KR20170116140A - 백신 생산용 바이러스 제조 방법 - Google Patents

백신 생산용 바이러스 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20170116140A
KR20170116140A KR1020177025598A KR20177025598A KR20170116140A KR 20170116140 A KR20170116140 A KR 20170116140A KR 1020177025598 A KR1020177025598 A KR 1020177025598A KR 20177025598 A KR20177025598 A KR 20177025598A KR 20170116140 A KR20170116140 A KR 20170116140A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
virus
enterovirus
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
KR1020177025598A
Other languages
English (en)
Inventor
라만 라오
Original Assignee
다케다 백신즈 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다케다 백신즈 인코포레이티드 filed Critical 다케다 백신즈 인코포레이티드
Publication of KR20170116140A publication Critical patent/KR20170116140A/ko
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32321—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32311—Enterovirus
    • C12N2770/32361—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/32363—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 세포를 고정층 생물반응기에서 배양하는 것을 포함하는, 예컨대, 백신 생산을 위한 엔테로바이러스 A의 생산 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 생산 방법에 의해 생산된 엔테로바이러스 A뿐만 아니라, 이와 관련된 조성물, 면역원성 조성물, 및 백신이 또한 본원에서 제공된다.

Description

백신 생산용 바이러스 제조 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2015년 2월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/116,361호의 이익을 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
ASCII 텍스트 파일에 의한 서열목록 제출
ASCII 텍스트 파일에 의한 다음 제출 내용은 그 전문이 본원에 참고로 인용되어 있다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형태(CRF)(파일명: 606772001140SEQLIST.txt, 기록 날짜: 2016년 2월 12일, 사이즈: 28 KB).
기술분야
본 발명은 백신 생산용 바이러스(예컨대, 엔테로바이러스 A 바이러스) 생산 방법에 관한 것이다.
수족구 질환(hand, foot, and mouth disease, HFMD)은 인간 엔테로바이러스 A(human enterovirus A, HEV-A) 그룹의 몇몇 일원에 의해 야기된다. 그것은 일반적으로 대개 아이들에게 영향을 미치는 자가 제한 감염(self-limiting infection)이고 손, 발 및 구강의 궤양과 수포를 특징으로 한다. 그러나, 보다 심각한 질병의 형태가 폐부종 및 사망으로 이어지는 뇌수막염, 뇌염, 소아마비 같은 마비, 뇌 줄기 뇌염과 같은 신경학적 증상과 함께 발생할 수도 있다(Huang, CC 등, (1999) N Engl J Med 341: 936-942; Chang, LY 등, (1998) Lancet 352: 367-368; 및 Ooi, MH 등, (2009) BMC Infect Dis 9: 3). 1990년대 중반 이래로, 인간 엔테로바이러스 71(EV71)에 의해 야기되는 HFMD 감염은 특히 아시아-태평양 지역에서 심각한 이환율 (morbidity) 및 사망율을 초래해왔다(Solomon, T 등, (2010) Lancet Infect Dis 10(11):778-90; and McMinn, PC (2002) FEMS Microbiol Rev 26: 91-107). 중국, 베트남 및 싱가포르는 2012년 1~5월에 2011년의 동일한 기간과 비교하여 증가된 활성을 보고하였다. 수족구 질환 발병은 질병 전파를 통제하기 위한 노력으로 학교 및 보육원 폐쇄로 인하여 교육 및 경제 활동을 방해한다.
인간 엔테로바이러스 A는, 또한 폴리오바이러스 및 리노바이러스를 포함하는, 비-외피, 양성-센스 RNA 바이러스의 피코르나바이러스 과에 속한다. HFMD를 유발하는 HEV-A 그룹의 일원들은 엔테로바이러스 71(EV71)과 혈청형 A1, A4, A6, A10 및 A16을 포함한, 콕사키바이러스(Coxsackievirus)를 포함한다(Pallansch 및 Roos, (2007) Knipe DM, Howley PM, Griffin DE, editors. Fields Virology. Philadelphia, PA Lippincott Williams & Wilkins. pp. 839-894; 및 Kobayashi M 등, Jpn J Infect Dis 2013; 66:260-1). EV71 감염으로 인한 HFMD 발병은 중증 신경계 질환을 유발하는 가장 큰 경향을 가지고 있다. 시노몰구스 마카크의 실험적감염은 수십년에 걸쳐 단리된 균주가 모두 신경친화성이었을 뿐만 아니라, 폴리오바이러스보다 광범위한 조직 화성을 나타낸다는 것을 보여주었다(Nagata, N 등, (2002) J Med Virol 67: 207-216).
EV71은 4종의 캡시드 단백질(VP1-VP4) 및 7종의 비구조 단백질을 갖는다. 바이러스 RNA를 보호하는 것 이외에도, 캡시드 단백질은 숙주 세포의 표면 상의 수용체를 인식하며, 바이러스의 항원 프로필에 기여한다(Pallansch 및 Roos, (2007) Knipe DM, Howley PM, Griffin DE, editors. Fields Virology. Philadelphia, PA Lippincott Williams & Wilkins. pp. 839-894). EV71에 대한 기지의 인간 세포 표면 수용체는 스캐빈저 수용체 B2(SCARB2), 및 P-셀렉틴 당단백질 리간드 1(PSGL-1)이다(Yamayoshi, S 등, (2009) Nat Med 15:798-801; 및 Nishimura, Y 등, (2009) Nat Med 15: 794-797).
혈청 중화에 의해 엔테로바이러스를 분류하는 전형적 방법이 단일 혈청형으로서 EV71을 규정할지라도(Oberste, MS 등 (1999) J Clin Microbiol 37: 1288-1293), 현행 분자 분류 방법은 여러 유전자군이 적어도 1990년대 이후로 아시아-태평양 지역에서 순환하고 있다는 것을나타낸다(Lee, MS 등, (2012) PLoS Negl Trop Dis 6: e1737). EV71 단리주는 이전에 VP1 뉴클레오티드 서열 단독을 기준으로 하여 유전자군 A, B, 및 C, 및 하위-유전자군으로 분류되었으며(Brown, BA 등, (1999) J Virol 73: 9969-9975); VP1 유전자의 뉴클레오티드 서열 동일성은 유전자군 내에서 >92%인 반면에, 유전자군 사이에서 뉴클레오티드 서열 동일성은 78-83%이다(Solomon, T 등, (2010) Lancet Infect Dis 10(11):778-90). 그러나, 전체-게놈 서열분석으로 B4 하의 하위유전자군 B5의 재분류 및 유전자군 D의 추가가이루어졌으며; 저자는 VP1과 함께 3D 폴리머라제 서열이 전체 게놈을 보다 우수하게 나타낸다고 제안하였다(Chan, YF 등, (2009) Infect Genet Evol 10(3):404-12). 유전자군간의 및 다른 인간 엔테로바이러스 A 혈청형과의 재조합이 또한 발생한다(Yoke-Fun and AbuBakar (2006) BMC Microbiol 6: 74).
현재 EV71에 대한 특정 항바이러스 요법 또는 백신은 존재하지 않는다. 정맥내 면역글로불린은 중증 HFMD 사례에 사용되어 왔으며, 일부 치료 이익이 결과에 의해 제안되었지만 아직 임상 시험에 의해서는 입증되지 않았다(Ooi, MH 등, (2009) BMC Infect Dis 9: 3; 및 Wang, SM 등, (1999) Clin Infect Dis 29: 184-190). EV71 발병 동안의 예방적 및 제어 조치는 감시, 교육 및 보육 시설의 폐쇄, 및 환자의 격리로 제한된다.
잠재적인 백신의 생산을 위해, 바이러스 백신은 통상적으로 부착-의존성 세포주(예컨대, VERO 세포)에 의해 생산된다. 산업 규모에서, 이러한 세포는 다중-플레이트 시스템(예컨대, 세포 공장, 세포 큐브 등), 롤러 병, 또는 생물반응기의 현탁액 중의 미세담체(다공성 또는 비-다공성) 상에서 정적인 모드로 배양된다. 다중-플레이트 시스템은 부피가 커서 상당한 처리 작업을 필요로 하지만, 미세담체 배양은 수많은 작업(담체의 멸균 및 수화 등) 및 사전 배양에서부터 복잡한 작업(즉, 비드-비드 전송)이 포함된 최종 공정에 이르기 까지 다수의 단계를 필요로 한다.
다수의 다른 장관계 바이러스와 마찬가지로, 엔테로바이러스 A(예컨대, EV71 바이러스)는 완전한 세포 용해로 CPE를 생산하는 세포주(예컨대, Vero 세포)에서 생장하도록 적응되어 왔으며, 바이러스를 세포 배양액으로 방출한다. 엔테로바이러스 A(예컨대 EV71 바이러스) 바이러스 배양은 세포 당 바이러스 생산량이 더 적고 세포 용해가 빠르기 때문에 다른 바이러스보다 더 어려우며, 배양 수행 당 낮은 수율을 초래한다. 세포 용해가 매우 빠르게 발생함에 따라, 대량의 바이러스 입자를 생산하는 것은 수백 개의 롤러 병이나 세포 공장 또는 수 리터의 대규모 미세담체 배양 탱크와 같은 종래 시스템의 여러 대형 세포 배양 장치를 필요로 하는 대규모 작업이므로, 연장된 사전 배양 단계 및 복잡한 다수의 작업을 필요로 한다. 현재의 규제 환경은 재사용이 가능한 배양 방법뿐만 아니라 오염 위험이 있는 여러 단계의 무균 작업 및 전달을 피하는 것을 요구한다. 그러나, 현재 이용가능한 일회용 반응기의 대부분은 미세담체 상에 고정화된 동물 세포를 배양하는데 잘 적응되어 있지 않다.
따라서, 엔테로바이러스 A의 생산 방법, 예컨대 산업 규모에서 바이러스를 생산할 수 있는 방법을 개발할 필요가 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 특히, 본 발명의 방법은 고정층(fixed bed) 배양 시스템을 사용하여 보다 높은 비용 효율성 및 능률적인 처리로 바이러스 생산을 향상시킬 수 있다. 유리하게는, 이러한 방법은 예컨대 대규모 또는 산업 규모의 엔테로바이러스 A의 생산에 사용될 수 있으며, 이는 백신 및/또는 면역원성 조성물의 제조에 유용하다.
따라서, 본 발명의 특정 양태는 다음의 단계를 포함하는 엔테로바이러스 A 바이러스의 제조 방법을 제공한다: (a) 거대담체를 함유하는 고정층에서 부착 세포를 배양하는 단계로서, 이때 상기 세포는 제1세포 배양 배지에서 배양되는 단계; (b) 엔테로바이러스 A 바이러스가 상기 세포를 감염시키는 조건 하에 상기 세포를 엔테로바이러스 A 바이러스로 접종하는 단계; (c) 상기 감염된 세포가 엔테로바이러스 A 바이러스를 생산하는 조건 하에 상기 감염된 세포를 제2세포 배양 배지의 고정층에서 배양하는 단계; 및 (d) 상기 세포에 의해 생산된 엔테로바이러스 A 바이러스를 회수하는 단계. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 상기 세포는 포유류 세포이다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 상기 세포는 Vero 세포이다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, Vero 세포주는 WHO Vero 10-87, ATCC CCL-81, Vero 76(ATCC 수탁 번호 CRL-1587), 및 Vero C1008(ATCC 수탁 번호 CRL-1586)로부터 선택된다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 엔테로바이러스 A 바이러스는 EV71, CA6, 및 CA16으로부터 선택된다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 엔테로바이러스 A 바이러스는 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유한다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 엔테로바이러스 A 바이러스는 EV71이고, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 VP1 폴리펩타이드 돌연변이를 포함한다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 엔테로바이러스 A 바이러스는 CA6이고, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 VP1 폴리펩타이드 돌연변이, VP2 폴리펩타이드 돌연변이, VP3 폴리펩타이드 돌연변이, 및 5' 비번역 영역(UTR) 돌연변이로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 엔테로바이러스 A 바이러스는 CA16이고, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 2A 폴리펩타이드 돌연변이, VP1 폴리펩타이드 돌연변이, VP2 폴리펩타이드 돌연변이, 및 5' 비번역 영역(UTR) 돌연변이로부터 선택된 돌연변이를 포함한다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 약 4,000 세포/cm2 내지 약 16,000 세포/cm2가 거대담체를 함유하는 고정층에서 부착 세포를 배양하는 단계에서 배양되고, 이때, 상기 세포는 제1세포 배양 배지에서 배양된다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 약 5,000 세포/cm2가 거대담체를 함유하는 고정층에서 부착 세포를 배양하는 단계에서 배양되고, 이때, 상기 세포는 제1세포 배양 배지에서 배양된다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 약 100,000 세포/cm2 내지 약 800,000 세포/cm2가 엔테로바이러스 A 바이러스가 세포를 감염시키는 조건 하에 세포를 엔테로바이러스 A 바이러스로 접종시키는 단계에서 접종된다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 약 200,000 세포/cm2 내지 약 350,000 세포/cm{2가 엔테로바이러스 A 바이러스가 세포를 감염시키는 조건 하에 세포를 엔테로바이러스 A 바이러스로 접종시키는 단계에서 접종된다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 제1세포 배양 배지는 혈청을 함유한다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 제1세포 배양 배지는 10% 미만의 우태 혈청을 함유하며, 세포는 무혈청 배지에 적응되어 있지 않다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 제1세포 배양 배지는 5%의 우태 혈청을 함유한다.. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 제1세포 배양 배지 및 제2세포 배양 배지는 상이하다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포가 제1세포 배양 배지에서 배양되고 엔테로바이러스 A 바이러스가 세포를 감염시키는 조건 하에 엔테로바이러스 A 바이러스로 세포를 접종시키는, 거대담체를 함유하는 고정층에서 부착 세포를 배양하는 단계 사이에, 제1세포 배양 배지를 제거하는 단계 및 세포를 제2배양 배지로 헹구는 단계를 추가로 포함한다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 제2세포 배양 배지는 무혈청 배지이다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 세포는 약 0.025 내지 약 0.0009의 MOI로 엔테로바이러스 A 바이러스로 접종된다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 세포는 약 0.001의 MOI로 엔테로바이러스 A 바이러스로 접종된다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 거대담체를 함유하는 고정층에서 부착 세포를 배양하는 단계로서, 이때, 상기 세포는 제1세포 배양 배지에서 배양되는 단계, 엔테로바이러스 A 바이러스가 세포를 감염시키는 조건 하에서 엔테로바이러스 A 바이러스로 세포를 접종하는 단계 및, 감염된 세포가 약 0.3 mL/cm2의 부피/표면 비율로 엔테로바이러스 A를 생산하는 조건 하에 감염된 세포를 제2세포 배양 배지의 고정층에서 배양하는 단계 동안 세포가 배양 된다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 거대담체를 함유하는 고정층에서 부착 세포를 배양하는 단계로서, 이때 상기 세포는 제1세포 배양 배지에서 배양되는 단계 및/또는 엔테로바이러스 A 바이러스가 세포를 감염시키는 조건 하에 엔테로바이러스 A 바이러스로 세포를 접종하는 단계 동안의 제1세포 배양 배지 중의 젖산 농도는 약 25 mM을 초과하지 않는다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 감염된 세포가 엔테로바이러스 A 바이러스를 생산하는 조건 하에 제2세포 배양 배지의 고정층에서 감염된 세포를 배양하는 단계 동안의 제2세포 배양 배지 중의 젖산 농도는 약 25 mM을 초과하지 않는다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 거대담체를 함유하는 고정층에서 부착 세포를 배양하는 단계로서, 이때 상기 세포는 제1세포 배양 배지에서 배양되는단계 및/또는 엔테로바이러스 A 바이러스가 세포를 감염시키는 조건 하에 엔테로바이러스 A 바이러스로 세포를 접종하는 단계 동안의 제1세포 배양 배지 중의 산소 밀도(DO)는 약 50% 초과로 유지된다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 감염된 세포가 엔테로바이러스 A 바이러스를 생산하는 조건 하에 제2세포 배양 배지의 고정층에서 감염된 세포를 배양하는 단계 동안의 제2세포 배양 배지 중의 산소 밀도(DO)는 약 50% 초과로 유지된다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 고정층은 약 2 cm의 층 높이를 갖는다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 고정층은 약 10 cm의 층 높이를 갖는다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 거대담체는 미세섬유 매트릭스이다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 거대담체는 약 60% 내지 99%의 공극률을 갖는다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 공극률은 약 80 % 내지 약 90%이다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 거대담체는 약 150 cm2/cm3 내지 약 1000 cm2/cm3의 세포에 접근가능한 표면적을 갖는다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 적어도 5.0 x 107 TCID50/mL의 엔테로바이러스 A 바이러스가 세포에 의해 생산된 엔테로바이러스 A 바이러스를 회수하는 단계에서 회수된다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 상기 방법은 베타-프로피오락톤(BPL), 포르말린, 또는 바이너리 에틸렌이민(BEI) 중 하나 이상으로 엔테로바이러스 A를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 엔테로바이러스 A 바이러스는 약독화된 바이러스이다.
본 발명의 다른 양태는 임의의 상기 구현예의 변형 방법에 의해 생산된 엔테로바이러스 A 바이러스에 관한 것이다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 상기 바이러스는 하나 이상의 항원을 함유한다. 상기 임의의 구현예와 조합될 수 있는 일부 구현예에서, 상기 바이러스는 베타-프로피오락톤(BPL), 포르말린, 또는 바이너리 에틸렌이민(BEI) 중 하나 이상으로 불활성화 되었다.
본 발명의 다른 양태는 임의의 상기 구현예의 방법에 의해 생산된 엔테로바이러스 A 바이러스를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태는 임의의 상기 구현예의 방법에 의해 생산된 엔테로바이러스 A 바이러스를 함유하는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태는 임의의 상기 구현예의 방법에 의해 생산된 엔테로바이러스 A 바이러스를 함유하는 백신에 관한 것이다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 구현된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청 시 및 필요한 수수료의 납부 시에 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 NANO에서의 실험적인 세포 배양 셋업을 나타낸다. 재순환을 위해, EasyLoad 헤드(미도시)가 장착된 MasterFlex 펌프가 이 도면에 나타난 관류 모듈 대신 사용되었다.
도2A 내지 2C는 NANO 담체의 사진을 나타낸다. 담체는 다른 시간에 샘플링되었고 크리스탈 바이올렛으로 착색되었다. 도 2A는 비어있는 담체를 나타낸다. 도 2B는 3일차의 담체를 나타낸다. 도 2C는 6일차의 담체를 나타낸다.
도 3은 iCELLis NANO에 대한 모니터링 결과를 나타낸다. 측정된 파라미터는 세포 수, 글루코스 및 젖산 농도, 용존 산소(DO), pH 및 온도이다. 배지 교체를 3일차 및 6일차에 수행하였다.
도 4는 iCELLis NANO 및 대조군 Cell-Stack에서의 세포 밀도 비교를 나타낸다. iCELLis NANO의 경우, 핵 계수 방법을 사용하여 세포를 계수하였지만, Cell-Stack의 경우 트립판 블루 방법을 사용하여 트립신 처리 후 계수하였다.
도 5는 0.52 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 EV71 iCELLis NANO를 배양을 위한 실험 계획을 나타낸다.
도 6은 0.52 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 대조군 EV71 Cell-Stack 배양을 위한 실험 계획을 나타낸다.
도 7은 0.52 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 EV71 iCELLis NANO 배양에 대한 모니터링 결과를 나타낸다. 측정된 파라미터는 세포 수, 글루코스 및 젖산 농도, 용존 산소(DO), pH 및 온도이다. 배지 교체를 3일차에, 그리고 감염을 6일차에 수행하였다.
도 8은 0.52 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 대조군 EV71 Cell-Stack 배양에 대한 모니터링 결과를 나타낸다. 측정된 파라미터는 글루코스 및 젖산 농도이다. 감염을 4일차에 수행하였다.
도 9는 0.52 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 EV71 Cell-Stack 배양 세포 변성 효과 (CPE)를 나타낸다.
도 10은 0.25 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 EV71 iCELLis NANO 배양 및 대조군 Cell-Stack 배양에 대한 실험 계획을 나타낸다.
도 11은 0.25 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 EV71 iCELLis NANO 배양에 대한 모니터링 결과를 나타낸다. 측정된 파라미터는 세포 수, 글루코스 및 젖산 농도, 용존 산소(DO), pH 및 온도이다. 감염을 4일차에 수행하였다.
도 12는 0.25 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 대조군 EV71 Cell-Stack 배양에 대한 모니터링 결과를 나타낸다. 측정된 파라미터는 글루코스 및 젖산 농도이다. 감염을 4일차에 수행하였다.
도13은 Polio S2 생산을 위한 벤치마크 Cytodex 공정에 대한 실험 계획을 나타낸다.
도 14는 0.52 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 Polio S2 iCELLis NANO 배양에 대한 실험 계획을 나타낸다.
도 15는 0.52 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 대조군 Polio S2 Cell-Stack 배양에 대한 실험 계획을 나타낸다.
도 16은 0.52 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 Polio S2 iCELLis NANO 배양에 대한 모니터링 결과를 나타낸다. 측정된 파라미터는 세포 수, 글루코스 및 젖산 농도이다. 배지 교체를 3일차에 수행하였고 감염을 6일차에 수행하였다.
도 17은 0.52 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 대조군 Polio S2 Cell-Stack 배양에 대한 모니터링 결과를 나타낸다. 측정된 파라미터는 글루코스 및 젖산 농도이다. 감염을 4일차에 수행하였다.
도 18은 0.52 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 Polio S2 Cell-Stack 배양 세포 변성 효과 (CPE)를 나타낸다.
도 19는 0.25 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 Polio S2 iCELLis NANO 및 대조군 Cell-Stack 배양에 대한 실험 계획을 나타낸다.
도 20은 0.25 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 Polio S2 iCELLis NANO 배양에 대한 모니터링 결과를 나타낸다. 측정된 파라미터는 세포 수, 글루코스 및 젖산 농도, 산소 밀도 (DO), pH 및 온도이다. 감염을 4일차에 수행하였다.
도 21은 0.25 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 대조군 Polio S2 Cell-Stack 배양에 대한 모니터링 결과를 나타낸다. 측정된 파라미터는 글루코스 및 젖산 농도이다. 감염을 4일차에 수행하였다.
도 22는 0.25 E6 세포/cm2의 세포 밀도를 사용하는 Polio S2 Cell-Stack 배양 세포 변성 효과 (CPE)를 나타낸다.
도 23A는 감염 시 세포 밀도에 따른 특이적 (세포 당) EV71 생산성의 최대치를 나타낸다. 도 23B는 감염 시 세포 밀도에 따른총 (회수 부피 당) EV71 생산성의 최대치를 나타낸다. 도 23C는 세포 당 바이러스 방출 역학을 나타낸다. 도 23D는 회수 부피 당 바이러스 방출 역학을 나타낸다.
도 24는 EV71 접종 시 감소하는 세포 밀도의 평가를 나타낸다. 2개의 iCELLis NANO를, 하나는 15,000 세포/cm2로(상부 패널), 다른 하나는 3배 낮은 세포 밀도로(5,000 세포/cm2; 하부 패널) 접종하였다. 글루코스(붉은 곡선) 및 젖산(푸른 곡선)를 배양 내내 모니터링 하였다.
도 25는 T-플라스크의 최종 세포 밀도에 대한 부피/표면 비율 및 FBS 농도의 영향을 나타낸다.
도 26은 iCELLis NANO에서 EV71 최적화 공정의 개략도를 나타낸다.
도 27은 모든 iCELLis NANO 실험에서 EV71에 대해 수득된 최대 바이러스 생산성의 요약을 나타낸다.
도 28은 iCELLis500/100에서의 EV71 공정의 개략도를 나타낸다.
도 29는 EV71 iCELLis500/100을 실험적 셋업으로 수행한 것을 나타낸다.
도 30A 내지 30C는 iCELLis500/100에서의 EV71 세포 배양 파라미터를 나타낸다. 도 30A는 세포 밀도를 나타낸다. 도 30B는 용존 산소를 나타낸다(설정 점은 50%임). 도 30C는 글루코스 및 젖산 농도를 나타낸다. 도 30D 내지 30F는 대조군 iCELLis NANO에서의 EV71 세포 배양 파라미터를 나타낸다. 도 30D는 세포 밀도를 나타낸다. 도 30E는 용존 산소를 나타낸다(설정 점은 50%임). 도 30F는 글루코스 및 젖산 농도를 나타낸다.
도 31A는 iCELLis500/100에서 감염 후 EV71 바이러스의 역학적 방출을 나타낸다. 바이러스는 TCID50 방법에 따라 정량화되었다. 도 31B는 iCELLis500/100에서 감염 후 HCP의 역학적 방출을 나타낸다. HCP는 Octet 및 Signus 항 Vero-HCP 항체를 사용하여 정량화되었다. 도 31C는 iCELLis500/100에서 감염 후 및 DNA의 역학적 방출을 나타낸다. DNA는 피코-그린 방법을 사용하여 정량화되었다.
도 32는 EV71 iCELLis500/100 수행의 수율을 요약한 개략도를 나타낸다.
도 33은 무혈청(SFM, OptiPro) 또는 10% FBS(M199) 배지를 사용하는 T-플라스크에서의 EV71 감염의 개략도를 나타낸다.
도 34는 EV71 공정 개발 전략의 개략도를 나타낸다.
도 35는 iCELLis500/500에서의 EV71 공장-규모 공정의 개략도를 나타낸다.
일반 기술
본원에 설명되거나 참조되는 기술 및 절차는 당업자에 의해 종래의 방법론, 예를 들어, Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, 등 eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR : The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 등, eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan 등, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita 등, eds., J.B. Lippincott Company, 1993)에 설명된 널리 활용되는 방법론을 이용하여 일반적으로 잘 이해되고 통상 사용된다.
세포 배양
본 발명의 특정 양태는 엔테로바이러스 A 바이러스 (용어 "엔테로바이러스 A"가 본원에서 상호 교환적으로 사용될 수 있음)를 생산하는 방법에 관한 것이다. 엔테로바이러스 A를 생산하는것은, 예컨대, 정제된 바이러스, 불활성화된 바이러스, 약독화 바이러스, 재조합 바이러스, 또는 서브유닛 백신에 대한 정제된 및/또는 재조합 바이러스 단백질을 포함할 수도포함하는 백신 및/또는 면역원성 조성물에 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 엔테로바이러스 A 바이러스를 생산하기 위한 본 발명의 방법은 매트릭스를 함유하는 층에서 세포를 배양하는 단계로서, 이때 상기 세포는 1차 세포 배양 배지에서 배양되는 단계; 엔테로바이러스 A 바이러스가 세포를 감염시키는 조건 하에 엔테로바이러스 A 바이러스로 상기 세포를 접종하는 단계; 상기 감염된 세포가 엔테로바이러스 A 바이러스를 생산하는 조건 하에 제2세포 배양 배지의 고정층에서 감염된 세포를 배양하는 단계; 및 상기 세포에 의해 생산된 엔테로바이러스 A 바이러스를 회수하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 포유류 세포(예컨대, 포유류 세포주)이다. 본 발명의 적어도 하나의 바이러스의 생장을 위한 적절한 세포주는 포유동물 유래의 것이 바람직하고, 하기를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: (원숭이 신장 유래) VERO 세포, 말, 소 (예, MDBK 세포), 양 개 (예, 개 신장 유래 MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) 또는 MDCK 33016, WO97/37001에 기재된 기탁 번호 DSM ACC 2219), 고양이, 및 설치류 (예, 햄스터 세포, 예컨대 BHK21-F, HKCC 세포, 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)), 및 예를 들어, 성인, 신생아, 태아 및 배아를 포함한, 광범위한 발달 단계에서 얻을 수 있다. 특정 실시예들에서, 세포는 불멸화된다 (예, WO01/38362 및 WO02/40665에 기재된, PERC.6 세포, 및 ECACC 기탁 번호 96022940 하에 기탁됨). 바람직한 구현예에서, 포유동물 세포가 이용되고, 다음의 비-제한적인 세포 유형 중 하나 이상부터 선택 및/또는 유도될 수도 있다: 섬유아세포 세포 (예, 피부, 폐), 내피세포 (예, 대동맥, 동맥, 폐, 혈관, 피부 미세 혈관, 제대), 간세포, 각질 세포, 면역 세포 (예, T 세포, B 세포, 대식세포, NK, 수지상), 유방 세포 (예, 상피), 평활근 세포 (예, 혈관, 동맥, 관상 동맥, 자궁, 기관지, 자궁경부, 망막 주연세포), 멜라닌 세포, 신경 세포 (예, 성상세포), 전립선 세포 (예, 상피, 평활근), 신장 세포 (예, 상피, 사구체 간질, 근위 세뇨관), 골격 세포 (예, 연골 세포, 파골 세포, 골 모세포), 근육 세포 (예, 근아세포, 골격근, 평활, 기관지), 간세포, 망막아세포, 및 간질 세포. WO97/37000 및 WO97/37001는 현탁액과 무혈청 배지에서 생장할 수 있으며 바이러스의 생산과 복제에 유용한 동물 세포와 세포주의 생산을 설명한다.
일부 구현예에서, 세포는 Vero 세포주이다. 적합한 Vero 세포주의 예로는, 제한하지 않고, WHO Vero 10-87, ATCC CCL-81, Vero 76 (ATCC 수탁 번호 CRL-1587), 또는 Vero C1008 (ATCC 수탁 번호 CRL-1586)을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 부착 세포이다. 본원에 사용된 바와 같이, 부착 세포는 배양 중에 기질에 부착되거나 고정된 임의의 세포를 지칭한다.
상기 세포 유형들에 대한 배양 조건은 공지되고 다양한 공개문헌에 기술되어 있으며, 또는 대안으로는 배양 배지, 보충배지, 및 조건이, 이를테면 예를 들어, Cambrex Bioproducts(뉴저지, 러더포드)의 카탈로그와 추가 문헌에 기재된 바와 같이, 상업적으로 구입될 수 있다.
알려진 무혈청 배지는 Iscove 배지, Ultra-CHO 배지(BioWhittaker) 또는 EX-CELL (JRH Bioscience)를 포함한다. 일반적인 혈청 함유 배지는 Eagle's Basal Medium (BME) 또는 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium, MEM) (Eagle, Science, 130, 432 (1959)) 또는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM 또는 EDM)를 포함하며, 이들은 통상적으로 최대 10% 우태 혈청 또는 유사한 첨가제와 함께 사용된다. 선택적으로, 최소 필수 배지(MEM) (Eagle, Science, 130, 432 (1959)) 또는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM or EDM)는 아무런 혈청 함유 보충재 없이 사용될 수도 있다. PF-CHO (JHR Bioscience) 같은 무 단백질 배지, ProCHO 4CDM (BioWhittaker) 같은 화학적 한정 배지 또는 SMIF 7 (Gibco/BRL Life Technologies) 및 Primactone, Pepticase 또는 HyPep.TM. 같은 유사분열 촉진 펩타이드 (전부 Quest International 사) 또는 락트알부민 가수분해물 (Gibco 및 다른 제조업체)도 적절하게 선행 기술에 공지되어 있다. 식물 가수분해물에 기반한 배지 첨가제는 바이러스, 미코플라즈마 또는 미공지된 감염원에 의한 오염이 배제될 수 있다는 특별한 장점이 있다.
본 발명의 방법의 특정 양태는 세포가 배양되는 밀도에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 제1배양 배지에서 배양된 세포의 밀도 또는 절대 수는 세포 배양물이 씨딩되는, 즉, 바이러스 접종 전 세포의 밀도 또는 절대 수를 지칭할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 이론에 구속되기를 바라지 않고, 보다 낮은 밀도로 세포를 배양하는 것이 바이러스 접종 시 세포 밀도를 감소시키고, 세포 생장기를 연장시키고/시키거나 비제한적으로 접종물의 크기, 노동 시간, 사전-배양 단계에서의 발자취, 인큐베이터의 수, 및/또는 오염의 위험성을 포함한 인자를 감소시키는데 유리할 수 있는 것으로 생각된다.
