KR20170101578A

KR20170101578A - 신규 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 및 이를 이용한 포도당-6-인산 제조방법

Info

Publication number: KR20170101578A
Application number: KR1020160024293A
Authority: KR
Inventors: 양성재; 조현국; 이영미; 김성보; 박승원
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2016-02-29
Filing date: 2016-02-29
Publication date: 2017-09-06
Also published as: EP3425047A1; RU2018134187A; BR112018067704B1; AU2017227349B2; JP6858787B2; US10822629B2; WO2017150814A1; TWI719140B; MX2018010375A; EP3425047A4; CA3015203C; CA3015203A1; JP2019506879A; US20190078125A1; RU2018134187A3; EP3425047B1; CN109312314A; BR112018067704A2; CN109312314B; TW201732039A

Abstract

본 발명은 열 안정성이 우수한 고온 활성 및 내열성의 신규 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 및 이를 이용한 포도당-6-인산 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 효소를 사용한 고온의 효소반응 공정에서는 기질[포도당, Poly(Pi)_n]의 용해도를 증가시킬 수 있어 고농도로 기질 사용이 가능하며, 물질 확산 속도의 증가, 반응속도의 증가, 반응시간의 단축 등으로 인해 단위 생산성을 향상 할 수 있다. 그리고, 고온의 효소반응 공정으로 인해 외부 미생물 등으로 인한 공정오염을 최소화시킬 수 있다. 또한, GRAS(generally recognized as safety) 미생물들에서 본 발명의 효소를 재조합 대량 발현 후 내열성의 특성을 이용하면 사균화 균체로 이용하고자 할 경우 고온에서 열처리하는 방법으로 효과적으로 재조합 미생물들을 사균화 가능할 뿐만 아니라, 재조합 효소를 분리하여 이용하고자 할 경우에도 재조합 미생물 유래의 단백질들을 선택적으로 변성시키고 제거 할 수 있어 효소의 정제공정을 효율화 할 수 있는 장점이 있다.

Description

신규 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 및 이를 이용한 포도당-6-인산 제조방법{New Poly(Pi)n-dependent glucokinase and method for preparing glucose 6-phosphate using thereby}

본 출원은 신규 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 및 이를 이용한 포도당-6-인산 제조방법에 관한 것이다.

생체 대사에 있어 주요 인산화 화합물인 포도당-6-인산(D-glucose 6-phosphate)은 해당경로(glycolysis pathway), 5탄당 인산 경로(pentose phosphate pathway) 및 헥소사민 생합성 경로(hexosamine biosynthetic pathway) 등을 통하여 매우 다양한 대사산물로 전환될 수 있어 산업적으로 중요한 화합물이다. 포도당-6-인산으로부터 일련의 다중 효소반응을 이용하여 특정 고부가 화합물을 생산하고자 하는 생물공정에서는 포도당-6-인산의 경제적 제조방법이 매우 중요하다.

지금까지 포도당-6-인산을 효소적으로 제조하기 위해서는 원료 포도당에 아데노신이인산(adenosine diphosphate, ADP) 또는 아데노신삼인산(adenosine triphosphate, ATP)의 인산기(ADP를 이용하는 경우에는 β-인산기, ATP를 이용하는 경우에는 γ-인산기)를 전이하는 ADP-의존형 포도당인산화효소(ADP-dependent glucokinase, EC 2.7.1.147) 또는 ATP-의존형 포도당인산화효소(ATP-dependent glucokinase, EC 2.7.1.2)를 이용하거나, 원료 포도당에 포스페이트(phosphate) 중합체인 폴리포스페이트[polyphosphate, Poly(Pi)_n]의 인산기를 전이하는 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소[Poly(Pi)_n-dependent glucokinase, EC 2.7.1.63]를 이용하는 방법이 보고되고 있다.

제조공정의 경제성과 안정성 측면에서, ADP 또는 ATP-의존형 포도당인산화효소들을 이용하여 포도당-6-인산을 생산하는 방법은 인산기의 공여 화합물로 고가의 ADP 또는 ATP를 요구하는 단점이 있다. 이의 해결 수단으로 탈인산화 생성된 AMP 또는 ADP에 Poly(Pi)_n의 인산기를 전이할 수 있는 폴리포스페이트-아데노신이인산 인산전이효소(polyphosphate-AMP/ADP phosphotransferase)를 병행 사용하여 ADP 또는 ATP를 재생하는 방법이 보고되어 있으나, 아데닌 뉴클레오타이드(adenine nucleotides AMP, ADP 및 ATP)가 물리화학적(열, pH 등) 안정성이 높지 않은 등의 문제점이 있어 실용화에 한계가 있다고 할 수 있다.

[반응식 1]

반면 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소를 이용하여 포도당-6-인산을 생산하는 방법은 인산기의 공여 화합물로 비교적 저가의 안정한 Poly(Pi)_n를 사용하여 포도당-6-인산을 직접 생산 할 수 있다. 따라서 ADP 또는 ATP-의존형 포도당인산화효소를 이용하여 포도당-6-인산을 생산하는 방법보다 제조공정의 경제적 실용화 측면에서 우수한 제조방법이라 할 수 있다.

