KR20170114957A

KR20170114957A - 폐암 환자의 혈중 순환 종양세포를 활용한 alk 유전자 변이 검출방법

Info

Publication number: KR20170114957A
Application number: KR1020170042891A
Authority: KR
Inventors: 전병희
Original assignee: 주식회사 싸이토젠
Priority date: 2016-04-05
Filing date: 2017-04-03
Publication date: 2017-10-16

Abstract

본 발명은 폐암 환자의 혈중 순환 종양세포를 활용한 ALK 유전자 변이 진단방법에 관한 기술로서, 더욱 상세하게는 희소 세포 분리장치인 사이즈 선택성을 가지는 칩을 활용하여 폐암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하여 단기배양한 후, ALK-FISH 분석법을 통해 ALK 유전자 변이를 진단함으로써, 폐암 진단의 민감도 및 특이도를 향상시켜 폐암을 진단하는 이점이 있다.

Description

폐암 환자의 혈중 순환 종양세포를 활용한 ALK 유전자 변이 검출방법 {Detecting method for ALK gene mutation using the circulating tumor cells derived on patients with the lung cancer}

본 발명은 폐암 환자의 혈중 순환 종양세포(CTCs; circulating tumor cells)를 활용한 ALK(anaplastic lymphoma kinase) 유전자 변이 진단방법에 관한 기술로서, 더욱 상세하게는 희소 세포 분리장치를 활용하여 폐암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리한 후, ALK-FISH(anaplastic lymphoma kinase-fluorescence in situ hybridization) 분석법을 통해 ALK 유전자 변이를 진단하는 임상진단법에 관한 것이다.

우리나라에서 폐암에 의한 사망률은 전체 암 중 1위를 차지할 만큼 가장 심각한 질병 중 하나이다. 폐암은 최근 수십 년간 그 발생 빈도가 급속히 증가하여 남자에서는 위암 다음으로 많은 악성종양이며, 최근에는 여성에게서도 그 빈도가 증가하고 있다. 폐암은 증상이 없이 정기검진이나 다른 질환의 검사 시에 우연히 발견되는 경우가 많고, 폐암의 양상에 따라 다양하게 나타날 수 있다.

흡연에 의해 야기되는 폐암의 91%는 중 약 87%가 나타내는 비소세포 폐암 (NSCLC; non-small cell lung cancer)이며, 나머지 13%는 소세포 폐암(SCLC)이다. 소세포 폐암은 드물게 발생하지만, 급속하게 진행(rapidly fatal)되어 조기 발견에 대한 기회가 적다.

비소세포 폐암 환자의 약 5%에서 ALK 유전자 변이가 관찰되고 있다. ALK 유전자 변이는 2번 염색체 단완(2p23)에서 관찰되며, 현재까지 11개 이상의 다양한 변이가 보고 되었고, 이 유전자 변이는 주로 선암(adenocarcinoma), 특히 반지세포암(signet ring cell carcinoma)과 비흡연자에서 발견되고 있다.

폐암은 1기부터 4기까지로 구분되는데, 1기는 암이 폐실질에 국한되어 있고 3cm 이하인 경우, 2기는 암이 주위의 림프절에 퍼져있고 늑막까지 퍼져있는 경우, 3A기는 암이 흉벽과 횡경막까지 퍼져 있고 수술이 가능한 경우, 3B기는 종격동의 혈관, 식도, 기관 등에 침범하여 수술 불가능 경우, 4기는 암이 타 장기(간, 뼈, 뇌, 골수)까지 퍼진 경우를 말한다.

폐암의 진단에 가장 중요하고 간편한 검사방법은 흉부 X선 촬영으로 폐의 종괴를 발견할 수 있으며, 그밖에 폐렴에 의한 침윤, 기관지 폐쇄에 의한 폐허탈, 늑막삼출액유무, 횡격막신경으로의 침범에 의한 횡격막의 상승과 흉곽골격으로의 전이소견 등을 볼 수 있다. 또한 객담 내 세포검사, 기관지 내시경 및 조직생검에 의해 조직학적으로 폐암을 확진 할 수 있다.

그러나 폐암 환자로부터의 반복적인 조직 생검이 어렵고, 한번의 조직 생검 후 일정시간의 회복기간을 필요로 하며 환자에게도 육체적인 부담을 줄 뿐만 아니라 조직 생검을 하기 전 다양한 검사를 필요로 하기 때문에 효율적이지 못한 문제점들이 있다. 따라서, 조직 생검이 불가능한 환자 또는 반복적인 조직 생검을 필요로 하는 환자를 위해 간단한 방법으로 폐암 진단을 가능하게 하는 검사 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.

또한, 폐암은 세부적인 진단이 어렵다는 문제를 갖는다. 경험이 많은 병리학자들 사이에서도 폐암의 세부 유형에 대한 의견이 엇갈린다는 사실을 봐도 그 어려움을 짐작할 수 있다. 이 같이 폐암의 세부적인 진단이 어려운 이유는 진단에 유용한 표지가 제한적이기 때문이다.

따라서, 전혈, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 체액, 타액, 객담, 소변 및 대변 등의 생물학적 시료에 존재하는 암 특이적인 항체(antibody)를 이용하여, 높은 정확도와 정밀도로 암을 진단할 수 있는 방법에 대한 개발 필요성이 절실하다.

이와 관련하여 대한민국 특허 제 10-1362284호 (발명의 명칭: 인간 고형 종양에서 유전자 결손 및 돌연변이 ALK 카이네이즈, 이하 종래기술 1이라고 한다.)는 폐암 조직 세포를 이용하여 ALK 융합 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기 종래기술 1은 침습적인 조직 생검의 방법을 이용하여 폐암 조직을 채취하는 문제점을 가지고 있으며, 순환 종양세포를 활용하여 유전자 변이를 검사하는 방법은 개시되어 있지 않다.

상기 종래기술 1은 폐암 조직 세포를 이용하여 ALK 융합 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 침습적인 조직 생검의 방법을 이용하여 폐암 조직을 채취하는 문제점을 가지고 있으며, 순환 종양세포를 활용하여 유전자 변이를 검사하는 방법은 개시되어 있지 않다.

