" 은 기타 성분들의 미량 구성성분 및 본 발명의 조성물 투여를 위한 실질적인 방법 단계 외의 것은 배제함을 의미한다. 각각의 상기 이행 용어의 구현예가 본 발명의 범위에 속한다.

진단 또는 치료의 "대상체" 는 인간을 포함하는 포유류 또는 세포이다. 진단 또는 치료에 대한 비-인간 동물 대상체에는, 예를 들어 래트, 마우스와 같은 쥐과동물, 개와 같은 개과 동물, 토끼와 같은 토끼과 동물, 가축, 경주용 동물 및 애완동물이 포함된다.

용어 "단백질" 및 "폴리펩티드" 는 호환하여 사용되며, 그의 광의의 의미에서 2 개 이상의 서브유닛 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티드모사체 (peptidomimetic) 를 지칭한다. 서브유닛은 펩티드 결합으로 연결될 수 있다. 또다른 구현예에서, 서브유닛은 기타 결합, 예를 들에 에스테르, 에테르 등으로 연결될 수 있다. 단백질 또는 펩티드는 2 개 이상의 아미노산을 포함해야 하며, 단백질 또는 펩티드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 갯수에 대해서 제한은 없다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 " 아미노산" 은, 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체의 두가지 모두, 아미노산 유사체 및 펩티드모사체를 포함하는, 자연 및/또는 비자연 또는 합성 아미노산을 지칭한다. 자연 발생 아미노산의 단일 문자 및 세자리 문자 약어는 하기에 열거한다. 펩티드 사슬이 짧은 경우 3 개 이상의 아미노산의 펩티드는, 일반적으로 올리고펩티드로 지칭된다. 펩티드 사슬이 긴 경우, 펩티드는 일반적으로 폴리펩티드 또는 단백질로 지칭된다.

"인자 Xa" 또는 "fXa" 또는 "fXa 단백질" 은 불활성 인자 X (fX) 로부터 생산되는, 혈액응고 경로에서의 세린 프로테아제를 지칭한다. 인자 Xa 는 인자 IXa 와 그의 보조인자, 인자 VIIIa 에 의해 고유한 Xase 로서 공지된 복합체에서, 또는 인자 VIIa 와 그의 보조인자, 조직 인자에 의해 외인성 Xase 로 공지된 복합체에서 활성화된다. fXa 는 인자 Va 와 함께 막-결합 프로트롬비나아제 복합체를 형성하며, 프로트롬빈에서 트롬빈으로의 변환을 촉매하는 프로트롬비나아제 복합체 내에서 활성 성분이다. 트롬빈은, 궁극적으로는 혈병 형성을 유도하는, 피브리노겐에서 피브린으로의 변환을 촉매하는 효소이다. 따라서, fXa 의 생물학적 활성은 본원에서 종종 "응고촉진 활성" 으로 지칭된다.

인간 인자 X ("fX") 를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nuccore&id=89142731> 의 GenBank 에서, "NM_000504" 로 찾을 수 있으며, 도 1b 및 서열 식별 번호 2 에 제시되어 있다. 해당하는 아미노산 서열 및 fX 의 도메인 구조는, Leytus 등, Biochemistry, 1986, 25:5098-5102 에 기재되어 있다. 성숙형 fX 의 도메인 구조는 또한 Venkateswarlu, D. 등, Biophysical Journal, 2002, 82:1190-1206 에 기재되어 있다. 중쇄의 처음 52 개 잔기 (서열 식별 번호 3 의 아미노산 143 내지 194) 의 촉매 절단시, fX 는 fXa (서열 식별 번호 6) 로 활성화된다. FXa 는 경쇄 (서열 식별 번호 8) 및 중쇄 (서열 식별 번호 9) 를 포함한다. 경쇄의 처음 45 개의 아미노산 잔기 (서열 식별 번호 6 의 잔기 1 내지 45) 는, 11 개의 번역후 개질 γ-카르복시글루탐산 잔기 (Gla) 를 포함하기 때문에 Gla 도메인으로 지칭된다. 이는 또한 짧은 (6 개의 아미노산 잔기) 방향족 스택 서열 (서열 식별 번호 6 의 잔기 40 내지 45) 도 포함한다. 키모트립신 소화는 1 내지 44 잔기를 선택적으로 제거하여, Gla-도메인이 없는 fXa (서열 식별 번호 4) 를 제공한다. fXa 의 세린 프로테아제 촉매 도메인은 C-말단 중쇄에 위치한다. fXa 의 중쇄는 트롬빈, 트립신 및 활성화 단백질 C 와 같은 기타 세린 프로테아제와 매우 유사하다.

성숙형 인자 X 의 도메인 구조는, 본원에 그의 전체가 참고문헌으로 포함되는 Venkateswarlu D. 등, Biophysical J., 2002, 82, 1190-1206 에서 찾을 수 있다. 상기 도면에서의 아미노산 넘버링은 도 3 에서와 같다. 경쇄를 활성화 펩티드에 연결하는 트리펩티드 Arg140-Lys141-Arg142 (도 1 에 나타낸 바와 같이 RKR 삼중항) 는 보이지 않는데, 이는 트리펩티드가 결핍된 상기 형태가 순환 혈액 혈장 중에서는 우세하기 때문이다. 개별 도메인들은 박스에 나타낸다. 여기에는 도 2 에서의 아미노산 1 내지 45 (서열 식별 번호 3) 가 포함된다. 기능적으로 중요한 촉매 잔기는 동그라미로 표시했으며, 'γ' 는 Gla (γ-카르복시글루탐산) 잔기를 나타낸다.

"네이티브 fXa" 또는 "야생형 fXa" 는 혈장에 원래 존재하거나, 그의 기원으로부터 분리되어 개질되지 않은 형태로서, 프로트롬빈 활성화의 생물학적 활성을 프로세스하여 혈병 형성을 촉진하는 fXa 를 지칭한다. 상기 용어에는 조직 시료로부터 단리된 자연 발생 폴리펩티드 뿐만 아니라 재조합적으로 제조된 fXa 도 포함된다. "활성 fXa" 는 프로트롬빈을 활성화시키는 생물학적 활성을 가진 fXa 를 지칭한다. "활성 fXa" 는 네이티브 fXa 또는 응고촉진 활성을 보유한 개질된 fXa 일 수 있다.

"fXa 유도체" 또는 "개질된 fXa" 또는 "인자 Xa 단백질의 유도체" 는 fXa 가 직접적이든 간접적이든 인자 Xa 저해제에 결합하고 프로트롬비나아제 복합체로는 조립되지 않도록 개질된 fXa 단백질을 지칭한다. 구조적으로, 상기 유도체들은 응고촉진 활성을 전혀 제공하지 않거나 또는 감소된 응고촉진 활성을 제공하도록 개질된다. "응고촉진 활성" 은 본원에서 혈액 응고 또는 혈병 형성을 야기하는 시약의 능력을 지칭한다. 감소된 응고촉진 활성은 응고촉진 활성이 야생형 fXa 에 비해 약 50% 이상, 또는 약 90% 이상, 또는 약 95% 이상 감소되었음을 의미한다. 예를 들어, 재조합성 fX-S395A 는 시험관내 검정, 예컨대 fXa 활성 검정으로 측정시 본질적으로 응고촉진 활성이 없다.

유도체들은 개질된 활성 부위 또는 개질된 Gla 도메인 또는 이들 두가지 모두를 갖는다. 추가적인 개질이 또한 고려된다. 상기 개질은 하나 이상의 하기 방식으로 할 수 있다: 서열에서 하나 이상의 아미노산의 결실, 하나 이상의 아미노산 잔기를 하나 이상의 상이한 아미노산 잔기로 치환 및/또는 하나 이상의 아미노산 측쇄 또는 그의 "C" 또는 "N" 말단의 취급.

용어 "활성 부위" 는 화학 반응이 일어나는 효소 또는 항체의 부분을 지칭한다. "개질된 활성 부위" 는 증가 또는 감소된 화학 반응성 또는 특이성을 가진 활성 부위를 제공하도록 구조적으로 개질된 활성 부위이다. 활성 부위의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 235-499 아미노산 잔기를 포함하는 인간 인자 X 의 촉매 도메인 (도 1) 및 195 내지 448 아미노산 잔기를 포함하는 인간 인자 Xa 의 촉매 도메인 (도 2 및 3) 이 포함된다. 개질된 활성 부위의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414 또는 Arg424 의 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환이 있는 서열 식별 번호 10, 11, 12, 13 또는 15 의 195 내지 448 아미노산 잔기를 포함하는 인간 인자 Xa 의 촉매 도메인이 포함된다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 유도체에는 개질된 Gla 도메인이 있거나 또는 전체 Gla 도메인이 제거되어 있을 수 있다. 본 발명의 방법에서 안티도트로서 적합한 fXa 의 예시는, Gla-도메인이 없는 fXa (서열 식별 번호 4 또는 5), Gla-결핍성 fXa (본원에 기재된 개질이 있는 서열 식별 번호 7), 촉매 부위에서의 개질이 있는 fXa (서열 식별 번호 10 또는 11), 및 본원에서 상세하게 기재된 바와 같이 fV/fVa 상호작용 또는 fVIII/fVIIIa 상호작용에 중요한 것으로 공지된 부위에서의 개질이 있는 fXa (Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414 또는 Arg424 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환이 있는 서열 식별 번호 4, 5, 7, 10 또는 11) 이 포함된다. 본 발명에서 고려한 fXa 유도체의 추가 예시는 하기에 제공된다.

"Gla-도메인이 없는 fXa" 또는 "des-Gla fXa" 는 Gla-도메인을 갖고 있지 않는 fXa 를 지칭하며, Gla-도메인의 제거에 추가하여 기타 개질(들)을 포함하는 fXa 유도체도 포함한다. 본 발명에서 Gla-도메인이 없는 fXa 의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 서열 식별 번호 3 의 1 내지 39 아미노산이 결핍된 fXa 유도체; 서열 식별 번호 3 의 6 내지 39 아미노산 잔기가 결핍된 fXa 유도체로서, 하기에 더욱 상세하게 기재된 CHO 세포에서 발현되는 fXa 돌연변이에 해당하는 것 (서열 식별 번호 12, 표 12); 서열 식별 번호 3 의 1 내지 44 아미노산 잔기가 결핍된 fXa 유도체로서, 인간 fXa 의 키모트립신 소화 후 des-Gla fXa 에 해당하는 것 (서열 식별 번호 4, 도 3); 및 Padmanabhan 등, Journal Mol. Biol, 1993, 232:947-966 에 기재된 바와 같이 서열 식별 번호 3 의 전체 1 내지 45 Gla 도메인 잔기가 결핍된 fXa 유도체 (서열 식별 번호 5) 가 포함된다. 기타 예시에는 des-Gla 안히드로 fXa (서열 식별 번호 10, 표 10) 및 des-Gla fXa-S379A (서열 식별 번호 11, 표 11) 이 포함된다.

일부 구현예에서, des-Gla fXa 는 적어도 서열 식별 번호 3 의 아미노산 잔기 40 내지 448 또는 그의 등가물을 포함한다. 일부 구현예에서, des-Gla fXa 는 적어도 서열 식별 번호 3 의 아미노산 잔기 45 내지 488 (서열 식별 번호 4) 또는 서열 식별 번호 3 의 46 내지 488 (서열 식별 번호 5) 또는 이들의 등가물을 포함한다.

일부 구현예에서, des-Gla fXa 는 적어도 서열 식별 번호 3 의 아미노산 잔기 40 내지 139 및 195 내지 448 또는 이들의 등가물을 포함한다. 일부 구현예에서, des-Gla fXa 는 적어도 서열 식별 번호 3 의 아미노산 잔기 45 내지 139 및 195 내지 448 또는 이들의 등가물을 포함한다. 또다른 구현예에서, des-Gla fXa 는 적어도 서열 식별 번호 3 의 아미노산 잔기 46 내지 139 및 195 내지 448 또는 이들의 등가물을 포함한다.

"Gla-결핍 fXa" 는 Gla 도메인에서 자유 측쇄 γ-카르복실기 갯수가 줄어든 fXa 를 지칭한다. Gla-도메인이 없는 fXa 와 마찬가지로, Gla-결핍 fXa 는 또한 기타 개질을 포함할 수 있다. Gla-결핍 fXa 에는, 비카르복시화 (uncarboxylated), 미카르복시화 (undercarboxylated) 및 탈카르복시화 (decarboxylated) fXa 가 포함된다. "비카르복시화 fXa" 또는 "탈카르복시화 fXa" 는 Gla 도메인의 γ-카르복시글루탐산 잔기의 γ-카르복실기가 없는 fXa 유도체, 예컨대 그의 Gla 도메인 γ-카르복시글루탐산 전부가 상이한 아미노산으로 치환된 fXa 또는, 그의 측쇄 γ-카르복실이 전부 아민화, 에스테르화 등에 의해 제거 또는 차폐된 fXa 를 지칭한다. 재조합적으로 발현된 단백질에 대해서는, 비카르복시화 fXa 가, 종종 무-카르복시화 fXa 로 지칭된다. "미카르복시화 fXa" 는 야생형 fXa 와 비교할 때, Gla 도메인에서의 γ-카르복실기의 갯수가 줄어든 fXa 유도체, 예컨대 전부는 아니지만 하나 이상의 그의 Gla 도메인 γ-카르복시글루탐산이 하나 이상의 상이한 아미노산으로 치환된 fXa, 또는 전부는 아니지만 하나 이상의 그의 측쇄 γ-카르복실이 아민화 및 에스테르화 등과 같은 수단으로 제거 또는 차폐된 fXa 를 지칭한다.

인간 Gla-도메인이 없는 인자 Xa 의 도메인 구조는, 그의 전문이 본원에 참고문헌으로 포함되는 Padmanabhan 등, J. Mol. Biol., 1993, 232, 947-966 에서 찾을 수 있다. 아미노산 넘버링은, 예를 들어, Ser195 가 인간 성숙형 fX 넘버링을 사용했을 때 도 2 에서의 Ser379 에 해당되는, 키모트립신과의 위상적 동등성을 근거로 한다. 삽입은 문자로 표시되며, 결실은 2 개의 연속적인 숫자표기로 표시된다. 중쇄 넘버링과 구분하기 위해, 경쇄 넘버링에는 300 을 더한다. β363 은 β-히드록시 아스파르테이트이다. 빗금은 결정성 물질에서 관찰되는 단백질 가수분해성 절단을 표시한다. 성숙형 fXa (서열 식별 번호 3) 에서 1 내지 45 아미노산 잔기가 결핍된, Gla-도메인이 없는 fXa 의 서열은 서열 식별 번호 5 에 제시한다.

한 구현예에서, fXa 유도체는 fXa 의 경쇄가 결핍되어 있으나, 중쇄에 존재하는 세린 프로테아제 촉매 도메인은 여전히 갖고 있을 수 있다. 추가로, 다른 세린 프로테아제 촉매 도메인을 가진 키메라가 중쇄에서의 치환을 제공하기 위해 이용될 수 있다.

"pd-안티도트" 또는 "혈장-유도성 안티도트" 는 des-Gla 안히드로 fXa 유도체를 지칭하며, 서열 식별 번호 10 의 아미노산 잔기를 갖는다.

"r-안티도트" 또는 "재조합성 안티도트" 는 하기에 더욱 상세하게 기재한 CHO 세포에서 발현되는 fXa 돌연변이에 해당하는, 서열 식별 번호 3 의 6 내지 39 아미노산 잔기가 결핍된 fXa 유도체를 지칭한다 (서열 식별 번호 13, 표 12a).

"항응고 시약" 또는 "항응고제" 는 혈병 형성을 저해하는 시약이다. 항응고 시약의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 트롬빈의 특이적인 저해제, 인자 IXa, 인자 Xa, 인자 XIa, 인자 XIIa 또는 인자 VIIa, 헤파린 및 유도체, 비타민 K 안타고니스트, 및 항-조직 인자 항체가 포함된다. 트롬빈의 특이적인 저해제의 예시에는, 히루딘, 비발리루딘 (Angiomax®), 아르가트로반 및 레피루딘 (Refiudan®) 이 포함된다. 헤파린 및 유도체의 예시에는, 비분획화 헤파린 (UFH), 저분자량 헤파린 (LMWH), 예컨대 에녹사파린 (Lovenox®), 달테파린 (Fragmin®) 및 다나파로이드 (Orgaran®); 및 합성 오당류, 예컨대 폰다파리눅스 (Arixtra®) 가 포함된다. 비타민 K 안타고니스트의 예시에는, 와파린 (Coumadin®), 페노쿠마롤, 아세노쿠마롤 (Sintrom®), 클로린디온, 디쿠마롤, 디페나디온, 에틸 비스쿠마세테이트, 펜프로쿠몬, 페닌디온 및 티오클로마롤이 포함된다. 한 구현예에서, 항응고제는 인자 Xa 의 저해제이다. 한 구현예에서, 항응고제는 베트릭사반이다.

"항응고 요법" 은 바람직하지 않은 혈병 또는 혈전증을 예방하기 위해 환자에게 적용하는 치료 요법을 지칭한다. 항응고 요법은 환자에서 바람직하지 않은 혈병 또는 혈전증을 치료 또는 예방하기 위해 적합한 투여량 및 일정으로 2 가지 이상의 항응고 시약 또는 기타 시약의 하나 이상의 조합을 투여하는 것을 포함한다.

용어 "인자 Xa 저해제" 또는 "인자 Xa 의 저해제" 는 시험관내 및/또는 생체내에서 프로트롬빈의 변환을 촉매하는 항응고 인자 Xa 의 활성을 직접적으로든 또는 간접적으로든 저해할 수 있는 화합물을 지칭한다. 공지된 fXa 저해제의 예시에는, 이제 제한되지 않으나, 폰다파리눅스, 이드라파리눅스, 바이오틴화 이드라파리눅스, 에녹사파린, 프라민, NAP-5, rNAPc2, 조직 인자 경로 저해제, DX-9065a (예를 들어, Herbert, J.M., 등, J Pharmacol Exp Ther. 1996 276(3): 1030-8 에 기재되어 있음), YM-60828 (예를 들어, Taniuchi, Y., 등, Thromb Haemost. 1998 79(3):543-8 에 기재되어 있음), YM-150 (예를 들어, Eriksson, B.I. 등, Blood 2005; 106(11), Abstract 1865 에 기재되어 있음), 아픽사반, 리바록사반, PD-348292 (예를 들어, Pipeline Insight: Antithrombotics - Reaching the Untreated Prophylaxis Market, 2007 에 기재되어 있음), 오타믹사반, 라작사반 (DPC906), BAY 59-7939 (예를 들어, Turpie, A.G., 등, J. Thromb. Haemost. 2005, 3(11):2479-86 에 기재되어 있음), DU-176b (예를 들어, Hylek EM, Curr Opin Invest Drugs 2007 8(9):778-783 에 기재되어 있음), LY517717 (예를 들어, Agnelli, G., 등, J. Thromb. Haemost. 2007 5(4):746-53 에 기재되어 있음), GSK913893, 베트릭사반 (하기에 기재되어 있음) 및 이들의 유도체가 포함된다. 저분자량 헤파린 ("LMWH") 이 또한 인자 Xa 저해제로 간주된다.

한 구현예에서, 인자 Xa 저해제는 베트릭사반, 리바록사반, LMWH 및 이들의 조합으로부터 선택된다.

용어 "베트릭사반" 은 화합물 "[2-({4-[(디메틸아미노)이미노메틸]페닐}카르보닐아미노)-5-메톡시페닐]-N-(5-클로로(2-피리딜))카르복사미드" 또는 약제학적으로 허용되는 그의 염을 지칭한다. "[2-({4-[(디메틸아미노)이미노메틸]페닐}카르보닐아미노)-5-메톡시페닐]-N-(5-클로로(2-피리딜))카르복사미드" 는 하기의 구조를 가진 화합물:

또는 그의 호변체 또는 약제학적으로 허용되는 염을 지칭한다.

베트릭사반은 U.S. 특허 6,376,515 및 6,835,739, 및 2006 년 11 월 7 일에 출원된 U.S. 특허 출원 공보 2007/0112039 에 기재되어 있으며, 이들은 본원에 전부 참고문헌으로 포함된다. 베트릭사반은 인자 Xa 의 특이적인 저해제로 공지되어 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "안티도트" 또는 "인자 Xa 저해제에 대한 안티도트" 는 이용가능한 fXa 저해제와 결합하여 활성 fXa 와 경쟁함으로써 fXa 저해제의 응고 저해 활성을 실질적으로 중화 또는 역전시킬 수 있는, fXa 의 유도체와 같은 분자들을 지칭한다. 본 발명의 안티도트의 예시는 인지질막 결합이 감소된 fXa 유도체, 예컨대 des-Gla fXa 또는 Gla-결핍성 fXa, 및 촉매 활성이 감소된 fXa 유도체, 예컨대 활성 부위 개질 fXa 유도체, 및 fV/Va 또는 fVIII/fVIIIa 와의 상호작용이 감소된 유도체이다. 막 결합이 감소되고 촉매 활성이 감소된 본 발명의 안티도트의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 안히드로-fXa 의 키모트립신 소화에 의한 des-Gla 안히드로-fXa (실시예 1 에 기재된 바와 같음); 돌연변이생성에 의한 des-Gla fXa-S379A (키모트립신 넘버링에서 S195A) (실시예 6 에 기재된 바와 같음) 이 포함된다.

본 발명의 안티도트의 기타 예시에는, fXa 촉매 도메인과 충분한 구조적 유사성을 가져 소분자 fXa 저해제와 결합할 수 있는 세린 프로테아제 도메인을 포함하는 단백질 및 폴리펩티드가 포함된다. 예시에는, 이에 제한되지 않으나, fXa 저해제 GSK913893 에 결합하는 트롬빈 (Young R., 등, Bioorg. Med Chem. Lett. 2007, 17(10): 2927-2930); fXa 저해제 아픽사반에 결합하는 혈장 칼리크레인 (Luettgen J., 등, Blood, 2006, 108(11) abstract 4130); 및 나노몰 이하의 친화성 (Kd=500pM) 으로 fXa 저해제 C921-78 에 결합하는 트립신 (또는 그의 박테리아성 유사체 서브틸리신) (Betz A, 등, Biochem., 1999, 38(44): 14582-14591) 이 포함된다.

한 구현예에서, 본 발명의 유도체는 직접적으로든 또는 간접적으로는 인자 Xa 저해제에 결합한다. 본원에 사용된 용어 "결합", "결합하다", "인식" 또는 "인식하다" 는, 예를 들어 혼성화 검정을 이용하여 검출될 수 있는 분자들 사이의 상호작용을 포함하는 것을 의미한다. 상기 용어는 또한 분자들 사이의 "결합" 상호작용을 포함하는 것을 의미한다. 상호작용은, 예를 들어, 자연에서의 단백질-단백질, 단백질-핵산, 단백질-소형 분자 또는 소형 분자-핵산 간에 있을 수 있다. 결합은 "직접적" 또는 "간접적"일 수 있다. "직접적" 결합은 분자들 사이의 직접적인 물리적인 접촉을 포함한다. "간접적" 결합은 하나 이상의 중간체 분자들과의 동시적인 직접적 물리적 접촉이 있는 분자들을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 유도체가 저분자량 헤파린 및 인자 Xa 의 기타 간접적인 저해제와 간접적으로 결합하고 실질적으로 중화시킨다는 것을 고려한다. 상기 결합은 상호작용하는 분자들을 포함하는 "복합체" 의 형성을 제공할 수 있다. "복합체" 는 공유 또는 비공유 결합, 상호작용 또는 인력에 의해 함께 유지되는 2 개 이상의 분자들의 결합체를 지칭한다.

fXa 의 저해제의 활성 또는 유사한 상들을 "중화", "역전" 또는 "대응" 하는 것은, 인자 Xa 저해 또는 fXa 저해제의 항응고 기능을 저해 또는 차단하는 것을 지칭한다. 상기 상들은 상기 기능의 부분적인 저해 또는 차단 뿐만 아니라 시험관내 및/또는 생체내 fXa 저해제의 대부분 또는 전부를 저해 또는 차단하는 것을 지칭한다.

특정 구현예에서, 인자 Xa 저해제가 실질적으로 중화되었음은, 직접적으로든 또는 간접적으로든 인자 Xa 를 저해하는 그의 능력이 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상 또는 100% 감소되었음을 의미한다.

용어 "인지질막 결합" 은 음으로 하전된 인지질막 또는 기타 세포막, 예컨대 혈소판에 Ca²⁺ 이온의 존재 하에 결합하는 활성 fXa 의 능력을 지칭한다. 상기 결합은 fXa 의 Gla 도메인 중의 γ-카르복시글루탐산 잔기에 의해 중재된다.

용어 "감소된 상호작용" 은 야생형 fXa 와 일반적으로 결합하거나 또는 복합체를 형성하는 기타 보조 인자 또는 이온에 결합하거나 또는 함께 복합체를 형성하는 fXa 유도체의 능력 감소를 지칭한다. 상기 상호작용의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, fXa 의 Ca²⁺ 이온 및 인지질막과 결합, fV/fVa 또는 fVIII/f/VIIIa 와의 상호작용 등이 포함된다. 이온 또는 기타 보조인자와 fXa 유도체의 상호작용은 야생형 fXa 의 것의 50% 로 감소하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 상호작용은 야생형 fXa 의 10%, 1% 및 0.1% 로 감소한다. 이는 "프로트롬비나아제 복합체로 조립" 되는 유도체의 능력을 지칭한다.

"fXa 저해제 결합 활성" 은 fXa 의 저해제에 결합하는 분자의 능력을 지칭한다. 본 발명의 안티도트는 직접적이든 또는 간접적이든 fXa 저해제 결합 활성을 갖는다.

용어 "순환 반감기" 또는 "혈장 반감기" 는 단일 투여 후 혈장 내에서 순환하는 안티도트의 농도가 최초 농도의 절반으로 줄어드는데 필요한 시간을 지칭한다.

용어 "콘쥬게이션된 부분" 은 fXa 유도체의 잔기와 함께 공유 결합을 형성함으로써 fXa 유도체에 추가될 수 있는 부분을 지칭한다. 상기 부분은 fXa 유도체의 잔기에 직접 결합할 수 있거나, 또는 이후에 fXa 유도체의 잔기와 공유 결합을 형성할 링커와 공유 결합을 형성할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "항체" 에는 온전한 항체 및 그의 임의의 항원 결합 절편 또는 단일쇄가 포함된다. 따라서, 용어 "항체" 에는 면역글로불린 분자의 적어도 일부를 포함하는 임의의 단백질 또는 펩티드가 포함된다. 상기의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 중쇄 또는 경쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 그의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 (FR) 영역 또는 이들의 임의의 부분, 또는 결합 단백질의 적어도 일부분이 포함된다.

항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있으며, 임의의 적합한 생물학적 공급원, 예를 들어 쥐과동물, 래트, 양 및 개로부터 단리될 수 있다.