일부 구현예에서, 약 4,000 세포/cm2 내지 약 16,000 세포/cm2가 배양된다. 일부 구현예에서, 임의의 이의 사이 값을 포함하여, 약 4,000 세포/cm2; 약 5,000 세포/cm2; 약 6,000 세포/cm2; 약 7,000 세포/cm2; 약 8,000 세포/cm2; 약 9,000 세포/cm2; 약 10,000 세포/cm2; 약 11,000 세포/cm2; 약 12,000 세포/cm2; 약 13,000 세포/cm2; 약 14,000 세포/cm2; 약 15,000 세포/cm2; 또는 약 16,000 세포/cm2가 배양된다. 일부 구현예에서, 접종 전의 세포 밀도는 다음의 밀도(세포/ cm2임) 중 임의의 것보다 더 낮다: 16,000; 15,500; 15,000; 14,500; 14,000; 13,500; 13,000; 12,500; 12,000; 11,500; 11,000; 10,500; 9,000; 8,500; 8,000; 7,500; 7,000; 6,500; 6,000; 5,500; 5,000; 또는 4,500. 일부 구현예에서, 접종 전의 세포 밀도는 다음의 밀도(세포/ cm2임) 중 임의의 것보다 더 크다: 4,000; 4,500; 5,000; 5,500; 6,000; 6,500; 7,000; 7,500; 8,000; 8,500; 9,000; 9,500; 10,000; 10,500; 11,000; 11,500; 12,000; 12,500; 13,000; 13,500; 14,000; 14,500; 15,000; 또는 15,500. 즉, 접종 전의 세포 밀도는 16,000; 15,500; 15,000; 14,500; 14,000; 13,500; 13,000; 12,500; 12,000; 11,500; 11,000; 10,500; 9,000; 8,500; 8,000; 7,500; 7,000; 6,500; 6,000; 5,500; 5,000; 또는 4,500의 상한 및 독립적으로 선택된 4,000; 4,500; 5,000; 5,500; 6,000; 6,500; 7,000; 7,500; 8,000; 8,500; 9,000; 9,500; 10,000; 10,500; 11,000; 11,500; 12,000; 12,500; 13,000; 13,500; 14,000; 14,500; 15,000; 또는 15,500의 하한을 갖는 임의의 밀도 범위일 수 있고, 이때, 하한은 상한보다 작다. 특정 구현예에서, 약 5,000 세포/cm2가 배양된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 엔테로바이러스 A 바이러스가 세포를 감염시키는 조건 하에 본 발명의 엔테로바이러스 A 바이러스로 접종된다. 엔테로바이러스 A가 세포를 감염시키는 조건은 당업계에 공지되어 있으며, 세포 유형, 엔테로바이러스 A 유형, 배양 배지, 온도, 세포 밀도, 바이러스 밀도 (예컨대, MOI), 세포 생장 속도, 세포 계대 수 등에 따라 달라질 수 있다. 엔테로바이러스가 세포를 감염시키는 조건의 예시적인 설명이 아래에 제공된다.
본 발명의 방법의 특정 양태는 바이러스 접종 시의 세포 밀도에 관한 것이다. 본원에 기술된 바와 같이, 이론에 구속되기를 바라지 않고, 감염 시의 세포 밀도가 바이러스 생산 (예컨대, 바이러스 생산성)에 영향을 미칠 수 있는 것으로 생각된다. 바이러스 접종 시의 최적의 세포 밀도는 특이적 (세포 당) 생산성, 부피 (회수 mL 당) 생산성, 및/또는 안정성을 증가시킬뿐만 아니라, 회수 시 배지 소모 및/또는 오염을 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 약 100,000 세포/cm2 내지 약 800,000 세포/cm2가 엔테로바이러스 A로 접종된다. 일부 구현예에서, 약 200,000 세포/cm2 내지 약 350,000 세포/cm2가 엔테로바이러스 A로 접종된다. 일부 구현예에서, 접종 시의 세포 밀도는 다음의 밀도 (세포/cm2임) 중 임의의 것보다 더 작다: 800,000; 750,000; 700,000; 650,000; 600,000; 550,000; 500,000; 450,000; 400,000; 350,000; 300,000; 250,000; 200,000; 또는 150,000. 일부 구현예에서, 접종 시의 세포 밀도는 다음의 밀도(세포/cm2임) 중 임의의 것보다 더 크다: 100,000; 150,000; 200,000; 250,000; 300,000; 350,000; 400,000; 450,000; 500,000; 550,000; 600,000; 650,000; 700,000; 또는 750,000. 즉, 접종시의 세포 밀도는 800,000; 750,000; 700,000; 650,000; 600,000; 550,000; 500,000; 450,000; 400,000; 350,000; 300,000; 250,000; 200,000; 또는 150,000의 상한 및 독립적으로 선택된 100,000; 150,000; 200,000; 250,000; 300,000; 350,000; 400,000; 450,000; 500,000; 550,000; 600,000; 650,000; 700,000; 또는 750,000의 하한을 갖는 임의의 밀도 범위일 수 있고, 이때, 하한은 상한보다 작다.
본 발명의 방법의 특정 양태는 본 발명의 세포 배양물을 접종하는데 사용되는 엔테로바이러스의 MOI에 관한 것이다. 본원에서 사용된 MOI는 당업계에서 허용되는 의미, 즉, 바이러스 표적 (예컨대, 본 발명의 세포)에 대한 바이러스 제제 (예컨대, 엔테로바이러스 A 바이러스)의 공지되거나 예측된 비율과 일치한다. MOI는 적어도 하나의 바이러스에 감염된 배양물 내의 세포의 백분율에 영향을 미치는 것으로 당업계에 공지되어 있다. MOI가 보다 높으면 바이러스 생산성이 증가할 수 있지만, 특정 범위의 MOI 감염률은 포화될 수 있으며, 역치 또는 원하는 감염율에 도달한 후 MOI를 감소시키면 해당 바이러스의 종자 은행의 부피와 비용이 낮아질 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 약 0.025 내지 약 0.0009 사이의 MOI로 엔테로바이러스 A 바이러스로 접종된다. 일부 구현예에서, MOI는 다음의 MOI 중 임의의 것보다 더 낮다: 0.025, 0.022, 0.020, 0.018, 0.015, 0.012, 0.010, 0.008, 0.005, 0.002, 또는 0.0010. 일부 구현예에서, MOI는 다음의 MOI 중 임의의 것보다 더 크다: 0.0009, 0.0010, 0.002, 0.005, 0.008, 0.010, 0.012, 0.015, 0.018, 0.020, 또는 0.022. 즉, MOI는 0.025, 0.022, 0.020, 0.018, 0.015, 0.012, 0.010, 0.008, 0.005, 0.002, 또는 0.0010의 상한 및 독립적으로 선택된 0.0009, 0.0010, 0.002, 0.005, 0.008, 0.010, 0.012, 0.015, 0.018, 0.020, 또는 0.022의 하한을 갖는 임의의 MOI 범위일 수 있으며, 이때, 하한은 상한보다 작다. 특정 구현예에서, 세포는 약 0.001의 MOI로 엔테로바이러스 A 바이러스로 접종된다.
감염 시, 본 발명의 감염된 세포는 제2세포 배양 배지에서 (예컨대, 본 발명의 고정층에서) 배양될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 배양된 세포는 바이러스 접종 전에 제1배양 배지에서 배양되고 바이러스 접종 시 및/또는 접종 후 제2배양 배지에서 배양될 수 있다. 예컨대, 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 제1세포 배양 배지에서 배양될 수 있고, 이어서 제1세포 배양 배지가 제거될 수 있고, 상기 세포는 선택적으로 헹구어질 수 있고 (예컨대, PBS와 같은 수성 완충 용액을 사용하여), 제2 배양 배지가 상기 세포에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 제2배양 배지는 세포를 접종하기 위한 엔테로바이러스 A 바이러스를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1배양 배지 및 제2배양 배지는 동일한 배양 배지이다(예컨대, 동일한 조성을 가지며, 일부 구현예에서는 반드시 동일한 물리적 배지는 아님). 다른 구현예에서, 제1배양 배지 및 제2배양 배지는 상이하다(예컨대, 상이한 조성을 가짐).
일부 구현예에서, 제1세포 배양 배지는 혈청(예컨대, 우태 혈청)을 함유한다. 배양된 세포의 생장에 적절한 임의의 유형의 혈청이 사용될 수 있다. 당업계의 혈청의 예로는 비제한적으로 우태 혈청, 소태아 혈청, 말 혈청, 염소 혈청, 토끼 혈청, 랫트 혈청, 마우스 혈청, 및 인간 혈청을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1세포 배양 배지는 10% 미만의 혈청 (예컨대, 우태 혈청)을 함유하고, 세포는 무혈청 배지에 적응되어 있지 않다. 특정 구현예에서, 제1세포 배양 배지는 5%의 혈청 (예컨대, 우태 혈청)을 함유한다.
일부 구현예에서, 제2배양 배지는 무혈청 배지이다. 일부 구현예에서, 제2배양 배지는 무 단백질 배지이다. 배지 (예컨대, 본 발명의 배양 배지)는 인간 또는 동물 기원의 혈청의 첨가물이 없는, 본 발명의 맥락에서 무혈청 배지라고 한다. 무 단백질은 세포의 증식이 단백질, 생장 인자, 다른 단백질 첨가제 및 무혈청 단백질의 배제 하에 발생하는 배양을 의미하는 것으로 이해되지만, 선택적으로 바이러스 생장을 위해 필요할 수도 있는 트립신 또는 기타 프로테아제 같은 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 배양에서 생장하는 세포는 자연적으로 단백질 자체를 함유한다.
바이러스 접종물과 바이러스 배양액에는 바람직하게는 단순 헤르페스 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 3, SARS 코로나바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, 레오바이러스, 폴리오마바이러스, 버나바이러스, 써코바이러스, 및/또는 파보바이러스가 없다 (즉, 이들에 의한 오염에 대해 테스트되고 부정적인 결과가 주어졌을 것임) [WO2006/027698].
세포 배양 및 세포 배양 배지의 다른 파라미터가 또한 바이러스 생산에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 세포는 원하는 부피/표면 비율로 본 발명의 제1 및/또는 제2배양 배지에서 배양될 수 있다. 이론에 구속되기를 바라지 않고, 세포가 배양되는 부피/표면 비율은 파라미터, 예컨대 세포 생산성, 세포 크기, 생장 속도, 및/또는 배양 배지 내의 영양소 및 다른 구성성분에 대한 접근에 영향을 미칠 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 약 0.3 mL/cm2의 부피/표면 비율로 (예컨대, 바이러스 접종 전, 접종 중, 및/또는 접종 후에) 배양된다.
일부 조건 하에서, 본 발명의 세포는 배양 중에 젖산을 생산할 수 있다. 당업계에서 배양 중인 세포가 당분해성 또는 혐기성 유형 대사의 결과로서 젖산을 생산할 수 있음이 알려져 있다. 이론에 구속되기를 바라지 않고, 세포 배양 배지 중의 과량의 젖산은 예컨대, 배양 배지의 pH를 감소시킴으로써 세포 생장, 대사, 및/또는 바이러스 생산성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 배양된 세포에 의한 과량의 젖산 생산은 바이러스 생산 및/또는 생장에 바람직하지 않을 수 있는 세포 대사 상태를 나타낼 수 있다. 일부 구현예에서, 제1세포 배양 배지 및/또는 제2세포 배양 배지 중의 젖산 농도는 약 25 mM을 초과하지 않는다. 세포 배양 배지 중의 젖산 농도를 측정하는 방법이 당업계에 공지되어 있고, 비제한적으로 락토미터, 젖산 효소 검정 (예컨대, 젖산 탈수소효소 및 비색법 또는 형광 분석 검출 시약 사용에 의해), 미세 투석 샘플링 장치 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 감염된 세포는 감염된 세포가 엔테로바이러스 A 바이러스를 생산하는 제2세포 배양 배지에서 (예컨대, 본 발명의 고정층에서) 배양될 수 있다. 감염된 세포가 엔테로바이러스 A를 생산하는 조건이 당업계에 공지되어 있으며, 세포 유형, 엔테로바이러스 A 유형, 배양 배지, 온도, 세포 밀도, 바이러스 밀도 (예컨대, MOI), 세포 생장 속도, 세포 계대 수 등에 따라 달라질 수 있다. 엔테로바이러스가 세포를 감염시키는 조건의 예시적인 설명이 아래에 제공된다.
본원에 기술된 방법의 다른 양태는 세포 배양 배지 중의 산소 밀도 (DO)에 관한 것이다. 세포 배양 배지에서 적절한 산소 수준을 유지하는 것은 세포 호흡에 산소를 제공함으로써 세포 생장 및/또는 바이러스 생산성을 촉진시킬 수 있다. 추가로, 세포 배양에서 세포에 의한 산소 이용은 이들의 건강, 생장 및/또는 대사 상태를 반영할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1세포 배양 배지 및/또는 제2 세포 배양 배지 중의 산소 밀도는 약 50% 초과로 유지된다. 세포 배양 배지 중의 DO를 유지하는 방법 및/또는 측정하는 방법이 당업계에 공지되어 있으며, 비제한적으로 자동 산소 주입, 세포 배양 배지를 산소에 노출시키는 것 (바람직하게는, 오염 위험을 최소화하면서), 산소 제어기 사용, 산소 센서 사용을 포함할 수 있다.
당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 본 발명의 방법에 의해 생산된 감염성 바이러스의 역가를 측정할 수 있다. 이러한 방법은 비제한적으로 끝점 희석 분석 (예컨대, TCID50 값을 결정하기 위한 것), 단백질 분석, 정량적 투과 전자 현미경 (TEM), 플라크 분석, 포커스 형성 분석 (FFA) 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 역가는 TCID50/mL로 측정된다. 일부 구현예에서, 적어도 5.0 x 107 TCID50/mL의 엔테로바이러스 A 바이러스가 회수된다.
세포 배양 장치
본 발명의 특정 양태는 고정층에서 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 예시적인 세포 배양 장치가 US8597939, US8137959, US PG Pub 2008/0248552, 및 WO2014093444에서 참조되며 상업적으로 이용가능하다 (예컨대, 뉴욕 포트 워싱턴, Pall® Life Sciences의 iCELLis® Bioreactors, 예컨대 Nano 및 500/100 생물반응기).
일부 구현예에서, 세포는 고정층 생물반응기에서 배양된다. 고정층 생물반응기는 세포 부착 및 생장을 촉진하기 위한 고정 또는 패킹 층을 형성하는 고정 패킹 물질 형태의 담체를 포함한다. 고정층의 패킹 물질의 배열은 국소적인 흐름, 열, 및 물질 수송에 영향을 미치며, 통상적으로 주어진 공간에서 세포 배양을 최대화하기 위해 매우 조밀하다. 일 구현예에서, 반응기는 세포 부착 및 생장을 촉진시키기 위한 패킹 물질 (예컨대, 섬유, 비드, 구형 등)로 이루어진 패킹되거나 고정된 층을 갖는 내부를 형성하는 벽을 포함한다. 이러한 물질은 반응기의 내부 구획에 위치해있으며, 구획은 중공의 수직 연장 튜브의 상부를 포함할 수 있다. 고정층을 적어도 부분적으로 형성하는 구획의 물질로 또는 이로부터 유체를 운반하기 위해 반응기 내부에 제2구획이 제공된다. 전형적으로, 패킹 물질은 세포 생장을 위한 표면적을 최대화하도록 배열되어야 하며, 1,000 평방 미터가 유리한 양의 표면적으로 간주된다 (예컨대, 의료용 폴리에스터 미세섬유를 패킹 물질로서 사용하여 달성될 수 있음). 일 구현예에서, 내장된 자기 구동 임펠러에 의해 고르게 분산된 배지 순환이 달성되어 낮은 전단 스트레스 및 높은 세포 생존능이 보장된다. 세포 배양 배지는 고정층을 통해 바닥에서 상부로 흐른다. 상부에서, 배지는 생물반응기에서 높은 KLa.를 유지하기 위해 O2를 차지하는 외벽 아래로 얇은 막을 따라 떨어진다. 온화한 교반 및 바이오매스 고정화와 함께, 이러한 폭포 산소화는 생물반응기가 높은 세포 밀도를 달성하고 유지할 수 있도록 한다. 일부 구현예에서, 고정층은 약 2 cm의 층 높이를 갖는다. 다른 구현예에서, 고정층은 약 10 cm의 층 높이를 갖는다.
일부 구현예에서, 고정층은 거대담체 (예컨대, 매트릭스)를 함유한다. 일부 구현예에서, 거대담체는 섬유 매트릭스이다. 일부 구현예에서, 거대담체는 탄소 섬유 매트릭스이다. 거대담체는 직조되거나 직조되지 않은 미세섬유, 폴리에스터 미세 섬유 (예컨대, 의료용 폴리에스터 미세섬유) 다공성 탄소 및 키토산 매트릭스로부터 선택될 수 있다. 미세섬유는 선택적으로 PET 또는 임의의 다른 중합체 또는 생물중합체로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 거대담체는 비드를 포함한다. 중합체는 필요한 경우 세포 배양과 양립할 수 있도록 처리될 수 있다.
적절한 거대담체, 매트릭스 또는 "운반 물질"은 광물 담체 예컨대 실리케이트, 칼슘 포스페이트, 유기 화합물 예컨대 다공성 탄소, 천연 산물 예컨대 키토산, 중합체 또는 세포 생장과 양립할 수 있는 생물 중합체이다. 매트릭스는 규칙적이거나 불규칙한 구조를 갖는 비드 형태를 가질 수 있거나, 중합체 또는 세포 생장과 양립할 수 있는 임의의 다른 물질의 직조된 또는 비직조된 미세섬유를 포함할 수 있다. 패킹은 또한 기공 또는 채널이 있는 단일 부품으로서 제공될 수 있다. 수용기 (recipient)내의 패킹은 다양한 형태 및 치수를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 매트릭스는 고체 또는 다공성 구형, 과립, 다각형의 미립자 물질이다. 이는 세포에 손상을 줄 수 있고 기체 및/또는 배지의 순환에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 전형적으로, 충분한 양의 매트릭스가 사용시 수용기에서 매트릭스 입자의 이동을 피하기 위해 사용된다. 대안적으로, 매트릭스는 내부 수용기 또는 수용기의 구획에 맞추어지고 적절한 다공성 및 표면을 갖는 요소로 구성된다. 이의 예는 Cinvention (독일)에 의해 제조된 탄소 매트릭스 (Carboscale)이다. 일부 구현예에서, 섬유 매트릭스는 약 150 cm2/cm3 내지 약 1000 cm2/cm3의 세포가 접근가능한 표면적을 갖는다.
일부 구현예에서, 거대담체 (예컨대, 섬유 매트릭스)는 약 60 내지 99%의 다공성을 갖는다. 일부 구현예에서, 거대담체 (예컨대, 섬유 매트릭스)는 약 80 내지 90%의 다공성을 갖는다. 선택적으로, 패킹은 50% 내지 98% 범위로 다공성 P를 가질 수 있다. 용어 다공성 P는 주어진 물질의 부피에 존재하는 공기의 부피이며, 주어진 물질의 부피의 백분율로서 표현된다. 다공성은 다음의 수학식을 사용하여 다공성 물질의 부피 당 중량 Wx를 측정함으로써 측정될 수 있다:
P = 100 - (1-Wx Wspec)
상기 식에서, Wspec은 물질의 특정 중량이다. 다공성 물질은 다공성 물질의 하나의 고체 단위일 수 있거나 알갱이, 칩, 비드, 섬유 또는 섬유 응집체와 같은 복수의 개별적인 단위일 수 있다.
일부 구현예에서, 고정층은 일회용 또는 일용성 고정층이다. 예컨대, 상업적으로 이용가능한 생물반응기 예컨대 iCELLis® Nano 및 500/100 생물반응기 Bioreactors (Pall® Life Sciences, 뉴욕, 포트 워싱턴)는 소형 생물반응기 용적에서 큰 생장 표면적을 제공하는 제거가능한, 일용성 또는 일회용 고정층이 있는 생물반응기 시스템을 포함할 수 있다. 미세담체를 사용하는 표준 교반-탱크 생물반응기에 비해, 이러한 시스템은 수동 조작, 멸균 및 미세담체의 수화 및 전처리로부터 최종 공정으로의 비드-비드 이동을 포함하는 일부 섬세하고 시간-소모적인 절차를 피한다. 본원에 기술된 바와 같이, 이러한 생물반응기는 대규모 (예컨대, 500 평방 미터)의 배양 면적에 상당한 공정을 가능케 할 수 있고 최대 1500 내지 2000 L의 유체 부피를 회수할 수 있으므로 산업적 규모의 바이러스 (예컨대, 백신 생산용) 생산에 유리하다. 본원에 예시된 바와 같이, 이러한 장치는 저 세포 접종물; 짧은 사전 배양 기간에 감염을 위한 최적의 세포 밀도 도달; 및/또는 배양물 생장기 동안 MOI, 배지 및 혈청 농도 최적화와 같은 추가 이점을 가능케 할 수 있다. 이러한 장치는, 예컨대 세포의 90% 이상이 동일한 배지 환경을 경험하도록 배양 중인 세포의 신속한 관류를 허용하도록 구성될 수 있다. 또한, 이론에 구속되기를 바라지 않고, 일회용 또는 일용성 고정층은 유선형 하류 처리가 생산성을 최대화할 수 있을뿐만 아니라 몇 개의 대규모 통상적인 배양 용기와 동등한 규모로 증가시켜도 공정 영역의 발자취를 감소시킬 수 있다. 따라서, 최소 단계 및 비용으로 유리한 생산성 및 순도가 달성될 수 있다.
일 구현예에서, 세포 배양을 위한 수용기는 내부 공간을 가지며, 이는 고리형일 수 있지만 다른 형태를 취할 수 있다. 상기 공간은 패킹을 포함한다. 수용기가 세포 배양에 사용되는 경우, 패킹은 세포 생장과 양립할 수 있어야 한다. 고리형태 구조에서, 내부 공간은 제1외측 단부 및 제2외측 단부를 갖는 외측 관형 벽과 종방향으로 연장된 종방향 벽에 의해 한정된 고리형 체적을 갖는다. 외측 관형 벽은 종방향으로 고리형 체적부의 외측 경계를 한정하고; 제1 및 제2 펴쇄부는 외측 관형 벽의 제1외측 단부 및 제2외측 단부 각각에서 고리형 체적을 한정하고 폐쇄하며; 내측 신장 벽은 외측 관형 벽의 제1외측 단부를 향한 제1외측 단부, 및 외측 관형 벽의 제2외측 단부를 향한 제2외측 단부를 갖는다. 내측 신장 벽은 외측 관형 벽 이내에 위치한다. 내측 신장 벽은 종방향으로 연장되고 고리형 체적의 내부 경계를 한정하고, 내부 경계는 외부 경계에 의해 둘러싸인다. 내측 신장 벽의 제2외측 단부는 제2폐쇄부와 일치한다. 예컨대, 외측 관형 벽은 원통형 외측 관형 요소에 의해 제공된다. 내측 신장 벽은 고체 내측 원통형 요소, 예컨대 원통형 막대에 의해 제공될 수 있다. 외측 관형 요소는 원통형 관형 요소이고, 종방향으로 평행한 중심 축을 갖는다. 내측 원통형 요소 및 외측 관형 요소는 동축으로 장착될 수 있다.
일부 구현예에서, 내측 원통형 요소의 제1외측 단부는 폐쇄부가 내측 원통형 요소 및 외측 관형 요소에 고정됨으로써 내부 원통형 요소를 결합하는 커플링 요소를 포함할 수 있으며, 기작을 구동시키기 위한 외측 관형 요소, 예컨대 생물반응기의 모터도 역시 포함할 수 있다. 제2폐쇄부는 내부 공간으로 및/또는 내부 공간으로부터 배지 및/또는 기체를 제공 및/또는 추출하기 위해 수용기를 배지 또는 기체 공급원에 연결하기에 적합한 커넥터가 제공되어 있다. 이러한 커넥터 또는 대안적으로 추가의 커넥터가 제1폐쇄부 또는 제2폐쇄부에 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 수용기를 움직이는 경우, 패킹, 특히 다공성 물질은 수용기에 대해 고정된 상대적인 위치에 놓일 수 있거나, 수용기 내에서 또는 수용기에 상대적으로 또는 경우에 따라, 수용기의 구획 내에서 움직일 수 있다. 수용기는 이의 축을 중심으로, 선택적으로 분 당 0.1 내지 25회전의 회전 속도로 회전되어야 한다.
일부 구현예에서, 내부 공간은 세포 배양 배지와 같은 배양 배지로 부분적으로 채워진다. 예컨대, 액체 수위가 적어도 내측 신장 벽과 접촉하거나 내측 신장 벽이 부분적으로 배지에 잠긴다. 액체 수위 아래에 위치한 패킹 부분이 배양 배지, 예컨대 세포 배양 배지에 의해 적셔진다. 액체 수위 위에 위치한 패킹은 내부 공간에 존재하는 기체 또는 공기와 접촉된다. 수용기가 축을 중심으로 하나의 방향으로 회전하는 경우, 예컨대 시계 방향으로 회전하는 경우, 배양 배지, 예컨대 세포 배양 배지는 반대로, 즉, 패킹에 대해 반시계 방향으로 회전한다. 배양 배지, 예컨대 세포 배양 배지는 플러그의 흐름에 따라 패킹을 완전히 통과한다. 수용기가 예컨대 시계 방향으로 회전 시, 배양 배지, 예컨대 세포 배양 배지는 플러그 흐름의 선단 가장자리에 있는 기체 또는 공기를 강제로 반시계 방향으로 이동시킨다. 배지의 트레일링 가장자리에서, 선택적으로 제한된 함몰부가 생성되어, 기체 또는 공기가 트레일링 가장자리를 향해 흡입되게 한다. 이와 같이, 배지 및 기체 또는 공기가 패킹을 완전히 통과한다.
일부 구현예에서, 대안적인 수용기의 내측 신장 벽이 원통형 관형 요소에 의해 제공될 수 있다. 외측 관형 벽이 외측 관형 요소에 의해 제공된다. 내측 신장 벽은 신장 원통형 관형 요소에 의해 제공된다. 외측 관형 요소 및 신장 원통형 관형 요소는 2개의 제거가능한 폐쇄부에 고정된다. 제1폐쇄부에는 종방향으로 축을 따라 수용기를 회전시키기 위한 구동 수단에 수용기를 연결시키기 위한 커플링 요소가 구비되어 있다. 제1폐쇄부는 내부 공간을 가요성 튜브와 같은 도관에 연결기시키 위한 커넥터를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 외측 관형 요소는 예컨대 110 mm의 길이 L 및 예컨대 135 mm의 내부 직경 Do를 갖는 유리 튜브일 수 있다. 내측 신장 요소는 예컨대 88.9 mm의 외부 직경 Di를 갖는 폴리비닐리덴플루오라이드 (PVDF)일 수 있다. 내측 신장 요소의 외측 단부, 즉 내측 신장 벽은 폐쇄부와 만난다. 폐쇄부는 실리콘을 사용하여 내측 및 외측 요소에 부착될 수 있는 스테인리스 스틸 또는 PVDF 고리형 디스크일 수 있다. 커넥터가 구비될 수 있는 제1폐쇄부는 예컨대 약 35 mm의 외부 직경 Dee를 갖는 커플링 요소를 갖는다. 내부 공간은 적어도 부분적으로 패킹으로 채워져 있다.
일부 구현예에서, 수용기는 2개의 구획 내의 내부 공간을 분할하는 2개의 유체 투과성 분배기를 추가로 포함한다. 유체 투과성 분배기는 내측 신장 벽으로부터 외측 관형 벽까지 연장되고, 관 축 방향에 평행한 종방향으로 제1폐쇄부에서 제2폐쇄부까지 연장된다. 하나의 구획은 패킹이 구비되어 있다. 하나의 구획은 패킹이 구비되어 있지 않다. 유체 투과성 분배기는 다공성 분배기를 제공하기 위한 다공성 물질의 사용에 의한 것과 같이 기공이 구비되어 있거나, 어떠한 경우에서든 액체, 즉 배양 배지 및 기체의 통과를 허용하는 구멍이 구비되어 있다. 그러나 분배기에는 패킹이 분배기의 한쪽에서 다른 쪽까지 통과하지 못하도록 하는 충분히 작은 기공 또는 구멍이 제공된다.
일부 구현예에서, 외측 관형 벽은 단면이 원의 형상을 갖는, 종방향으로 수직인 평면을 따라 방사상 단면을 갖는 외측 관형 요소에 의해 제공된다. 내측 신장 벽은 단면이 잘려진 원 또는 환형 세그먼트의 형상을 갖는, 종 방향으로 수직인 평면을 따라 방사상 단면부를 갖는 내측 신장 요소에 의해 제공된다. 일 구현예에서, 환형 세그먼트는 환형 섹션 및 코드를 갖는다. 예컨대, 환형 세그먼트의 높이는 200 mm (Dec), 400mm (Do), 240mm (Di) 및 125mm (L)의 치수를 갖는다. 이러한 구현예에서 분배기는 환형 세그먼트의 코드와 동일한 평면상에 있다. 2개의 폐쇄부의 제2폐쇄부는 2개의 커넥터가 구비되어 있다. 제1커넥터는 외측 관형 벽 가까이에 제공된다. 제2커넥터는 내측 신장 벽 가까이에 제공된다. 수용기가 액체 표면을 갖는 배양 배지로 부분적으로만 채워져 있는 경우, 액체가 내측 신장 벽과 접촉하지 않고 내측 신장 벽으로부터 주어진 거리 상에 머무르는 위치로 수용기를 회전시킬 수 있다. 수용기가 이 위치에 있을 때, 제1커넥터는 배지를 제거하거나 패킹으로 채워지지 않은 구획으로 배지를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 기체는 커넥터를 통해 제거되거나 배지 액체 표면 위로 제공될 수 있다. 수용기를 시계방향 또는 반시계방향으로 예컨대 최대 360° 또는 그 이상의 각도로 회전시킴으로써, 배지는 2개의 분배기 중 하나, 특히 배지에 점차적으로 잠기게되는 분배기를 통해 통과한다. 패킹이 회전에 의해 배지를 점진적으로 통과하기 때문에, 배지는 패킹을 통해 천천히 흐르게 된다. 수용기의 회전으로 인해, 배지는 플러그 흐름에 따라 패킹을 완전히 통과하여 흐르게 된다. 고리형 체적 전체에 걸쳐 배지와 패킹 사이의 균일한 접촉이 발생하게 된다. 패킹의 일부가 배지를 통과하면, 배지는 패킹으로부터 점차적으로 새어나올 것이고, 따라서 수용기에서 기체가 패킹과 다시 접촉하여 패킹 전체에 걸쳐 세포가 균일하게 생장할 수 있다.
수용기의 대안적인 구현예에서, 내부 공간의 고리형 체적은 복수의 환형 섹션에 의해, 이러한 특별한 경우에는 4개의 고리형 쿼터에 의해 제공된다. 각각의 섹션은 외측 관형 벽 섹션에 의해 외측 관형 벽의 일부분을 제공한다. 각각의 섹션은 내측 신장 벽 섹션에 의해 내측 신장 벽의 일부분을 제공한다. 각각의 섹션은 2개의 방사상으로 연장된 섹션 벽을 갖는다. 이러한 섹션 벽은 액체 및 기체 불투과성이다. 각각의 섹션 벽은 인접한 섹션이 서로 결합하도록하는 장착 수단이 구비되어 있다. 제1및 제2섹션 폐쇄부는 외측 관형 벽의 제1 및 제2 외측 단부 각각에서 고리형 섹션의 체적을 한정하고 폐쇄한다. 이러한 섹션 폐쇄부는 함께 수용기의 고리형 체적의 제1 및 제2 폐쇄부 각각을 형성한다.
일부 구현예에서, 각각의 섹션은 3개의 구획 내의 각각의 고리형 섹션의 내부 공간을 분할하는 2개의 유체 투과성 분배기가 추가로 제공될 수 있다. 유체 투과성 분배기, 예컨대 다공성 분배기는 내측 신장 벽에서 외측 관형 벽으로 그리고 관축 방향에 평행한 종방향으로 제1폐쇄부에서 제2폐쇄부로 연장된다. 하나의 구획은 패킹이 구비되어 있다. 2개의 구획은 패킹이 구비되어 있지 않다. 각각의 고리형 섹션에서, 제1커넥터는 외측 관형 벽 가까이에 제공된다. 제2커넥터는 내측 신장 벽 가까이에 제공된다. 각각의 섹션은 수용기가 축을 중심으로 회전하는 경우 수용기의 독립적인 수용기 섹션으로서 기능할 수 있다. 각각의 섹션의 패킹에는 섹션의 반경 위치에 따라 이러한 섹션에 존재하는 배지가 제공된다.
이러한 섹션을 장착함으로써, 이러한 구현예에서 4개의 섹션에서, 외측 관형 벽 및 내측 신장 벽을 갖는 수용기가 수득되며, 이의 고리형 체적은 2개의 폐쇄부에 의해 외측 관형 벽의 2개의 외측 단부에서 폐쇄된다. 2개의 방사상으로 연장된 섹션 벽을 장착하고 결합함으로써 섹션의 커플링이 제공되기 때문에, 2개의 인접한 섹션 벽의 조합은 내측 신장 벽에서 외측 관형 벽으로 그리고 관 축 방향에 평행한 종방향으로 제1폐쇄부에서 제2폐쇄부로 연장되는 액체 및 기체 불투과성 분배기를 형성한다. 이러한 구현예는 각각의 섹션이 상이한 세포 배양을 위한 상이한 배지를 제공할 수 있다는 이점을 갖는다. 또한, 섹션 중 하나에서 반응 패킹이 제대로 작동하지 않는 경우, 하나의 섹션만 교체하면된다. 수용기 (또는 본원에 개시된 임의의 다른 수용기)의 회전이 회전자에 의해 제공될 수 있다. 일례로, 이러한 회전자는 외측 관형 벽의 외부 표면을 적어도 하나가 구동되는 적어도 2개의 지지 휠과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
대안적인 구현예에서, 수용기의 각각의 섹션은 방사상으로 연장된 섹션 벽을 갖는다. 이러한 섹션 벽은 액체 및 기체 투과성이다. 각각의 섹션 벽은 다수의 구멍을 포함하며, 각각의 이러한 구멍은 인접한 구획의 제2섹션 벽에 상응하는 구멍을 발견한다. 제1섹션 벽의 구멍에는 제2섹션 벽의 상응하는 구멍을 통해 연장되는 회향 연장 림이 제공될 수 있다. 선택적으로, 인접한 섹션 벽의 구멍 둘레에 밀봉부가 제공되어 접촉하는 벽 사이에서 배지가 새어나오지 않도록 한다. 대안적인 구현예에서, 가요성 튜빙이 밀봉 대신 수용기 사이에 배치된다.
수용기를 사용하는 생물반응기의 구현예에서, 적어도 하나의 수용기는 임의의 적절한 방사상 단면 예컨대 환형 또는 다각형 예컨대 직사각형 (선택적으로 정사각형)을 가질 수 있는 용기 내에 회전 가능하게 장착된다. 용기는 배양 배지로 부분적으로 채워지므로, 액체 수위는 선택적으로 생물반응기의 축보다 높게 상승하지는 않지만 적어도 내측 신장 벽과 접촉한다. 수용기는 수용기의 종축과 동일한 축을 중심으로 회전한다. 수용기의 종축은 외측 관상 벽의 종방향에 평행한 축이다. 선택적으로, 외측 관형 벽에는 구멍이 제공되거나 다공성, 예컨대 액체 및 기체 투과성 물질로 제조된다. 이러한 유체 투과성 외측 관형 벽이 배지로 부분적으로 채워진 용기 내에서 회전하는 경우, 외측 관형 벽의 일부분만이 배지에 잠기므로, 패킹은 외측 관형 벽을 통해 고리형 체적으로 흐르는 배지가 제공될 수 있다. 수용기가 용기 내에서 회전하는 경우 배지의 일부가 패킹과 함께 끌릴 수 있다.
일부 구현예에서, 수용기 중 적어도 하나는 자기 요소를 포함한다. 생물반응기는 수용기의 자기 요소와 함께 작동하는 자기 요소를 포함한다. 둘 모두의 자기 요소는 회전 축 주위의 생물반응기의 자기 요소의 회전이 수용기의 자기 요소의 회전을 유도하여 수용기를 완전히 회전시키도록 배치된다. 인접한 수용기는 회전하는 주위에 공통 샤프트 상에 장착될 수 있다. 인접한 수용기는 고정된 위치에서 서로 커플링될 수 있으므로, 수용기의 회전은 수용기의 회전을 또한 유도한다.
일부 구현예에서, 수용기는 액체 및 기체 불투과성 외측 관형 벽을 가지며, 선택적으로 가요성 튜빙에 의해 수용기를 기체 또는 배지 저장소에 연결하기 위한 커넥터를 갖는다. 수용기는 생물반응기를 제공하기 위한 구동 시스템에 의해 회전될 수 있다. 수용기는 회전가능한 샤프트 상에 장착되어 수용기의 축과 만나는 회전 축을 중심으로 회전가능하다. 샤프트는 내측 신장 요소의 내부 보이드 내의 독특한 회전 위치에 프로파일링되고 맞춰진다. 이와 같이, 샤프트의 회전 위치를 제어함으로써, 축에 대한 수용기의 위치가 분명하게 정의된다. 구동 시스템은 선형 모터와 같은 모터 또는 샤프트의 회전을 정밀하게 제어하기 위한 임의의 다른 적절한 수단을 추가로 포함할 수 있다. 수용기가 샤프트 위에서 종방향으로 변위하는 것을 방지하기 위한 클램프 스크류 또는 임의의 적절한 수단은 샤프트 상의 수용기의 위치를 종방향으로 고정시킬 수 있다. 선택적으로 하나 이상의 수용기가 공통의 샤프트 상에 장착될 수 있음이 이해된다. 내측 신장 요소의 내부 보이드 형상 및 샤프트의 둘레는 샤프트 및 수용기가 한정되거나 심지어 고유한 방식으로 장착될 수 있도록 선택된다.
수용기의 일 구현예에서, 내측 신장 요소는 내측 신장 요소의 내측 벽에 종 방향 홈을 갖는다. 샤프트의 융기 부분이 이 홈에 맞춰져 있다. 수용기는 샤프트에 분명하게 맞춰져 있다. 융기는 홈에서 미끄러지듯이 움직일 수 있다. 수용기의 대안적인 구현예에서, 내측 신장 요소는 내측 신장 요소의 내측 벽에 2개의 종방향 홈을 갖는다. 샤프트 상의 2개의 상호 수직인 융기가 이러한 홈에 맞춰져 있다. 수용기는 샤프트 상에 2개의 방향으로 맞추어지며, 첫 번째 위치는 두 번째 위치에 대해 축을 중심으로 180° 회전한다. 융기는 홈에서 미끄러지듯이 움직일 수 있다. 수용기의 추가의 구현예에서, 내측 신장 요소는 구획에 의해 제공된 내측 신장 요소의 내측 벽 각각에 하나씩 4개의 종방향 홈을 갖는다. 샤프트는 샤프트 상에 4개의 서로 수직인 융기를 포함하는 실질적으로 십자형의 단면을 갖는다. 각각의 융기는 구획 중 하나의 홈에 맞춰져 있다. 수용기는 샤프트 상의 4개의 방향으로 맞춰져 있다. 융기는 홈에서 미끄러지듯이 움직일 수 있다.
생물반응기 수용기의 추가의 구현예에서, 내부 공간의 체적은 복수의 세그먼트에 의해, 특히 이러한 경우 4개의 쿼터에 의해 제공된다. 각각의 섹션은 외측 관형 벽 부분에 의해 외측 관형 벽의 하나의 부분을 제공한다. 각각의 세그먼트는 내측 신장 벽 부분에 의해 내측 신장 벽의 하나의 부분을 제공한다. 각각의 세그먼트는 2개의 방사상으로 연장된 세그먼트 벽을 갖는다. 예시적인 세그먼트는 2개의 방사상으로 연장된 세그먼트 벽을 갖는다. 배양 배지는 내측 신장 벽의 내부 보이드를 추가로 채울 수 있다. 구멍을 통해, 배양 배지는 섹션 내외로, 그리고 선택적으로 인접한 섹션으로 흐를 수 있다. 수용기는 종 방향 벽을 형성하는 몸체 및 마개 형태의 단부를 포함한다. 마개는 제거될 수 있으며, 연결된 위치에서 몸체 내에 임의의 유체를 담기 위한 유체-기밀 밀봉을 형성할 수 있다. 각각의 마개는 배양 배지를 수용하기 위한 유입구 또는 배출구를 형성하는 개구를 포함할 수 있지만, 유입구 및 배출구는 각각 동일한 마개 또는 몸체의 종방향 벽에 제공될 수도 있다. 천공된 파티션과 같은 하나 이상의 또는 한 쌍의 유체 투과성 구조물이 제공되어 임의의 패킹을 담기 위한 구획을 형성한다. 각각의 파티션 내의 천공은 구획 내의 유체의 흐름 및 체류 시간을 제어하기 위한 형상 및 크기로 제공될 수 있으며, 파티션간에 동일하거나 상이할 수 있다. 패킹은 수용기의 구획을 완전히 차지하여 유체 투과성 구조물뿐만 아니라 몸체의 벽의 내부 표면과 원주방향으로 접촉하는 방식으로 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 수용기는 회전 장치와 결합될 수 있다. 이러한 장치는 몸체의 종방향 축을 중심으로 수용기를 수용, 지지, 및 회전시키기 위한 한 쌍의 롤러를 포함할 수 있다. 수용기는 구획 내에 존재하는 임의의 패킹을 통해 임의의 유체 (예컨대, 배양 배지, 또는 임의의 헹굼 또는 회수 제제)를 분배하는 것을 돕기 위해 롤러에 맞물리거나 회전하도록 개조된 일반적으로 원통형인 몸체가 구비될 수 있다. 관형 커넥터는 또한 유체를 구획에 전달하기 위한 유입구 및 배출구와 결합되어 제공될 수 있다. 이는 수용기가 고정되거나 회전하는 동안 수행될 수 있다. 후자의 경우, 커넥터는 스냅-맞춰진 맞물림 또는 베어링을 사용하여 생성된 회전 조인트를 사용하는 것과 같은 상대 회전을 허용하는 방식으로 연결될 수 있다. O-링과 같은 밀봉은 임의의 누출을 방지하고 세포 배양에 바람직한 멸균 조건을 유지하는데 도움이 되도록 사용될 수 있다. 수용기의 하나의 이점은 배열의 단순성이다. 예컨대, 수용기는 센서, 프로브, 혼합기 등을 포함하지 않으며, 이러한 구조물을 포함하는 것이 바람직한 경우, 이는 가능하며, 폐쇄된 루프 내에서 수용기를 저장조와 연결시킴으로써 달성될 수 있다. 저장조는 순환된 유체의 하나 이상의 특성을 측정하기 위한 임의의 수의 센서 등을 포함할 수 있으며, 세척 및 멸균의 필요성을 피하기 위해 일회용 용기 (예컨대, 가요성 백)를 포함할 수 있다. 연동 펌프와 같은 펌프가 또한 루프를 통해 유체를 순환시키기 위해 제공될 수 있다.
이러한 구현예에서, 수용기는 상기 임의의 세부 사항에 따라 구성될 수 있으며 (따라서 롤러 병을 형성함), 유입구 및 배출구를 포함한다. 각각의 유입구 및 배출구는 유체의 전달을 방해하지 않는 방식으로 도관의 과도한 구부림 또는 비틀림 없이 수용기의 회전을 허용하는 도관에 연결될 수 있으며, 따라서 회전하는 동안 유체의 수용기를 향한 그리고 수용기로부터의 연속적인 흐름을 허용할 수 있다. 구체적으로, 도관은 유입구 또는 배출구에 각각 연결하기 위한 개방 단부를 갖는 코일형 튜브를 포함할 수 있으며, 반대쪽 단부에서 임의의 유체 저장조와 결합할 수 있다. 도관 및 수용기를 통해 유체를 이동시키기 위한 적절한 펌핑 배열이 또한 제공될 수 있다.
일 구현예에서, 수용기는 적절한 회전자 (예컨대 롤러)를 사용하여 시계 방향과 같은 제1방향으로 하나 이상의 완전한 회전에 대해 회전될 수 있다. 도관의 결합 없이 가능한 회전의 수는 다양할 수 있지만, 최소 2~3회 회전이 가능해야함이 예상된다. 이어서, 수용기는 하나 이상의 완전한 회전을 위해 제2의 반대 방향으로 회전될 수 있다. 보다 구체적으로, 회전은 제1방향의 회전 수가 코일형 튜브를 이의 원래 위치에 복귀시키는 것일 수 있고, 코일형 튜브가 유체 전달에 결합하지 않거나 다른 방식으로 간섭하지 않는 한, 제2방향으로의 상응하는 회전 수이다. 회전 및 역회전은 연속적 또는 간헐적으로 발생할 수 있으며, 도관을 통한 유체의 전달 및 회복에 대해서도 마찬가지이다. 수용기가 센서를 포함하는 경우에서도, 감지에 사용되는 임의의 에너지원에 연결될 수도 있음이 또한 이해될 수 있다. 이러한 경우에, 케이블과 같은 임의의 전송선은 비틀림 또는 결합 없이 상기 고려된 방식으로 상대 회전을 수용하기 위한 코일형 또는 나선형일 수도 있다. 다시 말해, 임의의 재순환 루프에서 임의의 센서 등을 배치하는 것이 바람직하지만, 이는 수용기의 비용을 낮추기 때문이다.
