KR20170120119A - 펩타이드 미니유전자 발현 시스템을 포함하는 리스테리아-기반 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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어드박시스, 인크.
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Abstract

본 발명은 미니유전자 발현 작제물을 포함하는 리스테리아 전달 벡터를 포함하는 조성물, 및 항원-발현 종양에 대한 면역 반응을 유도하고 상기 종양을 가진 대상체에서 상기 종양을 치료하고 상기 종양에 대해 백신접종을 하기 위한 상기 조성물의 사용 방법을 제공한다.

Description

펩타이드 미니유전자 발현 시스템을 포함하는 리스테리아-기반 조성물 및 이의 사용 방법
본 발명은 미니유전자 발현 작제물을 포함하는 리스테리아 전달 벡터를 포함하는 조성물, 및 종양 또는 암을 가진 대상체에서, 항원-발현 종양 또는 암에 대한 면역 반응의 유도, 및 항원-발현 종양 또는 암의 치료 및 항원-발현 종양 또는 암에 대한 백신접종을 위한 상기 조성물의 사용 방법을 개시한다.
리스테리아 모노사이토게네스는 주로 항원 제시 세포에 감염되어 이들 세포의 세포질에서의 생활에 적응하는 세포 내 병원균이다. 대식세포와 같은 숙주 세포는 리스테리아 모노사이토게네스를 활발하게 식균하며 대부분의 박테리아는 포식리소좀 내에서 분해된다. 일부 박테리아는 용혈 리스테리오리신 O(LLO)의 활동을 통해 식포 막에 구멍을 내서 숙주 시토졸로 탈출한다. 시토졸에 있으면, 리스테리아 모노사이토게네스는 숙주 액틴을 중합할 수 있어 숙주 면역 시스템을 더 피하면서 세포에서 세포로 직접 통과할 수 있는 리스테리아 모노사이토게네스에 대한 무시할 수 있는 항체 반응을 야기한다.
리스테리아로부터의 재조합 단백질 발현은 관심 항원 서열(들)을 함유하는 전장 단백질 또는 큰 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열을 도입하는 것을 수반하고 있지만, 이는 이종성 소스로부터 다수의 펩타이드 결정소들의 발현이 요망된 경우에는 가능하지 않았다. 이러한 경우, 펩타이드는 다양한 길이의 아미노산 링커에 의해 분리된 관심 펩타이드를 함유하는 단일 폴리펩타이드 작제물로서 발현되어 왔으며, 이들은 MHC 부류 I 결합 펩타이드 결정소의 생성을 위해 프로테오좀 활성(proteasomal activity)을 필요로 하였다. 이는 항원 제시의 상실을 초래할 수 있다.
따라서, 면역 반응을 증가시키기 위해 프로테오좀 활성을 피하고 항원 제시를 증강시킬 필요가 있다. 본 발명은 MHC 부류 I 분자에 의한 제시를 위해 최소 펩타이드 결정소를 인코딩하는 핵산 서열의 "미니유전자" 발현 시스템을 포함하는 리스테리아-기반 조성물을 제공함으로써 이러한 필요성을 해결한다. 이들 미니유전자는 유비퀴틴 모이어티 바로 뒤의 펩타이드(Ub-펩타이드)와 함께 발현될 수 있으며, 이로써 이러한 시스템은 항원이 항원-처리 경로에 들어가야 하는 필요성을 피하며, 따라서 펩타이드 항원은 재조합 리스테리아에 의해 감염된 세포의 시토졸 내로 직접 발현될 수 있다. 나아가, 본원에 개시된 상세한 설명에 기재된 바와 같이, 개시내용의 미니유전자 시스템은, 다수의 펩타이드들이 단일 리스테리아 전달 벡터를 사용하여 세포내로 로딩될 수 있는 이점을 제공한다.
(해당 사항 없음)
일 양태에서, 본 발명은 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 제공하며, 상기 작제물은 키메라 단백질을 인코딩하는 개방 해독 프레임(open reading frame)을 포함하고, 여기서 상기 키메라 단백질은:
a. 박테리아 분비 신호 서열;
b. 유비퀴틴(Ub) 단백질;
c. 펩타이드를 포함하고,
여기서 a. 내지 c.의 상기 신호 서열, 상기 유비퀴틴 및 상기 펩타이드는 각각 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 일렬로 배열된다.
다른 양태에서, 본 발명은 종양 또는 암을 가진 대상체에서 항종양 또는 항암 반응의 유도 방법을 제공하며, 상기 방법은 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 작제물은 키메라 단백질을 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하고, 여기서 상기 키메라 단백질은:
a. 박테리아 분비 신호 서열;
b. 유비퀴틴(Ub) 단백질;
c. 펩타이드를 포함하고,
여기서 a. 내지 c.의 상기 신호 서열, 상기 유비퀴틴 및 상기 펩타이드는 각각 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 일렬로 배열되고, 이에 의해서 상기 대상체 내에서 항종양 반응을 증강시킨다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 종양 또는 암의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아를 상기 대상체에게 투여하대상체는 단계를 포함하며, 상기 작제물은 키메라 단백질을 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하고, 여기서 상기 키메라 단백질은:
a. 박테리아 분비 신호 서열;
b. 유비퀴틴(Ub) 단백질;
c. 펩타이드를 포함하고,
여기서 a. 내지 c.의 상기 신호 서열, 상기 유비퀴틴 및 상기 펩타이드는 각각 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 일렬로 배열되고, 이에 의해서 상기 대상체 내에서 항종양 반응을 증강시킨다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공개공보의 사본은 필요한 수수료 납부와 함께 요청시 특허청에 의해 제공될 것이다. 본 발명으로 간주되는 주제는 본 명세서의 결론 부분에서 특히 지적되고 명확하게 청구된다. 그러나, 본 발명은, 그 목적, 특징 및 장점과 함께, 구성 및 동작 방법 모두에 관하여 첨부된 도면들을 읽을 때 다음과 같은 상세한 설명을 참조하여 가장 잘 이해될 수도 있다:
도 1a 내지 도 1b는 Lm-E7 및 Lm-LLO-E7이 상이한 발현 시스템들을 사용하여 E7을 발현하고 분비하는 것을 도시한다. Lm-E7은, 유전자 카세트를 리스테리아 모노사이토게네스 게놈의 orfZ 도메인에 도입함으로써 생성되었다(도 1a). hly 프로모터는, hly 신호 서열 및 HPV-16-E7이 뒤따르는 LLO의 처음 5개의 아미노산(AA)의 발현을 구동한다(도 1b). Lm-LLO-E7은 플라스미드 pGG-55로 prfA-균주 XFL-7을 형질전환하여 생성되었다. pGG-55는 LLO-E7의 비-용혈성 융합의 발현을 구동하는 hly 프로모터를 가진다. pGG-55는 또한, 생체내에서 XFL-7에 의한 플라스미드의 유지를 위해 선택된 prfA 유전자를 함유한다.
도 2는 Lm-E7 및 Lm-LLO-E7이 E7을 분비함을 보인다. Lm-Gag(레인 1), Lm-E7(레인 2), Lm-LLO-NP(레인 3), Lm-LLO-E7(레인 4), XFL-7(레인 5), 및 10403S(레인 6)를 37℃의 Luria-Bertoni 액체 배지에서 밤새 성장시켰다. 600 nm 흡광도에서 OD에 의해 결정된 바와 같은 균등 개수의 세균을, 펠릿 처리하고, 각 상청액 18 ml를 TCA 침전시켰다. 웨스턴 블롯에 의해 E7 발현을 분석하였다. 블롯은 항-E7 mAb로 탐지한 후 HRP-접합 항-마우스(Amersham)으로 탐지한 다음, ECL 검출 시약을 사용하여 현상하였다.
도 3은 LLO-E7 융합의 종양 면역적 효능을 보인다. 마우스의 밀리미터 단위의 종양 크기가 종양 접종 7일후, 14일후, 21일후, 28일후, 및 56일후에 대하여 도시되어 있다. 나이브(naive) 마우스: 개방 원형; Lm-LLO-E7: 채워진 원형: Lm-E7: 정사각형; Lm-Gag: 개방 다이아몬드형; 및 Lm-LLO-NP: 채워진 삼각형.
도 4는 TC-1 세포에 노출되었을 때 Lm-LLO-E7-면역화 마우스로부터의 비장세포가 급증함을 보인다. C57BL/6 마우스를 면역화하고 Lm-LLO-E7, Lm-E7, 또는 대조 rLm 균주로 추가투여하였다. 추가투여 후 6일째에 비장 세포를 채취하고, 방사선 조사된 TC-1 세포를 도시된 비로 발랐다. 세포를, 3H 티미딘으로 펄스 처리하고 채취하였다. Cpm은 (실험 cpm) - (no-TC-1 대조군)으로서 정의된다.
도 5a는 (A) 웨스턴 블롯 Lm-ActA-E7이 E7을 분비함을 입증하는 웨스턴 블롯이다. 레인 1: Lm-LLO-E7; 레인 2: Lm-ActA-E7.001; 레인 3; Lm-ActA-E7-2.5.3; 레인 4: Lm-ActA-E7-2.5.4.
도 5b는 Lm-ActA-E7(직사각형), Lm-E7(타원형), Lm-LLO-E7 (X)가 투여된 마우스 및 처리되지 않은 마우스(비-백신접종; 고형 삼각형)에서의 종양 크기를 보인다.
도 6a는 4LM 백신을 생성하기 위해 사용되는 플라스미드 삽입물의 개략도를 보인다. Lm-LLO-E7 삽입물은 사용된 리스테리아 유전자 모두를 함유한다. 이는 hly 프로모터, 처음 1.3 kb의 hly 유전자(단백질 LLO를 인코딩함) 및 HPV-16E7 유전자를 포함한다. 처음 1.3 kb의 hly는 신호 서열(ss) 및 PEST 영역을 포함한다. Lm-PEST-E7은 hly 프로모터, 신호 서열, PEST 및 E7 서열을 포함하나 나머지 말단이 절단된 LLO 유전자는 배제한다. Lm-ΔPEST-E7은 PEST 영역은 배제하나, hly 프로모터, 신호 서열, E7 및 나머지 말단이 절단된 LLO 유전자는 포함한다. Lm-E7epi는 hly 프로모터, 신호 서열 및 E7만을 포함한다.
도 6b 상부 패널: PEST 영역을 함유하는 리스테리아 구성물은 종양 억제를 유도한다. 하부 패널: 2개의 개별 실험에서 종양 접종-후 28일째에 평균 종양 크기.
도 6c는 PEST 영역을 함유하는 리스테리아 구성물이 비장에서 더 높은 백분율의 E7-특이 림프구를 유도함을 보인다. 3개 실험으로부터의 데이터의 평균 및 SE가 묘사된다.
도 7a는 비장에서의 E7-특이 IFN-감마-분비 CD8+ T 세포의 유도 및 TC-1 종양 세포 투여 후 Lm-E7, Lm-LLO-E7, Lm-ActA-E7을 투여하거나 백신을 투여하지 않은(처리하지 않은) 마우스에서의 종양을 침투한 수를 보인다.
도 7b는 (a)에서 기재된 마우스의 종양 및 비장에서의 E7 특이 CD8+ 세포 종양의 유도 및 투과를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8b는 PEST 영역을 함유하는 리스테리아 작제물이 종양 내 더 높은 백분율의 E7-특이 림프구를 유도함을 도시한다. (도 8a) 실험 1로부터의 대표적인 데이터. (도 8b) 모든 3회 실험으로부터의 데이터의 평균 및 SE.
도 9a는 E. coli - 리스테리아 셔틀 플라스미드 pGG55의 도식적인 맵을 보인다. CAT(-): E. coli 클로람페니콜 트랜스페라제; CAT(+): 리스테리아 클로람페니콜 트랜스페라제; 리스테리아에 대한 Ori Lm 복제 기원; Ori Ec: E. coli에 대한 복제의 p15 기원; prfA: 리스테리아 병원성 조절 인자 A; LLO: 이의 프로모터를 포함하는, C-말단 절단된 리스테리오리신 O; E7: HPV E7. 선택된 제한 부위 또한 묘사된다.
도 9b는 E. coli - 리스테리아 셔틀 플라스미드 pTV3(하기)의 도식적인 맵을 보인다. CAT(-): E. coli 클로람페니콜 트랜스페라제; CAT(+): 리스테리아 클로람페니콜 트랜스페라제; 리스테리아에 대한 Ori Lm 복제 기원; Ori Ec: E. coli에 대한 복제의 p15 기원; prfA: 리스테리아 병원성 조절 인자 A; LLO: 이의 프로모터를 포함하는, C-말단 절단된 리스테리오리신 O; E7: HPV E7; p60-dal; p60 프로모터 및 리스테리아 유전자의 발현 카세트. 선택된 제한 부위 또한 묘사된다.
도 10은 DNA 서열(SEQ ID NO: 74)이 리스테리아 균주 EGD의 게놈 상의 inlC 영역의 업스트림 및 다운스트림을 나타냄을 도시한다. DNA-상위(적색), inlC 유전자(청색) 및 DNA-하위(흑색).
도 11은 DNA 서열(SEQ ID NO: 75)가 inlC 결실 돌연변이체를 생성하기 위해 온도 민감성 플라스미드인 pKSV7에 클로닝됨을 보인다. 이들 영역의 클로닝을 위해 사용된 제한 효소는 cap에서 표시되며 밑줄로 표시된다. GAATTC- EcoRI, GGATCC-BamHI 및 CTGCAg-PstI. EcoRI-PstI 삽입물은 벡터인 pKSV7 내에 클로닝된다.
도 12는 Lm-dd 및 Lm-dd actA 균주의 개략적 표시를 보인다. 주형으로서 균주 Lm-dd 및 Lm-dd DactA 의 염색체 DNA를 사용하여 수득된 올리고의 1/2 및 올리고의 3/4를 사용한 PCR 산물의 크기를 보이는 겔.
도 13은 DNA 서열(SEQ ID NO: 57)이 리스테리아 염색체에서 actA 유전자의 업스트림 및 다운스트림을 나타냄을 도시한다. 이탤릭체의 영역은 Lmdd actA 균주에 존재하는 잔여D actA 서열 요소를 함유한다. 밑줄친 서열 gtcgac는 actA의 N-T 및 C-T 사이의 연결인 XhoI의 제한 부위를 나타낸다.
도 14는 LM 백신 균주의 투여에 대한 반응에서의 종양 퇴행을 묘사한다(A). 원은 처리되지 않은 마우스를 나타내고, 역삼각형은 Lmdd-TV3이 투여된 마우스를 나타내며, 십자는 Lm-LLOE7이 투여된 마우스를 나타낸다.
도 15a 내지 도 15b는 (도 15a) LmddA 균주에서 염색체 dal -dat 결실의 상보성을 위해 구성적 리스테리아 p60 프로모터의 조절 하에서 바실러스 서브틸리스 dal 유전자가 잠복하는 pAdv164의 플라스미드 맵을 보인다. 이는 또한, 3개 단편인 Her-2/neu:의 직접 융합에 의해 구성되는, 키메라 인간 Her-2/neu 유전자로 말단이 절단된 LLO(1-441)의 융합을 포함한다: EC1(aa 40-170), EC2(aa 359-518) 및 ICI(aa 679-808). (도 15b) tLLO-ChHer-2의 발현 및 분비는 항-LLO 항체로 블롯팅된 TCA 침전 세포 배양 상층액의 웨스턴 블롯 분석에 의해 Lm-LLO-ChHer-2(Lm-LLO-138) 및 LmddA-LLO-ChHer-2(ADXS31-164)에서 검출되었다. 104 KD까지의 차별되는 밴드는 tLLO-ChHer-2에 상응한다. 내인성 LLO는 58 KD 밴드로서 검출된다. 리스테리아 대조군은 ChHer-2 발현이 없었다.
도 16a 내지 도 16c. (도 16a) 면역화 마우스로부터의 비장세포에서 Her2/neu 리스테리아-기반 백신에 의해 유도된 세포독성 T 세포 반응을, 자극제로서 NT-2 세포 및 표적으로서 3T3/neu 세포를 사용하여 시험하였다. Lm-대조군은 모든 방면에서 동일하지만 비관련 항원(HPV16-E7)을 발현하는 LmddA 백그라운드에 근거하였다. (도 16b) 면역화 FVB/N 마우스 유래의 비장세포에 의해 세포 배양 배지 내로 분비된 IFN-η를, 미토신 C 처리된 NT-2 세포로의 시험관내 자극 24시간 후에, ELISA에 의해 측정하였다. (도 16c) 단백질의 상이한 영역들로부터 펩타이드의 시험관내 인큐베이션에 반응하여 키메라 백신으로 면역화된 HLA-A2 트랜스제닉 마우스 유래의 비장세포에 의한 IFN-γ 분비. 재조합 ChHer-2 단백질이 양성 대조군으로서 사용되었으며, 비관련 펩티드 또는 펩티드가 없는 그룹이 도면 설명에 열거된 바와 같이 음성 대조군을 구성하였다. IFN-γ 분비는 공동-접종 72시간 후에 수확된 세포 배양 상청액을 사용한 ELISA 분석으로 검출되었다. 각 데이터 포인트는 삼중 데이터 +/- 표준 오류의 평균이었다. * P 값 < 0.001.
도 17은 각각의 재조합 리스테리아-ChHer2 또는 대조 리스테리아 백신을 6회 주입한 Her2/neu 트랜스제닉 마우스로부터의 결과를 나타낸다. 면역화는 6주령에 시작하였고 21주까지 매 3주마다 지속하였다. 종양의 외관은 매주 측정되었으며 종양이 없는 마우스의 백분율로서 표현되었다. *p < 0.05, 그룹 당 N = 9종.
도 18은 FVB/N 마우스가 1 x 106의 NT-2 세포로 s.c. 접종되고 1주 간격으로 각 백신으로 3회 면역화됨을 보인다. 비장은 2차 면역화 후 7일째에 수확하였다. 면역 세포의 분리 후, Treg의 검출을 위해 이들을 항 CD3, CD4, CD25 및 FoxP3 항체로 염색하였다. 상이한 치료 그룹에 걸쳐 전체 CD3+ 또는 CD3+CD4+ T 세포의 백분율로서 표시되는, CD25+/FoxP3+ T 세포의 빈도를 보이는 대표적인 실험으로부터의 Treg를 점플롯으로 표시하였다.
도 19a 내지 도 19b는 FVB/N 마우스가 1 x 106개의 NT-2 세포로 피하로 접종되고 1주일 간격으로 각 백신으로 3회 면역화됨을 도시한다. 종양은 2차 면역화 후 7일째에 수확되었다. 면역 세포의 분리 후, 이들은 항 CD3, CD4, CD25 및 FoxP3 항체에 의한 Treg검출을 위해 염색되었다. (도 19a). 대표적 실험으로부터의 Treg의 점도표. (도 19b). 상이한 치료 그룹에어 걸쳐 총 CD3+ 또는 CD3+CD4+ T 세포의 백분율(좌측 패널) 및 종양내 CD8/Tregs 비율(우측 패널)로서 표현되는, CD25+/FoxP3+ T 세포의 빈도. 데이터는 2회의 독립 실험으로부터 수득된 평균 ± SEM으로 보여진다.
도 20a 내지 도 20c는 재조합 리스테리아 단백질 미니유전자 작제물의 도식적인 맵을 나타낸다. (도 20a)는 오브알부민 유래 SIINFEKL 펩타이드를 생성하는 작제물을 나타낸다. (도 20b)은 GBM 유래 펩타이드가 PCR 클로닝에 의해 SIINFEKL 대신 도입된 유사한 재조합 단백질을 나타낸다. (도 20c)는 리스테리아 균주 유래의 4개의 개별 펩타이드 항원들을 발현하도록 설계된 작제물을 나타낸다.
예시의 단순성 및 명확성을 위해, 도면들에 도시된 요소들이 반드시 일정한 비율로 도시되지 않았음은 이해될 것이다. 예를 들어, 상기 요소들의 일부의 치수들은 명확성을 위해 다른 요소들에 비해 과장될 수도 있다. 또한, 적절하다고 인정되는 경우, 참조 부호들은 대응하거나 유사한 요소들을 나타내기 위해 도면들에 반복될 수도 있다.
하기 상세한 설명에서, 많은 특정 세부사항들은 본 발명의 완벽한 이해를 제공하기 위해 진술된다. 그러나, 본 발명은 이들 특정 세부사항들 없이도 실시될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 발명을 불명료하게 하지 않도록, 주지된 방법, 절차 및 성분들이 상세하게 설명되지 않았다.
일 실시예에서, 본 발명은 항종양 반응 또는 항암 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다.
일 양태에서, 본 발명은 키메라 단백질을 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하는 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 제공하며, 여기서 상기 키메라 단백질은:
a. 박테리아 분비 신호 서열;
b. 유비퀴틴(Ub) 단백질;
c. 펩타이드를 포함하고,
여기서 a. 내지 c.의 상기 신호 서열, 상기 유비퀴틴 및 상기 펩타이드는 각각 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 일렬로 배열된다.
일 실시예에서, 리스테리아는 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 리보좀 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 2개 이상의 개방 해독 프레임을 추가로 포함한다.
다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 각각의 개방 해독 프레임 사이에서 샤인-달가노 리보좀 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 1개 또는 4개의 개방 해독 프레임을 추가로 포함한다. 다른 실시예에서, 각각의 개방 해독 프레임은 상이한 펩타이드들을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 종양 또는 암을 가진 대상체에서 항종양 또는 항암 반응의 유도 방법을 제공하며, 상기 방법은 키메라 단백질을 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하는 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 키메라 단백질은:
a. 박테리아 분비 신호 서열;
b. 유비퀴틴(Ub) 단백질;
c. 펩타이드를 포함하고,
여기서 a. 내지 c.의 상기 신호 서열, 상기 유비퀴틴 및 상기 펩타이드는 각각 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 일렬로 배열되고, 이에 의해서 상기 대상체 내에서 항종양 반응을 증강시킨다.
일 양태에서, 본 발명은 대상체에서 종양 또는 암의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 키메라 단백질을 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하는 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 키메라 단백질은:
a. 박테리아 분비 신호 서열;
b. 유비퀴틴(Ub) 단백질;
c. 펩타이드를 포함하고,
여기서 a. 내지 c.의 상기 신호 서열, 상기 유비퀴틴 및 상기 펩타이드는 각각 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 일렬로 배열되고, 이에 의해서 상기 대상체 내에서 항종양 반응을 증강시킨다.
일 실시예에서, 용어 "핵산 분자," "핵산 작제물" 및 "미니유전자 핵산 작제물"은 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
당업자는, 용어 "핵산" 및 이의 문법적 등가물이 원핵 서열, 진핵 mRNA, 진핵 mRNA 유래 cDNA, 진핵(예를 들어, 포유류) DNA 유래 게놈 DNA 서열, 심지어 합성 DNA 서열 등이 있으나 이들로 한정되지 않는 분자를 지칭할 수 있음을 이해할 것이다. 이 용어는 또한 DNA 및 RNA의 임의의 공지된 염기 유사체를 포함하는 서열을 가리킨다.
다른 실시예에서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 생생된 융합 펩타이드는 추가로 HIS 태그 또는 SIINFECKL 태그에 연결된다. 이들 태그는 발현될 수 있고, 제시된 항원 에피토프는, 임상의가 이들 "태그" 서열 펩타이드에 대한 면역 반응을 추적함으로써 분비된 펩타이드의 면역원성을 추적하게 한다. 이러한 면역 반응은 이들 태그에 특이적인 모노클로날 항체 및 DNA 프로브 또는 RNA 프로브를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 시약들을 사용하여 모니터링될 수 있다. 당업자는, 태그용 서열이 융합 펩타이드 서열을 인코딩하는 핵산 서열 내에 혼입될 수 있음을 이해할 것이다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 벡터, 예컨대 플라스미드 또는 파지 벡터는 본원에 개시된 융합 펩타이드 또는 키메라 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
당업자는, 본원에 사용된 용어 "암" 및 "종양"이 모두 동일한 의미 및 품질을 가질 수 있음을 이해할 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 종양 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 다른 실시예에서, 종양 항원은 이종성 항원이다. 다른 실시예에서, 종양 항원은 자기항원이다. 다른 실시예에서, 본 발명은 감염성 질환 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 다른 실시예에서, 감염성 질환 항원은 이종성 항원이다. 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 종양 또는 암에 대해 백신접종하는 데 사용된다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 치료 후 탈출 돌연변이의 발생을 방지한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 종양 또는 암을 앓고 있는 대상체에게 무진행 생존(progression free survival)을 제공하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 암 또는 종양에 대해 대상체를 면역화시키기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 암 또는 종양에 대해 대상체를 면역화시키기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 다른 실시예에서, 암은 전이성이다.
재조합 리스테리아 균주
일 실시예에서, 본 발명은 키메라 단백질을 인코딩하는 핵산 작제물을 포함하는 재조합 약독화된(attenuated) 리스테리아 균주를 개시한다. 다른 실시예에서, 핵산 작제물은 재조합 핵산 작제물이다. 다른 실시예에서, 본 발명은 박테리아 분비 신호 서열(SS), 유비퀴틴(Ub) 단백질 및 펩타이드 서열을 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하는 재조합 핵산 작제물을 포함하는 재조합 약독화된 리스테리아 균주를 개시한다. 다른 실시예에서, 핵산 작제물은 박테리아 분비 신호 서열, 유비퀴틴 단백질 및 펩타이드 서열을 포함하는 키메라 단백질을 인코딩한다. 일 실시예에서, 키메라 단백질은 하기(SS-Ub-펩타이드)의 방식으로 배열된다:
일 실시예에서, 핵산 작제물은 펩타이드 모이어티의 카르복시-말단에 대응하는 코돈을 포함하며, 단백질 합성의 종료를 보장하기 위해 2개의 정지 코돈에 의해 따른다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산은 또한, 신호 펩타이드 또는 신호 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물에 의해 인코딩되는 박테리아 분비 신호 서열은 리스테리아 분비 신호 서열이다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물의 융합 단백질은 리스테리오리손 O(Listeriolyson O; LLO) 유래의 LLO 신호 서열을 포함한다. 일 실시예에서, 이종성 항원은 리스테리아 신호 서열과 같은 신호 서열, 예를 들어, 용혈소(hly) 신호 서열 또는 actA 신호 서열의 사용을 통해 발현될 수 있다. 그렇지 않으면, 예를 들어, 외부 유전자가 융합 단백질의 생성 없이 리스테리아 모노사이토게네스 프로모터로부터 다운스트림 발현될 수 있다. 다른 실시예에서, 신호 펩티드는 박테리아성이다(리스테리아 또는 비-리스테리아). 일 실시예에서, 신호 펩티드는 박테리아 고유의 것이다. 다른 실시예에서, 신호 펩티드는 박테리아에 이질적인 것이다. 다른 실시예에서, 신호 펩티드는 secA1 신호 펩티드와 같은 리스테리아 모노사이토게네스로부터의 신호 펩티드이다. 다른 실시예에서, 신호 펩타이드는 락토콕커스 락티스로부터의 Usp45 신호 펩타이드, 또는 바실러스 안트라시스로부터의 보호 항원 신호 펩타이드이다. 다른 실시예에서, 신호 펩티드는 리스테리아 모노사이토게네스로부터의 p60 신호 펩티드와 같은 secA2 신호 펩티드이다. 게다가, 재조합 핵산 분자는 p60, 또는 이의 단편을 인코딩하는 제3 폴리펩티드를 임의로 포함한다. 다른 실시예에서, 신호 펩티드는 Tat 신호 펩티드, 예컨대 B. 서브틸리스Tat 신호 펩티드이다(예를 들어, PhoD). 일 실시예에서, 신호 펩티드는 재조합 폴리펩티드를 인코딩하는 동일한 전사 리딩 프레임 내에 있다.
본원에서 모든 목적을 위해, 용어 "재조합 폴리펩타이드," "융합 단백질," "재조합 단백질" 및 "키메라 단백질"은 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
다른 실시예에서, 분비 신호 서열은 리스테리아 단백질로부터 유래된 것이다. 다른 실시예에서, 분비 신호는 ActA300 분비 신호이다. 다른 실시예에서, 분비 신호는 ActA100 분비 신호이다.
일 실시예에서, 핵산 작제물은 유비퀴틴 단백질을 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함한다. 일 실시예에서, 유비퀴틴은 전장 단백질이다. 당업자는, 본원에 개시된 발현된 작제물(본원에 개시된 핵산 작제물로부터 발현된) 내 유비퀴틴은 숙주 세포 시토졸로의 도입 시 가수분해효소의 작용을 통해, 핵산 작제물로부터 발현된 재조합 키메라 단백질의 나머지로부터 카르복시-말단에서 절단됨을 이해할 것이다. 이는 펩타이드 모이어티의 아미노-말단을 유리시켜, 숙주 세포 시토졸에서 펩타이드(길이는 특정 펩타이드에 따라 다름)를 생성한다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 핵산 작제물에 의해 인코딩된 펩타이드의 길이는 8 내지 10개의 아미노산(AA)이다. 다른 실시예에서, 상기 펩타이드는 10 내지 20개의 AA 길이이다. 다른 실시예에서, 상기 펩타이드는 21 내지 30개의 AA 길이이다. 다른 실시예에서, 상기 펩타이드는 31 내지 50개의 AA 길이이다. 다른 실시예에서, 상기 펩타이드는 51 내지 100개의 AA 길이이다.
일 실시예에서, 펩타이드는 항원 펩타이드이다. 다른 실시예에서, 펩타이드는 종양 항원으로부터 유래된다. 다른 실시예에서, 펩타이드는 감염성 질환 항원으로부터 유래된다. 다른 실시예에서, 펩타이드는 자기항원으로부터 유래된다. 다른 실시예에서, 펩타이드는 혈관신생 항원으로부터 유래된다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 펩타이드가 유래되는 항원은 진균류 병원균, 박테리아, 기생충, 연충(helminth) 또는 바이러스이다. 다른 실시예에서, 본원의 펩타이드가 유래되는 항원은 파상풍 톡소이드, 인플루엔자 바이러스 유래 헤마글루티닌 분자, 디프테리아 톡소이드, HIV gp120, HIV gag 단백질, IgA 프로테아제, 인슐린 펩타이드 B, 스폰고스포라 수브테라네아 항원, 비브리오스(vibriose) 항원, 살모넬라 항원, 폐렴 구균 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 항원, 헤모필루스 인플루엔자 외막 단백질, 헬리코박터 파이로리 우레아제, 나이세리아 뇌수막염 필린, N. 임질 필린, 흑색종 관련 항원 (TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, gp-100, 티로시나제, MART-1, HSP-70, 베타-HCG), HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35 또는 HPV-45 인간 유두종 바이러스 유래 인간 유두종 바이러스 항원 E1 및 E2, 종양 항원 CEA, ras 단백질, 돌연변이되거나 돌연변이되지 않은 p53 단백질, 돌연변이되거나 돌연변이되지 않은 Muc1, 메소텔린(mesothelin), EGFRVIII 또는 pSA로부터 선택된다.
다른 실시예에서, 펩타이드는 하기 질병과 연관된 항원으로부터 유래된다: 콜레라, 디프테리아, 헤모필루스, A형 간염, B형 간염, 인플루엔자, 홍역, 뇌수막염, 볼거리, 백일해, 천연두, 페렴구균성 폐렴, 소아마비, 광견병, 풍진, 파상풍, 폐결핵, 장티푸스, 대상포진, 백일해, 황열병, 에디슨병으로부터의 면역원 및 항원, 알러지, 아나필락시스, 부르턴 증후군, 고형 종양 및 혈액 매개 종양을 포함하는 암, 하시모토 갑상선염, 다발성 근염, 피부근염, 제1 당뇨병, 후천성 면역결핍증, 신장, 심장, 췌장, 폐, 뼈 및 간 이식과 같은 이식 거부, 그레이브스병, 다선 자가면역 질병, 간염, 현미경적 다발성동맥염, 결절성 다발동맥염, 천포창, 원발 쓸개관간경화증, 악성 빈혈, 만성 소화 장애증, 항체-매게 신염, 사구체 신염, 류미티스성 질병, 전신 홍반 루푸스, 류마티스 관절염, 혈청반응 음성 척추관절염, 비염, 소그렌 증후군, 전신 경화증, 경화성 담관염, 베게너 육아종증, 포진성 피부염, 건선, 백반증, 다발성 경화증, 뇌척수염, 길랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 램버트-이튼 증후군, 공막, 상공막, 포도막염, 만성 피부점막 칸디다증, 두드러기, 유아기 일과성 저감마글로불린혈증, 골수종, X-연성 과IgM혈증, 비스코트-올드리치 증후군, 모세혈관 확장성 운동실조증, 자가면역 용혈성 빈열, 자가면역 혈소판감소증, 자가면역 호중구감소증, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 아밀로이드증, 만성 림프성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 말라리아 시르쿰스포로자이트 단백질(malarial circumsporozite protein), 미생물 항원, 바이러스 항원, 자가항원, 및 리스테리아증.
다른 실시예에서, 본원에 개시된 펩타이드가 유래되는 항원은 종양-연관 항원으로서, 일 실시예에서, 다음과 같은 종양 항원들 중 하나이다: MAGE(흑색종-연관 항원 E) 단백질, 예를 들어, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, 티로시나제; 돌연변이체 ras 단백질; 돌연변이체 p53 단백질; p97 흑색종 항원, 진행 암과 연관된 ras 펩타이드 또는 p53의 펩타이드; 자궁경부암과 연관된 HPV 16/18 항원, 유방암과 연관된 KLH 항원, 대장암과 연관된 CEA(암 배아 항원), gp100, 흑색종과 연관된 MART1 항원, 또는 전립선암과 연관된 PSA 항원. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 대한 항원은 흑색종-연관 항원으로서, 일 실시예에서, TRP-2, MAGE-1, MAGE-3, gp-100, 티로시나제, HSP-70, 베타-HCG 또는 이들의 조합이다. 본 분야에서 공지된 다른 종양-연관 항원은 본 발명에서 또한 고려된다.
일 실시예에서, 펩타이드는 미국 특허 출원 일련 번호 12/945,386에 기재된 키메라 Her2 항원으로부터 유래되며, 이러한 특허 문헌의 전문은 본원에 참고로 원용된다.
다른 실시예에서, 펩타이드는 HPV-E7(HPV16 또는 HPV18 균주로부터), HPV-E6(HPV16 또는 HPV18 균주로부터), Her-2/neu, NY-ESO-1, 텔로머라제(TERT, SCCE, CEA, LMP-1, p53, 카르복시 안하이드라제 IX(CAIX), PSMA, 전립선 줄기세포 항원(PSCA), HMW-MAA, WT-1, HIV-1 Gag, 프로테나제 3, 티로시나제 관련 단백질 2, PSA(전립선-특이 항원), EGFR-III, 서바이빈, 아폽토시스 반복의 바큘로 저해제-함유 5(BIRC5), LMP-1, p53, PSMA, PSCA, Muc1, PSA(전립선-특이 항원) 또는 이들의 조합으로부터 선택된 항원으로부터 유래된다.
일 실시예에서, 본 발명의 리스테리아에 의해 발현되는 폴리펩타이드는 신경펩타이드 성장 인자 길항제일 수도 있으며, 일 실시예에서는 [[D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11] 물질 P, [[Arg6, D-Trp7,9, NmePhe8]물질 P(6-11)이다. 이들 및 관련된 실시예들은 당업자에 의해 이해된다.
다른 실시예에서, 이종 항원은 감염성 질환 항원이다. 다른 실시예에서, 항원은 자기 항원 또는 자가-항원이다.
일 실시예에서, 펩타이드는 MHC 부류 I 분자 상으로 로딩될 수 있다. 다른 실시예에서, 펩타이드는 MHC 부류 II 분자 상으로 로딩될 수 있다. 다른 실시예에서, 펩타이드는 MHC 부류 I 펩타이드이다. 다른 실시예에서, 펩타이드는 MHC 부류 II 펩타이드이다. 다른 실시예에서, 펩타이드는 숙주 세포의 표면 상의 MHC 부류 I 분자에 결합되는 경우, CD8+ T 세포 상의 T 세포 수용체에 의해 인지될 수 있다. 다른 실시예에서, 펩타이드는 숙주 세포의 표면 상의 MHC 부류 II 분자에 결합되는 경우, CD4+ T 세포 상의 T 세포 수용체에 의해 인지될 수 있다. 다른 실시예에서, 펩타이드는 숙주 세포의 표면 상의 MHC 부류 I 또는 MHC 부류 II 분자에 결합되는 경우, 상기 펩타이드에의 결합에 특이적인 효과기 CD4+ 또는 CD8+ 세포의 표면 상에 존재하는 항체 또는 저분자(small molecule)에 의해 인지될 수 있다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 발현 시스템은 본원에 개시된 키메라 단백질을 인코딩하는 핵산 작제물의 사용을 포함한다. 다른 실시예에서, 이러한 발현 시스템은 카르복시 말단에 별개의 펩타이드 모이어티를 함유하는 재조합 단백질의 패널을 촉진하도록 설계된다. 일 실시예에서, 이는 박테리아 분비 신호 서열-유비퀴틴-펩타이드(SS-Ub-펩타이드) 작제물을 인코딩하는 서열을 주형으로 이용하는 PCR 반응에 의해 달성된다. 일 실시예에서, Ub 서열의 카르복시-말단 영역 내로 연장되는 프라이머를 사용하고 요망되는 펩타이드 서열에 대한 코돈을 프라이머의 3' 말단에 도입하면, 새로운 SS-Ub-펩타이드 서열이 단일 PCR 반응에서 발생될 수 있다(본원의 실시예 참조). 박테리아 프로모터 및 박테리아 분비 신호 서열의 처음 몇 개의 뉴클레오타이드를 인코딩하는 5' 프라이머는 모든 작제물들에 대해 동일할 수 있다. 이러한 작제물의 개략적인 표시는 본원의 도 1에 제공되어 있다.
일 실시예에서, 재조합 리스테리아는 대사 효소를 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하는 제2 핵산 분자 또는 작제물을 포함하며, 여기서 대사 효소는 리스 테리아의 내인성 유전자에서의 돌연변이, 결실 또는 비활성화를 보완한다. 다른 실시예에서, 대사 효소는 재조합 리스테리아 균주의 염색체에 결여되어 있는 내인성 유전자를 보완한다. 다른 실시예에서, 제2 핵산 분자는 리스테리아의 내인성 유전자에서의 돌연변이를 보완하는 제2 대사 효소를 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함한다. 다른 실시예에서, 제2 핵산 분자는 재조합 리스테리아 균주의 염색체에서 돌연변이된 내인성 유전자를 보완하는 제2 대사 효소를 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함한다.
전장 단백질 또는 폴리펩타이드에 있어서, "단편"이라는 용어는 전장 단백질 또는 폴리펩타이드보다 더 짧거나 더 적은 수의 아미노산을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다.