"조성물" 은 활성제 및 불활성 (예를 들어, 검출가능한 약제 또는 표지) 또는 활성인 기타 화합물 또는 조성물, 예컨대 아쥬반트의 조합을 의미한다.

"약제학적 조성물" 은 시험관내, 생체내 또는 생체외 진단 또는 치료 용도에 적합하도록 만드는 불활성 또는 활성인 담체와 활성제의 조합을 포함하는 것을 의미한다.

"유효량" 은 원하는 생물학적 및/또는 치료 결과를 유도하기에 충분한 유도체의 양을 지칭한다. 상기 결과는 질환의 싸인, 징후 또는 원인의 완화 또는 생물학적 계의 임의의 기타 바람직한 변경일 수 있다. 본 발명에서, 상기 결과는 일반적으로 하기 중 하나 이상의 것과 수반된다: 환자에게 투여된 fXa 저해제의 중화, fXa 저해제의 항응고 활성의 역전, 혈장에서 fXa 저해제의 제거, 지혈의 복구 및 출혈의 감소 또는 정지. 유효량은 사용되는 특이적인 안티도트제, 대상체에 투여된 특이적인 fXa 저해제, fXa 저해제의 투여 요법, 안티도트의 투여 시간, 치료할 대상체 및 질환, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 심각성, 투여 방식 등에 따라 가변적이며, 이들 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 등은 본원에서 원하는 약학적 및/또는 생리학적 효과를 수득함을 의미하기 위해 사용된다. 상기 효과는 장애 또는 그의 싸인 또는 징후를 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 측면에서 예방적일 수 있고/있거나 장애 및/또는 장애에 따른 부작용의 부분적 또는 완전한 치유의 측면에서 치료적일 수 있다.

"치료하다" 는 또한 포유류에서의 장애의 임의의 치료를 포괄하며, 하기를 포함한다: (a) 장애에 잘 걸릴 수 있지만, 아직 그렇게 된 것으로 진단되지는 않을 수 있는 대상체에서의 장애 발생 예방, 예를 들어, 과량의 항응고제를 사용해 환자에서 출혈을 예방함; (b) 장애를 막음, 즉 그의 발생을 중지시킴, 예를 들어 출혈을 막음; 또는 (c) 장애를 개선 또는 완화시킴, 예를 들어 출혈을 감소시킴.

본원에 사용된 바와 같이, "치료" 는 추가로 병리적 측면과 연합된 징후 및/또는 징후 발생 지연의 전신적인 개선을 포함한다. "치료" 의 임상적 및 전임상적 증거는 병리적 측면, 개인 및 치료에 따라 가변적일 것이다.

"투여" 는 치료 과정을 통해 연속적으로 또는 간헐적으로 1 회 투여량으로 유효해질 수 있다. 투여의 가장 유효한 수단 및 투여량의 결정 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 요법에 이용되는 조성물, 요법의 목적, 치료할 표적 세포 및 치료할 대상에 따라 가변적일 것이다. 치료하는 임상의가 선택한 투여량 수준 및 패턴에 따라 단일 또는 다중 투여가 수행될 수 있다. 적합한 투여 제형물 및 투여 방법은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 약제 및 조성물은 의약 제조, 및 약제학적 조성물 중의 활성 성분과 같이 통상적인 절차에 따른 투여에 의한 인간 및 기타 동물의 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 약제는 임의의 적합한 경로, 구체적으로는 비경구 (피하, 근육내, 정맥내 및 피내 포함) 투여에 의해 요법을 위해 투여될 수 있다. 바람직한 경로는 수용자의 상태 및 연령, 및 치료할 질환에 따라 가변적일 것이다.

방법, 즉 인자 Xa 저해제의 저해 또는 역전이, 다수의 시험관내 검정, 예컨대 트롬빈 생성 검정 및, aPTT, PT 및 ACT 와 같은 임상적 혈병형성 검정에 의해 달성되는지 여부를 결정할 수 있다. .

DNA 또는 RNA 와 같은 핵산에 대해 본원에 사용된 용어 "단리된" 은 거대분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA 들로부터 각각 분리된 분자를 지칭한다. 용어 "단리된 핵산" 은 자연적으로 발생하지 않은 절편들인 핵산 절편 및 자연 상태에서는 관찰되지 않는 절편들을 포함한다. 용어 "단리된" 은 또한 본원에서 기타 세포 단백질로부터 분리된 폴리펩티드 및 단백질을 지칭하며, 정제 및 재조합 폴리펩티드의 두가지 모두를 포함하는 것을 의미한다. 다른 구현예에서, 용어 "단리된" 은, 자연에서는 일반적으로 연합되어 있는 세포, 조직, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 절편(들) 이 내용물, 세포 및 그 외의 것들로부터 분리되어 있음을 의미한다. 예를 들어, 단리된 세포는 같지 않은 표현형 또는 유전자형의 조직 또는 세포로부터 분리된 세포이다. 당업자에게는 자명한 바와 같이, 비-자연발생 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 절편(들)은 그것을 그의 자연 발생 대응체와 구분하기 위한 "분리" 를 필요로 하지 않는다.

본원에 사용된 바와 같이, 기준 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산을 언급할 때 용어 "그의 등가물" 은, 원하는 관능성은 유지하면서도 최소한의 상동성을 갖는 것을 의미한다. 본원에서 언급하는 임의의 개질된 단백질은 또한 그의 등가물을 포함하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 상동성은 75 % 이상의 상동성, 대안적으로는 80 % 이상, 또는 대안적으로는 85 % 이상, 또는 대안적으로는 90 % 이상, 또는 대안적으로는 95 % 이상, 또는 대안적으로는 98 % 의백분율 상동성일 수 있으며, 기준 폴리펩티드 또는 단백질과 실질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 정렬시 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역 (또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역) 이 또다른 서열에 대해 특정한 백분율 (예를 들어, 80%, 85%, 90% 또는 95%) 의 "서열 동일성" 을 갖는다는 것은, 두 서열의 비교에서 해당 백분율의 염기 (또는 아미노산) 가 동일하다는 것을 의미한다. fXa 의 중쇄 (또는 관련된 세린 프로테아제) 만 사용되는 경우, 전체적인 상동성은, 예를 들어 65% 또는 50% 와 같이 75% 미만이 될 수 있으나, 원하는 관능성은 남아있다는 점에 유의한다. 이러한 정렬 및 백분율 상동성 또는 서열 동일성은 당업계에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel 등 편저, 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1 에 기재된 것을 이용하여 결정할 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 파라미터가 정렬에 이용된다. 바람직한 정렬 프로그램은, 디폴트 파라미터를 이용하는 BLAST 이다. 특히, 바람직한 프로그램은 하기의 디폴트 파라미터를 이용하는 BLASTN 및 BLASTP 이다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 표준 = 양쪽 모두; 컷오프 = 60; 예상값 = 10; 매트릭스 = LOSUM62; 기술 = 50 개 서열; 분류 기준 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-불요성 (non-redundant), GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translation + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세한 사항은 하기의 인터넷 주소에서 찾을 수 있다 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.

용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드" 는 호환되어 사용되며, 임의의 길이의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 이들의 유사체인 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3 차 구조를 가질 수 있으며, 공지 또는 비공지의 임의의 관능을 수행할 수 있다. 하기의 것은 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예시이다: 유전자 또는 유전자 절편 (예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 이동 RNA, 리보솜 RNA, 라이소자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 개질된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 개질은 폴리뉴클레오티드의 조립 이전 또는 이후에 부여할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 구성원에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후, 예컨대 표지화 성분과의 콘쥬게이션에 의해 추가로 개질될 수 있다. 상기 용어는 또한 이중- 및 단일-가닥 분자의 두가지 모두를 지칭한다. 달리 특정화되거나 또는 필요한 것이 아니면, 폴리뉴클레오티드인 본 발명의 임의의 구현예는, 이중 가닥 형태 및 이중 가닥 형태를 만드는 것으로 공지되어 있거나 또는 예상되는 2 개의 각 상보적인 단일 가닥 형태를 모두 포함한다.

폴리뉴클레오티드는 4 가지 뉴클레오티드의 특이적인 서열을 포함하여 이루어진다: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 티민 (T); 및 폴리뉴클레오티드가 RNA 일 때는 티민 대신 우라실 (U). 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드 서열" 은 폴리뉴클레오티드 분자의 알파벳 표시이다. 상기 알파벳 표시는 중앙 처리 유닛을 가진 컴퓨터에서 데이터베이스로 입력될 수 있고, 기능 유전체학 및 상동성 검색과 같은 생물정보학에 이용될 수 있다.

"상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성" 은 두 펩티드간 또는 두 핵산 분자간 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교를 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열에서의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교하는 서열에서의 위치가 동일한 염기 및 아미노산으로 채워질 때, 분자들은 그 위치에서 상동이다. 서열간 상동성 정도는 서열간 매칭되는 수 또는 상동성 위치 갯수의 함수이다. "무관" 또는 "비상동성" 서열은 본 발명의 서열들 중 하나와 40% 미만의 동일성, 대안적으로는 25% 미만의 동일성을 공유한다.

폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역 (또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역) 이 또다른 서열과 특정 백분율 (예를 들어, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%) 의 "서열 동일성" 을 갖는다는 것은, 정렬시 해당 백분율의 염기 (또는 아미노산) 가 두 서열 비교시 동일하다는 것을 의미한다. 상기 정렬 및 백분율 상동성 또는 서열 동일성은 당업계에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 Ausubel 등 편저 (2007) Current Protocols in Molecular Biology 에 기재되어 있는 것을 이용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는, 디폴트 파라미터가 정렬에 이용된다. 한가지 정렬 프로그램은, 디폴트 파라미터를 이용하는 BLAST 이다. 특히, 프로그램은 하기 디폴트 파라미터를 이용하는 BLASTIN 및 BLASTP-1 이다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽 모두; 컷오프 = 60; 예상치 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 기술 = 50 개 서열; 분류 기준 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-불요성 (non-redundant), GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR. 상기 프로그램의 상세한 사항은 하기의 인터넷 주소로 찾을 수 있다: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi, 마지막 접근은 2007 년 11 월 26 일. 생물학적으로 동등한 폴리뉴클레오티드는 특정 백분율의 상동성을 갖고, 동일하거나 또는 유사한 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 것이다.

용어 "핵산의 상동성" 은 핵산의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보물과 특정 정도의 상동성을 가진 뉴클레오티드 서열을 가진 핵산을 지칭한다. 이중 가닥 핵산의 상동물은 특정 정도의 상동성을 가진 뉴클레오티드 서열 또는 그의 상보물을 포함하는 것을 의도로 한다. 한 국면에서, 핵산의 상동물은 그 핵산 또는 그의 상보물에 혼성화할 수 있다.

"유전자" 는, 전사 및 번역 후 특별한 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩할 수 있는 오픈 리딩 프레임 (ORF) 을 하나 이상 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 이들이 연합된 유전자의 더 큰 절편 또는 전장 코딩 서열을 동정하기 위해 이용될 수 있다. 더 큰 절편 서열의 단리 방법은 당업계에 공지되어 있다.

용어 "발현" 은 유전자 생성물의 생산을 지칭한다.

본원에 사용한 바와 같이, "발현" 은 폴리뉴클레오티드가 mRNA 로 전사되는 프로세스 및/또는 전사된 mRNA 가 후속하여 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 프로세스를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA 로부터 유도되는 경우, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA 의 스플라이싱을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 적용될 때의 용어 "코딩" 은, 폴리펩티드를 그의 자연 상태에서 또는 당업자에게 널리 공지된 방법으로 취급할 때, 해당 폴리펩티드 및/또는 그의 절편에 대한 mRNA 를 생산하도록 전사 및/또는 번역될 수 있으면 폴리펩티드를 "코딩" 하는 것으로 언급되는, 폴리뉴클레오티드와 관련있다. 안티센스 가닥은 상기 핵산에 상보적인 것이며, 코딩 서열은 그로부터 추론될 수 있다.

"펩티드 콘쥬게이트" 는 하나 이상의 폴리펩티드 및 또다른 화학적 또는 생물학적 화합물의 공유 또는 비공유 결합에 의한 회합을 지칭한다. 비제한적 예시에서, 폴리펩티드와 화학적 화합물의 "콘쥬게이션" 은 의도하는 목적에 대한 폴리펩티드의 개선된 안정성 또는 효능을 제공한다. 한 구현예에서, 펩티드는 담체에 콘쥬게이션되며, 여기서 담체는 리포좀, 미셀 또는 약제학적으로 허용되는 중합체이다.

"리포좀" 은 중심이 지질 이중층으로 이루어진 현미경 수준의 액포이다. 구조적으로, 리포좀은 수백 옹스트롬 내지 밀리미터의 몇분의 일이 되는 크기의 긴 관 내지 구체인 크기 및 형태를 갖춘다. 액포-형성 지질은, 외층의 지질 조성을 제공하는 최종 복합체의 특정 정도의 유동성 또는 경직성을 달성하도록 선택된다. 이들은 중성 (콜레스테롤) 또는 쌍극성이며, 여기에는 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린 (PC), 포스파티딜에탄올아민 (PE), 포스파티딜이노시톨 (PI), 및 스핑고미엘린 (SM) 및, 탄소 사슬 길이가 14 내지 22 의 범위이며 포화 또는 하나 이상의 이중 C=C 결합을 가진, 이에 제한되지 않으나 디올레일포스파티딜에탄올아민 (DOPE) 을 포함하는 기타 유형의 쌍극성 지질이 포함된다. 단독으로, 또는 다른 지질 성분과 함께 병용되어 안정한 리포좀을 생산할 수 있는 지질의 예시는, 인지질, 예컨대 수소화 대두 포스파티딜콜린 (HSPC), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 세팔린, 카르디올리핀, 포스파티드산, 세레브로사이드, 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 디올레일포스파티딜콜린 (DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 팔미토일올레일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레일포스파티딜에탄올아민 (POPE) 및 디올레일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도-메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (DOPE-mal) 이다. 리포좀에 혼입될 수 있는, 추가적인 지질 함유 비-인에는, 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 이소프로필 미리스테이트, 트리에탄올아민-라우릴 설페이트, 알킬-아릴 설페이트, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤 리시놀레에이트, 헥사데실 스테레에이트, 암포테르 아크릴 중합체, 폴리에틸옥실화 지방산 아민 및 상기 언급한 양이온성 지질 (DDAB, DODAC, DMRIE, DMTAP, DOGS, DOTAP (DOTMA), DOSPA, DPTAP, DSTAP, DC-Chol) 이 포함된다. 음으로 하전된 지질에는 포스파티드산 (PA), 디팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 디올레일포스파티딜글리세롤 및 (DOPG), 액포를 형성할 수 있는 디세틸포스페이트가 포함된다. 일반적으로, 리보좀은 그의 전체적인 크기 및 라멜라 구조를 근거로 3 개의 카테고리로 나뉘어질 수 있다. 1977 년 12 월에 개최된 New York Academy Sciences Meeting, "Liposomes and Their Use in Biology and Medicine" 에서 개발한 3 개의 분류군은, 멀티-라멜라 액포 (MLV), 소형 유니-라멜라 액포 (SUV) 및 대형 유니-라멜라 액포 (LUV) 이다.

"미셀" 은 액체 콜로이드에 분산된 계면활성제 분자의 응집물이다. 수용액 중의 전형적인 미셀은, 미셀 중심에 소수성 꼬리 영역이 격리되어 있고, 주변의 용매와 접촉하는 친수성 "헤드" 영역이 있는 응집체를 형성한다. 이러한 유형의 미셀은 정상 미셀 (수중유 미셀) 로 공지되어 있다. 역전된 미셀은 꼬리가 밖으로 나와있고 중심에 헤드 군이 있다 (유중수 미셀). 미셀은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체 또는 본원에 기재된 조성물의 표적 세포 또는 조직으로의 효율적인 전달을 촉진하기 위해 사용될 수 있다.

어구 "약제학적으로 허용되는 중합체" 는 본원에 기재된 하나 이상의 폴리펩티드에 콘쥬게이션될 수 있는 화합물의 군을 지칭한다. 폴리펩티드에 대한 중합체의 콘쥬게이션은 생체내에서 및 시험관내에서 폴리펩티드의 반감기를 연장시킬 수 있다. 비제한적 예시에는, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알콜, 셀룰로오스 유도체, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 당, 폴리올 및 이들의 혼합물이 포함된다.

"유전자 전달 비히클" 은 숙주 세포에 삽입된 폴리뉴클레오티드를 보유할 수 있는 임의의 분자로 정의된다. 유전자 전달 비히클의 예시는, 리포좀, 미셀, 천연 중합체 및 합성 중합체를 포함하는 생물상용성 중합체; 지질단백질; 폴리펩티드; 다당류; 지질다당류; 인공 바이러스 외피; 금속 입자; 및 박테리아 또는 바이러스, 예컨대 바큘로바이러스, 아데노바이러스 및 레트로바이러스, 박테리오파지, 코스미드, 플라스미드, 진균 벡터 및, 각종 진핵성 및 원핵성 숙주에서의 발현에 대해 기재되어 있고 유전자 요법 및 단순 단백질 발현에 이용될 수 있는, 당업계에서 일반적으로 사용되는 기타 재조합 비히클이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유전자 전달 비히클을 이용하여 세포 또는 조직에 전달될 수 있다. 본원에 사용된 "유전자 전달", "유전자 이동", "형질유도" 등은, 도입에 이용된 방법에 상관없이, 외인성 폴리뉴클레오티드 (종종 "트랜스유전자 (transgene)" 으로 지칭됨) 의 숙주 세포로의 도입을 지칭한다. 상기 방법에는, (예를 들어, 바이러스 감염/트랜스펙션, 또는 각종 기타 단백질-기재 또는 지질-기재 유전자 전달 복합체에 의한) 벡터 개재 유전자 이동 뿐만 아니라 "네이키드" 폴리뉴클레오티드의 전달을 촉진하는 기법 (예컨대, 전자천공, "유전자 총 (gene gun)" 전달 및 폴리뉴클레오티드 도입을 위해 이용되는 각종 기타 기법들) 이 포함된다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에서 안정하게 또는 일시적으로 유지될 수 있다. 안정한 유지는 일반적으로 도입된 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포와 상용성인 복제 기원을 포함하거나 또는, 예컨대 염색체외 레플리콘 (예를 들어, 플라스미드) 또는 핵 또는 미토콘드리아 염색체에 통합하는 것을 필요로 한다. 당업계에 공지된 바 및 본원에 기재된 바와 같이, 다수의 벡터가 포유류 세포에 대한 유전자 이동을 매개할 수 있는 것으로 공지되어 있다.

"바이러스 벡터" 는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 숙주 세포에 전달되는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합적으로 생산된 바이러스 또는 바이러스 입자로 정의된다. 바이러스 벡터의 예시에는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-회합성 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 등이 포함된다. 알파바이러스 벡터, 예컨대 셈리키 포레스트 (Semliki Forest) 바이러스-기재 벡터 및 신드비스 (Sindbis) 바이러스-기재 벡터는 또한 유전자요법 및 면역요법에서의 이용을 위해 개발되었다. 참고문헌은, Schlesinger 및 Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 및 Ying, 등 (1999) Nat. Med. 5(7):823-827. 유전자 이동이 레트로바이러스 벡터에 의해 매개되는 국면에서, 벡터 구축물은 레트로바이러스 게놈 또는 그의 일부 및 치료 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "레트로바이러스 매개 유전자 이동" 또는 "레트로바이러스 형질도입" 은 유전자 또는 핵산 서열이, 세포에 출입하여 그의 게놈을 숙주 세포에 통합하는 바이러스로 인해 안정하게 숙주 세포로 이동하는 프로세스를 지칭한다. 바이러스는 그의 정상적인 감염 메커니즘을 통해 숙주 세포에 출입할 수 있거나, 또는 세포에 출입하기 위해 상이한 숙주 세포 표면 수용체 또는 리간드에 결합하도록 개질될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 레트로바이러스 벡터는 바이러스 또는 바이러스형 출입 메커니즘을 통해 외인성 핵산을 세포로 도입할 수 있는 바이러스 입자를 지칭한다.

레트로바이러스는 RNA 형태로 그의 유전자 정보를 보유한다; 그러나 일단 바이러스가 세포에 침입하면, RNA 는 감염된 세포의 게놈 DNA 로 통합하는 DNA 형태로 역전사된다. 통합된 DNA 형태는 프로바이러스 (provirus) 로 지칭된다.

아데노바이러스 (Ad) 또는 아데노-회합성 바이러스 (AAV) 와 같은 DNA 바이러스 벡터에 의해 유전자 이동이 매개되는 국면에서, 벡터 구축물은 바이러스 게놈 또는 그의 일부, 및 트랜스유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 아데노바이러스 (Ad) 는 비교적 특징분석이 잘 되어 있는, 50 가지가 넘는 항원형을 포함하는 바이러스의 동질 군이다. 참고문헌은, 예를 들어, 국제 PCT 출원 WO 95/27071. Ad 는 숙주 세포 게놈으로의 통합을 필요로 하지 않는다. 재조합성 Ad 유도성 벡터, 특히 야생형 바이러스의 재조합 및 생성에 대한 잠재성을 감소시키는 것이 또한 구축되어 있다. 참고문헌은, 국제 PCT 출원 WO 95/00655 및 WO 95/11984. 야생형 AAV 는 높은 감염성 및 숙주 세포 게놈으로 통합하는 높은 특이성을 갖고 있다. 참고문헌은, Hermonat 및 Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 및 Lebkowski 등 (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996.

폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결될 수 있는 클로닝 부위 및 프로모터를 모두 포함하는 벡터는 당업계에 널리 공지되어 있다. 그러한 벡터는 시험관내 또는 생체내에서 RNA 를 전사할 수 있으며, Stratagene (La Jolla, CA) 및 Promega Biotech (Madison, WI) 와 같은 공급처로부터 시판되어 입수가능하다. 발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위해서는, 클론의 5' 및/또는 3' 비번역 부분을 제거, 추가 또는 변경하여, 전사 또는 번역 단계에서 발현을 방해 또는 감소시킬 수 있는 번외의, 잠재적으로 부적당한 대안적인 번역 개시 코돈 또는 기타 서열을 제거하는 것이 필요할 수 있다. 대안적으로, 콘센서스 리보좀 결합 부위를 개시 코돈의 5' 에 바로 삽입하여 발현을 증강시킬 수 있다.

유전자 전달 비히클은 또한 DNA/리포좀 복합체, 미셀 및 표적화된 바이러스 단백질-DNA 복합체를 포함한다. 표적 항체 또는 그의 절편을 포함하는 리포좀이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다. 세포로의 전달을 증강시키기 위해, 본 발명의 핵산 또는 단백질은 세포 표면 항원, 예를 들어 줄기 세포 또는 심근세포에서 발견되는 세포 표면 마커에 결합하는 항체 또는 그의 결합 절편에 콘쥬게이션될 수 있다. 세포 또는 세포 집단에 대한 폴리뉴클레오티드의 전달에 추가하여, 세포 또는 세포 집단에 대한 본원에 기재된 단백질의 직접적인 도입을 단백질 트랜스펙션의 비제한적 기법으로 수행할 수 있거나, 대안적으로는 본 발명의 단백질의 발현 및/또는 활성 촉진을 증강시킬 수 있는 배양 조건이 기타 비제한적 기법이다.

어구 "고체 지지체" 는 "배양 플레이트", "유전자칩" 또는 "마이크로어레이" 와 같은 비수성 표면을 지칭한다. 상기 유전자칩 또는 마이크로어레이는 당업자에게 공지된 다수의 기법으로 진단 및 치료 목적을 위해 이용될 수 있다. 한가지 기법에서는, 올리고뉴클레오티드가, U.S. 특허 6,025,136 및 6,018,041 에 개요된 것과 같이, 혼성화 접근법으로 DNA 서열을 결정하기 위한 유전자칩 상에 배치된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 프로브로 개질될 수 있으며, 이어서 유전자 서열 검출을 위해 이용될 수 있다. 상기 기법은, 예를 들어 U.S. 특허 5,968,740 및 5,858,659 에 기재되어 있다. 프로브는 또한 Kayem 등, U.S. 특허 5,952,172 및 Kelley 등 (1999) Nucleic Acids ReS. 27:4830-4837 에 기재된 것들과 같이, 핵산 서열의 전기화학적 검출을 위해 전극 표면에 고정될 수 있다.

각종 "유전자칩" 또는 "마이크로어레이" 및 유사한 기법이 당업계에 공지되어 있다. 상기의 예시에는, 이제 제한되지 않으나, LabCard (ACLARA Bio Sciences Inc.); GeneChip (Affymetric, Inc); LabChip (Caliper Technologies Corp); 전기화학적 감지가 있는 저밀도 어레이 (Clinical Micro Sensors); LabCD 시스템 (Gamera Bioscience Corp.); Omni Grid (Gene Machines); Q Array (Genetix Ltd.); 액상 발현 기법을 이용하는, 고속처리 자동화 질량 분광계 시스템 (Gene Trace Systems, Inc.); 열 젯트 스팟팅 시스템 (Hewlett Packard Company); Hyseq HyChip (Hyseq, Inc.); BeadArray (Illumina, Inc.); GEM (Incyte Microarray Systems); 다중 유리 슬라이드 상에 12 내지 64 스팟을 분산시킬 수 있는 고속처리 마이크로어레이 시스템 (Intelligent Bio-Instruments); Molecular Biology Workstation and NanoChip (Nanogen, Inc.); 마이크로플루이드 유리칩 (Orchid biosciences, Inc.); 4 개의 PiezoTip 압전기의 드롭-온-디멘드 (drop-on-demand) 팁이 있는 BioChip Arrayer (Packard Instruments, Inc.); FlexJet (Rosetta Inpharmatic, Inc.); MALDI-TOF 질량분광계 (Sequnome); ChipMaker 2 및 ChipMaker 3 (TeleChem International, Inc.); 및 Heller (2002) Annu. Rev. BiomeD. Eng. 4:129-153 에서 동정하고 기재한 GenoSensor (Vysis, Inc.) 이 포함된다. "유전자칩" 또는 "마이크로어레이" 의 예시는 또한 U.S. 특허 공보: 2007-0111322, 2007-0099198, 2007-0084997, 2007-0059769 및 2007-0059765 및 U.S. 특허 7,138,506, 7,070,740, 및 6,989,267 에 기재되어 있다.

한 국면에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체와 상동성인 프로브 또는 프라이머를 포함하는 "유전자칩" 또는 "마이크로어레이" 를 제조한다. 적합한 시료는 환자로부터 수득되며, 게놈 DNA, RNA, 단백질 또는 이들의 임의의 조합의 추출을 수행하며, 필요한 경우 증폭시킨다. 시료는, 유전자칩 또는 마이크로어레이 상에 포함된 프로브(들) 또는 프라이머(들)에 대한, 관심대상의 유전자(들) 또는 유전사 생성물(들)의 혼성화에 적합한 조건 하에, 유전자칩 또는 마이크로어레이 패널에 접촉시킨다. 프로브 또는 프라이머는 검출가능하게 표지함으로써 관심대상의 유전자(들)을 동정해낼 수 있다. 대안적으로, 화학적 또는 생물학적 반응을 이용하여 관심대상의 DNA 또는 RNA 와 혼성화하는 프로브 또는 프라이머를 동정할 수 있다. 이어서, 환자의 유전자형 또는 표현형을 상기 언급한 기구 및 방법의 보조로 결정한다.