따라서 종래기술의 문제점을 해소하고자 안출된 본 발명은 본 발명은 희소 세포 분리장치인 사이즈 선택성을 가지는 칩을 활용하여 폐암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하여 단기배양한 후, ALK-FISH 분석법을 통해 ALK 유전자 변이를 진단함으로써, 폐암 진단의 민감도 및 특이도를 향상시켜 폐암을 진단하는 임상진단법에 관한 기술을 제공하고자 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일측면에 따른 ALK 유전자 변이 검출방법은

폐암 환자의 시료에서 혈중 순환 종양세포(CTCs; circulating tumor cells)를 분리하는 단계;

상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 단기 배양하는 단계; 및

상기 단기 배양된 혈중 순환 종양세포를 활용하여 ALK-FISH(anaplastic lymphoma kinase-fluorescence in situ hybridization) 분석법을 통해 ALK 유전자 변이를 분석하는 단계를 포함할 수 있고,

상기 시료는 혈액일 수 있으며,

상기 혈중 순환 종양세포는 사이즈 선택성 칩(chip)을 이용하여 분리되는 것일 수 있고,

상기 사이즈 선택성 칩은 상기 시료의 반복 통과가 가능할 수 있으며,

상기 단기 배양하는 단계에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스페린, 상피성장인자 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개로 이루어진 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있고,

상기 ALK유전자 변이를 분석하는 단계는,

슬라이드에 상기 혈중 순환 종양세포를 고정시키는 단계;

상기 혈중 순환 종양세포를 단계에서 고정시킨 혈중 순환 종양세포에 ALK 프로브를 반응시키는 단계; 및

형광 신호를 분석하는 단계;

를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 인슐린은 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 트랜스페린은 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 상피성장인자는 0.5 내지 10ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 3 내지 30μm인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), RKI-1447 및 Y27632으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 단기 배양하는 단계는 혈중 순환 종양세포 접착을 막아주는 표면을 가진 배양플레이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 배양플레이트는 히드로겔층이 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 히드로겔층은 중성전하를 가지면서 친수성인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 단기 배양하는 단계는 배양을 시작하는 시점부터 1 내지 15일동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 사이즈 선택성 칩의 기공 크기(pore size)는 5.5 내지 8.5 μm인 것을 특징으로 하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따르면, 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 ALK 유전자 변이 검출방법을 이용하여 환자의 시료로부터 ALK 유전자 변이 여부를 판단하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 희소 세포 분리장치인 사이즈 선택성을 가지는 칩을 활용하여 폐암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리한다는 제 1효과, 기존 조직 생검에서 활용되지 못하거나 시행하지 못하였던 반복적이고 비침습적인 유전자 변이 검사를 가능하게 한다는 제 2효과, 기존 조직 생검을 위해 요구되었던 다양한 검사 및 시술을 대체함으로써 비용절감 뿐만 아니라 환자의 몸 상태에 대한 부담을 덜어준다는 제 3효과, 폐암 진단의 민감도 및 특이도를 향상시켜 폐암 진단의 정확성을 증가시킨다는 제 4효과, 폐암의 조기 진단 및 예후, 예측 모니터링을 가능하게 한다는 제 5효과, 폐암에 특이적인 항암제 반응 시 혈중 순환 종양세포의 강도를 통하여 항암제 반응 분석에 응용이 가능하다는 제 6효과를 갖는다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 폐암 환자의 혈액으로부터 분리한 혈중 순환 종양세포를 단기배양한 후, ALK-FISH 분석법을 통해 ALK 유전자 변이를 진단하는 프로세스를 보여주는 도면이다.
도 2는 폐함 환자의 혈액으로부터 분리한 혈중 순환 종양세포가 암 세포임을 확인하기 위한 형광 염색 사진이다.
도 3은 폐암 환자의 혈액으로부터 분리한 혈중 순환 종양세포를 이용하여 ALK-FISH 분석을 수행하여 도출된 FISH 프로브 신호 사진이다.
도4는 사이즈 선택성 칩에 의해 분리된 혈중 순환 종양세포를 찍은 사진이다.
도5 는 본 발명에 따른 배양액에서 배양된 혈중 순환 종양세포의 성장 및 분열과 일반적인 배양액에서 배양된 혈중 순환 종양세포의 성장 및 분열에 대해 나타낸 그래프이다.
도6 는 본 발명에 따른 배양액을 이용하여, 본 발명에서 사용된 히드로겔 코팅된 배양플레이트에서 배양된 혈중 순환 종양세포의 성장 및 분열과 일반적인 배양플레이트에서 배양된 혈중 순환 종양세포의 성장 및 분열에 대해 나타낸 그래프이다.

이하에서는 화학식, 반응식, 구체적인 실시예 및 실험예를 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결 (접속, 접촉, 결합)"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 부재를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 또한 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 ALK 유전자 변이를 가지는 환자를 신속, 정확하게 선별할 수 있는 진단법으로 희소 세포 분리장치인 사이즈 선택성을 가지는 칩을 활용하여 폐암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하여 단기배양한 후, ALK-FISH 분석법을 통해 ALK 유전자 변이를 진단함으로써, 폐암 진단의 민감도 및 특이도를 향상시켜 폐암을 진단하는 임상진단법에 관한 기술에 관한 것이다.

ALK 유전자는 2번 염색체 역전(inversion)에 의해 재배열(gene rearrangement)이 발생하며, 재배열에 의한 ALK 유전자 결손 및 전위(translocation, 전좌) 현상은 ALK 유전자의 일부를 다른 유전자 내로 이동시킨 후, 그 유전자 내에 삽입되어 새로 재배열 되는 비정상적인 상태를 야기하며, 결과적으로 세포 내에서는 정상적인 ALK 단백질이 생성되지 못하고 다른 단백질과 융합된 형태인 ALK 융합 단백질이 생성되는데, 이는 직접적으로 폐암을 야기한다고 알려져 있다.