[반응식 2]

포도당의 인산화 화합물인 포도당-6-인산은 생체 내에서 특정 대사경로를 통해 매우 다양한 유용 화합물로 전환될 수 있어 산업적으로 이용성이 높은 전구 화합물이라 할 수 있다. 특히, 포도당-6-인산으로부터 일련의 다중 효소반응을 이용하여 특정 고부가 화합물을 생산하고자 하는 생물공정에서는 포도당-6-인산의 경제적 제조방법 개발이 매우 중요하다.

제조방법의 실용화 측면에서, 포도당에 인산기를 공여할 수 있는 화합물로 ADP 또는 ATP는 고가격으로 인하여 포도당-6-인산의 효소적 제조방법으로는 한계가 있고, 또한 미생물 대사를 이용한 발효적 제조방법은 포도당-6-인산이 세포막 비투과성 등의 문제로 그 제조방법으로는 효율적이지 않다.

그러나, 포도당에 인산기를 공여할 수 있는 화합물인 포스페이트의 중합체인 Poly(Pi)_n는 자연계에 다량 존재할 뿐만 아니라 화학적 제조방법으로 저가에 생산할 수 있어 포도당-6-인산을 경제적으로 생산하기 위한 우수한 인산기의 공여 화합물이다. 따라서 이러한 Poly(Pi)_n를 이용하여 포도당-6-인산을 효과적으로 제조할 수 있는 효소적 제조방법 개발은 상업적으로 매우 중요하다. 또한 특정 유용 화합물의 효소적 제조공정에서 효소의 열 안정성 등은 공정의 효율화 측면에서 매우 중요한 특성이다. 그러나 지금까지 본 출원과 관련된 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 일부 미생물 종에서 제한적으로 보고되고 있고, 대부분의 분리된 효소들은 중온성 미생물 유래의 효소들로 열 안정성 등이 낮은 것으로 보고되고 있다 (표 1). 이의 해결을 위해 본 출원은 호열성 미생물로부터 고온 활성 및 내열성이 우수한 신규 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 및 이를 이용한 포도당-6-인산을 생산하는 방법을 제공하고자 한다.

본 출원은 호열성 미생물로부터 고온 활성 및 내열성이 우수한 신규 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 및 이를 이용한 포도당-6-인산을 생산하는 방법을 제공하고자 한다.

이하, 본 출원을 상세히 설명한다.

구체적으로 본 출원의 일 양태는, 언에어로리네(Anaerolinea)속 유래의 고온 활성 및 내열성의 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소를 제공 할 수 있다.

구체적으로, 상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 서열번호 2의 아미노산 서열로 기재된 것일 수 있으며, 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 상기 효소와 동일하거나 상응하는 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소를 이루는 단백질이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 또한 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화 기능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 단백질 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

본 출원에서 용어, "상동성"은 공통 진화 기원을 공유하거나 하지 않을 수 있는 주어진 폴리펩타이드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간의 동일성이나 상응성 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0를 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 결정될 수 있다 (예. Sambrook et al. 1989. infra 참고). 하나의 구체 예에서, 두 개의 아미노산 서열이 아미노산 서열의 소정의 길이에 대해 폴리펩타이드 매치가 적어도 21%(구체적으로 적어도 약 50%, 특히 약 75%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 99%)일 때, "실질적으로 상동" 또는 "실질적으로 유사" 하다.

나아가, 본 출원의 또 다른 양태는, 언에어로리네(Anaerolinea)속 유래의 내열성의 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다. 구체적으로, 본 출원은 서열번호 1의 염기 서열로 기재되어 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체가 공유결합에 의하여 길게 사슬 모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체로, 일반적으로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다.

상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 서열번호 2의 아미노산을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 효소를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 예를 들면 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 가장 구체적으로는 98% 이상의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열로서 실질적으로 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 포도당 2%, 폴리포스페이트 1.5%, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 10-50 U/ml 및 10 mM MgSO₄의 조건에서 전환 수율이 60% 이상일 수 있고, 보다 바람직하게는 70% 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 80% 이상일 수 있다.

상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 포도당 15%, 폴리포스페이트 10%, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 10-50 U/ml 및 10 mM MgSO₄의 조건에서 전환 수율이 50% 이상일 수 있고, 보다 바람직하게는 60% 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 65% 이상일 수 있다.

상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 45 ℃ 내지 90 ℃에서 활성을 보일 수 있고, 보다 바람직하게는 55 ℃ 내지 80 ℃에서 활성을 보일 수 있고, 가장 바람직하게는 65 ℃ 내지 70 ℃ 에서 활성을 보일 수 있다.

상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 pH 4 내지 pH 10에서 활성을 보일 수 있고, 가장 바람직하게는 pH 4 내지 pH 5에서 활성을 보일 수 있다.

상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 마그네슘 이온의 존재 하에서 활성이 증대 될 수 있다.