롤러 병 형태의 수용기의 추가의 구현예에서, 유입구 및 배출구가 공통의 벽에 제공될 수 있다. 유입구는 또한 고정층 내의 유체 투과성 내부 원통 내에 위치한 튜브와 결합될 수 있으며, 이는 유입된 유체 (기체, 액체 또는 둘 모두)가 유입구를 통해 단순히 즉시 빠져나가지 않도록 돕는다. 재순환 루프 내에 로터미터와 같은 주입기를 배치시킴으로써 기체가 액체에 도입될 수 있다. 배치는 유입구의 바로 상류일 수 있다. 액체 흐름과 관련된 이러한 방식의 기체 도입은 유리하게는 발포의 발생을 감소시키고 물질 전달 속도를 향상시키는데 도움을 주는데, 그 이유는 기체가 액체에 의해 분리된 주머니에 남아있기 때문이다. 배출구와 결합된 전송선은 저장조로 되돌아가며, 이는 수용기와의 직접적인 연결을 위한 통기구를 피하기 위해 도시된 바와 같이 필터를 통해 배출될 수 있다.
일부 구현예에서, 다른 요소가 수용기 및 생물반응기에 추가될 수 있다. 예컨대, 내측 신장 벽은 신장 관형의, 선택적으로 원통형인 벽일 수 있다. 내측 관형 벽의 내측 보이드는 하나 이상의 센서 예컨대 온도 센서, 위치 센서 (예컨대, 회전축에 대한 수용기의 방향을 한정하기 위한 것), 광학 센서 (예컨대, 배양 배지 예컨대 세포 배양 배지의 색에 대한 데이터를 생성하기 위한 것), pH-센서, 산소 센서 (예컨대 용존 산소 (DO)-센서), CO2-센서, 암모니아 센서 또는 세포 바이오매스 센서 (예컨대 탁도 농도계)를 수용하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 센서는 폐쇄부 내에 또는 폐쇄부 상에 추가적으로 또는 선택적으로 위치할 수 있다. 수용기는 관류, 신선한 영양 배지의 연속 첨가 및 동등한 부피의 사용된 배지의 회수를 또한 수용할 수 있으므로, 생체 내 상황에 가능한 근접하게 근사된 세포 배양 조건을 실현할 수 있다. 관류 세포 배양과 예컨대 효소 글루코스 생체 센서와의 조합은 세포 배양물의 글루코스 소모를 지속적으로 모니터링할 수 있도록 한다. 또한, 가열 블랭킷과 같은 가열 요소가 수용기의 배지 및 패킹의 온도를 가열하거나 유지하기 위해 외측 및 선택적으로 내측 벽에 제공될 수 있음이 이해된다.
대안적인 구현예에서, 생물반응기는 실질적으로 수직이고 원통형 배양 용기를 포함하는 세포 배양 용기를 포함하지만, 다른 형태, 예컨대 임의의 각기둥 형태, 바람직하게는 규칙적인 형태도 또한 고려될 수 있다. 배양 용기는 서로 연통하는 적어도 4개의 구역을 포함한다. 용기의 중심으로부터 외부를 향하여, 용기는 제1구역, 제3구역, 제2구역 및 제4구역을 포함한다.
일부 구현예에서, 배양 용기는 이의 바닥 부분에 배지 순환 수단을 포함한다. 이러한 바람직한 구현예에서, 배지 순환 수단은 자기 장치, 예컨대 실제 또는 가상의 중심 회전 축을 중심으로 회전하는 자기 막대로 구성되며, 이의 제1단부는 상부 결합 수단에 수용되고 이의 제2단부는 하부 결합 수단에 수용된다. 자기 막대는 배양 용기 외부의 회전식 자기 구동 모터에 의해 구동되며 여기에는 표시되지 않았다. 순환 수단은 적어도 하나의 배지 유입구를 포함한다. 배지 유입구는 배지의 흐름을 위한 전환 배플 (diversion baffle)에서 끝나는 적어도 하나의 제1단부를 포함한다. 자기 막대는 원심분리 펌프로서 기능하며, 즉, 배지는 막대에 의해 생성된 배지의 움직임에 의해 상대적으로 중심인 구역으로 흡입되고, 배지는 중심점에 대해 바깥쪽으로 추진된다. 배지 전환 배플은 배지가 막대의 상대적으로 중심인 구역으로 안내되도록하여 배지가 이곳에서 흡입되어 바깥쪽으로 추진되도록 한다. 유리하게는, 유입구는 동일한 평면 (별 모양)에 있고, 유입구의 수는 이의 위치가 대칭을 나타낼 수 있는 수일 것이다. 보다 구체적으로, 3개의 유입구가 고려되는 경우, 각각이 약 120°의 각도로 서로 분리되는 것이 유리하며, 유입구의 수가 4개인 경우, 유입구는 90°와 실질적으로 동일한 각도로 서로 분리될 것이고, 유입구의 수가 10개인 경우, 유입구는 약 36°의 분리 각도로 배치될 것이다. 배지 순환 수단은 또한 적어도 하나의 배지 배출구를 포함한다. 배지 배출구는 유리하게는 자기 막대의 원심분리 효과에 의해 배지가 추진되는 지점에 위치한다. 유리하게는, 배출구의 수는 이의 위치가 대칭을 나타내는 수일 것이다. 보다 구체적으로, 3개의 배출구가 고려되는 경우, 각각이 약 120°의 각도로 서로 분리되는 것이 유리하며, 배출구의 수가 4개인 경우, 배출구는 90°와 실질적으로 동일한 각도로 서로 분리될 것이고, 배출구의 수가 10개인 경우, 배출구는 약 36°의 분리 각도로 배치될 것이다. 바람직하게는, 배출구는 유입구와 동일한 수평면에 위치하지 않는다. 배양 용기의 바닥 부분은 상기 상기하나 이상의 배출구에 인접한 적어도 하나의 배지 안내 수단을 포함하며, 이는 추진된 배양 배지를 배양 용기의 상부로 안내한다.
일부 구현예에서, 배양 용기의 제1구역은 실질적으로 중심 구역이고 배지 이동 구역이다. 제1구역은 기저부를 포함하고 특정 구현예에서는 선택적으로 원통형 부분을 또한 포함한다. 기저부의 직경은 배양 용기의 직경보다 작다. 기저부는 배지에서 상기 배지 순환 수단의 적어도 하나의 배지 배출구와 배지 연통한다. 기저부는 제1구역의 상부에서 기저부보다 작은 직경을 갖는 원통으로 감소된다. 상부 원통형 부분은 외부 벽을 포함하고 상기 제1배지 이동 구역의 기저부와 직접 배지 연통한다. 제3구역은 제1배지 이동 구역 외부의 배지 이동 구역이다. 제3구역은 또한 실질적으로 기저부 (슬리브 형태), 및 특정 구현예에서 선택적으로 실질적으로 원통형 상부를 또한 포함한다.
일부 구현예에서, 제3배지 이동 구역의 실질적으로 원통형 부분은 제1배지 이동 구역의 실질적으로 원통형 부분과 본질적으로 동심이며, 이러한 2개의 부분은 배지 연통한다. 배지 연통은 오리피스 또는 튜브에 의해, 오버플로우를 통한 오버플로우에 의해 (도에 나타난 바와 같이), 또는 이러한 연통을 달성하기 위한 임의의 다른 가능한 수단에 의해 달성된다. 제2구역은 담체 또는 미세담체가 존재하거나 부재인 세포 배양 구역이다. 제2구역은 또한 슬리브형태이며, 중앙은 제1 및 제3 배지 이동 구역이다. 제2구역은 바닥 벽 및 상부 벽을 포함하고, 각각의 벽에는 세포가 본질적으로 없는 배양 배지의 이동을 허용하는 오리피스가 제공된다. 제2배양 구역은 배지가 통과할 수 있도록 바닥 벽의 오리피스에 의해 제3배지 이동 구역의 상대적인 기저부와 배지 연통한다. 제4구역은 제2배양 구역의 외부이지만 배양 용기의 내부인 배지 이동 구역이다. 제4구역은 제2배양 구역과 배지 연통한다. 또한, 상기 적어도 하나의 유입구를 통해 배지 순환 수단과 배지 연통한다. 배지 연통은 오리피스 또는 튜브에 의해, 오버플로우에 의해 또는 이러한 연통의 달성을 위한 임의의 다른 가능한 수단에 의해 달성된다.
일부 구현예에서, 배양 장치는 실질적으로 원통형 배양 용기를 포함하지만, 다른 구현예는 앞서 언급된 바와 같이 예컨대 실질적으로 각기둥 형태의 용기, 바람직하게는 규칙적인 형태가 또한 고려될 수 있다. 명백하게는, 이는 다양한 배지 및 배양 이동 구역에서도 마찬가지이다. 이는 또한 각기둥, 바람직하게는 규칙적인 형태, 가능한 형태의 임의의 조합일 수 있다. 이러한 경우, 용어 슬리브는 고려된 각기둥의 단면과 유사한 단면을 갖는 포정 (envelope)으로 고려되어야 한다. 배지 순환 수단이 작동중인 경우, 배지는 상기 적어도 하나의 배출구를 통해 이를 남기며, 여러 개인 경우 다양한 배출구를 통하고, 안내 수단에 의해 전환되고, 제1배지 이동 구역의 실질적인 기저부에서 끝난다. 제1배지 이동 구역의 구조 및 펌프의 출력은 배지가 제1배지 이동 구역의 실질적으로 원통형인 부분을 향하도록 유도될 것을 요구한다. 실질적으로 원통형인 부분의 벽의 상부에 도달하는 경우, 오버플로우를 통해 제3배지 이동 구역으로 오버플로우된다.
이러한 특정 구현예에서, 당업자라면, 제1배지 이동 구역의 실질적으로 원통형인 부분의 벽이 효율 및 유속의 이유로 제3배지 이동 구역의 벽보다 더 낮지만, 제1배지 이동 구역의 실질적으로 원통형인 부분의 벽은 또한 제3배지 이동 구역의 실질적으로 원통형인 부분의 벽보다 높을 수 있음이 명백할 것이다. 따라서, 배지는 펌프에 의해 부과된 유속 및 중력을 받게 되고, 실질적으로 원통형인 부분을 따라 흘러내리는 제3배지 이동 구역으로부터 아래쪽을 향하여 제3배지 이동 구역의 실질적인 기저부에 도달한다. 다음으로, 배지의 흐름은 펌프의 부과된 유속에 의해 연통하는 용기 효과를 통해 상승하는 방향을 가지며, 제2배양 구역의 최상부에 도달한다. 배지는 제2배양 구역의 바닥 벽에서 세포가 실질적으로 존재하지 않는 배지를 통과시키기 위해 오리피스를 통해 제3배지 이동 구역으로부터 제2배양 구역에 도달한다. 이미 언급한 바와 같이, 배지 통로 오리피스는 배양의 유형에 따라 크기가 정해진다. 배양이 담체가 없는 배양인 경우, 오리피스를 포함하는 벽은 기공 크기가 세포 지름보다 작은 다공성 막일 것이다. 배양이 미세담체 또는 담체상인 경우, 오리피스의 크기는 미세담체 또는 담체의 크기보다 작을 것이다. 배지 흐름 가장자리가 제2배양 구역의 벽의 최상부에 도달하였을 때, 제4배지 이동 구역으로 오버플로우된다. 당연히, 오리피스 또는 튜브가 존재하는 경우, 배지 흐름 가장자리가 오리피스 또는 튜브에 도달하였을 때 제4구역으로 흘러들어간다는 것이 이해되어야 한다.
일 구현예에서, 제4배지 이동 구역은 제2구역에서 제4구역으로 통과할 때 배지가 흐르는 경사진 벽을 포함한다. 경사진 벽은 바람직하게는 상기 경사진 벽 상에 필름을 형성을 향상시키기 위한 친수성 막을 포함한다. 발포의 형성을 가능한 방지하기 위해 필름은 바람직하게는 적층형 (laminar)이어야 한다. 필름을 안정화시키기 위해, 물, 특히 배양 배지의 유변학적 특성을 변형시키기 위해 배양 배지에 첨가제를 첨가하는 것이 가능하며, 이러한 첨가제는 계면활성제, Pluronic F68, 글리세린, 4차 암모늄 및 배양 배지의 유변학적 특성을 변형시키기 위한 임의의 다른 첨가제로 이루어진 군에 포함된 것들이다. 친수성 막은 예컨대 폴리옥시에틸렌으로 구성된 막일 것이다. 경사진 벽 상의 필름 형성은 "박막"상에서 산소를 공급할 수 있기 때문에 중요한 단계이다. 실제로, 이러한 제4배지 이동 구역에서의 배지의 양에 대한 기체의 부피는 크고 교환을 향상시킨다. 또한, 경사진 벽 상의 필름 형성은 기체-액체 접촉 표면적을 증가시킨다.
일부 구현예에서, 배양 용기는 바람직하게는 적어도 하나의 기체 유입 오리피스 및 적어도 기체 배출 오리피스가 통과하는 커버를 포함한다. 기체 유입 오리피스는 바람직하게는 제4배지 이동 구역과 직접적으로 연통하도록 배치된다. 일부 변형예에서, 기체 유입 오리피스가 배양 용기의 수직 벽 또는 배양 용기의 바닥에 존재하는 것이 바람직할 수 있으며, 즉, 기체가 커버 반대쪽의 배양 용기의 벽을 통해 오리피스에 의해 통과하고, 이러한 오리피스에는 액체 수위 위에서 끝나기 위한 튜브가 제공된다.
이러한 구현예에서, 커버는 제2배양 구역의 상부 벽 상의 고정 수단에 의해 고정된다. 변형예에서, 커버는 제2배양 구역의 상부 벽과 일체로 만들어질 수 있으며, 이러한 부분은 배양 용기의 커버가 상승될 때 개방된다. 이러한 방식으로, 예컨대 세포 밀도, 세포 구조 및 배양물의 건강을 반영하는 세포의 다른 물리적인 특성을 평가하기 위해 담체의 존재와 관계 없이 세포 샘플을 추출하는 것이 용이하다. 실제로, 2가지를 서로 연결하면 배양 용기의 커버를 올림으로써 배양 구획을 단순히 여는 것이 가능하다. 현탁 배양의 경우, 다공성 막을 제2배양 구역의 오리피스가 제공된 상부 벽에 연결하는 것이 유리할 수 있으며, 이러한 조립은 샘플을 취하기 위한 커버/막 조립의 강성을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 자기 막대는 나선형 형태를 갖는다. 실질적으로 중심 회전축을 갖는 자기 장치의 설계는 본질적으로 배양의 부피에 달려있을 것이다. 실제로, 소량의 배양에서, 장치는 배지를 순환시키기 위한 자기 칩과 같은 단순한 막대를 제공할 수 있도록 설계되어 있다. 큰 부피의 경우, 장치는 예를 들어 높은 배지 순환 속도를 가능케하는 수족관에서 사용되는 것과 같은 회전자와 같이, 외부 모터에 의해서도 구동되는 자기 회전자를 고려한다.
세포 배양 장치의 일부 구현예는 생성된 기포의 크기에 따라 "분출기" 또는 "미세분출기"로 보다 통상적으로 지칭되는 기포 생성 장치의 사용을 고려할 수 있다. 유리하게는, 기포가 사용되는 경우, 예컨대 튜브의 기포 생성 장치의 관통 단부는 제4배지 이동 구역의 바닥 또는 제1배지 이동 구역에서의 배지 중에 잠길 것이다. 이러한 유형의 산소 공급이 선택되는 경우, 박막 상의 산소공급이 또한 항상 지속될 수 있기 때문에, 기체 흐름을 줄이고 기포 형성이 더 감소되므로 발포 형성을 감소시킬 수 있다. 이러한 경우, 배양 용기의 커버 또는 배양 용기의 수직 벽 상에 2개의 기체 유입구를 갖도록 하는 것이 또한 고려된다. 또한, 기포 생성 장치가 SOS 절차로서만 존재하고 필요한 경우에만 사용되는 것이 또한 고려될 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 장치는 또한 일련의 배양 파라미터 센서, 예컨대 용존 산소의 분압 pO2, 산도 pH, 온도, 탁도, 광학 밀도, 글루코스, CO2, 젖산, 암모늄 및 세포 배양 모니터링에서 통상적으로 사용되는 임의의 다른 파라미터를 포함한다. 이러한 센서는 바람직하게는 배양 용기의 내부와 이의 외부 사이의 연결을 필요로하지 않는 광학 센서이다. 이러한 센서의 바람직한 위치는, 배양 용기의 벽에 가깝게 위치하여 배지와 접촉하고 바람직하게는 세포가 통과하기 전에 또는 통과 직후에 배지가 통과하는 구역과 같은 전략적인 위치에 있도록 하는 것이 유리하다는 점에서 중요한 위치이다.
일부 구현예에서, 세포 배양 장치는 전술된 단순성 및 경제성의 모든 이유로 일용성 생물반응기를 포함한다. 따라서, 이것이 배양 용기의 내부와 외부 사이의 연결이 감소된 이유이다. 또한, 생물반응기는 일용성으로 인해 오염의 위험이 특히 낮은 특히 신뢰할 수 있는 생물반응기를 포함한다.
장치의 구현예는 또한 보다 큰 부피의 배양을 위한 일련의 모듈을 포함하는 모듈식 디자인이 고려된다. 예컨대, 이러한 유형의 모듈 디자인의 경우, 매우 제한된 수의 표준 모듈을 사용하여 약 500 ml 내지 100 리터의 배양 부피가 고려된다. 일부 구현예에서, 장치는 배지 순환 수단 및 커버를 포함하는 표준 배양 용기에 배치되도록 제1배지 이동 구역 둘레에서 "미끄러질 수 있는" 일련의 모듈을 제공한다. 특정 변형예에서, 장치는 다양한 표준 모듈을 포함하는 장착 시스템을 포함한다. 이러한 표준 모듈은 예컨대 조립체의 바닥에 배치되는 순환 수단 모듈, 하나 이상의 배양 모듈 및 커버 모듈이다. 이러한 모듈을 고정시키는 다른 수단이 고려될 수 있지만, 모듈은 액체 및 기체 관점에서 완전히 불투과성인 고속 커넥터에 의해 서로 클램핑될 것이다.
따라서, 배양 유형 및 요구되는 부피에 따라, 사용자는 배지 순환 수단을 포함하는 베이스 모듈을 저장액으로부터 취할 수 있을 것이고, 필요한 배양 부피에 따라 필요한 다수의 배양 모듈을 취하여 커버에 상응하는 헤드 모듈을 취해야 한다. 다음으로, 모든 이러한 모듈은 멸균된 형태로 포장되고, 단지 포장을 풀고 다른 포장 위헤 하나씩 "붙이기 (clip)"만 하면 된다. 스태킹은 "일용성 생물반응기"를 형성하거나 적절한 용기에 놓일 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 용기의 바닥에 고정될 수 있는 순환 수단을 포함하는 베이스 모듈은 이를 배치하고 또 다른 배양을 위해 또 다른 것을 사용하여 교차 오염을 방지하기 위해 배양 용기 내로 미끄러질 수 있다. 이러한 순환 수단은 중심 회전축을 중심으로 회전하는 자기 장치를 포함하며, 이의 제1단부는 상부 결합 수단에 수용되고 이의 제2단부는 하부 결합 수단에 수용된다. 순환 수단은 적어도 하나의 배지 유입구를 포함한다. 배지 순환 수단은 또한 적어도 하나의 배지 배출구를 포함한다. 배양 용기의 베이스 모듈은 배양 용기의 상부를 향해 추진되는 배양 배지를 안내하는 상기 적어도 하나의 배출구에 인접한 적어도 하나의 배지 안내 수단을 포함한다.
일부 구현예에서, 배양 용기는 서로 적층된 일련의 배양 모듈을 포함한다. 이들이 서로 단순히 인접하는 것이, 즉, 나란히 배치되는 것이 또한 고려될 수 있다. 일부 구현예에서, 모듈은 급속 커넥터 또는 클립에 의해 서로 클램핑된다. 또한, 각각의 모듈이 각 배양 모듈의 제4구역과 연통하는 기체 또는 기체 혼합물 유입구를 포함하는 것이 유리할 수 있다. 용기는 또한 과량의 기체 또는 기체 혼합물을 위한 배출구를 이의 일부분으로 포함할 수 있다. 예컨대, 기체 유입 오리피스는 배양 용기의 바닥에 존재할 수 있으며, 즉, 오리피스를 통해 커버의 반대쪽 배양 용기의 벽을 통해 통과하고 이러한 오리피스에는 모듈의 액체 수위보다 위에서 끝날 수 있도록 하는 튜브가 제공된다. 따라서, 기체 혼합물은 이러한 모듈의 제4배지 이동 구역에 도달한다. 모듈 위에 배치된 모듈은 또한 배양 모듈의 제4구역에 존재하는 기체 혼합물이 모듈의 제4구역과 연통할 수 있게 하는 튜브를 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 튜브는 유리하게는 모듈의 바닥 벽을 통해 통과한다.
특정 구현예에서, 장기 배양을 위해, 배양 배지의 일부를 신선한 배지로 교체하거나 영양물의 첨가를 수행하는 것이 유리할 수 있다. 따라서, 베이스 모듈은 이어서 영양물 유입구를 포함할 수 있다. 또한, 유리하게는, 배양 용기는 오버플로우를 방지하기 위해 배지 순환 수단에 배지 배출구를 포함할 수 있다. 유사한 방식으로, 배양 용기는 위에 위치한 모듈에서 샘플을 취하는 것을 단순화하기 위해 고정 수단에 의해 배지 통과 오리피스가 제공된 상부 벽에 유리하게 연결된 커버를 포함하는 헤드 모듈을 포함한다. 또한, 유리하게는 배양 파라미터 센서가 각 배양 모듈에 제공될 수도 있다. 또한, 모든 구역 또는 베이스 모듈에서 단 하나 또는 여러 개의 배양 모듈에 센서를 제공할 수 있다.
일부 구현예 또는 베이스 모듈에서, 배지는 상기 적어도 하나의 배출구를 통해, 배출구가 여러 개 존재하는 경우, 다양한 배출구를 통해 배지 순환 수단으로부터 추진되며, 안내 수단에 의해 전환된다. 이는 제1배지 이동 구역의 실질적인 기저부에서 끝난다. 이러한 구현예의 실질적인 기저부는 모든 배양 모듈에 공통적인 구역이고, 예시된 구현예에서 베이스 모듈에 위치한다. 배양 모듈이 적층되어 있거나 병치되어 있는 경우에도 유효하다. 제1배지 이동 구역의 구조 및 펌프의 출력은, 배지가 제2모듈의 제1배지 이동 구역의 실질적으로 원통형인 부분을 향하는 제1모듈의 제1배지 이동 구역의 실질적으로 원통형인 부분을 향할 것을 요구한다. 이러한 구현예에서, 실질적으로 원통형인 부분을 포함하는 큰 제1배지 이동 구역을 생성하는 것이 모듈을 조립하는 것이다. 배지가 제2배양 모듈의 실질적으로 원통형인 부분의 벽의 상부에 도달하면, 제2배양 모듈의 제3배지 이동 구역으로 오버플로우된다.
일부 구현예에서, 배지는 펌프에 의해 부과된 유속및 중력을 받게 되어 제2배양 모듈의 제3배지 이동 구역의 바닥을 향하게 되고, 제2배양 모듈의 실질적으로 원통형인 부분으로 흘러서 제2배양 모듈의 제3배지 이동 구역의 실질적인 기저부에 도달한다. 다음으로, 배지의 흐름은 연통하는 용기 효과 및 펌프의 부과된 유속을 통하는 상승 방향을 가지며 제2배양 모듈의 제2배양 구역의 최상부에 도달한다. 배지는 제2배양 모듈의 바닥 벽의 실질적으로 세포가 없는 배지의 통과를 위한 오리피스를 통해 제2배양 모듈의 제3배지 이동 구역으로부터 제2배양 모듈의 제2구역에 도달한다. 배지 흐름 가장자리가 제2배양 모듈의 제2배양 구역의 외부 벽의 상부에 도달하면, 제2배양 모듈의 제4배지 이동 구역으로 오버플로우된다. 당연히, 오리피스 또는 튜브가 배양 구역의 이러한 외부 벽에 존재한다면, 배지 흐름 가장자리가 오리피스 또는 튜브에 도달할 때, 제2배양 모듈의 제4구역으로 흘러들어온다는 것을 이해해야 한다. 장치의 특히 바람직한 구현예에서, 제2배양 모듈의 제4배지 이동 구역은 제2배양 모듈의 제2구역에서 제2배양 모듈의 제4구역으로 통과할 때 배지가 흐르는 경사진 벽을 포함한다. 경사진 벽은 바람직하게는 상기 경사진 벽 상에 필름을 형성을 향상시키기 위한 친수성 막을 포함한다. 발포의 형성을 가능한 방지하기 위해 필름은 바람직하게는 적층형 (laminar)이어야 한다. 필름을 안정화시키기 위해, 전술된 바와 같이, 물의 유변학적 특성을 변형시키기 위해 배양 배지에 첨가제를 첨가하는 것이 또한 가능하다. 다음으로, 제2배양 모듈의 제4배지 이동 구역에 존재하는 배양 배지는 튜브를 통해 또는 제2배양 모듈의 제4배지 이동 구역의 벽의 상부를 통해 제1배양 모듈의 제3배지 이동 구역으로 오버플로우된다.
일부 구현예에서, 배지는 배지는 펌프에 의해 부과된 유속 및 중력을 받게 되고, 제1배양 모듈의 제3배지 이동 구역으로부터 아래쪽으로 향하여 제1배양 모듈의 실질적으로 원통형인 부분을 흘러내려가서 제1배양 모듈의 제3배지 이동 영역의 실질적인 기저부에 도달한다. 다음으로, 배지의 흐름은 연통하는 용기 효과를 통해 그리고 펌프에 의해 부과된 유속을 통해 위쪽 방향을 가지며 제1배양 모듈의 제2배양 구역의 최상부에 도달한다. 배지는 제1배양 모듈의 바닥 벽의 세포가 실질적으로 없는 배지의 통과를 위한 오리피스를 통해 제1배양 모듈의 제3배지 이동 구역으로부터 제1배양 모듈의 제2구역에 도달한다. 배지 흐름 가장자리가 제1배양 모듈의 제2배양 구역의 벽의 정상에 도달하면, 제1배양 모듈의 제4배지 이동 구역으로 오버플로우된다. 명백하게, 오리피스 또는 튜브가 이러한 벽에 존재하는 경우, 배지 흐름 가장자리가 오리피스 또는 튜브에 도달할 때 제1배양 모듈의 제4배지 이동 구역으로 흘러들어간다는 것이 이해되어야 한다. 제2배양 모듈의 제4배지 이동 구역은 또한 제1배양 모듈의 제1배양 구역으로부터 제1배양 모듈의 제4배지 이동 구역으로 통과할 때 배지가 흐르는 경사진 벽을 포함할 수 있다. 경사진 벽은 아마도 상기와 같은 친수성 막이 제공된다. 다음으로, 배지는 유입구 (파이프)를 통해 베이스 모듈 및 배지 순환 수단으로 되돌아가며, 즉, 제1배양 모듈의 제4배지 이동 구역에 존재하는 배양 배지는 튜브를 통해 또는 상기 배지 순환 수단을 구성하는 상기 원심분리 펌프에 의해 생성된 사이펀의 실질적인 중앙 구역에서 끝나는 파이프 내의 제1배양 모듈의 제4배지 이동 구역의 벽 상부로 오버플로우 된다.
이러한 구현예의 변형에서, 적층된 모듈은 배양 용기를 구성한다. 이러한 변형예에서, 예컨대 3종의 모듈, 베이스 모듈, 4개의 구역을 포함하는 모듈, 및 헤드 모듈 mx가 존재할 수 있다. 베이스 모듈 또는 기저 모듈은 배지 순환 수단 및 조립 수단을 포함한다; 이는 상기 설명된 바와 같이 4개의 구역 모듈의 제1조립 수단과 결합하고 용기의 바닥을 구성하도록 설계된다. 헤드 모듈은 4개의 구역 모듈의 제2조립 수단과 결합하도록 설계된다. 베이스 모듈에 의해 결합된 4개의 구역 모듈은 헤드 모듈에 의해 결합된 것과 동일할 수 있거나 베이스 모듈에 의해 결합된 4개의 구역 모듈은 일련의 4개의 구역 모듈 중 첫 번째가 될 수 있고 헤드 모듈에 의해 결합된 모듈은 결과적으로 상기 일련의 4개의 구역 모듈에서 제2의 4개의 구역 모듈이다.
일부 구현예에서, 모든 모듈은 다른 배양 모듈 및 베이스 모듈 또는 헤드 모듈 모두와 함께 조립될 수 있는 단일 배양 모듈을 얻는 것을 가능하게 하는 고정 수단을 포함한다. 이러한 고정 수단은 예컨대 환형 밀봉이 구비된 2개의 동심원, 세포 배양 분야에서 잘 알려진 급속 커넥터, 나사 피치 및 톱니형 또는 이러한 모듈을 조립하기 위한 임의의 다른 장치이다.
이러한 구현예에서, 베이스 모듈의 기저부는 기체 또는 기체 혼합물의 도입을 허용하는 경우의 오리피스인 실질적으로 관형인 오리피스와 결합한다. 기체 유입 오리피스는 배양 배지의 수위 위로 끝나는 튜브에 연결되어, 기체 또는 기체 혼합물이 배양 장치의 적어도 제4배지 이동 구역에 도달할 수 있도록 한다. 제4배지 이동 구역의 모든 주위 대기는 유사한 튜브에 의해 연결되어 기체 혼합물이 상부에 도달할 수 있다. 특히, 반응기의 바닥을 통해 기체 공급을 제공하기 위해 매우 높게 상승할 수 있는 높이로 적층가능한 모듈을 갖는 장치가 유리하다. 변형예에서, 기저부는 기체 물질을 자기 장치가 위치된 구역으로 운반하기 위한 기체 또는 기체 혼합물 공급 튜브를 포함한다. 이러한 방식으로, 유입된 기체는 자기 장치의 회전에 의해 교반되고, 배지의 이동에 의해 산소의 용해가 향상된다. 과량의 기체는 또한 교반되어 작은 기포 형태로 다시 위로 이동한다. 또한, 이러한 외부로부터 오리피스에 접근하기 위한 틈이 제공되어, 이러한 오리피스가 기체, 기체 혼합물, 신선한 배지 등의 공급원에 연결될 수 있도록 한다. 모듈의 상부 부분은 고정 수단에 의해 파지되고 베이스 모듈 하부에 있는 환형 씰에 의해 밀봉되도록 설계된 요소이다.
일부 구현예에서, 장치는 또한 커버를 통과하는 튜브 또는 장치의 벽 중 하나를 통과하는 튜브를 통한 영양소 공급을 포함한다. 마찬가지로, 가열 수단이 또한 장치 또는 모듈 또는 각각의 4개의 구역 모듈의 제1 또는 제4구역에 존재할 수 있다. 가능하게는, 장치는 또한 여러 개의 원심분리 펌프와 같은 여러 개의 배지 순환 수단을 포함할 수 있다. 이러한 장치는 제2구역의 바닥부에 있는 오리피스를 통해 진입할 때 및 결과적으로 제2구역을 또한 통과할 때에도 균질한 배양 배지의 흐름을 가능케 한다. 이는 제1구역이 제2구역과 직접 접촉하여 제2구역 전체에 걸쳐 비균질한 흐름을 야기하는 장치와는 대조적이다. 이러한 비균질한 흐름은 산소 및 영양소가 충분히 공급되지 못하고 세포 생장 및/또는 대사가 최적화되지 않는 세포 배양 구역 내의 공급 부족 또는 사멸 구역의 존재를 초래한다.
이러한 장치 및 방법의 특정 구현예는 장치 및 이의 사용에 관한 것으로서, 제3구역은 상기 제2구역의 내부 구역 및 상기 제1구역의 외부 구역이다. 제1구역의 상부 원통형 부분을 통해 제1구역의 기저부로부터 위쪽으로, 추가로, 제3이동 구역의 원통형 상부를 통해 제3구역의 기저부까지의 배지의 흐름은 제2구역의 바닥 부분으로 진입할 때 목적하는 균질한 흐름을 생성한다. 원통형 부분의 존재는 또한 제2구역에 진입하기 전에 이의 특성을 분석하기 위해 배지에 쉽게 접근하는 것을 가능케 한다. 원통형 요소의 존재는 또한 장치 내에 높은 압력이 축적되는 것을 방지한다. 또한 원통형 부분의 존재는 상이한 모듈을 포함하는 장치의 제조를 가능케 한다.
다른 구현예는 원통형 부분을 통한 액체 흐름이 통과되도록 하는 변형된 장치에 관한 것이다. 장치의 이러한 대안적인 구현예에서, 제3구역은 제2구역의 아래의 전체 및 제1구역 위의 전체에 위치한다. 장치의 일 구현예에서, 제1구역 및 제2구역의 원통형 부분에 상응하는 장치의 부분은 예컨대 플라스틱, 유리 또는 금속의 고체 요소로 대체된다.
다른 구현예에서, 제1구역 및 제2구역은 각각이 기저부에 상응하고 평평한 형상의 체적으로 이루어지며 원통형 부분이 없다. 이러한 개조로, 배양 배지는 오버플로우를 통해 제1구역에서 제3구역으로 동등하게 오버플로우될 수 있다. 교반 장치에 의해 생성된 배지의 흐름은 제1구역과 제3구역 사이의 분리 벽에 의해 균질화되고 제2구역에 진입 시 균질한 흐름을 야기한다.
특정 구현예에서, 제1구역과 제3구역 사이의 분리 벽은 수직 부분뿐만 아니라 수평 부분으로 이루어지며, 오버플로우를 갖는 이러한 수직 부분은 최대 약 5%, 최대 10%, 최대 20% 또는 최대 50%의 제3구역의 높이를 갖는다. 다른 특정 구현예에서, 제1구역과 제3구역 사이의 분리 벽의 수직 부분은 부재되어 있다.
특정 구현예에서, 고체 요소는 예컨대 제3구역에서 배지 상태(pH, 산소, 온도)를 측정하기 위해 예컨대 프로브를 포함하도록 개조된 채널이 제공된다. 다른 특정 구현예에서, 고체 요소는 과압이 제1구역 및 제3구역에서 형성될 때 개방될 수 있는 안전 압력 밸브를 포함하는 채널이 제공된다. 장치의 대안적인 구현예에서, 제1구역 및 제3구역 제2구역의 원통형 부분은 부재되어 있다. 요소에 의해 이전에 차지되어 있는 부피가 이제는 제2구역의 일부가 되어 세포 생장에 적절하도록 부피가 커져서 장치를 보다 효율적으로 사용할 수 있게 된다.
제3구역내로의 균질한 흐름 분배 없이 제1구역으로부터 제2구역으로의 배지의 직접적인 유입을 방지하기 위해, 제2구역의 바닥 벽의 오리피스는 제1구역과 제3구역 사이의 벽의 개구 위에 위치하는 영역에서 폐쇄된다. 개구 위에 폐쇄된 영역을 제공함으로써 장치를 개조하면, 제2구역으로 균질한 흐름으로서 들어가기 전에 배양 배지가 제1배양 배지 이동 구역으로부터 제3배양 배지 이동 구역으로 오버플로우 된다.
특정 구현예에서, 다수의 개구 및 상응 폐쇄 영역은 제1구역과 제3구역 사이의 분리된 벽, 및 제3구역과 제2구역 사이의 벽에 각각 제공된다. 전형적으로, 이러한 다수의 개구 및 상응 폐쇄 영역은 대칭적으로 분포되어 있다.
장치의 대안적인 구현예에서, 배지의 균질한 흐름은 제3구역 내에 흐름 재분배 요소를 제공함으로써 달성된다. 이러한 요소는 제2구역에 진입하기 전에 제3구역에서 균질한 액체 흐름을 수득하기 위해 제1구역으로부터 오는 배지의 적절한 재분배에 적합한 임의의 형상을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 요소는 환형, 다이아몬드형, 타원형 단면을 갖는 방사형으로 연장된 막대 세트의 형태를 가지며, 방사형으로 적용된 대응 개구들 위에 위치한다.
바이러스
본 발명의 특정 양태는 엔테로바이러스 A의 생산에 관한 것이다. 인간의 수족구 질환(HFMD)은 인간 엔테로바이러스 A (HEV-A) 군의 몇몇 구성원에 의해 야기된다. 인간 엔테로바이러스 A는, 또한 폴리오바이러스 및 리노바이러스를 포함하는, 비-외피, 양성-센스 RNA 바이러스의 피코르나바이러스 과에 속한다. HFMD를 유발할 수 있는 HEV-A 그룹 일원들은 엔테로바이러스 71 (EV71) 및 콕사키바이러스를 포함한다. 따라서, 제한하지 않고, 적절한 엔테로바이러스 A의 예로는, 엔테로바이러스 71 (EV71), 혈청형 A1, A2, A4, A5, A6, A8, A9, A10 또는 A16을 포함한 콕사키바이러스 A 균주, 또는 혈청형 B3 또는 B5를 포함하는 콕사키바이러스 B 균주 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본원에서 사용 된 용어 "CA6"는 "CVA6" 및 "콕사키바이러스 A6"와 상호 교환적으로 사용된다. 본원에서 사용 된 용어 "CA16"는 "CVA16" 및 "콕사키바이러스 A16"와 상호 교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 바이러스는 EV71, CA6 및 CA16로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 또는 세 가지 바이러스일 수도 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 바이러스는 EV71 및 CA6일 수도 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 바이러스는 EV71 및 CA16일 수도 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 바이러스는 CA6 및 CA16일 수도 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 바이러스는 EV71일 수도 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 엔테로바이러스 A는 본원에 개시된 백신 및/또는 면역원성 조성물 중 어느 하나에 사용될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 엔테로바이러스 A는 이를 필요로 하는 대상의 수족구 질환을 치료 또는 예방하고 및/또는 면역 반응, 예컨대 이를 필요로 하는 대상의 수족구 질환에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 데 유용한 하나 이상의 항원을 제공하는 데 사용될 수도 있다.
본 발명의 항원은 본 발명의 엔테로바이러스 A (예컨대, 본원에 기술된 방법에 의해 생산 및/또는 정제된 엔테로바이러스 A)로부터 유래될 수 있다 본 발명의 항원은 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 물질일 수도 있다. 적합한 항원의 예로는 전 바이러스(whole virus), 약독화 바이러스, 불활성화된 바이러스, 단백질, 폴리펩타이드(활성 단백질 및 단백질 내의 개별 폴리펩타이드 에피토프를 포함한), 글리코 폴리펩타이드, 리포 폴리펩타이드, 펩타이드, 다당류, 다당류 컨쥬게이트, 다당류 및 다른 분자의 펩타이드 및 비-펩타이드 모방체, 소분자, 지질, 당지질, 및 탄수화물을 포함하지만, 이들에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 엔테로바이러스 A는 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함할 수도 있다. 적응 돌연변이는 특정 세포주에서의 생장에 바이러스를 적응시켜서 발생될 수도 있다. 예를 들어, 세포는 바이러스로 형질감염되고 바이러스가 복제하고 그 핵산이 돌연변이되도록 계대될 수도 있다. 핵산 돌연변이는 점 돌연변이, 삽입 돌연변이, 또는 결실 돌연변이일 수도 있다. 핵산 돌연변이는 비-인간 세포에서 바이러스의 생장을 촉진하는 바이러스 단백질 내에서 아미노산 변화로 이어질 수 있다. 적응 돌연변이는 변경된 플라크 크기, 생장 역학, 온도 민감도, 약물 내성, 독성 및 세포 배양에서 바이러스 수율을 포함한, 바이러스 내의 표현형 변화를 촉진할 수도 있다. 이러한 적응 돌연변이는 세포주에서 배양된 바이러스의 속도와 수율을 증가시켜 백신 제조에 유용할 수도 있다. 또한, 적응 돌연변이는 면역원성 에피토프의 구조를 변경하여 바이러스 항원의 면역원성을 향상시킬 수도 있다.
따라서, 특정 구현예들에서, 본 발명의 엔테로바이러스 A는 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예들에서, 적응 돌연변이는 비-인간 세포에 대한 바이러스 항원의 돌연변이이다. 일부 구현예에서, 비-인간 세포는 포유동물 세포일 수도 있다. 비-인간 포유동물 세포의 예로는 제한하지 않고, 전술된 것들, 예컨대 (원숭이 신장 유래) VERO 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) 세포, MDCK 33016 (WO97/37001에 설명된 기탁 번호 DSM ACC 2219) 세포, BHK21-F 세포, HKCC 세포 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)를 포함한다. 일부 구현예에서, 비-인간 세포는 원숭이 세포일 수도 있다. 일부 구현예에서, 원숭이 세포는 Vero 세포주에서 유래한다. 적합한 Vero 세포주의 예로는, 제한하지 않고, WHO Vero 10-87, ATCC CCL-81, Vero 76 (ATCC 수탁 번호 CRL-1587), 또는 Vero C1008 (ATCC 수탁 번호 CRL-1586)을 포함한다.
엔테로바이러스 A, 예컨대 EV71는, CA6 및 CA16은 선형, 양성 센스, 단일 가닥 RNA 게놈을 갖는다. 이 바이러스 게놈의 각각은 구조적 및 비-구조적 폴리펩타이드 모두를 인코딩한다. 이러한 바이러스들 각각에 의해 인코딩된 구조적 폴리펩타이드는 제한하지 않고, VP1, VP2, VP3, VP4를 포함하며, 이들은 함께 바이러스 캡시드를 구성할 수도 있다. 이러한 바이러스들 각각에 의해 인코딩된 비-구조적 폴리펩타이드는 제한하지 않고, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C 및 3D를 포함하며, 이들은 예컨대, 바이러스 복제 및 독성에 연관된다.
따라서, 특정 구현예들에서, 본 발명의 엔테로바이러스 A는 제한하지 않고, VP1, VP2, VP3, 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C 및 3D를 포함한, 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 이상의 바이러스 항원 내에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 또는 그 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유할 수도 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 엔테로바이러스 A는 바이러스의 5' 또는 3' 비번역 영역 (UTR) 내에 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 또는 그 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유할 수도 있는, 전체, 불활성화 바이러스를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 EV71의 VP1 폴리펩타이드 내에 있다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA6의 VP1 폴리펩타이드 내에 있다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA6의 VP2 폴리펩타이드 내에 있다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA6의 VP3 폴리펩타이드 내에 있다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA16의 2A 폴리펩타이드 내에 있다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA16의 VP2 폴리펩타이드 내에 있다. 다른 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA16의 VP1 폴리펩타이드 내에 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항원은 비제한적으로 EV71, CA6 및 CA16을 포함하여, 본 발명의 엔테로바이러스 A의 5' 비번역 영역 (UTR) 내에 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 EV71의 VP1 폴리펩타이드 내에 있다. 예시적인 EV71 균주로부터 VP1 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
GDRVADVIESSIGDSVSRALTQALPAPTGQNTQVSSHRLDTGEVPALQAAEIGASSNTSDESMIETRCVLNSHSTAETTLDSFFSRAGLVGEIDLPLEGTTNPNGYANWDIDITGYAQMRRKVELFTYMRFDAEFTFVACTPTGEVVPQLLQYMFVPPGAPKPESRESLAWQTATNPSVFVKLTDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQEKDLEYGACPNNMMGTFSVRTVGSSKSKYPLVVRIYMRMKHVRAWIPRPMRNQNYLFKANPNYAGNSIKPTGTSRNAITTL (서열번호 1).