일 실시예에서, 상기 단편은 10 내지 20개의 핵산 또는 아미노산을 가지며, 다른 실시예에서 상기 단편은 5개 이상의 핵산 또는 아미노산을 갖는 반면, 다른 실시예에서는 상기 단편은 100 내지 200개의 핵산 또는 아미노산을 갖는 반면, 일 실시예에서, 상기 단편은 100 내지 500개의 핵산 또는 아미노산을 가지며, 다른 실시예에서 상기 단편은 50 내지 200개의 핵산 또는 아미노산을 갖는 반면, 다른 실시예에서 상기 단편은 10 내지 250개의 핵산 또는 아미노산을 갖는다.
다른 실시예에서, 핵산 작제물 또는 핵산 분자는 적어도 하나의 에피좀 벡터 또는 플라스미드 벡터로부터 발현된다. 다른 실시예에서, 플라스미드 벡터는 항생제 선택의 부재 시에 재조합 리스테리아 균주에서 안정적으로 유지된다. 다른 실시예에서, 플라스미드는 재조합 리스테리아에 항생제 내성을 부여하지 않는다. 일 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 항생제 내성 유전자가 결여되어 있다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 항생제 내성 유전자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 플라스미드를 포함한다.
일 실시예에서, 재조합 리스테리아는 본원에 개시된 핵산 작제물을 운반하는 에피좀 벡터를 포함한다. 다른 실시예에서, 에피좀 벡터는 염색체외 벡터이므로, 리스테리아의 게놈 내에 통합되지 않는다. 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 본원에 개시된 핵산 작제물을 운반하는 플라스미드 벡터를 포함한다. 다른 실시예에서, 플라스미드 벡터는 리스테리아 염색체 내로 통합되기 위한 통합 서열을 함유한다. 다른 실시예에서, 용어 "게놈" 및 "염색체"는 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되기 위한 LLO 단백질을 개시한다. 다른 실시예에서, LLO 단백질의 단편은 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용된다. 다른 실시예에서, 단편은 기능성 단편이다. 다른 실시예에서, 단편은 면역원성 단편이다.
본 발명의 백신을 구축하기 위해 사용되는 LLO 단백질은, 다른 실시예에서, 다음 서열을 가진다:
(GenBank Accession No. P13128; SEQ ID NO: 1; 핵산 서열은 GenBank Accession No. X15127에 제시됨). 다른 실시예에서, LLO 단백질은 GenBank Accession No. DQ054589.1에 제시된 서열을 가지며, 이는 리스테리아 10403S 유래의 hly 유전자를 지칭한다. 이 서열에 해당하는 프로단백질의 처음 25개의 AA는 신호 서열이고 박테리아에 의해 분비되는 경우 LLO로부터 절단(cleave)된다. 따라서, 본 실시예에서, 전장 활성 LLO 단백질은 504개의 잔기 길이이다. 다른 실시예에서, 상기 LLO 단편은 본 발명의 백신에 포함되는 LLO 단편의 소스로서 사용된다.
다른 실시예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법에 사용되는 LLO 단백질의 N-말단 단편은 다음 서열을 가진다: (SEQ ID NO: 2).
다른 실시예에서, LLO 단편은 본원에서 사용된 LLO 단백질의 약 20 내지 442개의 AA에 대응한다.
다른 실시예에서, LLO 단편은 다음 서열을 가진다: (서열번호: 3).
일 실시예에서, LLO 신호 펩타이드 또는 신호 서열은 다음 아미노산을 포함한다: MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAK (SEQ ID NO: 4).
본원에 사용된 바와 같이, "말단이 절단된 LLO"는 "tLLO" 또는 "ΔLLO"는 PEST-유사 도메인을 포함하는 LLO의 단편을 지칭한다. 다른 실시예에서, 이 용어는 PEST 서열을 포함하는 LLO 단편을 지칭한다. 다른 실시예에서 "ΔLLO"는 상기 정의된 바와 같은 416AA LLO 단편을 지칭한다.
다른 실시예에서, 말단이 절단된 LLO, tLLO 또는 ΔLLO라는 용어는 아미노 말단에 활성화 도메인을 함유하지 않고 시스테인 484를 포함하지 않는 LLO 단편을 지칭한다. 다른 실시예에서, 이 용어는 용혈성이 아닌 LLO 단편을 의미한다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 상기 활성화 도메인의 결실 또는 돌연변이에 의해 비용혈성이 부여된다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 시스테인 484의 결실 또는 돌연변이에 의해 비용혈성이 부여된다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 다른 위치에서 결실 또는 돌연변이에 의해 비용혈성이 부여된다. 다른 실시예에서, 상기 LLO 단편은 전체가 참조로 본원에 통합된 미국 특허 제8,771,702호에 기재된 콜레스테롤 결합 도메인(CBD)의 결실 또는 돌연변이에 의해 비용혈성이 부여된다.
다른 실시예에서, LLO 단편은 LLO 단백질의 약 처음 441개의 AA로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 LLO의 약 처음 420개의 AA로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 LLO 단백질의 비용혈 형태이다.
다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 25개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 50개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 75개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 100개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 125개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 150개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1175개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 200개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 225개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 250개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 275개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 300개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 325개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 350개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 375개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 400개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 425개의 잔기로 이루어진다.
다른 실시예에서, LLO 단편은 상기 AA 범위 중 하나에 해당하는 상동성 LLO 단백질의 잔기들을 포함하고 있다. 잔기 수는 필요하지 않으며, 다른 실시예에서, 위에 열거된 잔기 수와 정확히 일치한다; 예를 들면 상동성 LLO 단백질이 본원에서 이용되는 LLO 단백질에 대해 상대적인, 삽입 또는 결실을 가지는 경우, 그 잔기 수는 적절히 조절될 수 있다. 다른 LLO 단편은 당업계에 공지되어 있다.
다른 실시예에서, LLO 단편은 LLO 단백질의 약 처음 441개의 AA로 구성된다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 LLO의 약 처음 420개의 AA로 구성된다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 LLO 단백질의 비용혈 형태이다.
다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 25개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 50개의 잔기으로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 75개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 100개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 125개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 150개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 잔기 1175로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 200개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 225개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 250개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 275개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 300개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 325개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 350개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 375개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 400개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, LLO 단편은 약 1 내지 425개의 잔기로 이루어진다.
다른 실시예에서, LLO 단편은 상기 AA 범위 중 하나에 해당하는 상동성 LLO 단백질의 잔기들을 포함하고 있다. 다른 실시예에서, 잔기 수는 상기 열거된 잔기 수에 정확히 대응할 필요는 없으며; 예를 들어, 상동성 LLO 단백질이 본원에서 이용되는 LLO 단백질에 대해 삽입 또는 결실을 가지는 경우, 그 잔기 수는 그에 따라 조정될 수 있다. 다른 LLO 단편은 당업계에 공지되어 있다.
다른 실시예에서, 상동성 LLO는 70% 초과의 LLO 서열에 대한(예를 들어, SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한) 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성 LLO는 72% 초과의 SEQ ID N0: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 75% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 78% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 80% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 82% 초과의SEQ ID N0: 1 내지 34 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 83% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 85% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 87% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 88% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 90% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 92% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 93% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 95% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 96% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 97% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 98% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 99% 초과의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 100%의 SEQ ID NO: 1 내지 3 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다.
일 실시예에서, ActA 단백질은 SEQ ID NO: 5에 제시된 서열에 의해 인코딩된다(SEQ ID NO: 5). 다른 실시예에서, ActA 단백질은 SEQ ID NO: 5를 포함한다. 이 서열에 대응하는 포로단백질의 처음 29개의 AA는 신호 서열이고, 박테리아에 의해 분비되는 경우 ActA 단백질로부터 절단된다. 일 실시예에서, ActA 폴리펩타이드 EH는 펩타이드는 상기 SEQ ID NO: 5의 1개 내지 29개의 AA인 신호 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, ActA 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 상기 SEQ ID NO: 5의 1개 내지 29개의 AA인 신호 서열을 포함하지 않는다.
다른 실시예에서, 본원에 개시된 말단 절단된 ActA 단백질을 인코딩하는 재조합 뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 6에 제시된 서열을 포함한다. (SEQ ID NO: 6). 다른 실시예에서, 재조합 뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 6에 제시된 서열을 갖는다. 다른 실시예에서, 재조합 뉴클레오티드는 ActA 단백질의 단편을 인코딩하는 임의의 다른 서열을 포함한다.
다른 실시예에서, ActA 단백질은 SEQ ID NO: 7에 제시된 서열을 포함한다(SEQ ID NO: 7). 이 서열에 대응하는 프로단백질의 처음 29개의 AA는 신호 서열이고, 박테리아에 의해 분비되는 경우 ActA 단백질로부터 절단된다.
일 실시예에서, ActA 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 신호 서열, SEQ ID NO: 7의 1개 내지 29개의 AA를 포함한다. 다른 실시예에서, ActA 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 SEQ ID NO: 7의 1개 내지 29개의 AA를 포함한다. 일 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 ActA 단백질의 N-말단 단편을 포함한다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 ActA 단백질의 N-말단 단편이다.
다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 SEQ ID NO: 8에 제시된 서열을 포함한다(SEQ ID NO: 8). 다른 실시예에서, ActA 단편은 SEQ ID NO: 8에 제시된 서열을 포함한다.
다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 SEQ ID NO: 9에 제시된 서열을 포함한다(SEQ ID NO: 9).
다른 실시예에서, ActA 단편은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 ActA 단편이다.
다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 SEQ ID NO: 10에 제시된 서열을 포함한다(SEQ ID NO: 10).
다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 SEQ ID NO: 11에 제시된 서열을 포함한다(SEQ ID NO: 11).
다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 SEQ ID NO: 12에 제시된 서열을 포함한다(SEQ ID NO: 12). 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 12에 제시된 말단 절단된 ActA 12는 ActA/PEST1로 지칭된다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA는 전장 ActA 서열의 처음 30개부터 122개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 12는 전장 ActA 서열의 처음 30개부터 122개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 SEQ ID NO: 7의 처음 30개부터 122개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 12는 SEQ ID NO: 7의 처음 30개부터 122개의 아미노산까지 포함한다.
다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 SEQ ID NO: 13에 제시된 서열을 포함한다(SEQ ID NO: 13). 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 12에 기재된 말단 절단된 ActA는 ActA/PEST1로 지칭된다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA는 전장 ActA 서열의 처음 1개부터 130개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 13은 전장 ActA 서열의 처음 1개부터 130개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 SEQ ID NO: 7의 처음 1개부터 130개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 13은 SEQ ID NO: 7의 처음 30개부터 122개의 아미노산을 포함한다.
다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 SEQ ID NO: 14에 제시된 서열을 포함한다(SEQ ID NO: 14). 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 14에 제시된 말단 절단된 ActA는 ActA/PEST1로 지칭된다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA는 전장 ActA 서열의 처음 30개부터 122개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 14는 전장 ActA 서열의 처음 30개부터 122개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA은 SEQ ID NO: 7의 처음 30개부터 122개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 14는 SEQ ID NO: 7의 처음 30개부터 122개의 아미노산까지 포함한다.
다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 SEQ ID NO: 15에 제시된 서열을 포함한다(SEQ ID NO: 15). 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 15에 제시된 말단 절단된 ActA는 ActA/PEST2로 지칭된다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA는 전장 ActA 서열의 30개의 아미노산부터 229개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 15는 전장 ActA 서열의 약 30개의 아미노산부터 약 229개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA는 SEQ ID NO: 7의 약 30개의 아미노산부터 229개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 15는 SEQ ID NO: 7의 처음 30개부터 229개의 아미노산을 포함한다.
다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 SEQ ID NO: 16에 제시된 서열을 포함한다(SEQ ID NO: 16). 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 16에 제시된 말단 절단된 ActA은 ActA/PEST3으로 지칭된다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA는 전장 ActA 서열의 처음 30개부터 332개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 16은 전장 ActA 서열의 처음 30개부터 332개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA는 SEQ ID NO: 7의 약 처음 30개부터 332개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 16은 SEQ ID NO: 7의 처음 30개부터 332개의 아미노산을 포함한다.
다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질은 SEQ ID NO: 17에 제시된 서열을 포함한다(SEQ ID NO: 17). 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 17에 제시된 말단 절단된 ActA는 ActA/PEST4로 지칭된다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA는 전장 ActA 서열의 처음 30개부터 399개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 25는 전장 ActA 서열의 처음 30개부터 399개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA는 SEQ ID NO: 7의 처음 30개부터 399개의 아미노산까지 포함한다. 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 17은 SEQ ID NO: 7의 처음 30개부터 399개의 아미노산까지 포함한다.
다른 실시예에서, 본원에 개시된 말단 절단된 ActA 서열은 N-말단에서 hly 신호 펩타이드에 추가로 융합된다. 다른 실시예에서, hly 신호 펩타이드에 융합된 말단 절단된 ActA는 SEQ ID NO: 18에 제시된 서열을 가진다.
다른 실시예에서, SEQ ID NO: 18에 제시된 말단 절단된 ActA 18은 "LA229"로 지칭된다.
다른 실시예에서, hly 신호 펩타이드에 융합된 말단 절단된 ActA는 SEQ ID NO: 19를 포함하는 서열에 의해서 인코딩된다(SEQ ID NO: 19). 다른 실시예에서, SEQ ID NO: 19는 XbaI에 대해 독특한 제한 효소 부위를 생성하도록 사용되는 링커 영역(굵은 이탤릭체를 참조함)을 인코딩하는 서열을 포함하여, 상이한 폴리펩타이드, 이종성 항원 등이 신호 서열 후에 클로닝될 수 있다. 따라서, 당업자는, 신호 펩티다제가 링커 영역 앞의 서열에 작용하여, 신호 펩타이드를 절단함을 이해할 것이다.
다른 실시예에서, 말단 절단된 ActA 단백질을 인코딩하는 재조합 뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 20에 제시된 서열을 포함한다(SEQ ID NO: 20).
다른 실시예에서, 재조합 뉴클레오타이드는 SEQ ID NO: 18에 제시된 서열을 가진다. 다른 실시예에서, 재조합 뉴클레오타이드는 ActA 단백질의 단편을 인코딩하는 다른 서열을 포함한다.
다른 실시예에서, 용어 "말단 절단된 ActA", "N-말단 ActA 단편" 또는 "ΔactA"는 본 발명에서 상호호환적으로 사용되고, PEST 도메인을 포함하는 ActA의 단편을 지칭한다. 다른 실시예에서, 이 용어는 PEST 서열을 포함하는 ActA 단편을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상기 용어는 ActA 단백질의 면역원성 단편을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상기 용어는, 본원에 개시된 SEQ ID NO: 8 내지 18에 의해 인코딩된 말단 절단된 ActA 단편을 지칭한다.
본 발명의 방법 및 조성물의 N-말단 ActA 단백질 단편은, 일 실시예에서, SEQ ID NO: 8 내지 18로부터 선택되는 서열에 상동성이다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 ActA 신호 펩타이드를 포함한다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 SEQ ID NO: 8 내지 18로부터 선택되는 서열에 상동성이다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 SEQ ID NO: 8 내지 18로부터 선택되는 서열에 상동성이다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 SEQ ID NO: 8 내지 18로부터 선택되는 서열에 상동성이다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 SEQ ID NO: 8 내지 18로부터 선택되는 서열에 상동성이다.
다른 실시예에서, PEST 서열은 원핵 유기체로부터 유래된 다른 PEST AA 서열이다. PEST AA 서열은 당업계에 알려진 다른 PEST 서열일 수 있다.
다른 실시예에서, ActA 단편은 ActA 단백질의 약 처음 100개의 AA로 이루어진다.
다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 25개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 29개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 50개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 75개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 100개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 125개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 150개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 175개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 200개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 225개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 250개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 275개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 300개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 325개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 338개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 350개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 375개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 400개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 450개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 500개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 550개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 600개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 639개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 100개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 125개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 150개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 175개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 200개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 225개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 250개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 275개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 300개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 325개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 338개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 350개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 375개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 400개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 450개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 500개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 550개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 1 내지 600개의 잔기로 이루어진다. 다른 실시예에서, ActA 단편은 약 30 내지 604개의 잔기로 이루어진다.
다른 실시예에서, ActA 단편은 상기 AA 범위 중 하나에 대응하는 상동성 ActA 단백질의 잔기를 함유한다. 잔기 수는 필요하지 않으며, 다른 실시예에서, 위에 열거된 잔기 수와 정확히 대응한다; 예를 들면, 상동성 ActA 단백질이 본원에서 이용되는 ActA 단백질에 대해 삽입 또는 결실을 가지는 경우, 그에 따라 잔기 수는 조정될 수 있다. 다른 ActA 단편은 당업계에 알려져 있다.
다른 실시예에서, 상동성 ActA는 70% 초과의 ActA 서열에 대한(예를 들어, SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한) 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성 ActA는 72% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 75% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 78% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 80% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 82% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 83% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 85% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 87% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 88% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 90% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 92% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 93% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 95% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 96% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 97% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 98% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 99% 초과의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 상동성은 100%의 SEQ ID NO: 5, 7 내지 18 중 하나에 대한 동일성을 지칭한다.
다른 실시예에서, 용어 "상동성"은, 본원에서 개시된 임의의 핵산 서열을 참조하는 경우, 대응하는 고유의 핵산 서열의 뉴클레오타이드와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오타이드의 백분율을 지칭한다.
상동성은, 당업계에 잘 기재된 방법에 의해 서열 정렬을 위한 컴퓨터 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열 상동성의 컴퓨터 알고리즘 분석은 예를 들어, BLAST, DOMAIN, BEAUTY(BLAST 증강 정렬 유틸리티), GENPEPT 및 TREMBL 패키지와 같은 입수 가능한 많은 소프트웨어 패키지의 사용을 포함할 수 있다.
다른 실시예에서, "상동성"은 68% 초과의 본원에 개시된 서열로부터 선택된 서열에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, "상동성"은 70% 초과의 본원에 개시된 서열로부터 선택된 서열에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, "상동성"은 72% 초과의 본원에 개시된 서열로부터 선택된 서열에 대한 동일성을 지칭한다. 다른 실시예에서, 동일성은 75% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 78% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 80% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 82% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 83% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 85% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 87% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 88% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 90% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 92% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 93% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 95% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 96% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 97% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 98% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 99% 초과이다. 다른 실시예에서, 동일성은 100%이다.
다른 실시예에서, 본개시의 LLO 단백질, ActA 단백질 또는 이들의 단편들은 본원에 제시된 서열에 정확하게 제시되어 있는 것일 필요는 없으며, 오히려 본원에서 다른 곳에 제시된 바와 같이 LLO 또는 ActA 단백질의 기능적 특징을 보유하는 다른 변경, 변형 또는 변화가 이루어질 수 있다. 다른 실시예에서, 본 발명은 LLO 단백질, ActA 단백질, 또는 이들의 단편들의 유사체를 이용한다. 유사체는, 다른 실시예에서, 보존적 AA 서열 차이에 의해, 또는 서열에 영향을 미치지 않는 변형에 의해, 또는 둘 다에 의해 자연 발생하는 단백질 또는 펩타이드와 다르다.
다른 실시예에서, 상동성은 본 분야에서 널리 기재된 방법인 후보 서열 혼성화를 통해 결정된다(예를 들어, "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds.(1985); Sambrook 외, 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel 외, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y). 예를 들어, 잡종형성 방법들은, 적절한 조건 내지 엄격한 조건 하에서 천연 카스파제 펩타이드를 인코딩하는 DNA의 보체에 대하여 실시될 수 있다. 혼성화 조건은, 예를 들어, 하기를 포함하는 용액 내에서 42℃에서 밤새 인큐베이션하는 것이다: 10% 내지 20%의 포름아미드, 5 X SSC(150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7. 6), 5 X 덴하르트 용액, 10% 덱스트란황산, 및 20 μg/ml 변성된 시어드 연어 정자 DNA.
일 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아는 파고리소좀(phagolysosome)을 탈출시킬 수 있다.
일 실시예에서, 이종성 항원 또는 이의 항원 부분을 인코딩하는 핵산 서열은 리스테리아 염색체 내의 프레임에 통합된다. 다른 실시예에서, 이종성 항원을 인코딩하는 통합된 핵산 서열은 ActA 유전자좌에서 ActA와 함께 프레임에 통합된다. 다른 실시예에서, ActA를 인코딩하는 염색체 핵산은 항원을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자로 대체된다. 다른 실시예에서, 항원은 본원에 개시되고 당업계에 공지된 임의의 항원이다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 제2 핵산 분자 또는 작제물은 대사 효소를 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함한다. 다른 실시예에서, 대사 효소는 재조합 리 스테리아 균주의 염색체에서 돌연변이화되어 있는 내인성 유전자를 보완한다. 다른 실시예에서, 대사 효소는 재조합 리스테리아 균주의 염색체에 결여되어 있는 내인성 유전자를 보완한다. 다른 실시예에서, 상기 개방형 해독틀에 의해 인코딩된 대사 효소는 알라닌 라세미화효소(dal)이다. 다른 실시예에서, 상기 개방형 해독틀에 의해 인코딩된 대사 효소는 D-아미노산 전이효소(dat)이다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 리스테리아 균주는 내인성 dal/dat 유전자에 돌연변이를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 리스테리아는 dal/dat 유전자가 결여되어 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물의 핵산 분자는 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물의 개방 해독 프레임은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 다른 실시예에서, 각각의 개방 해독 프레임은 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 각각의 개방 해독 프레임의 발현은 단일 프로모터/조절 서열에 의해 구동된다.
일 실시예에서, hly 프로모터 및 hly 신호 서열은 본원에 개시된 키메라 단백질의 발현을 구동하도록 작동적으로 연결되어 있다. 다른 실시예에서, actA 프로모터 및 actA 신호 서열은 본원에 기재된 키메라 단백질의 발현을 구동하도록 작동적으로 연결되어 있다.
"대사 효소"는 숙주 박테리아에 의해 요구되는 영양소의 합성에 수반된 효소를 지칭한다. 다른 실시예에서, 용어는 숙주 박테리아에 의해 요구되는 영양소의 합성에 요구되는 효소를 가리킨다. 다른 실시예에서, 용어는 숙주 박테리아에 의해 사용되는 영양소의 합성에 연관된 효소를 가리킨다. 다른 실시예에서, 용어는 숙주 박테리아의 지속되는 성장을 위해 요구되는 영양소의 합성에 연관된 효소를 가리킨다. 다른 실시예에서, 효소는 영양소의 합성을 위해 요구된다.
다른 실시예에서, 재조합리스테리아는 약독화 영양요구성 균주이다.
일 실시예에서, 약독화 균주는 Lm dal(-)dat(-) (Lmdd)이다. 다른 실시예에서, 약독화 균주는 Lm dal(-)dat(-)ΔactA (LmddA)이다. LmddA는, 독성 유전자 actA의 결실로 인해 약독화되고 dal 유전자의 상보성에 의한 생체내 및 시험관내 플라스미드 발현을 보유하는 리스테리아 백신 벡터에 기반한다.
다른 실시예에서 약독화 균주는 Lmdd이다 . 다른 실시예에서, 약독화 균주는 LmDactA이다. 다른 실시예에서, 약독화된 균주는 LmDprfA이다. 다른 실시예에서, 상기 약독화된 균주는 LmDplcB이다. 다른 실시예에서, 상기 약독화된 균주는 LmDplcA이다. 다른 실시예에서, 상기 균주는 상기 균주들 중 어느 하나의 이중 돌연변이체 또는 삼중 돌연변이체이다. 다른 실시예에서, 이 균주는 리스테리아 기반 백신의 고유한 속성인 강력한 애쥬번트(adjuvant) 효과를 발휘한다. 다른 실시예에서, 이 균주는 EGD 리스테리아 골격으로부터 구축된다. 다른 실시예에서, 본 개시내용에 사용된 균주는 게놈성 용혈 LLO를 발현하는 리스테리아 균주이다.
다른 실시예에서, 영양요구성 돌연변이체인 리스테리아 균주이다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 비타민 합성 유전자를 암호화하는 유전자가 결핍되어 있다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 판토텐산 합성 효소를 인코딩하는 유전자가 결핍되어 있다.
다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 아미노산(AA) 대사 효소가 결핍되어 있다. 일 실시예에서, D-알라닌이 결핍된 리스테리아의 영양요구성 균주의 생성은, 예를 들면, 당업자에게 잘 알려진 다수의 방식들로 달성될 수도 있는데, 이들 방식으로는 결실 돌연변이 생성, 삽입 돌연변이 생성 및 프레임 이동 돌연변이의 생성을 초래하는 돌연변이 생성, 단백질의 조기 종결을 야기하는 돌연변이, 또는 유전자 발현에 영향을 미치는 조절 서열(들)의 돌연변이 등이 있다. 다른 실시예에서, 돌연변이는 재조합 DNA 기술을 이용하거나 돌연변이 화학 물질이나 방사선에 이어서 돌연변이체의 선택을 이용하여 기존의 돌연변이 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 다른 실시예에서, 결실 돌연변이체가 바람직한데, 영양 요구성 표현형의 낮은 복귀 가능성을 동반하기 때문이다. 다른 실시예에서, 본 명세서에서 제시된 프로토콜에 따라 생성되는 D-알라닌의 돌연변이체는 간단한 실험실 배양 분석에서 D-알라닌의 부재시에 성장할 수 있는 능력에 대해 시험될 수 있다. 다른 실시예에서, 이 화합물의 부재 시에 성장할 수 없는 돌연변이체들은 추가 연구를 위해 선택된다.
다른 실시예에서, 상기 언급된 D-알라닌 관련 유전자에 더하여, 본원에 개시된, 대사 효소의 합성에 수반하는 다른 유전자들이 리스테리아의 돌연변이 생성을 위한 표적으로 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 대사 효소는 재조합 박테리아 균주의 염색체의 나머지 부분이 결여된 내인성 대사 유전자를 보완한다. 일 실시예에서, 내인성 대사 유전자는 염색체에서 돌연변이된다. 다른 실시예에서, 내인성 대사 유전자는 염색체에서 결실된다. 다른 실시예에서, 대사 효소는 아미노산 대사 효소이다. 다른 실시예에서, 대사 효소는 상기 재조합 리스테리아 균주 내에서 세포벽 합성에 사용되는 아미노산의 형성을 촉매한다. 다른 실시예에서, 상기 대사 효소는 알라닌 라세마제 효소이다. 다른 실시예에서, 대사 효소는 D-아미노산 전이효소 효소이다.
일 실시예에서, 영양요구성 리스테리아 균주는 상기 영양요구성 리스테리아 균주의 영양요구성을 보완하는 대사 효소를 포함하는 에피솜 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시예에서, 구성체는 에피솜 방식으로 리스테리아 균주에 포함되어 있다. 다른 실시예에서, 외래 항원은 재조합 리스테리아 균주에 의해 잠복된 벡터로부터 발현된다. 다른 실시예에서, 상기 에피솜 발현 벡터는 항생제 내성 마커가 결여되어 있다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 D-글루탐산 합성효소 유전자가 결핍되어 있다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 dat 유전자가 결핍되어 있다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 dal 유전자가 결핍되어 있다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 dga 유전자가 결핍되어 있다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 디아미노피멜산(diaminopimelic acid)의 합성에 관여하는 유전자가 결핍되어 있다. CysK. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 비타민 B12 독립적 메티오닌 합성효소이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 trpA이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 trpB이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 trpE이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 asnB이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 gltD이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 gltB이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 leuA이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 argG이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 thrC이다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 상술한 유전자들 중 하나 이상이 결핍되어 있다.
다른 실시예에서의 리스테리아 균주는 합성효소 유전자가 결핍되어 있다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 AA 합성 유전자이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 folP이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 디하이드로우리딘 합성효소 과 단백질이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ispD이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ispF이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 포스포에놀피루베이트 합성효소이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 hisF이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 hisH이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 fliI이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 리보솜 큰 소단위 슈도우리딘 합성효소이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ispD이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 2작용 GMP 합성효소/글루타민 아미도전이효소 단백질이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 cobS이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 cobB이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 cbiD이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 유로포르피린-III C-메틸전이효소/ 유로포르피리노겐-III 합성효소 이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 cobQ이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 uppS이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 truB이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 dxs이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 mvaS이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 dapA이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ispG이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 folC이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 시트르산염 합성효소이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 argJ이다. 다른 실시예에서 상기 유전자는 3-데옥시-7-포스포헵투론산 합성효소이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 인돌-3-글리세롤-인산 합성효소이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 안트라닐산염 합성효소/글루타민 아미도전이효소 성분이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 menB이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 메나퀴논-특이적 이소코리스민산염 합성효소이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 포스포리보실포르밀글리신아미딘 합성효소 I 또는 II이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 포스포리보실아미노이미다졸-숙시노카르복사이미드 합성효소이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 carB이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 carA이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 thyA이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 mgsA이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 aroB이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 hepB이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 rluB이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ilvB이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ilvN이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 alsS이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 fabF이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 fabH이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 슈도우리딘 합성효소이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 pyrG이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 truA이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 pabB이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 atp 합성효소 유전자이다(예를 들어, atpC , atpD -2, aptG , atpA -2 등).
다른 실시예에서, 상기 유전자는 phoP이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 aroA이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 aroC이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 aroD이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 plcB이다.
다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 펩타이드 수송체가 결핍되어 있다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ABC 수송체/ATP-결합/투과효소 단백질이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 올리고 펩타이드 ABC 수송체/올리고펩타이드-결합 단백질이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 올리고펩타이드 ABC 수송체/투과효소 단백질이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 아연 ABC 수송체/아연-결합 단백질이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 설탕 ABC 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 인산염 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 ZIP 아연 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 EmrB/QacA 과의 약물 내성 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 황산염 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 양성자-의존성 올리고펩타이드 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 마그네슘 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 포름산염/아질산염 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 스퍼미딘/퓨트레신 ABC 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 Na/Pi-공동수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 설탕 인산염 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 글루타민 ABC 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 주 촉진자(Major Facilitator) 과 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 글리신 베타인/L-프롤린 ABC 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 몰리브덴 ABC 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 테코익산 ABC 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 코발트 ABC 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 암모늄 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 아미노산 ABC 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 세포 분열 ABC 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 망간 ABC 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 철 화합물 ABC 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 말토오스/말토덱스트린 ABC 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 Bcr/CflA 과 약물 내성 수송체이다. 다른 실시예에서, 상기 유전자는 상기한 단백질(들) 중 하나의 서브유닛이다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 것은 재조합 리스테리아에 도달하기 위해 리스테리아를 형질전환시키는 데 사용되는 핵산 분자이다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 핵산은 독성 유전자가 결여된 리스테리아를 형질전환시키는 데 사용된다. 다른 실시예에서, 핵산 분자는 리스테리아 게놈 내에 통합되고 비-작용성 독성 유전자를 운반한다. 다른 실시예에서, 독성 유전자는 재조합 리스테리아 게놈에서 변이된다. 다른 실시예에서, 상기 핵산 분자는 리스테리아 게놈에 존재하는 내인성 유전자를 비활성화시키는 데에 사용된다. 다른 실시예에서, 독성 유전자는 actA 유전자, inlA 유전자, 및 inlB 유전자, inlC 유전자, inlJ 유전자, plbC 유전자, bsh 유전자, 또는 prfA 유전자이다. 독성 유전자는 재조합 리스테리아 내의 독성과 연관될 수 있다고 공지된 임의의 유전자일 수 있다는 것이 숙련자에 의해 이해되어야 한다.
또 다른 실시예에서, 상기 리스테리아 균주는 inlA 돌연변이체, inlB 돌연변이체, inlC 돌연변이체, inlJ 돌연변이체, prfA 돌연변이체, actA 돌연변이체, dal/dat 돌연변이체, prfA 돌연변이체, plcB 결실 돌연변이체, 또는 plcA와 plcB 둘 모두가 결여된 이중 돌연변이체이다. 다른 실시예에서, 리스테리아는 이 유전자들의 개별적 또는 조합 형태의 결실 또는 돌연변이를 포함한다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 리스테리아는 유전자들 중 각각 하나가 결여되어 있다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 리스테리아는 actA, prfA 및 dal/dat 유전자를 포함하여, 본원에 개시된 임의의 유전자 중 적어도 하나 및 최대 10개까지 결여되어 있다. 다른 실시예에서, prfA 돌연변이체는 D133V prfA 돌연변이체이다.
일 실시예에서, 살아 있는 약독화 리스테리아는 재조합 리스테리아이다. 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 게놈 internalin C(inlC) 유전자의 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 게놈 actA 유전자 및 게놈 internalin C 유전자의 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 일 실시예에서, 인접하는 세포로의 리스테리아의 전위(translocation)는 actA 유전자 및/또는 inlC 유전자의 결실에 의해 억제되는데, 이는 상기 과정에 연관되어서, 백신 골격으로서 증가된 면역원성 및 유용성을 가지고 예기치 않게 높은 수준의 약독화 결과를 야기하게 된다.
일 실시예에서, 대사 유전자, 독성 유전자 등은 리스테리아 균주의 염색체가 결여되어 있다. 다른 실시예에서, 대사 유전자, 독성 유전자 등에는 리스테리아 균주의 게놈이 결여되어 있다. 일 실시예에서, 독성 유전자는 염색체에서 돌연변이된다. 다른 실시예에서, 독성 유전자는 염색체로부터 결실된다. 다른 실시예에서, 독성 유전자는 염색체에서 비활성화된다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 약독화된다. 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 actA 독성 유전자가 결여되어 있다. 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 prfA 독성 유전자가 결여되어 있다. 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 inlB 유전자가 결여되어 있다. 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 상기 actA와 inlB 유전자가 모두 결여되어 있다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 내인성 inlB 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 내인성 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA 및 inlB 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA 및 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA, inlB 및 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA, inlB 및 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 내인성 actA, inlB 및 inlC 유전자의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 다음과 같은 유전자들 중 임의의 하나의 유전자 또는 조합의 불활성화 돌연변이를 포함한다: actA , dal , dat, inlB , inlC , prfA , plcA , plcB. 일 실시예에서, 게놈 독성 유전자를 참조하는 경우, 용어 "결여"는, 독성 유전자가 결실되거나(부분적 결실 또는 전체 결실) 그렇지 않다면 염색체로부터 기능적으로 발현되지 않는 것을 의미한다. 이러한 용어는 또한 염색체 내의 병독성 유전자의 부분 결실 또는 전체 유전자 결실은 포함한다.
당업자는, 용어 "돌연변이" 및 그 문법적 등가물은, 서열(핵산 또는 아미노산 서열)에 대한 돌연변이 또는 변형 중 임의의 유형을 포함하며, 아미노산 결실 돌연변이, 치환, 대체, 말단 절단(truncation), 불활성화, 파괴(disruption) 또는 전위를 포함함을 이해할 것이다. 이러한 종류의 돌연변이는 본 기술분야에 쉽게 공지되어 있다.
일 실시예에서, 대사효소를 인코딩하는 플라스미드 또는 본원에 개시된 보완 유전자를 포함하는 영양 요구성 박테리아를 선택하기 위해, 형질전환된 영양 요구성 박테리아는 아미노산 대사 유전자 또는 보완 유전자의 발현을 선택하게 될 배지 상에서 성장된다. 다른 실시예에서, D-글루탐산 합성을 위한 영양 요구성 세균은 D-글루탐산 합성을 위한 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환되고, 영양 요구성 세균은 D-글루탐산의 부재에서 성장할 것이며, 플라스미드로 형질전환되지 않았거나, 또는 D-글루탐산 합성을 위한 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 발현하지 않는 영양 요구성 세균은 성장하지 않을 것이다. 다른 실시예에서, 본 발명의 플라스미드를 발현할 때, D-알라닌 합성을 위한 영양 요구성 박테리아는, 형질전환되고, 플라스미드가 D-알라닌 합성을 위한 아미노산 대사 효소를 인코딩하는 분리된 핵산을 포함한다면, D-알라닌 부재 시 성장할 것이다. 필요한 성장 인자, 보충제, 아미노산, 비타민, 항생제 기타 등등을 포함하거나 결여된 적절한 배지를 제조하는 이러한 방법은, 본 기술분야에서 주지되어 있고, Becton-Dickinson(프랭클린 레이크스, 뉴저지주)에서 시판되고 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 플라스미드를 포함하는 영양 요구성 박테리아가 적절한 배지에 선별되었다면, 박테리아는 선택적 압력의 존재에서 전파된다. 이러한 전파는 영양 요구성 인자 없는 배지에서 세균을 성장시키는 것을 포함한다. 영양 요구성 세균 내의 아미노산 대사효소를 발현하는 플라스미드의 존재는 이 플라스미드가 세균과 함께 복제할 것이며, 이에 따라 지속적으로 플라스미드를 숨기는 세균을 위해 선별하는 것을 보장한다. 숙련자라면, 본 발명과 본원에서의 방법들이 장착되는 경우, 플라스미드를 포함하는 영양 요구성 세균이 성장하고 있는 배지의 부피를 조정함으로써 리스테리아 백신 벡터의 생산 규모를 용이하게 크게 할 수 있을 것이다.
숙련자라면 다른 실시예에서, 다른 영양 요구성 균주들과 보완 시스템이 본 발명에 사용하기 위해 채택된다는 것을 이해할 것이다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주는 본원에 개시된 키메라 단백질을 발현한다. 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아 균주는 키메라 단백질을 인코딩하는 플라스미드를 포함한다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 재조합 핵산은 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주 내 플라스미드 내에 있다. 다른 실시예에서, 플라스미드는 상기 재조합 리스테리아 균주의 염색체에 통합하지 않는 에피솜 플라스미드이다. 다른 실시예에서, 플라스미드는 멀티카피 플라스미드이다. 다른 실시예에서, 플라스미드는 상기 리스테리아 균주의 염색체에 통합하는 통합 플라스미드(integrative plasmid)이다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 바와 같은 재조합 리스테리아 균주는 종양 연관된 펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
다른 실시예에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물의 재조합 리스테리아 균주는 내인성 ActA 서열과 함께 개방 해독 프레임으로서 상기 리스테리아 게놈에 작동 가능하게 통합된 핵산 분자를 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물의 재조합 리스테리아 균주는 유비퀴틴 단백질에 대해 아미노-말단에 융합된 펩타이드 항원을 포함하는 키메라 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 에피솜 발현 벡터를 포함한다. 일 실시예에서, 펩타이드 항원의 발현 및 분비는 actA 프로모터 및 ActA 신호 서열의 조절 하에 있으며, ActA(말단 절단된 ActA 또는 tActA)의 1 내지 233개의 아미노산에 융합되어 발현된다. 다른 실시예에서, 펩타이드 항원의 발현 및 분비는 actA 프로모터 및 ActA 신호 서열의 조절 하에 있으며, ActA(말단 절단된 ActA 또는 tActA)의 1 내지 100개의 아미노산에 융합되어 발현된다. 다른 실시예에서, 펩타이드 항원의 발현 및 분비는 actA 프로모터 및 ActA 신호 서열의 조절 하에 있으며, ActA(말단 절단된 ActA 또는 tActA)의 1 내지 300개의 아미노산에 융합되어 발현된다. 다른 실시예에서, 절단된 ActA는, 이의 전체가 본원에 참조로서 통합된 미국 특허 일련 번호 제7,655,238호에 기재된 바와 같이 야생형 ActA 단백질의 처음 390개 아미노산으로 구성된다. 다른 실시예에서, 말단이 절단된 ActA는 ActA-N100 또는 이의 개질된 버전(ActA-N100*으로서 언급됨)이며, 여기에서 미국 특허 공개 일련 번호 제2014/0186387호에 기재된 바와 같이 PEST 모티프가 결실되고 비보존성 QDNKR 치환을 함유한다.