고상 지지체의 기타 비제한적 예시에는, 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렝, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 및 개질 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 반려암 및 자석이 포함된다. 담체의 특성은 어느 정도 가용성이거나 또는 불용성일 수 있다. 지지체 재료는, 커플링되는 분자가 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체에 결합할 수 있는 한, 실질적으로 임의의 가능한 구조 배치를 가질 수 있다. 따라서, 지지체 배치는 구형, 비드, 원통형, 시험관 내부 표면, 또는 막대의 외부 표면일 수 있다. 대안적으로, 표면은 쉬트, 테스트 스트립 등과 같이 평평한 것이거나 또는 대안적으로 폴리스티렌 비드일 수 있다. 당업자는 항체 또는 항원 결합에 적합한 다수의 기타 담체들을 알거나 또는 일상적인 실험을 이용해 그것을 알아낼 수 있을 것이다.

"진핵 세포" 는 모네라(monera)계를 제외한 모든 계의 생물을 포함한다. 이들은 막-결합 핵을 통해 쉽게 구분될 수 있다. 동물, 식물, 균류 및 원생생물은 진핵생물이거나 또는 세포가 내부 막 및 세포골격에 의해 복합체 구조로 조직화되는 유기체이다. 가장 특징적인 막-결합 구조는 핵이다. 진핵성 숙주에는, 예를 들어, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포가 포함된다. 비제한적 예시에는 유인원, 소, 돼지, 쥐과동물, 래트, 조류, 파충류 및 인간이 포함된다.

"원핵 세포" 는 일반적으로 핵 또는 임의의 기타 막-결합 세포 기관이 없고, 박테리아 및 아키온 (archaeon) 의 두 무리로 나뉜다. 추가로, 염색체 DMA 대신에, 이들의 세포 유전자 정보는 플라스미드로 지칭되는 원형 루프에 있다. 박테리아 세포는 매우 작고, 대략 크기가 동물 미토콘드리아의 것과 같다 (직경이 약 1 내지 2 ㎛ 이며 길이가 10 ㎛). 원핵 세포는 세가지 주된 형태를 특징으로 한다: 간상형, 구형 및 나선형. 진핵생물에서와 같은 정교한 복제 과정을 거치는 것 대신에, 박테리아 세포는 이분법 (binary fission) 으로 분열한다. 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 에셰리키아 콜라이 (E. coli) 박테리아 및 살모넬라 박테리아가 포함된다.

본원에 사용된 용어 "인간 항체" 는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 가진 항체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이) 를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체" 는, 마우스같은 또다른 포유류 종의 생식세포로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프트된 항체를 포함하는 것을 의미하지는 않는다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체" 는, 단백질의 실질적으로 모든 부분 (예를 들어, CDR, 프레임워크, C_L, C_H 도메인 (예를 들어, C_H1, C_H2, C_H3), 힌지 (VL, VH)) 에 오직 미미한 서열 변경 또는 변이가 있을 뿐 인간에서 실질적으로 비면역원성인 항체를 지칭한다. 유사하게, 영장류 (원숭이, 개코원숭이, 침팬지 등), 설치류 (마우스, 래트, 토끼, 기니피그, 햄스터 등) 및 기타 포유류로 지정된 항체들은 상기 종, 아속, 속, 아군, 군 특이적 항체를 지정한다. 추가로, 키메라성 항체는 상기의 임의의 조합을 포함한다. 상기 변경 또는 변이는 임의로는 그리고 바람직하게는, 비-개질 항체에 비해 인간 또는 기타 종들에서 면역원성을 유지 또는 감소시킨다. 따라서, 인간 항체는 키메라성 또는 인간화 항체와는 구분된다. 인간 항체가, 기능적으로 재배열된 인간 면역글로불린 (예를 들어, 중쇄 및/또는 경쇄) 유전자의 발현이 가능한 비-인간 동물 또는 원핵성 또는 진핵성 세포에 의해 제조될 수 있다는 점에 유의한다. 추가로, 인간 항체가 단일쇄 항체인 경우, 네이티브 인간 항체에서는 발견되지 않는 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, Fv 는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 연결하는 2 내지 약 8 개의 글리신 또는 기타 아미노산 잔기와 같은 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 상기 링커 펩티드는 인간 기원의 것이 고려된다.

본원에 사용된 바와 같이, 항체가, 예를 들어 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 면역화하거나 또는 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 스크리닝함으로써 인간 면역글로불린 서열을 이용하는 계로부터 수득되는 경우, 인간 항체가 특별한 생식세포 서열"로부터 유도" 된다. 인간 생식세포 면역글로불린 서열"로부터 유도" 된 인간 항체는, 인간 항체의 아미노산 서열과 인간 생식세포 면역글로불린의 아미노산 서열을 비교함으로써 동정될 수 있다. 선별된 인간 항체는 일반적으로 인간 생식세포 유전자로 코딩되는 아미노산 서열과 90% 이상 동일하며, 기타 종들의 생식세포 면역글로불린 아미노산 서열 (예를 들어, 쥐과동물 생식세포 서열) 과 비교했을 때 상기 인간 항체를 인간의 것으로 식별하는 아미노산 잔기를 포함한다. 특정한 경우, 인간 항체는 생식세포 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산의 서열에 대해 아미노산 서열이 95% 이상, 또는 심지어 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일할 수 있다. 일반적으로, 특별한 인간 생식세포 서열로부터 유도된 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 상이한 아미노산이 10 개 이하이다. 특정한 경우, 인간 항체는 생식세포 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 상이한 아미노산이 5 개 이하, 또는 심지어 4, 3, 2 또는 1 개 이하일 수 있다.

"인간 모노클로날 항체" 는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 가진 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 상기 용어는 또한 재조합 인간 항체를 의미한다. 상기 항체의 제조 방법은 하기에 기재되어 있다.

본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체" 에는, 재조합적 수단에 의해 제조, 발현, 창안 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자 또는 그로부터 제조된 하이브리도마에 대한 트랜스제닉 또는 트랜스크로조말 (transchrosomal) 인 동물 (예를 들어, 마우스) 로부터 단리된 항체, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, 재조합성의, 조합된 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것과 연관된 임의의 기타 수단에 의해 제조, 발현, 창안 또는 단리된 항체가 포함된다. 상기 재조합성 인간 항체는 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 및 불변 영역을 갖고 있다. 그러나, 특정 구현예에서, 상기 재조합성 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 이용되는 경우에는, 생체내 체세포 돌연변이유발) 에 적용하며, 이에 따라 재조합성 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열이, 인간 생식세포 VH 및 VL 서열로부터 유도되어 연관관계가 있을 때, 생체내 인간 항체 생식세포 레퍼토리에는 자연적으로는 존재하지 않을 수 있다. 상기 항체의 제조 방법은 하기에 기재된다.

본원에 사용된 바와 같이, "이소타입" 은 중쇄 불변 영역 유전자로 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어, IgM 또는 IgGl) 를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "폴리클로날 항체" 또는 "폴리클로날 항체 조성물" 은 상이한 B-세포주로부터 유도된 항체의 제제를 지칭한다. 이들은 각각 상이한 에피토프를 인식하는 특이적인 항원에 대해 분비되는 면역글로불린 분자의 혼합물이다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물" 은 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특별한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "표지" 는 검출할 조성물, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질, 예컨대 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 콘쥬게이션되어 "표지된" 조성물을 생성하기 위한, 직접적으로 또는 간접적으로 검출가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 상기 용어는 또한 삽입된 서열, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP) 등의 발현시 시그널을 제공하는 폴리뉴클레오티드에 콘쥬게이션된 서열이 포함된다. 표지는 자체로 (예를 들어, 방사성동위원소 표지 또는 형광 표지) 검출가능하거나 또는, 효소 표지의 경우 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학물 변경을 촉매작용할 수 있다. 표지는 작은 규모의 검출에 적합할 수 있고, 또는 고속처리 스크리닝에 더욱 적합할 수 있다. 이와 같이, 적합한 표지에는, 이에 한정되지 않으나, 방사성동위원소, 플루오로크롬, 화학발광 화합물, 염료, 및 효소를 포함하는 단백질이 포함된다. 표지는 단순하게 검출될 수 있거나 또는 정량될 수 있다. 단순하게 검출되는 응답은 일반적으로 그의 존재가 단지 확인되는 응답을 포함하는 반면, 정량되는 응답은 일반적으로 강도, 극성 및/또는 기타 특성과 같은 정량가능한 (예를 들어, 숫자로 기록가능한) 값을 가진 응답을 포함한다. 발광 또는 형광 검정에서, 검출가능한 응답은 일반적으로 결합에 실제적으로 관여하는 검정 성분과 연합된 발광자 또는 형광자를 이용하여 직접적으로 생성되거나 또는 또다른 성분 (예를 들어, 리포터 또는 지시약) 과 연합된 발광자 또는 형광자를 이용하여 간접적으로 생성될 수 있다.

시그널을 제공하는 발광 표지의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 생물발광 및 화학발광이 포함된다. 검출가능한 발광 응답은 일반적으로 발광 시그널의 변경 또는 발생을 포함한다. 발광 표지 검정에 적합한 방법 및 발광자는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (제 6 판) 에 기재되어 있다. 발광 프로브의 예시에는, 이에 제한되지 않으나 애쿠오린 및 루시퍼라아제가 포함된다.

적합한 형광 표지의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 플루오레신, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라시테 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, Cascade Blue^TM, 및 텍사스 레드가 포함된다. 기타 적합한 광학 염료는 Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (제 6 판) 에 기재되어 있다.

또다른 국면에서, 형광 표지는 세포 표면 마커와 같이, 세포 또는 조직의 표면에 존재하는 세포 성분에 대한 공유 결합을 촉진하도록 관능화된다. 이에 제한되지 않으나, 적합한 관능기에는, 이소티오시아네이트기, 아미노기, 할로아세틸기, 말레이미드, 숙신이미딜 에스테르 및 술포닐 할라이드가 포함되며, 이들은 모두 형광 표지를 제 2 분자에 결합시키기 위해 이용될 수 있다. 형광 표지의 관능기의 선택은 링커, 약제, 마커 또는 2 차 표지화제 대한 결합 부위에 좌우될 것이다.

II. 본 발명의 방법

본 발명의 한 국면은 항응고 요법 중인 대상체에 유효량의 인자 Xa 단백질 유도체를 투여함으로써 그 대상체에서의 출혈을 예방 또는 감소시키는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 유도체는 개질된 활성 부위 및/또는 개질된 Gla-도메인을 가짐으로써, 응고촉진 활성이 감소되거나 또는 없어진다. 유도체들은 안티도트로서 작용하고, 저해제의 항응고 활성을 실질적으로 중화시킨다. 한 구현예에서, 유도체는 Gla-결핍성이거나 또는 Gla-도메인이 없다. 대상체는 포유류이거나 또는 더욱 특별하게는 인간일 수 있다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 대상체에서 외부에서 투여된 인자 Xa 저해제에 선택적으로 결합 및 저해하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 환자에게 상기 기재된 유효량의 인자 Xa 유도체를 투여하는 것을 포함한다. 대상체는 세포 또는 포유류, 예컨대 인간일 수 있다.

상기 요법에 적합한 환자는 선행한 항응고 요법을 한 적이 있으며, 예를 들어 이들은 하나 이상의 항응고제, 예컨대 인자 Xa 의 저해제를 투여받았다. 인자 Xa 저해제인 항응고제의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 폰다파리눅스, 이드라파리눅스, 바이오틴화 이드라파리눅스, 에녹사파린, 프라그민, NAP-5, rNAPc2, 조직 인자 경로 저해제, DX-9065a, YM-60828, YM-150, 아픽사반, 리바록사반, PD-348292, 오타믹사반, DU-176b, LY517717, GSK913893, 저분자량 헤파린 및 베트릭사반, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 각종 항응고제의 공급원은 본 명세서에서 알게 된다.

한 국면에서, 유도체는 개질된 활성 부위 및/또는 개질 또는 제거된 Gla 도메인을 갖는다. 한 국면에서, 인자 Xa 유도체는 응고촉진 활성을 갖지 않거나 또는 나타내지 않는다. 상기 국면에서, 유도체는 서열 식별 번호 3 의 하나 이상의 아미노산 잔기 40 내지 448, 45 내지 448, 또는 46 내지 448 또는 이들의 등가물을 포함한다. 또다른 국면에서, 유도체는 서열 식별 번호 3 의 하나 이상의 아미노산 잔기 45 내지 139 및 195 내지 448 또는 46 내지 139 및 195 내지 448 또는 이들의 등가물을 포함한다.

본 발명의 또다른 국면에서, fXa 유도체는 fXa 단백질의 활성 부위의 3 차원 구조를 유지한다. des-Gla fXa 의 3 차원 구조에 관한 정보는 Brandstetter, H 등 J. Bio. Chem., 1996, 271 :29988-29992 에서 찾을 수 있다.

본 발명의 또다른 국면에서, fXa 유도체는 Gla 도메인 뿐만 아니라 3 개의 EGF 도메인들 중 하나가 결핍되어 있을 수 있다. 본 발명의 또다른 국면에서, fXa 유도체는 경쇄가 완전히 결핍되어 있다. 중쇄의 기타 개질은 저해제에 결합할 수 있는 관련 세린 프로테아제의 촉매 도메인을 포함할 수 있다. 관련 세린 프로테아제는 fXa 촉매 도메인과 충분한 구조적 유사성을 가진 촉매 도메인을 갖고 있으며, 따라서 소분자 fXa 저해제에 결합할 수 있다. 관련 세린 프로테아제의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 포유류 프로테아제, 예컨대 혈장 칼리크레인, 트롬빈 및 트립신 또는 박테리아 프로테아제 서브틸리신이 포함된다. 이들 유도체는 추가로 본원에 기재된 활성 부위 세린 (SER379) 또는 아스파르트산 (ASP282) 과 동등한 아미노산 잔기에서의 개질을 포함한다.

일부 구현예에서, 응고촉진 활성이 감소된 인자 Xa 단백질은 개질된 경쇄를 포함하며, 여기서 개질은 fXa 의 인지질막 결합을 경감시키는 Gla-도메인의 치환, 부가 또는 결실이다. 일부 구현예에서, fXa 의 프라임 아미노산은 변경되지 않으나, 특정 아미노산의 측쇄는 변경된다. fXa 의 인지질막 결합을 경감시키는 개질된 Gla-도메인의 예시는, 야생형 인간 인자 Xa 단백질의 Gla-도메인과 비교할 때 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 또는 결실이 있는, 서열 식별 번호 3 의 1 차 아미노산 서열 또는 그의 등가물을 가진 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 치환 또는 결실되는 하나 이상의 아미노산은 γ-카르복시글루탐산 (Gla) 이다. Gla 잔기는 서열 식별 번호 3 에서 아미노산 위치 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 32 및 39 에서 나타난다. 일부 구현예에서, 안티도트의 1 차 아미노산 서열은 서열 식별 번호 3 또는 그의 등가물과 동일하나, 비카르복시화, 미카르복시화 또는 탈카르복시화 인자 Xa 단백질이다. 일부 구현예에서, 안티도트는 des-Gla 안히드로-fXa 또는 des-Gla fX-S379A 이다. 일부 구현예에서, 인지질막 결합이 경감된 인자 Xa 단백질은 추가로 EGF1 및/또는 EGF2 (도 3 에 각각 아미노산 46 내지 84 및 85 내지 128 로 나타냄) 또는 일부, 즉 EGF1 및/또는 EGF2 도메인의 절편의 개질 또는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 온전한 경쇄 또는 실질적으로 온전한 경쇄는 개질 또는 제거된다. 예를 들어, 인지질막 결합이 경감된 개질된 fXa 단백질은 오직 중쇄만을 포함할 수 있거나, 또는 개질된 fXa 가 중쇄 및, 서열 식별 번호 3 에서 중쇄의 Cys302 와 단일 디설파이드 결합을 형성하는 아미노산 잔기인 Cys132 를 포함하는 경쇄의 절편을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유도체는 서열 식별 번호 12 의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유도체는 서열 식별 번호 13 를 포함하는 2 개의 사슬 폴리펩티드이다. 다른 국면에서, 유도체는 서열 식별 번호 15 의 폴리펩티드이다.

일부 구현예에서, 인자 Xa 단백질 유도체는 상기 인자 Xa 단백질의 촉매 도메인을 포함하는 개질된 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환이 서열 식별 번호 3 및 7 에서의 Glu216, Glu218, Arg332, Arg347, Lys351 및 Ser379 (키모트립신 넘버링에서는 각각 Glu37, Glu39, Arg150, Arg165, Lys169 및 Ser195) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 fXa 의 하나 이상의 아미노산 위치에 존재한다. 일부 구현예에서, 안티도트는 디히드로-알라닌 또는 알라닌에 대해 개질된 활성 부위 세린 (서열 식별 번호 3 및 7 에서 Ser379, 키모트립신 넘버링에서는 Ser195) 잔기가 있는 인자 Xa 단백질이다. 상기 개질은 야생형 fXa 단백질에 대해 또는 상기 기재된 임의의 개질된 fXa 단백질들 또는 절편들에 행해질 수 있다. 예를 들어, 실시예 1 에 기재된 디히드로-알라닌으로 치환된 활성 부위 세린 잔기를 가진 des-Gla 안히드로-fXa 는 안티도트 활성을 갖는다.

다른 국면에서, 유도체는 야생형 또는 자연 발생 인자 Xa 에 비해 ATIII, 보조인자 fV/fVa 및 fVIII/fVIIIa 과 경감된 상호작용을 갖는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환이 서열 식별 번호 3 및 7 에서의 아미노산 위치 Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414 또는 Arg424 (키모트립신 넘버링에서는 각각 Arg125, Glu129, Arg165, Lys169, Lys230 또는 Arg240) 에 존재한다. 상기 개질은 야생형 fXa 단백질에 또는 상기 기재된 임의의 개질된 fXa 단백질들 또는 절편들에 대해 행해질 수 있다.

다른 국면에서, 안티도트는 fXa 중쇄의 저해제 결합 능력을 모방할 수 있는 세린 프로테아제 촉매 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 상기 단백질은, 단백질 기질을 절단할 수 있는 세린 프로테아제 활성은 결핍되지만 활성 부위 클레프트 (cleft) 의 구조적인 특성은 여전히 갖고 있도록 재조합적으로 개질된 혈장 칼리크레인, 트롬빈, 트립신 (또는 그의 박테리아 상동체 서브틸리신) 과 같은 포유류 프로테아제를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 하나 이상의 개질된 인자 Xa 유도체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다. 조성물은 원하는 이득인 출혈의 감소 또는 정지를 제공하는 양으로 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 조성물은 인자 Xa 유도체의 활성을 보충 또는 증강시키는 임의의 적합한 약제 또는 요법과 병용투여될 수 있다. 그의 예시는 안티도트의 혈장 반감기를 연장시킬 수 있는 제 2 약제이다. 적합한 제 2 약제의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, fXa 중쇄의 엑소사이트 (exosite) 를 인식하는 항-fXa 항체 또는 알파-2-마크로글로불린 결합 fXa 유도체가 포함된다. fXa 유도체 및 제 2 약제 (엑소사이트 항체 또는 알파-2-마크로글로불린) 사이의 복합체 형성은 거대분자 상호작용을 차단하나, 활성 부위 의존성 저해제 결합의 능력은 유지한다. 병용 투여에 적합한 항-fXa 항체의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, Yang Y.H., 등, J Immunol. 2006, 1;177(11):8219-25, Wilkens, M. 및 Krishnaswamy, S., J. Bio. Chem., 2002, 277 (11), 9366-9374, 및 Church WR, 등, Blood, 1988, 72(6), 1911-1921 에 기재된 것이 포함된다.

일부 구현예에서, 인자 Xa 단백질은 화학물, 효소 또는 재조합적 수단에 의해 개질된다. 예를 들어, 활성 부위 Ser379 는 디히드로알라닌으로 화학적으로 개질될 수 있고, Gla 도메인은 실시예 1 에 기재된 바와 같이 키모트립신 소화에 의해 효소로 제거될 수 있다. 본원에 기재된 개질된 fXa 는 또한, 재조합성 안티도트 (r-안티도트) 의 직접 발현에 대해 실시예 7 에서 더욱 상세하게 기재된 야생형 fX (서열 식별 번호 2) 를 코딩하는 cDNA 의 서열을 개질함으로써 재조합적 수단으로 제조될 수 있거나, 또는 대안적으로는, 원하는 개질이 있는 fX 단백질이, 재조합적 수단에 이어, 개질된 fXa 에 대한 뱀독, 예를 들어 러셀 바이퍼 베놈 (Russell's viper venom) 및 fVIIa/조직 인자 또는 flXa/fVIIIa 의 복합체와 같은 활성화제에 의한 활성화에 의해 제조될 수 있다.

본원에 기재된 조성물의 투여 및 수반하는 방법으로 이득을 얻는 대상체에는, 임상적인 대량 출혈 발생 또는 임상적으로 중요한 경증 출혈을 겪고 있거나 또는 그런 성향이 있는 대상체가 포함된다. 임상적인 대량 출혈 발생의 예시는, 대출혈, 주요 장기로의 출혈, 재수술 또는 신규한 치료 과정이 필요한 출혈 및 연관된 명시적인 출혈의 출혈 지수 (Turpie AGG, 등, NEJM, 2001, 344: 619-625) 가 2.0 이상인 출혈로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 추가로, 대상체는 연속적이거나 또는 재발성이며 실질적인 양의 코피 또는 조정없이는 중지하지 않는 코피, 치료 과정을 필요로 하는 수준에는 이르지 않는 직장 또는 뇨관 출혈, 주사부위 또는 자발적이거나 또는 사소한 외상으로 발생하는 그밖의 부위에서의 실질적인 혈종, 혈액 배출을 필요로 하지 않는 수술 과정에서 일반적인 것보다 더 많은 실질적인 혈액 손실 및 계획에 없던 수혈을 필요로 하는 출혈로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경증 출혈을 겪고 있거나 또는 그런 성향이 있을 수 있다.

일부 구현예에서, 안티도트는 과다투여량의 fXa 저해제 투여 후 또는 대상체가 대출혈의 위험에 노출되어 있는 수술 전에 투여된다.

본원에 기재된 임의의 방법에서, 항상 명쾌하게 언급되지는 않더라도, 유효량의 유도체가 대상체에 투여된다는 것이 이해될 것이다. 상기 양은 치료하는 임상의에 의해 경험적으로 결정될 수 있으며, 대상체의 연령, 성별, 체중 및 건강상태에 따라 가변적일 것이다. 치료하는 임상의가 고려해야 할 추가적인 요인들에는, 이에 제한되지 않으나, 투여될 인자 Xa 저해제의 정체 및/또는 양, 안티도트가 대상체에 투여되는 방법 또는 양태, 안티도트의 제형 및 환자에 대한 치료 종결점이 포함된다. 이러한 변수들을 고려하여, 당업자는 치료 유효량을 치료할 대상체에게 투여한다. 대상체에서 항응고제와 대응하거나 또는 실질적으로 중화시키기에 충분한 본원에 기재된 안티도트의 치료 유효량은, 안티도트 대상체의 체중 킬로그램 당 안티도트를 약 0.01 밀리그램 내지 1 그램 함유할 수 있다. 약 10 나노몰농도 내지 약 100 마이크로몰농도, 또는 약 10 나노몰농도 내지 약 5 마이크로몰농도, 또는 약 100 나노몰농도 내지 약 2.5 마이크로몰농도 범위의 농도로 안티도트를 대상체에 제공할 수 있다는 것을 추가로 고려한다.

조성물은 대상체에서 인자 Xa 저해제를 직접적으로 또는 간접적으로 선별하여 인식 및 결합하는 안티도트에 대해 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이들은 또한 대상체에서 외부에서 투여된 인자 Xa 를 저해하거나 또는 실질적으로 중화하는 양으로 투여될 수 있다.

또다른 국면에서, 본 발명은, 유효량의 안티도트를 인자 Xa 저해제 및 약제학적으로 허용되는 담체에 투여하는 것을 포함하며, 단 상기 안티도트는 혈장 유도성 인자 VIIa, 재조합 인자 VIIa, 신선한 냉동 혈장, 프로트롬빈 복합체 농축물 및 전혈이 아닌, 대상체에 투여된 인자 Xa 저해제의 항응고 활성을 역전 또는 중화하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

일부 구현예에서, 안티도트는 상기에 기재한 안티도트들 중 임의의 하나이다. 일부 구현예에서, 안티도트는 안티도트의 순환 반감기를 연장시킬 수 있는 부분과 콘쥬게이션된다. 일부 구현예에서, 상기 부분은 폴리에틸렌 글리콜, 아실기, 리포좀, 담체 단백질, 인공 인지질막 및 나노입자로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 본원에 기재된 fXa 유도체의 비활성 부위 라이신 또는 시스테인 잔기는 폴리에틸렌 글리콜 분자에 결합하도록 화학적으로 개질될 수 있다. Werle, M. & Bernkop-Schnurch, A. Strategies to Improve Plasma Half Life Time of Peptide and Protein Drugs, Amino Acids 2006, 30(4):351-367 에서 제공하는 기타 방법들이 본 발명의 안티도트의 혈장 반감기 연장에 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, fXa 유도체의 반감기는 안티도트를 Fc 담체 도메인에 커플링시켜 개선된다. 한 구현예에서, 안티도트는 Fc 절편, 예컨대 면역글로불린 펩티드 부분 또는 IgG1 절편에 커플링된다. 한 구현예에서, fXa 유도체 및 면역글로불린 펩티드 부분을 포함하는 키메라성 단백질이 고려된다. 또다른 구현예에서, fXa 유도체 및 면역글로불린 펩티드는, 인간 IgG 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역과의 디설파이드 결합과 같은 화학 반응에 의해 커플링된다.

일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 안티도트의 혈장 반감기를 연장시키는 약제를 함유한다. 또다른 국면에서, 약제학적 조성물은 안티도트의 혈장 반감기를 연장시키는 약제와 함께 병용제형화된다. 일부 구현예에서, 병용투여 또는 병용제형화되는 약제는 Xa 의 엑소사이트 또는 알파-2-마크로글로불린 결합 fXa 유도체를 인식하는 항-fXa 항체이다.