유전자 재배열이란 일반적으로 체세포의 유전자 단편 사이에서 재조합이 일어나 염색체 상의 유전자 위치 및 순서의 변화를 일으키는 구조적 변화를 말한다. 또한, 전위란, 염색체 이상의 하나로서 염색체의 일부분에 절단이 일어나 그 단편이 같은 염색체의 다른 부분 또는 다른 염색체 상에 결합하여 염색체의 형태를 바꾸는 이상현상을 말한다.

FISH(fluorescence in situ hybridization)는 형광제자리교잡반응으로 염색체의 특정 DNA 염기서열 (DNA sequence)의 존재 유무를 규정하기 위한 목적으로 이용한다. 여기서 교합 또는 교잡반응 (hybridization)은 염색체에 프로브(probe)를 결합시키는 방법으로, 염색체에 결합하는 DNA 프로브가 자외선을 받아 형광을 냄으로써, DNA 염기서열의 유무 및 위치를 보여주게 된다.

본 발명의 실시예에서 ALK 유전자 변이 진단방법은 (i) 폐암 환자의 시료에서 혈중 순환 종양세포(CTCs; circulating tumor cells)를 분리하는 단계, (ii) 상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 단기 배양하는 단계 및 (iii) 상기 단기 배양된 혈중 순환 종양세포를 활용하여 ALK-FISH(anaplastic lymphoma kinase-fluorescence in situ hybridization) 분석법을 통해 ALK 유전자 변이를 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 순환 종양세포는 암 환자의 혈액으로부터 분리되는 순환 종양세포로 암종의 전이에 중요한 역할을 하며, 암 진단을 위한 새로운 진단방법으로 활용될 수 있다.

시료로부터 혈중 순환 종양세포를 분리하는 단계는 일정한 비중을 가지는 피콜(ficoll) 용액을 사용하는데, 이 피콜 용액의 사용은 부유 밀도 구배 원심분리 방법에 의해 적혈구(RBC; red blood cell)와 백혈구(WBC; white blood cell)가 제거된 혈중 순환 종양세포를 분리할 수 있게 한다.

폐암 환자의 혈액을 채혈한 후, 피콜 용액을 사용하여 말초혈액 단핵세포를 분리하기 전, 전처리 과정을 수행할 수 있다. 전처리 방법의 일 예는 (a) 혈액에 백혈구 항체를 넣어 백혈구를 제거하는 단계, 또는 (b) 혈액의 적혈구를 용해하는 단계일 수 있으나, 이 전처리 과정은 생략할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 상기 시료가 혈액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 발명의 실시예에서 상기 혈중 순환 종양세포는 사이즈 선택성을 가지는 칩(chip)을 이용하여 분리될 수 있다. 이 칩은 혈액 세포의 크기 차이를 기반으로 하며 10분 이내에 약 90%의 회수율로 순환 종양세포를 포착할 수 있다.

본 발명의 실시예에서 상기 사이즈 선택성 칩의 기공 크기(pore size)는 5.5 내지 8.5 μm이 바람직할 수 있으며, 더 바람직하게는 6.5 내지 7.5μm일 수 있다. 기공의 크기가 5.5 μm보다 작을 경우 백혈구와 적혈구가 칩을 통과하지 못해 칩 상에 걸리게 되어 제거되지 못하고, 기공의 크기가 8.5 μm보다 클 경우에는 기공의 크기가 암 세포의 크기보다 커서 암세포가 칩을 통과하여 암세포를 선택적으로 회수할 수 없게 된다. 본 발명의 일실시예에서 상기 사이즈 선택성 칩의 기공 모양은 원형, 사각형 또는 타원 모양일 수 있으며, 바람직하게는 사각형일 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 사이즈 선택성 칩의 기공은 규칙적인 패턴으로 배열될 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에서 상기 사이즈 선택성 칩은 구체적으로 스테인리스스틸, 니켈, 알루미늄 또는 구리를 소재로 제작될 수 있다. 상기 기공들은 멤스(MEMS, Micro-electro Mechanical Systems)기술을 이용한 에칭(etching)에 의해 형성될 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 사이즈 선택성 칩에서 상기 시료가 반복적으로 통과하게 할 수 있다. 구체적으로, 혈중 순환 종양세포가 상기 사이즈 선택성 칩에서 한번 분리되고 난 후 상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 다시 한번 상기 사이즈 선택성 칩으로 로딩하여 분리할 수 있고, 상기 분리 과정을 반복할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 사이즈 선택성 칩을 통한 혈중 순환 종양세포 분리는 혈중 순환 종양세포가 포함된 용액을 사이즈 선택성 칩에 로딩한 후에 특정적인 인위적 압력을 가함으로써 이루어지는 것이 아니라, 중력을 이용하여 혈중 순환 종양세포 분리가 이루어 질 수 있다. 본 발명에 따른 사이즈 선택성 칩을 통한 혈중 순환 종양세포 분리는 혈중 순환 종양세포에 인위적인 압력에 의한 데미지를 최소화함으로써 환자 체내에 존재하던 상태 그대로를 유지하게 해줄 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 사이즈 선택성 칩은, 혈중 순환 종양세포가 분리될 때 상기 사이즈 선택성 칩에 의한 혈중 순환 종양세포 데미지를 최소화시키거나 상기 사이즈 선택성 칩이 반복사용이 더 효율적으로 되도록 하기 위해, 또는 혈중 순환 종양세포 회수율을 보다 더 효율적으로 하기 위해 특정 물질로 코팅될 수 있다. 상기 특정 물질은, 구체적으로 혈중 순환 종양세포에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있으며, 세포에 물리적 또는 화학적으로 데미지를 주지 않는 생체재료이면 가능하다.

본 발명의 실시예에서, 상기 ALK유전자 변이를 분석하는 단계는, 슬라이드에 상기 혈중 순환 종양세포를 고정시키는 단계, 상기 혈중 순환 종양세포를 고정시키는 단계에서 고정된 혈중 순환 종양세포에 ALK 프로브를 반응시키는 단계 및 형광 신호를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.