다른 실시예에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물의 재조합 리스테리아 균주는 내인성 LLO 서열과 함께 개방 해독 프레임으로서 상기 리스테리아 게놈에 작동 가능하게 통합된 핵산 분자를 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물의 재조합 리스테리아 균주는 유비퀴틴 단백질에 대해 아미노-말단에 융합된 펩타이드 항원을 포함하는 키메라 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 에피솜 발현 벡터를 포함한다. 일 실시예에서, 펩타이드 항원의 발현 및 분비는 LLO 프로모터 및 LLO 신호 서열의 조절 하에 있으며, LLO(말단 절단된 LLO 또는 tLLO)의 1 내지 50개의 아미노산에 융합되어 발현된다. 다른 실시예에서, 펩타이드 항원의 발현 및 분비는 LLO 프로모터 및 LLO 신호 서열의 조절 하에 있으며, LLO(말단 절단된 LLO 또는 tLLO)의 1 내지 100개의 아미노산에 융합되어 발현된다. 다른 실시예에서, 펩타이드 항원의 발현 및 분비는 LLO 프로모터 및 LLO 신호 서열의 조절 하에 있으며, LLO(말단 절단된 LLO 또는 tLLO)의 1 내지 300개의 아미노산에 융합되어 발현된다. 다른 실시예에서, 말단 절단된 LLO는 야생형 LLO의 처음 420개의 아미노산들로 이루어진다.
일 실시예에서, CTL 활성은 나이브 동물 또는 비관련 리스테리아 백신이 주입된 마우스에서는 검출되지 않는다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 키메라 단백질을 발현하는 약독화된 영양요구성 균주는 IFN-g 의 분비를 자극하고 항종양 면역 반응을 유도할 수 있다.
다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 펩타이드 항원을 향한 내성을 파괴하는 능력을 가진 강력하고 항원 특이적인 항종양 반응을 발휘한다.
일 실시예에서, dal/dat/actA 균주는, 면역화된 마우스의 비장으로부터 더 신속하게 청소되기 때문에 매우 약독화되고, 종래 리스테리아 백신 세대보다 더 양호한 안전성 프로필을 가진다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 종양내 T 조절 세포(Treg)의 상당한 감소를 야기한다. 다른 실시예에서, LmddA 백신으로 처리된 종양에서의 Treg의 더 낮은 빈도는 증가된 종양내 CD8/Treg 비율을 야기하며, 이는 더 유망한 종양 미세환경이 LmddA 백신으로의 면역화 후 수득될 수 있음을 제안한다.
일 실시예에서, 용어 "펩타이드 항원"은 하기 용어들, "항원", "항원 단편", "항원성 펩타이드" 또는 "항원 펩타이드"와 상호호환적으로 사용된다. 당업자는, 용어 "펩타이드 항원"이 항원 제시 세포(APC) 상에 주 조직적합성 복합체(MHC)를 통해 제시될 때 면역 반응을 유도할 수 있는 이종성 항원 또는 이의 단편을 포함함을 이해할 것이다.
본원에서 열거된 임의의 아미노산 서열에 대한 단백질 및/또는 펩티드 상동성은, 일 실시예에서, 면역블롯 분석법을 포함하는 본 분야에서 널리 기재된 방법에 의해 또는 구축된 방법을 통해, 입수 가능한 임의의 많은 소프트웨어 패키지를 사용하여 아미노산 서열의 컴퓨터 알고리즘 분석을 통해 결정된다. 이들 패키지의 일부는 FASTA, BLAST, MPsrch 또는 Scanps 패키지를 포함할 수 있으며, Smith 및 Waterman 알고리즘, 및/또는 예를 들어, 분석을 위해 국제/지역 또는 BLOCKS 정렬의 이용을 사용할 수 있다.
다른 실시예에서, 본원에 개시된 작제물 또는 핵산 분자는 상동성 재조합을 이용하여 리스테리아 염색체에 통합된다. 상동성 재조합을 위한 기술은 본 분야에서 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, Baloglu S, Boyle SM, 외. (Immune responses of mice to vaccinia virus recombinants expressing either Listeria monocytogenes partial listeriolysin or Brucella abortus ribosomal L7/L12 protein. Vet Microbiol 2005, 109(1-2): 11-7); 및 Jiang LL, Song HH, 외,(Characterization of a mutant Listeriamonocytogenes strain expressing green fluorescent protein. Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai) 2005, 37(1): 19-24)에 기재되어 있다. 다른 실시예에서, 동종 재조합은 미국 특허 번호 제6,855,320호에 기재된 바와 같이 실행된다. 이 경우, E7을 발현하는 재조합체 Lm 균주는, Lm-AZ/E7이라 칭하는 재조합체를 형성하게끔 유전자 산물의 분비를 확실히 하도록 hly 신호 서열의 포함 및 hly 촉진자의 제어 하에 E7 유전자의 염색체 통합에 의해 제조되었다. 다른 실시예에서, 온도 민감성 플라스미드가 재조합체를 선별하기 위해 사용된다.
다른 실시예에서, 구성체 또는 핵산 분자는 트랜스포손 삽입을 이용하여 리스테리아 염색체에 통합된다. 트랜스포존 삽입을 위한 기술은 본 분야에서 널리 공지되어 있으며, 그 중에서, Sun 외. 문헌에 기재되어 있다 DP-L967의 구성물에서 (Infection and Immunity 1990, 58: 3770-3778). 트랜스포존 돌연변이 생성은, 다른 실시예에서, 안정한 게놈 삽입 돌연변이가 형성될 수 있는 이점을 갖지만 외부 유전자가 삽입된 게놈에서의 위치가 공지되지 않은 단점을 갖는다.
다른 실시예에서, 구성물 또는 핵산 분자는 파지 통합 부위를 사용하여 리스테리아 염색체 내로 통합된다(Lauer P, Chow MY 외, Construction, characterization, and use of two Listeria monocytogenes site-specific phage integration vectors. J Bacteriol 2002; 184(15):4177-86). 이 방법의 특정 실시예에서, 박테리오파지(예를 들어, U153 또는 PSA 리스테리오파지)의 인테그라제 유전자 및 부착 부위는 이종 유전자를 상응하는 부착 부위 내로 삽입하기 위해 사용되며, 이는 게놈 내에서의 임의의 적절한 부위일 수 있다(예를 들어, arg tRNA 유전자의 comK 또는 3' 말단). 다른 실시예에서, 내인성 프로파지는 구성물 또는 이종 유전자의 통합 전에 사용되는 부착 부위로부터 치유된다. 다른 실시예에서, 이 방법은 단일-카피 통합물을 야기한다. 다른 실시예에서, 본 발명은, 임상 적용을 위한 파지-기반 염색체 통합 시스템을 더 포함하며, 이러한 적용에서 d-알라닌 라세마제 를 포함하지만 이에 한정되지 않는 필수 효소를 위한 영양 요구성 숙주 균주, 예를 들어, Lmdal(-)dat(-)를 사용할 수 있다. 다른 실시예에서는, "파지 치료 단계"를 피하도록, PSA에 기초하는 파지 통합 시스템을 사용한다. 다른 실시예에서, 통합된 유전자를 유지하기 위해 항생제에 의한 지속적인 선별을 필요로 한다. 그러므로, 다른 실시예에서, 본 발명은 항생제를 사용한 선택을 필요로 하지 않는 파지-기반 염색체 통합 시스템의 구축을 가능하게 한다. 대신, 영양 요구성 숙주 균주가 상보화될 수 있다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 일 실시예에서, 용어 "재조합 부위" 또는 "부위-특이적 재조합 부위"는 재조합 부위에 인접한 핵산 분절의 교환 또는 절단을 매개하는 리컴비라제(일부 경우에 연관된 단백질과 함께)에 의해 인지되는 핵산 분자 내의 염기 서열을 지칭한다. 재조합효소 및 연관 단백질은 총칭하여 "재조합 단백질"이라 칭하며, 예를 들어, Landy, A.,(Current Opinion in Genetics & Development) 3:699-707; 1993)를 참조한다.
당업자는, 용어 "벡터"가 플라스미드를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 다른 실시예에서, 상기 용어는 통합 벡터에 의해 포함된 유전자의 발현을 허용하는 방식으로 리스테리아 숙주 내로 형질전환되고 리스테리아 염색체에 혼입될 수 있는 상기 통합 벡터를 지칭한다. 다른 실시예에서, 상기 용어는 리스테리아 염색체에 통합되지 않으나 그 대신 상기 리스테리아의 세포질에 존재하는 비-통합 벡터를 지칭한다. 다른 실시예에서, 상기 용어는 통합 벡터를 포함하는 플라스미드를 의미한다. 다른 실시예에서, 통합 벡터는 자리-특이적 통합 벡터이다.
본 개시내용 및 본원에 개시된 방법에 따라 구비될 때, 당업자는 상이한 전사 프로모터, 종결자, 담체 벡터 또는 특이 유전자 서열(예를 들어, 상업적으로 입수 가능한 클로닝 벡터 내의 것들)이 본 발명의 방법 및 조성물에서 성공적으로 사용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 본 발명에서 고려되는 바와 같이, 이들 기능성은 예를 들어, pUC 시리즈로서 공지된 상업적으로 입수 가능한 벡터로 제공된다. 다른 실시예에서, 비-필수 DNA 서열(예를 들어, 항생제 저항 유전자)은 제거된다. 다른 실시예에서, 상업적으로 입수 가능한 플라스미드가 본 발명에서 사용된다. 이러한 플라스미드는 다양한 원천, 예를 들어, Invitrogen(라호야, 캘리포니아주), Stratagene(라호야, 캘리포니아주), Clontech (팔로 알토, 캘리포니아주)으로부터 입수 가능하거나 본 분야에서 널리 공지된 방법을 사용하여 구성될 수 있다.
다른 실시예는 복제의 원핵 기원 및 원핵 생물에서 발현을 용이하게 하기 위한 프로모터/발현 요소를 갖는 원핵 발현 벡터인 pCR2.1(Invitrogen, 라호야, 캘리포니아주)와 같은 플라스미드이다. 다른 실시예에서, 외인성 뉴클레오티드 서열은 플라스미드의 크기를 줄이고 여기에 위치될 수 있는 카세트의 크기를 증가시키기 위해 제거된다.
이러한 방법은 본 기술분야에 주지되어 있고, 예를 들면, Sambrook 외. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) 및 Ausubei 외. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York)에 기재되어 있다.
항생제 저항 유전자는 분자 생물학 및 백신 제조에서 일반적으로 사용되는 종래의 선별 및 클로닝 공정에서 사용된다. 본 발명에서 고려되는 항생제 저항 유전자는 암피실린, 페니실린, 메티실린, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜(CAT), 네오마이신, 히그로마이신, 겐타마이신 및 당업계에 널리 공지된 다른의 것에 대해 내성을 부여하는 유전자 산물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 유용한 플라스미드 및 다른 발현 벡터는 본원의 다른 곳에 기재되며, 프로모터/조절 서열, 그램 음성 박테리아 및 그램 양성 박테리아의 복제 기원, 융합 단백질을 인코딩하는 분리된 핵산 및 아미노산 대사 유전자를 인코딩하는 분리된 핵산과 같은 이러한 특징을 포함할 수 있다. 또한, 융합 단백질 및 아미노산 대사 유전자를 인코딩하는 분리된 핵산은 이러한 분리된 핵산의 발현을 구동하는데 적합한 프로모터를 가질 것이다. 박테리아 시스템에서 발현을 구동하는데 유용한 프로모터는 본 분야에서 널리 공지되며, 박테리오파지 람다, pBR322의 베타-락타마제 유전자의 bla 프로모터, 및 pBR325의 클로람페니콜 아세틸 전이효소 유전자의 CAT 프로모터를 포함한다. 원핵 프로모터의 추가 예는 5개 박테리오파지 람다(PL 및 PR)의 주요 우측 및 좌측 프로모터인 E. coli의 trp, recA, lacZ, lad, 및 gal 프로모터, B. 서브틸리스의 알파-아밀라제(Ulmanen 외, 1985.J. Bacteriol. 162:176-182) 및 S28-특이 프로모터(Gilman 외, 1984 Gene 32:11- 20), 바실러스의 박테리오파지의 프로모터(Gryczan, 1982, In: The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., New York), 및 스트렙토마이세스 프로모터(Ward 외, 1986, Mol. Gen. Genet. 203: 468-478)를 포함한다. 본 발명에서 고려되는 추가 원핵 프로모터는 예를 들어, Glick의 문헌(1987, J. Ind. Microbiol.1:277-282); Cenatiempo의 문헌(1986, Biochimie, 68:505-516); 및 Gottesman의 문헌(1984, Ann.Rev. Genet.18:415-442)에서 검토된다. 본 발명에서 고려되는 프로모터/조절 요소의 추가 예는 리스테리아 prfA 프로모터, 리스테리아 hly 프로모터, 리스테리아 p60 프로모터 및 리스테리아 ActA 프로모터(GenBank 수탁. 번호. NC_003210) 또는 이들의 단편들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물의 플라스미드는 적절한 제한 효소를 사용하여 절단된 서열 및 클로닝된 적절한 서열을 포함한다. 그런 다음, 다른 실시예에서, 단편은 원하는 DNA 서열에 융합된다. 다른 실시예에서, 항원을 인코딩하는 DNA는 DNA 증폭 방법, 예를 들어 당업계에 널리 공지된 기법인 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 생성된다.
"파지 발현 벡터" 또는 "파지미드"는 시험관내 또는 생체내, 구성적으로 또는 유도적으로, 원핵, 효모, 진균류, 식물, 곤충 또는 포유류 세포를 포함한 임의의 세포에서 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물의 핵산 서열을 발현하는 목적을 위한 임의의 파지-기반 재조합 발현 시스템을 지칭한다. 파지 발현 벡터는 전형적으로 박테리아 세포내에서 재생되고 적절한 조건 하에서 파지 입자를 생산할 수 있다. 용어는 선형 또는 순환 발현 시스템을 포함하며 에피솜을 유지하거나 숙주 세포 게놈 내로 통합하는 파지-기반 발현 벡터 둘 다를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 임상 적용을 위해 파지 기반 염색체 통합 시스템을 추가로 포함한다. d-알라닌 라세미화 효소를 포함하나, 이에 제한되지 않는 필수 효소에 대해 영양요구성인 숙주 균주가 사용될 것이며, 예를 들어 Lmdal(-)dat(-)이다. 다른 실시예에서, "파지 치유 단계"를 피하기 위해, PSA에 근거한 파지 통합 시스템이 사용된다(Lauer 외, 2002 J Bacteriol, 184: 4177-4186). 다른 실시예에서, 통합된 유전자를 유지하기 위해 항생제에 의한 지속적인 선별을 필요로 한다. 그러므로, 다른 실시예에서, 본 발명은 항생제를 사용한 선택을 필요로 하지 않는 파지-기반 염색체 통합 시스템의 구축을 가능하게 한다. 대신에, 영양요구성 숙주 균주가 고려될 것이다.
본 발명의 키메라 단백질은 다른 실시예에서, 재조합 DNA 방법을 사용하여 합성된다. 일 실시예에서, 이러한 방법은 키메라 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 생성하고, 특정 프로모터/조절 요소의 조절 하에 본 발명의 플라스미드와 같은 발현 카세트 내에 DNA를 위치시키고, 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. 본 발명의 키메라 단백질을 인코딩하는 DNA(예를 들어, SS-Ub-펩타이드)는, 다른 실시예에서, 예를 들면, 임의의 적합한 방법에 의해 제조되는데, 예컨대 Narang 외의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth. Enzymol. 66: 90-99); Brown 외의 포스포디에스테르의 방법(1979, Meth. Enzymol 68: 109-151); Beaucage 외의 디에틸소스포아미다이트 방법(1981, Tetra. Lett., 22: 15 1859-1862); 및 미국특허 제4,458,066호의 고체 지지 방법과 같은 방법에 의한 적절한 서열 또는 직접적 화학 합성의 클로닝 및 제한을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명의 키메라 단백질 또는 재조합 단백질을 인코딩하는 DNA는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 DNA 증폭 방법을 사용하여 클로닝된다. 다른 실시예에서, 화학 합성은 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드를 생산하는데 사용된다. 다양한 실시예에서, 이 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 상보적 서열과의 혼성화에 의해, 또는 주형으로서 단일 가닥을 사용하는 DNA 폴리머라제로의 고분자화에 의해 이중 가닥 DNA로 전환된다. DNA의 화학적 합성은 약 100개 염기의 서열에 국한되며, 더 긴 서열은 더 짧은 서열의 연결에 의해 수득될 수 있음을 본 분야의 숙련자가 인지할 것이다. 다른 실시예에서, 부분 서열들은 클로닝되고, 적절한 부분 서열들은 적절한 제한 효소를 사용하여 절단된다. 그런 다음, 단편은 원하는 DNA 서열을 생산하기 위해 연결된다.
다른 실시예에서, 본원에 개시된 키메라 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 E. coli, 다른 박테리아 숙주, 예컨대 리스테리아, 효모 및 다양한 고등 진핵 세포, 예컨대 COS, CHO 및 HeLa 세포주 및 골육종 세포주를 포함하는 다양한 숙주 세포로 형질전환된다. 본원에 개시된 키메라 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 각각의 숙주 세포에 대한 적절한 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 프로모터/조절 서열은 본원의 다른 곳에서 상세히 기재된다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 키메라 단백질을 인코딩하는 플라스미드는 추가 프로모터 조절 요소뿐만 아니라 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 신호도 추가로 포함한다. 진핵 세포에서, 조절 서열은 프로모터 및 예를 들어, 면역글로불린 유전자, SV40, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유래된 증강제, 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 것이다. 다른 실시예에서, 서열은 스플라이스 공여자 및 수여자 서열을 포함한다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 플라스미드는 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 키메라 단백질의 인코딩을 허용하는 적어도 하나의 리보솜 결합 부위 및 적어도 하나의 전사 종결 신호를 포함하며, 상기 키메라 단백질은 각각 상이한 펩타이드 항원을 포함한다. 일 실시예에서, 본원에 개시된 플라스미드는 본원에 개시된 바와 같은 1개 내지 4개의 키메라 단백질의 인코딩을 허용하는 1개 내지 4개의 리보솜 결합 리보솜 결합 부위 및 1개 내지 4개의 전사 종결 신호를 포함하며, 상기 키메라 단백질은 각각 상이한 펩타이드 항원을 포함한다. 일 실시예에서, 본원에 개시된 플라스미드는 본원에 개시된 바와 같은 5개 내지 10개의 키메라 단백질의 인코딩을 허용하는 5개 내지 10개의 리보솜 결합 리보솜 결합 부위 및 5개 내지 10개의 전사 종결 신호를 포함하며, 상기 키메라 단백질은 각각 상이한 펩타이드 항원을 포함한다. 일 실시예에서, 본원에 개시된 플라스미드는 본원에 개시된 바와 같은 11개 내지 20개의 키메라 단백질의 인코딩을 허용하는 11개 내지 20개의 리보솜 결합 리보솜 결합 부위 및 11개 내지 20개의 전사 종결 신호를 포함하며, 상기 키메라 단백질은 각각 상이한 펩타이드 항원을 포함한다. 일 실시예에서, 본원에 개시된 플라스미드는 본원에 개시된 바와 같은 21개 내지 30개의 키메라 단백질의 인코딩을 허용하는 21개 내지 30개의 리보솜 결합 리보솜 결합 부위 및 21개 내지 30개의 전사 종결 신호를 포함하며, 상기 키메라 단백질은 각각 상이한 펩타이드 항원을 포함한다. 다른 실시예에서, 리보솜 결합 부위는 샤인-달가노 리보솜 결합 부위이다.
일 실시예에서, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 전사 및 번역 조절 핵산이 전사가 개시되는 방식으로 임의의 코딩 서열에 대해 위치된다는 것을 의미한다. 일반적으로, 이는 프로모터 및 전사 개시 또는 개시 서열이 코딩 영역의 5'에 위치한다는 것을 의미한다. 다른 실시예에서, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 기재된 바와 같은 성분이 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 하기 위해 관계하는 병렬을 지칭한다. 코딩 서열에 대해 "작동적으로 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 양립될 수 있는 조건 하에서 달성되는 방식으로 연결된다. 다른 실시예에서, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 키메라 단백질 또는 폴리펩타이드가 의도된 대로 기능하는 발현을 야기하기 위해 각각 단백질 또는 펩타이드를 인코딩하는 전사 단위에서 몇몇의 개방 해독 프레임의 접합을 지칭한다.
일 실시예에서, "개방 해독 프레임" 또는 "ORF"는 단백질을 잠재적으로 인코딩할 수 있는 염기의 서열을 함유하는 유기체의 게놈의 부분이다. 다른 실시예에서, ORF의 시작 및 종료 말단은 mRNA의 말단과 동일하지 않으나, 이들은 mRNA 내에 일반적으로 함유된다. 일 실시예에서, ORF는 유전자의 시작-코드 서열(개시 코돈) 및 종료-코돈(종결 코돈) 사이에 위치한다. 그러므로, 일 실시예에서, 내인성 폴리펩타이드를 갖는 개방 해독 프레임으로서 게놈 내에 작동 가능하게 통합된 핵산 분자는 내인성 폴리펩타이드와 동일한 개방 해독 프레임에서 게놈 내로 통합된 핵산 분자이다.
일 실시예에서, 본 발명은 링커 서열을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다. 당업자는, "링커 서열"이 2개의 이종성 폴리펩타이드 또는 이의 단편 또는 도메인을 접합시키는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 링커는 상기 폴리펩타이드들을 공유 연결시켜 융합 폴리펩타이드를 형성하는 아미노산 서열이다. 전형적으로, 링커는 디스플레이 단백질 및 개방 구조 틀에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 생성하기 위해 디스플레이 벡터로부터 리포터 유전자를 제거한 후 나머지 재조합 신호로부터 번역된 아미노산을 포함한다. 숙련자에게 이해되는 바와 같이, 상기 링커는 글리신 및 기타 소(small) 중성 아미노산과 같은 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 용어 "내인성"은 참조 유기체 내에서 발생 또는 유래하였거나 참조 유기체 내의 원인으로부터 발생된 사항을 설명한다. 예를 들어, 내인성은 고유(native)를 지칭한다.
본원에 개시된 재조합 단백질 또는 키메라 단백질은, 예를 들어 적절한 서열의 클로닝 및 제한을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해, 또는 후술하는 방법들에 의한 직접적인 화학 합성에 의해 제조될 수 있다. 그렇지 않으면, 서브서열이 클로닝될 수 있으며 적절한 서브 서열이 적절한 제한 효소를 사용하여 절단될 수 있다. 그런 다음, 단편은 원하는 DNA 서열을 제조하도록 연결될 수 있다. 일 실시예에서, 항원을 인코딩하는 DNA는 DNA 증폭 방법, 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 제조될 수 있다. 먼저, 새로운 말단의 양측 상의 고유 DNA의 세그먼트들이 개별적으로 증폭된다. 증폭된 하나의 서열의 5' 말단은 펩타이드 링커를 인코딩하는 한편, 다른 증폭된 서열의 3' 말단도 펩타이드 링커를 암호화한다. 제1 단편의 5' 말단은 제2 단편의 3' 말단에 대하여 상보적이므로, (예를 들어, LM 아가로스 상의 부분적 정제 후의) 그 두 개의 단편은, 제3 PCR 반응에 있어서 중첩 템플릿 상에서 사용될 수 있다. 증폭된 서열은, 코돈, (이제 아미노 서열을 형성하는) 개구 부위의 카르복시측 상의 세그먼트, 링커, 및 (이제 카르복실 서열을 형성하는) 개구 부위의 아미노측의 서열을 함유한다. 항원은 플라스미드 내로 연결된다.
"안정적으로 유지된다"는 것은, 검출 가능한 손실 없이 10세대 동안 선택(예를 들어, 항생제 선택)의 부재에서 핵산 분자 또는 플라스미드의 유지를 지칭한다. 다른 실시예에서, 기간은 15세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 20세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 25세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 30세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 40세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 50세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 60세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 80세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 100세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 150세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 200세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 300세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 500세대이다. 다른 실시예에서, 기간은 세대들보다 길다. 다른 실시예에서, 핵산 분자 또는 플라스미드는 실험관내(예를 들어, 배양에서) 안정적으로 유지된다. 다른 실시예에서, 핵산 분자 또는 플라스미드는 생체내에서 안정적으로 유지된다. 다른 실시예에서, 핵산 분자 또는 플라스미드는 실험관내 및 생체내 둘 다에서 안정적으로 유지된다.
다른 실시예에서, "기능성 단편"은 면역원성 단편이며, 대상체에게 단독으로 또는 본원에서 개시된 치료 조성물로 투여될 때 면역 반응을 유도한다. 예를 들어, 기능성 단편은 당업자에 의해 이해될 것이고 본원에서 더 제공되는 바와 같이, 생물학적 활성을 가지고 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능성 단편"은 용어 "면역원성 단편"과 상호호환적으로 사용된다.
용어 "면역원성", "면역원적" 또는 이들의 문법적 등가물은 단백질, 펩타이드, 핵산, 항원 또는 유기체가 동물에게 투여될 때, 인간 또는 비-인간 동물에서 면역 반응을 유도하는 상기 단백질, 펩타이드, 핵산, 항원 또는 유기체의 내재 능력(innate ability)을 지칭할 수 있다. 따라서, "면역원성의 증강"은, 단백질, 펩타이드, 핵산, 항원 또는 유기체를 동물에 투여 시 동물에서 면역 반응을 유도하는 상기 단백질, 펩타이드, 핵산, 항원 또는 유기체의 능력의 증가를 지칭할 수 있다. 상기 면역 반응을 유도하는 단백질, 펩타이드, 핵산, 항원 또는 유기체의 향상된 능력은, 일 실시예에서, 단백질, 펩타이드, 핵산, 항원 또는 유기체에 대한 항체 수의 증가, 항원 또는 유기체에 대한 항체의 다양성 증가, 단백질, 펩타이드, 핵산, 항원 또는 유기체에 특이적인 T-세포 수의 증가, 단백질, 펩타이드, 핵산, 항원 또는 유기체에 대한 세포독성 또는 헬퍼 T-세포 반응의 증가 등에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물의 재조합 리스테리아 균주는, 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아 모노사이토게네스 균주이다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 실링게리 균주이다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 그라이 균주이다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 이바노비 균주이다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 무라이 균주이다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 웰쉬메리 균주이다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 다른 리스테리아 종의 재조합 균주이다.
일 실시예에서, 약독화 리스테리아 균주, 예컨대 LM 델타-actA 돌연변이체(Brundage 등의, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11890-11894), L. 모노사이토게네스 델타-plcA(Camilli 등의, 1991, J. Exp. Med., 173:751-754), 또는 델타-ActA, 델타 INL-b(Brockstedt et 5 al, 2004, PNAS, 101:13832-13837) 이 본 발명에서 사용된다. 다른 실시예에서, 약독화 리스테리아 균주는 하나 이상의 약독화 돌연변이를 도입하여 구성되며, 이는 본원에서 기재된 바와 같이 갖춰졌을 때 평균의 숙련자에게 이해될 것이다. 이러한 균주의 예는 방향족 아미노산에 대해 영양요구성인 리스테리아 균주(Alexander 외, 1993, Infection and Immunity 10 61:2245-2248) 및 리포테이코산의 형성에 대한 돌연변이체(Abachin 외, 2002, Mol. Microbiol. 43:1-14) 및 독성 유전자의 결여에 의해 약독화된 균주(본원의 실시예 참조)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
다른 실시예에서, 본 발명의 재조합 리스테리아 균주는 동물 숙주를 통해 계대되었다. 다른 실시예에서, 상기 계대는 백신 벡터로서 균주의 효능을 극대화한다. 다른 실시예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 면역원성을 안정화시킨다. 다른 실시예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 독성을 안정화시킨다. 다른 실시예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 면역원성을 증가시킨다. 다른 실시예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 독성을 증가시킨다. 다른 실시예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 불안정한 서브-균주를 제거한다. 다른 실시예에서, 상기 계대는 리스테리아 균주의 불안정한 서브-균주의 유병률을 감소시킨다. 다른 실시예에서, 상기 계대는 본원에서 기재된 바와 같이 수행된다. 다른 실시예에서, 상기 계대는 당분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 수행된다.
일 실시예에서, 리스테리아 균주는 본원에 개시된 미니유전자 핵산 작제물의 게놈 삽입을 함유한다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 본원에 개시된 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 플라스미드를 운반한다.
다른 실시예에서, 본 발명의 재조합 핵산은, 리스테리아 균주의 인코딩된 펩타이드의 발현을 구동하는 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 유전자의 기본구성 발현을 구동하는 데 유용한 프로모터/조절 서열은, 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 리스테리아의 PhlyA, PActA, 및 p60 프로모터, Streptococcus bac 프로모터, Streptomyces griseus sgiA 프로모터, 및 B. thuringiensis phaZ 프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
다른 실시예에서, 본 발명의 펩타이드를 인코딩하는 핵산의 유도적이며 조직 특이적인 발현은, 유도성 또는 조직 특이적 프로모터/조절 서열의 조절 하에 펩타이드를 인코딩하는 핵산을 위치시킴으로써 달성된다. 이 목적에 유용한 조직 특이성 또는 유도가능 프로모터/조절 서열의 예는, MMTV LTR 유도가능 프로모터 및 SV40 만기 증강제/프로모터를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 실시예에서는, 금속, 글루코코르티코이드 등의 유도제에 반응하여 유도되는 프로모터를 이용한다. 따라서, 본 발명이, 임의의 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 원하는 단백질의 발현을 구동할 수 있으며 알려져 있는 또는 알려져 있지 않은 임의의 프로모터/조절 서열을 이용하는 것을 포함한다는 점이 이해될 것이다.
당업자는 용어 "이종성"이 참조 종과는 상이한 종으로부터 유래된 핵산, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 단백질을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어, 일 실시예에서 이종성 폴리펩타이드를 발현하는 리스테리아 균주는 리스테리아 균주에 고유적이지 않거나 내인성이 아닌 폴리펩타이드를 발현하거나, 다른 실시예에서는 상기 리스테리아 균주에 의해 정상적으로 발현되지 않는 폴리펩타이드를 발현하거나, 다른 실시예에서는 상기 리스테리아 균주 이외의 소스로부터의 폴리펩타이드를 발현할 것이다. 다른 실시예에서, "이종"은 동일한 종 내의 상이한 생물체로부터 유래된 것을 기술하기 위해 사용될 수 있다.
당업자는 용어 "에피솜 발현 벡터"가 선형 또는 환형일 수 있으며, 통상적으로 이중 가닥 형태이고, 또한 박테리아의 게놈 또는 세포의 게놈에 통합되는 것과는 반대로 숙주 박테리아 또는 숙주 세포의 세포질에 존재한다는 점에서 염색체외적 핵산 벡터를 포함한다는 것을 이해할 것이다. 일 실시예에서, 에피솜 발현 벡터는 관심있는 유전자를 포함한다. 다른 실시예에서, 에피솜 벡터는 박테리아 세포질에서의 다수의 복사를 계속하여, 관심 유전자의 증폭을 야기하며, 일 실시예에서 이러한 관심 유전자는 본원에 개시된 핵산 분자 또는 작제물이다. 다른 실시예에서, 바이러스 트랜스-작용 인자는 필요 시 공급된다. 에피솜 발현 벡터는 본원에서 플라스미드로 지칭될 수 있다. "통합 플라스미드"는 숙주 게놈 내로 운반된 관심 유전자의 삽입 또는 이의 삽입을 표적으로 하는 서열을 포함한다. 다른 실시예에서, 삽입된, 관심 있는 유전자는 세포 DNA로의 통합에 의해 종종 발생하는 규제적인 제약을 받지 않거나 이에 방해받지 않는다. 다른 실시예에서, 삽입된 이종 유전자의 존재는 세포 고유의 중요 영역의 재배치 또는 방해로 이어지지 않는다. 다른 실시예에 따르면, 안정한 형질 감염 과정에서, 에피솜 벡터의 사용은 염색체 통합 플라스미드의 사용 시보다 종종 높은 형질 감염 효율을 초래한다(Belt, P.B.G.M., 등(1991) Efficient cDNA cloning by direct phenotypic correction of mutant human cell line(HPRT2) using Epstein-Barr virus-derived cDNA experssion vector. Nucleic Acids Res. 19, 4861-4866; Mazda, O., 등(1997) Extremely efficient gene transfection into lympho-hemotopoietic cell lines by Epstein-Barr virus-based vectors. J. Immunol. Methods 204, 143-151). 일 실시예에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물의 에피솜 발현 벡터는 생체내, 생체외 또는 시험관내에서, DNA 분자를 세포에 전달하기 위해 사용되는 다양한 방법 중 임의의 것에 의해서 세포에 전달될 수 있다. 또한, 상기 벡터는 단독으로 또는 대상물의 세포로의 수송을 향상하는 약제학적 조성물의 형태로서 수송될 수 있다.
당업자는, 용어 "융합된"이 공유 결합에 의한 작동 가능한 연결을 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 일 실시예에서, 이 용어는 (핵산 서열 또는 이의 개방 해독 프레임의) 재조합 융합을 포함한다. 다른 실시예에서, 이 용어는 화학적 접합을 포함한다.
"형질전환"이란 용어는 플라스미드 또는 다른 이종성 DNA 분자를 취하도록 하는 박테리아 세포의 조작을 포함할 수 있다. "형질전환"은 또한, 플라스미드의 유전자 또는 다른 이종성 DNA 분자를 발현하기 위한 박테리아 세포의 조작을 지칭할 수 있다.
박테리아를 형질전환시키는 방법은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 칼슘-클로라이드 적격 세포-기반 방법, 전기천공 방법, 박테리오파지-매개 형질도입, 화학적 형질전환 및 물리적 형질전환 기법을 포함한다(de Boer 외, 1989, Cell 56:641-649; Miller 외, 1995, FASEB J., 9:190-199; Sambrook 외, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel 외, 1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Gerhardt 외, eds., 1994, method for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, DC; Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). 다른 실시예에서, 본 발명의 리스테리아 백신 균주는 전기천공에 의해 형질전환된다.
다른 실시예에서, 접합은 유전 물질 및/또는 플라스미드를 박테리아 내로 도입하기 위해 사용된다. 접합을 위한 방법은 당분야에 널리 공지되었으며, 예를 들어, Nikodinovic J 외(A second generation snp-derived Escherichia coli-Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation. Plasmid.2006 Nov;56(3):223-7) 및 Auchtung JM 외(Regulation of a Bacillus subtilis mobile genetic element by intercellular signaling and the global DNA damage response. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Aug 30;102(35):12554-9)에 기재되어 있다.
당업자라면, 용어 "약독화"가 동물에서 질환을 야기하는 박테리아의 능력에서의 저하를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 다시 말하면, 약독화된 리스테리아 균주의 병리적 특징은, 야생형 리스테리아에 비해 감소되었지만, 약독화된 리스테리아는 배양액에서 성장 및 유지될 수 있다. 약독화된 리스테리아에 의한 Balb/c 마우스의 정맥 접종을 일례로 사용하여, 접종된 동물들의 50%(LD50)가 생존하는 치사용량이 바람직하게 적어도 약 10배만큼, 더욱 바람직하게 적어도 약 100배만큼, 더욱 바람직하게 적어도 약 1,000배만큼, 더욱 바람직하게 적어도 약 10,000배 만큼, 가장 바람직하게 적어도 약 100,000배만큼 야생형 리스테리아의 LD50을 초과하여 증가한다. 따라서, 리스테리아의 약독화된 균주는, 투여되는 동물을 사멸하지 않는 것, 또는 투여되는 세균의 개수가 동일한 동물을 사멸하는 데 요구되는 야생형 비약독화 세균의 개수보다 매우 많을 때에만 동물을 사멸하는 것이다. 약독화된 세균은, 또한, 그 세균의 성장에 요구되는 영양분이 내부에 존재하지 않기 때문에, 일반적인 환경에서 복제될 수 없는 것을 의미하도록 해석되어야 한다. 따라서, 세균은, 필요 영양소가 제공되는 피제어 환경에서의 복제로 한정된다. 따라서, 본 발명의 약독화된 균주는, 그 균주가 조절되지 않은 복제가 불가능하도록 환경적으로 안전하다.
조성물
다른 실시예에서, 본원에 개시된 키메라 단백질을 인코딩하는 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시되어 있으며, 여기서, 상기 약제학적 조성물을 암을 포함하는 질환을 가진 대상체에게 투여하여 상기 질환 또는 상기 암을 치료하고, 완화시킨다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 키메라 단백질을 인코딩하는 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시된다. 다른 실시예에서, 약제학적 조성물은 애쥬번트와 함께 투여된다.
일 실시예에서, 본 발명의 조성물은 면역원성 조성물이다. 일 실시예에서, 본 발명의 조성물은 인터페론-감마의 강력한 내재적 자극을 유도하며, 이는 일 실시예에서, 항-혈관신생 속성을 갖는다. 일 실시예에서, 본 발명의 리스테리아는 인터페론-감마의 강력한 내재적 자극을 유도하며, 이는 일 실시예에서 항-혈관신생 특성을 갖는다(Dominiecki 등, Cancer Immunol Immunother. 2005 May; 54(5):477-88. Epub 2004 Oct 6, 본원 전체에서 참조로 포함됨; Beatty and Paterson, J Immunol. 2001 Feb 15; 166(4): 2276-82, 본원 전체에서 참조로 포함됨). 일 실시예에서, 리스테리아의 항-혈관형성 특성은 CD4+T 세포에 의해 매개된다(Beatty 및 Paterson, 2001). 다른 실시예에서, 리스테리아의 항-혈관형성 특성은 CD8+ T 세포에 의해 매개된다. 다른 실시예에서, 리스테리아 예방접종의 결과로서 IFN-감마 분비는 NK 세포, NKT 세포, Th1 CD4+ T 세포, TC1 CD8+ T 세포, 또는 이들의 조합에 의해 매개된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 조성물의 투여는 하나 이상의 항-혈관신생 단백질 또는 인자의 생성을 유도한다. 일 실시예에서, 항-혈관형성 단백질은 IFN-감마이다. 다른 실시예에서, 항-혈관형성 단백질은 색소 상피세포 유래 인자(PEDF); 안지오스타틴; 엔도스타틴; fms-유사 티로신 키나제(sFlt)-1; 또는 수용성 엔도글린(endoglin)(sEng)이다. 일 실시예에서, 본 발명의 리스테리아는 항-혈관신생 인자의 방출에 수반되며, 따라서, 일 실시예에서, 대상체에게 항원을 도입하기 위한 벡터 역할에 더하여 치료 역할을 갖는다. 일 실시예에서, 본 발명의 조성물의 투여는 숙주에서 인터페론 유전자 자극제(STING) 경로를 자극한다.