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 EV71의 VP1 폴리펩타이드 내의 1개 이상의 아미노산 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘(pairwise alignment algorithm)을 사용하여 EV71의 VP1 폴리펩타이드가 서열번호 1로 정렬되는 경우, 서열번호 1의 7, 14, 145, 및 282로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개의 아미노산 위치, 또는 서열번호 1의 7, 14, 145, 또는 282 위치에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘을 사용하여 서열번호 1로 정렬되는 경우, 서열번호 1의 7 위치 또는 서열번호 1의 7 위치에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘을 사용하여 EV71의 VP1 폴리펩타이드가 서열번호 1로 정렬되는 경우, 서열번호 1의 7 위치, 또는 서열번호 1의 7, 14, 145, 또는 282 위치 중 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 전부의 위치, 또는 서열번호 1의 7, 14, 145, 또는 282 위치에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 위치 7에서의 돌연변이는 발린의 메티오닌으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 14에서의 돌연변이는 아스파르트산의 아스파라긴으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 145에서의 돌연변이는 글루탐산의 글루타민으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 282에서의 돌연변이는 아스파라긴의 아스파르트산으로의 치환이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA6의 VP1 폴리펩타이드 내에 있다. 예시적인 CA6 균주로부터 VP1 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
NDPISNAIENAVSTLADTTISRVTAANTAASSHSLGTGRVPALQAAETGASSNASDENLIETRCVMNRNGVNEASVEHFYSRAGLVGVVEVKDSGTSQDGYTVWPIDVMGFVQQRRKLELSTYMRFDAEFTFVSNLNDSTTPGMLLQYMYVPPGAPKPDGRKSYQWQTATNPSIFAKLSDPPPQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHKQATNLQYGQCPNNMMGHFAIRTVSESTTGKNVHVRVYMRIKHVRAWVPRPFRSQAYMVKNYPTYSQTISNTAADRASITTTDYEGGVPANPQRTF (서열번호 2).
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA6의 VP1 폴리펩타이드 내의 1개 이상의 아미노산 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘을 사용하여 CA6의 VP1 폴리펩타이드가 서열번호 2로 정렬되는 경우, 서열번호 2의 46, 90, 96, 및 268로부터선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개의 아미노산위치, 또는 서열번호 2의 46, 90, 96, 및 268 위치에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘을 사용하여 CA6의 VP1 폴리펩타이드가 서열번호 2로 정렬되는 경우, 서열번호 2의 46, 90, 96, 및 268 위치 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 또는 4개 전부의 위치, 또는 서열번호 2의 46, 90, 96, 및 268 위치에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 위치 46에서의 돌연변이는 알라닌의 발린으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 90에서의 돌연변이는 글루탐산의 리신으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 96에서의 돌연변이는 트레오닌의 알라닌으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 268에서의 돌연변이는 발린의 이소류신으로의 치환이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA6의 VP2 폴리펩타이드 내에 있다. 예시적인 CA6 균주로부터 VP2 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
SPSVEACGYSDRVAQLTVGNSTITTQEAANIVLSYGEWPGYCPSTDATAVDKPTRPDVSVNRFYTLSTKSWKTESTGWYWKFPDVLNDTGVFGQNAQFHYLYRSGFCMHVQCNASKFHQGALLVVVIPEFVVAASSPAMKPNGQGLYPDFAHTNPGKEGQVFRDPYVLDAGIPLSQALVFPHQWINLRTNNCATIIMPYVNALPFDSALNHSNFGLAVIPISPLKYCNGATTEVPITLTIAPLNSEFSGLRQAIKQ (서열번호 3).
일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘을 사용하여 CA6의 VP2 폴리펩타이드가 서열번호 3으로 정렬되는 경우, 서열번호3의 144 위치 아미노산, 또는 서열번호 3의 144 위치에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 위치 144에서의 돌연변이는 글루타민의 리신으로의 치환이다.
일부 실시예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA6의 VP3 폴리펩타이드 내에 있다. 예시적인 CA6 균주로부터 VP3 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
GLPTELKPGTNQFLTTDDGTSPPILPGFEPTPLIHIPGEFTSLLDLCRIETILEVNNTTGTTGVNRLLIPVRAQNNVDQLCASFQVDPGRNGPWQSTMVGQICRYYTQWSGSLKVTFMFTGSFMATGKMLIAYTPPGSAQPTTREAAMLGTHIVWDFGLQSSVTLVIPWISNTHFRAVKTGGVYDYYATGIVTIWYQTNFVVPPDTPSEANIIALGAAQENFTLKLCKDTDEIRQTAEYQ (서열번호 4).
일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA6의 VP3 폴리펩타이드 내의 1개 이상의 아미노산 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘을 사용하여 CA6의 VP3 폴리펩타이드가 서열번호 4로 정렬되는 경우, 서열번호 4의 아미노산 위치 102, 또는 서열번호 4의 102 위치에 상응하는 위치에서 발생한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA6의 5' UTR 내에 있다. 예시적인 CA6 균주로부터 5' UTR의 핵산 서열은 다음과 같이 제시된다:
TTAAAACAGCTAGTGGGTTGCACCCACTCACAGGGCCCACTGGGCGCTAGCACACTGATTTCCCGGAATCCTTGTGCGCCTGTTTTATATCCCCTCCCCCATGCGCAACTTAGAAGCAATCTACACCTTCGATCAATAGCAGGCGTGGCGCGCCAGCCATGTCTAGATCAAGCACTTCTGTTTCCCCGGACTGAGTATCAATAAACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAATGTTCGTTACCCGGCTAACTACTTCGAGAAACCTAGTAGCACCATGAAAATTGCAGAGCGTTtCGcTCAGCGcTtCCCCcGCGtAGATCAGGCTGATGAGTCACTGCATTCCTCACGGGCGACCGTGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGTAACCCATGGGACGCTCTAATATGGACATGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACATACCCCCAAACCAGGGGGCGGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTCTTATATTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAAAGATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGAATAACAGAGCCTTGATATACCTTTTTGTAGGGTTTATACCACTTACTCTTCGCGTTGTTGAGACTCTAAAGTACATTCTAATCTTGAACACTAGAAA (서열번호 8).
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA6의 5' UTR 내의 하나 이상의 핵산 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘을 사용하여 CA6의 5' UTR이 서열번호 8로 정렬되는 경우, 서열번호 8의 1, 13, 14, 15, 16, 21, 23, 34, 및 40으로부터 선택된 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 또는 9개 이상의 핵산 위치, 또는 서열번호 8의 1, 13, 14, 15, 16, 21, 23, 34, 및 40 위치에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘을 사용하여 CA6의 5' UTR이 서열번호 8로 정렬되는 경우, 서열번호 8의 1, 13, 14, 15, 16, 21, 23, 34, 및 40의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상 또는 9개 모두의 아미노산 위치, 또는 서열번호 8의 1, 13, 14, 15, 16, 21, 23, 34, 및 40 위치에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 위치 1에서의 돌연변이는 티민의 구아닌으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 13에서의 돌연변이는 구아닌의 아데닌으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 14에서의 돌연변이는 티민의 구아닌으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 15에서의 돌연변이는 구아닌의 시토신으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 16에서의 돌연변이는 구아닌의 아데닌으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 21에서의 돌연변이는 시토신의 티민으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 23에서의 돌연변이는 시토신의 티민으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 34에서의 돌연변이는 구아닌의 티민으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 40에서의 돌연변이는 시토신의 구아닌으로의 치환이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA16의 2A 폴리펩타이드 내에 있다. 예시적인 CA16 균주로부터 2A 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
GKFGQQSGAIYVGNYRVVNRHLATHNDWANLVWEDSSRDLLVSSTTAQGCDTIARCDCQTGIYYCSSKRKHYPVSFTKPSLIFVEASEYYPARYQSHLMLAVGHSEPGDCGGILRCQHGVVGIVSTGGNGLVGFADVRDLLWLDEEAMEQ (서열번호 5).
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA16의 2A 폴리펩타이드 내의 1개 이상의 아미노산 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘을 사용하여 CA16의 2A 폴리펩타이드가 서열번호 5로 정렬되는 경우, 서열번호 5의 아미노산 위치 2, 또는 서열번호 5의 2 위치에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 위치 2에서의 돌연변이는 리신의 글루탐산으로의 치환이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA16의 VP2 폴리펩타이드 내에 있다. 예시적인 CA16 균주로부터 VP2 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
SPSAEACGYSDRVAQLTIGNSTITTQEAANIVIAYGEWPEYCPDTDATAVDKPTRPDVSVNRFFTLDTKSWAKDSKGWYWKFPDVLTEVGVFGQNAQFHYLYRSGFCVHVQCNASKFHQGALLVAVLPEYVLGTIAGGTGNENSHPPYATTQPGQVGAVLMHPYVLDAGIPLSQLTVCPHQWINLRTNNCATIIVPYMNTVPFDSALNHCNFGLLVIPVVPLDFNAGATSEIPITVTIAPMCAEFAGLRQAVKQ (서열번호 6).
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA16의 VP2 폴리펩타이드 내의 1개 이상의 아미노산 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘을 사용하여 CA16의 VP2 폴리펩타이드가 서열번호 6으로 정렬되는 경우, 서열번호 6의 아미노산 위치 161, 또는 서열번호 6의 161 위치에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 위치 161에서의 돌연변이는 메티오닌의 트레오닌으로의 치환이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA16의 VP1 폴리펩타이드 내에 있다. 예시적인 CA16 균주로부터 VP1 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 다음과 같이 제시된다:
GDPIADMIDQTVNNQVNRSLTALQVLPTAANTEASSHRLGTGVVPALQAAETGASSNASDKNLIETRCVLNHHSTQETAIGNFFSRAGLVSIITMPTTDTQNTDGYVNWDIDLMGYAQLRRKCELFTYMRFDAEFTFVVAKPNGVLVPQLLQYMYVPPGAPKPTSRDSFAWQTATNPSVFVKMTDPPAQVSVPFMSPASAYQWFYDGYPTFGEHLQANDLDYGQCPNNMMGTFSIRTVGTEKSPHSITLRVYMRIKHVRAWIPRPLRNQPYLFKTNPNYKGNDIKCTSTSRDKITTL (서열번호 7).
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA16의 VP1 폴리펩타이드 내의 1개 이상의 아미노산 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘을 사용하여 CA16의 VP1 폴리펩타이드가 서열번호 7로 정렬되는 경우, 서열번호 7의 99 및 145로부터 선택된 1개 이상 또는 2개의 아미노산 위치, 또는 서열번호 7의 99 또는 145 위치에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 위치 99에서의 돌연변이는 아스파르트산의 글리신으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 145에서의 돌연변이는 발린의 글루탐산으로의 치환이다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA16의 5' UTR 내에 있다. 예시적인 CA16 균주로부터 5' UTR의 핵산 서열은 다음과 같이 제시된다:
AGCCTGTGGGTTGTTCCCACCCACAGGGCCCAGTGGGCGCTAGCACACTGATTCTGCGGGATCTTTGTGCGCCTGTTTTATAACCCCTTCCCTAAGCAGCAACTTAGAAGTTTCACACAATCACGACCAGTAGTGGGCGTGGCGCGCCAGTCACGTCTTGGTCAAGCACTTCTGTTCCCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAACGTTCGTTATCCGGCTAACTACTTCGAGAAACCTAGtAGCACCGTGAAAGTTGCGGAGtGTttCGCTCAGCACTTCCCCCGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACTGTAAACCCCACGGGCGACCGTGACAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGTAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGTGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTAGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACGCACCCTCAACCCAGGGGGCGGCGTGTCGTAATGGGTAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTCCTTATTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAAAAGTTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGTCTAACAGAGCTATTGTTTACCTATTTATTGGATACGTCCCTCTTAATCTCAAGGCCATTCAAACTCTTGATTATATATTGCTCCTTAACTGTAAGAAA (서열번호 9).
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 CA16의 5' UTR 내의 1개 이상의 핵산 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘을 사용하여 CA16의 5' UTR가 서열번호 9로 정렬되는 경우, 서열번호 9의 위치 6 및 33으로부터 선택된 1개 이상 또는 2개의 핵산 위치, 또는 서열번호 9의 6 또는 33 위치에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 쌍 정렬 알고리즘을 사용하여 CA16의 5' UTR가 서열번호 9로 정렬되는 경우, 서열번호 9의 위치 6 및 33 둘 다, 또는 서열번호 9의 6 및 33 위치에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구현예에서, 위치 6에서의 돌연변이는 구아닌의 아데닌으로의 치환이다. 일부 구현예에서, 위치 33에서의 돌연변이는 구아닌의 시토신으로의 치환이다.
본 발명의 상기 구현예들에서, 예시적인 쌍 정렬 알고리즘은 디폴트 파라미터(예, 갭 오프닝 패널티=10.0 포함, 갭 연장 페널티=0.5 포함, EBLOSUM62 점수 매트릭스 사용함)를 사용하는 니들-분쉬 글로벌 정렬 알고리즘(Needleman-Wunsch global alignment algorithm)이다. 이 알고리즘은 EMBOSS 패키지로 상기 니들 툴에서 편리하게 구현된다.
일부 구현예에서, 엔테로바이러스 A는 본 발명의 임의의 백신 및 면역원성 조성물에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 엔테로바이러스 A는 이를 필요로 하는 대상의 수족구 질환을 치료 또는 예방하고 및/또는 이를 필요로 하는 대상의 수족구 질환에 대한 면역 반응, 예컨대 보호성 면역 반응을 유도하는 데 유용할 수도 있다.
항원의 생산
제한하지 않고, 정제된 바이러스, 불활성화된 바이러스, 약독화 바이러스, 재조합 바이러스, 또는 서브유닛 백신에 대한 정제된 및/또는 재조합 바이러스 단백질을 비롯하여, 백신 및/또는 면역원성 조성물에 사용해서 수족구 질환을 치료 또는 예방하고 및/또는 면역 반응, 예컨대 수족구 질환에 대한 보호성 면역 반응을 유도하기 위한 본 발명의 항원이, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생산 및/또는 정제되거나 또는 그렇지 않으면 단리될 수도 있다. 제한하지 않고, 본 발명의 항원은 전 바이러스(whole virus), 약독화 바이러스, 불활성화된 바이러스, 단백질, 폴리펩타이드 (활성 단백질 및 단백질 내의 개별 폴리펩타이드 에피토프를 포함한), 글리코 폴리펩타이드, 리포 폴리펩타이드, 펩타이드, 다당류, 다당류 컨쥬게이트, 다당류 및 다른 분자의 펩타이드 및 비-펩타이드 모방체, 소분자, 지질, 당지질, 탄수화물을 포함하며, 수족구 질환을 유발하는 적어도 하나의 바이러스로부터 생산, 유도, 정제 및/또는 그렇지 않으면 단리된다. 예를 들어, 적절한 항원은, 제한하지 않고, 바이러스 예컨대 EV71, CA6, 및 CA16으로부터 구조적 폴리펩타이드 예컨대 VP1, VP2, VP3, 및 VP4, 및 비-구조적인 폴리펩타이드예컨대 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 및 3D를 포함할 수 있다.
본 발명의 항원은 화학적 또는 효소적 합성, 재조합적 생산, 천연 원료로부터 단리 또는 이들의 조합일 수도 있다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 항원은 EV71, CA6 및 CA16 같은 수족구 질환을 유발하는 본 발명의 적어도 하나의 바이러스에서 생산, 정제, 단리 및/또는 유래된다. 본 발명의 항원은 정제된, 부분 정제된 또는 미정제 추출물일 수도 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 항원은 "백신 및 면역원성 조성물 제조"라는 상기 섹션에 기재된 바와 같이 제조된, 바이러스, 예컨대 불활성화된 바이러스이다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 하나 이상의 항원은 비-인간 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 항원의 생산에 적합한 세포주는 바람직하게는 포유동물 기원이며, 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: (원숭이 신장 유래) VERO 세포, 말, 소 (예, MDBK 세포), 양 개 (예, 개 신장 유래 MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) 또는 MDCK 33016, WO97/37001에 기재된 기탁 번호 DSM ACC 2219), 고양이, 및 설치류 (예, 햄스터 세포, 예컨대 BHK21-F, HKCC 세포, 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)), 및 예를 들어, 성인, 신생아, 태아 및 배아를 포함한, 광범위한 발달 단계에서 얻을 수 있다. 특정 구현예들에서, 세포는 불멸화된다 (예, WO01/38362 및 WO02/40665에 기재된, PERC.6 세포, 및 ECACC 기탁 번호 96022940 하에 기탁됨). 바람직한 구현예에서, 포유동물 세포가 이용되고, 다음의 비-제한적인 세포 유형 중 하나 이상으로부터 선택 및/또는 유도될 수도 있다: 섬유아세포 세포 (예, 피부, 폐), 내피세포 (예, 대동맥, 동맥, 폐, 혈관, 피부 미세 혈관, 제대), 간세포, 각질 세포, 면역 세포 (예, T 세포, B 세포, 대식세포, NK, 수지상), 유방 세포 (예, 상피), 평활근 세포 (예, 혈관, 동맥, 관상 동맥, 자궁, 기관지, 자궁경부, 망막 주연세포), 멜라닌 세포, 신경 세포 (예, 성상세포), 전립선 세포 (예, 상피, 평활근), 신장 세포 (예, 상피, 사구체 간질, 근위 세뇨관), 골격 세포 (예, 연골 세포, 파골 세포, 골 모세포), 근육 세포 (예, 근아세포, 골격근, 평활, 기관지), 간세포, 망막아세포, 및 간질 세포. WO97/37000 및 WO97/37001는 현탁액과 무혈청 배지에서 생장할 수 있으며 바이러스 항원의 생산에 유용한 동물 세포와 세포주의 생산을 설명한다. 특정 구현예들에서, 비-인간 세포는 무혈청 배지에서 배양된다.
폴리펩타이드 항원은 액체 크로마토그래피 (예, 고성능 액체 크로마토그래피, 고속 단백질 액체 크로마토그래피 등), 크기 배제 크로마토그래피, (1차원 겔 전기 영동, 2차원 겔 전기영동을 포함한) 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 또는 기타 정제 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 단백질 정제의 표준 방법을 이용하여 천연 원료로부터 단리될 수도 있다. 많은 구현예에서, 항원은 예를 들어, 약 50% 내지 약 75% 순도, 약 75% 내지 약 85% 순도, 약 85% 내지 약 90% 순도, 약 90% 내지 약 95% 순도, 약 95% 내지 약 98% 순도, 약 98% 내지 약 99% 순도, 또는 99% 순도 초과의, 정제된 항원이다.
이러한 기술이 당업자에게 공지된 경우, 고상 펩타이드 합성 기술을 사용할 수 있다. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides (Clarendon Press, Oxford) (1994)을 참조한다. 일반적으로, 이러한 방법들에서 펩타이드는 고상 결합된 생장하는 펩타이드 사슬에 활성화된 단량체 단위를 순차적으로 첨가해서 생산된다.
확립된 재조합 DNA 기술은 폴리펩타이드의 생산을 위해 사용될 수 있으며, 이때 예컨대, 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 구조체는 적절한 숙주 세포 (예, 시험관내 세포 배양물, 예를 들면, 효모 세포, 곤충 세포, 포유동물 세포 등에서 단세포성 엔티티로서 생장한 진핵 숙주 세포) 또는 (예, 시험관내 세포 배양물에서 생장한) 원핵 세포, 유전자 변형된 숙주 세포 발생 내로 도입되며; 적절한 배양 조건 하에서, 단백질은 유전자 변형 숙주 세포에 의해 생산된다.
사멸 및 약독화 바이러스 면역원성 조성물 외에, 동물에게 수족구 질환 바이러스의 항원 성분을 제시하는 서브유닛 면역원성 조성물 또는 면역원성 조성물의 다른 유형을 사용할 수 있다. 항원 성분은 인체에 주입할 때, 인간이 수족구 질환에 대한 보호 면역성을 개발하도록 인간에서 면역 반응을 촉진하는, 단백질, 당단백질, 지질-공역 단백질 또는 당단백질, 변형된 지질 모이어티, 또는 기타 바이러스 성분일 수도 있다. 서브유닛 면역원성 조성물의 경우, 바이러스는 상술한 바와 같이, 포유동물 세포에서 배양될 수 있다. 세포 배양은 균질화될 수 있고, 면역원성 조성물은 적정한 컬럼 위에서 또는 적정한 기공 크기 필터를 통해서 또는 세포 배양 균질물의 원심분리를 통해서 세포 배양 균질물의 계대에 의해 단리될 수 있다.
항원 성분이 단백질인 경우, 이어서 단백질을 암호화하는 핵산을 단리시키고 단리된 핵산을 포함하는 면역원성 조성물을 생성할 수 있다. 항원 성분을 인코딩하는 핵산은 진핵세포 프로모터의 신호 서열의 하류 플라스미드 상에 배치될 수 있다. 그 플라스미드는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 약독화된 원핵 유기체, 예컨대 살모넬라 종, 시겔 종, 또는 기타 적절한 박테리아 내로 형질감염될 수 있다. 그런 다음 박테리아는 인간이 항원 성분에 대한 보호성 면역 반응을 발생할 수 있도록 인체에 투여될 수 있다. 대안적으로, 항원 성분을 인코딩하는 핵산이 원핵 프로모터의 하류에 배치될 수 있으며, 하나 이상의 선택성 마커를 가지고, 약독화된 원핵 유기체, 예컨대 살모넬라 종, 시겔 종, 또는 기타 적절한 박테리아 내로 형질감염될 수 있다. 그런 다음 박테리아는 관심있는 항원에 대한 면역 반응이 요구되는 진핵세포 대상에게 투여될 수 있다. 예를 들어, Hone 등의 미국 특허 제6,500,419호 등을 참조하기로 한다.
서브유닛 면역원성 조성물의 경우, 수족구 질환 바이러스의 단백질성 항원 성분을 인코딩하는 핵산은 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/32047 (Galen) 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 02/083890 (Galen)에 기재된 바와 같은 플라스미드로 클로닝될 수 있다. 그런 다음 플라스미드는 박테리아에 형질감염될 수 있고, 박테리아는 원하는 항원 단백질을 생산할 수 있다. 두 특허 출원 모두에 기재된 다양한 방법에 의해 원하는 항원 단백질을 단리시키고 정제할 수 있다.
바이러스 불활성화
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 생산 및/또는 정제된 엔테로바이러스 A는 불활성화되어 있다. 바이러스를 불활성화시키거나 사멸시켜서 포유동물 세포를 감염시키는 능력을 파괴하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 방법은 화학적 및 물리적 수단을 모두 포함한다. 바이러스를 불활성화하기 위한 적합한 수단은 제한하지 않고, 세제, 포르말린("포름알데히드"로도 지칭함), 베타-프로피오락톤 (BPL), 바이너리 에틸아민 (BEI), 아세틸 에틸렌이민, 열, 전자기 방사선, x-선 방사선, 감마선, 자외선 (UV 방사선), UV-A 방사선, UV-B 방사선, UV-C 방사선, 메틸렌 블루, 소랄렌(psoralen), 카르복시풀러렌(carboxyfullerene) (C60) 및 이들의 임의의 조합에서 선택된 하나 이상의 제제의 유효량에 의한 처리를 포함한다.
화학적 불활성화제, 화학적 불활성화 방법은 당업계에 주지되어 있으며 본원에서 설명된다. 일부 구현예에서, 엔테로바이러스 A는 BPL, 포르말린 또는 BEI 중 하나로 화학적으로 불활성화된다. 엔테로바이러스 A가 BPL로 화학적으로 불활성화된 특정 구현예에서, 바이러스는 하나 이상의 변형을 포함할 수도 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 변형된 핵산을 포함할 수도 있다. 일부 구현예에서, 변형된 핵산은 알킬화 핵산이다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 변형은 변형된 폴리펩타이드를 포함할 수도 있다. 일부 구현예에서, 변형된 폴리펩타이드는 변형된 시스테인, 메티오닌, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 티로신, 리신, 세린, 및 트레오닌 중 하나 이상을 포함하는 변형된 아미노산 잔기를 포함한다. 엔테로바이러스 A가 포르말린으로 화학적으로 불활성화된 특정 구현예에서, 바이러스는 하나 이상의 변형을 포함할 수도 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 변형된 폴리펩타이드를 포함할 수도 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 가교 결합된 폴리펩타이드를 포함할 수도 있다. 엔테로바이러스 A가 포르말린으로 화학적으로 불활성화된 일부 구현예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 포르말린을 더 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 엔테로바이러스 A는 BEI로 불활성화되었다. 엔테로바이러스 A가 BEI로 화학적으로 불활성화된 특정 구현예에서, 바이러스는 하나 이상의 변형을 포함할 수도 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 변형은 변형된 핵산을 포함할 수도 있다. 일부 구현예에서, 변형된 핵산은 알킬화 핵산이다.
엔테로바이러스 A가 BEI 또는 BPL로 화학적으로 불활성화된 일부 구현예에서, 임의의 잔류 미반응 BEI 또는 BPL은 티오황산 나트륨으로 중화(즉, 가수분해)될 수도 있다. 일반적으로, 티오황산 나트륨은 과량으로 첨가된다. 일부 구현예에서, 티오황산 나트륨은 약 25mM 내지 약 100mM, 약 25mM 내지 약 75mM, 또는 약 25mM 내지 약 50mM 범위의 농도로 첨가될 수도 있다. 특정 구현예들에서, 티오황산 나트륨은 1부 농축 티오황산 나트륨 대 BEI 20부 비율로 약 25mM, 약 26mM, 약 27mM, 약 28mM, 약 29mM, 약 30mM, 약 31mM, 약 32mM, 약 33mM, 약 34mM, 약 35mM, 약 36mM, 약 37mM, 약 38mM, 약 39mM, 또는 약 40mM의 농도로 첨가될 수도 있다. 일부 구현예에서, 용액은 인-라인 정적 혼합기와 같은 혼합기를 사용하여 혼합되고, 이어서 후속적으로 여과(예, 정화)될 수도 있다. 일반적으로, 혼합기를 통한 두 용액의 펌핑 결과 완전한 혼합 및 티오황산 나트륨에 의한 BEI의 중화가 일어난다.
본 발명의 특정 구현예는 엔테로바이러스 A를 불활성화시키는 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 바이러스 제제를 유효량의 BEI로 처리하는 것을 포함한다. 특정 구현예들에서, BEI의 유효량으로 처리하는 단계는 제한하지 않고, 약 0.25% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위의 양으로 BEI로 처리하는 것을 포함한다. 특정 구현예들에서, 단리 및 처리된 바이러스는 EV71, CA6 및 CA16 중 하나 이상으로부터 선택된다. 상기 방법의 특정 구현예들에서, 바이러스 제제는 약 25°C 내지 약 42°C 범위의 온도에서 BEI로 처리된다. 상기 방법의 특정 구현예들에서, 바이러스 제제는 약 1 시간 내지 약 10 시간 범위의 시간 동안 BEI으로 처리된다. 특정 구현예들에서, 상기 방법은 티오황산 나트륨의 유효량으로 미반응 BEI를 불활성화(즉, 가수분해)시키는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 티오황산 나트륨의 유효량은 약 25mM 내지 약 100mM, 약 25mM 내지 약 75mM, 또는 약 25mM 내지 약 50mM 범위이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 베타-프로피오락톤(BPL)의 유효량으로 바이러스 제제를 처리하는 단계; 및 선택적으로, 베타-프로피오락톤(BPL)의 유효량으로 바이러스 제제를 처리하는 단계와 동시 또는 이후 포르말린의 유효량으로 바이러스 제제를 처리하는 단계와 연관된다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 상기 방법은 제1 시간 동안 베타-프로피오락톤(BPL)의 유효량으로 바이러스 제제를 처리하는 단계; 및 제2 시간 동안 BPL의 유효량으로 바이러스 제제를 처리해서 바이러스 제제를 완전히 불활성화시키는 단계와 연관된다. 일부 구현예에서, 제1 시간 및/또는 제2 시간은 약 12 시간 내지 약 36 시간 범위이다. 특정 구현예들에서 제1 시간 및/또는 제2 시간은 약 24 시간이다. 특정 구현예들에서, BPL의 유효량으로 처리하는 단계는 제한하지 않고, 약 0.05% v/v 내지 약 3.0% v/v, 0.1% v/v 내지 약 2% v/v, 또는 약 0.1% v/v 내지 약 1% v/v 범위의 양의 BPL로 처리하는 것을 포함한다. 특정 구현예들에서, BPL의 유효량으로 처리하는 단계는 제한하지 않고, 0.05% v/v, 0.06% v/v, 0.07% v/v, 0.08% v/v, 0.09% v/v, 0.1% v/v, 0.2% v/v, 0.3% v/v, 0.4% v/v, 0.5% v/v, 0.6% v/v, 0.7% v/v, 0.8% v/v, 0.9% v/v, 또는 1% v/v BPL로 처리하는 것을 포함한다. 특정 구현예들에서, 단리 및 처리된 바이러스는 EV71, CA6 및 CA16 중 하나 이상으로부터 선택된다. 상기 방법의 특정 구현예들에서, 바이러스 제제는 약 2°C 내지 약 8°C 범위의 온도에서 BEI로 처리된다. 특정 구현예들에서, 상기 방법은 BPL을 가수분해하기에 충분한 시간 동안 37°C의 온도에서 바이러스 제제를 가열하는 것을 포함한다. 특정 구현예들에서, 상기 시간은 약 1 시간 내지 약 6 시간이다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 상기 방법은 티오황산 나트륨의 유효량으로 미반응 BPL을 불활성화(즉, 가수분해)시키는 것을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 티오황산 나트륨의 유효량은 약 25mM 내지 약 100mM, 약 25mM 내지 약 75mM, 또는 약 25mM 내지 약 50mM 범위이다.
일부 구현예에서, 이러한 방법은 바이러스 제제를 유효량의 포르말린으로 처리하는 단계; 및 바이러스 제제를 포르말린으로부터 정제하는 단계를 포함한다. 특정 구현예들에서, 포르말린의 유효량으로 처리하는 단계는 제한하지 않고, 약 0.05% v/v 내지 약 3.0% v/v, 0.1% v/v 내지 약 2% v/v, 또는 약 0.1% v/v 내지 약 1% v/v 범위의 양의 포르말린으로 처리하는 것을 포함한다. 특정 구현예들에서, 단리 및 포르말린 처리된 바이러스는 EV71, CA6 및 CA16 중 하나 이상으로부터 선택된다. 특정 구현예들에서, 바이러스 제제는 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 그 이상인 양의 포르말린에서 고도로 정제된다.
백신 및/또는 면역원성 조성물의 제형
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 방법에 의해 생산된 조성물, 면역원성 조성물, 및/또는 바이러스 (예컨대, 본 발명의 엔테로바이러스 A)를 포함하는 백신에 관한 것이다. 이러한 조성물, 백신 및/또는 면역원성 조성물은 예를 들어, 이를 필요로 하는 대상의 수족구 질환을 치료 또는 예방하고 및/또는 이를 필요로 하는 대상의 수족구 질환에 대한 면역 반응, 예컨대 보호성 면역 반응을 유도하는 데 유용할 수도 있다.
일반적으로, 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 액체 용액 또는 현탁액 중 하나로서 주사제로 제조된다; 주사 전 액체 중의, 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태도 제조될 수도 있다. 이러한 제제는 또한 유화 또는 건조 분말로서 제조될 수도 있다. 활성 면역원성 성분은 종종 약제학적으로 허용 가능하고 활성 성분과 호환되는 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 수크로오스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합을 포함한다. 또한, 원하는 경우, 백신 또는 면역원성 조성물은 백신 또는 면역원성 조성물의 효능을 향상시키는 습윤제 또는 에멀젼, pH 완충제 또는 보강제와 같은 보조 물질을 함유할 수도 있다.