상기 마그네슘의 농도는 바람직하게는 0.5 mM 내지 20 mM일 수 있고, 보다 바람직하게는 0.2 mM 내지 10 mM일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1 mM일 수 있다.

본 출원의 또 다른 일 양태는, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소, 포도당 및 폴리포스페이트을 혼합하여 포도당-6-인산을 제조하는 방법을 제공할 수 있다.

상기 포도당은 전분 또는 셀룰로스를 액화 또는 당화 시킨 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 폴리포스페이트는 인산기의 공여 화합물로, 예를 들어, 헥사메타인산나트륨(sodium hexametaphosphate), 트리폴리인산나트륨(sodium tripolyphosphate), 헥사메타인산칼륨(potassium hexametaphosphate) 등일 수 있으며, 이에 제한되지 않고 시판되는 것도 사용할 수 있음은 물론이다.

상기 포도당-6-인산의 제조는 45 ℃ 내지 90 ℃에서 수행 될 수 있고, 보다 바람직하게는 55 ℃ 내지 80 ℃에서 수행 될 수 있고, 가장 바람직하게는 65 ℃ 내지 70 ℃에서 수행 될 수 있다.

상기 포도당-6-인산을 제조에 MgSO₄을 추가로 포함할 수 있다.

상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소의 함량은 10 U/ml 내지 50 U/ml인 일수 있다.

상기 포도당은 전체 조성물 100 중량%를 기준으로 0.1 중량% 내지 40 중량%일 수 있고, 보다 바람직하게는 1 중량% 내지 20 중량%일 수 있고, 가장 바람직하게는 1 중량% 내지 10 중량%일수 있다.

상기 폴리포스페이트는 전체 조성물 100 중량%를 기준으로 0.5 중량% 내지 25 중량%일 수 있고, 보다 바람직하게는 1 중량% 내지 20 중량%일 수 있고, 가장 바람직하게는 1 중량% 내지 10 중량%일수 있다.

본 출원의 또 다른 일 양태는, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소, 당화 효소, 전분 및 폴리포스페이트을 혼합하여 포도당-6-인산을 제조하는 방법을 제공 할 수 있다.

상기 당화 효소는 알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 알파-글코시다아제 중 하나 이상일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 출원은 상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소를 생산하는 미생물, 구체적으로 에스케리키아 속(Escherichia sp .) 미생물을 제공 할 수 있다.

본 발명에서 용어, "폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소를 생산하는 미생물"은 본 효소를 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서, 구체적으로는 유전적 조작에 의하거나 자연적 돌연변이에 의해 본 효소를 배지 또는 미생물 체내에 축적할 수 있는 미생물을 의미한다.

구체적으로 상기 미생물은 서열번호 2의 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 미생물이면 특별히 그 종류가 제한되지 않으며, 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하나, 구체적으로 원핵세포일 수 있다. 예로 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물일 수 있으며, 예로 에스케리키아 콜라이(Eschrichia coli)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "발현"은 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 작동 가능하게 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되거나, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체 내에 삽입되어 달성될 수 있으나, 이로 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결" 된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주 세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비 바이러스 매개물을 포함하며, 또한 미니구형 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 벡터는 박테리아 DNA 서열을 갖지 않는 플라스미드일 수 있다. CpG 영역에서 풍부한 박테리아 DNA 서열의 제거는 전이유전자 발현 사일런싱을 감소시키고 플라스미드 DNA 벡터로부터 보다 지속적인 발현을 가져오기 위해 행해지고 있다(예를 들면, Ehrhardt et al. 2003. HumGene Ther 10:215-25; Yet et al. 2002. MoI Ther 5:731-738; Chen et al. 2004. Gene Ther 11:856-864). 또한, 상기 벡터는 트랜스포존(Annu Rev Genet. 2003. 37:3-29), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 구체적으로는 pACYC177, pACYC184, pCL1920, pECCG117, pUC19, pBR322 및 pMW118 벡터나 이들에서 프로모터 등을 변이시킨 변이벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

특히, 본 발명에서 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물일 수 있다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질 전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, 들어, 파지 벡터 또는 λE15, λE1515, M13, 들어, 파지 벡터들어, 파지 벡터 또는/및 Charon21A 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공 할 수 있다.

서열목록 1번의 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 것을 특징으로하는, 대장균 BL21 (DE3)/CJ_at_ppgk ( Escherichia coli BL21 (DE3)/CJ_at_ppgk) (기탁 기관: 한국 미생물 보존센터, 기탁일: 2016.02.16, 기탁번호: KCCM11814P)을 제공 할 수 있다.

폴리포스페이트 및 포도당 또는 전분으로부터 본 발명의 효소 및 추가 기능의 효소들(α-amylase, glucoamylase, α-glucosidase, isomerase, aldolase, synthase, kinase, phosphatase 등)을 사용한 동시효소반응(one-pot enzymatic conversions)을 이용하여 하기의 다양한 화합물들을 경제적으로 제조 할 수 있는 방법을 제공 할 수 있다.