본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 유도되는 면역 반응은, 다른 실시예에서, T 세포 반응이다. 다른 실시예에서, 면역 반응은 T 세포 반응을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 반응은 CD8+ T 세포 반응이다. 다른 실시예에서, 상기 반응은 CD8+ T 세포 반응을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 유도된 면역 반응은 CD8+ T 세포-매개 반응을 포함한다. 다른 실시예에서, 면역 반응은 CD8+ T 세포-매개 반응으로 주로 이루어진다. 다른 실시예에서, 면역 반응의 유일한 검출 가능한 성분이 CD8+ T 세포-매개 반응이다.
다른 실시예에서, 본 발명에 개시된 방법 및 조성물에 의해 유도된 면역 반응은 CD4+ T 세포-매개 반응을 포함한다. 다른 실시예에서, 면역 반응은 CD4+ T 세포-매개 반응으로 주로 이루어진다. 다른 실시예에서, 면역 반응의 유일한 검출 가능한 성분이 CD4+ T 세포-매개 반응이다. 다른 실시예에서, CD4+ T 세포-매개 반응은 항원에 대항하는 측정 가능한 항체 반응을 동반한다. 다른 실시예에서, CD4+ T 세포-매개 반응은 항원에 대항하는 측정 가능한 항체 반응을 동반하지 않는다.
다른 실시예에서, 본 발명은 항원의 서브우성 CD8+ T 세포 에피토프에 대한 대상체에서 CD8+ T 세포-매개 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 본원은 CD8+/T 조절 세포의 종양내 비율을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 다른 실시예에서, 상기 방법은 본 발명의 키메라 단백질, 재조합 리 스테리아 또는 재조합 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 본원은 CD8+/T 조절 세포의 종양내 비율을 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 다른 실시예에서, 상기 방법은 본 발명의 키메라 단백질, 재조합 리스테리아 또는 재조합 벡터를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물에 의해 유도된 면역 반응은 고유 항원의 적어도 하나의 서브우성 에피토프에 대한 면역 반응을 포함한다. 다른 실시예에서, 면역 반응 서브우성 에피토프에 대한 면역 반응을 포함하지 않는다. 다른 실시예에서, 면역 반응은 하나의 서브우성 에피토프에 대한 면역 반응으로 주로 이루어진다. 다른 실시예에서, 면역 반응의 유일한 측정 가능한 성분은 적어도 하나의 서브우성 에피토프에 대한 면역 반응이다.
다른 실시예에서, 본 발명의 조성물의 투여는 항원-특이적 T 세포의 수를 증가시킨다. 다른 실시예에서, 조성물의 투여는 T 세포 상의 공동-자극성 수용체를 활성화시킨다. 다른 실시예에서, 조성물의 투여는 기억 T 세포 및/또는 효과기 T 세포의 증식을 유도한다. 다른 실시예에서, 조성물의 투여는 T 세포의 증식을 증가시킨다.
본 발명의 조성물은, 대상체에서 증강된 항-종양 T 세포 반응을 유도하도록, 종양-매개 면역억제를 저해하도록, 또는 대상체의 비장과 종양에서의 T 효과기 세포 대 조절 T 세포(Treg)의 비율를 증가시키도록, 또는 이들의 임의의 조합을 위해, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
다른 실시예에서, 본 발명의 리스테리아 균주를 포함하는 조성물은 애쥬번트를 더 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물은 애쥬번트를 더 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용되는 애쥬번트는, 다른 실시예에서, 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 단백질이다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 GM-CSF 단백질을 포함한다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 GM-CSF를 인코딩하는 뉴클레오티드 분자이다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 GM-CSF를 인코딩하는 뉴클레오티드 분자를 포함한다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 사포닌 QS21이다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 사포닌 QS21을 포함한다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 모노포스포릴 리피드 A이다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 모노포스포릴 리피드 A를 포함한다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 SBAS2이다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 SBAS2을 포함한다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 비-메틸화 CpG 함유 올리고뉴클레오티드이다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 비-메틸화 CpG 함유 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 면역 자극 사이토카인이다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 면역 자극 사이토카인을 포함한다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 면역 자극 사이토카인을 인코딩하는 뉴클레오티드 분자이다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 면역 자극 사이토카인을 암호화하는 뉴클레오티드 분자를 포함한다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 퀼 글리코시드이거나 이를 포함한다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 세균 미토겐이거나 이를 포함한다. 다른 실시예에서, 애쥬번트는 세균 독소이거나 이를 포함한다. 다른 애쥬번트들이 당분야에 알려져 있다.
일 실시예에서, 본 발명은 펩타이드 항원을 발현하는 재조합 리스테리아 균주를 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 본원에 개시된 재조합 리스테리아를 포함하는 백신 및 면역원성 조성물을 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 본원에 개시된 재조합 리스테리아를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본원에 개시된 키메라 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 리스테리아 균주를 포함한다.
일부 실시예에서, 추가 폴리펩타이드 또는 추가 애쥬번트 폴리펩타이드는 유사한 방식으로 LLO에 대한 항원 제시 및 면역력을 증가시킨다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 추가적인 요법과 함께 공동-투여된다. 다른 실시예에서, 추가 요법은 수술, 화학요법, 방사선요법, 면역요법 또는 이들의 조합이다. 다른 실시예에서, 추가 요법은 재조합 리스테리아를 포함하는 약제학적 조성물의 투여에 선행한다. 다른 실시예에서, 추가 요법은 재조합 리스테리아를 포함하는 약제학적 조성물의 투여에 후속한다. 다른 실시예에서, 추가 요법은 항체 요법이다. 다른 실시예에서 상기 항체 요법은 항-PD1, 항-CTLA4이다. 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아를 포함하는 약제학적 조성물은 T-효과기 세포 대 조절 T 세포 비율을 증가시키고 더 강력한 항종양 면역 반응을 생성하기 위해 투여량을 증가시키서 투여된다. 항-종양 면역 반응은 IFN-γ, TNF-α를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 사이토카인, 및 세포 면역 반응을 강화하는 것으로 당해 기술 분야에서 공지된 기타 사이토카인을 종양을 갖는 상기 대상물에 제공함으로써 더욱 강화될 수 있다는 사실이 숙련자에 의해 이해될 것이며, 이들 중 일부는 본원에 참고로 인용된 미국 특허 번호 제6,991,785호에서 찾을 수 있다.
일 실시예에서, 본원에서 본 발명의 재조합 리스테리아를 포함하는 백신을 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 미니유전자 작제물을 발현하는 재조합 약독화된 리스테리아를 포함하는 백신이 본원에 개시된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 재조합 리스테리아를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 미니유전자 작제물을 발현하는 재조합 약독화된 리스테리아를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 재조합 폴리펩타이드, 상기 재조합 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물, 또는 상기 핵산 작제물을 인코딩하는 재조합 리스테리아를 포함하는 면역원성 조성물이 본원에 개시된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 분자 또는 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 분자 또는 재조합 폴리펩타이드를 포함하는 벡터가 본원에 개시된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 리스테리아의 재조합 형태가 본원에 개시된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 리스테리아의 재조합 형태를 포함하는 백신이 본원에 개시된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 리스테리아의 재조합 형태를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 리스테리아의 재조합 형태의 배양이 본원에 개시된다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물의 리스테리아는 리스테리아 모노사이토게네스이다. 다른 실시예에서, 리스테리아는 리스테리아 이바노비이다. 다른 실시예에서, 리스테리아는 리스테리아 웰쉬메리이다. 다른 실시예에서, 리스테 리아는 리스테리아 세엘리게리이다.
항원
용어 "항원", "항원성 폴리펩타이드", "항원 단편"은 본원에서 상호호환적으로 사용되고, 당업자가 이해할 바와 같이, 숙주 세포의 표면 상의 MHC 부류 I 및/또는 MHC 부류 II 분자 상으로 로딩되고 제시되며 숙주의 면역 세포에 의해 인지되거나 검출될 수 있어서, 이를 제시하는 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 세포에 대한 면역 반응의 축적(mounting)을 초래하는 폴리펩타이드 또는 펩타이드(재조합 펩타이드 포함)를 포함할 수 있다. 유사하게는, 면역 반응은 또한, 숙주 내의 다른 세포들, 예컨대 동일한 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 발현하는 종양 세포 또는 암세포와 같이 질병에 걸린 세포에까지 확장될 수 있다.
또한, 당업자는, 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 관련하여 "이의 항원 부분", "이의 단편" 및 "이의 면역원성 부분"이 본원에서 상호호환적으로 사용되고, 존재하는 경우 또는 일부 실시예에서 본원에 기재된 바와 같이 단독으로 또는 융합 단백질을 통해 숙주에 의해 검출되는 면역 반응의 축적을 초래하는 도메인 또는 분절을 포함하는 이들의 재조합 형태를 포함하는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드를 포함할 수 있다.
숙련자는 용어 "이종"이 참조 종과는 상이한 종으로부터 유래된 핵산, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질을 포괄한다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 예를 들어, 일 실시예에서 이종 폴리펩타이드를 발현하는 리스테리아 균주는 리스테리아 균주에 내인성이 아닌 폴리펩타이드를 발현하거나, 다른 실시예에서는 상기 리스테리아 균주에 의해 정상적으로 발현되지 않는 폴리펩타이드를 발현하거나, 다른 실시예에서는 상기 리스테리아 균주 외의 다른 출처로부터의 폴리펩타이드를 발현할 것이다. 다른 실시예에서, "이종"은 동일한 종 내의 상이한 생물체로부터 유래된 것을 기술하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 이종 항원은 리스테리아의 재조합 균주에 의해 발현되고, 가공되어 포유류 세포가 재조합 균주에 의해 감염될 때 세포독성 T 세포에게 제공된다. 다른 실시예에서, 리스테리아 종에 의해 발현된 상기 이종 항원은 그것이 포유류에서 자연적으로 발현되는 비개질된 항원 또는 단백질을 인식하는 T 세포 반응을 초래하는 한, 감염원이나 종양 세포 중의 단백질이나 대응하는 비개질된 항원과 정확히 일치할 필요는 없다. 일 실시예에서, 용어 "항원성 폴리펩타이드", "단백질 항원", "항원"은 본원에서 상호호환적으로 사용된다.
일 실시예에서, 항원은 외래, 즉 숙주에 대해 이종성일 수 있으며, 이는 본원에서 "이종성 항원"으로 지칭된다. 다른 실시예에서, 상기 항원은 숙주에 존재하지만 면역학적 내성 때문에 숙주의 면역 반응을 유발하지 않는 항원인 자가 항원이다. 숙련자는 자가 항원 및 이종 항원은 종양 항원, 종양 관련 항원 또는 혈관형성 항원을 포괄할 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 이종성 항원은 감염성 질환 항원을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 항원은 혈관신생 항원이다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 펩타이드는 종양-연관 항원으로부터 유래된다. 일 실시예에서, 종양-연관 항원은 HPV-E7, HPV-E6, Her-2, NY-ESO-1, 고분자량 흑색종-연관(HMW-MAA) 항원 또는 이의 단편, 헵신, 서바이빈, PSG4, VEGFR-2 단편, 서바이빈, B-세포 수용체 항원, 티로시나제 관련 단백질 2 또는 PSA(전립선-특이 항원) 또는 이들의 조합으로부터 선택된다. 다른 실시예에서, 항원은 감염성 질환 항원이며, 예컨대 HIV-1 Gag, MAGE(흑색종-연관 항원 E) 단백질, 예를 들어 MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, 티로시나제; 돌연변이체 ras 단백질; 돌연변이체 p53 단백질; p97 흑색종 항원, 진행 암과 연관된 ras 펩타이드 또는 p53 펩타이드; 자궁경부암과 연관된 HPV 16/18 항원, 유방암종과 연관된 KLH 항원, 암배 항원(CEA), gp100, 흑색종과 연관된 MART1 항원, 인터루킨-13 수용체 알파(IR13-R 알파), 텔로머라제(TERT), 피부 각질층 키모트립신 효소(stratum corneum chymotryptic enzyme; SCCE) 항원, CEA, LMP-1, p53, 프로테이나제 3, 윤활막육종, 탄산 탈수효소 IX(CAIX), 서바이빈, GP100, 테스티신 펩타이드, PSMA, 전립선 줄기세포 항원(PSCA) 또는 윌름 종양(WT-1) 항원이다. 본원에 개시되거나 당분야에 개시된 임의의 항원의 단편 또한, 본 발명에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 질환은 감염성 질환이다. 일 실시예에서, 감염성 질환은 하기 병원균들 중 임의의 병원균에 의해 유발되는 질환이지만 이에 한정되지는 않는다: 리슈만편모충, 이질아메바(아메바성 감염을 유발함), 트리쿠리스, BCG/결핵, 말라리아, 열대열원충, 사일열원충, 삼일열원충, 로타바이러스, 콜레라, 디프테리아-파상풍, 백일해, 인플루엔자 균, B 형 간염, 인간 유두종 바이러스, 계절성 인플루엔자), 대유행 인플루엔자 A (H1N1), 홍역과 풍진, 유행성 이하선염, 수막염 A+C, 경구 소아마비 백신, 1가, 2가, 3가, 폐렴 구균, 광견병, 파상풍 톡소이드, 황열병, 탄저균 (탄저병), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 독소 (보툴리누스 중독), 페스트 균 (전염병), 천연두 (마마) 및 기타 관련 수두 바이러스, 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) (야토병), 바이러스성 출혈열, 아레나바이러스 (LCM, 후닌 바이러스, 맞추포 바이러스(Machupo virus), 구아나리토 바이러스(Guanarito virus), 라사 발열(Lassa Fever), 버냐바이러스(Bunyaviruses) (한타바이러스(Hantaviruses), 리프트 밸리 열병), 플라비바이러스(Flaviruses) (뎅기열), 필로바이러스 (에볼라, 마르부르크), 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii) (Q 열병), 브루셀라 종 (브루셀라증), 부르크홀데리아 말레이 (마비저(glanders)), 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci) (앵무새병), 리신 독소 (피마자 유래), 클로스트리디움 퍼프린젠스의 엡실론 독소, 황색포도상구균 장독소 B, 발진티푸스 발열 (리케치아 프로바제키), 기타 리케치아, 식품- 및 수용성 병원균, 박테리아 (설사유발 대장균, 병원성 비브리오스, 시겔라 종, 살모넬라 BCG/, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 예르시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica)) 바이러스 (칼리시바이러스, A 형 간염, 웨스트 나일 바이러스, 라크로스(LaCrosse), 캘리포니아 뇌염, VEE, EEE, WEE, 일본 뇌염 바이러스, 키아사누 포레스트(Kyasanur Forest) 바이러스, 니파 바이러스, 한타바이러스(hantaviruses), 참진드기 매개 출혈열 바이러스, 치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus), 크림-콩고 출혈열 바이러스, 참진드기 매개 뇌염 바이러스, B 형 간염 바이러스, C 형 간염 바이러스, 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 인간 유두종 바이러스 (HPV)), 원생동물 (작은와포자충(Cryptosporidium parvum), 원포자충(Cyclospora cayatanensis), 람블편모충(Giardia lamblia), 이질아메바(Entamoeba histolytica), 톡소포자충(Toxoplasma)), 균류 (미포자충), 황열, 약제 내성 결핵 포함 결핵, 광견병, 프리온, 중증 급성 호흡기 증후군 연관 코로나 바이러스 (SARS-CoV), 콕시디오이데스 포사다시(Coccidioides posadasii), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 박테리아성 질증, 클라미디아 트라코마티스, 거대세포 바이러스, 서혜부 육아종, 헤모필루스 듀크레이(Hemophilus ducreyi), 나이세리아 임질, 매독 균, 질트리코모나스, 또는 여기에 열거되지 않은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 감염성 질환.
일 실시예에서, 병원성 원생동물 및 기생충 감염은 : 아메바증; 말라리아; 리슈만편모충증; 트리파노소마증; 톡소플라즈마증; 뉴모시스티스 카리니; 바베시아증; 편모충증; 선모충증; 필라리아병; 주혈흡충병; 선충류; 디스토마류 또는 흡충류; 및 촌총류(조충류) 감염을 포함한다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 HPV 항원, 예컨대 E6 항원 또는 E7 항원은 HPV 6 균주, HPV 11 균주, HPV 16 균주, HPV-18 균주, HPV-31 균주, HPV-35 균주, HPV-39 균주, HPV-45 균주, HPV-51 균주, HPV-52 균주, HPV-58 균주 또는 HPV-59 균주로부터 선택된다. 다른 실시예에서, HPV 항원은 고위험 HPV 균주로부터 선택된다. 다른 실시예에서, HPV는 점막 HPV형이다. 다른 실시예에서, HPV 항원은 사마귀 및 형성이상을 유발하는 유형 6, 유형 11 등과 같은 비-종양원성 HPV를 포함한 모든 HPV 균주로부터 선택될 수 있다.
일 실시예에서, HPV-16 E6 및 E7은 HPV-18 E6 및 E7 대신에 또는 이와 조합하여 사용된다. 이러한 실시예에서, 재조합 리스테리아는 염색체로부터 HPV-16 E6 및 E7을 발현하고 플라스미드로부터 HPV-18 E6 및 E7를 발현할 수도 있거나 또는 그 역으로 발현할 수도 있다. 다른 실시예에서, HPV-16 E6 및 E7 항원 및 HPV-18 E6 및 E7 항원은 본원에 개시된 재조합 리스테리아에 존재하는 플라스미드로부터 발현된다. 다른 실시예에서, HPV-16 E6 및 E7 항원 및 HPV-18 E6 및 E7 항원은 본원에 개시된 재조합 리스테리아의 염색체로부터 발현된다. 다른 실시예에서, HPV-16 E6 및 E7 항원 및 HPV-18 E6 및 E7 항원은 각각의 HPV 균주로부터의 각각의 E6 및 E7 항원이 플라스미드 또는 염색체로부터 발현되는 경우를 비롯하여, 상기 실시예들과 임의의 조합으로 발현된다.
일 실시예에서, 항원은 미국 특허 출원 일련 번호 12/945,386에 기재되어 있는 키메라 Her2 항원이며, 이러한 특허 문헌의 전문은 본원에 참고로 원용된다.
다른 실시예에서, 상기 항원은 다음 질환들 중 하나와 연관된다: 콜레라, 디프테리아, 헤모필루스, A 형 간염, B 형 간염, 인플루엔자, 홍역, 수막염, 유행성 이하선염, 백일해(pertussis), 천연두, 폐렴 구균성 폐렴, 소아마비, 광견병, 풍진, 파상풍, 결핵, 장티푸스, 수두-대상체 포진, 백일기침(whooping cough), 황열병, 애디슨 병 유래 면역원 및 항원, 알레르기, 아나필락시스, 브루톤 증후군, 고체 및 혈액 매개 종양을 비롯한 암, 습진, 하시모토 갑상선염, 다발성 근염, 피부 근염, 1 형 당뇨병, 후천성 면역결핍 증후군, 신장, 심장, 췌장, 폐, 뼈, 간 이식 등의 이식 거부, 그레이브스 병(Graves' disease), 다선(polyendocrine) 자가면역 질환, 간염, 현미경적 다발성 동맥염, 결절성 다발 동맥염, 천포창, 원발성 담즙성 간경변, 악성 빈혈, 소아 지방 변증, 항체-매개 신염, 사구체 신염, 류마티스 질환, 전신성 홍반성 낭창, 류마티스 관절염, 혈청음성 척추 관절병증, 비염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 전신성 경화증, 경화성 담관염, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 포진, 건선, 백반증, 다발성 경화증, 뇌척수염 피부염, 길렝-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 중증 근무력증, 램버트-이튼 증후군(Lambert-Eaton syndrome), 공막(sclera), 상공막(episclera), 포도막염, 만성 피부 점막 칸디다증, 두드러기, 유아기의 일시적인 저감마글로불린혈증, 골수종, X-연결 하이퍼 IgM 증후군, 비스코트-알드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 운동 실조의 모세혈관 확장, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 혈소판 감소증, 자가면역 호중구 감소증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 아밀로이드증, 만성 림프구성 백혈병, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 말라리아 환상포자소체(malarial circumsporozite) 단백질, 미생물 항원, 바이러스 항원, 자가항원 및 리스테리아증(lesteriosis).
다른 실시예에서, 본원에 개시된 병태는 형성이상이다. 다른 실시예에서, 질환은 종양 형성이다. 다른 실시예에서, 질환은 항문 상피내 종양 형성(AIN)이다. 다른 실시예에서, 질환은 질 상피내 종양 형성(VIN)이다. 다른 실시예에서, 질환은 자궁경부 상피내 종양 형성(CIN)이다.
다른 실시예에서, 본원에 개시된 병태는 전악성 병태, 또는 치료되지 않은 채 방치되는 경우 만성 또는 급성 질환으로 발생하게 되는 병태이다.
다른 실시예에서, 본원에 개시된 종양-연관 항원은 활성화된 혈관주위세포(pericyte)와 종양 혈관신생 혈관내 혈관주위세포 둘 모두에서 발현되며, 이는 생체내에서 신혈관 형성과 연관이 있는 혈관신생 항원이다. 혈관신생 항원은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 WO2010/102140를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 예를 들어, 혈관신생 인자는 안지오포이에틴-1(Ang1), 안지오포이에틴 3, 안지오포이에틴 4, 안지오포이에틴 6; Del-1; 섬유아세포 성장 인자들: 산성(aFGF) 및 염기성(bFGF); 폴리스타틴; 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF); 헤파토사이트 성장 인자(HGF)/산란 인자(SF); 인터류킨-8(IL-8); 렙틴; 미드카인; 태반 성장 인자; 혈소판에서 유래한 내피 세포 성장 인자(PD-ECGF); 혈소판에서 유래한 성장 인자-BB(PDGF-BB); 플레이오트로핀(PTN); 프로그래뉼린; 프롤리페린; 서바이빈; 형질전환 성장 인자-알파(TGF-alpha); 형질전환 성장 인자-베타(TGF-beta); 종양 괴사 인자-알파(TNF-alpha); 혈관내피 성장 인자(VEGF)/혈관 침투 인자(VPF)이다. 다른 실시예에서, 혈관형성 인자는 혈관형성 단백질이다. 일 실시예에서, 성장 인자는 혈관형성 단백질이다. 일 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 혈관신생 단백질은 섬유아세포 성장 인자(FGF); VEGF; VEGFR 및 뉴로필린1(NRP-1); Tie2; 혈소판-유래 성장 인자(PDGF; BB-호모다이머) 및 PDGFR; 형질전환 성장 인자-베타(TGF-β), 엔도글린 및 TGF-β 수용체; 단핵 백혈구 화학주성 단백질-1(MCP-1); 인테그린 αVβ3, αVβ5 및 α5β1; VE-카데린 및 CD31; 에프린; 플라스미노겐활성화인자; 플라스미노겐활성화인자 억제자-1; 일산화질소 신타제(NOS) 및 COX-2; AC133; 또는 Id1/Id3, TGF베타 공동-수용체 또는 엔도글린(endoglin)(이는 CD105; EDG; HHT1; ORW; 또는 ORW1로도 알려져 있음)이다.
일 실시예에서, 네오에피토프는 하기 미국 출원들 중 임의의 하나에서 개시된 바와 같이 생성되고 수득된다(USSN 62/166,591; USSN 62/174,692; USSN 62/218,936; USSN 62/184,125, 이들은 모두 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함되어 있음.
일 실시예에서, 리스테리아-기반 면역요법 섭생의 투여 후, 대상체 내 조직 상에서 리스테리아 균주의 지속의 예방 방법이 본원에 개시되어 있으며, 상기 예방 방법은, 상기 재조합 리스테리아-기반 면역요법의 투여 후 유효량의 항생제 섭생을 투여하여, 상기 대상체 내에서 상기 리스테리아 균주의 상기 지속을 예방하는 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 하나 이상의 네오에피토프를 인코딩하는 하나 이상의 펩타이드를 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 분자를 포함하며, 여기서, 상기 하나 이상의 펩타이드는 면역원성 단백질 또는 펩타이드와 융합되어 있다. 다른 실시예에서, 면역원성 단백질 또는 펩타이드는 말단 절단된 LLO(tLLO), 말단 절단된 ActA(tActA) 또는 PEST 아미노산 서열 펩타이드를 포함한다.
일 실시예에서, 재조합 약독화된 리스테리아 균주가 본원에 개시되어 있으며, 여기서, 리스테리아 균주는 하나 이상의 개인화된 네오에피토프를 포함하는 하나 이상의 펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서, 상기 네오에피토프(들)는 질환 또는 병태를 가진 대상체의 질환 또는 병태-함유 조직 또는 세포에 존재하는 면역원성 에피토프를 포함한다. 다른 실시예에서, 하나 이상의 에피토프는 질환 또는 병태를 가진 대상체의 질환 또는 병태-함유 조직 또는 세포에 존재한다.
다른 실시예에서, 상기 질환 또는 병태를 가진 대상체에게의 리스테리아 균주의 투여는 상기 대상체의 질환 또는 병태를 표적으로 한 면역 반응을 생성한다.
다른 실시예에서, 상기 균주는 상기 대상체의 질환 또는 병태를 표적으로 한 상기 대상체에 대한 개인화된 면역요법 벡터이다.
다른 실시예에서, 펩타이드는 적어도 2개의 상이한 네오에피토프 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시예에서, 펩타이드는 동일한 아미노산 서열의 하나 이상의 네오에피토프 반복부를 포함한다.
다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 하나의 네오에피토프를 포함한다. 다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 약 1 내지 100개 범위의 네오에피토프를 포함한다. 대안적으로, 리스테리아 균주는 1 내지 5, 5 내지 10, 10 내지 15, 15 내지 20, 10 내지 20, 20 내지 30, 30 내지 40,40 내지 50, 50 내지 60, 60 내지 70, 70 내지 80, 80 내지 90, 90 내지 100, 5 내지 15, 5 내지 20, 5 내지 25, 15 내지 20, 15 내지 25, 15 내지 30, 15 내지 35, 20 내지 25, 20 내지 35, 20 내지 45, 30 내지 45, 30 내지 55, 40 내지 55, 40 내지 65, 50 내지 65, 50 내지 75, 60 내지 75, 60 내지 85, 70 내지 85, 70 내지 95, 80 내지 95, 80 내지 105 또는 95 내지 105개 범위의 네오에피토프를 포함한다. 대안적으로, 리스테리아 균주는 약 50 내지 100개 범위의 네오에피토프를 포함한다. 대안적으로, 리스테리아 균주는 최대 약 100개의 네오에피토프를 포함한다.
다른 실시예에서, 리스테리아 균주는 약 100개 초과의 네오에피토프를 포함한다. 대안적으로, 리스테리아 균주는 최대 약 10개의 네오에피토프를 포함한다. 대안적으로, 리스테리아 균주는 최대 약 20개의 네오에피토프를 포함한다. 대안적으로, 리스테리아 균주는 최대 약 50개의 네오에피토프를 포함한다. 대안적으로, 리스테리아 균주는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100개의 네오에피토프를 포함한다.
본원에 기재된 일 실시예에서, 결실된 돌연변이의 각각의 측면에 인접한 약 5 내지 30개 아미노산 범위 내에서의 아미노산의 혼입이 발생한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 다양한 크기의 네오에피토프 삽입물이 약 8 내지 27개 길이 범위의 아미노산 서열 내에 삽입된다. 추가적으로 또는 대안적으로, 다양한 크기의 네오에피토프 삽입물이 약 5 내지 50개 길이 범위의 아미노산 서열 내에 삽입된다.
다른 실시예에서, 네오에피토프 서열은 종양 특이적이며, 전이 특이적이며, 박테리아 감염 특이적이며, 바이러스 감염 특이적이고, 이들의 임의의 조합이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 네오에피토프 서열은 염증 특이적이며, 면역 조절 분자 에피토프 특이적이며, T-세포 특이적이며, 자가면역 질환 특이적이며, 숙주편대 질환(GvHD) 특이적이고, 이들의 임의의 조합이다.
다른 실시예에서, 하나 이상의 네오에피토프는 선형 네오에피토프를 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 하나 이상의 네오에피토프는 용매-노출된 에피토프를 포함한다.
다른 실시예에서, 하나 이상의 네오에피토프는 T-세포 에피토프를 포함한다.
치료 방법 및 이의 사용 조성물
다른 실시예에서, 본 발명은 종양 또는 암을 포함한 질환 또는 병태의 치료를 위한 상기 기재된 바와 같은 면역원성 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용되는 면역원성 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 미니유전자 핵산 작제물을 발현하는 리스테리아 균주를 포함한다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 병태는 형성이상이다. 다른 실시예에서, 질환은 종양 형성이다. 다른 실시예에서, 질환은 항문 상피내 종양 형성(AIN)이다. 다른 실시예에서, 질환은 질 상피내 종양 형성(VIN)이다. 다른 실시예에서, 질환은 자궁경부 상피내 종양 형성(CIN)이다.
다른 실시예에서, 본원에 개시된 병태는 전악성 병태, 또는 치료되지 않은 채 방치되는 경우 만성 또는 급성 질환으로 발생하게 되는 병태이다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 암은 유방암, 중추신경계(CNS) 암, 두경부암, 골육종(OSA), 개 골육종(OSA), 결장직장 암, 신세포암종, 췌장 관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma), 유윙 육종(ES), 췌장암, 난소암, 위암, 췌장의 암성 병변, 폐 선암종, 결장직장 선암종, 폐 편평 선암종, 위 선암종, 난소 표면 상피 신생물(예, 이의 양성, 증식성 또는 악성 변형물), 구강 편평 상피 세포 암종, 비소세포 폐암종, CNS 암종, 자궁내막 암종, 방광암, 중피종, 악성 중피종(MM), 전립선 암종, 흑색종 또는 당업계에 알려진 임의의 다른 암이다. 다른 실시예에서, 상기 암은 림프종, 백혈병 또는 골수종이다. 다른 실시예에서, 림프종은 호지킨 림프종이다. 다른 실시예에서, 림프종은 비호지킨 림프종이다. 다른 실시예에서, 암은 다발성 흑색종이다.
또 다른 실시예에서, 암은 급성 림프구성 백혈병(ALL)이다. 다른 실시예에서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML)이다. 다른 실시예에서, 암은 만성 림프구성 백혈병(CLL)이다. 다른 실시예에서, 암은 모양 세포성 백혈병(HCL)이다. 다른 실시예에서, 암은 T-세포 전림프구성 백혈병(T-PLL)이다. 다른 실시예에서, 암은 거대 과립 림프구성 백혈병이다. 다른 실시예에서, 암은 성인 T-세포 백혈병이다. 다른 실시예에서, 암은 만성 골수성 백혈병(CML)이다. 다른 실시예에서, 암은 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)이다. 다른 실시예에서, 암은 림프종이다. 다른 실시예에서, 암은 피부 림프종이다. 다른 실시예에서, 암은 호지킨 질환이다. 다른 실시예에서, 암은 비호지킨 림프종(NHL)이다. 다른 실시예에서, 암은 저등급 NHL이다. 다른 실시예에서, 암은 미만성 큰 B 세포 림프종이다. 다른 실시예에서, 암은 저등급 NHL이다. 다른 실시예에서, 암은 전구체 T 세포 림프종이다. 다른 실시예에서, 암은 말초 T 세포 림프종이다. 다른 실시예에서, 암은 말초 맨틀세포 림프종이다. 다른 실시예에서, 암은 다발성 골수종이다. 다른 실시예에서, 암은 여포성 림프종이다. 다른 실시예에서, 암은 면역증식성 질환이다. 다른 실시예에서, 암은 B 세포 만성 림프구성 백혈병이다. 다른 실시예에서, 상기 암은 버킷 림프종이다. 다른 실시예에서, 상기 암은 MALT 림프종이다. 다른 실시예에서, 암은 균상식육종이다. 다른 실시예에서, 암은 결절경화이다. 다른 실시예에서, 암은 저등급 림프종이다. 다른 실시예에서, 암은 상기 유형의 림프종 또는 백혈병 중 하나로부터의 후유증이다. 다른 실시예에서, 암은 당해 분야에 공지된 임의의 다른 유형의 림프종 또는 백혈병이다. 다른 실시예에서, 암은 서바이빈을 발현하는 임의의 다른 공지된 유형의 림프종이다. 다른 실시예에서, 암은 골수이형성 증후군이다. 다른 실시예에서, 암은 임의의 서바이빈-발현 혈액암이다. 다른 실시예에서, 상기 암 또는 고형 종양은 재발 또는 전이 질병의 결과이다. 다른 실시예에서, 암은 불응성이다. 다른 실시예에서, 암은 진행성이다. 다른 실시예에서, 암은 전이성이다.
다른 실시예에서, 종양은 골육종 종양, 유방 종양, 두경부 종양, 또는 본원에 개시되고 당업계에 공지된 임의의 암으로 진행될 수 있는 임의의 다른 종양이다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 표적화되는 종양의 세포는 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주에 의해 발현되는 펩타이드와 연관된 항원을 발현한다. 다른 실시예에서, 펩타이드 항원은 혈관신생 종양 항원(예를 들어, HMW-MAA)과 연관된다. 본원에 개시된 면역원성 조성물의 투여 후, 본원에 개시된 방법들은, 말초 림프 장기에서의 T 효과기 세포들의 증식을 유도하여 종양 부위에서의 증강된 T 효과기 세포들의 존재를 초래한다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 방법들은, 말초 림프 장기에서의 T 효과기 세포들의 증식을 유도하여 그 말초 부분에서의 증강된 T 효과기 세포들의 존재를 초래한다. 이러한 T 효과기 세포들의 팽창에 따라, Treg의 개수에 영향을 끼치지 않고 말초 부분과 종양 부위에서의 T 효과기 세포 대 조절 T 세포의 비가 증가한다. 숙련자라면, 말초 림프 장기가, 비장, 페이어스 패치, 림프절, 아데노이드 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않음을 이해할 것이다. 일 실시예에서, T 효과기 세포 대 조절 T 세포의 증가된 비는, Treg의 개수에 영향을 끼치지 않고 말초 부분에서 발생한다. 다른 실시예에서, T 효과기 세포 대 조절 T 세포의 증가된 비는, 말초 부분, 림프 장기, 및 종양 부위에서 이러한 부위들에서의 Treg의 개수에 영향을 끼치지 않고 발생한다. 다른 실시예에서, T 효과기 세포의 증가된 비율은 Treg의 빈도를 감소시키지만, 이들 부위에서의 Treg의 총 수는 감소시키지 않는다.
다른 실시예에서, 대상체에서 암의 예방 방법이 본원에 개시되며, 상기 예방 방법은 키메라 단백질을 인코딩하는 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 키메라 단백질은 종양 항원-연관 펩타이드를 포함한다. 다른 실시예에서, 대상체에서 종양 성장의 예방 방법이 본원에 개시되어 있으며, 상기 예방 방법은 키메라 단백질을 인코딩하는 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 키메라 단백질은 종양 항원-연관 펩타이드를 포함한다.
일 실시예에서, 대상체에서 암의 치료 방법이 본원에 개시되어 있으며, 상기 치료 방법은 키메라 단백질을 인코딩하는 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리 스테리아를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 키메라 단백질은 종양 항원-연관 펩타이드를 포함한다. 일 실시예에서, 대상체에서 종양 성장의 치료 방법이 본원에 개시되어 있으며, 상기 치료 방법은 키메라 단백질을 인코딩하는 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 키메라 단백질은 종양 항원-연관 펩타이드를 포함한다.
일 실시예에서, 암을 가진 대상체의 생존 연장 방법이 본원에 개시되어 있으며, 상기 연장 방법은 키메라 단백질을 인코딩하는 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 키메라 단백질은 종양 항원-연관 펩타이드를 포함한다. 일 실시예에서, 종양 성장을 가진 대상체의 생존의 연장 방법이 본원에 개시되어 있으며, 상기 연장 방법은 키메라 단백질을 인코딩하는 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 키메라 단백질은 종양 항원-연관 펩타이드를 포함한다.
일 실시예에서, 질환을 가진 대상체에서 전이성 질환의 저해, 지체 또는 지연 방법이 본원에 개시되어 있으며, 상기 저해, 지체 또는 지연 방법은 키메라 단백질을 인코딩하는 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 키메라 단백질은 상기 질환과 연관된 펩타이드를 포함한다. 일 실시예에서, 본 발명은 대상체에서 항종양 면역 반응 또는 항암 면역 반응의 유도 방법을 제공하며, 상기 유도 방법은 본 발명의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 대상체에서 종양 또는 암의 퇴행의 유도 방법이 본원에 개시되며, 상기 유도 방법은 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 종양내 T 조절 세포의 빈도의 감소 방법이 본원에 개시되며, 상기 감소 방법은 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 종양내 골육종 유래 억제자 세포 빈도의 감소 방법이 본원에 개시되며, 상기 감소 방법은 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 골육종 유래 억제자 세포(MDSC) 빈도의 감소 방법이 본원에 개시되며, 상기 감소 방법은 본원에 개시된 재조합 리스테리아 백신을 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 대상체에서 전이성 종양 또는 암의 치료 방법이 본원에 개시되며, 상기 치료 방법은 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 방법은 상기 대상체에서 종양 또는 암에 대한 대상체에서의 내성을 파괴시키는 방법이며, 상기 파괴 방법은 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 대상체에서 종양 또는 암의 성장의 지체 방법을 제공하며, 상기 지체 방법은 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 이에 의해 상기 대상체에서 종양 또는 암의 성장을 지체시킨다.
다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 리스테리아를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암 발생률의 감소 방법을 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 리스테리아를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 개선 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 본원에 기재된 리스테리아 균주를 포함하는 본원에 개시된 임의의 조성물은 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 본 발명의 조성물을 투여하는 방법이 본원에 개시되어 있다. 다른 실시예에서, 본 발명의 재조합 리스테리아를 포함하는 백신의 투여 방법이 본원에 개시되어 있다. 다른 실시예에서, 본 발명의 재조합 폴리펩타이드의 투여 방법이 본원에 개시되어 있다. 다른 실시예에서, 본 발명의 재조합 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물의 투여 방법이 본원에 개시된다. 다른 실시예에서, 투여는 상이한 약독화 박테리아 벡터로 수행된다. 다른 실시예에서, 상기 투여는 상이한 약독화된 리스테리아 모노사이토게네스 벡터를 사용하여 수행된다. 다른 실시예에서, 투여는 DNA 백신 (예를 들어, 네이키드 DNA 백신)으로 수행된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 재조합 폴리펩타이드의 투여는 단백질을 재조합적으로 생산한 후, 재조합 단백질을 대상체에게 투여함으로써 수행된다.