백신 또는 면역원성 조성물은 통상 주사, 예를 들어, 피하, 경피, 피내, 진피하 또는 근육내 중 하나에 의해 비경구 투여될 수도 있다. 다른 투여 방식에 적합한 추가적인 제형은 경우에 따라, 구강, 경구, 비강내, 볼, 설하, 복강내, 질내, 항문 및 두개내 제형을 포함한다. 좌약의 경우, 기존의 바인더와 담체는, 예를 들어, 폴리알카렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함할 수도 있으며; 이러한 좌약은 0.5% 내지 10%, 심지어 1-2%의 범위인 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 특정 구현예들에서, 지방산 글리세라이드 또는 코코아 버터의 혼합물 같은 저 융점 왁스는 먼저 용융되고 본원에 기재된 수족구 질환 백신 또는 면역원성 조성물 항원은, 예를 들어, 교반에 의해 균질하게 분산된다. 그런 다음 용융된 균질 혼합물을 편리한 크기의 주형에 부어서, 냉각되고 고화될 수 있게 한다.
비강내 전달에 적합한 제형은 액체 (예, 에어로졸 또는 비강 액으로서 투여 목적 수용액) 및 건조 분말 (예, 비강 통로 내 급속 침적 목적)을 포함한다. 제형은 보통 사용되는 부형제, 예를 들면, 만니톨, 락토오스, 수크로오스, 트레할로스, 자일리톨, 키토산의 약제학적 등급을 포함한다. 키토산 등의 점막부착성 제제는 액체 또는 분말 제형 중 하나에 사용되어서 비강내 투여 제형의 점막 섬모의 제거를 지연시킬 수 있다. 만니톨 및 수크로오스 같은 당은 액체 제형 내의 안정화제로서와 건조 분말 제형 내의 안정성, 벌크화 또는 분말 유동 및 사이즈 제로서 사용될 수 있다. 또한, 보강제, 예컨대 모노포스포릴 지질 A (MLA), 또는 이의 유도체, 또는 CpG 올리고뉴클레오티드는 면역 자극성 보강제로서 액체와 건조 분말 제형 모두에서 사용될 수 있다.
경구 전달에 적합한 제형은 액체, 고체, 반-고체 겔, 정제, 캡슐, 캔디 등을 포함한다. 구강 전달에 적합한 제형은 정제, 캔디, 캡슐, 겔, 액체, 식품, 음료, 기능성 식품 등을 포함한다. 제형은 보통 사용되는 부형제, 예를 들어, 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등의 약제학적 등급을 포함한다. 다른 수족구 질환 백신과 면역원성 조성물은 용액, 현탁액, 알약, 서방형 제형 또는 분말의 형태를 취할 수도 있으며 활성 성분의 10-95%, 또는 25-70%를 포함할 수도 있다. 구강 제형의 경우, 콜레라 독소는 흥미로운 제형 파트너(또한 가능한 접합 파트너)이다.
질내 투여 목적으로 제형화된 경우 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물은 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이의 형태일 수도 있다. 상기 제형 중 어느 하나는 당업계에서 적절한 것으로 공지된, 담체 같은, 수족구 질환 백신과 면역원성 조성물 항원에 부가하여 제제를 함유할 수도 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물은 전신 또는 국소 전달을 위해 제형화될 수도 있다. 이러한 제형은 당업계에 주지되어 있다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 유당화 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제 (예컨대 링거 덱스트로스 기반으로 하는 것) 등을 포함한다. 전신 및 국소 투여 경로는, 예를 들어, 피내, 국소 적용, 정맥내, 근육내 등을 포함한다.
본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 투여량 제형과 호환하는 방식으로 투여될 수도 있으며, 이러한 양은 치료학적으로 효과적이고 면역원성일 것이다. 투여될 양은 예를 들면, 개인의 면역 시스템의 면역 반응을 탑재하는 능력, 원하는 보호 정도를 포함하여, 치료될 대상에 따라 달라진다. 적합한 투여량 범위는 약 0.1?g 내지 10?g (심지어 1-10mg의 범위 내에서 더 많은 양이 고려된다 하더라도)의 예시적인 범위로, 예컨대 약 0.1?g 내지 5?g의 범위, 또는 심지어 0.6?g 내지 3?g의 범위 또는 약 1?g 내지 3?g, 또는 심지어 0.1?g 내지 1?g의 범위에서 백신접종 당 수백 마이크로그램 활성 성분의 순서를 갖는다. 특정 구현예들에서, 투여량은 투여량 당 약 0.1?g, 약 0.2?g, 약 0.3?g, 약 0.4?g, 약 0.5?g, 약 0.6?g, 약 0.7?g, 약 0.8?g, 약 0.9?g, 약 1?g, 약 1.1?g, 약 1.2?g, 약 1.3?g, 약 1.4?g, 약 1.5?g, 약 1.6?g, 약 1.7?g, 약 1.8?g, 약 1.9?g, 약 2?g, 약 2.1?g, 약 2.2?g, 약 2.3?g, 약 2.4?g, 약 2.5?g, 약 2.6?g, 약 2.7?g, 약 2.8?g, 약 2.9?g, 또는 약 3?g일 수 있다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 투여량 당 1?g의 양으로 투여될 수도 있다. 다가 백신, 예를 들면, EV71, CA6 및 CA16 중 둘 이상으로부터의 항원을 포함하는 2가 또는 3가 백신 및/또는 면역원성 조성물인, 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물에서, 각 성분의 투여량은 당량 투여 비율 (즉, 2가 백신의 경우 1:1 및 3가 백신의 경우 1:1:1 및/또는 면역원성 조성물)로 투여된다.
초기 투여 및 추가 샷에 적절한 처방은 또한 가변적이지만 후속 접종 또는 다른 투여가 이어지는 초기 투여에 의해 정형화된다.
적용 방식은 광범위하게 변할 수 있다. 백신 또는 면역원성 조성물의 투여를 위한 기존의 방법 중 어느 하나가 적용 가능하다. 이들은 고체 생리학적 허용 가능한 염기 또는 생리학적 허용 가능한 분산액 내에 주사 등에 의해, 비경구적으로, 경구 적용을 포함한다. 백신 또는 면역원성 조성물의 투여량은 투여 경로에 달라질 것이며 백신접종되는 인간의 연령 및 항원의 제형에 따라 달라질 것이다. 본원에 기재된 백신 또는 면역원성 조성물은 0.5㎖ 초과, 0.5㎖ 또는 0.5㎖ 미만의, 단위 투여량을 가질 수 있다. 예를 들어, 0.25㎖의 부피로 투여될 수 있다.
점막부착을 개선하는 전달 제제는 또한 전달 및 면역원성, 특히 비강내, 구강 또는 폐 기반 전달 제형을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 이러한 화합물, 키토산, 키틴의 N-탈아세틸화 형태는, 많은 약제학적 제형에 사용된다. 이것의 점액섬모 제거를 지연시키는 능력 및 점막 항원 흡수 및 처리에 더 많은 시간을 허용할 수 있는 능력으로 인해 비강내 백신 전달을 위한 매력적인 점막부착 제제이다. 또한, NALT로 항원의 상피통과 수송을 향상시킬 수도 있는 단단한 접합부를 일시적으로 개방할 수 있다. 최근 인간 연구에서, 키토산은 있지만 아무런 추가 보강제 없이 비강내 투여된 3가 불활성화 인플루엔자 백신은 혈청전환(seroconversion) 및 근육내 접종 후 얻은 것들보다 근소하게 더 낮았던 HI 역가를 수득했다.
키토산은 또한 유전적으로 해독된 대장균 이열성 장내독소(heat-labile enterotoxin) 돌연변이 LTK63 같은 비강내 잘 기능하는 보강제와 함께 제형화될 수 있다. 이것은 향상된 점막 및 전신성 반응을 초래하는 키토산에 의해 부여된 전달 및 부착 이점의 최상위에 면역자극 효과를 추가한다.
마지막으로, 키토산 제형이 백신 안정성을 향상시키고 액체 제형 위에 점액섬모 제거에서 추가의 지연 결과를 초래하도록 나타난 건조 분말 형태로 제조될 수 있음을 유의해야 한다. 이는 비강내 경로가 분비 IgA 반응의 추가 혜택과 함께 기존의 근육내 경로만큼 효과적인 키토산과 제형화된 비강내 건조 분말 디프테리아 톡소이드 백신을 포함하는 최근 인간의 임상 시험에서 관찰되었다. 이 백신은 또한 매우 내성이 좋았다. 키토산과 MLA, 또는 이들의 유도체를 함유하는 탄저병 용 비강내 건조 분말 백신은, 근육내 접종보다 토끼에서 더 강한 응답을 유도하며 또한 에어로졸 포자 시험접종에 대하여 보호성이다.
비강내 백신은 하부 호흡기도에 영향을 미치는 것에 더 나은 비경구 투여된 백신과 달리 상부 및 하부 호흡기도에 영향을 미칠 수 있으므로 예시적인 제형을 나타낸다. 이것은 알레르기 기반 백신에 내성을 유도하고 병원균 기반 백신에 대한 면역을 유도하는 데에 이익이 될 수 있다.
상부 및 하부 호흡기도 모두에 보호를 제공하는 데에 더하여, 비강내 백신은 바늘 접종의 합병증을 회피하고 미립자 및/또는 가용성 항원의 비인두-연관 림프 조직(nasopharyngeal-associated lymphoid tissues, NALT)과의 상호작용을 통해 점막 전신 체액성 및 세포성 반응을 모두 유도하는 수단을 제공한다.
본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 약제학적으로 허용 가능하다. 그들은 항원과 보강제 이외의 성분들을 포함할 수도 있으며, 예를 들어 일반적으로 하나 이상의 약제학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)를 포함할 것이다. 이러한 성분들에 대한 심도있는 논의는 Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472에서 입수 가능하다.
삼투압을 조절하기 위해서, 예컨대 나트륨 염 같은, 생리학적 염을 포함하는 것이 바람직하다. 염화 나트륨(NaCl)이 바람직하며, 1 내지 20mg/ml로 존재할 수도 있다. 존재할 수 있는 다른 염으로는 염화 칼륨, 인산 이수소 칼륨, 인산 이나트륨 탈수화물, 염화 마그네슘, 염화 칼슘 등을 포함한다.
본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수도 있다. 일반적인 완충제는 다음을 포함한다: 인산 완충액; 트리스 완충액; 붕산염 완충액; 숙신산염 완충액; (특히, 수산화 알루미늄 보강제 함유) 히스티딘 완충액; 또는 시트르산염 완충액. 완충액은 일반적으로 5-20mM 범위에 포함될 것이다.
백신 또는 면역원성 조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1 사이, 보다 전형적으로 6.0 내지 8.0 사이, 예를 들어 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8 사이에 있을 것이다. 본 발명의 제조 공정은 따라서 포장하기 전에 벌크 백신의 pH를 조정하는 단계를 포함할 수도 있다.
백신 또는 면역원성 조성물은 바람직하게는 무균성이다. 그것은 바람직하게는 비 발열성으로, 예를 들어 투여량 당 <1 EU (장내독소 유닛, 표준 측정), 및 바람직하게는 투여량 당 <0.1 EU를 포함한다. 그것은 바람직하게는 글루텐 프리이다.
특정 구현예들에서, 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 유효한 농도의 세제를 포함할 수도 있다. 일부 구현예들에서, 세제의 유효량은 제한하지 않고, 약 0.00005% v/v 내지 약 5% v/v 또는 약 0.0001% v/v 내지 약 1% v/v를 포함할 수도 있다. 특정 구현예들에서, 세제의 유효량은, 약 0.001% v/v, 약 0.002% v/v, 약 0.003% v/v, 약 0.004% v/v, 약 0.005% v/v, 약 0.006% v/v, 약 0.007% v/v, 약 0.008% v/v, 약 0.009% v/v, 또는 약 0.01% v/v이다. 이론에 구속되고자 하지 않고, 세제는 용액 중 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물을 유지하는 데 도움이 되고 백신 및/또는 면역원성 조성물이 응집되지 않도록 하는 데 도움이 된다.
적합한 세제는, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 ('Tweens'라고도 함), 옥톡시놀 (예컨대 옥톡시놀-9 (Triton X 100) 또는 t 옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 브롬화 세틸 트리메틸 암모늄 ('CTAB') 및 데옥시콜산 나트륨 (특히 분할 또는 표면 항원 백신 용)을 포함한다. 세제는 미량으로 존재할 수도 있다. 미량의 다른 잔류 성분은 항생제일 수 있다 (예, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B). 일부 구현예에서, 세제는 폴리소르베이트를 함유한다. 일부 구현예에서, 세제의 유효 농도는 약 0.00005% v/v 내지 약 5% v/v의 범위를 포함한다.
백신 및/또는 면역원성 조성물은 바람직하게는 2°C 내지 8°C에서 보관된다. 그들은 냉동하지 않아야 한다. 그들은 이상적으로는 직사광선으로부터 멀리 보관해야 한다. 이들이 초기에는 즉석 혼화를 위해 개별 성분들의 키트의 형태로 제공될 수 있지만, 항원 및 에멀젼은 통상적으로 혼화 상태에 있을 것이다. 대상에게 투여될 때 백신 및/또는 면역원성 조성물은 일반적으로 수용액 형태일 것이다.
보강제 ( Adjuvants )
본 발명의 조성물, 면역원성 조성물, 및/또는 백신은 하나 이상의 보강제와 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 보강제를 갖는 백신 및/또는 면역원성 조성물은 이를 필요로 하는 대상의 수족구 질환을 치료 또는 예방하고 및/또는 이를 필요로 하는 대상의 수족구 질환에 대한 면역 반응, 예컨대 보호성 면역 반응을 유도하는 데 유용할 수도 있다.
백신에 대한 보강제 효과를 달성하는 다양한 방법이 공지되어 있으며 본원에 개시된 수족구 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 사용될 수도 있다. 일반 원칙 및 방법은 "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, 및 또한 "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G 등. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9에 자세히 설명되어 있다.
일부 구현예에서, 수족구 백신 또는 면역원성 조성물은 항원과 보강제를 포함한다. 항원은 약 10:1 내지 약 1010:1 항원:보강제, 예를 들면, 약 10:1 내지 약 100:1, 약 100:1 내지 약 103:1, 약 103:1 내지 약 104:1, 약 104:1 내지 약 105:1, 약 105:1 내지 약 106:1, 약 106:1 내지 약 107:1, 약 107:1 내지 약 108:1, 약 108:1 내지 약 109:1, 또는 약 109:1 내지 약 1010:1 항원:보강제인 중량 기반 비율로, 적어도 하나의 보강제와 혼합물일 수 있다. 당업자는 최적 비율을 결정하기 위한 보강제와 통상적인 실험에 대한 정보를 통해 적절한 비율을 용이하게 결정할 수 있다.
예시적인 보강제는 알루미늄 염, toll 유사 수용체 (TLR) 효능제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), MLA 유도체, 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 사이토킨, 사포닌, 무라밀 디펩타이드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 리포폴리사카라이드(LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼, 비로좀, 코클리에이트(cochleates), 폴리(락티드-코-글리콜라이드) (PLG) 미립자, 폴록사머 입자, 미세입자, 리포좀, 완전 프로인트 보강제 (CFA), 및 불완전 프로인트 보강제 (IFA)를 포함할 수도 있지만 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 보강제는 MLA 또는 그의 유도체이다.
일부 구현예에서, 보강제는 알루미늄 염이다. 일부 구현예에서, 보강제는 명반, 인산 알루미늄, 수산화 알루미늄, 황산 알루미늄 칼륨, Alhydrogel 85 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서 본 발명의 알루미늄 염 보강제는 본 발명의 HFMD 백신 및/또는 면역원성 조성물의 항원 흡착을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 따라서, 일부 구현예에서, 항원의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95% 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%가 알루미늄 염 보강제에 흡착된다.
본 발명의 특정 구현예들은 보강제를 갖는 수족구 백신 또는 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 포함하고, 이는 (a) 알루미늄 염 보강제를 갖는 백신 또는 면역원성 조성물을, 수족구 질환을 유발하는 적어도 하나의 바이러스로부터의 하나 이상의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물과 혼합하는 단계 및 (b) 약 16 시간 내지 약 24 시간의 범위의 시간 동안 적합한 조건 하에서 혼합물을 알루미늄 염 보강제에 흡착된 항원의 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97% 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%로 인큐베이팅하는 단계와 연관된다. 상기 방법의 특정 구현예들에서, 수족구 질환을 유발하는 적어도 하나의 바이러스는 EV71, CA6 및 CA16 중 하나 이상으로부터 선택된다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 혼합물은 약 2°C 내지 약 8°C의 범위의 온도에서 인큐베이팅된다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 혼합물은 당업계에 공지된 임의의 적합한 혼합기를 사용하여 일정한 혼합 하에 인큐베이팅된다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 혼합물은 약 6.5 내지 약 8, 약 6.8 내지 약 7 8, 약 6.9 내지 약 7.6, 또는 약 7 내지 약 7.5의 값의 범위의 pH에서 인큐베이팅된다. 특정 바람직한 구현예들에서, 혼합물은 중성 pH에서 인큐베이팅된다. 상기 방법의 일부 구현예에서, 알루미늄 염 보강제는 명반, 인산 알루미늄, 수산화 알루미늄, 황산 칼륨 알루미늄 및 Alhydrogel 85로부터 선택된다.
모노포스포릴 지질 A (MLA), 살모넬라 유래 지질 A의 무독성 유도체는 백신 보강제로서 개발된 강력한 TLR-4 효능제 (Evans 등 2003)이다. 전임상 쥐 연구에서 비강내 MLA는 분비성뿐만 아니라 전신성 체액 반응을 향상시키는 것으로 나타났다 (Baldridge 등 2000; Yang 등 2002). 또한 120,000 명 넘는 환자의 임상 연구에서 백신 보강제로 안전하고 효과적인 것으로 입증되었다(Baldrick 등, 2002; 2004). MLA는 TLR-4 수용체를 통해 선천성 면역의 유도를 자극하고 그람 음성 세균, 그람 양성 세균, 바이러스, 기생충을 포함하여 광범위한 감염성 병원체에 대해 비특이적 면역 반응을 유도할 수 있다 (Baldrick 등 2004; Persing 등 2002). 비강내 제형에서 MLA의 포함은 백신의 항원 성분에 의해 발생된 특이적 반응을 강화하면서도 바이러스 시험접종으로부터의 비특이적 면역 반응을 유도하면서, 선천성 반응의 신속한 유도를 제공한다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 모노포스포릴 지질 A (MLA), 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A (3D-MLA), 또는 적응성 선천성 면역 증강제로서 이의 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 화학적으로 3D-MLA는 4, 5 또는 6 아실화된 사슬과 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A의 혼합물이다. 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 형태는 유럽 특허 0 689 454 B1에 개시되어 있다(SmithKline Beecham Biologicals SA). 다른 구현예에서, 본 발명은 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 예컨대 BioMira의 PET 지질 A, 또는 TLR-4 효능제 처럼 기능하도록 고안된 합성 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다.
예시적인 추가의 보강제는 제한하지 않고, 폴리펩타이드 성분과의 동시-발현, 또는 폴리펩타이드 성분과의 융합에 의해 본원에 기술된 항원에 쉽게 첨가되어서 키메라 폴리펩타이드를 생성할 수도 있는 폴리펩타이드 보강제를 포함한다. 세균 편모, 편모의 주요 단백질 성분은, toll-유사 수용체 TLR5 (65)에 의한 선천성 면역계에 의한 인식 때문에 보강제 단백질로서 주목이 증가한 보강제다. TLR5를 통한 편모 신호전달은 전염증성 매개 물질 (66-72)의 제조의 결과를 초래하는 대식세포, 호중구 및 장내 상피세포의 DC 성숙 및 이동뿐만 아니라 활성화를 유도하여 선천성 및 후천성 면역 기능 모두에 대한 효과를 갖는다.
TLR5는 이 단백질에 고유하며 편모 기능에 필요한 편모 단량체 내에 보존된 구조를 인식하며 면역학적 압력 (73)에 응답하여 그 돌연변이를 배제한다. 수용체는 100 fM 농도에 민감하지만 본연의 필라멘트를 인식하지 못한다. 단량체로 편모 분해는 결합과 자극에 요구된다.
보강제로서, 편모는 비경구적 또는 비강내 투여된 이종 항원에 대한 보호성 반응의 유도에 대해 강력한 활성을 가지며 DNA 백신에 대한 보강제 효과 또한 보고되었다. 편모가 사용되는 경우 인플루엔자 등의 호흡기 바이러스에 적합하며 Th2 바이어스가 관찰되지만 쥐 또는 원숭이에서 IgE 유도에 대한 증거는 관찰되지 않았다. 또한, 국소 또는 전신성 염증 반응은 원숭이에서 비강내 또는 전신성 투여 후에 보고되지 않았다. 편모의 사용 후에 야기된 반응의 Th2 특성은 편모가 MyD88-의존적 방식으로 TLR5를 통해 신호전달하기 때문에 약간 놀라우며 TLR을 통한 다른 모든 MyD88-의존적 신호는 Th1 바이어스를 유발하는 것으로 나타났다. 중요한 것은, 편모에 대한 기존의 항체는 보강제 효능에 큰 영향을 미치지 않으며 다용도의 보강제로서 매력적이다.
최근 많은 비강내 백신 시험에서 공통적인 주제는 백신의 효능을 개선하기 위한 보강제 및/또는 전달 시스템의 사용이다. 한 가지 이러한 연구에서 유전적으로 해독된 대장균 이열성 장내독소 보강제(LT R192G)를 포함하는 인플루엔자 H3 백신은 비강내 전달 이후에만 H5 시험접종에 대한 헤테로서브타입 보호의 결과를 초래했다. 보호는 교차 중화 항체의 유도에 기초를 두었으며 새로운 백신 개발에 있어서 비강내 경로에 중요한 영향을 미쳤다.
사이토카인, 콜로니 자극 인자 (예, GM-CSF, CSF 등); 종양 괴사 인자; 인터루킨-2, -7, -12, 인터페론 및 다른 유사 생장 인자, 또한 보강제로서 사용될 수도 있는데, 이들이 폴리펩타이드 성분과 혼화 또는 융합하여 수족구 백신 또는 면역원성 조성물에 용이하게 포함될 수 있기 때문이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 수족구 백신 및 면역원성 조성물은 5'-TCG-3' 서열을 포함하는 핵산 TLR9 리간드; 이미다조퀴놀린 TLR7 리간드; 치환된 구아닌 TLR7/8 리간드; 기타 TLR7 리간드, 예컨대 록소리빈, 7-데아자데옥시구아노신, 7-티아-8-옥소데옥시구아노신, 이미퀴모드 (R-837) 및 레시퀴모드 (R-848) 등 Toll-유사 수용체를 통해 작용하는 다른 보강제를 포함할 수도 있다.
특정 보강제는 수지상 세포와 같은 APC에 의해 백신 분자의 흡수를 용이하게 하고, 이를 활성화시킨다. 비제한적인 예는 면역 표적화 보강제; 면역 조절 보강제, 예컨대 독소, 사이토카인 및 미코박테리아 유도체; 오일 제형; 중합체; 미셸 형성 보강제; 사포닌; 면역자극 복합체 매트릭스 (ISCOM 매트릭스); 입자; DDA; 알루미늄 보강제; DNA 보강제; MLA; 및 캡슐화 보강제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보강제의 추가적인 예는 일반적으로 완충 식염수 중의 0.05 내지 0.1% 용액으로서 사용되는, 수산화물 또는 인산염 (명반)과 같은 알루미늄 염과 같은 제제(예, Nicklas (1992) Res. Immunol. 143:489-493 참조), 0.25% 용액으로서 사용되는 당의 합성 중합체 (예, Carbopol®)와의 혼화물, 70°C 내지 101°C의 온도에서 각각 30 초 내지 2 분 동안의 열처리에 의한 백신 내 단백질의 응집물을 포함하며, 가교제에 의한 응집물 또한 가능하다. 알부민에 대해 펩신 처리된 항체(Fab 단편)와 재활성화에 의한 응집물, C. parvum 같은 박테리아 세포 또는 장내 독소 또는 그람 음성 세균의 리포폴리사카라이드 성분과의 혼합물, 만니드 올레에이트 (Aracel A) 같은 생리학적으로 허용 가능한 오일 비히클 중의 에멀젼, 또는 블록 치환체로 사용되는 퍼플루오로카본 (Fluosol-DA)의 20% 용액을 사용한 에멀젼 또한 사용될 수도 있다. 스쿠알렌 및 IFA와 같은 오일과의 혼화물 또한 사용될 수도 있다.
DDA(디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, dimethyldioctadecylammonium bromide)는 보강제에 대한 흥미로운 후보 물질이지만, Freund의 완전 및 불완전 보강제뿐만 아니라 QuilA 및 QS21과 같은 키라야 사포닌(quillaja saponin)도 흥미롭다. 추가 가능 물질로는 모노포스포릴지질 A (MLA), 무라밀 디펩타이드 (MDP) 및 트레오닐 무라밀 디펩타이드 (tMDP) 같은 리포폴리사카라이드의 폴리[디카르복실레이트 페녹시)포스파젠 (PCPP)] 유도체를 포함한다. 리포폴리사카라이드 기반 보강제 또한 예를 들어 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 같은 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄 염의 조합을 포함하는 우세한 Th1-형 반응을 생성하는데 사용될 수도 있다.
리포좀 제형 또한 보강제 효과를 부여하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 리포솜 보강제가 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 사용될 수도 있다.
면역자극 복합체 매트릭스 형(ISCOM® 매트릭스) 보강제 또한 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 사용될 수도 있는데, 특히 이러한 유형의 보강제가 APC에 의한 MHC 클래스 II 발현을 상향 조절할 수 있는 것으로 나타났기 때문이다. ISCOM 매트릭스는 키라야 사포나리아(Quillaja saponaria) 유래 사포닌 (트리터페노이드), 콜레스테롤 및 인지질로 구성된다(선택적으로 분획된다). 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물 항원 같은 면역원성 단백질과 혼화하는 경우, 얻어지는 미립자 제형은 ISCOM 입자로 알려진 것으로, 이때 사포닌은 60-70% w/w, 콜레스테롤 및 인지질은 10-15% w/w, 단백질은 10-15% w/w를 구성할 수 있다. 면역 자극 복합체의 조성 및 사용에 관한 세부 사항은 예를 들어 상기 언급된 보강제를 취급하는 문헌들에서 찾을 수 있지만, Morein B 등, 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475 및 Barr IG and Mitchell GF, 1996, Immunol. 및 Cell Biol. 74: 8-25 역시 완전 면역자극 복합체의 제조를 위한 유용한 지침을 제공한다.
본원에 개시된 수족구 질환 백신 항원 및 면역원성 조성물과의 보강제 조합물에 사용될 수 있는, 사포닌은 iscom 형태이든지 아니든지 간에, 미국 특허 제5,057,540호 및 "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; 및 EP 0 362 279 B1에 기재된, Quill A로 불리는 키라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 껍질, 및 이들의 분획에서 유래된 것들을 포함한다. Quill A의 예시적인 분획은 QS21, QS7 및 QS17이다.
b-에스신(Escin)이 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물의 보강제 조성물에 사용하기 위한 또 다른 용혈성 사포닌이다. 에스신(Escin)은 마로니에(horse chestnut) 나무 (Lat: 아에스쿨루스 히포카스타눔)의 종자에서 발생하는 사포닌의 혼합물로서 머크(Merck) 색인(12th ed: 번호 3737)에 기재되어 있다. 이의 분리는 크로마토그래피 및 정제(Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)), 및 이온-교환 수지(Erbring 등, 미국 특허 제3,238,190호)에 의해 기재되어 있다. 에스신의 분획은 정제되었고, 생물학적으로 활성인 것으로 밝혀졌다(Yoshikawa M, 등 (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Aug;44(8): 1454-1464)). b-에스신 또한 aescin로 알려져 있다.
수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물에 사용하기 위한 또 다른 용혈성 사포닌은 디기토닌(Digitonin)이다. 디기토닌은 디기탈리스 퍼퓨레아(Digitalis purpurea)의 종자에서 유래되고 Gisvold 등, J. Am. Pharm. Assoc, 1934, 23, 664; 및 Rubenstroth-Bauer, Physiol. Chem., 1955, 301, 621에 기재된 절차에 따라 정제된, 사포닌으로서 머크(Merck) 색인(12th ed, 번호 3204)에 기재되어 있다. 그것의 용도는 콜레스테롤 결정을 위한 임상 시약으로 설명된다.
보강제 효과를 달성하는 또 다른 흥미로운 가능성은 Gosselin 등, 1992에 기재된 기술을 사용하는 것이다. 간단히 말해서, 본 발명의 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물 같은 관련 항원의 제시는 항원을 단핵세포/마크로파지 상의 FC 수용체에 대한 항체 (또는 항원 결합 항체 단편)에 접합시킴으로써 향상시킬 수 있다. 특히 항원과 항-FCRI 간의 접합체는 백신접종의 목적을 위한 면역원성을 증진시키는 것으로 입증되었다. 항체는 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물 항원의 폴리펩타이드 성분 중 어느 하나에 융합으로서 발현시키는 것을 포함하는 발생 후 또는 발생의 일부로서 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물 항원에 접합될 수도 있다.
다른 가능성은 상기 표적화 및 면역 조절 물질 (즉, 사이토카인)의 사용을 수반한다. 추가로, 폴리 I:C와 같은 사이토카인의 합성 유도 인자 또한 사용될 수도 있다.
적절한 미코박테리아 유도체는 무라밀 디펩타이드, 완전 프로인트 보강제, RIBI(Ribi ImmunoChem Research Inc., 몬타나주 해밀턴), 및 TDM 및 TDE와 같은 트레할로오스의 디에스테르로 이루어진 군 중에서 선택될 수도 있다.
적절한 면역 표적화 보강제는 CD40 리간드 및 CD40 항체 또는 특이적으로 결합하는 이들의 단편(상기의 기재 참조), 만노오스, Fab 단편 및 CTLA-4를 포함한다.
적절한 중합체 보강제는 덱스트란, PEG, 전분, 만난 및 만노오스와 같은 탄수화물; 플라스틱 중합체; 및 라텍스 비드와 같은 라텍스를 포함한다.
면역 반응을 조절하는 또 다른 흥미로운 방식은 "가상 림프절(virtual lymph node)"(VLN)(사유 의료 기구, ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501에 의해서 개발) 내에 면역원을 (임의적으로 보강제 및 약제학적으로 허용가능한 담체 및 비히클과 함께) 포함하는 것이다. VLN (얇은 관상 기구)는 림프절의 구조와 기능을 모방한 것이다. 피부 아래에 VLN를 삽입하면 사이토카인 및 케모카인이 급증된 무균 염증 부위가 생긴다. T- 및 B-세포 뿐 아니라 APC는 위험 신호에 대하여 신속하게 반응하고, 염증 부위로 향하고 VLN의 다공성 매트릭스 내부에 축적된다. 항원에 대하여 면역 반응을 마운팅하기 위하여 요구되는 항원 필요량은 VLN을 사용하는 경우 감소하고, VLN을 사용하는 백신접종에 의하여 부여된 면역 보호는 보강제로서 Ribi를 사용하는 통상적인 면역화를 초월하는 것으로 나타났다. 이러한 기술은 Gelber C 등, 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts ofImmunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual LymphNode", 및 "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, Oct. 12-15, 1998, Seascape Resort, Aptos, Calif."에 간략하게 개시되어 있다.
올리고뉴클레오티드는 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물 항원과 함께 보강제로서 사용될 수도 있으며 적어도 3개 이상 또는 심지어 적어도 6개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된 2개 이상의 디뉴클레오티드 CpG 모티프를 함유할 수도 있다. CpG-함유 올리고뉴클레오티드(CpG 디뉴클레오티드가 탈메틸화되어 있음)는 주로 Th1 반응을 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 널리 공지되어 있고, 예를 들어, WO 96/02555호, WO 99/33488호 및 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호에 기재되어 있다.
이러한 올리고뉴클레오티드 보강제는 데옥시뉴클레오티드이다. 특정 구현예들에서, 올리고뉴클레오티드 내의 뉴클레오티드 백본은 포스포로디티오에이트, 또는 포스포로티오에이트 결합이지만, 포스포디에스테르 및 기타 뉴클레오티드 백본, 예컨대 혼합된 백본 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PNA도 사용될 수도 있다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로디티오에이트를 생성하는 방법이 미국 특허 제5,666,153호, 미국 특허 제5,278,302호 및 W095/26204호에 기재되어 있다.
예시적인 올리고뉴클레오티드는 하기 서열을 지닌다. 서열은 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드 백본을 함유할 수 있다:
(서열번호 10) OLIGO 1: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826);
(서열번호 11) OLIGO 2: TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758);
(서열번호 12) OLIGO 3: ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG;
(서열번호 13) OLIGO 4: TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006); 및
(서열번호 14) OLIGO 5: TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
대안적인 CpG 올리고뉴클레오티드는 상기 서열들을 포함하고, 여기에 중요하지 않은 결실 또는 첨가를 갖는다. CpG 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 합성될 수도 있다 (예를 들어, EP 468520). 예를 들어, 이러한 올리고뉴클레오티드는 자동화된 합성기를 이용하여 합성될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 보강제는 10-50 염기 길이일 수도 있다. 또 다른 보강제 시스템은 CpG-함유 올리고뉴클레오티드 및 사포닌 유도체의 조합물을 포함하며, 특히 CpG 및 QS21의 조합은 WO 00/09159에 개시되어 있다.
많은 단일 또는 다중 상 에멀젼 시스템이 기재되었다. 당업자는 수족구 질환 백신 및 면역원성 조성물 항원과 함께 사용하기 위해 이러한 에멀젼 시스템을 쉽게 적응시켜서 에멀젼이 항원의 구조를 파괴시키지 않도록 할 수도 있다. 수중유 에멀젼 보강제 그 자체가 보강제 조성물로서 유용한 것으로 제안되었으며(EPO 399 843B), 또한 수중유 에멀젼과 기타 활성제의 조합물이 백신용 보강제로 기재되었다(WO 95/17210; WO 98/56414, WO 99/12565; WO 99/11241). 유중수 에멀젼 (미국 특허 제5,422,109호; EP 0 480 982 B2) 및 수중유중수 에멀젼 (미국 특허 제5,424,067호; EP 0 480 981 B)과 같은 기타 오일 에멀젼 보강제가 기술되었다.
본원에 기재된 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 사용하기 위한 오일 에멀젼 보강제는 천연 또는 합성일 수 있고, 광물 또는 유기물일 수도 있다. 미네랄 및 유기 오일의 예는 당업자에게 자명할 것이다.
임의의 수중유 조성물이 인간 투여에 적합하도록 하기 위해서, 에멀젼 시스템의 오일상(oil phase)은 대사가능한 오일을 포함할 수도 있다. 용어 대사가능한 오일의 의미는 당업계에 주지되어 있다. 대사가능한 이란 "대사작용에 의해 변형될 수 있는"이라는 의미로 정의될 수 있다 (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition(1974)). 상기 오일은 수혜자에게 무독성이고, 대사작용에 의해 변형될 수 있는, 임의의 식물성 오일, 어류 오일, 동물성 오일 또는 합성 오일일 수 있다. 견과(예컨대 땅콩유), 종자 및 곡물은 식물성 오일의 통상적인 소스다. 합성 오일 또한 사용될 수도 있으며, 시판 중인 오일, 예컨대, NEOBEE® 등을 포함할 수 있다. 스쿠알렌(2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥산)은 상어간 오일에서 다량으로, 그리고 올리브 오일, 밀배아 오일, 쌀겨 오일, 및 효모에서 소량으로 발견되는 불포화 오일이며, 수족구 질환 백신 및 면역원성 조성물 항원과 사용될 수도 있다. 스쿠알렌은 콜레스테롤 생합성에서 중간체라는 사실에 비추어 대사가능한 오일이다 (머크 색인, 10th Edition, 번호 제8619).