산업적으로 유용한 다양한 화합물들은 포도당-1-인산(D-glucose 1-phosphate), 과당-6-인산(D-fructose 6-phosphate), 과당-1,6-이인산(D-fructose 1,6-bisphosphate), 미오-이노시톨-3-인산(myo-inositol 3-phosphate), 미오-이노시톨(myo-inositol), 글루쿠론산(D-glucuronate), 글루코사민-6-인산(D-glucosamine 6-phosphate), 글루코사민(D-glucosamine), N-아세틸글루코사민-6-인산(N-acetyl-D-glucosamine 6-phosphate), N-아세틸글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine), N-아세틸만노사민-6-인산(N-acetyl-D-manosamine 6-phosphate), N-아세틸만노사민(N-acetyl-D-manosamine), N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid, sialic acid), 만노스-6-인산(D-mannose 6-phosphate), 만노스(D-mannose), 타가토스-6-인산(D-tagatose 6-phosphate), 타가토스(D-tagatose), 알루로스-6-인산(D-allulose 6-phosphate), 알루로스(D-allulose), 글리세르알데히디 3-인산(D-glyceraldehyde 3-phosphate), 디히드록시아세톤인산(dihydroxyacetone phosphate) 등이며, 이에 제한되지 않고 포도당-6-인산을 이용한 다양한 화합물들을 포함할 수 있음은 물론이다.

본 발명에 따른 효소는 고온에서 효소반응이 가능하기 때문에, 고온의 반응 공정에서 기질[포도당, Poly(Pi)_n]의 용해도를 증가시킬 수 있어 고농도로 기질 사용이 가능하며, 물질 확산 속도의 증가, 반응속도의 증가, 반응시간의 단축 등으로 인해 단위 생산성을 향상 할 수 있다. 그리고, 고온의 효소반응 공정으로 인해 외부 미생물 등으로 인한 공정오염을 최소화시킬 수 있다. 또한, GRAS(generally recognized as safety) 미생물들에서 본 발명의 효소를 재조합 대량 발현 후 내열성의 특성을 이용하면 사균화 균체로 이용하고자 할 경우 고온에서 열처리하는 방법으로 효과적으로 재조합 미생물들을 사균화 가능할 뿐만 아니라, 재조합 효소를 분리하여 이용하고자 할 경우에도 재조합 미생물 유래의 단백질들을 선택적으로 변성시키고 제거 할 수 있어 효소의 정제공정을 효율화 할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 제조 방법을 플로우 차트(flow-chart)을 이용하여 나타낸 것이다.
도 2는 포도당과 ATP를 반응시킨 반응 식이다.
도 3은 포도당과 폴리포스페이트를 반응시킨 반응 식이다.
도 4는 세포파쇄 상등액(CFE), 단백질 크기측정 마커(M) 및 정제된 재조합 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화 효소(PE)의 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 분석결과이다.
도 5는 재조합 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화 효소의 pH에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 재조합 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화 효소의 온도에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 재조합 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화 효소의 금속이온의 종류에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 재조합 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화 효소의 열처리 온도에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 재조합 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화 효소의 DNA 서열 목록이다.
도 10은 재조합 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화 효소의 아미노산 서열 목록이다.
도 11은 재조합 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화 효소의 정방향 프라이머의 서열 목록이다.
도 12는 재조합 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화 효소의 역방향 프라이머의 서열 목록이다.

현재 비교적 저가의 탄소원이며 대량 생산 가능한 전분 또는 셀룰로스 유래 포도당은 화학, 의약, 화장품 및 식품 산업에서 유용한 다양한 화합물을 생산하기 위해 화학적 또는 생물학적 전환공정의 기초 원료로 사용되고 있다.

그러나, 특히 생물공정 중 효소적 전환공정에서 기초 원료로서의 인산화 포도당은 현재 고가여서 매우 제한적으로 활용되고 있다.

산업적 측면에서, 포도당 대사에 있어 매우 중요한 대사 산물인 포도당-6-인산은 자연계(생물체)에 존재하는 다양한 대사효소들을 이용 시 매우 유용한 반응을 유도 할 수 있는 기초원료로 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 산업적으로 다양한 유용 화합물들을 생산할 수 있는 원료로서의 포도당-6-인산을 포도당 및 폴리포스페이트로부터 경제적으로 생산 할 수 있는 효소 및 효소적 제조방법을 제공 하고자 한다.

또한, 본 발명의 제조된 포도당-6-인산 및 제조방법 활용 시 효소적으로 제조 가능한 의약, 화장품 및 식품 산업에서 고부가 기능성 화합물을 제공 하고자 한다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 폴리포스페이트 -의존형 포도당인산화효소의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물의 제조

본 발명의 고온 활성 및 내열성의 특성을 보유하는 신규 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 효소를 제공하기 위해 호열성 미생물인 언에어로리네 써모필라(Anaerolinea thermophila)에서 유래한 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소의 유전자를 분리하였고, 재조합 발현벡터 및 형질전환 미생물을 제조하였다.