일 실시예에서, 본 발명은 종양의 "에피토프 확산"을 위한 방법을 제공한다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용한 면역화는 본 발명의 백신에서 운반되는 항원 이외의 항원을 보유하는 다른 종양 상으로의 에피토프 확산을 유도한다. 이는 다른 종양으로의 항종양 반응의 증식을 야기한다.
다른 실시예에서, 우성 에피토프 또는 서브우성 에피토프는 치료될 대상물에서 각각 우성 또는 서브우성이다. 다른 실시예에서, 우성 에피토프 또는 서브우성 에피토프는 치료될 집단에서 각각 우성 또는 서브우성이다.
일 실시예에서, 대상체에서 에피토프 확산에 의한 암 또는 종양 성장의 치료, 억제 또는 저해 방법이 본원에 개시되며, 여기에서 다른 실시예에서, 상기 암은 본 발명의 조성물 내에 포함된 항원 또는 이의 단편의 발현과 연관된다. 다른 실시예에서, 방법은 본 발명의 재조합 폴리펩티드, 재조합 리스테리아, 또는 재조합 벡터를 포함하는 조성물을 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 대상물은 항원-발현 암 또는 항원-발현 종양에 대항하는 면역 반응이 증가하며, 이에 의해 대상물에서 암 또는 종양 성장을 치료하거나 억제하거나 저해한다.
일 실시예에서, "우성 CD8+ T 세포 에피토프" 또는 "우성 에피토프"는 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 병원균 또는 암세포를 사용한 백신접종, 감염 또는 악성 성장에 의해 유도된 항원-특이적 CD8+ T 세포의 30%를 초과하여 인지되는 에피토프를 지칭한다. 다른 실시예에서, 용어는 이에 의해 유발되는 항원-특이 CD8+ T 세포를 35% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 40% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 45% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 50% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 55% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 60% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 65% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 70% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 75% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 80% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 85% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 90% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 95% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 96% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 97% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 98% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다.
일 실시예에서, 용어 "서브우성 CD8+ T 세포 에피토프" 또는 "서브우성 에피토프"는 단백질, 또는 상기 단백질을 함유하는 병원균 또는 암세포를 사용한 백신접종, 감염 또는 악성 성장에 의해 유도된 항원-특이적 CD8+ T 세포의 30% 미만으로써 인지되는 에피토프를 지칭한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 28% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 26% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 24% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 22% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 20% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 18% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 16% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 14% 넘게 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 12% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 10% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 8% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 6% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 5% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 4% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 3% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 2% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 1% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다. 다른 실시예에서, 용어는 항원-특이 CD8+ T 세포를 0.5% 미만으로 인식하는 에피토프를 의미한다.
본 발명의 방법 및 조성물에서의 펩타이드를 포함하는 항원은, 일 실시예에서, 대상체의 비-종양 세포에서의 검출 가능한 수준으로 발현된다. 다른 실시예에서, 항원은 대상물의 비-종양 세포의 적어도 특정 백분율(예를 들어, 0.01%, 0.03%, 0.1%, 0.3%, 1%, 2%, 3%, 또는 5%)의 검출 가능한 수준에서 발현된다. 일 실시예에서, "비-종양 세포"는 종양의 체외 세포를 의미한다. 다른 실시예에서, "비-종양 세포"는 비-악성 T 세포를 의미한다. 다른 실시예에서, "비-종양 세포"는 비-형질전환 세포를 의미한다. 다른 실시예에서, 비-종양 세포는 체세포이다. 다른 실시예에서, 비-종양 세포는 생식 세포이다.
"검출 가능한 수준"은, 표준 검정법을 사용했을 때 검출 가능한 수준을 지칭한다. 일 실시예에서, 분석법은 면역 분석법이다. 일 실시예에서, 분석법은 효소-결합 면역분석법(ELISA)이다. 다른 실시예에서, 분석법은 웨스턴 블롯이다. 다른 실시예에서, 분석법은 FACS이다. 다른 실시예에서, 상기 검정법은 유전자-발현 검정법이다. 본 분야에서 입수 가능한 임의의 다른 검정법이 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다. 다른 실시예에서, 검출 가능한 수준은 특정 분석법의 백그라운드 수준에 비례하여 결정된다. 이들 각각의 기법의 수행 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
일 실시예에서, 재조합 항원-발현 LM을 사용한 백신접종은 에피토프 확산을 유도한다.
일 실시예에서, 본 발명은 항종양 반응의 "에피토프 확산" 방법을 제공한다. 다른 실시예에서, 본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용한 면역화는 다른 종양 상으로의 에피토프 확산을 유도한다.
다른 실시예에서, 우성 에피토프 또는 서브우성 에피토프는 치료될 대상물에서 각각 우성 또는 서브우성이다. 다른 실시예에서, 우성 에피토프 또는 서브우성 에피토프는 치료될 집단에서 각각 우성 또는 서브우성이다.
일 실시예에서, 대상체에서 에피토프 확산에 의한 암 또는 종양 성장의 치료, 억제 또는 저해 방법이 본원에 개시되며, 여기에서 다른 실시예에서, 상기 암은 본 발명의 조성물 내에 포함된 항원 또는 이의 단편의 발현과 연관된다. 다른 실시예에서, 방법은 본 발명의 재조합 폴리펩티드, 재조합 리스테리아, 또는 재조합 벡터를 포함하는 조성물을 상기 대상물에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 대상물은 항원-발현 암 또는 항원-발현 종양에 대항하는 면역 반응이 증가하며, 이에 의해 대상물에서 암 또는 종양 성장을 치료하거나 억제하거나 저해한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 암을 가진 숙주에서 세포독성 T 세포의 형성의 유도 방법을 제공하며, 상기 유도 방법은 본 발명의 조성물을 숙주에게 투여하여, 이에 의해 암을 가진 숙주에서 세포독성 T 세포의 형성을 유도한다.
일 실시예에서, 조성물은 생체외에서 대상체의 세포에 투여되며; 다른 실시예에서, 조성물은 생체외에서 공여자의 세포에 투여된다; 다른 실시예에서, 조성물은 생체내에서 공여자의 세포 내로 투여된 후 대상체로 전이된다.
본 발명의 방법의 다른 실시예에서, 대상물은 항원-발현 종양 또는 표적 항원에 대항하는 면역 반응이 증가하며, 이에 의해 항-종양 효과를 매개한다.
일 실시예에서, 본 발명의 조성물의 반복 투여(부스터 용량)는 종양 퇴행을 달성하기 위해 치료의 제1 과정 후 바로 또는 며칠, 몇주 또는 몇 개월의 간격 후에 착수될 수 있다. 다른 실시예에서, 반복 투여량은 첫 번째 치료 과정 직후 또는 종양 성장의 억제를 달성하기 위한 수 일, 수 주 또는 수 개월의 기간 후 수행될 수도 있다. 평가는 이미징 기술, 혈청 종양 마커 분석, 생검, 또는 종양 관련 증상의 존재, 부재 또는 경감 같은 진단 방법을 포함하여, 본 기술분야에 공지된 기술들 중 어느 것에 의해 결정될 수도 있다.
일 실시예에서는, 대상체의 비장 및 종양 미세환경에서 조절 T 세포(Treg)에 대한 T 효과기 세포의 비율의 증가 방법을 제공하며, 상기 증가 방법은 본원에 개시된 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 대상물의 비장 및 종양 마이크로 환경에서 조절 T 세포(Treg)에 대한 T 주효 세포의 비를 증가시킴으로써, 대상물의 더욱 깊은 항종양 반응이 가능해진다. 다른 실시예에서, 상기 조절 T 세포는 CD4+FoxP3+ T 세포이다.
다른 실시예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD4+FoxP3- T 세포를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD4+FoxP3- T 세포이다. 다른 실시예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD4+FoxP3- T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 T 효과기 세포는 CD4+FoxP3- T 세포 및 CD8+ T 세포이다.
일 실시예에서, 본 발명은 종양 또는 암에 대한 치료, 보호, 및 면역 반응 유도 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명은 인간 대상체에서 종양 또는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 개시된 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 면역 반응은 T-세포 반응이다. 다른 실시예에서, 상기 T-세포 반응은 CD4+FoxP3- T 세포 반응이다. 다른 실시예에서, 상기 T-세포 반응은 CD8+ T 세포 반응이다. 다른 실시예에서, 상기 T-세포 반응은 CD4+FoxP3- 및 CD8+ T 세포 반응이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 종양 또는 암에 대한 대상체를 보호하는 방법을 제공하며, 상기 보호 방법은 본원에 개시된 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 대상체 내의 종양의 퇴행을 유도하는 방법을 제공하며, 본원에 개시된 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 종양 또는 암의 발생 또는 재발을 감소시키는 방법을 제공하며, 본원에 개시된 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 대상체 내의 종양의 형성을 억제하는 방법을 제공하며, 본원에 개시된 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 대상체에서 암의 관해를 유도하는 방법을 제공하며, 본원에 개시된 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 바와 같은 키메라 펩타이드를 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하는 미니유전자 핵산 작제물은 리스테리아 게놈 내로 통합된다. 다른 실시예에서, 미니유전자 작제물은 재조합 리스테리아 백신 균주 내의 플라스미드 내에 있다. 다른 실시예에서, 미니유전자 작제물은 상기 리스테리아 내 염색체외 플라스미드에 존재한다. 다른 실시예에서, 상기 작제물을 상기 리스테리 아 내 염색체외 플라스미드로부터 발현된다.
다른 실시예에서, 치료 방법은 림프절 크기를 감소시킨다. 림프절 크기의 감소는 부분적이거나 또는 100%만큼일 수 있다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 림프절 크기를 90%만큼 감소시킨다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 림프절 크기를 80%만큼 감소시킨다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 림프절 크기를 70%만큼 감소시킨다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 림프절 크기를 60%만큼 감소시킨다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 림프절 크기를 50%만큼 감소시킨다.
다른 실시예에서, 치료 방법은 질환 진행까지의 시간을 증가시킨다. 일 실시예에서, 질환 진행까지의 시간은 비치료된 대상체와 비교하여 적어도 2개월만큼 증가되었다. 일 실시예에서, 질환 진행까지의 시간은 비치료된 대상체와 비교하여 적어도 4개월만큼 증가되었다. 일 실시예에서, 질환 진행까지의 시간은 비치료된 대상체와 비교하여 적어도 6개월만큼 증가되었다. 일 실시예에서, 질환 진행까지의 시간은 비치료된 대상체와 비교하여 적어도 1년만큼 증가되었다. 일 실시예에서, 질환 진행까지의 시간은 비치료된 대상체와 비교하여 적어도 2년만큼 증가되었다. 일 실시예에서, 질환 진행까지의 시간은 비치료된 대상체와 비교하여 적어도 3년만큼 증가되었다. 일 실시예에서, 질환 진행까지의 시간은 비치료된 대상체와 비교하여 적어도 4년만큼 증가되었다. 일 실시예에서, 질환 진행까지의 시간은 비치료된 대상체와 비교하여 적어도 5년만큼 증가되었다.
일 실시예에서, 상기 방법은 추가 요법과 재조합 리스테리아를 공동 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 추가 요법은 수술, 화학요법, 면역 요법, 방사선 요법, 항체-기반 면역 요법 또는 이들의 조합이다. 다른 실시예에서, 추가 요법은 재조합 리스테리아의 투여에 선행한다. 다른 실시예에서, 추가 요법은 재조합 리스테리아의 투여에 뒤따른다. 다른 실시예에서, 추가 요법은 항체 요법이다. 다른 실시예에서, 재조합 리스테리아는 T-효과기 세포 대 조절 T 세포 비율을 증가시키고 더 강력한 항-종양 면역 반응을 생성하기 위해 투여량을 늘리면서 투여된다. 항-종양 면역 반응은 IFN-γ, TNF-α를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 사이토카인, 및 세포 면역 반응을 강화하는 것으로 당해 기술 분야에서 공지된 기타 사이토카인을 종양을 갖는 상기 대상물에 제공함으로써 더욱 강화될 수 있다는 사실이 숙련자에 의해 이해될 것이며, 이들 중 일부는 본원에 참고로 인용된 미국 특허 번호 제6,991,785호에서 찾을 수 있다.
일 실시예에서, 본원에 개시된 방법은 상기 대상체에서 본원에 개시된 면역원성 조성물을 항종양 면역 반응을 증강시키는 항체 또는 이의 기능성 단편과 함께 공동-투여하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 실시예에서, 암을 앓고 있거나 종양을 가진 대상체의 생존을 증가시키는 방법이 본원에 개시되며, 상기 증가 방법은 본원에 개시된 재조합 리스테리아 백신 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
다른 실시예에서, 암을 앓고 있거나 종양을 가진 대상체의 항원-특이적 T 세포를 증가시키는 방법이 본원에 개시되며, 상기 증가 방법은 본원에 개시된 재조합 리스테리아 백신 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명의 치료 프로토콜은 치료적이다. 다른 실시예에서, 프로토콜은 예방적이다. 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물은 유방암 같은 암 또는 가족 유전학으로 인한 다른 유형의 종양 또는 당업자에 의해 이해될 바와 같은 이들 유형의 질환에 걸리기 쉽게 하는 다른 상황에 대한 위험에 있는 사람들을 보호하기 위해 사용된다. 다른 실시예에서, 본 조성물은 수술, 통상의 화학요법 또는 방사선 치료에 의한 종양 성장의 감축시킨 후 암 면역요법으로서 사용된다. 이러한 치료 후, 본 발명의 조성물이 투여되어, 백신의 종양 항원에 대한 세포독성 T-세포(CTL) 반응이 잔여 전이를 파괴하고 암으로부터의 관해를 연장한다. 다른 실시예에서, 본 조성물은 수술, 통상의 화학요법 또는 방사선 치료와 조합하여 암 면역요법으로서 사용된다. 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물은 이전에 구축된 종양의 성장에 영향을 미치고 기존의 종양 세포를 사멸하는 데 사용된다.
용량 범위의 다양한 실시예가 본 발명에 의해 고려된다. 일 실시예에서, 백신 벡터의 경우에서, 용량은 0.4 LD50/용량의 범위이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 0.4-4.9 LD50/용량으로부터이다. 다른 실시예에서 용량은 약 0.5-0.59 LD50/용량으로부터이다. 다른 실시예에서 용량은 약 0.6-0.69 LD50/용량으로부터이다. 다른 실시예에서 용량은 약 0.7-0.79 LD50/용량으로부터이다. 다른 실시예에서 용량은 약 0.8 LD50/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 0.4 LD50/용량 내지 0.8 LD50/용량이다.
다른 실시예에서, 용량은 약 107 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 1.5 x 107 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 2 x 107 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 3 x 107 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 4 x 107 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 6 x 107 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 8 x 107 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 1 x 108 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 1.5 x 108 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 2 x 108 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 3 x 108 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 4 x 108 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 6 x 108 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 8 x 108 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 1 x 109 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 1.5 x 109 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 2 x 109 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 3 x 109 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 5 x 109 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 6 x 109 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 8 x 109 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 1 x 1010 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 1.5 x 1010 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 2 x 1010 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 3 x 1010 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 5 x 1010 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 6 x 1010 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 8 x 1010 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 8 x 109 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 1 x 1011 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 1.5 x 1011 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 2 x 1011 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 3 x 1011 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 5 x 1011 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 6 x 1011 박테리아/용량이다. 다른 실시예에서, 용량은 약 8 x 1011 박테리아/용량이다.
다양한 투여 섭생들 또한 본 발명에 의해 고려된다. 일 실시예에서, 본 발명에 기재된 바와 같은 박테리아를 포함하는 약제학적 조성물은 1회 투여된다. 다른 실시예에서, 본 조성물은 1회 초과로 투여된다. 다른 실시예에서, 본 조성물은 투여 사이에 1주의 간격을 두고 2회 투여된다. 다른 실시예에서, 본 조성물은 투여 사이에 2주의 간격을 두고 2회 투여된다. 다른 실시예에서, 본 조성물은 투여 사이에 3주의 간격을 두고 2회 투여된다. 다른 실시예에서, 본 조성물은 투여 사이에 1주의 간격을 두고 3회 투여된다. 다른 실시예에서, 본 조성물은 투여 사이에 2주의 간격을 두고 3회 투여된다. 다른 실시예에서, 본 조성물은 투여 사이에 3주의 간격을 두고 3회 투여된다. 다른 실시예에서, 상기 섭생들 중 임의의 섭생 후, 추가 투여가 후속된다. 일부 실시예에서, 추가의 투여는 예방적이다. 다른 실시예에서, 추가의 부스터 투여는 대상체가 암 재발을 겪은 경우 수행된다. 다른 실시예에서, 추가의 부스터 투여는 대상체가 암 관해를 겪은 경우 수행된다. 일부 실시예에서, 부스터 투여 섭생은 본 조성물의 매월 투여를 포함한다. 다른 실시예에서, 부스터 투여 섭생은 본 조성물의 격월 투여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 부스터 투여 섭생은 2개월 이상의 간격을 둔 본 조성물의 투여를 포함한다. 다른 실시예에서, 부스터 투여 섭생은 1회의 추가적인 투여를 포함한다. 다른 실시예에서, 부스터 투여 섭생은 1회 초과의 부가적인 투여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 부스터 투여 섭생은 2회의 추가적인 투여를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 부스터 투여 섭생은 3회의 추가적인 투여를 포함한다. 다른 실시예에서, 후속 투여 섭생은 3회 초과의 추가적인 투여를 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 본원에 개시된 약독화된 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물을 대상체에게 부스터 투여하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 본원에서 제공된 약독화된 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물의 부스터 용량을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 추가투여 면역원성 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다. 일 실시예에서, 추가투여량은 상기 면역원성 조성물의 단일 시동투여량을 뒤따른다. 다른 실시예에서, 단일 추가투여량은 시동투여량 후 투여된다. 다른 실시예에서, 두 개의 추가투여량은 시동투여량 후 투여된다. 다른 실시예에서, 세 개의 추가투여량은 시동투여량 후 투여된다. 일 실시예에서, 본원에 개시된 약독화된 리스테리아를 포함하는 면역원성 조성물의 시동 투여량과 부스터 투여량 사이의 기간은 당업자에 의해 실험적으로 결정된다.
다른 실시예에서, 부스터 용량은 본원에 개시된 리스테리아를 포함하는 면역원성 조성물의 대안적 형태이다. 다른 실시예에서, 부스터 용량은 본원에 개시된 면역원성 조성물 및 애쥬번트를 포함한다. 이종성 "시동 추가" 전략은 면역 반응 증강 및 다수의 병원균에 대한 보호에 효과적이다. Schneider 등, Immunol. Rev. 170:29-38(1999); Robinson, H. L., Nat. Rev. Immunol. 2:239-50(2002); Gonzalo, R. M. 등, Strain 20:1226-31(2002); Tanghe, A., Infect. Immun. 69:3041-7(2001). 상기 시동 및 추가투여 주사에 다양한 형태의 항원을 제공하는 것은 항원에 대한 면역 반응을 극대화하는 것처럼 보인다. 보조제 내 단백질로 추가투여하거나 또는 항원을 인코딩하는 DNA의 바이러스 벡터 전달이 뒤따르는 DNA 균주 시동투여가, 항원 특이적 항체 및 CD4+T-세포 반응 또는 CD8+T-세포 반응 각각을 향상시키는 가장 효과적인 방법인 것처럼 보인다. Shiver J. W. 등, Nature 415: 331-5(2002); Gilbert, S. C. 등, Strain 20:1039-45(2002); Billaut-Mulot, O. 등, Strain 19:95-102(2000); Sin, J. I. 등, DNA Cell Biol. 18:771-9(1999). 원숭이 예방접종 연구의 최근 데이터는, HIV gag 항원을 인코딩하는 DNA에, CRL1005 폴록사머(12 kDa, 5% POE)를 첨가하는 것은 HIV gag를 발현하는 아데노바이러스 벡터(Ad5-gag)로 추가투여하는 것이 뒤따르는 HIV gag DNA 시동투여로 원숭이가 예방접종되는 경우 T-세포 반응을 향상시킨다고 제시하고 있다. Ad5-gag 추가투여가 뒤따르는 DNA/폴록사머 시동투여에 대한 세포 면역 반응은 Ad5-gag 추가투여가 뒤따르는 DNA(폴록사머 없음) 시동투여 또는 Ad5-gag 만에 대해서만 유도된 반응보다 컸다. Shiver, J. W. 외. Nature 415:331-5(2002). 미국 특허 출원. 공개 번호 US 2002/0165172 A1은 항원의 면역원성 부분을 인코딩하는 벡터 구성체 및 항원의 면역원성 부분을 포함하는 단백질을 공동 투여해서 면역 반응이 생성되는 것을 설명한다. 이 문서는 B형 간염 항원들과 HIV 항원에 제한된다. 또한, 미국 특허. 번호 제6,500,432호는 관심 있는 폴리뉴클레오티드와 폴리펩타이드의 공동 투여에 의해 핵산 예방접종의 면역 반응을 강화하는 방법에 관한 것이다. 상기 특허에 따르면, 공동 투여는 동일한 면역 반응 동안, 바람직하게는 서로의 0 내지 10일 또는 3 내지 7일 이내에서 폴리뉴클레오티드와 폴리펩타이드의 투여를 가리킨다. 고려되는 항원으로는, 그 중에서도, 간염(모든 형태), HSV, HIV, CMV, EBV, RSV, VZV, HPV, 소아마비, 인플루엔자, 기생충(예를 들어, 말라리아원층 종 유래), 및 병원성 박테리아(M. 튜버큘로시스, M. 레프래, 클라미디아, 쉬겔라, B. 부르그도르페리, 독소원성 E. Coli, S. 티포사, H. 파일로리, V. 콜레라, B. 페르투시스 등이 있으나 이들로 한정되는 것은 아님) 등이 있다. 상기 참고 문헌들 모두는 본원에 그 전체가 참조로 인용된다.
일 실시예에서, 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은 단독으로 대상체에게 투여된다. 다른 실시예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 방사선 요법, 화학요법 또는 체크포인트 저해제, 예컨대 항-PD-1 항체, IDO 경로 저해제 등 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 것과 같은 다른 암 치료법과 함께 투여된다.
일 실시예에서, 본 발명의 치료 프로토콜은 치료적이다. 다른 실시예에서, 프로토콜은 예방적이다. 다른 실시예에서, 본 발명의 조성물은 유방암 같은 암 또는 가족 유전학으로 인한 다른 유형의 종양 또는 당업자에 의해 이해될 바와 같은 이들 유형의 질환에 걸리기 쉽게 하는 다른 상황에 대한 위험에 있는 사람들을 보호하기 위해 사용된다. 다른 실시예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 수술, 통상의 화학요법 또는 방사선 치료에 의해 종양 성장을 감축시킨 후 암 면역요법으로서 사용된다. 이러한 치료 후, 본 발명의 백신이 투여되어서, 백신의 종양 항원에 대한 CTL 반응이 잔여 전이를 파괴하고 암에서 관해를 연장시킨다. 다른 실시예에서, 본 발명의 백신은 이전에 구축된 종양의 성장에 영향을 미치고 기존의 종양 세포를 사멸하는 데 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "한", "하나", "그" 라는 단수 형태는, 문맥상 명백하게 다르게 명시하지 않는 한 참조되는 부분의 복수 개를 포함한다. 예를 들어, "한 화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"이라는 용어는, 복수의 화합물의 혼합물을 포함한 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
본원 전체에 걸쳐, 본 발명의 다양한 실시예들은 범위 포맷으로 제시될 수 있다. 범위 형태의 설명은, 편의성과 간략성을 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 변경할 수 없게 한정하는 것으로서 해석해서는 안 된다는 점을 이해하도록 한다. 이에 따라, 범위 설명은, 모든 가능한 부 범위 및 그 범위 내의 개별적인 수치를 특정하게 개시한 것으로서 고려해야 한다. 예를 들어, 1 내지 6 등의 범위 설명은, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등의 부 범위, 및 그 범위 내의 개별적인 수, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6을 특정하게 개시한 것으로서 고려해야 한다. 이는 범위의 폭에 상관없이 적용된다.
본원에서 수치 범위가 표시될 때마다, 이것은, 표시된 범위 내에서의 임의의 언급되는 수치(분수 형태 또는 정수 형태)를 포함하는 것을 의미한다. 제1 표시 수와 제2 표시 수 사이에 "걸치는/걸치다" 및 제1 표시 수로부터 제2 표시 수까지 "걸치는/걸치다"라는 구들은, 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며, 제1 표시 수와 제2 표시 수 및 이들 사이의 모든 분수와 정수 형태의 수를 포함하는 것을 의미한다.
용어 "방법"은, 화학 분야, 약학 분야, 생물학 분야, 생화학 분야 및 의료 분야들의 실시자들에게 알려져 있거나 그러한 실시자들에 의해 알려져 있는 방식, 수단, 기법, 및 절차로부터 쉽게 발생되는 주어진 작업을 달성하기 위한 방식, 수단, 기술, 및 절차를 포함한 소정의 작업을 달성하기 위한 방식, 수단, 기술, 및 절차를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
다음의 예시들에서, 다수의 특정 세부사항들이 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 설명된다. 그러나, 본 발명은 이들 특정 세부사항들 없이도 실시될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 발명을 불명료하게 하지 않도록, 주지된 방법, 절차 및 성분들이 상세하게 설명되지 않았다.
약제학적 제형 및 투여
본 발명의 백신, 면역학적 조성물 또는 재조합 리스테리아를 포함하는 약제학적 조성물은, 다른 실시예에서, 비경구로, 암 주위로, 경점막으로, 경피로, 근육내로, 정맥내로, 경피내로, 피하로, 경구로, 복막내로, 심실내로, 두개내로, 질내로 또는 종양내로 등의 당업자에게 알려져 있는 임의의 방법에 의해 대상체에 투여된다.
일 실시예에서, 대상체에서 적어도 하나의 암을 치료, 억제 또는 저해하는 방법이 본원에 개시되며, 상기 방법은 상기 대상체에게 재조합 리스테리아 균주를 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 암 또는 종양은 특정 암 또는 종양에 민감한 것으로 알려져 있는 특정 집단에서 본원에 개시된 면역원성 조성물의 투여에 의해 예방될 수 있다. 일 실시예에서, 이러한 민감성은 흡연과 같은 환경적 요인 때문일 수 있고, 일 실시예에서, 이러한 요인은 집단에 폐암을 발병할 수 있으나, 다른 실시예에서는, 이러한 민감성은 유전적 요인 때문일 수 있고, 예를 들어, BRCA1/2 돌연변이를 가진 집단은, 일 실시예에서 유방암, 다른 실시예에서는 난소암에 민감할 수 있다. 다른 실시예에서, 염색체 8q24, 염색체 17q12, 및 염색체 17q24.3상에 있는 하나 이상의 돌연변이는, 당업계에 공지된 바와 같이, 전립선암에 대한 민감성을 증가시킬 수 있다. 암 민감성의 한 원인이 되는 다른 유전적 및 환경적 요인은 당업계에 공지되어 있다.
본원에 개시된 방법 및 조성물의 다른 실시예에서, 본 백신 또는 조성물은 경구 투여되며, 따라서 경구 투여에 적합한 형태로 제형화되며, 즉 고체 조제물 또는 액체 조제물로 제형화된다. 적절한 고체 경구 제형은, 태블릿, 캡슐, 알약, 과립, 펠릿 등을 포함한다. 적절한 액체 경구 제형은, 용액, 현탁액, 분산제, 유탁액, 오일 등을 포함한다. 본 발명의 다른 실시예에서, 활성 성분은 캡슐로 제형화된다. 본 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 활성 화합물 및 불활성 담체 또는 희석제에 더하여 경질 겔화 캡슐을 포함한다.
다른 실시예에서, 백신 또는 조성물은, 액체 조제물의 정맥내, 동맥내, 또는 근육내 주입에 의해 투여된다. 적절한 액체 제형은, 용액, 현탁액, 분산제, 유탁액, 오일 등을 포함한다. 일 실시예에서, 제약 조성물은, 정맥내 투여되며, 따라서, 정맥내 투여에 적절한 형태로 조제된다. 다른 실시예에서, 약제학적 조성물은, 동맥내 투여되고, 따라서 동맥내 투여에 적절한 형태로 제형화된다. 다른 실시예에서, 약제학적 조성물은, 근육내 투여되고, 따라서 근육내 투여에 적절한 형태로 제형화된다.
용어 "면역원성 조성물", "조성물" 및 "약학적 조성물"은 상호 교환가능하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 본 발명의 조성물은 본원에 기재된 재조합 리스테리아 및 애쥬번트를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 면역원성 조성물은 본원에 개시된 재조합 리스테리아를 포함한다. 다른 실시예에서, 면역원성 조성물은, 당업계에 알려져 있거나 본원에 개시된 바와 같은 애쥬번트를 포함한다. 또한, 이러한 조성물의 투여는 본원에서 추가로 개시되는 바와 같이, 면역 반응을 증강시키거나 조절 T 세포에 대한 T 효과기 세포의 비율을 증가시키거나 항종양 면역 반응을 유도함을 이해해야 한다.
용어 "약제학적 조성물"은, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 리스테리아 균주를 포함하는 활성 성분 또는 성분들을 치료적 유효량으로 포함한다.
숙련자라면, "투여"라는 용어가 대상물을 본 발명의 조성물과 접촉시킨다는 것을 포함한다는 점을 이해할 것이다. 일 실시예에서, 투여는, 시험관내에서, 즉, 테스트 튜브에서, 또는 생체내에서, 즉, 생물, 예를 들어, 인간의 세포들이나 조직들에서 달성될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 리스테리아 균주 및 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시예에서, 용어 "치료하는"은 질병을 치유하는 것을 의미한다. 다른 실시예에서, "치료하는"은 질병을 예방하는 것을 의미한다. 다른 실시예에서, "치료하는"은 질병의 발생을 감소시키는 것을 의미한다. 다른 실시예에서, "치료하는"은 질병의 증상을 개선시키는 것을 의미한다. 다른 실시예에서, "치료하는"은 환자의 무실행 생존율 또는 전체 생존률을 증가시키는 것을 의미한다. 다른 실시예에서, "치료하는"은 질병의 진행을 안정화하는 것을 의미한다. 다른 실시예에서, "치료하는"은 차도를 유도하는 것을 의미한다. 다른 실시예에서, "치료하는"은 질병의 진행을 늦추는 것을 의미한다. 다른 실시예에서, 종양 또는 암을 참조할 때 "치료하는"은 종양 또는 암의 퇴행을 유도하는 것을 지칭한다. 용어 "감소시키는," "억제하는" 및 "저해하는"은 줄이거나 저하하는 것을 지칭한다.
일 실시예에서, 용어 "치료하는"은, 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방적 측정 둘 모두를 지칭하고, 그 목적은 본원에 기재된 바와 같이 표적화된 병리학적 병태 또는 장애를 예방하거나 줄이는 것이다. 따라서, 일 실시예에서, 치료는, 질환, 장애, 또는 상태, 또는 이들의 조합에 연관된 증상의 중증도를 직접적으로 영향을 끼치거나 치유하는 것, 억제하는 것, 금지시키는 것, 방지하는 것, 감소시키는 것, 증상에 연관된 발병을 지연시키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, "치료"는, 특히, 퇴행 지연, 진정 가속, 진정 유도, 진정 증강, 회복 가속, 대체 치료요법에 대한 저항의 효능을 증가 또는 그 저항의 감소, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, "방지" 또는 "지연"은, 특히, 증상의 발병을 지연, 질환 재발 방지, 재발 에피소드의 빈도 횟수 감소, 증상 에피소드 간의 잠복기 증가, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, "억제" 또는 "저해"는, 특히, 증상의 중증도를 감소시키는 것, 급성 에피소드의 중증도를 감소시키는 것, 증상의 개수를 감소시키는 것, 질환 관련 증상의 발생을 감소시키는 것, 증상의 잠복기를 감소시키는 것, 증상을 완화시키는 것, 이차 증상을 감소시키는 것, 이차 감염을 감소시키는 것, 환자 생존을 증가시키는 것, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 증상은, 일차적인 한편, 다른 실시예에서, 증상은 이차적이다. 일 실시예에서, "일차"는, 구체적인 질환 또는 장애의 직접적 결과인 증상을 가리키는 한편, 일 실시예에서, "이차"는 일차 원인으로부터 또는 일차 원인에 따라 유도되는 증상을 가리킨다. 일 실시예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 화합물은, 일차적인 또는 이차적인 증상 또는 이차적인 합병증을 치료한다. 다른 실시예에서, "증상"은, 질환 또는 병리학적 상태의 임의의 소견일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약"은 5%가 더해지거나 빼지고, 또는 다른 실시예에서 10%가 더해지거나 빼지고, 또는 다른 실시예에서 15%가 더해지거나 빼지고, 또는 다른 실시예에서 20%가 더해지거나 빼지는 정량적 용어를 의미한다.
"대상물"이라는 용어는, 상태 또는 그 후유증에 대한 치료를 필요로 하거나 상태 또는 그 후유증에 민감한 성인 인간 또는 인간 아이, 십대 또는 청소년을 비롯한 포유 동물을 포함할 수 있으며, 또한 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 랫, 및 마우스 같은 비-인간 포유 동물을 포함할 수도 있다. 또한 상기 용어는 가축을 포괄할 수도 있다는 것을 이해할 것이다. 용어 "대상물"은 모든 면에서 정상적인 개인을 배제하지 않는다.
치료 목적을 위해 용어 "포유 동물"은 사람, 가정 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠, 또는 개를 포함한 개와 비슷한 애완 동물 , 및 말, 고양이, 소, 돼지, 양 등을 포함하는 포유 동물로 분류된 임의의 동물을 의미하는 것으로 숙련자에 의해 이해될 것이다.
종양의 치료에 관련하여 "치료학적 유효량"은 하나 이상의 하기 효과를 적용할 수 있는 양을 의미한다: (1) 진행을 감속시키고 성장 저지를 완료하는 것을 포함하는, 어느 정도까지 종양 성장의 저해; (2) 종양 세포 수의 감소; (3) 종양 크기의 감소; (4) 말초 기관으로 종양 세포 침투의 저해(즉, 감소, 진행 감속 또는 완전한 중단); (5) 전이의 감소(즉, 감소, 진행 감속 또는 완전한 중단); (6) 종양의 퇴행 또는 거부를 야기할 수 있으나 야기할 필요가 없는 항-종양 면역 반응의 증강; 및/또는 (7) 장애에 연관된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 완화. 종양 치료의 목적을 위해 본원에서 개시된 백신의 "치료학적 유효량"은 경험적으로 그리고 정기적인 방식으로 결정될 수 있다.
다음의 예시들에서, 다수의 특정 세부사항들이 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 제시된다. 그러나, 본 발명은 이들 특정 세부사항들 없이도 실시될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 발명을 불명료하게 하지 않도록, 주지된 방법, 절차 및 성분들이 상세하게 설명되지 않았다. 따라서, 이 예시들은 어떠한 방식으로든 본 발명의 넓은 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
재료 및 실험 방법( 실시예 1-2)
실시예 1: LLO -항원 융합은 항종양 면역성을 유도한다
세포주
C57BL/6 동계 TC-1 종양을, HPV-16 E6 및 E7로 무한증식하고 c-Ha-ras 종양유전자로 형질전환하였다. T. C. Wu(존스홉킨스 의과대학, 볼티모어, 메릴랜드주)에 의해 제공되는 TC-1은, 낮은 수준의 HPV-16 E6과 E7을 발현하고 c-Ha-ras 종양 유전자로 형질전환된 고종양형성 폐상피세포이다. 10% CO2와 37℃에서, RPM 1640, 10% FCS, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 100 μM 비필수 아미노산, 1 mM 소듐 피루베이트, 50 마이크로몰(mcM) 2-ME, 400 마이크로그램(mcg)/ml G418, 및 10% 내셔컬 컬렉션형 배양물-109 배지에서 TC-1을 성장시켰다. C3은, HPV16의 완전한 게놈으로 무한 증식되고 pEJ-ras로 형질전환된 C57BL/6 마우스로부터의 마우스 배아 세포이다. EL-4/E7은, E7로 레트로바이러스 변환된 티모마 EL-4이다.
L. 모노사이토게네스 균주 및 전파
사용된 리스테리아 균주는 Lm-LLO-E7(에피솜 발현 시스템에서의 hly-E7 융합 유전자; 도 1A), Lm-E7(리스테리아 게놈으로 통합된 단일-복제 E7 유전자 카세트), Lm-LLO-NP("DP-L2028"; 에피솜 발현 시스템에서의 hly-NP 융합 유전자), 및 Lm-Gag("ZY-18"; 염색체로 통합된 단일-복제 HIV-1 Gag 유전자 카세트) 이었다. E7은 프라이머 5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3'(SEQ ID NO: 21; XhoI 부위는 밑줄이 그어져 있음) 및 5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(SEQ ID NO: 21; SpeI 부위는 밑줄이 그어져 있음)를 이용하여 PCR에 의해 증폭되었으며 pCR2.1(Invitrogen사, 캘리포니아주 샌디에고)에 연결되었다. E7을 XhoI/ SpeI 소화에 의해 pCR2.1로부터 잘라내고, pGG-55에 연결하였다. hly-E7 융합 유전자 및 다능성 전사 인자 prfA는 pGG-55를 생성하며, 다중복제 셔틀 플라스미드(Wirth R 등, J Bacteriol, 165: 831, 1986)인, pAM401로 클로닝되었다. hly 프로모터는 hly 유전자 산물(용혈성 C-말단이 결여됨, "ΔLLO"로서 하기에 언급되었음)의 처음 441 아미노산의 발현을 구동하며, 이것은 E7 유전자의 Xhol 위치에 의해 결합되며, LLO-E7로서 전사되고 분비된 hly-E7 융합 유전자를 산출한다. 리스테리아의 prfA 음성 균주인, XFL-7(펜실베니아 대학교, Hao Shen 박사에게서 제공됨)과, 생체내 플라스미드의 유지를 위해 선택된 pGG-55의 형질전환(도 1a 내지 도 1b). hly 프로모터 및 유전자 단편은 프라이머 5'-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(SEQ ID NO: 23; NheI 부위는 밑줄이 그어져 있음) 및 5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3'(SEQ ID NO: 24; XhoI 부위는 밑줄이 그어져 있음)를 이용하여 생성되었다. prfA 유전자는 프라이머 5'-ACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAA CCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(SEQ ID NO: 25; XbaI 부위는 밑줄이 그어져 있음) 및 5'-CCC GTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SEQ ID NO: 26; SalI 부위는 밑줄이 그어져 있음)를 이용하여 PCR 증폭되었다. E7의 분비와 발현을 구동하는 신호 서열과 hly 촉진제를 함유하는 발현 카세트를 LM 게놈의 orfZ 도메인 내에 도입하여 Lm-E7을 생성하였다. E7는 프라이머 5'-GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3'(서열번호: 27; BamHI 위치는 밑줄이 그어져 있음) 및 5'-GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3'(서열번호: 28; XbaI 위치는 밑줄이 그어져 있음)를 이용하여 PCR에 의해 증폭되었다. 이어서, E7을 pZY-21 셔틀 벡터에 연결하였다. LM 균주 10403S를 형성 플라스미드인 pZY-21-E7로 형질전환하였으며, 이 플라스미드는, LM 게놈의 X, Y, Z 도메인에 대응하는 1.6kb 서열의 중간에 삽입된 발현 카세트를 포함한다. 상동 도메인은, 상동 재조합에 의한 E7 유전자 카세트의 orfZ 도메인 내로의 삽입을 허용한다. E7 유전자 카세트의 orfZ 도메인 내로의 통합을 위해 클론들을 선별하였다. (Lm-LLO-E7 및 Lm-LLO-NP)가 있는 또는 (Lm-E7 및 ZY-18) 클로로암페니콜(20 μg/ml)이 없는 뇌 심장 주입 배지에서 세균을 성장시켰다. -80℃에서 알리코트에서 세균을 동결하였다. 웨스턴 블롯팅에 의해 발현을 검증하였다(도 2).
