KR20170107238A

KR20170107238A - 정향의 에탄올 추출물을 함유하는 요시니아 엔테로콜리티카의 바이오필름 형성 방지용 조성물

Info

Publication number: KR20170107238A
Application number: KR1020160030922A
Authority: KR
Inventors: 김태종; 함영석
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2016-03-15
Filing date: 2016-03-15
Publication date: 2017-09-25

Abstract

본 발명은 소화기관 질병의 원인균인 정향의 55~65% 에탄올 추출물을 함유하는 Yersinia enterocolitica 와 Streptococcus mutans의 바이오필름 형성을 방지하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물을 이용하면, Yersinia enterocolitica 유래 소화기 질환 및 Streptococcus mutans에 의한 치아우식을 효과적으로 예방할 수 있다.

Description

정향의 에탄올 추출물을 함유하는 요시니아 엔테로콜리티카의 바이오필름 형성 방지용 조성물{Composition for Preventing Biofilm Formation of Yersinia enterocolitica Containing Ethanol Extract of Clove}

본 발명은 바이오필름 형성 방지용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 소화기관 질병의 원인균인 정향의 55~65% 에탄올 추출물을 함유하는 장출혈과 같은 소화기 질환을 유발하는 Yersinia enterocolitica의 바이오필름 형성을 방지하는 조성물에 관한 것이다.

바이오필름은 미생물에 의하여 형성된 막 모양 구조체이며, 표면에 연결된 미생물 세포층으로 이루어진 잘 구성된 미생물계로 복잡한 구조적 기능적 특징을 가지고 있다. 생체막은 미생물의 대사 과정에 영향을 주는 물리 화학적 구배를 갖는다. 바이오필름을 형성하는 세포는 부유세포보다 항생제에 대한 저항성이 1000배 이상 높으며, 바이오필름 형성은 여러 질병의 발병(pathogenesis)에 중요한 역할을 한다(Rasmussen and Givskov 2006).

한편, 장 출혈성 병원성 대장균은 식품의 오염이나 출혈성 대장염 즉, 용혈성 요독증후군을 이끌 수 있는 혈변으로 인해 장관 내에 침투하는 인체 병원균이다. 최근 들어, 이들 병원균이 일반 부유상태가 아닌 표면에 부착하여 생존할 수 있다는 것이 알려지게 되었다. 따라서 잠재적인 병원균에 의해 생성되는 바이오필름 (biofilm)은 고질적이고 재발되는 감염의 중요한 원인으로 생각되며, 특히 의료 장비의 표면이나 인체 내부의 유치 장치에서도 바이오필름을 형성하고 견디는 능력 때문이라고 생각된다. 최근에 바이오필름에 관련된 조사가 늘어나고 있는 가운데, 대부분은 근본적인 바이오필름의 예방, 조절, 근절 등을 목적으로 하고 있다. 그동안 아주 소수의 연구만이 병원성 대장균 계통을 포함하여 E. coli 등에 의해 형성되는 바이오필름을 억제하는, 천연 물질을 밝히고 특성을 기술하였다. 해조류 Delisea pulchra 로부터 생성된 (5Z)-4-bromo-5-(bromomethylene)-3-butyl-2(5H)-furanone과, 가봉의 흑단나무인 Diospyros dendo로부터 생성되는 우르솔릭산(ursolic acid, 3??beta-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid), 비병원성 대장균군에 의해 생성되는 그룹 캡슐모양의 다당류 등의 화합물이, 바이오필름의 형성을 유의적으로 억제하였다. 그러나 이 화합물들의 독성과, 물에 잘 녹지 않는 특성 때문에 식품 및 약학산업에의 이용에 한계가 있다.

또한, 치아우식균으로 알려져 있는 Streptococcus mutans는 Gram-positive균으로, 입 속에서 음식을 예비 소화시키는 세균이나, 당류를 접하게 되면 이를 발효시켜 산을 생성시키고, 끈적끈적한 물질을 생산하여 균주와 함께 바이오필름 즉, 플라그를 만들어 이 세균이 치아에 달라붙는 것을 도와준다. 이 때, 세균의 신진 대사 산물로 만들어진 산(acid)이 치아 표면을 공격하여 에나멜질에 구멍을 내며, 충치를 유발하는 것으로 알려져 있다.