예시적인 오일 에멀젼은 수중유 에멀젼이며, 특히 수중 스쿠알렌 에멀젼이다.
또한, 수족구 질환 백신 및 면역원성 조성물 항원에서 사용하기 위한 오일 에멀젼 보강제는 예를 들면 오일 ?-토코페롤 같은 항산화제를 포함할 수도 있다 (비타민 E, EP 0 382 271 B1).
WO 95/17210 및 WO 99/11241은 스쿠알렌, ?-토코페롤 및 TWEEN 80 (TM)에 기반한 에멀젼 보강제를 개시하며, 선택적으로 면역자극제 QS21 및/또는 3D-MLA로 제형화된다. WO 99/12565는 스테롤을 오일상에 첨가하여 이들 스쿠알렌 에멀젼에 대한 개선을 개시한다. 또한, 에멀젼을 안정화시키기 위해 트리카프릴린(tricaprylin)(C27H50O6) 같은 트리글리세리드를 오일상에 첨가할 수도 있다 (WO 98/56414).
안정적인 수중유 에멀젼 내에서 발견되는 오일 방울의 크기는 1?m 미만일 수도 있으며, 광자 상관 분광법에 의해 측정되는 경우 실질적으로 30-600nm, 실질적으로 약 30-500nm 직경, 또는 실질적으로 150-500nm 직경, 및 150 nm 직경의 범위일 수도 있다. 이와 관련하여, 번호로 오일 방울의 80%가 이 범위 내에 있을 수 있고, 번호로 오일 방울의 90% 초과 또는 95% 초과가 상기 한정된 크기 범위 내에 있다. 오일 에멀젼에 존재하는 성분의 양은 통상적으로 2 내지 10% 오일, 예컨대 스쿠알렌; 및 존재 시, 2 내지 10% 알파 토코페롤; 및 0.3 내지 3% 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트의 범위에 있다. 오일: 알파 토코페롤의 비율은 1 이하일 수도 있는데, 더욱 안정적인 에멀젼을 제공하기 때문이다. SPAN 85 (TM) 또한 약 1%의 수준으로 존재할 수도 있다. 몇몇 경우에 본원에 개시된 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물은 또한 안정화제를 포함하는 것이 유리할 수도 있다.
수중유 에멀젼을 제조하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 통상적으로, 이 방법은 오일상을 PBS/TWEEN80® 용액과 같은 계면활성제와 혼합한 다음, 균질화기를 사용하여 균질화하는 단계를 포함하며, 혼합물을 주사기 바늘로 두 번 통과시키는 방법이 소량의 액체를 균질화하는 데 적합할 것이라는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 동일하게, 미세유체화기 (M110S 미세유체 기계, 최대 압력 입력 6 bar (약 850 bar의 출력 압력)에서 2 분 동안 최대 50회 패스)에서의 유화 공정은 당업자에 의해 적응되어 소량 또는 대량 용적의 에멀젼을 제조할 수 있게 된다. 이러한 적응은 요구되는 직경의 오일 방울을 갖는 제제가 얻어질 때까지 생성된 에멀션의 측정을 포함하는 통상적인 실험에 의해 달성될 수 있다.
대안적으로, 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물은 키토산 (상술한 바와 같음) 또는 기타 폴리 양이온성 중합체, 폴리락티드 및 폴리락티드-코글리콜라이드 입자, 폴리-N-아세틸 글루코사민 기반 중합체 매트릭스, 다당류 또는 화학적으로 변형된 다당류로 구성된 입자, 리포좀 및 지질 기반 입자, 글리세롤 모노에스테르로 구성된 입자 등으로 구성된 백신 비히클과 조합될 수도 있다. 사포닌은 또한 콜레스테롤의 존재 하에 제형화되어 리포좀 또는 ISCOM과 같은 입자성 구조를 형성할 수도 있다. 또한, 사포닌은 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르와 함께 비-미립자 용액 또는 현탁액으로, 또는 파우실라메라 리포좀 또는 ISCOM과 같은 입자성 구조로 제형화될 수도 있다.
본원에 기재된 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물에 사용하기 위한 추가적인 예시적인 보강제로는 SAF (Chiron, Calif., United States), MF-59 (Chiron, 예를 들어, Granoff 등 (1997) Infect Immun. 65 (5):1710-1715 참조), 보강제의 SBAS 시리즈 (예, SB-AS2 (MLA 및 QS21 함유 수중유 에멀젼); SBAS-4 (명반 및 MLA 함유 보강제 시스템), (SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium에서 입수 가능)), Detox (Enhanzyn®) (GlaxoSmithKline), RC-512, RC-522, RC-527, RC-529, RC-544, 및 RC-560 (GlaxoSmithKline) 및 기타 아미노알킬 글루코사민 4-포스페이트 (AGPs), 예컨대 계류 중인 미국 특허 출원 제08/853,826호 및 제09/074,720호에 기재된 것들을 포함한다.
보강제의 다른 예는 Hunter's TiterMax® 보강제 CytRx Corp., Norcross, Ga.); Gerbu 보강제 (Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg, Germany); 니트로셀룰로오스 (Nilsson and Larsson (1992) Res. Immunol. 143:553-557); 명반 (예, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄) 미네랄 오일, 비-미네랄 오일, 유중수 또는 수중유 에멀젼을 포함하는 제형 기반 에멀젼, 예컨대, Montamide 보강제의 Seppic ISA 시리즈 (예, ISA-51, ISA-57, ISA-720, ISA-151 등; Seppic, Paris, France); 및 PROVAX® (IDEC Pharmaceuticals); OM-174 (지질 A와 관련된 글루코사민 디사카라이드); Leishmania 연신 인자; CRL 1005와 같은 미셸을 형성하는 비이온성 블록 공중합체; 및 Syntex 보강제 제형을 포함하지만, 이들에만 한정되지 않는다. 예를 들어, O'Hagan 등 (2001) Biomol Eng. 18(3):69-85; 및 "Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols" D. O'Hagan, ed. (2000) Humana Press를 참고한다.
다른 예시적인 보강제로는 하기 일반식의 보강제 분자를 포함한다:
HO(CH 2CH2O)n-A-R, (I)
이때, n은 1-50이고, A는 결합 또는 --C(O)--이고, R은 C1-50 알킬 또는 페닐 C1-50 알킬이다.
일 구현예는 일반식 (I)의 폴리옥시에틸렌 에테르를 포함하는 백신 제형으로 구성되고, 이때 n은 1과 50 사이, 4-24, 또는 9이고; R 성분은 C1-50, C4-C20 알킬, 또는 C12 알킬이고, A는 결합이다. 폴리옥시에틸렌 에테르의 농도는 0.1-20%, 0.1-10% 또는 0.1-1% 범위에 있어야 한다. 예시적인 폴리옥시에틸렌 에테르는 다음 군으로부터 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르. 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르는 머크 색인(12th edition: 번호 7717)에 기재되어 있다. 이들 보강제 분자는 WO 99/52549에 기재되어 있다.
상기 일반식 (I)에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르는, 필요하다면, 다른 보강제와 조합될 수 있다. 예를 들어, 보강제 조합은 전술한 바와 같이 CpG를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 사용하기에 적합한 약제학적으로 허용가능한 부형제의 추가의 예는 물, 인산 완충 식염수, 등장성 완충 용액을 포함한다.
본 발명의 추가 측면들은 수족구 질환을 유발하는 적어도 하나의 바이러스로부터의 하나 이상의 항원을 포함하는 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물을 사용해서 이를 필요로 하는 대상에서 수족구 질환을 치료 또는 예방하고 및/또는 이를 필요로 하는 대상에서 수족구 질환에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 수족구 질환을 유발하는 적어도 하나의 바이러스로부터의 하나 이상의 항원을 포함하는 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 치료학적 유효량을 대상에게 투여하여, 이를 필요로 하는 대상의 수족구 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 수족구 질환을 유발하는 적어도 하나의 바이러스로부터의 하나 이상의 항원을 포함하는 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 치료학적 유효량을 대상에게 투여하여, 이를 필요로 하는 대상에서 수족구 질환에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 방법에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 보호성 면역 반응은 EV71, CA6 및 CA16 중 하나 이상에 대한 면역 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 보호성 면역 반응은 EV71 바이러스 유전자형, 예컨대 B4, C2, C4, 및 C5 중 하나 이상에 대한 면역 반응을 포함한다.
본원에 개시된 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물은 비강내, 구강, 경구, 볼, 설하, 근육내, 복강내, 피내, 경피, 피하, 질내, 항문, 두개내, 정맥내, 경피 또는 피하 투여에 의해 백신을 투여하는 것에 의하여, 바이러스 감염에 민감하거나 이를 앓고 있는 포유류 또는 조류를 보호하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 전신 투여 방법은 종래의 주사기 및 주사 바늘, 또는 고체 백신의 발사체성 전달(ballistic delivery)을 위해 고안된 장치 (WO 99/27961), 또는 바늘 없는 압력 액체 분사 장치 (미국 특허 제4,596,556호; 미국 특허 제5,993,412호), 또는 경피용 패치(WO 97/48440; WO 98/28037)를 포함할 수 있다. 본 발명의 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물은 또한 피부에 도포될 수 있다(피하 또는 경피 전달 WO 98/20734; WO 98/28037). 따라서 본 발명의 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물은 수족구 질환 백신 또는 면역원성 조성물로 미리 채워진, 전신 투여용 전달 장치를 포함할 수 있다. 따라서 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물 및 선택적으로 보강제 및/또는 담체를, 대상에게 투여하는 단계를 포함하여, 포유류 또는 조류 같은 대상에서 수족구 질환을 치료 또는 예방하고 면역 반응을 유도하기 위한 방법이 제공되며, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 비경구 또는 전신 경로를 통해 투여된다.
본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 점막 경로, 예컨대 구강/소화기 또는 비강 경로를 통해 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것에 의하여, 바이러스 감염에 민감하거나 이를 앓고 있는 포유류 또는 조류를 보호하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다. 다른 점막 경로는 질내 및 직장내이다. 점막 투여 경로는 비강 경로를 통해 이루어질 수 있다(비강내 백신접종이라고 함). 비강내 백신접종의 방법은 면역화될 개인의 비인두 내로 백신의 액적, 분무 또는 건조 분말 형태의 투여를 포함하여, 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 분무화되거나 에어로졸화된 백신 제형은 본원에 개시된 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물의 잠재적 형태이다. 경구 투여 용 위장 내성 캡슐 및 과립과 같은 장용 제형, 직장 또는 질 투여 용 좌약 또한 본원의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 제형이다.
본 발명의 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물은 또한 경구 경로를 통해 투여될 수도 있다. 이러한 경우, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 또한 알칼리성 완충액 또는 장용 캡슐 또는 미세 과립을 포함할 수도 있다. 본 발명의 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물은 또한 질 경로에 의해 투여될 수도 있다. 이러한 경우, 약제학적으로 허용가능한 부형제는 또한 유화제, 중합체 예컨대 CARBOPOL®, 질 크림 및 좌약의 다른 공지된 안정화제를 포함할 수도 있다. 수족구 질환 백신 및/또는 면역원성 조성물은 또한 직장 경로에 의해 투여될 수 있다. 이러한 경우, 부형제는 또한 직장 좌약을 형성하기 위해 본 기술분야에 공지된 왁스 및 중합체를 포함할 수도 있다.
일부 구현예에서, 투여 단계는 하나 이상의 투여를 포함한다. 투여는 단일 투여량 스케줄 또는 다중 투여량 (프라임-부스트) 스케줄일 수 있다. 다중 투여량 스케줄에서, 다양한 투여량은 동일하거나 상이한 경로 예, 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등에 의해 주어질 수도 있다. 통상적으로 그들은 동일한 경로에 의해 주어질 것이다. 다중 투여량은 통상적으로 적어도 1 주 간격으로 투여될 것이다 (예, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 6 주, 약 8 주, 약 12 주, 약 16 주 등). 25~30 일 간격으로 2 회 투여하는 것이 (예, 28 일) 특히 유용하다.
본 발명의 방법들은 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 치료학적 유효량 또는 면역원성 량의 투여를 포함한다. 치료학적 유효량 또는 면역원성 량은 투여되는 감염되지 않거나, 감염되거나 노출되지 않은 대상에서 보호성 면역 반응을 유도할 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 양일 수도 있다. 이러한 반응은 일반적으로 백신에 대한 분비성, 세포성 및/또는 항체 매개 면역 반응의 대상에서 발달의 결과를 초래할 것이다. 일반적으로, 이러한 반응은 다음의 효과 중 하나 이상을 포함하지만, 이들에만 한정되지 않는다; 면역글로불린 A, D, E, G 또는 M 같은 면역학적 부류 중 어느 하나로부터의 항체의 생산; B 및 T 림프구의 증식; 면역 세포에 대한 활성화, 생장 및 분화 신호 제공; 보조 T 세포, 억제자 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포의 확장.
바람직하게는, 치료학적 유효량 또는 면역원성 량은 질병의 증상을 치료 또는 예방을 야기하기에 충분하다. 필요한 정확한 양은 다른 인자들 중에서, 치료되는 대상; 치료될 대상의 연령과 일반적인 상태; 대상의 면역 시스템의 항체 합성 능력; 원하는 보호의 정도; 치료되는 상태의 중증도; 선택된 특정 수족구 질환 항원 폴리펩타이드 및 투여 모드에 따라 달라질 것이다. 적절한 치료학적 유효량 또는 면역원성 양은 본 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 치료학적 유효량 또는 면역원성 양은 일상적인 실험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위 내로 떨어질 것이다.
본 발명은 하기 실시예를 참고하여 더욱 충분히 이해될 것이다. 하지만, 이들은 본 발명의 임의의 측면 또는 범주를 어떤 식으로든 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: iCELLis NANO에서의 세포 생장 평가
iCELLis NANO 나노 생물 반응기에서 Vero 세포주 생장을 평가하였다.
방법
세포 및 핵 계수
iCELLis NANO의 경우, 핵 계수 방법을 사용하여 세포를 계수한 반면, Cell-Stack의 경우 트립판 블루 방법을 사용하여 세포를 계수하였다.
글루코스 /젖산 측정
ScoutTM락토미터를 사용하여 젖산을 측정하였다. ACCU- CHEK Aviva Plus 시스템을 사용하여 글루코스를 측정하였다.
Vero 소생 (resuscitation)
Vero 세포 소생을 수행하였다. 1-ml 바이알의 Vero 세포를 신속하게 녹이고 (3분 미만으로), IsaSept로 닦아내고, T-75 플라스크에서 10% FBS 및 2 mM의 글루타민이 보충된 19 mL의 미리 가온된 DMEM D1145와 혼합하였다. 세포 계수 및 생존능을 위해 분취량 (0.4 ml)을 취하고 T-75 플라스크를 CO2(5%) 인큐베이터에서 37°C에 두었다. 다음날, 소비된 배지를 버리고 신선한 배지 (20 ml)로 교체한 후 배양을 계속하였다.
T-175 플라스크에서 배양 및 계대
Vero 세포 배양 및 계대를 수행하였다. T-175를 2.6 E6 세포 (0.015 E6 세포/cm2에서)로 55 mL의 작동 부피 (부피/표면 = 0.31mL/cm2) 중에 씨딩하고 컨플루언스에 도달할 때까지 CO2 (5%) 인큐베이터에서 37°C에서 배양하였다. 계대를 위해, T-175를 25 ml의 DPBS로 2회 헹구고 세포를 CO2 (5%) 인큐베이터에서 37°C에서 5분 동안 4 ml TrypLE로 트립신처리하였다. 21 mL의 완전 배지를 첨가하고 세포 계수를 위해 분취량을 취하였다.
Cell Stack에서의 배양 및 계대
Vero 세포 배양 및 계대를 수행하였다. Cell-Stack을 9.5 E6 세포/플레이트 (0.015 E6 세포/cm2에서)로 200 mL/플래토 (부피/표면 = 0.31mL/cm2)의 작동 부피 중에 씨딩하고 컨플루언스에 도달할 때까지 CO2 (5%) 인큐베이터에서 37°C에서 배양하였다. 계대를 위해, Cell-Stack을 100 ml의 DPBS/플래토로 2회 헹구고 세포를 CO2 (5%) 인큐베이터에서 37°C에서 5분 동안 10 ml TrypLE/플래토로 트립신처리하였다. 50 mL/플래토의 완전 배지를 첨가하고, 세포 계수를 위해 세포를 수집하고 분취량을 취하였다.
대조군 Cell Stack의 감염
배양 배지를 제거하고 Cell Stack (CS)을 100 ml DPBS/플래토로 2회 헹구었다. 감염 배지 (200 mL/플래토; 바이러스 함유)를 CS에 채우고, 37°C에서 5 % CO2 하에 감염시켰다.
NANO에서의 배양
NANO를 조립하고 600 ml 배양 배지로 미리 채우고 조절을 시작하였다. 설정 온도 (37°C) 및 pH (7.2-7.4)에 도달하면 NANO에 씨딩하였다. 씨딩을 위해, 목적하는 수의 세포를 1 L 병 중의 200 ml 배양 배지에 재현탁시키고 샘플링 루프를 사용하여 생물반응기 내에 씨드를 로딩하였다. 샘플링 루프를 병에서 배지를 앞뒤로 순환시킴으로써 헹구었다. 재순환 루프를 씨딩 후 4시간 내지 16시간 (밤새) 동안 활성화시켜 세포를 담체에 최적으로 부착하였다. NANO의 모니터링 (글루코스 및 젖산 측정, 배양 파라미터 체크)을 매일 수행하였다.
감염 전에, 생물반응기를 DPBS로 2회 헹구었다. 재순환 펌프 및 모든 조절을 중단하고 배양 배지 (800 mL)를 NANO로부터 제거하였다. 이어서, 800 ml의 DPBS를 생물반응기에 채우고, 가열 및 교반을 시작하고 5분 동안 헹구었다. DPBS를 버리고 헹굼을 반복하였다. 감염을 위해, 목적하는 양의 바이러스 입자를 800 mL의 감염 배지와 혼합하였다. 감염 배지 (바이러스 함유)를 생물반응기에 채우고 조절을 시작하였다 잔여 감염 배지 (바이러스 부재)를 함유하는 재순환 병을 순환 루프에 연결하고 다음 날부터 시작하였다. NANO 배양 동안 이용된 제어기 설정점을 아래 표1에 요약하였다.
Figure pct00001
TCID50 시험
TCID50 시험을 수행하였다.
iCELLis NANO에서의 Vero 세포 생장 평가
40 mL 고정층 (2-cm 층 높이) Compaction 1X NANO를 사용하여 생물반응기에서의 배양을 수행하였다. 생물반응기를 0.015E6세포/cm2의 세포 밀도로 800 mL의 수행 부피로 접종하였다. 나머지 850 mL이 담긴 병을 재순환 루프를 통해 생물반응기에 연결하여 1,650 mL의 총 배양 부피에 도달하게 하였다. Advanced 제어기를 T°를 37°C, pH를 7.4 (CO2 또는 NaOH 주입에 의해), 50% 초과의 DO (공기/O2 주입에 의해)를 유지하도록 프로그래밍하고 600 rpm (2 cm/초의 떨어지는 필름 속도에 해당)에서 교반하였다. 20 rpm의 속도로 NANO와 재순환 병 사이에서의 배지 재순환을 위해 EasyLoad 헤드가 장착된 MasterFlex 펌프를 사용하였다 (도 1). Advanced 제어기를 사용하여 온도, pH 및 DO를 기록하였다. 3일차 및 6일차에, 배지 전체를 교체하고 8일차에 배양을 중단하였다. 상이한 시점에 담체를 샘플링하고 크리스탈 바이올렛으로 착색시켰다 (도 2A 내지 2C). 대조군으로서, Cell-Stack 10 (CS-10) 및 Cell-Stack 2 (CS-2)를 3일 및 4일 동안 배양하였다 (동일한 접종 시 세포 밀도 및 표면에 대한 배지 부피 비율을 사용함).
결과
지속적인 글루코스 소모 및 젖산 생산이 배양 내내 관찰되었다. 글루코스 부족 및 20~25 mM의 임계 농도를 초과하는 젖산 축적을 피하기 위해 3일차 및 6일차에 배지 교체를 수행하였다. 산소 소모가 시간이 지남에 따라 증가하였고 용존 산소 (DO)는 공기/산소의 자동 주입으로 50% 초과의 설정점으로 유지되었다. 온도 및 pH가 안정적으로 유지되었다 (도 3).
8일차에 도달한 최대 세포 밀도는 약 0.8E6 세포/cm2였다. 대조군 Cell-Stack에서, 0.13 및 0.26 E6/cm2의 세포 밀도가 3일차 및 4일차에 각각 도달하였다 (도 4). 이러한 결과는 iCELLis NANO에서 Vero 세포가 Cell Stack에 비해 3배 이상 높은 밀도를 달성함을 나타낸다. 하나의 NANO 40 mL 고정층 Compaction 1X는3개의 CS-10만큼 많은 세포를 생성하였다.
배양 배지 소모의 경우, iCELLis NANO에서 총 약 5 리터를 사용하여 4.2 E9 세포를 생산하였으며, 이는 1 ml이 0.85 E6 세포를 생산할 수 있음을 나타낸다. 이에 비해, Cell-Stack 플레이트에서는 1 ml의 배양 배지에서 0.42 내지 0.82E6 세포가 생산되었다. 따라서, NANO에서 관찰된 보다 높은 세포 밀도가 세포 당 유사한 배지 부피 소모로 수득되었다.
실시예 2: iCELLis NANO에서 0.52 E6 세포/ cm 2 의 세포 밀도로 EV71 감염 평가
iCELLis NANO에서 생장한 Vero 세포에 의해 생산된 EV71 바이러스의 역학 및 수율을 평가하였다. 40 ml 고정층 Compaction 1 X 생물반응기를 사용하였고 EV71 감염을 0.52 E6 세포/cm2의 세포 밀도로 수행하였다.
방법
실시예 1에 기술된 바와 같이 NANO를 씨딩하였고 사용된 총 배양 부피는 1,650 mL이었다. 3일차에, 배양 배지를 완전히 교체하였다. 6일차에, 세포 밀도가 0.52 E6 세포/cm에 도달하였다. 이전에 특성분석한 Vero-적응 EV71 바이러스 균주를 사용하였다. 8계대 (P8) Vero-적응 EV71 균주의 아미노산 돌연변이를 표2에 나타냈다.
Vero-적응 EV71의 아미노산 돌연변이
　 아미노산 서열
　 EV71 P0 EV71 P8 -적응 균주
　
VP1
　
　		 7-V 7-M
14-D 14-N
145-E 145-Q
282-N 282-D
DPBS로 생물반응기를 2회 헹구고 2 mM 글루타민이 보충되었지만 FBS는 없는 DMEM D1145를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 EV71로 감염을 시작하였다. 생물반응기 중의 세포 밀도가 대조군 Cell-Stack의 세포 밀도의 두배 였으므로, 2배 부피의 감염 배지를 사용하였다 (3,300 mL, 즉 0.62 mL/cm2의 부피/표면 비율).
대조군으로서, Cell-Stack 10 (6360 cm2)을 동일한 접종 밀도를 사용하여 씨딩하고 세포를 CO2(5%) 인큐베이터에서 37°C에서 생장하도록 하였다. 4일 후에 (즉, 3일차에), 배양 배지를 버리고 Cell-Stack을 DPBS로 2회 헹구고 0.024의 MOI를 사용하여 EV71 감염을 수행하였다. 사용한 감염 배지는 배양 배지와 동일하였지만 FBS는 없다. Vero 세포 생장 및 감염에 사용된 배지의 조성을 표3에 요약하였다. 일정한 0.31 mL/cm2의 부피/표면 비율을 대조 실험에 사용하였다. EV71 iCELLis NANO 및 대조군 Cell-Stack 배양의 개략도를 도 5 및 도 6에 각각 나타냈다.
Vero 세포 생장 및 EV71 감염 동안 사용된 배지의 조성.
Vero 세포에 사용된 배지
생장 		Vero 세포에 사용된 배지
감염
EV71 DMEM #1145 (Sigma)
4.5 g/L 글루코스
2 mM 글루타민
10 % FBS #10099-141 (Gibco)		 DMEM #1145 (Sigma)
4.5 g/L 글루코스 2 mM 글루타민
결과
사전-배양기 동안 (즉, 바이러스 감염 전에), 지속적인 글루코스 소모 및 젖산 생산이 배양 내내 관찰되었다 (도 7 및 도 8). 글루코스 부족 및 20~25 mM의 임계 농도를 초과하는 젖산 축적을 피하기 위해 3일차에 배지 교체를 수행하였다. 산소 소모가 시간이 지남에 따라 증가하였고 용존 산소 (DO)는 공기/산소의 자동 주입으로 50% 초과의 설정점으로 유지되었다. 온도 및 pH가 안정적으로 유지되었다.
감염날인 6일차에 세포 밀도가 0.55 E6 세포/cm2에 도달하였다. 감염 후에, 글루코스 소모 및 젖산 생산이 극히 낮았다 (글루코스의 경우 측정 불가, 젖산의 경우 1g/L-1/일 미만). 지속적으로, 산소 소모가 표시된 DO 증가에 의해 나타난 바와 같이 감소하였다 (도7). 부유 세포 잔해가 2 DPI부터 보이기 시작하였고 시간이 지남에 따라 수가 증가하였다.
대조군 Cell-Stack에서, 세포 변성 효과 (CPE)를 2 DPI부터 볼 수 있었고 시간이 지남에 따라 증가하였다 (도 9). 4 DPI에서, 약 5% 미만의 Cell-Stack이 여전이 부착 세포로 덮여있었다.
지시된 감염 후 일 (DPI)에서의 샘플에 대한 TCID50 시험 결과를 표 4 및 5에 나타냈다. TCID50 결과는 싱가포르 및 브루셀에서 수행한 시험간에 유사하였다.
싱가포르에서 수행한 TCID50 시험.
샘플 iCELLis NANO ( TCID50 /mL)
1 DPI 1.00 E7
2 DPI 1.00 E7
3 DPI (AM) 1.00 E7
3 DPI (PM) 1.00 E7
4 DPI (AM) 1.78 E7
4 DPI (PM) 3.16 E7
양성 대조군 1.00 E7
브루셀에서 수행한 TCID50 시험
샘플 iCELLis NANO ( TCID50 /mL) 대조군 Cell-Stack (TCID50/mL)
1 DPI 1.78 E6 3.16 E5
2 DPI 1.00 E7 3.16 E6
3 DPI (PM) 5.62 E6 3.16 E7
4 DPI (PM) 1.78 E6 5.62 E6
양성 대조군 1.78 E7
실시예 3: iCELLis NANO에서 0.25 E6 세포/ cm 2 의 세포 밀도로 EV71 감염 평가
iCELLis NANO에서 생장한 Vero 세포에 의해 생산된 EV71 바이러스의 역학 및 수율을 평가하였다. 40 ml 고정층 Compaction 1.5 X 생물반응기를 사용하였고 EV71 감염을 0.25 E6 세포/cm2의 세포 밀도로 수행하였다.
방법
실시예 1에 기술된 바와 같이 NANO에 씨딩하였고 사용된 총 배양 부피는 2,500 mL이었다. 사전-배양기 동안 배지 교체를 수행하지 않았다. 3일차에, 세포 밀도가 0.25 E6 세포/cm2에 도달하였다. 생물반응기를 DPBS로 헹구고 0.024의 MOI를 사용하여 EV71로 감염을 시작하였다. 실시예 2에 기술된 바와 같이, 사용한 감염 배지는 배양 배지와 동일하였지만 FBS는 없다. 감염 동안 사용된 배양 부피는 2,500 mL (즉 0.31 mL/cm2의 부피/표면 비율)이었다. 대조군으로서, 실시예 2에 기술된 바와 같이 Cell-Stack 5 (CS-5)를 배양하고 감염시켰다. Vero 세포 생장 및 감염에 사용된 배지 조성을 실시예 2의 표 3에 요약하였다. EV71 iCELLis NANO 배양의 개략도를 도 10에 나타냈다.
결과
사전-배양기 동안 (즉, 바이러스 감염 전에), 지속적인 글루코스 소모 및 젖산 생산이 배양 내내 관찰되었다 (도 11 및 도 12). 산소 소모는 공기/산소의 자동 주입으로 50% 초과의 설정점으로 유지되는 DO의 저하에 의해 표시된 바와 같이 증가하였다. 온도 및 pH가 안정적으로 유지되었다. iCELLis NANO 40 compaction 1X를 사용하는 약 1.5 E9 세포와 비교하여, 4일차의 총 세포의 양은 2.0 E9이었다. 이러한 증가 (약 35%)는 compaction 1.5X를 사용하여 개발된 보다 높은 표면과 일치한다.
4일차에, 세포 밀도가 0.25 E6 세포/cm2에 도달하였고 감염을 개시하였다. 감염 후에, 글루코스, 산소 소모, 및 젖산 생산이 극히 낮았다. 부유 세포 잔해가 2 DPI부터 보이기 시작하였고 시간이 지남에 따라 수가 증가하였다. 대조군 Cell-Stack 5는 실시예 2의 대조군과 동일하게 행동하며, CPE는 2 DPI부터 보이기 시작하였다.
지시된 감염 후 일 (DPI)에서의 샘플에 대한 TCID50 시험 결과를 표 6 및 7에 나타냈다. NANO에서 4 DPI 후에 가장 높은 역가 (3.16 E7 TCID50/mL, 표 6)를 수득하였으며, 대조군 Cell-Stack에서 수득된 가장 높은 역가 (1.0 E7 TCID50/mL, 표 6)보다 약간 더 높았다. 동일한 샘플에 대해 수행한 2차 TCID50 분석 결과, NANO에서 수득된 바이러스 역가가 대조군 Cell-Stack보다 약간 더 높음을 확인하였다 (표 7).
브루셀에서 수행한 TCID50
샘플 iCELLis NANO ( TCID50 /mL) 대조군 Cell-Stack (TCID50/mL)
1 DPI 3.16 E5 1.75 E5
2 DPI 3.16 E6 1.00 E6
3 DPI (AM) 3.16 E6 1.00 E6
3 DPI (PM) 1.00 E7 3.16 E6
4 DPI 3.16 E7 1.00 E7
양성 대조군 1.00 E7
브루셀에서 수행한 2차 TCID50
샘플 iCELLis NANO ( TCID50 /mL) 대조군 Cell-Stack (TCID50/mL)
1 DPI 3.16 E5 1.78 E6
2 DPI 5.62 E6 3.16 E6
3 DPI (PM) 3.16 E6 3.16 E6
4 DPI 1.00 E7 1.78 E6
양성 대조군 1.78 E6
실시예 4: iCELLis NANO에서 0.52 E6 세포/ cm 2 의 세포 밀도로 Polio S2 감염 평가
iCELLis NANO 생물반응기에서 생장한 Vero 세포에 의한 Polio S2 바이러스 생산을 평가하였다. 40 ml 고정층 Compaction 1 X 생물반응기를 사용하였고 Polio 감염을 0.52 E6 세포/cm2의 세포 밀도로 수행하였다.
방법
Polio S2를 배양하기 위해 Cytodex 생물반응기를 수행하였다. 생장기에 사용된 배지는 프럭토스 (1g/L) 및 5% FBS가 보충된 1g/L 글루코스를 함유하는 DME이었다. pH 설정점은 7.15이고, 씨딩 밀도는 0.002 내지 0.0045 E6세포/cm2이고, 표면에 대한 배양 부피의 비율은 0.045 mL/cm2이고, 감염시 밀도는 0.055 E6세포/cm2이었다. 도 13은 Polio S2 Cytodex 공정을 요약한 것이다.
1,650 mL의 총 배양 부피를 사용하여 기술된 바와 같이 iCELLis NANO에 씨딩하였고 세포가 생장하도록 하였다. 3일차에 배양 배지를 교체하였다. 6일차에 세포 밀도가 1.55 E6 세포/cm2에 도달하였다. 생물반응기를 DPBS로 헹구고 감염 배지로서 M199를 사용하여 0.002의 MOI로 Polio S2로 감염을 개시하였다. 생물반응기 중의 세포 밀도가 대조군 Cell-Stack의 세포 밀도의 2배이기 때문에, 2배 부피의 감염 배지를 사용하였다 (3,300 mL, 즉 0.62 mL/cm2의 부피/표면 비율). 감염 동안의 온도를 34 °C로 설정하였다.
대조군으로서, Cell-Stack 10 (6300 cm2)을 동일한 접종 밀도를 사용하여 씨딩하고 세포를 CO2(5%) 인큐베이터에서 37°C에서 생장하도록 하였다. 4일 후에, 배양 배지를 버리고 Cell-Stack을 DPBS로 2회 헹구었다. FBS가 없는 동일한 배양 배지를 사용하여 Polio S2 감염을 수행하였다. 일정한 0.31 mL/cm2의 부피/표면 비율을 대조 실험 동안 사용하였다. Vero 세포 생장 및 Polio 감염에 사용한 배지의 조성을 표 8에 요약하였다. Polio iCELLis NANO 및 대조군 Cell-Stack 배양의 개략도를 도14 및 도 15에 각각 나타냈다. NANO 배양 동안 이용된 제어기 설정점을 표 9에 요약하였다.
Vero 세포 생장 및 Polio 감염 동안 사용된 배지 조성.
Vero 세포에 사용된 배지
생장		 Vero 세포에 사용된 배지
감염
Polio S2 DMEM #1145 (Sigma)
4.5 g/L 글루코스 2 mM 글루타민
10 % FBS #10099-141 (Gibco)		 M199 #31150-30 (Gibco)
Figure pct00002
결과
사전 배양 동안, 글루코스 소모 및 젖산 생산이 관찰되었다 (도16). 3일차에, 세포 밀도가 0.135 E6세포/cm2에 도달하였고 배지 교체를 수행하였다. 6일차에, 세포 밀도가 0.55 E6세포/cm2에 도달하였고, M199 배지 (글루코스 농도: 1 g/L)를 사용하여 감염을 수행하였다. 감염 후에, 글루코스 소모 및 젖산 생산이 극히 낮았다 (글루코스의 경우: 검출 한계 이하, 젖산의 경우: 1g.L-1/일 미만). 부유 세포 잔해가 3 DPI부터 보이기 시작하였고 시간이 지남에 따라 증가하였다.
대조군 Cell-Stack에서, 지속적인 글루코스 감소가 관찰되었고 8일차 (4 DPI) 에 검출 한계로 떨어졌다 (도 17). 상청액의 탁함이 4 DPI에서 관찰되었고, 시간이 지남에 따라 증가하였으며 이는 세포 변성 효과 (CPE)를 나타낸다 (도 18).
지시된 감염 후 일 (DPI)에서의 샘플에 대한 TCID50 시험 결과를 표 10에 나타냈다. NANO에서 수득된 가장 높은 역가 (107.9)는 대조군 Cell Stack에서 수득된 가장 높은 역가 (108.3 TCID50/mL)와 유사하였다. ELISA를 사용하여 D-항원 함량 시험을 수행하였고 결과는 TCID50 값과 일치하였다.
TCID50 시험 결과
샘플 iCELLis NANO (TCID50/mL) 대조군 CS-10 (TCID50/mL)
2 DPI <10 E4.9 -
4 DPI 10 E6.6 -
5 DPI 10 E7.5 10 E7.7
6 DPI 10 E7.9 -
7 DPI 10 E7.9 10 E8.3
실시예 5: iCELLis NANO에서 0.25 E6 세포/ cm 2 의 세포 밀도로 Polio S2 감염 평가
iCELLis NANO 생물반응기에서 생장한 Vero 세포에 의한 Polio S2 바이러스 생산을 평가하였다. 40 ml 고정층 Compaction 1.5 X 생물반응기를 사용하였고, 감염을 0.25 E6 세포/cm2의 세포 밀도로 수행하였다.
방법
실시예 1에 기술된 바와 같이 NANO에 씨딩하였고 사용된 총 배양 부피는 2,500 mL이었다. 사전-배양기 동안 배지 교체를 수행하지 않았다. 4일차에, 세포 밀도가 0.23 E6세포/cm2에 도달하였다. 생물반응기를 DPBS로 헹구고 감염 배지로서 M199를 사용하여 0.02의 MOI로 Polio S2로 감염을 개시하였다. 감염 동안 사용된 배양 부피는 2,500 mL (즉 0.31 mL/cm2의 부피/표면 비율)이었다.
대조군으로서, Cell-Stack 5를 배양하고 실시예 2에 기술된 바와 같이 감염시켰다. 6일차에, 글루코스 농도가 0.28 g/L로 떨어졌다. 0.72 g 글루코스를 25 ml의 DPBS에 용해시키고, 0.22 마이크로 상에서 여과하고, 최종 농도 1 g/L에 도달하도록 첨가하였다. Vero 세포 생장 및 Polio 감염에 사용된 배지 조성을 실시예 4의 표 8에 요약하였다. Polio iCELLis NANO 배양의 개략도를 도 19에 나타냈다. NANO 배양 동안 이용된 제어기 설정점을 실시예 4의 표9에 요약하였다.
결과
사전-배양기 동안, 젖산 증가가 관찰되었다. 산소 소모는 공기/산소의 자동 주입으로 50% 초과의 설정점으로 유지되는 용존 산소 (DO)의 저하로 나타나는 바와 같이 증가하였다. 온도 및 pH가 안정적으로 유지되었다 (도 20).
4일차에, 세포 밀도가 0.23 E6세포/cm2에 도달하였고 감염을 개시하였다. Polio S2 감염 후에, 글루코스, 산소 소모, 및 젖산 생성이 극히 적었다 (도 20). 부유 세포 잔해가 2 DPI부터 보이기 시작하였고 시간이 지남에 따라 수가 증가하였다.
대조군 Cell-Stack에서, 6일차에 0.28 g/L로 지속적인 글루코스 감소가 관찰되었다. 1.72 g의 글루코스를 첨가하고 배양하였다 (도 21). 상청액의 탁함이 4 DPI에서 관찰되었고, 시간이 지남에 따라 증가하였으며 이는 세포 변성 효과 (CPE)를 나타낸다 (도 22).
지시된 감염 후 일 (DPI)에서의 샘플에 대한 TCID50 시험 결과를 표 11에 나타냈다. NANO에서 수득된 가장 높은 역가 (107.8 TCID50/mL)는 대조군 Cell Stack에서 수득된 가장 높은 역가 (108.3 TCID50/mL)와 유사하였다. ELISA를 사용하여 D-항원 함량 시험을 수행하였고 결과는 TCID50 값과 일치하였다.
TCID50 시험 결과
샘플 iCELLis NANO (TCID50/mL) 대조군 CS-5 (TCID50/mL)
1 DPI 10 E5.1 10 E4.6
2 DPI 10 E5.9 10 E5.8
3 DPI 10 E5.9 10 E5.9
4 DPI 10 E7.1 10 E6.6
5 DPI 10 E7.7 10 E7.1
6 DPI 10 E7.6 10 E8.0
7 DPI 10 E7.8 10 E8.3
실시예 6: 실험 파라미터 요약
iCELLis NANO 및 Cell Stack에서 수행한 실험 1 내지 5의 주요 파라미터의 요약을 아래 표 12 및 13에 나타냈다.
iCELLis NANO에수 수행한 주요 실험 파라미터의 요약