웨스턴 블롯팅
리스테리아 균주는 37에서 루리아-베트로니 배지(Luria-Bertoni medium)에서 성장하였으며 600 nm에서 측정된 동일한 광학 밀도에서 수확되었다. 상청액을 TCA 침전시키고, 0.1 N NaOH가 보충된 1x 샘플 버퍼에서 재부유시켰다. 각 세포 펠릿 또는 각 TCA-침전된 상청액의 동일한 양을 4-20% Tris-글리신 SDS-PAGE 겔(NOVEX, 캘리포니아주 샌디에고)에 로딩하였다. 겔들을 폴리비닐리덴 디플루오라이드로 형질전환하고, 항-E7 모노클로날 항체(mAb)(Zymed Laboratories, 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)로 프로빙한 후, HRP-접합된 항-마우스 이차 Ab(Amersham Pharmacia Biotech, 영국 리틀 챌폰트)로 배양하고, Amersham ECL 검출 시약으로 현상하고, Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)에 노출시켰다.
종양 성장의 측정
최단 표면 직경과 최장 표면 직경에 걸친 캘리퍼로 하루 걸러 종양을 측정하였다. 이러한 두 개의 측정값의 평균을 다양한 시점에 대하여 밀리미터 단위의 평균 종양 직경으로서 플롯팅하였다. 종양 직경이 20 mm에 도달했을 때 마우스를 희생시켰다. 각 시점에 대한 종양 측정값은 생존하고 있는 마우스에 대해서만 도시되어 있다.
확립된 종양 성장에 대한 리스테리아 재조합체의 영향
6주 내지 8주된 C57BL/6 마우스(Charles River)는 좌측 옆구리에 2x105 TC-1 세포를 피하식으로 수용하였다. 종양 접종 후 1주일째, 종양은 직경이 4 내지 5 mm인 감지 가능한 크기에 도달하였다. 이어서, 8개 마우스 군을 0.1 LD50 복강내에서 Lm-LLO-E7(107 CFU), Lm- E7(106 CFU), Lm-LLO-NP(107 CFU), 또는 Lm-Gag(5 x 105 CFU)로 7일째와 14일째 치료하였다.
51 Cr 방출 분석
6 내지 8주된 C57BL/6 마우스를, 0.1LD50 Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP, 또는 Lm-Gag로 복강내 면역시켰다. 예방 접종후 10일째, 비장을 채취하였다. 지지 세포(feeder cell)로서 방사선 조사 TC-1 세포가 있는 배양물에서 세포를 확립하였고(100:1, 비장 세포: TC-1), 5일 동안 생체외에서 자극한 후, 표적들을 사용하여 표준 51Cr 방출 분석에 사용하였다: EL-4, EL-4/E7, 또는 E7 H-2b 펩타이드(RAHYNIVTF)로 펄스 처리된 EL-4(SEQ ID NO: 29). 3회 수행된 E:T 세포 비는 80:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 및 2.5:1이었다. 37℃에서의 4시간 배양 후에, 세포를 펠릿 처리하고, 50 μl 상청액을 각 웰로부터 제거하였다. Wallac 1450 섬광 계수기(Gaithersburg, MD)로 샘플들을 분석하였다. 퍼센트 특이성 용해를, [(분당 실험 카운트(cpm)-순간 cpm)/(총 cpm-순간 cpm)] x 100으로서 결정하였다.
TC -1 특이성 증식
C57BL/6 마우스를 0.1 LD50로 면역시키고, 1 LD50 Lm-LLO-E7, Lm-E7, Lm-LLO-NP 또는 Lm-Gag로 20일째 복강내 주입에 의해 추가투여하였다. 추가투여 후 6일째, 면역된 원시 마우스로부터 비장을 채취하였다. E7 Ag의 소스로서 웰 당 2.5 x 104, 1.25 x 104, 6 x 103, 또는 3 x 103 방사선 조사된 TC-1 세포가 있는, 또는 TC-1 세포가 없는, 또는 10 μg/ml Con A가 있는, 바닥이 평평한 96개의 웰 판에서 5x105/웰로 배양액에 비장 세포를 확립하였다. 45시간 후에 세포를 0.5 μCi[3H]티미딘/웰로 펄스 처리하였다. Tomtec harvester 96(코네티컷주 오렌지)을 사용하여 18시간 후에 평판들을 거두고, Wallac 1450 섬광 계수기로 증식을 분석하였다. cpm의 변화를 실험적 cpm-no Ag cpm으로서 산출하였다.
유동 세포 분석
C57BL/6 마우스를 0.1 LD50 Lm-LLO-E7 또는 Lm-E7로 정맥 내(i.v.) 면역시키고 30일 후 추가투여하였다. CellQuest® 소프트웨어를 구비한 FACSCalibur® 유동 세포 분석기(Becton Dickinson, 마운틴 뷰, 캘리포니아주)를 사용하여 CD8(53-6.7, PE 접합형), CD62 리간드(CD62L; MEL-14, APC 접합형), 및 E7 H-2Db 테트라머에 대한 3색 유동 세포 분석을 수행하였다. 부스트가 실온(rt)에서 E7 펩타이드(RAHYNIVTF)(SEQ ID NO: 29) 또는 대조군 (HIV-Gag) 펩타이드로 로딩된 H-2Db 테트라머로 염색된 5일 후 비장세포가 채취되었다. 사합체들을 1/200 희석으로 사용하고, Dr. Larry R. Pease(Mayo Clinic, 로체스터, 미네소타주) 및 NIAID Tetramer Core Facility 및 NIH AIDS Research and Reference Reagent Program에 의해 제공되였다. 테트라머+, CD8+, CD62Llow 세포를 분석하였다.
B16F0 -난자 실험
24 C57BL/6 마우스를 5x105 B16F0-난자 세포로 접종하였다. 3일, 10일, 및 17일째, 0.1 LD50 Lm-OVA (106 cfu), Lm-LLO-OVA (108 cfu)로 8개 마우스의 군을 면역시키고, 8마리 동물은 치료하지 않은 상태로 두었다.
통계
종양 직경의 비교를 위해, 각 군에 대한 종양 크기의 평균 및 SD를 측정하고, 스튜던트 t 검정에 의해 통계 유의성을 결정하였다. p ≤ 0.05가 유의성을 갖는 것으로 간주되었다.
결과
TC-1 성장에 영향을 미치는 능력에 대하여 Lm-E7 및 Lm-LLO-E7을 비교하였다. C57BL/6 마우스의 좌측 측면에 피하 종양을 확립하였다. 이후 7일째, 종양이 검출 가능한 크기(4 내지 5 mm)에 도달하였다. 0.1 LD50 Lm-E7, Lm-LLO-E7, 또는 대조군인 Lm-Gag 및 Lm-LLO-NP로 7일째와 14일째 마우스를 예방접종하였다. Lm-LLO-E7은 확립된 TC-1 종양의 75%의 완벽한 퇴행을 유도한 한편, 군의 다른 2마리 마우스에서 종양 성장을 제어하였다(도 3). 대조적으로, Lm-E7과 Lm-Gag에 의한 면역화는 종양 퇴행을 유도하지 않았다. 이 실험을 여러 번 반복하였으며, 항상 매우 유사한 결과를 얻었다. 또한, 서로 다른 면역화 프로토콜들 하에서 Lm-LLO-E7에 대하여 유사한 결과들을 얻었다. 다른 실험에서, 확립된 5 mm TC-1 종양이 있는 마우스를 단일 면역화로 치료할 수 있었다.
다른 실험들에서, 2개의 다른 E7-발현 종양 세포주로 유사한 결과를 얻었다: C3 및 EL-4/E7. Lm-LLO-E7에 의한 예방접종의 효능을 확인하기 위해, 종양이 제거된 동물들을 상대로 60일째 또는 40일째 TC-1 또는 EL-4/E7 종양 세포로 각각 재도전하였다. Lm-LLO-E7로 면역된 동물들은, 실험 종료(TC-1의 경우엔 124일 및 EL-4/E7의 경우엔 54일)까지 종양이 없었다. 따라서, ΔLLO를 이용한 융합 단백질로서 항원의 발현은 항원의 면역원성을 향상시킨다.
실시예 2: LM- LLO -E7 치료는 TC -1 특이성 비장 세포 증식을 유발한다
Lm-E7와 Lm-LLO-E7, E7-특이적 증식 반응에 의한 T 세포의 유도를 측정하기 위해, 항원-특이적 면역능력의 측정이, 면역화된 마우스에서 측정되었다. Lm-LLO-E7로 면역된 마우스로부터의 비장 세포는, 비장 세포에서 E7의 소스로서 방사선 조사된 TC-1 세포에 노출시 증식되었다: 20:1, 40:1, 80:1, 및 160:1의 TC-1 비율(도 4). 역으로, Lm-E7과 rLm 대조군 면역 마우스로부터의 비장 세포는 백그라운드 수준의 증식만을 나타내었다.
실시예 3: ActA -E7 및 PEST-E7 융합은 항-종양 면역을 부여한다
재료 및 실험 방법
Lm- ActA -E7의 제조
Lm-ActA-E7는 LM의 재조합 균주이며, actA 단백질의 절단된 버전으로 융합된 E7 단백질을 발현하는 플라스미즈를 포함한다. Lm-actA-E7는 pDP-2028을 개질함으로써 작제된, 플라스미드 벡터 pDD-1를 리스테리아로 도입함으로써 생성되었다. pDD-1은 310 bp hly 프로모터 및 hly 신호 서열(ss)의 카피를 발현하는 발현 카세트를 포함하며, 이것은 ActA-E7의 발현 및 분비를 구동한다; 4개의 PEST 서열을 포함하는 actA 유전자의 1170 bp(말단 절단된 ActA 폴리펩타이드는 해당 분자의 처음 390개의 AA로 이루어짐; 300 bp HPV E7 유전자; 1019 bp prfA 유전자(병원성 유전자의 대조군 발현); 및 형질전환된 박테리아 클론의 선택을 위한 CAT 유전자(클로람페니콜 내성 유전자)(Sewell 외, (2004), Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg., 130:92-97).
hly 프로모터(pHly) 및 유전자 단편은 프라이머 5'-GGGGTCTAGACCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(Xba I 부위는 밑줄 그어져 있음; SEQ ID NO: 30) 및 프라이머 5'-ATCTTCGCTATCTGTCGCCGCGGCGCGTGCTTCAGTTTGTTGCGC-'3(NotI 위치는 밑줄 그어져 있음)를 이용하여 pGG55(실시예 1)로부터 PCR 증폭되었다. 처음 18개의 뉴클레오티드는 ActA 유전자 중첩이다; SEQ ID NO: 31). actA 유전자는 프라이머 5'-GCGCAACAAACTGAAGCAGCGGCCGCGGCGACAGATAGCGAAGAT-3'(NotI 부위는 밑줄 그어져 있음; SEQ ID NO: 32) 및 프라이머 5'-TGTAGGTGTATCTCCATGCTCGAGAGCTAGGCGATCAATTTC-3'(XhoI 부위는 밑줄 그어져 있음; SEQ ID NO: 33)를 이용하여 LM 10403s 야생형 게놈으로부터 PCR 증폭되었다. E7 유전자는 프라이머 5'-GGAATTGATCGCCTAGCTCTCGAGCATGGAGATACACCTACA-3'(XhoI 위치는 밑줄 그어져 있음; SEQ ID NO: 34) 및 프라이머 5'-AAACGGATTTATTTAGATCCCGGGTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(XmaI 위치는 밑줄 그어져 있음; SEQ ID NO: 35)를 이용하여 pGG55(pLLO-E7)로부터 PCR 증폭되었다. prfA 유전자는 프라이머 5'-TGTTCTCAGAAACCATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(Xmal 위치는 밑줄 그어져 있음; SEQ ID NO: 36) 및 프라이머 5'-GGGGGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SalI 부위는 밑줄 그어져 있음; SEQ ID NO: 37)를 이용하여 LM 10403s 야생형 게놈으로부터 PCR 증폭되었다. Hly 프로모터-actA 유전자 융합(pHly-actA)은 PCR 생성되었고, 정제된 pHly DNA 및 정제된 actA DNA로부터 업스트림 pHly 프라이머(SEQ ID NO: 30) 및 다운스트림 actA 프라이머(SEQ ID NO: 33)를 이용하여 증폭되었다.
prfA 유전자에 융합된 E7 유전자(E7-prfA)는 PCR 생성되었으며, 정제된 E7 DNA 및 정제된 prfA DNA로부터 업스트림 E7 프라이머(SEQ ID NO: 34) 및 다운스트림 prfA 유전자 프라이머(SEQ ID NO: 37)을 이용하여 증폭되었다.
E7-prfA 융합 산물에 융합된 pHly-actA 융합 산물은 PCR 생성되었으며, 정제된 융합 pHly-actA DNA 산물 및 정제된 융합 E7-prfA DNA 산물로부터 업스트림 pHly 프라이머(SEQ ID NO: 30) 및 다운스트림 prfA 유전자 프라이머(SEQ ID NO: 37)을 이용하여 증폭되었고, pCRII(Invitrogen, 라호야, 캘리포니아주)로 연결되었다. 형질전환용 대장균(컴피턴트 E. coli)(TOP10'F, Invitrogen, 라호야, 캘리포니아주)은 pCRII-ActAE7로 형질전환 되었다. 용해 및 분리 이후, 플라스미드는 BamHI(770 bp 및 6400 bp 단편 크기로 예상됨 (또는 삽입이 벡터로 반전되었을 때: 2500 bp 및 4100 bp)) 및 BstXI(2800 bp 및 3900 bp 단편 크기로 예상됨)을 이용하여 제한 분석에 의해 선별되었으며, 또한 업스트림 pHly 프라이머(SEQ ID NO: 30) 및 다운스트림 prfA 유전자 프라이머(SEQ ID NO: 37)을 이용하여 PCR 분석으로 선별되었다.
pHly-actA-E7-prfA DNA 삽입은 Xba I 및 Sal I의 이중 소화에 의해 pCRII로부터 절단되었으며, Xba I 및 Sal I로 또한 소화된 pDP-2028로 연결되었다. 발현 시스템F pActAE7를 갖춘 TOP10'F 컴피턴트 E. coli(Invitrogen, 라호야, 캘리포니아주) 형질전환 후, 클로람페니콜 내성 클론은 업스트림 pHly 프라이머(SEQ ID NO: 30) 및 다운스트림 PrfA 유전자 프라이머(SEQ ID NO: 37)를 이용하여 PCR 분석에 의해 선별되었다. pActAE7을 포함하는 클론은 뇌-심근침출 배지(클로로람페니콜 (20 mcg(마이크로그램)/ml(밀리리터), Difco, 디트로이트, 미시간주)에서 성장하였으며pActAE7는 미디프렙 DNA 정제 시스템 키트(Promega, 매디슨, 위스콘신주)를 이용하여 박테리아 세포로부터 단리되었다. 페니실린-처리된 리스테리아(XFL-7 균주)의 prfA-음성 균주는 Ikonomidis 외(1994, J. Exp. Med. 180: 2209-2218) 문헌에 기재된 바와 같이, 발현 시스템 pActAE7으로 형질전환 되었으며, 클론은 생체내 플라스미드의 유지를 위해 선택되었다. 클론은 37℃에서 클로람페니콜(20 mcg/ml)과 함께 뇌-심근침출 배지에서 성장하였다. 박테리아는 -80℃의 분획에서 냉각되었다.
항원 발현의 면역 검증
Lm-ActA-E7가 ActA-E7를 분비하는지 확인하기 위해(약 64 kD), 리스테리아 균주가 37에서 루리아-베르토니(LB) 배지에서 성장하였다. 단백질은 트리클로로아세트산(TCA)로 배양 상층액으로부터 침전되었으며 0.1 N 수산화나트륨으로 1x 샘플 완충액에서 재현탁되었다. 각 TCA 침전된 상층액의 동일한 양이 4% 내지 20% Tris-글리세린 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 젤(NOVEX, 샌디에고, 캘리포니아주) 상에 로딩되었다. 젤은 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인으로 이동되었으며 1:2500 항-E7 단일클론성 항체(Zymed Laboratories, 사우스 샌프란시스코, 캘리포니아주)로, 그 후 1:5000 홀스래디쉬 퍼록시다제-공액 항-마우스 IgG(Amersham Pharmacia Biotech, 리틀 섈폰트, 영국)로 프로빙되었다. 블롯은 Amersham 증강된 화학발광 검출 시약으로 성장되었으며 방사능 사진 필름(Amersham)에 노출되었다(도 5a).
Lm-PEST-E7, Lm- ΔPEST -E7, 및 Lm- E7epi의 제조(도 6a)
Lm-PEST-E7는 이것이 hly 유전자의 프로모터 및 PEST 서열, 특히 LLO의 처음 50개의 아미노산을 함유한다는 것을 제외하고는, Lm-LLO-E7와 동일하다. Lm-PEST-E7를 구성하기 위해, hly 프로모터 및 PEST 영역은 SOE(중첩 연장에 의한 유전자 스플라이싱) PCR 기술을 이용하여 전체-길이 E7 유전자에 융합되었다. E7 유전자 및 hly-PEST 유전자 단편은 LLO의 처음 441 아미노산을 함유하는, 플라스미드 pGG-55로부터 증폭되었으며, 이전의 PCR 기술에 의해 서로 스플라이싱되었다. 최종 플라스미드인, pVS16.5를 형성하기 위해, hly-PEST-E7 단편 및 prfA 유전자가 플라스미드 pAM401로 서브클로닝 되었으며, 이것은 시험관내 선택에 대해 클로람페니콜 내성 유전자를 포함하며, 생성된 플라스미드는 XFL-7을 형질전환 하기 위해 사용되었다.
Lm-ΔPEST-E7는 이것이 PEST 서열이 결여되었다는 것을 제외하고는 Lm- LLO-E7와 동일한 재조합 리스테리아 균주이다. 에피솜 발현 시스템은 에피솜 발현 시스템이 hly-E7 융합 유전자로부터 PEST-함유 영역(bp 333 내지 387)를 제거하기 위해 설계된 프라이머를 이용하여 제조되었다는 것을 제외하고는, Lm-PEST-E7에 대해 기재된 바와 같이 본질적으로 제조되었다. Lm-E7epi는 PEST 영역 또는 LLO 없이 E7을 분비하는 재조합 균주이다. 이러한 균주를 형질전환 하기 위해 사용되는 플라스미드는 hly 프로모터 및 E7 유전자로 융합된 신호 서열의 유전자 단편을 포함한다. 이러한 구조는 본래의 Lm-E7과는 상이하며, 이것은 염색체로 통합된 E7 유전자의 단일 복제를 발현하였다. Lm-E7epi는 발현된 E7 항원의 형태를 제외하고는 Lm- LLO-E7, Lm-PEST-E7, 및 Lm-ΔPEST-E7와 완벽하게 동종이다.
결과
Lm-ActA-E7 대 Lm-LLO-E7에 의해 유도된 항-종양 면역을 비교하기 위해, 2 x 105 TC-1 종양 세포가 마우스에서 피하로 이식되었으며 감지 가능한 크기로 성장하였다(약 5 밀리미터 [mm]). 마우스는 7일 및 14일째에 Lm-ActA-E7(5 x108 CFU), (십자) Lm-LLO-E7(108 CFU)(사각형) 또는 Lm-E7(106 CFU)(원형) 둘 중 하나의 LD50으로 복강내 면역화되었다. 26일째, 모든 처리되지 않은 동물(삼각형) 및 Lm-E7로 면역화된 동물이 큰 종양을 성장시킨 반면, Lm-LLO-E7 및 Lm-ActA-E7에서 모든 동물은 종양이 없었으며 그렇게 유지되었다(도 5b). 따라서, ActA-E7 융합과의 백신접종은 종양 퇴행을 야기한다.
또한, Lm-LLO-E7, Lm-PEST-E7, Lm-ΔPEST-E7, 및 Lm-E7epi는 E7-발현 종양의 퇴행을 유발하는 그들의 능력에 대해 비교되었다. 피하 TC-1 종양은 40마리의 C57BL/6 마우스의 왼쪽 측면에 구축되었다. 종양이 4 내지 5 mm에 도달한 이후, 마우스는 8마리의 5개 그룹으로 나누어졌다. 각각의 그룹은 4개의 재조합 LM 백신 중 1개로 처리되었으며, 1개의 그룹은 처리하지 않고 방치되었다. Lm-LLO-E7 및 Lm-PEST-E7는 각각, 5/8 및 3/8 경우에서 확립된 종양의 퇴행을 유도하였다. 어떠한 시점에서도 Lm-PEST-E7 또는 Lm-LLO-E7로 처리된 마우스의 평균 종양 크기 사이에는 유의한 차이가 없었다. 그러나, PEST 서열, Lm-ΔPEST-E7 및 Lm-E7epi 없이 E7을 발현시키는 백신은, 하나를 제외하고는 모든 마우스에서 종양 퇴행을 유도하는데 실패하였다(도 6b, 상부 패널). 이것은 28일째에서 평균 종양 크기에서 통계적으로 유의한 차이가 Lm-LLO-E7 또는 Lm-PEST-E7로 처리된 종양과 Lm-E7epi 또는 Lm-ΔPEST-E7로 처리된 것 사이에서 발견되었던, 2개 실험의 대표였다; P < 0.001, 스튜던트 t 검정; 도 6b, 하부 패널). 또한, 테트라머-양성 비장세포의 향상된 백분율이 PEST-함유 백신으로 백신접종된 마우스의 비장에서 3개의 실험에 걸쳐 증식하며 나타났다(도 6c). 따라서, PEST-E7 융합과 백신접종은 종양 퇴행을 야기한다.
실시예 4: LLO , ActA , 또는 PEST-유사 서열에 대한 E7의 융합은 E7-특이적 면역을 향상시키고 종양-침윤성 E7-특이적 CD8 + 세포를 생성한다
재료 및 실험 방법
인산 완충 식염수(PBS) 중 2 x 105 TC-1 종양 세포 100 mcl와 MATRIGEL®(BD Biosciences, 프랭크린 레이크스, 뉴저지주) 400 mcl를 포함하는 MATRIGEL® 500 mcl(마이크로리터)를 12 C57BL/6 마우스 (n=3)의 좌측 옆구리에 피하 내 이식하였다. 7일, 14일, 및 21일째 마우스를 복강내 면역시키고, 28일째 비장과 종양을 채취하였다. 마우스로부터 종양 MATRIGEL을 제거하고, 얼음 상에 2 ml의 RP 10 배지를 함유하는 튜브에서 밤새 4℃에서 배양하였다. 종양을 겸자로 갈고, 2 mm 블록들로 절단하고, 3 ml의 효소 혼합물(0.2 mg/ml 콜라게나제-P, PBS 내 1 mg/ml DNAse-1)로 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 조직 현탁액을 나일론 메시를 통해 필터링하고, 테트라머 및 IFN-감마 염색을 위해 5% 소태아혈청 + PBS 내 0.05%의 NaN3로 세척하였다.
브레펠딘 A의 존재 하에 5시간 동안 1 마이크로몰(mcm)의 E7 펩타이드를 이용하여 비장 세포와 종양 세포를 107 세포/ml로 배양하였다. 세포를 2회 세척하고, 4℃에서 1시간 동안 또는 밤새 50 mcl의 항-마우스 Fc 수용체 상청액(2.4 G2)에서 배양하였다. 세포를 표면 분자 CD8 및 CD62L에 대하여 염색하고, 침투 키트 Golgi-stop® 또는 Golgi-Plug® (Pharmingen, 샌디에고, 캘리포니아주)를 사용하여 침투, 고정하고, IFN-감마에 대해 염색하였다. 이중-레이저 유동 세포 분석기 FACSCalibur 를 사용하여 500,000개 이벤트를 얻고, Cellquest 소프트웨어(Becton Dickinson, 프랭클린 레이크스, 뉴저지주)를 사용하여 분석하였다. 활성화된 (CD62Llow) CD8+ T 세포 내의 IFN-감마 분비 세포의 퍼센트를 산출하였다.
테트라머 염색의 경우, H-2Db 테트라머가 피코에리트린 (PE)-접합 E7 펩타이드(RAHYNIVTF, SEQ ID NO: 27)로 로딩되었으며, 1시간에 걸쳐 상온에서 염색되었고, 이후 항-알로피코시아닌(APC) 접합 MEL-14(CD62L) 및 FITC-접합 CD8+로 4℃에서 30분 동안 염색되었다. 세포는 비장 및 종양에서의 테트라머+CD8+ CD62Llow 세포를 비교하여 분석되었다.
결과
항원 특이 면역성을 향상시키는 Lm-ActA-E7의 능력을 분석하기 위해, 마우스에 TC-1 종양 세포를 이식하고, Lm-LLO-E7(1 x 107 CFU), Lm-E7 (1 x 106 CFU), 또는 Lm-ActA-E7(2 x 108 CFU)로 면역시켰거나, 또는 치료하지 않았다(나이브). Lm-LLO-E7 및 Lm-ActA-E7으로부터의 마우스의 종양은 Lm-E7 또는 처리되지 않은 마우스에서 보다 더 높은 백분율의 IFN-감마-분비 CD8+ T 세포(도 7a) 및 테트라머-특이적 CD8+ 세포 (도 7b)를 함유하였다.
다른 실험에서는, 종양이 있는 마우스에 Lm-LLO-E7, Lm-PEST-E7, Lm-ΔPEST-E7, 또는 Lm-E7epi를 투여하고, 종양 내의 E7-특이성 림프구의 레벨을 측정하였다. 7일째와 14일째, 4개 백신의 0.1 LD50으로 마우스를 치료하였다. 21일째 종양을 채취하고, CD62L, CD8 항체로 염색하고, E7/Db 테트라머로 염색하였다. 종양 내 테트라머-양성 림프구의 증가된 백분율은 Lm-LLO-E7 및 Lm-PEST-E7로 백신접종된 마우스에서 관찰되었다(도 8a). 이러한 결과는 세 가지 실험을 통해 재현이 가능하였다(도 8b).
따라서, Lm-LLO-E7, Lm-ActA-E7, 및 Lm-PEST-E7 각각은, 종양-침윤 CD8+ T 세포의 유도 및 종양 퇴행에 효과적이다.
재료 및 실험 방법 ( 실시예 5 내지 10)
박테리아 균주, 형질전환 및 선택
E. coli 균주 MB2159가 표준 프로코콜을 이용하여, 형질전환을 위해 사용되었다. 박테리아 세포는 H2O로 세척함으로써 전기천공을 위해 준비되었다.
E. coli 균주 MB2159 (Strych U 등, FEMS Microbiol Lett. 2001 Mar 15;196(2):93-8)는 D-알라닌 라세미화효소를 합성할 수 없는 alr (-)/dadX (-) 결실 돌연변이이다. 리스테리아 균주 dal(-)/dat(-) (Lmdd)는 유사하게 dal 및 dat 유전자의 부분 결실로 인하여 D-알라닌 라세미화효소를 합성할 수 없다.
플라스미드 제조
plcA 유전자(Mengaud 등, Infect. Immun. 1989 57, 3695-3701)의 공개된 서열을 이용하여, PCR이 염색체 DNA로부터 유전자를 증폭하는 데에 사용되었다. 그런 다음, 증폭된 생성물을 SalI-생성된 DNA 말단 및 XbaI-생성된 DNA 말단을 사용하여 pAM401에 연결하여, pDP1462를 생성하였다.
prfA 단독을 함유하는, 플라스미드 pDP1500은, XbaI 및 PstI으로의 제한, 그들을 평활하게 만드는 T4 DNA 중합효소로 DNA 말단 처리, 및 분자내 연결 이후에 pDP1462로부터, plcA 유전자인, 염기 429 내지 1349(Mengaud 외, 상기 문헌)를 삭제함으로써 제조되었다.
plcA 프로모터 및 plcA의 3' 말단의 부분을 함유하는, 플라스미드 pDP1499는, PstI 및 NsiI로 제한 및 분자내 연결 이후 pDP1339로부터, plcA 내부 단편인, 염기 428 내지 882(Mengaud 외, Infect. Immun. 1989 57, 3695-3701)를 결실함으로써 작제되었다.
pDP1526(pKSV7::ΔplcA)는 BAMHI 및 XbaI로 제한된 pKSV7, plcA(염기 882 내지 1351; Mengaud 외, 상기 문헌)의 5' 말단을 함유하는 pAM401::plcA 로부터의 468 bp XbaI 및 NsiI-발생된 단편, plcA(염기 77 내지 429; Mengaud 외, 상기 문헌)의 3' 말단을 함유하는 pAM401::plcA prfA로부터의 501 bp PstI- 및 BamHI- 발생된 단편의 단일 3-부분 연결에 의해 제조되었다.
염기 1 내지 429(Mengaud 외, 상기 문헌)인, prfA 프로모터는, pDP1462의 EcoRI및 Pstl 이중 분해에 의해 단리되었으며 단편은 pDP1498을 생성하기 위해 EcoRI-및 PstI-제한된 pKSV7 로 그 후 연결되었다. 대략 3 kb 길이의, 임의의 두 개의 HindIII-생성된 10403S 염색체 DNA이, 임의의 통합 대조군 플라스미드 pDP1519 및 pDP1521를 생성하기 위해 HindIII-제한된 pKSV7로 연결되었다.
리스테리아 모노사이토게네스 돌연변이 균주의 제조
리스테리아 모노사이토게네스 균주 DP-L1387는 이전에 기재된 바와 같이(Camilli 외, J. Bacteriol. 1990, 172, 3738-3744) 제조된, SLCC 5764의 Tn917-LTV3 뱅크로부터 감소된 레시티나제(PC-PLC)를 갖는 돌연변이로서 분리되었다. Tn917-LTV3 삽입의 위치는 이전에 기재된 바와 같이(Sun 외, Infect. Immun. 1990 58, 3770-3778) 하나의 전이인자-염색체 DNA 접합을 서열결정외함으로써 결정되었다. 리스테리아 모노사이토게네스는 이전에 기재된 바와 같이(Camilli 외, 상기문헌) 플라스미드 DNA로 형질전환되었다. pAM401, pKSV7, 및 리스테리아 모노사이토 게네스에서 그들의 유도체의 유지를 위한 선택적 압력은 배지의 ml 당 10 μg의 클로람페니콜의 존재 하에서 발휘되었다. 또한, pKSV7 유도체의 유지는 그람-양성 박테리아에서 플라스미드 복제에 대한 허용 온도인, 30℃에서의 성장이 요구되었다.
리스테리아 모노사이토게네스로의 pKSV7 유도체의 통합이 플라스미드에서 리 스테리아 모노사이토게네스 DNA 서열 및 그들의 대응하는 염색체 대립유전자 사이의 상동 재조합에 의해 발생되었다. 통합 돌연변이는 배지의 ml 당 10 μg의 클로람페니콜을 포함하는 뇌-심근침출배지(BHI) 액체 배지에서, pKSV7 복제에 대한 비허용 온도인, 40℃에서 대략 30세대에 대한 성장에 의해 강화되었다. 후속적으로, 각각의 통합 균주를 배지 1 ml 당 10 ㎍ 클로람페니콜을 함유하는 BHI 한천 상에서 콜로니 정제하고, 40℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 통합 균주로부터 분리된 염색체 DNA의 서던 블롯 분석은 통합된 플라스미드의 존재를 확인시켰다.
DP-L1552의 제조는 상기 기재된 바와 같이 부분이배체(merodiploid) 중간체를 형성하기 위해, pKSV7 유도체, pDP1526의 통합에 의해 성취되었다. 분자 내 상동 재조합을 통한, 통합된 플라스미드의 자생 절제는 낮은 빈도수에서 발생하였다. 염색체로부터 절단된 플라스미드에서의 박테리아는 대략 50세대에 대한 BHI 액체 배지에서 30℃의 성장에 의해 강화되었다. 이러한 단계 동안 선택적 압력의 본질은 통합된 온도-민감성 플라스미드를 포함하는 균주의 약간의 성장 결함으로 인하여 잘 알려지지 않았다. 대략 50%의 절제 이벤트, 즉 3' 삭제 서열 사이의 상동 재조합으로부터 야기된 것은, 염색체에서 야생형 대립유전자에 대한 ΔplcA의 대립유전자 교환을 야기한다.
절단된 플라스미드는 대략 30세대에 대해 BHI에서 40℃에서 박테리아의 성장에 의해 치유되었다. 염색체 상 ΔplcA 대립유전자를 유지하는 플라스미드의 치유된 박테리아는 5 ml의 오버레이 BHI 한천/2.5% 난황/2.5% 인산-완충 식염수(PBS)(BHI/난황 한천)를 함유하는 BHI 한천 플레이트 상에서의 성장 후에 콜로니 주변에 혼탁 영역을 생성하는 그들의 불이행에 의하여 확인되었다. 혼탁 영역은 불용성 디아실클리세롤 침전물을 남기는, 난황 중 PI의 PI-PLC 가수분해에서 야기되었다. 리스테리아 모노사이토게네스 염색체 상에서 plcA 결실을 수정하는 것은 PCR을 이용하여 삭제된 대립유전자를 증폭하고 결실을 가로질러 서열결정함으로써 확인되었다.
따라서, PI-PLC 음성 돌연변이체(plcA 결실 돌연변이체)는 약독화된 리스테리아 모노사이토게네스 백신의 생성를 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 다른 돌연변이는 동일한 방법, 즉, actA 결실 돌연변이, plcB 결실 돌연변이, 및 plcA 및 plcB 둘 다가 결여된 이중 돌연변이를 이용하여 제조되었으며, 이러한 모든 것은 약독화 리스테리아 모노사이토게네스 백신을 생성하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 본 발명에 내용을 감안하여, 당업자는 상기 서술한 것뿐만 아니라 다른 약독화 돌연변이를 제조할 수 있을 것이다.
Lmdd의 제조
dal 유전자는 이전의 850-bp dal 유전자 PCR 산물의 5' 말단으로부터의 450-bp 단편 및 dal 유전자 PCR 산물의 3' 말단으로부터의 450-bp 단편 사이의 에리스로마이신 저항성 유전자를 운반하는 염색체 유전자 및 온도-민감성 셔플 플라스미드 pKSV7(Smith K 외, Biochimie. 1992 Jul-Aug;74(7-8):705-11) 사이의 이중-대립유전자 교환에 의해서 초기에 불활성화되었다. 이어서, 유전자의 82%를 커버하는 dal 결실 돌연변이가 원하는 결실 주변의 온전한 유전자(유전자의 업스트림 및 다운스트림 서열을 포함)의 5' 및 3' 말단으로부터 상동 영역을 운반하는 pKSV7와 유사한 교환 반응에 의해 제조되었다. PCR 분석은 이러한 염색체 결실의 구조를 확인하기 위해 사용되었다.
염색체 dat 유전자는 유사한 대립유전자 교환 반응에 의해 불활성화 되었다. pKSV7은 온전한 dat 유전자(유전자의 서열 업스트림 및 다운스트림 포함함)의 5' 및 3' 말단 둘 다로부터 PCR에 의해 유래된 450-bp 단편을 수송하기 위해 변형되었다. 이러한 두 개의 단편은 적절한 PCR에 의해 연결되었다. 염색체로의 이러한 구성 교류는 dat 유전자의 중심 염기의 30%의 결실을 야기하였으며, PCR 분석에 의해 확인되었다.
박테리아 배양 및 리스테리아의 생체내 계대
E. coli은 다음의 표준 방법으로 배양되었다. 리스테리아를 LB 배지(Difco, 디트로이트, 미시간주) 내에서 250 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 성장시켰다. 50 ㎍/ml 스트렙토마이신을 첨가하여, 지수성장기(exponential growth phase) 동안 채취하였다. Lm-LLOE7에 대해, 37 ㎍/ml 클로람페니콜을 배지에 첨가하였다. 성장 속도 결정을 위해, 박테리아는 10 ml의 LB+ 항생제에서 16시간에 걸쳐 배양되었다. OD600 nm가 측정되었으며 배양 밀도는 균주 사이에서 평균화되었다. 배양은 적용되는 경우 LB+ 적절한 항생제 및 D-알라닌으로 1:50으로 희석되었다.
마우스에서 LM의 계대
1 x 108 CFU는 C57BL/6 마우스로 복강내(i.p.) 주사되었다. 3일째, 비장이 단리되었으며 PBS 내에서 균질화되었다. 비장 현탁액의 분취량은 적용 가능한 항생제와 함께 LB 플레이트 상에 플레이팅되었다. 몇몇의 콜로니가 주입 스톡을 확립하기 위해 팽창되고 혼합되었다.