III. 안티도트

인자 Xa 유도체

본 발명의 한 국면은, 출혈을 예방 또는 정지하기 위한, 응고제 fXa 의 저해제의 활성을 실질적으로 중화시킬 안전하고 유효한 안티도트로서의 fXa 유도체, 예컨대 Gla-도메인 결핍 fXa 또는 des-Gla fXa 의 용도이다. 본 발명의 안티도트는 fXa 저해제의 항응고 효과, 특히 활성 부위-지정 소분자 저해제의 역전에 유용할 것이다.

fXa 저해제는 응고촉진 활성이 감소되었거나 또는 없지만, fXa 저해제와 결합할 수 있는 것으로 생각된다. 상기 제한된 활성은 순환하는 야생형 fXa 보다 더 높은 수준으로 안티도트의 투여를 가능케 하는 것으로 생각된다. 특정 fXa 유도체, 예컨대 des-Gla fXa 및 Gla-결핍 fXa 는 본 발명의 적합한 안티도트이다. 감소되거나 또는 사라진 응고촉진 활성 외에도, 본 발명의 안티도트는 또한 대상체에 대해 비면역원성이어야 한다. 안티도트는 2 가지 이상의 상기 돌연변이 및/또는 개질을 포함할 수 있다. 추가로, 상기 fXa 유도체들 중 임의의 것이 단독으로 또는 또다른 것과 병용하여 투여될 수 있다.

인자 Xa 는 프로트롬빈의 트롬빈으로의 변환에 원인을 제공하는 혈액 응고 경로에서의 세린 프로테아제이다. 고유한 Xase (인자 IXa 와 그의 보조인자인, 인자 VIIIa 에 의해 형성되는 복합체) 에 의해 또는 외인성 Xase (인자 VIIa 와 그의 보조 인자, 조직 인자에 의해 형성되는 복합체) 에 의해 활성화되면 불활성 인자 X 로부터 생성된다. 활성화 fX (fXa) 는, 그의 중쇄의 C-말단에서의 추가적인 자가촉매성 절단 하에서, fXaα 를 서브 형태 fXaβ 로 변환시킬 수 있다 (Jesty, J 등 J. Biol. Chem. 1975, 250(12):4497-4504). fXaq 및 fXaβ 의 두가지 모두가 본 발명에 적합한 물질이다. fXa 는 자체로는 응고를 지지하기에는 충분하지 않는 느린 속도로 프로트롬빈을 변환시킨다. 보조인자 Ca²⁺, 인지질 및 인자 Va 와 함께 프로트롬비나아제 복합체를 형성할 때에만, fXa 는 응고를 지지하기에 충분히 빠른 속도로 프로트롬빈을 활성화시킬 수 있다 (Skogen, W.F., 등, J. Biol. Chem. 1984, 259(4):2306-10). 복합체는, 음으로 하전된 인지질 및 fXa 의 Gla 도메인 내의 γ-카르복시글루탐산 잔기 사이에서의 Ca²⁺ 가교를 경유하는 결합을 필요로 한다.

따라서, Gla 도메인은 fXa 의 활성 부위를 포함하지 않지만, 이것이 fXa 로 하여금 γ-카르복시글루탐산 잔기를 통해 프로트롬비나아제 복합체를 형성할 수 있도록 한다. 이는 키모트립신 소화에 의한 fXa Gla-도메인의 선택적인 제거로 증명된다 (도 7 및 실시예 1 참조). 혈병형성 검정은 키모트립신 소화에 의한 Gla 도메인 절단의 과정동안 fXa 상에서 수행되었다. Gla-도메인이 없는 fXa, fVa, 인지질 및 칼슘 이온을 함유하는 재건된 프로트롬비나아제 복합체는 상당히 감소된 비율 (네이티브 fXa 를 함유하는 대조군 복합체에 대해 0.5% 생성물이 생성됨) 로 트롬빈을 제공한다는 것이 보고된 바 있다 (Skogen 등, J. Biol. Chem. 1984, 259(4):2306-10). 도 7 에 나타낸 바와 같이, 혈병 형성시 fXa 의 활성은 키모트립신으로 15 분 동안 소화시킨 후 부분적으로 감소되며, 소화 30 분 후에는 완전히 소실된다. 비카르복시화 또는 탈카르복시화 fXa 는, 칼슘 이온 의존성 막 결합에 필요한 적당한 감마-카르복시글루탐산이 결핍되어, 막 의존성 응고 복합체 조립이 불가하며 혈병 형성을 지지하지 않는 것으로 나타났다 (Mann, KG 등, Blood, 1990, 76: 1-16).

Gla-도메인 결핍성 fXa 이 fXa 의 활성 부위-지정 저해제에 결합한다는 것이 확립되어 있다 (Brandstetter, H 등, J. Bio. Chem., 1996, 271:29988-29992). 활성 부위 클레프트의 구조 설명을 제공하는, des-Gla 인간 fXa 에 결합된 소분자 fXa 저해제의 결정학의 보고서가 있다 (Brandstetter, J. Bio. Chem., 1996, 271 :29988-29992 및 Roehrig, J. Med. Chem. 2005, 48(19):5900-8). 도 8 은 des-Gla 안히드로-fXa 가, 네이티브 fXa 의 것에 필적하는, fXa 저해제 베트릭사반과 0.319 nM 의 결합 친화성을 나타낸다는 것을 보여준다.

des-Gla fXa, 및 응고촉진 활성은 감소되었으나 fXa 저해제 결합은 가능한 기타 fXa 유도체가 fXa 저해제에 대한 안티도트로서 사용될 수 있다는 것을 발견했다. 도 9 에 나타낸 바와 같이, des-Gla 안히드로-fXa 는 680 nM 의 농도에서 베트릭사반의 항응고 활성의 완전한 역전을 나타낸다. 실시예 2 에 상세하게 서술한 바와 같이, 트롬빈 생성은 TF-함유 시약 (Innovin) 을 첨가함으로써 개시되었고, 이에 따라 외인성 응고 경로에서의 응고 인자들의 표시가 작용한다. 실시예 9 내지 13 에서는 또한 재조합성 안티도트가 광범위한 항응고제 역전에 유용하다는 것을 증명한다.

고유한 응고 경로에서 응고 인자의 기능을 결정하는 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 시약 (Actin FS) 을 이용한 혈병형성 연장 검정은 또한 des-Gla 안히드로-fXa 가 항체 활성을 보유한다는 것을 나타낸다. 도 10 은, 250 nM 의 베트릭사반에 대한 des-Gla 안히드로-fXa 의 투여량 응답성 안티도트 효과를, 600 nM 에서는 완전한 역전을 보여준다. 도 11 은 des-Gla 안히드로-fXa 가 또한 또다른 fXa 저해제인 에녹사파린의 항응고 활성을 역전시킬 수 있다는 것을 보여준다. 도 12 는 des-Gla 안히드로-fXa 가 직접 트롬빈 저해제에 대한 현저한 항체 활성을 나타내지 않음을 보여준다. 따라서, des-Gla 안히드로-fXa 는 fXa 저해제에 대한 선택적인 안티도트이며, 외인성 또는 고유한 경로에 의해 개시되는 fXa 응고촉진 활성을 회복시킬 수 있다.

더욱이, des-Gla 안히드로-fXa 의 안티도트 활성은 전통적인 응고 타이머를 이용해 측정하는 aPTT 연장 검정으로 증명했다. 도 13 에 나타낸 바와 같이, des-Gla 안히드로-fXa 는 자체로는 시험한 최대 농도 (2576 nM) 에서는 대조군 혈장의 aPTT 에 대해 아무 효과가 없다. 400 nM 의 베트릭사반은 aPTT 를 2 배 넘게 연장시켰다. 베트릭사반의 상기 항응고 효과는 투여량-응답성 방식으로 des-Gla 안히드로-fXa 에 의해 역전되며, 1610 nM 를 초과하는 안티도트 농도에서는 대조군 혈장의 정상적인 수준에 가깝게 aPTT 를 되돌린다.

fXa 경쇄에서의 추가적인 절단, 예를 들어 EGF1 도메인, EGF1 과 EGF2 도메인, 또는 이들의 절편의 추가적인 결실, 및 중쇄만 있는 불활성 fXa 가 본 발명의 유용한 안티도트일 수 있다고 생각된다.

Gla-도메인 결핍성 fXa 는 생리학적으로 적절한 농도 하에서의 정상적인 응고를 지지하지 않는다. 그러나, 그 단백질은 다수의 기질들을 절단하고 더 높은 농도에서 혈병형성을 야기하는 능력을 가졌다. 예를 들어, Skogen 등 (Skogen, W.F., 등, J. Biol. Chem. 1984, 259(4):2306-10) 은, 소 des-Gla fXa 가 야생형 fXa 에 비해 약 0.5 내지 1.0 % 프로트롬비나아제 복합체 활성을 갖는다는 것을 보여줬다. 따라서, fXa 유도체의 응고촉진 활성을 더 감소시키거나 또는 완전히 제거하는 개질이 본 발명의 방법에서 고려된다. 그러한 개질은, 예를 들어 fXa 의 촉매 도메인에 있을 수 있다.

fXa 중쇄의 응고촉진 활성을 감소시키기 위해 fXa 중쇄의 촉매 도메인을 개질하는 여러가지 방법이 고려된다. fXa 의 활성 부위 잔기 S379 (서열 식별 번호 7 에서 나타냄) 는, 예를 들어, 디히드로-알라닌 (실시예 1 참고) 또는 알라닌 (실시예 6 참고) 로 선택적으로 치환하여 응고촉진 활성을 감소 또는 제거할 수 있다. fXa 및 fXa 의 엑소사이트를 표적으로 하는 시약 사이의 복합체 형성은 fXa 의 마크로분자 결합 능력을 차단하여, 활성 부위 내의 소분자 결합 능력은 유지하면서 그의 응고촉진 활성을 감소시킬 수 있다는 것이 또한 공지되어 있다. 상기 엑소사이트 표적 시약에는, 이에 제한되지 않으나, 활성 부위로부터 제거된 영역을 표적으로 하는 모노클로날 항체 (Wilkens, M and Krishnaswamy, S, J. Bio. Chem., 2002, 277 (11), 9366-9374) 또는 α-2-마크로글로불린이 포함된다. 트립신, 트롬빈 또는 fXa 같은, α-2-마크로글로불린-세린 프로테아제 복합체는 소분자 물질과 결합할 수 있다는 것이 공지되어 있다 (Kurolwa, K. 등, CHN. Chem. 1989, 35(11), 2169-2172).

경쇄는 변경하지 않은 채로 두고 중쇄에서만 개질이 있는 불활성 fXa 가, 도 6 에 나타낸 바와 같이 정상 fXa 의 응고촉진 활성을 방해하기 때문에, 프로트롬비나아제의 저해제로서 작용한다는 것이 또한 공지되어 있다 (Hollenbach, S. 등, ThromB. Haemost, 1994, 71(3), 357-62). 따라서, 한 구현예에서, fXa 유도체는 경쇄 및 중쇄의 두가지 모두에서 개질이 있다. 상기 개질은, fXa 유도체의 저해제 결합 능력은 유지한 채, 응고촉진 및 항응고 활성의 두가지 모두를 감소시키거나 또는 제거한다는 것을 발견했다.

본원에 기재된 Gla-도메인 결핍성 fXa 유도체 또는 기타 fXa 유도체를 제공하기 위해 몇가지 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, Gla-도메인은 키모트립신 절단으로 완전히 제거되어 Gla-도메인이 없는 fXa 를 제공할 수 있다. 대안적으로, Gla-도메인이 없는 fX 는 네이티브 fX 의 키모트립신 절단으로 제공될 수 있다. 이어서, Gla-도메인이 없는 fX 는 fX 활성화제에 의해 Gla-도메인이 없는 fXa 로 변환될 수 있다. fX 는 치료할 대상체와 동일 또는 상이한 종의 혈장으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 소 fX 는 인간 혈장 검정에서 관능성인 것으로 나타났다. fX 활성화제의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 뱀독, 예컨대 러셀 바이퍼 베놈, 및 fVTIa/조직 인자 또는 flXa/fVIIIa 의 복합체가 포함된다. 그러한 수단은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, Rudolph A.E. 등은 Arg347 의 글루타민에 의한 단일 치환이 있는 재조합 인자 X (fX) 로부터 제조된 재조합 fXa 를 보고했다 (fXR347N) (BiocheM. 2000, 39 (11): 2861-2867). 한 구현예에서, 비-인간 공급원으로부터 제조된 fXa 유도체는 비-면역원성이거나 또는 실질적으로 비-면역원성이다. 실시예 7 은 또한 서열 식별 번호 12 의 아미노산 서열을 가진 재조합성 안티도트를 제공하는 방법을 제공한다.

fXa 유도체는 또한 인간 혈장으로부터 정제될 수 있거나, 또는 fXa 유도체에 대한 적당한 유전자가 적합한 숙주 유기체에서 발현되는 재조합 DNA 방법에 의해 제공될 수 있다. 재조합성 fXa 의 발현 및 정제는 몇몇 그룹에 의해 보고되었으며, 참고문헌은, 예를 들어, 재조합 fX 의 제조에 대해서는 Larson, P. J., 등, Biochem., 1998, 37:5029-5038, 및 Camire, R.M., 등, Biochem., 2000, 39, 14322-14329; 재조합 fXa 의 제조에 대해서는 Wolf, D.L. 등, J. Bio. Chem., 1991, 266(21):13726-13730. 개질된 fXa 는, 원하는 fXa 돌연변이를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가진, 유전자적으로 개질된 cDNA 를 이용하여 상기 과정에 따라 제조할 수 있다. 실시예 6 은 안티도트로서의 관능적 활성을 가진 Gla-도메인이 없는 fXa-S379 돌연변이의 직접 발현에 대한 더욱 상세한 사항을 제공한다.

미카르복시화 fXa 와 같은 Gla-도메인이 결핍된 개질 fXa 또는 활성-부위 돌연변이 fXa 가 또한, fXa 저해제 안티도트로서 유용할 수 있다고 여겨진다. 미카르복시화 fXa 는, 단백질 발현 동안의 비타민 K 유도체의 미제공 (비타민 K 유도체는 Gla 잔기 형성을 위한 번역후 개질에 필요함) 으로 또는 조직 배양 동안 와파린같은 비타민 K 안타고니스트의 첨가로, 재조합 수단으로 제조할 수 있다. 탈카르복시화 fXa 는 가열에 의해 (Bajaj P., J. Biol. Chem., 1982, 257(7):3726-3731), 또는 키모트립신에 의한 가수분해 소화에 의해 (Morita T., 등, J. Biol. Chem., 1986, 261(9):4015-4023) 제조할 수 있다. 안티도트에서는 또한, 원핵세포 시스템에서 생성된 후 시험관내 리폴딩 또는 fXa 저해제 결합 부위 구성이 후속될 수 있다.

Gla 잔기는 또한 화학적으로 개질되어 칼슘 이온 의존성 막 결합에 원인을 제공하는 카르복실기를 제거할 수 있다. 예를 들어, Gla 잔기 상의 카르복실기는 탈카르복실화 조건 하에 선택적으로 제거될 수 있거나 또는 예를 들어 에스테르화 또는 아민화에 의해 캡핑될 수 있다. 상기 에스테르화 또는 아민화는 생체내 가수분해에 대해 내성이어서, 개질된 fXa 가, 혈전증을 유발할 수 있는 활성 fXa 로 쉽게 변환되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

fXa 의 다른 돌연변이 또는 유도체가 또한 본 발명의 안티도트에 유용할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명은, Peter J. Larson 등, Biochem., 1998, 37:5029-5038 에 기재된 돌연변이의 fXa 저해제 안티도트로서의 용도를 포함한다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 fXa 저해제 안티도트 제조를 위한 촉매적으로 불활성인 fXa 돌연변이의 용도를 포함한다. 예를 들어, Sinha, U., 등, Protein Expression and Purif., 1992, 3:518-524 에 기재된 돌연변이 rXai, Nogami, 등, J. Biol. Chem. 1999, 274(43):31000-7 에 기재된 바와 같이 화학적 개질이 있는 돌연변이, 예컨대 디히드로-알라닌 (안히드로 fXa) 가 있다. 알라닌으로 치환된 활성 부위 세린 (서열 식별 번호 7 에 나타낸 fX 넘버링에서는 Ser379, 키모트립신 넘버링에서는 Ser195) 이 있는 fXa (fX 넘버링에서는 fXa-S379A, 또는 키모트립신 넘버링에서는 fXa-S195A) 에서, 응고촉진 활성은 제거되어 있는데, 역시 fXa 저해제 안티도트로서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 소분자 저해제에 여전히 결합할 수 있는, 비가역적으로 아실화된 활성 부위 세린이 있는 fXa 유도체가 있을 것으로 예상한다. 비가역적으로 아실화된 활성 부위 세린이 있는 fXa 는 Wolf, 등, Blood, 1995, 86(11):4153-7 에서 보고했다. 그러나, 상기 비가역적 아실화는 활성 fXa 의 시간 의존적 생산이 가능하며, 소정 기간에 걸쳐 과량의 활성 fXa 를 유도할 수 있다. 탈아실화 속도는 Lin P.H. 등, Thrombosis Res., 1997, 88(4), 365-372 에 기재된 것과 유사한 전략에 의해 감소될 수 있다. 예를 들어, 4-메톡시벤질 및 3-브로모-4-메톡시벤질기에 의해 아실화된 Ser379 (키모트립신 넘버링에서는 Ser195) 이 있는 fXa 는, 37℃ 에서 4 시간 동안 pH7.5 인 완충액에서 인큐베이션시 그의 원래 활성의 50% 미만을 회복한다.

한 구현예는 fXa 의 보조인자 fV/fVa 와의 상호작용에 대해 중요한 것으로 공지된 fXa 잔기에서의 돌연변이가 있는 fXa 유도체의 용도에 관한 것이다. 상기 잔기에는, 이에 제한되지 않지만, Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, 또는 Lys414 (서열 식별 번호 3 및 7, 상기 아미노산은 키모트립신 넘버링에서는 Argl25, Glul29, Argl65, Lysl69, Lys230 에 해당함) 가 포함된다. 상기 돌연변이의 예시는 Rudolph, A.E. 등, J. Bio. Chem., 2001, 276:5123-5128 에서 보고한다. 추가로, fVTII/fVIIIa 상호작용에 중요한 것으로 공지된 fXa 잔기, 예컨대 서열 식별 번호 3 및 7 에서의 Arg424 (키모트립신 넘버링에서는 Arg240) 에서의 돌연변이가 또한 fXa 저해제 안티도트로서 이용될 수 있다. 상기 돌연변이의 예시는 Nogami, K. 등, J. Biol. Chem., 2004, 279(32):33104-33113 에 기재되어 있다.

fXa 의 활성 부위 잔기 또는 세린 프로테아제 상호작용에 중요한 것으로 공지된 잔기의 기타 개질, 예를 들어 서열 식별 번호 3 및 7 에서의 Glu216, Glu218 및 Arg332 (키모트립신 넘버링에서는 각각 Glu37, Glu39 및 Arg150) 를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것은 또한 본 발명의 유용한 안티도트를 유도할 수 있다.

한 구현예에서, 아미드가수분해 기질 절단 검정 (amidolytic substrate cleavage assay) 으로 평가한 안티도트의 잔류 응고촉진 활성은 인간 혈장 유도성 네이티브 fXa 의 1 % 미만, 바람직하게는 0.1 % 미만, 더욱 바람직하게는 0.05 % 미만이다. 예를 들어, 활성 부위 Ser379 (키모트립신 넘버링에서는 S195) 가 알라닌 잔기로 치환된 경우, 혈병형성 검정으로 측정하면, 재조합 fXa-S379A 에 대해서는 측정가능한 응고촉진 활성이 없다.

본 발명은 추가로 상기 기재된 fXa 유도체를 코딩하는 핵산 서열, 특히 DNA 서열에 관한 것이다. 이들은 폴리펩티드 서열을 유전자 코드에 따라 대응하는 DNA 서열로 되돌려 번역하여 쉽게 결정할 수 있다. 바람직하게 사용되는 코돈은 필요한 숙주 유기체에서의 양호한 발현을 유도하는 것이다. 핵산 서열은 자연 fXa 유전자 서열로부터 출발하는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 그밖에 완전 DNa 합성에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드

특정 국면에서, 본 발명은 서열 식별 번호 12, 13 또는 15 의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명에는 또한 서열 식별 번호 12, 13 또는 15 와 80% 이상의 상동성을 가진 폴리펩티드가 포함된다.

본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 적당한 숙주 세포에서 본 발명의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현함으로써 제조될 수 있다. 이는 당업자에게 공지된 재조합 DNA 기법의 방법으로 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포에서 본 발명의 폴리펩티드를 재조합적으로 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 단백질 및 폴리펩티드는 미국 CA, Foster City 소재의 Perkin Elmer/ Applied Biosystems, Inc. 에서 제조하는 Model 430A 또는 43 와 같은, 시판되어 입수가능한 자동화된 펩티드 합성기를 이용한 화학적 합성으로 수득할 수 있다. 합성된 단백질 또는 폴리펩티드는 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 로 침전시켜 추가로 정제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 아미노산 및 효소와 같은 단백질 서열 및 시약의 제공 및 적절한 배열 및 선형 서열 내에서의 아미노산 연결로써 본 발명의 단백질을 화학적으로 합성하는 방법을 제공한다.

당업자에게는 변경된 특성을 부여하기 위해 임의의 펩티드에 개질을 가할 수 있음이 공지되어 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 비자연 아미노산을 포함하도록 개질될 수 있다. 따라서, 펩티드는 펩티드에 특별한 특성을 전달하기 위해 D-아미노산, D- 및 L-아미노산의 조합 및 각종 "디자이너" 아미노산 (예를 들어, β-메틸 아미노산, C-α-메틸 아미노산 및 N-α-메틸 아미노산 등) 을 포함할 수 있다. 추가적으로, 특별한 커플링 단계에 특이적 아미노산을 지정함으로써, α-나선, β 턴, β 쉬트, α-턴 및 환형 펩티드를 생성할 수 있다. 일반적으로, α-나선 2 차 구조 또는 랜덤 2 차 구조가 선호되는 것으로 여겨진다.

추가 구현예에서, 유용한 화학적 및 구조적 특징을 부여하는 폴리펩티드의 서브유닛이 선택될 것이다. 예를 들어, D-아미노산을 포함하는 펩티드는 생체내에서 L-아미노산 특이적 프로테아제에 대해 내성일 수 있다. D-아미노산으로 개질된 화합물은, 본 발명의 펩티드를 레트로-인버소 (retro-inverso) 펩티드로 제조하기 위해, 거꾸로 된 순서로 정렬된 아미노산으로 합성될 수 있다. 추가로, 본 발명은 더 나은 규정된 구조적 특징을 가진 펩티드의 제조 및 신규한 특성을 가진 펩티드 제조를 위한 펩티드모사체, 및 펩티드모사체 결합, 예컨대 에스테르 결합의 이용을 예상해볼 수 있다. 또다른 구현예에서, 환원된 펩티드 결합을 혼입하는 펩티드, 즉, R₁-CH₂NH-R₂ (식 중, R₁ 및 R₂ 는 아미노산 잔기 또는 서열이다) 을 생성할 수 있다. 환원된 펩티드 결합은 디펩티드 서브유닛으로서 도입될 수 있다. 상기 분자는 펩티드 결합 가수분해, 예를 들어 프로테아제 활성에 대해 내성이다. 상기 분자는 독특한 기능 및 활성, 예컨대 대사성 분해에 대한 내성으로 인한 생체내 반감기 증가 또는 프로테아제 활성을 가진 리간드를 제공한다. 더욱이, 특정 시스템에서는, 부자연스러운 펩티드가 증강된 기능적 활성을 나타낸다는 것이 널리 공지되어 있다 (Hruby (1982) Life Sciences 31:189-199 및 Hruby 등 (1990) Biochem J. 268:249-262); 본 발명은 모든 기타 위치에 랜덤 서열을 혼입하는 부자연스러운 펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.

하기의 비-분류성 아미노산은 특별한 공간배좌 모티프를 도입하기 위해 본 발명의 펩티드에 혼입될 수 있다: 1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실레이트 (Kazrnierski 등 (1991) J. AM. Chem. Soc. 113:2275-2283); (2S,3S)-메틸-페닐알라닌, (2S,3R)-메틸-페닐알라닌, (2R,3S)-메틸-페닐알라닌 및 (2R,3R)-메틸-페닐알라닌 (Kazmierski 및 Hruby (1991) Tetrahedron Lett. 32(41):5769-5772); 2-아미노테트라히드로나프탈렌-2-카르복실산 (Landis (1989) Ph.D. Thesis, University of Arizona); 히드록시-1,2,3,4-테트라히드로이소퀴놀린-3-카르복실레이트 (Miyake 등 (1989) J. Takeda Res. Labs. 43:53-76); 히스티딘 이소퀴놀린 카르복실산 (Zechel 등 (1991) Int. J. Pep. Protein Res. 38(2): 131-138); 및 HIC (히스티딘 싸이클릭 우레아), (Dharanipragada 등 (1993) Int. J. Pep. Protein Res. 42(1):68-77) 및 (Dharanipragada 등 (1992) Acta. Crystallogr. C. 48: 1239-1241).

하기의 아미노산 유사체 및 펩티드모사체가 펩티드에 혼입되어 특이적인 2 차 구조를 유도 또는 촉진할 수 있다: LL-Acp (LL-3-아미노-2-프로펜디온-6-카르복실산), β-턴 유도성 디펩티드 유사체 (Kemp 등 (1985) J. Org. Chem. 50:5834-5838); β-쉬트 유도성 유사체 (Kemp 등 (1988) Tetrahedron Lett. 29:5081-5082); β-턴 유도성 유사체 (Kemp 등 (1988) Tetrahedron Lett. 29:5057-5060); α-나선 유도성 유사체 (Kemp 등 (1988) Tetrahedron Lett. 29:4935- 4938); α-턴 유도성 유사체 (Kemp 등 (1989) J. Org. Chem. 54:109:115); 하기의 참고문헌에서 제공하는 유사체: Nagai 및 Sato (1985) Tetrahedron Lett. 26:647-650; 및 DiMaio 등 (1989) J. Chem. Soc. Perkin Trans, P. 1687; Gly-Ala 턴 유사체 (Kahn 등 (1989) Tetrahedron Lett. 30:2317); 아미드 결합 이소스테어 (isostere) (Clones 등 (1988) Tetrahedron Lett. 29:3853-3856); 테트라졸 (Zabrocki 등 (1988) J. AM. Chem. Soc. 110:5875-5880); DTC (Samanen 등 (1990) Int. J. Protein Pep. Res. 35:501:509); 및 Olson 등 (1990) J. Am. Chem. Sci. 112:323-333 및 Garvey 등 (1990) J. Org. Chem. 56:436 에서 교시한 유사체. 베타 턴 및 베타 벌지 (beta bulge) 의 구조적으로 제한된 모사체 및 이들을 포함하는 펩티드는 1995 년 8 월 8 일자로 Kahn 에서 허여된 U.S. 특허 5,440,013 에 기재되어 있다.