세포나 조직의 형태학적 관찰을 원활하게 하기 위해서는 고정 과정이 가장 중요하다. 고정이 잘된 세포는 소기관이 잘 유지되지만, 고정이 부족하면 형태학적 구조가 불완전하게 되고, 고정이 너무 지나치면 항원의 소실과 비특이적인 반응이 나타날 수 있기 때문이다. 본 발명의 실시예에서 상기 혈중 순환 종양세포를 고정시키는 단계는 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 세포를 고정시켰으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 발명의 실시예에서 상기 ALK 프로브는 ALK 프로브는 50ng/10ul 내지 200ng/10ul로 처리하고, 22 내지 40℃ 온도에서 60 내지 120분 동안 반응시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는 30ng/10ul 내지 100ng/10ul로 처리하고, 25내지 37℃ 온도에서 80 내지 100분 동안 반응시킬 수 있다. 희석 비율, 온도 및 시간 조건이 상기 범위를 벗어나는 경우, ALK 항체 반응이 감소되어 세포 염색 과정이 정상적으로 수행되지 않을 수 있다.

본 발명의 실시예에서, ALK 항체 반응은 면역조직화학법(immunohistochemical techniques), 면역 블롯법(immunoblot), 면역침강법(immunoprecipitation), 효소결합 면역흡착분석법(ELISA; enzyme linked immunosorbent assay), 응집법(agglutination) 및 방사능 면역시험법(radio-immuno assay)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

본 발명의 실시예에서 상기 혈중 순환 종양세포는 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole) +/EpCAM(epithelial cell adhesion molecule, 상피세포결합분자)+/CD(cluster of differentiation)45- 세포 또는 DAPI+/EpCAM+/CK(cytokeratin)+/CD45- 세포일 수 있다. 핵의 대조염색(counterstaining)을 위해 DAPI를 사용하였고, CD45는 백혈구 공통 항원으로 CD45 양성을 제외함으로써 순환 종양세포와 구별하기 위해 사용되었다. EpCAM은 상피세포결합분자로 상피성종양로부터 유래된 혈중 순환 종양세포를 선택하기 위해 사용되었으며, CK는 특이적 종양세포의 마커로 혈중 순환 종양세포를 선택하기 위해 사용되었다.

본 발명의 실시예에서 상기 형광 신호를 분석하는 단계는 150 내지 250개의 세포에서 염색체 변화를 분석하여 정량화할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 180 내지 220개의 세포에서 정량화할 수 있다. 세포의 수가 상기 범위를 벗어나는 경우, ALK-FISH 분석법으로 도출된 형광 프로브 값의 오차가 커져 암 진단의 정확성이 떨어질 수 있다.

본 발명의 실시예에서 상기 150 내지 250개의 세포 중 개수를 측정하여 일정한 수의 세포가 ALK 로커스(locus)에 인접한 형광 프로브가 절단된 것으로 나타난다면, 양성으로 판단할 수 있다. 또한 절단되어 나타난 거리는 시그널 사이즈를 사용하여 측정할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 상기 단기배양에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스퍼린, EGF(Epidermal Growth Factor) 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개로 이루어질 수 있다.

상기 인슐린은 인간의 물질대사 체계의 호르몬 중 하나이며 이자 (기관)의 랑게르한스 섬 베타 세포에서 분비되어, 혈액 속의 포도당 수치인 혈당량을 일정하게 유지시키는 역할을 한다. 혈당량이 일정 이상으로 높아지면 인슐린이 분비되며, 혈액내의 포도당을 세포 내로 유입해 다시 다당류(글리코겐)의 형태로 저장하는 작용을 촉진시킨다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 인슐린을 포함함으로써 혈중순환 암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 인슐린은 3~50ng/ml, 3~45 ng/ml, 3~40ng/ml, 3~30ng/ml, 4~50ng/ml, 4~45ng/ml, 4~30ng/ml, 5~50ng/ml, 5~45ng/ml 또는 5~30ng/ml일 수 있다.

상기 트랜스페린은 β글로불린의 일종으로 혈청 속에 흡수된 2분자의 3가철이온과 결합하여 세포증식이나 헤모글로빈 생산에 필요한 철을 트랜스페린수용체를 매개로 하여 세포 내로 공급하는 철운반단백질이다. 혈청 속의 철 99% 이상은 트랜스페린과 결합하며 정상적으로는 트랜스페린의 약 1/3이 철과 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 트랜스페린을 포함함으로써 혈중순환 암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 트랜스페린은 3~50ng/ml, 3~45 ng/ml, 3~40 ng/ml, 3~30 ng/ml, 4~50 ng/ml, 4~45 ng/ml, 4~30 ng/ml, 5~50 ng/ml, 5~45 ng/ml 또는 5~30 ng/ml일 수 있다.

상기 상피성장인자(Epidermal Growth Factor, EGF)는 상피성장인자 수용체에 결합하여 세포의 성장 및 분열을 촉진시키는 폴리펩티드성 성장인자이다. 또한, 상기 상피성장인자는 단백질합성이나 RNA합성을 촉진하는 것 외에 오르니틴 탈카르복실효소를 유도할 수 있다. 본 발명에 따른 단기 배양단계에서 사용되는 배양액은 상기 상피성장인자를 포함함으로써 혈중순환 암세포를 배양시키는데 있어서 종래의 혈중 순황 종양세포배양액보다 세포 성장 및 분열을 더욱 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 상피성장인자는 0.5~10ng/ml, 0.5~9 ng/ml, 0.5~8ng/ml, 0.5~7ng/ml, 0.5~6ng/ml, 0.5~5ng/ml, 0.7~10ng/ml, 0.7~9ng/ml, 0.7~8ng/ml, 0.7~7ng/ml, 0.7~6ng/ml, 0.7~5ng/ml, 1~10ng/ml, 1~9ng/ml, 1~8ng/ml, 1~7ng/ml, 1~6ng/ml 또는 1~5ng/ml 일 수 있다.