항생제 내성 인자가 없는 플라스미드 pTV3작의 작제
p60- dal 카세트의 작제. 항생제 내성이 없는 벡터의 제조에서 첫 단계는 dal 유전자에 대한 절단된 p60 프로모터의 융합의 제조이다. LM 알라닌 라세마제(dal) 유전자(포워드 프라이머:5'-CCA TGG TGA CAG GCT GGC ATC-3'; SEQ ID NO: 38)(리버스 프라이머:5'-GCT AGC CTA ATG GAT GTA TTT TCT AGG-3'; SEQ ID NO: 39) 및 최소 p60 프로모터 서열(포워드 프라이머:5'-TTA ATT AAC AAA TAG TTG GTA TAG TCC-3'; SEQ ID NO: 40)(리버스 프라이머:5'-GAC GAT GCC AGC CTG TCA CCA TGG AAA ACT CCT CTC-3'; SEQ ID NO: 41)는 LM 균주 10403S의 게놈으로부터 PCR 증폭에 의해 분리되었다. 프라이머는 p60 및 dal의 이후 융합을 위해 스플라이스 중첩 확장 (SOE)-PCR에 의하여 p60 서열의 Pacl 위치 업스트림, dal 서열의 Nhel 위치 다운스트림(굵은 글씨로 표시된 제한 위치), 및 p60 프로모터의 중복 dal 서열(처음 18 bp) 다운스트림에 도입하였다. 절단된 p60 프로모터의 서열은 다음과 같다: CAAATAGTTGGTATAGTCCTCTTTAGCCTTTGGAGTATTATCTCATCATTTGTTTTTTAGGTGAAAACTGGGTAAACTTAGTATTATCAATATAAAATTAATTCTCAAATACTTAATTACGTACTGGGATTTTCTGAAAAAAGAGAGGAGTTTTCC(SEQ ID NO: 42)(Kohler 등의, J Bacteriol 173:4668-74, 1991). SOE-PCR을 이용하여, p60 및 dal PCR 산물은 융합되었으며 클로닝 벡터 pCR2.1(Invitrogen, 라호야, 캘리포니아주)으로 클로닝되었다.
pGG55로부터 항생제 내성 유전자의 제거. 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT) 유전자를 pGG55로부터 제거하고 p60-dal 카세트를 도입하기위한 후속 클로닝 전략은 간헐적으로 그람-양성균 복제 영역의 제거를 야기한다(oriRep; Brantl 등의, Nucleic Acid Res 18:4783-4790, 1990). 그램-양성 oriRep을 재-도입하기 위해, oriRep는 (GGCGCCACTAACTCAACGCTAGTAG, SEQ ID NO: 43) 서열의 NarI/EheI 업스트림 부위가 추가된 5'-프라이머 및 (GCTAGCCAGCAAAGAAAAACAAACACG, SEQ ID NO: 44) 서열의 NheI 다운스트림 부위가 추가된 3'-프라이머를 이용하여, pGG55로부터 PCR-증폭되었다. PCR 산물은 클로닝 벡터 pCR2.1로 클로닝되었으며 서열이 확인되었다.
p60-dal 서열을 pGG55 벡터에 통합하기 위해, p60-dal 발현 카세트가 PacI/NheI 이중 분해에 의하여 pCR-p60dal로부터 절단되었다. pGG55에서 그램-양성 박테리아에 대한 복제 영역은 EheI 및 NheI에 대한 추가적인 제한 부위를 도입하기 위해 PCR(프라이머 1, 5'-GTC GAC GGT CAC CGG CGC CAC TAA CTC AAC GCT AGT AG-3'; SEQ ID NO: 45); (프라이머 2, 5'-TTA ATT AAG CTA GCC AGC AAA GAA AAA CAA ACA CG-3'; SEQ ID NO: 46)에 의해 pCR-oriRep로부터 증폭되었다. PCR 산물은 pCR2.1-TOPO (Invitrogen, 칼즈배드, 캘리포니아)로 연결되었으며 서열이 확인되었다. 복제 영역은 EheI/NheI 분해에 의해 절단되었으며, 벡터 pGG55는 EheI 및 NheI로 이중 분해되었으며, 플라스미드로부터 CAT 유전자 둘 다가 동시에 제거되었다. p60-dal 및 oriRep인, 두 개의 삽입과 pGG55 단편이 pTV3를 수득하면서, 함께 연결되었다(도 9). pTV3은 또한 prfA(병원성 조절 인자 A) 유전자를 포함한다. 이러한 유전자는 pTV3의 기능에 필요한 것은 아니지만, 추가적인 선택 마커가 요구되거나 또는 필요한 경우에 사용될 수 있다.
실시간 PCR을 위한 DNA의 준비
전체 리스테리아 DNA는 Masterpure® 총 DNA 키트(Epicentre, 매디슨, 위스콘신주)를 이용하여 제조되었다. 리스테리아는 37℃에서 24시간에 걸쳐 배양되었으며 25 ml의 루리아-베르토니 액체 배지(LB)에서 250 rpm으로 진탕되었다. 박테리아 세포는 원심분리에 의해 펠렛 처리되고, 5 mg/ml의 리소자임이 보충된 PBS에서 재현탁되었으며, DNA가 분리된 이후, 37℃에서 20분 동안 배양되었다.
실시간 PCR에 대한 표준 표적 DNA을 수득하기 위해, LLO-E7 유전자가 pGG55(5'-ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTAC-3'(SEQ ID NO: 47); 5'-GCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGTGGTTTCTG AGAACAGATG-3'(SEQ ID NO: 48))로부터 PCR 증폭되었고, 벡터 pETblue1(Novagen, 샌디에고, 캘리포니아주) 내로 클로닝되었다. 마찬가지로, plcA 증폭산물(amplicon)이 pCR2.1.로 클로닝되었다. E. coli는 각각, pET-LLOE7 및 pCR-plcA로 형질전환되었으며, 정제된 플라스미드 DNA는 실시간 PCR에 사용하기 위해 제조되었다.
실시간 PCR
Taqman 프라이머-프로브 세트(Applied Biosystems, 포스터 시티, 캘리포니아주) 가 ABI PrimerExpress 소프트웨어(Applied Biosystems)와 플라스미드 타겟으로서 E7를 이용하여, 다음의 프라이머를 이용하여 설계되었다: 5'-GCAAGTGTGACTCTACGCTTCG-3'(SEQ ID NO: 49); 5'-TGCCCATTAACAGGTCTTCCA-3'(SEQ ID NO: 50); 5'-FAM-TGCGTA CAAAGCACACACGTAGACATTCGTAC-TAMRA-3'(SEQ ID NO: 51) 및 단일-카피 유전자 plcA (TGACATCGTTTGTGTTTGAGCTAG -3'(SEQ ID NO: 52), 5'-GCAGCGCTCTCTATACCAGGTAC-3'(SEQ ID NO: 53); 리스테리아 게놈 표적으로서(5'-TET-TTAATGTCCATGTTA TGTCTCCGTTATAGCTCATCGTA-TAMRA-3'; SEQ ID NO: 54).
0.4 μM 프라이머 및 0.05 mM 프로브가 제조업체가 권장한 바와 같이 PuRE Taq RTG PCR beads(Amersham, 피스카타웨이, 뉴저지주)와 혼합되었다. 표준 곡선은 각각의 타겟에 대해 정제된 플라스미드 DNA, pET-LLOE7 및 pCR-plcA(내부 표준)로 제조되었으며 알려지지 않은 샘플에서 유전자 복제 수를 계산하는 데 사용되었다. E7 복제 / plcA 복제의 평균 비율은 표준 곡선에 기반하여 계산되었으며 Lm-E7에서 야기된 Lmdd-TV3 및 Lm-LLOE7의 결과를 나눔으로써 보정되었고, E7 유전자의 단일 복제를 갖는 리스테리아 균주는 게놈으로 통합되었다. 모든 샘플은 3 회 반복되는 각 qPCR 분석에서 3 회 수행되었다. 샘플 사이의 편차는 KyPlot 소프트웨어를 이용하여 양방향 ANOVA에 의해 분석되었다. 결과는 p가 0.05 미만(p < 0.05)인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
성장 측정
박테리아는 37℃에서 성장하였고, 루리아 베르타니(LB) 배지 +/- 100 마이크로그램 (μg)/ml D-알라닌 및/또는 37 μg/ml 클로람페니콜에서 250 rpm 진탕되었다. 출발 접종원은 모든 균주에 대해 동일하도록 OD600 nm 측정에 기반하여 조정되었다.
용혈성 용해 분석
4 x 109 CFU의 리스테리아가 해동되어, 원심분리(1분, 14000 rpm)에 의해 펠렛 처리되고 1 M 시스테인과 함께 100 μl PBS, pH 5.5에서 재현탁되었다. 박테리아는 연속적으로 1:2 희석되었으며 분비된 LLO를 활성화시키기 위해 37℃에서 45분 동안 배양되었다. 섬유소가 제거된 양의 전혈(시더레인, 혼비, 온타리오주, 캐나다)은 세척 단계 사이에 8분 동안 3000 x g에서 세포를 펠렛 처리하면서, 남아있는 상층액이 제거될 때까지 5 볼륨의 PBS로 2회 및 6 볼륨의 PBS-시스테인으로 3 내지 4 회 세척되었으며, 그 후 PBS-시스테인에서 10%(v/v)의 최종 농도로 재현탁되었다. 100 μl의 10% 세척된 혈액 세포는 100 μl의 리스테리아 현탁액과 혼합되어 37℃에서 추가적인 45분 동안 인큐베이션되었다. 그런 다음, 비-용해된 혈액 세포를 원심분리(10분, 1000 x g)에 의해 펠렛 처리하였다. 100 μl의 상층액을 새로운 플레이트로 전이하였으며, OD530 nm를 샘플 희석에 대해 결정하고 플로팅하였다.
Lmdd - Tv3의 치료학적 효능
105 TC-1(ATCC, 매너서스, 버지니아주)이 C57BL/6 마우스(n=8)에 피하내 이식되었으며 종양이 감지된 이후에, 약 7일간 성장되도록 하였다. TC-1는 C57BL/6 HPV E6 및 E7로 불멸화되고 활성화된 라스(ras)로 형질전환된 상피세포주이며, 이것은 피하내 이식에 따라 종양을 형성한다. 마우스는 종양 세포의 이식 이후 0.1 LD50의 적절한 리스테리아 균주로 7일 및 14일째에 면역화되었다. 비-면역화된 대조군 그룹(나이브)이 또한 포함되었다. 종양 성장은 전자 캘리퍼스로 측정되었다.
ActA 결실 돌연변이의 생성
Lm dal dat(Lmdd) 균주는 독성 인자, ActA의 비가역적 결실에 의해 약독화되었다. Lm dal dat(Lmdd) 백그라운드에서 actA의 프레임 결실은 다운스트림 유전자의 발현에 어떠한 극성 효과를 방지하기 위해 구성되었다. Lm dal dat ΔactA은 ActA의 591개 아미노산의 결실과 함께 N-말단에 처음 19개의 아미노산 및 C-말단의 28개 아미노산 잔기를 함유한다. 염색체 자리로의 유전자의 결실은 actA 결실 영역으로 외부 어닐링하는 프라이머를 이용하여 확인되었다. 이것들은 도 12에 도시된 바와 같이 프라이머 3(Adv 305-tgggatggccaagaaattc)(SEQ ID NO: 55) 및 4(Adv304-ctaccatgtcttccgttgcttg)(SEQ ID NO: 56)이다. PCR 분석이 Lmdd 및 Lm-ddΔactA로부터 분리된 염색체 DNA에서 수행되었다. Lm-dd 염색체 DNA에서 프라이머 쌍 1, 2 및 3, 4의 두 개의 상이한 세트로 증폭한 이후 DNA 단편의 크기는 3.0 Kb 및 3.4 Kb가 될 것으로 예상되었다. 그러나, Lm-ddΔactA에 대하여, 프라이머 쌍 1, 2 및 3, 4를 이용한 PCR의 예상된 크기는 1.2 Kb 및 1.6 Kb이었다. 따라서, 도 12의 PCR 분석은 actA의 1.8 kb 영역이 균주인 Lm-ddΔactA에서 결실되었음을 확인시킨다. DNA 서열결정이, 균주인 Lm-ddΔactA에서 actA-함유 영역의 결실을 확인하기 위해 PCR 산물에서 또한 수행되었다(도 13, SEQ ID NO: 57).
(SEQ ID NO: 57).
염증성 사이토카인의 생성:
RAW 264.7와 같은 대식세포는 Lm prfA-(pGG55), Lm dal dat, Lm dal dat actA, Lm dal dat actA Δ inlC 및 Lm dal dat Δ inlC와 같은 상이한 리스테리아 백본에 감염되었으며 상층액은 상이한 ELISA 기반 키트를 이용한 다양한 사이토카인의 수준을 정량화하기 위해 상이한 시점에서 수확되었다. 정량화된 사이토카인은 IFN-γ, TNF-α 및 IL-6를 포함한다.
생체내 사이토카인 생성:
생체내 사이토카인 생성 및 호중구의 점증을 측정하기 위해, C57BL/6 마우스가 Lm prfA-(pGG55), Lm dal dat, Lm dal dat actA , Lm dal dat actA Δ inlC 및 Lm dal dat Δ inlC의 상이한 108 CFU, 리스테리아 대조군 또는 식염수의 동등한 양으로 복강내 주사되었다. 12시간 이후 마우스는 희생되었으며 복막강이 2 ml의 PBS로 세척되었다. 복막 세척액은 성장 배지에 플레이팅 후 박테리아 로딩 및 MIP-1α, KC, MCP 등과 같은 염증성 사이토 카인의 분석에 대해 검사되었다. 유세포 분석기를 사용하여 호중구 및 대식세포의 수는 Gr-1, CD11b 및 F4/80와 같은 마커로 염색 후 결정되었으며 그 후 이러한 집단은 CellQuest 소프트웨어를 이용하여 정량화되었다.
트랜스웰 이동 분석:
이러한 분석은 inlC 결실 균주와 함께 골수 유래 대식세포 또는 수지상 세포의 주사 이후 호중구의 이동에서 증가가 있는 지를 확인하기 위해 수행되었다. 골수-유래 대식세포 또는 수지상 세포는 C57BL/6와 같은 마우스로부터 분리되었으며 inlC 돌연변이 또는 대조군 리스테리아로 감염되었다. 감염된 세포를 이용하여 트랜스웰 분석은 코닝 코스타(corning costar) 트랜스웰 플레이트를 이용하여 설정된다. 분석은 3, 5, 또는 8 마이크론 동공 트렌스웰 플레이트를 이용하여 초기에 규격화된다. 호중구 이동을 시험하기 위해, 플레이트는 플레이트의 하단에서의 APCs 및 챔버에서 웰의 상단에서의 호중구를 감염시켰다. 상이한 시점에서 세포는 하단으로 이동한 호중구의 수를 확인하기 위해 계산된다.
Lm dal dat actA Δ inlC 돌연변이의 치료학적 효능:
inlC 돌연변이체의 치료학적 효능을 결정하기 위해, 인간 전립선 특이적 항원(PSA)이 개념의 증거로서 종양 항원으로 사용되었다. Lm dal dat actA inlC의 백본은 플라스미드, LmddAinlC142를 야기하는 인간 PSA에 대한 발현 카세트를 함유하는 pAdv142로 형질전환되었다. LmddAinlC142 균주는 발현 및 융합 단백질인, tLLO-PSA의 분비를 위한 것을 특징으로 한다. 또한 LmddAinlC142 균주는 생체내 계대가 발현 및 융합 단백질인, tLLO-PSA의 분비에 대해 확인된 이후 마우스 및 수득된 콜로니에서 생체내 2회 계대된다. 백신 작업 스톡은 생체내 2번째 계대 이후 수득된 콜로니로부터 제조되었으며 이것은 치료학적 효과 및 면역원성의 평가를 위해 사용된다.
종양 미세환경에 미치는 영향:
종양 미세환경에서 면역 세포의 침윤을 유발하는 LmddA, LmddAΔactA, LmddAΔPlcA, LmddAΔPlcB, LmddAΔprfA, LmddAinlC142, LmddA142 및 다른 대조군 균주의 능력이 확인되었다. 이러한 연구에서 마우스는 0일째에 1 x 106 TPSA23 종양 세포로 접종되었으며 7일, 14일 및 21일째 LmddAinlC142, LmddA142 및 다른 대조군 균주의 108 CFU로 백신접종되었다. 종양은 28일째 수확되었으며 Gr-1, CD11b, CD3, CD4, CD8, CD25, Foxp3, NK1.1 및 CD62L와 같은 상이한 세포 표면 마커로 후속 염색에 대해 처리되었다. 조사된 이러한 상이한 세포 집단 마커의 이용은 대식세포(CD11b+), NK 세포(NK1.1+), 호중구(Gr-1+CD11b+), 골수 유래 억제 세포(MDSC)(Gr-1+CD11b+), 조절 T 세포(CD4+ CD25+ Foxp3+) 및 이펙터 T 세포(CD8+CD3+CD62Llow)를 포함한다. 또한 이펙터 T 세포는 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2와 같은 이펙터 사이토카인을 생성하는 그들의 기능적인 능력에 대해 특성 분석된다. 종양 내 조절 T 세포 및 MDSC는 T 세포 증식의 억제를 야기하는 그들의 능력에 대해 시험된다.
결과
실시예 5: 항생제 내성 유전자 대신 아미노산 대사 효소를 포함하는 플라스미드는 E. coli 및 시험관내 및 생체내 둘 다에서 유지된다.
D-알라닌 라세미화효소에 기반한 영양요구주 보완 시스템은 항생제 내성 유전자의 사용 없이 LM에서 플라스미드 유지를 매개하는 데에 이용되었다. E. coli 균주 MB2159는 D-알라닌 라세미화효소를 합성할 수 없는 alr(-)/dadX(-) 결실 돌연변이이다. 리스테리아 균주 dal(-)/dat(-)(Lmdd)는 유사하게 dal 및 dat 유전자의 부분 결실로 인하여 D-알라닌 라세미화효소를 합성할 수 없다. E. coli - 리스테리아 벡터 pAM401에 기반한, 플라스미드 pGG55는, pTV3을 생성하는 리스테리아 p60 프로모터의 제어 하에 CAT 유전자를 제거하고 p60-dal 발현 카세트로 대체됨으로써 변형된다(도 9). DNA는 몇몇 콜로니로부터 정제되었다.
실시예 6: 대사 효소를 포함하는 플라스미드는
박테리아의 독성을 증가시키지 않는다
독성이 LLO 기능에 연결됨에 따라, Lmdd-TV3 및 Lm-LLOE7 사이의 용혈성 용해 활성이 비교되었다. 이러한 분석은 적혈구의 용해에 의하여 LLO 기능을 시험하며 배양 상층액, 정제된 LLO 또는 박테리아 세포로 수행될 수 있다. Lmdd-TV3는 Lm-LLOE7보다 높은 용혈성 용해 활성을 나타냈다.
생체내 독성이 또한 더 직접적인, 그에따라 더 정확한, LD50 값의 결정, 독성 평가의 방법에 의해 측정되었다. Lmdd-TV3(0.75 x 109)의 LD50은 Lm-LLOE7(1 x 109)의 것과 매우 근접하였으며, 대사 효소를 포함하는 플라스미드가 박테리아의 독성을 증가시키지 않음을 나타내었다.
실시예 7: 대사 효소를 포함하는 플라스미스에 의한 항-종양 면역의 유도
암 백신으로서 대사 효소-함유 플라스미드의 효능은 종양 퇴행 모델에서 측정되었다. HPV 백신 성장을 위해 잘 특성 분석되며 Lmdd-TV3 또는 Lm-LLOE7로 면역법 이후 유사한 크기의 확립 종양 퇴행의 제어된 비교를 위해 허용된, TC-1 세포주 모델이 사용되었다. 2개의 별도의 실험에서, Lmdd-TV3 및 Lm-LLOE7로 마우스의 면역화는 백신접종된 그룹 사이에서 통계학적으로 유의한 차이점(p < 0.05)을 나타내지 않는 유사한 종양 퇴행(도 14)을 야기하였다. 비-면역화된 마우스가 그들의 종양이 직경 20 mm에 도달하였을 때 희생된 반면, 모든 면역화된 마우스는 63일 후까지 생존하였다. 치료된 마우스는 실험의 종료까지 종양이 없는 채로 남아있었다.
따라서, 대사 효소-함유 플라스미드는 치료학적 암 백신으로서 효능이 있다. 치료학적 암 백신에 대해 요구되는 면역 반응이 예방적인 암 백신에 대해 요구되는 것보다 더 강하기 때문에, 이러한 결과는 예방적인 암 백신에 대한 것뿐만 아니라 유용성을 나타낸다.
실시예 8: inlC -결실 돌연변이는 상당히 높은 수준의 케모카인 및
사이토카인을 생성한다.
inlC 결실 돌연변이는 감염 위치에 대해 호중구 및 백혈규 침윤을 야기하며 MIP-1α, KC(IL-8의 마우스 동종체), MCP와 같은 상당히 높은 수준의 케모카인을 생성한다. 따라서 상이한 리스테리아 균주가 복강 내 투여될 때, inlC 돌연변이는 이러한 사이토카인 및 케모카인의 증가를 나타내며, 이것은 주입 12시간 후 수득된 복막액에서 호중구 및 대식세포를 유도한다. 또한, inlC 결실 돌연변이는 대조군 균주와 비교할 때 상당히 높은 수준의 염증성 사이토카인을 생성한다.
실시예 9: inlC -결실 돌연변이는 호중구 이동을 유도한다
inlC 돌연변이로 감염된 대식세포는 다른 대조군 균주와 비교하였을 때 상이한 시점에서 호중구의 이동에서의 상이한 증가를 나타낸다. 이러한 실험의 결과는 감염 동안 호중구와 같은 면역 세포를 유도하는 이러한 균주의 능력을 강하게 지지한다.
실시예 10: inlC -결실 돌연변이는 치료학적 항-종양 반응을 초래한다.
LmddA142 및 LmddAinlC142 둘 다를 이용한 항-종양 연구의 결과는 각각 다른 것과 유사하며 종양의 치료학적 퇴행이 관찰되었다. 또한, LmddAinlC142의 두 가지 용량은 이것의 높은 수준의 타고난 응답 및 전염증성 사이토카인의 증가된 분비를 생성하는 능력으로 인하여 LmddA142 균주의 세 가지 용량과 유사하다.
재료 및 방법 ( 실시예 11 내지 16)
올리고뉴클레오티드는 Invitrogen(칼즈배드, 캘리포니아주)에 의해 합성되었으며 DNA 서열결정은 Genewiz사(사우스 플레인필드, 뉴저지주)에 의해 실시되었다. 유동 세포 계측 시약은 Becton Dickinson Biosciences(BD, 샌디에고, 캘리포니아주)로부터 구매했다. 세포 배양 배지, 보충제 및 모든 다른 시약들은, 지시되지 않는 한 Sigma(세인트 루이스, 미주리주)로부터 구했다. Her2/neu HLA-A2 펩티드는 EZbiolabs(웨스트필드, 인디애나주)에 의해 합성되었다. 완전 RPMI 1640(C-RPMI) 배지는 2 mM 글루타민, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 및 1 mM 피루브산나트륨, 10% 소태아혈청, 페니실린/스트렙토마이신, Hepes(25 mM)를 함유한다. 다클론성 항-LLO 항체는 이전에 기재된 바와 같으며 항-Her2/neu 항체는 Sigma로부터 구입되었다.
마우스 및 세포주
모든 동물 실험은 펜실베니아 대학교 또는 러트거스 대학교에서 IACUC에 의한 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다. FVB/N 마우스는 Jackson laboratories(바 하버, 메인주)로부터 구입했다. 랫트 Her2/neu 발암-단백질을 과발현한, FVB/N Her2/neu 형질전환 마우스는 펜실베니아 대학에서 동물 핵심 시설에서 보관 및 사육되었다. NT-2 종양 세포주는 높은 수준의 Her2/neu 단백질을 발현하며, 이러한 마우스에서 자생 유방 종양으로부터 유래되었으며 이전에 기재된 바와 같이 성장하였다. DHFR-G8(3T3/neu) 세포는 ATCC로부터 수득되었으며 the ATCC 권고에 따라 성장시켰다. EMT6-Luc 세포주는 John Ohlfest 박사(미네소타 대학교, 미네소타주)로부터의 너그러운 기증품이었으며 완전 C-RPMI 배지에서 배양하였다. 생물발광 작업은 펜실베니아 대학교(필라델피아, 펜실베니아주)의 Small Animal Imaging Facility(SAIF)에서 지도 하에 실시되었다.
리스테리아 구성물 및 항원 발현
Her2/neu-pGEM7Z는 펜실베니아 대학교의 Mark Greene 박사에 의해 자연스럽게 제공되었으며 pGEM7Z 플라스미드(Promega, 매디슨, 위스콘신주)로 클로닝된 전체 길이의 인간 Her2/neu(hHer2) 유전자를 포함하였다. 이러한 플라스미드는 pfx DNA 중합효소(Invitrogen) 및 표 1에 기재된 올리고를 이용하여 PCR에 의해, hHer-2/neu의 이러한 부분, 즉 EC1, EC2, 및 IC1을 증폭하기 위해 주형으로서 사용되었다.
[표 1] 인간 her-2-키메라의 클로닝을 위한 프라이머
Figure pct00001
Her-2/neu 키메라 제조는 SOEing PCR 법 및 주형으로서 각각 분리된 hHer-2/neu 부분에 의한 직접 융합에 의해 제조되었다. 프라이머는 표 2에 보여진다.
Figure pct00002
상이한 부분의 인간 Her2 영역의 증폭을 위한 프라이머의 서열.
상이한 부분의 인간 Her2 영역의 증폭을 위한 프라이머의 서열.
ChHer2 유전자는 XhoI 및 SpeI 제한 효소를 이용하여 pAdv138로부터 절단되었으며, 절단된, Lmdd 셔틀 벡터인 pAdv134에서 LLO의 비-용혈성 단편으로 인프레임 클로닝되었다. 삽입의 서열, LLO 및 hly 프로모터는 DNA 서열결정 분석에 의해 확인되었다. 이 플라스미드는 전기-컨피턴트 actA , dal , dat 돌연변이 리스테리아 모노사이토게네스 균주 내로 전기천공되었으며, LmddA 및 양성 클론은 스트렙토마이신(250 mg/ml)을 함유하는 뇌 심장 침출액(BHI) 한천 플레이트 상에서 선별되었다. 일부 실험에서 hHer2/neu(Lm-hHer2) 단편을 발현하는 유사한 리스테리아 균주가 비교 목적을 위해 사용되었다. 이들은 이전에 기재되었다. 모든 연구에서, 무관한 리스테리아 구성물(Lm-대조군)이 면역계에서 리스테리아의 항원 독립적 효과를 설명하기 위해 포함되었다. Lm-대조군은 ADXS31-164와 같은 동일한 리스테리아 플랫폼에 근거하나, HPV16-E7 또는 NY-ESO-1과 같은 상이한 항원을 발현하지 않았다. 리스테리아로부터의 융합 단백질의 발현 및 분비가 테스트되었다. 각 구성물은 생체내에서 계대되었다.
세포독성 분석
3마리 내지 5마리 FVB/N 마우스의 그룹들을 1 x 108 콜로니 형성 유닛(CFU)의 Lm-LLO-ChHer-2, ADXS31-164, Lm-hHer-2 ICI 또는 Lm-대조군(무관한 항원을 발현함)으로 1주 간격으로 3회 면역화시키거나 처리되지 않고 남겨뒀다. NT-2 세포를 생체내에서 성장시켰으며 트립신으로 탈착시키고 37℃에서 45분간 미토신 C(무혈청 C-RPMI 배지 중 250 μg/ml)으로 처리하였다. 5회 세척 후, 이들을 면역화된 동물 또는 처리되지 않은 동물로부터 수확된 비장과 1:5(자극제: 응답자)의 비율로 37℃ 및 5% CO2에서 5일 동안 공동-인큐베이션 하였다. 표준 세포독성 분석을 이전에 기재된 방법에 따라 표적으로서 유로퓸 표지된 3T3/neu(DHFR-G8) 세포를 사용하여 수행하였다. 사멸된 표적 T 세포로부터의 방출된 유로퓸을 590 nm에서 분광광도계(Perkin Elmer, Victor2)를 사용하여 4시간 인큐베이션 후 측정하였다. 특이 용해 백분율을(실험 그룹에서의 용해-자발적 용해)/(최대 용해-자발적 용해)로서 규정하였다.
면역화된 마우스로부터의 비장세포에 의한 인터페론-g 분비
3마리 내지 5마리 FVB/N 또는 HLA-A2 트랜스제닉 마우스의 그룹들을 1 x 108 CFU의 ADXS31-164, 음성 리스테리아 대조군(무관한 항원을 발현함)로 1주 간격으로 3회 면역화시키거나 나이브로 방치하였다. FVB/N 마우스로부터의 비장세포를 마지막 면역화 후 1주일째에 분리하고 C-RPMI 배지 내에서 미토신 C 처리된 NT-2 세포의 존재 하에 5 x 106 세포/웰로 24 웰 플레이트에서 공동-배양하였다. HLA-A2 형질전환 마우스로부터의 비장세포는 1 mM의 HLA-A2 특이적 펩티드 또는 1 μg/ml의 재조합 His-태그된 ChHer-2 단백질의 존재 하에 배양되었으며, E. coli에서 생성되었고 친화도 크로마토그래피 시스템에 기반하여 니켈에 의해 정제되었다. 상청액으로부터의 시료를 24시간 또는 72시간 후에 수득하고 제조업자의 권고에 따라 마우스 IFN-g 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 키트를 사용하여 인터페론-g(IFN-g)의 존재에 대해 테스트하였다.
Her-2 트랜스제닉 동물에서의 종양 연구
6 주령 FVB/N 랫 Her2/neu 형질전환 마우스(9 내지 14/그룹)가 Lm-LLO-ChHer2, ADXS31-164의 5 x 108 CFU 또는 Lm-대조군으로 6 회 면역화되었다. 이들을 자발적 유방 종양의 출현에 대해 주 2회 관찰하였으며, 이는 52주까지 전자 캘리퍼스를 사용하여 측정하였다. 탈출된 종양은 이들이 평균 직경에서 1cm2 크기에 도달할 때 제거되어 -20℃에서 RNAlater중에 보관되었다. 이러한 종양의 탈출에서 Her2/neu 단백질의 돌연변이의 영향을 확인하기 위해, 유전자 DNA가 유전자 DNA 단리 키트를 이용하여 추출되었고, 서열결정되었다.
비장 및 종양에서 조절 T 세포에서의 ADXS31 -164의 효과
마우스에게 1 x 106 NT-2세포가 피하(s.c.) 이식되었다. 7, 14 및 21일에, 이들을 1 x 108 CFU의 ADXS31-164, LmddA -대조군으로 면역화시키거나 처리하지 않고 두었다. 종양 및 비장을 28일째에 추출하고 CD3+/CD4+/FoxP3+ Treg의 존재에 대해 FACS 분석으로 테스트하였다. 간략하게, 비장세포를 C-RPMI 배지 중 2개 유리 슬라이드 사이에서 비장을 균질화하여 분리하였다. 종양을 멸균 면도날로 분쇄하고 PBS 중 DNase(12 U/ml), 및 콜라게나제(2 mg/ml)를 함유하는 버퍼로 소화시켰다. 교반하면서 실온에서 60분 인큐베이션한 후, 세포를 온화한 피펫팅으로 분리했다. 적혈구 세포를 RBC 용해 버퍼로 용해한 후 10% FBS를 함유한 완전 RPMI-1640 배지로 복수 회 세척하였다. 나일론 메쉬를 통해 여과한 후, 종양 세포 및 비장세포를 FACS 버퍼(2% FBS/PBS)에 재현탁하고 항-CD3-PerCP-Cy5.5, CD4-FITC, CD25-APC 항체로 염색한 후 항-Foxp3-PE로 투과화 및 염색하였다. 유동 세포 계측 분석을 4-색 FACS calibur(BD)를 사용하여 수행하고 데이터를 세포 퀘스트 소프트웨어(BD)를 사용하여 분석하였다.
통계학적 분석
로그-랭크 카이-자승 테스트를 생존 데이터에 사용하였고 CTL 및 ELISA 분석에 스튜던트 t 테스트를 사용하였으며, 삼중으로 실시되었다. 0.05 미만의 p-값(*로 표시됨)은 이들 분석에서 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다. 모든 통계학적 분석은 Prism 소프트웨어, V.4.0a(2006) 또는 SPSS 소프트웨어, V.15.0(2006)로 실시되었다. 모든 FVB/N 랫 Her2/neu 형질전환 연구를 위해 우리는 그룹당 8 내지14마리의 마우스를 사용하였으며, 모든 야생형 FVB/N 연구는 명시되지 않는 한 그룹당 적어도 8마리의 마우스를 사용하였다. 모든 연구는 Her2/neu 형질전환 마우스 모델에서 장기 종양 연구를 제외하고는 적어도 1회 반복되었다.
결과
실시예 11: Her-2 단편에 융합된 LLO 단편을 분비하는
리스테리아 모노사이토게네스 의 생성: ADXS31 -164의 구성물.
키메라성 Her2 / neu 유전자(ChHer2)의 제조는 이전에 기재되었다. 요약하면, ChHer2 유전자는 SOEing PCR 법에 의해 Her2/neu 단백질의 두 개의 세포외(아미노산 40 내지 170 및 아미노산 359 내지 433) 및 하나의 세포내 단편(아미노산 678 내지 808)의 직접 융합에 의해 생성되었다. 키메라 단백질은 단백질의 공지된 인간 MHC 클래스 I 에피토프 중 대부분을 보유한다. ChHer2 유전자는 pAdv138(Lm-LLO-ChHer2를 구성하기 위해 사용됨) 및 LmddA 셔틀 플라스미드로 클로닝된, 플라스미드로부터 제거되었으며, 플라스미드 pAdv164(도 15a)를 야기한다. 이들 2개의 플라스미드 골격 사이에는 2개의 주요 차이가 있다. 1) pAdv138은 재조합 박테리아의 실험관내 선별을 위해 클로람페니콜 저항 마커(cat)를 사용하는 반면, pAdv164는 바실러스 서브틸리스로부터의 D-알라닌 라세미화 효소 유전자(dal)을 보유하며, dal -dat 유전자가 결여된 LmddA 균주에서 실험관내 선별 및 생체내 플라스미드 보유에 대한 대사 보완 경로를 사용한다. 이 백신 플랫폼은 조작된 리스테리아 백신 균주의 항생제 저항에 대한 FDA 우려를 해결하기 위해 설계되고 발달되었다. 2) pAdv138와 달리, Lmdd 균주의 생체내 보완에 대해 필요하지 않으므로, pAdv164는 플라스미드(하기 서열 및 도 15a 참조)에서 prfA 유전자의 복제를 품고 있지 않는다. LmddA 백신 균주는 또한 actA 유전자(리스테리아의 세포내 이동 및 세포에서 세포로의 확산의 원인임)가 결여되어 있어 이 골격으로부터 유래된 재조합 백신 균주가 이의 모체 균주인 Lmdd로부터 유래된 것보다 100배 적은 독성을 나타낸다. LmddA-기반 백신은 또한 면역화된 마우스의 비장으로부터의 Lmdd-기반 백신보다 더 빨리 지워진다(48시간 미만). 이러한 균주로부터 융합 단백질 tLLO-ChHer2의 발현 및 분비는 약 104 KD의 밴드가 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 항-LLO 항체에 의해 검출된 것과 같이 시험관내 성장(도 15b)의 8시간 이후 TCA 침전된 세포 배양 상층액에서 Lm-LLO-ChHer2의 것에 필적하였다. tLLO만을 발현하는 리스테리아 골격 균주는 음성 대조군으로서 사용되었다.
pAdv164 서열(7075 염기 쌍)(도 15 참조): (SEQ ID NO: 70)
실시예 12: ADXS31-164는 LM-LLO-ChHer-2만큼 면역원성이다.
항-Her2/neu 특이적 세포독성 T 세포를 생성하는 ADXS31-164의 면역원성 특성은 표준 CTL 분석에서 Lm-LLO-ChHer2 백신의 것과 비교되었다. 두 백신은 강력하지만 3T3/neu 타겟 세포에 의해 발현된 Her2/neu 항원에 대해 유사한 세포독성 T 세포 반응을 이끌어냈다. 따라서, LLO에 융합된 Her-2의 세포내 단편만을 발현하는 리스테리아로 면역화된 마우스는 더 많은 MHC 클래스 I 에피토프를 함유하는 키메라보다 더 낮은 용해 활성을 보였다. 처리되지 않은 동물 또는 관련이 없는 리스테 리아 백신으로 주입된 마우스에서 CTL 활성은 검출되지 않았다(도 16a). ADXS31-164는 야생형 FVB/N 마우스로부터 비장세포에 의한 IFN-γ의 분비를 또한 자극할 수 있었다(도 16b). 이것은 NT-2 세포로 처리된 미토마이신 C와 공동-배양된 이러한 세포의 배양 상층액에서 검출되었으며, 이것은 높은 수준의 Her2/neu 항원을 발현한다(도 19c).
ADXS31-164로의 면역화 후 인간 MHC 클래스 I 에피토프의 적절한 처리 및 제시가 HLA-A2 마우스에서 테스트되었다. 면역화된 HLA-A2 형질전환 동물로부터의 비장세포가 Her2/neu 분자의 세포외(HLYQGCQVV SEQ ID NO: 71 또는 KIFGSLAFL SEQ ID NO: 72) 또는 세포내(RLLQETELV SEQ ID NO: 73) 도메인에서 위치된 매핑된 HLA-A2 제한 에피토프와 대응하는 펩타이드와 함께 72시간 동안 공동-인큐베이션되었다(도 16c). 재조합 ChHer-2 단백질이 양성 대조군으로서 사용되었으며 무관한 펩티드 또는 펩티드가 없는 것이 음성 대조군으로서 사용되었다. 이러한 실험으로부터의 데이터는 ADXS31-164가 타겟팅된 항원의 상이한 도메인에서 위치한 인간 항원결정부위에 대해 항-Her2/neu 특이적 면역 반응을 이끌어낼 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 13: ADXS31 -164는 자발적 유방 종양의 발생을 예방에서
LM- LLO - ChHer -2에서보다 더 효과적이었다.
ADXS31-164의 항-종양 효과는 20 내지 25 주령에서 자생 유방 종양인, 느리게 성장하는 Her2/neu 형질전환 동물에서 Lm-LLO-ChHer2의 것과 비교되었다. 무관한 리스 테리아-대조군 백신으로 면역화된 모든 동물은 21-25주 내에 유방 종양이 발달하였으며 33주 전에 희생되었다. 반대로, 리스테리아-Her2/neu 재조합 백신은 유방 종양의 형성에서 유의한 지연을 야기하였다. 45주에서, ADXS31-164 예방접종된 마우스의 50% 초과(9마리 중 5마리)가 Lm-LLO-ChHer-2로 면역화된 마우스의 25%에 비해 여전히 종양이 없었다. 52주에서, 다른 실험 그룹에서 모든 마우스가 그들의 질병에 이미 굴복된 반면, ADXS31-164로 면역화된 8마리 중 2마리의 마우스는 여전히 종양이 없는 채로 남아있었다(도 17). 이러한 결과는 더욱 약독화되었음에도 불구하고, ADXS31-164가 Her2/neu 형질전환 동물에서 자생 유방 종양의 발생을 예방함에 있어 Lm-LLO-ChHer2보다 효율적임을 나타낸다.
실시예 14: ADXS31 -164로의 면역화에 따른 HER2 / NEU 유전자에서의 돌연변이.
Her2/neu의 MHC 클래스 I 항원결정부위에서 돌연변이는 작은 단편 백신 또는 트라스투주맙(trastuzumab)(허셉틴), Her2/neu의 세포외 도메인에서 항원결정부위를 타겟으로 하는 단일클론성 항체로 면역화에 따른 종양 탈출에 대한 책임으로 간주되고 있다. 이를 평가하기 위해, 게놈 물질이 트랜스제닉 동물 내 탈출 종양으로부터 추출되었으며 키메라 또는 대조군 백신으로 면역화된 종양에서의 neu 유전자의 상응하는 단편이 서열결정되었다. 돌연변이는 대안적인 탈출 메커니즘을 제앙하는 임의의 백신접종된 종양 샘플의 Her-2/neu 유전자에서 관찰되지 않았다(데이터는 도시되지 않음).