또한, X. oryzae가 생산하는 바이오필름은 벼에 감염되었을 때, 도관의 통로를 막게 되고, 이를 통해 영양분의 전달이나 물의 전달이 원활하지 않아서 잎이 죽기 시작하여 벼가 죽거나 살아남더라도 쌀을 정상적으로 생산할 수 없게 되는 흰잎마름병을 일으키게 된다.

따라서, 인체에 독성이 없이 안전하고 세포의 성장을 저해하여 약제저항성을 나타내지 않으면서, 바이오필름 억제 효과가 뛰어난 새로운 천연물질의 개발이 시급하다.

본 발명자들은 정향의 메탄올추출물을 디클로로메탄으로 분획한 추출물이 벼 흰잎마름병 원인균인 Xanthomonas oryzae와 장 질환 원인균인 Yersinia enterocolitica와 Aeromonas hydrophila의 바이오필름 형성을 효과적으로 억제하는 것을 확인한 바 있다(대한민국 특허공개 2015-0044271).

이에, 본 발명자들은 장출혈과 같은 소화기 질환을 유발하는 Yersinia enterocolitica의 바이오필름 억제효율을 높일 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 놀랍게도, 정향의 55~65% 에탄올 추출물이 그 외 농도의 추출물보다 현저히 높은 바이오필름 억제능을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 Yersinia enterocolitica 균주에 대한 바이오필름 억제능이 우수한 정향추출물 분획을 함유하는 바이오필름 형성 방지용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 Yersinia enterocolitica 균주의 바이오필름 억제능이 우수한 정향추출물 분획을 함유하는 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반, 식중독 및 장염으로 구성된 군에서 선택되는 Yersinia enterocolitica에 의해 발생하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 정향의 55~65% 에탄올 추출물을 함유하는 Yersinia enterocolitica의 바이오필름 형성 방지용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 정향의 55~65% 에탄올 추출물을 함유하는 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반, 식중독 및 장염으로 구성된 군에서 선택되는 Yersinia enterocolitica 에 의해 발생하는 질병의 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 정향의 55~65% 에탄올 추출물을 함유하는 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반, 식중독 및 장염으로 구성된 군에서 선택되는 Yersinia enterocolitica 에 의해 발생하는 질병의 예방용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명의 조성물을 이용하면, Yersinia enterocolitica 유래 소화기 질환을 효과적으로 예방할 수 있다.

도 1은 정향을 에탄올 농도별 용매로 추출한 추출물의 1차 시료를 이용하여, Y. enterocolitica 균주의 바이오필름 억제능을 확인한 것이다.
도 2는 정향을 에탄올 농도별 용매로 추출한 추출물의 1차 시료를 이용하여, S. mutans 균주의 바이오필름 억제능을 확인한 것이다.
도 3은 정향을 에탄올 농도별 용매로 추출한 추출물의 2차 시료를 이용하여, S. mutans 균주의 바이오필름 억제능을 확인한 것이다.
도 4는 정향을 에탄올 농도별 용매로 추출한 추출물을 이용하여, X. oryzae 균주의 바이오필름 억제능을 확인한 것이다.

본 발명에서는 바이오필름 억제능을 가지는 정향추출물에서 각 균주에 대한 바이오필름 형성 억제능을 가지는 물질을 효율적으로 추출할 수 있는 조건을 확립하였으며, 놀랍게도, 정향을 55~65% 에탄올 추출물을 사용하여 추출하는 경우, 상기 범위 이외의 농도를 가지는 에탄올을 이용한 정향 추출물보다, 현저히 높은 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

Yersinia enterocolitica 가 형성하는 바이오필름의 경우, 정향의 60% 에탄올 추출물을 사용한 경우, 50% 나 70% 에탄올 추출물보다 약 1.3 배의 억제능을 나타내었다.