상기 ROCK(Rho-associated protein kinase) 억제제는 Rho 키나제(ROCK)를 타겟으로 하여그 기능을 억제시키거나 저하시킬 수 있는 화합물을 의미한다. 여기서, Rho키나제는 세린-트레오닌 키나제의 AGC패밀리(PKA/PKG/PKC)에 속하는 키나제이다. 상기 Rho 키나제는 사이토스켈레톤에 작용함으로써 세포의 운동 및 형태를 제어하는 과정에 관련되어 있다. 구체적으로는 상기 Rho 키나제는 세포의 이동 및 액틴 조직화의 조절인자로 작용할 수 있다. 상기 Rho 키나제는 당뇨병, 출혈성 뇌혈관질환, 파킨스씨 병 같은 신경변성 질환에 관련되어 있고, 상기 Rho 키나제 억제제 가 상기 Rho 키나제관련 질병들에 대한 치료 및 억제를 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), RKI-1447 및 Y27632으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다. 상기 파수딜은 ROCK 억제제의 하나로서, 뇌혈관경련 치료를 위해 사용될 수 있으며 폐고혈압 치료에도 효과를 나타낼 수 있다. 상기 리파수딜은 상기 파수딜의 유도체로서 ROCK 억제제로 작용할 수 있으며 녹내장 또는 고안압증 치료에도 사용될 수 있다. 상기 RKI-1447은 ROCK1과 ROCK2를 억제할 수 있다. 상기 Y27632은 세포를 통과하여 효소의 촉매부위 결합을 위해 ATP와 경쟁함으로써 ROCK1과 ROCK2를 억제할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 ROCK 억제제는 3~30μm, 3~27μm, 3~24μm, 3~21μm, 4~20μm, 4~30μm, 4~27μm, 4~24μm, 4~21μm, 4~20μm, 5~30μm, 5~27μm, 5~24μm, 5~21μm 또는 5~20μm일 수 있다.

본 발명에 따른 단기 배양에서 사용되는 상기 배양플레이트는 세포 접착을 막아주는 표면을 가질 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 혈중순환 암세포는 부유상태에서 배양을 시킬 수 있으므로 상기 배양플레이트의 표면이 세포 접착을 막아주도록 코팅이 될 수 있다. 상기 배양플레이트의 표면 코팅은 히드로겔로 이루어질 수 있다. 상기 히드로겔은 물을 분산매로 하는 겔을 의미하며, 히드로졸이 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창하거나 하여 형성된다. 구체적으로 보면, 상기 히드로겔은 공유 결합, 수소결합, 반데르발스 결합 또는 물리적 결합 등과 같은 응집력에 의해 가교된 친수성 고분자로서, 수용액상에서 다량의 물을 내부에 함유하여 팽윤할 수 있는 3차원 고분자 네트워크 구조를 갖는 물질이다. 이렇게 물을 흡수한 상태에서는 생체의 조직과 비슷한 거동을 보인다. 상기 히드로겔은 온도, pH 등으로 상전이를 하여 팽창비가 불연속적으로 변화할수 있으며 콘텍트 렌즈, 의료용 전극, 세포 배양에 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 히드로겔은 상기 배양플레이트에 공유결합으로 코팅되어 혈중 순환 종양세포가 배양플레이트 표면에 접착되는 것을 막아줄 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 상기 히드로겔은 중성전하를 가지면서 친수성을 가질 수 있다. 상기 중성전하를 가진다는 것은 전하가 플러스도 아니고 마이너스도 아닌 상태를 가진다는 것을 의미하며, 상기 친수성이란, 물에 대한 강한 친화력을 말하는 것으로서 물에 잘 용해될 수 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 실시예에서, 상기 단기 배양하는 단계는 배양을 시작하는 시점부터 1내지15일동안 이루어질 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서는 5내지 15일일수 있으며 바람직하게는 10 내지 15일일 수 있다. 보다 더 바람직하게는 12내지 15일일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 상기 방법으로 진단되는 ALK 유전자 변이 진단방법을 이용하여 환자의 시료로부터 ALK 유전자 변이 여부를 판단할 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 기재한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아님을 명시한다.

실시예 1. 사이즈 선택성을 가지는 칩 제작 단계

실험에서 사용되는 사이즈 선택성을 가지는 칩은 기공의 크기(pore-size)가 5.5~8.5μm로 형성되어 있어, 상기 5.5μm보다 작은 크기의 백혈구(WBC; white blood cell) 및 적혈구(RBC; red blood cell)는 칩을 통과시켜 제거하고, 5.5μm보다 큰 사이즈의 암 세포는 칩 상에 걸리게 만들어 특정 사이즈를 선택적으로 회수할 수 있도록 고안한 마이크로 칩이다.

참고로, 사이즈 선택성을 가지는 칩의 세포 회수율을 확인하기 위해, 암 환자의 암세포를 10개, 100개, 1000개로 스파이킹(spiking)하여, 이를 칩으로 통과시켜 칩 상의 암세포의 회수율을 보는 실험을 수행하였다. 이의 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

시료	스파이킹 세포 수	회수 된 세포 수	세포 회수율(%)
1	10	9	90
2	100	86	86
3	1000	850	85

칩의 세포 회수율을 계산한 결과, 약 80% 이상의 높은 세포 회수율을 보였으며, 회수된 세포들이 암세포 임을 다시 한번 확인하기 위해, 기존에 암 검정에서 사용되고 있는 CK 항체를 염색하여 확인한 결과, 모두 CK 양성으로 암 세포임을 확인하였다.

실시예 2. 혈중 순환 종양세포 준비 단계

<폐암 환자의 혈액으로부터 혈중 순환 종양세포의 분리 방법(S10)>

1. 폐암 환자의 말초혈액을 추출하여 혈액 추출용 ACDA(acid citrate dextrose solution 'A') 튜브에 담는다.

2. 말초혈액과 동일 볼륨의 피콜(ficoll) 용액을 새로운 튜브에 담고, PBS(phosphate buffered saline, 인산완충식염수)로 희석시킨 말초혈액을 피콜 용액 층 위로 조심스럽게 옮긴다.