하나 이상의 아미노산을, 펩티드의 생물학적 기능을 변경하지 않는 하나 이상의 기능적으로 동등한 아미노산으로 치환함으로써 임의의 펩티드에 개질을 가할 수 있음이 당업자에게 공지되어 있다. 한 국면에서, 이에 제한되지 않으나, 소수성, 크기 또는 전하를 포함하는 유사한 고유 특성을 가진 아미노산으로 치환된 아미노산. 치환할 적당한 아미노산을 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 비제한적 예시에는, Dahoff 등 (1978) In Atlas of Protein Sequence and Structure VoL. 5 suppl. 제 2 판. M.O. Dayhoff), pp. 345-352 에서 제시한 실증적인 모델, National Biomedical Research Foundation, Washington DC; Dayhoff 매트릭스를 포함하는 PAM 매트릭스 (Dahoff 등 (1978), 상기문헌, 또는 Jones 등 (1992) Comput. Appl. Biosci. 8:275-282 및 Gonnet 등 (1992) Science 256: 1443-1145 에서 기재한 JTT 매트릭스; Adach 및 Hasegawa (1996) J. Mol. Evol. 42:459-468 에서 기재한 실증적인 모델; Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919 에서 기재한 블록 치환 매트릭스 (BLOSUM); Nei (1987) Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University Press, New YorK. 에서 기재한 프와종 모델; 및 Muller 등 (2002) Mol. Biol. Evol. 19:8-13 이 기재한 맥시멈 라이클리후드 (ML) 방법이 포함된다.

폴리펩티드 콘쥬게이트

본 발명의 폴리펩티드 및 폴리펩티드 복합체는 각종 제형물에서 이용될 수 있으며, 이는 의도하는 용도에 따라 가변적일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상이 공유적으로 또는 비공유적으로 각종 기타 분자에 연결 (복합체화) 될 수 있는데, 이들의 특성은 특별한 목적에 따라 가변적일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드는, 이에 제한되지 않으나, 천연 및 합성 중합체, 단백질, 다당류, 폴리펩티드 (아미노산), 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈 및 지질에 공유적으로 또는 비공유적으로 복합체화될 수 있다. 펩티드는 리포좀으로의 도입을 위해 지방산으로 콘쥬게이션화될 수 있으며, 참고문헌은 U.S. 특허 5,837,249 이다. 본 발명의 펩티드는, 해당하는 각종의 것이 당업계에 공지되어 있으며 본원에도 기재되어 있는 고체 지지체에 공유적으로 또는 비공유적으로 복합체화될 수 있다. 본 발명의 항원결정성 펩티드 에피토프 (antigenic peptide epitope) 는, 공동자극 분자의 존재 또는 부재 하에 MHC 복합체와 같은 항원-제시 매트릭스와 회합될 수 있다.

단백질 담체의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 초항원, 혈청 알부민, 파상풍 독소, 오브알부민, 티로글로불린, 미요글로불린 및 면역글로불린이 포함된다. 펩티드-단백질 담체 중합체는, 통상적인 가교제, 예컨대 카르보디이미드를 이용하여 형성될 수 있다. 카르보디이미드의 예시는, 1-시클로헥실-3-(2-모르폴리닐-(4-에틸) 카르보디이미드 (CMC), 1-에틸-3-(3-디메티아미노프로필) 카르보디이미드 (EDC) 및 1-에틸-3-(4-아조니아-44-디메틸펜틸) 카르보디이미드이다.

기타 적합한 가교제의 예시는, 시아노겐 브로마이드, 글루타르알데히드 및 숙신산 무수물이다. 일반적으로, 호모-이관능성 알데히드, 호모-이관능성 에폭시드, 호모-이관능성 이미도-에스테르, 호모-이관능성 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 호모-이관능성 말레이미드, 호모-이관능성 알킬 할라이드, 호모-이관능성 피리딜 디설파이드, 호모-이관능성 아릴 할라이드, 호모-이관능성 히드라지드, 호모-이관능성 디아조늄 유도체 및 호모-이관능성 광반응성 화합물을 포함하는 다수의 호모-이관능성 시약 중 임의의 것이 이용될 수 있다. 헤테로-이관능성 화합물, 예를 들어, 아민-반응성 및 술프히드릴-반응성 기를 가진 화합물, 아민-반응성 및 광반응성 기를 가진 화합물 및 카르보닐-반응성 및 술프히드릴-반응성 기를 가진 화합물이 포함된다.

그러한 호모-이관능성 가교제의 구체적인 예시에는, 이관능성 N-히드록시숙신이미드 에스테르 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), 디숙신이미딜 수베레이트 및 디숙신이미딜 타르트레이트; 이관능성 이미도-에스테르 디메틸 아디프이미데이트, 디메틸 피멜이미데이트, 및 디메틸 수베르이미데이트; 이관능성 술프히드릴-반응성 크로스링커 1,4-디-[3'-(2'-피리딜디티오) 프로피온아미도]부탄, 비스말레이미도헥산, 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄; 이관능성 아릴 할라이드 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 및 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐술폰; 이관능성 광반응성제, 예컨대 비스-[b-(4-아지도살리실아미도)에틸]디설파이드; 이관능성 알데히드 포름알데히드, 말론디알데히드, 숙신알데히드, 글루타르알데히드, 및 아디프알데히드; 이관능성 에폭시드, 예컨대 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르; 이관능성 히드라지드 아디프산 디히드라지드, 카르보히드라지드, 및 숙신산 디히드라지드; 이관능성 디아조늄 o-톨리딘, 디아조화 및 비스-디아조화 벤지딘; 이관능성 알킬할라이드 NlN'-에틸렌-비스(요오도아세트아미드), NlN'-헥사메틸렌-비스(요오도아세트아미드), NlN'-운데카메틸렌-비스(요오도아세트아미드), 및 벤질할라이드 및 할로머스타드, 예컨대 알라'-디요오도-p-자일렌 술폰산 및 트리(2-클로로에틸)아민, 각각이 포함된다.

단백질의 펩티드에 대한 콘쥬게이션을 유효하게 하기 위해 이용될 수 있는 헤테로-이관능성 가교제의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, SMCC (숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트), MBS (m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르), SIAB (N-숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트), SMPB (숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트), GMBS (N-(γ-말레이미도부티릴옥시)숙신이미드 에스테르), MPBH (4-(4-N-말레이미도페닐) 부티르산 히드라지드), M2C2H (4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실-히드라지드), SMPT (숙신이미딜옥시카르보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔), 및 SPDP (N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트) 가 포함된다.

가교는 반응성 아민화에 의해 아민기 또는 히드라지드기에 카르보닐기를 커플링함으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 펩티드는 또한 이온성, 흡착성 또는 생물특이적 상호작용을 통해 단량체의 비공유적 결합으로서 제형화될 수 있다. 고도로 양으로 또는 음으로 하전된 분자들의 복합체는 약한 이온력 환경, 예컨대 탈이온수 하에서의 염다리 (salt bridge) 형성을 통해 될 수 있다. 큰 복합체는 각각 다수의 음전하 및 양전하를 포함하는 폴리-(L-글루탐산) 또는 폴리-(L-라이신) 과 같은 하전된 중합체를 이용하여 생성될 수 있다. 펩티드의 흡착은, 가교 또는 화학 중합 단백질을 유효하게 모방하는 비공유적으로 회합된 펩티드-초항원 (peptide-superantigen) 복합체를 형성하는, 마이크로입자 라텍스 비드 또는 기타 소수성 중합체와 같은 표면들에 될 수 있다. 최종적으로, 펩티드는 기타 분자들간의 생물특이적 상호작용의 이용을 통해 비공유적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 아비딘 또는 스트렙타비딘 또는 이들의 유도체와 같은 단백질에 대한 바이오틴의 강한 상호작용의 이용이 펩티드 복합체 형성에 이용될 수 있다. 상기 바이오틴-결합성 단백질들은 용액 중의 바이오틴과 상호작용하거나 또는 또다른 분자에 공유결합될 수 있는 4 개의 결합 부위를 포함한다 (참고문헌은, Wilchek (1988) Anal. Biochem. 171: 1-32). 단백질 상의 이용가능한 아민기와 반응하는 D-바이오틴의 N-히드록시숙신이미딜 에스테르 (NHS-바이오틴) 와 같은 일반적인 바이오틴화 시약을 이용하여 바이오틴기를 갖도록 펩티드를 개질할 수 있다. 이어서, 바이오틴화 펩티드는 더 큰 복합체를 만들기 위해 아비딘 또는 스트렙타비딘과 인큐베이션할 수 있다. 상기 중합체의 분자량은 바이오틴화 펩티드 대 아비딘 또는 스트렙타비딘의 몰비를 조심스럽게 제어하여 조절할 수 있다.

본 출원은 또한 진단 방법에서 사용하기 위해, 표지, 예를 들어 형광 또는 바이오발광 표지에 콘쥬게이션된 본원에 기재된 펩티드 및 폴리펩티드를 제공한다. 예를 들어, 검출가능하게 표지된 펩티드 및 폴리펩티드는 컬럼에 결합시켜 항체의 검출 및 정제에 이용할 수 있다. 적합한 형광 표지에는, 이에 제한되지 않으나, 플루오레신, 로다민, 테트라메틸로다민, 에오신, 에리트로신, 쿠마린, 메틸-쿠마린, 피렌, 말라카이트 그린, 스틸벤, 루시퍼 옐로우, Cascade Blue^TM 및 텍사스 레드가 포함된다. 기타 적합한 광학 염료는 Haugland, Richard P. (1996) Molecular Probes Handbook 에 기재되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한 각종 액상 담체, 예컨대 멸균 또는 수용액, 약제학적으로 허용되는 담체, 현탁액 및 에멀전과 병용될 수 있다. 비수성 용매의 예시에는, 프로필 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 식물성 오일이 포함된다. 항체 제조에 사용하는 경우, 담체는 또한 특이적 면역 응답성의 비특이적 증가에 유용한 아쥬반트를 포함할 수 있다. 당업자는 아쥬반트가 필요한지 여부 및 어느 것을 선택할지 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 그러나, 단지 설명의 목적으로, 적합한 아쥬반트에는, 이에 제한되지 않으나, 프로인트 완전 아쥬반트 (Freund's Complete Adjuvant), 프로인트 불완전 아쥬반트 (Freund's Incomplete Adjuvant) 및 미네랄 염이 포함된다.

숙주 세포

본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 한 국면에서, 폴리펩티드는 세포 표면 (세포외에서) 발현 및 제시된다. 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 적합한 세포에는, 원핵 및 진핵 세포로서, 이에 제한되지 않으나, 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 포유류 세포, 쥐과동물 세포, 래트 세포, 양 세포, 원숭이 세포 및 인간 세포를 포함하는 세포들이 포함된다. 박테리아 세포의 예시에는, 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica) 및 스트렙토코커스 고르도니이 (Streptococcus gordonii) 가 포함된다. 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville Maryland, USA) 와 같은 상업적인 제조사로부터 구매할 수 있거나 또는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 단리체로부터 배양할 수 있다. 적합한 진핵 세포의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 293T HEK 세포, 및 햄스터 세포주 CHO, BHK-21; NIH3T3, NSO, C127 로 지정된 쥐과동물 세포주, 원숭이 세포주 COS, Vero; 및 인간 세포주 HeLa, PER.C6 (Crucell 에서 시판하여 입수가능), U-937 및 HepG2 가 포함된다. 곤충 세포의 비제한적 예시에는, 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 가 포함된다. 발현에 유용한 효모의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 한세눌라 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 토룰롭시스 (Torulopsis), 야로위아 (Yarrowia) 또는 피키아 (Pichia) 가 포함된다. 참고문헌은, 예를 들어, U.S. 특허 4,812,405; 4,818,700; 4,929,555; 5,736,383; 5,955,349; 5,888,768 및 6,258,559.

종 특이성에 더하여, 세포는 신경세포와 같은 임의의 특별한 조직 유형, 또는 대안적으로는 신경 세포로 분화할 수 있거나 또는 분화할 수 없는 체세포 또는 배아 줄기 세포, 예를 들어 배아 줄기 세포, 지방 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 조혈 줄기 세포일 수 있다. 줄기 세포는 인간 기원의 것이거나 또는 포유류와 같은 동물 기원의 것일 수 있다.

단리된 폴리뉴클레오티드 및 조성물

본 발명은 또한 상기 동정된 서열에 대한 상보적인 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보물을 제공한다. 상보성은 보통 또는 고도의 엄격한 조건 하에서의 전통적인 혼성화를 이용하여 결정될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA 뿐만 아니라 개질된 뉴클레오티드를 의미한다. 예를 들어, 본 발명은 또한 안티-센스 폴리뉴클레오티드 가닥, 예를 들어, 상기 서열에 대한 안티센스 RNA 또는 그의 상보물을 제공한다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리펩티드 복합체에 대한 실질적으로 상동이며 생물학적으로 동등한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 실질적으로 상동이며 생물학적으로 동등함이란, 예컨대 상기 정의된 것과 65% 이상, 또는 대안적으로, 70 % 이상, 또는 대안적으로, 75 % 이상, 또는 대안적으로 80 % 이상, 또는 대안적으로, 85 % 이상, 또는 대안적으로 90 % 이상, 또는 대안적으로, 95 % 이상, 또는 대안적으로 97 % 이상 상동인 다양한 정도의 상동성을 갖고, 인자 Xa 저해제에 결합하는 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하며, 본원에 기재된 프로트롬비나아제 복합체로 조립되지 않는 것을 의미한다. 늘 명쾌하게 언급하지는 않더라도, 실질적으로 상동인 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에 대한 구현예는 본 발명의 각 국면, 예를 들어, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 항체에 대한 것을 의미하는 것임이 이해될 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 통상적인 재조합 기법을 이용하여 복제될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 PCR 기법을 이용하여 복제될 수 있다. PCR 은 U.S. 특허 4,683,195; 4,800,159; 4,754,065; 및 4,683,202 의 대상 주제이며, PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis 등 편저, Birkhauser Press, Boston (1994)) 및 본원에 인용되는 참고문헌에 기재되어 있다. 추가로, 당업자는 본원에 제공되는 서열 및 시판되는 DNA 합성기를 이용하여 DNA 를 복제할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 폴리뉴클레오티드의 선형 서열, 적당한 프라이머 분자, 효소와 같은 화학물 및, 그들의 복제 및 폴리뉴클레오티드 수득에 적당한 배열의 뉴클레오티드의 화학적 복제 또는 연결을 위한 지시사항을 제공함으로써, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위한 프로세스를 제공한다. 별도의 국면에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 추가로 단리된다. 더욱이, 당업자는 폴리뉴클레오티드를, 숙주 세포에서의 그의 발현을 위해 조절 서열에 작동적으로 연결할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 조절 서열은 복제 및 증폭을 위해 숙주 세포 (원핵성 또는 진핵성) 로 삽입된다. 그렇게 증폭된 DNA 는 당업자에게 공지된 방법으로 단리될 수 있다. 상기 방법으로 폴리뉴클레오티드를 수득하는 프로세스 및 그렇게 수득한 폴리뉴클레도티드가 또한 본원에 제공된다.

RNA 는 DNA 폴리뉴클레오티드를 먼저 적합한 원핵성 또는 진핵성 숙주 세포에 삽입함으로써 수득할 수 있다. DNA 는 임의의 적당한 방법, 예를 들어 적당한 유전자 전달 비히클 (예를 들어, 리포좀, 플라스미드 또는 벡터) 의 이용으로 또는 전자천공으로 삽입될 수 있다. 세포가 복제하고 DNA 가 RNA 로 전사될 때, RNA 는 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어 Sambrook 및 Russell (2001) 의 상기 문헌에 제시된 바와 같이 단리될 수 있다. 예를 들어, mRNA 는 Sambrook 및 Russell (2001) 의 상기 문헌에 제시된 과정에 따라 각종 분해효소 또는 화학물 용액을 이용하여 단리되거나 또는 제조사가 제공하는 지시사항에 따라 핵산 결합 수지에 의해 추출될 수 있다.

한 국면에서, RNA 는 siRNA 로도 공지된, 짧은 상호간섭 RNA 이다. 상호간섭 RNA 를 제조 및 스크리닝하고, 폴리뉴클레오티드 발현 차단 능력에 대해 선별하기 위한 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 그의 비제한적 예시는 하기에 제시된다. 상기 상호간섭 RNA 는 본 발명에 의해 제공된다.

siRNA 서열은, 표적 mRNA 서열을 수득하고, 적당한 siRNA 상보 서열을 결정하여 고안될 수 있다. 본 발명의 siRNA 는 표적 서열과 상호작용하도록 고안되며, 이는 이들이 표적 서열에 혼성화하기에 충분하게 표적 서열에 상보적이라는 것을 의미한다. siRNA 는 표적 서열에 대해 100% 동일할 수 있다. 그러나, 표적 서열에 대한 siRNA 서열의 상동성은, siRNA 가 표적 서열에 혼성화할 수 있는 한 100% 미만일 수 있다. 따라서, 예를 들어 siRNA 분자는 표적 서열에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일할 수 있거나 또는 표적 서열의 상보체일 수 있다. 따라서, 표적에 대해 삽입, 결실 또는 단일 포인트 돌연변이가 있는 siRNA 분자가 또한 이용될 수 있다. 표적 mRNA 에 대한 몇가지 상이한 siRNA 서열의 생성은 최적의 표적 서열에 대한 스크리닝을 가능케 하기 위해 권장된다. siRNA 서열이 임의의 공지된 포유류 유전자에 대한 상동성을 포함하지 않는다는 점을 보장하기 위해, BLAST 검색과 같은 상동성 검색이 수행되어야 한다.

일반적으로, 표적 서열이 Aug 개시 코돈으로부터 적어도 100 내지 200 뉴클레오티드 떨어져 있고, 표적 mRNA 의 종결 코돈으로부터 적어도 50 내지 100 뉴클레오티드 떨어져 있는 것이 바람직하다 (Duxbury (2004) J. Surgical Res. 117:339-344).

연구자들은 그들의 표적 유전자를 유효하게 침묵시키는 siRNA 분자들에서 특정한 특징들이 공통된다는 것을 알아냈다 (Duxbury (2004) J. Surgical Res. 117:339-344; Ui-Tei 등 (2004) Nucl. Acids Res. 32:936-48). 일반적인 가이드로서, 하나 이상의 하기 조건을 포함하는 siRNA 는 포유류 세포에서의 유전자 침묵화에 특히 유용하다: GC 비율이 45 내지 55% 이고, G/C 잔기가 9 개를 초과하지 않고, 센스 가닥의 5' 말단에 G/C 이 있음; 안티센스 가닥의 5' 말단에 A/U 이 있음; 안티센스 가닥의 5' 종결의 첫번째 7 개 염기에 5 개 이상의 A/U 잔기가 있음.

siRNA 는, 일반적으로 그 길이가 약 10 내지 약 30 뉴클레오티드이다. 예를 들어, siRNA 는 10 내지 30 뉴클레오티드 길이, 12 내지 28 뉴클레오티드 길이, 15 내지 25 뉴클레오티드 길이, 19 내지 23 뉴클레오티드 길이, 또는 21 내지 23 뉴클레오티드 길이이다. siRNA 가 상이한 길이의 2 개 가닥을 포함하는 경우, 더 긴 가닥은 siRNA 의 길이를 정한다. 상기 상황에서, 더 긴 가닥의 짝지어지지 않은 뉴클레오티드는 오버행 (overhang) 을 형성한다.

용어 siRNA 는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 을 포함한다. shRNA 는 스템-루프 구조를 형성하는 RNA 의 단일 가닥을 포함하며, 상기 스템은 이중 가닥 siRNA 를 포함하는 상보적인 센스 및 안티센스 가닥으로 이루어지고, 루프는 여러가지 크기의 링커이다. shRNA 의 스템 구조는 일반적으로 약 10 내지 약 30 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 스템은 10 내지 30 뉴클레오티드 길이, 12 내지 28 뉴클레오티드 길이, 15 내지 25 뉴클레오티드 길이, 19 내지 23 뉴클레오티드 길이, 또는 21-23 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

siRNA 고안을 보조하기 위한 도구들은 공개되어 쉽게 입수가능하다. 예를 들어, 컴퓨터기반의 siRNA 고안 도구는, 2007 년 11 월 26 일에 마지막으로 접근했던 www.dharmacon.com 에서 인터넷상으로 입수가능하다.

dsRNA 및 siRNA 의 합성

dsRNA 및 siRNA 는 Micura (2002) Agnes Chem. Int. Ed. Emgl. 41:2265-2269; Betz (2003) Promega Notes 85: 15-18; 및 Paddison 및 Hannon (2002) Cancer Cell. 2: 17-23 에 기재된 바와 같이 시험관내에서 화학적으로 또는 효소를 이용하여 합성할 수 있다. 화학적 합성은, Micura (2002) 의 상기 문헌에 기재된 바와 같이 당업계에 널리 공지되어 있는, 수동식 또는 자동식 방법을 통해 달성될 수 있다. siRNA 는 또한, Yu 등 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052; 및 McManus 등 (2002) RNA 8:842-850 에 기재된 바와 같이, shRNA 의 형태로 세포 내에서 내재적으로 발현될 수도 있다. 내재적 발현은, Brummelkamp 등 (2002) Science 296:550-553 (2002); 및 Novarino 등 (2004) J. Neurosci. 24:5322-5330 에 기재된 바와 같이, RNA 폴리머라아제 III U6 또는 H1, 또는 RNA 폴리머라아제 II U1 와 같은 소형 핵 RNA 프로모터를 이용하여 플라스미드-기재 발현 시스템을 이용해 달성된다.

시험관내 효소성 dsRNA 및 siRNA 합성은, Fire 등 (1998) Nature 391:806-811; Donze 및 Picard (2002) Nucl. Acids Res. 30(10):e46; Yu 등 (2002); 및 Shim 등 (2002) J. Biol. Chem. 277:30413-30416 에 기재된 바와 같이, 선택한 세포에 전달하기 전에, 시험관내에서 어닐링되는 개별적인 센스 및 안티센스 가닥을 제조하는 RNA 폴리머라아제 매개 프로세스를 이용하여 수행될 수 있다. 몇몇 제조사들 (Promega, Ambion, New England Biolabs, 및 Stragene) 은 시험관내 합성 수행에 유용한 전사 키트를 제조한다.

siRNA 의 시험관내 합성은, DNA 템플레이트로서 센스 및 안티센스 RNA 서열의 상류에 T7 RNA 폴리머라아제 프로모터를 포함하는 짧은, 이중 올리고뉴클레오티드의 쌍을 이용하여 달성될 수 있다. 상기 이중체의 각각의 올리고뉴클레오티드는 siRNA 의 한 가닥의 합성을 위한 별도의 템플레이트이다. 합성된 별도의 짧은 RNA 가닥들은 이어서 어닐링되어, Protocols and Applications, Chapter 2: RNA interference, Promega Corporation, (2005) 에 기재된 바와 같이 siRNA 를 형성한다.

dsRNA 의 시험관내 합성은, 예를 들어 양측 DNA 표적 서열 가닥의 5'-말단에서의 T7 RNA 폴리머라아제 프로모터를 이용하여 달성될 수 있다. 이는, 2 개의 별도 반응에서 전사되는, 각각 T7 프로모터에 대해 상이한 배열 중의 표적 서열을 포함하는 별도의 DNA 템플레이트를 이용하여 달성된다. 결과로서 수득되는 전사물은 혼합하고 전사후 어닐링된다. 상기 반응에 이용되는 DNA 템플레이트는, PCR 에 의해 또는, 각각 표적 서열의 상이한 말단에 T7 폴리머라아제 프로모터를 포함하는 2 개의 선형화된 플라스미트 템플레이트를 이용하여 만들어질 수 있다. Protocols and Applications, Chapter 2: RNA interference, Promega Corporation, (2005).

본원에 기재된 단백질을 발현시키기 위해서, 관심대상의 유전자를 코딩하는 핵산 서열은 몇가지 기법에 의해 전달될 수 있다. 그의 예시에는, 본원에 기재되는 바와 같은 바이러스 기법 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-회합성 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 등) 및 비-바이러스 기법 (예를 들어, DNA/리포좀 복합체, 미셀 및 표적하는 바이러스 단백질-DNA 복합체) 이 포함된다. 일단 관심 대상의 세포 내부에서는, 트랜스유전자의 발현은 어디에나 있는 프로모터 (예를 들어, EF-1α) 또는 조직 특이적 프로모터 (예를 들어, 칼슘 칼모듈린 키나아제 2 (CaMK1) 프로모터, NSE 프로모터 및 인간 Thy-1 프로모터) 의 제어 하에 있을 수 있다. 대안적으로, 발현 수준은, Wiznerowicz 등 (2005) Stem Cells 77:8957-8961 에 기재된 바와 같은 유도성 프로모터 시스템 (예를 들어, Tet on/off 프로모터) 의 이용에 의해 제어될 수 있다.

프로모터의 비제한적 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 싸이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (Kaplitt 등 (1994) Nat. Genet. 8: 148-154), CMV/인간 β3-글로빈 프로모터 (Mandel 등 (1998) J. Neurosci. 18:4271-4284), NCXl 프로모터, αMHC 프로모터, MLC2v 프로모터, GFAP 프로모터 (Xu 등 (2001) Gene Ther., 8: 1323-1332), 1.8-kb 신경세포-특이적 에놀라아제 (NSE) 프로모터 (Klein 등 (1998) Exp. Neurol. 150: 183-194), 닭 베타 액틴 (CBA) 프로모터 (Miyazaki (1989) Gene 79:269-277) 및 β-글루쿠로니다아제 (GUSB) 프로모터 (Shipley 등 (1991) Genetics 10: 1009-1018), 인간 혈청 알부민 프로모터, 알파-1-안티트립신 프로모터가 포함된다. 발현 개선을 위해, 예를 들어, Woodchuck Hepatitis Virus Post-Regulatory Element (WPRE) (Donello 등 (1998) J. Virol. 72: 5085-5092) 또는 소 성장 호르몬 (BGH) 폴리아데닐화 부위와 같은 기타 조절 구성원이 트랜스유전자에 추가적으로 작동적으로 연결될 수 있다.

또한, 서열 식별 번호 12 내지 15 를 코딩하는 10 개 이상, 또는 대안적으로, 17 개 이상 또는 대안적으로 20 개 이상, 또는 대안적으로, 50 개 이상, 또는 대안적으로, 75 개 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 대안적으로 100 개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머가 제공된다. 적합한 프로브 및 프라이머는 상기에 기재되어 있다. 특이적 혼성화에 "완벽하게 매칭되는" 프로브가 필요한 것은 아니라는 점이 당업계에 공지되어 있다. 소수 염기의 치환, 결실 또는 삽입에 의해 달성되는 프로브 서열에서의 미미한 변화는 혼성화 특이성에 영향을 주지 않는다. 일반적으로, 20% 정도의 염기쌍 미스매치 (최적으로 정렬된 경우) 는 용인가능하다. 상기 언급한 mRNA 검출에 유용한 프로브는, 앞서 특징분석된 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 대응하는 앞서 밝힌 서열들 (상기에 밝힘) 에 포함된 필적할 크기의 상동 영역에 대해 약 80% 이상 동일하다. 대안적으로, 프로브는 상동 영역의 정렬 후 대응하는 유전자 서열에 85% 동일하며; 나아가, 이는 90% 동일성, 또는 더 나아가 95% 이상 동일성을 나타낸다.