따라서, 본 발명은 일관점에서, 정향의 55~65% 에탄올 추출물을 함유하는 Yersinia enterocolitica 의 바이오필름 형성 방지용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서, 정향의 에탄올 추출물은 정향을 1 mm이하의 크기로 분쇄하고 분쇄된 정향을 55~65% 에탄올 비율의 용매로 추출하였다. 이 때 사용한 정향은 각 용매 당 10 g이었다. 추출 시 200 ml의 용매를 50℃ 항온수조에서 30분마다 유리막대로 저어주면서 3시간 동안 추출하였다. 추출 후 여과종이를 이용하여 고형분을 제거하고, 그 양을 측정하였으며, 추출된 시료를 1차 시료라 하였다. 1차 시료로써 추출된 상태의 원액을 그대로 실험에 이용하였으며, 시료 1㎕ 처리하여 미생물의 생장과 바이오필름 형성 억제 정도를 확인하였다.

본 발명의 다른 양태에서는 정향의 에탄올 추출물은 정향을 1 mm이하의 크기로 분쇄하고 분쇄된 정향을 55~65% 에탄올 비율의 용매로 추출하였다. 이 때 사용한 정향은 각 용매 당 10 g이었다. 추출 시 200 ml의 용매를 50℃ 항온수조에서 30분마다 유리막대로 저어주면서 3시간 동안 추출하였다. 추출 후 여과종이를 이용하여 고형분을 제거하고, 그 양을 측정하였으며, 추출된 시료를 1차 시료에, 추출 시 사용한 용매의 양(200ml)만큼의 물을 첨가하여 50% 희석한 후, 회전감압농축기를 이용하여 약 10%까지 농축하여 포함된 에탄올을 증발시켰다. 그 후 물을 첨가하여 여과 시 측정한 양만큼 맞춰주었다. 원심분리(4℃, 13,000 rpm, 20분)하여 고형분을 제거한 후, 상등액을 취하여 0.45㎛ 구멍의 여과막을 이용하여 여과하여 2차 시료로 사용하였으며, 시료 5㎕ 처리하여 미생물의 생장과 바이오필름 형성 억제 정도를 확인하였다

본 발명에서, 상기 바이오필름 형성 방지용 조성물은 55~65% 에탄올 추출물을 함유하는 Yersinia enterocolitica의 바이오필름 형성 방지용 조성물인 것을 특징으로 할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명은 정향의 55~65% 에탄올 추출물을 함유하는 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반, 식중독 및 장염으로 구성된 군에서 선택되는 Yersinia enterocolitica에 의해 발생하는 질병의 예방 또는 치료용 의약조성물에 관한 것이다.

Y. enterocolitica는 장내세균과에 속하며 gastroenteritis (식중독, 장염)을 일으키는 Gram-negative균이다. 사람에서 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반 등 다양한 질병을 발생시키는 것으로 알려져 있다. 이 균은 매우 넓은 범위의 온도에서 생육하며, 바이오필름을 형성함으로써 외부의 자극이나 항생제 처리에 대해 저항을 가져 관리가 어렵다.

본 발명의 일 양태에서는 정향의 55~65% 에탄올추출물을 Y. enterocolitica의 배양액에 처리하는 경우, 효율적으로 바이오필름의 형성을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.

본 발명의 의약 조성물에 사용된 담체는 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및 비히클을 포함하며 총괄적으로 “약제학적으로 허용되는 담체”라고 한다. 본 발명의 의약조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이온 교환, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 여러 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로즈-계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지 등이 포함된다.

본 발명에 따른 의약 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다.