구체적으로, Genbank에 등록된 유전자 서열들을 대상으로 본 발명의 효소와 관련된 유전자 서열들을 선발하였고, 이들 중 호열성 미생물 유래의 유전자 서열만을 선정하였다. 유전자 염기서열[서열번호 1]과 아미노산 서열[서열번호 2]로 등록된 언에어로리네 써모필라의 유전자의 염기서열을 기초로 정방향 프라이머(forward primer, 서열번호 3) 및 역방향 프라이머(reverse primer, 서열번호 4)를 고안하였다. 합성된 프라이머를 이용하여 언에어로리네 써모필라 염색체 DNA(genomic DNA)로부터 해당 유전자를 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 증폭하였고, 증폭된 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 유전자는 제한효소 NdeⅠ 및 XhoⅠ을 사용하여 대장균 발현용 플라스미드 벡터 pET21a(Novagen사)에 삽입하여 CJ_at_ppgk라 명명된 재조합 발현벡터를 제작하였다. CJ_at_ppgk 는 통상적인 형질전환 방법[참조: Sambrook et al. 1989]으로 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질 전환하여 E. coli BL21(DE3)/CJ_at_ppgk라 명명된 형질전환 미생물을 제조하였다.

실시예 2: 재조합 폴리포스페이트 -의존형 포도당인산화효소의 제조

재조합 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소를 제조하기 위해, E. coli BL21(DE3)/CJ_at_ppgk를 LB 액체배지 5 ml를 포함하는 배양 튜브에 접종하고, 600 nm에서 흡광도가 2.0이 될 때까지 37 ℃의 진탕 배양기에서 종균 배양을 하였다. 본 종균 배양된 배양액을 LB 액체배지를 포함하는 배양 플라스크에 접종하여 본 배양을 진행하였다. 600 nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때 1 mM IPTG를 첨가하여 재조합 효소의 발현생산을 유도하였다. 상기 배양 과정 중의 교반 속도는 200 rpm이며 배양 온도는 37 ℃가 유지되도록 하였다. 배양액은 8,000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체는 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액으로 2회 세척하였고, 동일 완충용액으로 현탁 후 초음파 세포파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물은 13,000×g로 4 ℃에서 20분 동안 원심분리 후 상등액만을 취하였다. 재조합 효소는 상기 상등액으로부터 His-tag 친화 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다. 정제된 재조합 효소액은 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액으로 투석 후 효소의 특성 분석을 의해 사용되었다.

도 4의 M은 단백질 크기측정 마커(size marker), CFE는 세포파쇄 상등액, PE는 정제된 효소이다. 정제된 재조합 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 SDS-PAGE 분석을 통하여 약 28 kDa 인 것을 확인하였다 (도 4).

실시예 3: 재조합 폴리포스페이트 -의존형 포도당인산화효소의 활성 분석

활성 분석을 위한 반응 조성물은 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 현탁된 4%(w/v) 포도당, 3%(w/v) 헥사메타인산나트륨(sodium hexametaphosphate) 및 1 mM MgCl₂를 사용하였다. 상기 반응 조성물에 0.1 mg/ml 정제효소를 첨가하여 60 ℃에서 15분 동안 반응 후 HPLC를 이용하여 반응물을 분석하였다. HPLC 분석 조건은 Aminex HPX-87C(Bio-rad사) 컬럼을 사용하여 80 ℃에서 이동상으로 5 mM H2SO4 용액을 0.6 ml/min 유속으로 흘려 주면서 수행하였으며 Refractive Index Detector로 포도당-6-인산을 검출 분석하였다.

분석 결과, 재조합 정제 효소의 반응물에서 포도당-6-인산이 생성됨을 확인할 수 있었다.

실시예 4: pH에 따른 재조합 폴리포스페이트 -의존형 포도당인산화효소의 활성 분석

본 발명의 효소에 대한 pH 영향성을 조사하기 위한 반응 조성물은 다양한 pH의 50 mM 완충용액(pH 4-7, sodium citrate; pH 4-7, sodium acetate; pH 7-10, Tris-HCl)에 현탁된 4%(w/v) 포도당, 3%(w/v) 헥사메타인산나트륨(sodium hexametaphosphate) 및 1 mM MgCl₂를 사용하였다. 상기 각 반응 조성물에 0.1 mg/ml 정제효소를 첨가하여 60 ℃에서 15분 동안 반응 후 HPLC를 이용하여 포도당-6-인산을 정량 분석하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 본 발명의 언에어로리네 써모필라 유래의 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 기존에 보고된 효소들과는 달리 pH 4-5 인근의 산성에서 최대 활성을 보였고, 상기 pH에 해당하는 완충용액 중에서 sodium acetate 완충용액에서 가장 높은 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 또한, pH 4-10에 걸친 매우 광범위한 범위에서 최대 활성 대비 70% 이상의 활성을 나타내었다 (도 5).