실험		 접종 시 세포 밀도 (E6/cm2) 감염 시 세포 밀도 (E6/cm2)

MOI
NANO
compaction		 NANO
고정층 부피 (mL)
NANO
표면 (m2)		 세포 생장에 사용된 총 배지 부피 (mL) 감염에 사용된 총 배지 부피 (mL)
실험 1 0.015 - - 1X 40 0.53 4,950 -
실험 2 0.015 0.52 0.024 1X 40 0.53 3,300 3,300
실험 3 0.015 0.25 0.024 1.5X 40 0.8 2,480 2,480
실험 4 0.015 0.55 0.002 1X 40 0.53 3,300 3,300
실험 5 0.015 0.22 0.020 1.5X 40 0.8 2,480 2,480
Cell Stack에서 수행된 대조 실험의 주요 파라미터의 요약


실험		 접종 시 세포 밀도 (E6/cm2) 감염 시 세포 밀도 추정치 (E6/cm2)

MOI
Cell Stack
(플래토 수)		 Cell Stack 표면 (m2) 세포 생장에 사용된 총 배지 부피 (mL) 감염에 사용된 총 배지 부피 (mL)
실험 1 0.015 - - 10 0.63 2,000 -
실험 2 0.015 ~0.25 0.024 10 0.63 2,000 2,000
실험 3 0.015 ~0.25 0.024 5 0.32 1,000 1,000
실험 4 0.015 ~0.25 0.002 10 0.63 2,000 2,000
실험 5 0.015 ~0.25 0.020 5 0.32 1,000 1,000
실시예 7: 최적화 연구: iCELLis NANO 배양에서 EV71 MOI가 20배 감소하는 영향
iCELLis NANO 배양에서 EV71 MOI가 0.02에서 0.001 아래로 20배 감소하는 영향을 평가하였다. MOI가 감소하면 바이러스 종자 은행에서 해당하는 부피 및 비용이 낮아진다.
방법
접종 시 세포 밀도의 20배 감소의 영향을 평가하기 위해, 2개의 iCELLis NANO 배양을 수행하였고 0.001의 MOI를 사용하여 0.25 또는 0.5x10E6세포/cm2의 밀도로 감염시켰다. 이어서 이러한 배양을 유사한 조건이지만 0.02의 MOI로 감염시켜 수행한 iCELLis NANO 배양과 비교하였다. TCID50 방법을 사용하여 바이러스 생산성을 평가하였다.
결과
TCID50 결과를 표 14에 나타냈다. 0.25x10E6세포/cm2의 낮은 세포 밀도에서, 높은 MOI가 5배 더 높았다. 0.5x10E6세포/cm2의 세포 밀도에서, 높은 MOI와 낮은 MOI 사이에 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 또한, Cell-Stack에서 수행한 실험은 MOI (0.02 내지 0.0001)가 생산성에 유의한 영향을 미치지 않음을 나타냈다. 이러한 결과에 기초하여, 낮은 MOI (0.001)를 후속 연구에서 선택하였다.
최대 바이러스 생산성에서의 MOI 영향
감염 시 세포 밀도 (106 세포/cm2) 높은 MOI (0.02) (TCID50/mL) 낮은MOI (0.001) (TCID50/mL)
0.25 1.00E+08 1.78E+07
0.50 1.78E+07 1.00E+07
실시예 8: 최적화 연구: EV71 감염 및 생산성 피크에서 최적의 세포 밀도 결정
감염 시 세포 밀도가 바이러스 생산성에 중요한 영향을 미친다. 생산성 피크를 결정하기 위해 EV71 감염 시의 최적의 세포 밀도 및 바이러스 방출 역학을 평가하였다.
방법
EV71 (0.001의 MOI)을 사용하여 상이한 세포 밀도에서 일련의 5개의 iCELLis NANO 배양물을 감염시켰다. 다음의 배양 조건을 사용하였다: 접종 시의 세포 밀도: 15,000 세포/cm2, 생장 배지: Sigma D1145+10% FBS+ 4 mM 글루타민, 감염 배지: FBS가 없는 생장 배지, 부피/표면 비율: 0.3 mL/cm2. 다음의 밀도에 도달하기 위해 생장기 동안 전체 배지를 교체하였다: 0.55, 0.7 및 0.86x10E6 세포/cm2. 배양 배지를 완전히 모니터링하고 (글루코스 소모, 젖산 생산, 세포 밀도, DO, pH) 바이러스 생산성을 감염 후 각각의 일수에서 TCID50 방법을 사용하여 측정하였다.
결과
특이적 (세포 당) 생산성이 세포 밀도가 증가함에 따라 감소하였다 (도 23A 내지 23D). 가장 높은 부피의 생산성이 가장 낮은 세포 밀도에서 관찰되었으며, 이는 보다 높은 세포 밀도가 보다 낮은 특이적 생산성을 보상하지 못함을 나타낸다.
전반적으로, 0.2 및 0.35x10E6 세포/cm2 둘 모두에서 유사한 최대 생산성을 수득하였으며, 이는 총 샌산성이 이러한 범위 이내의 세포 밀도와 무관함을 나타낸다. 최대 생산성이 낮은 세포 밀도에서 감염 후 3일 후에 (감염 후의 일 수는 0일차임) 달성되었으며, 적어도 4일 이상 안정하게 유지되었다. 보다 높은 세포 밀도에서, 감염 후 4~5일 후에 생산성 피크에 도달한 후 생산성이 감소하였다.
결과적으로, 데이터가 나타내는 바와 같이, 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 낮은 세포 밀도 (예컨대, 0.2~0.35x105 세포/cm2)가 유리할 수 있는데 그 이유는 제한 없이 다음을 포함한다: 특이적 생산성 (세포 당), 부피 생산성 (회수물의 mL 당), 시간의 경과에 따른 안정성, 보다 적은 배지 소모, 및 낮은 세포 밀도의 세포로 기인한 보다 적은 HCP 및 DNA 오염 반대로, 데이터가 나타내는 바와 같이, 이론에 구속되기를 바라지 않으면서, 높은 세포 밀도 (예컨대, >0.5x105 세포/cm2)가 낮은 생산성, 시간 경과에 따른 더 불량한 안정성, 보다 높은 배지 소모, 및 보다 높은 세포 밀도에 기인한 더 많은 HCP 및 DNA 오염을 야기할 수 있다.
실시예 9: 최적화 연구: EV71 접종 시 세포 밀도 감소의 영향
접종물의 부피를 감소시키는 것의 잠재적인 이익은 다음을 포함한다: (i) 보다 적은 노동 시간 및 (ii) 보다 적은 오염 위험. 접종 시 세포 밀도를 3배 감소시키는 것의 영향을 평가하였다.
방법
iCELLis NANO를 5,000 세포/cm2의 낮은 밀도로 접종하고 15,000 세포/cm2의 세포 밀도로 접종한 iCELLis NANO와 비교하였다. 0.001의 MOI를 사용하여 350,000 세포/cm2의 세포 밀도에서 두 iCELLis NANO를 감염시켰다. 생장기 및 감염기 동안의 부피/표면 비율은 0.3 mL/cm2이었다.
결과
생장기 동안, 글루코스 소모 및 젖산 생산은 2개의 조건 사이에 유사하였다 (도 24). 접종 시 낮은 세포 밀도를 사용하였을 때, 감염 시 목표 세포 밀도에 도달하기 까지 약 48시간의 지연이 관찰되었다. 2개의 배양물 사이에 바이러스 생산성에 있어 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (표 15).
바이러스 생산성
15,000 세포/cm2
씨딩 밀도		 5,000 세포/cm2
씨딩 밀도
최대 바이러스 생산성 (TCID50/mL) 1.78E+07 3.16E+07
데이터는, 접종 시 세포 밀도를 5,000 세포/cm2로 감소시키는 것이 (i) 바이러스 생산성에 영향을 미치지 않으며, (ii) 배지/대사산물 소모를 증가시키지 않고, (iii) 생장기를 최대 48시간까지 연장시킴을 나타낸다. 결론적으로, 데이터가 나타내는 바와 같이, 이론에 구속되기를 윈치 않고, 접종 시 세포 밀도를 감소시키는 것은 비제한적으로 다음을 포함하는 이유로 유리할 수 있다: 접종물 크기, 노동 시간, 사전 배양 단계의 발자취, 인큐베이터의 수, 오염 위험.
실시예 10: 최적화 연구: 생장기 동안 FBS 농도 및 부피/표면 비율 감소의 영향.
세포 생장 또는 바이러스 생산 시 사용하는 배양 부피의 감소 (부피/표면 비율 감소) 또는 FBS 농도의 감소의 영향을 평가하였다.
방법
일련의 실험을 T-플라스크에서 수행하고 글루코스 소모 및 젖산 생산을 포함하여 세포 밀도를 모니터링하였다. 생장기에서 5% FBS 및 5,000 세포/cm2의 낮은 접종 밀도를 사용하여 iCELLis NANO에서의 배양을 수행하였다. 세포를 약 0.25x10E6 세포/cm2의 밀도로 생장시킨 후 EV71 (MOI=0.001)로 감염시켰다. 바이러스 생산성을 분석하였다.
결과
T-플라스크 배양에서의 2개의 조건이 200,000 세포/cm2의 목표 세포 밀도에 도달하였다: (1) 0.2의 부피/표면 비율을 갖는 10% FBS, 및 (2) 0.3의 부피/표면 비율을 갖는 5% FBS (도 25). iCELLis NANO 배양에서, FBS 농도의 2배 감소는 생장기 및 바이러스 생산성에 유의한 영향을 미치지 않았다 (표 16).
바이러스 생산성
10 % FBS에서의 생장기 5 % FBS에서의 생장기
최대 바이러스 생산성 (TCID50/mL) 3.16E+07 1.00E+08
데이터는, 생장이기 동안 10%에서 5%로의 FBS 농도 감소가 생장기 지속성 및 바이러스 생산성에 유의한 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
실시예 11: 최적화된 EV71 iCELLis NANO 조건 요약
iCELLis NANO 사전 및 최적화 후 실험 둘 모두 (실시예 7 내지 10)의 EV71에 대한 배양 파라미터를 표 17에 나타냈다. 결과적인 iCELLis NANO 실험 설정도 또한 도 26에 요약하였다. 최적화된 실험 설정에서, iCELLis NANO를 5,000 세포/cm2의 세포 밀도로 접종시키고, 0.2 x 106 세포/cm2의 밀도에 도달할 때까지 세포를 4 mM 글루타민 및 5 % FBS가 보충된 DMEM 배지(Sigma D1145, 4.5 g/L 글루코스 함유)에서 37°C 및 pH 7.4에서 6일 동안 생장시켰다 (배지 교체 없이). 부피/표면 비율은 0.3 mL/cm2이었다. 감염을 위해, 2회의 세척 단계를 수행하여 알부민 및 다른 FBS에 함유된 단백질을 제거하였다. 4 mM 글루타민이 보충되어 있지만 FBS가 없는 DMEM (Sigma D1145)에서 0.3 mL/cm2의 동일한 부피/표면 비율 및 0.001의 MOI를 사용하여 감염을 수행하였다. 감염 후 3 내지 4일차에 회수하였다.
iCELLis 최적화된 공정의 주요 배양 파라미터.
최적화 전 최적화 후
접종물 15,000 세포/cm2 5,000 세포/cm2
생장 배지 DMEM+10% FBS
 DMEM+5% FBS
부피/표면 (생장기) 0.3 0.3
감염 배지 FBS가 없는 DMEM FBS가 없는 DMEM
부피/표면 (감염기) 0.3 0.3
MOI 0.02 0.001
바이러스 생산성 (로그 TCID50/mL) 7-8 7-8
실시예 12: 최적화: EV71 공정 견고성
iCELLis NANO 실험에 대한 최대 EV71 생산성의 요약을 도 27에 나타냈다. 0.001 내지 0.02 범위의 MOI, 5,000 내지 15,000 세포/cm2의 접종물 밀도, 0.2 내지 약 0.8x106 세포/cm2 범위의 접종 시 밀도, 및 다양한 FBS 농도를 사용하여 각각의 이러한 실험을 수행하였다. 바이러스 생산성은 1 로그 미만 및 107~108 TCID50/mL의 수확량으로 다양하였다.
실시예 13: iCELLis500 /100에서의 EV71 공정
iCELLis NANO (2 cm 층 높이)에서 iCELLis500/100 (2 cm 층 높이)로의 스케일-업 EV71 생산에 대한 능력을 평가하였다. 생장기 동안 10% FBS 농도를 사용하였다는 것을 제외하고, 실시예 11에 제시된 최적화 후 세포 배양 파라미터를 사용하였다.
방법
일회용 바이오-매스 프로브가 구비되어 있고 iCELLis Skid에 의해 조종되는 iCELLis500/100 생물반응기 (2 cm 층 높이, 100 m2의 표면을 발달시키는 5L 고정층)를 사용하여 수행하였다. 배양 공정의 전반적인 모습을 도 28에 도시하였고, iCELLis500/100 수행의 실험 설정을 도 29에 나타냈다. 대조군으로서, iCELLis NANO 및 Cell-Stack 배양을 iCELLis500/100 배양에 사용했던 동일한 원료 물질을 사용하여 수행하였다.
접종물
5,000 세포/cm2의 밀도로 iCELLis500/100를 씨딩하는데 50억개의 Vero 세포 (5x109)를 사용하였다. 일련의 증폭 단계를 통해 접종이 이루어졌다. iCELLis 100 m2에 대한 목적하는 양의 접종물을 생산하기 위해 4개의 Cell-Stack 10을 사용하였다.
생장기
4 mM 글루타민 및 10 % FBS (항생제 첨가되지 않음)가 보충된 0.3 mL/cm2의 DMEM 배지 (4.5 g/L 글루코스)를 사용하여 6일 동안, 세포 밀도가 0.2 x106 세포/cm2의 최적 밀도에 도달할 때까지 생장기를 수행하였다. 배지를 교체하지 않았다. 온도는 37°C였고, CO2 및 NaOH의 자동화된 감염에 의해 pH가 7.4로 유지되었다. 자동화된 공기 및/또는 산소의 주입에 의해 산소 밀도가 50% 초과로 유지되었다.
다음과 같이 나누어진, 총 300L를 사용하는 재순환 배치 모드에서 배양을 수행하였다: 생물반응기에서 65 L 및 나머지 팔레탱크 (palletank)의 500 L 백에서 나머지 235 L. 생물반응기와 백 사이의 재순환은 Skid 연동 펌프를 사용하여 0.25 L/분의 속도로 수행하여, 매 20시간 마다 배양 배지가 완전히 순환되도록 하였다. (i) 세포를 담체에 최적으로 고정시키고 (ii) 분비된 생장 인자의 희석을 감소시키기 위해 씨딩 후 40시간 후에 재순환을 개시하였다.
Skid 제어기를 사용하여 다음 파라미터의 지속적인 모니터링을 자동적으로 수행하였다: T°, pH, 고정층 전 후의 DO, 전도도, 및 바이오매스 (정전용량). 세포 밀도 (및 따라서 감염 시간) 및 이어서 세포 변성 효과를 평가하기 위해 바이오매스 프로브를 사용하였으며, 이는 점진적이고 거대한 바이오매스 신호의 감소를 야기하였다 (도 30A 내지 30C). 배양 동안 소모된 공기, 산소, CO2 및 NaOH의 양을 또한 기록하였다. pH (측정치 외), 글루코스 및 젖산 농도를 측정하기 위해 매일 샘플을 취하였다.
감염기
생장기와 동일한 T°, pH, 및 DO 조건 하에 4 mM 글루타민이 보충된 0.3 mL/cm2의 DMEM (4.5 g/L 글루코스)을 사용하여 무혈청 감염 배지에서 감염기를 수행하였다.
감염 전에, 생물반응기의 고정층을 65 L의 감염 배지로 2회 헹구어 FBS 및 다른 혈청 단백질을 제거하였다. 생물배양기에 적정량의 바이러스 씨드를 혼합하여 0.001의 MOI에 도달하도록 감염을 수행하였다. 이 단계 동안, 백 내의 바이러스 손실을 방지하기 위해, 생물반응기와 백 사이의 재순환을 4시간 동안 중단시킨 다음 재시작하였다.
생장기 중과 동일하게 세포 배양 모니터링을 수행하였다. 또한, 반응기 및 재순환 백에서의 QC 분석 (TCID50, HCP, DNA 정량화)을 위해 샘플을 취하였다.
회수 및 정화 (clarification)
장기간에 걸쳐 바이러스 역학 연구를 수행하기 위해, 감염 후 6일 까지 (6 DPI) 감염을 진행하였다. 3 DPI에서 중간 회수물 (40 L)을 취하고6 DPI에서 최종적으로 회수하였다. 후속 DSP 연구를 위해 두 회수물을 Bio-20 (PALL) 딥 필터에서 정화하였다.
iCELLis500 취급
항생제 없이 멸균 조건 하에서 iCELLis500/100 배양을 수행하였다. Bio-Welder 또는 무균 커넥터를 사용하여 모든 연결을 무균적으로 수행하였다. 적절한 매니폴드 (manifold)를 사용하여, 적층 흐름 하에 배양 샘플을 취하였다.
결과
세포 생장, 대사물 소모 (글루코스, 용존 산소), 및 대사물 생산 (젖산)의 관점에서, iCELLis NANO 대조군과 유사한 방식으로 iCELLis500/100 배양을 수행하였다 (도 30A 내지 30E).
iCELLis500/100에서의 바이러스 생산성은 3 DPI에서 5.0 x 107 TCID50/mL의 회수의 최대 역가에 도달하였고, 총 수율은 1.5 x 1013 TCID50 이었다 (도 31A 내지 31C, 및 도 32). 최대 6 DPI까지 생산성이 안정하게 유지되었다. HCP 및 DNA가 각각 4 및 5 DPI에 최대에 도달하였다.
이러한 결과는, 작은 규모의 iCELLis NANO에서 개발되고 최적화된 EV71 배양 공정의 성공적인 스케일-업을 보여준다. iCELLis500/100에서 수득된 바이러스 역가 및 총 수율은 작은 규모에서 수득된 것들과 유사하다.
실시예 14: 생장기 동안 5% FBS를 사용하는 iCELLis500 /100
감소된 5% FBS 농도를 사용한 것을 제외하고, 실시예 13에 기술된 바와 같이 iCELLis500/100에서 EV71을 생산하였다.
실시예 15: 무혈청 배지( SFM )에서의 EV71 공정
무혈청(SFM, OptiPro) 또는 10% FBS (M199) 배지를 사용하여 T-플라스크에서 EV71 감염을 수행하였다 (도 33). 점진적으로 적응된 Vero 세포주 및 영구적으로 무혈청 배지 적응된 세포주에서의 바이러스 생산을 평가하였다. 세포 생장 및 바이러스 생산성 (TCID50)은 바이러스 감염기 동안 무혈청 또는 10% FBS 배지를 사용하였을 때와 유사하였다 (표 18). 무혈청 조건에서의 EV71 생산을 GMP Vero SFM-적응 세포주를 사용하여 iCELLis NANO에서 후속적으로 평가하였다.
최대 바이러스 생산성(TCID50/mL)
점진적으로 적응된 Vero 세포주 영구적으로 무혈청 배지 적응된 Vero 세포주
생장 OptiPro
감염 M199		 1.0 E+07 1.0 E+07
생장 OptiPro 감염 OptiPro 5.0 E+07 5.0 E+07
실시예 16: 공정 개발 전략
iCELLis EV71 생산을 위한 전반적인 공정 개발 전략을 도 34에 나타냈다. 첫 번째 단계 (실현가능성 연구)를 실시예 1 내지 3에 나타냈다. 두 번째 단계 (iCELLis NANO 2 cm 층 높이에서의 공정 최적화)를 실시예 7 내지 10에 나타냈다. 3번째 단계인 규모 확대는 "수평" 규모 확대 (생물반응기의 고정층 높이가 일정하게 유지되고, 이의 직경이 증가함) 및 "수직" 규모 확대 (고정층 높이가 증가하고 직경이 일정하게 유지됨)으로 나누어진다. 수평 규모 확대 (iCELLis500/100, 2 cm 층 높이)를 실시예 13에 나타냈다. 수직 규모 확대를 5% FBS로 최적화된 공정을 사용하여 iCELLis NANO 10 cm 층 높이 (200 mL, 4 m2)에서 수행하였다. 공장 규모 EV71 배양을 iCELLis500/500 (10 cm 층 높이)에서 수행하였다 (도 35).
실시예 17: iCELLis NANO에서 0.52 E6 세포/ cm 2 의 세포 밀도로 CA6 및 CA16 감염 평가
iCELLis NANO에서 생장한 Vero 세포에 의해 생산된 CA6 및 CA16 바이러스의 역학 및 수율을 평가하였다. 40 ml 고정층 Compaction 1 X 생물반응기를 사용하였고 CA6 및 CA16 감염을 0.52 E6 세포/cm2의 세포 밀도로 수행하였다.
방법
실시예 1에 기술된 바와 같이 NANO에 씨딩하였고 사용한 총 배양 부피는 1,650 mL이었다. 3일차에 배양 배지를 완전히 교체하였다. 이전에 특성분석한 Vero-적응 CA6 및 CA16 바이러스 균주를 사용하였다. 11계대 (P11) CA6 및 3계대 (P3) CA16 Vero-적응 균주의 핵산 및 아미노산 돌연변이를 표19 및 20에 나타냈다.
Figure pct00003
Figure pct00004
DPBS로 생물반응기를 2회 헹구고 2 mM 글루타민이 보충되었지만 FBS는 없는 DMEM D1145를 사용하여 실시예 1에 기술된 바와 같이 CA6 및 CA16을 사용하는 감염을 시작하였다. 생물반응기 중의 세포 밀도가 대조군 Cell-Stack의 세포 밀도의 두배 였으므로, 2배 부피의 감염 배지를 사용하였다 (3,300 mL, 즉 0.62 mL/cm2의 부피/표면 비율).
대조군으로서, Cell-Stack 10 (6360 cm2)에 동일한 접종 밀도를 사용하여 씨딩하고 세포를 CO2 (5%) 인큐베이터에서 37°C에서 생장하도록 하였다. 4일 후에 (즉, 3일차에), 배양 배지를 버리고 Cell-Stack을 DPBS로 2회 헹구고 0.024의 MOI를 사용하여 CA6 및 CA16 감염을 수행하였다. 사용한 감염 배지는 FBS가 없다는 것을 제외하고 배양 배지와 동일하였다. Vero 세포 생장 및 감염에 사용한 배지의 조성을 표 21에 요약하였다. 일정한 0.31 mL/cm2의 부피/표면 비율을 대조 실험 동안 사용하였다.
Vero 세포 생장 및 CA6 및 CA16 감염 동안 사용된 배지 조성.
Vero 세포에 사용된 배지
생장 		Vero 세포에 사용된 배지
감염
CA6 및 CA16 DMEM #1145 (Sigma)
4.5 g/L 글루코스
2 mM 글루타민
10 % FBS #10099-141 (Gibco)		 DMEM #1145 (Sigma)
4.5 g/L 글루코스 2 mM 글루타민
실시예 18: iCELLis NANO에서 0.25 E6 세포/ cm 2 의 세포 밀도로 CA6 및 CA16 감염 평가
iCELLis NANO에서 생장한 Vero 세포 생장에 의해 생산된 CA6 및 CA16 바이러스 생산성의 역학 및 수율을 평가하였다. 40 ml 고정층 Compaction 1.5 X 생물반응기를 사용하였고 CA6 및 CA16 감염을 0.25 E6 세포/cm2의 세포 밀도로 수행하였다.
방법
실시예 1에 기술된 바와 같이 NANO에 씨딩하였고 사용한 총 배양 부피는 2,500 mL이었다. 사전-배양기 동안 배지 교체를 수행하지 않았다. 생물반응기를 DPBS로 헹구고 0.024의 MOI를 사용하여 CA6 및 CA16으로 감염을 개시하였다. 사용된 감염 배지는 FBS가 없다는 점을 제외하고 실시예 17에 기술된 배양 배지와 동일하였다. 감염 동안 사용된 배양 부피는 2,500 mL 이었다 (즉 0.31 mL/cm2의 부피/표면 비율). 대조군으로서, Cell-Stack 5 (CS-5)를 배양하고 실시예 17에 기술된 바와 같이 감염시켰다. Vero 세포 생장 및 감염에 사용한 배지 조성을 실시예 17의 표 21에 요약하였다.
실시예 19: 최적화 연구: iCELLis NANO 배양에서 CA6 및 CA16의 MOI가 20배 감소하는 영향
iCELLis NANO 배양에서 CA6 및 CA16의 MOI가 0.02에서 0.001 아래로 20배 감소하는 영향을 평가하였다. MOI가 감소하면 바이러스 종자 은행에서 해당하는 부피 및 비용이 낮아진다.
방법
접종 시 세포 밀도의 20배 감소의 영향을 평가하기 위해, 2개의 iCELLis NANO 배양을 수행하였고 0.001의 MOI를 사용하여 0.25 또는 0.5x10E6 세포/cm2의 밀도로 감염시켰다. 이어서 이러한 배양을 유사한 조건이지만 0.02의 MOI로 감염시켜 수행한 iCELLis NANO 배양과 비교하였다. TCID50 방법을 사용하여 바이러스 생산성을 평가하였다.
실시예 20: 최적화 연구: CA6 및 CA16 감염 및 생산성 피크에서 최적의 세포 밀도 결정
감염 시 세포 밀도가 바이러스 생산성에 중요한 영향을 미친다. 생산성 피크를 결정하기 위해 CA6 및 CA16 감염 시의 최적의 세포 밀도 및 바이러스 방출 역학을 평가하였다.
방법
CA6 및 CA16 (0.001의 MOI)을 사용하여 상이한 세포 밀도로 일련의 5개의 iCELLis NANO 배양물을 감염시켰다. 다음의 배양 조건을 사용하였다: 접종 시의 세포 밀도: 15,000 세포/cm2, 생장 배지: Sigma D1145+10% FBS+ 4 mM 글루타민, 감염 배지: FBS가 없는 생장 배지, 부피/표면 비율: 0.3 mL/cm2. 다음의 밀도에 도달하기 위해 생장기 동안 전체 배지를 교체하였다: 0.55, 0.7 및 0.86x10E6 세포/cm2. 배양 배지를 완전히 모니터링하고 (글루코스 소모, 젖산 생산, 세포 밀도, DO, pH) 바이러스 생산성을 감염 후 각각의 일수에서 TCID50 방법을 사용하여 측정하였다.
실시예 21: 최적화 연구: CA6 및 CA16 접종 시 세포 밀도감소의 영향
접종물의 부피를 감소시키는 것의 잠재적인 이익은 다음을 포함한다: (i) 보다 적은 노동 시간 및 (ii) 보다 적은 오염 위험. 접종 시 세포 밀도를 3배 감소시키는 것의 영향을 평가하였다.
방법
iCELLis NANO를 5,000 세포/cm2의 낮은 밀도로 접종하고 15,000 세포/cm2의 세포 밀도로 접종한 iCELLis NANO와 비교하였다. 0.001의 MOI를 사용하여 350,000 세포/cm2의 세포 밀도에서 CA6 및 CA16으로 iCELLis NANO를 감염시켰다. 생장기 및 감염기 동안의 부피/표면 비율은 0.3 mL/cm2이었다.
실시예 22: 최적화 연구: 생장기 동안 FBS 농도 및 부피/표면 비율 감소의 영향.
세포 생장 또는 CA6 및 CA16 바이러스 생산 시 사용된 배양 부피의 감소 (부피/표면 비율 감소) 또는 FBS 농도의 감소의 영향을 평가하였다.
방법
일련의 실험을 T-플라스크에서 수행하고 글루코스 소모 및 젖산 생산을 포함하여 세포 밀도를 모니터링하였다. 생장기에서 5% FBS 및 5,000 세포/cm2의 낮은 접종 밀도를 사용하여 iCELLis NANO에서의 배양을 수행하였다. 세포를 약 0.25x10E6 세포/cm2의 밀도로 생장시킨 후 CA6 및 CA16 (MOI=0.001)을 감염시켰다. CA6 및 CA16 바이러스 생산성을 분석하였다.
실시예 23: iCELLis500 /100에서의 CA6 및 CA16 공정
iCELLis NANO (2 cm 층 높이)에서 iCELLis500/100 (2 cm 층 높이)로의 스케일-업 CA6 및 CA16 생산에 대한 능력을 평가하였다. 생장기 동안 10% FBS 농도를 사용하였다는 것을 제외하고, 최적화 후 세포 배양 파라미터를 사용하였다.
방법
일회용 바이오-매스 프로브가 구비되어 있고 iCELLis Skid에 의해 조종되는 iCELLis500/100 생물반응기 (2 cm 층 높이, 100 m2의 표면을 발달시키는 5L 고정층)를 사용하여 배양을 수행하였다. 대조군으로서, iCELLis NANO 및 Cell-Stack 배양을 iCELLis500/100 배양에 사용했던 동일한 원료 물질을 사용하여 수행하였다.
접종물
5,000 세포/cm2의 밀도로 iCELLis500/100를 씨딩하는데 50억개의 Vero 세포 (5x109)를 사용하였다. 일련의 증폭 단계를 통해 접종이 이루어졌다. iCELLis 100 m2에 대한 목적하는 양의 접종물을 생산하기 위해 4개의 Cell-Stack 10을 사용하였다.
생장기
4 mM 글루타민 및 10 % FBS (항생제 첨가되지 않음)가 보충된 0.3 mL/cm2의 DMEM 배지 (4.5 g/L 글루코스)를 사용하여 6일 동안, 세포 밀도가 0.2 x106 세포/cm2의 최적 밀도에 도달할 때까지 생장기를 수행하였다. 배지를 교체하지 않았다. 온도는 37°C였고, CO2 및 NaOH의 자동화된 감염에 의해 pH가 7.4로 유지되었다. 자동화된 공기 및/또는 산소의 주입에 의해 산소 밀도가 50% 초과로 유지되었다.
다음과 같이 나누어진, 총 300L를 사용하는 재순환 배치 모드에서 배양을 수행하였다: 생물반응기에서 65 L 및 나머지 팔레탱크 (palletank)의 500 L 백에서 나머지 235 L. 생물반응기와 백 사이의 재순환은 Skid 연동 펌프를 사용하여 0.25 L/분의 속도로 수행하여, 매 20시간 마다 배양 배지가 완전히 순환되도록 하였다. (i) 세포를 담체에 최적으로 고정시키고 (ii) 분비된 생장 인자의 희석을 감소시키기 위해 씨딩 후 40시간 후에 재순환을 개시하였다.
Skid 제어기를 사용하여 다음 파라미터의 지속적인 모니터링을 자동적으로 수행하였다: T°, pH, 고정층 전 후의 DO, 전도도, 및 바이오매스 (정전용량). 세포 밀도 (및 따라서 감염 시간) 및 이어서 세포 변성 효과를 평가하기 위해 바이오매스 프로브를 사용하였다. 배양 동안 소모된 공기, 산소, CO2 및 NaOH의 양을 또한 기록하였다. pH (측정치 외), 글루코스 및 젖산 농도를 측정하기 위해 매일 샘플을 취하였다.
감염기
생장기와 동일한 T°, pH, 및 DO 조건 하에 4 mM 글루타민이 보충된 0.3 mL/cm2의 DMEM (4.5 g/L 글루코스)을 사용하여 무혈청 감염 배지에서 감염기를 수행하였다.
감염 전에, 생물반응기의 고정층을 65 L의 감염 배지로 2회 헹구어 FBS 및 다른 혈청 단백질을 제거하였다. 생물배양기에 적정량의 바이러스 씨드를 혼합하여 0.001의 MOI에 도달하도록 감염을 수행하였다. 이 단계 동안, 백 내의 바이러스 손실을 방지하기 위해, 생물반응기와 백 사이의 재순환을 4시간 동안 중단시킨 다음 재시작하였다.
생장기 중과 동일하게 세포 배양 모니터링을 수행하였다. 또한, 반응기 및 재순환 백에서의 QC 분석 (TCID50, HCP, DNA 정량화)을 위해 샘플을 취하였다.
회수 및 정화 (clarification)
장기간에 걸쳐 바이러스 역학 연구를 수행하기 위해, 감염 후 6일 까지 (6 DPI) 감염을 진행하였다. 3 DPI에서 중간 회수물 (40 L)을 취하고6 DPI에서 최종적으로 회수하였다. 후속 DSP 연구를 위해 두 회수물을 Bio-20 (PALL) 딥 필터에서 정화하였다.
iCELLis500 취급
항생제 없이 멸균 조건 하에서 iCELLis500/100 배양을 수행하였다. Bio-Welder 또는 무균 커넥터를 사용하여 모든 연결을 무균적으로 수행하였다. 적절한 매니폴드 (manifold)를 사용하여, 적층 흐름 하에 배양 샘플을 취하였다.
실시예 24: 생장기 동안 5% FBS를 사용하는 iCELLis500 /100
감소된 5% FBS 농도를 사용하였다는 것을 제외하고, 실시예 23에 기술된 바와 같이 iCELLis500/100에서 CA6 및 CA16을 생산하였다.
실시예 25: 무혈청 배지( SFM ) 에서의 CA6 및 CA16 공정
CA6 및 CA16의 생산에 완전한 무혈정 공정을 사용하였다. 세포 생장 및 바이러스 생산성 (TCID50)을 생장기 동안 무혈청 (SFM, OptiPro) 또는 10% FBS 배지를 사용하였을 때와 비교하였다. 무혈청 조건에서의 CA6 및 CA16 생산을 GMP Vero SFM-적응 세포주를 사용하여 iCELLis NANO에서 평가하였다.
SEQUENCE LISTING <110> RAO, Raman <120> METHODS FOR PRODUCING VIRUS FOR VACCINE PRODUCTION <130> 606772001140 <140> Not yet assigned <141> Concurrently Herewith <150> 62/116,361 <151> 2015-02-13 <160> 14 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 297 <212> PRT <213> Enterovirus A <400> 1 Gly Asp Arg Val Ala Asp Val Ile Glu Ser Ser Ile Gly Asp Ser Val 1 5 10 15 Ser Arg Ala Leu Thr Gln Ala Leu Pro Ala Pro Thr Gly Gln Asn Thr 20 25 30 Gln Val Ser Ser His Arg Leu Asp Thr Gly Glu Val Pro Ala Leu Gln 35 40 45 Ala Ala Glu Ile Gly Ala Ser Ser Asn Thr Ser Asp Glu Ser Met Ile 50 55 60 Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn Ser His Ser Thr Ala Glu Thr Thr Leu 65 70 75 80 Asp Ser Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Glu Ile Asp Leu Pro 85 90 95 Leu Glu Gly Thr Thr Asn Pro Asn Gly Tyr Ala Asn Trp Asp Ile Asp 100 105 110 Ile Thr Gly Tyr Ala Gln Met Arg Arg Lys Val Glu Leu Phe Thr Tyr 115 120 125 Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Ala Cys Thr Pro Thr Gly 130 135 140 Glu Val Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Phe Val Pro Pro Gly Ala 145 150 155 160 Pro Lys Pro Glu Ser Arg Glu Ser Leu Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn 165 170 175 Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Thr Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val 180 185 190 Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr 195 200 205 Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Ala 210 215 220 Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Val Arg Thr Val Gly Ser 225 230 235 240 Ser Lys Ser Lys Tyr Pro Leu Val Val Arg Ile Tyr Met Arg Met Lys 245 250 255 His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Met Arg Asn Gln Asn Tyr Leu 260 265 270 Phe Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Ala Gly Asn Ser Ile Lys Pro Thr Gly 275 280 285 Thr Ser Arg Asn Ala Ile Thr Thr Leu 290 295 <210> 2 <211> 305 <212> PRT <213> Coxsackievirus A6 <400> 2 Asn Asp Pro Ile Ser Asn Ala Ile Glu Asn Ala Val Ser Thr Leu Ala 1 5 10 15 Asp Thr Thr Ile Ser Arg Val Thr Ala Ala Asn Thr Ala Ala Ser Ser 20 25 30 His Ser Leu Gly Thr Gly Arg Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr 35 40 45 Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Asn Leu Ile Glu Thr Arg Cys 50 55 60 Val Met Asn Arg Asn Gly Val Asn Glu Ala Ser Val Glu His Phe Tyr 65 70 75 80 Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Val Val Glu Val Lys Asp Ser Gly Thr 85 90 95 Ser Gln Asp Gly Tyr Thr Val Trp Pro Ile Asp Val Met Gly Phe Val 100 105 110 Gln Gln Arg Arg Lys Leu Glu Leu Ser Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala 115 120 125 Glu Phe Thr Phe Val Ser Asn Leu Asn Asp Ser Thr Thr Pro Gly Met 130 135 140 Leu Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Gly 145 150 155 160 Arg Lys Ser Tyr Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Ile Phe Ala 165 170 175 Lys Leu Ser Asp Pro Pro Pro Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro 180 185 190 Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu 195 200 205 His Lys Gln Ala Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Gln Cys Pro Asn Asn Met 210 215 220 Met Gly His Phe Ala Ile Arg Thr Val Ser Glu Ser Thr Thr Gly Lys 225 230 235 240 Asn Val His Val Arg Val Tyr Met Arg Ile Lys His Val Arg Ala Trp 245 250 255 Val Pro Arg Pro Phe Arg Ser Gln Ala Tyr Met Val Lys Asn Tyr Pro 260 265 270 Thr Tyr Ser Gln Thr Ile Ser Asn Thr Ala Ala Asp Arg Ala Ser Ile 275 280 285 Thr Thr Thr Asp Tyr Glu Gly Gly Val Pro Ala Asn Pro Gln Arg Thr 290 295 300 Phe 305 <210> 3 <211> 256 <212> PRT <213> Coxsackievirus A6 <400> 3 Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Ala Gln Leu 1 5 10 15 Thr Val Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Ala Ala Asn Ile Val 20 25 30 Leu Ser Tyr Gly Glu Trp Pro Gly Tyr Cys Pro Ser Thr Asp Ala Thr 35 40 45 Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser Val Asn Arg Phe Tyr 50 55 60 Thr Leu Ser Thr Lys Ser Trp Lys Thr Glu Ser Thr Gly Trp Tyr Trp 65 70 75 80 Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Asp Thr Gly Val Phe Gly Gln Asn Ala 85 90 95 Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys Met His Val Gln Cys 100 105 110 Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Val Val Ile Pro 115 120 125 Glu Phe Val Val Ala Ala Ser Ser Pro Ala Met Lys Pro Asn Gly Gln 130 135 140 Gly Leu Tyr Pro Asp Phe Ala His Thr Asn Pro Gly Lys Glu Gly Gln 145 150 155 160 Val Phe Arg Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro Leu Ser Gln 165 170 175 Ala Leu Val Phe Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Cys 180 185 190 Ala Thr Ile Ile Met Pro Tyr Val Asn Ala Leu Pro Phe Asp Ser Ala 195 200 205 Leu Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Ala Val Ile Pro Ile Ser Pro Leu 210 215 220 Lys Tyr Cys Asn Gly Ala Thr Thr Glu Val Pro Ile Thr Leu Thr Ile 225 230 235 240 Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Ser Gly Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln 245 250 255 <210> 4 <211> 240 <212> PRT <213> Coxsackievirus A6 <400> 4 Gly Leu Pro Thr Glu Leu Lys Pro Gly Thr Asn Gln Phe Leu Thr Thr 1 5 10 15 Asp Asp Gly Thr Ser Pro Pro Ile Leu Pro Gly Phe Glu Pro Thr Pro 20 25 30 Leu Ile His Ile Pro Gly Glu Phe Thr Ser Leu Leu Asp Leu Cys Arg 35 40 45 Ile Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Gly Thr Thr Gly Val 50 55 60 Asn Arg Leu Leu Ile Pro Val Arg Ala Gln Asn Asn Val Asp Gln Leu 65 70 75 80 Cys Ala Ser Phe Gln Val Asp Pro Gly Arg Asn Gly Pro Trp Gln Ser 85 90 95 Thr Met Val Gly Gln Ile Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln Trp Ser Gly Ser 100 105 110 Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met Ala Thr Gly Lys 115 120 125 Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Ser Ala Gln Pro Thr Thr Arg 130 135 140 Glu Ala Ala Met Leu Gly Thr His Ile Val Trp Asp Phe Gly Leu Gln 145 150 155 160 Ser Ser Val Thr Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn Thr His Phe Arg 165 170 175 Ala Val Lys Thr Gly Gly Val Tyr Asp Tyr Tyr Ala Thr Gly Ile Val 180 185 190 Thr Ile Trp Tyr Gln Thr Asn Phe Val Val Pro Pro Asp Thr Pro Ser 195 200 205 Glu Ala Asn Ile Ile Ala Leu Gly Ala Ala Gln Glu Asn Phe Thr Leu 210 215 220 Lys Leu Cys Lys Asp Thr Asp Glu Ile Arg Gln Thr Ala Glu Tyr Gln 225 230 235 240 <210> 5 <211> 150 <212> PRT <213> Coxsackievirus A16 <400> 5 Gly Lys Phe Gly Gln Gln Ser Gly Ala Ile Tyr Val Gly Asn Tyr Arg 1 5 10 15 Val Val Asn Arg His Leu Ala Thr His Asn Asp Trp Ala Asn Leu Val 20 25 30 Trp Glu Asp Ser Ser Arg Asp Leu Leu Val Ser Ser Thr Thr Ala Gln 35 40 45 Gly Cys Asp Thr Ile Ala Arg Cys Asp Cys Gln Thr Gly Ile Tyr Tyr 50 55 60 Cys Ser Ser Lys Arg Lys His Tyr Pro Val Ser Phe Thr Lys Pro Ser 65 70 75 80 Leu Ile Phe Val Glu Ala Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Arg Tyr Gln Ser 85 90 95 His Leu Met Leu Ala Val Gly His Ser Glu Pro Gly Asp Cys Gly Gly 100 105 110 Ile Leu Arg Cys Gln His Gly Val Val Gly Ile Val Ser Thr Gly Gly 115 120 125 Asn Gly Leu Val Gly Phe Ala Asp Val Arg Asp Leu Leu Trp Leu Asp 130 135 140 Glu Glu Ala Met Glu Gln 145 150 <210> 6 <211> 254 <212> PRT <213> Coxsackievirus A16 <400> 6 Ser Pro Ser Ala Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Ala Gln Leu 1 5 10 15 Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu Ala Ala Asn Ile Val 20 25 30 Ile Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Thr Asp Ala Thr 35 40 45 Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser Val Asn Arg Phe Phe 50 55 60 Thr Leu Asp Thr Lys Ser Trp Ala Lys Asp Ser Lys Gly Trp Tyr Trp 65 70 75 80 Lys Phe Pro Asp Val Leu Thr Glu Val Gly Val Phe Gly Gln Asn Ala 85 90 95 Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys Val His Val Gln Cys 100 105 110 Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Ala Val Leu Pro 115 120 125 Glu Tyr Val Leu Gly Thr Ile Ala Gly Gly Thr Gly Asn Glu Asn Ser 130 135 140 His Pro Pro Tyr Ala Thr Thr Gln Pro Gly Gln Val Gly Ala Val Leu 145 150 155 160 Met His Pro Tyr Val Leu Asp Ala Gly Ile Pro Leu Ser Gln Leu Thr 165 170 175 Val Cys Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Cys Ala Thr 180 185 190 Ile Ile Val Pro Tyr Met Asn Thr Val Pro Phe Asp Ser Ala Leu Asn 195 200 205 His Cys Asn Phe Gly Leu Leu Val Ile Pro Val Val Pro Leu Asp Phe 210 215 220 Asn Ala Gly Ala Thr Ser Glu Ile Pro Ile Thr Val Thr Ile Ala Pro 225 230 235 240 Met Cys Ala Glu Phe Ala Gly Leu Arg Gln Ala Val Lys Gln 245 250 <210> 7 <211> 297 <212> PRT <213> Coxsackievirus A16 <400> 7 Gly Asp Pro Ile Ala Asp Met Ile Asp Gln Thr Val Asn Asn Gln Val 1 5 10 15 Asn Arg Ser Leu Thr Ala Leu Gln Val Leu Pro Thr Ala Ala Asn Thr 20 25 30 Glu Ala Ser Ser His Arg Leu Gly Thr Gly Val Val Pro Ala Leu Gln 35 40 45 Ala Ala Glu Thr Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Lys Asn Leu Ile 50 55 60 Glu Thr Arg Cys Val Leu Asn His His Ser Thr Gln Glu Thr Ala Ile 65 70 75 80 Gly Asn Phe Phe Ser Arg Ala Gly Leu Val Ser Ile Ile Thr Met Pro 85 90 95 Thr Thr Asp Thr Gln Asn Thr Asp Gly Tyr Val Asn Trp Asp Ile Asp 100 105 110 Leu Met Gly Tyr Ala Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Leu Phe Thr Tyr 115 120 125 Met Arg Phe Asp Ala Glu Phe Thr Phe Val Val Ala Lys Pro Asn Gly 130 135 140 Val Leu Val Pro Gln Leu Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala 145 150 155 160 Pro Lys Pro Thr Ser Arg Asp Ser Phe Ala Trp Gln Thr Ala Thr Asn 165 170 175 Pro Ser Val Phe Val Lys Met Thr Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val 180 185 190 Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr 195 200 205 Pro Thr Phe Gly Glu His Leu Gln Ala Asn Asp Leu Asp Tyr Gly Gln 210 215 220 Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ser Ile Arg Thr Val Gly Thr 225 230 235 240 Glu Lys Ser Pro His Ser Ile Thr Leu Arg Val Tyr Met Arg Ile Lys 245 250 255 His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Pro Leu Arg Asn Gln Pro Tyr Leu 260 265 270 Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys Cys Thr Ser 275 280 285 Thr Ser Arg Asp Lys Ile Thr Thr Leu 290 295 <210> 8 <211> 739 <212> PRT <213> Coxsackievirus A6 <400> 8 Thr Thr Ala Ala Ala Ala Cys Ala Gly Cys Thr Ala Gly Thr Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Thr Gly Cys Ala Cys Cys Cys Ala Cys Thr Cys Ala Cys Ala 20 25 30 Gly Gly Gly Cys Cys Cys Ala Cys Thr Gly Gly Gly Cys Gly Cys Thr 35 40 45 Ala Gly Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala Thr Thr Thr Cys Cys Cys 50 55 60 Gly Gly Ala Ala Thr Cys Cys Thr Thr Gly Thr Gly Cys Gly Cys Cys 65 70 75 80 Thr Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Ala Thr Cys Cys Cys Cys Thr Cys 85 90 95 Cys Cys Cys Cys Ala Thr Gly Cys Gly Cys Ala Ala Cys Thr Thr Ala 100 105 110 Gly Ala Ala Gly Cys Ala Ala Thr Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Thr 115 120 125 Thr Cys Gly Ala Thr Cys Ala Ala Thr Ala Gly Cys Ala Gly Gly Cys 130 135 140 Gly Thr Gly Gly Cys Gly Cys Gly Cys Cys Ala Gly Cys Cys Ala Thr 145 150 155 160 Gly Thr Cys Thr Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr 165 170 175 Thr Cys Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys Thr 180 185 190 Gly Ala Gly Thr Ala Thr Cys Ala Ala Thr Ala Ala Ala Cys Thr Gly 195 200 205 Cys Thr Cys Ala Cys Gly Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Gly 210 215 220 Ala Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Thr Thr Cys Gly Thr Thr Ala Cys 225 230 235 240 Cys Cys Gly Gly Cys Thr Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys Gly 245 250 255 Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Thr Ala Gly Thr Ala Gly Cys Ala Cys 260 265 270 Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Thr Gly Cys Ala Gly Ala Gly 275 280 285 Cys Gly Thr Thr Cys Gly Thr Cys Ala Gly Cys Gly Thr Cys Cys Cys 290 295 300 Cys Gly Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gly Cys Thr Gly Ala 305 310 315 320 Thr Gly Ala Gly Thr Cys Ala Cys Thr Gly Cys Ala Thr Thr Cys Cys 325 330 335 Thr Cys Ala Cys Gly Gly Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Gly 340 345 350 Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Gly Thr Thr Gly Gly Cys 355 360 365 Gly Gly Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Gly Thr 370 375 380 Ala Ala Cys Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Ala Cys Gly Cys Thr Cys 385 390 395 400 Thr Ala Ala Thr Ala Thr Gly Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly 405 410 415 Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Thr Cys Thr Ala Thr Thr Gly Ala Gly 420 425 430 Cys Thr Ala Gly Thr Thr Ala Gly Thr Ala Gly Thr Cys Cys Thr Cys 435 440 445 Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Cys Gly Gly 450 455 460 Cys Thr Ala Ala Thr Cys Cys Thr Ala Ala Cys Thr Gly Cys Gly Gly 465 470 475 480 Ala Gly Cys Ala Cys Ala Thr Ala Cys Cys Cys Cys Cys Ala Ala Ala 485 490 495 Cys Cys Ala Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Thr Gly Thr 500 505 510 Cys Gly Thr Ala Ala Cys Gly Gly Gly Cys Ala Ala Cys Thr Cys Thr 515 520 525 Gly Cys Ala Gly Cys Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala 530 535 540 Cys Thr Thr Thr Gly Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr 545 550 555 560 Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Cys Thr Thr Ala Thr 565 570 575 Ala Thr Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr 580 585 590 Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Gly Ala Ala Ala Gly Ala Thr Thr Gly 595 600 605 Thr Thr Ala Cys Cys Ala Thr Ala Thr Ala Gly Cys Thr Ala Thr Thr 610 615 620 Gly Gly Ala Thr Thr Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr 625 630 635 640 Gly Ala Ala Thr Ala Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys Cys Thr Thr Gly 645 650 655 Ala Thr Ala Thr Ala Cys Cys Thr Thr Thr Thr Thr Gly Thr Ala Gly 660 665 670 Gly Gly Thr Thr Thr Ala Thr Ala Cys Cys Ala Cys Thr Thr Ala Cys 675 680 685 Thr Cys Thr Thr Cys Gly Cys Gly Thr Thr Gly Thr Thr Gly Ala Gly 690 695 700 Ala Cys Thr Cys Thr Ala Ala Ala Gly Thr Ala Cys Ala Thr Thr Cys 705 710 715 720 Thr Ala Ala Thr Cys Thr Thr Gly Ala Ala Cys Ala Cys Thr Ala Gly 725 730 735 Ala Ala Ala <210> 9 <211> 735 <212> PRT <213> Coxsackievirus A16 <400> 9 Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly Gly Thr Thr Gly Thr Thr Cys 1 5 10 15 Cys Cys Ala Cys Cys Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Cys Cys Cys Ala 20 25 30 Gly Thr Gly Gly Gly Cys Gly Cys Thr Ala Gly Cys Ala Cys Ala Cys 35 40 45 Thr Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Cys Gly Gly Gly Ala Thr Cys Thr 50 55 60 Thr Thr Gly Thr Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly Thr Thr Thr Thr Ala 65 70 75 80 Thr Ala Ala Cys Cys Cys Cys Thr Thr Cys Cys Cys Thr Ala Ala Gly 85 90 95 Cys Ala Gly Cys Ala Ala Cys Thr Thr Ala Gly Ala Ala Gly Thr Thr 100 105 110 Thr Cys Ala Cys Ala Cys Ala Ala Thr Cys Ala Cys Gly Ala Cys Cys 115 120 125 Ala Gly Thr Ala Gly Thr Gly Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly Cys Gly 130 135 140 Cys Gly Cys Cys Ala Gly Thr Cys Ala Cys Gly Thr Cys Thr Thr Gly 145 150 155 160 Gly Thr Cys Ala Ala Gly Cys Ala Cys Thr Thr Cys Thr Gly Thr Thr 165 170 175 Cys Cys Cys Cys Cys Gly Gly Ala Cys Thr Gly Ala Gly Thr Ala Thr 180 185 190 Cys Ala Ala Thr Ala Gly Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala Cys Gly 195 200 205 Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala 210 215 220 Cys Gly Thr Thr Cys Gly Thr Thr Ala Thr Cys Cys Gly Gly Cys Thr 225 230 235 240 Ala Ala Cys Thr Ala Cys Thr Thr Cys Gly Ala Gly Ala Ala Ala Cys 245 250 255 Cys Thr Ala Gly Ala Gly Cys Ala Cys Cys Gly Thr Gly Ala Ala Ala 260 265 270 Gly Thr Thr Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Thr Cys Gly Cys Thr Cys 275 280 285 Ala Gly Cys Ala Cys Thr Thr Cys Cys Cys Cys Cys Gly Thr Gly Thr 290 295 300 Ala Gly Ala Thr Cys Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Thr Gly Ala Gly 305 310 315 320 Thr Cys Ala Cys Thr Gly Thr Ala Ala Ala Cys Cys Cys Cys Ala Cys 325 330 335 Gly Gly Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Ala Cys Ala Gly Thr 340 345 350 Gly Gly Cys Thr Gly Cys Gly Thr Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Cys 355 360 365 Thr Gly Cys Cys Cys Ala Thr Gly Gly Gly Gly Thr Ala Ala Cys Cys 370 375 380 Cys Ala Thr Gly Gly Gly Ala Cys Gly Cys Thr Cys Thr Ala Ala Thr 385 390 395 400 Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Thr Gly Gly Thr Gly Thr Gly Ala Ala 405 410 415 Gly Ala Gly Thr Cys Thr Ala Thr Thr Gly Ala Gly Cys Thr Ala Gly 420 425 430 Thr Thr Ala Gly Thr Ala Gly Thr Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Cys 435 440 445 Cys Cys Cys Thr Gly Ala Ala Thr Gly Cys Gly Gly Cys Thr Ala Ala 450 455 460 Thr Cys Cys Thr Ala Ala Cys Thr Gly Cys Gly Gly Ala Gly Cys Ala 465 470 475 480 Cys Gly Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Ala Cys Cys Cys Ala Gly 485 490 495 Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly Cys Gly Thr Gly Thr Cys Gly Thr Ala 500 505 510 Ala Thr Gly Gly Gly Thr Ala Ala Cys Thr Cys Thr Gly Cys Ala Gly 515 520 525 Cys Gly Gly Ala Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Thr Thr 530 535 540 Gly Gly Gly Thr Gly Thr Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Thr Cys Cys 545 550 555 560 Thr Thr Thr Thr Ala Thr Thr Cys Cys Thr Thr Ala Thr Thr Gly Gly 565 570 575 Cys Thr Gly Cys Thr Thr Ala Thr Gly Gly Thr Gly Ala Cys Ala Ala 580 585 590 Thr Thr Gly Ala Ala Ala Ala Gly Thr Thr Gly Thr Thr Ala Cys Cys 595 600 605 Ala Thr Ala Thr Ala Gly Cys Thr Ala Thr Thr Gly Gly Ala Thr Thr 610 615 620 Gly Gly Cys Cys Ala Thr Cys Cys Gly Gly Thr Gly Thr Cys Thr Ala 625 630 635 640 Ala Cys Ala Gly Ala Gly Cys Thr Ala Thr Thr Gly Thr Thr Thr Ala 645 650 655 Cys Cys Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr Thr Gly Gly Ala Thr Ala Cys 660 665 670 Gly Thr Cys Cys Cys Thr Cys Thr Thr Ala Ala Thr Cys Thr Cys Ala 675 680 685 Ala Gly Gly Cys Cys Ala Thr Thr Cys Ala Ala Ala Cys Thr Cys Thr 690 695 700 Thr Gly Ala Thr Thr Ala Thr Ala Thr Ala Thr Thr Gly Cys Thr Cys 705 710 715 720 Cys Thr Thr Ala Ala Cys Thr Gly Thr Ala Ala Gly Ala Ala Ala 725 730 735 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sythetic Construct <400> 10 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sythetic Construct <400> 11 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sythetic Construct <400> 12 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sythetic Construct <400> 13 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sythetic Construct <400> 14 tccatgacgt tcctgatgct 20