경구 및 비경구 투여가 바람직하다. 본원에 사용된 용어 “비경구”는 피하, 피내, 정맥 내, 근육 내, 관절 내, 활액낭 내, 흉골 내, 경막 내, 병소 내 및 두개골 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

의약조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액으로서 멸균 주사용 제제의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제(예, 트윈 80) 및 현탁화제를 사용하여 본 분야에 공지된 기술에 따라 제형될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매중의 멸균 주사용액 또는 현탁액(예, 1,3-부탄디올중의 용액)일 수 있다. 허용적으로 사용될 수 있는 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링겔 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 불휘발성 오일이 통상적으로 용매 또는 현탁화 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하여 자극성이 적은 어떠한 불휘발성 오일도 사용할 수 있다. 올레산 및 이의 글리세라이드 유도체와 같은 지방산이 약제학적으로 허용되는 천연 오일(예, 올리브유 또는 피마자유), 특히 이들의 폴리옥시에틸화 된 것과 마찬가지로 주사 제제에 유용하다.

본 발명의 의약조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만 캡슐, 정제 및 수성 현탁액 및 용액을 포함하여 경구적으로 허용되는 어떠한 용량형으로도 경구 투여될 수 있다. 경구용 정제의 경우, 흔히 사용되는 담체로는 락토즈 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 또한 전형적으로 첨가된다. 캡슐형으로 경구 투여하는 경우 유용한 희석제로는 락토즈 및 건조된 옥수수 전분이 포함된다. 수성 현탁액이 경구 투여될 때 활성 성분은 유화제 및 현탁화제와 배합된다. 필요한 경우, 감미제 및/또는 풍미제 및/또는 착색제가 첨가될 수 있다.

본 발명의 의약조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 본 발명의 화합물을 실온에서 고형이지만 직장 온도에서는 액상인 적합한 비자극성 부형제와 혼합하여 제조할 수 있다. 이러한 물질로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 코코아 버터, 밀랍 및 폴리에틸렌 글리콜이 포함된다.

본 발명에 따른 의약조성물의 경구 투여는 목적하는 치료가 국소 적용으로 접근이 용이한 부위 또는 기관과 관련이 있을 때 특히 유용하다. 피부에 국소적으로 적용하는 경우, 의약조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 함유한 적합한 연고로 제형되어야 한다. 본 발명의 화합물을 국소 투여하기 위한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 유동 파라핀, 백색 와셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌, 폴리옥시프로필렌 화합물, 유화 왁스 및 물이 포함된다. 다른 방도로서, 의약조성물은 담체에 현탁 또는 용해된 활성 화합물을 함유한 적합한 로션 또는 크림으로 제형 될 수 있다. 적합한 담체로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 광유, 솔비탄 모노스테아레이트, 폴리솔베이트 60, 세틸 에스테르 왁스, 세테아릴 알코올, 2-옥틸도데카놀, 벤질 알코올 및 물이 포함된다. 본 발명의 의약조성물은 또한 직장 좌제에 의해 또한 적합한 관장제로 하부 장관으로 국소 적용할 수 있다. 국소 적용된 경피 패치가 또한 본 발명에 포함된다.

본 발명의 의약조성물은 비 내 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여할 수 있다. 이러한 조성물은 약제의 분야에 잘 알려진 기술에 따라 제조하며 벤질 알코올 또는 다른 적합한 보존제, 생체이용율을 증강시키기 위한 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 본 분야에 알려진 가용화제 또는 분산제를 사용하여 염수중의 용액으로서 제조할 수 있다.

특정 환자에 대한 특정 유효량은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 규정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 변할 수 있음은 이해될 것이다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형 될 수 있다.

본 발명에 따른 의약 조성물을 어류의 피하세포에 투입할 경우 새낭 또는 소화관에 투여할 수 있다. 주사는 근육조직내의 근육세포 또는 다른 세포에 주사할 수 있으며 복강 내의 내장세포에 주사할 수 있다.

바람직한 양태로서, 구강 내 투여를 위한 의약 조성물은 고체상의 부형제와 함께 활성 성분을 혼합함으로써 제조할 수 있으며 정제 또는 당의정 형태로 제조하기 위해 과립형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제로는 락토스, 수크로스, 만니톨 및 소르비톨과 같은 슈가 형태 또는 옥수수, 밀가루, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터 전분, 메틸 셀룰로스, 하이드로시프로필메틸-셀룰로스 또는 나트륨 카복시메틸세룰로스와 같은 세룰로스, 아라빅 검, 타가칸쓰 검을 포함하는 검류와 같은 카보하이드레이트 또는 젤라틴, 콜라겐과 같은 단백질 필러를 사용할 수 있다. 필요한 경우에는, 교차결합된 폴리비닐피롤리돈, 아가 및 알긴산 또는 나트륨 알긴산과 같은 각각의 염 형태의 붕해제 또는 용해제를 첨가할 수 있다.