이러한 본 발명의 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소가 보유하는 호산성 및 고온 활성의 신규 특성은 전분 덱스트린(dextrin) 당화효소인 Aspergillus 속 유래 글루코아밀레이즈[Aspergillus niger 유래 상용화 당화효소 AMG 300L(novozymes사) 최적활성 pH 4.5, 온도 60 ℃] 등과 함께 사용할 경우 전분 덱스트린으로부터 포도당-6-인산을 효율적으로 생산할 수 있다. 그리고, pH 4 내지 10에 걸친 광범위한 범위에서 최대 활성 대비 70% 이상의 활성 활성을 갖는 본 발명의 효소 특성 또한 산업적 활용성이 매우 크다 할 수 있다.

실시예 5: 온도에 따른 재조합 폴리포스페이트 -의존형 포도당인산화효소의 활성 분석

온도에 따른 재조합 효소의 활성 분석을 위한 반응 조성물은 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 현탁된 4%(w/v) 포도당, 3%(w/v) 헥사메타인산나트륨(sodium hexametaphosphate) 및 1 mM MgCl₂를 사용하였다. 상기 반응 조성물에 0.1 mg/ml 정제효소를 첨가하여 40 내지 80 ℃에서 15분 동안 반응 후 HPLC를 이용하여 포도당-6-인산을 정량 분석하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 본 발명의 효소는 65-70 ℃ 인근에서 최대 활성을 나타내었다. 또한, 60-80 ℃에 걸친 광범위한 온도 범위에서 최대 활성 대비 95% 이상의 활성을 보였다 (도 6).

지금까지 보고된 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소들 가운데 써모비피다 푸스카(Thermobifida fusca) 유래의 효소는 고온 활성 및 내열성 효소로 알려져 있으며 최적 활성온도는 55 ℃임을 보고하고 있다 [Liao et al. 2012. Appl Microbiol Biotechnol 93:1109-1117 참고].

따라서, 본 발명의 언에어로리네 써모필라 유래 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 65-70 ℃ 최적 활성온도를 보임으로서 지금까지 보고된 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소들 가운데 고온 활성이 가장 우수한 효소임을 보여준다.

실시예 6: 금속이온에 따른 재조합 폴리포스페이트 -의존형 포도당인산화효소의 활성 분석

지금까지 보고된 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소들은 활성을 위해서 Mg² ⁺, Mn² ⁺, Co² ⁺ 및 Zn² ⁺ 등의 금속이온을 요구하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소에 대해서 금속 이온 종류별 활성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 10 mM EDTA를 처리 후 투석된 효소 시료가 사용되었다. 반응 조성물은 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 현탁된 2%(w/v) 포도당, 1.5%(w/v) 헥사메타인산나트륨 및 1 mM 금속이온(NiSO₄, CuSO₄, MnSO₄, CaCl₂, ZnSO₄, MgSO₄, MgCl₂, FeSO₄, NaCl, LiCl, KCl)를 사용하였다. 각 반응 조성물에 금속이온을 제거한 상기 효소시료 0.1 mg/ml 첨가하여 60 ℃에서 15분 동안 반응 후 HPLC를 이용하여 포도당-6-인산을 정량 분석하였다. 금속이온을 처리하지 않은 효소의 활성 대비 각 금속 이온을 처리한 경우의 효소 활성을 비교 분석하였다.

그 결과, 언에어로리네 써모필라 유래의 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 도 7에 나타난 바와 같이 활성을 위해 Mg, Mn, Zn, Fe 및 Ni 등에 대해서 금속이온 요구성을 보였다. 금속 이온들 중 기존에 보고된 효소들과 유사하게 마그네슘이 가장 효과적이었으며, 특히, MgSO₄를 첨가한 경우 최대 활성을 보이는 것으로 나타났다 (도 7).

실시예 6: 재조합 폴리포스페이트 -의존형 포도당인산화효소의 온도 안정성 분석

본 발명의 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소의 온도 안정성을 분석하기 위해서 재조합 정제 효소(0.2 mg/ml)를 온도 55 ℃에서 65 ℃까지의 범위에서 다양한 시간 동안 열처리 후 효소의 잔존 활성을 비교 분석 하였다.

반응 조성물은 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 현탁된 4%(w/v) 포도당, 3%(w/v) 헥사메타인산나트륨(sodium hexametaphosphate) 및 1 mM MgCl₂를 사용하였다. 잔존 활성을 측정하기 위해서 상기 반응 조성물에 온도별 열처리한 효소시료를 0.1 mg/ml 첨가하여 60 ℃에서 15분 동안 반응 후 HPLC를 이용하여 포도당-6-인산을 정량 분석하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 온도 55 ℃에서는 6시간 동안 효소 활성의 감소가 나타나지 않았으며, 60 ℃ 온도에서는 4시간 경과 후 효소 활성이 약 49%가 감소되었다. 또한, 65 ℃ 온도에서는 0.5시간 경과 후에도 효소 활성이 약 62%가 유지되는 것을 확인할 수 있었다 (도 8).