3. 400xg의 스피드로 상온에서 30분간 원심분리 한다.

4. 원심분리 후, 형성된 말초혈액 단핵세포 층을 새로운 튜브로 옮겨 담고, 제 3 버퍼(buffer)를 이용해 희석시킨다.

5. 사이즈 선택성을 가지는 칩을 고정대에 고정시킨 후, 제 4 버퍼를 이용하여 칩을 미리 적셔 놓는다.

6. 위 실험방법 5에서, 제 3 버퍼로 희석된 말초혈액 단핵세포를 칩으로 통과시킨다.

7. 세포의 회수율을 높이기 위해, 튜브에 남아있는 세포들을 제 3 버퍼로 헹군 후, 칩으로 통과시키는 과정을 반복 수행한다.

8. 칩으로부터 세포를 회수한다.

실시예 3. 분리된 혈중 순환 종양세포의 단기 배양(S11)

본 발명에 따른 사이즈 선택성 칩에 의해 분리된 혈중순환 종양세포를 중성전하를가지면서 친수성을 띄는 히드로겔로 코팅된 Ultra low attachment 배양플레이트에 seeding을 했다. 상기 배양플레이트는 11ng/ml 인슐린, 22ng/ml 트랜스페린, 2ng/ml EGF 및 8μm ROCK 억제제를 포함하고 있는 배양액이 들어 있으며 상기 단기 배양은 배양한 시점부터 14일동안 세포 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5~10% CO2 조건하에서 배양을 실시했다.

실시예 4. 혈중 순환 종양세포의 확인 단계

단기 배양된 혈중 순환 종양세포는 염색 방법을 통해 암 세포임을 확인하기 위하여, 하기 방법을 이용하여 세포 염색과정을 수행한다.

1. 세포 원심분리법인 싸이토스핀(cytospin) 과정을 수행하여 회수된 세포들을 염색용 슬라이드에 고정시킨다.

2. 항체가 세포 내부로 들어갈 수 있도록 투과(permeabilization)과정을 수행한다.

3. PBS로 워싱(washing) 과정을 수행한다.

4. PBS를 이용하여 1% BSA(bovine serum albumin)를 만들고, 비특이적 반응(non-specific binding)과 내인성 퍼옥시다제 활성(endogenous peroxidase activity)를 줄이기 위해 블러킹(blocking) 과정을 수행한다.

5. 1차 항체로 EpCAM(epithelial cell adhesion molecule), CK(cytokeratin) 및 CD(cluster of differentiation) 45를 상온에서 60분간 반응시킨다.

6. 상기 1차 항체에 결합하는 형광표지된 2차 항체를 상온에서 60분간 반응시킨다.

7. PBS로 워싱 과정을 수행한다.

8. 최종적으로 세포 핵을 염색하기 위해, DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole) solution을 넣은 후 커버글라스를 덮고 상온에서 10분간 반응시킨다.

9. 염색된 세포들을 관찰하면서, 염색된 비율 및 회수율을 매뉴얼로 계산한다.

실시예 5. 폐암 환자의 혈중 순환 종양세포를 이용한 ALK -FISH 분석 단계(S12)

ALK-FISH 분석 방법은 조직마이크로어레이(TMA; tissue microarray)를 이용한 테스트 세트에서 모든 케이스를 대상으로 시행되었고, 밸리데이션(validation) 세트에서 면역조직화학(IHC; immunohistochemistry)을 통해 조직검사 블록에서 ALK 양성을 확인하였다.

1. 혈중 순환 세포는 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 슬라이드에 고정시킨다.

2. ALK 유전자 변이 확인용 듀얼-프로브 혼성화(dual-probe hybridization)는 LSI ALK 듀얼 컬러 프로브를 사용한다. 상기 프로브는 밴드 2p23을 스펙트럼레드와 스펙트럼그린을 가지고 ALK 유전자 브레이크포인트(break point)에서 혼성화 시킨다.

3. 프로브 혼합 후, 프로테아제를 처리하고, 프로브와 타켓 DNA를 변성시키기 위해, 습한 분위기(humidified atmosphere) 하에서, 75℃에서 5분 동안 인큐베이션 시키고, 순차적으로 혼성화를 가능하게 하기 위해 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션 시킨다.

4. 혈중 순환 종양세포를 세척하기 위해 0.3% NP-40/2X 살린 구연산나트륨(saline sodium citrate)에 담근다.

5. 핵의 대조염색(counterstaining)을 위해, DAPI와 anti-fade(p-phenylenediamine)화합물을 사용하고, 각 프로브의 신호는 유침물체(oil immersion objective)와 트리플-패스 필터(triple-pass filter)가 탑재된 현미경 하에서 평가한다.

실시예 6. 폐암 환자의 조직을 이용한 ALK 유전자 변이 분석 단계

1. 폐암 환자의 조직을 바이옵시(biopsy)한 후, 포르말린으로 고정시킨다.

2. 고정된 조직을 파라핀(paraffin)으로 포매하여 블록을 만들고, 3μm 두께로 섹션(section)한다.

3. 섹션하여 만들어진 조직 슬라이드를 60℃에서 1시간 동안 건조시키고, EZ 프렙(EZ Prep)을 이용하여 75℃에서 4분 동안 탈파라핀시킨다.

4. 조직 슬라이드는 탈수 후, 0.2N HCl에 담가 세척하고, 조직 슬라이드를 0.01M 구연산염(citrate) 버퍼에 담아 전자레인지에서 5분 동안 끓인다.

5. 80℃에서 30분간 전처리 시약(pretreatment reagent)을 처리한 후, 프로테아제 버퍼와 프로테아제를 섞어 반응시킨다.

6. 듀얼-프로브 혼성화는 LSI ALK 듀얼 컬러 프로브를 사용하여, ALK 유전자 브레이크포인트(break point)에서 혼성화시킨다.

7. 프로브 혼합 후, 프로테아제를 처리하고, 프로브와 타켓 DNA를 변성시키기 위해, 습한 분위기하에서, 75℃에서 5분 동안 인큐베이션 시키고, 순차적으로 혼성화를 가능하게 하기 위해 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션 시킨다.