바람직한 양태로서, 비경구적 투여의 경우 본 발명의 의약 조성물은 수용성 용액으로 제조할 수 있다. 바람직하게는, 한스 용액(Hank's solution), 링거 용액 (Ringer's solution) 또는 물리적으로 완충된 염수와 같은 물리적으로 적절한 완충용액을 사용할 수 있다. 수용성 주입(injection) 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀룰로스, 솔비톨 또는 덱스트란과 같이 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 기질을 첨가할 수 있다. 덧붙여서, 활성 성분의 현탁액은 적합한 유질의 주입 현탁액(oily injection suspensions)으로 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 담체는 참기름과 같은 지방산 또는 에틸 올레이트, 트리글리세라이드 또는 리포솜과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 복수양이온성 비지질 아미노 폴리머(polycationic amino polymers)도 운반체로서 사용될 수 있다. 임의로, 현탁액은 화합물의 용해도를 증가시키고 고농도의 용액을 제조하기 위해 적합한 안정화제 또는 약제를 사용할 수 있다.

이상과 같은 안정화제, 완충제 혹은 흡착방지제를 가하여 본 발명 제제를 조제할 수 있지만, 특히 의료용 또는 동물약용 주사제로서 이용하는 경우는 삼투압비로서 허용되는 삼투압비는 1 내지 2가 좋다. 삼투압비는 약제화시에 염화나트륨의 증감에 의해 조제할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 정향의 55~65% 에탄올 추출물을 함유하는 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반, 식중독 및 장염으로 구성된 군에서 선택되는 Yersinia enterocolitica에 의해 발생하는 질병의 예방용 기능성 식품에 관한 것이다.

본 발명의 기능성 식품은 상기 질병 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은, 예를 들어, 각종 식품류, 캔디, 초콜릿, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은 상기 질병 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 기능 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 20 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등의 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 정향 에탄올 추출물의 제조

정향(원산지: 중국)을 경동시장에서 구입하여 1 mm이하의 크기로 분쇄하였다. 분쇄된 정향을 물과 각각 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 및 95%의 다양한 에탄올 비율의 용매로 추출하였다. 이 때 사용한 정향은 각 용매 당 10 g이었다. 추출 시 200 ml의 용매를 50℃ 항온수조에서 30분마다 유리막대로 저어주면서 3시간 동안 추출하였다. 추출 후 여과종이를 이용하여 고형분을 제거하고, 그 양을 측정하였으며, 추출된 시료를 1차 시료라 하였다. 1차 시료로써 추출된 상태의 원액을 그대로 실험에 이용하였으며, 시료 1㎕ 처리하여 미생물의 생장과 바이오필름 형성 억제 정도를 확인하였다.

2차 시료로써 모든 추출된 상태의 원액에 추출 시 사용한 용매의 양(200 ml)만큼의 물을 첨가하여 50% 희석한 후, 회전감압농축기를 이용하여 약 10%까지 농축하여 포함된 에탄올을 증발시켰다. 그 후 물을 첨가하여 여과 시 측정한 양만큼 맞춰주었다. 원심분리(4℃, 13,000rpm, 20분)하여 고형분을 제거한 후, 상등액을 취하여 0.45㎛ 구멍의 여과막을 이용하여 여과하여 2차 시료로 사용하였으며, 시료 5㎕ 처리하여 미생물의 생장과 바이오필름 형성 억제 정도를 확인하였다.

실시예 2: 정향에탄올 추출물의 Yersinia enterocolitica 의 바이오필름 형성억제 효과 분석

본 실시예에서 사용한 Y. enterocolitica (KCCM 41657)는 한국미생물보존센터에서 분양받아 사용하였다.