지금까지 보고된 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소들 가운데 써모비피다 푸스카(Thermobifida fusca) 유래의 효소는 내열성이 가장 우수한 효소로 알려져 있으며 50 ℃에서 0.25시간 열처리 후에 50%의 활성이 소실됨을 보고하고 있다. 내열성을 향상시키기 위한 고정화된 형태의 효소(immobilized-enzyme)는 2시간 후에 50%의 활성이 소실되었다고 보고하고 있다 [Liao et al. 2012. Appl Microbiol Biotechnol 93:1109-1117 참고].

따라서, 본 발명의 언에어로리네 써모필라 유래 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 60 ℃에서 4시간 열처리 후에도 약 51%의 활성을 유지함을 보임으로서 지금까지 보고된 효소들 가운데 가장 열 안정성이 우수한 효소임 보여준다.

실시예 7. 기질 농도별 전환수율 분석

포도당 및 헥사메타인산나트륨 농도별 포도당-6-인산의 전환수율을 분석하였다. 반응 조성물은 50 mM Tris-HCl(pH 7.0) 완충용액에 현탁된 2-15%(w/v) 포도당, 1.5-11.5%(w/v) 헥사메타인산나트륨 및 10 mM MgSO₄를 사용하였다. 각 반응 조성물에 10 내지 50 U/ml의 정제효소를 첨가하여 55 ℃에서 12시간 동안 반응 후 HPLC를 이용하여 포도당-6-인산을 정량 분석하였다.

그 결과, 2%(w/v) 포도당 및 1.5%(w/v) 헥사메타인산나트륨을 이용 시 12 시간 반응 후 81% 전환수율을 나타냈으며, 5%(w/v) 포도당 및 3.5%(w/v) 헥사메타인산나트륨을 이용 시 12 시간 반응 후 78% 전환수율을 나타내으며, 10% 포도당 및 7%(w/v) 헥사메타인산나트륨을 이용 시 12 시간 반응 후 77% 전환수율을 나타내으며, 15%(w/v) 포도당 및 10%(w/v) 헥사메타인산나트륨을 이용 시 12 시간 반응 후 65% 전환수율을 나타내었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11814P

20160216

<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION <120> New Poly(Pi)n-dependent glucokinase and method for preparing glucose 6-phosphate using thereby <130> P16-0035 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 762 <212> DNA <213> Anaerolinea thermophila <400> 1 atggggaggc agggcatgga aattttaggg attgatatcg gaggatccgg catcaaaggg 60 gctccggtgg atgtagaaac cggccagtta accgccgagc gataccgctt acccaccccc 120 gaaaatgcct tacctgaaga agtggctctg gtagttgccc aaattgtcga acactttcag 180 tggaaaggtc gtgtaggggc aggatttcct gctgccatca agcacggcgt ggcacagacg 240 gccgcaaaca tccaccctac atggattgga cttcatgctg gcaacctttt cagcgaaaaa 300 tgcggatgtc ctgtctcagt gttgaatgat gcggatgctg ccggactggc ggaaatgatc 360 tttggggcag gaaaaggcca gaaaggggtg gtgctgatga ttaccattgg cactggcatc 420 gggacagccc tgttcaccga tgggatattg gtccctaata ccgagttggg acatattgaa 480 attcggggca aagatgccga acagcgctct tcggaagccg cccgccagcg gaaggattgg 540 acctggcaac aatgggcaaa gcgtctgaat gagcatttgg agcgcctgga agccctgttc 600 tggcccgatt tattcatcct tggtggaggg gcagtaaaaa atcatgaaaa gttcttccct 660 tatctaaaac tgcgtactcc ctttgttgca gcaaaattgg ggaatctggc tgggattgta 720 ggcgcagcgt ggtatgctca cacccaggaa acgcaagcct ga 762 <210> 2 <211> 253 <212> PRT <213> Anaerolinea thermophila <400> 2 Met Gly Arg Gln Gly Met Glu Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Val Glu Thr Gly Gln Leu Thr Ala 20 25 30 Glu Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Pro Glu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Val 35 40 45 Ala Leu Val Val Ala Gln Ile Val Glu His Phe Gln Trp Lys Gly Arg 50 55 60 Val Gly Ala Gly Phe Pro Ala Ala Ile Lys His Gly Val Ala Gln Thr 65 70 75 80 Ala Ala Asn Ile His Pro Thr Trp Ile Gly Leu His Ala Gly Asn Leu 85 90 95 Phe Ser Glu Lys Cys Gly Cys Pro Val Ser Val Leu Asn Asp Ala Asp 100 105 110 Ala Ala Gly Leu Ala Glu Met Ile Phe Gly Ala Gly Lys Gly Gln Lys 115 120 125 Gly Val Val Leu Met Ile Thr Ile Gly Thr Gly Ile Gly Thr Ala Leu 130 135 140 Phe Thr Asp Gly Ile Leu Val Pro Asn Thr Glu Leu Gly His Ile Glu 145 150 155 160 Ile Arg Gly Lys Asp Ala Glu Gln Arg Ser Ser Glu Ala Ala Arg Gln 165 170 175 Arg Lys Asp Trp Thr Trp Gln Gln Trp Ala Lys Arg Leu Asn Glu His 180 185 190 Leu Glu Arg Leu Glu Ala Leu Phe Trp Pro Asp Leu Phe Ile Leu Gly 195 200 205 Gly Gly Ala Val Lys Asn His Glu Lys Phe Phe Pro Tyr Leu Lys Leu 210 215 220 Arg Thr Pro Phe Val Ala Ala Lys Leu Gly Asn Leu Ala Gly Ile Val 225 230 235 240 Gly Ala Ala Trp Tyr Ala His Thr Gln Glu Thr Gln Ala 245 250 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 caccatatgg ggaggcaggg catggaaatt ttag 34 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 caaactcgag ggcttgcgtt tcctgggtg 29