8. 조직 슬라이드를 세척하기 위해 0.3% NP-40/2X 살린 구연산나트륨에 담근다.

9. 핵의 대조염색을 위해, DAPI와 anti-fade 화합물을 사용하고, 각 프로브의 신호는 유침물체와 트리플-패스필터가 탑재된 현미경 하에서 평가한다.

실험예 1. 혈중 순환 종양세포 확인 실험

상기 실시예 2 및 실시예 3과 동일한 조건 및 방법을 이용하여, 폐암 환자의 혈중 순환 종양세포를 분리하고 단기배양한 후, 세포 염색을 수행하였다. 혈액으로부터 분리된 혈중 순환 종양세포가 암 세포임을 확인하기 위해, 기존의 암 검정에서 사용되고 있는 EpCAM과 CK 항체를 이용하여 세포를 염색하였다.

도 2를 참조하여 보면, 혈중 순환 종양세포는 DAPI +/EpCAM+/CD45- 세포 또는 DAPI+/EpCAM+/CK+/CD45- 세포인 것을 확인하였다. 핵의 대조염색(counterstaining)을 위해 DAPI를 사용하였고, CD45는 백혈구 공통 항원으로 CD45 양성을 제외함으로써 순환 종양세포와 구별하기 위해 사용되었다. EpCAM은 상피세포결합분자로 상피성종양로부터 유래된 혈중 순환 종양세포를 선택하기 위해 사용되었으며, CK는 특이적 종양세포의 마커로 혈중 순환 종양세포를 선택하기 위해 사용되었다. 백혈구, PC9(비소세포 폐암 세포주)및 KG-1(급성 골수구성 백혈병 세포주)은 각각 CD45, EpCAM 및 CD45에 양성을 가지는 양성 대조군(positive control)로 사용되었다.

실험예 2. 혈중 순환 종양세포의 ALK-FISH 분석 실험

상기 실시예 2및 실시예 4와 동일한 조건 및 방법을 이용하여, 폐암 환자 23명의 혈중 순환 종양세포를 분리한 후, ALK-FISH 분석법을 통해 ALK 유전자 변이를 분석하였다.

비교예 1. 배양액에 따른 혈중순환 암세포의 배양된 세포수 변화

일반적으로 세포 배양에 사용되는 세포 배양액과 본 발명에 따른 배양액에서 혈중순환 암세포의 분열 및 성장 정도를 비교실험하였다. 일반적으로 세포 배양에 사용되는 배양액은 25 nM sodium selenite, 50 nM Hydrocortisone, 0.01 mM ethanolamine, 0.01 mM phosphorylethanolamine, 100 pM triiodothyronine, 0.5% (w/v) bovine serum albumin, 10 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, 4.5mM L-glutamine 및 1X antibiotic-antimycotic 을 포함하고 있으며, 본 발명의 따른 배양액은 상기 실시예3과 동일하다. 또한 배양 조건은 일반적인 플레이트를 이용한 점을 제외하고는 실시예3과 동일하다.

도5를 보면, CD45-는 배양되는 혈중순환 암세포에 대한 바이오마커이며, Normal growth media는 일반적인 세포 배양액, CG growth media는 본 발명에 따른 배양액을 의미한다. 도5는 본 발명에 따른 배양액에서 혈중순환 암세포가 더 많이 배양된 것을 나타내며 이는 본 발명에 따른 배양액이 일반적인 배양액보다 혈중순환 암세포의 분열 및 배양에 있어서 더 효과적이라는 것을 알 수 있다.

비교예 2. 히드로겔이 코팅된 배양플레이트에서 배양액에 따른 혈중순환 암세포의 배양된 세포수 변화

본 발명에 따른 배양액이 사용된 상황에서, 혈중 순환 종양세포의 세포 성장 및 분열에 대한 히드로겔 코팅된 배양플레이트 효과를 측정하기 위해 일반적인 배양플레이트와 비교배양을 실시하였다. 본 발명에 따른 배양액은 상기 실시예3과 동일하다.

도6을 보면, Normal culture type은 일반적인 세포 배양플레이트(세포가 배양플레이트 표면이 붙음)를 나타낸 것이고, Low attachment type은 본 발명에서 사용된 히드로겔이 코팅된 배양플레이트이다. 도6은 본 발명에 따른 배양액을 이용하여 히드로겔 코팅된 배양플레이트에서 배양된 혈중순환 암세포가 더 많이 배양된 것을 나타내며 이는 히드로겔 코팅된 배양플레이트에서의 배양이 혈중순환 암세포의 분열 및 배양에 있어서 더 효과적이라는 것을 나타낸다.

비교예 2. 폐암 조직으로부터의 ALK-FISH 분석 실험

상기 실시예 5와 동일한 조건 및 방법을 이용하여, 상기 실험예 2와 동일한 폐암 환자 23명의 조직으로부터ALK 유전자 변이를 분석하였다.

23명의 폐암 환자의 조직과 혈중 순환 종양세포를 각각 분리하여, 조직에서의 ALK 유전자 변이가 혈중 순환 종양세포에서 동일하게 발현되는지를 보기 위해, 상기 실시예 2, 실시예 4 및 실시예 5와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였으며, ALK-FISH 분석법을 통해서 얻어진 형광 프로브 값을 바탕으로 결과분석을 도출하였다. 이의 결과를 하기 표 2과 도 3에 나타내었다.