상기 프로브는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 폴리펩티드를 검출 또는 모니터링하기 위한 방사성 검정 (예를 들어, 서던 및 노던 블롯 분석) 에 이용될 수 있다. 프로브는 또한, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)에 대응하는 유전자 발현 검출을 위한 고성능 스크리닝 검정에 이용하기 위한 칩과 같은 어레이 또는 고체 지지체에 결합될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 절편은, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 숙주 세포로의 형질도입을 확인하기 위해, 신경세포에서 발현되는 유전자 또는 유전자 전사물의 검출을 위한 프라이머로서 제공될 수 있다. 이러한 맥락에서, 증폭은 타당한 정확도를 갖고 표적 서열을 복제할 수 있는 프라이머-의존성 폴리머라아제를 채용하는 임의의 방법을 의미한다. 증폭은 T7 DNA 폴리머라아제, 에셰리키아 콜라이 (E. coli) DNA 폴리머라아제의 Klenow 절편, 및 역전사효소와 같은 자연 또는 재조합 DNA-폴리머라아제에 의해 수행될 수 있다. 프라이머 길이는 프로브에 대해 상기에서 밝힌 것과 동일하다.

본 발명은 추가로 RNA 전사의 프로모터에 작동적으로 연결된 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 및 DNA 또는 RNA 의 복제 및/또는 일시적 또는 안정한 발현을 위한 기타 조절 서열들을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동적으로 연결된" 은 프로모터가 RNA 의 DNA 분자로의 전사를 지시하도록 위치했음을 의미한다. 상기 프로모터의 예시는 SP6, T4 및 T7 이다. 특정 구현예에서, 세포-특이적 프로모터는 삽입된 폴리뉴클레오티드의 세포-특이적 발현에 이용된다. 종결 코돈 및 선별가능한 마커 서열과 함께 프로모터 또는 프로모터/인핸서 뿐만 아니라 DNA 의 삽입된 조각이 상기 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있는 클로닝 부위를 포함하는 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 시판되어 입수가능하다. 일반적인 방법론 및 클로닝 전략에 대해, 참고문헌은 Gene Expression Technology (Goeddel 편저, Academic Press, InC. (1991)) 및 그에 인용된 참고문헌, 및 각종 적합한 벡터에 대한 맵, 기능적 특성, 시판 공급사 및 GenEMBL 접근 번호에 대한 참고사항을 포함하는 Vectors: Essential Data Series (Gacesa and Ramji, 편저, John Wiley & Sons, N. Y. (1994)). 바람직하게는, 상기 벡터들은 시험관내 또는 생체내에서 RNA 를 전사할 수 있다.

상기 핵산을 포함하는 발현 벡터는 단백질 및 폴리펩티드 생산을 위한 숙주 벡터 수득에 유용하다. 상기 발현 벡터들은 숙주 유기체에서 에피좀으로든 또는 염색체 DNA 의 통합 부분으로든 복제가능해야 한다. 적합한 발현 벡터에는, 플라스미드, 아데노바이러스, 아데노-회합성 바이러스, 레트로바이러스를 포함하는 바이러스 벡터, 코스미드 등이 포함된다. 아데노바이러스 벡터는, 시험관내 및 생체내에서의 그의 높은 발현 수준 및 효율적인 세포 형질전환으로 인해, 생체내 조직으로의 유전자 도입에 특히 유용하다. 핵산이 적합한 숙주 세포, 예를 들어 원핵 또는 진핵 세포 및 숙주 세포에 삽입될 때, 단백질은 재조합적으로 생산될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 벡터에 좌우될 것이며, 상기 언급한 바와 같이 포유류 세포, 동물 세포, 인간 세포, 원숭이 세포, 곤충 세포, 효모 세포 및 상기 언급한 박테리아 세포를 포함할 수 있으며, 널리 공지된 방법을 이용하여 구축될 수 있다. 참고문헌은, Sambrook 및 Russell (2001) 의 상기 문헌. 외인성 핵산을 세포로 삽입하기 위한 바이러스 벡터의 이용에 추가하여, 핵산은 당업계에 널리 공지된 방법, 예컨대 박테리아 세포에 대해서는 형질전환; 포유류 세포에 대해서는 칼슘 포스페이트 침전을 이용한 트랜스펙션; DEAE-덱스트란; 전기천공; 또는 마이크로인젝션으로 숙주 세포에 삽입될 수 있다. 본 방법론에 대한 참고문헌은, Sambrook 및 Russell (2001) 의 상기 문헌.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 세포로 (생체내, 생체외 또는 시험관내) 전달하기에 적합한 전달 비히클을 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유전자 전달 비히클, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 포함될 수 있다. 상기 벡터들 (특히 발현 벡터) 은 이어서, 예를 들어 세포로의 전달 및/또는 출입을 촉진할 수 있는, 다수의 형태들 중 임의의 것을 취하도록 취급될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 단리된 숙주 세포들은 폴리뉴클레오티드의 재조합적 복제 및 펩티드의 재조합적 생산 및 고성능 스크리닝에 유용하다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 검출가능한 표지에 콘쥬게이션되거나 또는 고체 지지체 또는 약제학적으로 허용되는 담체와 병용될 수 있다. 적합한 고체 지지체는 상기에 기재되어 있고 적합한 표지를 갖는다. 표지를 폴리뉴클레오티드에 결합시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 참고문헌은, Sambrook 및 Russell (2001) 의 상기 문헌.

치료용 항체 조성물

본 발명은 또한, 본 발명의 치료 방법에 유용한, 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 특이적으로 복합체를 형성할 수 있는 항체를 제공한다. 용어 "항체" 에는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체, 항체 절편 뿐만 아니라 이들의 유도체 (상기에 기재됨) 가 포함된다. 항체에는, 이에 제한되지 않으나, 래트 및 토끼 또는 인간 항체가 포함된다. 항체는 세포 배양에서, 파지에서, 또는 이에 제한되지 않으나 소, 토끼, 염소, 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그, 양, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지, 유인원 등을 포함하는 각종 동물에서 생산될 수 있다. 항체는 또한 치료용 폴리펩티드를 동정 및 정제하기에 유용하다.

본 발명은 또한 상기 기재된 항체 및 항체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 항체-펩티드 복합체를 제공한다. 한 국면에서, 폴리펩티드는 항체가 발생하게 하는 폴리펩티드이다. 한 국면에서, 항체-펩티드 복합체는 단리된 복합체이다. 추가 국면에서, 복합체의 항체는, 이에 제한되지 않으나, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인간화된 항체 또는 본원에 기재된 항체 유도체이다. 항체-펩티드 복합체의 항체 또는 펩티드 중 하나 또는 이들 두가지 모두가 검출가능하게 표지될 수 있다. 한 국면에서, 본 발명의 항체-펩티드 복합체는 진단 또는 스크리닝 검정에서 대조군으로서 또는 표준 시료로서 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리클로날 항체는 당업계에 공지된 통상적인 기법을 이용하여 생성될 수 있으며, 문헌에 널리 기재되어 있다. 몇가지 방법론들은 폴리클로날 항체의 생산을 위해 존재한다. 예를 들어, 폴리클로날 항체는 일반적으로, 이에 제한되지 않으나, 닭, 염소, 기니피그, 햄스터, 말, 마우스, 래트 및 토끼와 같은 적합한 포유류의 면역화에 의해 생산된다. 항원은 포유류에 주사되어, 항원에 특이적인 IgG 면역글로불린을 생산할 B-림프구를 유도한다. 상기 IgG 는 포유류 혈청으로부터 정제된다. 본 방법론의 변형에는, 아쥬반트, 투여 경로 및 부위, 부위 당 주사 부피 및 최적의 생산을 위한 동물마다의 부위의 갯수 및 동물의 인도적인 처리의 개질이 포함된다. 예를 들어, 아쥬반트는 전형적으로는 항원에 대한 면역 응답성을 개선 또는 증강시키기 위해 사용한다. 대부분의 아쥬반트는, 배수작용 림프절에 대한 항원의 느린 방출이 가능하도록 하는, 주사 부위 안티벤 데포 (antiben depot) 를 제공한다. 기타 아쥬반트에는 큰 표면적 및 면역자극성 분자에 걸쳐 단백질 항원 분자의 집중을 촉진하는 계면활성제가 포함된다. 폴리클로날 항체 생성을 위한 아쥬반트의 비제한적 예시에는 프로인트 아쥬반트 (Freund's adjuvants), 리비 아쥬반트 시스템 (Ribi adjuvant system) 및 티테르맥스 (Titermax) 가 포함된다. 폴리클로날 항체는 U.S. 특허 7,279,559; 7,119,179; 7,060,800; 6,709,659; 6,656,746; 6,322,788; 5,686,073; 및 5,670,153 에 기재된 방법을 이용하여 생성될 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체는 당업계에 널리 공지되어 있고 문헌에 널리 기재되어 있는 통상적인 하이브리도마 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마는 적합한 불멸 세포주 (예를 들어, 미엘로마 세포주, 예컨대 이에 제한되지 않으나, Sp2/0, Sp2/0-AG14, NSO, NS1, NS2, AE-I, L.5, >243, P3X63Ag8.653, Sp2 SA3, Sp2 MAI, Sp2 SSl, Sp2 SA5, U397, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-I, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, CHO, PerC.6, YB2/O) 등, 또는 헤테로미엘로마, 이들의 융합 생성물, 또는 이들로부터 유도된 임의의 세포 또는 융합 세포, 또는 당업계에 공지된, 항체 생산 세포인 임의의 적합한 세포주 (참고문헌은, 예를 들어, 2007 년 11 월 26 일에 마지막으로 접속했던 www.atcc.org, www.lifetech.com., 등), 예컨대, 이에 제한되지 않으나, 단리된 또는 클로닝된 비장, 말초혈, 림프, 편도선 또는 기타 면역 또는 B 세포 포함 세포, 또는 바이러스, 박테리아, 조류, 원핵성, 양서류, 곤충, 파충류, 어류, 포유류, 설치류, 말, 양, 염소, 면양, 영장류, 진핵성, 게놈 DNA, cDNA, rDNA, 미토콘드리아 DNA 또는 RNA, 엽록소 DNA 또는 RNA, hnRNA, mRNA, tRNA, 단일, 이중 또는 삼중 가닥, 혼성화 등 또는 이들의 임의의 조합인, 중쇄 또는 경쇄 불변 또는 가변, 또는 내생성 또는 이종기원성 핵산으로서의 재조합성 또는 내생성인 프레임워크 또는 CDR 서열을 발현하는 임의의 기타 세포에 의해 생산된다. 항체 생산 세포는 또한, 관심대상의 항원으로 면역화된 인간 또는 기타 적합한 동물의 말초혈로부터, 또는 바람직하게는 비장 또는 림프절로부터 수득될 수 있다. 임의의 기타 적합한 숙주 세포는 또한 본 발명의 항체, 그의 특이적 절편 또는 변이체를 코딩하는 이종기원성 또는 내생성 핵산을 발현시키기 위해 이용될 수 있다. 융합 세포 (하이브리도마) 또는 재조합 세포는 선택적 배양 조건 또는 기타 적합한 공지된 방법을 이용하여 단리되고, 희석 제한 또는 세포 분류 또는 기타 공지된 방법으로 클로닝될 수 있다.

한 구현예에서, 본원에 기재된 항체는 Multiple Antigenic Peptide (MAP) 시스템을 이용하여 생성될 수 있다. MAP 시스템은, 관심대상의 항원 펩티드가 표준 고상 화학을 이용하여 만들어질 수 있는, 3 또는 7 개의 방사상으로 분지하는 라이신 잔기를 포함한다. 라이신 코어는, 일반적으로 총 분자량의 10% 미만에 달하는 내부 코어에 따라서 펩티드 에피토프의 약 4 내지 8 개 복제물을 포함하는 MAP 을 제공한다. MAP 시스템은 콘쥬게이션을 위한 담체 단백질을 필요로 하지 않는다. MAP 내에서의 항원성 에피토프의 다중 복제물의 높은 몰비 및 밀집한 팩킹은 강한 면역원성 응답을 불러오는 것으로 나타났다. 상기 방법은 U.S. 특허 5,229,490 에 기재되어 있고, 본원에 그 전부가 참고문헌으로 포함된다.

이에 제한되지 않으나, 펩티드 또는 단백질 라이브러리 (예를 들어, 이에 제한되지 않으나, 박테리오파지, 리보좀, 올리고뉴클레오티드, RNA, cDNA 등, 디스플레이 라이브러리; 예를 들어, Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK), MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Del), Biovation (Aberdeen, Scotland, UK), Biolnvent (Lund, Sweden) 와 같은 여러 상업적 판매사로부터 입수가능한 것들) 로부터 공지된 방법을 이용하여 재조합 항체를 선별하는 방법을 포함하는, 필요한 특이성의 항체를 생산 또는 단리하기 위한 기타 적합한 방법을 이용할 수 있다. 참고문헌은, U.S. 특허 4,704,692; 5,723,323; 5,763,192; 5,814,476; 5,817,483; 5,824,514; 5,976,862. 대안적인 방법은, 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 당업계에 공지 및/또는 본원에 기재된 바와 같이 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있는 SCID 마우스, Nguyen 등 (1977) MicroBiol. Immunol. 41:901-907 (1997); Sandhu 등(1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118; Eren 등 (1998) Immunol. 93:154-161) 의 면역화에 의존한다. 상기 기법에는, 이에 제한되지 않으나, 리보좀 디스플레이 (Hanes 등 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:4937-4942; Hanes 등(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14130- 14135); 단일 세포 항체 생산 기법 (예를 들어, 선별된 림프구 항체 방법 ("SLAM") (U.S. 특허 5,627,052, Wen 등 (1987) J. Immunol. 17:887-892; Babcook 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93:7843-7848); 겔 마이크로적가 및 유세포분석 (Powell 등 (1990) Biotechnol. 8:333-337; One Cell Systems, (Cambridge, Mass).; Gray 등 (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163; 및 Kenny 등 (1995) Bio. Technol. 13:787-790); B-세포 선별 (Steenbakkers 등 (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134) 이 포함된다.

본 발명의 항체 유도체는 또한 본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 숙주에 전달함으로써, 예컨대 상기 항체를 그의 유즙에 제공하는 트랜스제닉 동물 또는 포유류, 예컨대 염소, 소, 말, 양 등을 제공하기 위해 제조될 수 있다. 상기 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 U.S. 특허 5,827,690; 5,849,992; 4,873,316; 5,849,992; 5,994,616; 5,565,362; 및 5,304,489 에 기재되어 있다.

용어 "항체 유도체" 에는 항체 또는 절편의 선형 폴리펩티드 서열에 대한 번역후 개질이 포함된다. 예를 들어, U.S. 특허 6,602,684 B1 은, 증강된 Fc-매개 세포 독성을 가진, 면역글로불린의 Fc 영역과 동등한 영역을 포함하는 전체 항체 분자, 항체 절편, 또는 융합 단백질 및 그렇게 형성된 당단백질을 기재한다.

항체 유도체는 또한 상기 항체를 생산하는 트랜스제닉 식물 및 배양된 식물 세포 (예를 들어, 이에 제한되지 않으나, 담배, 옥수수 및 좀개구리밥), 특정화된 일부분 또는 변이체를 식물 부분 또는 그로부터 배양된 세포에 제공할 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 전달함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, Cramer 등 (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118 및 그의 인용 문헌은, 예를 들어, 유도성 프로모터를 이용하는, 대량의 재조합성 단백질을 발현하는 트랜스제닉 담뱃잎의 생산을 기재한다. 트랜스제닉 옥수수는, 기타 재조합 시스템에서 제조되거나 또는 자연 공급원으로부터 정제된 것과 동등한 생물학적 활성을 가진, 상업적 생산 수준으로 포유류 단백질을 발현하도록 이용된 바 있다. 참고문헌은, 예를 들어, Hood 등 (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147 및 그의 인용된 참고문헌. 항체 절편들, 예컨대 단일쇄 항체 (scFv) 를 포함하는 항체 유도체들은 또한, 담배 종자 및 감자 덩이줄기를 포함하는 트랜스제닉 식물 종자들로부터 대량으로 생산되었다. 참고문헌은, 예를 들어, Conrad 등(1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109 및 그의 인용된 참고문헌. 따라서, 본 발명의 항체는 또한 공지된 방법에 따라 트랜스제닉 식물을 이용하여 생산될 수 있다.

항체 유도체들은 또한, 예를 들어 면역원성을 개질하거나 또는 결합성, 친화성, 온-레이트 (on-rate), 오프-레이트 (off-rate), 결합활성, 특이성, 반감기 또는 임의의 기타 적합한 특징들을 감소, 증강 또는 개질하기 위한 외인성 서열을 첨가하여 생산될 수 있다. 일반적으로, 비인간 또는 인간 CDR 서열의 일부 또는 전부는 유지되는 한편, 가변 및 불변 영역의 비인간 서열이 인간 또는 기타 아미노산으로 치환된다.

일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 주는 것에 직접적으로 및 가장 실질적으로 연관되어 있다. 본 발명의 항체의 인간화 또는 조작은, 예컨대 이에 제한되지 않으나, U.S. 특허 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 및 4,816,567 에 기재된 것과 같은 임의의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

부분적 또는 완전 인간 항체를 제조하기 위한 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 임의의 상기 기법이 이용될 수 있다. 한 구현예에 따르면, 완전 인간 항체 서열은 인간 중쇄 및 경쇄 항체 유전자를 발현하도록 조작된 트랜스제닉 마우스에서 만들어진다. 상이한 클래스의 항체를 제조할 수 있는 많은 종류의 상기 트랜스제닉 마우스가 제작되었다. 원하는 항체를 생산하고 있는 트랜스제닉 마우스 유래의 B 세포를 융합시켜 원하는 항체의 연속적인 생산을 위한 하이브리도마 세포주를 제조할 수 있다. (참고문헌은, 예를 들어 Russel 등 (2000) Infection and Immunity April 2000: 1820-1826; Gallo 등 (2000) European J. of Immun. 30:534-540; Green (1999) J. of Immun. Methods 231:11-23; Yang 등 (1999A) J. of Leukocyte Biology 66:401-410; Yang (1999B) Cancer Research 59(6): 1236-1243; Jakobovits. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42; Green 및 Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188(3):483-495; Jakobovits (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4): 607-614; Tsuda 등 (1997) Genomics 42:413-421; Sherman-Gold (1997) Genetic Engineering News 17(14); Mendez 등 (1997) Nature Genetics 15:146-156; Jakobovits (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System Vol. IV, 194.1-194.7; Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology 6:561-566; Mendez 등 (1995) Genomics 26:294-307; Jakobovits (1994) Current Biology 4(8):761-763; Arbones 등 (1994) Immunity 1(4):247-260; Jakobovits (1993) Nature 362(6417):255-258; Jakobovits 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(6):2551-2555; 및 U.S. 특허 6,075,181.)

본 발명의 항체는 또한 키메라성 항체를 만들기 위해 개질될 수 있다. 키메라성 항체는 한 종 이상 유래의 DNA 에 의해 항체의 중쇄 및 경쇄의 여러 도메인이 코딩되는 것이다. 참고문헌은, 예를 들어, U.S. 특허 4,816,567.

대안적으로, 본 발명의 항체는 또한 베니어드 (veneered) 항체를 만들기 위해 개질될 수 있다. 베니어드 항체는 한 종의 항체의 외부 아미노산 잔기를 적절히 고려하여 치환시키거나 또는 제 2 의 종의 것으로 "베니어드" 시켜 제 1 종의 항체가 제 2 종에서 면역원성이 되지 않도록 함으로써 항체의 면역원성을 감소시킨 것이다. 단백질의 면역원성은 원래 그의 표면의 특징에 의해 좌우되므로, 항체의 면역원성은 또다른 포유류 종 항체에서 일반적으로 발견되는 것과 상이한 노출된 잔기들을 치환함으로써 감소될 수 있다. 외부 잔기의 그러한 적절한 치환은 내부 도메인 또는 도메인간 접촉에 영향이 거의 없거나 또는 없다. 따라서, 리간드 결합 특성은 가변 영역 프레임워크 잔기에 제한된 변경의 결과로서는 영향을 받지 않는다. 그 프로세스는, 항체의 외곽 표면 또는 껍질만이 변경되고 지지중인 잔기들은 영향을 받지 않은 채 남아있기 때문에 "베니어링" 으로 지칭된다.

"베니어링" 에 대한 과정은, Kabat 등 (1987), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제 4 판, Bethesda, Md., National Institutes of Health, 상기 데이터에 대한 업데이트, 및 기타 접근가능한 U.S. 및 외국 데이터베이스 (핵산 및 단백질의 두가지 모두) 에 의해 집대성된 인간 항체 가변 도메인에 대한 이용가능한 서열 데이터를 이용한다. 베니어드 항체 생성에 이용되는 방법의 비제한적 예시에는, EP 519596; U.S. 특허 6,797,492 가 포함되며; Padlan 등 (1991) Mol. Immunol. 28(4-5):489-498 에 기재되어 있다.

용어 "항체 유도체" 는 또한 2 개의 항원-결합 부위를 가진 작은 항체 절편인 "2 가 항체" 를 포함하는데, 절편들은 동일한 폴리펩티드 사슬 내에서 경쇄 가변 도메인 (VL) 에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) 을 포함한다 (참고문헌은, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger 등, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). 동일한 사슬 상의 두 도메인 사이의 짝짓기를 허용하기에는 너무 짧은 링커를 이용함으로써, 도메인들이 또다른 사슬의 상보적 도메인과 짝을 이루게 되어, 2 개의 항원-결합 부위가 만들어진다 (참고문헌은 또한, 모 항체의 고변이 영역에 삽입된 하나 이상의 아미노산을 갖고, 항원에 대한 모 항체의 결합 친화성보다 약 2 배 이상 더 강한 표적 항원에 대한 결합 친화성을 가진 항체 변이체를 개시하는, Chen 등에게 허여된, U.S. 특허 6,632,926).

용어 "항체 유도체" 는 추가로 "선형 항체" 를 포함한다. 선형 항체의 제조 과정은 당업계에 공지되어 있으며, Zapata 등 (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062 에 기재되어 있다. 간략하게, 상기 항체들은 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 탠덤 Fd 세절 (V_H-C_H1-V_H-C_H1) 을 포함한다.

본 발명의 항체는, 이에 제한되지 않으나, 단백질 A 정제, 암모늄 설페이트 또는 에탄올 침전, 산 침전, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 공지된 방법으로 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC") 가 또한 정제에 이용될 수 있다.

본 발명의 항체에는 자연적으로 정제된 생성물, 화학 합성 과정의 생성물 및, 예를 들어 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유류 세포를 포함하는 진핵성 숙주 또는 대안적으로 상기 기재된 원핵성 세포로부터 재조합 기법으로 생산된 생성물이 포함된다.

시험한 모노클로날 항체가 단백질 또는 폴리펩티드에 결합한다면, 시험한 항체 및 본 발명의 하이브리도마에 의해 제공되는 항체는 동등하다. 번잡한 실험없이도, 본 발명의 모노클로날 항체로 하여금 정상적으로는 상기 모노클로날 항체와 반응성인 단백질 또는 폴리펩티드에 결합하는 것을 시험 항체가 저해하는지 여부를 측정하여, 상기 시험 항체가 본 발명의 모노클로날 항체와 동일한 특이성을 갖는지 여부를 알 수 있다. 시험한 항체가, 본 발명의 모노클로날 항체에 의한 결합의 감소로 나타나는 바와 같이, 본 발명의 모노클로날 항체와 경쟁한다면, 두 항체는 동일하거나 또는 밀접하게 관련된 에피토프에 결합하는 것으로 여겨진다. 대안적으로, 본 발명의 모노클로날 항체로 하여금 정상적으로는 상기 모노클로날 항체와 반응성인 단백질과 예비인큐베이션하여, 시험한 모노클로날 항체가 항원에 결합하는 그의 능력에 있어서 저해를 받는지 여부를 측정할 수 있다. 시험한 모노클로날 항체가 저해받는다면, 십중팔구 그것은 본 발명의 모노클로날 항체와 동일하거나 또는 밀접하게 관련된 에피토프 특이성을 갖는다.

용어 "항체" 는 또한 모든 이소타입의 항체를 포함하는 것을 의미한다. 특별한 이소타입의 모노클로날 항체는 최초 융합으로부터 선별하여 직접 제조하거나 또는, Steplewski, 등 (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8653 또는 Spira, 등 (1984; J. Immunol. Methods 74:307 에 기재된 과정을 이용한 클래스 전환 변이체를 단리하는 sib 선별 기법을 이용하여 상이한 이소타입의 모노클로날 항체를 분비하는 모(parent) 하이브리도마로부터 이차적으로 제조할 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체의 특이성을 가진 모노클로날 항체를 분비하는 기타 하이브리도마의 단리는 또한, 항-이디오타입 항체 제조로 당업자에 의해 수행될 수 있다. Herlyn, 등 (1986) Science 232: 100. 항-이디오타입 항체는 관심대상의 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체에 존재하는 특별한 결정요인을 인식하는 항체이다.

두 하이브리도마의 모노클로날 항체간 이디오타입 동일성은, 상기 두 모노클로날 항체가 동일한 에피토프 결정요인의 인식에 있어서는 동일하다는 것을 표명한다. 따라서, 모노클로날 항체 상의 에피토프 결정요인에 대한 항체를 이용함으로써, 동일한 에피토프 특이성의 모노클로날 항체를 발현하는 다른 하이브리도마를 동정하는 것이 가능하다.

에피토프를 모방하는 모노클로날 항체 제조에 항-이디오타입 기법을 이용하는 것이 가능하다. 예를 들어, 첫번째 모노클로날 항체로 만든 항-이디오타입 모노클로날 항체는 상기 첫번째 모노클로날 항체에 의해 결합되는 에피토프의 거울상인 고변이부위 영역 내에 결합 도메인을 가질 것이다. 따라서, 상기의 경우, 항-이디오타입 모노클로날 항체는 상기 항체 제조를 위한 면역화에 이용될 수 있다.

본 발명의 일부 국면에서, 항체를 검출가능하게 또는 치료용으로 표지하는 것이 유용할 것이다. 적합한 표지는 상기에 기재되어 있다. 항체를 상기 시약에 콘쥬게이션시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 오직 설명의 목적으로 언급하자면, 항체는 방사활성 원자, 발색단, 형광체 등과 같은 검출가능한 부분으로 표지될 수 있다. 상기 표지된 항체들은 생체내에서 또는 단리된 시험 시료에서 진단 기법용으로 이용될 수 있다.

저분자량 합텐에 대한 항체의 커플링은 검정에서 항체의 감도를 증가시킬 수 있다. 이어서, 합텐은 2 차 반응을 수단으로 하여 특이적으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 아비딘과 반응하는 바이오틴, 또는 특이적인 항-합텐 항체와 반응할 수 있는 디니트로페놀, 피리독살 및 플루오레신과 같은 합텐을 이용하는 것이 일반적이다. 참고문헌은, Harlow 및 Lane (1988) 의 상기 문헌.