실시예 15: ADXS31-164는 종양내 T 조절 세포 내 상당한 감소를 일으킨다.
비장 및 종양에서 조절 T 세포의 빈도에서의 ADXS31-164의 영향을 설명하기 위해, 마우스에 NT-2 종양 세포를 이식하였다. 비장세포 및 종양내 림프구가 3회 면역화 후 분리되고 CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+ 세포로서 규정되는 Treg에 대해 염색하였으나, 개별적으로 분석했을 때 비슷한 결과가 FoxP3 또는 CD25 마커로 수득되었다. 결과는 무관한 리스테리아 백신 또는 처리되지 않은 동물과 비교하여(도 18 참조), ADXS31-164 로 면역화가 비장에서 Treg의 빈도에 대해 효과가 없음을 나타냈다. 반대로, 리스테리아 백신으로의 면역화는 종양에서 Treg의 존재에 상당한 영향을 일으켰다(도 19a). 처리되지 않은 종양에서 모든 CD3+ T 세포의 평균 19.0%가 Treg인 반면, 이러한 빈도는 종양 내 Treg의 빈도에서 5 배 감소한, 무관한 백신에 대해 4.2% 및 ADXS31-164에 대해 3.4% 감소되었다(도 19b). LmddA 백신 중 하나로 처리된 마우스의 종양내 Treg의 빈도에서의 감소는 종양의 크기에서의 차이에 기여하지 않을 것이다. 대표 실험에서, ADXS31-164로 면역화된 마우스로부터의 종양은 비처리된 마우스(8.69 ± 0.98, n = 5, p < 0.01) 또는 무관한 백신으로 처리된 마우스(8.41 ± 1.47, n = 5, p = 0.04)로부터의 종양보다 상당히 작지만[평균 직경(mm) ± SD, 6.71 ± 0.43, n = 5], 이들 마지막 두 그룹의 비교는 종양 크기에서 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(p = 0.73). LmddA 백신으로 처리된 종양에서의 Treg의 더 낮은 빈도는 증가된 종양내 CD8/Treg 비율을 야기하며, 이는 더 선호되는 종양 미세환경이 LmddA 백신으로 면역화된 후에 수득될 수 있음을 제안한다. 그러나, 표적 항원 HER2/neu(ADXS31-164) 를 발현하는 백신만이 종양 성장을 감소시킬 수 있었으며, 이는 Treg에서의 감소가 종양에서 항원-특이 반응의 존재시에만 영향이 있음을 나타내는 것이다.
실시예 16: 펩타이드 "미니유전자" 발현 시스템
재료 및 방법
이 발현 시스템은, 카르복시-말단에 개별 펩타이드 모이어티를 함유하는 재조합 단백질로 된 패널의 클로닝을 용이하게 하기 위해 설계되었다. 이는, SS-Ub-펩타이드 작제물들 중 하나를 인코딩하는 서열을 주형으로서 이용하는 단순 PCR 반응에 의해 달성된다. Ub 서열의 카르복시-말단 영역까지 연장되는 프라미어를 사용하고 상기 프라이머의 3' 말단에서 요망되는 펩타이드 서열에 대한 코돈을 도입함으로써, 새로운 SS-Ub-펩타이드 서열이 단일 PCR 반응에서 생성될 수 있다. 박테리아 프로모터 및 ActA 신호 서열의 처음 몇 개의 뉴클레오타이드를 인코딩하는 5' 프라이머는 모든 작제물들에 대해 동일하다. 이러한 전략을 이용하여 생성된 작제물은 도 1에 도식적으로 나타나 있다. 본 실시예에서, 2개의 작제물이 기재되어 있다. 하나의 작제물은 마우스 MHC 부류 I 상에 제시된 모델 펩타이드를 함유하고, 제2 작제물은, 치료학적으로 관련된 펩타이드, 예컨대 인간 교아세포종(GBM) TAA로부터 유래된 것과 같은 치환될 위치를 가리킨다. 분명하게 하기 위해, 본 발명자들은 도 1에 도시된 작제물을 ActA1 -100 분비 신호를 함유하도록 지정하였다. 그러나, LLO-기반 분비 신호는 동일한 효과로 치환될 수 있었다.
제안된 시스템의 이점들 중 하나는, 다수의 펩타이드들을 단일 리스테리아 벡터 작제물을 사용하여 세포에 로딩 가능할 것이라는 점이다. 다수의 펩타이드들은 상기 기재된 단일 펩타이드 발현 시스템의 변형을 이용하여 재조합 약독화된 리스테리아(예를 들어, prfA 돌연변이체 리스테리아 또는 dal/dat/actA 돌연변이체 리스테리아) 내로 도입될 것이다. 순차적인 SS-Ub-펩타이드 서열 유래의 다수의 개별 펩타이드들을 인코딩하는 키메라 단백질은 하나의 삽입물에서 인코딩되었다. 각각의 SS-Ub-펩타이드 코딩 서열 앞에 샤인-달가노 리보솜 결합 부위를 도입하여, 각각의 펩타이드 작제물을 개별적으로 번역할 수 있다. 도 1c는 하나의 재조합 리스테리아 균주로부터 4개의 개별 펩타이드 항원을 발현하도록 설계된 작제물의 도식도를 나타낸다. 이는 엄밀히 일반적인 발현 방법의 대표도이기 때문에, 본 발명자들은 공지된 마우스 또는 인간 종양 연관-항원 또는 감염성 질환 항원으로부터 유래된 4개의 개별 MHC 부류 I 결합 펩타이드를 포함시켰다.
본 발명의 소정의 특징들이 예시되고 기술되었지만, 많은 변형, 치환, 변화 및 등가물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 사상 내에 있는 바와 같은 모든 변형 및 변경을 포함하도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Advaxis, Inc. <120> LISTERIA-BASED COMPOSITIONS COMPRISING A PEPTIDE MINIGENE EXPRESSION SYSTEM AND METHODS OF USE THEREOF <130> P-78709-PC <150> LISTERIA-BASED COMPOSITIONS COMPRISING A PEPTIDE MINIGENE EXPRESSION SYSTEM AND METHODS OF USE THEREOF <151> 2015-03-03 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LLO protein <400> 1 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 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gaaagaaaaa gcagaaaaag gtccaaatat caataataac 300 aacagtgaac aaactgagaa tgcggctata aatgaagagg cttcaggagc cgaccgacca 360 gctatacaag tggagcgtcg tcatccagga ttgccatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420 aaaagaagga aagccatagc atcatcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccggat 480 aaaccaacaa aagtaaataa gaaaaaagtg gcgaaagagt cagttgcgga tgcttctgaa 540 agtgacttag attctagcat gcagtcagca gatgagtctt caccacaacc tttaaaagca 600 aaccaacaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660 cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720 ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780 ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccaat gcttcttggt 840 tttaatgctc ctgctacatc agaaccgagc tcattcgaat ttccaccacc acctacggat 900 gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960 acatcggaac cgagctcgtt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatc 1020 atccgggaaa cagcatcctc gctagattct agttttacaa gaggggattt agctagtttg 1080 agaaatgcta ttaatcgcca tagtcaaaat ttctctgatt tcccaccaat cccaacagaa 1140 gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170 <210> 7 <211> 639 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ActA protein <400> 7 Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr 1 5 10 15 Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp 20 25 30 Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr 35 40 45 Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala 50 55 60 Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys 65 70 75 80 Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys 85 90 95 Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly 100 105 110 Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu 115 120 125 Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu 130 135 140 Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu 145 150 155 160 Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val 165 170 175 Ala Lys Glu 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gaactagaaa aatcgaataa agtgaaaaat 240 acgaacaaag cagacctaat agcaatgttg aaagcaaaag cagagaaagg tccgaataac 300 aataataaca acggtgagca aacaggaaat gtggctataa atgaagaggc ttcaggagtc 360 gaccgaccaa ctctgcaagt ggagcgtcgt catccaggtc tgtcatcgga tagcgcagcg 420 gaaattaaaa aaagaagaaa agccatagcg tcgtcggata gtgagcttga aagccttact 480 tatccagata aaccaacaaa agcaaataag agaaaagtgg cgaaagagtc agttgtggat 540 gcttctgaaa gtgacttaga ttctagcatg cagtcagcag acgagtctac accacaacct 600 ttaaaagcaa atcaaaaacc atttttccct aaagtattta aaaaaataaa agatgcgggg 660 aaatgggtac gtgataaa 678 <210> 20 <211> 1170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant nucleotide encoding a truncated ActA protein <400> 20 atgcgtgcga tgatggtggt tttcattact gccaattgca ttacgattaa ccccgacata 60 atatttgcag cgacagatag cgaagattct agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120 aaaacagaag agcaaccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180 gtaagttcac gtgatattaa agaactagaa aaatcgaata aagtgagaaa tacgaacaaa 240 gcagacctaa tagcaatgtt gaaagaaaaa 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tcccaccaat cccaacagaa 1140 gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 ggctcgagca tggagataca cc 22 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 ggggactagt ttatggtttc tgagaaca 28 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 gggggctagc cctcctttga ttagtatatt c 31 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 ctccctcgag atcataattt acttcatc 28 <210> 25 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 gactacaagg acgatgaccg acaagtgata acccgggatc taaataaatc cgttt 55 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 cccgtcgacc agctcttctt ggtgaag 27 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 gcggatccca tggagataca cctac 25 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 gctctagatt 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cacagcttat gccctatggc tgcctcttag 3660 actaatctag acccgggcca ctaactcaac gctagtagtg gatttaatcc caaatgagcc 3720 aacagaacca gaaccagaaa cagaacaagt aacattggag ttagaaatgg aagaagaaaa 3780 aagcaatgat ttcgtgtgaa taatgcacga aatcattgct tattttttta aaaagcgata 3840 tactagatat aacgaaacaa cgaactgaat aaagaataca aaaaaagagc cacgaccagt 3900 taaagcctga gaaactttaa ctgcgagcct taattgatta ccaccaatca attaaagaag 3960 tcgagaccca aaatttggta aagtatttaa ttactttatt aatcagatac ttaaatatct 4020 gtaaacccat tatatcgggt ttttgagggg atttcaagtc tttaagaaga taccaggcaa 4080 tcaattaaga aaaacttagt tgattgcctt ttttgttgtg attcaacttt gatcgtagct 4140 tctaactaat taattttcgt aagaaaggag aacagctgaa tgaatatccc ttttgttgta 4200 gaaactgtgc ttcatgacgg cttgttaaag tacaaattta aaaatagtaa aattcgctca 4260 atcactacca agccaggtaa aagtaaaggg gctatttttg cgtatcgctc aaaaaaaagc 4320 atgattggcg gacgtggcgt tgttctgact tccgaagaag cgattcacga aaatcaagat 4380 acatttacgc attggacacc aaacgtttat cgttatggta cgtatgcaga cgaaaaccgt 4440 tcatacacta aaggacattc tgaaaacaat ttaagacaaa tcaatacctt ctttattgat 4500 tttgatattc acacggaaaa agaaactatt tcagcaagcg atattttaac aacagctatt 4560 gatttaggtt ttatgcctac gttaattatc aaatctgata aaggttatca agcatatttt 4620 gttttagaaa cgccagtcta tgtgacttca aaatcagaat ttaaatctgt caaagcagcc 4680 aaaataatct cgcaaaatat ccgagaatat tttggaaagt ctttgccagt tgatctaacg 4740 tgcaatcatt ttgggattgc tcgtatacca agaacggaca atgtagaatt ttttgatccc 4800 aattaccgtt attctttcaa agaatggcaa gattggtctt tcaaacaaac agataataag 4860 ggctttactc gttcaagtct aacggtttta agcggtacag aaggcaaaaa acaagtagat 4920 gaaccctggt ttaatctctt attgcacgaa acgaaatttt caggagaaaa gggtttagta 4980 gggcgcaata gcgttatgtt taccctctct ttagcctact ttagttcagg ctattcaatc 5040 gaaacgtgcg aatataatat gtttgagttt aataatcgat tagatcaacc cttagaagaa 5100 aaagaagtaa tcaaaattgt tagaagtgcc tattcagaaa actatcaagg ggctaatagg 5160 gaatacatta ccattctttg caaagcttgg gtatcaagtg atttaaccag taaagattta 5220 tttgtccgtc aagggtggtt taaattcaag aaaaaaagaa gcgaacgtca acgtgttcat 5280 ttgtcagaat ggaaagaaga tttaatggct tatattagcg aaaaaagcga tgtatacaag 5340 ccttatttag cgacgaccaa aaaagagatt agagaagtgc taggcattcc tgaacggaca 5400 ttagataaat tgctgaaggt actgaaggcg aatcaggaaa ttttctttaa gattaaacca 5460 ggaagaaatg gtggcattca acttgctagt gttaaatcat tgttgctatc gatcattaaa 5520 ttaaaaaaag aagaacgaga aagctatata aaggcgctga cagcttcgtt taatttagaa 5580 cgtacattta ttcaagaaac tctaaacaaa ttggcagaac gccccaaaac ggacccacaa 5640 ctcgatttgt ttagctacga tacaggctga aaataaaacc cgcactatgc cattacattt 5700 atatctatga tacgtgtttg tttttctttg ctggctagct taattgctta tatttacctg 5760 caataaagga tttcttactt ccattatact cccattttcc aaaaacatac ggggaacacg 5820 ggaacttatt gtacaggcca cctcatagtt aatggtttcg agccttcctg caatctcatc 5880 catggaaata tattcatccc cctgccggcc tattaatgtg acttttgtgc ccggcggata 5940 ttcctgatcc agctccacca taaattggtc catgcaaatt cggccggcaa ttttcaggcg 6000 ttttcccttc acaaggatgt cggtcccttt caattttcgg agccagccgt ccgcatagcc 6060 tacaggcacc gtcccgatcc atgtgtcttt ttccgctgtg tactcggctc cgtagctgac 6120 gctctcgcct tttctgatca gtttgacatg tgacagtgtc gaatgcaggg taaatgccgg 6180 acgcagctga aacggtatct cgtccgacat gtcagcagac gggcgaaggc catacatgcc 6240 gatgccgaat ctgactgcat taaaaaagcc ttttttcagc cggagtccag cggcgctgtt 6300 cgcgcagtgg accattagat tctttaacgg cagcggagca atcagctctt taaagcgctc 6360 aaactgcatt aagaaatagc ctctttcttt ttcatccgct gtcgcaaaat gggtaaatac 6420 ccctttgcac tttaaacgag ggttgcggtc aagaattgcc atcacgttct gaacttcttc 6480 ctctgttttt acaccaagtc tgttcatccc cgtatcgacc ttcagatgaa aatgaagaga 6540 accttttttc gtgtggcggg ctgcctcctg aagccattca acagaataac ctgttaaggt 6600 cacgtcatac tcagcagcga ttgccacata ctccggggga accgcgccaa gcaccaatat 6660 aggcgccttc aatccctttt tgcgcagtga aatcgcttca tccaaaatgg ccacggccaa 6720 gcatgaagca cctgcgtcaa gagcagcctt tgctgtttct gcatcaccat gcccgtaggc 6780 gtttgctttc acaactgcca tcaagtggac atgttcaccg atatgttttt tcatattgct 6840 gacattttcc tttatcgcgg acaagtcaat ttccgcccac gtatctctgt aaaaaggttt 6900 tgtgctcatg gaaaactcct ctcttttttc agaaaatccc agtacgtaat taagtatttg 6960 agaattaatt ttatattgat taatactaag tttacccagt tttcacctaa aaaacaaatg 7020 atgagataat agctccaaag gctaaagagg actataccaa ctatttgtta attaa 7075 <210> 70 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HLA-A2 restricted epitopes <400> 70 Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu 1 5 <210> 71 <211> 2015 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence present upstream and downstream of the inlC region on the genome of Listeria strain <400> 71 atggcgcggg atggtatact atacaagcgt atggttcaaa aagatacttt gaattaagaa 60 gtacaataaa gttaacttca ttagacaaaa agaaaaaaca aggaagaata gtacatagtt 120 ataaatactt ggagagtgag gtgtaatatg ggggcagctg atttttgggg tttcatatat 180 gtagtttcaa gattagccat tgttgcggca gtagtttact tcttatactt attgagaaaa 240 attgcaaata aatagaaaaa aagccttgtc aaacgaggct ttttttatgc aaaaaatacg 300 acgaatgaag ccatgtgaga caatttggaa tagcagacaa caaggaaggt agaacatgtt 360 ttgaaaaatt tactgatttt cgattattat taacgcttgt taatttaaac atctcttatt 420 tttgctaaca tataagtata caaagggaca taaaaaggtt aacagcgttt gttaaatagg 480 aagtatatga aaatcctctt ttgtgtttct aaatttattt ttaaggagtg gagaatgttg 540 aaaaaaaata attggttaca aaatgcagta atagcaatgc tagtgttaat tgtaggtctg 600 tgcattaata tgggttctgg aacaaaagta caagctgaga gtattcaacg accaacgcct 660 attaaccaag tttttccaga tcccggccta gcgaatgcag tgaaacaaaa tttagggaag 720 caaagtgtta cagaccttgt atcacaaaag gaactatctg gagtacaaaa tttcaatgga 780 gataatagca acattcaatc tcttgcggga atgcaatttt tcactaattt aaaagaactt 840 catctatccc ataatcaaat aagtgacctt agtcctttaa aggatctaac taagttagaa 900 gagctatctg tgaatagaaa cagactgaaa aatttaaacg gaattccaag tgcttgttta 960 tctcgcttgt ttttagataa caacgaactc agagatactg actcgcttat tcatttgaaa 1020 aatctagaaa tcttatctat tcgtaataat aagttaaaaa gtattgtgat gcttggtttt 1080 ttatcaaaac tagaggtatt agatttgcat ggtaatgaaa taacaaatac aggtggacta 1140 actagattga agaaagttaa ctggatagat ttaactggtc agaaatgtgt gaatgaacca 1200 gtaaaatacc aaccagaatt gtatataaca aatactgtca aagacccaga tggaagatgg 1260 atatctccat attacatcag taatggtggg agttatgtag atggttgtgt cctgtgggaa 1320 ttgccagttt atacagatga agtaagctat aagtttagcg aatatataaa cgttggggag 1380 actgaggcta tatttgatgg aacagttaca caacctatca agaattagga cttgtgcaca 1440 cctgtatact ttgagctctc gtataatcac gagagctttt taaatatgta agtcttaatt 1500 atctcttgac aaaaagaacg tttattcgta taaggttacc aagagatgaa gaaactattt 1560 tatttacaat tcaccttgac accaaaaact ccatatgata tagtaaataa ggttattaaa 1620 caagaaagaa gaagcaaccc gcttctcgcc tcgttaacac gaacgttttc aggcaaaaaa 1680 ttcaaacttt cgtcgcgtag cttacgcgat tttgaatgtg cgggattgct gaaaagcagc 1740 ccgttttttt atggcctccg aacgaatgag ttagcaggcc gcagatttga acagctattt 1800 tctatcttgt tgtaacaaaa ttaagtggag gtggctcacc attagcaaag acatgttggt 1860 aaacgatggg attcgtgcac gtgaagtaag attgatcgac caagacggtg aacaattagg 1920 cgtgaagagt aaaatcgatg cgcttcaaat tgctgaaaag gctaatcttg atctagtgct 1980 tgttgctcca acagcgaaac cgccagtagc tcgta 2015 <210> 72 <211> 1140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA that is cloned in the temperature sensitive plasmid, pKSV7 to create inl C deletion muta <400> 72 gaattcatgg cgcgggatgg tatactatac aagcgtatgg ttcaaaaaga tactttgaat 60 taagaagtac aataaagtta acttcattag acaaaaagaa aaaacaagga agaatagtac 120 atagttataa atacttggag agtgaggtgt aatatggggg cagctgattt ttggggtttc 180 atatatgtag tttcaagatt agccattgtt gcggcagtag tttacttctt atacttattg 240 agaaaaattg caaataaata gaaaaaaagc cttgtcaaac gaggcttttt ttatgcaaaa 300 aatacgacga atgaagccat gtgagacaat ttggaatagc agacaacaag gaaggtagaa 360 catgttttga aaaatttact gattttcgat tattattaac gcttgttaat ttaaacatct 420 cttatttttg ctaacatata agtatacaaa gggacataaa aaggttaaca gcgtttgtta 480 aataggaagt atatgaaaat cctcttttgt gtttctaaat ttatttttaa ggagtggaga 540 ggatccggac ttgtgcacac ctgtatactt tgagctctcg tataatcacg agagcttttt 600 aaatatgtaa gtcttaatta tctcttgaca aaaagaacgt ttattcgtat aaggttacca 660 agagatgaag aaactatttt atttacaatt caccttgaca ccaaaaactc catatgatat 720 agtaaataag gttattaaac aagaaagaag aagcaacccg cttctcgcct cgttaacacg 780 aacgttttca ggcaaaaaat tcaaactttc gtcgcgtagc ttacgcgatt ttgaatgtgc 840 gggattgctg aaaagcagcc cgttttttta tggcctccga acgaatgagt tagcaggccg 900 cagatttgaa cagctatttt ctatcttgtt gtaacaaaat taagtggagg tggctcacca 960 ttagcaaaga catgttggta aacgatggga ttcgtgcacg tgaagtaaga ttgatcgacc 1020 aagacggtga acaattaggc gtgaagagta aaatcgatgc gcttcaaatt gctgaaaagg 1080 ctaatcttga tctagtgctt gttgctccaa cagcgaaacc gccagtagct cgtactgcag 1140

Claims (118)

  1. 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아 균주로서, 상기 작제물은 키메라 단백질을 인코딩하는 개방 해독 프레임(open reading frame)을 포함하고, 상기 키메라 단백질은:
    a. 박테리아 분비 신호 서열,
    b. 유비퀴틴(Ub) 단백질,
    c. 펩타이드를 포함하고, 여기서 a. 내지 c.의 상기 신호 서열, 상기 유비퀴틴 및 상기 펩타이드는 각각 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 일렬로 배열되는, 재조합 리스테리아 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 리스테리아가 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 2개 이상의 개방 해독 프레임을 추가로 포함하는, 재조합 리스테리아.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 리스테리아가 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 1개 내지 4개의 개방 해독 프레임을 각각의 개방 해독 프레임 사이에 추가로 포함하는, 재조합 리스테리아.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 하나 이상의 네오에피토프를 포함하는, 재조합 리스테리아.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 개방 해독 프레임이 상이한 펩타이드를 포함하는, 재조합 리스테리아.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미니유전자 작제물이 핵산 작제물의 발현을 구동하는 5' 박테리아 프로모터를 추가로 포함하는, 재조합 리스 테리아.
  7. 제6항에 있어서, 상기 프로모터가 actA 프로모터, hly 프로모터 또는 p60 프로모터인, 재조합 리스테리아.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 분비 신호 서열이 ActA 단백질 신호 서열의 처음 100개 아미노산을 포함하는 ActA100 신호 서열을 인코딩하는, 재조합 리스테리아.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 분비 신호 서열이 SEQ ID NO: 4를 포함하는 리스테리오리신 O(LLO) 단백질 유래의 분비 신호 서열인, 재조합 리스테리아.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아가 D-알라닌 라세미화효소(dal) 및 D-아미노산 트랜스퍼라제(dat) 유전자에 게놈 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 재조합 리스테리아.
  11. 제10항에 있어서, 리스테리아가 대사 효소를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 분자를 추가로 포함하고, 상기 대사 효소가 상기 dal/dat 게놈 돌연변이 또는 결실을 보완하는, 재조합 리스테리아.
  12. 제11항에 있어서, 상기 핵산 분자가 리스테리아 게놈 내로 통합되는, 재조합 리스테리아.
  13. 제11항에 있어서, 상기 핵산 분자가 상기 재조합 리스테리아 균주 내의 플라스미드에 존재하며, 상기 플라스미드가 항생제 선별의 부재 시 상기 재조합 리스테리아 균주 내에서 안정하게 유지되는, 재조합 리스테리아.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대사 효소가 알라닌 라세마제 효소 또는 D-아미노산 트랜스퍼라제 효소인, 재조합 리스테리아.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미니유전자 작제물이 리스테리아 게놈 내로 통합되거나 상기 리스테리아 내 염색체외 플라스미드에 존재하는, 재조합 리스테리아.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아가 actA 유전자에 게놈 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 재조합 리스테리아.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아가 inlB 유전자에 게놈 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 재조합 리스테리아.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주가 prfA 유전자에 게놈 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 재조합 리스테리아.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 약독화된 리스테리아가 리스테리아 모노사이토게네스 ( Listeria monocytogenes )인, 재조합 리스테리아.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리스테리아 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  21. 종양 또는 암을 가진 대상체에서 항종양 또는 항암 반응의 유도 방법으로서, 상기 유도 방법은 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아를 상기 대상체에게 투여하여, 상기 대상체에서 항종양 반응을 증강시키는 단계를 포함하며, 상기 작제물은 키메라 단백질을 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하고, 상기 키메라 단백질은:
    a. 박테리아 분비 신호 서열,
    b. 유비퀴틴(Ub) 단백질,
    c. 펩타이드를 포함하고, 여기서 a. 내지 c.의 상기 신호 서열, 상기 유비퀴틴 및 상기 펩타이드는 각각 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 일렬로 배열되고, 이에 의해서 상기 대상체 내에서 항종양 반응을 증강시키는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 리스테리아가 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 2개 이상의 개방 해독 프레임을 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 리스테리아가 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 1개 내지 4개의 개방 해독 프레임을 각각의 개방 해독 프레임 사이에 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 하나 이상의 네오에피토프를 포함하는, 방법.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 개방 해독 프레임이 상이한 펩타이드를 포함하는, 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미니유전자 작제물이 핵산 작제물의 발현을 구동하는 5' 박테리아 프로모터를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 프로모터가 actA 프로모터, hly 프로모터 또는 p60 프로모터인, 방법.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 분비 신호 서열이 ActA 단백질 신호 서열의 처음 100개 아미노산을 포함하는 ActA100 신호 서열을 인코딩하는, 방법.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 분비 신호 서열이 리스테리오리신 O(LLO) 단백질 유래의 분비 신호 서열인, 방법.
  30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아가 D-알라닌 라세마제(dal) 및 D-아미노산 트랜스퍼라제(dat) 유전자에 게놈 돌연변이를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 리스테리아가 대사 효소를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 분자를 추가로 포함하고, 상기 대사 효소가 상기 재조합 리스 테리아 균주의 염색체에서 돌연변이화되거나 결실된 내인성 유전자를 보완하는, 방법.
  32. 제33항에 있어서, 상기 핵산 분자가 리스테리아 게놈 내로 통합되는, 방법.
  33. 제33항에 있어서, 상기 핵산 분자가 상기 재조합 리스테리아 균주 내의 플라스미드에 존재하고, 상기 플라스미드가 항생제 선별의 부재 시 상기 재조합 리스테리아 균주 내에서 안정하게 유지되는 것인, 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대사 효소가 알라닌 라세마제 효소 또는 D-아미노산 트랜스퍼라제 효소인, 방법.
  35. 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미니유전자 작제물이 리스테리아 게놈 내로 통합되거나 또는 상기 리스테리아 내 염색체외 플라스미드에 존재하는, 방법.
  36. 제21항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아가 actA 유전자에 게놈 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 방법.
  37. 제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아가 inlB 유전자에 게놈 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 방법.
  38. 제21항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주가 prfA 유전자에 게놈 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 방법.
  39. 제21항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 약독화된 리스테리아가 리스테리아 모노사이토게네스인, 방법.
  40. 제21항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 독립적인 애쥬번트의 투여를 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 애쥬번트가 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 단백질, GM-CSF 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 분자, 사포닌 QS21, 모노포스포릴 지질 A 또는 비메틸화된 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  42. 제21항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 림프종, 백혈병, 유방암, 결장직장암, 두경부 편평 암종, 신세포 암종, 췌장 관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma), 골육종, 위암, 비소세포 폐암 또는 골암을 포함하는, 방법.
  43. 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 불응성 암(refractory cancer)인, 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 림프종이 호지킨 림프종 또는 비호지킨 림프종인, 방법.
  45. 제42항에 있어서, 상기 림프종이 다발성 골수종인, 방법.
  46. 대상체에서 종양 또는 암의 치료 방법으로서, 상기 치료 방법은 미니유전자 핵산 작제물을 포함하는 재조합 리스테리아를 상기 대상체에게 투여하여, 상기 대상체에서 항종양 반응을 증강시키는 단계를 포함하며, 상기 작제물은 키메라 단백질을 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하고, 상기 키메라 단백질은:
    a. 박테리아 분비 신호 서열,
    b. 유비퀴틴(Ub) 단백질,
    c. 펩타이드를 포함하고, 여기서 a. 내지 c.의 상기 신호 서열, 상기 유비퀴틴 및 상기 펩타이드는 각각 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 일렬로 배열되고, 이에 의해서 상기 대상체 내에서 항종양 반응을 증강시키는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 리스테리아가 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 2개 이상의 개방 해독 프레임을 추가로 포함하는, 방법.
  48. 제46항에 있어서, 상기 리스테리아가 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 1개 내지 4개의 개방 해독 프레임을 각각의 개방 해독 프레임 사이에 추가로 포함하는, 방법.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 하나 이상의 네오에피토프를 포함하는, 방법.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 개방 해독 프레임이 상이한 펩타이드를 포함하는, 방법.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미니유전자 작제물이 핵산 작제물의 발현을 구동하는 5' 박테리아 프로모터를 추가로 포함하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 프로모터가 actA 프로모터, hly 프로모터 또는 p60 프로모터인, 방법.
  53. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 분비 신호 서열이 ActA 단백질 신호 서열의 처음 100개 아미노산을 포함하는 ActA100 신호 서열을 인코딩하는, 방법.
  54. 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 분비 신호 서열이 리스테리오리신 O(LLO) 단백질 유래의 분비 신호 서열인, 방법.
  55. 제46항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아가 D-알라닌 라세미화효소(dal) 및 D-아미노산 트랜스퍼라제(dat) 유전자에 게놈 돌연변이를 포함하는, 방법.
  56. 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리스테리아가 대사 효소를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 분자를 추가로 포함하고, 상기 대사 효소가 상기 재조합 리스테리아 균주의 염색체에서 돌연변이화되거나 결실된 내인성 유전자를 보완하는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 핵산 분자가 리스테리아 게놈 내로 통합되는, 방법.
  58. 제56항에 있어서, 상기 핵산 분자가 상기 재조합 리스테리아 균주 내의 플라스미드에 존재하고, 상기 플라스미드가 항생제 선별의 부재 시 상기 재조합 리스테리아 균주 내에서 안정하게 유지되는 것인, 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대사 효소가 알라닌 라세마제 효소 또는 D-아미노산 트랜스퍼라제 효소인, 방법.
  60. 제46항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미니유전자 작제물이 리스테리아 게놈 내로 통합되거나 또는 상기 리스테리아 내 염색체외 플라스미드에 존재하는, 방법.
  61. 제46항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아가 actA 유전자에 게놈 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 방법.
  62. 제46항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아가 inlB 유전자에 게놈 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 방법.
  63. 제46항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주가 prfA 유전자에 게놈 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 방법.
  64. 제46항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 약독화된 리스테리아가 리스테리아 모노사이토게네스인, 방법.
  65. 제46항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 독립적인 애쥬번트의 투여를 추가로 포함하는, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 애쥬번트가 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 단백질, GM-CSF 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 분자, 사포닌 QS21, 모노포스포릴 지질 A 또는 비메틸화된 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 방법.
  67. 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 림프종, 백혈병, 유방암, 결장직장암, 두경부 편평 암종, 신세포 암종, 췌장 관 선암종, 골육종, 위암, 비소세포 폐암 또는 골암을 포함하는, 방법.
  68. 제46항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 불응성 암인, 방법.
  69. 제67항에 있어서, 상기 림프종이 호지킨 림프종 또는 비호지킨 림프종인, 방법.
  70. 제67항에 있어서, 상기 림프종이 다발성 골수종인, 방법.
  71. 제21항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 상기 재조합 약독화된 리스테리아의 적어도 2회의 투여를 포함하는, 방법.
  72. 제21항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 상기 암의 재발 또는 전이 후, 상기 재조합 약독화된 리스테리아를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  73. 제21항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 접종량(booster shot)를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  74. 제21항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응이 CD8+ T 세포 면역 반응인, 방법.
  75. 제46항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 전이성 질환을 지연시키는, 방법.
  76. 제46항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 림프절 크기를 감소시키는, 방법.
  77. 제46항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 무진행 생존(progression free survival)을 초래하는, 방법.
  78. 제46항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 질환 진행까지의 시간을 증가시키는, 방법.
  79. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리스테리아 또는 제20항에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 또는 암의 형성을 억제하거나 지연시키는 방법.
  80. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리스테리아 또는 제20항에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 자기항원에 대한 내성을 파괴하는 방법.
  81. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리스테리아 또는 제20항에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암 퇴행을 유도하는 방법.
  82. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리스테리아 또는 제20항에 따른 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 생존을 연장시키는 방법.
  83. 종양 또는 암을 가진 대상체에서 항종양 반응 또는 항암 반응을 유도하기 위한 재조합 리스테리아의 용도로서, 상기 용도는 상기 종양 또는 암을 가진 상기 대상체에게 상기 리스테리아를 투여하는 단계를 포함하며, 상기 재조합 리스테리아는 미니유전자 핵산 작제물을 포함하며, 상기 핵산 작제물은 키메라 단백질을 인코딩하는 개방 해독 프레임을 포함하고, 상기 키메라 단백질은:
    a. 박테리아 분비 신호 서열,
    b. 유비퀴틴(Ub) 단백질,
    c. 펩타이드를 포함하고, 여기서 a. 내지 c.의 상기 신호 서열, 상기 유비퀴틴 및 상기 펩타이드는 각각 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 일렬로 배열되는, 용도.
  84. 제83항에 있어서, 상기 리스테리아가 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 2개 이상의 개방 해독 프레임을 추가로 포함하는, 용도.
  85. 제83항에 있어서, 상기 리스테리아가 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 1개 내지 4개의 개방 해독 프레임을 각각의 개방 해독 프레임 사이에 추가로 포함하는, 용도.
  86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 하나 이상의 네오에피토프를 포함하는, 용도.
  87. 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 개방 해독 프레임이 상이한 펩타이드를 포함하는, 용도.
  88. 제83항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미니유전자 작제물이 핵산 작제물의 발현을 구동하는 5' 박테리아 프로모터를 추가로 포함하는, 용도.
  89. 제88항에 있어서, 상기 프로모터가 actA 프로모터, hly 프로모터 또는 p60 프로모터인, 용도.
  90. 제83항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 분비 신호 서열이 ActA 단백질 신호 서열의 처음 100개 아미노산을 포함하는 ActA100 신호 서열을 인코딩하는, 용도.
  91. 제83항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 분비 신호 서열이 리스테리오리신 O(LLO) 단백질 유래의 분비 신호 서열인, 용도.
  92. 제83항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아가 D-알라닌 라세마제(dal) 및 D-아미노산 트랜스퍼라제(dat) 유전자에 게놈 돌연변이를 포함하는, 용도.
  93. 제88항에 있어서, 상기 리스테리아가 대사 효소를 인코딩하는 제1 개방 해독 프레임을 포함하는 핵산 분자를 추가로 포함하고, 상기 대사 효소가 상기 재조합 리스 테리아 균주의 염색체에서 돌연변이화되거나 결실된 내인성 유전자를 보완하는, 용도.
  94. 제93항에 있어서, 상기 핵산 분자가 리스테리아 게놈 내로 통합되는, 용도.
  95. 제93항에 있어서, 상기 핵산 분자가 상기 재조합 리스테리아 균주 내의 플라스미드에 존재하고, 상기 플라스미드가 항생제 선별의 부재 시 상기 재조합 리스테리아 균주 내에서 안정하게 유지되는 것인, 용도.
  96. 제93항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대사 효소가 알라닌 라세마제 효소 또는 D-아미노산 트랜스퍼라제 효소인, 용도.
  97. 제83항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미니유전자 작제물이 리스테리아 게놈 내로 통합되거나 또는 상기 리스테리아 내 염색체외 플라스미드에 존재하는, 용도.
  98. 제83항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아가 actA 유전자에 게놈 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 용도.
  99. 제83항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아가 inlB 유전자에 게놈 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 용도.
  100. 제83항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 리스테리아 균주가 prfA 유전자에 게놈 돌연변이 또는 결실을 포함하는, 용도.
  101. 제83항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 약독화된 리스테리아가 리스테리아 모노사이토게네스인, 용도.
  102. 제83항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 독립적인 애쥬번트의 투여를 추가로 포함하는, 용도.
  103. 제102항에 있어서, 상기 애쥬번트가 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 단백질, GM-CSF 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 분자, 사포닌 QS21, 모노포스포릴 지질 A 또는 비메틸화된 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드를 포함하는, 용도.
  104. 제83항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응이 CD8+ T 세포 면역인, 방법.
  105. 제83항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 종양 또는 암의 치료를 위한 것인, 용도.
  106. 제83항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 림프종, 백혈병, 유방암, 결장직장암, 두경부 편평 암종, 신세포 암종, 췌장 관 선암종, 골육종, 위암, 비소세포 폐암 또는 골암을 포함하는, 용도.
  107. 제83항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 불응성 암인, 용도.
  108. 제106항에 있어서, 상기 림프종이 호지킨 림프종 또는 비호지킨 림프종인, 용도.
  109. 제105항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 상기 암의 재발 또는 전이 후, 상기 재조합 약독화된 리스테리아를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 용도.
  110. 제104항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 추가 접종량을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 용도.
  111. 제104항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 전이성 질환을 지연시키는 것인, 용도.
  112. 제104항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 림프절 크기를 감소시키는 것인, 용도.
  113. 제104항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 무진행 생존을 초래하는 것인, 용도.
  114. 제104항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 질환 진행까지의 시간을 증가시키는 것인, 용도.
  115. 대상체에서 종양 또는 암의 형성을 억제하거나 지연시키기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리스테리아 또는 제20항에 따른 약제학적 조성물의 용도로서, 상기 재조합 리스테리아 또는 상기 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 용도.
  116. 자기항원에 대한 내성을 파괴하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리스테리아 또는 제20항에 따른 약제학적 조성물의 용도로서, 상기 재조합 리스테리아 또는 상기 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 용도.
  117. 대상체에서 암 퇴행을 유도하기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리스테리아 또는 제20항에 따른 약제학적 조성물의 용도로서, 상기 재조합 리 스테리아 또는 상기 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 용도.
  118. 대상체에서 생존을 연장시키기 위한, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 재조합 리스테리아 또는 제20항에 따른 약제학적 조성물의 용도로서, 상기 재조합 리 스테리아 또는 상기 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 용도.
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