시료	성별	나이	조직에서의 변이(%)	혈중 순환 종양세포에서의 FISH 신호	FISH 신호 질(quality)
1	여	35	76	58
2	여	82	42	16
3	남	59	32	3
4	여	54	48	16
5	남	70	54	15
6	남	62	28	13
7	여	76	31	149	Excellent
8	남	51	21	24
9	여	49	33	2
10	남	71	37	177	Excellent
11	남	51	23	9
12	여	32	18	53	Excellent
13	여	49	27	130	Excellent
14	여	50	24	92
15	여	51	42	4
16	여	63	34	88	Excellent
17	여	56	52	4
18	남	71	49	6
19	여	66	34	149
20	여	53	60	16
21	여	60	80	14
22	남	76	73	197	Excellent
23	남	69	Negative	261	Excellent

폐암 환자 23명을 대상으로 조직에서의 ALK 유전자 변이가 혈중 순환 종양세포에서 동일하게 발현되는지 상호 연관성을 비교한 결과, 조직에서의 ALK 유전자 변이 퍼센트(%)와 혈중 순환 종양세포에서의 ALK-FISH 신호가 상당히 일치한 유전자 변이 패턴을 보이는 것을 확인하였다.

도 3을 참조하여 보면, 두 개의 융합 신호(인접한 레드와 그린, 또는 융합된 엘로우)를 나타내는 정상적인 간기(interphase) 핵과는 달리, 종양 세포에서 세 개의 시그널이 모두 나타났다. 즉 하나의 융합 신호(native ALK)와 각각 하나의 빨간색과 녹색(break-apart)의 신호(translocated ALK)는 예전에 보고된 연구에 따라 ALK 유전자 전좌(translocation)로 해석하였다. 또한, 종양 세포에서 하나의 융합 신호(native ALK)와 함께 녹색 신호와 대응되지 않는 하나의 빨간 신호가 발견되었는데, 이들은 독립된 빨간 신호(isolatedred signal, IRS) 패턴으로 지정하였다.

실험예 3. 혈중 순환 종양세포를 이용한 ALK-FISH 분석법의 재현성 실험

폐암 환자의 혈중 순환 종양세포에서 ALK-FISH 분석법을 이용한 ALK 유전자 변이의 진단이 재현성이 있다는 것을 보여주기 위하여 재현성 실험을 수행하였다. 상기 실시예 2 및 실시예 4와 동일한 조건 및 방법을 이용하여, 폐암 환자의 혈중 순환 종양세포를 분리한 후, ALK-FISH 분석법을 통해 ALK 유전자 변이를 분석하였다.

비교예 3. 폐암 조직을 이용한 ALK-FISH 분석법의 재현성 실험

상기 실시예 5와 동일한 조건 및 방법을 이용하여, 상기 실험예 3과 동일한 폐암 환자의 조직으로부터ALK 유전자 변이를 분석하였다.

폐암 환자의 조직과 혈중 순환 종양세포를 각각 분리하여, ALK 유전자 변이의 진단이 재현성을 가지는지를 확인하기 위해, 상기 실시예 2, 실시예 4 및 실시예 5와 동일한 조건 및 방법으로 실험을 수행하였으며, ALK-FISH 분석법을 통해서 얻어진 형광 프로브 값을 바탕으로 결과분석을 도출하였다. 이의 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

시료	성별	나이	조직에서의 변이(%)	혈중 순환 종양세포에서의 FISH 신호
1	남	59	32	3147
2	여	54	48	1316
3	여	76	31	14959
4	여	66	34	14938

재현성 실험 결과, 시료 2번과 3번의 조직에서 각각 48%, 31%의 ALK 유전자 변이 패턴을 보였고, 이들 환자의 혈액으로부터 분리한 혈중 순환 종양세포를 단기 배양 한 후, ALK-FISH분석법을 수행하였을 때, 조직에서의 ALK 유전자 변이 결과와 각각 유사한 패턴을 보임으로써 재현성을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

폐암 환자의 시료에서 혈중 순환 종양세포(CTCs; circulating tumor cells)를 분리하는 단계;
상기 분리된 혈중 순환 종양세포를 단기 배양하는 단계; 및
상기 단기 배양된 혈중 순환 종양세포를 활용하여 ALK-FISH(anaplastic lymphoma kinase-fluorescence in situ hybridization) 분석법을 통해 ALK 유전자 변이를 분석하는 단계를 포함하고,
상기 시료는 혈액이며,
상기 혈중 순환 종양세포는 사이즈 선택성 칩(chip)을 이용하여 분리되는 것이고,
상기 사이즈 선택성 칩은 상기 시료의 반복 통과가 가능하며,
상기 단기 배양하는 단계에서 사용되는 배양액은 인슐린, 트랜스페린, 상피성장인자 및 ROCK(Rho Kinase) 억제제로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 3개로 이루어진 것을 특징으로 하는 것을 포함하고,
상기 ALK유전자 변이를 분석하는 단계는,
슬라이드에 상기 혈중 순환 종양세포를 고정시키는 단계;
상기 혈중 순환 종양세포를 고정시키는 단계에서 고정된 혈중 순환 종양세포에 ALK 프로브를 반응시키는 단계; 및
형광 신호를 분석하는 단계;
를 더 포함하는 ALK 유전자 변이 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 인슐린은 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 ALK 유전자 변이 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 트랜스페린은 3 내지 50ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 ALK 유전자 변이 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 상피성장인자는 0.5 내지 10ng/ml인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 ALK 유전자 변이 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 ROCK 억제제는 3 내지 30μm인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 ALK 유전자 변이 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), RKI-1447 및 Y27632으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 ALK 유전자 변이 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 단기 배양하는 단계는 혈중 순환 종양세포 접착을 막아주는 표면을 가진 배양플레이트를 사용하는 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 ALK 유전자 변이 검출방법.
제7항에 있어서,
상기 배양플레이트는 히드로겔층이 표면에 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 ALK 유전자 변이 검출방법.
제8항에 있어서,
상기 히드로겔층은 중성전하를 가지면서 친수성인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 ALK 유전자 변이 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 단기 배양하는 단계는 배양을 시작하는 시점부터 1 내지 15일동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 ALK 유전자 변이 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 사이즈 선택성 칩의 기공 크기(pore size)는 5.5 내지 8.5 μm인 것을 특징으로 하는 것을 포함하는 ALK 유전자 변이 검출방법.
폐암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 제1항에 따른 ALK 유전자 변이 검출방법을 이용하여 환자의 시료로부터 ALK 유전자 변이 여부를 판단하는 방법.