항체는 방사활성 원자, 발색단, 형광체 등과 같은 검출가능한 부분으로 표지될 수 있다. 상기 표지된 항체는 생체내에서 또는 단리된 시험 시료에서 진단 기법용으로 이용될 수 있다. 항체는 또한, 예를 들어 화학요법 약물 또는 독소와 같은 약제학적 제에 콘쥬게이션될 수 있다. 이들은 싸이토카인, 리간드, 또다른 항체에 연결될 수 있다. 항암 효과를 달성하는 항체에 커플링하기에 적합한 약제에는, 사이토카인, 예컨대 인터류킨 2 (IL-2) 및 종양 괴사 인자 (TNF); 알루미늄 (III) 프탈로시아닌 테트라술포네이트, 헤마토포르피린 및 프탈로시아닌을 포함하는 포토다이나믹 요법에 사용하기 위한 광감작제; 방사성 핵종, 예컨대 요오드-131 (¹³¹I), 이트륨-90 (⁹⁰Y), 비스무트-212 (²¹²Bi), 비스무트-213 (²¹³Bi), 테크네슘-99m (⁹⁹mTc), 레늄-186 (¹⁸⁶Re), 및 레늄-188 (¹⁸⁸Re); 항생제, 예컨대 독소루비신, 아드리아마이신, 다우노루비신, 메토트렉세이트, 다우노마이신, 네오카르지노스타틴 및 카르보플라틴; 박테리아, 식물 및 기타 독소, 예컨대 디프테리아 독소, 녹농균 외독소 A, 포도상구균 내장독소 A, 아비린-A 독소, 리신 A (탈글리코실화 리신 A 및 네이티브 리신 A), TGF-알파 독소, 중국 코브라 (naja naja atra) 유래의 세포독소, 및 젤로닌 (식물 독소); 식물, 박테리아 및 균류 유래의 리보좀 불활성화 단백질, 예컨대 레스트릭토신 (아스페르길루스 레스트릭투스 (Aspergillus restrictus) 에서 생성되는 리보좀 불활성화 단백질), 사포린 (사포나리아 오피시날리스 (Saponaria officinalis) 유래의 리보좀 불활성화 단백질), 및 RNase; 티로신 키나아제 저해제; ly207702 (디플루오르화 퓨린 뉴클레오시드); 항시스틱제 (anti cystic agent) 를 함유하는 리포좀 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 독소를 코딩하는 플라스미드, 메토트렉세이트 등); 및 기타 항체 또는 항체 절편, 예컨대 F(ab) 가 포함된다.

본 발명의 항체는 또한 다수의 상이한 담체에 결합될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 항체 및 활성 또는 불활성인 기타 물질을 함유하는 조성물을 제공한다. 널리 공지된 담체의 예시에는, 유리, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라아제, 천연 및 개질 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 아가로오스 및 마그네타이트가 포함된다. 담체의 특성은 본 발명의 목적에 따라 가용성 또는 불용성일 수 있다. 당업자는 모노클로날 항체 결합에 적합한 기타 항체를 알고 있거나 또는, 일상적인 실험을 이용해 그것을 알아낼 수 있을 것이다.

IV. 요법

본 발명은 항응고 요법 중인 대상체에서의 출혈을 예방 또는 감소시키는 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명의 안티도트 또는 유도체가, 해로운 혈액역동학적 (hemodynamic) 부작용 또는 상처에 대한 증식성 혈관 반응의 악화를 유발하지 않고, fXa 저해제의 통상적인 항응고 특징을 안전하고 특이적으로 중화시킬 수 있는, 긴급하지 않은 상황 또는 응급 상황에서 사용될 단기간 약물 (short-duration drugs) 일 수 있다는 것이 고려된다.

한 구현예에서, 치료 유효량의 안티도트는 높은 치료 지수를 나타낸다. 치료 지수는, LD₅₀ 및 ED₅₀ 사이의 비율로 나타낼 수 있는, 독성 효과와 치료 효과 사이의 투여량 비율이다. LD₅₀ 은 집단의 50% 에 치명적인 투여량이며, ED₅₀ 는 집단의 50% 에 치료유효한 투여량이다. LD₅₀ 및 ED₅₀ 는 동물 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 약제학적 과정으로 결정된다. 본 발명의 안티도트 또는 유도체는 대상체의 혈장 내에 존재하는 fXa 저해제의 효과를 중화시킬 필요가 있을 때 1 회 또는 수회 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 안티도트는 단일 투여량으로 투여될 때 충분하다.

본 발명의 안티도트의 전형적인 투여량은 실제적인 임상 설정 및 혈장 내 저해제 농도에 좌우될 것으로 예상된다. 트롬빈 생성, 임상 혈병형성 검정, 예컨대 aPTT, PT 및 ACT 와 같은 시험관내 검정에서, 치료 유효량의 안티도트는 생체외 혈병형성 활성의 10% 이상 보정을 제공할 것으로 예상된다. 시험관내 검정은, 1.0 을 초과하는 안티도트/저해제 비율이 역전 효과를 보여준다는 것을 나타낸다. 안티도트에 대한 최대 혈장 농도는 10 마이크로몰농도 또는 그 이하인, 마이크로몰농도 범위일 것으로 예상된다.

임상 설정에서, 안티도트의 유효성을 측정함에 있어서의 기준들 중 하나는, 그것이 출혈의 실제적인 측정치에서의 임의의 변화를 제공하는 것이다. 임상 시도에서, 대출혈의 범위에는, 치명적인 대출혈, 주요 장기 (두개내, 안내, 복막뒤, 척추, 심막) 로의 출혈, 재수술 또는 신규한 치료 과정을 요하는 출혈 (예를 들어, 수술한 무릎의 흡인, 혈흉에 대한 개흉관 삽입, 내시경 전기응고 등) 또는 명시적인 출혈이 동반된 경우 2.0 이상의 출혈 지수를 포함한다. 출혈 지수는, 수혈한 포장된 적혈구 또는 전혈 단위의 갯수에 출혈 사건 전의 헤모글로빈 수치를 더하고, 여기서 출혈이 안정화된 후 헤모글로빈 수치 (데시리터 당 그램) 를 뺀 값으로 정의된다.

임상적 설정에서의 안티도트 효능에 대한 또다른 기준은 이것이 임상적으로 유의한 경증 출혈을 감소시킨다는 것이다. 이러한 카테고리의 출혈에는, 지속성이거나 또는 재발성이고 상당량이거나 지혈없이는 정지하지 않는 코피; 치료 과정을 필요로 하지는 않는 수준으로 일어나는 직장 또는 요관 출혈 (예를 들어, 폴리 (Foley) 카테터의 새로운 삽입 또는 방광경적 관찰), 자발적이거나 또는 사소한 외상과 함께 발생한 주사 부위 또는 그밖의 위치에서의 상당량의 혈종을 포함하는, 중증은 아니나, 일상적인 것보다는 더 심하고 임상적인 주의를 요하는 출혈; 상당량의 혈액 손실; 계획에 없던 수혈이 필요한 출혈이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이 "상당량의 혈액 손실" 은 일반적으로 외과적인 과정과 연계된 양보다 더 많은 양의 혈액 손실을 의미한다. 상당량의 혈액 손실은, 방혈을 필요로 하는 것에는 미치지 못하기 때문에, 보수적으로 다뤄지는 하는 부종을 유도한다.

한 구현예에서, 본 발명의 유도체는 혈장 내에 존재하는 fXa 저해제를 실질적으로 중화시키기 위한 충분한 혈장 순환 반감기를 갖는다. 활성화된 fXa 는, 이것이 ATIII, TFPI 및 기타 혈장 저해제에 의해 유효하게 저해되기 때문에, 인간에서는 본질적으로 순환 반감기를 갖지 않는다 (Fuchs, H. E. and Pizzo, S.V., J Clin. Invest., 1983, 72:2041-2049). 불활성 fXa 는 인간에서 2 내지 3 시간의 순환 반감기를 갖는 것으로 나타난다. 개코원숭이 모델에서, DEGR ([5-(디메틸아미노)-1-나프탈렌술포닐]-글루타밀글리실아르기닐 클로로메틸 케톤) 에 의한 활성 부위에서의 차단된 fXa 의 반감기는, 동위원소 또는 효소-연계 면역흡착 검정법으로 각각 측정시, 약 10 시간 또는 2 시간이었다 (Taylor, F. B. 등, Blood, 1991, 78(2):364-368).

안티도트 fXa 유도체의 반감기를 24 내지 48 시간으로 연장하는 것이 바람직하다. 하나 이상의 하기 부분들의 콘쥬게이션 또는 첨가가 안티도트의 혈장 반감기를 증가시킬 것으로 생각된다:

a) 폴리에틸렌 글리콜;

b) 아실기;

c) 리포좀 및 캡슐화제;

d) 담체 단백질;

e) 인공 인지질막;

f) 면역글로불린; 및

g) 나노입자.

콘쥬게이션 부위는, 콘쥬게이션이 안티도트의 저해제 결합 부위(들)을 차폐하지 않는 한 특별한 사슬 또는 잔기로 제한되지 않는다. 본원에 기재된 안티도트는 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 화합물과 병용하여 투여될 수 있다.

일반적으로, 투여되는 항체는 순환하는 혈액 응고 단백질보다 훨씬 더 긴 반감기를 갖는다. Gla-도메인 결핍 fXa 및, 연장된 순환 반감기를 가진 안티도트로서의 fXa 의 엑소사이트 (exosite) 에 결합된 항체로 이루어진 복합체를 이용하는 것이 가능하다. fXa 및 엑소사이트를 표적으로 하는 항체의 복합체 형성은 Gla-도메인 결핍 fXa 와 거대분자 기질 및 저해제, 예컨대 프로트롬빈 및 안티트롬빈의 상호작용을 감소시킬 수 있으며, 활성 부위 클레프트는 그대로 두어 복합체가 활성 부위 지정 소형 분자 저해제에 결합하는 안티도트로서 작용할 수 있도록 한다. α-2-마크로글로불린-fXa 복합체의 형성은 또한 fXa 소형 분자 저해제에 대한 안티도트로서 유용할 수 있다.

fXa 저해제의 항응고 활성 및 그의 응고촉진 활성의 역전에서의 안티도트의 효능은 당업자에 의한 시험관내 검정 및 동물 모델에서 결정될 수 있다. 시험관내 검정의 예시는, 트롬빈 생성, 임상적 혈병형성 검정, 예컨대 aPTT, PT 및 ACT 이다. 본 발명의 안티도트는 생체외 혈병형성 활성의 10% 이상 보정을 제공할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스, 개 및 영장류, 예컨대 원숭이에서의 출혈 시간 및/또는 혈액 손실의 몇가지 생체내 동물 모델이 효능 측정에 이용될 수 있다.

V. 약제학적 조성물

본 발명은 추가로 fXa 유도체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 조성물을 제공한다.

"약제학적으로 허용되는 담체" 는 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 임의의 희석제, 부형제 또는 담체를 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 담체에는, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 인산수소2나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스-기재 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 울 지방이 포함된다. 적합한 약제학적 담체는, 당업계의 표준 참고문헌 텍스트인, Mack Publishing Company 에서 출판한, Remington's Pharmaceutical Sciences 에 기재되어 있다. 이들은 바람직하게는 의도하는 투여 형태, 즉 경구용 정제, 캡슐, 엘릭서, 시럽 등에 따라, 그리고 통상적인 제약 실무에 맞춰 선택된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당업계에 널리 공지된 방법, 예컨대 다른 것들 중에서도 특히 통상적인 조립, 혼합, 용해, 캡슐화, 동결건조 또는 에멀전화 프로세스에 의해 제조될 수 있다. 조성물은, 과립, 침전물 또는 미립자, 동결 건조되거나, 회전증발 건조되거나 또는 분사 건조된 분말을 포함하는 분말, 무정형 분말, 주사제, 에멀전, 엘릭서, 현탁액 또는 용액을 포함하는 여러가지 형태로 제조될 수 있다. 제형물은 임의로는 안정화제, pH 조정제, 계면활성제, 생물이용능 개선제 및 이들의 조합물을 함유할 수 있다.

약제학적 제형물은, 오일, 물, 알콜 및 이들의 조합과 같은 멸균 액체를 이용하는 액상 현탁액 또는 용액으로서 제조될 수 있다. 약제학적으로 적합한 계면활성제, 현탁제 또는 에멀전화제가 경구용 또는 비경구용 투여를 위해 첨가될 수 있다. 현탁액은 오일, 예컨대 땅콩 오일, 참기름, 면실유, 옥수수유 및 올리브유를 포함할 수 있다. 현탁 제제는 또한 지방산의 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 지방산 글리세리드 및 아세틸화 지방산 글리세리드를 포함할 수 있다. 현탁 제형물은 알콜, 예컨대 에탄올, 이소프로필 알콜, 헥사데실 알콜, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다. 에테르, 예컨대 폴리(에틸렌 글리콜), 석유 탄화수소, 예컨대 미네랄 오일 및 광유, 및 물이 또한 현탁 제형물에 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 포유류, 바람직하게는 인간에 대한 약제학적 투여를 위해 제형화된다. 본 발명의 그러한 약제학적 조성물은 여러가지 방식으로, 바람직하게는 비경구적으로 투여될 수 있다.

응급 상황에 있는 환자의 혈장 내에 존재하는 fXa 저해제의 항응고 활성을 신속하게 역전시키기 위해, 본 발명의 안티도트는 비경구 투여를 경유하여 전신 순환에 투여가능하거나 또는 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비경구" 는, 피하, 정맥내, 근육내, 안내, 활액내, 흉골내, 경막내, 간내, 병변내 및 두개골내 주사 또는 주입 기법이 포함된다. 그러나, 중화시킬 fXa 저해제가 긴 혈장 반감기를 갖는 경우, 연속적인 주입 또는 서방성 제형물이 fXa 에 대한 결합에 필요할 수 있으며, 이는 신체로부터의 fXa 저해제의 일소 전에 fXa 저해제를 해방시킨다.

본 발명의 조성물의 멸균 주사가능한 형태는 수성 또는 기름이 많이 든 현탁액일 수 있다. 상기 현탁액은 적합한 분산 또는 습윤제 및 현탁제를 이용하여 당업계에 공지된 기법에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄디올 중의 용액으로서의 멸균 주사 용액 또는 현탁액일 수 있다. 채용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에서는 특히 물, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 추가로, 멸균된 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 채용된다. 이러한 목적을 위해서는, 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 포함하는 임의의 블랜드 (bland) 고정유가 채용될 수 있다. 올레산 및 그의 글리세리드 유도체와 같은 지방산은, 특히 그의 폴리옥시에틸화 버젼인 천연의 약제학적으로 허용되는 오일, 예컨대 올리브유 또는 평지유와 마찬가지로 주사가능한 제제에 유용하다. 상기 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로오스 또는, 에멀전 및 현탁액을 포함하는 약제학적으로 허용되는 투여 형태의 제형물에 보통 사용되는 유사한 분산제를 포함할 수 있다. 기타 보통 사용되는 계면활성제, 예컨대 Tweens, Spans 및 기타 에멀전화제 또는 약제학적으로 허용되는 고체, 액체 또는 기타 투여 형태에 보통 사용되는 생물이용능 증강제가 또한 제형물의 목적을 위해 이용될 수 있다. 주사에 의해, 예컨대 일시 주사 또는 연속 주입에 의해, 화합물들을 비경구 투여용으로 제형화할 수 있다. 주사용 단위 투여량 형태는 앰플 또는 다회 포장 용기일 수 있다.

상기에 기재된 투여 형태에 추가하여, 약제학적으로 허용되는 부형제 및 담체 및 투여 형태가 당업자에게 일반적으로 공지되어 있으며, 본 발명에 포함된다. 임의의 특별한 환자를 위한 특이적 투여 및 치료 요법은, 채용되는 특이적 안티도트의 활성, 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이, 신장 및 간의 기능, 및 투여 시간, 청소율, 치료하는 임상의 또는 수의사의 판단 및 치료할 특정 질환의 심각성을 포함하는 여러가지 요인들에 좌우될 것이다.

VI. 키트

본 발명은 추가로 키트 또는 패키지를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 키트는 하기를 포함한다: (a) 혈전증 치료를 위한 정기적인 투여용의 fXa 저해제를 포함하는 제 1 용기, 및 (b) (a) 중의 fXa 저해제의 과량이 있을 때 또는 출혈 정지 또는 예방를 위해 정상적인 지혈이 유지될 필요가 있을 때 사용되는 본 발명의 안티도트를 포함하는 제 2 용기. 다른 구현예에서, 키트는 추가로 (a) 및 (b) 중의 두 약제를 사용해야 할 때를 설명하는 표지를 포함한다.

제 1 및 제 2 용기는 병, 단지, 바이알, 플라스크, 주사기, 튜브, 백 또는 약제학적 제품의 제조, 저장 또는 분배에 사용되는 임의의 기타 용기일 수 있다. 패키지 삽입물은 라벨, 태그, 마커 등의, 키트의 약제학적 조성물과 관련된 정보를 열거하는 것일 수 있다. 열거된 정보는 일반적으로 약제학적 조성물이 판매되는 지역을 관장하는 규제 단체, 예컨대 United States Food and Drug Administration 에 의해 결정된다. 바람직하게는 패키지 삽입물은 약제학적 조성물이 승인되었다는 지시문을 구체적으로 열거한다. 패키지 삽입물은 그 속에 또는 그 위에 포함된, 개인이 정보를 읽을 수 있는 임의의 자료로 제작될 수 있다. 바람직하게는, 패키지 삽입물은 인쇄가능한 자료, 예컨대 종이, 접착제가 뒤에 있는 종이 판지, 호일 또는 플라스틱 등으로서, 원하는 정보가 인쇄 또는 적용되어 있는 것이다.

실시예

본 발명은 하기의 실시예를 참고로 하여 더욱더 이해될 것인데, 이는 본 발명을 순전히 설명하려는 의도의 것이다. 본 발명은 예시되는 구현예들에 의해 범위를 제한받지 않으며, 이들은 단지 본 발명의 단일한 국면들의 설명을 의도로 하는 것이다. 기능적으로 동등한 임의의 방법이 본 발명의 범위에 속한다. 본원에 기재된 것들에 추가하여, 상기한 상세한 설명 및 첨부하는 도면으로부터 당업자에게는 본 발명의 각종 개질이 자명할 것이다. 상기 개질은 첨부되는 특허청구범위의 범위에 속한다.

달리 언급하지 않는 한, 모든 온도는 섭씨 온도이다. 또한, 본 실시예 및 다른 부분에서, 약어는 하기의 의미를 갖는다:

aa = 아미노산

ab = 항체

ACT = 활성화된 혈병형성 시간

aPTT = 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간

CHO 세포 = 중국 햄스터 난소 세포

CHO dhfr(-) 세포 = dhfr 유전자가 결핍된 CHO 세포

hr = 시간

INR = 국제 정상화 비율

IV = 정맥내

kg = 킬로그램

M = 몰농도

mg = 밀리그램

mg/kg = 밀리그램/킬로그램

mg/mL = 밀리그램/밀리리터

min = 분

mL = 밀리리터

mM = 밀리몰농도

nm = 나노미터

nM = 나노몰농도

PO = 경구

PRP = 혈소판 풍부 혈장

PT = 프로트롬빈 시간

RFU = 상대적 형광 단위

s = 초

TF = 조직 인자

U/mL = 유닛/밀리리터

μL 또는 uL = 마이크로리터

μM = 마이크로몰농도

㎍ = 마이크로그램

실시예 1. 키모트립신 소화에 의한 des-Gla 안히드로-fXa 의 제조

Morita, T. 등, J. Bio. Chem., 1986, 261(9):4015-4023 의 과정에 따라, 0.05 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl 중에서, pH 7.5 및 22℃ 로 60 분 동안 키모트립신과 함께 안히드로-fXa 을 인큐베이션하여, 활성-부위 세린을 디히드로알라닌이 치환해 des-Gla 안히드로-fXa 를 제조했다. 전형적인 실험 설정에서, 약한 진탕과 함께, 0.5 밀리그램/밀리리터 (mg/mL) 안히드로-fXa 를 5 유닛/밀리리터 (U/mL) α-키모트립신-아가로스 비드와 인큐베이션했다. 반응 종결시, α-키모트립신-아가로스 비드를 원심분리 또는 여과로 제거했다. 이후, 과량의 저해제 4-아미디노-페닐-메탄-술포닐 플루오라이드 (APMSF), 토실-L-라이신 클로로메틸 케톤 (TLCK), 및 토실-L-페닐알라닌 클로로메틸 케톤 (TPCK) 과 인큐베이션하여, 잔류 fXa 활성 또는 비드로부터 침출되었을 수 있는 임의의 키모트립신 활성을 켄칭했다. Gla-도메인 절편 및 저해제를, Amicon Ultra Centrifugal 필터 장치 (YMlO membrane) 에 의해 또는 통상적인 투석으로 최종 생성물 des-Gla 안히드로-fXa 로부터 제거했다. 필요한 경우, 농축 또는 완충액 교환을 동시에 수행했다. Gla-도메인 포함 안히드로-fXa 를, Nogami, 등, J. Biol. Chem. 1999, 274(43):31000-7 에서 보고한 과정에 따라 제조했다. α-키모트립신-아가로스 비드를 Sigma 로부터 구입하고, 특이적 활성 (U/mL) 은 사용한 특정 롯트 번호에 대한 제조사의 데이터를 근거로 했다.

활성 fXa 의 키모트립신 소화는 APMSF 를 사용하지 않고, 상기 과정에 따라 수행될 수 있다. 활성 fXa 의 혈병형성 활성은 키모트립신 소화 전, 하기의 실시예 3 에 기재된 과정에 따른 키모트립신 소화 15, 30 및 60 분 후 측정했다. 도 7 은 키모트립신 소화 30 분 후 혈병형성 활성의 완전한 소실을 보여준다. 인큐베이션 시간을 60 분까지 연장시켜 Gla 도메인의 완전한 제거를 보장했다.

실시예 2. 혈소판이 적은 혈장 (PPP) 또는 혈소판 풍부 혈장 (PRP) 에서의 트롬빈 생성 검정

본 실시예에서, 인간 혈소판이 적거나 또는 풍부한 혈장 시료를 0.32% 시트레이트에 넣은, 건강한 공여체의 혈액으로부터 제조했다. PRP 및 PPP 는 실온에서의 ∼100 X 중력 또는 1000 X 중력에서 20 분 동안 각각 항응고 혈액을 스피닝하여 제조했다. 75 내지 100 마이크로리터 (uL) 의 혈장을 CaCl₂ 및 Z-Gly-Gly-Arg-아미노메틸쿠마린 (Z-GGR-AMC, 트롬빈 형광형성 기질) 과 혼합했다. 조직 인자 (Innovin, Dade Behring) 를 첨가하여 트롬빈 생성을 개시했다. 전형적인 실험을 위해, 반응 혼합물은 15 밀리몰농도 (mM) Ca²⁺, 100 마이크로몰농도 (μM) Z-GGR-AMC, 및 0.1 나노몰농도 (nM) 조직 인자 (TF) (Innovin) 를 함유했다. 트롬빈 형성은 상대적인 형광 유닛 (RFU) 을 측정하는 형광측정 플레이트 검독기 (Molecular Devices) 로 37℃ 에서 연속적으로 모니터링했다. 저해제 및 안티도트는, 존재하는 경우, 트롬빈 생성 개시 전에, 실온에서 20 분 동안 혈장과 함께 예비인큐베이션했다.

본 검정을 이용한 각종 실험 결과를 도 4, 6 및 9 에서 찾을 수 있다.

실시예 3. 혈병형성 연장 검정

혈병형성 연장에 대한 인자 Xa 저해제 및 안티도트의 영향을 시험하기 위해, 2 가지 혈병형성 검정 포맷을 이용했다. 첫번째 포맷에서, 96-웰 플레이트를 이용하여 동시에 다중의 시료를 측정했다. 두번째 검정 포맷에서, aPTT 를 통상적인 응고 기구 (MLA Electra 800 자동 응고 타이머) 를 이용하여 측정했다.

96-웰 플레이트 포맷 방법에서, 인간 혈소판이 적은 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장을 실시예 2 에서의 과정과 비슷하게 제조했다. 75 내지 100 μL 혈장을 CaCl₂ 를 이용하여 다시 칼슘처리하고 (recalcified), 37℃ 에서 3 분 동안 인큐베이션하고, 조직 인자 (Innovin, Dade Behring) 또는 aPTT 시약 (Actin FS, Dade Behring) 을 첨가하여 혈병 형성을 개시했다. OD₄₀₅ 의 변화를 플레이트 검독기 (Molecular Devices) 로 연속적으로 모니터링했다. 혈병형성 시간은 흡광도 (OD405nm) 가 최대값의 절반으로 변경할 때 시간 (초) 로 정의했다. 인자 Xa 저해제 및 안티도트는, 존재하는 경우, 반응 개시 전에 20 분 동안 실온에서 혈장과 함께 예비인큐베이션했다.

도 7 에 나타낸 바와 같이 활성 fXa 를 그의 혈병형성 활성에 대해 시험할 때, 75 내지 100 uL fX 결핍 혈장 (George King Bio-Medical, Inc.) 을 CaCl₂ 를 이용하여 다시 칼슘처리하고, 37℃ 에서 3 분 동안 인큐베이션하고, 키모트립신 소화 후 fXa 생성물을 혈장에 첨가하여 혈병 형성을 개시했다. OD405 의 변화는 상기에 기재한 바와 같이 플레이트 검독기로 연속적으로 모니터링했다.

도 13 에서, 정상 인간 혈장의 aPTT 연장에 대한 400 nM 베트릭사반의 효과 및 안티도트 des-Gla 안히드로-fXa 에 의한 베트릭사반 저해 효과의 역전을 MLA Electra 800 자동화 응고 타이머를 이용해 측정했다. 100 μL 의 모은 인간 혈장을 400 nM 베트릭사반 및 상이한 농도의 안티도트와 함께 혼합했다. aPTT 시약 (Actin FS, Dade Behring) 및 CaCl₂ 를 혈병형성 시간 측정에 대한 제조사의 지시에 따라 첨가했다.

상기 검정을 이용한 추가적인 실험 결과들을 도 10 및 11 에 나타냈다.

실시예 4. des-Gla 안히드로-fXa 에 의한, 베트릭사반에 의한 fXa 저해의 역전

베트릭사반에 의한 fXa 활성의 저해 및 그의 저해 효과의 역전을 측정하기 위해, 정제된 활성 fXa, 상이한 농도의 베트릭사반 및 안티도트 des-Gla 안히드로-fXa 를 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM Ca²⁺, 및 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA) 에 첨가했다. 실온에서 20 분 동안 인큐베이션 후, 100 μM Spectrozyme-fXa (인자 Xa 발색 기질, Chromogenix) 를 혼합물에 첨가하고, 기질 절단 속도를 플레이트 검독기를 이용하여 405 나노미터 (nm) 에서 5 분 동안 연속적으로 모니터링했다. 도 5 에서, 임의의 저해제의 부재 하에 발색 활성을 활성 fXa 에 대해 정상화했다. 저해제 및 안티도트 농도의 함수로서의 생성물 형성의 초기 속도를 비선형 회귀로써 분석하여 베트릭사반의 안티도트에 대한 친화성을 추산했다 (도 8).