-80℃에서 보관되어 있던 Y. enterocolitica 균주를 활발한 생육 상태로 만들기 위하여, LB 고체배지에 도말한 후, 26℃ 에서 2일간 배양하였다. 배양된 균주는 5 ml의 TYE 액체배지에 접종한 후, test tube에서 26℃, 250 rpm으로 1일간 배양하였다.

TYE 배지의 조성은 표 1에 나타내었다.

TYE 배지(100 ml)의 조성

성분	함량
Tryptone	1g
Yeast extracts	0.5g
Water	총부피를 100ml로 맞춤

TYE 배지에서 배양된 Y. enterocolitica 균주의 바이오필름 형성을 정향추출물이 억제하는지 확인하기 위하여, 바이오필름 형성용 배지인 M63 배지를 사용하였다.

M63 배지의 조성은 표 2에 나타내었다.

M63 배지의 조성

성분	함량
5x M63 medium(입수처 기재)	20ml
20% Glucose	1ml
20% MgSO₄	0.1ml
Water	총부피를 100 ml로 맞춤

5x M63 배지 제조

성분	함량
KH₂PO₄	0.3g
K₂HPO₄	0.7g
(NH₄)₂SO₄	0.2g
FeSO₄ㅇ7H₂O (1mg/ml)	0.05ml
Water	총부피를 20ml로 맞춤

96웰의 PVC 마이크로플레이트에 M63 배지를 100μl씩 분주하고, 실시예 1에서 제조한 정향 에탄올 추출물 (1차 시료 및 2차 시료)을 1차 시료의 경우는 1 μl 씩 추가로 분주하였으며, 2차 시료의 경우는 5 μl씩 추가로 분주하였다. 상기 분주된 각 웰에 TYE 배지에서 배양된 Y. enterocolitica 균주를 세포농도 Abs600=0.05가 되도록 접종하고, 26℃에서 24시간 동안 배양하였다.

배양액을 제거한 후, 물로 3번 세척하고, 1% crystal violet 용액 100 μl를 각각의 웰에 넣고 15분간 상온에서 정치하여 반응시켰다. 반응이 끝난 용액을 제거하고 물로 3번 부드럽게 세척한 후, 95% 에탄올 100 μl를 각각의 웰에 넣고 15분간 정치시킨 후, Abs595에서 마이크로플레이트 리더로 바이오필름의 형성정도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, Y. enterocolitica 균주가 생산하는 바이오필름에 대해 정향의 에탄올 추출물 중 1차 시료에서 50%, 60% 및 70%의 에탄올을 사용하여 추출한 추출물에서 가장 높은 억제효과를 나타내었으며, 이는 95% 에탄올 추출물이 바이오필름 억제효과가 거의 없는 것과 비교하여 매우 임계적 범위에서 매우 현저한 효과를 나타내는 것이라 할 수 있다.

실시예 3: 정향에탄올 추출물의 Streptococcus mutans 의 바이오필름 형성억제 효과 분석

본 실시예에서 사용한 S. mutans는 LG 생활과학 기술연구원에서 분양받아 사용하였다.

-80℃에서 보관되어 있던 S. mutans 균주를 활발한 생육 상태로 만들기 위하여, BHI 고체배지에 도말한 후, 37℃ 에서 2일간 배양하였다. 배양된 균주는 5 ml의 BHI 액체배지(Bacto^TM)에 접종한 후, test tube에서 37℃에서 shaking 없이 1일간 배양하였다.