Claims (42)

  1. 엔테로바이러스 A 바이러스의 생산 방법으로서,
    (a) 거대담체를 포함하는 고정층에서 부착 세포를 배양하는 단계로서, 이때 상기 세포는 제1세포 배양 배지에서 배양되는 단계;
    (b) 엔테로바이러스 A 바이러스가 상기 세포를 감염시키는 조건 하에 상기 세포를 엔테로바이러스 A 바이러스로 접종하는 단계;
    (c) 상기 감염된 세포가 엔테로바이러스 A 바이러스를 생산하는 조건 하에 상기 감염된 세포를 제2세포 배양 배지의 고정층에서 배양하는 단계; 및
    (d) 상기 세포에 의해 생산된 엔테로바이러스 A 바이러스를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포는 Vero 세포인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 Vero 세포주는 WHO Vero 10-87, ATCC CCL-81, Vero 76 (ATCC 수탁 번호 CRL-1587), 및 Vero C1008 (ATCC 수탁 번호 CRL-1586)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔테로 바이러스 A 바이러스는 EV71, CA6, 및 CA16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 엔테로바이러스 A 바이러스는 적어도 하나의 비 인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 엔테로바이러스 A 바이러스는 EV71이고, 상기 적어도 하나의 비인간 세포 적응 돌연변이는 VP1 폴리펩타이드 돌연변이를 포함하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 엔테로바이러스 A 바이러스는 CA6이고, 상기 적어도 하나의 비인간 세포 적응 돌연변이는 VP1 폴리펩타이드 돌연변이, VP2 폴리펩타이드 돌연변이, VP3 폴리펩타이드 돌연변이, 및 5' 비번역 영역 (UTR) 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 엔테로바이러스 A 바이러스는 CA16이고, 상기 적어도 하나의 비인간 세포 적응 돌연변이는2A 폴리펩타이드 돌연변이, VP1 폴리펩타이드 돌연변이, VP2 폴리펩타이드 돌연변이, 및 5' 비번역 영역 (UTR) 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4,000 세포/cm2 내지 약 16,000 세포/cm2가 상기 (a) 단계에서 배양되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 약 5,000 세포/cm2가 상기 (a) 단계에서 배양되는 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약 100,000 세포/cm2 내지 약 800,000 세포/cm2가 상기 (b) 단계에서 접종되는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 약 200,000 세포/cm2 내지 약 350,000 세포/cm2가 상기 (b) 단계에서 접종되는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1세포 배양 배지는 혈청을 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제1세포 배양 배지는 10% 미만의 우태 혈청을 포함하고 상기 세포는 무혈청 배지에 적응되어 있지 않은 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 제1세포 배양 배지는 5%의 우태 혈청을 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1세포 배양 배지 및 상기 제2세포 배양 배지는 상이한 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 (a) 단계와 (b)단계 사이에, 제1세포 배양 배지를 제거하는 단계 및 상기 세포를 제2배양 배지로 헹구는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2세포 배양 배지는 무혈청 배지인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 약 0.025 내지 약 0.0009의 MOI로 엔테로바이러스 A 바이러스로 접종되는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 세포는 약 0.001의 MOI로 엔테로바이러스 A 바이러스로 접종되는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 약 0.3 mL/cm2의 부피/표면 비율로 (a), (b), 및/또는 (c) 단계 동안 배양되는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 및/또는 (b) 단계 동안의 제1세포 배양 배지 중의 젖산 농도가 약 25 mM을 초과하지 않는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (c) 단계 동안의 제2세포 배양 배지 중의 젖산 농도가 약 25 mM을 초과하지 않는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 및/또는 (b) 단계 동안의 제1세포 배양 배지 중의 산소 밀도 (DO)가 약 50% 초과로 유지되는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (c) 단계 동안의 제2세포 배양 배지 중의 산소 밀도 (DO)가 약 50% 초과로 유지되는 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정층이 약 2 cm의 층 높이를 갖는 방법.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정층이 약 10 cm의 층 높이를 갖는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 거대 담체가 미세섬유 매트릭스인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 거대 담체가 약 60% 내지 99%의 다공성을 갖는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 다공성이 약 80% 내지 약 90%인 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 거대담체가 약 150 cm2/cm3 내지 약 1000 cm2/cm3의 세포가 접근가능한 표면적을 갖는 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, (d) 단계에서 적어도 5.0 x 107 TCID50/mL의 엔테로바이러스 A 바이러스가 회수되는 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 베타-프로피오락톤 (BPL), 포르말린, 또는 바이너리 에틸렌이민 (BEI) 중 하나 이상으로 엔테로바이러스 A를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔테로바이러스 A 바이러스가 약독화된 바이러스인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 엔테로바이러스 A 바이러스.
  37. 제36항에 있어서, 상기 바이러스가 하나 이상의 항원을 포함하는 엔테로바이러스 A 바이러스.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 바이러스가 베타-프로피오락톤 (BPL), 포르말린, 또는 바이너리 에틸렌이민 (BEI) 중 하나 이상으로 불활성화된 엔테로바이러스 A 바이러스.
  39. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 바이러스가 약독화된 바이러스인 엔테로바이러스 A 바이러스.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항의 바이러스를 포함하는 조성물.
  41. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항의 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물.
  42. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항의 바이러스를 포함하는 백신.
KR1020177025598A 2015-02-13 2016-02-12 백신 생산용 바이러스 제조 방법 Ceased KR20170116140A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562116361P 2015-02-13 2015-02-13
US62/116,361 2015-02-13
PCT/US2016/017784 WO2016130940A1 (en) 2015-02-13 2016-02-12 Methods for producing virus for vaccine production

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170116140A true KR20170116140A (ko) 2017-10-18

Family

ID=56615015

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177025598A Ceased KR20170116140A (ko) 2015-02-13 2016-02-12 백신 생산용 바이러스 제조 방법

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20180195048A1 (ko)
EP (1) EP3256571B1 (ko)
JP (1) JP6723253B2 (ko)
KR (1) KR20170116140A (ko)
CN (2) CN114107221A (ko)
AU (2) AU2016219122A1 (ko)
CA (1) CA2975881A1 (ko)
HK (1) HK1248759A1 (ko)
MA (1) MA41506A (ko)
PH (1) PH12017501445A1 (ko)
SG (1) SG11201706593SA (ko)
WO (1) WO2016130940A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021107612A1 (ko) * 2019-11-27 2021-06-03 에스케이바이오사이언스 주식회사 무혈청 배지에서 부유배양이 가능한 신규한 vero 세포주, 이의 제조 방법 및 상기 신규 세포주를 이용한 백신용 바이러스 제조 방법

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015148704A1 (en) 2014-03-25 2015-10-01 Terumo Bct, Inc. Passive replacement of media
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
HUE055862T2 (hu) 2016-04-20 2021-12-28 Centro De Investig Energeticas Készítmények és eljárások PKLR fokozott génexpressziójára
US11965175B2 (en) 2016-05-25 2024-04-23 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
AR109564A1 (es) * 2016-09-01 2018-12-26 Takeda Vaccines Inc Métodos para producir enterovirus c para la producción de vacunas
BE1024733B1 (fr) 2016-11-09 2018-06-14 Univercells Sa Matrice de croissance cellulaire
KR102091372B1 (ko) * 2017-02-28 2020-05-27 대한민국 엔테로바이러스 71형 불활화 백신 및 이의 용도
CN117247899A (zh) 2017-03-31 2023-12-19 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
JP2020534829A (ja) * 2017-09-27 2020-12-03 ユニバーセルズ エス．エー．Ｕｎｉｖｅｒｃｅｌｌｓ Ｓ．Ａ． ウイルスワクチンなどの生体分子の製造システムおよび製造方法
SG11202002263TA (en) 2017-10-16 2020-04-29 Centro De Investigaciones Energeticas Medioambientales Y Tecnologicas Lentiviral vectors for delivery of pklr to treat pyruvate kinase deficiency
EP3728549A1 (en) 2017-12-20 2020-10-28 Univercells Technologies S.A. Bioreactor and related methods
WO2019200167A1 (en) 2018-04-11 2019-10-17 Rocket Pharmaceuticals, Ltd. Compositions and methods for stem cell transplant
TWI846694B (zh) * 2018-05-04 2024-07-01 美商健臻公司 具有過濾系統的灌注式生物反應器
EP3794829A1 (en) * 2018-05-14 2021-03-24 InterDigital VC Holdings, Inc. Block shape adaptive intra prediction directions for quadtree-binary tree
KR20210108406A (ko) * 2018-12-21 2021-09-02 론자 워커스빌 아이엔씨. 바이러스 벡터의 자동화된 생산
WO2020163329A1 (en) 2019-02-05 2020-08-13 Corning Incorporated Woven cell culture substrates
EP3924469A4 (en) * 2019-02-15 2022-12-14 Ology Bioservices, Inc. METHODS OF VIRUS PRODUCTION
US11118151B2 (en) 2019-11-05 2021-09-14 Corning Incorporated Fixed bed bioreactor and methods of using the same
CA3180557A1 (en) * 2020-05-29 2021-12-02 Lorena Lerner Encapsulated rna replicons and methods of use
CN111849870B (zh) * 2020-08-07 2021-07-23 成都柏奥特克生物科技股份有限公司 无血清Vero细胞固定床生物反应器高密度培养工艺
JP2023547618A (ja) * 2020-10-23 2023-11-13 オロジー バイオサーヴィシズ、インク． ウイルスを細胞に感染させるための方法
US12577540B2 (en) 2020-12-10 2026-03-17 Sarepta Therapeutics, Inc. Suspension mode seed train development for adherent cells
CN114990075B (zh) * 2022-04-20 2023-07-14 中国医学科学院医学生物学研究所 一株可适用于人用疫苗细胞基质培养的柯萨奇病毒a组10型疫苗株及其应用
CN114807060B (zh) * 2022-06-23 2022-09-30 北京民海生物科技有限公司 柯萨奇病毒a6型毒株及其免疫原性组合物和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5063852B2 (ja) * 2000-09-25 2012-10-31 ポリマン サイエンティフィック イミューンバイオロジッシュ フォーシュング ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ファフツング 生ワクチン及び製造方法
US9051361B2 (en) * 2010-08-17 2015-06-09 National Health Research Institutes Immunogenic compositions and uses thereof
MY185184A (en) * 2013-01-18 2021-04-30 Temasek Life Sciences Laboratory Ltd Cold-adapted temperature sensitive strains of enterovirus 71 and processes of developing cold-adapted temperature sensitive virus strains
CN103215233B (zh) * 2013-04-03 2015-03-25 浙江普康生物技术股份有限公司 用生物反应器扩增肠道病毒71型的优化工艺方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021107612A1 (ko) * 2019-11-27 2021-06-03 에스케이바이오사이언스 주식회사 무혈청 배지에서 부유배양이 가능한 신규한 vero 세포주, 이의 제조 방법 및 상기 신규 세포주를 이용한 백신용 바이러스 제조 방법
US12454680B2 (en) 2019-11-27 2025-10-28 Sk Bioscience Co., Ltd. Vero cell line that can be suspension-cultured in serum-free medium, preparation method therefor, and method for preparing viruses for vaccines by using novel cell line

Also Published As

Publication number Publication date
CN114107221A (zh) 2022-03-01
PH12017501445A1 (en) 2018-01-15
HK1248759A1 (zh) 2018-10-19
AU2022202087A1 (en) 2022-04-14
JP2018506283A (ja) 2018-03-08
EP3256571B1 (en) 2022-03-30
US20180195048A1 (en) 2018-07-12
EP3256571A4 (en) 2018-07-25
JP6723253B2 (ja) 2020-07-15
CN107532150A (zh) 2018-01-02
SG11201706593SA (en) 2017-09-28
CA2975881A1 (en) 2016-08-18
AU2016219122A1 (en) 2017-09-07
MA41506A (fr) 2017-12-19
EP3256571A1 (en) 2017-12-20
WO2016130940A1 (en) 2016-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3256571B1 (en) Methods for producing virus for vaccine production
US20190194628A1 (en) Methods for producing virus for vaccine production
US12109260B2 (en) Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same
US10233429B2 (en) Hand, foot, and mouth vaccines and methods of manufacture and use thereof
CN107406856B (zh) 手、足及口疫苗及其制备及使用方法
WO2019108970A1 (en) Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same
KR20120131725A (ko) 고병원성 조류인플루엔자 ａ ｈ５ｎ１ 바이러스 유사입자 및 이를 이용한 가금용 백신

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20170912

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20210210

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20220811

Patent event code: PE09021S01D

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20221017

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20220811

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I