발색 기질 S2288 (200 μM) 에 대한 트롬빈 활성에 대한 안티도트 des-Gla 안히드로-fXa 의 효과를, 특이적인 소형 분자 IIa 저해제인 아르가트로반 (Argatroban) 의 존재 또는 부재 하에, 유사하게 측정했다. 예상한 바와 같이, 안티도트 (538 nM) 는 IIa (5 nM) 의 아미드 가수분해 활성 또는 50 nM 아르가트로반에 의한 그의 저해에 영향을 주지 않는다.

실시예 5. 탈카르복시화 γ-카르복시글루탐산 잔기가 있는 fXa 의 제조

탈카르복시화 γ-카르복시글루탐산 잔기가 있는 fXa 유도체는, 예를 들어, Bajaj, 등 J. Biol. Chem., 1982, 257(7):3726-3731 에서 보고한 과정을 근거로 하여, fXa 단백질을 처리함으로써 제조할 수 있다. 2 mL 의, pH 8.0 의 0.1 몰농도 암모늄 비카르보네이트 중의 2 내지 5 mg 의 정제된 또는 재조합 fXa 를 동결건조시켰다. 결과로서 수득한 분말을 20 μm 의 진공 하에 밀봉하고, 탈카르복시화 fXa 를 수득하는 각종 기간에 대해 110℃ 에서 가열했다.

실시예 6. 재조합체 des-Gla fXa-S379A 의 제조

돌연변이형성 및 분자생물학의 일반적일 과정에 따라, 적합한 숙주 유기체에서 fX (서열 식별 번호 1, 3) 또는 fXa 유도체 (서열 식별 번호 4, 5, 9, 및 11) 를 발현시키기 위한 fX cDNA (서열 식별 번호 2) 를 근거로 한 하기의 과정들 중 하나를 이용하여 재조합 DNA 방법으로 제조했다.

재조합성 fX 및 fX 유도체는, 예를 들어 Larson, P.J., 등, Biochem., 1998, 37:5029-5038, 및 Camire, R.M., 등, Biochem., 2000, 39, 14322-14329 에 기재된 과정을 근거로 하여 인간 태아 신장 세포 HEK293 에서 발현될 수 있다. 재조합성 fX 는 인자 X 활성화제 러셀 바이퍼 베놈 (Russell's Viper Venom (RVV)) 에 의해 rfXa 로 활성화될 수 있다. rfXa 는 실시예 1 에 기재된 과정을 근거로 하여 des-Gla 안히드로-fXa 로 더 가공될 수 있다.

활성 부위 세린 잔기가 알라닌으로 치환된 재조합성 fX-S379A (키모트립신 넘버링에서는 S195A), 및 바람직하게는 활성화된 fXa 돌연변이 rfXa-379A 가, 예를 들어 Sinha 등, Protein Expression and Purif. 1992, 3: 518-524; WoIf, D.L. 등, J. Biol. Chem., 1991, 266(21):13726-13730 에 기재된 과정을 근거로 하여 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현될 수 있다.

Des-Gla fXa-S379A 는 실시예 1 에 기재된 과정에 따라 fXa-S379A 의 키모트립신 소화로 제조될 수 있다.

더욱 구체적으로, Des-Gla fXa-S379A 는 돌연변이생성 과정에 의해 Gla-도메인 절편의 결실과 함께 상기한 과정에 따라 직접 발현될 수 있다. 예를 들어, 재조합성 단백질 발현은: 서열 식별 번호 3 의 Gla-도메인 절편 1 내지 39 의 제거 후, des-Gla(1-39)-fXa-S379A; 디히드로-알라닌이 알라닌으로 치환된, 서열 식별 번호 10 과 동등한 des-Gla(1-44)-fXa-S379A; 및 전체 Gla-도메인이 제거된 des-Gla(1-45)-fXa-S379A (서열 식별 번호 11) 을 발현하기 위해 이용할 수 있다.

EGF1 에서 또는 EGF1 와 EGF2 도메인에서의 추가적인 절단 (도 2) 을 또한 des(1-84)-fXa-S379A 또는 des(1-128)-fXa-S379A 유도체 발현을 위해 제조할 수 있다.

실시예 7. CHO 세포에서의 재조합 fXa 돌연변이의 발현

본 실시예는 Gla-도메인이 없는 fXa-S379A (키모트립신 넘버링에서는 S195A) 변이체의 직접 발현을 위한 재조합성 단백질 발현 구축물 및 세포주를 기재한다. 재조합성 안티도트는 pd-안티도트 생산에 필요한 활성화 또는 화학적 개질을 필요로 하지 않으며, 본원에서 논의된 시험관내 검정에서 혈장 유도성 단백질에 대해 필적할 친화성을 갖는다.

본 실시예에서, fXa 돌연변이 (서열 식별 번호 13, 표 12a) 는 CHO 세포 (발현 벡터에 대해서는 도 14 참조) 에서 직접 발현시키고, 기능성 단백질은 하기에 기재된 조건화된 배지로부터 정제했다. 재조합성 안티도트 (r-안티도트) 기능성 활성은 시험관내 및 동물 모델에서 시험했다 (실시예 8).

fX 의 cDNA 서열 (서열 식별 번호 2) 을 3 개 영역에서 돌연변이화하기 위해 PCR 을 이용했다. 첫번째 돌연변이는 FX 의 Gla-도메인에서의 6 내지 39 aa 의 결실이다 (서열 식별 번호 3, 도 3). 두번째 돌연변이는 활성화 펩티드 서열 143 내지 194 aa 를 -RKR- 로 치환하는 것이다. 이는 경쇄 및 중쇄를 연결하는 -RKRRKR- 링커를 제공한다. 분비시, 상기 링커는 CHO 에서 제거되어, 2 쇄 fXa 분자를 제공한다. 세번째 돌연변이는 활성 부위 잔기 S379 의 Ala 잔기로의 돌연변이이다.

방금 기재한 cDNA (서열 식별 번호 16) 에 의해 생산되는 폴리펩티드는 표 12 (서열 식별 번호 12) 에 기재되어 있다. 상기 폴리펩티드에 대한 cDNA 의 정렬은 표 20 에 제시한다. 분비 후 생산되는 2 쇄 fXa 분자는 표 12b (서열 식별 번호 14) 에 기재된 경쇄 절편 및 표 12c (서열 식별 번호 15) 에 기재된 중쇄 절편이다.

fX 서열에서의 첫번째 1 내지 5 aa 는 보존성이며, fXa 돌연변이에서의 프리프로 펩티드의 적절한 프로세싱을 보장하며 fXa 돌연변이의 폴리펩티드를 fX 의 프리프로 펩티드 (서열 식별 번호 1, 도 1) 에 연결하기 위해 이용된다.

상기 기재된 fXa 돌연변이의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 서열분석하고, 도 14 에 나타낸 발현 벡터에 삽입했다. 발현 벡터의 폴리뉴클레오티드는 서열 식별 번호 18 에 제시한다. 플라스미드 DNA 는 선형화하고 CHO dhfr(-) 세포에 트랜스펙션한다. 세포를 테트라히드로폴레이트 (HT) 결핍 배지와 메토트렉세이트 (MTX) 를 이용하여 선별했다. 안정한 클론을, fX ELISA 키트 (Enzyme Research Laboratories, Catalogue Number FX-EIA) 를 이용하여 고도의 단백질 발현에 대해 스크리닝했다. FXa 돌연변이 단백질은 무혈청 배지에서 발현시키고, 정제를 위해 조건화된 배지를 수합 및 가공했다.

배지 중의 표적 단백질은 이온 교환 크로마토그래피로 단리한 후, 후속하여 단일 단계 친화성 크로마토그래피 (예컨대, 매트릭스에 커플링된 항-fXa 항체) 에 의해 또는 소수성 매트릭스와 같은 몇가지 크로마토그래피 단계의 조합에 의해 정제할 수 있다. 친화성 정제는, fXa 활성 부위 클레프트에 선택적으로 결합하는 크로마토그래피 재료, 예컨대 벤즈아미딘-세파로스 또는 대두 트립신 저해제-아가로스 (STI-아가로스) 를 포함할 수 있다.

도 15 는 fX 중쇄 및 경쇄를 각각 인식하는 모노클로날 항체 (Enzyme Research Laboratories, FX-EIA) 를 이용하여 친화성 (STI-Agaros, Sigma Catalog # T0637) 정제된 fXa 돌연변이의 웨스턴 블롯을 보여준다. 경쇄 및 중쇄를 연결하는 디설파이드 결합 환원시, r-안티도트는 웨스턴 블롯에서 혈장 유도성 fXa 와 유사한 예상했던 중쇄 밴드를 보여준다. fXa 돌연변이의 Gla-도메인에서의 6 내지 39 aa 의 결실은, 혈장 유도성 fXa 에 비해 r-안티도트의 경쇄의 더 낮은 분자량 밴드를 제공한다. 분자량 표시는 또한 블롯 상에서 볼 수 있다.

실시예 8. 생체내 마우스 모델

안티도트 투여의 존재 또는 부재 하의, 수컷 C57B1/6 마우스에서의 약동학적 및 약력학적 (PK-PD) 프로파일을 시험했다. 베트릭사반의 단일 경구 투여는 대조군에 대해서는 0, 15, 25, 및 75 mg/kg 의 투여량이었다. 안티도트 처리군에 대해서는 15 mg/kg 를 이용했다. 안티도트 (300 ㎍/200 μL) 또는 비히클 (정상 식염수, 200 μL) 의 단일한 정맥내 (IV) 주사를 1.5 시간의 시점 5 분 전에 투여했다.

베트릭사반의 경구 투여 후 1.5, 2.0 및 4.0 시간 째에, 마우스를 케타민 칵테일 (SC) 로 안락사시키고, 심장 천공을 통해 방혈시켰다. 혈액 시료 (0.5 mL) 를 50 μL 트리소듐 시트레이트 중에 수득했다. 전혈 INR 을 제조사의 지시에 따라 Hemochron Jr. cartridges (International Technidyne Corporation) 을 이용하여 측정했다. 마우스 혈소판이 적은 혈장을, 베트릭사반에 대한 원심분리 및 안티도트 (ELISA) 혈장 농도 결정에 의해 제조했다.

재조합성 안티도트 (r-안티도트) 실험에 대해서는, 마우스는 대조군에 대해서는 0, 15, 25, 및 75 mg/kg 로 베트릭사반을 경구투여했다. 안티도트 (300 ㎍/200 μL) 처리군에 대해서는 15 mg/kg 를 이용했다. 베트릭사반 경구투여 후 1.5 시간 째 (안티도트 주사 후 5 분) 에 시료를 취했다.

도 16 및 17 및 표 13 및 14 에 나타낸 바와 같이, 베트릭사반의 투여 (15mg/kg, PO) 후, 혈장 유도성 안티도트 (pd-안티도트) 또는 재조합성 fXa 돌연변이 (r-안티도트) 의 마우스에 대한 단독 투여 (300 ㎍, IV) 는 생체내에서 저해제를 유효하게 포획했다. 전혈 INR 및 안티도트 혈장 농도 (표 13 내지 14) 의 PK-PD 상관관계는 INR 측정값을 기준으로 기능성 베트릭사반의 50% 초과 감소를 나타내며, 다중 주사 또는 기타 요법을 통해 안티도트에 의한 fXa 저해제의 유효한 중화가 맞다는 것을 보여줬다. 상기 결과들은, 본 발명의 fXa 유도체가 출혈 또는 기타 의학적 응급에 처한 환자에서의 fXa 저해제의 항응고 효과를 역전시키는 범용적인 안티도트로서 작용하는 잠재성을 갖는다는 것을 증명하는 것으로 여겨진다.

도 22 는 베트릭사반의 경구 투여 (15 mg/kg) 후 r-안티도트의 단일 IV 주사 (1 회 주사) 또는 2 회 주사 (2 회 주사) 한 마우스 실험 (군 당 n=5, 312 ㎍/200 ul r-안티도트) 을 보여준다. 단일 주사 군에 대해, 마우스 혈액 시료를 베트릭사반 경구 투여 후 1 시간 째에 취했다. 비히클 (대조군_1) 또는 r-안티도트 (1 회 주사) 를 1 시간이 되기 5 분 전에 투여했다. 이중 주사군에 대해, 베트릭사반의 경구 투여 후 비히클 또는 r-안티도트를 55 분째에 주사하고, 115 분째에 반복했다. 마우스 혈액 시료를 비히클 (대조군_2) 및 r-안티도트 (2 회 주사) 처리 마우스에 대해 2 시간째에 취했다. 안티도트의 단일 또는 이중 투여 후 마우스 혈장 중 안티도트/베트릭사반의 함수로서 측정한 INR 은 도 22B 에 나타냈다.

실시예 9. 안티도트에 의한 리바록사반 및 아픽사반의 시험관내 역전

예상한 바와 같이, 본 발명에 의해 고려되는 안티도트는 또한 기타 활성 부위 지정 fXa 저해제에 결합 및 중화할 수 있다. 표 15 및 16 은 pd-안티도트 및 r-안티도트에 의한, 베트릭사반, 리바록사반 및 아픽사반에 의한 저해의 시험관내 상관성을 보여준다. 정제된 fXa (3.0 nM), 저해제 (7.5 nM), 및 상이한 농도의 안티도트를 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% BSA, pH7.4 인 완충액 내에서 22℃ 로 10 분 동안 인큐베이션했다. fXa 활성은 실시예 4 와 유사하게 검정했다.

표 15 에 나타낸 바와 같이, 204 nM pd-안티도트는 시험한 저해제의 저해 효과의 60% 이상 보정을 제공하며, 표 16 에서 베트릭사반 및 리바록사반에 대해서는 95% 를 초과하는 저해 보정이 r-안티도트 (186 nM) 에 의해 달성되었고, 아픽사반의 70% 초과 역전이 있었다.

실시예 10. r-안티도트에 의한 베트릭사반의 시험관내 역전

표 17 에서, 베트릭사반에 의한 항응고의 역전에 대한 재조합성 안티도트 단백질의 효과를 인간 혈장 혈병형성 검정에서 시험했다. 혈장의 aPTT 연장 및 저해 효과 역전에 대한 300 nM 및 400 nM 베트릭사반의 효과는 MLA Electra 800 자동 응고 타이머로 측정했다. 100 μL 의 모은 시트레이트 항응고화 인간 혈장을 300 nM 또는 400 nM 베트릭사반 및 상이한 농도의 안티도트와 혼합했다. aPTT 시약 (Actin FS, Dade Behring) 및 CaCl₂ 을 제조사의 지시에 따라 첨가했다.

실시예 11. r-안티도트에 의한 저분자량 헤파린 ("LMWH") 의 시험관내 역전

도 18 에서, LMWH 에녹사파린 (Sanofi-Aventis) 의 저해 효과를 역전시키는 r-안티도트의 효과를 인간 혈장에서의 탁도 변화로 시험했다. 에녹사파린 (0 내지 1.25 U/mL) 을 508 nM r-안티도트의 존재 또는 부재 하에 22℃ 에서 20 분 동안 인큐베이션했다. 탁도 변화는 실시예 3 에 기재된 과정에 따라 측정했다. 508 nM r-안티도트는 0.3125 내지 1.25 U/mL 에녹사파린의 저해 효과를 실질적으로 보정했다 (>75%).

도 19 에서, 저분자량 헤파린 (LMWH 에녹사파린, Sanofi-Aventis) 에 의한 항응고의 역전에 대한 r-안티도트의 효과를 인간 혈장 혈병형성 검정에서 시험했다. 혈장의 aPTT 연장 및 저해 효과의 역전에 대한 1 antiXa Unit/mL LMWH 의 효과를 MLA Electra 800 자동 응고 타이머로 측정했다. 100 μL 의 모은 시트레이트 항응고화 인간 혈장을 에녹사파린 및 상이한 농도의 안티도트와 혼합했다. 혈병형성 시간 측정 전에, aPTT 시약 (Actin FS, Dade Behring) 및 CaCl₂ 을 제조사의 지시에 따라 첨가했다. 1.14 μM 재조합성 안티도트의 첨가에 의해 1 Unit/mL 에녹사파린에 의해 제공된 항응고의 52% 보정율이 제공되었다.

실시예 12. r-안티도트에 의한 리바록사반의 시험관내 역전

도 20 에서, 소형 분자 인자 Xa 저해제 (리바록사반, Bay 59-7939) 에 의한 항응고의 역전에 대한 재조합성 안티도트 단백질의 효과를 인간 혈장 혈병형성 검정에서 시험했다. Perzborn 등, J ThromB. Haemost. 3:514-521, 2005 에서 보고한 바와 같이; 프로트롬빈 시간 측정은 리바록사반의 항응고 효과를 평가하기 위한 정확한 방법이다. 모은 인간 혈장의 프로트롬빈 시간 (PT) 연장 및 저해 효과의 역전에 대한 1 μM 리바록사반의 효과는 MLA Electra 800 자동 응고 타이머로 측정했다. 100 μL 의 모은 시트레이트 항응고화 인간 혈장을 리바록사반 및 상이한 농도의 안티도트와 혼합했다. 혈병형성 시간 측정 전에, 토끼 뇌 트롬보플라스틴 C 플러스 시약 (Dade Behring) 을 제조사의 지시사항에 따라 혈장 시료에 첨가했다. 1.9 μM 재조합성 안티도트의 첨가에 의해 1 μM 리바록사반에 의해 제공된 항응고의 100% 보정율이 제공되었다.

실시예 13. r-안티도트에 의한 아픽사반의 시험관내 역전

표 18 에서, 아픽사반에 의한 항응고의 역전에 대한 재조합성 안티도트 단백질의 영향을 인간 혈장 혈병형성 검정에서 시험했다. Pinto 등, J. Med. Chem. 55(22):5339-5356, 2007 에서 보고한 바와 같이; 프로트롬빈 시간 (PT) 측정은 아픽사반의 생체외 항응고 효과 평가의 정확한 방법이다. 모은 인간 혈장의 프로트롬빈 시간 (PT) 및 저해 효과의 역전에 대한 1 μM 및 1.5 μM 아픽사반의 효과는 MLA Electra 800 자동 응고 타이머로 측정했다. 100 μL 의 모은 시트레이트 항응고 인간 혈장을 아픽사반 및 상이한 농도의 안티도트와 혼합했다. 혈병형성 시간 측정 전에, 토끼 뇌 트롬보플라스틴 C 플러스 시약 (Dade Behring) 을 제조사의 지시사항에 따라 혈장 시료에 첨가했다. 1.9 μM 재조합성 안티도트의 첨가에 의해 1.5 μM 아픽사반에 의해 제공된 항응고의 97% 보정율이 제공되었다.

실시예 14. des-Gla 안히드로-fXa 에 의한 아르가트로반의 시험관내 저해

아르가트로반에 의한 트롬빈 활성의 저해 및 그의 저해 효과의 역전을 측정하기 위해, 정제된 인간 트롬빈 (5 nM), 아르가트로반 (50 nM) 및 상이한 농도의 안티도트 des-Gla 안히드로 fXa 를 20 mM Tris, 0.15 M NaCl, 5 mM 염화칼슘, 0.1% 소혈청 알부민, pH 7.4 을 함유하는 완충액에 첨가했다. 실온에서 20 분간 인큐베이션 후, 아미드가수분해 기질 S2288 (200 μM) 을 혼합물에 첨가하고, p-니트로아닐라이드 기질 절단 속도를 405 nm 에서의 흡광도로 모니터링했다. 결과를 도 12 에 제시한다.

본 발명은 상기 구현예와 함께 기재하고, 상기한 상세한 설명 및 실시예는 설명을 의도로 하는 것이고, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 범위 내의 다른 국면, 장점 및 개질은 본 발명이 적용되는 당업계의 당업자에게는 자명할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> PORTOLA PHARMACEUTICALS, INC. <120> ANTIDOTES FOR FACTOR XA INHIBITORS AND METHODS OF USING THE SAME <130> 070545-1560 <140> PCT/US2008/078014 <141> 2008-09-26 <150> 61/090,574 <151> 2008-08-20 <150> 60/976,343 <151> 2007-09-28 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 488 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gln Ala Asn 20 25 30 Asn Ile Leu Ala Arg Val Thr Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met 35 40 45 Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr 50 55 60 Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 65 70 75 80 Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln 85 90 95 Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys 100 105 110 Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu 115 120 125 Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln 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accggttcac 720 aaaggagacc tatgacttcg acatcgccgt gctccggctc aagaccccca tcaccttccg 780 catgaacgtg gcgcctgcct gcctccccga gcgtgactgg gccgagtcca cgctgatgac 840 gcagaagacg gggattgtga gcggcttcgg gcgcacccac gagaagggcc ggcagtccac 900 caggctcaag atgctggagg tgccctacgt ggaccgcaac agctgcaagc tgtccagcag 960 cttcatcatc acccagaaca tgttctgtgc cggctacgac accaagcagg aggatgcctg 1020 ccagggggac gcagggggcc cgcacgtcac ccgcttcaag gacacctact tcgtgacagg 1080 catcgtcagc tggggagagg gctgtgcccg taaggggaag tacgggatct acaccaaggt 1140 caccgccttc ctcaagtgga tcgacaggtc catgaaaacc aggggcttgc ccaaggccaa 1200 gagccatgcc ccggaggtca taacgtcctc tccattaaag tgagatccca ctcggatccc 1260 tattctatag tgtcacctaa atgctagagc tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag 1320 ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac 1380 tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca 1440 ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag 1500 caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg 1560 ctcgagcggc cgccccttct gaggcggaaa gaaccagctg tggaatgtgt gtcagttagg 1620 gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 1680 gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat 1740 gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac 1800 tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga 1860 ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg 1920 cctaggcttt tgcaaaaaag ctagcttccc gctgccatca tggttcgacc attgaactgc 1980 atcgtcgccg tgtcccaaaa tatggggatt ggcaagaacg gagacctacc ctggcctccg 2040 ctcaggaacg agttcaagta cttccaaaga atgaccacaa cctcttcagt ggaaggtaaa 2100 cagaatctgg tgattatggg taggaaaacc tggttctcca ttcctgagaa gaatcgacct 2160 ttaaaggaca gaattaatat agttctcagt agagaactca aagaaccacc acgaggagct 2220 cattttcttg ccaaaagttt ggatgatgcc ttaagactta ttgaacaacc ggaattggca 2280 agtaaagtag acatggtttg gatagtcgga ggcagttctg tttaccagga agccatgaat 2340 caaccaggcc accttagact ctttgtgaca aggatcatgc aggaatttga aagtgacacg 2400 tttttcccag aaattgattt ggggaaatat aaacttctcc cagaataccc aggcgtcctc 2460 tctgaggtcc aggaggaaaa aggcatcaag tataagtttg aagtctacga gaagaaagac 2520 taacaggaag atgctttcaa gttctctgct cccctcctaa agctatgcat ttttataaga 2580 ccatgggact tttgctggct ttagatcccg cggagatcca gacatgataa gatacattga 2640 tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg 2700 tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa 2760 ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta 2820 aaacctctac aaatgtggta tggctgatta tgagctccag cttttgttcc ctttagtgag 2880 ggttaattgc gcgcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 2940 cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 3000 aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 3060 acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 3120 ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 3180 gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 3240 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taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 4140 tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 4200 tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 4260 gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 4320 gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 4380 ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 4440 cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 4500 tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 4560 cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 4620 agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 4680 cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 4740 aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 4800 aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 4860 gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 4920 gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 4980 tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 5040 ttccccgaaa agtgccacct gggaaattgt aaacgttaat attttgttaa aattcgcgtt 5100 aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta 5160 taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc 5220 actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg 5280 cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact 5340 aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt 5400 ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc 5460 ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc 5520 gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 5580 gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 5640 agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc 5700 actatagggc gaattggaat taattcgctg ggctgagacc cgcagaggaa gacgctctag 5760 ggatttgtcc cggactagcg agatggcaag gctgaggacg ggaggctgat tgagaggcga 5820 aggtacaccc taatctcaat acaacccttg gagctaagcc agcaatggta gagggaagat 5880 tctgcacgtc ccttccaggc ggcctccccg tcaccaccca ccccaacccg ccccgaccgg 5940 agctgagagt aattcataca aaaggactcg cccctgcctt ggggaatccc agggaccgtc 6000 gttaaactcc cactaacgta gaacccagag atcgctgcgt tcccgccccc tcacccgccc 6060 gctctcgtca tcactgaggt ggagaagagc atgcgtgagg ctccggtgcc cgtcagtggg 6120 cagagcgcac atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc aattgaaccg 6180 gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc 6240 tttttcccga gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt 6300 ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc cgcgggcctg 6360 gcctctttac gggttatggc ccttgcgtgc cttgaattac ttccacgccc ctggctgcag 6420 tacgtgattc ttgatcccga gcttcgggtt gaaagtgggt gggagagttc gaggccttgc 6480 gcttaaggag ccccttcgcc tcgtgcttga gttgaggcct ggcttgggcg ctggggccgc 6540 cgcgtgcgaa tctggtggca ccttcgcgcc tatctcgctg ctttcgataa gtctctagcc 6600 atttaaaatt tttgatgacc tgctgcgacg ctttttttct ggcaagatag tcttgtaaat 6660 gcgggccaag atctgcacac tggtatttcg gtttttgggg ccgcgggcgg cgacggggcc 6720 cgtgcgtccc agcgcacatg ttcggcgagg cggggcctgc gagcgcggcc accgagaatc 6780 ggacgggggt agtctcaagc tggccggcct gctctggtgc ctggcctcgc gccgccgtgt 6840 atcgccccgc cctgggcggc aaggctggcc cggtcggcac cagttgcgtg agcggaaaga 6900 tggccgcttc ccggccctgc tgcagggagc tcaaaatgga ggacgcggcg ctcgggagag 6960 cgggcgggtg agtcacccac acaaaggaaa agggcctttc cgtcctcagc cgtcgcttca 7020 tgtgactcca cggagtaccg ggcgccgtcc aggcacctcg attagttctc gagcttttgg 7080 agtacgtcgt ctttaggttg gggggagggg ttttatgcga tggagtttcc ccacactgag 7140 tgggtggaga ctgaagttag gccagcttgg cacttgatgt aattctcctt ggaatttgcc 7200 ctttttgagt ttggatcttg gttcattctc aagcctcaga cagtggttca aagttttttt 7260 cttccatttc aggtgtcgtg aaaactaccc ctaaaagcca aat 7303 <210> 19 <211> 405 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <222> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 19 Met Gly Arg 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Claims

본원 발명에서 청구하는 모든 조성물.