96웰의 PVC 마이크로플레이트에 BHI + 1% Sucrose 배지를 100 μl씩 분주하고, 실시예 1에서 제조한 정향 에탄올 추출물 (1차 시료 및 2차 시료)을 1차 시료의 경우는 1 μl 씩 추가로 분주하였으며, 2차 시료의 경우는 5 μl씩 추가로 분주하였다. 상기 분주된 각 웰에 BHI 배지에서 배양된 S. mutans 균주를 세포농도 Abs600=0.05가 되도록 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, S. mutans 균주가 생산하는 바이오필름에 대하여 정향의 에탄올 추출물 중 1차 시료에서 40%의 에탄올을 사용하여 추출한 추출물에서 가장 높은 억제효과를 나타내었으며, 도 3에 나타난 바와 같이, 2차 시료에서 40% 에탄올 및 50% 에탄올을 사용하여 추출한 정향 추출물에서 가장 높은 억제 효과를 나타내었다. 이는 95% 에탄올 추출물이 바이오필름 억제효과가 거의 없는 것과 비교하여 매우 임계적 범위에서 매우 현저한 효과를 나타내는 것이라 할 수 있다.

실시예 4: 정향 에탄올 추출물의 Xanthomonas oryzae 의 바이오필름 형성억제 효과 분석

X. oryzae (KACC 10331)는 농촌진흥청 농업유전자원정보센터에서 분양받아 사용하였다.

-80℃에서 보관되어 있던 X. oryzae 균주를 고체배양 배지인 YGC 배지에서 도말하여, 28℃에서 2일간 배양하여, 활발한 생육상태 균주로 배양하였다. 한천을 이용한 고형배지인 YGC 배지의 조성은 표 4과 같다.

YGC 배지 (100 ml)의 구성

성분	함량
Glucose	5g
Yeast extracts	0.5g
CaCO₃	1.25g
Agar	1.5g
Water	총부피를 100 ml로 맞춤

YGC 배지에서 배양된 X. oryzae 균주는 액체 배지인 210 배지 5 ml에 접종한 후, 28℃, 250 rpm에서 2일간 배양하였다. 배양에 사용된 210 배지의 조성은 표 5에 나타내었다.

210배지 조성

성분	함량
Sucrose	0.5g
Casein hydrolysates	0.8g
Yeast extract	0.4g
K₂HPO₄	0.3g
MgSO₄·7H₂O	30mg
Water	총부피를 100 ml로 맞춤

210배지에서 배양된 X. oryzae 균주의 바이오필름 형성을 정향추출물이 억제하는지 확인하기 위하여, 바이오필름 형성용 배지인 XOM2 배지를 사용하였다.

XOM2 배지의 조성은 표 6에 나타내었다.

XOM2 배지의 조성지(pH 6.5)

성분	함량
L-methionine	670μM
Na-glutamate·H₂O	10mM
KH₂PO₄	14.7mM
MnSO₄	40μM
Fe(III)-EDTA	240μM
MgCl₂	5mM
D-xylose	0.18%

96웰의 PVC 마이크로플레이트에 XOM2 배지를 100μl씩 분주하고, 실시예 1에서 제조한 정향 에탄올 추출물 (1차 시료 및 2차 시료)을 1차 시료의 경우는 1 μl 씩 추가로 분주하였으며, 2차 시료의 경우는 5 μl씩 추가로 분주하였다. 상기 분주된 각 웰에 210배지에서 배양된 X. oryzae 균주을 세포농도 Abs600=0.05가 되도록 접종하고, 28℃에서 24시간 동안 배양하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, X. oryzae 균주의 바이오필름 형성에 있어서는 물로 추출한 것이나 에탄올로 추출한 것에 대하여 큰 차이가 없었으며, 70%~100% 에탄올에서 에탄올 농도가 증가할 수 록 바이오필름 억제능이 낮아지는 것을 확인하였으며, 임계적 범위에서의 억제능 차이는 관찰되지 않았다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

정향의 55~65% 에탄올 추출물을 함유하는 Yersinia enterocolitica의 바이오필름 형성 방지용 조성물.
정향의 55~65% 에탄올 추출물을 함유하는 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반, 식중독 및 장염으로 구성된 군에서 선택되는 Yersinia enterocolitica 에 의해 발생하는 질병의 예방 또는 치료용 조성물.
정향의 55~65% 에탄올 추출물을 함유하는 급성위장염, 종말회장염, 패혈증, 결핵성 홍반, 식중독 및 장염으로 구성된 군에서 선택되는 Yersinia enterocolitica 에 의해 발생하는 질병의 예방용 기능성 식품.