Claims

언에어로리네(Anaerolinea)속 유래의 내열성의 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소.
제 1항에 있어서, 상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 서열번호 1번의 DNA 서열로부터 발현되는, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소.
제 1항에 있어서, 상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 서열번호 2번의 아미노산 서열을 갖는, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소.
제 1항에 있어서, 상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 포도당 2%, 폴리포스페이트 1.5%, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 10 내지 50 U/ml 및 10 mM MgSO₄의 조건에서 전환 수율이 80% 이상인, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소.
제 1항에 있어서, 상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 포도당 15%, 폴리포스페이트 10%, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소 10 내지 50 U/ml 및 10 mM MgSO₄의 조건에서 전환 수율이 60% 이상인, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소.
제 1항에 있어서, 상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 45 ℃ 내지 90 ℃에서 활성을 가지는, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소.
제 1항에 있어서, 상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 pH 4 내지 pH 10 활성을 가지는, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소.
제 1항에 있어서, 상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소는 마그네슘 이온의 존재 하에서 활성이 증대되는, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소.
제 8항에 있어서, 상기 마그네슘의 농도는 0.2 mM 내지 20 mM인, 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소, 포도당 및 폴리포스페이트을 혼합하여 포도당-6-인산을 제조하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 포도당은 전분 또는 셀룰로스를 액화 또는 당화 시킨 것을 특징으로 하는, 포도당-6-인산을 제조하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 폴리포스페이트는 헥사메타인나트륨을 특징으로 하는, 포도당-6-인산을 제조하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 포도당-6-인산의 제조는 45 ℃ 내지 90 ℃에서 수행되는, 포도당-6-인산을 제조하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 포도당-6-인산의 제조에 MgSO₄을 추가로 포함하는, 포도당-6-인산을 제조하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소의 함량은 10 U/ml 내지 50 U/ml인, 포도당-6-인산을 제조하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 포도당은 0.1% 내지 40% 인, 포도당-6-인산을 제조하는 방법.
제 10항에 있어서, 상기 폴리포스페이트는 0.5% 내지 25% 인, 포도당-6-인산을 제조하는 방법.
제 1항에 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소, 당화 효소, 전분 및 폴리포스페이트을 혼합하여 포도당-6-인산을 제조하는 방법.
제 18항에 있어서, 상기 당화 효소는 알파-아밀라아제, 글루코아밀라아제 및 알파-글코시다아제 중 하나 이상인, 포도당-6-인산 제조방법.
제 3항에 따른 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소를 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
서열목록 1번의 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질 전환된 것을 특징으로 하는, 대장균 BL21 (DE3)/CJ_at_ppgk ( Escherichia coli BL21 (DE3)/CJ_at_ppgk, KCCM11814P).
제 1항에 내지 제 9항에 중 어느 한 항에 따른 폴리포스페이트-의존형 포도당인산화효소, 포도당 또는 전분, 폴리포스페이트 및 추가 효소와 반응하여 포도당-1-인산(D-glucose 1-phosphate), 과당-6-인산(D-fructose 6-phosphate), 과당-1,6-이인산(D-fructose 1,6-bisphosphate), 미오-이노시톨-3-인산(D-myo-inositol 3-phosphate), 미오-이노시톨(D-myo-inositol), 글루쿠론산(D-glucuronate), 글루코사민-6-인산(D-glucosamine 6-phosphate), 글루코사민(D-glucosamine), N-아세틸글루코사민-6-인산(N-acetyl-D-glucosamine 6-phosphate), N-아세틸글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine), N-아세틸만노사민-6-인산(N-acetyl-D-manosamine 6-phosphate), N-아세틸만노사민(N-acetyl-D-manosamine), N-아세틸뉴라민산(N-acetylneuraminic acid, sialic acid), 만노스-6-인산(D-mannose 6-phosphate), 만노스(D-mannose), 타가토스-6-인산(D-tagatose 6-phosphate), 타가토스(D-tagatose), 알루로스-6-인산(D-allulose 6-phosphate), 알루로스(D-allulose), 글리세르알데히디 3-인산(D-glyceraldehyde 3-phosphate), 디히드록시아세톤인산(dihydroxyacetone phosphate) 중 어느 하나를 생산하는 방법.